JP2001522582A - 細胞周期のｇ２／ｍ期移行に必須なｈｉｖ−１ｖｐｒのための細胞レセプター - Google Patents

細胞周期のｇ２／ｍ期移行に必須なｈｉｖ−１ｖｐｒのための細胞レセプター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は実質的に純粋なヒトＶｐｒ相互作用タンパク質（ｈＶＩＰ）およびその断片に関する。ｈＶＩＰまたはその断片をコードする単離された核酸分子；ｈＶＩＰまたはその断片をコードする核酸分子に関する核酸プローブおよびプライマー；ｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列の一部と相補的なヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチド分子；ｈＶＩＰをコードする核酸分子を含むベクター；ｈＶＩＰをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクター；ｈＶＩＰをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞；ｈＶＩＰをコードする核酸分子を含む遺伝子治療ベクター；ｈＶＩＰ上のエピトープへ結合する単離された抗体；医薬として受容可能な担体およびｈＶＩＰの一部と相補的な核酸分子を含む医薬組成物；ｈＶＩＰの作製方法；ｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列の一部と相補的なｈＶＩＰオリゴヌクレオチドの発現を阻害する方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明はヒトＶｐｒ相互作用タンパク質（ｈＶＩＰ）の同定およびクローニン
グ、その作製および使用法、および細胞周期においてその活性を阻害するための
組成物および方法に関する。 背景技術 １５ｋｄタンパク質をコードするＲと称されるＨＩＶ−１内の小さな読み取り
枠が示されて以来、ウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｒｐ）の機能に関してはほとんど
報告されていない。Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．
Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９８７，３，３３−３９。Ｖｐｒ読み取
り枠はＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のすべてのゲノム内およびほとんどの（必ず
しも全部ではないにしても）サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ゲノム内で保存さ
れている。Ｖｐｒはインビボで免疫原性であり、ほとんどの（必ずしも全部では
ないにしても）ＨＩＶ+個体は真核動物産生Ｖｐｒタンパク質と反応できる抗体 を作っている。
【０００２】 ＨＩＶ感染からＡＩＤＳへの進行は大部分、感染した細胞（ＣＤ４+ Ｔリン パ球およびマクロファージを含む）上のＨＩＶの影響により決定される。一方、
細胞活性化、分化および増殖はその度にＴ細胞およびマクロファージにおけるＨ
ＩＶ感染および複製を制御すると考えられている。Ｇａｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２２４，５００；Ｌｅｖｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，１９８４，２２５，８４０；Ｚａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９８８，２４０，１０２６；Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９８８，３３９，７０；Ｖａｌｅｎｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＡＩＤＳ
，１９９１，４，７５１；Ｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，１９９２，８９，１７６；およびＳｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ，ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，１３５４。ＨＩＶおよび他のレンチウ
イルスは非増殖性で最終的に分化されたマクロファージおよび増殖停止Ｔリンパ
球中で複製できるので、細胞***それ自体は必要とされないであろう。Ｒｏｓｅ
，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１９８６，１４３，
８５０；Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９８６，６８，
２８１；およびＬｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，３９
６９。非増殖細胞中で複製する、ＨＩＶを含んだレンチウイルスの能力はレトロ
ウイルス間でも独特であると思われ、いくつかのレンチウイルスがｖｐｒ様遺伝
子を含んでいることが重要であるようである。Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，ＡＩ
ＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，１９９２，８，３７３。骨髄細胞
株のＨｌＶ感染はより分化した表現型を生じることができ、ＨＩＶ複製に必要で
あるＮＦ−ＫＢのような因子の発現が増加する。Ｒｏｕｌｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９２，１７５，７５１；およびＣｈａｎｔａｌ
Ｐｅｔｉｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８７，７９
，１８８３。
【０００３】 Ｖｐｒタンパク質機能のほとんどの証拠は、ｖｐｒ遺伝子中に突然変異を持つ
ＨＩＶ株の活性を報告するいくつかの研究からのものである。ｖｐｒ遺伝子中の
