JP2002065299A

JP2002065299A - 同時多項目多検体検査法

Info

Publication number: JP2002065299A
Application number: JP2000263505A
Authority: JP
Inventors: Nobuko Yamamoto; 伸子山本; Hisashi Okamoto; 尚志岡本; Tomohiro Suzuki; 智博鈴木; Suguru Shimizu; 英清水
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-08-31
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2002-03-05

Abstract

(57)【要約】【課題】多検体について同時に多項目検査することを
目的とし、異なる性質、起源を持つ生物試料の結合した
マトリクス基板を作製し、さらにそれぞれのマトリクス
上に、異なる配列のオリゴヌクレオチド、蛋白質、薬剤
をアレイ上にスポッテイングすることにより多検体を同
時に多項目検査する方法を提供すること。【解決手段】基板上の予め規定された領域内の全面
に、例えば検体生物試料である第１番目の試料を固定
し、この領域に、この試料との反応性を検査する第２番
目以降の異なる試薬からなる試料をそれぞれ独立のスポ
ットとして付与して、各試料間での反応性を検定するこ
とで、検体生物試料の多項目検査を効率良く同時検定す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多検体について同
時に多項目検査することを目的とし、異なる性質、起源
を持つ生物試料の結合したマトリクス基板を作製し、さ
らにそれぞれのマトリクス上に、異なる配列のオリゴヌ
クレオチド、蛋白質、薬剤をアレイ上にスポッテイング
することにより多検体を同時に多項目検査する方法を提
供するものである。

【０００２】

【従来の技術】核酸の塩基配列の決定やサンプル中の標
的核酸の検出、各種細菌の同定を迅速、正確に行いうる
技術のひとつとして、例えば該標的核酸と特異的に結合
し得る物質、いわゆるプローブを固相上に多数並べたプ
ローブアレイの使用が提案されている。

【０００３】このようなプローブアレイの一般的な製造
方法としては、例えば、ヨーロッパ特許第３７３２０３
号公報（ＥＰ０３７３２０３Ｂ１）に記載されているよ
うに、固相上で核酸プローブを合成していく方法や、あ
らかじめ合成した核酸プローブを固相上に供給する方法
等が知られている。前者の方法が開示されている先行技
術としては、例えば米国特許第５４０５７８３号公報
（ＵＳＰ５４０５７８３）が挙げられる。

【０００４】また、後者の方法としては、例えば、米国
特許第５６０１９８０号公報（ＵＳＰ５６０１９８０）
や「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２７０巻、４
６７頁、（１９９５）にはマイクロピペッテイングを用
いてｃＤＮＡをアレイ状に並べる方法が開示されてい
る。

【０００５】これらの方法では、核酸プローブを固相に
１インチ角当たり１００００以上の核酸プローブが高密
度で並べてある。このような高密度ＤＮＡアレイは、少
量のサンプルで同時に多項目の検査ができ、被験者から
のサンプル採取に伴う負担が少ないという利点がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記高密度ＤＮＡアレ
イを基板上の合成法により作製する方法として、フォト
リソグラフィーの技術を用いた方法が前述の米国特許第
５４０５７８３号広報で開示されているが、この方法を
行うには高度な設備が必要であり、誰もが簡単に作製で
きるものではない。また、必要とされる検査項目がそれ
はど多くなく検体の数が多い場合、ＤＮＡアレイ上への
ＤＮＡプローブの集積度はそれほど高い必要はない。む
しろ、より簡便に所望のＤＮＡプローブを固定したＤＮ
Ａアレイが必要な場合がある。

【０００７】例えば、臨床検査の領域に於いても１００
００を越える項目の検査が必ずしも必要とはいえない。
集団検診の場合のように、ある項目に絞って多数の検体
を調べることが重要なこともある。このような場合に
は、標準試料との比較例より多数の検体について病気の
有無を迅速に検査できるシステムが必要である。

【０００８】さらに、合成可能なオリゴヌクレオチドに
比べて検体ＤＮＡ量が少ないのが一般的である。通常行
われているハイブリダイゼーション反応のように、ＤＮ
Ａアレイ基板を検体溶液に浸す形態の反応には基板が充
分浸るだけの検体ＤＮＡが必要となる。そのために、Ｄ
ＮＡアレイ基板の大きさに制限が生じ、高密度化が必要
となる。或いは、溶液の容量を確保するために、溶媒で
希釈して検体溶液の濃度を低くし、反応時間を長くする
といった方法が採られる。

【０００９】また、検体は組織からの分離あるいは抽出
物であるためサンプル量に限りがあること、さらにハイ
ブリダイゼーション反応に用いる前処理（核酸の抽出の
みならず、一本鎖化、標識化の処理が加わる）を経るた
め、得られるサンプル量が更に少くなる。そのために、
最近では、ＰＣＲ処理のような増幅処理を経てから検査
や研究に用いられるようになった。しかし、ＰＣＲ反応
を行うということは、プライマーを必要とするために特
定の遺伝子についての検討しか行い得ないという欠点が
ある。さらに、ＰＣＲ反応の過程で増幅されやすい配列
とされにくい配列とがあり、反応の効率は一律ではな
い。従って、抽出した総ｍＲＮＡにおける特定のｍＲＮ
Ａの含量を調べ、病気等の判定を行うためには、常に基
準となるサンプルを準備する必要がある。

【００１０】小さくすればするほど必要な検体溶液の量
は減少するが、基板の最小化にはその取扱い性の点から
物理的な限界がある。要するに、高密度化を行ったり、
プローブ数を減らして基板の大きさを小さくすることは
可能であるが、ハイブリダイゼーション反応及びその検
出等の処理過程で、あまりにも小さな基板はハンドリン
グのための装置を必要とする点で実用的とはいえない。

【００１１】また、ｃＤＮＡアレイを利用する方法（例
えば上記「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２７０
巻、４６７頁、（１９９５））においては、ある生物の
発生過程でのｃＤＮＡ、ある細胞の培養過程での各フェ
ーズでのｃＤＮＡ等、多種類の検体を並べたＤＮＡアレ
イが用いられる。この方法の場合でも多くの場合、１０
０００種を越えるｃＤＮＡがアレイとして並べられる。
しかし、研究の種類によっては必ずしも１００００種を
同時に調べることが必須というわけではない。それだけ
のｃＤＮＡを抽出する前に数少ないサンプル数で簡便に
検討を行うことも必要である。

【００１２】さらに、この方法では、特定の働きを持つ
配列既知のラベルしたＤＮＡをプローブ溶液ととして反
応させることが常法として行われているが、複数の項目
について調べようとすると、項目の数だけアレイの枚数
を必要とする。これを回避し、同一アレイ上で複数の項
目を検討しようとすると、その数だけ標識に用いる蛍光
試薬の種類が必要になる。それらの蛍光色素は検出時に
区別して検出されなければならないため、その波長等が
異なることが必要であり、また、それぞれに対応した検
出用のフィルターも必要になり、なかなか色素の選定が
困難である。

