KR101027718B1

KR101027718B1 - 웅성 생식세포-특이 뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR101027718B1
Application number: KR1020080084458A
Authority: KR
Inventors: 한재용; 렝거라지 데반드란
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2011-04-12
Also published as: KR20100025775A

Abstract

본 발명은 웅성 생식세포의 동정용 키트 및 웅성 생식세포의 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 웅성 생식세포의 동정용 키트 및 웅성 생식세포의 동정 방법은 조류의 웅성 생식세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 대상으로 하기 때문에, 정소 세포의 동정, 성의 구별, 정자의 분리, 불임 치료, 불임 유도, 불임 진단 및 조류의 성 발달 과정 연구에 매우 유용하게 이용할 수 있다.

웅성 생식세포, 조류 정소 세포, 동정용 키트, 생식세포 특이 발현 유전자

Description

웅성 생식세포-특이 뉴클레오타이드 서열{Male Germ Cell-Specific Nucleotide Sequences}

본 발명은 웅성 생식세포-특이 (male germ cell-specific) 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.

닭에서의 게놈 연구는 발현 유전자 단편 (expressed sequence tag, EST)의 수집 및 닭 게놈의 집합의 클로닝 및 특성을 통해 진행되어 왔다 [1]. 그러나, 조류의 성적 성숙화에 대한 게놈 분석은 포유류에 비해서 그 정보가 부족한 실정이다. 게놈 연구는 여러 분야에서 많은 의문점들을 해결해 주었다 [2]. 성 발생에 특이적인 전사체에 대한 시퀀싱, 주석 및 분석은 게놈 연구에 있어서 근본적인 부분이다. ESTs는 유전자 발견, 유전자 발현, 유전자 조절 및 프로테오믹스-기초의 연구에 적용되는 시퀀스의 일부분이다 [3].

몇몇의 대규모의 EST/전사체 데이터 라이브러리는 서로 다른 배아 및 성체 닭의 생식 조직/세포에 대해 발전되어 왔고, 또한 조류 유전체학의 발전에 기여해 왔다 [4-7]. 특히, TIGR (the institute for genomic research)의 GgGI (Gallus gallus Gene Index)는 일반에 공개된 데이터베이스로, 다양한 EST 라이브러리로부터의 집적된 데이터를 가지고 있다. TIGR는 닭의 조직에 관련된 시험적 컨센서스 (tentative consensus, TCs) 시퀀스, ESTs 및 발현된 전사체 (expressed transcripts, ETs)의 대규모의 정보를 제공한다 [4, 8]. TIGR G. gallus 라이브러리의 갱신된 정보는 (release 11.0, 2006년 6월 17일에 갱신) 75,408개의 TC 시퀀스, 112,983개의 싱글턴 EST (singleton EST) 및 860개의 싱클턴 ETs를 포함한 다. TC 시퀀스 (1kb 미만부터 5kb 이상까지)는 일반적인 방법에 따라 100%의 ESTs 또는 ETs를 모아서 만들었다. 이러한 TC 시퀀스는 예전에 확인하였던 부분적인 유전자들을 나타낸다. TC 시퀀스에 대한 발현 패턴, 세포의 기능 및 유전자적 관계에 대해서는 아직 많이 알려져 있지 않다.

본 발명은 웅성 및 자성의 화이트 레그혼의 성 발생 과정 중에 있어 291개의 TC 시퀀스의 발현을 역전사 PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)을 통해 조사하고, 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 통해 선택한 성체의 생식세포-특이적인 전사체의 발현을 더 확인하였다. 본 연구에서 선발된 웅성 생식세포 특이 유전자는 조류에서 최초로 연구되었고 포유류 및 인간에서 연구된 바 없으므로 조류의 연구결과를 포유류에서도 적용할 수 있다. 또한 본 발명은 조류의 생식에 중요한 새로운 전사체에 대한 발현 및 유전 정보를 제공하며, 성체 정소에서 확인된 전사체들은 닭에서 새로운 유전자들을 클로닝하는데 더 많은 정보를 제공하게 될 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 정자형성 (spermatogenesis)의 일련의 기작을 규명하기 위한 준비 작업으로서 웅성의 생식세포에서 특이적으로 발현되는 뉴클레오타이드 서열을 동정하기 위하여 연구를 하였다. 본 발명자들은 다양한 조류 기관 (예: 정소, 뇌, 비장, 간, 근육 및 난소)를 대상으로 하여 연구를 하였고, 그 결과 웅성의 생식세포에서 특이적으로 발현되는 뉴클레오타이드 서열들을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 동물의 웅성 생식세포의 동정용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 동물의 웅성 생식세포의 동정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 동물의 웅성 생식세포의 동정용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 정자형성 (spermatogenesis)의 일련의 기작을 규명하기 위한 준비 작업으로서 웅성의 생식세포에서 특이적으로 발현되는 뉴클레오타이드 서열을 동정하기 위하여 연구를 하였다. 본 발명자들은 다양한 조류 기관 (예: 정소, 뇌, 비장, 간, 근육 및 난소)를 대상으로 하여 연구를 하였고, 그 결과 웅성의 생식세포에서 특이적으로 발현되는 뉴클레오타이드 서열들을 발견하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "웅성 생식세포 (male germ cell)"는 정원줄기세포, 정원줄기세포에서 유래된 모든 생식세포, 정원세포(spermatogonia), 정모세포(spermatocytes), 정자(sperm 또는 spermatozoa), 세르톨리 세포, 간질세포와 기타 결체조직에 관련된 근육세포 등을 포함하는 정소조직 내의 세포를 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 정원줄기세포, 정원세포, 정모세포 및 정자를 의미한다. 이러한 웅성 생식세포는 정소뿐만 아니라 배아 조직에서도 분리할 수 있다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함한다. 본 발명의 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열 (perfectly complementary sequence)뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열 (substantially complementary sequence)도 포함한다. 용어 “실질적으로 상보적인 서열”은 당업계에 공지된 엄격 조건 (stringent conditions) 하에서 서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미 한다. 용어 “엄격 조건"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있으며, 엄격 조건은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 a) 50℃ 온도 및 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트로 세척하거나, b) 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 단편 (fragment)을 포함한다.

하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열들은 분자적 기능 (molecular function), 생물학적 과정 (biological process) 및 세포 성분 (cellular component)에 기여한다. 분자적 기능 그룹으로 분류된 서열 중, 일부는 결합 (binding)에 관여하는 것이고, 다른 일부는 촉매 활성에 관여한다. 생물학적 과정에 기여하는 서열 중, 일부는 생리학적 과정에서 참여하는 단백질을 암호화하고, 다른 일부는 세포내 과정에 참여하는 단백질을 암호화하며, 또 다른 일부는 발달에 관여하는 단백질을 암호화한다. 세포 성분으로 분류된 서열 중 거의 모든 것은 세포 내에 분포된 것이다.

동물에서 많은 유전자들이 웅성 생식세포 발달에 영향을 미칠 것이라 판단된다. 본 발명에서 규명된 웅성 생식세포-특이 다수의 뉴클레오타이드 서열은 이러한 당업계의 컨센서스 (consensus)를 뒷받침한다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 웅성 생식세포 특이성 때문에 다음의 용도로 사용될 수 있다: a) 웅성 생식세포(예컨대, 정소 세포)의 동정; b) 성의 구별 (discrimination of sex); c) 정자의 분리; d) 불임 치료 또는 불임 유도; e) 유전자 진단 (특히, 불임에 대한 유전자 진단) 및 f) 조류, 특히 닭의 성 발달 과정 연구. 예를 들어, 초기 배자 (배아)로부터 얻은 세포로부터 총 RNA를 이용하여 노던 블롯팅 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press)을 하거나, 총 RNA로부터 cDNA를 얻은 다음, 혼성화 반응을 시켜 성의 구별을 실시할 수 있다. 만일, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 불임 치료 또는 불임 유도에 이용하는 경우, 본 발명의 웅성 생식세포-특이 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 불임이 된 동물개체의 정소 세포에 본 발명의 서열을 주입시켜 불임 치료를 할 수 있는 가능성이 있다. 반대로, 동물개체의 웅성 생식세포에 있는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 조작하여 발현을 억제함으로써 불임을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 진단, 특히 단일염기 다형성 (single nucleotide polymorphism)에 기초한 유전자 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 동물의 웅성 생식세포의 동정 방법을 제공한다: (a) 서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편과 분석하고자 하는 세포로부터 수득한 DNA 또는 그들의 단편을 혼성화 반응을 실시하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서의 혼성화 여부를 확인하는 단계.

본 발명의 방법에 있어서, 시험 대상이 되는 세포에서부터 DNA를 수득하는 방법은 세포로부터 분리한 총 RNA로부터 역전사 반응을 통해 얻은 cDNA인 것이 바람직하다. 총 RNA 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol. Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 총 RNA로부터 cDNA를 얻는 것은 RT-PCR(reverse transcriptase -PCR) 방법에 따라 용이하게 할 수 있다.