突然変異は一次ＣＤ４+ Ｔリンパ球および形質転換されたＴ細胞株におけるＨ ＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの複製および細胞変性性の減少を生じること
が報告されている（Ｏｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９，
６３，４１１０−４１１４；Ｓｈｉｂａｔａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉ
ｍａｔｏｌ．，１９９０ａ，１９，２１７−２２５；Ｓｈｉｂａｔａ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０ｂ，６４，７４２−７４７およびＷｅｓｔｅ
ｒｖｅｌｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６，３９２５）、
しかしながら、突然変異したｖｐｒ遺伝子は複製に何の影響も及ぼさないという
報告もある（Ｄｅｄｅｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，１９８９，６３，３
２０５−３２０８）。興味あることに、ｖｐｒが突然変異したＨＩＶ−２は一次
単球／マクロファージに感染できないことが報告されている。Ｈａｔｔｏｒｉ，
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８
７，８０８０−８０８４。Ｖｐｒが転写を活性化する機構は未知であり、および
間接的であろうけれど、ＨＩＶによるＨＩＶの長い末端反復配列および異種プロ
モーターのトランス活性化は、ｖｐｒ陰性ＨＩＶ−１に対して野生株では約３倍
増加している。Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ
Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．，ｌ９９０ｂ，３，１１−１８。Ｖｐｒの影響とプロ
モーター活性およびウイルス感染性間の相関は明瞭ではない。Ｖｐｒタンパク質
がウイルス粒子内に取り込まれているという発見は、ウイルス貫入および被膜除
去に続いてＶｐｒは感染初期に機能し、Ｖｐｒは感染の確立に重要な細胞調節機
構と相互作用するようであるという提案を導いた。Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０ａ，６４，３０９７−３０９９；Ｙｕ，ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０，６４，５６８８−５６９３；およびＹｕａｎ
，ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９
９０，６，１２６５−１２７１。
【０００４】 ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子はインビトロにおいて中間分化の腫瘍細胞の細胞増
殖阻害および分化を誘導することが示されている。Ｌｅｖｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ，１９９３，７２，５４１。Ｖｐｒタンパク質はウイルス粒子内に源を発
しているので、Ｖｐｒは増殖性感染の確立に役割を果たしているのであろう。加
えて、ＨＩＶ−１ Ｖｐｒのいくつかの重要な相互に関係がある可能性を持つ機
能が同定されている。これらには、非分割細胞核内への逆転写複合体の運び込み
、細胞分化、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期の停止およびＨＩＶ−１複製の促進が含ま
れる。
【０００５】 ＨＩＶ−ｌ Ｖｐｒは非分割細胞核内へのウイルス前組込み複合体を運び込む
ために必要とされ（Ｈｅｉｎｚｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，７３１１−７３１５；およびＦ
ｌｅｔｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．，１９９６，１５，６１５５−６１
６５）、それは単球細胞株におけるウイルス複製を促進する（Ｂａｌｏｔｔａ，
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，６７，４４０９−４４１４；Ｂａ
ｌｌｉｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，２００，６２３−６
３１；およびＣｏｎｎｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２０
６，９３５−９４４）。Ｖｐｒは核へ局在化して細胞分化を誘導し、続いて細胞
周期のＧ２／Ｍ期で細胞を停止させる。Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
，１９９３，６７，６５４２−６５５０；Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｌ ａｌ．
，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３１−３３９；ＤｉＭａｒｚｉｏ，
ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，７９０９−７９１６；Ｌｅ
ｖｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７２，５４１−５５０；Ｒｏｇｅｌ
，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，８８２−８８８；Ｊｏｗ
ｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，６３０４−６３１
３；Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１
９９７，１６，１３７−１５３。突然変異分析は、この９６アミノ酸Ｖｐｒタン
パク質の機能が適当な細胞性補因子との相互作用を通して媒介されることを示唆
している。Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９，２６