【００１３】このような多項目多検体同時検査のニーズ
は遺伝子間のハイブリダイゼーション反応に限らない。

【００１４】例えば、遺伝子と蛋白貿との相互作用（Ｄ
ＮＡ結合性蛋白質）、遺伝子に結合する化学物質のスク
リーニング等、遺伝子との相互作用に関してもいくつか
のニーズがある。前者は蛋白質による逸伝子の制御機構
解明等に利用されるが、現状は遺伝子と蛋白質とを結合
させてその後ゲル電気泳動で解析する方法が採られてい
る。この方法によると、一度に解析可能な検体数は限ら
れる。

【００１５】創薬の分野でも遺伝子と薬剤の相互作用を
調べることが重要な項目になる。化学合成品を得ること
はなかなか手間のかかることであり、スクリーニングに
使う量の低減ができるとその効率を著しく向上できると
考えられる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、多検
体について同時に多項目検査、例えば、異なる性質、起
源を持つ生物試料の結合したマトリクス基板を作製し、
さらにそれぞれのマトリクス上に、異なる配列のオリゴ
ヌクレオチド、蛋白質、薬剤をアレイ上にスポッテイン
グすることにより多検体を同時に多項目検査する方法を
提供することにある。

【００１７】本発明の他の目的は、化学物質、特に薬剤
とｃＤＮＡとの相互作用、蛋白質とＣＤＮＡの結合性等
の目的でも同様に多検体を多項目について同時に検査で
きる方法を提供することにある。

【００１８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成し得る本
発明の検査方法は、第１番目の試料と、複数の試料との
反応性を同時に検定する方法であって、第１番目の試料
が全面にわたってあらかじめ結合されている基板上の規
定された領域内に、それぞれ異なる性質を持つ第２番目
〜第２＋ｎ番目（ｎ≧１）の試料を該規定された領域域
よりも小さい領域としてそれぞれ独立に配置し、該第１
の試料と、第２〜第２＋ｎ（ｎ≧１）の試料のそれぞれ
との間の反応性を検定することを特徴とするものであ
る。

【００１９】このような検査方法に利用するのに有用で
ある本発明にかかる生体試料マトリクスは、それぞれ異
なる起源を持つ複数種の生体試料が、基板上に区切られ
たそれぞれのマトリクス上に存在することを特徴とする
ものである。

【００２０】本発明によれば、異なる性質、起源を持つ
生物試料（例えば核酸、蛋白質）をあらかじめマトリク
ス状に結合させた基板を提供することができる。

【００２１】また、その基板のひとつの形態として、あ
らかじめ疎水性化合物によりパターンで区切られたマト
リクス上に、異なる性質、起源を持つ生物試料を結合さ
せた基板、及びその作製方法を提供することができる。

【００２２】また、異なる性質、起源を持つ生物試料が
マトリクス状に配置された上記基板上に、オリゴヌクレ
オチド等のＤＮＡプローブ、ｃＤＮＡ、蛋白質、化学物
質のような別の試料をアレイ状にスポットして反応を行
うことにより、ある特定の生物試料に対する別の試料の
結合の有無、強弱、相互作用の有無を、同時に多項目、
しかも迅速に調べる方法を提供することができる。

【００２３】さらに具体的に説明すると、マトリクス状
に配置された試料がｃＤＮＡの場合には、この基板上に
多種類のオリゴヌクレオチドプロープをアレイ状にスポ
ットしてハイブリダイゼーション反応を行うことによ
り、ある特定のｃＤＮＡに対する各種核酸プローブの相
補性を迅速に調べる方法を提供することになる。また、
スポットする試料が複数種の蛋白質の場合には、特定の
ｃＤＮＡと結合するような蛋白質のスクリーニングが可
能となる。さらに、薬剤の場合には、特定のｃＤＮＡと
相互作用しうる薬剤のスクリーニングが行われることに
なる。

【００２４】この方法では、ひとつの基板上に複数種の
検体が配置されるために、ひとつの検体が占める面積は
極めて小さい。そのため、従来のような膨大な種類のＤ
ＮＡプローブがアレイ状にあらかじめ結合されているＤ
ＮＡアレイを用いてハイブリダイゼーション反応を行う
場合に比べて、必要とされるｃＤＮＡ量が極めて少なく
て良いという利点がある。また、ＤＮＡアレイ基板の大
きさについての制限もなく、取り扱い上の不都合もな
い。

【００２５】また、少ないサンプルでも検査可能な方法
を提供することにより、これまで十分なサンプル量が得
られず、検討できなかった領域、例えば組織から得られ
たｍＲＮＡを直接調べるといった、新しい検査領域に道
を開くものである。

【００２６】さらに、本発明によれば同一基板上で、化
学物質、蛋白質、及び核酸を同時に同じ反応条件で検討
することも可能な方法をも提供することができる。

【００２７】マトリクス状に配置される生物試料がある
特定の蛋白質の場合には、スポットする試料が各種核酸
であれば、特定の蛋白質に結合しうる核酸のスクリーニ
ングになり、蛋白質であれば、蛋白質間の相互作用の検
出になり、薬剤であれば特定蛋白質と結合する薬剤のス
クリーニングになる。

【００２８】どちらの物質をマトリクス状に配置し、ど
の物質をスポット状に配置するかは、それぞれの検討し
たい目的により異なる。また、試料の入手のしやすさも
重要なファクターである。大量に調製が容易な方をマト
リクス状に配する方が擦作上は有効であるが、マトリク
ス状に配置される試料は、基板に化学結合、或いは吸着
により固定されることが必要である。また、固定の過程
での乾燥に耐えられるような試料であることも重要であ
る。揮発性の溶媒にしか溶解されないような薬剤はスポ
ットによるサンプル供給には不向きであるので、マトリ
クス状に供給されるべきである。

【００２９】

【発明の実施の形態】本発明の一形態について以下に図
１を参照して説明する。図１は規定された領域が６４個
形成されている基板面を示すもので、各領域（マトリク
ス）は１ｍｍ×１ｍｍで、領域間の間隔ｘは任意に選択
できる。例えば生物試料結合マトリクス基板の作製方法
としては、基板上の規定された領域の全面に、第１番目
の試料（例えば生物試料）の溶液を、塗布、インクジェ
ット法による「べた塗りパターン」としてプリント、或
いは基板上での化学合成等の方法により供給し、基板上
への吸着、或いは生物試料中に存在する官能基と基板上
にある官能基との化学反応により、基板上にマトリクス
状に結合させる方法が利用できる。なお、規定された領
域全面に第１番目の試料が結合されている状態とは、こ
の規定された領域内に第２番目以降の試料が供給された
際に、該領域内の供給位置に限定されずに、これらの反
応が生じる程度に全面にわたって第１番目の試料が結合
している状態をいう。例えば、第１の試料が層状に全面
に固定されている状態や、第１番目の試料を構成する分
子や塊が、微小な間隔で高密度で全面に分散している状
態でもよい。

