JP2001523472A - ***の疾患の検出に有用な試薬および方法 - Google Patents

***の疾患の検出に有用な試薬および方法

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Abstract

(57)【要約】 BS265と称される、連続的または部分的に重複したcDNA配列のセット、およびそれにコードされ***組織から転写されるポリペプチドを記載する。これらの配列は、個体における乳癌などの***の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。また、***の疾患、腫瘍または転移の治療に有用な分子である、BS265コード化ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体、および組織特異的BS265ポリペプチドの作用を妨げるアゴニストまたは阻害剤を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 本発明は、概して、***の疾患の検出に関する。更に、本発明は、***の疾患
を検出するための試薬及び方法にも関する。特に、本発明は、ポリヌクレオチド
配列、それにコードされているポリペプチド配列などの試薬、およびこれらの配
列を利用する方法に関する。これらのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は
、乳癌などの***の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判
定、in vivoイメージング、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。
【０００２】 乳癌は、米国において女性に発症する癌の形態としては、最も一般的なもので
ある。1998年に米国で乳癌と診断された数はおよそ180,300例と推定され、乳癌 関連で死亡した例は43,900例にのぼる（American Cancer Society）。1985年に7
00,000例であった乳癌の発症例は、1990年には900,000例になり、世界的に増加 傾向にある（G．N．Hortobagyi et al., CA Cancer J Clin 45: 1993）。
【０００３】 乳癌などの***の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判
定、in vivoイメージング、予防もしくは治療または素因の判定は、患者の成り 行きに非常に重要である。例えば、遠位転移乳癌と診断された患者の5年生存率 が約20％であるのに対し、初期相の乳癌と診断された患者は90％以上の生存率を
有する（American Cancer Society statistics）。現在、初期相の乳癌を示す最
も優れた最初の指標は、***の検診及びマモグラフィーである（J．R．Harris e
t al . In: Cancer: Principle and Practice of Oncology, Fourth Edition, p
p. 1264-1332, Philadelphia, PA: J/B. Lippicott Co. (1993)）。マモグラフ ィーは***の検診によって検出し得ない段階で乳癌を検出することが可能である
が、その効果は限られている。例えば、マモグラフィーによる検出能力は、観察
者の熟練度及びマモグラム（***Ｘ線写真）の枚数によって左右される。更に、
乳癌と疑わしいマモグラムの80〜93％は偽陽性である一方、乳癌患者の10〜15％
はマモグラムにおいて陰性である（C.J.Wright et al., Lancet 346: 29-32(199
5)）。従って、初期乳癌に対しより高感度で特異性に優れた新たな診断方法の開
発がおおいに望まれている。
【０００４】 乳癌患者は、初期治療の後からアジュバント治療の間、治療に対する応答性を
検討し、潜伏性又は再発性疾患を検出するために厳密にモニターされる。現在、
乳癌をモニターする診断方法には、マモグラフィー、骨スキャン、胸部Ｘ線写真
、肝機能試験及び血清マーカー試験等がある。患者をモニターするために最も一
般的に使用される血清腫瘍マーカーは癌胎児性抗原（CEA）及びCA15-3である。 しかし、CEAには、転移疾患に罹患している女性患者の約40％において血清レベ ルが上昇しないという限界がある。更に、アジュバント治療中におけるCEA上昇 は、疾患の再発ではなく、臨床上重要でないその他の要因に関連していると考え
られる。CA15-3もまた進行性疾患患者の多くにおいて陰性を示し、そのため癌転
移を診断できない場合がある。CEA及びCA15-3レベルは、非悪性、即ち良性状態 において上昇するため、陰性の結果が得られない場合がある。従って、腫瘍再発
の検出においてより高感度で特異性に優れた***関連マーカーを見出すことは、
臨床上の利益をもたらす（J.K.Harris et al., 上掲 M.K.Schwartz, In: Cancer
: Principles and Practice of Oncology. Vol. 1, 第４版、pp. 531-542, Phila
delphia, PA: J/B. Lippincott Co. 1993）。
【０００５】 病期を明らかにすることにより有効な診断効果が得られ、好適な治療計画を構
築するための基準が得られることから、疾患の病期を明らかにすることは、乳癌
治療における他の重要なステップである。現在、より正確な診断が可能であるこ
とから、乳癌の病理学的病期分類は臨床的病期分類よりも優れている（J.R.Harr
is et al.,上掲）。一方、少なくとも病理学的病期分類と同程度に正確性がある
ならば、病理評価のために組織を採取する侵襲的工程を必要としない点で、臨床
的病期分類が好ましい。異なった侵襲期を区別し得る血清中または尿中の新規マ
ーカーを検出することによって、乳癌の病期分類を改善することが可能であった
。このようなマーカーは、***の原発性腫瘍を起源とし、血中、骨髄中又はリン
パ節に転移した細胞によって発現されるmRNA又はタンパク質マーカーであること
が可能であり、これら遠位組織への転移に対する高感度な指標として有用であり
える。例えば、***の上皮細胞に関連する特異的なタンパク質及びmRNAが、それ
ぞれ免疫組織技術及びRT-PCRによって、転移が疑われる乳癌患者の骨髄、リンパ
節及び血液中において検出された（K.Pantel et al., Onkologie 18:394-401（1
995））。
【０００６】 このような診断方法には、最低限の侵襲的処理によって得られる血液、血漿、
血清又は尿などの試験サンプル中における、免疫学的方法によって検出可能な様
々な疾患マーカーの発現に基づく免疫学的アッセイ法も含まれる。これらの診断
方法は、乳癌患者に大きな費用の負担をかけることなく、臨床医の助けとなる情
報を提供する。前立腺特異抗原（PSA）やヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）等
のマーカーが存在し、それぞれ前立腺癌及び精巣癌患者のスクリーニングに臨床
上利用されている。例えば、健常人では、PSAは精巣から***中に高濃度で分泌 されるが、血中には非常に低レベルにしか存在しない。血清中のPSAタンパク質 レベルの上昇は、無症候性患者の前立腺癌又は疾患の早期検出に利用されている
（G.E.Hanks et al., In: Cancer: Principle and Practice of Oncology, Vol.
1, 第４版、pp.1073-1113. Philadelphia, PA: J.B.Lippincott Co. 1993. M.K.
Schwartz et al., In: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Vol.1,
第4版, pp. 531-542, Philadelphia, PA:J.B.Lippincott Co.1993）。同様に、
***において正常に発現されているが、***疾患の結果、不適当な身体部分にお
いて高レベルに検出される新規マーカーを使用することによって、***疾患への
処置も改善することができる。
【０００７】 更に、初期乳癌の生物学的性質を予測し得る新規マーカーも、非常に有効であ
る。患者の生命を脅かす、あるいは将来脅かすことになる初期乳癌は、このよう
な脅威にない、または将来において脅威とならない癌に比較しより臨床上の重要
性が大きい（G.E.Hanks 上掲）。組織学的に陰性なリンパ節を有する何れの患 者が癌再発を発症するか、またin situにおける管癌（ductal carcinoma）の何 れのケースが侵襲性の乳癌に発達するかを予測するうえで、このようなマーカー
が必要となる。より正確な診断マーカーを用いることにより、臨床医は十分な治
療を施さなければ増殖し転移するであろう***に局在する初期癌を正確に同定す
ることが可能となる。更に、侵襲性の癌に対するマーカーが患者に存在しない場
合には、患者に高価で有益でない処置を施す必要がなくなる（J.R.Harris et al
., 上掲, E.R.Frykberg et al,. Cancer 74:350-361 (1994)）。
【０００８】 したがって、***の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後
判定、in vivoイメージング、予防もしくは治療または素因の判定のための有用 な特異的な方法および試薬を提供したり、またはこれらの状態の、可能な素因を
示すことは有益であろう。そのような方法は、***に関する疾患および状態（例
えば、癌）において過剰発現される遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセ
イすることを含むであろう。また、そのような方法は、癌を含む***関連疾患ま
たは状態によって改変された遺伝子の産物に関して試験サンプルをアッセイする
ことを含むかもしれない。さらに、そのような方法は、身体の種々の組織および
画分中の分布が癌を含む***関連疾患または状態により改変している遺伝子の産
物に関して試験サンプルをアッセイすることを含もう。そのような方法には、試
験サンプル中のmRNAからcDNAを合すること、必要であれば遺伝子に対応するcDNA
の部分またはその断片を増幅すること、癌を含む疾患若しくは状態の存在の指標
としてcDNA産物を検出すること若または疾患の存在の指標として遺伝子配列を含
むmRNAの転写産物の検出をおこなうことが含まれる。有用な試薬には、生検され
た組織、血液または他の試験サンプルから抽出したmRNAの逆転写酵素ポリメラー
ゼ連鎖反応（RT-PCR）、PCRまたはハイブリダイゼーションアッセイなどの診断 方法において使用しうるポリヌクレオチドまたはその断片;そのようなmRNAの翻 訳産物であるタンパク質;又はこれらのタンパク質に対する抗体が含まれる。こ のようなアッセイには、遺伝子産物についてサンプルをアッセイする方法及び乳
房疾患の指標として産物を検出する方法が含まれる。このように、癌を含む***
の疾患及び状態に対する薬物治療または遺伝子治療は、これらの同定された遺伝
子配列またはそれらの発現されたタンパク質に基づくことが可能であり、いずれ
かの特定の療法の効力をモニターすることが可能である。さらに、初期段階の乳
房疾患（例えば、癌）を検出する能力を有する代替的な非外科的診断方法が利用
可能になれば、有益であろう。
【０００９】 発明の概要 本発明は、試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドを検出する方法であ って、該試験サンプルを、少なくとも1つのBS265特異的ポリヌクレオチドと接触
させ、該試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドの存在を検出することを 含んでなる方法を提供する。BS265特異的ポリヌクレオチドは、配列番号１、配 列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6およびそれらの断片ま たは相補体よりなる群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の
同一性を有する。また、該方法を行なう前に、BS265特異的ポリヌクレオチドを 固相に結合させることが可能である。
【００１０】 本発明はまた、試験サンプル中のBS265 mRNAを検出する方法であって、少なく
とも1つのプライマーで逆転写（RT）を行なってcDNAを得、得られたcDNAを、BS2
65オリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして
使用して増幅して、BS265アンプリコンを得、試験サンプル中のBS265 mRNAの存 在の指標として該BS265アンプリコンの存在を検出することを含んでなり、該BS2
65オリゴヌクレオチドが、配列番号1、配列番号２、配列番号３、配列番号４、 配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれ
る配列に対して少なくとも50％の同一性を有することを特徴とする方法を提供す
る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応により行なうことができる。また、該方法を
行なう前、増幅の前または検出の前に、該試験サンプルを固相と反応させてもよ
い。この反応は、直接的または間接的な反応であってもよい。さらに、該検出工
程は、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識の使用を含む。この検出
可能な標識は、固相に結合させることが可能である。
【００１１】 本発明はさらに、標的BS265ポリヌクレオチドを含有する疑いのある試験サン プル中の標的BS265ポリヌクレオチドの検出方法であって、（a）該試験サンプル
を、センスプライマーとしての少なくとも1つのBS265オリゴヌクレオチドおよび
アンチセンスプライマーとしての少なくとも1つのBS265オリゴヌクレオチドと接
触させ、増幅して第1段階反応産物を得、（b）該第1段階反応産物を少なくとも1
つの他のBS265オリゴヌクレオチドと接触させて、第2段階反応産物を得（ただし
、前記の、他のBS265オリゴヌクレオチドは、工程（a）で使用するBS265オリゴ ヌクレオチドの3’側に位置し、該第1段階反応産物に相補的である）、（c）該 試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドの存在の指標として該第2段階反応
産物を検出することを含んでなる方法を提供する。該方法において試薬として選
択するBS265オリゴヌクレオチドは、配列番号1、配列番号２、配列番号３、配列
番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群か
ら選ばれる配列に対して少なくとも50％の同一性を有する。増幅は、ポリメラー
ゼ連鎖反応により行なうことができる。また、該方法を行なう前、または増幅の
前、または検出の前に、直接的または間接的に該試験サンプルを固相と反応させ
ることが可能である。
【００１２】 また、該検出工程は、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な標識の使用
を含む。さらに、この検出可能な標識は、固相に結合させることが可能である。
【００１３】 また、試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドを検出するのに有用な試 験キットであって、配列番号1、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番 号５、配列番号６およびそれらの断片または相補体よりなる群から選ばれる少な
くとも1つのBS265特異的ポリヌクレオチドを含有する容器を含んでなる試験キッ
トを提供する。これらの試験キットはさらに、試験サンプル（例えば、血液、尿
、唾液および糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器を含む。そのような
手段には、血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾
液を採集し安定化するためのスワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採集し安
定化するためのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避け
るために、所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理すること
が可能である。また、試料の完全性を維持するのを助けるために、該採集材料を
保存剤、安定化剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定化
剤または抗微生物剤を含有させることが可能である。
【００１４】 本発明は、BS265遺伝子に由来する精製されたポリヌクレオチドまたはその断 片をも提供する。該精製ポリヌクレオチドは、BS265遺伝子またはその相補体の 核酸に選択的にハイブリダイズする能力を有する。該ポリヌクレオチドは、（ａ
）配列番号1，配列番号５、配列番号６；（ｂ）配列番号1、配列番号２、配列番
号３、配列番号４の断片；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の相補体よりなる群から
選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有する。さらに、
該精製ポリヌクレオチドは、組換えおよび／または合成技術により製造すること
ができる。該精製組換えポリヌクレオチドは、組換えベクター中に含有されてい
ることが可能である。本発明はさらに、該ベクターでトランスフェクトされた宿
主細胞を含む。
【００１５】 本発明はさらに、BS265に由来するオープンリーディングフレームを含む核酸 配列を含んでなる組換え発現系を提供する。該核酸配列は、配列番号1、配列番 号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびそれらの断片ま
たは相補体よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも50％の同一性を有す
る。該核酸配列は、所望の宿主に和合性の制御配列に作動的に結合している。ま
た、この組換え発現系でトランスフェクトされた細胞を提供する。
【００１６】 本発明はまた、BS265にコードされるポリペプチドを提供する。該ポリペプチ ドは、組換え技術により製造し、精製形態で提供することが可能であり、または
合成技術により製造することが可能である。該ポリペプチドは、配列番号16及び
配列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少
なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】 また、少なくとも1つのBS265エピトープに特異的に結合する抗体その他の特異
的結合分子を提供する。該抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
体であることが可能である。該エピトープは、配列番号16及び配列番号17並びに
それらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に由来する。試験サンプル中
のBS265抗原または抗BS265抗体の存在を判定するためのアッセイキットも含まれ
る。1つの実施態様では、該アッセイキットは、配列番号16及び配列番号17並び にそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも50％の
同一性を有する少なくとも1つのBS265ポリペプチドを含有する容器を含む。さら
に、該試験キットは、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を採
集するのに有用な手段を有する容器を含む。そのような手段には、血液を採集し
安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するた
めのスワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが
含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるために、所望により、
紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理してもよい。また、試料の完全性
を維持するのを助けるために、これらの採集材料を保存剤、安定化剤または抗微
生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定化剤または抗微生物剤を含有さ
せてもよい。また、該ポリペプチドを固相に結合させることが可能である。
【００１８】 本発明の他の態様では、疾患又は状態を検出又は診断することを目的として、
患者中のBS265抗原を検出するため、または局在位置をイメージングするために 、BS265抗原に対する抗体又はその断片を使用し得る。このような抗体は、ポリ クローナル抗体、モノクローナル抗体、又は分子生物学的手法により生産された
ものでもあり得、例えば放射性同位体や磁性金属などを含むがこれらに限定され
ない様々な検出可能な標識で標識され得る。更に、モノクローナル、ポリクロー
ナル及び分子生物学的に産生されたものの別を問わず、抗体又はその断片を、BS
265抗原の発現により特徴付けられる疾患の治療用薬剤として使用し得る。治療 に用いる場合には、誘導体化することなく使用することが可能であり、また、放
射性同位体、酵素、毒物、薬物、プロドラッグその他の細胞傷害性薬剤で誘導体
化することも可能である。
【００１９】 BS265抗原または抗BS265抗体の存在を判定するためのもう1つのアッセイキッ トは、BS265抗原に特異的に結合する抗体等の特異的結合分子を含有する容器を 含んでなり、該BS265抗原は、少なくとも1つのBS265コード化エピトープを含む 。該BS265抗原は、配列番号16および配列番号17並びにそれらの断片よりなる群 から選ばれるBS265コード化抗原の配列に対して少なくとも60％の配列類似性を 有する。さらに、該試験キットは、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液およ
び糞便）を採集するのに有用な手段を有する容器を含む。そのような手段には、
血液を採集し安定化するためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し
安定化するためのスワブ、ならびに尿または糞便サンプルを採集し安定化するた
めのカップが含まれる。該サンプルの変性または不可逆的吸着を避けるために、
所望により、紙、布、スワブ、カップなどの採集材料を処理してもよい。また、
試料の完全性を維持するのを助けるために、これらの採集材料を保存剤、安定化
剤または抗微生物剤で処理したり、該採集材料に保存剤、安定化剤または抗微生
物剤を含有させてもよい。また、該抗体を固相に結合させることが可能である。
【００２０】 BS265のエピトープの少なくとも1つを含有するポリペプチドの製造法であって
、発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートすることを
含んでなる製造法を提供する。このベクターは、配列番号16および配列番号17並
びにそれらの断片よりなる群から選ばれるBS265アミノ酸配列に対して少なくと も50％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列を含む。
【００２１】 また、BS265抗原を含有する疑いのある試験サンプル中のBS265抗原を検出する
方法を提供する。該方法は、BS265抗原のエピトープの少なくとも1つに特異的に
結合する抗体またはその断片と該試験サンプルとを、抗体／抗原複合体の形成に
十分な時間および条件下で接触させ、該抗体を含有するそのような複合体の存在
を、該試験サンプル中のBS265抗原の存在の指標として検出することを含む。該 抗体は、固相に結合させることが可能であり、モノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体であることが可能である。さらに、該抗体は、配列番号16および配
列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれる少なくとも1つのBS265抗原
に特異的に結合する。
【００２２】 これらの抗体を含有する疑いのある試験サンプル中のBS265抗原に特異的に結 合する抗体を検出する、もう1つの方法を提供する。該方法は、BS265ポリヌクレ
オチドにコードされるアミノ酸またはその断片に対して少なくとも50％の同一性
を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのBS265エピトープを含有するポリペ
プチドと該試験サンプルとを接触させることを含む。接触は、抗原／抗体複合体
の形成が可能となるのに十分な時間および条件下で行なう。該方法はさらに、該
ポリペプチドを含有する複合体を検出することを含む。該ポリペプチドは、固相
に結合させることが可能である。さらに、該ポリペプチドは、配列番号16および
配列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して少
なくとも50％の同一性を有する組換えタンパク質または合成ペプチドであっても
よい。
【００２３】 本発明は、BS265抗原のエピトープの少なくとも1つ又はその断片をコードする
BS265核酸配列でトランスフェクトされた細胞を提供する。該核酸配列は、配列 番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6並びにそ
れらの断片または相補体よりなる群から選ばれる。
【００２４】 また、BS265抗原に対する抗体の製造法であって、少なくとも1つのBS265エピ トープを含む単離された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を個体に投与する
ことを含んでなる製造法を提供する。免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を引き
起こすのに十分な量を投与する。この単離された免疫原性ポリペプチドは、配列
番号16および配列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配
列を含む。
【００２５】 BS265抗原に特異的に結合する抗体のもう1つの製造法であって、配列番号16お
よび配列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれるアミノ酸配列からの
少なくとも1つのBS265由来エピトープをコードする核酸配列を含むプラスミドを
個体に投与することを含んでなる製造法を開示する。プラスミドは、個体内で細
胞に取り込まれ、免疫応答を誘導するのに十分な量を投与する。
【００２６】 また、（ａ）配列番号1、配列番号5、配列番号6；（ｂ）配列番号1、配列番号
２、配列番号３、配列番号４；および（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の相補体から成る
群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも50％の同一性を有する少なくと
も約10〜12ヌクレオチドのBS265ポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供す る。BS265ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのBS265エピトープを有するアミ ノ酸配列をコードする。本発明が提供するもう1つの組成物は、約8〜10アミノ酸
のBS265エピトープの少なくとも1つを有するポリペプチドを含む。該ポリペプチ
ドは、配列番号16および配列番号17並びにこれらの断片よりなる群から選ばれる
アミノ酸配列に対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ま
た、配列番号16に対して少なくとも50％の同一性を有するBS265ポリペプチドを コードする遺伝子またはその断片、および配列番号5または配列番号6に対して少
なくとも50％の同一性を有するDNAを含んでなる遺伝子またはその断片を提供す る。
【００２７】 発明の詳細な説明 本発明は、配列番号16に対して少なくとも約50％の同一性を有するBS265ポリ ペプチドをコードする遺伝子またはその断片を提供する。本発明はさらに、配列
番号5または配列番号6に対して少なくとも約50％の同一性を有するDNAを含んで なるBS265遺伝子またはその断片を含む。
【００２８】 本発明は、BS265と称される***組織遺伝子の産物に関して試験サンプルをア ッセイするための方法であって、該試験サンプル中のmRNAからcDNAを調製し、乳
房組織遺伝子BS265の存在の指標として該cDNAを検出することを含んでなる方法 を提供する。該方法は、BS265に由来する、該遺伝子またはその断片に対応する1
以上のmRNA部分を増幅する増幅工程を含む。また、BS265の翻訳産物に関してア ッセイするための方法を提供する。本発明で提供する方法によりアッセイしうる
試験サンプルには、組織、細胞、体液および分泌物が含まれる。本発明はまた、
これらの方法を実施するのに有用なオリゴヌクレオチドプライマー、ポリペプチ
ドなどの試薬を提供する。
【００２９】 本明細書で開示する核酸配列の一部は、RNAの逆転写のための、またはcDNAの 増幅のためのプライマーとして、あるいは試験サンプル中の或るmRNA配列の存在
を判定するためのプローブとして有用である。また、診断用イムノアッセイにお
ける基準または試薬として、医薬スクリーニングアッセイの標的として、および
／または、種々の療法のための成分または標的部位として有用なコードされるポ
リペプチド配列の製造を可能にする核酸配列を開示する。これらのポリペプチド
配列内に含有される少なくとも1つのエピトープに対するモノクローナル抗体お よびポリクローナル抗体は、BS265に関連した疾患または状態（特に乳癌）の治 療剤の運搬剤として有用であり、また、該疾患または状態に関する診断試験およ
びスクリーニングに有用である。関心のある遺伝子の他の部分の配列の単離は、
これらの核酸配列に由来するプローブまたはPCRプライマーを用いて行なうこと ができる。これは、確認すべき関心のあるｍRNAまたはcDNAの追加的なプローブ および対応するコード化ポリペプチド配列を可能にする。これらの追加的な分子
は、本明細書に開示するBS265により特徴づけられる***の疾患および状態（例 えば、乳癌）の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、in vivo イメージ
ング、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。
【００３０】 本明細書に記載の組成物および方法は、***組織の疾患または状態の指標とし
ての或るマーカーの同定を可能にし、それから得られる情報は、BS265に関連し た疾患および状態（特に乳癌）の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、
in vivo イメージング、予防もしくは治療または素因の判定の助けとなるであろ
う。試験方法には、例えば、本発明で提供する配列を利用し核酸増幅方法、例え
ばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼチェーン反応（LCR）およびハイブリ
ダイゼーションを利用しうるプローブアッセイが含まれる。
【００３１】 また、本発明で提供するヌクレオチド配列は、免疫原性エピトープを見出すこ
とが可能なオープンリーディングフレームを含有する。このエピトープは、BS26
5に関連した病態または状態に特有であると考えられている。また、BS265遺伝子
によりコードされるポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびタンパク質は、
マーカーとして有用であると考えられている。このマーカーは、乳癌などの疾患
において上昇するか、乳癌などの疾患において変化しているか、または正常なタ
ンパク質として存在するが不適当な身体画分中に出現する。該エピトープの特有
性は、（i）BS265遺伝子にコードされるタンパク質およびポリペプチドに対する
抗体に対するその免疫反応性および特異性、および（ii）他の任意の組織マーカ
ーに対するその非反応性により測定することができる。免疫反応の測定方法は、
よく知られており、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合抗体免疫 吸着アッセイ（ELISA）、赤血球凝集反応（HA）、蛍光偏光イムノアッセイ（FPI
A）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）などを含むが、これらに限定されるもの ではない。適当な方法のいくつかの例は、本明細書に記載されている。
【００３２】 特に示さない限り、以下の用語は以下の意味を有するものとする。
【００３３】 示されている配列に「由来」する又は「特異的」なポリヌクレオチドは、示さ
れているヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち、一致した又は相補的で
ある）少なくとも約6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約8ヌクレオチド、よ
り好ましくは少なくとも約10〜12ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも
約15〜20ヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。
【００３４】 該配列は、当該技術分野で公知の技術で判定した場合に、ある特定のポリヌク
レオチド配列に特有の配列と相補的または同一であってよい。示されている配列
の特有性を判定する方法として、例えば、データバンク中の配列の比較を用いる
ことができる。配列が由来する領域には、特異的エピトープをコードする領域、
ならびに非翻訳および／または非転写領域が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。
【００３５】 該由来ポリヌクレオチドは、必ずしも、研究中の関心のあるヌクレオチド配列
に物理的に由来するとは限らず、該ポリヌクレオチドが由来する領域中の塩基配
列から得られる情報に基づく化学合成、複製、逆転写または転写を含む（これら
に限定されるものではない）任意の方法で生成させることができる。このように
、これは、元のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス配向であってよい
。さらに、示されている配列の領域に対応する領域の組合せを、意図する用途に
適合するように、当該技術分野で公知の方法で修飾することができる。
【００３６】 特定されているポリヌクレオチドの「断片」は、示されているヌクレオチド配
列の領域に対応する（すなわち、一致した又は相補的である）少なくとも約6ヌ クレオチド、好ましくは少なくとも約8ヌクレオチド、より好ましくは少なくと も約10〜12ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約15〜20ヌクレオチド
の連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。
【００３７】 「プライマー」なる語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり該標的ヌクレ
オチド配列にハイブリダイズさせるのに使用する特定のオリゴヌクレオチド配列
を意味する。プライマーは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵
素により触媒されるヌクレオチドの重合の開始点として働く。
【００３８】 「プローブ」なる語は、相補的配列を含有するサンプル中に存在する特定のポ
リヌクレオチドを同定するために使用しうる一定の核酸セグメント（またはヌク
レオチド類似体セグメント、例えば、後記で定義するPNA）を意味する。
【００３９】 「コード（されている）」は、ポリペプチド配列が核酸配列にコードされてい
ることを意味する（該ポリペプチドまたはその一部は、該核酸配列にコードされ
ているポリペプチドからの少なくとも3〜5アミノ酸、より好ましくは少なくとも
8〜10アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも15〜20アミノ酸のアミノ酸配列 を含有する）。また、該配列にコードされているポリペプチドで免疫学的に同定
可能なポリペプチド配列が含まれる。したがって、「ポリペプチド」、「タンパ
ク質」または「アミノ酸」配列は、BS265アミノ酸配列に対して少なくとも約50 ％の同一性、好ましくは約60％の同一性、より好ましくは約75〜85％の同一性、
最も好ましくは約90〜95％以上の同一性を有する。さらに、BS265「ポリペプチ ド」、「タンパク質」または「アミノ酸」配列は、BS265のポリペプチドまたは アミノ酸配列に対して少なくとも約60％の類似性、好ましくは少なくとも約75％
の類似性、より好ましくは約85％の類似性、最も好ましくは約95％以上の類似性
を有することが可能である。このアミノ酸配列は、配列番号16および配列番号17
並びにそれらの断片よりなる群から選ぶことが可能である。
【００４０】 本明細書では互換的に用いることがある「組換えポリペプチド」、「組換えタ
ンパク質」または「組換え技術により製造されたポリペプチド」なる語は、本来
的に又は操作により、天然において伴われているポリペプチドの全部または一部
を伴われていないポリペプチド、および／または、天然で結合しているポリペプ
チド以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドを意味する。組換え又はコ
ード化ポリペプチドまたはタンパク質は、必ずしも、示されている核酸配列から
翻訳されるわけではない。また、それは、化学合成または組換え発現系の発現を