９，１５５７７−１５５８２；Ｒｅｆａｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，３６２１−３６２５；Ｈｅ
，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，６７０５−６７１１；Ｒ
ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，６９，６８５９−６８６４。
【０００６】 ＨＩＶ複製を阻害する新規化合物を同定する必要性が存在する。特に、Ｖｐｒ
により媒介される特定の分子シグナルを妨害することにより複製を減少させる安
全で効果的な化合物が捜し求められた。同様に、細胞周期カスケードの必須成分
であり、Ｖｐｒと相互作用する補因子を妨害する安全で効果的な化合物が捜し求
められた。さらに、補因子を同定し、細胞周期を調節する方法においてそれを標
的とする要求が存在する。過増殖細胞のようにその増殖が望まれない細胞におけ
るＧ２からＭ期への細胞周期の進行を阻害するための化合物および方法に対する
要求が存在する。 発明の要約 本発明では、Ｖｐｒと相互作用する特異的細胞性補因子を同定する努力におい
て、酵母二ハイブリッドアッセイが利用された。同一の遺伝子から誘導された重
複相補的ＤＮＡを含み、Ｖｐｒリガンドに必須な範疇を満たす三つのクローンが
単離された。このｃＤＮＡによりコードされるタンパク質はｈＶＩＰと称された
。種々のＶｐｒ変異体が、異なったヒト細胞株において、細胞周期を停止させる
およびｈＶＩＰと共通して局在化する能力について試験された。細胞増殖の阻害
とｈＶＩＰを持つＶｐｒ突然変異体の共通局在化の間に直接的相関が観察された
。細胞周期を回っている細胞におけるｈＶＩＰ発現の抑制は、細胞をＧ２／Ｍ期
で停止させる。ｈＶＩＰはＧ２からＭ期への移行に必須であり、従って細胞周期
カスケードの必須成分であることが観察された。
【０００７】 本発明は実質的に純粋なｈＶＩＰおよびその断片に関する。 本発明はｈＶＩＰおよびその断片をコードする単離された核酸分子に関する。
【０００８】 本発明はｈＶＩＰおよびその断片をコードする核酸分子に関する核酸プローブ
およびプライマーに関する。
【０００９】 本発明はｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列の一部と相補的なヌクレオチ
ド配列から成るオリゴヌクレオチド分子に関する。
【００１０】 本発明はｈＶＩＰをコードする核酸分子を含むベクターに関する。 本発明はｈＶＩＰをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターに関する。
【００１１】 本発明はｈＶＩＰをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主
細胞に関する。
【００１２】 本発明はｈＶＩＰをコードする核酸分子を含む遺伝子治療ベクターに関する。 本発明はｈＶＩＰ上のエピトープへ結合する単離された抗体に関する。
【００１３】 本発明は医薬として受容可能な担体およびｈＶＩＰの一部と相補的な核酸分子
を含む医薬組成物に関する。
【００１４】 本発明はｈＶＩＰを作製する方法に関する。 本発明はｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列の一部と相補的なオリゴヌク
レオチドによるヒトＶｐｒ相互作用タンパク質の発現を阻害する方法に関する。
【００１５】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片に関する。
【００１６】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片を含む医薬組成物に関する。
【００１７】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片をコードする単離された核酸分子に関する。
【００１８】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片をコードする核酸分子を含むベクターに関する。
【００１９】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターに関する。
【００２０】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関す
る。
【００２１】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片をコードする核酸分子を含む遺伝子治療ベクターに関する。
【００２２】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片を作成する方法に関する。
【００２３】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片、または細胞により発現され、ｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ
移行を防止または阻害するＶｐｒ断片をコードするヌクレオチド配列と細胞を接
触させることから成るＭからＧ２への移行から細胞を阻害する方法に関する。
【００２４】 本発明は試験化合物存在下、ｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防
止または阻害することが知られているｈＶＩＰまたはｈＶＩＰ断片とｈＶＩＰと
相互作用するＶｐｒまたはＶｐｒ断片を接触させ、Ｖｐｒまたはその断片とｈＶ
ＩＰまたはその断片の親和性を、試験化合物不在下でのＶｐｒまたはその断片と
ｈＶＩＰまたはその断片の親和性を比較する工程から成る抗ＨＩＶ化合物を同定
する方法に関する。 発明の詳細な説明 新規ヒトＶｐｒ関連タンパク質、ヒトＶｐｒ相互作用タンパク質（ｈＶＩＰ）
が発見された。このタンパク質は核に局在化し、細胞周期カスケードの必須成分
として機能する。Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止の誘導、および核から核周辺パタ
ーンへのｈＶＩＰの細胞内局在化の変化の間の関連が示されている。従って、ｈ
ＶＩＰはＶｐｒの細胞性補因子であり、それらの特異的相互作用はＶｐｒの細胞
周期停止活性に必須である。それ故、ｈＶＩＰの阻害は細胞分割を阻害するであ
ろう。
【００２５】 多数の疾患が細胞周期制御の喪失および結果としての制御されない細胞分割に