【００３０】この基板上の規定された領域は、あらかじ
め基板上に疎水性化合物の壁によりパターン状に仕切ら
れた区画からなるウェルとして設けても良い。

【００３１】また、第１番目の試料として生物試料であ
る核酸（ｃＤＮＡ）が固定された基板を用いて、ｃＤＮ
Ａの中に含まれている可能性のある複数種のプローブＤ
ＮＡを第２番目以降の試料として基板上のｃＤＮＡと接
触させ、該固相上にて該プローブとの反応物を検出して
該ｃＤＮＡ中にプローブＤＮＡ配列の有無を検出する場
合に、各種ｃＤＮＡが規定された領域に結合されている
各マトリクス中に、複数種のプローブを互いに独立した
スポットとしてアレイ状に供給することで、複数種のプ
ローブでの同時検定が可能となる。

【００３２】また、核酸（ｃＤＮＡ）マトリクス上に、
ｃＤＮＡと結合する可能性のある複数種の化学物質或い
は蛋白質を、互いに独立したスポットとして基板上のプ
ローブＤＮＡと接触させることで、これら反応からなる
多項目検査を同時に行なうことができる。このように固
相上にて化学物貿或いは蛋白質とプローブとの結合の有
無を検出することで、ＤＮＡ結合性蛋白質、ＤＮＡ結合
性化学物質を同時に多項目スクリーニングすることがで
きる。

【００３３】本発明は、ｃＤＮＡ等生物試料が塗布され
ているマトリクス上に、プローブＤＮＡ、蛋白質、化学
物質を微少液滴により供給することがその特徴で、異な
る種類の試料をアレイ状に並べることによって、同時多
項目処理を可能とするものである。

【００３４】基板上にあらかじめ固定される第１番目の
試料と、第１番目の試料と反応させる第２番目以降の試
料との組合せとしては以下のものを挙げることができ
る。

【００３５】以下、本発明に用い得る基板上の規定され
た領域からなるマトリクスなどについての具体例を説明
する。（生物試料が結合したマトリクスの形状）マトリクスパ
ターンの形状としては、特に制限はなく、どのような形
状のものでも可能であるが、作成された基板上に検体を
供給するときの利便性から考えると、線形（ライン
状）、正方形、長方形といった形状が、どのような検体
供給に対しても対応可能という点で好ましい。もちろん
円形、楕円形の形状であっても何ら問題は生じない。

【００３６】第１番目の試料として基板に固定する材料
としては、生物由来の未知の塩基配列、ｃＤＮＡライブ
ラリー、ｍＲＮＡライブラリー、複数種のＤＮＡやＲＮ
Ａのセット、合成あるいは生物由来の既知のＤＮＡやＲ
ＮＡ、あるいはこれらのセット、クローン化されたオン
コジーン断片、少なくとも１種の蛋白質を含む生物由来
の蛋白質画分、単一種の蛋白質、既知の異種の蛋白質の
混合物、化学物質などを挙げることはできる。

【００３７】（生物試料が結合したマトリクスの密度）
マトリクスの密度に特に限定はないが、好ましい形態と
しては、１ｃｍ²当たり４００以下であることが好まし
い。４００／ｃｍ²は、その形状が正方形である場合、
ひとつのマトリクスの大きさは５００μｍ角になる。ス
ポットとしてアレイ上に並べる試料を１００μｍの径の
スポットとして並べた場合には、縦横それぞれ５スポッ
ト、計２５スポットとなる。また、試料溶液の径を２０
μｍとした場合には、一列に並べうるスポットの数は２
５になり、総数６２５のスポットを並べることが可能で
ある。

【００３８】（生物試料が結合した基板の作製）生物由
来の試料（生物試料）として挙げられるのは、核酸及び
蛋白質がある。核酸としては、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａがあり、これらを基板上に結合させる方法として、あ
らかじめ抽出精製された核酸を塗布し、吸着或いは静電
結合による固定を行う方法と、核酸が有するアミノ基を
利用した基板上の官能基との化学反応により共有結合す
ることにより固定する方法とがある。

【００３９】ＤＮＡの負の荷電を利用た方法とは、ポリ
リジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなど
のポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合さ
せ、ついで余分な陽イオンをブロッキングする方法で、
一般的に使われる。

【００４０】（固相と核酸の官能基の種類）固定化に利
用する宮能基の組み合わせとしては、例えばエポキシ基
（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端、或いは塩基
中のアミノ基）の組み合わせ等が挙げられる。固相表面
へのエポキシ基の導入は例えばエポキシ基を有するポリ
グリシジルメタクリレートを樹脂からなる固相表面に塗
布したり、エポキシ基を有するシランカップリング剤を
ガラス製の固相表面に塗布してガラスと反応させる方法
等が挙げられる。

【００４１】（固相と蛋白質の結合）蛋白質の基板への
結合方法として、核酸と同様な吸着による方法、静電結
合を利用した方法が挙げられる。さらに共有結合方法と
して上記アミノ基を利用した方法の他に、システイン残
基のＳＨ基を利用した方法が挙げられる。

【００４２】（チオール基を利用した蛋白貿の樹定化方
法）蛋白質の固定にシステイン残基を利用する方法とし
て、マレイミド基とチオール基（−ＳＨ）との組み合わ
せを用いる例が挙げられる。即ち、固相表面がマレイミ
ド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供
給された蛋白質のシステイン残基のチオール基と固相表
面のマレイミド基とが反応して蛋白質を固定化すること
ができる。

【００４３】固相表面のマレイミド基の導入方法として
は、種々の方法が利用できるが、例えばガラス基板にア
ミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ
基と下記構造式で示されるＮ−（６−マレイミドカプロ
イロキシ）スクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄ
ｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を
含む試薬（ＥＭＣＳ試薬：Ｄｏｊｉｎ社製）とを反応さ
せることで可能である。（疎水性マトリクスからなるＤＮＡマトリクス構成）生
物試料固定のさらなる形態は、固相表面上に例えば親水
性及び疎水性のマトリクスからなるウェルを形成し、ス
ポット間の連結を防止するような構成をあらかじめ設
け、そのウェル中にＤＮＡプローブを供給して、結合反
応を行う方法が利用できる。

【００４４】（マトリクス／ウェルの素材）区画された
マトリクス上にプローブ溶液を入れて結合反応を行う場
合、ウェルを構成する部分は親水性でありウェルの壁
面、隣のウェルとの仕切りに相当する部分は、表面がプ
ローブ溶液に対して親和性の低い素材で構成されること
が好ましい。このような処理により、プロープ溶液のウ
ェルヘの供給に当たって多少の位置ずれが生じたとして
も所望のウェルにスムーズにプロープ溶液を供給するこ
とができる。