이렇게 수득한 DNA (예: cDNA)는 바람직하게는 표지 (labelling) 된다. 이와 같은 표지는 분광측정, 광화학 측정, 생화학적 측정, 생전자적 (bioelectronic) 측정, 면역화학적 측정, 전기적 측정, 광학적 측정, 화학적 측정에 의해 검출될 수 있는 물질에 의해 이루어진다. 예를 들어, 상기 표지 물질은 P³² 및 S³⁵와 같은 방사선동위원소, 화학발광 (chemiluminescent) 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자, 형광 마커와 다이와 같은 분광학적 마커, 그리고 자기 표지물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 다이는 예컨대, 퀴놀린 다이, 트리아릴메탄 다이, 프탈레인, 아조 다이 및 시아닌 다이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 마커의 비-제한적 예는 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)를 포함한다. 표지 물질에 의한 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 세포에서부터 수득한 DNA와 웅성 생식세포-특이 뉴클레오타이드 서열과의 혼성화 반응은 qRT-PCR (quantitative RT-PCR) 방법 또는 in situ 혼성화 방법에 따라 실시된다.

qRT-PCR 방법은 RNA 분자의 파퓰레이션 내에서(예를 들면, 총 RNA 또는 mRNA 등) 미량의 RNA를 빠르고 정확하게 검출하는데 사용되는 실험기법으로 다음 과정을 포함한다: a) cDNA를 생성하기에 적절한 조건 하에서 역전사 효소 및 목적으로 하는 시퀀스-특이 역전사 프라이머와 RNA 시료를 반응시키고; b) cDNA에 특이적인 높은 농도의 PCR 프라이머 세트와 열에 안정적인 DNA 중합효소를 포함하는 적절한 PCR 시약을 상기 역전사 효소 반응물에 넣어준 후; c) 원하는 사이클만큼 PCR 반응을 수행하여 적절한 조건 하에서 cDNA에 특이적인 PCR 생성물(“앰플리콘”)을 얻는다. 상기 과정에서 역전사 효소 반응과 PCR 반응을 시간적으로 분리하거나, 역전사 효소-최적 및 PCR-최적 프라이머를 사용함으로써 더욱 특이성이 우수한 앰플리콘을 얻을 수 있다.

In situ 혼성화 방법은 Gall et al. Meth . Enzymol ., 21:470-480 (1981); Angerer et al. in Genetic Engineering : Principles and Methods Setlow and Hollaender, Eds. Vol 7:43-65 (plenum Press, New York 1985)에 기재된 방법에 의한다. in situ 혼성화 방법을 비롯한 일반적인 핵산의 혼성화 과정은 다음의 단계를 거친다: a) 목적으로 하는 핵산을 고정하고; b) 목적으로 하는 핵산에 접근성을 높이고 비특이적인 결합을 막기 위해 전혼성화 처리를 한 후; c) 고형 표면에 존재하는 핵산에 핵산 혼합물(즉, 프로브)을 혼성화시키고; d) 혼성화 과정에서 결합하지 않은 남은 핵산들을 제거하는 세척 과정을 거친 후; e) 혼성화 여부를 확인한다.

본 발명의 방법에 있어서, 혼성화 여부를 확인하는 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 다양한 방법, 특히 표지에 이용된 상기 표지 물질의 종류에 따라 다양하게 실시될 수 있다. 예를 들어, 표지 물질로서 형광 물질을 이용한 경우, 형광 현미경, 바람직하게는 콘포컬 형광 현미경으로 확인할 수 있으며, 이와 같은 장치를 통해 검출된 시그널의 세기는 혼성화 정도에 비례하여 증가된다.

한편, 본 발명의 키트 및 방법은 동물로서 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 포유동물 또는 조류 동물, 더욱 바람직하게는 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위, 꿩 및 비둘기, 가장 바람직하게는 닭에 적용되어 웅성의 생식세포를 정확하게 동정할 수 있도록 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 웅성 생식세포의 동정용 키트 및 웅성 생식세포의 동정 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 웅성 생식세포의 동정용 키트 및 웅성 생식세포의 동정 방법은 조류의 웅성 생식세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 대상으로 하기 때문에, 정소 세포의 동정, 성의 구별, 정자의 분리, 불임 치료, 불임 유도, 불임 진단 및 조류의 성 발달 과정 연구에 매우 유용하게 이용할 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 동물의 정자생성을 지배하는 일련의 기작들을 연구하는 데 기본적인 정보를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 실험 방법

실험 동물

본 연구에서 이용되는 화이트 레그혼 닭은 서울대학교 부속실험목장에서 유지하였다. 동물을 다루고, 생산하고 수술하는 것은 서울대학교 동물 유전 공학과의 정형화된 프로토콜에 따랐다. 본 연구에서 모든 실험 데이터는 3-5회의 독립적인 실험에 의한 결과이다.

조직, 총 RNA 의 추출 및 RT - PCR 의 실시

웅성 및 자성의 닭이 성 발생을 하는 동안 17종의 조직 (배아 6일 및 12일째인 웅성 및 자성의 생식기, 부화한지 1일, 4주 및 12주령 닭의 정소와 난소 및 25주령 닭의 뇌, 신장, 간, 비장, 골격 근육, 정소 및 난소)을 수집하였다.

6일령 닭의 배아의 성 결정을 위해, 약 0.2 ㎕의 배아 혈액을 5일간 배양한 수정란으로부터 살균된 미세바늘을 이용하여 뽑아내었다. 배아 혈액 시료는 증류수에 희석하였고, 94℃에서 5분간 및 55℃에서 5분간 각각 5번씩 끓인 후, 게놈 DNA를 닭의 W 염색체-특이적 프라이머인 USP1 (5'-CTATGCCTACCACATTCCTATTTGC-3') 및 USP3 (5'-AGCTGGACTTCAGACCATCTTCT-3')을 이용하여 증폭시켰다 [9]. 25주령의 웅성 및 자성의 닭에서 비생식기 조직을 수집하여 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 제 조사의 프로토콜에 따라 각각의 조직으로부터 Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 추출하였고, 페놀:클로로포름-추출을 하였으며, 에탄올로 침전시켰다. 총 RNA에 남아있는 DNA는 역전사의 전단계에서 제조사의 프로토콜에 따라 RQ1 RNA 분해효소-프리 DNA 분해효소 (Promega)로 분해하였다. 올리고(dT)₂₀-프라임된 총 RNA (1 ㎍)은 Superscript Ⅲ 제1쇄 합성 시스템 (Invitrogen)으로 역전사하였다. cDNA는 20%로 희석하였으며, 하기의 실험에 사용하였다.

수집된 새로운 전사체의 TC 시퀀스로의 선택 및 RT - PCR 분석

TIGR의 GgGI 데이터베이스로부터, 성 발생 과정동안 이들 TC 시퀀스의 발현을 결정하기 위해서 ESTs로 수집된 291개의 TC 시퀀스를 조사하였다. 17가지 조직 타입으로부터의 cDNA는 각각의 291개의 TC 시퀀스에 대한 적절한 프라이머들로 증폭하였다. 각각의 20-㎕ PCR 반응에는 2 ㎕의 cDNA, 2 ㎕의 PCR 버퍼, 1 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 10 pmole의 각각의 프라이머 및 1 unit의 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. 거짓의 밴드 형성을 방지하기 위하여 터치다운 PCR를 실시하였다. 초기 변성 단계를 94℃에서 5분 동안 실시한 다음, 터치다운 사이클의 5 라운드를 실시하였다. 첫 번째 사이클에서 프라이머 변성은 62℃에서 실시하였고, 이어지는 사이클에서 매번 0.5℃ 감소시켰다. 이어지는 30 사이클에서, 94℃에서 30초, 프로그램된 어닐링(annealing) 온도에서 30초 및 72℃에서 30초의 온도 사이클을 이용하여 증폭하였다. 온도 사이클 프로그램을 72℃에서 7분의 반응으로 종결시 켜 완전한 연장반응이 일어나도록 하였다.

RT-PCR 분석에서 강하고 유일하게 발현되는 것을 기초로 하여, 12개의 성체 정소-특이적 TC 시퀀스를 선택하여 qRT-PCR 및 in situ 혼성화 실험으로 더 확인을 하였다. qRT-PCR 및 in situ 혼성화 실험에서 사용된 선택된 성체 정소-특이적 TC 시퀀스에 대한 프라이머 시퀀스 및 프로그램된 어닐링 온도는 하기 표 1a 및 표 1b와 같다. 표 1a 및 표 1b에서 위쪽 부분의 프라이머 쌍은 qRT-PCR에 사용하였고, 아래 부분은 in situ 혼성화에 사용하였다.