含む任意の方法で得ることができよう。
【００４１】 本発明で用いる「合成ペプチド」なる語は、当業者によく知られている方法で
化学的に合成することが可能な、任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。
これらの合成ペプチドは、種々の用途において有用である。
【００４２】 本発明で用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、リボヌクレオチドまたはデオ
キシリボヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。こ
の用語は、該分子の一次構造のみをさす。したがって、該用語は、二本鎖および
一本鎖のDNAならびに二本鎖および一本鎖のRNAを含む。また、それは、該ポリヌ
クレオチドのメチル化体またはキャップ形成体などの修飾体、および非修飾形態
を含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」およ
び「オリゴ」は、本明細書中では互換的に用いる。
【００４３】 「cDNAに対応する配列」は、該配列が、示されているDNA中の配列と同一また は相補的であるポリヌクレオチド配列を含有することを意味する。cDNAに対する
同一性または相補性の程度（または割合（％））は、約50％以上、好ましくは少
なくとも約70％以上、より好ましくは少なくとも約90％以上となろう。特定され
ているcDNAに対応する配列は、少なくとも約50ヌクレオチド長、好ましくは少な
くとも約60ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長とな
ろう。関心のある遺伝子または遺伝子断片と該cDNAとの間の対応度は、当該技術
分野で公知の方法により決定することができ、例えば、配列決定された物質と、
記載されているcDNAとの直接比較、またはハイブリダイゼーション、および一本
鎖ヌクレアーゼによる消化、およびそれに続く、該消化断片のサイズの測定を含
む。
【００４４】 アミノ酸配列の「類似性」を決定する手法は当業界において周知である。一般に
、「類似性」とは、2以上のポリペプチドのアミノ酸対比における、アミノ酸が同 一であるか類似の化学的および/又は荷電若しくは疎水性などの物理的性質を有 する適当な位置での同一のアミノ酸を意味する。いわゆる「％類似性」は、比較さ
れるポリペプチド配列間において決定され得る。核酸およびアミノ酸配列の同一
性を決定する手法も当業界において周知であり、本手法は、その遺伝子のmRNAヌ
クレオチド配列を決定し（一般にはcDNA中間体を介して）、本遺伝子にコードさ
れるアミノ酸配列を決定し、この配列をもう一方のアミノ酸配列と比較すること
から成る。一般に「同一性」とは２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列
におけ対応する同一のヌクレオチドまたは同一のアミノ酸をいう。２つ以上のポ
リヌクレオチド配列をその「％同一性」を決定することにより比較することが可能
である。２つの核酸配列又はペプチド配列間における％相同性とは、より短い配
列に分断し整列させた２つの配列間での同一の核酸又はアミノ酸の数を100倍し た値である。核酸配列における近似する整列化はSmith and Waterman (Advances
in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981))の局所相同性アルゴリズム（loca
l homology algorithm）によって得られる。このアルゴリズムは、Dayhoff（Atl
as of Protein Sequences and Structure, M.O.Dayhoff編, 5 suppl.3:353-358,
National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.,USA,） により
開発され、Gribskov（ Nucl.Acids Res. 14(6):6745-6763(1986)）によって標準
化されたスコアリングマトリックスを用いて、ペプチド配列にも拡張して使用し
得る。このアルゴリズムは、Genentic Computer Group(Madison, WI)のBestFit を有効に利用して核酸およびペプチド配列において実施する。本方法のデフォル
トパラメーターは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Ve
rsion 8 (1995)(Genetics Compputer Group, Madison, WIより入手可)において 記載されている。配列間の同一性又は相同性％を計算する適当なその他同等のプ
ログラムも当業界において周知である。
【００４５】 「精製（された）ポリヌクレオチド」は、該ポリヌクレオチドが天然において
伴われているタンパク質を実質的に含まない（例えば、その約50％以上、好まし
くは約70％以上、より好ましくは約90％以上を含有しない）関心のあるポリヌク
レオチドまたはその断片を意味する。関心のあるポリヌクレオチドを精製するた
めの技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ポリヌクレオチドを含
有する細胞をカオトロピック試薬で破壊すること、およびイオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に応じた沈降によるポ
リヌクレオチドおよびタンパク質の分離を含む。
【００４６】 「精製（された）ポリペプチド」または「精製（された）タンパク質」は、関
心のあるポリペプチドが天然において伴われている細胞成分を実質的に含まない
（例えば、その約50％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約90％以上
を含有しない）関心のあるポリペプチドまたはその断片を意味する。関心のある
ポリペプチドを精製するための方法は、当該技術分野で公知である。
【００４７】 「単離（された）」なる語は、該物質が、その元の環境（例えば、それが天然
に生じるものである場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。
例えば、生きた動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは、単離されていないが、天然系中の共存物質の一部または全部から分離さ
れている同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは、単離されてい る。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部となることが可能であり、お
よび／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成物の一部
となることが可能であり、それらもまた、該ベクターまたは組成物がその天然環
境の一部でないため単離されている。
【００４８】 「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中では互換的に用い、共
有結合および／または非共有結合で結合したアミノ酸の分子鎖の少なくとも1つ を示す。これらの用語は、特定の長さの該産物を意味するものではない。したが
って、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が
含まれる。これらの用語は、該ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化
、アセチル化、リン酸化などを含む。また、タンパク質断片、類似体、突然変異
または変異タンパク質、融合タンパク質などが、ポリペプチドの意義に含まれる
。
【００４９】 特定されているポリペプチドの「断片」は、その特定されているポリペプチド
に由来する少なくとも約3〜5アミノ酸、より好ましくは少なくとも約8〜10アミ ノ酸、より一層好ましくは少なくとも約15〜20アミノ酸を含むアミノ酸配列を意
味する。
【００５０】 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」お
よび単細胞体として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他のそのよう
な用語は、組換えベクターまたは他の導入DNAのレシピエントとして使用しうる 又は使用されている細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の元の後代
（original progeny）を含む。
【００５１】 本発明で用いる「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位
として挙動するプラスミド、染色体、ウイルスなどの任意の遺伝要素を意味する
。
【００５２】 「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合しているレプリコン
であり、例えば該結合セグメントの複製および／または発現を引き起こす。
【００５３】 「制御配列」なる語は、それが結合しているコード配列の発現を引き起こすた
めに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿
主生物によって異なる。原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモ
ーター、リボソーム結合部位およびターミネーターを含み、真核生物では、その
ような制御配列は、一般に、プロモーター、ターミネーター、および場合によっ
てはエンハンサーを含む。したがって、「制御配列」なる語は、発現するために
存在することを要する全成分を最低限含むと意図され、また、存在すれば有利で
ある追加的な成分（例えば、リーダー配列）を含んでいてもよい。
【００５４】 「作動的に結合」は、記載されている成分が、それらの意図される様態で機能
しうる関係で存在している状況を意味する。したがって、例えば、コード配列に
「作動的に結合」している「制御配列」は、該制御配列に適合しうる条件下で該
コード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００５５】 「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、ポリペプチドをコード するポリヌクレオチド配列の領域を意味する。この領域は、コード配列の一部ま
たは全コード配列に相当する。
【００５６】 「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に配置された場合に、mRNAに転写
されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。該コード配列の境
界は、5’末端の翻訳開始コドンと、3’末端の翻訳停止コドンとにより定められ
る。コード配列には、mRNA、cDNAおよび組換えポリヌクレオチド配列を含めるこ
とが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】 「免疫学的に同定可能」なる語は、示されているポリペプチド中に存在しそれ
に特有なエピトープおよびポリペプチドの存在を意味する。免疫学的同一性は、
抗体結合および／または結合における競合により判定することができる。これら
の技術は、当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。また、エピトー
プの特有性は、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列に関するGenBank などの公知データバンクのコンピューター検索により、また、他の公知タンパク
質とのアミノ酸配列の比較により判定することができる。
【００５８】 本発明で用いる「エピトープ」は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原決定
基を意味する。エピトープは、該エピトープに特有の空間コンホメーションにお
いて3個のアミノ酸を含むことが可能である、と考えられる。一般に、エピトー プは、少なくとも5個のそのようなアミノ酸よりなり、通常、それは、少なくと も8〜10個のアミノ酸よりなる。空間コンホメーションを調べる方法は、当該技 術分野で公知であり、例えば、X線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。
【００５９】 「コンホメーションエピトープ」は、免疫学的に認識可能な構造のアミノ酸の
特異的な配置を含むエピトープであり、そのようなアミノ酸は、連続的または不
連続的な順序で同一ポリペプチド上に存在するか又は異なるポリペプチド上に存
在する。
【００６０】 ポリペプチド内に含有される特異的エピトープの抗体認識により該ポリペプチ
ドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドは抗体に対して「免疫反応性」である
。免疫反応性は、抗体結合により、より詳しくは抗体結合の速度論により、およ
び／または、該抗体に対するエピトープを含有する公知ポリペプチドを競合体と
して用いる結合における競合により測定することができる。ポリペプチドが抗体
に対して免疫反応性であるか否かを判定する方法は、当該技術分野で公知である
。
【００６１】 本発明で用いる「関心のあるエピトープを含有する免疫原性ポリペプチド」は
、関心のある天然に生じるポリペプチドまたはその断片、および他の手段（例え
ば、化学合成、または組換え生物中での該ポリペプチドの発現）で製造されたポ
リペプチドを意味する。
【００６２】 「トランスフェクション」なる語は、原核性または真核性宿主細胞内に外因性
ポリヌクレオチドを導入することを意味し、その導入に用いる方法には無関係で
ある。「トランスフェクション」なる語は、ポリヌクレオチドの安定な導入およ
び一過性の導入の両方を意味し、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換、形
質導入およびf接合を含む。外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入され たら、非組込みレプリコン（例えば、プラスミド）として維持されることが可能
であり、あるいは宿主ゲノム内に組込まれることが可能である。
【００６３】 「処置」は、予防および／または治療を意味する。
【００６４】 本発明で用いる「個体」なる語は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意
味し、家畜、競技用動物、霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されるもの
ではない。この用語は、特にヒトを意味する。
【００６５】 本発明で用いる「センス鎖」または「プラス鎖」（または「＋」）なる語は、
該ポリペプチドをコードする配列を含有する核酸を意味する。「アンチセンス鎖
」または「マイナス鎖」（または「−」）は、「プラス」鎖の配列に相補的な配
列を含有する核酸を意味する。
【００６６】 「試験サンプル」なる語は、被検体（例えば、関心のある抗体または関心のあ
る抗原）の起源である個体の身体の成分を意味する。これらの成分は当該技術分
野でよく知られている。試験サンプルは、典型的には、標的配列を含有する疑い
のあるものである。試験サンプルは、当該技術分野でよく知られた方法により、
例えば、個体から試料を得、必要に応じて、それが含有するいずれかの細胞を破
壊して標的核酸を遊離させることにより調製することができる。これらの試験サ
ンプルには、本明細書に記載の本発明の方法により試験することができる生物学
的サンプルが含まれ、ヒトおよび動物の体液、例えば、全血、血清、血漿、脳脊
髄液、痰、気管支洗液、気管支吸引液、尿、リンパ液、および気道、腸管および
尿生殖路の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫など；生物学的流体
、例えば、細胞培養上清；固定しうる組織試料；および固定しうる細胞試料が含
まれる。
【００６７】 「精製（された）産物」は、該産物が通常伴っている細胞構成成分から、また
、関心のあるサンプル中に存在しうる他の型の細胞から単離されている産物の調
製物を意味する。
【００６８】 「PNA」は、標的の存在を判定するための本明細書に記載のアッセイなどの方 法で使用しうる「ペプチド核酸類似体」を意味する。「MA」は、標的の存在を判
定するための本明細書に記載のアッセイなどの方法で使用しうるモルホリノ類似
体を意味する。例えば、米国特許第5,378,841号を参照されたい。PNAは、RNA標 的またはDNAに指向しうる中性に荷電している部分である。例えば本発明のDNAプ
ローブの代わりにアッセイで使用するPNAプローブは、DNAプローブを使用した場
合には達成できない利点をもたらす。これらの利点には、製造可能性、大規模標
識、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する不感受性、およびDNAまたはRNA
を用いる方法において存在する酵素分解に対する抵抗性が含まれる。これらのPN
Aは、フルオレセイン、放射性ヌクレオチド、化学発光性化合物などのシグナル 生成化合物で標識（「付加」）することができる。したがって、DNAまたはRNAの
代わりに、PNAまたは他の核酸類似体、例えばMAを、アッセイ方法において使用 することができる。本明細書には、DNAプローブを使用するアッセイが記載され ているが、RNAまたはDNAの代わりにPNAまたはMAを使用し、必要に応じて、アッ セイ試薬における適当な変更を加えることは、当業者の技量の範囲内に含まれる
。
【００６９】 本発明で用いる「被検体」は、試験サンプル中に存在する可能性がある検出す
べき物質である。該被検体は、天然に生じる特異的結合メンバー（例えば、抗体
）に対する物質、または特異的結合メンバーを与えうる任意の物質であることが
可能である。したがって、被検体は、アッセイにおいて1以上の特異的結合メン バーに結合しうる物質である。また、「被検体」は、任意の抗原物質、ハプテン
、抗体およびそれらの組合せを含む。天然に生じる特異的結合パートナー（ペア
）を用いて（例えば、ビタミンB12を測定するために特異的結合ペアのメンバー として内因子タンパク質を使用して、あるいは葉酸を測定するために葉酸結合タ
ンパク質を使用して、あるいは炭水化物を測定するために特異的結合ペアのメン
バーとしてレクチンを使用して）、該被検体を特異的結合ペアのメンバーとして
検出することができる。該被検体には、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、
ヌクレオチド標的などを含めることができる。被検体は、血液、血漿若しくは血
清、尿その他の体液中に溶解することができる。被検体は、組織中、即ち、細胞
表面若しくは細胞内に存在し得る。被検体は、血液、尿、胸部吸引液その他の体
液中に浮遊する細胞又は生検サンプルとして得られた細胞の表面上あるいは細胞
内に存在し得る。
【００７０】 本発明で用いる「***の疾患」、「***疾患」及び「***の状態」の用語は、
異型性増殖、繊維血管腫、嚢胞性***疾患および癌を含む（これらに限定される
ものではない）前立腺の任意の疾患または状態を意味するものとして互換的に使
用される。
【００７１】 本発明で用いる「乳癌」は、in situ管癌、in situ 小葉癌、浸透性管癌、骨 髄癌、管状癌、ムチン癌、浸透性小葉癌、浸透性コメド癌および炎症性癌を含む
（これらに限定されるものではない）***の任意の悪性疾患を意味する。
【００７２】 「発現しているタグ配列」または「EST」は、組織から抽出されたmRNAの逆転 写およびそれに続くベクター内への挿入により作製されたcDNA挿入断片の部分配
列を意味する。
【００７３】 「転写産物イメージ」は、ライブラリー中のESTの量的分布を示す表または一 覧を意味し、該ライブラリーが由来する組織内で活性な遺伝子を表す。
【００７４】 本発明は、特異的結合メンバーを使用するアッセイを提供する。本発明で用い
る「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペアのメンバーである。すなわち、2 つの異なる分子のうちの一方が、化学的または物理的手段により、もう一方の分
子に特異的に結合する。したがって、一般的なイムノアッセイの抗原および抗体
特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとして、ビオチンおよびアビジン
、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容
体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを含めることができる。
さらに、特異的結合ペアには、元の特異的結合メンバーの類似体（例えば、被検
体類似体）であるメンバーを含めることができる。免疫反応性特異的結合メンバ
ーには、組換えDNA分子により形成されたものを含む、抗原、抗原断片、抗体お よび抗体断片（モノクローナルおよびポリクローナルの両方ならびにそれらの複
合体）が含まれる。
【００７５】 特異的結合メンバーには、「特異的結合分子」が含まれる。「特異的結合分子」は
、あらゆる特異的結合メンバー、特に、免疫反応特異的結合メンバーを意味する
。「特異的結合分子」との用語は抗体分子（ポリクローナルおよびモノクローナル
産生の何れによって得られるものをも含む）および雑種（キメラ）抗体分子（例
えば、Winter,et at., Nature 349:293-299(1991)および米国特許第4、816、567明
細書参照）；F(ab’)２およびF（ab）断片；Fv分子（非共有結合異種二量体；例
えば、Inbar, et at., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2659-2662(1972)およびEhri
ch, et al.,Biochem. 19:4091-4096（1980）参照）；一本鎖Fv分子（sFv）（例 えば、Huston, et at., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)参照）； ヒト化抗体分子（例えば、Riechmann, et al., Nature 332:323-327(1988),Verh
oeyan, et al., Science 229:1534-1536(1988)および英国特許公報GB2,276,169 1994年9月21日発行参照）およびこれら分子から得られるあらゆる機能性断片 であって、原抗体分子の免疫学的結合性を保有する断片を含む。
【００７６】 本発明で用いる「ハプテン」なる語は、抗体に結合する能力を有するが、担体
タンパク質に結合しない限り抗体形成を惹起する能力を有さない部分抗原または
非タンパク質結合メンバーを意味する。
【００７７】 本発明で用いる「捕捉試薬」は、サンドイッチアッセイにおいては該被検体に
特異的な、あるいは競合アッセイにおいては指示試薬に特異的な、あるいは間接
アッセイにおいては補助的特異的結合メンバー（それ自体は、該被検体に特異的
である）に特異的な未標識の特異的結合メンバーを意味する。該アッセイの実施
前または該アッセイの実施中に、該捕捉試薬を固相材料に直接的または間接的に
結合させて、試験サンプルから固定化複合体を分離できるようにすることが可能
である。
【００７８】 「指示試薬」は、特異的結合メンバーに共役（「付加」）している、外的手段
により検出可能な測定可能なシグナルを生成する能力を有し該シグナルを生成す
る「シグナル生成化合物」（「標識」）を含む。該指示試薬は、特異的結合ペア
の抗体メンバーであることに加えて、ハプテン−抗ハプテン系（例えば、ビオチ
ンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補
的ヌクレオチド配列、エフェクターまたは受容体分子、酵素補因子および酵素、
酵素阻害剤または酵素など）を含む任意の特異的結合ペアのメンバーとなること
も可能である。免疫反応性の特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにお
ける関心のあるポリペプチド、または競合アッセイにおける捕捉試薬、または間
接アッセイにおける補助的特異的結合メンバーのいずれかに結合する能力を有す
る抗体、抗原または抗体／抗原複合体でありうる。プローブおよびプローブアッ
セイを説明する場合に、「レポーター分子」なる語を用いることがある。レポー
ター分子は、特異的結合ペアの特異的結合メンバーに共役した前記のシグナル生
成化合物（例えば、カルバゾールまたはアダマンタン）を含む。
【００７９】 意図される種々の「シグナル生成化合物」（標識）には、発色性物質、触媒（
例えば、酵素）、発光性化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、
化学発光性化合物（例えば、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニ
ウムおよびルミノール）、放射性要素および直接可視標識が含まれる。酵素には
、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β
-ガラクトシダーゼなどが含まれる。個々の標識の選択は、決定的に重要ではな いが、それ自体で又は1以上の追加的物質と共にシグナルを生成する能力を有す るものでなければならない。
【００８０】 「固相」（「固体支持体」）は、当業者に公知であり、反応トレーのウェルの
壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性または非磁性ビーズ、ニトロセルロース
小片、膜、微粒子（例えば、ラテックス粒子）、ヒツジ（または他の動物の）赤
血球およびDuracytes（登録商標）（Abbott Laboratories, Abbott Park, ILか ら入手可能な、ピルビン酸アルデヒドおよびホルムアルデヒドで固定された赤血
球）などを含む。「固相」は決定的に重要なものではなく、当業者であれば選択
することができよう。例えば、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビー
ズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコン
チップ、ヒツジ（または他の動物の）赤血球およびDuracytes（登録商標）はす べて、適当な具体例である。ペプチドを固相上に固定化するための適当な方法に
は、イオン、疎水性、共有結合相互作用などが含まれる。本発明で用いる「固相
」は、不溶性であるか又は後続の反応で不溶性にすることができる任意の材料を
意味する。固相は、捕捉試薬を誘引し固定化するその固有能力に関して選択する
ことができる。あるいは、固相は、捕捉試薬を誘引し固定化する能力を有する追
加的な受容体を保有することが可能である。追加的な受容体には、捕捉試薬自体
とは反対に荷電した、あるいは捕捉試薬に共役した荷電物質とは反対に荷電した
荷電物質を含めることが可能である。あるいはまた、該受容体分子は、特異的結
合反応により捕捉試薬を固定化する能力を有し固相上に固定化（付加）されてい
る任意の特異的結合メンバーであることが可能である。該受容体分子は、アッセ
イの実施前またはアッセイの実施中に捕捉試薬が固相材料に間接的に結合するの
を可能にする。したがって、固相は、プラスチック、誘導プラスチック、磁性ま
たは非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウェル
、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の動物の）赤血球、Dura
cytes（登録商標）および当業者に公知の他の形態であることが可能である。
【００８１】 検出抗体の接近を許容するのに十分な多孔性と、抗原を結合させる適当な表面
親和性とを有する、適当な任意の多孔性材料を、固相が含むことも可能であると
期待され、そのような場合も本発明の範囲内に含まれる。多孔性構造が一般に好
ましいが、水和化状態のゲル構造を有する材料も使用できる。そのような有用な
固体支持体には、ニトロセルロースおよびナイロンが含まれるが、これらに限定
されるものではない。本明細書に記載のそのような多孔性固体支持体は、好まし
くは、約0.01〜0.5mm、好ましくは約0.1mmの厚さのシートの形態であると意図さ
れる。該孔径は、広範囲の値を取ることが可能であり、好ましくは約0.025〜15 ミクロン、特に好ましくは約0.15〜15ミクロンである。そのような支持体の表面
は、該支持体に対する抗原または抗体の共有結合を引き起こす化学的方法により
活性化することができる。しかしながら、一般には、十分には理解されていない
疎水性力による多孔性材料上での吸着により、抗原または抗体の不可逆的結合を
得る。他の適当な固体支持体は、当該技術分野で公知である。
【００８２】 試薬 本発明は、関心のある***組織に由来しBS265と称されるポリヌクレオチド配 列、それにコードされるポリペプチド、これらのポリペプチドに特異的な抗体な
どの試薬を提供する。本発明はまた、開示されているポリヌクレオチドおよびこ
れらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列に由来するオリゴヌクレオチド断片
などの試薬を提供する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体を
使用して、乳癌などの***の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター
、予後判定、in vivo イメージング、予防もしくは治療または素因の判定につな
がる情報を得ることができる。本明細書に開示の配列は、遺伝子転写活性の特異
的プロフィールを得るために又はアッセイで使用しうる特有のポリヌクレオチド
である。そのようなアッセイは、欧州特許第0373203B1号および国際公開WO 95/1
1995に開示されている。
【００８３】 選択したBS265由来ポリヌクレオチドを、正常な又は改変された遺伝子発現の 検出のために本明細書に記載の方法で使用することができる。そのような方法で
は、BS265ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、それらの断片もしくは 誘導体、またはそれらに相補的な核酸配列を使用することができよう。
【００８４】 本明細書に開示のポリヌクレオチド、それらに相補的な配列、またはそれらの
いずれかの断片を、***組織の疾患または状態に関連した遺伝子、核酸、cDNAま
たはmRNAの検出、増幅または定量のためのアッセイで使用することができる。ま
た、それらを使用して、BS265ポリペプチドのコード領域の全部または一部を同 定することができる。さらに、それらは、アッセイ用のキットの形態で個々の容
器内に提供したり、あるいは個々の組成物として提供することができる。アッセ
イ用のキットで提供する場合には、緩衝液、結合体などの他の適当な試薬を含有
させることができよう。
【００８５】 該ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAの形態でありうる。DNA、cDNA、ゲノムD
NA、核酸類似体および合成DNAの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内に 含まれる。該DNAは、二本鎖または一本鎖でありえて、一本鎖である場合には、 コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖でありうる。該ポリペプ
チドをコードするコード配列は、本発明で提供するコード配列と同一でありえて
、遺伝暗号の重複または縮重の結果、本発明で提供するDNAと同じポリペプチド をコードする異なるコード配列でありうる。
【００８６】 このポリヌクレオチドは、該ポリペプチドのコード配列のみを含んでいたり、
あるいは該ポリペプチドのコード配列と追加的なコード配列（例えば、リーダー
または分泌配列またはプロタンパク質配列）とを含んでいたり、あるいは該ポリ
ペプチドのコード配列（および所望により追加的なコード配列）と非コード配列
（例えば、該ポリペプチドのコード配列の5’および／または3’側の非コード配
列）とを含んでいよう。
【００８７】 また、本発明は、ポリヌクレオチドの欠失、置換または付加などの修飾を含有
する変異ポリヌクレオチドと、該変異ポリヌクレオチド配列から生じる任意のポ
リヌクレオチド修飾体を含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明で提
供するコード配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコード配列を有してい
てもよい。
【００８８】 さらに、該ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞におけるポリペプチドの発
現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチ
ドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に、同じリー
ディングフレームで融合させることができる。リーダー配列を有するポリペプチ
ドはプレタンパク質であり、それは、該ポリペプチドを形成するために宿主細胞
により切断されるリーダー配列を有していてもよい。また、該ポリヌクレオチド
は、該タンパク質と追加的な5’アミノ酸残基とを含むプロタンパク質をコード していてもよい。プロ配列を有するタンパク質は、プロタンパク質であり、場合
によっては、該タンパク質の不活性形態であってもよい。プロ配列が切断される
と、活性タンパク質が残される。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、タ
ンパク質をコードしたり、あるいはプロ配列を有するタンパク質をコードしたり
、あるいはプレ配列（リーダー配列）とプロ配列とを有するタンパク質をコード
してもよい。
【００８９】 また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にす
るマーカー配列とインフレームで融合したコード配列を有していてもよい。該マ
ーカー配列は、細菌宿主の場合には、該マーカーと融合したポリペプチドの精製
をもたらすための、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであ ることが可能であり、あるいは例えば、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞系） を使用する場合には、該マーカー配列は赤血球凝集素（HA）タグであることが可
能である。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトー
プに対応する。例えば、I. Wilsonら, Cell 37:767 (1984)を参照されたい。
【００９０】 ポリヌクレオチドと本発明で提供する配列との間で少なくとも50％、好ましく
は少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％の同一性があれば、該ポリヌ
クレオチドは該配列にハイブリダイズすると期待される。
【００９１】 ２つの核酸分子間の配列同位程度は、これら分子間のハイブリダイゼーション
の効率および強度に大きな影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同
一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する。
完全同一配列のハイブリダイゼーションに対する抑制効果は、当業界において周
知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定することが可能である。この
ようなアッセイには例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリ
ダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーションなどがある（Sambrook, et a
l., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版（1989）Cold Spring Har
bor, N.Y.）。 これらのアッセイは、幅広い強度の選択性、例えば、低緊縮性か
ら高緊縮性までの様々な条件を用いて実施することができる。非特異的結合が生
じない場合には二次プローブが標的にハイブリダイズしない程度に部分的配列同
一性を欠いている二次プローブ（例えば、標的分子と30％以下の配列同一性を有
するプローブ）を用いて非特異的結合が生じないことを確認することができる。
【００９２】 ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイを使用する場合には、標的核酸
配列に相補的な核酸プローブを選択し、その後、プローブおよび標的配列が「選 択的にハイブリダイズする」又は相互に結合し交雑分子を形成するような条件を 選択する。本発明の一態様において、核酸分子は温和な緊縮条件下において標的
配列と選択的にハイブリダイズし得る。本願発明において、温和な緊縮ハイブリ
ダイゼーション条件下で、選択された核酸プローブと少なくとも約70％の同一性
を有する少なくとも14ヌクレオチド長の標的核酸配列が検出できる。別の態様に
おいて、このような選択的ハイブリダイゼーションを緊縮ハイブリダイゼーショ
ン条件下で実施する。緊縮ハイブリダイゼーション条件により、選択した核酸プ
ローブの配列と90％以上の配列同一性を有する14ヌクレオチド長の標的核酸配列
を検出することが可能となる。プローブおよび標的が特定の配列同一性を有する
プローブ/標的ハイブリダイゼーションに適したハイブリダイゼーション条件を 決定することが可能であり、このことは当業界において周知である（Nucleic Ac
id Hybridization: A Practical Approach, B.D.Hames and S.J.Higgins 編(198
5)Oxford: Washington, DC; IRL Press等参照）。ハイブリッド分子は、例えば 固体支持層上、溶液中および組織切片中で形成させることが可能である。レポー
ター分子を包含させること、典型的にはプローブ中に包含させることにより、ハ