【００４５】図２に、本態様におけるマトリクスの一例
を示す。図２（Ａ）は平面図であり、図２（Ｂ）はその
ＢＢ断面図である。このマトリクスは固相１０３状に配
置された凹部（ウェル）１２７を形成した枠体構造を有
するマトリクスパターン１２５を設けた横造を有する。
マトリクス１２５（凸部）によって互いに隔離されたウ
ェル１２７は、マトリクスパターン中の貫通孔（くりぬ
き部）として設けられたもので、その側面は凸部からな
り、その底面１２９には固相１０３の表面が露出した状
態にある。固相１０３の表面露出部分は、プローブと結
合可能な表面を形成しており、所定の凹部にプローブが
固定されている。

【００４６】マトリクスパターンを形成する材料として
は、例えば金属（クロム、アルミ、金等）及び樹脂等が
挙げられる。アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリイミド、アクリル酸モノマー、ウレタンアクリ
レート、等の樹脂や、フォトレジスト等の感光性の樹脂
に黒色の染料や黒色の含量を含有させたものが挙げられ
る。感光性樹脂の具体例としては、例えばＵＶレジス
ト、ＤＥＥＰ−ＵＶレジスト、紫外線硬化樹脂等を用い
ることができる。ＵＶレジストとしては、環化ポリイソ
プレンー芳香族ピスアジド系レジスト、フェノール樹脂
−芳香族アジド化合物系レジスト等のネガレジスト、ノ
ボラック樹脂−ジアゾナフトキノン系レジスト等のポジ
レジストを挙げることができる。

【００４７】ＤＥＥＰ−ＵＶレジストとしては、ポジ型
レジストとして、例えば、ポリメチルメタクリレート、
ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフルオロブチルメタ
クリレート、ポリメチルイソプロベニルケトン、及び、
臭化ポリ１−トリメチルシリルプロピン等の放射線分散
型ポリマーレジスト、コール酸ｏ−ニトロベンジルエス
テル等の溶解抑制剤系レジストを挙げることができ、ネ
ガ型レジストとして、ポロビニルフェノール−３−３’
−ジアジドジフェニルスルホン、及び、ポリメタクリル
酸グリシジル等を挙げることができる。

【００４８】紫外線硬化樹脂としては、ベンゾフェノ
ン、及び、その置換誘導体、ベンジル等のオキシム系化
合物等の中から選ばれる、１個、又は２種以上の光重合
開始剤を２〜１０重量％程度含有した、ポリエステルア
クリレート、エポキシアクリレート、及びウレタンジア
クリレート等を挙げることができる。

【００４９】マトリクスを形成する素材による検出時の
反射を抑制するためには、マトリクスパターンを形成す
る素材に遮光性のものを用いると効果的である。そのた
めには上記樹脂に黒色の顔料を加えることが有効であ
り、黒色の顔料としては、カーボンブラックや黒色有機
顔料を用いることができる。

【００５０】ここでマトリクス１２５を樹脂製とした場
合、マトリクス１２５の表面は疎水性となる。この構成
はウェルに供給するプローブを含む溶液として水系の溶
液を用いる場合に好ましいものである。即ちウェルにプ
ローブ溶液が供給されたとしても、所望のウェルにプロ
ーブ溶液が極めてスムーズに供給されることになる。ま
た、同時に隣接するウェル間で、異なる種類のプローブ
を供給した場合でも、これらのウェル間に供給された異
なるプローブ溶液間での混じり合い（クロスコンタミネ
ーション）を防ぐことも可能となる。

【００５１】マトリクスの厚さ（固相表面からの高さ）
は、マトリクスパターンの形成方法やウェルの容量を考
慮して決定されるが、１〜２０μｍとすることが好まし
い。特に、インクジェット法によりプローブ溶液を各ウ
ェルに供給する場合のクロスコンタミネーションを有効
に防止する厚さ領域と考えられる。（スポットする試料
の種類）上記記載の生物試料マトリクス上に液滴として
スポットする試料としては、プローブ核酸、蛋白質、薬
剤等の化学物質が挙げられる。

【００５２】プローブ核酸としては、デオキシリボ核酸
の他、リボ核酸、ベプチド核酸等、核酸塩基を有するも
のならその種類を問わない。オリゴヌクレオチドプロー
ブの長さは、特に限定されないが、ｃＤＮＡとの正確な
ハイブリダイゼーション反応を行わせるためには１０ｍ
ｅｒ以上５０ｍｅｒ以下が好ましい。

【００５３】蛋白質はそれ自体の蛍光を利用して、ＤＮ
Ａ結合性蛋白質の検出を行うことができる。

【００５４】化学物質も、ものによってはそれ自体の蛍
光での検出が可能である。（試料アレィの作製方法）試料洛液を定められた位置に
数十ミクロンから百ミクロンのサイズでスポットする方
法として、ピン方式、インクジェット方式、キャピラリ
ー方式が挙げられる。

【００５５】ピン方式は、ピン先端に試料を、例えば試
料を含む溶液の液面にピン先端を接触させてこれを付着
させてから、その先端を固相へ機械的に接触させること
により試料アレイを作製する方法である。毛細管による
キャピラリー方式は、一度毛細管に吸い上げられた試料
溶液を、ピン方式と同様、毛細管の先端から固相に機械
的に接触させることによりアレイ状に試料溶液を供給す
るものである。このようなスポティング操作には各社か
ら販売されているそれぞれの装置が利用できる。これら
の方法は、どのような試料ＤＮＡでも供給可能であると
いう点で、最も好ましい方法と考えられる。但し、ＤＮ
Ａの長さや濃度により粘度が異なる点が定量性という点
では問題が残る場合がある。蛋白貿に関しても、これら
の方法は分子の大きさや粘度の影響を受けず、また、イ
ンクジェット法のようなせん断力等の物理的な刺激も加
わらずに試料を供給できるという点で好ましいものであ
る。（インクジェット法による試料アレイ製法概略）インク
ジェット法で吐出可能な試料として挙げられるのは、核
酸、蛋白質の他、化学薬品があげられる。

【００５６】インクジェット法ではせん断力が働くため
に、吐出できる核酸の長さ、蛋白質の大きさに制限が加
わる場合が多い。しかし、その定量性は他のピン方式、
キャピラリー方式より優れたものであり、特に化学物質
の吐出に関しては他の方式よりも好適に用いられる。吐
出可能な核酸としては、塩基対長１ｋｂ以下のものであ
り、蛋白貿としては１００Ｋダルトン以下のものに限ら
れる。化学物質に閑してはどのようなものでも吐出可能
である。

【００５７】試料をインクジェットで吐出供給するため
に用いる吐出用の液体としてはインクジェットから吐出
可能であって、かつヘッドから吐出された該液体が所望
の位置に着弾し、さらに核酸プローブとの混合状態、及
び吐出時に於いて該核酸プローブが損傷を受けなければ
いかなる液体でも用いることができる。

【００５８】そしてインクジェット、特にバブルジェッ
ト（登録商標）ヘッドからの吐出性という観点からは、
該液体の特性としては例えば、その粘度が１〜１５ｃｐ
ｓ、表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ以上が好ましい。ま
た、粘度を１〜５ｃｐｓ、表面張力を３０〜５０ｄｙｎ
／ｃｍとした場合、固相上での着弾位置が極めて正確な
ものとなり特に好適に用いられる。