서열번호	TIGR 유전자 인덱스에서 억세션 번호	TIGR 유전자 인덱스에서 잠정적 주석	프라이머 시퀀스(5'-3')	크기(bps)	어닐링 온도(℃)
제1서열	TC113009	UP\|Q7ZVL7_BRARE (Q7ZVL7) 헥소키나아제 2와 약하게 유사, 부분 partial 12%	F: GACGGAAACCAGAACCCACAGC R: TGAGTTCCGCCTTGTCCAGC	208	60
			F: GACGGAAACCAGAACCCACAG R: TGCCCGAACCCACAACCAAG
제2서열	TC116690	KIAA1640 단백질과 유사한 호모로그{Gallus gallus} (exp=1;wgp=0; cg=0), 부분 36%	F: AGAAGCGATTGATGAACCACTG R: TCATTCTTCTCCTCCTCCTTCC	172	60
			F: CAGAGGACACCAAAGTAAC R: ATCTCACTCTCCATCTGC
제3서열	TC120901	UP\|Q2VRL0_CHICK (Q2VRL0) 포스포리파아제 C 제타{Gallus gallus}, 완전	F: ATGGAGGAGAACAGATGG R: ATGTATCTTCCGCTTGTC	165	55
			F: AAATCTTGCTGACACTGAG R: TGGTGAAGTAAGAAGTTTGTC
제4서열	TC130453	Q55C46 가설 단백질과 유사, 부분 3%	F: TTTCTCTCCGTCATCTTTC R: AGGATGATGATGATGATGAC	164	55
			F: TTTCTCTCCGTCATCTTTC R: CTACCGTCTCTGTTCCGTC

서열번호	TIGR 유전자 인덱스에서 억세션 번호	TIGR 유전자 인덱스에서 잠정적 주석	프라이머 시퀀스(5'-3')	크기(bps)	어닐링 온도(℃)
제5서열	TC249072	가설 단백질과 유사한 호모로그{Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 39%	F: AACTCAGACCCAGCGGATTCAG R: TGTCCTTCGCTGCTTGGCTG	164	60
			F: GGATGAGCAAGAGAAACAG R: TCTTTCTCCTCATTTGCC
제6서열	TC262314	XP_429937 가설 단백질과 유사{Gallus gallus} (exp=0;wgp=1;cg=0), 완전	F: GGAACCTGACGACTTAGATG R: CGTCTTCCCGATGTCTTG	153	60
			F: 5'-GGAACCTGACGACTTAGATG R: 5'-TCCTTTATTCAGACACTTCG
제7서열	TC113702	UP\|Q3PRZ6_NITHA (Q3PRZ6)몰리브돕테린 탈수소효소와 유사, FAD-결합, 부분 5%	F: CAGCGTTGGGAAGGTGATGG R: TTCGGCAAGGAGCACAGACC	196	62
			F: CGACGGATTGAAGAGAGAG R: AATGGAACGCTACTCAAG
제8서열	TC117377	UP\|Q4SNS3_TETNG (Q4SNS3) 염색체 15번 SCAF14542와 유사, 모든 게놈 숏건 시퀀스, 부분 11%	F: GGAGAGAACCCTGAAAGCAAC R: CTGCTGGGATGTTGGCTCTAC	150	60
			F: AGGAGCACCACTGAGCTACC R: TTGCTGCTTTGTTCTCAGGA
제9서열	TC119769	가설 단백질 XP_419543 {Gallus gallus}(exp=0; wgp=1; cg=0), 완전	F: GCAATCAAACTAAGGGAG R: TTTGGGCTTCATAGTTTAC	190	57
			F: CCTGTGATTCGTCTCATCCA R: TGCAAGAGTGATTTATGCTCCT
제10서열	TC137350	UP\|Q99AQ0_9VIRU (Q99AQ0) Orf1과 유사, 부분 3%	F: AGGATGCTGGAAATGTGGAC R: CGTCTGCGTCTCCAAGTTAG	150	57
			F: CCCTGCGACGGAGTTTGATG R: GCCTGTTCTCCGTCTCCTCATC
제11서열	TC139858	UP\|Q3F4L4_9BURK (Q3F4L4) 알데히드 탈수소효소와 약하게 유사, 부분 4%	F: GGCTACACTGAGAGAGATTC R: TGAAAGGAAGAGAAAGGTG	120	55
			F: TACCTCTCTGCAGCGACAGC R: AGAAAGGTGGTTTGCTCCTG
제12서열	TC244139	UP\|O29301_ARCFU (O29301) 브랜치된 체인 아미노산 ABC 수송단백질, 퍼미아제 단백질(BraD-3), 부분 (7%)	F: TTTCCAGCAAGGTGAGGCAGAG R: CGCCATCAGCACAGCATTCC	156	60
			F: 5'-AAGCAGGAGTAAAGAACC R: 5'-GTGTGCCTGTGTTGTAATG

qRT - PCR 분석

배아 6일령 및 12일령인 웅성의 생식선, 1일령, 4주령 및 12주령의 닭의 정소 및 25주령 닭의 뇌, 신장, 간, 비장, 골격 근육, 정소 및 난소로부터의 cDNA를 12개의 정소-특이적 TC 시퀀스에 대한 적절한 프라이머로 증폭하였다. 닭(25주령)의 난소는 자성에 대한 대조군 조직으로 사용하였다. 수치화는 iCycler 7300 실시간 PCR 검출 시스템 (Applied Biosystems Inc.)으로 수행하였다. 각각의 반응에는 2 ㎕의 PCR 버퍼, 1.6 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 10 pmole의 각각의 프라이머, 2 ㎕의 cDNA, 4 ㎕의 SYBR 그린 I(Sigma), 0.5 ㎕의 ROX 레퍼런스 염색액(Invitrogen) 및 1 unit의 Taq DNA 중합효소를 사용하여 총 부피가 20 ㎕이 되도록 하였으며, 옵티컬 96-웰 표준 플레이트 (Applied Biosystems Inc.)에서 수행하였다. PCR 반응은 초기 반응을 50℃에서 2분간 실시하고 95℃에서 10분 동안 실시한 다음, 이어지는 40 사이클에서, 95℃에서 15초, 프로그램된 어닐링(annealing) 온도에서 30초 및 72℃에서 30초의 온도 사이클을 이용하여 증폭하였다. PCR 반응은 95℃에서 15초, 60℃에서 30초 및 95℃에서 15초의 분리 온도에서 마지막으로 반응시켜 종결시켰다. PCR 이후 분석에서, 시퀀스-특이적인 생성물은 융해곡선을 생성함으로써 확인하였다. 각각의 TC 시퀀스의 역치 주기(C_t 값)는 벡그라운드 이상으로 형광 신호가 정적으로 올라가는 싸이클 수를 나타내며, 내인성 하우스키핑 유전자인 닭의 β-액틴 (순방향: 5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3'; 역방향: 5'-TTCTCTCTCGGCTGTGGTGG-3', GenBank accession number L08165)의 C_t값으로 표준화하였다. 각각의 TC 시퀀스의 발현에 대한 상대적인 수치화는 2^-ΔΔ ^C _t 방법을 이용하여 계산하였다 [10,11].

혼성화 프로브

각각의 TC 시퀀스의 정확한 위치를 결정하기 위해서, 12개의 성체 정소-특이적 TC 시퀀스의 발현을 이전 방법을 변형한 in situ 혼성화 방법으로 조사하였다 [12]. 25주령의 닭의 정소로부터 생성한 cDNA를 적절한 프라이머로 증폭하였다. 각 TC 시퀀스의 증폭된 절편은 1% 아가로즈 젤에 로딩하여 5 V/cm에서 30분 동안 전기영동으로 분리하였다. 각 TC 시퀀스의 DNA는 Power Gel Extraction 키트(TaKaRa)를 이용하여 회수하였으며, pGEM-T 플라스미드 벡터(Promega)에 클로닝하고, E. coli DH5α에 형질전환하였다. 시퀀스를 확인한 후, 각 TC 시퀀스가 클로닝된 재조합 플라스미드는 cRNA 프로브를 라벨링하기 위한 주형을 만들기 위해 T7- 및 SP6-특이 프라이머(T7: 5'-TGTAATACGACTCACTATAGGG-3' SP6: 5'-CTATTTAGGTGACACTATAGAAT-3')로 증폭하였다. 디그옥시제닌(Digoxigenin, DIG)으로 라벨된 센스 및 안티센스 cRNA 프로브 (클로닝 방향에 따라 T7 또는 SP6 RNA 중합효소로 프로모트된)는 DIG RNA 라벨링 키트 (Roche)를 이용하여 인 비트로 전사하였다.

In situ 혼성화

25주령 닭의 정소를 8-10 mm 조각으로 잘라내어 액체 질소에서 냉동시킨다. 상기 냉동 조각(10 ㎛)을 3-아미노프로필트리에톡시실란 (Sigma)이 전처리된 슬라이드에 올려놓고, 슬라이드를 50℃로 따듯하게 말린 후, 새로 준비된 1x PBS (1.4 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄ 및 KH₂PO₄,pH 7.4)에 4%의 파라포름알데히드가 들어있는 용액에 상온에서 1시간 동안 고정시킨다. 상기 조각은 1x PBS에서 두 번 세척하고, 1%의 트리톤 X-100에서 20분간 처리하고, 1x PBS에서 다시 세 번 세척한다. 상기 조각은 50% 포름아미드 및 5x SSC (150 mM NaCl 및 15 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0)가 포함된 전혼성화 용액으로 상온에서 15분간 반응시킨다. 전혼성화 후에, 상기 조각은 50% 포름아미드, 5x SSC, 10% 덱스트란 설페이트 소듐염, 0.02% BSA, 250 ㎍/㎖ 효모 tRNA 및 변성된 DIG-라벨된 정소-특이적 TC 시퀀스의 센스 또는 안티센스 cRNA 프로브가 포함된 혼성화 용액으로 55℃ 반응 챔버에서 18시간 동안 반응시킨다.

조각들은 상기의 포름아미드 및 SSC가 포함된 일련의 용액으로 강하게 세척하였다 [12]. 1% 블로킹 시약(Roche)이 들어있는 버퍼 I [1 M Tris-HCl (pH 7.5)]으로 비특이적인 결합을 막은 후, 조각들은 알칼라인 포스파타제 (Roche)가 컨쥬게이트된 양의 항-DIG 항체로 밤새 반응시켰다. 시그널은 버퍼 Ⅲ[1 M Tris-HCl(pH 9.5), 2.5 M NaCl 및 0.5 M MgCl₂]에 0.4 mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 0.4 mM 니트로블루 테트라졸리움 및 2 mM 레바미졸 (Sigma)이 포함된 발색 용액으로 확인하였다. 모든 조각들은 1%(w/v) 메틸 그린 (Sigma)으로 대조 염색을 하였으며, Zeiss Axiophot 광학 현미경이 장착된 Axiocam HRc 카메라로 사진을 찍었다 (Carl Zeiss, Germany).

