JP2001524984A - 核酸の選択的修飾のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞含有組成物または生体高分子含有組成物中のウイルスおよびその他の生物を、選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤に接触させることなどにより、蛋白質またはその他の生体高分子に有意な変化を引き起こすことなく、該ウイルスおよびその他の生物を不活化する手段および方法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の選択的修飾のための方法および組成物 発明の背景 本発明は、生物学的組成物中のウイルスの選択的不活性化を目的とする方法お よび組成物に関する。 血液または血液剤を介したウイルス性疾患の伝播（たとえばＡ型およびＢ型肝 炎、後天性免疫不全症候群、サイトメガロウイルス感染症）は、医学における重 大な問題である。ドナーの選択基準およびドナー血液のウイルスマーカーに基づ くスクリーニングは、レシピエントへのウイルス伝播を減少させるのに役立って はいるが、スクリーニング方法は、ほとんどが２〜３の特定のウイルスだけに対 するものであり、スクリーニングが不完全であるかまたは感受性が100%未満であ る。しかもその場合でも感受性が不十分である。さらに、例えば哺乳類およびハ イブリドーマ細胞株、細胞株による産生物、乳汁、初乳、および***といった、 他の生物学的組成物も感染性のウイルスを含んでいる可能性がある。 ドナーの血液、血液産物、またはその他の生物学的組成物に含まれているいか なるウイルスも不活化することが望ましい。同時に、赤血球、血小板、白血球な らびに蛋白質および多糖類といった血漿中の生体高分子のような有益な含有物の 構造および機能は比較的不変に保つことが重要である。 最大限に安全かつ有効なヒトまたは動物用の死菌ワクチンを製造するには、完 全かつ確実に、生きた微生物、例えばウイルスおよび細菌を非感染性に（［不活 化」）し、一方でそれらの免疫原性に対する影響を最小限に抑える方法が必要と なる。ウイルスワクチンを製造する際に有用な、ウイルスの不活化に用いられる 典型的な方法は、一般に、細胞、細胞成分、蛋白質およびその他の抗原の機能お よび構造を変化させたり、破壊するものである。 現行の不活化法には、ホルマリン、β−プロピオラクトンまたは紫外線照射を 用いるウイルスの不活化が含まれる。さらに、エチレンイミン単量体が、*** ウイルス（SU 1915956）、マイコプラズマおよびアコレプラズマ（WO 92/18161 ）、およびトリの感染症（RO 101400）を不活化するために用いられており；二 価のエチレンイミン（すなわち２つの試薬を組み合わせて生成されたエチレンイ ミン 単量体）が、ネコの腸内コロナウイルス、FECVを不活化するために用いられてお り（欧州特許第94200383号）；ポリエチレンイミンが、植物ウイルスの制御剤と して用いられている（日本国特許第7882735号）。 これらの薬剤および方法は、ウイルスおよび細菌のような微生物を非特異的に 修飾するため、標準化して再現可能に用いることが困難である。さらに、どの化 学的な変化が微生物を非感染性にするのか不明なため、その過程を再現可能に適 用することが困難になっている。その結果、不十分な不活化または不活化の後の 回復に起因する疾患の周期的な大発生が起きる。麻痺性ポリオ、***、および ベネズエラウマ脳脊髄炎の主な大発生は、この問題によって起こってきた。 一般的に、ウイルスのカプシド蛋白質の様な重要な表面抗原決定基を有する多 数の微生物は、現在用いられている不活化剤によって影響を受ける。こうした薬 剤は、核酸だけでなく蛋白質、炭水化物、および脂質といった他の生体高分子を も有意に修飾し、それによってこれらの機能を低下させる。変化した抗原または 保護的エピトープの不活化により、免疫原性が減少しそれにより効力が低くなる （例えば不活化ポリオワクチン）か、抗原性が変化しそれにより疾患の予防の代 わりに疾患の免疫有効性が変化する（例えば呼吸器合胞体ウイルスおよびホルマ リン不活化による不活化麻疹ワクチン）か、または同一の不活化剤により調製さ れた別の死菌ワクチンと共通の新しい抗原が出現することが可能となる。 この生物学的混合物中でのウイルスの不活化という問題は、血漿中の蛋白質、 炭水化物、および糖蛋白質といった望ましい生体高分子が同時に存在することに よるもので、ウイルスのみの不活化の問題とは異なるものである。ホルムアミド または酸化剤の様な薬剤を用いてある種のウイルスを不活化することは可能であ るが、血液中のウイルスの不活化に対しては、これらの不活化剤のほとんどは血 漿中の生体高分子や血液の細胞成分の生物学的活性を損なうことが報告されてい るため、こうした方法は適切ではない。例えば、紫外線を用いると濃厚血小板に 含まれるウイルスを不活化できることが示された。しかし、照射量が多いと重篤 な血小板の障害が生じた。ベータプロピオラクトンは核酸と蛋白質に同様の比率 で反応する；したがって、ウイルスが不活化される一方で、血漿中の第VIII因子 の量がかなり失われてしまう。 さらにもう一つの別の問題は、血液またはその他の生物学的液体に混入するウ イルスの中には、完全なウイルス粒子、ウイルスゲノム断片または宿主ゲノムに 組み込まれたウイルス核酸のいずれかの形で細胞内に含まれているものがあるこ とである。例えば、ＨＩＶウイルスは白血球内部に含まれている。無細胞および 細胞内部の両方の形態のウイルスを不活化し、一方で細胞の構造を完全に保つこ とができることは、特に重要なことである。有用な生体高分子を非血液性の原料 から調製する際にも、病原性ウイルスが組成物に混入する可能性があるため、問 題が生じる可能性がある。 発明の概要 本発明は、ウイルスを不活化する条件下で、構造式β-Hal-(CH₂-CH₂-NH)_nH（ ここでnは２以上５以下の整数である）を持つ選択的不活化剤と生物学的組成物 を接触させることによって、該組成物中に含まれるウイルスを不活化する方法を 特徴とする。好ましくはnは2また3である。 生物学的組成物は、好ましくは細胞を含有する組成物である。この生物学的組 成物は、好ましくは哺乳類の全血、精製または部分精製された血液蛋白質、血液 細胞蛋白質、乳汁、唾液、血漿、血小板濃厚血漿、濃縮血漿、該血漿のいずれか の分画からの沈殿物、該血漿のいずれかの分画からの上清、血清、寒冷沈降物、 寒冷上清、細胞溶解液、哺乳類培養細胞または培養液、胎盤抽出物、発酵産物、 および血球中に導入された蛋白質からなる群より選択される。例えば、生物学的 組成物は、哺乳類の全血または血漿でありうる。 好ましくは、生物学的組成物は、フィブリノーゲン、第VII因子、第VIII因子 、第IX因子、第X因子、免疫グロブリン、プレアルブミン、レチノール結合蛋白 質、アルブミン、α-グロブリン、γ-グロブリン、補体構成成分、フィブロネク チン、アンチトロンビンIII、ヘモグロビン、インターフェロン、増殖因子、プ ラスミノーゲン活性化因子、成長ホルモン、インスリン、およびエリスロポエチ ンからなる群より選択される蛋白質を含む。好ましくは、この蛋白質はヒト蛋白 質である。ウイルスは、エンベロープを持つウイルスであっても、持たないウイ ルスであってもよい。 さらに、本発明は、構造式β-Hal-(CH₂-CH₂-NH)_nH（ここでnは２以上５以下の 整数である）を持つ化合物を特徴とする。好ましくは、nは２または3である。本 発明は、また、［Br-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂］(HBr)₃という構造式 を持つ化合物、および［Cl-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂］(HCl)₃という 構造式を持つ化合物を特徴とする。 図面の簡単な説明 図１．エチレンイミンオリゴマー不活化剤の単量体（I）、二量体（II）、三 量体（III）、直鎖状および分枝状四量体（それぞれ、IVおよびV）の構造。 図２．エチレンイミンおよびそのオリゴマーの電位滴定曲線。ローマ数字は図 １に小した構造に対応する。 図３．0.15M NaCl、pH7.5、20℃におけるエチレンイミン（0.025M、曲線１） 、その二量体（0.007M、曲線２）、三量体（0.003M、曲線３）、ならびに直鎖状 および分枝状四量体の等モル混合物（0.0015M、曲線４）作用下でのMS2ファージ の生存曲線。 図４．pH6.5、6.9、7.5、および8.5における（それぞれ曲線１、２、３、およ び４）0.15M NaCl（20℃）中での0.007Mエチレンイミン２量体の作用下でのファ ージMS2の生存曲線を示す先行技術による図。 好ましい態様の説明 １．定義： 「選択的不活化剤」とは、一つのアジリジノ基またはβ-ハロ-エチルアミノ基 を持ち、例えばポリヌクレオチドのようなポリアニオンに対して、他の生物学的 分子よりも特異的に親和性を有するエチレンイミンオリゴマー試薬を指す。