【００５９】したがって、吐出時の核酸の安定性等を考
慮すると、溶液中には例えば２〜１００ｍｅｒ、特には
２〜６０ｍｅｒの核酸プローブを、０．０５〜５００μ
Ｍ、特には２〜５０μＭの濃度で含有させることが好ま
しい。

【００６０】図３は本発明の一実施態様であるバブルジ
ェット法による検体溶液吐出方法の概略説明図である。
図３において１０１は吐出液としての検体を含む溶液を
吐出可能に保持している液体供給系（ノズル）、１０３
は該検体が反応する対象である核酸プローブが結合され
ている固相、１０５はインクジェットヘッドの一種であ
る、該液体に熱エネルギーを付与して吐出させる機能を
備えるバブルジェットヘッドである。１０４はバブルジ
ェットヘッドから吐出された検体を含む液体である。図
４は図３のバブルジェットヘッド１０５のＡ−Ａ線断面
図であり、図４において１０５はバブルジェットヘッ
ド、１０７は吐出されるべき検体溶液を含む液体、そし
て１１７は該液体に吐出エネルギーを付与する発熱部を
有する基板部分である。基板部分１１７は、酸化シリコ
ン等で形成されている保護膜１０９、アルミニウム等で
形成されている電極１１１−１，１１１−２，ニクロム
等で形成されている発熱抵抗体層１１３，蓄熱層１１５
及び放熱性の良好なアルミナ等で形成されている支持体
１１６を含んでいる。

【００６１】検体を含む液体１０７は吐出オリフィス
（吐出口）１１９まできており、所定の圧力によってメ
ニスカス１２１を形成している。ここで電極１１１−
１，１１１−２に電気信号が加わると、１２３で示す領
域（発泡領域）が急激に発熱し、ここに接している液体
１０７が吐出し、固相１０３の表面に向かって飛翔す
る。このような構造を備えるバブルジェットヘッドを用
いて吐出可能な液体の量は、そのノズルのサイズ等によ
って異なるが、例えば４〜５０ピコリットル程度に制御
することが可能であり、高密度に検体プローブを配置さ
せる手段として極めて有効である。

【００６２】そしてインクジェット、特にバブルジェッ
トヘッドからの吐出性という観点からは、該液体の特性
としては例えば、その粘度が１〜１５ｃｐｓ、表面張力
が３０ｄｙｎ／ｃｍ以上が好ましい。また、粘度を１〜
５ｃｐｓ、表面張力を３０〜５０ｄｙｎ／ｃｍとした場
合、固相上での着弾位置が極めて正確なものとなり特に
好適に用いられる。

【００６３】したがって、吐出時の核酸の安定性等を考
慮すると、溶液中には例えば１００〜１００００ｍｅ
ｒ、特には１００〜５０００ｍｅｒの核酸プローブを、
１０μＭ以下、特には１μＭ以下の濃度で含有させるこ
とが好ましい。

【００６４】吐出液の組成としては、上記したように核
酸プローブと混合したとき、及びインクジェットから吐
出されたときに核酸プローブに対して影響を実質的に与
えないものであって、かつインクジェットを用いて固相
に対して正常に吐出可能である条件を満たせば、特に液
体組成を限定するものではないが、例えばグリセリン、
尿素、チオジグリコール又はエチレングリコール、イソ
プロピルアルコール及び下記式で示されるアセチレンア
ルコールを含む液体は好ましいものである。

【００６５】

【化１】

【００６６】（上記式（Ｉ）中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄
はアルキル基、具体的には例えば炭素数１〜４の直鎖状
又は分岐状のアルキル基を表し、ｍ及びｎはそれぞれ整
数を表し、ｍ＝０，ｎ＝０、もしくは１≦ｍ＋ｎ≦３０
であって、ｍ＋ｎ＝１の場合はｍまたはｎは０であ
る。）さらに具体的には尿素を５〜１０重量（ｗｔ）％、グリ
セリンを５〜１０ｗｔ％、チオジグリコールを５〜１０
ｗｔ％、及び上記式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコ
ールを０．０２〜５ｗｔ％、より好ましくは０．５〜１
ｗｔ％を含む液体が好適に用いられる。

【００６７】

【実施例】以下実施例により詳細に説明する。実施例１パターンで区分けされた検体マトリクス基板でのｐ５３
遺伝子の配列解析検体マトリクス用ブラックマトリクス
付きガラス基板を調製する。

【００６８】１．ポリリジンを塗布したブラックマトリ
クス導入基板の作製合成石英からなるガラス基板（６０
ｍｍ×５０ｍｍ）を、２％水酸化ナトリウム水溶液を用
いて超音波洗浄し、次いでＵＶオゾン処理を行って表面
を清浄化する。次に、ポリリジン溶液（ｓｉｇｍａ社
製）をスピンコーターで全面に塗布する。さらに、カー
ボンブラックを含有するＤＥＥＰ−ＵＶレジスト（ブラ
ックマトリクス用ネガ型レジスト）（商品名：ＢＫ−７
３９Ｐ；新日鐵化学株式会社製）をスピンコーターで硬
化後の膜厚が５μｍとなるように塗布し、この基板をホ
ットプレートで８０℃で５分間加熱して硬化させる。Ｄ
ＥＥＰ−ＵＶ露光装置を用いて１ｃｍ×１ｃｍの領域
に、図１における隣接ウェル間の拒離（Ｘ）が１００μ
ｍ、及びウェルの形状が１ｍｍ×１ｍｍの正方形となる
ようにパターニングされたマスクを用いてプロキシミテ
ィ露光し、次いで無機アルカリ水溶液の現像液で、スピ
ン乾燥機を用いて現像し、さらに純水で洗浄して現像液
を完全に除去を行う。

【００６９】次にスピン乾燥機を用いて簡単に乾燥し、
その後クリーンオーブン中で１８０℃で３０分間加熱し
てレジストを本硬化させ、所定の配列でウェルが４００
個配置され、隣接するウェルがブラックマトリクスで隔
離された基板を得る。尚各ウェルの容積は液の厚みを５
μｍとすると、５μｌと計算させる。

【００７０】２．検体ＤＮＡの固定化（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製癌の組織から得られた６４種のｃＤＮＡライブラリーか
らＰＣＲ反応でｐ５３遺伝子を得る。

【００７１】つまり、バイオプシーで採取した各組繊か
らＣａｔｒｉｍｏｘ−１４（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ社）を用いてＲＮＡサンプルを得た。このサンプル溶
液を基に、Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙ
ｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＬｉｆｅＳｃｅｉｎｃｅｓ
社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを得る。（２）ＰＣＲ法によるＴ３結合サイトを持つｐ５３遺伝
子の増幅ｃＤＮＡライブラリーを基にＣＬＯＮＴＥＣＨ社の「Ｈ
ｕｍａｎｐ５３ＡｍｐｌｉｍｅｒＳｅｔ」を用い
てＰＣＲ反応を行う。