어셈블리된 ESTs / ETs 의 서치 및 TC 시퀀스의 염색체 번호

센스/안티센스 가닥에서 찾은 ESTs/ETs의 위치는 TIGR G. gallus 라이브러리로부터 결정하였다. TC 시퀀스를 어셈블링 하는데 사용된 ESTs/ETs의 길이를 결정하기 위해, 상응하는 TC 시퀀스 및 ESTs/ETs의 모든 시퀀스들을 Gene Runner를 사용하여 직접 개수를 세었다. 염색체에 배열된 TC 시퀀스(ESTs)의 숫자를 결정하기 위해 각 TC 시퀀스의 염색체 번호를 TIGR G. gallus 라이브러리로부터 적어 놓았다.

TC 시퀀스의 매치되는 단백질 및 기능적 도메인의 서치

TC 시퀀스의 매치된 단백질들은 NCBI BLASTX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)에서 각 TC 시퀀스의 염기 서열을 입력하여 찾았다. 이후, 보존된 기능적 도메인들은 Pfam-A 패밀리 매트릭스(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) 및 NCBI 보존된 도메인 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)에서 서치하였다. 모든 데이터는 가장 높은 히트 및 E-value의 컷오프에 기초하여 얻었다.

2. 실험 결과

닭의 성 발생 과정 동안 나타나는 새로운 전사체에 대한 RT - PCR 분석

106개(36.4%)의 TC 시퀀스가 적어도 하나의 비생식 성체 조직에서 항상 나타났으며, 85개(29.2%)의 TC 시퀀스가 웅성의 성 발생 과정 동안 생식선 및 정소에서 특이적으로 나타났고, 52개(17.9%)의 TC 시퀀스가 성 발생 과정 동안 정소 및 난소에서 특이적으로 나타났으며, 48개(16.5%)의 TC 시퀀스가 테스트한 어떠한 조직에서도 나타나지 않았다.

많은 수의 TC 시퀀스가 생식 세포의 성 발생 과정 동안 정소에서 특이적으로 나타났다. 정소 발생 과정의 배아 부분에서는 TC 시퀀스가 거의 나타나지 않았다. 10개의 TC 시퀀스가 각각 4주령 및 25주령 닭의 정소에서 나타났으며, 28개의 TC 시퀀스가 12주령 및 25주령 닭의 정소에서 나타났다. 또한, 25주령 닭의 정소에서만 상향 조절되는 43개의 후보 TC 시퀀스를 찾아내었다 (도 1a). 정소-특이적 TC 시퀀스들 중에서, 적은 부분만이 완전한 시퀀스였다. TC120901는 닭의 Plcz1, TC233325는 정소-특이적인 류신 지퍼 단백질 단위체이며, TC236430는 RIKEN cDNA 3110050N22였다. TC136991 및 TC252966는 각각 G. gallus의 완료된 cDNA, 클론들 chEST172d12 및 chEST132b5이다. TC119769, TC141765 및 TC262314는 또한 완료된 시퀀스였지만 가설 단백질(hypothetical protein)들이었다. TC109550 (듀얼 특이적 단백질 포스파타제 18), TC116475 (가설 단백질), TC138234 (가설 단백질) 및 TC236914 (세린/트레오닌 키나아제 22C)은 잠정적 주석(tentative annotation)에 주어진 단백질들과 80% 이상의 유사성을 가지고 있었다 (표 2a 내지 표 2e).

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
배아 12일째부터 25주째	TC138353	가설 단백질과 유사{Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 63%
	TC233325	정소-특이적 류신 지퍼 단백질 뉴릿(nurit)과 유사; 새로운 류신 지퍼 정소 단백질, 완전
	TC242369	UP\|Q6GPD0_XENLA (Q6GPD0) MGC80493 단백질과 유사, 부분 17%
	TC257928	gb\|aal49115.1\|17946148\|ay071493 re55690p {Drosophila melanogaster} (exp=-1; wgp=0; cg=0)과 유사, 부분 27%
4주 및 25주령	TC118402	호모로그 to RF\|NP_001003879.1\|51468008\|NM_001003879 DNA 주형 중합효소, 베타{Danio rerio} (exp=1; wgp=0; cg=0), 부분 9%
	TC136991	Gallus gallus 최종 cDNA, 클론 chEST172d12
	TC138234	가설 단백질 XP_429906 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 88%
	TC138732	UP\|Q28ED2_XENTR (Q28ED2) 마엘로이드/림포이드 또는 홉합직계성 류케미아 (Trithorax 호모로그, Drosophila); translocated to, 3, 부분 13%
	TC140396	가설 단백질 XP_429679 {Gallus gallus} exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 21%
	TC140464	UP\|CT195_BOVIN (Q2T9Z2) 단백질C20orf195 호모로그와 약하게 유사, 부분 36%
	TC141611	UP\|Q49960_MYCLE (Q49960) U1756o과 유사, 부분 24%
	TC141765	가설 단백질 XP_429489 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 완전
	TC141861	GB\|CAI94996.1\|66347687\|AL354776 매치와 약하게 유사: 단백질: B0350.2B O70511 O88521 P97582 Q01484 Q01485 Q12955 Q17343 Q61307 Q9CVU0 Q9RYQ2 Q9Y566 {Homo sapiens} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 15%
	TC142187	GB\|AAH23614.2\|33874587\|BC023614 MECT1 단백질과 유사 {Homo sapiens} (exp=-1; wgp=0; cg=0), 부분 42%
12주 및 25주령	TC106173	가설 단백질 XP_430309과 유사 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 75%
	TC109550	UP\|DUS18_BOVIN (Q5BIP9) 듀얼 특이적 단백질 포스파타제 18과 유사, 부분 83%
	TC117011	칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 타입 II 델타 체인과 유사한 호모로그, 부분 8%
	TC117262	UP\|Q6AYI6_RAT (Q6AYI6) Spag8_예상된 단백질(조각)과 약하게 유사, 부분 11%
	TC117315	UP\|Q7L590_HUMAN (Q7L590) MCM10 단백질(조각)과 유사, 부분 40%
	TC117596	(Q2JCC9) 가설 단백질과 호모로그, 부분 5%
	TC117857	UP\|Q9FI79_ARATH (Q9FI79) Arabidopsis thaliana 게놈 DNA, 염색체 5번, TAC 클론:K19E20 (At5g48920)과 유사, 부분 8%
	TC119931	UP\|Q415M3_KINRA (Q415M3) N-아실-D-아미노산 디아실라제, 부분 4%

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
12주 및 25주령	TC121836	가설 단백질 XP_794742 {Strongylocentrotus purpuratus}과 약하게 유사 (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 64%
	TC132675	UP\|Q8NCR6_HUMAN (Q8NCR6) 정소 발생-관련 NYD-SP22과 유사, 동종형태 1, 부분 11%
	TC133213	UP\|Q6GPH4_HUMAN (Q6GPH4) XIAP 관련 인자-1과 유사, 동종형태 1, 부분 11%
	TC133374	리졸바아제의 가능한 헬릭스-턴-헬릭스 도메인 UP\|Q7TUC9 (Q7TUC9)과 유사, 부분 13%
	TC135566	UP\|O70575_MOUSE (O70575) 콜라겐 타입 XIII 알파-1 체인, 부분 3%
	TC136010	UP\|Q8VG57_MOUSE (Q8VG57) 후각 수용체 MOR231-12와 호모로그, 부분 5%
	TC136930	(Q4A2S9)과 유사, 잠정적인 막 단백질 전구체, 부분 3%
	TC137807	세갈래의 모티프를 포함하는 42{Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)과 유사 ,부분 24%
	TC137940	UP\|Q79FT3_MYCTU (Q79FT3) PE-PGRS FAMILY 단백질과 유사, 부분 3%
	TC138036	UP\|Q9SBM1_VOLCA (Q9SBM1) 하이드록시프롤린-다량 당단백질 DZ-HRGP 전구체과 유사, 부분 5%
	TC139805	UP\|Q76KT5_CHICK (Q76KT5) 멜트린 엡실론과 약하게 유사, 부분 6%
	TC139876	염색체 9전 열린 해독틀 138; 4930500O09Rik {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)과 유사, 부분 46%
	TC236430	RIKEN cDNA 3110050N22 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)과 유사, 완전
	TC236535	가설 단백질 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)과 유사, 부분 46%
	TC236914	UP\|Q6V9Y3_RAT (Q6V9Y3) 세린/트레오닌 키나아제 22C과 유사, 부분 87%
	TC237932	UP\|Q5PPX0_XENLA (Q5PPX0) LOC496055 단백질과 유사, 부분 49%
	TC255003	UP\|Q41IM0_METBU (Q41IM0) 나이트리트/설파이트 환원효소, 헤모단백질 베타-컴포넌트, 페레독신-유사: 나이트리크 및 설파이트 환원효소 4Fe-4S 지역 (절편), 부분 5%
	TC274966	UP\|Q6Z5Z0_ORYSA (Q6Z5Z0) 아미노트랜스퍼라아제-유사 Aminotransferase-like 단백질과 유사, 부분 5%
	TC280955	UP\|Q03866_MAIZE (Q03866) 비시린-유사(Vicilin-like) 배 저장 단백질과 유사, 부분 3%
	TC288019	UP\|Q9VPS3_DROME (Q9VPS3) CG2839-PA와 유사 , 부분 7%