本発 明の選択的不活化剤は、ウイルスの遺伝物質を含む核酸（一本鎖ＤＮＡ、二本鎖 ＤＮＡ、またはＲＮＡ）に選択的に結合し、不活化条件のもとでは、非可逆的に 機能的核酸を修飾してウイルスを不活化する、比較的毒性の低い化合物を含む。 本発明の「エチレンイミンオリゴマー」とは、一端にアジリジノ基を有し、任 意で置換されていてもよいエチレンイミンのオリゴマーを指す。本発明において 好ましいエチレンイミンオリゴマーは、少なくとも３個のエチレンイミンユニッ トを有し、例えば三量体または直鎖状もしくは分枝状の四量体を含む。代表的な エチレンイミンオリゴマーを図１に示す。本発明の方法では、10ユニット未満の エチレンイミンオリゴマーが好ましく、約３から４ユニットのエチレンイミンオ リゴマーがより好ましい。 エチレンイミンオリゴマーはまた、エチレンイミンの本質的な特性を逸しない 限りにおいて、置換されていてもよい。一つの態様において、エチレンイミンオ リゴマーはハロゲンに置換され、一般式、β-Hal-(CH₂-CH₂-NH)_nHで表される。 好ましくは、「n」は２以上５以下の整数である。このような化合物は、しばし ばナイトロジェンマスタードと呼ばれているが、塩化水素または臭化水素によっ て，エチレンイミンまたはそのオリゴマーをβ-ハロゲン化したモノまたはオリ ゴエチルアミンへと定量的に変換することによって合成される。合成方法は、以 下により詳細に記載される。ナイトロジェンマスタードは強力な求電子体で、直 接にまたは対応するアジリジンへの中間的な変換を通して、核塩基の求核基をア ルキル化する。エチレンイミノオリゴマーと同様に、β-ハロゲノ-オリゴ-エチ ルアミンは、ポリアニオンに対する親和性が高い。このため、これらのエチレン イミンオリゴマーは核酸に対する選択性が高いが、修飾の動態については検討の 余地がある。 不活化剤は、不活化剤と核酸との比較反応速度が、例えば蛋白質、炭化水素ま たは脂質などの他の生物学的分子との反応速度より大きければ、核酸に対する「 選択性」を有する、または「選択的に」核酸と反応すると言える。核酸に対する 選択性が他のアルキル化剤とおよそ同程度のエチレンイミン単量体については、 エチレンイミンオリゴマー不活化剤としてのレベルで、蛋白質より核酸に対する 選択性が高いことは、期待できない。 「核酸」とは、一本鎖および二本鎖の、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を指す。 「生物学的組成物」とは、細胞または生体高分子を含む組成物を意味する。細 胞含有組成物は、例えば、全血、赤血球濃縮液、血小板濃縮液、白血球濃縮液、 血球蛋白質、血漿蛋白質画分、精製血液蛋白質、血清、***、哺乳類の初乳およ び乳汁、胎盤抽出物、発酵産物、腹水液、ならびに正常または（例えば、組換え ＤＮＡまたはモノクローナル抗体技術を用いて）形質転換した細胞による細胞培 養において産生された生成物を含む。「生体高分子」または「生物学的分子」と は、例えば、核酸、ポリペプチド、転写後修飾を受けた蛋白質（例えば糖蛋白質 ）、多糖類および脂質を含む、生体中に通常認められるすべての種類の有機分子 を意味する。生体高分子含有組成物には、例えば血球蛋白質、血漿、血漿画分沈 降物、血漿画分上清、寒冷沈降物、寒冷上清、またはそれらに由来する部分もし くは派生物、血清、または正常もしくは（例えば組換えＤＮＡ技術を介して）形 質転換した細胞から産生された非血液生成物が含まれる。生物学的組成物は、無 細胞系でもあり得る。 「機能的核酸」とは、複製、転写、翻訳または核酸分子のその他の活性の鋳型 として働く配列要素を持つ核酸を意味する。そのような要素には、例えば、核酸 分子の複製起点をコードする配列、プロモーター／エンハンサー、転写ターミネ ーターおよびその他の調節要素などの転写要素；リボソーム結合部位、翻訳開始 コドン、コード配列、およびインフレーム終止コドンなどの翻訳要素；ならびに ＲＮＡの触媒活性に関与する配列が含まれる。 「生体高分子の活性を阻害する」とは、生体高分子の機能または活性を、測定 で検出できる程度減少させることを意味する。機能または活性の減少は、特定の 生体高分子の活性を測定するのに用いられる標準的なアッセイのいずれによって も測定できる。例えば、ある酵素（蛋白質）または抗原の活性の阻害は、酵素反 応の速度変化または抗原に対する免疫応答の変化を、一般的なアッセイを用いて 測定することによって定量できる。 「不活化すること」、「不活化」、または「不活化する」とは、機能的核酸に 関する場合には、たとえば、複製、転写またはメッセージの翻訳を行う活性を破 壊することにより、ＤＮＡまたはＲＮＡの活性を、実質的に除去することを意味 する。例えば、あるＲＮＡの翻訳阻害は、適当なインビトロまたはインビホの翻 訳系において産生される、一定量のＲＮＡによってコードされる蛋白質の量を測 定することにより、決定できる。ウイルスに関する場合には、本用語は、１mlあ たりの感染力価または感染性ウイルス粒子数の減少として測定される、感染性ウ イルス粒子数を減少させることまたは除去することを意味する。感染性ウイルス 粒子のそのような減少は、[Lennette，E.H.およびSchmidt，N.J.（編）（1985） ウイルス、リケッチアおよびクラミジア感染の診断法（Diagnostic Procedures for Viral，Rickettsial and Chlamydial Infections）第６２版、American Pub lisher's Assn.，Washington，D.C.]などに記載されている当業者に周知のアッ セイによって定量する。 「ウイルスを不活化する条件」とは、ウイルスゲノムを所望の程度まで不活化 するための、例えば、処理時間、pH、温度、塩組成および選択的不活化剤の濃度 を含む、ウイルス粒子を本発明の選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤とも にインキュベートする条件を指す。ウイルスを不活化する条件は、核酸を選択的 に修飾するための条件として以下に記述した条件から選択される。 「ウイルス」は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスの両方を意味する。ウ イルスはエンベロープを持つウイルスおよび持たないウイルスの両方、例えばポ ックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボ ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、 アルファウイルス、ルビウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型およびＢ型肝 炎ウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モビリウ イルス、肺炎ウイルス、ラブドウイルス、リッサウイルス、オルソミクソウイル ス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、ヘパドナウイルス、ア レナウイルス、レトロウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルスおよびフィ ロウイルスを含む。 「ワクチン」は、生物に必要な程度の免疫を付与するのには有効で、罹病率お よび死亡率は非常に低いレベルであるような薬剤を意味する、通常の意味で用い る。ワクチンの製造法は、勿論、免疫系の研究および動物またはヒトの疾患の予 防に有用である。 「薬学的に許容される」とは、化合物を投与される動物にとって、比較的毒性 がないことを意味する。「薬学的に許容される担体」には、リン酸緩衝塩類溶液 、水ならびに、油／水または水／油乳剤などの乳剤、ならびに様々なタイプの湿 潤剤および／またはアジュバントのような、すべての標準的な薬学的担体、緩衝 液および賦形剤が含まれる。 ２．一般事項： 本発明は、核酸を修飾する多くの薬剤、特にエチレンイミン単量体（アジリジ ン）と比較して、三量体および四量体の形のエチレンイミンオリゴマーが、核酸 の修飾において、蛋白質などの他の生体高分子の修飾よりも有意に選択的である という、予期せぬ驚くべき所見に基づいている。エチレンイミンオリゴマーは、 エチレンイミン単量体と比べて何桁も高い、場合によっては６桁高い選択性を有 する。核蛋白質のように、核酸が蛋白質と密接に会合している組成物においては 、本発明の方法で選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤を用いると、特に効 果的である。 エチレンイミンオリゴマーの不活化剤は、細胞または生体高分子を含む組成物 の様な生物学的組成物中のウイルスを効果的かつ特異的に不活化できる。本発明 は、生体高分子の混合組成物中でウイルスまたはその他の微生物の核酸分子を選 択的に修飾する方法を提供する。 