【００７２】ＰＣＲ反応溶液として、「ｏｎｅｓｈｏ
ｔＬＡＰＣＲＭｉｘ」（宝洒造）を用いた。ＰＣ
Ｒ反応溶液組成は、ｏｎｅｓｈｏｔＬＡＰＣＲＭｉｘ２５μｌ５’ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１３’ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１ｃＤＮＡライブラリー溶液１ＤＷ２２／５０μｌＰＣＲサイクルは、９５℃で５分間熱変性後、９５℃３
０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルを２９回
行い、最後に７２℃で５分間反応させて４℃で保存す
る。

【００７３】反応後、ゲル電気泳動を行い、３００ｍｅ
ｒ程度の分子量域に産物があることを確認し、Ｍｉｃｒ
ｏＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳ２００（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）で精製してｐ５３遺伝子（ｐ５３ＤＮＡ）を得
る。（３）一本鎖ｐ５３ＤＮＡの合成上記の（２）で得られたＤＮＡを鋳型に、５’プライマ
ー（宝酒造）を用いてＰＣＲ反応により一本鎖標識ＤＮ
Ａを得る。反応溶液は、ｏｎｅｓｈｏｔＬＡＰＣＲＭｉｘ２５μｌ５’ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１Ｐ５３ＤＮＡ１ＤＷ２３／５
０μｌで、反応サイクルは、９６℃で３０秒、６０℃で１５
秒、６０℃で４分を２４回繰り返し、最後に４℃で保存
する。その後ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳ２０
０で精製する。（４）ｐ５３ｃＤＮＡの固定化上記の（３）で得られた一本鎖ＤＮＡ５μｌを顕微鏡下
で上記（１）で作製したブラックマトリクス付きのポリ
リジン塗布基板の各ウェルに注入し、静電結合により固
定する。

【００７４】３．オリゴヌクレオチドプローブによるｐ
５３遺伝子変異の解析６４種のＤＮＡは、癌抑制遺伝子であるｐ５３遭伝子の
２４８番目、２４９番目のアミノ酸配列に注目して選ば
れた。つまり、塩基配列ＣＧＧＡＧＧの中で変異頻度が
高いのは、１番目のＣがＴに、２番目のＡがＧに、そし
て２４９番目のアミノ酸に対応する配列の３番目のＧが
Ｔに変異している場合であることが知られている。そこ
で、この３ヵ所の塩基配列に着目して６４種のプローブ
を設計した。

【００７５】つまり、プローブ全長を１８ｍｅｒとし、
その真ん中にこの変異を含む６塩基を位置させ、その前
後を共通配列で挟んだ構造である。共通配列は、５’末
端からＡＴＧＡＡＣであり、続く変異を含む部分がＮＮ
ＧＡＧＮ、さらにそれに続く共通部分がＣＣＣＡＴＣと
なり、最終的な配列は^5'ＡＴＧＡＡＣＮＮＧＡＧＮＣＣ
ＣＡＴＣ^3'となる。ここで、Ｎと表した部分が４種の核
酸塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに対応する。プローブＤＮ
Ａは、検出したい配列（上記配列）と相補的な配列であ
るので、実際には、^5'ＭＧＧＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡ
Ｔ^3'となる。各プローブ配列の５’末端にローダミンを
結合し標識を施す。この６４種の標識化ＤＮＡプローブ
の具体的な塩基配列は、以下の表１に示すとおりであ
る。

【００７６】

【表１】

【００７７】次に、６４種の標識プローブＤＮＡのそれ
ぞれを、グリセリン、尿素、及びチオジグリコールが最
終濃度７．５％、アセチレノールＥＨが最終濃度１％含
む８μＭの溶液に調製する。ＢＪプリンター用ヘッドＢ
Ｃ６２（キヤノン社製）の６個のノズルのそれぞれに異
なるプローブ溶液を１００μ１ずつ充填した。各ヘッド
あたり６種のＤＮＡが吐出できるようにして２つヘッド
を用い、一度に１２種のＤＮＡを吐出し、ヘッドを６回
交換して、６４種のＤＮＡのそれぞれのスポットが独立
して形成されるように吐出させる。こうして計６４種類
のプローブをポリリジンを塗布したブラックマトリクス
の各ウェル内に８×８のアレイ状に吐出する。

【００７８】図５には吐出される６４種ＤＮＡプローブ
の各ブラックマトリクス上での配置図を示す。この場
合、１つのマトリクス中に６４種のＤＮＡプローブが打
ち込まれる。

【００７９】その後、この各プローブがスポットされた
基板を、４０℃に設定した加湿チャンバー内に放置し、
ハイブリダイゼーション反応を行う。

【００８０】その後、基板を１００ｍＭＮａＣｌを含
む１０ｍＭリン酸緩衝液にて洗浄し、ハイブリッド体形
成に関与しなかったＤＮＡプローブを除去する。

【００８１】ハイブリダイゼーション反応後のＤＮＡア
レイを、ローダミンに適するフィルターセットを装着し
た倒立型蛍光顕微鏡を用いて観察する。

【００８２】検体としての遺伝子が正常な塩基配列を有
するものであれば、遺伝子に対４２番のＤＮＡプローブ
の位置に最も蛍光強度の強いスポットが観察されるはず
である。これらはプローブＤＮＡとＰＣＲで増幅された
正常な配列を持つｐ５３遺伝子のハイブリッドに由来す
ると考えられる。変異のある検体遺伝子では４２番以外
の場所に検出可能なスポットが見られ、その位置に供給
されたＤＮＡプローブの配列から変異している配列を知
ることができる。

【００８３】実施例２（ｍＲＮＡを用いた発癌遺伝子の有無の評価）１．ｍＲＮＡの抽出バイオプシーで採取した癌組織から“ＱｕｉｃｋＰｒｅ
ｐＭｉｃｒｏｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａｂ
ｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてｍＲＮＡを抽出する。この
ｍＲＮＡを実施例１と同様ブラックマトリクス付きのポ
リリジン基板に結合させる。

【００８４】２．各種発癌遺伝子プローブアレイによる
発癌遺伝子の有無、種類の検査クローン化されたオンコジーンのセット（１８種、宝酒
造社製）を購入し、“ＬａｂｅｌＩＴｎｏｎ−ＲＩＬ
ａｂｅｌｉｎｇＫｉｔｓ”を用いてローダミン標識を
行う。

【００８５】標識された１８種のオンコジーンプローブ
を上記ｍＲＮＡが結合された基板に、Ｃａｒｔｅｓｉａ
ｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイ作製
装置（ピン方式）を用いて４×５の並びとしてスポット
する。