イブリッドの形成をモニターすることができる。このようなレポーター分子また
は検出可能因子には、放射活性因子、蛍光マーカーおよび酵素結合リガンドが結
合し得るような分子が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００９３】 ハイブリダイゼーションの緊縮条件に関して、例えば、プローブの長さおよび
性質、標的配列、異なった配列の塩基組成、塩その他のハイブリダイゼーション
溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング試薬（ホルム
アミド、デキストランスルフェート、ポリエチレングリコールなど）の有無、ハ
イブリダイゼーション反応温度、時間パラメーターおよび洗浄条件等の様々な要
素を変化させることにより特定の緊縮性を得ることで、数多くの等価条件を選択
し得ることは当業界において周知である（Sambrook, et at., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, 第2版、（1989）Cold Spring Harbor, N.Y.）。
【００９４】 本発明はまた、精製されたBS265ポリペプチドを使用して産生された抗体であ って、該ポリペプチドの少なくとも一部が、本発明が提供するポリヌクレオチド
から選ばれるBS265ポリヌクレオチドにコードされることを特徴とする抗体を提 供する。これらの抗体は、試験サンプル中のBS265抗原の検出のために本発明で 提供する方法で使用することができる。試験サンプル中のBS265抗原の存在は、 ***の疾患または状態の存在の指標となる。該抗体はまた、治療目的に使用する
ことが可能であり、例えば、改変した又は異常な発現に関連した状態におけるBS
265ポリペプチドの活性の中和において使用することができる。
【００９５】 本発明はさらに、本発明で提供する推定アミノ酸配列を有するBS265ポリペプ チド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然の精製ポリペプチドまたは
合成ポリペプチドでありうる。BS265ポリペプチドの断片、誘導体または類似体 は、該アミノ酸残基の1以上が同類アミノ酸残基または非同類アミノ酸残基（好 ましくは、同類アミノ酸残基）で置換されているものでありうる。そのような置
換アミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされていてもコードされていなくても
よい。あるいはそれは、アミノ酸残基の1以上が置換基を含みうる。あるいはそ れは、該ポリペプチドが別の化合物（例えば、該ポリペプチドの半減期を増加さ
せる化合物、例えばポリエチレングリコール）に融合しているものでありうる。
あるいはそれは、追加的なアミノ酸（例えば、リーダーもしくは分泌配列、また
は該ポリペプチドの精製のために使用する配列、またはプロタンパク質配列）が
該ポリペプチドに融合しているものでありうる。そのような断片、誘導体および
類似体は、本発明の範囲内に含まれる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは、好ましくは、単離（好ましくは精製）された形態で提供される。
【００９６】 したがって、本発明のポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドのアミノ酸
配列と同じであるか又は1以上のアミノ酸の置換による小さな変異により異なる アミノ酸配列を有することが可能である。該変異は、典型的には、約1〜5アミノ
酸の範囲の「同類変化」であることが可能であり、この場合、該置換アミノ酸は
、類似した構造的または化学的特性を有する（例えば、ロイシンからイソロイシ
ンへの置換またはトレオニンからセリンへの置換）。これに対して、変異には、
非同類変化（例えば、グリシンからトリプトファンへの置換）を含めることがで
きる。また、類似した小さな変異には、アミノ酸の欠失または挿入またはそれら
の両方を含めることができる。生物学的または免疫学的活性の変化を引き起こさ
ずに置換し、挿入し又は欠失させるアミノ酸の種類および個数を決定する際の指
針は、当該技術分野でよく知られているコンピュータープログラム、例えばDNAS
TARソフトウェア（DNASTAR Inc., Madison WI）を用いて得ることができる。
【００９７】 本発明のポリヌクレオチド配列に従い構築したプローブを、種々のタイプの分
析を行なうための種々のアッセイ方法で使用することができる。例えば、そのよ
うなプローブは、染色体分析を行なうために蛍光in situハイブリダイゼーショ ン（FISH）技術で使用することが可能であり、また、染色体の広がりから認めら
れるか又はPCR産生および／または対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロー ブ、対立遺伝子特異的増幅を用いて若しくは直接シークエンス法により検出可能
な欠失または転座などの染色体中の癌特異的構造改変を同定するために使用する
ことができる。また、プローブは、放射性同位体、直接的または間接的に検出可
能なハプテン、または蛍光性分子で標識することができ、組織試料または細胞中
のポリヌクレオチドを含む遺伝子のmRNA発現を評価するためのin situハイブリ ダイゼーション研究で使用することができる。
【００９８】 また、本発明は、本発明で提供するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製
造に関する教示を提供する。
【００９９】 プローブアッセイ 試験サンプル中の核酸の検出のためのアッセイで使用しうるプローブを得るた
めに、本発明で提供する配列を使用することができる。該プローブは、関心のあ
るポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域から、または関心のあるポリヌクレ
オチドの非保存ヌクレオチド領域から設計することができる。アッセイの最適化
のためのそのようなプローブの設計は、当業者の技量の範囲内である。一般には
、最大の特異性を望む場合には、非保存領域またはユニーク領域から核酸プロー
ブを得、例えば多遺伝子ファミリーの異なるメンバーに密接に関連しているヌク
レオチド領域またはマウスおよびヒトなどの関連種におけるヌクレオチド領域に
関してアッセイする場合には、保存領域から核酸プローブを得る。
【０１００】 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、核酸中またはその混合物中に含有されてい る所望の核酸配列（標的）を増幅するための技術である。PCRでは、一対のプラ イマーを過剰に使用して、標的核酸の相補鎖とハイブリダイズさせる。標的核酸
を鋳型として使用して、該プライマーのそれぞれをポリメラーゼにより伸長させ
る。該伸長産物は、元の標的鎖から解離した後、それ自体が標的配列となる。つ
いで新たなプライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより伸長させ、こ
のサイクルを繰返して、標的配列分子の数を幾何級数的に増加させる。PCRは、 米国特許第4,683,195号および第4,683,202号に開示されている。
【０１０１】 リガーゼチェーン反応（LCR）は、核酸の増幅のためのもう1つの方法である。
LCRでは、2個の一次（第1および第2）プローブと2個の二次（第3および第4）プ ローブとを含むプローブペアを使用し、それらはすべて、標的に対して過剰モル
で使用する。第1プローブを標的鎖の第1セグメントにハイブリダイズさせ、第2 プローブを標的鎖の第2セグメントにハイブリダイズさせる。該一次プローブが5
’リン酸−3’ヒドロキシルの関係で互いに隣接するよう、また、リガーゼがそ れらの2個のプローブを融合産物に共有的に融合または連結させることが可能と なるよう、第1セグメントと第2セグメントとは隣接している。さらに、第3（二 次）プローブは第1プローブの一部にハイブリダイズすることが可能であり、第4
（二次）プローブは、同様の隣接様態で第2プローブの一部にハイブリダイズす ることが可能である。勿論、該標的が最初に二本鎖である場合は、二次プローブ
は、最初の標的の相補体にもハイブリダイズすることになる。一次プローブのラ
イゲーションした鎖が標的鎖から分離すると、それは第3および第4プローブにハ
イブリダイズすることになり、それらはライゲーションされて相補的な二次連結
産物を形成しうる。該ライゲーション産物が標的またはその相補体のいずれかと
機能的に等価であると認識されることが重要である。ハイブリダイゼーションと
ライゲーションとの反復サイクルにより、標的配列の増幅が達成される。この技
術は、1989年6月16日付け公開のK. BackmanのEP-A-320 308および1991年7月31日
付け公開のK. BackmanらのEP-A-439 182に更に詳しく記載されている。
【０１０２】 mRNAの増幅の場合には、mRNAをcDNAに逆転写し、ついでポリメラーゼ連鎖反応
を行なうこと（RT-PCR）、あるいは米国特許第5,322,770号に記載されていると おり、両工程で単一の酵素を使用すること、あるいはR.L. Marshallら, PCR Met hods and Applications 4:80-84 (1994)に記載のとおり、mRNAをcDNAに逆転写し
、ついで不斉ギャップリガーゼチェーン反応を行なうこと（RT-AGLCR）が、本発
明の範囲内に含まれる。
【０１０３】 本発明で使用しうる他の公知増幅方法には、J.C Guatelliら, PNAS USA 87:18
74-1878 (1990) およびJ Compton, Nature 350 (No 6313):91-92 (1991)に記載 のいわゆる「NASBA」または「3SR」技術、欧州特許出願公開(EPA)第4544610号に
記載のQ-β増幅、鎖置換増幅（strand displacement amplification）（G.T. Wa
lkerら, Clin. Chem. 42:9-13 (1996)および欧州特許出願第684315号に記載）、
および国際公開WO 93/22461に記載の標的媒介増幅（target mediated amplifica
tion）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】 BS265の検出は、当該技術分野で現在よく知られている検出方法および将来現 れうる検出方法を含む適当な任意の検出方法を用いて行なうことができる。例え
ば、Caskeyらの米国特許第5,582,989号およびGelfandらの米国特許第5,210,015 号を参照されたい。そのような検出方法には、例えば、標的増幅方法およびシグ
ナル増幅技術が含まれる。現在公知の検出方法には、例えば、PCR、LCR、NASBA 、SDA、RCRおよびTMAと称される核酸増幅技術が含まれるであろう。例えば、Cas
keyら, 米国特許第5,582,989号およびGelfandら, 米国特許第5,210,015号を参照
されたい。また、Snitmanら, 米国特許第5,273,882号などに開示されているシグ
ナル増幅を用いて、検出を行なうことができる。標的またはシグナルの増幅が現
在好ましいが、増幅を必要としない超高感度の検出方法を本発明で使用すること
が可能であると考えられ、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０５】 種々の不均一または均一な検出様式を用いて、増幅型または非増幅型の両方の
検出を（組合せて）行なうことができる。不均一検出様式の具体例は、Snitman ら, 米国特許第5,273,882号、Albarellaら, EP-84114441.9、Urdeaら, 米国特許
第5,124,246号、Ullmanら, 米国特許第5,185,243号およびKouriskyら, 米国特許
第4,581,333号に開示されている。均一検出様式の具体例は、米国特許第5,582,9
89号および第5,210,015号に開示されている。また、ハイブリダイゼーションア ッセイにおける複数のプローブの使用（その使用により、BS265シグナルの感度 および増幅が改善される）が意図され、本発明の範囲内に含まれる。例えば、Ca
skeyらの米国特許第5,582,989号およびGelfandらの米国特許第5,210,015号を参 照されたい。
【０１０６】 1つの実施態様では、本発明は、一般に、標的ポリヌクレオチド配列を含有す る疑いのある試験サンプルを、アンプリコン配列の内部領域にハイブリダイズし
うる検出プローブと増幅プライマーとを含む増幅反応試薬と接触させる工程を含
む。本発明で提供する方法に従い使用するプローブおよびプライマーは、捕捉標
識および検出標識で標識し、この場合、プローブは1つのタイプの標識で標識し 、プライマーは別のタイプの標識で標識する。さらに、プライマーおよびプロー
ブは、該プローブ配列が、該プライマー配列より低い融解温度を有するように選
択する。増幅試薬、検出試薬および試験サンプルは、標的配列の存在下で該標的
配列のコピー（アンプリコン）を産生させる増幅条件下に配置する。通常の場合
、プライマーは標的配列とその相補的鎖とを増幅するように与えられるため、該
アンプリコンは二本鎖である。ついで該二本鎖アンプリコンを熱変性させて、一
本鎖アンプリコンメンバーを得る。該一本鎖アンプリコンメンバーが形成したら
、該プローブと一本鎖アンプリコンメンバーとの複合体の形成が可能となるよう
に該混合物を冷却する。
【０１０７】 該一本鎖アンプリコン配列およびプローブ配列を冷却するにつれて、該プロー
ブ配列は該一本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合する。該プローブ配列が
、一般に、該プライマー配列より短くなるように選択され、したがって該プライ
マーより低い融解温度を有すると仮定すると、この知見は反直感的なものである
。したがって、該プライマーにより産生されるアンプリコンの融解温度も、該プ
ローブより高い融解温度を有するはずである。したがって、該混合物が冷却する
につれて、二本鎖アンプリコンの再形成が予想されるであろう。しかしながら、
前記のとおり、それはこの場合には当てはまらない。該プローブは、該一本鎖ア
ンプリコンメンバーに優先的に結合することが判明している。さらに、このよう
なプローブ／一本鎖アンプリコン結合の優先性は、該プライマー配列を該プロー
ブに対して過剰に加えた場合にも存在する。
【０１０８】 該プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーのハイブリッドが形成した後、それ
らを検出する。該プライマーおよびプローブ上に存在する検出標識および捕捉標
識を使用して該ハイブリッドを検出するには、標準的な不均一アッセイ様式が適
している。該ハイブリッドを、該捕捉標識により固相試薬に結合させ、該検出標
識により検出することが可能である。該検出標識が直接的に検出可能な場合には
、検出可能なシグナルを該標識に生成させ、必要に応じて該シグナルを検出する
ことにより、該固相上のハイブリッドの存在を検出することができる。該標識が
直接的に検出されない場合には、直接的に検出可能な標識に結合した結合メンバ
ーを一般に含む結合体と該捕捉ハイブリッドとを接触させることが可能である。
該結合体が該複合体に結合するようになり、該複合体上の結合体の存在を、その
直接的に検出可能な標識で検出することができる。このようにして、固相試薬上
のハイブリッドの存在を判定することができる。ハイブリダイズしていないアン
プリコンまたはプローブおよび未結合結合体を洗い落とすために洗浄工程を実施
しうる、と当業者に認識されるであろう。
【０１０９】 一態様において、核酸分子配列を坦持している固相支持体を用いて異種アッセ
イを簡便に実施することができる。このような配列は、ハイスループットおよび
／またはマルチプレキシドアッセイフォーマットに有用である。予め形成された
核酸分子からこのような配列を形成する方法、あるいはin situ 合成技術を用い
るて上記配列を生成する数多くの方法が当業界において一般的に知られている（
Dattagupta,et al,. 欧州特許公開番号0234、726A3号明細書；Southern,米国特許
第5、700、637号明細書；Pirrung,et al., 米国特許第5、143、854号明細書、PCT国 際公開WO92/10092；およびFodor,et at., Science 251:767-777(1991)等参照） 。
【０１１０】 標的配列は一本鎖として記載されているが、標的配列が実際には二本鎖であり
、増幅プライマー配列とのハイブリダイゼーションの前に、該標的配列がその相
補体から分離されるにすぎない場合も含むと意図される。この方法においてPCR を用いる場合には、通常は、標的配列の末端が既知である。好ましい方法におい
てLCRまたはその変法を用いる場合には、通常は、全標的配列が既知である。典 型的には、標的配列は、RNA、DNAなどの核酸配列である。
【０１１１】 本発明で提供する方法は、熱サイクル反応混合物を含む良く知られた増幅反応
において、特にPCRおよびギャップLCR（GLCR）において用いることができる。増
幅反応では、典型的には、標的核酸配列（該標的配列は、通常、より一層大きな
核酸配列の小さな領域である）のコピーを反復的に産生させるためにプライマー
を使用する。プライマー自体は、標的配列の領域に相補的な核酸配列である。増
幅条件下では、これらのプライマーは、標的配列の相補的領域にハイブリダイズ
または結合する。標的配列のコピーは、典型的には、該ハイブリダイゼーション
プライマーにヌクレオチドを加え及び／又は隣接プローブ対をライゲーションす
るためにポリメラーゼまたはリガーゼ活性を有する酵素を別々に又は組合せて用
いるプライマー伸長および／またはライゲーションの過程により生じる。単量体
または予め生成したオリゴマーとしてプライマーまたはプローブに加えるヌクレ
オチドもまた、標的配列に相補的である。プライマーまたはプローブが、十分に
伸長し及び／又はライゲーションしたら、例えば、相補的核酸鎖が解離する温度
である「融解温度」まで該反応混合物を加熱することにより、それらを標的配列
から分離する。このようにして、標的配列に相補的な配列が形成する。
【０１１２】 ついでいずれかの二本鎖配列を分離して、プライマーまたはプローブがそれら
の各々の標的にハイブリダイズするのを可能にし、ハイブリダイズしたプライマ
ーまたはプローブを伸長および／またはライゲーションさせ、再分離することに
より、標的配列数を更に増幅するために、新たな増幅サイクルを行なうことがで
きる。増幅サイクルにより産生される相補的配列は、標的配列数を更に増幅する
ためにプライマーを伸長させるため又は2個のプローブのギャップを埋めるため の鋳型として働くことが可能である。典型的には、反応混合物を20〜100サイク ルに付す。より典型的には、反応混合物を25〜50サイクルに付す。サイクル数の
決定は、当業者において可能である。このようにして、多コピーの標的配列およ
びその相補的配列を得る。したがって、プライマーが増幅条件下に存在する場合
には、該プライマーが標的配列の増幅を開始させる。
【０１１３】 一般には、PCRにおいては、標的鎖の一部とその相補体とに相補的な2個のプラ
イマーを使用する。LCRでは、一般に、4個のプローブ（そのうちの2個は標的配 列に相補的であり、残りの2個は、同様に、標的の相補体に相補的である）を使 用する。前記のプライマーセットおよび酵素に加えて、核酸増幅反応混合物は、
よく知られている他の試薬を含むことも可能であり、それらには、酵素補因子（
例えば、マンガン）、マグネシウム塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD）、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）（例えば、デオキシア デニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸および
デオキシチミン三リン酸）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１４】 増幅プライマーは標的配列の増幅を開始させるが、検出（またはハイブリダイ
ゼーション）プローブは増幅に関与しない。検出プローブは、一般に、核酸配列
または非荷電核酸類似体、例えば、国際公開WO 92/20702に開示されているペプ チド核酸、米国特許第5,185,444号、第5,034,506号および第5,142,047号に記載 されているモルホリノ類似体などである。該プローブが担持する標識のタイプに
応じて、増幅反応により生じるアンプリコンの捕捉または検出に、該プローブを
使用する。該プローブは標的配列の増幅に関与せず、したがって、追加的なdNTP
を該プローブに加えることができない点で該プローブを「伸長不可能」なものと
する必要があるかもしれない。通常、類似体自体はもともと伸長不可能である。
核酸プローブは、該プローブの3’末端を修飾してヒドロキシル基がもはや伸長 に関与できなくなるようにすることにより、伸長不可能にすることが可能である
。例えば、該プローブの3’末端を捕捉または検出標識で官能基化して、ヒドロ キシル基を消費させるか又は保護する。あるいは、3’ヒドロキシル基を単に切 断し、置換し又は修飾することが可能である。1993年4月19日付け出願の米国特 許出願第07/049,061号には、プローブを伸長不可能にするのに使用しうる修飾が
記載されている。
【０１１５】 プローブに対するプライマーの比は、重要ではない。したがって、プローブま
たはプライマーのいずれかを過剰に反応混合物に加えて、一方の濃度を他方の濃
度より大きくすることが可能である。あるいは、プライマーおよびプローブを同
等の濃度で使用することができる。しかしながら、好ましくは、プローブに対し
て過剰のプライマーを反応混合物に加える。したがって、プライマー対プローブ
の比は、例えば5：1であり、20：1が好ましい。
【０１１６】 プライマーおよびプローブの長さは様々となることが可能であるが、プローブ
配列がプライマー配列より低い融解温度を有するように、プローブ配列を選択す
る。したがって、プライマー配列は、一般に、プローブ配列より長い。典型的に
は、プライマー配列は、20〜50ヌクレオチド長の範囲であり、より典型的には、
20〜30ヌクレオチド長の範囲である。典型的なプローブは、10〜25ヌクレオチド
長の範囲である。
【０１１７】 プライマーおよびプローブを合成するための種々の方法が、当該技術分野でよ
く知られている。同様に、プライマーまたはプローブに標識を結合させるための
方法も、当該技術分野でよく知られている。例えば、通常のヌクレオチドホスホ
ルアミジット化学と、Applied Biosystems, Inc.（Foster City, CA）、DuPont （Wilmington, DE）または、Milligen（Bedford MA）から入手可能な装置とを用
いて、所望の核酸プライマーまたはプローブを合成するのが、常套手段である。
本発明のプライマー、プローブなどのオリゴヌクレオチドを標識するための多数
の方法が、既に記載されている。Enzo Biochemical（New York, NY）およびClon
tech（Palo Alto, CA）は共に、プローブ標識技術を記載し、商業化している。 例えば、3’-Amin- ON CPGTM（Clontech, Palo Alto, CA）を使用して、第一級 アミンを3’オリゴ末端に結合させることができる。同様に、Aminomodifier II （登録商標）（Clontech）を使用して、第一級アミンを5’オリゴ末端に結合さ せることができる。通常の活性化および結合の化学的方法を用いて、該アミンを
種々のハプテンと反応させることができる。また、1990年12月11日付け出願の同
時係属米国特許出願第625,566号および1990年12月20日付け出願の第630,908号は
、それぞれ5’および3’末端でプローブを標識するための方法を教示している。
1992年6月25日付け公開の国際公開WO92/10505および1992年7月9日付け公開のWO9
2/11388は、それぞれ5’および3’末端でプローブを標識するための方法を教示 している。オリゴヌクレオチドを標識するための1つの公知方法では、標識-ホス
ホルアミジット試薬を調製し使用して、該標識をオリゴヌクレオチドに、その合
成中に付加する。例えば、N.T Thuongら, Tet. Letters 29(46):5905-5908 (198
8)またはJ.S. Cohenら, 米国特許出願第07/246,688号（NTIS ORDER No. PAT-APP
L-7-246,688）(1989)を参照されたい。好ましくは、プローブは、その3’および
5’末端で標識する。
【０１１８】 捕捉標識は、プライマーまたはプローブに結合させる。該捕捉標識は、固相試
薬の特異的結合メンバーと結合ペアを形成する特異的結合メンバーであることが
可能である。プライマーまたはプローブ自体が捕捉標識として機能しうると理解
されるであろう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、
それは、プライマーまたはプローブの相補的部分に結合して該プライマーまたは
プローブを固相に固定化するように選択することができる。プローブ自体が結合
メンバーとして機能する場合には、該プローブは、一本鎖アンプリコンメンバー
に相補的でない配列または「テイル」を含有する、と当業者には認識されるであ
ろう。プライマー自体が捕捉標識として機能する場合には、該プライマーの少な
くとも一部は、固相上の核酸に自由にハイブリダイズすることができるであろう
。なぜなら、該プローブは、プライマー配列に対して完全には相補的とならない
ように選ばれるからである。
【０１１９】 一般に、不均一系イムノアッセイを行なうために一般的に用いる技術を用いて
、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体を検出することができる。好ま
しくは、この実施態様では、商業的に入手可能なAbbott LCx（登録商標）（Abbo
tt Laboratories, Abbott Park, IL）装置で用いるプロトコールに従い、検出を
行なう。
【０１２０】 試験サンプルを一対のプライマーと接触させ、増幅を行ない、ハイブリダイゼ
ーションプローブを加え、検出を行なう典型的なPCRアッセイにおいて、本明細 書に開示するプライマーおよびプローブは有用である。
【０１２１】 本発明が提供するもう1つの方法は、試験サンプルを複数のポリヌクレオチド （少なくとも1つのポリヌクレオチドは、本明細書に記載のBS265分子である）と
接触させ、該試験サンプルを複数のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハ
イブリダイゼーション複合体を検出することを含む。ハイブリダイゼーション複
合体を同定し、定量して、***組織の疾患（例えば、乳癌）を示すプロフィール
を集める。さらに、発現されたRNA配列を、逆転写と、ポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）などの当該技術分野でよく知られている方法によるDNAの増幅とにより検出 することができる。
【０１２２】 薬物のスクリーニングおよび遺伝子治療 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドなどのア
ンチセンスBS265由来分子を、***組織の疾患または状態（特に、乳癌）に関連 したポリヌクレオチドの異常な発現に関連した状態を有する患者内に導入するた
めの、遺伝子治療方法の用途を含む。アンチセンスRNAおよびDNA断片ならびにリ
ボザイムを含むこれらの分子は、BS265-mRNAの翻訳を抑制するように設計し、BS
265ポリヌクレオチドの改変された又は異常な発現に関連した状態の治療におい て治療的に使用することができる。
【０１２３】 あるいは、前記のオリゴヌクレオチドを、当該技術分野で公知の方法で細胞に
運搬して、該アンチセンスRNAまたはDNAをインビボで発現させて、前記のとおり
にBS265ポリペプチドの産生を抑制することができよう。したがって、BS265ポリ
ヌクレオチドに対するアンチセンス構築物は、BS265転写産物の作用を逆転させ 、***組織の病態（例えば、乳癌）の治療に使用することができる。また、これ
らのアンチセンス構築物は、腫瘍転移を治療するために使用することができよう
。
【０１２４】 本発明はまた、BS265ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも1つの化合物
を同定するために、BS265ポリペプチドまたはその任意の断片に対する特異的結 合に関して複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法
は、少なくとも1つの化合物を準備し、結合を許容するのに十分な時間、適当な 条件下でBS265ポリペプチドと各化合物とを一緒にし、各化合物に対する該BS265
ポリペプチド結合を検出する工程を含む。
【０１２５】 そのような試験で使用するポリペプチドまたはペプチド断片は、溶液中で遊離
していることも、固相に固定されていることも、細胞表面上に担持されているこ
とも、あるいは細胞内に局在していることも可能である。1つのスクリーニング 方法では、該ポリペプチドまたはペプチド断片を発現しうる組換え核酸で安定に
トランスフェクトされた真核性または原核性宿主細胞を使用する。そのようなト
ランスフェクト化細胞に対して競合結合アッセイにおいて、薬物、化合物または
他の任意の物質をスクリーニングすることができる。例えば、ポリペプチドと被
検体との複合体の形成は、生存細胞または固定細胞のいずれかにおいて測定する
ことができる。
【０１２６】 したがって、本発明は、BS265に関連した疾患を治療するために使用しうる薬 物、化合物または他の任意の物質に関してスクリーニングする方法を提供する。
これらの方法は、該物質をポリペプチドまたはその断片と接触させ、該物質と該
ポリペプチドとの複合体の存在に関して、または該ポリペプチドと該細胞との複
合体の存在に関してアッセイすることを含む。競合的結合アッセイにおいては、
典型的には、該ポリペプチドを標識する。適当なインキュベーションの後、遊離
（または未複合体化）ポリペプチドまたはその断片を、結合形態で存在するポリ
ペプチドまたはその断片から分離し、遊離または未複合体化標識の量を、その個
々の物質が該ポリペプチドに結合する又はポリペプチド／細胞複合体を妨害する
能力の尺度として用いる。
【０１２７】 本発明はまた、ポリペプチドに結合する能力を有する中和抗体を、該ポリペプ
チドまたはその断片に対する結合に関して試験剤と特異的に競合させる競合的ス
クリーニングアッセイの用途を含む。このようにして、本発明で提供するBS265 ポリペプチドと1以上の抗原決定基を共有する、試験サンプル中のいずれかのポ リペプチドの存在を検出するために、該抗体を使用することができる。
【０１２８】 もう1つのスクリーニング方法は、本明細書に開示するBS265の少なくとも1つ のポリペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物に関する高処理量のス
クリーニングをもたらす。簡単に説明すると、多数の異なる小さなペプチド試験
化合物を、固相（例えば、プラスチックピンまたは他の何らかの表面）の固相上
で合成する。該ペプチド試験化合物を、ポリペプチドと反応させ、洗浄する。そ
のように固相に結合しているポリペプチドを、当該技術分野でよく知られている
方法で検出する。また、本明細書に記載のスクリーニング方法で使用するために
、精製ポリペプチドをプレート上に直接コーティングすることができる。さらに
、非中和抗体を使用して、該ポリペプチドを捕捉し、それを固相上に固定化する
ことができる。例えば、1984年9月13日付け公開のEP 84/03564を参照されたい。
【０１２９】 合理的な薬物設計の目標は、関心のある生物学的に活性なポリペプチドの又は
小分子の構造類似体（それらが相互作用するアゴニスト、アンタゴニストまたは
阻害剤を含む）を得ることである。また、そのような構造類似体を使用して、該
ポリペプチドのより活性な又は安定な形態である又はポリペプチドの機能をイン
ビボで増強または阻害する薬物を設計することができる（J. Hodgson, Bio/Tech nology 9:19-21 (1991)）。
【０１３０】 例えば、1つのアプローチでは、ポリペプチドまたはポリペプチド−阻害剤複 合体の三次元構造を、X線結晶解析、コンピューターモデリングまたは最も一般 的にはそれらの2つのアプローチの組合せにより決定する。該ポリペプチドのの 構造を解明し、その活性部位を決定するためには、該ポリペプチドの形状および
電荷の両方を確認しなければならない。該ポリペプチドの構造に関する有用な情
報が、同種タンパク質の構造に基づくモデリングにより得られることは、それほ
ど多くない。どちらの場合も、関連した構造情報を用いて、類似したポリペプチ
ド様分子を設計したり、あるいは効率的な阻害剤を同定する。
【０１３１】 合理的な薬物設計の有用な具体例には、S. Braxtonら, Biochemistry 31:7796
-7801 (1992)に示されているとおり、改善された活性または安定性を有する分子
、またはS.B.P. Athaudaら, J. Biochem. (Tokyo) 113 (6): 742-746 (1993)に 示されているとおり、天然ペプチドの阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニスト
として作用する分子を含めることができる。
【０１３２】 また、前記のアッセイにより選択された標的特異的抗体を単離し、ついでその
結晶構造を決定することが可能である。原則として、このアプローチは、後続の
薬物設計の基礎となりうるファーマコフォア（pharmacophore）を与える。さら に、機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（「抗id」）
を産生させることにより、タンパク質の結晶解析を全く行なわないで済ませるこ
とが可能である。抗idの結合部位は、鏡像の鏡像として、もとの受容体の類似体
となる。したがって、抗idを使用して、化学的または生物学的に得られたペプチ
ドのバンクからペプチドを同定し、単離することができる。ついで、単離された
ペプチドは、ファーマコフォア（すなわち、原型（prototype）医薬）として機 能することが可能である。
【０１３３】 X線結晶解析などの分析的研究を行なうのに十分な量の本発明の組換えポリペ プチドを入手可能とすることができる。さらに、本発明で提供する核酸配列から
導き出すことができる該ポリペプチドのアミノ酸配列の知見は、X線結晶解析の 代わりに又はそれに加えてコンピューターモデリング技術を用いる者に指針を与
えるであろう。
【０１３４】 さらに、BS265ポリペプチドに特異的な抗体（例えば、抗BS265抗体）を使用し
て、該ポリペプチドに対する結合により該ポリペプチドの生物学的作用を阻害す
ることができる。このようにして、該抗体を、例えば、乳癌およびその転移を含
む***組織疾患を治療するための療法において使用することができる。
【０１３５】 さらに、そのような抗体は、試験サンプル中のBS265ポリペプチドの存在また は不存在を検出することができ、したがって***組織の疾患または状態（特に、
乳癌）の診断のための診断マーカーとして有用である。また、そのような抗体は
、***組織の病態（例えば、乳癌）に関する診断マーカーとして機能しうる。 本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニストおよび阻害剤に関する。
該アンタゴニストおよび阻害剤は、該ポリペプチドの機能を阻害または除去する
ものである。したがって、例えば、アンタゴニストは、本発明のポリペプチドに
結合し、その機能を阻害または除去しうる。該アンタゴニストは、例えば、BS26
5ポリペプチドに結合することによりBS265ポリペプチドの活性を除去するポリペ
プチドに対する抗体であることが可能であろう。場合によっては、該アンタゴニ
ストは、オリゴヌクレオチドであることが可能である。小分子阻害剤には、例え
ば、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。
【０１３６】 該アンタゴニストおよび阻害剤は、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、
水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含む（これらに限定され
るものではない）医薬上許容される担体と共に組成物として使用することができ
る。BS265ポリペプチド阻害剤の投与は、好ましくは、全身投与である。本発明 はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害する抗体を提供する。
【０１３７】 アンチセンス技術を用いて、三重らせんの形成またはアンチセンスDNAもしく はRNAにより遺伝子発現を減少させることができ、それらの方法は共に、DNAまた
はRNAに対するポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、本発明のポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5’コード部分を用いて、10〜40 塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオ
チドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であることにより転写およびBS26
5ポリペプチドの産生を妨げるように設計する。三重らせんに関しては、例えば 、Leeら, Nuc. Acids Res, 6:3073 (1979); Cooneyら, Science 241:456 (1988)
およびDervanら, Science 251:1360 (1991)を参照されたい。該アンチセンスRNA
オリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、mRNA分子からBS26
5ポリペプチドへの翻訳を遮断する。アンチセンスに関しては、例えば、Okano,
J. Neurochem, 56:560 (1991)および“Oligodeoxynucleotides as Antisense In