例えば、血液細胞蛋白質、血液細胞の派生物（例えばヘモグロビン、αインタ ーフェロン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、PDGF、tPAなど）、血漿、 血漿分画沈降物、血漿分画上清、寒冷沈降物、寒冷上清、またはそれらの一部分 もしくは派生物、血清、または正常もしくは（例えば、組換えDNA技術を用いて ）形質転換した細胞から産生された非血液蛋白質などの生体高分子を含む組成物 をエチレンイミンオリゴマーの不活化剤に十分な時間接触させると、該組成物中 に存在するウイルスが、その中に含まれている蛋白質の様な生体高分子に重大な 損傷を与えることなく望ましい程度に（ウイルス不活化測定において少なくとも 約6log、または計算値で少なくとも約20log）不活化されることが見出された。 血液蛋白質の混合物または濃縮物をエチレンイミンオリゴマー不活化剤に接触さ せることによって、A型もしくはB型肝炎ウイルスまたはHIVの様なウイルスを、 望ましい程度、たとえば測定値として少なくとも約6log以上、または計算値とし て少なくとも約20桁程度に不活化できる。組成物中のウイルスの量は、感染力価 測定によって決定される。処理された組成物中に含まれる蛋白質、炭水化物およ び脂質の様な生体高分子は、本質的に全ての活性が不活化処理以前の水準に保た れる。 本発明の過程は、血漿、血漿分画、血漿濃縮物、またはそれらの構成成分の処 理として記載されてきた。しかし、その過程は、溶解液または細胞が分泌する蛋 白質を処理する場合においても役に立つ。血小板、白血球、赤血球、線維芽細胞 に由来する分画およびインターフェロン、成長ホルモン、tPA、第VII因子、転 位因子、ヘモグロヒン、増殖因子、EPOおよびDNA分解酵素の溶液に対する処理も 企図している。 また、本発明の不活化剤および過程を用いて、新鮮凍結血漿、解凍した凍結血 漿、寒冷沈降物、寒冷上清、またはこれらの希釈物と同様に凍結血漿からの濃縮 物を処理することもできる。 本明細書中に記載したものと同一の過程で、正常または形質転換した細胞の産 物中に存在するウイルスを、こうした産物中の生体高分子の活性を保ったままで 、不活化できる。例えば、エチレンイミンオリゴマー不活化剤を用いることによ って、正常または形質転換した細胞、正常または形質転換した細胞の滲出物、ハ イブリドーマにより産生された産物、および遺伝子工学によって産生された産物 を不活化できる。そのような処理は、特定の蛋白質のような所望の生体高分子に 実質的な悪影響を与えない。もちろん、所望の蛋白質を産生するために用いる細 胞は、哺乳類以外の細胞と同様に哺乳類細胞を用いることができる。 本発明の方法および組成物は、試料中に含まれる実質的に全てのウイルスを不 活化する。感染性の程度を決定する方法は、当業者には周知である。本発明にし たがって、ウイルスの実験的に測定可能な不活化は、少なくとも約「6log」（6. 0log₁₀）の程度まで得られる。即ち、10⁶希釈されてもウイルスの感染性が検出 できる程度に未処理の混合物中にウイルスが存在する場合に、感染性試験で決定 される程度には完全にウイルスを不活化でき、したがって、処理後は未希釈の材 料中でウイルスは検出されない。さらに重要なことは、本明細書中に記載されて いる不活性過程の正確な速度論的記載が得られたことによって、ウイルス含有組 成物の感染性は、計算上少なくとも約20桁の程度または「20log」減少させるこ とができた。 本発明は、細胞または生体高分子を含む組成物を、エチレンイミンオリゴマー 不活化剤と接触させることを含む、該組成物中の核酸分子を選択的にアミノアル キル化するための方法および条件を提供する。その方法の結果、該組成物中の核 酸は、他の生物学的分子よりも遥かに速やかに化学修飾される。この方法は、核 酸は修飾したいが他の生物学的分子は比較的変化させたくない、いかなる方法に おいても有用である。例えば、本発明の方法は、例えばマッピング、またはウイ ルスもしくはその他の生物のゲノムを不活化するために、検出可能な標識（放射 性、蛍光、酵素等）を有するエチレンイミンオリゴマーで優先的に核蛋白質（例 えばクロマチンまたはリボソーム）中の核酸を標識するのに有用である。 本発明のエチレンイミンオリゴマー不活化剤は、プロトン化したアジリジノ基 がポリヌクレオチド中の核塩基と反応することにより、核酸を優先的に修飾する 。ウイルス不活化剤がポリアニオンと会合する活性は、一部は、分子当たりのプ ロトン化しうる基の数、および与えられた条件下におけるプロトン化の全体の程 度に依存する。修飾は、複数の陽イオンを持つウイルス不活化剤が核酸ポリアニ オンと会合する過程を介して起きる。プロトン化の程度は、部分的にはpHに依存 する。本明細書に記述したように、アジリジン基のpK_a値は、ポリマーの長さに 従って減少する。しかしながら、エチレンイミンオリゴマー不活化剤が選択的に 核酸と会合する活性は、エチレンイミンオリゴマー不活化剤の長さに従って、有 意に増加する。従って、生理学的なpHにおいて、効果的かつ選択的に核酸をアル キル化することができる。 ある態様において、エチレンイミンオリゴマー不活化剤は、三量体、直鎖状四 量体または分枝状四量体である。生物学的組成物中でのウイルスを不活化するた めの好ましい不活化条件としては、約0.0001Mから約0.010Mのエチレンイミンオ リゴマー不活化剤を含む組成物；約pH6.5〜約pH8.5の条件下；イオン強度約0.01 Mがら0.5Mを持つ反応液でのインキュベートが含まれる。より好ましい反応条件 としては、約0.001Mから約0.01Mのエチレンイミンオリゴマー不活化剤を含む組 成物の、約pH6.9から約pH8.5；イオン強度約0.1から0.5M未満の溶液中でのイン キュベートが含まれる。好ましい不活化条件としては、約4℃から30℃の範囲の 温度で、量体、直鎖状四量体または分枝状四量体の様なエチレンイミンオリゴマ ー不活化剤を細胞または生体高分子を含む組成物と接触させることが含まれてい る。 選択的に核酸をアミノ-アルキル化するための好ましい条件は、pH約6.5から約 8.5、好ましくはpH約7.0から約8.0、最も好ましくはpH約7.5で、選択的なエチレ ンイミンオリゴマー不活化剤を約0.0001Mから約0.015Mで核酸と接触させる段階 を含む。エチレンイミンオリゴマー不活化剤の濃度は、エチレンイミンオリゴマ ー不活化剤中の水素イオン化できる基の数に部分的に依存し、およびpHの選択は 、 ウイルス粒子の安定性に依存する。選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤は 、好ましくはエチレンイミン三量体、直鎖状四量体または分枝状四量体である。 さらに好ましい条件には、イオン強度約0.1Mから約0.5M、および好ましくは約0. 15Mの溶液中で選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤に核酸を暴露ないし接 触することが含まれる。塩は、ナトリウム、カリウム、リン酸塩または酢酸塩等 を含む、生化学において通常使用されるどのような塩でもよい。溶液のpHは、酢 酸、トリス、HEPES、MOPSなどの当技術分野において生体高分子または細胞を取 り扱う際に通常用いる、多くの緩衝液を用いて調整することができる。好ましい 緩衝液は、MOPSおよびトリスである。高濃度のリン酸を含む緩衝液は好ましくな い。所望のpHおよびイオン強度を達成するために、反応条件を調整することが可 能である。また、反応物質の濃度、温度、処理時間などの、反応条件および望ま しい感染性不活化の程度に依存する他の要因も、調整することが可能である。本 明細書で以下に記述するように、速度論的な方法を用いて、核酸をアミノアルキ ル化して、機能的核酸またはウイルスを予め決めた程度まで不活化する条件を、 記載された条件の中から選択するとともに、不活化の終点を決定する必要がある 。 ウイルス核酸のアルキル化の程度は、感受性細胞にウイルス含有混合液を段階 希釈して導入した後、37℃でインキュベートする、組織培養における細胞傷害効 果（CPE）の測定といった、当業者に公知の様々なアッセイを用いて、ウイルス 感染性の不活化の程度に基づいて、決定することができる。蛋白質、多糖類およ び糖蛋白質をエチレンイミンオリゴマーで修飾すると、余分の正電荷を導入する ことになると考えられる。この生体高分子の修飾程度は、例えば、等電点電気泳 動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC、およびオートラジオグラフィーに よるもしくは適当な方法の検出によるその他のクロマトグラフィーを含む、当技 術分野において公知の手段によって、測定することができる。 本発明はまた、イオン強度が約0.1Mから約0.2M、好ましくは約0.15Mで、pH約6 .5から約8.5、好ましくはpH約7.0から約8.0、および最も好ましくはpH約7.5に調 製した、約0.0001Mから約0.015Mのエチレンイミンオリゴマー不活化剤を含む、 細胞または生体高分子を含む組成物中の核酸を選択的に修飾、すなわちアミノア ルキル化するための組成物に関する。エチレンイミンオリゴマー不活化剤 は、好ましくは、三量体または四量体で、直鎖状または分枝状のいずれかである 。塩および緩衝液は上記のいかなるものでも用いることができる。