【００８６】さらに実施例１と同様な方法によりハイブ
リダイゼーション反応を行う。

【００８７】それぞれの組織から抽出されたｍＲＮＡ画
分中に存在するオンコジーンの種類を知ることができ
る。

【００８８】この時、オンコジーンの種類によらず一種
類の標識で検出が可能である。

【００８９】

【発明の効果】本発明によれば、多検体を同時に多項目
的に検査する方法を提供することができる。

【００９０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Canon INC. <120>An assay of many samples for multiple items at the same time <130>3912041 <160>64 <210>1 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>1 gatgggactc aagtt cat <210>2 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>2 gatgggactc aggtt cat <210>3 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>3 gatgggactc acgtt cat <210>4 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>4 gatgggactc atgtt cat <210>5 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>5 gatgggactc gagtt cat <210>6 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>6 gatgg gactc gggtt cat <210>7 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>7 gatgggactc gcgttcat <210>8 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>8 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<400>17 gatggggctc aagttcat <210>18 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>18 gatggggctc aggttcat <210>19 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>19 gatggggctca cgttcat <210>20 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>20 gatggggctc atgttcat <210>21 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>21 gatggggctcg agttcat <210>22 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>22 gatggggctc gggttcat <210>23 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>23 gatggggctc gcgttcat <210>24 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>24 gatggggctc gtgttcat <210>25 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>25 gatggggctc cagttcat <210>26 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>26 gatggggctc cggttcat <210>27 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>27 gatggggctc ccgttcat <210>28 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>28 gatggggctc ctgttcat <210>29 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>29 gatggggctct agttcat <210>30 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>30 gatggggctc tggttcat <210>31 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>31 gatggggctc tcgttcat <210>32 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>32 gatggggctc ttgttcat <210>33 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>33 gatgggcctc aagttcat <210>34 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>34 gatgggcctc aggttcat <210>35 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> 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【図面の簡単な説明】

【図１】本態様における基板上の規定された領域の配置
態様の一例を示す図である。

【図２】本態様におけるマトリクスの一例を示し、図２
（Ａ）は平面図であり、図２（Ｂ）はそのＢＢ断面図で
ある。

【図３】本発明の一実施態様であるバブルジェット法に
よる検体溶液吐出方法の概略説明図である。

【図４】図３のバブルジェットヘッド１０５のＡ−Ａ線
断面図である。

【図５】吐出される６４種ＤＮＡプローブの各ブラック
マトリクス上での配置図である。

【符号の説明】

１０１液体供給系（ノズル）１０３固相１０４液体１０５バブルジェットヘッド１０７液体１０９保護膜１１１−１、１１１−２電極１１３発熱抵抗体層１１５畜熱層１１６支持体１１７基板部１１９吐出口（オリフィス）１２１メニスカス１２１１２３発泡領域