より特徴付けられている。制御されない細胞増殖は、癌並びに乾癬、過形成およ
び細胞増殖により特徴付けられる他の疾患および障害のあらゆる形態において主
要な特徴である。ｈＶＩＰの活性を阻害してそれにより細胞の分割をブロックす
る能力は、制御されない細胞増殖およびＨＩＶにより特徴付けされる疾患および
障害を罹患する患者を治療する手段を提供する。ｈＶＩＰの発見、およびそれが
細胞周期において役割を担うことは、阻害剤が同定および／または設計されうる
薬剤標的を提供する。そのような阻害剤は細胞分割をブロックするのに有用であ
り、抗癌剤または抗ＨＩＶ薬剤のための特定の戦略である。
【００２６】 ｈＶＩＰが精製された；該タンパク質を含む複合体が単離された；該タンパク
質に結合する抗体を産生するハイブリドーマを生成できた；このタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡを単離し、配列決定し、宿主細胞に取り込まれてのちに組換え
により該タンパク質を発現する発現ベクターを含むベクターに取り込まれた。ｈ
ＶＩＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が生成された。
【００２７】 ｈＶＩＰの発見は、特定の阻害剤を設計および発見するための手段を提供する
。本発明によれば、ｈＶＩＰを用いることにより特定の阻害剤に関して化合物を
スクリーンしてよい。阻害剤は、抗癌剤または抗ＨＩＶ薬剤として有用である。
生成されたｈＶＩＰ、およびｈＶＩＰを含む複合体は、試験化合物の存在下にお
いてこれらのタンパク質および複合体が活性であるか否かを決定するための薬剤
スクリーンにおいて使用してよい。試験化合物をスクリーンすることにより、該
複合体を解離して複合体の形成を阻害する化合物を同定してよい。
【００２８】 ｈＶＩＰをコードする単離されたｃＤＮＡはｈＶＩＰの組換え生産における出
発物質として有用である。該ｃＤＮＡは、宿主細胞に取り込まれてのちに組換え
により該タンパク質を発現する発現ベクターを含むベクターに取り込まれる。核
酸分子およびそれらの断片、特にゲノミック配列は、遺伝子再編成を検出するた
めのプローブとして使用してよい。プローブは、例えば、制限断片長多形性アッ
セイにおいて有用であり、そして蛍光はインサイチュハイブリダイゼーションア
ッセイにおいて有用である。ｈＶＩＰをコードするｃＤＮＡの断片に相補な核酸
配列を含む核酸分子は、アンチセンス分子にｍＲＮＡの翻訳を阻害させることに
、そしてプライマーに遺伝子配列を増幅させることに、使用してよい。
【００２９】 ｈＶＩＰは、配列番号：１に示すｃＤＮＡによりコードされ、そして配列番号
：２に示すアミノ酸配列を有する。ｈＶＩＰは、天然源から単離するか、組換え
ＤＮＡ法により生成するか、または標準タンパク質合成技術により合成すること
ができる。完全長のｈＶＩＰの断片は１９９６年１月２９日に出願された特許出
願シリアル番号０８／５９３，６９５に記載され、引用により編入される。
【００３０】 標準技術および容易に利用可能な出発物質を用いることにより、配列番号：１
に開示された核酸配列情報を用いて設計されたプローブおよびプライマーを用い
て、ｈＶＩＰをコードする核酸分子をｃＤＮＡライブラリーから単離してよい。
本発明はｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関
する。本発明は配列番号：２のアミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレ
オチド配列を含む単離された核酸分子に関する。いくつかの態様において、核酸
分子はｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列から成る。いくつかの態様におい
て、核酸分子は配列番号：１中のコード配列から成る。いくつかの態様において
、核酸分子は配列番号：１に示したヌクレオチド配列から成る。本発明の単離さ
れた核酸配列は本発明のタンパク質を製造するための構築物および組換え発現系
の製造に有用である。
【００３１】 ｃＤＮＡライブラリーはよく知られた技術により発生される。本明細書に記載
されたヌクレオチド配列の一つを含むｃＤＮＡクローンは配列番号：１に記載さ
れたヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むプローブまたはプライマーを使用
して同定されるであろう。プローブまたはプライマーは少なくとも１６のヌクレ
オチド、好適には少なくとも２４のヌクレオチドを有する。プローブまたはプラ
イマーは標準ハイブリダイゼーション技術を使用してのｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングに使用される。もしくは、出発材料として任意のヒト細胞からの
ゲノムＤＮＡを使用してゲノムクローンが単離される。
【００３２】 本発明は少なくとも１０ヌクレオチドであり、配列番号：１の断片と同一また
は相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。いくつかの態
様において、単離された核酸分子は少なくとも１０ヌクレオチドであり、配列番
号：１の断片と同一または相補的なヌクレオチド配列から成る。いくつかの態様
において、単離された核酸分子は少なくとも１５−１５０ヌクレオチドであり、
配列番号：１の断片と同一または相補的なヌクレオチド配列を含む（ｃｏｍｐｒ
ｉｓｅ）かまたは該配列から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）。いくつかの態様に
おいて、単離された核酸分子は少なくとも１５−３０ヌクレオチドであり、配列
番号：１の断片と同一または相補的なヌクレオチド配列を含むかまたはから成る
。少なくとも１０ヌクレオチドであり、配列番号：１の断片と同一または相補的
なヌクレオチド配列を含むかまたはから成る単離された核酸分子は、配列番号：
１を有する遺伝子およびｃＤＮＡ配列を同定するためのプローブとして有用であ
る。配列番号：１を有する遺伝子およびｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライ
マー、および遺伝子およびｃＤＮＡの転写および翻訳を阻害するためのアンチセ
ンス分子は各々、配列番号：２のアミノ酸配列を有するｈＶＩＰをコードする。