ひとつの態様 においては、その組成物は、機能的な核酸をアミノアルキル化するのに有効な量 のエチレンイミンオリゴマー、イオン強度およびpHを有する。別の態様において は、該組成物は、ウイルスを不活化するのに有効な濃度のエチレンイミンオリゴ マー、イオン強度およびpHを有する。これらの組成物は、殺菌剤または抗ウイル ス剤として、また本明細書に記述された本発明の全ての方法において、有用であ る。 本発明はまた、試料を有効量の選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤と接 触させることを含む、生物学的試料中の機能的な核酸の活性を、選択的に阻害す る方法に関する。これらの方法には、多くの用途がある。機能的な核酸がプラス ミドまたはDNAセグメントのような裸の核酸である場合、それらを阻害すること は、例えばトランスフェクションによってそれらを取り込んだ細胞へと形質転換 させるような分子の活性を減少させるのに有用である。無細胞翻訳系においては 、このような阻害はＲＮＡの翻訳を低減させるのに有用である。機能的な核酸が 、リボザイムのような触媒活性を持つ核酸である場合には、この方法は、核酸が その標的に働くのを阻害するのに有用である。 機能的な核酸が感染性ウイルスの一部であるウイルスゲノムの場合、この方法 は、ある領域を殺菌したり、全血、血液製剤または細胞培養で産生される蛋白質 のような生物学的産物などの、細胞または生体高分子を含む組成物中のウイルス を、不活化または除去して、ウイルスの感染性を所望の程度（例えば本明細書に 記述したように、計算上で少なくとも約20ログ）まで不活化するのに有用である 。生体高分子を含む組成物としては、例えば、全血から精製した蛋白質；血液製 剤（例えば、第VIII因子などの凝固因子、エリスロポエチンなどのホルモン等） ；細胞抽出液、生物学的分子（例えば、組換え蛋白質）に富む増殖培地などの細 胞培養による産生物；血液製剤とともに処理する蛋白質を含む組成物（例えば、 ウシ血清と共にインキュベートした組成物）および植物性の産物が含まれる。こ れらの方法は、組成物中の生物学的産物の重要な生物学的特性を保持しつつ、実 験室においても治療においても使用する、これらの産物の純度および安全性を保 証する手段として、有用である。 同様に、機能的な核酸が細菌性またはその他の生物のゲノムの一部である場合 には、この方法は、そのような細菌またはその他の生物を殺菌し除去するのに有 用である。 本発明の方法によってウイルスゲノムを修飾すると、ウイルスの再生産が阻害 されるため、本発明の不活化ワクチンは感染性を持たない。更に、ウイルス外被 蛋白質は同じ程度にまでは修飾されないため、ワクチンは十分に免疫原性を保持 している。エチレンイミンオリゴマーは、他の選択的不活化剤と比較すると有意 に核酸に対する修飾の選択性が高いため、エチレンイミンオリゴマーを含む本発 明の組成物は、現在使用されているより選択性の少ない他の不活化剤に比べて、 大きな利点を提供する。 したがって、本発明はまた、ウイルスを不活化する条件下で、ウイルスを選択 的エチレンイミンオリゴマー不活化剤と接触させることを含む、不活化ワクチン の製造方法に関する。ウイルスを不活化する条件は、ウイルス性、細菌性または その他の核酸をアミノアルキル化して不活化するための、上述した方法の中から 選択する。一般に、１ml当たり約10⁷から10⁸ユニットの力価のウイルスを、pH約 6.5から約8.5、イオン強度0.50M未満の溶液中で、約4℃から約40℃の温度で、エ チレンイミンオリゴマーとともにインキュベートする。処理時間（すなわち不活 化の終点）は、その特定のウイルスの構造および組成、処理温度、イオン強度、 およびエチレンイミンオリゴマー中のプロトン化しうる基の数に依存する。しか しながら、速度論的研究から、pHおよび不活化されるウイルスによって、処理時 間は最低２〜３秒から１時間、５時間、５０時間、１００時間、３００時間また は５００時間にもなりうることが示されている。好ましくは、選択的エチレンイ ミンオリゴマー不活化剤は、三量体、直鎖型四量体または分枝型四量体である。 ワクチン製造の方法は、当技術分野においてはよく知られており、例えば、ワク チン(Vaccines)(Slorein，G．Martance，E.編)第二版、1994、Saunders、Harcou rt-Brace、Phil.、Torontoに記載されている。 ワクチンの用途には、不活化ウイルスを直接ワクチン製剤に用いるか、または 、個々のもしくは複数回の投与量の容器中で凍結乾燥し、その後、薬学的に許容 できる担体と混合することができる。凍結乾燥した不活化ワクチンは、通常4℃ で保存する。 ワクチンはまた、アジュバント、すなわち抗原とともに用いると免疫反応を引 き起こすような物質の中に入れて、投与することもできる。このワクチンは、免 疫用量で投与することができる。免疫用量は、免疫反応を惹起または増強するの に必要な、抗原または免疫原の量である。この量は、存在する様々なアジュバン トの種類および有効性により、変化しうる。この量は、動物および免疫原もしく は抗原またはアジュバントにより異なるが、一般に、一回の投与量当たり約100m g未満であると考えられる。免疫用量は、宿主動物で、統計学的に有効な、免疫 およびチャレンジに関する研究を行うなど、当業者に周知の方法で、簡単に決定 することができる。例えば、臨床免疫マニュアル（Manual of Clinical Immunol ogy）、H.R．RoseおよびH．Friedman、アメリカ微生物学会、Washington D.C.(1 980)参照。 細胞もしくは生体高分子を含む組成物を処理する方法、または不活化ワクチン を産生する方法は、当技術分野において、エチレンイミン単量体およびβ-プロ ピオラクトンのような他のアルキル化剤により、非可逆的に不活化されることが 既に知られているウイルスを不活化する場合に、特に有用である。従って、本発 明の薬剤は選択性が高いために、ワクチンを製造するためのウイルスまたは混入 物を除去するための生物学的産生物を選択する際に用途がより広いが、部分的に は、当技術分野における他の不活化剤に関する経験から、示唆を得ることができ る。 本発明はまた、有効量の不活化ウイルスおよび薬学的に許容できる担体を含み 、該不活化ウイルスが、感染性を所望の程度まで（直接測定によれば少なくとも 約６ログまで、または本明細書の記述に従った計算によれば少なくとも約２０ロ グまで）減少させるのに有効なウイルス不活化条件下でウイルスを処理する方法 により製造される、不活化ワクチンに関する。本発明のワクチンは、動物または ヒトの疾患を予防するために有用である。所望の程度の免疫を惹起することので きるワクチンは、勿論、免疫反応を惹起するのに有効量の不活化ウイルスを含む 。これらのワクチンに含まれるウイルスゲノムは、他のワクチンに比し、核塩基 の内環の窒素がアルキル化されるが、他のいかなる選択的不活化剤がなし得るよ りも、ウイルス粒子内の他の生体高分子より核酸が修飾される相対速度が有意に 大きいため、不活化が遥かに効果的であるという事実により、それらのワクチン と実質的に異なっている。不活化ワクチンを産生する際には、ウイルスは不活化 するが免疫原性は保持するような量および条件下で、本発明の選択的不活化剤で ウイルス標品を処理する。 適当な薬学的担体およびそれらの剤形は、Martin、レミントン薬科学（Reming ton's Phavmaceutical Sciences）、第１９版（Mack Publishing Co.、Easton 1 995）に記載されている。そのような組成物は、一般に、患者に適正に投与する ための適正な投与形態を調製するために、有効量の化合物とともに適当量の担体 を含む。 本発明は更に、本発明の不活化ワクチンを対象に投与することにより、対象を ウイルスに対して免疫する治療方法に関する。投与対象は、ヒトまたはヒト以外 の動物である。本発明の治療方法を実施する際には、上述したような、本発明の 化合物の有効量が、当技術分野において知られている通常の、および許容できる どの方法によっても、単独または本発明の別の化合物との組み合わせで、投与さ れる。 本発明の治療方法を実施する際には、対象に投与するワクチンの量は、ウイル スの性質、投与計画、対象の年齢および生理的特性等を含む様々な検討項目に依 存する。医学分野で周知の臨床的な手法を用いて、適正な投与量が決定できると 考えられる。 本発明はまた、血液またはその分画を収容する容器を含む血液回収装置であっ て、該容器が容器に収容された血液またはその分画中のウイルスを不活化するの に有効な量のエチレンイミンオリゴマー不活化剤を含む装置を提供する。 別の態様においで、本発明は、不活化する条件下で、本発明のウイルスト活化 剤によって処理されたウイルスを含む診断用試薬および診断例を目的としている 。 理論に制約を受けたくはないが、選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤の 核酸に対する高い特異性は、明らかに、本発明を実施する際に扱う可能性のある 、以下の要因に関連する。エチレンイミン単量体およびエチレンイミンオリゴマ ーは、１個のアジリジノ基を含む（図１）。