hibitors of Gene Expression”, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)を参照 されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド切断に対して該分
子を抵抗性にする人工的ヌクレオチド間結合を含有するように修飾されている場
合に、より大きな効力で作用する。そのような人工的ヌクレオチド間結合には、
メチルホスホナート、ホスホロチオラートおよびホスホロアミダートヌクレオチ
ド間結合が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３８】 組換え技術 本発明は、本発明のBS265ポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞および発現 ベクター、およびそれがコードするポリペプチドの製造法を提供する。そのよう
な製造法は、BS265ポリヌクレオチドの発現に適した条件化で該宿主細胞を培養 し、該細胞培養からBS265ポリヌクレオチドを回収することを含む。
【０１３９】 本発明はまた、本発明のBS265ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベ クターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペ
プチドの製造を提供する。
【０１４０】 宿主細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターであることが可能な本
発明のベクターで遺伝的に操作する（トランスフェクト、形質導入または形質転
換する）。該ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であ
ることが可能である。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化しトランス
フェクト化細胞を選択し又はBS265遺伝子を増幅するために必要に応じて改変さ れた通常の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発
現のために選択された宿主細胞で既に用いられているものであり、当業者には明
らかなものである。
【０１４１】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によるポリペプチドの製造に使用す
ることができる。したがって、ポリペプチドを発現させるためのいずれか1つの 種々の発現ビヒクル（特に、ベクターまたはプラスミド）中に該ポリヌクレオチ
ド配列を含めることが可能である。そのようなベクターには、染色体、非染色体
および合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、酵
母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ウ イルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂 犬病ウイルス）が含まれる。しかしながら、宿主内で増殖可能かつ生存可能であ
る限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することも可能である。
【０１４２】 適当なDNA配列を、種々の方法によりベクター中に挿入することができる。一 般には、該DNA配列を、当該技術分野で公知の方法により、適当な制限エンドヌ クレアーゼ部位内に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の技量
の範囲内であると考えられる。該発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令 する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動的に結合させる。そのようなプ
ロモータの代表例には、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌（E. coli）lacま たはtrp、ファージλP subLプロモーター、および原核性もしくは真核性細胞ま たはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロ
モーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターはまた
、翻訳の開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する
。該ベクターはまた、配列の増幅のための適当な配列を含むことが可能である。
さらに、該発現ベクターは、好ましくは、トランスフェクト化宿主細胞の選択の
ための表現型形質を与える遺伝子（例えば、真核細胞培養におけるジヒドロ葉酸
レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌（E. coli）におけるテト ラサイクリンまたはアンピシリン耐性）を含有する。
【０１４３】 前記の適当なDNA配列と適当なプロモーターまたは制御配列とを含有するベク ターを使用して、適当な宿主にトランスフェクトして、該宿主が該タンパク質を
発現できるようにすることが可能である。適当な宿主の代表例としては、細菌細
胞、例えば大腸菌（E. coli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella ty
phimurium）；ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp）；真菌細胞、
例えば酵母；昆虫細胞、例えばショウジョウバエおよびSf9；動物細胞、例えばC
HO、COSまたはBowes黒色腫；植物細胞などが挙げられる。適当な宿主の選択は、
本明細書の教示に基づけば当業者の技量の範囲内に含まれると考えられる。
【０１４４】 より詳しくは、本発明はまた、前記で広く記載されている配列の1以上を含ん でなる組換え構築物を含む。該構築物は、本発明の配列が順配向または逆配向で
挿入されているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む
。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、該配列に作動的に結合
した調節配列（例えば、プロモーターなど）を含む。多数の適当なベクターおよ
びプロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。以下のベクタ
ーを例示する：細菌性：pINCY（Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA ）、pSPORT1（Life Technologies, Gaithersburg, MD）、pQE70、pQE60、pQE-9 （Qiagen）pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16
a、pNH18a、pNH46a（Stratagene）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pR
IT5（Pharmacia）；真核性：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene ）pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）。しかしながら、宿主内で複製可能で
生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することが可
能である。
【０１４５】 プラスミドpINCYは、一般には、それがポリリンカー（マルチクローニング部 位）中に2つの修飾を有することを除きプラスミドpSPORT1（Life Technologies,
Gaithersburg, MDから入手可能）と同一である。これらの修飾は、（1）それが
HindIII制限部位を欠き、（2）そのEcoRI制限部位が、異なる位置に存在するこ とである。pSPORT1をHindIIIとEcoRIとの両方で切断し、該ポリリンカーの切り 出された断片を合成DNA断片（配列番号7および配列番8）で置換することにより 、pINCYをpSPORT1から作製する。この置換は、当業者に公知の任意の方法で行な
うことができる。例えば、それらの2つのヌクレオチド配列（配列番号7および配
列番号8）は、5’末端リン酸を有するように合成的に生成させ、共に混合し、つ
いで、HindIIIとEcoRIとで切断されたpSPORT1プラスミド中に、付着末端のライ ゲーションを行なうための標準的な条件下でライゲーションする。ついで適当な
宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli）DH5∝細胞）を、そのライゲーションされ
たDNAでトランスフェクトし、アンピシリン耐性に関して組換えクローンを選択 する。ついで個々のクローンからプラスミドDNAを調製し、制限酵素分析またはD
NA配列決定に付して、挿入配列が適切な配向で存在することを確認する。当業者
に公知の他のクローニング方法を用いることも可能である。
【０１４６】 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、所望の任意の遺伝子
から選択することができる。2つの適当なベクターとして、pKK232-8およびpCM7 が挙げられる。挙げられる個々の細菌性プロモーターには、lacI、lacZ、T3、SP
6、T7、gpt、λP sub R、P sub L、およびtrpが含まれる。真核性プロモーター には、サイトメガロウイルス（CMV）最初期、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミ
ジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウス メタロチオイネンIが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、 当業者の技量の範囲内に十分に含まれるものである。
【０１４７】 もう1つの実施態様では、本発明は、前記構築物を含有する宿主細胞を提供す る。該宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下
等動物細胞であることが可能であり、あるいは該宿主細胞は、細菌細胞などの原
核細胞であることが可能である。該宿主細胞内への該構築物の導入は、リン酸カ
ルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクショ ンまたはエレクトロポレーション（L. Davisら, “Basic Methods in Molecular
Biology”, 第2版, Appleton and Lang, Paramount Publishing, East Norwalk
, CT (1994)）により行なうことができる。
【０１４８】 宿主細胞内の構築物は、該組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生さ
せるために常法で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、
通常のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。
【０１４９】 組換えタンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細
菌または他の細胞内で発現させることができる。また、本発明のDNA構築物に由 来するRNAを使用してそのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を 使用することができる。原核性または真核性宿主と共に使用するための適当なク
ローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laborat ory Manual , 第2版 (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)に記載されている。
【０１５０】 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、該ベク ター中にエンハンサー配列を挿入することにより増強される。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増強する、通常約10〜300bpのシス作用性要 素である。具体例には、複製起点の後期側上SV40エンハンサー（bp100〜270）、
サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上ポリ
オーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【０１５１】 一般には、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞のトランスフェクショ
ンを可能にする選択マーカー（例えば、大腸菌（E. coli）のアンピシリン耐性 遺伝子およびエス・セレビシエ（S. cerevisiae）TRP1遺伝子）、および下流の 構造配列の転写を指令するための、高度に発現される遺伝子に由来するプロモー
ターを含むであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ3-ホスホグリセリン
酸キナーゼ（PGK）、α因子、酸ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質な どの解糖酵素をコードするオペロンに由来することが可能である。該異種構造配
列を、翻訳開始配列および終結配列、および好ましくは、周辺腔または細胞外培
地中への翻訳タンパク質の分泌を指令しうるリーダー配列と、適当な段階で合体
させる。所望により、該異種配列は、所望の特性（例えば、発現された組換え産
物の安定化または簡便な精製）を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパ ク質をコードすることが可能である。
【０１５２】 細菌において使用するための有用な発現ベクターは、作動可能な読取りを機能
的プロモーターと一致させて適当な翻訳開始および終結シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築する。該ベクター は、該ベクターの維持を保証し、所望により該宿主内での増幅をもたらすための
、1以上の形質選択マーカーと複製起点とを含むであろう。トランスフェクショ ンのための適当な原核性宿主には、大腸菌（E. coli）、バシラス・サチリス（B
acillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium
）、およびシュードモナス（シュードモナス）属、ストレプトマイセス（Strept
omyces）属およびスタヒロコッカス（Staphylococcus）属内の種々の種が含まれ
るが、その他の原核性宿主を通常の選択物として使用することも可能である。
【０１５３】 細菌において使用するための有用な発現ベクターは、選択マーカーと細菌性複
製起点（よく知られたクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝要素を 含むプラスミドに由来するもの）とを含む。他のベクターには、PKK223-3（Phar
macia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）およびGEM1（Promega Biotec, Madis
on, WI）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのpBR322「バ
ックボーン」切片を、適当なプロモーターおよび発現させる構造配列と合体させ
る。
【０１５４】 適当な宿主にトランスフェクトし、該宿主を適当な細胞密度まで増殖させた後
、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）
により抑制解除し、細胞を更に一定期間培養する。細胞は、典型的には、遠心分
離により収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更
なる精製のために保存する。タンパク質の発現において使用した微生物細胞は、
凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む簡便な
任意の方法で破壊することができる。そのような方法は、当業者によく知られて
いる。
【０１５５】 組換えタンパク質を発現させるためには、種々の哺乳動物細胞培養系を使用す
ることができる。哺乳動物発現系には、例えば、Gluzman, Cell 23:175 (1981) に記載のサル腎線維芽細胞のCOS-7系、および和合性ベクターを発現する能力を 有する他の細胞系（例えば、C127、HEK-293、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系）
が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエ
ンハンサーならびに必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、ス
プライス供与および受容部位、転写終結配列および5’フランキング非転写配列 を含むであろう。SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列（例えば、SV40起点、 初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位）を使
用して、必要な非転写遺伝要素を得ることが可能である。代表的で有用なベクタ
ーには、pRc/CMVおよびpcDNA 3（Invitrogen, San Diego, CAから入手可能）が 含まれる。
【０１５６】 アフィニティークロマトグラフィー、硫安沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、陰
イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーなどの公知方法により、BS265ポリ ペプチドを組換え細胞培養物から回収し、精製する。精製中に存在するカルシウ
ムイオンを低濃度（約0.1〜5mM）にするのが好ましい（Priceら, J. Biol. Chem . 244:917 (1969)）。該ポリペプチドの立体配置を完全なものにする際に、必要
に応じて、タンパク質のリフォールディング工程を行なうことが可能である。最
後に、最終精製工程として高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行なうことが
できる。
【０１５７】 このように、本発明のポリペプチドは、高発現細胞系から発現された天然に精
製された産物、または化学方法により又は原核性もしくは真核性宿主から（例え
ば、培養における細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞により）組換
え技術で得られた産物でありうる。組換え製造法で使用する宿主に応じて、本発
明のポリペプチドを哺乳動物または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化され
、あるいは非グリコシル化されよう。また、本発明のポリペプチドには、開始メ
チオニンアミノ酸残基を含むこともあろう。
【０１５８】 出発プラスミドは、入手可能なプラスミドから、公開されている公知方法に従
い構築することができる。さらに、記載されているものと同等のプラスミドが、
当該技術分野において公知であり、当業者には明らかであろう。
【０１５９】 以下は、cDNAクローンの単離および分析のための一般的な方法である。本明細
書に開示する特定の実施態様においては、mRNAを***組織から単離し、cDNAライ
ブラリーの作製のために使用する。***組織を、患者から外科的切除により得、
それが病理学者により腫瘍または非腫瘍組織に分類される。
【０１６０】 該***組織ライブラリーのランダム単離物からのcDNA挿入断片を、部分的に配
列決定し、実施例に記載のとおりに詳細に分析した。それは、配列番号１、配列
番号２、配列番号３および配列番号４として配列表に開示されている。同様に、
クローン3090742H1（クローン3090742inh（配列番号5）として示す）の全長の配
列が、実施例に記載のとおりに詳細に分析され、配列表に開示されている。これ
らの挿入断片のコンセンサス配列は、配列番号9として記載されている。これら のポリヌクレオチドは、ある特定の遺伝子に関する関連調節配列を有する又は有
さない全オープンリーディングフレームを含有しているかもしれない、あるいは
それらは、関心のある遺伝子の一部のみをコードしているかもしれない。これは
、遺伝子の多くが数百塩基長、時には数千塩基長であり、ベクターの制約、第1 鎖の不完全な逆転写または第2鎖の不完全な複製のため、現在の技術では、その 全体をクローニングすることができないということに起因する。追加的なヌクレ
オチド配列を含有する連続的な二次クローンは、当業者に公知の種々の方法を用
いて得ることができる。
【０１６１】 DNA配列決定の方法は、当該技術分野でよく知られている。通常の酵素法では 、関心のあるDNA鋳型にアニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマーからDNA
鎖を伸長するために、DNAポリメラーゼ、Klenow断片、Sequenase（US Biochemic
al Corp, Cleveland, OH）またはTaqポリメラーゼを使用する。一本鎖および二 本鎖の両方の鋳型を使用するための方法が、開発されている。チェーンターミネ
ーション反応生成物を、尿素／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、オート
ラジオグラフィー（放射性ヌクレオチド標識前駆体の場合）または蛍光（蛍光標
識前駆体の場合）により検出することができる。蛍光検出方法を用いる機械化さ
れた反応調製、配列決定および分析における最近の改良は、Applied Biosystems
377 DNA Sequencers（Applied Biosystem, Foster City, CA）などの装置を使 用して1日当たりに測定しうる配列数の拡大を可能にした。
【０１６２】 ヌクレオチド配列のリーディングフレームは、いくつかのタイプの分析で確認
することができる。第1に、コード配列内に含有されているリーディングフレー ムは、開始コドンATGおよび停止コドンTGA、TAAまたはTAGの存在に関して分析す
ることができる。典型的には、1つのリーディングフレームが、cDNAの大きな部 分にわたって続き、他のリーディングフレームは、多数の停止コドンを含有する
傾向にある。そのような場合には、リーディングフレームの決定は直接的である
。それより困難な他の場合には、さらなる分析が必要となる。
【０１６３】 各推定コドントリプレットにおける個々のヌクレオチド塩基の出現頻度を分析
するためのアルゴリズムが作製されている。例えば、J.W. Fickett, Nuc Acids Res 10:5303 (1982)を参照されたい。特定の生物（細菌、植物および動物）に関
するコードDNAは、あるトリプレット周期性内で或るヌクレオチドを含有する傾 向にある（例えば、第3コドン位にピリミジンの優先性が有意に認められる）。 これらの優先性は、所定のDNA伸長のコード可能性（coding potential）（およ びフレーム）を判定するために使用しうる広く利用可能なソフトウェアに取込ま
れている。アルゴリズム由来の情報を開始／停止コドンの情報と一緒に使用して
、適切なフレームを高い確実性で決定することができる。そしてこれは、正確な
リーディングフレーム内の配列を適当な発現ベクター中にクローニングするのを
容易に可能にする。
【０１６４】 本明細書に開示する核酸配列は、十分に確立されている組換えDNA技術により 、関心のある他の種々のポリヌクレオチド配列およびベクターに結合させること
が可能である。J Sambrookら, 前掲を参照されたい。関心のあるベクターには、
プラスミド、コスミド、ファージ誘導体、ファジミドなどのクローニングベクタ
ーならびに配列決定、複製および発現ベクターなどが含まれる。一般に、そのよ
うなベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、簡便な制限 エンドヌクレアーゼ消化部位、および個々の宿主細胞に適した選択マーカーを含
有する。該ベクターは、当業者に公知の種々の手段により、所望のDNA、RNAまた
はポリペプチドを産生する適当な宿主細胞内に導入することができる。
【０１６５】 時には、配列決定またはランダム逆転写の誤りのために、適当なオープンリー
ディングフレームまたは調節要素の存在が隠されてしまう。そのような場合には
、ポリペプチドの発現を試み、標準的なペプチドマッピングおよび配列決定技術
によりアミノ酸配列を決定することにより、正確なリーディングフレームを決定
することが可能である。F.M. Ausubelら, Current Protocols in Molecular Bio logy , John Wiley & Sons, New York, NY (1989)を参照されたい。さらに、ある
与えられたヌクレオチド配列の実際のリーディングフレームは、合計3個の潜在 的リーディングフレームを含有するベクターで宿主細胞をトランスフェクトする
ことより決定することができる。正確なリーディングフレームのヌクレオチド配
列を有する細胞だけが、予想される長さのペプチドを産生することになる。
【０１６６】 本発明で提供するヌクレオチド配列は、現在の最高水準の自動化された方法で
製造されており、それ自体が、未同定のヌクレオチドを含有している可能性があ
る。このことは、本発明を実施することを望む当業者に問題を提議することには
ならないであろう。J Sambrookら（前掲）またはその定期的最新版に記載されて
いる標準的な組換え技術を用いるいくつかの方法を用いて、欠けている配列情報
を完全なものにすることができる。本明細書に記載の完全長配列を得るために用
いるのと同じ技術を、ヌクレオチド配列を得るために用いることができる。
【０１６７】 cDNAを適当な発現ベクター中にサブクローニングし、このベクターを適当な発
現宿主中にトランスフェクトすることにより、ある特定のcDNAの発現を行なうこ
とができる。***組織のcDNAライブラリーの作製に使用するクローニングベクタ
ーは、ある特定のcDNAのmRNAの転写に使用することができ、β-ガラクトシダー ゼに関するプロモーター、アミノ末端のmetおよびそれに続くβ-ガラクトシダー
ゼの7アミノ酸残基を含有する。人工的なプライミングおよび転写に有用な操作 されたバクテリオファージプロモーターの直後に、これらの8残基ならびにクロ ーニング用の多数のユニーク制限部位（例えば、EcoRI）が存在する。該ベクタ ーは、大腸菌（E. coli）の適当な宿主株内にトランスフェクトすることができ る。
【０１６８】 単離された細菌株を標準的な方法によりイソプロピルチオガラクトシド（IPTG
）で誘導することにより、β-ガラクトシダーゼの最初の7残基、リンカーの約15
残基、および該cDNA内にコードされるペプチドを含有する融合タンパク質が得ら
れるであろう。cDNAクローンの挿入断片は、実質的にランダムな方法で作製され
るため、含まれるcDNAが適切な翻訳のための正確なフレームで存在する機会は、
3回のうちの1回である。該cDNAが適切なリーディングフレームにない場合は、イ
ンビトロ突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIもしくはヤエナリヌクレアーゼ での消化またはオリゴヌクレオチドリンカーの取込みなどの良く知られた方法に
よる適当な数の塩基の欠失または挿入により、正確なフレームを得ることができ
る。
【０１６９】 該cDNAは、特定の宿主内でのタンパク質の発現に有用であることが知られてい
る他のベクターに対して往復（シャトル）させることができる。クローニング部
位と標的DNAの両端の伸長にハイブリダイズするのに十分なDNAセグメントとを含
有するオリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な方法で化学的に合成すること
ができる。ついでこれらのプライマーを使用して、PCRにより所望の遺伝子セグ メントを増幅することができる。得られた新たな遺伝子セグメントは、標準的な
条件下、適当な制限酵素で消化し、ゲル電気泳動により単離することができる。
あるいは、該cDNAを適当な制限酵素で消化し、欠けている遺伝子セグメントを、
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドで埋めることにより、同様の遺伝子セグ
メントを得ることができる。複数の遺伝子に由来するコード配列のセグメントを
一緒にライゲーションし、適当なベクター中にクローニングして、組換え配列の
発現を最適化することができる。
【０１７０】 そのようなキメラ分子のための適当な発現宿主には、チャイニーズハムスター
卵巣（CHO）、ヒト胎児腎（HEK）293細胞などの哺乳動物細胞、Sf9細胞などの昆
虫細胞、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母
細胞および大腸菌（E. coli）などの細菌が含まれるが、これらに限定されるも のではない。これらの各細胞系に関して、有用な発現ベクターは、細菌内での増
殖を可能する複製起点と、細菌内での選択を可能にする選択マーカー（例えば、
β-ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子）とを含むことも可能である。さらに、該 ベクターは、トランスフェクトされた真核性宿主細胞における選択を可能にする
もう1つの選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝 子）を含むことが可能である。真核性発現宿主において使用するためのベクター
では、関心のある配列がポリAを欠く場合には、3’ポリAテイルの付加が必要と なるかもしれない。
【０１７１】 さらに、該ベクターは、遺伝子発現を増強するプロモーターまたはエンハンサ
ーを含有することが可能である。そのようなプロモーターは、宿主特異的であり
、CHO細胞の場合にはMMTV、SV40またはメタロチオニンプロモーター、細菌宿主 の場合にはtrp、lacまたはT7プロモーター、あるいは酵母の場合にはα因子、ア
ルコールオキシダーゼまたはPGHプロモーターを含むが、これらに限定されるも のではない。転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハン サー）を有する又は有さないアデノウイルスベクターを使用して、哺乳動物細胞
系におけるタンパク質の発現を駆動することができる。組換え細胞の均一培養が
得られたら、多量の組換え産生タンパク質を、ならし培地から回収し、当該技術
分野でよく知られているクロマトグラフィー法で分析することができる。多量の
分泌タンパク質のもう1つの製造法は、哺乳動物胚のトランスフェクション、お よびトランスジェニックウシ、ヤギ、ヒツジなどが産生する乳から該組換えタン
パク質を回収することを含む。ポリペプチド、および密接に関連している分子は
、タンパク質の精製を容易にするような方法で組換え的に発現させることができ
る。1つのアプローチは、ヒトポリペプチド上に天然には存在しない1以上の追加
的ポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質の発現を含む。精製を容易にす
るそのようなドメインには、固定化された金属上での精製を可能にする金属キレ
ート化ペプチド（例えば、ヒスチジン-トリプトファンドメイン）、固定化され た免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGS伸
長／アフィニティー精製系（Immunex Corp, Seattle, WA）で使用されるドメイ ンが含まれるが、これらに限定されるものではない。切断可能なリンカー配列、
例えばXA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CAから入手可 能）を該ポリペプチド配列と該精製ドメインとの間に含有させることは、該ポリ
ペプチドの回収に有用かもしれない。
【０１７２】 イムノアッセイ BS265ポリペプチド（その断片、誘導体および類似体を含む）またはそのよう なポリペプチドを発現する細胞は、***組織に対する抗体の検出のための種々の
アッセイ（そのうちの多数が本明細書に記載されている）で使用することができ
る。また、それらを免疫原として使用して、抗体を産生させることができう。こ
れらの抗体は、例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、
一本鎖およびヒト化抗体およびFab断片、またはFab発現ライブラリーの産物であ
ることが可能である。そのような抗体および断片の産生のためには、当該技術分
野で公知の種々の方法を用いることができる。
【０１７３】 例えば、本発明の配列を含むポリペプチドに対して産生される抗体は、該ポリ
ペプチドを動物に直接注入することにより、あるいは該ポリペプチドを動物（例
えば、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒト）に投与することにより得ることができ
る。マウス、ウサギまたはヤギが好ましい。該ポリペプチドは、配列番号16およ
び配列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれる。ついで、そのように
して得た抗体が、該ポリペプチド自体に結合することとなる。このように、該ポ
リペプチドの断片だけをコードする配列でさえ、天然ポリペプチドに結合する抗
体を産生させるために使用することができる。ついで、そのような抗体を使用し
て、そのポリペプチドを含有する疑いのある組織などの試験サンプルから該ポリ
ペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体の製造には、連続継代細
胞培養により産生される抗体を与える任意の技術を用いることができる。具体例
には、KohlerおよびMilstein, Nature 256:495-497 (1975)に記載のハイブリド ーマ技術、トリオーマ技術、Kozborら, Immun. Today 4:72 (1983)に記載のヒト
B細胞ハイブリドーマ技術、およびColeら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, Inc, New York, NY, pp. 77-96 (1985)に記載のヒトモ
ノクローナル抗体を産生させるためのEBV-ハイブリドーマ技術が含まれる。一本
鎖抗体の産生のための記載されている技術を、本発明の免疫原性ポリペプチド産
物に対する一本鎖抗体を産生させるために適用することができる。例えば、米国
特許第4,946,778号を参照されたい。
【０１７４】 本発明の抗体は、「サンドイッチ」イムノアッセイおよびプローブアッセイを
含む種々のアッセイ様式において使用することができる。例えば、本発明の抗体
またはその断片は、試験サンプル中のBS265抗原の存在を判定するための種々の アッセイ系で使用することができる。例えば、第1のアッセイ様式では、固相上 にコーティングされている、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または
その断片、またはこれらの抗体の組合せを、試験サンプルと接触させて、第1混 合物を形成させる。この第1混合物を、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間お よび条件下でインキュベートする。ついで、シグナル生成化合物が結合している
モノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその断片、またはこれらの抗
体の組合せを含む指示試薬を、該抗原／抗体複合体と接触させて、第2混合物を 形成させる。ついで、この第2混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分 な時間および条件下でインキュベートする。シグナル生成化合物により生成した
測定可能なシグナルを検出することにより、固相上に捕捉され試験サンプル中に
含まれうるBS265抗原の存在を判定する。試験サンプル中に存在するBS265抗原の
量は、生成したシグナルに比例する。
【０１７５】 もう1つのアッセイ様式では、（1）BS265抗原に特異的に結合するポリクロー ナル抗体、モノクローナル抗体もしくはその断片、または固体支持体に結合した
そのような抗体の組合せ、（2）試験サンプル、および（3）シグナル生成化合物
が結合している、異なるBS265抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体、ポ リクローナル抗体もしくはその断片（またはこれらの抗体の組合せ）含む指示試
薬を接触させることにより、混合物を得る。この混合物を、抗体／抗原／抗体複
合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。該シグナル生成化
合物により生成した測定可能なシグナルを検出することにより、試験サンプル中
に存在し固相上に捕捉されたBS265抗原の存在を判定する。試験サンプル中に存 在するBS265抗原の量は、生成したシグナルに比例する。
【０１７６】 もう1つのアッセイ様式では、本発明の少なくとも2つのモノクローナル抗体の
一方または組合せを、BS265抗原に対する抗体の検出のための競合プローブとし て使用することができる。例えば、BS265ポリペプチド（例えば、本明細書に開 示の組換え抗原）を、単独で又は組合せて、固相上にコーティングする。ついで
、BS265抗原に対する抗体を含有する疑いのある試験サンプルを、シグナル生成 化合物と本発明の少なくとも1つのモノクローナル抗体とを含む指示試薬と共に 、固相に結合している試験サンプルおよび指示試薬または固相に結合している指
示試薬のいずれかの抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキ
ュベートする。固相に対するモノクローナル抗体の結合の減少を定量的に測定す