【００３３】 ｈＶＩＰをコードするｃＤＮＡは、試料からのｃＤＮＡが電気泳動ゲルで分離
され、ｈＶＩＰプローブがバンド（そのようなプローブへハイブリダイズする）
の同定に使用される電気泳動アッセイにおいての分子マーカーとして使用される
。特に、配列番号：１またはその一部は試料からのｃＤＮＡが電気泳動ゲルで分
離され、ｈＶＩＰ特異的プローブがバンド（プローブへハイブリダイズし、バン
ドがプローブの配列と相補的なヌクレオチド配列を有することを示す）の同定に
使用される電気泳動アッセイにおいての分子マーカーとして使用される。サイズ
マーカーとして提供された単離核酸分子は、プローブへハイブリダイズすること
が知られている陽性バンドとして現れるであろうし、ｈＶＩＰをコードするｃＤ
ＮＡサイズの参照点として使用できるであろう。そのようなアッセイに有用な電
気泳動ゲルには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（本明細書に
おいて援用される）に記載されるような標準ポリアクリルアミドゲルが含まれる
。
【００３４】 配列番号：１のヌクレオチド配列はｈＶＩＰの独特のヌクレオチド配列に特異
的にハイブリダイズするプローブ、プライマーおよび相補的分子を設計するため
に使用される。ｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイ
ズするプローブ、プライマーおよび相補的分子は当業者にはルーチン的に設計さ
れるであろう。
【００３５】 本発明はまた、ｈＶＩＰを同定するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ン法を実施するためのプローブとして有用である標識オリゴヌクレオチドも含む
。従って、本発明は標識でき、およびｈＶＩＰの独特のヌクレオチド配列にハイ
ブリダイズできるプローブを含む。本発明の標識プローブは放射性標識核種で標
識されているか、または容易に利用可能な非放射活性検出系で検出可能である。
いくつかの好適な態様において、プローブは１０から１００の間のヌクレオチド
から成るオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの好適な態様において、プローブ
は１０から５０の間のヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを含む。いくつ
かの好適な態様において、プローブは１２から２０の間のヌクレオチドから成る
オリゴヌクレオチドを含む。プローブは好適にはｈＶＩＰの独特な配列の断片と
完全に同一かまたは相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様にお
いて、標識プローブはどの染色体にｈＶＩＰ遺伝子が存在するかを決定するため
に使用される。そのような標識プローブは配列番号：１の一部または全部を含む
。
【００３６】 ｈＶＩＰをコードするｃＤＮＡは核酸配列を増幅するためのＰＣＲプライマー
を設計するために使用される。ＰＣＲ技術は当業者にはルーチン的に実施されて
おり、診断におけるその使用はよく知られており、および受け入れられている。
ＰＣＲ技術を実施するための方法は”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉ
ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｉｎｎｉ
ｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（本明細書において援用される）に説明
されている。ＰＣＲ技術の応用は”Ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ” Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ（１９８９）（本明細書において援用される）に説明されている。い
くつかの簡単な規則が効率のよいプライマー設計の助けとなる。典型的なプライ
マーは１８−２８ヌクレオチド長であり、５０％から６０％のｇ＋ｃ組成を有す
る。全プライマーは好適にはそれがハイブリダイズしなければならない配列と相
補的である。好適には、プライマーは１００塩基対から２０００塩基対のＰＣＲ
生成物を発生する。しかしながら、５０塩基対から１０ｋｄおよびそれ以上の生
成物を発生することが可能である。
【００３７】 ＰＣＲ技術は、核酸分子中に存在する配列へハイブリダイズする５’および３
’プライマーを提供することにより、およびさらに遊離ヌクレオチドおよび遊離
ヌクレオチドでプライマー間のヌクレオチド配列へ相補的塩基を埋めてＤＮＡの
相補鎖を生成する酵素を提供することによりヌクレオチド配列の多数のコピーを
迅速に発生させることを可能にする。該酵素はプライマーに隣接する相補的配列
を埋めるであろう。もし５’プライマーおよび３’プライマーの両方が核酸の同
一断片の相補鎖上のヌクレオチド配列へハイブリダイズすると、特定の二重鎖生
成物の指数的増幅が生じる。もし単一のプライマーが核酸分子へハイブリダイズ
すると、色々な長さの一本鎖生成物の直線的増幅が生じる。
【００３８】 本発明は配列番号：２のアミノ酸配列を含むｈＶＩＰをコードするヌクレオチ
ド配列を含むベクターまたは組換え発現ベクターに関する。本明細書で使用され
る場合、用語”組換え発現ベクター”とは適切な宿主内に導入された場合、ｈＶ
ＩＰをコードするコード配列の発現を指示するために必要な遺伝子要素を含むプ
ラスミド、ファージ、ウイルス粒子または他のベクターを示すことを意味する。
【００３９】 当業者は標準技術および容易に利用可能な出発材料を用いて、ｈＶＩＰをコー
ドする核酸分子を単離し、およびそれを発現ベクター内へ挿入することができる
。コード配列は必要な調節配列に作動可能なように連結される。発現ベクターは
よく知られており、容易に利用可能である。発現ベクターの例には、プラスミド
、ファージ、ウイルスベクターおよびその他の核酸分子または宿主細胞を形質転
換するのに有用で、コード配列の発現を容易にする担体を含む核酸分子が含まれ
る。いくつかの態様において、組換え発現ベクターは配列番号：１に示したヌク
レオチド配列を含む。本発明の組換え発現ベクターはｈＶＩＰを発現する宿主を
形質転換するために有用である。