アジリジンの求電子剤としての反応 性は、アジリジン窒素のプロトン化に伴って、劇的に増加する。このため、アジ リジノ基がプロトン化された形の化合物のみが、おそらくは唯一の反応型である 。アジリジンの通常の求電子反応の速度は、溶液中の、それらのプロトン化型化 合物の濃度に比例するはずである。 図１の化合物I〜Vは、それらのアジリジノ基のpK_a値、ならびにアミノ基の数 、相対配置、およびpK_a値が、相互に有意に異なっている（図１）。このため、 アジリジノ基がプロトン化されているこれらの化合物の反応型の分画およびそれ ら全体の平均的な正電荷の両方が、pH値に大きく依存している（表２）。 表１ オリゴエチレンイミンのプロトン化可能な基のpK_a値 ^*）二つの第二級アミノ基の平均値^** ）二つの第一級アミノ基の平均値 アジリジンが蛋白質およびポリヌクレオチドに反応するとアミノ酸残基および 核塩基の両方の求核基がアミノアルキル化される（。他の多くの求電子剤のよう に、アジリジンは、プリンのN7、N3、およびN1で優先的に、およびピリミジンの N3でははるかに低い程度で、核酸を修飾する。鋳型合成は、N7がアルキル化され たプリン、多くの場合はグアニンの、イミダゾール環の開環が相対的に遅いこと が主な理由で、アルキル化剤により阻害される。例えば、エチレンイミンはグア ノシンを修飾してN7（アミノエチル）-グアノシンを生成するが、これはN7-アル キルグアノシンの場合よりイミダゾール環の開環速度が遥かに速い。 表２ オリゴエチレンイミンの総平均正電荷（A）およびそれらのアジリジノ基のプロ トン化の程度（B） pH7.5においてエチレンイミン単量体（I）がその四量体（IVおよびV）へと変 わると、溶液中の平均薬剤濃度に基づいて計算される、ファージの感染性不活化 の有効速度定数（k）は、二桁以上のオーダーで増加する（表３）。このような 変化の結果、アジリジノ基のpK_a値は５桁のオーダーで減少する。従って、このp Hでは、この薬剤の反応型画分は、約４桁のオーダーで減少する（表２）。この ため、pH7.5における単量体から四量体への変化によって、溶液中の反応型薬剤 の平均濃度（k１）に基づいて算出される速度定数は、およそ六桁のオーダーで 増加することになる。 表３ 反応型薬剤の総平均濃度（k１、括弧内）に基づき算出された、0.15M NaCl、20 ℃でのオリゴエチレンイミンの反応による、MS2ファージの感染性不活化（M^-1・ 分^-1）の速度定数 ^*速度定数は、生存曲線の最初の部分を用いて計算した。^** 直鎖型および分枝型四量体の等モル組成物 エチレンイミンオリゴマーは、オリゴカチオンとしてポリヌクレオチドに対し て高い親和性を有し、このことは、その結合定数に反映されている。静電気的な 相互作用に影響を受けるこの結合定数は、オリゴカチオンおよびポリアニオンの 体積当たりの電荷密度に比例するため、オリゴカチオンの総平均正電荷に伴って 増加する。エチレンイミン単量体がそのオリゴマーへ変化すると、分子の総平均 正電荷は、劇的に増加する（表２）。更に、エチレンイミンオリゴマー内でのプ ロトン付加可能な基同士の間の距離は、ポリヌクレオチド中の異分子間のリン酸 基の距離と同程度である。このために、単量体から四量体への変化によって、オ リゴエチレンイミンのプロトン付加可能な基の数が増加すると、例えばウイルス ＲＮＡのようなポリヌクレオチドに対するそれらの結合が増えることになる。 核酸の修飾に用いられるアルキル化剤の多くは、ポリヌクレオチドに対して、 特別な親和性を有しているわけではない。ポリヌクレオチド修飾のpH依存性を、 核塩基のpK_a値と比較すると、pH6.0〜8.0の範囲では、アルキル化を受けるのは 、主に中性型の核塩基であることがわかる。pHが更に高くなると、より反応性の 高い脱プロトン型のグアノシンおよびウリジン画分が増加し、このため、ファー ジ の不活加速度が速くなる。しかしながら、pH8.5におけるファージ感染性の不活 化の速度定数は、pH7.5の場合よりも小さくなる（表３）。このため、少なくと もこのpHの範囲においでは、反応型薬剤画分が不活加速度に及ぼす影響は、核塩 基の場合よりも大きい。従って、pH6.0-8.5において感染性不活化の速度定数を 算出する場合には、反応型（脱プロトン型）の核塩基画分は、基本的に一定であ ると仮定する。この結果、ファージMS2をオリゴエチレンイミンで不活化する際 には、不活化の速度定数のpH依存性は、主に、反応型画分および不活化剤の総平 均正電荷によって決定する。 pHを8.5から6.5に減少させると、有効不活化速度定数は60倍増加する。このこ とは、この薬剤の溶液中の反応性画分が増加することと相関する（表２および３ ）。このため、この場合には、不活化速度に対するpHの影響は、主として溶液中 の反応型薬剤の濃度変化によって決まる。しかしながら、三量体および四量体の 総平均正電荷のpH依存性は、エチレンイミン単量体の場合よりもはるかに著しく （表１）、このため三量体および四量体によるポリヌクレオチドの修飾速度の方 が、単量体および二量体による場合と比べてより多様性が大きいことは、強調さ れねばならない。 従来の不活化剤による任意のウイルス構成成分の修飾速度は、通常、溶液中の 薬剤の平均濃度の関数と考えられる。しかしながら、分子量の小さい薬剤が特定 のポリマーに対して特異的な親和性を有する場合には、このポリマー付近の薬剤 の局所濃度は、その薬剤の溶液中の平均濃度よりも高く、そのポリマーからの距 離に従って、指数関数的に減少する。ウイルスゲノム不活化の選択性は、それら の生体高分子付近の、薬剤の局所濃度の違いに比例するはずである。このため、 オリゴエチレンイミンの濃度がゲノム付近で局所的に増加するだけで、その修飾 速度は優先的に増加するはずである。しかしながら、上記で考察したように、エ チレンイミンのオリゴマーとポリヌクレオチドとの間で形成される複合体は、ア ジリジノ基のプロトン化の程度を増加させるはずであり、このため、ポリヌクレ オチドを修飾する速度定数（k１）をも増加させる。距離にしたがって薬剤濃度 は指数関数的に減少するため、そのポリマーから1-2nm離れると、薬剤の局所濃 度は、本質的には、その溶液中の平均濃度と等しい。明らかに、この距離での反 応 型薬剤画分は、溶液中の遊離（非会合）の状態と同じはずである。このため、不 活化剤のポリヌクレオチドへの会合とともに、ポリヌクレオチド付近の不活化剤 の濃度が増加しても、カプシド構成成分、特に、ウイルス粒子表面に存在するそ れらの抗原産生領域の修飾速度には、影響を与えないはずである。従来の不活化 剤と比べて、核酸に対して特異的な親和性を有する、本発明の選択的エチレンイ ミンオリゴマー不活化剤を用いることにより、ウイルスゲノム不活化の選択性が 増強される。 これらのデータおよび考察の全てから、ポリヌクレオチド親和性が高く、ウイ ルスゲノム修飾の反応速度が速く選択性の高い、エチレンイミン三量体または四 量体を、選択することとなる。上記で示したように、このようなオリゴマー化に より、少なくとも六桁のオーダーで選択性が増加する。従って、たとえエチレン イミン単量体の選択性が、現在、ウイルス粒子全体を用いた不活化ワクチンの製 造に用いられている他の薬剤よりすぐれていないとしても、三量体および四量体 の選択性が非常に増加するため、ウイルス粒子構成成分の免疫原性、安定性およ びその他のウイルス粒子の特性に対する修飾効果は、無視できるようになる。 ポリヌクレオチドの修飾に対する選択性を持つ、選択的エチレンイミンオリゴ マー不活化剤を用いることにより、安全かつ効率的な不活化抗ウイルスワクチン を製造する新たな機会が提供される。また、同様の方法を、動物組織および細胞 培養から単離された医薬品および動物用医薬品の場合と同様に、ドナーの血液お よび血清中の最も有害な混入物であるウイルスを選択的に不活化するために、用 いることができる可能性がある。同様の方法を、細胞または生体高分子を含む組 成物に混入する可能性のある、生物学的活性を持つ（例えば形質転換された）Ｄ ＮＡ断片を選択的に不活化するために用いることもできる可能性がある。 以下の実施例は、説明の目的で提供するもので、限定のためのものではない。ハロゲン塩の調製 上記のように、本発明のオリゴエチレンイミン不活化剤は、ハロゲン化水素塩 の形態で供給できる；好ましいハロゲンは、塩素、臭素、およびフッ素である。 β-クロロ-オリゴエチレンアミン塩酸塩の調製 これらの塩化物塩は、nを２以上５以下の整数として、β-クロロ-(CH₂-CH₂-NH )_nHの構造式を持つ。最も好ましいオリゴマーの塩は、(CH₂-CH₂-NH)の反復単位 が３または４のどちらかである。３量体の塩酸塩の構造式は以下のように表され る：[Cl-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂](HCl)₃。４量体塩酸塩は以下のよ うに表される：[Cl-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂](HCl)₄。 塩化物塩の調製は以下の通りである： １.