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
25주령	TC100766	UP\|Q8AXV0_CHICK (Q8AXV0) 엔도필린 II(Endophilin II), 부분 67%
	TC110394	UP\|RD23B_MOUSE (P54728) UV 절단 회복 단백질 RAD23 호모로그 B (mHR23B) (XP-C 회복-보충 복합체 58 kDa 단백질) (p58)과 유사, 부분 5%
	TC113009	UP\|Q7ZVL7_BRARE (Q7ZVL7) 헥소키나아제 2와 약하게 유사, 부분 12%
	TC113702	UP\|Q3PRZ6_NITHA (Q3PRZ6) 몰리브돕테린 탈수소효소와 유사, FAD-결합, 부분 5%
	TC114718	가설 단백질 XP_429781 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)과 유사, 부분 52%
	TC116374	UP\|Q39SJ9_GEOMG (Q39SJ9) 펩티도글리칸-결합 LysM:라이틱 트랜스글리코실라아제, 촉매와 유사, 부분 4%
	TC116404	UP\|Q7Q9F8_ANOGA (Q7Q9F8)ENSANGP00000015710과 유사, 부분 6%
	TC116475	가설 단백질 XP_430461 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 85%
	TC116690	KIAA1640 단백질 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)호모로그와 유사 , 부분 36%
	TC116738	UP\|NG3_DROME (P40140) 단백질 뉴-글루 3 전구체 (NG-3)와 약하게 유사, 부분 16%
	TC116847	RF\|NP_001006271.1\|57525528\|NM_001006271 숙신산-CoA 리가아제, ADP-형성, 베타 단위체{Gallus gallus} (exp=-1; wgp=0; cg=0), 부분 15%
	TC117377	UP\|Q4SNS3_TETNG (Q4SNS3) 염색체 15번 SCAF14542, 모든 게놈 숏건 시퀀스과 유사, 부분 11%
	TC117509	UP\|Q6ND96_RHOPA (Q6ND96) 가능한 OmpA 패밀리 멤버 전구체와 유사, 부분 4%
	TC119769	가설 단백질 XP_419543 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 완전
	TC119898	GB\|AAF21633.1\|6649923\|MMGDF11S03 성장/분화 인자-11 {Mus musculus} (exp=-1; wgp=0; cg=0)과 약하게 유사, 부분 5%
	TC120110	가설 단백질 XP_422421 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)과 호모로그, 부분 58%
	TC120359	UP\|Q8HEI3_9ACAR (Q8HEI3) 시토크롬 산화효소 단위체 III와 호모로그, 부분 5%
	TC120901	UP\|Q2VRL0_CHICK (Q2VRL0) 포스포리파아제 C 제타 {Gallus gallus}, 완전
	TC130453	(Q55C46) 가설 단백질과 유사 , 부분 3%
	TC133945	GB\|AAD40386.1\|5138999\|AF100743 NADH-유비퀴논 환원효소 {Homo sapiens} (exp=-1; wgp=0; cg=0)와 유사, 부분 79%
	TC135701	UP\|Q86BM9_DROME (Q86BM9) CG33003-PA와 유사, 부분 5%

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
25주령	TC136909	아르기노숙시네이트 라이아제(argH) {Sulfolobus solfataricus P2} (exp=1 wgp=0 cg=1)와 호모로그, 부분 3%
	TC137181	가설 단백질 FLJ32734 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)호모로그와 유사, 부분 77%
	TC137350	UP\|Q99AQ0_9VIRU (Q99AQ0) Orf1과 유사, 부분 3%
	TC138275	UP\|THAP1_HUMAN (Q9NVV9) THAP 도메인-포함 단백질 1과 유사, 부분 48%
	TC138404	염색체 17번 열린 해독틀 1A {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)호모로그와 유사, 부분 3%
	TC139045	GB\|AAK46531.1\|13881934\|AE000516 NLP/P60 패밀리 단백질 {Mycobacterium tuberculosis CDC1551} (exp=0; wgp=1; cg=1)과 유사, 부분 4%
	TC139553	UP\|Q4RDM9_TETNG (Q4RDM9) 염색체 결정되지 않은 SCAF16113, 모든 게놈 숏건 시퀀스와 호모로그. (절편), 부분 7%
	TC139823	UP\|ATF5_MOUSE (O70191) Cyclic AMP-의존성 전사인자 ATF-5 (활성 전사 인자 5-알파/베타) (전사인자 ATFx) (전사인자-유사 단백질 ODA-10) (BZIP 단백질 ATF7) (NRIF3-연관 단백질) (NAP1)과 약하게 유사, 부분 7%
	TC139858	UP\|Q3F4L4_9BURK (Q3F4L4) 알데히드 탈수소효소와 약하게 유사 , 부분 4%
	TC141886	UP\|Q3BYU4_XANC5 (Q3BYU4) 외부 막 유츌 단백질 전구체와 호모로그, 부분 4%
	TC239565	RF\|XP_819233.1\|71664506\|XM_814140 단백질 키나아제 {Trypanosoma cruzi strain CL Brener} (exp=-1; wgp=0; cg=0)과 유사, 부분 4%
	TC244139	UP\|O29301_ARCFU (O29301) 브랜치된-체인 아미노산 ABC 막수송체, 퍼미아제 단백질 (BraD-3), 부분 7%
	TC249072	가설 단백질 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)호모로그와 유사, 부분 39%
	TC252966	Gallus gallus 완성된 cDNA, 클론 ChEST132b5
	TC262314	가설 단백질 XP_429937 (Gallus gallus)(exp=0; wgp=1;cg=0)과 호모로그, 완전
	TC263506	UP\|Q4SMV7_TETNG (Q4SMV7) 염색체 6번 SCAF14544, 모든 게놈 숏건 시퀀스와 약하게 유사. (절편), 부분 16%
	TC272429	가설 단백질 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)과 유사, 부분 7%
	TC280177	UP\|Q9VZL1_DROME (Q9VZL1) CG14981-PA, 동종형태 A (LP07226p) (미토콘드리아 출입 단백질)과 유사, 부분 10%
	TC284840	GB\|BAC65755.1\|28972678\|AK122473 mKIAA1225 단백질 {Mus musculus} (exp=-1; wgp=0; cg=0)과 유사, 부분 28%

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
25주령	TC294032	UP\|Q3WFV5_9ACTO (Q3WFV5) PAS:GGDEF과 약하게 유사, 부분 4%
	TC297523	UP\|Q4S6A4_TETNG (Q4S6A4) 염색체 9번 SCAF14729, 모든 게놈 숏건 시퀀스와 유사, 부분 72%
	TC298175	UP\|Q2IIH7_ANADE (Q2IIH7) PE-PGRS 패밀리 단백질과 약하게 유사, 부분 10%

각각 정소 및 난소에서 발현된 양성 TC 시퀀스는 성 발생 과정에서 그 숫자가 증가하였다. 이들 TC 시퀀스들 중에서 어떤 것도 한쪽의 성에만 특이적이지 않았다. 즉, 주어진 나이의 정소에서 나타난 TC 시퀀스는 정소, 난소 또는 다른 나이에서 양쪽 모두 다시 발견되었다. 4주령 때까지는 정소 및/또는 난소에서 나타난 전사체에서 특별한 차이점이 없었다. 그러나, 25주령에서 정소 및 난소에서 나타난 전사체에서는 큰 차이점이 있었다. 배아 6일째의 웅성 생식기 또는 25주령 닭의 난소에서는 어떠한 전사체도 발견되지 않았다(도 1b). 정소 및 난소 양쪽에서 생긴 TC 시퀀스들 중에서, TC99039 (Cdh1), TC100743 (작은 핵 리보뉴클레오 단백질 Sm D3), 및 TC255207 (가설 단백질)은 완전한 시퀀스였다. TC121831 및 TC228489 는 각각 G. gallus cDNA의 WL/RJ 프랩된(phraped) EST인 콘티그2997 및 콘티그2904였다. TC106523 (포스듀신-유사 2), TC234861, 및 TC258629 (GTPase 활성화 단백질; GAB-결합된 CDC42)는 잠정적 주석(tentative annotation)에 주어진 단백질들과 80% 이상의 유사성을 가지고 있었다 (표 3a 내지 표 3c)).