【００４０】 本発明は、配列番号：１を含むｈＶＩＰをコードするヌクレオチド配列を含む
組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの態様において、宿主細
胞は配列番号：１を含む組換え発現ベクターを含む。タンパク質の産生のための
よく知られた組換え発現系で使用するための宿主細胞はよく知られており、容易
に利用可能である。宿主細胞の例には、大腸菌のような細菌細胞、Ｓ．セレビジ
エのような酵母細胞、Ｓ．フルギペルダのような昆虫細胞、非ヒト哺乳動物組織
培養細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒーラ細胞のよう
なヒト組織培養細胞が含まれる。
【００４１】 いくつかの態様において、例えば、当業者はよく知られた技術を用いて、よく
知られた発現系で使用するため、市販品として入手可能な発現ベクター内へＤＮ
Ａ分子を挿入することができる。例えば、市販品として入手可能なプラスミドｐ
ＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が大腸菌にお
けるｈＶＩＰの生産に使用される。例えば、市販品として入手可能なプラスミド
ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は酵母のＳ．
セレビジエ株においての生産に使用される。例えば、市販品として入手可能なＭ
ＡＸＢＡＣTM完全バキュウロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は昆虫細胞においての生産に使用される。例えば、市販品と
して入手可能なｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）はチャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物
細胞においての生産に使用される。当業者はルーチン技術および容易に入手可能
な出発材料を用い、ｈＶＩＰを生産するためにこれらの市販の発現ベクターおよ
び系またはその他を使用できる。（例えば、本明細書において援用されるＳａｍ
ｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。）それ故、所望のタンパク質は真
核動物および原核動物系の両方で製造でき、タンパク質のプロセシングを受けた
形のスペクトルが得られる。
【００４２】 当業者は他の市販品として入手可能な発現ベクターおよび系を使用してもよい
し、よく知られた方法および容易に入手可能な出発材料を使用してベクターを製
造してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、および好適にはエ
ンハンサーのような必須の調節配列を含む発現系は容易に入手可能であり、種々
の宿主について本分野では知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）を参照されたい。
【００４３】 ｈＶＩＰをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは適格性宿主を形質転換する
ために使用され、続いて異種ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養および維持する
。そのようにして産生された本発明のタンパク質は、当業者に理解されおよび知
られているように細胞を溶解することによりまたは培養培地から回収される。当
業者は、よく知られた技術を使用して、そのような発現系を用いて生成されたｈ
ＶＩＰを単離できる。前記のようなｈＶＩＰに特異的に結合する抗体を用いた天
然の供給源からｈＶＩＰを精製する方法は、組換えＤＮＡ方法論により生成され
たｈＶＩＰの精製に等しく応用できるであろう。
【００４４】 遺伝子構築物の例では、構築物がトランスフェクトされる細胞株で機能的であ
るプロモーターへ作動可能に連結されたｈＶＩＰコード配列が含まれる。構成的
プロモーターの例にはサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０からのプロモーター
が含まれる。誘導可能プロモーターの例にはマウス***白血病ウイルスまたはメ
タロチオネインプロモーターが含まれる。当業者は容易に入手可能な出発材料か
ら、ｈＶＩＰをコードするＤＮＡによる細胞のトランスフェクションに有用な遺
伝子構築物を容易に製造できる。そのような遺伝子構築物はｈＶＩＰの製造に有
用である。
【００４５】 組換え技術によりｈＶＩＰを製造することに加え、自動化ペプチド合成機もま
たｈＶＩＰを製造するために使用されるであろう。そのような技術は当業者には
よく知られており、もし置換を持つ誘導体がＤＮＡコードタンパク質生成で提供
されないならば有用である。
【００４６】 ｈＶＩＰをコードする核酸分子は、組換えウイルス発現ベクターまたは他の適
した送達手段のような種々の送達要素の一つを用いて、適合宿主細胞でのそれら
の導入および発現に影響するように細胞内へ送達される。一般に、ウイルスベク
ターは組換えアデノウイルスおよび組換えワクシニアウイルスのようなＤＮＡウ
イルス、または組換えレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスであろう。他の組
換えベクターには細胞に感染でき、組換え遺伝子を発現できる組換え原核生物が
含まれる。組換えベクターに加えて、リポソームでのカプセル化、トランスフェ
リン仲介トランスフェクションおよび他のレセプター仲介手段のような他の送達
手段も企図される。本発明は、等価な機能で働くおよびこれに関して続いて本分
野で知られるようになる、発現ベクターのそのような他の形および他の適した送
達手段を含むつもりである。
【００４７】 本発明の好適な態様において、ＤＮＡはアデノウイルス法により適格性宿主細
胞へ送達される。当業者はそのような手段により宿主細胞へＤＮＡを送達するこ
の技術を容易に理解するであろう。本発明では好適にはアデノウイルスが含まれ
るが、本発明は等価な機能で働く任意のウイルスを含むつもりである。
【００４８】 本発明の別の好適な態様において、ＲＮＡはレトロウイルスの手段により適格
性宿主細胞へ送達される。当業者はそのような手段により宿主細胞へＲＮＡを送
達するこの技術を容易に理解するであろう。ＲＮＡによりコードされるタンパク