ることができる。
【０１７７】 さらに別の検出方法では、本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体
のそれぞれを、免疫組織化学的分析による組織切片中または細胞中のBS265抗原 の検出において使用することができる。組織切片は組織の凍結或いは化学的固定
サンプルから切り出すことができる。細胞中の抗原を検出する場合には、血液、
尿、胸部吸引液その他の体液から細胞を単離することが可能である。細胞は、外
科的な又は針を用いた生検により得ることもできる。本願発明の抗体で染色する
特定の細胞画分を富化させるために、遠心分離することにより、または、磁性粒
子若しくは強磁性流体で標識した後に磁気吸引することによりに細胞を単離する
ことが可能である。これらの抗体を直接的に標識（例えば、フルオレセイン、金
コロイド、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど
での標識）したり又は二次標識化抗種抗体を使用して標識（本明細書に例示する
種々の標識）して、疾患の組織病理を追跡する細胞化学的分析も、本発明の範囲
内に含まれる。
【０１７８】 さらに、これらのモノクローナル抗体を、CNBr活性化セファロースに類似した
マトリックスに結合させて、細胞培養または生物学的組織からの特異的BS265ポ リペプチドのアフィニティー精製（例えば、組換え及び天然BS265タンパク質の 精製）に使用することができる。
【０１７９】 また、本発明のモノクローナル抗体は、治療用途または他の同様の用途のため
のキメラ抗体の産生に使用することができる。
【０１８０】 モノクローナル抗体またはその断片は、BS265抗原の検出のために個々に提供 することができる。また、本発明で提供するモノクローナル抗体（およびその断
片）の組合せを、他のBS265領域に特異的に結合する抗体（各抗体は、異なる結 合特異性を有する）と共に、本発明の少なくとも1つのBS265抗体の混合物または
「カクテル」中の成分として一緒に使用することができる。したがって、このカ
クテルは、本明細書に開示のBS265ポリペプチドに対する本発明のモノクローナ ル抗体と、BS265抗原または他の関連タンパク質の他の抗原決定基に特異的な他 のモノクローナル抗体とを含むことが可能である。
【０１８１】 アッセイ様式で使用しうるポリクローナル抗体またはその断片は、BS265ポリ ペプチドまたは該アッセイで追加的に使用する他のBS265ポリペプチドに特異的 に結合すべきである。好ましく使用されるポリクロナール抗体は、BS265ポリペ プチドに結合する、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジポリクローナル抗体などの
哺乳動物に由来するものである。最も好ましくは、該ポリクローナル抗体は、ウ
サギに由来するものである。該アッセイで使用するポリクローナル抗体は、単独
で又はポリクローナル抗体のカクテルとして使用することができる。該アッセイ
様式で使用するカクテルは、BS265ポリペプチドに対する異なる結合親和性を有 するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むため、それらは、乳癌
などの***の疾患または状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、in
vivo イメージング、予防もしくは治療または素因の判定に有用である。
【０１８２】 組換え抗原の使用により、あるいは該ペプチドは、BS265のアミノ酸配列を含 む合成ペプチドまたは精製ペプチドの使用により、アッセイにおいてBS265抗原 の検出が可能となることが意図され、それが本発明の範囲内に含まれる。そのよ
うなポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号16および配列番号17並びにそれら
の断片よりなる群から選ばれる。また、BS265の異なるエピトープを定める異な る合成、組換えまたは精製ペプチドを、乳癌などの***の疾患または状態の検出
、診断、病期分類、モニター、予後判定、in vivoイメージング、予防もしくは 治療または素因の判定のためのアッセイにおいて併用することも、本発明の範囲
内に含まれる。この場合、これらのペプチドすべてを固相上にコーティングした
り、あるいはそれぞれ分離したペプチドを、分離した固相（例えば、微粒子）上
にコーティングし、ついで、後にアッセイにおいて使用しうるペプチド混合物を
形成するように合体させることが可能である。さらに、乳癌などの***の疾患ま
たは状態の検出、診断、病期分類、モニター、予後判定、予防もしくは治療また
は素因の判定のために、異なる抗原からのエピトープを定める複数のペプチドを
使用することができると期待される。ついで、固相上にコーティングされた又は
検出可能な標識で標識されたペプチドを、一定量の抗体に関して、患者のサンプ
ル中に存在する（存在する場合）ペプチドと競合させる。該抗体に対する該合成
、組換えまたは精製ペプチドの結合の減少は、患者のサンプル中のBS265抗原の 存在の指標となる。BS265抗原の存在は、患者における***組織の疾患、特に乳 癌の存在を示す。アッセイ様式の変形は、当業者に公知であり、本明細書におい
て後に検討する。
【０１８３】 もう1つのアッセイ様式では、以下のとおり、抗BS265抗体および／またはBS26
5抗原の存在を同時に検出することができる。試験サンプルを、同時に、第1被検
体の捕捉試薬（該捕捉試薬は、固相に結合した第1被検体に特異的な第1結合メン
バーを含む）および第2被検体の捕捉試薬（該捕捉試薬は、第2固相に結合した第
2被検体に対する第1結合メンバーを含む）と接触させて、混合物を得る。この混
合物を、捕捉試薬／第1被検体および捕捉試薬／第2被検体複合体の形成に十分な
時間および条件下でインキュベートする。ついで、これらのいわゆる複合体を、
シグナル生成化合物で標識された第1被検体に特異的な結合ペアのメンバーと、 シグナル生成化合物で標識された第2被検体に特異的な結合ペアのメンバーとを 含む指示試薬に接触させる。この第2混合物を、捕捉試薬／第1被検体／指示試薬
複合体および捕捉試薬／第2被検体／指示試薬複合体の形成に十分な時間および 条件下でインキュベートする。いずれかの又は両方の固相上で形成した複合体に
関して生成したシグナルを、試験サンプル中の1以上の被検体の存在の指標とし て検出することにより、1以上の被検体の存在を判定する。このアッセイ様式で は、本明細書に開示する発現系に由来する組換え抗原、および本明細書に開示の
発現系に由来するタンパク質から産生したモノクローナル抗体を使用することが
できる。例えば、このアッセイでは、BS265抗原を第1被検体とすることが可能で
ある。そのようなアッセイ系は、EP公開第0473065号に、より詳しく記載されて いる。
【０１８４】 さらにもう1つのアッセイ様式では、本明細書に開示するポリペプチドを使用 して、試験サンプル中のBS265抗原に対する抗体の存在を検出することができる 。例えば、試験サンプルを、少なくとも1つのポリペプチド（例えば、組換えタ ンパク質または合成ペプチド）が結合している固相と共にインキュベートする。
該ポリペプチドは、配列番号16および配列番号17並びにそれらの断片よりなる群
から選ばれる。これらを、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で
反応させる。インキュベーション後、該抗原／抗体複合体を検出する。選択する
アッセイ系に応じて、検出を容易にするために、指示試薬を使用することができ
る。もう1つのアッセイ様式では、試験サンプルを、本明細書に記載のとおりに 産生させた組換えタンパク質が結合している固相と接触させ、また、指示試薬で
好ましくは標識されている、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体と接触させる。抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件
下でインキュベーションした後、固相を遊離相から分離し、該標識をBS265抗原 に対する抗体の存在の指標として該固相中または該遊離相中で検出する。本明細
書に開示する組換え抗原を使用する他のアッセイ様式が期待される。これらは、
第1起源からの少なくとも1つの抗原が結合している固相と試験サンプルとを接触
させ、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下で該固相と試験サンプ
ルとをインキュベートし、ついで該固相を標識抗原（該抗原は、第1起源とは異 なる第2起源に由来する）と接触させることを含む。例えば、大腸菌（E. coli）
などの第1起源に由来する組換えタンパク質を、固相上の捕捉抗原として使用し 、そのように調製された固相に試験サンプルを加え、必要に応じて標準的なイン
キュベーションおよび洗浄工程の後、異なる起源（すなわち、非大腸菌（E. col
i））に由来する組換えタンパク質を、後に検出する指示試薬の一部として使用 する。同様に、固相上の組換え抗原と合成ペプチド（指示相中）との組合せも可
能である。第1起源から産生した又はそれに由来するBS265に特異的な捕捉抗原と
しての抗原と、異なる第2起源からのBS265に特異的な抗原とを使用する任意のア
ッセイ様式が期待される。このように、組換え抗原の種々の組合せ、および合成
ペプチド、精製タンパク質などの使用が、本発明の範囲内に含まれる。このアッ
セイおよび他のアッセイは、同一所有者の米国特許第5,254,458号に記載されて いる。
【０１８５】 また、種々の他の固相を使用する他の実施態様も意図され、本発明の範囲内に
含まれる。例えば、速い液相免疫化学的反応を行なうために、負に荷電した重合
体との固定化可能反応複合体を固定化するためのイオン捕捉法（EP公開第032610
0号およびEP公開第0406473号に記載されている）を本発明で使用することができ
る。固定化可能な免疫複合体は、その負に荷電したポリ-アニオン／免疫複合体 と、予め処理されている正に荷電した多孔性マトリックスとの間のイオン相互作
用により、該反応混合物の残部から分離され、既に記載されている種々のシグナ
ル生成系（例えば、EPO公開第0273,115号に記載の化学発光シグナルの測定にお いて記載されているもの）を用いて検出される。
【０１８６】 また、固相が微粒子（磁性または非磁性）を含む微粒子技術を用いる系（例え
ば、自動化系および半自動化系）での使用に、本発明の方法を適合させることが
可能である。そのような系には、例えば、公開されているEPO出願EP 0425 633お
よびEP 0424634にそれぞれ記載されている系が含まれる。
【０１８７】 イムノアッセイにおける走査型プローブ顕微鏡検査法（scanning probe micro
scopy）（SPM）の使用も、本発明のモノクローナル抗体を容易に適合させること
が可能な技術として挙げられる。走査型プローブ顕微鏡検査法、特に原子間力顕
微鏡検査法においては、捕捉相、例えば、本発明のモノクローナル抗体の少なく
とも1つを固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用して、固相の表面上に 存在しうる抗原／抗体複合体を検出する。通常、多数のイムノアッセイ系におい
ては、抗原／抗体複合体を検出するために標識を使用しなければならないが、走
査型トンネル顕微鏡検査法を使用すると、そのような標識が不要になる。特異的
結合反応をモニターするためのSPMの使用は、多数の方法で実施することが可能 である。1つの実施態様では、特異的結合パートナーのメンバーの1つ（本発明の
モノクローナル抗体である被検体特異的物質）を、走査に適した表面に結合させ
る。該被検体特異的物質の結合は、当業者に公知の方法に従って行なう、プラス
チックまたは金属表面の固相を含む試験片に対する吸着によるものであってもよ
い。あるいは、誘導体化プラスチック、金属、シリコン（ケイ素）またはガラス
の固相を含む試験片に対する特異的結合パートナー（被検体特異的物質）の共有
結合を用いてもよい。共有結合方法は、当業者に公知であり、特異的結合パート
ナーを試験片に不可逆的に結合させるための種々の手段を含む。該試験片がシリ
コンまたはガラスである場合には、特異的結合パートナーを結合させる前に、該
表面を活性化する必要がある。また、特異的結合パートナーを試験片の表面上に
化学的方法で固定化するために、混成電極相互作用を用いることができる。好ま
しい結合方法は、共有的手段によるものである。特異的結合メンバーの結合の後
、非特異的結合を最小限に抑えるために、該表面を血清、タンパク質または他の
ブロッキング剤などの物質で更に処理することができる。また、アッセイ目的に
対する適合性を確認するために、該表面を、製造部位または使用点において走査
することができる。走査過程は、試験片の特異的結合特性を変えないと考えられ
る。
【０１８８】 本発明は、主として固相の使用に関して開示されているが、本発明の抗体、タ
ンパク質、ペプチドなどの試薬は、非固相アッセイ系においても使用可能である
と期待される。これらのアッセイ系は、当業者に公知であり、本発明の範囲内に
含まれるとみなされる。
【０１８９】 アッセイに使用する試薬は、バイアル、ボトルなどの1以上の容器を有する試 験キットの形態で提供できると期待される。その各容器は、該アッセイで使用す
るプローブ、プライマー、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のカ
クテル、またはポリペプチド（例えば、組換え的、合成的に製造または精製され
たもの）などの別個の試薬を含有する。該ポリペプチドは、配列番号16および配
列番号17並びにそれらの断片よりなる群から選ばれる。当業者に公知の他の成分
（例えば、緩衝液、対照など）を、そのような試験キットに含めることが可能で
ある。また、利用可能な体液（例えば、血液、尿、唾液および糞便）を含む試験
サンプルを採集するための手段を有する試験キットを提供することが期待される
。採集に有用なそのような手段（「採集材料」）には、血液を採集し安定化する
ためのランセットおよび吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワブ
、尿または糞便サンプルを採集し安定化するためのカップが含まれる。該サンプ
ルの変性または不可逆的吸着を避けるために、所望により、採集材料、紙、布、
スワブ、カップなどを処理することが可能である。また、試料の完全性を維持す
るのを助けるために、該採集材料を保存剤、安定化剤または抗微生物剤で処理し
たり、該採集材料に保存剤、安定化剤または抗微生物剤を含有させることが可能
である。手術または針生検により得た試験試料の採集、安定化および保存のため
に設計された試験キットも有用である。すべてのキットは、別個に提供されるこ
とが可能な2つの成分（その一方の成分は、試料の採集および運搬のためのもの であり、もう一方は、試料の分析のためのものである）に構成することができる
と期待される。例えば、採集成分は、公開市場の消費者に提供することが可能で
あり、一方、分析用成分は、被検体の存在、不存在または量の測定のために研究
者などに提供することが可能である。さらに、試験試料の採集、安定化および保
存のためのキットは、熟練していない者による使用を意図して構成することが可
能であり、家庭で使用された後、該試験サンプルの分析のために研究室に運搬さ
れることを意図して、公開市場において入手可能とすることができる。
【０１９０】 In vivo での抗体の使用 本発明の抗体は、in vivo において使用することが可能である。即ち、診断ま
たは治療対象の***疾患に罹患している、または罹患していると予想される患者
にそれら抗体を注射投与することが可能である。In vivo 診断のための抗体の使
用は当業界において周知である。Sumerdon らは、インジウム−111を標識に使用
した癌胎児性抗原（CEA）発現腫瘍のラジオイムノシントグラフィックイメージ ングに最適化した抗体-キレーターについて記載している (Nucl.Med.Biol17:247
-254(1990))。Griffin らは再発性直腸癌を有していると予想される患者におけ る腫瘍の検出においての本薬剤の使用について記載している(J.Clin Onc 9:631-
640(1991))。乳癌その他の***疾患に罹患していると予想される患者の診断また
は病期分類のために、BS265抗原に対する抗体を該患者に注射し得ることが予想 される。使用される標識は選択されるイメージングの様式にあわせて選択される
であろう。インジウム−111、テクネシウム−99m又はヨウ素-131等の放射性同位
体を、二次元スキャンまたは単光子射出コンピューター断層撮影（SPECT）に使 用することが可能である。フルオリン−19等の陽電子射出標識も陽子射出断層撮
影法（PET）に使用し得る。MRIには、ガドリニウム（III）またはマンガン（II ）等の常磁性体イオンが使用できる。***内部或いは***外部における標識の局
在化によって疾患の拡大を判断し得る。***内部の標識の総量によって、***の
癌の有無を判断し得る。
【０１９１】 ***疾患に罹患していることがわかっている患者に、BS265抗原に対する抗体 を注射することにより治療的利益が得られる。抗体は、薬剤を更に結合させなく
ても、組織又は臓器の内部又は表面上に発現しているBS265抗原に結合すること によってその効果を発揮する。或いは、医薬、毒物又は放射性核種を抗体に結合
させて、その治療効果の亢進を図ることも可能である。Garnet と Baldwin は 、薬剤-モノクローナル抗体複合体の調製について報告している(Cancer Researc
h 46: 2407-2412(1986))。 Pastan らは、様々な癌治療に対するモノクロナー ル抗体に結合した毒物の使用についての総説を寄稿している(Cell 47:641-648) 。Goodwin とMearesは、様々な手法を用いて、イットリウム-90標識モノクロー ナル抗体の正常組織における傷害性を限定しつつも、腫瘍に対する薬剤の濃度を
最大化させるイットリウム-90標識モノクローナル抗体の使用について報告して いる(Cancer Supplement 80:2675-2680(1997))。 その他既知の傷害性放射性核
種には、銅-67、ヨウ素-131およびレニウム-186などの、乳癌治療用の抗BS265抗
原モノクローナル抗体を標識するために使用し得るものが含まれる。
【０１９２】 大腸菌（E. coli）（クローン3090742H1）は、American Type Culture Collec
tion（A.T.C.C.）、10801 University Blvd. Manassas, VA, 20110に1998年3月9
日に寄託されている。本寄託はブダペスト条約の条項に基づき、寄託の日から30
年間または寄託に関する最終請求後5年間または該米国特許の存続期間のうち最 も遅い時まで保管されることとなる。該寄託および本明細書に記載の他の任意の
寄託物質は、便宜上与えられているにすぎず、本明細書の教示を考慮して本発明
を実施することは必ずしも要求されない。それらの全寄託物質におけるcDNA配列
を、参考として本明細書に組入れるものとする。クローン3090742H1には、A.T.C
.C.受託第98683号が付与されている。
【０１９３】 つぎに、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は例示にすぎず、
本発明の範囲を限定するものではない。
【０１９４】
【実施例】
実施例1：***組織ライブラリーBS265遺伝子特異的クローンの特定 A．発現されたタグ配列（EST）または転写イメージにおける、ライブラリーの 比較 cDNAクローン挿入断片の部分配列、いわゆる「発現されたタグ配列」（EST） を、***腫瘍組織、女房非腫瘍組織および多数の他の組織（腫瘍および非腫瘍の
両方）から作製したcDNAライブラリーから導き出し、遺伝子転写イメージとして
データベース（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CAから入手可能なLIFESEQ ＴＭ データベース）に入力した。国際公開WO 95/20681を参照されたい（転写イ メージは、ある与えられた組織ライブラリーにおける代表遺伝子のそれぞれに関
するEST数の一覧である。相互配列重複の領域を共有するESTは、クラスターに分
類される。クラスターには、代表的5’ESTからのクローン番号が割り当てられる
。
【０１９５】 しばしば、関心のあるクラスターを、そのコンセンサス配列と、自動化クラス
タリングの基準を満足しなかった他のESTの配列との比較により伸長させること が可能である。入手可能な全クラスターおよび単一ESTのアラインメントは、コ ンセンサス配列が導かれるコンティグを表す）。ついで該転写イメージを評価し
て、主として***組織ライブラリーを代表するEST配列を同定した。ついで、こ れらの標的クローンを、標的ライブラリー中のそれらの存在量（出現頻度）と、
バックグラウンドライブラリーにおけるそれらの不存在とに基づきランク付けし
た。低いバックグラウンド出現頻度を有する、より高い存在量のクローンには、
より高い研究優先度を与えた。BS265のコンセンサス配列に対応するESTが***組
織ライブラリーの33.3％（9/27）において認められた。配列番号6（又はその断 片）に対応するコンセンサス配列が、データベースのその他の、即ち、***以外
のライブラリーのわずか0.6％（3/476）において確認された。従って、非***組
織に比べ、***組織で確認されたコンセンサス配列あるいはその断片は52倍以上
であった。重複クローン3090742H1（配列番号1）、g991752（配列番号2）、g205
8967（配列番号3）、g1615448（配列番号4）を、さらなる研究に割り当てた。こ
れらは、クローン3090742H1（3090742inh（配列番号５）として示される）の全 配列とともに本明細書に記載するコンセンサス配列（配列番号6）を導き出すも とになった、コンティグを形成するのに必要な最小数のクローンを代表した。
【０１９６】 B．コンセンサス配列の作製 クローン3090742H1（配列番号1）、g991752（配列番号2）、g2058967（配列番
号3）、g1615448（配列番号4）およびクローン3090742H1の全配列（3090742inh(
配列番号５)として示す）のヌクレオチド配列を、SequencherTMプログラム（Gen
e Codes Corporation, Ann Arbor, MIから入手可能）に入力して、ヌクレオチド
アライメント（コンティグ地図）を得、ついでそれらのコンセンサス配列（配列
番号9）を得た。図1A〜1Bは、これらのクローンのヌクレオチド配列アラインメ ント、および得られたそれらのヌクレオチドコンセンサス配列（配列番号6）を 示す。図2は、BS265遺伝子の重複領域を形成するクローン3090742H1（配列番号1
）、g991752（配列番号2）、g2058967（配列番号3）、g1615448（配列番号4）お
よびクローン3090742H1（3090742inh（配列番号5）として示す）を示すコンティ
グ地図と、これらのクローンから得られたコンセンサスヌクレオチド配列（配列
番号6）とを図示的に表す。これの後、該コンセンサス配列（配列番号6）上で3 フレーム翻訳を行なった。第1フォワードフレームは、配列番号16で示される40 アミノ酸残基の配列をコードすることが判明し、これを配列番号16として示す。
このペプチド配列は、配列番号6のヌクレオチド１〜120に対応する。
【０１９７】 実施例2：BS265 EST特異的クローンの配列決定 BS265遺伝子コンティグのほとんどの上流および下流ESTを含むクローンのDNA 配列を、公知方法に従い、色素ターミネーターを使用するジデオキシターミネー
ション配列決定法で決定した（F Sangerら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463
(1977)）。
【０１９８】 pSPORT1(Life Technologies, Gaithersburg, MD)やpINCY（Incyte Pharmaceut
icals,Inc., Palo Alto, CA より入手可）などのベクターは、該挿入断片の3’ および5’ライゲーション結合部に直接隣接した普遍的プライミング部位を含有 するため、普遍的プライマー（配列番号9および配列番号10）（それぞれ、New E
ngland Biolabs, Beverly, MAおよびApplied Biosystems Inc, Foster City, CA
より入手可能）を使用して該挿入断片を両方向に配列決定する。該配列決定反応
を、ポリアクリルアミド変性ゲル上で行ない、Applied Biosystems 377 Sequenc
er（Applied Biosystems, Foster City, CAから入手可能）又はその他の配列決 定機器により、該配列を決定する。追加的な配列決定プライマー（配列番号11〜
13）を、コンセンサス配列（配列番号6）からの配列情報を基に設計した。つい で、これらのプライマーを使用して、既に記載されているとおりに、各DNA鎖か らのクローン化挿入断片の残りのDNA配列を決定した。
【０１９９】 実施例3：核酸 A．組織からのRNAの抽出 ***組織および非***組織から全RNAを単離した。当該技術分野で公知であり 文献（Katoら, J. Virol. 61:21-2191, (1987)およびTRIzolTM（Gibco−BRL．Gr
and．Island.NY）に記載されている塩化リチウム／尿素法を含む（これらに限定
されるものではない）種々の方法を用いた。
【０２００】 簡単には、該組織を氷上の無菌円錐管中に配置し、10〜15容量の3M LiCl、6.M
尿素、5mM EDTA、0.1M β-メルカプトエタノール、50mM Tris-HCl (pH7.5)、0.1
％サルコシルを加えた。該組織を、氷上でOmniTHホモジナイザー（Omni Interna
tional, Inc., Warrenton,VA）で30〜50秒間ホモジナイズした。該溶液を15mlプ
ラスチック遠心管に移し、−20℃で一晩放置した。該管を9,000×g、0〜4℃で遠
心し、該上清を直ちにデカントした。10mlの3M LiClを加え、該管を5秒間ボルテ
ックスした。
【０２０１】 チューブを9,000×g、0〜4℃で45分間遠心した。デカント、LiClへの再懸濁お
よび遠心分離を繰返し、最終ペレットを風乾し、2mlの1mM EDTA、0.5% SDS、10m
M Tris (pH7.5)に懸濁した。10分の1容量（0.22〜025ml）の3M NaClを加え、該 溶液をボルテックスした後、0.1％（w/v）8-ヒドロキシキノリンを含む2mlのフ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（PCI）を含有する予め冷却し た別の管に移した。該管を1〜3秒間ボルテックスし、3,000×g、10℃で20分間遠
心した。PCI抽出を更に繰返し、ついでクロロホルム／イソアミルアルコール（C
I）での同様の抽出を2回行なった。最終水溶液を、6.5mlの95％エタノールを含 有する予め冷却した15mlコレックスガラス管に移し、該管をパラフィンで覆い、
−20℃で一晩放置した。該管を10,000×g、0〜4℃で30分間遠心し、該エタノー ル上清を直ちにデカントした。該RNAペレットを10mlの75％氷冷エタノールで4回
洗浄し、最終ペレットを室温で15分間風乾した。該RNAを0.1ml 脱イオンホルム アミド（FORMAzol（登録商標）,Molecular Research Products, Cincinnati, OH
）に懸濁し、その濃度を分光光度的に測定した。RNAサンプルを等分割し、100％
FORMAzol（登録商標）中において−70℃で保存した。
【０２０２】 該RNAの量を、変性アガロースゲル電気泳動（実施例5のノーザンブロット分析
を参照されたい）により測定した（サンプルは、ゲルに乗せる前に、サンプルに
1 mg/ml の臭化エチジウムを添加することによりサンプルを可視化した）。無傷
rRNAを含有しないRNAサンプルを、該研究から除外した。
【０２０３】 RT-PCR分析では、1mlのUltraspec RNA試薬を、2.0mlポリプロピレンミクロ遠 心管120mgの微粉砕組織に加え、Polytron（登録商標）ホモジナイザー（Brinkma
n Instruments, Inc., Westbury, NY）で50秒間ホモジナイズし、氷上に5分間置
いた。ついで0.2mlのクロロホルムを各サンプルに加え、ついで15秒間ボルテッ クスした。該サンプルを氷中に更に5分間置き、ついで12,000×g、4℃で15分間 遠心した。該上層を集め、RNアーゼを含まない別の2.0mlミクロ遠心管に移した 。等容量のイソプロパノールを各サンプルに加え、該溶液を氷上に10分間放置し
た。該サンプルを12,000×g、4℃で10分間遠心し、該上清を捨てた。残ったペレ
ットを冷75％エタノールで2回洗浄し、ボルテックスにより再懸濁し、再懸濁し た該物質をついで、7,500×g、4℃で5分間遠心分離によりペレット化した。最後
に、該RNAペレットをスピードバック（speedvac）（Savant,Farmingdale,NY）中
で５分間乾燥し、RNアーゼを含まない水中で再構成した。
【０２０４】 B．血液単核細胞からのRNA抽出 単核細胞を、以下のとおりFicoll-Hypaqueを使用する遠心分離により、患者か
らの血液サンプルから単離する。10ml容量の全血を、等容量のRPMI培地（Gibco −BRL，GrandIsland、NY）と混合する。ついでこの混合物の下に10mlのFicoll-H
ypaque（Pharmacia, Piscataway, NJ）を配置し、200×gで30分間遠心する。該 単核細胞を含有するバフィーコートを取り出し、Dulbecco PBS（Gibco−BRL，Gr
andIsland、NY）で50mlまで希釈し、該混合物を200×gで10分間遠心した。2回の
洗浄の後、得られたペレットをDulbecco PBSに再懸濁して、1mlの最終容量とす る。
【０２０５】 N.Katoら（J.Virology 61:2182-2191(1987)）に記載のとおりに、単離した単 核細胞からRNAを調製する。簡単に説明すると、該ペレット化単核細胞を1mlの最
終容量にし、ついで250μLのPBSに再懸濁し、2.5mlの3M LiCl、6M尿素、5mM EDT
A、0.1M 2-メルカプトエタノール、50mM Tris-HCl (pH7.5)と混合する。得られ た混合物をホモジナイズし、−20℃で一晩インキュベートする。該ホモジネート
を、Beckman J2-21Mローター中、8,000RPM、0〜4℃で90分間遠心する。該ペレッ
トを、ボルテックスすることにより10mlの3M LiClに再懸濁し、ついでBeckman J
2-21Mローター遠心機中、10,000RPM、0〜4℃で45分間遠心する。ついで該再懸濁
工程およびペレット化工程を繰返す。該ペレットを、ボルテックスしながら2ml の1mM EDTA、0.5%SDS、10mM Tris (pH7.5)および400μgプロテイナーゼKに再懸 濁し、ついでそれを、振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。ついで
10分の1の容量の3M NaClを加え、該混合物をボルテックスする。フェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（PCI）での2サイクルの抽出、およびそれに
続くクロロホルム／イソアミルアルコール（CI）での1回の抽出により、タンパ ク質を除去する。6mlのエタノールを加え、ついで−20℃で一晩インキュベート することにより、RNAを沈殿させる。該沈殿RNAを遠心により集めた後、該ペレッ
トを75％エタノールで4回洗浄する。ついで該ペレット化RNAを1mM EDTA、10mM T
ris-HCl (pH7.5)を含む溶液に溶解する。
【０２０６】 非***組織を陰性対照として使用する。さらにポリアデニル化RNAの単離のた めのオリゴdTセルローススピンカラム（Pharmacia, Uppsala, SwedenからのRedi
ColＴＭ）などの商業的に入手可能なキットを使用して、該mRNAを全RNAから精製
することができる。全RNAまたはmRNAは、リボヌクレアーゼ保護アッセイにおけ る分析のために溶解緩衝液（5Mグアニジンチオシアナート、0.1m EDTA、pH7.0）
中に溶解することができる。
【０２０７】 C．ポリソームからのRNA抽出 組織を、4℃、食塩水中で細かく刻み、6mM 2-メルカプトエタノールを含有す るTK１５０M（150mM KCl、5mM MgCl２、50mM Tris-HCl、pH7.5）溶液中、2.5容 量の0.8Mショ糖と混合する。該組織を、Teflon-ガラスPotterホモジナイザー中 、100〜200rpm、5往復で、ついでDounceホモジナイザー中、6往復でホモジナイ ズする（B. Mechler, Methods in Enzymology 152:241-248 (1987)に記載のとお
り）。ついで該ホモジネートを、12,000×g、4℃で15分間遠心して、核を沈降さ
せる。2mlの該上清を、TK150M中の2.5Mショ糖6mlと混合し、この混合物を38mlポ
リアロマー管内のTK150M中の4mlの2.5Mショ糖の上に重層することにより、該ポ リソームを単離する。追加的な2つのTK１５０M溶液を、該抽出画分の上に順次重
層する（13mlの2.05Mショ糖の第1層およびそれに続く6mlの1.3Mショ糖の第2層）
。該勾配を90,000×g、4℃で5時間遠心することにより、該ポリソームを単離す る。ついで該画分をシリコーン化パスツールピペットで1.3Mショ糖／2.05Mショ 糖界面から取り、等量のTE（10mM Tris-HCl、pH7.4、1mM EDTA）中に希釈する。
等容量の90℃のSDS緩衝液（1%SDS、200mM NaCl、20mM Tris-HCl、pH7.4）を加え
、該溶液を沸騰水浴中で2分間インキュベートする。つぎにタンパク質をプロテ イナーゼK（50mg/ml）で37℃で15分間消化する。等容量のフェノール／クロロホ
ルムで3回抽出し、ついで0.1容量の2M酢酸ナトリウム（pH5.2）および2容量の10
0％エタノールで−20℃で一晩沈殿させることにより、該mRNAを精製する。その 沈殿したRNAを、12,000×g、4℃で10分間の遠心分離により回収する。該RNAを乾
燥し、TE（pH7.4）または蒸留水に再懸濁する。ついで該再懸濁化RNAをスロット
ブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで使用して、BS
265 mRNAの存在を確認することができる（実施例6を参照されたい）。
【０２０８】 核酸およびタンパク質の量は、用いる製造方法に左右される。標的分子の単離
効率を最大にするためには、各サンプルは、異なる調製技術を必要とするかもし
れない。これらの調製技術は、当業者の技量の範囲内に含まれる。
【０２０９】 実施例4：リボヌクレアーゼ保護アッセイ A．標識化相補的RNA（cRNA）ハイブリダイゼーションプローブおよび未標識セ ンス鎖の合成 SP6又はT7のような5’RNAポリメラーゼプロモーターを含むBS265遺伝子cDNA配
列から標識アンチセンス及び非標識センスリボプローブを転写した。配列は、お
およそのBS265cDNA挿入を含むベクターあるいは5’RNAポリメラーゼプロモータ ー配列と結合したPCRプライマーを用いた該挿入のPCR-合成産物から得られる。 例えば、開示されているプラスミド（クローン3090742H1）あるいは対向するSP6
およびT7（その他の）RNAポリメラーゼプロモーターに隣接するBS265遺伝子cDNA
配列を含むその他の同等物を、Qiagen Plasmid Purificationキット（Qiagen, C
hatsworth, CA）を使用して精製した。ついで10μgの該プラスミドDNAを、DdeI 等の適当な制限酵素を用いて37℃で1.5時間で切断し線状化した。その線状化さ れたプラスミドDNAを、QIAprepキット（Qiagen, Chatsworth, CA）を使用して精
製し、（アルファ３２P）CTP（Amersham Life Sciences. Inc. Arlington Heigh
ts. IL）あるいはビオチン化CTPを標識として使用し、Riboprobe（登録商標）イ
ンビトロTranscription System（Promega Corporation, Madison, WI）を該供給
業者の指示書の記載のとおりに使用して、アンチセンス転写産物を適当なプロモ
ーターから合成するために使用した。該センス鎖を得るために、10μgの該精製 プラスミドDNAを、XbaI及びNotI等の制限酵素で切断し、前記のとおりに適当な プロモーターから転写した。センスおよびアンチセンスの両方の鎖を、スピンカ
ラムクロマトグラフィーにより単離した。未標識センス鎖を、260nmのUV吸収に より定量した。
【０２１０】 B．標的に対する標識プローブのハイブリダイゼーション 凍結した組織を、液体窒素下で粉砕して粉末にし、100〜500 mgを1 ml倍容量 の溶解緩衝液（Direct ProtectＴＭ Lysate Rnase Protection キット（Ambion,
Inc., Austin, TX）の一成分として入手可能）に溶解した。さらに組織ホモジ ナーザーを使用して溶解が可能である。また、陽性対照として使用するために、
マウス肝臓溶液中の既知量のセンス鎖の希釈系列を作製した。最後に、可溶化し
た組織あるいは希釈センス標準の45 μLをともに（１）１×105 cpmの放射活性 標識プローブ、あるいは（２）5 μLの溶解緩衝液中の250 pgの非放射性同位体 標識プローブに直接混和する。 ハイブリダイゼーションを37℃で一晩進行させた。（T.Kaabacheら. Anal.Bioch
em.232:225-230参照） C．RNアーゼ消化 Direct ProtectＴＭプロトコールに従い、RNアーゼAおよびRNアーゼT1の溶液 を37℃で30分間使用して、その後サルコシルナトリウムの存在下でプロテイナー
ゼK切断によりRNase を除去することにより、プローブにハイブリダイズしてい
ないRNAを該反応から除去する。ついで、消化されないように保護されたハイブ リダイズした断片を同容量のイソプロパノールを加え、−70℃で３時間放置する
ことにより沈殿させる。該沈殿物を、12,000×gで20分間の遠心分離により集め る。
【０２１１】 D．断片の分析 該沈殿物を、変性ゲルローディング色素（80%ホルムアミド、10mM EDTA (pH8.