（好ましくは冷却したキャピラリを用いて）0.6〜0.7mmole（約100μl）の オリゴエチレンイミン三量体または四量体を一滴ずつ、3〜5分かけて、0.8mlの 激しく撹拌し冷却した（0℃）濃塩酸に加える。さらに１０分間撹拌を続ける。 ２.反応液を40mlの純エタノールに注ぎ、撹拌し、-20℃に1〜2時間置く。 ３.水流ポンプによる陰圧下で多孔性のグラスフィルターを通して反応液を濾 過し、生成された結晶を15mlの純エタノールで３回洗浄する。水-エタノール溶 液から再結晶させる。50℃で乾燥する。生成された白い結晶は、水に完全に可溶 性であり、冷却したエタノールにはほとんど不溶性である。 ４.TLC分析：アルミニウムフォイル上のシリカゲル板上を上昇させる。溶媒系 :NaClで飽和された、エチレングリコール/プロピオン酸/水（14:3:3v/v）を含む モノメチルエーテル混合液を新たに（使用の1〜2時間前）調製する。約40分間（ 溶媒が約7cm前方へ移動する）展開する。通常の方法に従い、ニンヒドリンで染 色する。 三量体臭化物塩は以下のように調製される： 48%臭化水素酸（6.6mmol）0.79mlを、マグネティックスターラーを入れた広口 のガラス容器（容積＝5ml）にとり、激しく撹拌しながら水浴中で0℃に冷却する 。一端が毛細管状のガラス管に100mgのエチレンイミン三量体（0.78mmol）を取 り、0℃に冷却する。その後、管の毛細管状の端を冷却撹拌している臭化水素酸 に浸し、エチレンイミン三量体をゆっくりと（1分以上かけて）加え始める。三 量体を加えていくと、臭化水素酸溶液の黄色が消える。添加を終了したら、さら に20分間以上、0℃で撹拌を続け、その後、混合物を室温へ置く。十分な量の（ 約300g）の固形アルカリを入れた真空デシケーターに、開口した容器を入れ、オ イルポンプで次第に減圧する。液体が完全に蒸発するまでデシケーター内で混合 物を乾燥させる（10〜12時間）。 残存固形物（白色の結晶塊）を約20mlの沸騰したエタノールに溶かし、熱した グラスフィルターを通して濾過することにより残存固形物を除く。濾過物を-20 ℃に約24時間置く。N1-(β-臭化エチル)-ジエチレントリアミンの三臭化物の固 体をグラスフィルターで濾過し、冷却したエタノール（3x3ml）で洗浄し、25℃ で乾燥させる。乾燥した化合物の収量は140mg(40%)である。最終的な白色の非吸 湿性の結晶は、水に容易に溶け、冷却したエタノールに難溶性で、エーテルに不 溶性である。Tm=176〜177℃（分解せず）。NMRによれば（データは含んでいない ）、この化合物はほぼ純粋（90%以上）である。白い懸濁液が認められるまで、 もとの溶液を撹拌しながら室温でゆっくりとエーテルを加えれば、同じ融点のこ の化合物をさらに120mg得ることが可能と考えられる。4℃に一晩おき、その後、 上記の様に、濾過し、洗浄し、結晶を乾燥させる。N1-(β-臭化エチル)-ジエチ レントリアミンの総収量は〜260mg(75%)である。 実施例１ バクテリオファージの不活化 速度論的測定 バクテリオファージMS2は、通常の方法にしたがって調製した。ポリエチレン グリコール（PEG 6000，Serva）による再沈降法またはNaClの直線的濃度勾配（0 .02-1.0M,20mM Tris HCl,pH7.4）によるDEAE-Sephadex A25のクロマトグラフィ ー法によって精製した。精製したファージは0.15M NaCl溶液に懸濁し（2-10mg/m l）４℃で保存した。ウイルス懸濁液の感染性は、大腸菌CA180と肉-ペプトン寒 天を用いた通常の２層法で決定した。 エチレンイミン（I）、その三量体（II）、および直鎖型（IV）、および分枝 型四量体は、Kostyanovskyら(1988)Izv.Akad.Nauk SSSR 11:2566-2575の方法に 従って調製した。これらの化合物の純度は、PMRのデータによって95%以上である ことが示された。エチレンイミンの溶液は、0.15M NaCl溶液に計算した量の化合 物（化合物I,IIIおよびIV(V)の20℃における比重は、それぞれ0.836、0.945およ び0.968g・cm^-3）を使用直前に加えることによって調製した。 25℃における0.15M NaCl溶液中でのアジリジノ不活化剤のプロトン化しうる基 のpK_a値は、サーモスタット付きの小室のある自動滴定機TTT-60（Radiometer） を用いて、HClによる電位測定滴定の結果に基づいて計算した。pK_a値測定の精度 は0.05程度である。反応型（アジリジン窒素がプロトン化される）薬剤（Q）画 分は以下の式で計算される： ここで、pKi値はそれぞれの化合物中のアジリジノ基のpK_a値である。分子の総平 均市電荷（p）は以下の式で計算される： ここでd(H_nAⁿ⁺)は、そのpH値でのnの正電荷を持つ薬剤画分を示す。 混合前、ウイルスを含む組成物および新たに調製したエチレンイミンオリゴマ ー選択的不活化剤の溶液を20℃に保ち、希釈したNaOHおよびHCl溶液でpHを調節 した。20℃に保温した反応液の一部分を定められた時間間隔で採取し、即座に10 0倍希釈して感染性（力価）の測定に用いた。感染性不活化の有効速度定数（k） は以下の式で計算される： ここでAは薬剤の濃度（総濃度または反応画分濃度）；S₀およびS_tは不活化開始 前およびt分後の懸濁液の感染性（力価）を示す。 電位滴定曲線（図2）は一定の形となり、これはエチレンイミンオリゴマー不 活化剤のイオン化状態の変化を反映している。単量体の場合、単一のプラトーは アジリジノ基のプロトン化に対応している。算出されたpK_a値（表1）は、文献値 （ O'Rourkeら、(1956)J.Am.Chem.Soc.,78:2159-2160）と良く一致している。この ほかの化合物については、プラトーはアミノ基およびアジリジノ基のプロトン化 に対応している（表１）。オリゴマーIIからVによる酸の消費は、それぞれがpK_a 5.15-3.0の一つの基を持っていることを示し、これらの分子中に一つのアジリジ ノ基が存在することに対応している。分子IIからVは、より多数の強い塩基性の アミノ基が分子の総正電荷を増加させ、それによってアジリジノ基のプロトン化 を減少させるため、エチレンイミンに対するアジリジノ基のpK_aが減少を示す。 分子IVとVの間で、pK_aの違いが目立たないのは、おそらくこれらの分子の間では アジリジノ基とアミノ基の相互の配置が異なるためと考られる。化合物IIからIV の場合の最も塩基性のアミノ基をプロトン化するためには１当量の酸が必要だが 、化合物Vには２当量が必要である。これらのデータは、最初の３種の化合物で はそれぞれ一つの第１級アミノ基が存在し、Vにはこうした官能基が２つ存在す ることに対応している。１および２当量の酸を消費することは、１個および２個 の第２級アミノ基が存在することに対応しており、化合物IIIおよびIVのイオン 転移がそれぞれpH7.35および7.05で起こるために必要である。pH6.4で化合物Vが イオン転移のために１当量の酸が消費されることは、一つの第３級アミノ基が存 在することに対応している。これらの化合物では、第１級アミノ基のpK_a値が、 第２級および第３級アミノ基のものより高いのは、恐らくポリアミン分子の構造 と同様に電子効果によるものであろう。これらのデータを用いて、任意のpHにお ける化合物IからVの総平均正電荷およびアジリジノ基のプロトン化の程度を計算 した（表2）。 pH7.5において化合物IからVの作用によってファージMS2の感染性が指数関数的 に減少している（図３）ことは、ここで用いた条件下では、これらの化合物の濃 度が一定であることを示している。このことから、ここで得られたデータに基づ いて感染性不活化に対する有効速度定数（k）を計算することができる。表3に示 したように、エチレンイミン単量体からその四量体への変化は、この速度定数を ２桁程度増加させる。 pHを8.5から6.5に減少させると、エチレンイミン二量体によるファージ感染性 の不活化の速度は60倍増加する（図4、表3）。この化合物をpH6.5で用いると、 生存曲線の形を指数関数的なものから有意に変化させる（図4）。この変化は、 化合 物IIの濃度の急激な減少が、恐らくこのpHにおける陽イオンの重合によることを 示している。このため、pH6.5での化合物IIに対する不活化速度定数は、生存曲 線の最初の部分だけを用いて計算した。不活化の初期段階の速度定数および感染 性不活化の最大値を用いて計算したpH6.5での化合物IIの消失の速度定数は、約0 .02min¹である。 実施例２ 不活化終末点の計算 ウイルスを含む組成物の感染性の減少度は、サンプルの体積を（常識的な範囲 で）増やしたり、一連の植え継ぎを続けるたとしても、少なくとも6桁程度では 実験的に制御できるであろう。しかし、安全な不活化抗ウイルスワクチンを製造 するためには、元になるウイルスを含む組成物の感染性は少なくとも20桁程度で 減少している必要がある。このため、一般的には、抗ウイルス死菌ワクチンの安 全性は、実験だけでは決定できず、本明細書で述べる方法に組み込む必要がある 。この安全性は、速度論的な方法を用いた計算によってより意義のある評価をす ることができる。