質を発現させるのに働く任意のレトロウイルスが本発明に含まれることが意図さ
れる。
【００４９】 本発明の別の好適な態様において、核酸は葉酸レセプター法により送達される
。宿主細胞へ送達されるべき核酸配列はポリリジンへ結合され、複合体は葉酸レ
セプター法により腫瘍細胞へ送達される。Ｌｏｗらにより１９９２年４月２８日
に公開された米国特許第５，１０８，９２１号（本明細書において援用される）
はそのような送達構成要素を記載する。
【００５０】 本発明はまた、配列番号：２のアミノ酸配列を含むｈＶＩＰをコードする核酸
配列を含む組換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物にも関
する。組換えタンパク質を産生するのに有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動
物は、必要な発現ベクターおよびトランスジェニック動物を発生させる技術とと
もによく知られている。一般に、トランスジェニック動物はｈＶＩＰがコードさ
れるヌクレオチド配列が哺乳動物細胞特異的プロモーターへ作動可能なように連
結されている組換え発現ベクターを含んでおり、それによりコード配列のみが哺
乳動物細胞で発現され、そのように発現された組換えタンパク質は動物のミルク
から回収される。いくつかの態様において、ｈＶＩＰをコードするコード配列は
配列番号：１である。
【００５１】 本発明のいくつかの態様において、トランスジェニック非ヒト動物が発生され
る。本発明に従ったトランスジェニック動物は哺乳動物特異的プロモーターの調
節制御下の配列番号：１を含む。Ｗａｇｎｅｒにより１９８９年１０月１０日に
公開された米国特許第４，８７３，１９１号およびＬｅｄｅｒにより１９８８年
４月１２日に公開された米国特許第４，７３６，８６６号（両方とも本明細書に
おいて援用される）の教えのような標準技術を用いて、当業者はｈＶＩＰを産生
するトランスジェニック動物を製造することができる。好適な動物は齧歯動物、
特にヤギ、ラットおよびマウスである。
【００５２】 本発明はまたｈＶＩＰ核酸分子と相補的なオリゴヌクレオチドによるｈＶＩＰ
の発現を阻害する方法にも関する。オリゴヌクレオチドは特定の核酸分子と特異
的ハイブリダイゼーションを達成するのに十分な同一性および数を有するヌクレ
オチド配列を含むであろう。そのようなオリゴヌクレオチドは一般に”ｍＲＮＡ
に相補的”として記載される。オリゴヌクレオチドはまたゲノム内のヌクレオチ
ド配列へ方向付けられるであろう。オリゴヌクレオチドは一般に研究試薬および
診断薬として使用される。オリゴヌクレオチドは動物およびヒトの疾患状態処置
における治療剤の一部として用いられている。
【００５３】 本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの好適な遺伝子内部位は、遺伝
子の読み取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを含む領域である。他の
標的領域には５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ
）が含まれる。ｍＲＮＡスプライス部位もまた好適な標的領域であろう。標的部
位が同定されたら、標的に十分に相補的であるオリゴヌクレオチド（即ち、申し
分なく十分で、および申し分なく特異的にハイブリダイズして所望の効果が得ら
れる）が選択される。
【００５４】 本発明では、”オリゴヌクレオチド”とはリボ核酸またはデオキシリボ核酸の
オリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語は天然に存在する核塩基、糖お
よび共有結合の糖間（主鎖）結合からなるオリゴヌクレオチドならびに、同様に
機能する非天然の部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾または置換オリ
ゴヌクレオチドは、例えば、促進された細胞取り込み、促進された核酸標的への
親和性およびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のような望ましい特性のた
めしばしば好適である。
【００５５】 好適なオリゴヌクレオチドには、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエ
ステルおよびメチルホスホネートが含まれる。オリゴヌクレオチドはまた一つま
たはそれ以上の置換糖部分を含んでおり、２’−ＯＨ、ハロゲンおよびアルキル
が含まれるが、それらに制限されるわけではない。本発明のためのオリゴヌクレ
オチドにはまた核塩基修飾または置換も含まれる。本明細書で使用する場合、”
非修飾”または”天然”核塩基にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（
Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核塩基には、例え
ば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅ ピリミジン、２−アミノ
アデニンなどが含まれる。
【００５６】 本発明に従ったオリゴヌクレオチドは約８から約１５０のヌクレオチドを含む
であろう。より好適には、オリゴヌクレオチドは約８から約１００のヌクレオチ
ドを含む。より好適には、オリゴヌクレオチドは約８から約５０のヌクレオチド
を含む。より好適には、オリゴヌクレオチドは約８から約３０のヌクレオチドを
含む。そのようなオリゴヌクレオチドが約１２から２５ヌクレオチドを含むこと
がより好適である。
【００５７】 本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬、治療薬として、および研究試薬および
キットとして利用できる。治療薬では、ｈＶＩＰの発現を調節することにより処
置できる疾患または障害を有すると疑われる動物（好適にはヒト）が、本発明に
従ったオリゴヌクレオチドを投与することにより処置される。本発明のオリゴヌ
クレオチドは、適した医薬として受容可能な希釈剤または担体へオリゴヌクレオ
チドの有効量を加えることにより医薬組成物で利用できる。オリゴヌクレオチド
の使用および本発明の方法はまた予防的にも有用であろう。
【００５８】 本発明のオリゴヌクレオチドは細胞または組織試料中のｈＶＩＰ特異的核酸存