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
배아 6일령부터 25주령	TC99039	UP\|Q8UWJ6_CHICK (Q8UWJ6) CDH1-C, 완전
	TC100290	UP\|Q6GPD0_XENLA (Q6GPD0) MGC80493 단백질과 유사, 부분 17%
	TC100743	UP\|SMD3_HUMAN (P62318) 작은 핵 리보뉴클레오단백질 Sm D3 (snRNP 코어 단백질 D3) (Sm-D3), 완전
	TC106133	GB\|AAB53118.1\|886302\|MSGDNAB 헬리카제 {Mycobacterium leprae} (exp=0; wgp=1; cg=0)와 약하게 유사, 부분 9%
	TC110609	RF\|NP_001025744.1\|71895537\|NM_001030573 디네인(dynein), 세포질상, 빛 매개 폴리펩타이드(light intermediate polypeptide) 2 {Gallus gallus} (exp=-1; wgp=0; cg=0)와 유사, 부분 65%
	TC111250	UP\|EWS_MOUSE (Q61545) RNA-결합 단백질 EWS와 유사, 부분 4%
	TC115070	UP\|Q73UV7_MYCPA (Q73UV7) PknJ와 유사, 부분 5%
	TC116212	UP\|Q2IP23_ANADE (Q2IP23) 2-옥소글루타레이트 탈수소효소, E2 컴포넌트, 디하이드로리포아미드 숙시닐트랜스퍼라아제와 유사, 부분 5%
	TC117325	(Q9U9B0) Gias 단백질과 유사, 부분 1%
	TC118014	UP\|Q2XNU2_ASPOF (Q2XNU2) 프롤린-다량 단백질 호모로그, 부분 8%
	TC118135	TIGR G. gallus 유전자 인덱스에 데이터 없음
	TC136220	(Q9HSA5) 피루베이트 키나아제와 유사, 부분 3%
	TC137326	UP\|Q5BJ81_XENTR (Q5BJ81) Rtdr1-prov 단백질 (절편)과 약하게 유사, 부분 33%
	TC137470	가설 단백질 XP_423743 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 43%
	TC139606	시냅토네말 복합체 단백질 2 (SCP-2 단백질)유사한 단백질과 약하게 유사, 부분 2%
	TC140434	UP\|Q91VB7_MOUSE (Q91VB7) FK506 결합 단백질과 유사, 부분 63%
	TC140481	UP\|Q7Z7C7_HUMAN (Q7Z7C7) STRA8와 유사, 부분 19%
	TC228489	콘티그2904 WL/RJ프랍된(Phraped) ESTs Gallus gallus cDNA 5'

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
배아 6일령부터 25주령	TC234861	rac GTP아제 활성화 단백질; GAB-연관 CDC42 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)와 유사한 단백질과 유사, 부분 93%
	TC255207	가설 단백질 XP_418330 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 완전
	TC258629	rac GTP아제 활성화 단백질; GAB-연관 CDC42 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)와 유사한 단백질과 유사, 부분 80%
	TC264315	GB\|AAA37425.1\|192641\|MUSCNCG cGMP-게이트 양이온 채널 단백질 {Mus musculus} (exp=-1; wgp=0; cg=0)와 유사, 부분 7%
	TC302089	rac GTP아제 활성화 단백질; GAB-연관 CDC42 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)와 유사한 호모로그, 부분 53%
4주령 및 25주령	TC100295	TIGR G. gallus 유전자 인덱스에 데이터 없음
	TC100950	RF\|NP_001008470.1\|56605954\|NM_001008470 CD82 항체 {Gallus gallus} (exp=-1; wgp=0; cg=0)호모로그, 부분 66%
	TC103778	UP\|Q6INE4_XENLA (Q6INE4) MGC83220 단백질과 유사, 부분 60%
	TC106523	UP\|Q9WUP3_MOUSE (Q9WUP3) PDCL2 (절편)와 유사, 부분 94%
	TC107637	UP\|SYPL1_HUMAN (Q16563) 시냅토피신-유사 단백질 1 (판토피신)와 약하게 유사, 부분 64%
	TC114028	(Q95K25) 가설 단백질과 유사, 부분 8%
	TC115014	UP\|Q7SB00_NEUCR (Q7SB00) 예측된 단백질, 부분 3%
	TC117476	UP\|Q8NEP0_HUMAN (Q8NEP0) TSGA10 단백질과 약하게 유사, 부분 47%
	TC118103	SWI/SNF 복합체 170KDa 단위체 {Homo sapiens} (exp=1; wgp=0; cg=0)와 유사, 부분 1%
	TC118133	열충격 전사 인자 Y-linked와 유사한 호모로그, 부분 53%
	TC118395	UP\|Q96PK9_HUMAN (Q96PK9) 음이온 수송체/교환체-9와 약하게 유사, 부분 6%
	TC118919	UP\|Q2VUB9_HORVD (Q2VUB9) HvCBF10A와 유사, 부분 5%

발현된 시간	TC 번호	잠정적 주석
4주령 및 25주령	TC119894	UP\|Q2DZ27_ACICE (Q2DZ27) NADPH-의존성 F420 환원효소와 유사, 부분 8%
	TC120389	(Q474D9) 일반 기질 수송체: 주 촉진자(Major facilitator) 슈퍼패밀리 MFS_1와 유사, 부분 3%
	TC121831	콘티그2997 WL/RJ 프랩드(Phraped) ESTs Gallus gallus cDNA 5'
	TC130004	UP\|Q8UZE3_9GAMA (Q8UZE3) BVRF2와 유사, 부분 3%
	TC131106	UP\|ACHA3_CARAU (P18845) 신경세포 아세틸콜린 수용체 단백질, α-3 단위체 전구체 (GF-α-3)와 유사, 부분 4%
	TC132150	염색체 14번 열린 해독틀 54 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)와 유사, 부분 42%
	TC134498	UP\|Q6Z5Z0_ORYSA (Q6Z5Z0) 아미노트랜스퍼라아제-유사 단백질과 유사 , 부분 5%
	TC138586	C10ORF6 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)호모로그와 유사, 부분 6%
	TC138739	UP\|FBRL_CANGA (Q6FN88) 피브릴라린(Fibrillarin)와 약하게 유사 , 부분 8%
	TC139251	UP\|Q212G2_RHOPA (Q212G2) 펩티다아제 C14, 카스파아제 효소 단위체 p20 전구체와 약하게 유사, 부분 3%
	TC140060	가설 단백질 XP_429858 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0), 부분 14%
	TC234505	UP\|H2A2_TETPY (P02274) 히스톤 H2A.2와 유사, 부분 35%
	TC235419	카복시펩티다아제 A2 전구체 {Gallus gallus} (exp=1; wgp=0; cg=0)와 유사, 부분 23%
	TC243294	가설 단백질 XP_419030 {Gallus gallus} (exp=0; wgp=1; cg=0)와 호모로그, 부분 61%
	TC253128	UP\|FA40B_MOUSE (Q8C9H6) 단백질 FAM40B와 호모로그, 부분 32%
	TC275501	UP\|Q28GC4_XENTR (Q28GC4) 포크헤드 박스(Forkhead box) H1와 호모로그, 부분 4%
	TC284738	UP\|Q8NEG2_HUMAN (Q8NEG2) LOC136288 단백질(절편)과 유사 , 부분 20%

성 발생 과정에서 성체 정소-특이적 TC 시퀀스의 qRT - PCR 확인

상기 RT-PCR 결과에 기초하여, 12개의 성체 정소-특이적인 TC 시퀀스(TC113009, TC113702, TC116690, TC117377, TC119769, TC120901, TC130453, TC137350, TC139858, TC244139, TC249072 및 TC262314)를 qRT-PCR 및 in situ 혼성화 방법으로 더 확인하였다.

qRT-PCR은 배아 6일령 및 12일령의 웅성의 생식기, 부화한지 1일, 4주 및 12주령 닭의 정소, 25주령 닭의 정소, 뇌, 신장, 간, 비장, 골격 근육 및 난소에서 12개의 성체 정소-특이적 TC 시퀀스의 생식세포 특이적 발현을 확인하기 위해 수행하였다. 각 TC 시퀀스의 발현 레벨에 대한 상대적인 양은 닭의 β-액틴으로 표준화하였다. 25주령 닭의 정소에서 모든 12개의 TC 시퀀스들은 β-액틴과 비교할 때 상당히 상향 조절되었다(도 2). TC116690, TC130453, TC262314, TC119769, TC137350 및 TC139858의 상대적 발현 수준은 qRT-PCR 결과 25주령 닭의 정소에서 배타적으로 발견되었다. TC113009, TC249072, TC113702, TC117377 및 TC244139는 실험한 모든 조직에서 발현되었다. 그러나, 발현 수준은 다른 조직에 비해 25주령 닭의 정소에서 상당히 높았다. 게다가, TC 시퀀스들은 다른 조직들과 비교할 때 25주령 닭의 정소보다 이른 정소 발생과정에서 낮은 수준으로 거의 발현되지 않았다. TC120901는 4주령 닭의 정소에서 발현되었고, TC137350는 1일령 또는 4주령 닭의 정소에서 발현되었다. TC130453 및 TC262314의 발현 수준은 실험한 다른 모든 TC 시퀀스에 비해 매우 높았다. TC113009의 발현은 25주령 닭의 정소에서 상당히 상향 조절되었지만, 발현 수준은 다른 TC 시퀀스들에 비해서 매우 낮았다(도 2). 정량 데이터를 조사한 후에, 각 TC 시퀀스-특이적 qRT-PCR 생성물은 젤 전기 영동을 통해서 확인하였다.