このためには、本発明による選択的な不活化剤の特徴を考慮に 入れた、ウイルスの不活化条件の正確な速度論的説明が必要である。データは生 存曲線の（実験的に制御された）初期部分から得ることができる。 正確な速度論的説明は、不活化の過程におけるウイルス懸濁液の感染性の、正 確な測定に基づかねばならない。当業者は、不活化速度定数および選択的な不活 化剤の作用が最小限持続する時間(t₁)が測定できるように、感染性（力価）の測 定を高い精度で行うべきである。t₁の信頼できる値は、特に生存曲線が特定の程 度に感染性が減少するまで、十分良く速度論的に描かれている場合には、下記の 速度論的な方法によって得ることができる。（DNA修復のような）生物学的な因 子によってウイルスゲノムの修飾が歪められないと仮定するなら、および最初の 不活化領域の形成が、ウイルス核酸中の位置に依らず、ゲノムの完全な複製を阻 害すると仮定するなら、本発明の選択的不活化剤が作用中のウイルスの生存曲線 は以下の等式に従う： S=S₀exp(-Akt) ここで、S₀およびSは選択的不活化剤の作用が開始する前および時間t後の、ウイ ルスを含む組成物の感染力価であり、Aは選択的不活化剤の濃度であり、kは不活 化すなわちゲノム当たりの１個のヌクレオチド残基が修飾される速度定数である 。 不活化の過程で、Aおよびkの値が一定であると仮定すれば、生存曲線は指数関 数になる。この場合、所定の程度の感染性の減少に必要な不活化の持続時間は、 以下の等式に従って計算される： t₁=[2.3/(Ak)]log(S₀/S) 表３で説明したように実施例１で得られた不活化に対する速度定数を用いて、 エチレンイミンオリゴマーの濃度が10^-3M（四量体として）、および、表３（pH7 .5）に基づいて不活化の速度定数をk=150、log(S/S₀)を所望の不活化の程度、こ の場合少なくとも約20と仮定すると、実施例１での感染性の減少のための時間は 、20℃で行った場合、15.3分になる。 本発明によれば、任意のウイルスおよび本発明の任意の選択的不活化剤を用い た場合の不活化の終点は、生存曲線の最初の部分から得られるデータに基づく小 活化条件のもとで、計算できる。 実施例３ ピコルナウイルス 一本鎖RNA、プラス鎖、カプシドには蛋白質だけを含むウ イルスである、A型肝炎ウイルス（エンテロウイルス属）および***ウイルス （アフタウイルス）について調べた。これらのウイルスは、精製および感染性な らびに安定性の測定を含む通常の方法に従って調製した。本発明の選択的エチレ ンイミンオリゴマー不活化剤を、上記の様に調製した。特定の塩溶液中および特 定の温度での不活化剤のpK_a値を測定した。ウイルスおよび選択したウイルス不 活化剤、即ちエチレンイミンオリゴマーを、表４に示したような各ウイルスごと の条件を用いて、特定のpH,温度および濃度で混合した。 表４ 20℃におけるエチレンイミン四量体の作用による動物ウイルスの不活化 (15〜20桁)に要する時間 ^*)ウイルスの種類および系統、ウイルス精製の方法、および反応液の組成に依存 する。 適当な時間間隔で反応液を採取したサンプルに、チオ硫酸（最終濃度0.1M）を 加えて過剰な不活化剤を抑えるために30分間放置し、反応液の感染性力価を上記 の方法で測定した。これらのウイルスの感染性を20桁程度減少させるのに要する 時間t₁を、上記の等式を用いて計算した。例えば、不活化の速度定数を約500（ 当業者に周知であり、実施例１で述べたバクテリオファージMS2とA型肝炎ウイル スのゲノムの長さの比較に基づく）とし、不活化の持続時間を、エチレンイミン オリゴマーの濃度を10^-4M（四量体の場合）、および不活化の速度定数をk=500（ pH7.5）、およびlog(S/S₀)を所望の不活化度、この場合少なくとも約20にすると 、本実施例での感染性減少に要する時間は、20℃で行うと30分になる。 実施例４ ラブドウイルス 一本鎖RNAウイルスで、脂質で包まれたヌクレオカプシドを 持つ、水抱性口内炎ウイルス（VSV）の不活化を調べる。 VSVはヒトA549細胞で培養する。マウスL929細胞またはヒトA459細胞のEMCスト ックを調製する。当業者に既知の方法で培養およびアッセイ方法を行う。VSVの 感染性は、10％ウシ胎仔血清を含むDMEM倍地で10倍の段階希釈を行い、終末点で 測定 する。各希釈ごとに96穴マイクロタイタープレート中のヒトA549細胞8穴ずつに 添加する。ウイルスにより誘発された細胞病理学的変化は、37℃、5%CO₂存在下 で72時間培養後、評価する。記録されたウイルスの力価は既知の方法で評価する 。 細胞に付着したVSVは、コンフルエントなヒトA549細胞の単層を、150cm²の組 織培養用フラスコ中で、5%CO₂存在下、37℃で1時間、5mlの10⁷ID₅₀/mlのVSVを加 えた無血清DMEM中でインキュベートして得る。これらの条件下では、感染価は約 2.1TCID₅₀/細胞である。不活化を評価するために、ポリスチレンチューブ内で3m lのDMEM中に含まれる細胞吸着性ウイルスに、選択的不活化剤を添加する。少量 の反応溶液を、一定の時間間隔で採取し、チオ硫酸（最終濃度0.1M）を加えて過 剰な不活化剤を抑えるために30分間放置する。細胞は遠心によって除去し、上清 および再懸濁したペレットの感染力価を評価する。これらのウイルスの感染性を 20桁程度減少させる時間t₁を、上記の等式を用いて計算する。 選択的不活化剤の存在下で全血（5X10⁹赤血球／ml）に加えた無細胞VSVの不活 化を評価する。ウイルスの感染性は、本明細占の記述に従って評価する。これら のウイルスの感染性を20桁減少させるのに必要な時間t₁は上記の等式を用いて計 算できる。赤血球の構造と機能を評価する。 実施例５ オルソミクソウイルス科 一本鎖断片化RNA、マイナス鎖、脂質で包まれたカ プシドのウイルスである、A型インフルエンザウイルスの不活化を評価する。ウ イルスは、精製および感染性ならびに安定性の測定など通常の方法に従って調製 する。本発明の選択的不活化剤を、上記の様に調製する。特定の塩溶液中および 特定の温度での、不活化剤のpK_a値を測定する。A型インフルエンザウイルスおよ び選択されたウイルス不活化剤は、上記で説明したようなこのウイルスに対する 条件下で、特定のpH,温度および濃度で混合する。ウイルスの感染性は、本明細 書に記載した方法で評価する。これらのウイルスの感染性を20桁減少させるのに 要する時間t₁は、上記の等式を用いて計算する。 実施例６ ヒト免疫不全ウイルス（２コピーの一本鎖RNAゲノム、頻繁に変異するカプシ ド蛋白質）について研究する。無細胞または細胞内型のHIVを、試験管内の全血 また は濃縮赤血球に加える。選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤を加えてサン プルを処理した後、HIV抗原を測定する。ウイルスの感染性は、本明細書中に記 載した方法で評価する。これらのウイルスの感染性を20桁減少させるのに要する 時間t₁は、上記の等式を用いて計算する。 実施例７ 周辺の蛋白質濃度と反応速度が無関係であること 培養液中の蛋白質濃度が高いと、ウイルスゲノムとの反応速度に有意な影響が 認められるかを検討する目的で、3%（30mg/ml）までの濃度の蛋白質の存在およ び非存在下でのMS2ファージの不活化を測定した。0.15M NaCl中に懸濁したMS2フ ァージを等量のヒト血清アルブミンに加えた。オリゴエチレンイミン三量体また は四量体を、最終濃度それぞれ0.4mMまたは0.2mMでファージ懸濁液に添加し、pH 7.0、25℃でインキュベートした。経時的に検体を採取し、残存する感染性（フ ァージ力価）を分析した。計算した速度定数を表５に示す。 表５ ヒト血清アルブミン存在下でのファージMS-2感染性不活化の速度定数 ウイルスの不活化速度に対する高い蛋白質濃度の効果が明確に認められなかっ たことは、エチレンイミンとウイルスゲノムの反応は高度に選択性が高いことを 支持し、高濃度の蛋白質もしくは他の生体高分子を含む生物学的またはその他の 液体中でも、核酸が修飾されることを示している。実施例８ ファージ感染性の不活化（核酸の修飾）の特異性： エチレンイミンオリゴマーによる蛋白質の非修飾 エチレンイミン単量体（25mM）、三量体（0.4mM）および四量体（0.2mM）によ るMS2ファージ感染性の不活化を、0.9%ヒト血清アルブミン存在下、0.02Mリン酸 緩衝液pH7.0-7.2中で、25℃で、種々の不活性化度となるよう行った。チオ硫酸 （最終濃度0.1M）で不活化反応を終了させた後、各培養液から得た検体を、還元 条件または非還元条件の12.5%SDS-PAGE法および等電点電気泳動（pH3から7の範 囲）で比較した。 表６に示すように、80桁までの不活化に伴って、還元条件においても非還元条 件においてもSDS-PAGE法でアルブミンの変化は検出されず、不活化は蛋白質の大 きさに影響を及ぼさないことが示された。 表６ エチレンイミンオリゴマーによる蛋白質の非修飾、SDS-PAGE分析 ^# 還元条件および非還元条件のSDS-PAGEで、主なバンドは約６８kDaにあり、約 ５本のより分子量の大きいかすかなバンドを伴っている。