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 35/02 ＺＣＣＧ０１Ｎ 37/00 １０２ 35/10 １０３ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ１０３Ｇ０１Ｎ 35/06 Ａ (72)発明者鈴木智博東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者清水英東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 2G058 CC02 CC08 EA11 EB00 ED02 FB02 GA02 4B024 AA11 AA20 CA09 HA14 HA20 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ04 QQ05 QQ20 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR55 QR82 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１番目の試料と、複数の試料との反応
性を同時に検定する方法であって、第１番目の試料が全面にわたってあらかじめ結合されて
いる基板上の規定された領域内に、それぞれ異なる性質
を持つ第２番目〜第２＋ｎ番目（ｎ≧１）の試料を該規
定された領域域よりも小さい領域としてそれぞれ独立に
配置し、該第１の試料と、第２〜第２＋ｎ（ｎ≧１）の
試料のそれぞれとの間の反応性を検定することを特徴と
する試薬と検体との反応性の検査方法。
【請求項２】該第１番目の試料が生物由来の試料であ
り、該第２番目以降の試料が既に性質が明らかにされて
いる試料である請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】該第１番目の試料が生物由来の試料であ
り、該第２番目以降の試料が合成されたものである請求
項２に記載の検査方法。
【請求項４】該１番目の試料が生物由来の塩基配列未
知の核酸であり、該２番目以降の試料は配列既知の合成
核酸であり、これらの反応性としてその相補性に基づく
結合を調べる請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】該１番目の試料が生物から抽出したｍＲ
ＮＡのセットである請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】該１番目の試料が生物から抽出したｍＲ
ＮＡを基に合成されたｃＤＮＡライブラリーである請求
項４に記載の検査方法。
【請求項７】該１番目の試料が生物由来の塩基配列未
知の核酸であり、該２番目以降の試料は合成された化学
物質であり、これらの反応性としてその結合性を調べる
請求項２に記載の検査方法。
【請求項８】該１番目の試料が生物由来の塩基配列未
知の核酸であり、該２番目以降の精製された蛋白質であ
り、これらの反応性としてその結合性を調べる請求項２
に記載の検査方法。
【請求項９】該第１番目の試料が既に性質が明らかに
されているものであり、該第２番目以降の試料が生物由
来の試料である請求項１に記載の検査方法。
【請求項１０】該第１番目の試料が既に性質が明らか
にされている遺伝子配列であり、該第２番目以降の試料
が生物由来の試料である請求項１に記載の検査方法。
【請求項１１】該第１番目の試料がクローン化された
オンコジーン断片であり、該第２番目以降の試料が生物
由来の核酸試料である請求項１に記載の検査方法。
【請求項１２】該１番目の試料が生物から抽出した蛋
白質画分であり、該２番目以降の試料は精製された単一
種の蛋白質であり、これらの反応性としてその結合性を
調べる請求項１に記載の検査方法。
【請求項１３】該１番目の試料が精製された単一種の
蛋白貿であり、該２番目以降の試料は生物から抽出した
蛋白質画分であり、これらの反応性としてその結合性を
調べることを特徴とする請求項１記載の検査方法。
【請求項１４】該１番目の試料が生物から抽出した蛋
白質画分であり、該２番目以降の試料は化学合成された
化学物質であり、これらの反応性としてその結合性を調
べる請求項２に記載の検査方法。
【請求項１５】該１番目の試料が精製された単一種の
蛋白質であり、該２番目以降の試料は化学合成された化
学物質であり、これらの反応性としてその結合性を調べ
る請求項２に記載の検査方法。
【請求項１６】該１番目の試料が化学合成された化学
物質であり、該２番目以降の試料は生物から抽出した核
酸であり、これらの反応性としてその結合性を調べる請
求項１に記載の検査方法。
【請求項１７】該１番目の試料が化学合成された化学
物質であり、該２番目以降の試料は生物から抽出した蛋
白質画分であり、これらの反応性としてその結合性を調
べる請求項に１記載の検査方法。
【請求項１８】それぞれ異なる性質を持つ該第１番目
の試料が、それぞれ異なる領域に全面にわたって結合
し、該結合領域が基板上に複数個マトリクス状にそれぞ
れが区画されて存在する請求項１に記載の検査方法。
【請求項１９】該第１番目の試料が、それぞれ異なる
生物種、組織または細胞に由来する核酸である請求項１
８に記載の検査方法。
【請求項２０】該第１番目の試料が、それぞれ異なる
生物種、組織または細胞から抽出された蛋白質である請
求項１８に記載の検査方法。
【請求項２１】それぞれ異なる性質を持つ該第１番目
の試料の結合領域が形成するマトリクスの密度が４００
／ｃｍ²以下である請求項１８に記載の検査方法。
【請求項２２】それぞれ異なる性質を持つ該第１番目
の試料の結合領域が形成するマトリクス上に、第２、第
３以降の試料のスポットからなるスポットアレイを、各
マトリクスにおいて同じ配置で並べる請求項１８に記載
の検査方法。
【請求項２３】該基板がガラスである請求項に１記載
の検査方法。
【請求項２４】該第１番目の試料が静電的な結合によ
り基板上に固定されている講求項１に記載の検査方法。
【請求項２５】該第１番目の試料が共有結合により基
板上に固定されている請求項１に記載の検査方法。
【請求項２６】該第１番目の試料が、ガラス基板表面
に導入したマレイミド基と該試料の有するチオール基と
の化学反応により該基板に結合されている請求項２５に
記載の検査方法。
【請求項２７】該第１番目の試料が蛋白質であり、該
チオール基が蛋白質中のシステイン残基によるものであ
る請求項２６に記載の検査方法。
【請求項２８】該マレイミド基がガラス表面にアミノ
基を導入した後、該アミノ基とスクシイミジル−４−
（マレイミドフェニル）ブチレートとを反応させて導入
したものである請求項２６に記載の検査方法。
【請求項２９】該第１番目の試料が、ガラス基板表面
に導入したエボキシ基と該第１番目の試料の有するアミ
ノ基との化学反応による請求項２６に記載の検査方法。
【請求項３０】該アミノ基が核酸塩基中に存在するア
ミノ基である請求項２９に記載の検査方法。
【請求項３１】基板表面があらかじめマトリクスに区
画されていて、これらのマトリクス内のそれぞれに第１
番目の試料として各マトリクス間で異なる性貿を持つ生
物試料があらかじめ結合されている請求項１に記載の検
査方法。
【請求項３２】該マトリクスを区画する壁面部分が疎
水性であり、該マトリクス内の底面部分が親水性である
請求項３１に記載の検査方法。
【請求項３３】該マトリクスの壁面の厚さが１〜２０
μｍである請求項３２に記載の検査方法。
【請求項３４】該第１の試料が結合した規定された領
域に形成される第２番目以降の試料溶液によるスポット
の径が２００μｍ以下である請求項１に記載の検査方
法。
【請求項３５】該第１の試料が結合した規定された領
域に形成される第２番目以降の試料溶液によるスポット
の密度が４００／ｃｍ²以上である請求項１に記載の検
査方法。
【請求項３６】該第２番目以降の試料がインクジェッ
ト法により供給される請求項１に記載の検査方法。
【請求項３７】該インクジェット法により供給される
第２番目以降の試料が核酸であり、その塩基対長が２〜
１００塩基対長である請求項３６に記載の検査方法。
【請求項３８】該インクジェット法により供給される
核酸が、水溶液として供給され、その水溶液の濃度が
０．０５μＭ〜６００μＭである請求項３７に記載の検
査方法。
【請求項３９】該インクジェット法がバブルジェット
法である請求項３６に記載の検査方法。
【請求項４０】該第２番自以降の試料の供給が、該試
料の溶液がピンが該試料の溶液の貯蔵部の液面での接触
後、基板へ物理的に接触することにより行なわれる請求
項１に記載の検査方法。
【請求項４１】該第２番目以降の試料の供給が、該試
料の溶液が毛細管を利用して試料供給部から吸入された
後、該毛細管先端の基板へ物理的な接触により行なわれ
る請求項１に記載の検査方法。
【請求項４２】それぞれ異なる起源を持つ複数種の生
体試料が、基板上に区切られたそれぞれのマトリクス上
に存在することを特徴とする生体試料マトリクス。
【請求項４３】該生体試料がクローン化されたオンコ
ジーン断片である請求項４２に記載のＤＮＡマトリク
ス。
【請求項４４】該生体試料がｍＲＮＡである請求項４
２に記載のｍＲＮＡマトリクス。
【請求項４５】該生体試料がｃＤＮＡである請求項４
２に記載のｃＤＮＡマトリクス。
【請求項４６】該生体試料がｃＤＮＡライブラリーで
ある請求項４２に記載のｃＤＮＡマトリクス。
【請求項４７】該生物試料がそれぞれ異なる立体構造
を持つ複数種の蛋白質である請求項に４２記載の蛋白質
マトリクス。
【請求項４８】生体試料が結合されているマトリクス
の密度が４００／ｃｍ²以下であることを特徴とする請
求項４２記載の生体試料マトリクス。
【請求項４９】該基板がガラスである請求項４２に記
載の生体試料マトリクス。
【請求項５０】該生体試料が静電的な結合により基板
上に固定されている請求項４２に記載の生体試料マトリ
クス。
【請求項５１】該生体試料が共有結合により基板上に
固定されている請求項４２に記載の生体試料マトリク
ス。
【請求項５２】該生体試料が、ガラス基板表面に導入
したマレイミド基と生体試料の有するチオール基との化
学反応により該ガラス基板に結合している請求項５１に
記載の生体試料マトリクス。
【請求項５３】該生体試料が蛋白質であり、ガラス基
板表面に導入したマレイミド基と蛋白質の有するシステ
イン残基のチオール基との化学反応によりこれらが結合
している請求項５２に記載の生体試料マトリクス。
【請求項５４】該マレイミド基がガラス表面にアミノ
基を導入した後、該アミノ基とスクシイミジル−４−
（マレイミドフェニル）ブチレートとを反応させて導入
したものである請求項に５２記載の生体試料マトリク
ス。
【請求項５５】該生体試料が核酸で、ガラス基板表面
に導入したエポキシ基と核酸の有するアミノ基との化学
反応によりこれらが結合している請求項に５１記載の生
体試料マトリクス。
【請求項５６】該複数種の生体試料がインクジェット
法により基板上に区切られたそれぞれのマトリクス上に
供給されたものである請求項４２に記載の生物試料マト
リクス。
【請求項５７】基板表面があらかじめマトリクスに区
画されていて、マトリクスのそれぞれの領域にそれぞれ
異なる起源を持つ複数種の生体試料があらかじめ結合さ
れている請求項に４２記載の生体試料マトリクス。
【請求項５８】該マトリクスを区画する壁面部分が疎
水性であり、該マトリクスの底面部分が親水性である請
求項５７に記載の生物試料マトリクス。
【請求項５９】該マトリクスの壁面部分の厚さが１〜
２０μｍである請求項５８に記載の生物試料マトリク
ス。
【請求項６０】該複数種のオリゴヌクレオチドがイン
クジェット法による区画されたマトリクスのウェルヘ供
給さたものである請求項５７に記載の生物試料マトリク
ス。
【請求項６１】該インクジェット法がバブルジェット
法である請求項５６に記載の生物試料マトリクス。