성체 정소-특이적 TC 시퀀스를 코딩하는 mRNA 의 발현

특정 세포 타입에서의 발현을 결정하기 위해 성체 닭 정소에서 in situ 혼성화 방법을 이용하여 12개의 성체 정소-특이적인 TC 시퀀스를 코딩하는 mRNA의 발현을 조사하였다. 정소세관의 관강(adluminal) 부분에서 모든 12개의 TC 시퀀스들이 상향 조절되었다. 6개의 TC 시퀀스의 mRNA(TC113009, TC116690, TC120901, TC130453, TC249072 및 TC262314)가 원형정세포(round spermatid), 신장된/신장하는 정세포(elongating/elongated spermatid) 및 정모세포의 세포질에서 음성 대조군과 비교했을 때 더욱 강하게 발현되었다(도 3). 특히, 정자 방출의 마지막 단계까지 후-감수분열 I 정모세포(즉, 2차 정모세포)에서 mRNA 발현이 발견되었다. 게다가, TC116690 및 TC262314의 mRNA 발현은 신장된 정모세포에서보다 정모세포 및 원형정세포에서 더 높았다. TC130453 및 TC113009의 발현 레벨은 다른 TC 시퀀스보다 높았다.

정모세포 및 정세포의 세포질에서 6개 TC 시퀀스의 서로 다른 발현을 볼 수 있었다(도 4). TC113702 및 TC119769는 제 2 정모세포에서 강하게 발현되었다. 제 2 정모세포가 분화 단계를 거치면, 발현은 줄어들었다. 원형 및 신장된 정세포는 약한 mRNA 시그널을 보였다. 또한, TC117377, TC139858 및 TC244139의 발현도 제 2 정모세포에서 강하게 나타났다. 반면, 원형 및 신장된 정세포에서는 이 mRNA가 거의 발현되지 않거나 전혀 발현되지 않았다. TC137350의 mRNA는 원형 및 신장된 정세포에서 강하게 발현되었다. 12개의 선택된 TC 시퀀스 전세사기(preleptotene)부터 말기(telophase) 정모세포에서 전혀 발현되지 않았다. 세르톨리(Sertoli) 세포 또는 정원세포의 기저 부분에서는 발현이 없었다. 기저막 및 레이딕(Leydig)의 세포 사이 조직에서도 mRNA가 발현되지 않았다.

성체 정소-특이적 TC 시퀀스에서 염색체 위치, 길이 및 어셈블된 ESTs / ETs 의 포지션

TC 시퀀스에서 어셈블된 ESTs/ETs는 TIGR G. gallus 라이브러리로부터 업데이트 되었다. 12개의 성체 정소-특이적 TC 시퀀스 중에서, TC120901 및 TC130453 가 ESTs/ETs로 더욱 어셈블 되었다. 총 56개의 5' ESTs가 12개의 TC 시퀀스로 어셈블 되었으며, 그 중 43개의 ESTs가 센스 가닥에서, 13개의 ESTs가 안티센스 가닥에서 발견되었다. 오직 2개의 ETs만이 선택된 TC 시퀀스의 센스 가닥에서 어셈블 되었다(표 4). 게다가, 상향 조절된 TC 시퀀스의 ESTs/ETs를 나타내는 36,793 염기가 어셈블리를 위한 ESTs/ETs에서 중복성(redundancy)을 줄이기 위해 표준화를 한 후 11,697 염기(32%)로 줄었다. TC120901는 어셈블 된 TC 시퀀스들 중에서 대부분의 염기(18%)를 포함하였다(표 4).

서열 번호	TC 번호	각 TC에서 발견한 ESTs/ETs의 총 개수^a	각 TC에서 발견한 ESTs/ETs의 총 길이(염기)	각 어셈블된 TC의 길이(염기)
제1서열	TC113009	4	2,120(258+821+424+617)	987
제2서열	TC116690	3	1,925	1,127
제3서열	TC120901	13	9,768	2,143
제4서열	TC130453	13	7,231	807
제5서열	TC249072	2	1,791	943
제6서열	TC262314	3	1,669	629
제7서열	TC113702	5	3,024	1,240
제8서열	TC117377	3	1,931	894
제9서열	TC119769	2	1,194	594
제10서열	TC137350	4	2,476	772
제11서열	TC139858	2	920	714
제12서열	TC244139	4	2,744	847

^a모든 TCs에서 발견한 ESTs는 5' ESTs이다; 단지 2개의 ETs가 TC120901에서 별견되었으며, TC130453의 ESTs는 안티센스 가닥에서 발견되었다.

상염색체 및 성염색체에 할당된 TC 시퀀스(ESTs)를 결정하기 위하여 TC 시퀀스의 염색체 번호를 TIGR G. gallus 라이브러리로부터 업데이트 하였다. TC120901 및 TC130453는 1번 염색체 상에 존재하였고, TC116690 및 TC119769는 3번 염색체 상에, TC262314 및 TC139858는 4번 염색체 상에, TC113009 및 TC117377은 13번 염색체 상에 존재하였으며, TC244139는 28번 염색체 상에 존재하였다. 3개의 TC 시퀀스(TC249072, TC113702 및 TC137350)의 염색체 상 위치는 결정되지 않았다(표 5). 성염색체 상에서는 TC 시퀀스가 발견되지 않았다.

서열 번호	TC 번호	염색체 번호	매치된 단백질	E-value 컷오프	기능적 도메인	매치된 단백질의 생식 과정에서의 기능
제1서열	TC113009	13번	헥소키나아제 2(Gallus gallus)	2e-44	헥소키나아제 2	감수분열 및 정자변형 동안에 포도당 흡수 및 에너지 제공
제2서열	TC116690	3번_랜덤	KIAA1640/ 40을 포함한 코일드-코일 도메인(Gallus gallus)	0.0	역치이상의 히트 수치 없음	-
제3서열	TC120901	1번	포스포리파아제 C, 제타(Gallus gallus)	0.0	EF-hand, PLC-X, PLC-Y 및 C2	칼슘이온 변동의 유발 및 에그(egg) 활성화
제4서열	TC130453	1번	혈청학적으로 정의된 결장암 항원 3(Gallus gallus)	2e-105	역치이상의 히트 수치 없음	-
제5서열	TC249072	모름	가설 단백질(Gallus gallus)	1e-98	역치이상의 히트 수치 없음	-
제6서열	TC262314	4번	유사성 없음	-	-	-
제7서열	TC113702	모름	가설 단백질(Gallus gallus)	7e-105	역치이상의 히트 수치 없음	-
제8서열	TC117377	13번	가설 단백질(Gallus gallus)	6e-77	역치이상의 히트 수치 없음	-
제9서열	TC119769	3번	가설 단백질(Gallus gallus)	1e-74	역치이상의 히트 수치 없음	-
제10서열	TC137350	모름	정자생성 연관 19(Bos taurus)	0.11	역치이상의 히트 수치 없음	정자의 중간 조각에서미토콘드리아를 어셈블리
제11서열	TC13985	4번	가설 단백질(Gallus gallus)	3e-6	역치이상의 히트 수치 없음	-
제12서열	TC244139	28번	유사성 없음	-	-	-

성체 정소-특이적인 TC 시퀀스의 매치된 단백질 및 기능적 도메인

12개의 성체 정소-특이적인 TC 시퀀스의 매치된 단백질 및 기능적 도메인은 NCBI BLASTX를 이용하여 비-중복 단백질 시퀀스, Pfam-A 패밀리 매트릭스 및 NCBI의 보존된 도메인 데이터베이스에 대하여 결정하였다. 데이터는 가장 높은 히트 및 E-value 컷오프에 기초하여 제시하였다(표 5). TC120901는 잘 알려진 단백질인 닭의 PLCZ1 및 그것의 활성 도메인들인 EF-hand, PLC-X, PLC-Y 및 C2와 가장 높은 히트 수치를 보였다(E-value 0.0). TC116690는 KIAA1640 단백질과 유사한 호모로그(homolog)와 가장 높은 수치를 보였다(E-value 0.0). TC113009는 헥소키나아제 2 단백질 및 G. gallus의 도메인과 낮은 히트를 나타냈으며(E-value 2e-44), TC130453 는 혈청학적으로 정의된 결장(colon) 암 항원 3(G. gallus, E-value 2e-105)와 상당한 히트 수치를 보였으며, TC137350는 정자생성연관 단백질 19(Bos tautus)과 높은 히트 수치를 나타냈다. 다른 상향 조절되는 TC 시퀀스들(TC249072, TC113702, TC117377, TC119769 및 TC139858)은 실험적 증거가 없는 가설 단백질들로 확인되었다. TC262314 또는 TC244139에서는 어떠한 단백질 또는 단백질 도메인 유사성이 발견되지 않았다(표 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 닭에서 성 발생 과정 중에 새로운 전사체의 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다. 양성 TC 시퀀스들 중에 배아 12주령에서 25주령까지 정소 발생 동안에 85개가 특이적으로 발현되었지만, 43개의 후보 TC 시퀀스들은 25주령 닭의 정소에서만 상향 조절되었다(A). 성 발생의 서로 다른 단계에서 다른 52개의 양성 TC 시 퀀스들이 정소 및 난소에서 모두 발현되었다(B).

도 2는 정소의 성 발생 과정 동안 및 비생식 조직에서 TC 시퀀스의 qRT-PCR 확인을 한 것이다. RT-PCR에 의해 확인된 성체 정소에서 상향 조절된 선택된 TC 시퀀스의 발현은 독립적으로 qRT-PCR에 의해 확인하였다. 각 TC 시퀀스의 역치 주기는 내인성 하우스키핑 유전자인 닭의 β-액틴으로 표준화하였다. 각각의 TC 시퀀스의 발현에 대한 상대적인 수치화는 2^-ΔΔ ^C _t 방법을 이용하여 계산하였다. y축의 값은 TC 시퀀스/β-액틴의 상대적인 발현이다. 각 바는 3번의 독립적인 실험의 ± SEM 값을 의미한다.