^・ 還元条件および非還元条件で変化が見られない。 しかし、表７で示すように、等電点電気泳動（IEF）によってアルブミン検体 を分析すると、エチレンイミン単量体による不活化は、三量体または四量体と異 なり、アルブミンの電荷の不均一性を有意に増加させ、より塩基性にする。この ことは、エチレンイミン単量体がアルブミンを修飾し、電荷を変化させることを 示している。一方、エチレンイミン三量体および四量体は、81桁のまでの同程度 の 不活化度でも、アルブミンの電荷に対しては検出できる変化を及ぼさない。この ことは、エチレンイミンオリゴマーによる不活化反応は核酸に対して非常に選択 的であるが、同じ条件下でのエチレンイミン単量体による不活化は核酸と同様に 蛋白質も修飾することを示している。 表７ エチレンイミンオリゴマーによる蛋白質の非修飾、等電点電気泳動分析 ^# 一本の主なバンドがpI約5.5にみられる。^・ 主に正の電荷が増加する方向（より塩基性）に主なバンドの幅と拡敗度が増 加している。 実施例９ エンベロープを持つ動物ウイルスの不活化 エンベロープを持つ動物ウイルスの不活化を示すために、ヴェネズエラウマ脳 炎ウイルス（「VE」）を、0.2%ウシ血清アルブミンを含む0.02M燐酸緩衝液中で 、エチレンイミン三量体（2mM）または四量体（0.5mM）で、22℃または37℃で、 24時間までインキュベートした。反応溶液から、経時的に検体を取り、残存する ウイルス濃度を測定した。不活加速度定数は、最初の７時間のデータから決定し た。結果を、以下の表８に示す： 表８ エチレンイミンオリゴマーによるベネズエラウマ脳炎ウイルスの不活化に対する 速度定数 実施例１０ エンベロープを持つ動物ウイルスの不活化過程 における抗原性エピトープの保存 エチレンイミンオリゴマーによる不活化の過程で、抗原性を持つエピトープが 保存されることを示すために、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを、37℃で、エチレ ンイミン三量体2mMで、７時間まで不活化した。不活化開始３時間および７時間 後、ウイルスの抗原性を、３つの異なる単クローン抗体を用いたELISAアッセイ で測定した。終末点の力価を測定し、不活化前のウイルスの力価と比較した。こ こで用いた単クローン抗体は、1A1B-9、7A1A-1および7A3A-4であった。1A1B-9抗 体は、型特異的抗原を認識し、一方、7A1A-1および7A3A-4抗体は、ウイルスカプ シド抗原の伸展に伴って露出される、潜在エピトープを認識する。 表９に示すように、８桁のオーダー以上の不活化（３時間の不活化）または推 定で18.7桁の不活化（７時間の不活化）の後に、抗原の反応性に変化は見られな かった。 表９ エチレンイミン三量体（2mM）によるベネズエラウマ脳炎ウイルスの不活化過程 における抗原エピトープの保存 実施例１１ エチレンイミンオリゴマーの臭化塩による MS2 ファージの不活化速度論 エチレンイミンオリゴマーの臭化塩によるMS2ファージの不活化の速度論を決 定するために、ファージを、25℃で24時間までの様々な時点で、pH7.0の何種類 かの緩衝液中で、エチレンイミン三量体、エチレンイミン四量体、エチレンイミ ン量体の臭化水素塩（β-ブロモエチル−ジエチレントリアミン三臭化水素酸塩 ）またはエチレンイミン四量体の臭化水素塩（β-ブロモエチル−トリエチレン テトラアミン四臭化水素酸塩）とともにインキュベートした。検体を経時的に採 取し、残存する感染性を測定して、感染性の不活化に対する速度定数を求めた。 表１０に結果を示すように、臭化塩で処理すると、MS2ファージは、それぞれ、 エチレンイミンの三量体または四量体に変換されることにより不活化される。対 応するエチレンイミンオリゴマーの存在下における不活化と比較して、臭化塩の 不活化の速度は幾分遅いが、このことは、この転換が約30〜40％しか完了してい ないことを示している。にもかかわらず、ハロゲン塩を用いることは、それらの 安定性の高さおよび簡便さのために、好ましいと考えられる。これらのデータは また、燐酸陰イオンがこの反応を阻害することをも示しているが、これは恐らく 、核酸とエチレンイミンオリゴマーの相互作用を、リン酸陰イオンまたはリン酸 の強い負の電荷が妨害することによるものと思われる。 表１０ エチレンイミン三量体および四量体および対応する臭化塩によるMS2ファージの 不活化速度定数 A：0.15M NaCl B：0.075M NaCl，0.2M MOPS C：0.1M NaCl，0.025M リン酸 D：0.075M NaCl，0.2M リン酸 以上の記述より、本発明の選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤および方 法は、例えば病院や実験室のような様々な状況下で、キットの一部として、細胞 または生体高分子を含む組成物中の血液を介して伝幡するウイルス、細菌、また は寄生体を不活化するために用いることが可能であることが認識される。細胞の 組成には多種の蛋白質が含まれるため、本明細書に記述されたウイルス不活化法 はまた、（第VIII因子および第IX因子のような）凝固因子、血清アルブミン、お よび／または免疫グロブリンを含むがこれらに限定はされない分画を含む、特に 血漿蛋白質分画または精製血液製剤といった蛋白質分画にも適用することができ る。ウイルスおよび細菌は、蛋白質分画または精製蛋白質を、本明細書に記述さ れた選択的エチレンイミンオリゴマー不活化剤で処理することにより、不活化で きると考えられる。 本発明の過程は、更に他の様式のウイルス不活化と組み合わせることが可能で ある。例えば、（低pHの緩衝液中でのクロマトグラフィー、またはカルシウムキ レート剤を含む酸性溶液中での赤血球の保存といったような）医用産物の調製に 用いられるある種の過程には、偶然に、通常は外殻を持つ特定の感受性ウイルス を不活化する特性が存在する場合がある。それらの薬剤でそのようなウイルスを 不活化する際に、エチレンイミンを付加する事も考えられる。 ウイルスとの関連で述べたように、本発明の方法は、保存血液または血液製剤 に見られる、細菌や血液感染性の寄生体を含むいかなる生物学的な混入物を不活 化するためにも、一般に有用であることが認識されると思われる。 上述の説明は、理解を明確にする目的で詳細に記載してきたが、後述する請求 の範囲内で、一定の変更が可能であることは明らかであると思われる。 本出願で引用した全ての出版物および特許文献はそれら個々の出版物または特 許文献が独立に記載されている場合と同程度に、全て参考文献として組み込まれ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｋ 37/02 38/43 37/48 Ｃ０７Ｃ 211/15 37/66 Ｄ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的組成物中のウイルスを不活化する方法であって、ウイルスを不活 化する条件下で、ｎが２以上５以下の整数の一つである、構造式β-Hal-(CH₂-CH₂ -NH)_nHを有する選択的不活化剤に該組成物を接触させることを含む方法。 ２．ｎが２または３である、請求項１記載の方法。 ３．生物学的組成物が細胞を含む組成物である、請求項１記載の方法。 ４．生物学的組成物が、哺乳類の全血、精製または部分精製された血液蛋白質 、血液細胞蛋白質、乳汁、唾液、血漿、血小板に富んだ血漿、濃縮血漿、該血漿 の任意の分画に由来する沈降物、該血漿の任意の分画に由来する上清、血清、寒 冷沈降物、寒冷上清、細胞溶解液、哺乳類培養細胞、哺乳類細胞培養培地、胎盤 抽出物、発酵産物、および血液細胞中に誘導された蛋白質から成る群より選択さ れる、請求項１記載の方法。 ５．生物学的組成物が哺乳類の全血である、請求項１記載の方法。 ６．生物学的組成物が血漿である、請求項１記載の方法。 ７．生物学的組成物が、フィブリノーゲン、第VII因子、第VIII因子、第IX因 子、第X因子、免疫グロブリン、プレアルブミン、レチノール結合蛋白質、アル ブミン、α−グロブリン、γ−グロブリン、補体構成成分、フィブロネクチン、 抗トロンビンIII、ヘモグロビン、インターフェロン、成長因子、プラスミノー ゲン活性化因子、成長ホルモン、インスリンおよびエリスロポエチンから成る群 より選択される蛋白質を含む、請求項１記載の方法。 ８．蛋白質がヒトの蛋白質である、請求項７記載の方法。 ９．ウイルスがエンベロープを持つウイルスである、請求項１記載の方法。 １０．ウイルスがエンベロープを持たないウイルスである、請求項１記載の方 法。 １１．ｎが２以上５以下の整数の一つである、構造式β-Hal-(CH₂-CH₂-NH)_nH を有する化合物。 １２．ｎが２または３である、請求項１１記載の化合物。 １３．構造式[Br-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂](HBr)₃を有する化合物 。 １４．構造式[Cl-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH₂](HCl)₃を有する化合物。