0)、1mg/mlキシレンシアノール、1mg/mlブロモフェノールブルー）に溶解し、熱
変性させ、6％ポリアクリルアミドTBE、8M尿素変性ゲル中で電気泳動する。STOR
M貯蔵蛍りん光体（storage phosphor）オートラジオグラフィー系（Molecular D
ynamics, Sunnyvale, CA）を使用して、該ゲルをイメージングし、分析する。試
験サンプルから得られるピーク領域と濃度既知の陽性対象のセンス標準希釈から
得られるピーク領域と比較することによって、フェムトグラム（fg）程度発現さ
れている保護されている断片のバンドが定量され（前掲のセクションB参照）。 結果は、BS265RNAの分子/細胞およびイメージ評価得点として表す。非放射性同 位体標識を使用する場合には、ハイブリッドはブロッティングによりゲルから膜
（ナイロン又はニトロセルローズ）へトランスファーし、ストレプトアビジンア
ルカリホスファターゼ結合およびケミルミネッセンス又はケミフルオレッセンス
試薬を利用する検出システムを使用して分析する。
【０２１２】 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6並
びにその断片又は相補体から成る群より選択される配列を含む産生物の検出は、
BS265ｍRNAの存在を示す指標であり、乳癌等の***組織の疾患あるいは状態の診
断を示唆している。
【０２１３】 実施例5：ノーザンブロット法 ゲル電気泳動および核酸ハイブリダイゼーションによりRNAの複合体集団由来 の特定のサイズのRNA断片を同定するために、ノーザンブロット法を用いる。ノ ーザンブロット法は、当業界において周知の技術である。簡単に説明すると、40
mMモルヒリノプロパンスルホン酸（MOPS）(pH7.0)、10mM酢酸ナトリウム、1mM E
DTA、2.2Mホルムアルデヒド、50% v/vホルムアミドを含有する15μlの溶液中で 、5〜10μgの全RNA（実施例3．核酸の調製を参照されたい）を65℃で15分間イン
キュベートする。該変性RNAを2μlのローディング緩衝液（50%グリセロール、1m
M EDTA、0.4%ブロモフェノールブルー、0.4%キシレンシアノール）と混合し、40
mM MOPS(pH7.0)、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTAおよび2.2Mホルムアルデヒドを
含有する変性1.0％アガロースゲル中にローディングする。該ゲルを60Vで1.5時 間電気泳動し、1.5時間染色しRNアーゼを含まない水中でリンスする。下向性ア ルカリキャピラリートランスファー法（downward alkaline capillary transfer
method）（Chomczynski, Anal. Biochem. 201:134-139, 1992）を用いて、RNA を該ゲルからナイロンメンブレン（Brightstar-Plus, Ambion, Inc., Austin, T
X）に1.5時間トランスファーする。該フィルターを1×SSCでリンスし、Stratali
nkerＴＭ（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）を自動架橋（autocrosslinking）
モードで使用してRNAを該フィルターに架橋し、15分間乾燥した。ついで該メン ブレンを、予め加熱した20mlのプレハイブリダイゼーション溶液（5×SSC、50% ホルムアミド、5×デンハルト液、100μg/ml変性サケ***DNA）を含有するハイ ブリダイゼーション管に入れ、42℃のハイブリダイゼーションオーブン中で少な
くとも3時間インキュベートする。ブロットをプレハイズリダイズする間、（ク ローン3090742H1または同等のクローンをXbaI およびNotIで切断することによ り得られる）BS265挿入断片を使用して、Random Primer DNA Labering System (
Life Technologies, Inc., Gaitherburg, MD)を用いて製造元の説明に従い32P標
識したランダムプライマープローブを合成する。プローブの半量を10分間煮沸し
、直ちに氷中にて冷却してハイブリダイゼーションチューブに加える。ハイブリ
ダイゼーションは、12℃で少なくも12時間実施する。ハイブリダイゼーション溶
液を捨て、フィルターを2回洗浄した後、42℃の0.3×SSC、0.1％SDS、30 mlでそ
れぞれ15分間、2回洗浄する。フィルターをサランラップでラッピングし、コダ ックXAR-Omatフィルムに8〜120時間露出し、フィルムを分析のために現像した。
従って、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列 番号6並びにその断片又は相補体を含む群から選択される配列に対応するmRNAの 高レベルの発現は、BS265ｍRNAの存在の指標であり、乳癌のような***の疾患又
は状態の診断を示唆している。
【０２１４】 実施例6：ドットブロット／スロットブロット ドットおよびスロットブロットアッセイは、複雑な核酸混合物中の特異的核酸
配列の存在を評価するための迅速な方法である。そのようなアッセイを行なうた
めに、50μgまでのRNAを50μlの50％ホルムアミド、7％ホルムアルデヒド、1×S
SC中で混合し、60℃で15分間インキュベートし、ついで氷上で冷却する。ついで
100μlの20×SSCを該RNA混合物に加え、調製されたニトロセルロースまたはナイ
ロンメンブレンを有するマニホールド装置上に真空下でローディングする。該メ
ンブレンを水、20×SSCに1時間漬け、20×SSCで予め湿らせたWhatman#3濾紙の2 枚のシート上に配置し、スロットブロットまたはドットブロット真空マニホール
ド装置中にローディングする。該スロットブロットを、前記実施例4に記載のと おりに調製され標識されたプローブで分析する。配列番号１、配列番号2、配列 番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6並びにそれらの断片または相補体
よりなる群から選ばれる配列に対応するmRNAの検出は、BS265の存在の指標とな り、乳癌などの***組織の疾患または状態の診断を示唆している。
【０２１５】 実施例5および6に記載（ただし、ここでは、特に詳細に記載されているわけで
はない）の方法で使用しうる他の方法および緩衝液は、当該技術分野で公知であ
り、J. Sambrookら（前掲）に記載されている。
【０２１６】 実施例7：In Situハイブリダイゼーション この方法は、検出可能な核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して細胞
中の特異的標的核酸配列を直接検出するのに有用である。
【０２１７】 細胞RNAの保持を最大にするためのパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ ドなどの架橋固定剤を用いて、組織を調製する。L. Angererら, Methods in Cel l Biol. 35:37-71 (1991)を参照されたい。簡単に説明すると、該組織を、50mM リン酸ナトリウム（pH7.5）中の5容量以上の1％グルタルアルデヒド中に4℃で30
分間放置する。該溶液を、新鮮なグルタルアルデヒド溶液（1%グルタルアルデヒ
ド、50mMリン酸ナトリウム中（pH7.5））と交換して、さらに30分間固定する。 該固定溶液は、約0.375％NaClの浸透圧モル濃度を有するべきである。該組織を 等張NaCl中で1回洗浄して、該リン酸を除去する。
【０２１８】 ついで該固定化組織を、以下のとおり、パラフィン中に包埋する。50％（2回 ）、70％（2回）、85％、90％、ついで100％（2回）の一連のエタノール増加濃 度により、それぞれ15分間、該組織を脱水する。つぎに、該組織をキシレン（2 回交換）に、室温でそれぞれ20分間漬ける。ついで該組織を、キシレンおよびパ
ラフィンの1：1混合物（2回交換）に60℃でそれぞれ20分間、ついでパラフィン （3回の最終交換）にそれぞれ15分間漬ける。
【０２１９】 つぎに、該組織を、標準的なミクロトームを使用して5μmの切片に切断し、3-
アミノプロピルトリエトキシシランなどの組織接着剤で予め処理されたスライド
上に配置する。
【０２２０】 キシレンに10分間2回漬けることにより、該組織からパラフィンを除去し、99 ％（2回）、95%、85%、70%、50%、30%の一連のエタノール減少濃度中、ついで蒸
留水（2回）中で再び脱水する。該切片を、0.2M HClで10分間、前処理し、37℃ で15分間、2μg/mlプロテイナーゼKで透過性を上昇させる。
【０２２１】 BS265遺伝子プラスミドから転写された標識リボプローブ（実施例4を参照され
たい）を、その調製された組織切片にハイブリダイズさせ、3×標準食塩水抽出 物および50％ホルムアミド中、56℃で一晩インキュベートする。2×標準クエン 酸食塩水および50％ホルムアミド中で洗浄し、ついで100μg/ml RNアーゼAで37 ℃で30分間消化することにより、過剰なプローブを除去する。蛍光プローブを、
顕微鏡下での紫外（UV）光による照明により可視化する。細胞質中の蛍光は、BS
265 mRNAを示している。別法として、該切片をオートラジオグラフィーで可視化
することができる。
【０２２２】 実施例8：逆転写PCR A．一工程RT-PCRアッセイ 当該技術分野で公知の方法を用いる逆転写PCRにより前記標的配列を検出する ために、標的特異的プライマーを設計する。一工程RT-PCRは、RTおよびPCRの両 方を単一反応混合物中で行なう逐次的方法である。該方法は、50mM（N,N-ビス[2
-ヒドロキシエチル]グリシン）（pH8.15）、81.7mM KOAc、33.33mM KOH、0.01mg
/mlウシ血清アルブミン、0.1mMエチレンジアミン四酢酸、0.02mg/ml NaN3、8%w/
vグリセロール、150μMの各dNTP、0.25μMの各プライマー、5U rTthポリメラー ゼ、3.25mM Mn(OAc)2および5μlの標的RNA（実施例3を参照されたい）を含有す る200μlの反応混合物中で行なう。RNAおよび該rTthポリメラーゼ酵素は、Mn(OA
c)2の存在下では不安定であるため、該Mn(OAc)2は、標的の添加の直前に加える べきである。該反応を、Perkin-Elmer Thermal Cycler480中でインキュベートす
る。当業者であれば、cDNA合成およびサーマルサイクリングのための最適条件を
容易に決定することが可能である。有用であると考えられる条件には、60℃〜70
℃で15〜45分間のcDNA合成、および94℃で1分間、55〜70℃で1分間、72℃で2分 間の30〜45サイクルの増幅が含まれる。また、一工程RT-PCRは、Taqポリメラー ゼと逆転写酵素（例えば、MMLV（Moloney murine leukemia virus）またはAMV(a
vian myeloblastosis virus) RT(reverse transcriptase)酵素）とを使用する二
重酵素法を用いて行なうことができる。
【０２２３】 B．伝統的なRT-PCR 別法として、伝統的な二工程RT-PCを、K.Q. Huら, Virology 181:721-726 (19
91)に記載のとおりに行なった。簡単に説明すると、2.0 μgの抽出されたｍRNA （実施例3を参照されたい）を、1×PCR II緩衝液（Perkin-Elmer）、5mM MgCl2 、1mM dNTP、20U RNasin、2.5μMランダムヘキサマーおよび50U MMLV（モロニー
マウス白血病ウイルス）逆転写酵素（RT）を含有する20μlの反応混合物中で逆 転写した。逆転写は、MJ Research Cycles Model PTC-200中、42℃で60分間、つ
いで95℃で5分間インキュベートして、該RTを不活性化した。PCRは、10mM Tris-
HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、200μM dNTP、0.5μMの各センスおよびアン
チセンスプライマー（それぞれ配列番号14および配列番号15）および2.5UのTaq ポリメラーゼを含有する50μlの最終PCR反応容量中、2μlの該cDNA反応液を使用
して行なった。該反応を、MJ Research Model PTC-200中で以下のとおりにイン キュベートした：35サイクルの増幅（94℃で20秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒
間）、最終伸長（72℃で10分間）および4℃での浸漬。
【０２２４】 C．PCR断片の分析 正しい産物を、SYBER Green I核酸ゲル染色（Molecular Probes，Eugene.OR）
によるゲル電気泳動を用いるサイズの決定により確認した。1.5％アガロースゲ ルを１XTBEで10、000倍希釈したSYBR（商標登録）Green Iで40分間染色し、その 後蒸留水中で20分間脱染色した。ゲルをSTROMTMイメージングシステム（Molecul
ar Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いてイメージ化した。814bpのRNA特異的PCR 増幅産物が正常***サンプル5例中2例、乳癌サンプル7例中5例において観察され
、このことは、BS265mRNAが組織中に存在していたことを示す。 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6、並
びにその断片又は相補体からなる群から選択される配列を含む産生物の検出はBS
265ｍRNAの存在の指標であり、乳癌のような***の疾患又は状態の診断を示唆し
ている。
【０２２５】 実施例9：OH-PCR A．プローブの選択および標識 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションPCRにより前記標的配列を検出す るために、標的特異的プライマーおよびプローブを設計する。1992年6月25日付 け公開の国際公開WO 92/10505および1992年7月9日付け公開のWO 92/11388は、そ
れぞれ5’末端および3’末端でオリゴヌクレオチドを標識するための方法を開示
している。オリゴヌクレオチドを標識するための1つの公知方法によれば、標識 −ホスホルアミジット試薬を調製し、それを使用して、該標識を該オリゴヌクレ
オチドに、その合成中に付加する。例えば、N.T. Thuongら, Tet. Letters 29(4
6):5905-5908 (1988)またはJ.S. Cohenら, 公開されている米国特許出願第07/24
6,688号（NTIS ORDER No. PAT-APPL-7-246,688）(1989)を参照されたい。好まし
くは、プローブを、その3’末端で標識して、PCRへの関与および望ましくない伸
長産物の形成を妨げる。一工程OH-PCRでは、該プローブは、該プライマーのTMよ
り少なくとも15℃低いTMを有するべきである。当該技術分野でよく知られている
標準的なホスホルアミジット化学および／または合成後標識法を用いて、該プラ
イマーおよびプローブを、検出可能な標識を有する又は有さない特異的結合メン
バーとして使用する。
【０２２６】 B．一工程オリゴハイブリダイゼーションPCR 50mM（N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]グリシン）（pH8.15）、81.7mM KOAc、3
3.33mM KOH、0.01mg/mlウシ血清アルブミン、0.1mMエチレンジアミン四酢酸、0.
02mg/ml NaN3、8% w/vグリセロール、150μMの各dNTP、0.25μMの各プライマー 、3.75nMのプローブ、5U rTthポリメラーゼ、3.25mM Mn(OAc)２および標的の血 液等価体5μl（実施例3を参照されたい）を含有する200μlの反応中で、OH-PCR を行なう。RNAおよび該rTthポリメラーゼ酵素は、Mn(OAc)２の存在下では不安定
であるため、該Mn(OAc)２は、標的の添加の直前に加えるべきである。該反応を 、Perkin-Elmer Thermal Cycler480中でインキュベートする。当業者であれば、
cDNA合成およびサーマルサイクリングのための最適条件を容易に決定することが
可能である。有用であると考えられる条件には、cDNA合成（60℃、30分間）、30
〜45サイクルの増幅（94℃で40秒間、55〜70℃で60秒間）、オリゴ−ハイブリダ
イゼーション（97℃で5分間、15℃で5分間、15での浸漬）が含まれる。正しい反
応産物は、該PCR産物の鎖の少なくとも1つと、内部でハイブリダイズしたプロー
ブとを含有する。
【０２２７】 C．OH-PCR産物の分析 増幅反応産物を、LCx（登録商標）分析系（Abbott Laboratories, Abbott Par
k, ILから入手可能）上で検出する。簡単に説明すると、抗体で標識された微粒 子により、該PCR産物鎖上または該ハイブリダイゼーションプローブ上の捕捉可 能部位で、正しい反応産物を捕捉させ、該プローブ上または該PCR鎖上の検出可 能部位に対する検出可能な抗体コンジュゲートの結合により複合体を検出する。
該内部プローブにハイブリダイズしたPCR鎖を含有する複合体だけが、検出可能 である。したがって、この複合体の検出は、BS265 mRNAの存在を示し、乳癌など
の***の疾患または状態の診断を示唆している。
【０２２８】 増幅された又は増幅されていないBS265由来核酸配列の存在を検出するために 当業者が使用および／または修飾しうる多数の他の検出様式が存在し、それらに
は、リガーゼチェーン反応（LCR, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）；Q
βレプリカーゼ（Gene-TrakＴＭ, Naperville, Illinois）、ブランチドチェー ン（branched chain）反応（Chiron, Emeryville, CA）および鎖置換（strand d
isplacement）アッセイ（Becton Dickinson, Research Triangle Park, NC）が 含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２９】 実施例10：合成ペプチドの製造 合成ペプチドを設計し、BS265ポリペプチドコンセンサス配列の推定アミノ酸 配列に基づいて調製した（実施例１参照）。特に、配列番号17のペプチドを含む
配列番号16由来の多くのBS265ペプチド誘導体を調製した。ペプチドは、FMOC化 学、標準的なサイクルおよびin situ HBTU活性化を用いてSymphony Peptide Syn
thesizer（Rainin Instrument Co, Emeryville CA）から入手可能）又はその同 等の機器上で合成する。切断および脱保護の条件は以下のとおりである：2.5ml の容量の切断試薬（77.5% v/vトリフルオロ酢酸、15% v/vエタンジチオール、2.
5% v/v水、5% v/vチオアニソール、1〜2%w/vフェノール）を該樹脂に加え、室温
で2〜4時間攪拌する。該濾液を除去し、該ペプチドを冷ジエチルエーテルで該切
断試薬から沈殿させる。各ペプチドを濾過し、水／アセトニトリル／0.1％TFA勾
配を用いる逆相分取HPLCで精製し、凍結乾燥した。産生物を質量分析により確認
する（実施例１２参照）。
【０２３０】 以下の自動酸化条件で、S-S結合の形成を行った；ペプチドを最小量（約10ml ）のDMSOに溶解した後、緩衝液（0.1 Mtris-HCl, pH6.2）を0.3-0.8mg/mlまで添
加する。反応をS-S結合が完全に形成されるまでHPLCでモニターし、その後水/ア
セトニトリル/0.1％TFAグラジエントで逆相分取HPLCを行い、凍結乾燥する。そ の後、産物を質量分析計において確認する（実施例12参照）。
【０２３１】 該精製ペプチドは、グルタルアルデヒドと共にキーホールリンペットヘモシア
ニン又はその他の免疫活性分子結合させ、アジュバントと混和し、動物に注射す
ることが可能である。
【０２３２】 実施例11a：プラスミド577を使用する、細胞系内でのタンパク質の発現 A．BS265発現プラスミドの構築 1995年6月7日付け出願の米国出願第08/478,073号に記載のプラスミド577は、 永久細胞系内での分泌抗原の発現用に構築されている。このプラスミドは、以下
のDNAセグメントを含有する：（a）細菌性β-ラクタマーゼとDNA複製起点とを含
有するpBR322の2.3kbの断片、（b）HSV-1チミジンキナーゼプロモーターおよび ポリA付加シグナルの制御下でネオマイシン耐性遺伝子の発現を指令する1.8Kbの
カセット、（c）Simian Virus 40（SV-40）プロモーターおよびポリA付加シグナ
ルの制御下でのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現を指令する1.9Kbのカセ ット、（d）SV40 T-Agプロモーターおよび転写エンハンサー、B型肝炎ウイルス 表面抗原（HbsAg）エンハンサーIおよびそれに続くポリA付加シグナルを与える 単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）ゲノムの断片の制御下で、修飾C型肝炎ウイル ス（HCV）E2タンパク質に融合したウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の発 現を指令する3.5Kbのカセット、（e）このプラスミド内で機能しないSV40ゲノム
後期領域の、残りの0.7Kb断片。該ベクターの全セグメントを、分子生物学の当 業者に公知の標準的な方法で合体させた。
【０２３３】 分泌可能なBS265タンパク質の発現のためのプラスミドは、プラスミド577中の
C型肝炎ウイルスE2タンパク質コード配列を、配列番号1、配列番号2、配列番号3
、配列番号4、配列番号5および配列番号6並びにそれらの断片または相補体より なる群から選ばれるBS265ポリヌクレオチド配列で以下のとおりに置換すること により構築する。XbaIでのプラスミド577の消化により、C型肝炎ウイルスE2遺伝
子断片が遊離する。得られたプラスミドバックボーンは、発現されたタンパク質
を該細胞の分泌経路に導くウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の下流のBS26
5 cDNA挿入断片の挿入を可能にする。該BS265 cDNA断片は、標準的な方法を用い
るPCRにより得る。該センスPCRプライマー配列内にコードされているのは、XbaI
部位であり、その直後には、シグナルプロテアーゼのプロセシング、効率的な分
泌および培養流体内の最終産物の安定性を向上させるアミノ酸配列Ser-Asn-Glu-
Leu（「SNEL」）をコードする12ヌクレオチドの配列が続く。該プライマーは、 この12ヌクレオチドの配列の直後に、BS265遺伝子のアミノ酸をコードする鋳型 配列に相補的なヌクレオチドを含有する。該アンチセンスプライマーは、以下の
8アミノ酸をコードする配列を、停止コドンの直前に取込む：Asp-Tyr-Lys-Asp-A
sp-Asp-Asp-Lys（配列番号18）。この配列内に、BS265タンパク質産物の分析お よび精製を容易にするための認識部位が取込まれる。抗FLAG M2（Eastman Kodak
, Co., New Haven, CT）と称される商業的に入手可能なモノクローナル抗体に認
識される認識部位（「FLAG」と称される）ならびに他の適合配列およびその対応
抗体を使用することが可能である。Perkin-Elmer-Cetusから入手されるGeneAmp （登録商標）試薬を供給業者の指示に従い使用して、PCRを行なう。PCRプライマ
ーは、0.5μMの最終濃度で使用する。PCRは、BS265プラスミド鋳型上、100μlの
反応液中、35サイクル（94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で90秒間）、ついで
72℃で10分間の伸長サイクルで行なう。
【０２３４】 B．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞へのトラ ンスフェクション 前記プラスミドをCHO/dhfr細胞（DXB-111, Uriacioら, Pro.Natl.Acad.Sci,US A 77:4451-4466 (1980)）中にトランスフェクトする。これらの細胞は、A.T.C.C
., 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852から受託第CRL 9096号として入
手可能である。トランスフェクションは、P.L. FelgnerらPro.Natl.Acad.Sci,US A 84:7413-7414 , (1987)に記載のカチオニックリポソーム媒介法を用いて行な
う。特に、CHO/dhfr細胞を、10％ウシ胎仔血清、L-グルタミン（1mM）で補足さ れたHam F-12培地内で培養し、フラスコ内に5〜8×105細胞/フラスコの密度で新
たに播く。トランスフェクションのために、60〜80％のコンフルエンシーになる
まで該細胞を増殖させる。20マイクログラム（20μg）のプラスミドDNAを1.5ml のOpti-MEM I培地に加え、100μlのLipofectin Reagent（Gibco-BRL; Grand Isl
and, NY）を、Opti-MEM I培地のもう1つの1.5ml部分に加える。それらの2つの溶
液を混合し、室温で20分間インキュベートする。該培地を該細胞から除いた後、
該細胞を5mlのOpti-MEM I培地で3回リンスする。ついで該Opti-MEM I- Lipofect
in-プラスミドDNA溶液を該細胞上に重層する。該細胞を37℃で3時間インキュベ ートし、ついで該Opti-MEM I- Lipofectin-プラスミドDNA溶液を、選択前に更に
24時間、培地と交換する。
【０２３５】 C．選択および増幅 トランスフェクションの1日後に、細胞を1：3継代し、dhfr/G418選択培地（以
下、「F-12マイナス培地G」と称する）と共にインキュベートする。選択培地は 、L-グルタミンを含有しヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含有しない
Ham F-12（JRH Biosciences, Lenexa, Kansas）ならびに300μg/mlのG418（Gibc
o-BRL; Grand Island, NY）である。培地の容量対表面積比を、5ml/25cm2に維持
する。約2週間後、F-12マイナス培地G内での継代および連続的維持が可能となる
ようにDHFR/G418細胞を増殖させる。
【０２３６】 トランスフェクトしたBS265 cDNA配列のそれぞれの増幅は、メトトレキセート
によるDHFR+、G418+細胞の逐次的選択により行なう（R. Schimke, Cell 37:705-
713 (1984)の総説）。耐性コロニーが出現するまで、150nMメトトレキセート（M
TX）（Sigma, St. Louis, MO）を含有するF-12マイナス培地Gと共に細胞を約2週
間インキュベートする。さらに、遺伝子増幅は、5μM MTXによる150nM適合細胞 の選択により行なう。
【０２３７】 D．抗原の産生 5μM MTXで補足されたF-12マイナス培地Gを、ちょうどコンフルエントの単層 上に5％CO2中37℃で12〜24時間重層する。該増殖培地を除き、該細胞をDulbecco
リン酸緩衝食塩水（PBS）（カルシウムおよびマグネシウム）（Gibco-BRL、Glan
d Island, NY）で3回リンスして、存在しうる残りの培地／血清を除く。ついで 細胞を、VAS特注（custom）培地（HEPESと共にL-グルタミンを含有しフェノール
レッドを含有しないVAS特注製剤、JRH Bioscience; Lenexa KSから入手可能、製
品番号52-08678P）と共に、5％CO２中37℃で1時間インキュベートする。ついで 細胞を、5ml/Tフラスコで製造するためにVASで覆う。7日間のインキュベーショ ンの後、培地を除去し、維持し、ついで収穫2、3および4と共に精製するまで凍 結する。3回の7日間の収穫のために、該単層をVASで覆う。