도 3은 성체 닭의 정소에서 TC113009, TC116690, TC120901, TC130453, TC249072 및 TC262314의 in situ 혼성화 결과를 보여준다. 모든 TC 시퀀스들은 제 2 정모세포 및 반수체 정세포에서 강하게 발현되었다. 레이딕(Leydig)의 기저 부분 및 세포 사이 조직에서는 발현되지 않았다. Lu - 루멘; Ss - 제 2 정모세포; Rs - 원형 정세포; Es - 신장된 정세포; Bm - 기저막; L - 레이딕 세포. 기본 배율: 센스 및 안티센스(중간 패널)는 x100 이고; 오른쪽 패널에서 안티센스는 x400 이다.

도 4는 성체 닭의 정소에서 TC113702, TC117377, TC119769, TC137350, TC139858 및 TC244139의 in situ 혼성화 결과를 보여준다. 모든 TC 시퀀스들은 제 2 정모세포 및 반수체 정세포에서 서로 다르게 발현되었다. Lu - 루멘; Ss - 제 2 정모세포; Rs - 원형 정세포; Es - 신장된 정세포; Bm - 기저막; L - 레이딕 세포. 기본 배율: 센스 및 안티센스(중간 패널)는 x100 이고; 오른쪽 패널에서 안티센스는 x400 이다.

<110> HAN, Jae Yong DEIVENDRAN, Rengaraj <120> Male Germ Cell-Specific Nucleotide Sequences <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 1 ctgttgccga ggtaacggcg agcggcgtta gcaaccgccc tccccccgtt cggctccatc 60 agcgccgccg gacccccgcc atgcccggcc cccgagagcg cggtgccccc gcccgcggct 120 ccaacgcttt cccgtggcgg ggggtgggcc ccgagcagag gggccggctg ccccccgtgc 180 ccgccctgaa tcgggccccg gggagcctcc agctgggagc tcaggacagg ggtccctcct 240 gcacgccggt gcagcgggcg ctgctggcgc tcaccccgac gctggagaag ctgcaggagg 300 tgaagggccg cgtgctggag gccctggagc gggggctgag ccagcagagc cgcgcgcgtt 360 ccaccatgca gatgctgccc accttcatct gctccacgcc cgacggcacc gagaacggcg 420 acgtgctggt ggcggagctg tgccagaacc acgtccgcac cctctgggtt accctcgcgg 480 gcgacggaaa ccagaaccca cagctgatgt accgcgtctt tgagacgccg ggggacgtcc 540 tgcagggctc cggggaagcg ctctttgact tcatcgcaca atgcgtgaag agtttcctgg 600 aggaaatcgg caaccctcag caccgcctgc ccctgggctt cgtcttcccg ttcagctgca 660 ggcagacggg gctggacaag gcggaactca tctcctggtc 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ccaagttcca gaactagcac tgatacgctt ctgcgtacaa 1920 gatgagatct ctctggttgc aaatgatttc ctcggtcaat acactttacc actgttgagt 1980 ttgagtaaag gttactgtac tgttccgctg ttttccaaat ctggtggcaa acttgaacct 2040 gcatctctgt ttgtgtatgt ctggtactac taataatgct ccgcaacagt tgtcattctg 2100 gtgactcaca ccccactcaa taaagcaaca tcacttggca tgc 2143 <210> 4 <211> 807 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 4 agcgagggga cctcccgggt ctccaatgga ctcctcgtgc cacttgtgag gctctgctcc 60 cctggcgtgc tccaggctgg agaggtgtgg gtcgctggtt tgggcccaca gggaagacaa 120 gtctgtcccc acgtgtttac ccgtgccatg ctggtaggag tcataggaac atggtgacac 180 gttggcagct cgagacgtgt gtttcctttg gtgcacaggg aggtggtagg tcctggtcca 240 gccactgtcc tcctcctcga atggggtggc ggacatctcc gtgtctttgt aaaatggttc 300 ctcaaactcc tgagcattct ctttgagctc caacgcgtgc cttgccaacc ttttggcgta 360 tattctgttt ttctctccgt catctttcac catgcaaggg tgcccgggct caaatgagaa 420 ctcagcatct cccagctgag tgtcacccaa actcatgcat ggtggtggag gatgtgccaa 480 gggacaggtg taactgaact cctcgtggtc gttgtcatca tcatcatcat cctcctcttc 540 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cgttcagtga gtcattggaa 420 cgctccttct tccagcccca gctcaagagc tgctcttaac aagcgcaaaa atcatttgtg 480 atagcgcaca ggctgagcaa caacagccag gaggagaaca ttaactgtat tgcgctctgt 540 ttcactgctg cagactccca gaaacaccac ctgctgggat actctgatga gaattctgcc 600 gaagtgtctg aataaaggaa ataaccctc 629 <210> 7 <211> 1240 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 7 ccgaggctgt gcagcactgc agtcccgcga ggatcgcaga gcaggcgagt ggggaagagg 60 tgcttgtgtc ctgggaggag agcaagctgt tccctgtgtc tgtcactgga gtgaaggtgc 120 caaaatgctg gcccagctgg gcaggcaacg cgctgccgaa gagaggggaa ggaggactcc 180 tgtcctgctt ctagcagtcc tttctgctgg agccttcctc tggataatgg caacttggaa 240 aaccaatgtc ctgcaggtgt cagcaggacc tgtgcatgag ctcccgtgtc tggggaactc 300 accgctctgc ctggagctga aaatgaaaac tattcagttc tcggccagaa aggacctcat 360 tctagatgcc gtgtttcaca gcctgaaaga caatgggatc gacggattga agagagagga 420 aattctgcag ctgacaagag aggcagttga gaaggtgatg aaacactaca cctggctgcc 480 cagttgggct ctaaaaacca tgggtgccac tattgatgtg gagaggacat ccaagagtta 540 tggggggaac cgctggcttt ctccattctt 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gctgggcggg gtgatgcgga 300 ggatgaggct gacacaccac ccggggagat acctggacaa cacgtggaag gtccctcttc 360 gtgcacagga gggggaaggc tcaggccagg tgatccagcg tgtccgtcgc tcctggctgg 420 cggactacct gggcgacgtg tggtttcact tctcggagag cttccccatc gccgtcctgt 480 acatcttccc cgtcaccgtg ctgatcctgc tcttcctctg ctgcttcacg gtaggtatgg 540 agtgaggcga cctggaggac tctgagagaa gcagcgtggc tacactgaga gagattctgg 600 tgcctcgatg gagctcagct cagagaagcc tccgaaactc caggagcccc gaagcggtgt 660 ggaaggccag gagcaaacca cctttctctt cctttcagat gattttaaag attc 714 <210> 12 <211> 847 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 12 ccccatggaa gcacacggtg cgctctctag tcacctgctg cactgctaaa gcaggagtaa 60 agaacccata tcagtccagc catgcctcta tcatcaaacc caaccagctg ggcacacgca 120 cagccgacgt gtgaggaagt cagatcagtg tatggagtgt acggtttaac caaacacact 180 tggtagcaat ctaggtagca gagatgcttg cttcccacca tcagcaaagg aaacagcact 240 acagcttcac catattgcct ctgaggtgga gcagagatgt ttccagcaag gtgaggcaga 300 gccatgctgc tcatgctggc agtgaggccg aagcagagcc ctgtgctaag cagtagtggt 360 ggcagtgggg ctgagcagtg ctgatggtga tggtaccact cagagaggag caacgggaat 420 gctgtgctga tggcgtgctg gcacttctgg gtccaagcag gaacacctga atcagacagc 480 tcagagatcc catccacaaa gcaccacctg gaccccccca ccttgcactt ccatcccctg 540 acacaacatt acaacacagg cacacgagag cagaggagca ctgcactgtg ttccagcccc 600 cggcgcagag ctgtgaaggc acagcgttgg aacgagctgt gctttttgcc tgctccgtac 660 atatgttttt gttgctacaa aaaggcttgc ttgggattgg tgccaaacgt gaagtaagtg 720 cttcagcagg tgctggtctc tcctaaggaa cctcctataa agcatgctgg gctgggggag 780 tgcttcatgt cctcagtacg tacccagcac aacgtaacgg ggcaggtcac caccatttcg 840 ccttcct 847

Claims

서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 동물의 웅성 생식세포의 동정용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 동물은 포유동물 또는 조류 동물인 것을 특징으로 하는 동물의 웅성 생식세포의 동정용 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 동물은 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위, 꿩 또는 비둘기인 것을 특징으로 하는 동물의 웅성 생식세포의 동정용 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 동물은 닭인 것을 특징으로 하는 동물의 웅성 생식세포의 동정용 키트.
다음의 단계를 포함하는 동물의 웅성 생식세포의 동정 방법:

(a) 서열번호 제2서열, 제5서열, 제6서열, 제10서열 및 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편과 분석하고자 하는 세포로부터 수득한 DNA 또는 그들의 단편을 혼성화 반응을 실시하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서의 혼성화 여부를 확인하는 단계.
제 5 항에 있어서, 상기 동물은 포유동물 또는 조류 동물인 것을 특징으로 하는 동물의 웅성 생식세포의 동정 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 동물은 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위, 꿩 또는 비둘기인 것을 특징으로 하는 동물의 웅성 생식세포의 동정 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 동물은 닭인 것을 특징으로 하는 동물의 웅성 생식세포의 동정 방법.