【０２３８】 E．***組織遺伝子BS265抗原の発現の分析 BS265タンパク質構築物を発現する細胞からのVAS上清のアリコートを、標準的
な方法および当該技術分野で公知の試薬（Laemmli不連続 discontiuous gels） を用いるSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、または質量 分析により分析する。
【０２３９】 F．精製 ヒドラジン結合でアガロースに共有結合している抗FLAG M2モノクローナル抗 体を含むアフィニティーマトリックス（Eastman Kodak Co., New Haven, CT）を
使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、FLAG配列を含有する
BS265タンパク質の精製を行なう。アフィニティー精製の前に、ローラーボトル からのプール化VAS培地収穫物中のタンパク質を、Sephadex G-25（Pharmacia Bi
otech Inc., Uppsala, Sweden）カラムを使用して50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM
NaCl緩衝液中に交換する。この緩衝液中のタンパク質を、抗FLAG M2抗体アフィ
ニティーカラムに適用する。該カラムを50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl緩衝
液で洗浄することにより、未結合タンパク質を溶出する。50mM Tris-HCl(pH7.5)
、150mM NaCl中の過剰のFLAGペプチドを使用して、結合タンパク質を溶出する。
その過剰のFLAGペプチドは、ゲル電気泳動またはHPLCにより該精製BS265タンパ ク質から除去することができる。
【０２４０】 この実施例ではプラスミド577を使用しているが、それに匹敵する他の発現系 （例えば、CMV）を、試薬および／または技術に適当な改変を加えて本発明で使 用することが可能であることが当業者に公知であり、当業者の技量の範囲内に含
まれる。
【０２４１】 BS265遺伝子のコード領域を含有する最大のクローン化挿入断片を、（i）例え
ばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよび／またはタンパク質融合可 能配列（タンパク質の発現および検出を助けるもの）を含有しうる真核発現ベク
ター、または（ii）スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびCMP-KDOシンタ
ーゼ（CKS）または他のタンパク質融合遺伝子（該タンパク質配列の発現のため のもの）を含有する細菌性発現ベクター中にサブクローニングする。SODの融合 配列を含有するポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは、1986年10月
1日付け公開のEPO 0196056に記載されており、CKSの融合配列を含有するものは 、1989年9月13日付け公開のEPO公開第0331961号に記載されている。このように して精製したタンパク質は、動物の免疫研究、固相イムノアッセイなどを含む種
々の技術において使用することができる。
【０２４２】 実施例11b：pcDNA3.1/Myc-Hisを使用する、細胞系内でのタンパク質の発現 A．BS265発現プラスミドの構築 プラスミドpcDNA3.1/Myc-His（Cat.# V855-20, Invitrogen, Carlsbad.CA）は
、ほとんどの哺乳動物細胞系による分泌抗原の発現用に構築されている。発現さ
れるタンパク質挿入断片は、myc-hisペプチドタグと融合している。該myc-hisタ
グ（配列番号19）は、抗mycもしくは抗hisアフィニティーカラムまたは金属タン
パク質結合カラムを使用することによる発現融合タンパク質の精製に有用なmyc 癌遺伝子エピトープおよびポリヒスチジン配列を含む。
【０２４３】 分泌可能なBS265タンパク質の発現用のプラスミドは、配列番号1、配列番号2 、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6並びにそれらの断片または
相補体よりなる群から選ばれるBS265ポリペプチド配列をpcDNA3.1/Myc-Hisベク ター中に挿入することにより構築した（このベクターをpc717188-M/Hと呼ぶ）。
BS265発現プラスミドを構築する前に、まず該BS265 cDNA配列を以下のようにpCR
（登録商標）-Bluntベクター中にクローニングする。 BS265 cDNA断片は、PCRを用いる標準的手法により産生される。例えば、PCRは 、Stratagene,Inc.(La Jolla, CA)から入手可能な試薬を供給業者の指示に従い 使用して行なう。PCRプライマーは、0.5μMの最終濃度で使用した。5Uのpfuポリ
メラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）を使用するPCRを、BS265プラスミド鋳型
（実施例2）上、50μlの反応液中、30サイクル（94℃で1分間、65℃で1.5分間、
72℃で3分間）の後、72℃で8分間伸張サイクルを行なった。該センスPCRプライ マー配列は、BS265遺伝子挿入の直ぐ上流のpINCYベクターと相同であるヌクレオ
チド若しくは５’EcoRI制限部位を組込んだヌクレオチド、隣接下流タンパク質 転写コンセンサス阻害体およびBS265cDNA挿入の最も５’側の終末と同じ方向で ある３’核酸配列を含む。アンチセンスPCRプライマーは、5’NotI制限配列と、
最も3’側のインフレーム停止コドンの直接上流のBS265 cDNA挿入の3’末端に相
補的な配列とを取込む。得られた平滑末端化PCR産物の5マイクロリットル（5μl
）を、25ngの線状化pCR-Bluntベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に連結 して、該ベクターの致死ccdB遺伝子を遮断する。One ShotTM形質転換キット（In
vitrogen, Carlsbad, CA）を製造業者の指示に従い使用して、得られた連結ベク
ターをTOP10大腸菌細胞（E. coli）（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に形質転換
する。該形質転換細胞を、LB-Kan（50μg/mlカナマイシン）選択プレート上、37
℃で増殖させる。遮断されたccdB遺伝子を有するプラスミドを含有する細胞だけ
が、形質転換後に増殖する（Grant, Pro.Natl.Acad.Sci,USA 87:4645-4649 (19
90)）。形質転換されたコロニーを拾い、3mlのLB-Kanブロス中、37℃で増殖させ
る。QIAprep（登録商標）（Qiagen Inc., Santa Clarita, CA）方法を製造業者 の指示に従い使用して、プラスミドDNAを単離した。該DNAをEcoRIおよびNotI制 限酵素で消化して、BS265挿入断片を遊離させる。該断片を1%Seakem（登録商標 ）LEアガロース/0.5μg/ml臭化エチジウム/TEゲル上で電気泳動し、UV照明によ り可視化し、QIAquickＴＭ法（Qiagen Inc, Santa Clarita, CA）を供給業者の 指示に従い使用して切り出し精製する。
【０２４４】 pcDNA3.1/Myc-HisプラスミドDNAを、プラスミドDNAのポリリンカー領域中に存
在するEcoRI若しくはSnaBIおよびNotIで消化し直鎖状化する。生成したプラスミ
ドDNAバックボーンによって、上記BS265精製cDNA断片を哺乳類細胞中の蛋白質の
発現を調節しているCMVプロモーターの下流に挿入することが可能になる。ライ ゲーションされたプラスミドを製造業者の指示に従いDH5アルファTM細胞（Gibco
-BRL Gland Island, NY）に形質転換する。簡単に説明すると、BS265挿入断片を
含有する10ngのpcDNA3.1/Myc-Hisを、50μlのコンピテントDH5アルファ細胞に加
え、該含有物を穏やかに混合した。該混合物を氷上で30分間インキュベートし、
37℃で20秒間、それに熱ショックを与え、それを氷上に更に2分間放置する。0.9
5mlのLB培地を加えたら、225rpmで振とうしながら該混合物を37℃で1時間インキ
ュベートする。ついで該形質転換細胞を100mm LB/Amp（50μg/ml アンピシリン
）プレート上にプレーティングし、37℃で増殖させる。コロニーを拾い、3mlのL
B/アンピシリンブロス中で増殖させる。QIAprepキットを使用して、プラスミドD
NAを精製した。該挿入断片の存在は、制限酵素消化およびゲル分析を含むがこれ
に限定されない当業者に知られた技術を用いて確認する（J.Sambrook et al.,上
掲）。
【０２４５】 B．ヒト胎児腎細胞293細胞のトランスフェクション 前掲のセクションAに記載のBS265発現プラスミドを、DH5アルファ細胞中にト ランスフェクトし、LB/アンピシリンアガー上にのせ、上述のとおりLB/アンピシ
リンブロス10 ml中において培養する。QIAフィルターＴＭMaxi キット（Quiagen
, Chatsworth, CA）を用いて精製したプラスミドをHEK293細胞（F.L. Grahamら,
J. Gen. Vir. 36:59-72 (1977)）中にトランスフェクトする。これらの細胞は 、A.T.C.C., 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852から、受託番号CRL 1
573として入手可能である。トランスフェクションの手順は、P. Hawley-Nelson ら, Focus 15:73 (1993)に記載されている。特に、HEK293細胞を、10％ウシ胎仔
血清（FBS）、L-グルタミン（2mM）で補足された10ml DMEM培地内で培養し、100
mm培養プレート内に6．5×106細胞/プレートの密度で新たに播く。トランスフェ
クションのために、70〜80％のコンフルエンシーになるまで該細胞を37℃で増殖
させる。8マイクログラム（8μg）のプラスミドDNAを800 μlのOpti-MEM I（登 録商標）培地（Gibco-BRL; Grand Island, NY）に加え、48〜96 μlのLipofecta
mineＴＭ Reagent（Gibco-BRL; Grand Island, NY）を、Opti-MEM I（登録商標 ）培地のも う1つの800μl部分に加える。それらの2つの溶液を混合し、室温で15〜30分間イ
ンキュベートする。該培地を該細胞から除いた後、該細胞を10mlの無血清DMEM培
地で1回洗浄する。ついで該Opti-MEM I-Lipofectamine-プラスミドDNA溶液を、6
.4mlの無血清DMEM中に希釈し、該細胞上に重層する。該細胞を37℃で5時間イン キュベートし、ついで20％FBSを含有する追加的な8mlのDMEMを加える。18〜24時
間後、その古い培地を吸引し、該細胞に、5％FBSを含有する5mlの新鮮なDMEMを 重層する。トランスフェクションの72時間後に、上清および細胞抽出物を、BS26
5遺伝子活性に関して分析する。
【０２４６】 C．***組織遺伝子BS265抗原の発現の分析 前記培養上清を、低温チューブ（cryotube）に移し、氷上で保存する。HEK293
細胞を、10mlの冷Dulbecco PBSで2回洗浄し1.5mlのCAT溶解緩衝液（Boehringer
Mannhein, Indianapolis, IN）を加えて溶解することにより収穫し、ついで室温
で30分間インキュベートする。ライセートを1.7mlポリプロピレンミクロ遠心管 に移し、1000×gで10分間遠心する。該上清を新たな低温チューブに移し、氷上 で保存した。上清を別の低温チューブに移し、氷上に保存した。細胞からの上清
及びBS265蛋白質構築物を発現している細胞からの溶解液のアリコートは、BS265
組換蛋白質の存在に関して分析する。当該技術分野で公知の標準的な方法および
試薬（J. Sambrookら, 前掲を参照されたい）を用いて、該アリコートをSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）において泳動する。これらのゲルはそ
の後ニトロセルロース、ニトランその他の固形媒体上にブロッティングし、抗my
cエピトープ又は抗ヒスチジンモノクローナル抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA ）又は抗BS265ポリクローナル血清（実施例14参照）を用い、ウエスタンブロッ ティング技術によってBS265タンパク質を可視化することができる。あるいは、 発現した組換えBS265タンパク質を質量分析計により分析することが可能である （実施例１２参照）。
【０２４７】 D．精製 ポリヒスチジン残基に特異的に結合するニッケル充填アガロース樹脂を含有す
るXpressアフィニティークロマトグラフィー系（Invitrogen Carlsbad, CA）を 使用して、myc-his配列を含有するBS265組換えタンパク質の精製を行なう。前記
のとおりに調製した、10×100mmプレートからの上清を、プールし、該ニッケル 充填カラムに通した。該カラムを50mM Tris-HCl(pH7.5)150mM NaCl緩衝液で洗浄
することにより、非結合タンパク質を溶出すると、myc-his融合タンパク質だけ が残る。ついで、過剰のイミダゾールもしくはヒスチジンまたは低pH緩衝液を使
用して、結合BS265組換えタンパク質を該カラムから溶出する。別法として、ヒ ドラジンまたは他の結合によりアガロース樹脂に結合した抗mycまたは抗ヒスチ ジンモノクローナル抗体よりなるアフィニティーカラムにmyc-his配列にて結合 させ、それぞれ過剰のmycペプチドまたはヒスチジンで溶出することにより、該 組換えタンパク質を精製することも可能である。
【０２４８】 ついで該精製組換えタンパク質を、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化セファ
ロースカラム（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）などの固相に供給業者の 指示に従い共有的に架橋することができる。ついで、共有結合したBS265組換え タンパク質を含有するこれらのカラムを使用して、ウサギまたはマウス血清から
抗BS265抗体を精製することができる（実施例13および14を参照されたい）。
【０２４９】 E．BS265発現タンパク質によるマイクロタイタープレートのコーティング 前記100mmプレートからの上清を、適当な量のPBS中に希釈する。その後、得ら
れた混合物の100μlを、Reaci-BindTM金属キレートマイクロタイタープレート（
Pierce, Rockford, IL）の各ウェル中に配置し、振とうしながら室温でインキュ
ベートし、ついで0．05％Tween（登録商標）20を含むPBS 200μlで3回洗浄する 。ついで、その調製されたマイクロタイタープレートを使用して、BS265抗体の 存在に関してポリクローナル抗血清をスクリーニングすることができる（実施例
17を参照されたい）。
【０２５０】 この実施例ではpcDNA3.1/Myc-Hisを使用しているが、それに匹敵する他の発現
系（例えば、CMV）を、試薬および／または技術に適当な改変を加えて本発明で 使用することが可能であることが当業者に公知であり、当業者の技量の範囲内に
含まれる。該BS265遺伝子のコード領域を含有する最大のクローン化挿入断片を 、（i）例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよび／またはタンパ
ク質融合可能配列（タンパク質の発現および検出を助けるもの）を含有しうる真
核発現ベクター、または（ii）スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびCMP
-KDOシンターゼ（CKS）または他のタンパク質融合遺伝子（該タンパク質配列の 発現のためのもの）を含有する細菌性発現ベクター中にサブクローニングする。
SODの融合配列を含有するポリペプチドの製造に有用な方法およびベクターは、1
986年10月1日付け公開の欧州特許出願EP 0 196 056に記載されており、CKSの融 合配列を含有するベクターは、1989年9月13日付け公開の欧州特許出願EP0 331 9
61号に記載されている。該精製タンパク質は、動物の免疫研究、固相イムノアッ
セイなどを含む種々の技術において使用することができる。
【０２５１】 実施例12：***組織タンパク質の化学的分析 A．MSによるトリプシンペプチド断片の分析 乳癌などの***疾患を有する患者からの血清、***疾患を有さない患者からの
血清、乳癌などの***疾患を有する患者からの***組織または細胞の抽出物、乳
房疾患を有さない患者からの***組織または細胞の抽出物、および患者の他の非
疾患または疾患器官からの組織または細胞の抽出物を、標準的な方法を用いてポ
リアクリルアミドゲル上で移動させ、クーマシーブルーで染色する。該未知ポリ
ペプチドを含有する疑いのあるゲルの切片を切り出し、ゲル内還元、アセトアミ
ド化およびトリプシン消化に付す（P. Jenoら, Anal. Bio. 224:451-455 (1995)
およびJ. Rosenfeldら, Anal. Bio. 203:173 (1992)）。該ゲル切片を100mM NH4 HCO３およびアセトニトリルで洗浄する。収縮したゲル片を、消化緩衝液（50mM
NH４HCO３、5mM CaCl２および12.5μg/mlトリプシン）中、4℃で45分間膨潤させ
る。該上清を吸引し、トリプシンを含有しない5〜10μlの消化緩衝液と置換し、
37℃で一晩インキュベートする。ペプチドを、5％ギ酸およびアセトニトリルの3
回の交換により抽出し、蒸発乾固させる。該ペプチドを、延伸したガスクロマト
グラフィー毛管の先端に捕捉された約0.1μlのPOROS R2吸着剤（Perseptive Bio
systems, Framingham, Massachusetts）に、それらを10μlの5％ギ酸に溶解しそ
れを該毛管に通すことにより吸着させる。吸着したペプチドを水洗し、60％エタ
ノール中の5％ギ酸で溶出する。ナノエレクトロスプレー質量分析による分析の ために、該溶出液をAPI III質量分析計（Perkin-Elmer Sciex, Thornhill, Onta
rio, Canada）の噴霧毛管中に直接通過さる（M. Wilmら, Int. J. Mass Spectro m. Ion Process 136:167-180 (1994)およびM. Wilmら, Anal. Chem. 66:1-8 (19
94)）。該トリプシンペプチドの質量を、第1四極子から得た質量スペクトルから
測定する。さらに、予想されるペプチドに対応する質量をMS/MSモードで分析し て、該ペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。
【０２５２】 B．LC/MSによるペプチド断片の分析 増殖性疾患組織中で見出されたmRNA配列から推定されるポリペプチドの存在を
、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（LC/MS/MS）で確認することが
できる（D. Hessら, METHODS. A Companion to Methods in Enzymology 6:227-2
38 (1994)）。該患者からの血清試料または腫瘍抽出物をSDSで変性させ、ジチオ
トレイトール（1.5mg/ml）で90℃で30分間還元し、ついでヨードアセトアミド（
4mg/ml）で25℃で15分間アルキル化する。アクリルアミド電気泳動の後、該ポリ
ペプチドをカチオンメンブレン上にエレクトロブロットし、クーマシーブルーで
染色する。染色後、該メンブレンを洗浄し、該未知ポリペプチドを含有すると考
えられる切片を切断し、小片に切断する。該メンブレンを500μlミクロ遠心管中
に配置し、10〜20μlのタンパク質分解消化緩衝液（0.1M NaCl、10%、2mM CaCl2 および5μg/mlトリプシンを含有する100mM Tris-HCl、pH8.2）（Sigma, St. Lou
is, MO）に漬ける。37℃で15時間後、3μlの飽和尿素および1μlの100μg/mlト リプシンを加え、さらに37℃で5時間インキュベートする。該消化混合物を3μl の10％トリフルオロ酢酸で酸性化し、遠心して、上清をメンブレンから分離する
。該上清をミクロボア逆相HPLCカラム上に直接注入し、0.05％トリフルオロ酢酸
中のアセトニトリルの直線勾配で溶出する。該溶出液を、物質の容量を調節する
ために必要に応じて流動スプリッターに通した後、エレクトロスプレー質量分析
計に送り込む。実施例12第A節に記載の方法に従い、データを分析する。
【０２５３】 実施例13：遺伝子免疫プロトコール A．インビボでの抗原の発現 遺伝子免疫（gene immunization）は、適当な発現ベクターの接種後に抗原を インビボで直接発現させることにより、タンパク質の精製工程を不要にする。ま
た、この方法による抗原の産生は、正しいタンパク質フォールディングおよびグ
リコシル化を可能にしうる。なぜなら、該タンパク質は、哺乳動物組織内で産生
されるからである。該方法では、CMVプロモーターを含有するプラスミド内への 該遺伝子配列の挿入、該プラスミドの増殖および精製、ならびに動物の筋肉組織
内への該プラスミドDNAの注入を行なう。好ましい動物には、マウスおよびウサ ギが含まれる。例えば、H. Davisら, Human Molecular Genetics 2:1847-1851 (
1993)を参照されたい。1回または2回のブースター免疫の後、該動物を出血させ 、腹水液を集めたり、あるいはハイブリドーマの産生のために該動物の脾臓を採
集することができる。
【０２５４】 B．プラスミドの調製および精製 BS265cDNA配列は実施例１１に記載した手順に従い、好適な５つの制限部位を 含む、適当なPCRプライマーを使用して、BS265cDNA含有ベクターからBS265cDNA を合成した。PCR産物は適当な制限酵素により切断し、CMVプロモーターを含むベ
クター（例えば、Invitrogen.SanDiego.CAから入手されるpRc/CMV又はpcDNA3ベ クター）に挿入する。その後、このプラスミドを適当な菌種中で増殖し、CsClグ
ラジエント又はQiagenプラスミドDNA精製カラムを用いて、細胞溶解液から精製 する。これらのすべての技術は、分子生物学の当業者に良く知られているもので
ある。
【０２５５】 C．免疫プロトコール 麻酔した動物を、PBSまたは他のDNA取込み増強剤（Cardiotoxin、25%ショ糖）
中に希釈された0.1〜100μgの該精製プラスミドで筋肉内にて免疫する。例えば 、H. Davisら, Human Gene Therapy 4:733-740 (1993)およびP. W. Wolffら, Bi otechniques 11:474-485 (1991)を参照されたい。1回または2回のブースター注 射を、1ヵ月間隔で行なう。
【０２５６】 D．抗血清の試験および使用 動物を出血させ、得られた血清を、当該技術分野で公知の技術（例えば、ウエ
スタンブロット法またはEIA技術）により公知遺伝子配列（実施例16参照）から 合成されたペプチドを使用して抗体に関して試験する。ついで、この方法により
産生した抗血清を使用して、実施例15〜18に記載したように、患者の組織もしく
は細胞抽出物中または患者の血清中の抗原の存在をELISAまたはウエスタンブロ ット法で検出することができる。実施例14：BS265に対する抗体の製造 A．ポリクロナール抗血清の製造 BS265コンセンサス配列（配列番号６）の推定アミノ酸配列のペプチド由来の 配列を有するペプチドを適当な動物に注射することにより、BS265に対する抗血 清を調製する。ペプチド、例えば配列番号17の合成、が実施例10に記載されてい
る。免疫原として使用されるペプチドは、以下に記載の通りに調製したキーホー
ルリンペットヘモシアニン（KLH）などのキャリアーと複合体化することが可能 であり、また、非複合体（即ち、KLHなどのキャリアーに結合していない）であ ることも可能である。
【０２５７】 １．ペプチドの結合 ペプチドを、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（KLH、Imj
ect（登録商標）としてPierce Chemical Company, Rockford, ILより商業的に 入手可能）と結合させる。Imject(商標登録)は、ヘモシアニン1分子あたり約260
分子の活性化マレイミドを含有する。活性化KLHを、リン酸緩衝生理的食塩液（P
BS、ｐH8.4）に約7.7 mg/ml の濃度で溶解させる。ペプチドは、ペプチド配列中
にあるシステイン又は結合する点を付加するために予め合成ペプチドに加えたシ
ステインを介してペプチドは結合する。ペプチドをジメチルスホキシド（DMSO、
Sigma Chemical Company, St.Louis, MO）に溶解し、KLHに結合している活性化 マレイミドの1分子あたり、約1.5分子の分子比率で、活性化KLHと反応させる。 ペプチド（配列番号17）の結合手順を以下に記載する。ペプチド結合の最適化の
ためにこの手順における量、時間および条件は変更可能であることは、当業者に
は周知のことである。
【０２５８】 以下に記載する結合反応は、約0.77μモルの活性化マレイミド基を含む３mgの
KLHペプチド複合体（複合体化ペプチド）を得ることを基準としている。このペ プチド複合体の量は、一般にポリクローナル抗血清を得るために、ウサギ1羽に1
回の初回注射および4回の追加注射をおこなうのに適した量である。簡単に説明 すると、ペプチド（配列番号17）を1.16 μモル／100μlの濃度でDMSOに溶解す る。100μlのDMSO溶液を上記調製済みの活性化KLH溶液380μlに添加し、PBS（pH
8.4） 20 μlを加えて500μlにする。反応溶液を攪拌しながら一晩室温で放置す
る。反応程度は、反応混合液中の未反応チオールの量を定量することによって判
断する。反応開始時のチオールの濃度と最終濃度の差を、活性化KLHに結合した ペプチドの濃度とみなす。チオールの残留量をEllman試薬（5,5’-ジチオビス（
２-ニトロ安息香酸）Pierce Chemical Vompany, Rockford,IL）を用いて測定す る。35mgのシステインHCL（Pierce Chemical Company, Rockford, IL）を10 ml
のPBS（pH 7.2）に溶解し、保存溶液を希釈することによって、0、0.1、0.5、2 、5および20 mMの濃度の標準システイン溶液を調製する。Immulon2（登録商標）
マイクロウェルプレート（Dynex Technologies, Chantilly, VA）の各ウェルに2
00μｌのPBS（pH 8.4）中を入れ、チオールの濃度の測光計測を行う。次に、標 準液又は反応混合液10μlを各ウェルに添加する。最後に、PBS（pH8.4）中1 mg/
ml の濃度のEllman試薬20μlを各ウェルに添加する。ウェルを室温で10分間放置
し、415 nmにおける全ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（BioRad Mod
el3550, BioRad, Richmond, CA等）で測定する。標準液の吸光度を基に標準曲線
を作成し、反応混合液中のチオール濃度を該標準曲線から算定する。PBS（pH7.2
）に対して室温で6時間透析することにより、未反応ペプチドを除去する。複合 体は、直ちに使用する場合には２〜８℃で保存し、それ以外の場合には-20℃以 下で保存する。
【０２５９】 ２．動物の免疫 動物の免疫には、ポリクローナル抗血清を産生するために、体重２kg以上の雌性
白色ニュージーランド種のウサギを使用する。一般にはウサギ１羽当り非複合体
化ペプチドまたは上記調製法による複合体化ペプチドの１種類で免疫する。最初
の免疫の1週間前に、非免疫採血前サンプルとして保存するために、動物から5〜
10mlの血液サンプルを採取する。
【０２６０】 非複合体化又は複合体化ペプチドを、フロイントの完全アジュバント（CFA） （Difco,Detroit，MI）0.5mlを含むPBS（pH7.2）中に2mg/mlの濃度のペプチド0.
5mlを乳化させることにより1次免疫原を調製した。免疫原を皮下、腹腔内および
／又は筋肉内投与経路により数ヶ所に分けて動物に注射した。１次免疫の4週間 後に追加免疫を行った。ペプチドを0.5mlのフロイントの不完全アジュバント（I
FA）（Difco,Detroit，MI）0.5mlにより1mg/mlに希釈する点を除き、１次免疫原
に使用したのと同じ非複合体化又は複合体化ペプチド0.5mlを乳化することによ り、追加免疫投与に使用する免疫原を調製する。再度、皮下、腹腔内及び筋肉内
投与経路により、追加免疫投与を数ヶ所に行う。追加免疫の2週間後に動物から5
mlの採血を行い、各血清のペプチドに対する免疫反応性を後述するように試験す
る。十分な力価が得られるまで4週間隔で追加免疫及び採血のスケジュールを繰 り返す。後述する実施例17に記載するマイクロタイターEIAにおいて非複合体化 ペプチドを使用することにより、血清の力価又は濃度を測定する。1：500以上の
抗体力価を以降の使用及び試験に十分な力価と判断する。
【０２６１】 B.モノクローナル抗体の作製 Ｉ. 免疫プロトコル 上述のように調製した免疫原を用いてマウスを免疫する。ここで、マウスにおい
てモノクローナル抗体を産生するための複合体化又は非複合体化ペプチドが、ウ
サギにおいてポリクローナル抗血清を産生するために使用した量の1/10のである
点を除いて同じ方法で免疫する。従って、一次免疫原は、0.1mlのCFAエマルショ
ン中の100μgの非共役または共役ペプチドよりなり、一方、ブースター免疫に使
用する免疫原は、0.1mlのIFA中の50μgの非共役または共役ペプチドよりなる。 標準的な技術を用いて、モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを調製し、
スクリーニングする。モノクローナル抗体産生に用いた方法は、KohlerおよびMi
lstein, Nature 256:494 (1975)に詳細に記載されており総説としてJ.G.R. Hurr
el編, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC
Press, Inc, Boca Raton, FL (1982)に記載されている当該技術分野で公知の手 順に従った。KohlerおよびMilsteinの方法に基づくモノクローナル抗体産生のた
めの他の方法は、L.T. Mimmsらの方法である（Virology 176:604-619 (1990)） 。
【０２６２】 免疫方式（マウス1匹当たり）は、追加的ブースター免疫を伴う一次免疫より なる。一次免疫に使用する一次免疫原は、50μlのCFA中に予め乳化されている50
μlのPBS（pH7.2）中の100μgの非共役または共役ペプチドよりなる。一次免疫 の約2週間および4週間後に行なうブースター免疫は、50μlのIFAで乳化されてい
る50μlのPBS（pH7.2）中の50μgの非共役または共役ペプチドよりなる。合計10
0μlのこの免疫原を各マウスの腹腔内および皮下に接種する。三次免疫の4週間 後に、実施例17に記載のマイクロタイタープレート酵素イムノアッセイ（EIA） により、免疫応答に関して個々のマウスをスクリーニングする。三次免疫の約15
週間後に、PBS（pH7.2）中の50μgの非共役または共役ペプチドをマウスの静脈 内、脾臓内または腹腔内に接種する。
【０２６３】 この静脈内ブースト（追加抗原刺激）の3日後に、脾細胞を、ポリエチレング リコール（PEG）法により例えばSp2/0-Ag14骨髄腫細胞（Milstein Laboratories
, England）と融合させる。該融合体を、10％ウシ胎仔血清（FCS）と1％ヒポキ サンチン、アミノプテリンおよびチミジン（HAT）とを含有するIscove’s Modif
ied Dulbecco’s Medium（IMDM）中で培養する。実施例17のプロトコールに従い
マイクロタイタープレートEIAにより、バルク培養をスクリーニングする。免疫 原として使用したペプチドには反応性であり他のペプチド（すなわち、免疫原と
して使用していないBS265のペプチド）には無反応性であるクローンを、最終増 殖のために選択する。このようにして選択したクローンを増殖させ、等分割し、
10％FCSおよび10％ジメチルスルホキシドを含有するIMDM中で凍結させる。
【０２６４】 2．モノクローナル抗体を含有する腹水液の製造 前記のとおりに調製した凍結ハイブリドーマ細胞を融解し、増殖培養内に配置
する。生存可能なハイブリドーマ細胞を、Pristane処理マウスの腹腔内に接種す
る。腹水液を該マウスから取り出し、プールし、0.2μフィルターで濾過し、免 疫グロブリンクラスG（IgG）分析に付して、該精製に必要なプロテインAカラム の容量を測定する。
【０２６５】 3．腹水液からのモノクローナル抗体の精製 簡単に説明すると、濾過し融解した腹水液を等容量のプロテインAセファロー ス結合緩衝液（1.5Mグリシン、3.0M NaCl、pH8.9）と混合し、0.2μフィルター で再濾過する。プロテインAカラムの容量を、腹水液中に存在するIgGの量から求
める。ついで該溶出液を、2〜8℃で一晩、PBS（pH7.2）に対して透析する。透析
されたモノクローナル抗体を滅菌濾過し、アリコートに分注する。該精製モノク
ローナル抗体の免疫反応性は、免疫原として使用するペプチドにそれが特異的に
結合する能力を実施例17のEIAマイクロタイタープレートアッセイ法で測定する ことにより確認する。該精製モノクローナル抗体の特異性は、それが無関係なペ
プチド（例えば、免疫原として使用していないBS265のペプチド）に結合しない ことを判定することにより確認する。このようにして調製し特徴づけた精製抗BS
265モノクローナルは、短期保存には2〜8℃、長期保存には−80℃で放置する。
【０２６６】 4．モノクローナル抗体の更なる特徴づけ 前記のとおりに製造したモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブタイプ
は、商業的に入手可能なキット（Amersham. Inc., Arlington Heights, ILから 入手可能）を用いて決定することができる。また、安定性試験は、該モノクロー
ナル抗体のアリコートを2〜8℃で連続保存し、ある期間の経過全体にわたって光
学密度（OD）をアッセイすることにより、該モノクローナル抗体上で行なうこと
ができる。
【０２６７】 C．免疫原としての組換えタンパク質の使用 本明細書に記載のとおりに製造した組換えタンパク質を、当業者に公知の試薬
および技術に付随的変更を加えて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の
製造における免疫原として使用することは、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６８】 実施例15：BS265ペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製 前記実施例13及び/又は14に記載のとおりに得た免疫血清を、実施例10に記載 のとおりに調製した固定化合成ペプチドまたは実施例11に記載のとおりに調製し
た組換えタンパク質を使用してアフィニティー精製する。希釈された該粗製抗血
清をプロテインAカラム（Affi-Gel protein A, Bio-Rad, Hercules, CA）に通過
させることにより、該抗血清のIgG画分を得る。緩衝液（該製造業者により供給 された結合緩衝液）での溶出により、免疫グロブリン以外の実質的にすべてのタ
ンパク質が除去される。0.1M緩衝化グリシン（pH3）での溶出により、アルブミ ンおよび他の血清タンパク質を実質的に含まない免疫グロブリン調製物が得られ
る。
【０２６９】 特異的抗原結合性抗体のより高い画分を有する調製物を得るために、免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーを行なう。該抗血清を産生させるために使用した
ペプチドを、クロマトグラフィー樹脂上に固定化し、そのエピトープに対する特
異的抗体を該樹脂に吸着させる。非結合成分を洗い落とした後、該特異的抗体を
0.1Mグリシン緩衝液（pH2.3）で溶出する。抗体画分を1.0M Tris緩衝液（pH8.0 ）で直ちに中和して、免疫反応性を維持する。選択するクロマトグラフィー樹脂
は、該ぺプチド中に存在する反応性基に左右される。該ペプチドがアミノ基を有
する場合には、Affi-Gel 10またはAffi-Gel 15（Bio-Rad, Hercules, CA）など の樹脂を使用する。該ペプチド上のカルボキシ基を介して結合させたい場合には
、Affe-Gel 102（Bio-Rad, Hercules, CA）を使用することができる。該ペプチ ドが遊離スルフヒドリル基を有する場合には、Affi-Gel 501などの有機水銀化合
物樹脂が使用できる（Bio−Rad，Hercules,CA）。
【０２７０】 別法として、脾臓を採取し、当該技術分野で公知の通常の前記方法に従いモノ
クローナル抗体を製造するためのハイブリドーマの製造に使用することができる
。
【０２７１】 実施例16：組織サンプルのウエスタンブロッティング 組織サンプルを0.1Mtris-HCl(pH7.5)、15％（w/v）グリセロール、0.2ｍMEDTA
、1.0ｍM1.4-ジチオスレイトール、10μg/mlロイペプチン及び1.0mMフェニルメ チルスルフォニルフルオライド（S.R.Kainら.,Biotechniques17:982(1994)）中 においてホモジナイズするすることによりタンパク抽出液を調製する。ホモジナ
イズした後、ホモジネートを4℃で5分間遠心分離し、破砕物と上清を分離する。
上述の緩衝液に更に0.1Mトリシン及び0.1％SDSを加えた緩衝液で、破砕物を再度
ホモジナイズする。2度目の抽出から得られた上清をウエスタンブロッティング に使用する。蛋白定量のために、上清の2〜5μlに1.5mlのクマシー蛋白質試薬（
Pierce.Rockford.IL）を加え、595nmの吸光度を測定する。
【０２７２】 SDS-PAGEのために、トリシン緩衝液（Novex.SanDiego.CA）でサンプルを希釈 し所望の蛋白質濃度とし、等量の２×トリシンサンプル緩衝液（Novex.SanDiego
.CA）と混和し、保温サイクラー中で100℃にて5分間加熱する。その後、サンプ ルを電気泳動用Novax10〜20％PrecastTricineGelにアプライする。電気泳動終了
後、サンプルをゲルからNovexTris-GlycineTransfer緩衝液に浸したニトロセル ロースメンブレンにトレンスファーする。その後、メンブレンを特異的抗ペプチ
ド抗体でプロービングし、Western Lights 又はWestern Lights Plus(Tropix. B
edford. MA)化学ルミニセンス検出キット中に提供される試薬及び手順を使用す る。現像するメンブレンをHyperfilm ECL (Amersham.ArlingtonHeights.IL)に感
光させることにより化学ルミネセンスのバンドを可視化する。
【０２７３】 以下の点を除いては、上記と同様の方法で比較試験を行う：ニトロセルロース
フィルターにかける前に、１次抗体（抗ペプチドポリクローナル抗体）に様々な
濃度のペプチド免疫原を加えて、室温で予め30分間保温する。ウエスタンブロッ
ティングの手順は上記と同様に実施する。
【０２７４】 フィルム上でバンドの可視化を行った後、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホ
スフェート（BCIP）等のクロモゲン基質を加え、発色させることによっても直接
メンブレン上で可視化することができる。このクロモゲン溶液は、100ｍM NaCl,
5 mM MgCl2 及び100 ｍMtris-HCl（pH9.5）を含む溶液中に0.016％BCIPを含む。このフィル ターを、バンドが所望の強度に発色するまで室温で保温する。予め染色した分子
量標準（Novex、Sans Diego．CA）又はビオチン化分子量標準（Tropix．Bedfor
d．MA）の易動度を基に決定した。
【０２７５】 実施例17：EIAマイクロタイタープレートアッセイ 好ましくは、実施例13又は14のウサギ又はマウスから得られた抗血清の免疫反
応性は、以下のマイクロタイタープレートEIA法により測定する。簡単に説明す ると、配列番号17等の合成ペプチド（実施例10において調製）を炭酸緩衝液（50
ｍM、pH9.6）に溶解し、最終濃度２ μg/mlとする。次に、100 μlのペプチド又
は蛋白質溶液をImmulon２（登録商標）マイクロタイタープレート(Dynex Techno
logies, Chantilly, VA)の各ウェルに入れる。このプレートを室温で一晩保温し
た後、脱イオン水で４回洗浄した。各ウェルにリン酸緩衝生理的食塩液（PBS pH
7.4）中のSuperblock（登録商標）（Pierce Chemical Company,Rockford,IL）等
の適当な蛋白ブロッキング試薬を加え、その後直ぐに液をすてることによってウ
ェルをブロックする。このブロッキング手順を３回実施する。上記のように調製
した免疫家兎又はマウスから得られた抗血清を、0.05％Tween-20（登録商標）（
モノラウレートポリオキシエチレンエーテル）（Sigma Chemical Company,St.Lo
uis,MO）及び0.05％ナトリウムアジドを含むPBS中の蛋白質ブロッキング試薬（ 例えば、3％Supreblock（登録商標）溶液）に、1：100、1：500，1：2500, 1:12
,500及び1：62,500の割合で希釈し、コーティングしたマイクロブレートの各ウ ェルに入れる。その後、ウェルを室温で3時間保温する。脱イオン水で各ウェル を４回洗浄する。0.05％Tween20（登録商標）及び0.05％ナトリウムアジドを含 むリン酸緩衝生理的食塩液3％Sperblock溶液で1：2000の割合で希釈したアルカ リホスファターゼ結合抗家兎IgGヤギ血清又は抗マウスIgGヤギ血清（Southern B
ioTech,Birmingham,AB）の100 μlを各ウェルに加える。室温で2時間ウェルを保
温する。次に、各ウェルを脱イオン水で4回洗浄する。その後、パラニトロフェ ニルリン酸基質（Kirkegaard及びPerry Laboratories,Gaithersburg,MD）100 μ
lを各ウェルに加える。ウェルを室温で30分間保温する。各ウェルの405nmの吸光
度を測定する。陽性反応は、試験ウェル中の405nmの吸光度が非免疫血清（陰性 対照）による吸光度以上に増加していることによって同定する。陽性反応は、検
出可能な抗BS265抗体が存在することを示している。抗ペプチド抗血清の力価は 上記の抗血清の希釈から算出し、A405nm＝0.5ODである計算上の希釈率で示す。
【０２７６】 力価に加えて、抗ペプチド抗血清の見かけ上の親和性[Kd(app)]も測定し得る 。EIAマイクロタイタープレートアッセイ結果を用いて、ミカエリス-メンテン方
程式の変形により見かけ上の解離定数（Kd）を算出することができる（V．Van H
eyningen, Methods in Enzymology, Vol.121, p.472(1986)およびその後のX.Qui
らの報告Journal of Immunology, Vol.156, p.3350(1996)）。 [Ag-Ab]=[Ag-Ab]ｍａｘX [Ab]/[Ab]=kｄ ここで、[Ag-Ab]は、抗原-抗体結合体の濃度であり、[Ag-Ab] ｍａｘは最大結合
濃度、[Ab]は抗体濃度、Kdは解離定数である。曲線のあてはめにおいて、[Ag-Ab
]は、既知のAbの濃度におけるOD4０５ｎｍからバックグランドを引いた値で置換
される。Kdおよび[Ag-Ab４０５ｎｍ]ｍａｘ（[Ag-Ab]ｍａｘに対応する）をあて
はめるパラメーターとして処理する。ソフトウェアープログラムOriginを曲線の
あてはめに使用することが可能である。
【０２７７】 実施例18：固相粒子のコーティング A．BS265抗原に特異的に結合する抗体による微粒子のコーティング BS265タンパク質に特異的に結合するアフィニティー精製された抗体（実施例1
5参照）を、約0.1〜20μmの範囲内の半径を有するポリスチレン、カルボキシル 化ポリスチレン、ポリメチルアクリラートの微粒子または同様の粒子上にコーテ
ィングする。微粒子は、受動的または能動的のいずれかでコーティングすること
が可能である。1つのコーティング方法は、EDAC（1-(3-ジメチルアミノプロピル
)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI）） で活性化されたカルボキシル化ラテックス微粒子を、BS265タンパク質に特異的 に結合する抗体で、以下のとおりにコーティングすることを含む。簡単に説明す
ると、最終的に0.375％の樹脂固体懸濁液で洗浄されたカルボキシル化ラテック ス微粒子（Bangs Laboratories, Carmel, INまたはSerodyn, Indianapolis, IN から入手可能）を、適当な容器内で、50mM MES緩衝液（pH4.0）と150mg/lのアフ
ィニチティー精製した抗BS265モノクローナル抗体（実施例14を参照されたい） とを含有する溶液中で15分間混合する。EDAC結合剤を、5.5μg/mlの最終濃度に なるまで該混合物に加え、室温で2.5時間混合する。
【０２７８】 ついで0.2μm Microgon Filtrationモジュールを使用するタンジェンシャルフ
ロー（tangential flow）濾過により、該微粒子を8容量のTween20（登録商標）/
リン酸ナトリウム洗浄緩衝液（pH7.2）で洗浄する。洗浄した微粒子は、希薄な 界面活性剤および無関係なタンパク質（ブロッキング剤）を通常は含有する適当
な緩衝液中に、必要になるまで保存する。
【０２７９】 B．1/4インチのビーズのコーティング また、BS265抗原に特異的に結合する抗体を、当該技術分野で公知の常法（Sni
tmanら, 米国特許第5,273,882号）により1/4インチのポリスチレンビーズの表面
上にコーティングし、競合結合またはEIAサンドイッチアッセイにおいて使用す ることができる まず、ポリスチレンビーズを、10mM NaHCO３緩衝液（pH8.0）中で約15秒間超 音波処理に付すことにより清浄化する。ついで、すべての細粒が除去されるまで
、該ビーズを脱イオン水で洗浄する。ついでビーズを、10mM炭酸緩衝液（pH8.0 〜9.5）中の抗体溶液に漬ける。該抗体溶液は、高親和性モノクローナル抗体の 場合には1μg/mlと同程度に、あるいはアフィニティー精製されていないポリク ローナル抗体の場合には約500μg/mlの濃度と同程度に希薄であってよい。ビー ズを、室温で少なくとも12時間コーティングし、脱イオン水で洗浄する。ビーズ
は、風乾するか、または湿ったまま保存（PBS, pH7.4中）することができる。ま
た、それらは、タンパク質安定化剤（例えば、ショ糖）、または非特異的結合ブ
ロッカー（例えば、無関係なタンパク質、Carnation脱脂乳, Superblock（登録 商標）など）として使用されるタンパク質ブロッキング剤でオーバーコーティン
グする 実施例19：微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA） 標準的な抗原競合EIAまたは抗体サンドイッチEIA（MEIA）を行ない、微粒子（
MEIA）などの固相を使用することにより、患者の試験サンプル中のBS265抗原を 検出する。該アッセイは、IMx（登録商標） Analyzer（Abbott Laboratories, A
bbott Park, IL）などの自動分析装置上で行なうことができる。A．抗体サンドイッチEIA 簡単に説明すると、抗原／抗体複合体を形成させるために、BS265抗原を含有 する疑いのあるサンプルを、抗BS265抗体でコーティングされた微粒子（実施例1
7に記載のとおりに調製したもの）の存在下でインキュベートする。続いて、該 微粒子を洗浄し、シグナル生成化合物（すなわち、アルカリホスファターゼ、ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素）に結合した抗体を含む指示試薬
を該抗原／抗体複合体または該微粒子に加え、インキュベートする。該微粒子を
洗浄し、シグナル生成化合物と反応して測定可能なシグナルを生成する基質（例
えば、それぞれ4-メチルウンベリフェリルホスファート（MUP）またはOPD/ペル オキシド）を加えることにより該結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。陰性
対照から生じたシグナルと比べて上昇した試験サンプル中のシグナルにより、BS
265抗原の存在が検出される。試験サンプル中のBS265抗原の存在は、乳癌などの
***の疾患または状態の診断を示している。
【０２８０】 B．競合結合アッセイ 該競合結合アッセイでは、抗ペプチド抗体でコーティングされた微粒子と標識
ペプチドとを接触させた場合に測定可能シグナルを生成するペプチドまたはタン
パク質を使用する。このアッセイは、IMx（登録商標） Analyzer（Abbott Labor
atories, Abbott Park, IL）上で行なうことができる。該標識ペプチドを、BS26
5抗原を含有する疑いのある試験サンプルの存在下、BS265抗体でコーティングさ
れた微粒子（実施例17に記載のとおりに調製したもの）に加え、標識BS265ペプ チド（または標識タンパク質）／結合抗体複合体および／または患者のBS265抗 原／結合抗体複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートする。試
験サンプル中のBS265抗原は、該微粒子上の結合部位に関して標識BS265ペプチド
（またはBS265タンパク質）と競合する。該アッセイにおいて、試験サンプル中 のBS265抗原は、標識ペプチドまたは抗体でコーティングされた微粒子の結合を 低下させる。なぜなら、試験サンプル中の抗原と、該BS265ペプチドまたはBS265
タンパク質とが、抗体結合部位に関して競合するからである。低下したシグナル
（対照と比べた場合）は、試験サンプル中のBS265抗原の存在を示す。BS265抗原
の存在は、乳癌などの***の疾患または状態の診断を示唆する。
【０２８１】 本発明で提供し前記で検討したBS265ポリヌクレオチドおよびそれにコードさ れるタンパク質は、***組織の疾患、特に乳癌のマーカーとして有用である。血
液、血漿、血清などの試験サンプルにおけるこのマーカーの出現に基づく試験は
、安価かつ非侵襲的に診断情報を提供して、癌の診断を行なう医師を助け、療法
プロトコールを選択したり又は選択した療法の達成度をモニターするのを助ける
。このマーカーは、血液、尿、糞便などの容易に利用可能な体液中に、免疫学的
方法により検出可能な疾患組織由来の抗原として出現しうる。このマーカーは、
病態において上昇したり、病態において変化したり、あるいは不適当な身体画分
中に出現する***の正常タンパク質であることが可能である。
【０２８２】 実施例20：BS265タンパク質の免疫組織測定 実施例14に記載のコンセンサスペプチド配列（配列番号16）由来のBS265合成ペ プチドに対する抗血清を、標準手順に基づいて様々な正常および疾患組織を免疫
組織学的に染色するために使用した。簡単に説明すると、組織の凍結ブロックを
6ミクロン片に薄切し、顕微鏡スライド上に乗せた。冷アセトン中で固定した後 、切片を室温で乾燥し、その後、リン酸緩衝生理的食塩液で洗浄し、ブロッキン
グした。スライドを500倍希釈した、コンセンサスBS265ペプチド配列（配列番号
16）由来の合成ペプチドに対する抗血清とインキュベートし、洗浄した後、ビオ
チン化ヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートし、再度洗浄した後、ホースラディシ
ュパラオキシダーゼで標識したアビジンとインキュベートする。最後に洗浄した
後、赤色に発色する3-アミノ-９-エチルカルバゾール基質をスライドに上層する
。スライドをヘマトキシリンで逆染色し、マウントし、病理学を専門とする者が
顕微鏡下に観察する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 クローン3090742H1（配列番号1）、g991752（配列番号2）、g2058967（配列番
号3）、g1615448（配列番号4）のヌクレオチドアラインメント、クローン309074
2H1の全配列（クローン3090742inh(配列番号5 )として示す）およびそれらに由 来するコンセンサス（Consensus）配列（配列番号6）を示す。
【図１Ｂ】 クローン3090742H1（配列番号1）、g991752（配列番号2）、g2058967（配列番
号3）、g1615448（配列番号4）のヌクレオチドアラインメント、クローン309074
2H1の全配列（クローン3090742inh(配列番号5 )として示す）およびそれらに由 来するコンセンサス（Consensus）配列（配列番号6）を示す。
【図２】 重複するクローン3090742H1（配列番号1）、g991752（配列番号2）、g2058967
（配列番号3）、g1615448（配列番号4）、30907inh（配列番号5）のヌクレオチ ドアラインメントからのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号6）の形成を 表すコンティグ地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/30 ４Ｈ０４５ 16/30 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 15/00 Ａ (72)発明者 コーエン，モーリス アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、デイアフイールド・ロー ド・2026 (72)発明者 コルピツツ，トレイシー・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク、ノース・サークル・ドライ ブ・34365 (72)発明者 フリードマン，ポーラ・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60015、デイ アフイールド、カムノー・コート・462 (72)発明者 ゴードン，ジユリアン アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、イースト・シエリダン・ロー ド・307 (72)発明者 グラナドス，エドワード・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、モンゴメリー・レイン・19 (72)発明者 ホツジス，ステイーブン・シー アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バツ フアロー・クローブ、ストーンゲイト・ロ ード・169 (72)発明者 クラス，マイクル・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、マルベリイ・ドライブ・1606 (72)発明者 クラトクビル，ジヨン・デイー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノーシヤ、フイフス・アベニユー・7101 (72)発明者 ロバーツ−ラツプ，ライザ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ウエストフイールド・ドライブ・ 2090 (72)発明者 ラツセル，ジヨン・シー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノーシヤ、シクステイフオース・コー ト・8275 (72)発明者 ストロープ，ステイーブン・デイー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、ウイルシヤー・ドライブ・945 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 CA01 CA09 CA11 CA12 CA20 DA03 EA04 GA11 HA08 HA11 HA14 HA19 4B029 AA07 FA01 4B063 QA01 QA13 QA18 QA19 QQ03 QQ41 QQ42 QQ53 QR33 QR48 QR51 QR55 QR56 QR62 QR72 QR80 QR83 QR84 QS02 QS16 QS24 QS25 QS34 4B065 AA93Y AB01 BA02 CA44 CA46 4C084 AA13 BA01 BA18 BA19 CA53 CA59 NA14 ZB262 ZC512 4C085 AA13 AA14 DD62 4H045 AA11 BA15 BA17 BA19 CA41 EA20

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドの存在を検出 する方法であって、 （a）試験サンプルを、少なくとも1つのBS265特異的ポリヌクレオチドまたは その相補体と接触させ（ここでBS265特異的ポリヌクレオチドは、配列番号1、配
    列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6およびそれらの断片若 しくは相補体から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも50％の同
    一性を有する）、 （b）BS265ポリヌクレオチドに結合する試験サンプル由来の標的BS265ポリヌ クレオチドの存在を検出することを含んでなることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 工程（a）を行なう前に、該標的BS265ポリヌクレオチドを固
    相に結合させる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程（ａ）を実施する前に、BS265特異的ポリヌクレオチド を固相に結合させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 試験サンプル中のBS265のmRNAを検出する方法であって （a）少なくとも1つのプライマーを用いて、サンプル上で逆転写を行なってcD
    NAを得、 （b）工程（a）から得たcDNAを、BS265オリゴヌクレオチドをセンスプライマ ーおよびアンチセンスプライマーとして使用して増幅して、BS265アンプリコン を得、 （c）該BS265アンプリコンの存在を検出することを含んでなり、工程（a）お よび（b）で使用するBS265オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配
    列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６並びにそれらの断片または
    相補体よりなる群から選ばれる配列と少なくとも50％の同一性を有することを特
    徴とする方法。
  5. 【請求項５】 工程（a）、（b）または（c）の１つを行なう前に、該試験 サンプルを固相と反応させる、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 該検出工程が、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な
    標識を使用することを含む、請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 標的ポリヌクレオチドを含有する疑いのある試験サンプル中
    の標的BS265ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （a）試験サンプルを、センスプライマーとしての少なくとも1つのBS265オリ ゴヌクレオチドおよびアンチセンスプライマーとしての少なくとも1つのBS265オ
    リゴヌクレオチドと接触させ、増幅して第1段階反応産物を得、 （b）該第1段階反応産物を少なくとも1つの他のBS265オリゴヌクレオチドと接
    触させて、第2段階反応産物を得（ただし、前記の、他のBS265オリゴヌクレオチ
    ドは、工程（a）で使用するBS265オリゴヌクレオチドの3’側に位置し、該第1段
    階反応産物に相補的である）、 （c）該標的BS265ポリヌクレオチドの存在の指標として該第2段階反応産物を 検出することを含んでなり、 工程（a）および（b）において使用するBS265オリゴヌクレオチドが、配列番号 １、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６並びに
    それらの断片または相補体よりなる群から選ばれる配列と少なくとも50％の同一
    性を有することを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】 工程（a）、（b）または（c）の１つを行なう前に、該試験 サンプルを固相と反応させる、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 該検出工程が、測定可能なシグナルを生成しうる検出可能な
    標識を使用することを含む、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記の検出可能な標識を固相と反応させる、請求項９に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドを検出する のに有用な試験キットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
    号４、配列番号５および配列番号６並びにそれらの断片または相補体よりなる群
    から選ばれる配列と少なくとも50％の同一性を有する少なくとも1つのBS265ポリ
    ヌクレオチドを含有する容器を含んでなる試験キット。
  12. 【請求項１２】 BS265核酸分子に由来する精製されたポリヌクレオチドで あって、 （a）配列番号１、配列番号５、配列番号６；（b）配列番号１、配列番号２、
    配列番号３、配列番号４の断片；および（c）（a）または（b）の相補体よりな る群から選ばれるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％の同一性を有するこ
    とを特徴とする前記ポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 ポリヌクレオチドがBS265核酸配列に選択的にハイブリダ イズすることを特徴とする請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 約２０〜５０ヌクレオチドの長さを有する請求項１２に記
    載のポリヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 約１０〜２５ヌクレオチドの長さを有する請求項１２に記
    載のポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 ポリヌクレオチドが組換え技術により産生されることを特
    徴とする請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 ポリヌクレオチドが合成技術により産生されることを特徴
    とする請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 ポリヌクレオチドが少なくとも１つのBS265エピトープを コードする配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 固相に結合していることを特徴とする請求項１２に記載の
    ポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 固相が、それに結合しているポリヌクレオチド分子の配列
    を含むことを特徴とする請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 所望の宿主に和合性の制御配列に作動的に結合しているBS
    265ポリヌクレオチド由来のオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含 んでなる組換え発現系であって、該核酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列
    番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６並びにそれらの断片または相
    補体よりなる群から選ばれる配列よりなる群から選ばれる配列に対して少なくと
    も50％の同一性を有することを特徴とする組換え発現系。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の組換え発現系でトランスフェクトされ
    た細胞。
  23. 【請求項２３】 配列番号１６および配列番号１７並びにこれらの断片から
    成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するBS265ポ リペプチド。
  24. 【請求項２４】 ポリペプチドが組換え技術によって産生されることを特徴
    とする請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 ポリペプチドが合成技術により産生されることを特徴とす
    る請求項２３に記載のポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 少なくとも１つのBS265エピトープに結合する特異的結合 分子であって、BS265エピトープが、配列番号１６および配列番号１７並びにこ れらの断片から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を
    有するアミノ酸配列に由来することを特徴とする前記結合分子。
  27. 【請求項２７】 結合分子が抗体分子である請求項２６に記載の特異的結合
    分子。
  28. 【請求項２８】 試験サンプル中のBS265抗原又は抗BS265抗体の存在を決定
    するための試験キットであって、配列番号１６および配列番号１７並びにこれら
    の断片から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有す
    るBS265ポリペプチドを含む容器を含むことを特徴とする前記試験キット。
  29. 【請求項２９】 BS265ポリペプチドが固相に結合していることを特徴とす る請求項２８に記載の試験キット。
  30. 【請求項３０】 試験サンプル中のBS265抗原の存在を決定するための試験 キットであり、少なくとも１つのBS265エピトープ有するBS265抗原に結合する特
    異的結合分子を含む容器を含むことを特徴とする前記試験キット。
  31. 【請求項３１】 前記特異的結合分子が固相に結合していることを特徴とす
    る請求項３０に記載のキット。
  32. 【請求項３２】 少なくとも１つのBS265エピトープを含むことを特徴とす るポリペプチドを産生する方法であり、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を保温することを
    含み、該ポリペプチドが配列番号１６および配列番号１７並びにこれらの断片か
    ら成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ
    酸配列を含むことを特徴とする前記方法。
  33. 【請求項３３】 BS265抗原を含有する疑いのある試験サンプル中のBS265抗
    原を検出する方法であって、 （ａ）配列番号１６および配列番号１７並びにこれらの断片から成る群より選択
    されるBS265抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する特異的結合分子と試 験サンプルを接触させる工程であって、結合分子-抗原複合体の形成に十分な時 間及び条件下で行われることを特徴とする工程、及び （ｂ）該BS265抗原の存在の指標として該複合体の存在を検出する工程を含む前 記検出方法。
  34. 【請求項３４】 特異的結合分子が抗体分子又はその断片であることを特徴
    とする請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 特異的結合分子が固相に結合していることを特徴とする請
    求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 BS265に特異的な抗体を含むことが予想される試験サンプ ル中の該抗体の存在を検出する方法であって、（ａ）抗原/抗体複合体の形成が 可能となる時間および条件下で、試験サンプルをBS265ポリペプチドと接触させ る工程（ここでBS265ポリペプチドは、配列番号１６および配列番号１７並びに それらの断片から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一
    性を有するアミノ酸配列由来の少なくとも１つのBS265エピトープ有する）、お よび（ｂ）BS265抗原に特異的な抗体の存在の指標として該複合体の存在を検出 する工程、を含むことを特徴とする前記検出方法。
  37. 【請求項３７】 BS265ポリペプチドが固相に結合していることを特徴とす る請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 少なくとも１つのBS265エピトープをコードする核酸配列 で形質転換された細胞であって、該核酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番
    号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６並びにそれらの断片または相補
    体から成る群より選択されることを特徴とする前記細胞。
  39. 【請求項３９】 BS265抗原に特異的に結合する抗体を産生する方法であっ て、免疫応答を誘導するのに十分な量の単離免疫原性ポリペプチド又はその断片
    を個体に投与することを含み、該免疫原ポリペプチドが少なくとも１つのBS265 エピトープを含み、配列番号１６および配列番号１７並びにそれらの断片から成
    る群より選択される配列と少なくとも５０％の相同性を有することを特徴とする
    特徴とする前記方法。
  40. 【請求項４０】 BS265抗原に特異的に結合する抗体を産生する方法であっ て、配列番号１６および配列番号１７並びにそれらの断片から成る群より選択さ
    れるアミノ酸配列を有するポリペプチド由来の少なくとも１つのBS265エピトー プをコードする配列を含むプラスミドを個体に投与することを含んで成る前記方
    法。
  41. 【請求項４１】 前記サンプルの採取に有用な手段を含む容器を更に含む試
    験キットであって、該手段がランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップから成
    る群より選択されることを特徴とする請求項１１に記載の試験キット。
  42. 【請求項４２】 前記サンプルの採取に有用な手段を含む容器を更に含む試
    験キットであって、該手段がランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップから成
    る群より選択されることを特徴とする請求項２８に記載の試験キット。
  43. 【請求項４３】 前記サンプルの採取に有用な手段を含む容器を更に含む試
    験キットであって、該手段がランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップから成
    る群より選択されることを特徴とする請求項３０に記載の試験キット。
  44. 【請求項４４】 特異的結合分子が抗体又はその断片である請求項３０に記
    載の試験キット。
  45. 【請求項４５】 配列番号１６と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ
    酸配列を含むBS265タンパク質をコードすることを特徴とする請求項１２に記載 のポリヌクレオチド。
  46. 【請求項４６】 配列番号５又は配列番号６と少なくとも５０％の同一性を
    有するDNAを含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  47. 【請求項４７】 試験サンプル中の標的BS265ポリヌクレオチドの存在が、 ***疾患の指標である請求項１に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 アンプリコンの存在が***疾患の指標である請求項４に記
    載の方法。
  49. 【請求項４９】 第二段階反応産物が***疾患の指標である請求項７に記載
    の方法。
  50. 【請求項５０】 複合体の検出が***疾患の指標である請求項３３に記載の
    方法。
  51. 【請求項５１】 複合体の検出が***疾患の指標である請求項３６に記載の
    方法。
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