在の診断薬として使用できる。例えば、放射性標識オリゴヌクレオチドがポリヌ
クレオチドキナーゼによる５’末端での32Ｐ標識により製造できる。Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８９，Ｖｏｌｕｍｅ２，ｐｇ１０．５９。放射性標識オリゴ
ヌクレオチドは次にｈＶＩＰ ｍＲＮＡを含んでいると疑われる細胞または組織
試料と接触させ、試料を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去する。試料中
に残っている放射活性は結合オリゴヌクレオチドの存在を示しており、それは順
にオリゴヌクレオチドと相補的な核酸の存在を示しており、シンチレーションカ
ウンターまたは他の通常の手段を用いて定量できる。これらのタンパク質をコー
ドする核酸の発現がそうして検出される。
【００５９】 本発明の放射性標識オリゴヌクレオチドはまた、研究、診断または治療目的の
ため、ｈＶＩＰの局在化、分布の決定および定量化のための組織オートラジオグ
ラフィーの実施にも使用できる。そのような研究においては、組織切片を放射性
標識オリゴヌクレオチドで処理し、前記のように洗浄し、続いて通常のオートラ
ジオグラフィー法に従って写真感光乳剤へ暴露する。感光乳剤は現像すると、ｈ
ＶＩＰ遺伝子が発現されている領域で銀粒子のイメージが得られる。銀粒子の定
量はｈＶＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の発現の検出を可能にし、こ
れらの領域へのオリゴヌクレオチドの標的化を可能にする。
【００６０】 オリゴヌクレオチドまたはそれを生成するベクターは医薬組成物へ処方できる
。本発明に従った医薬組成物は、例えば、食塩水のような医薬として受容可能な
担体または媒介物をさらに含む核酸分子と組み合わされた送達成分を含む。核酸
の送達がうまく行くことを可能にする任意の媒質が使用される。当業者は本発明
に使用されるであろう多数の医薬として受容可能な媒質を容易に理解するであろ
う。適した医薬担体は、本明細書において援用され、本分野での標準参考書であ
るＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ａ．Ｏｓｏｌに記載されている。
【００６１】 局所投与のための処方には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル
、座薬、スプレー、液剤および散剤が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉体ま
たは油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましいであろう。経口投与の
ための組成物には散剤または顆粒剤、水性または非水媒質の懸濁剤または液剤、
カプセル、サシェまたは錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分
散剤または結合剤が望ましい。非経口、鞘内または脳室内投与のための組成物に
は、緩衝剤、希釈剤および他の適した添加物を含むであろう無菌水性溶液が含ま
れ、好適には無菌であり発熱物質を含んでいない。本発明に従った静脈内投与に
適した医薬組成物は無菌であり発熱物質を含んでいない。
【００６２】 本発明の医薬組成物は、活性成分が哺乳動物体内の薬剤作用部位へ到達するこ
とを可能にする任意の手段により投与される。本発明の医薬組成物は局所または
全身的処置が望ましいか、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投
与される。投与は局所（眼、膣、直腸、鼻孔内、経皮を含む）、経口または非経
口であろう。非経口投与には点滴静注、皮下、腹腔内または筋肉内注射、肺投与
（例えば、吸入または吹送による）または鞘内または脳室内投与投与が含まれる
。
【００６３】 用量は特定の薬剤の薬力学的特性および投与様式および経路；受容者の年齢、
健康状態および体重；徴候の性質および程度、同時に行っている処置、処置の頻
度および望まれる結果の様な既知の因子に依存して変化する。治療組成物の処方
およびその後の投与は当業者の範囲内であると思われる。
【００６４】 ｈＶＩＰに結合する抗体を産生するハイブリドーマおよび抗体それ自身は、ｈ
ＶＩＰおよびｈＶＩＰを含むタンパク質複合体の単離および精製に有用である。
加えて、抗体はｈＶＩＰ活性の特異的阻害剤であろう。ｈＶＩＰに特異的に結合
する抗体はよく知られた技術および容易に利用可能な出発材料を用いて、天然起
源のタンパク質を精製するために使用される。そのような抗体はまた、組換えＤ
ＮＡ方法論によりタンパク質を製造した場合に存在する材料からタンパク質を精
製するためにも使用される。
【００６５】 本明細書で使用される場合、用語”抗体”とは完全で無傷の抗体、およびその
Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片を示すことを意味する。完全で無傷の抗体に はマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体のようなモノクロー
ナル抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体は配列番号：２のエピトー
プへ特異的に結合する。エピトープへ結合する抗体は、アフィニティクロマトグ
ラフィーのようなよく知られた技術を用いる、天然供給源または組換え発現系両
方からのタンパク質の単離および精製に有用である。そのような抗体は試料中の
そのようなタンパク質を検出するため、および細胞が該タンパク質を発現してい
るのかどうかを決定するために有用である。
【００６６】 抗体の製造および完全で無傷な抗体、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片のタ ンパク質構造、およびそのような分子をコードする遺伝子配列の構成はよく知ら
れており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴ
ＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書において援用される）に記載されている。手短に言え
ば、例えば、ｈＶＩＰまたはそれらの免疫原性断片をマウスに注射する。マウス
の脾臓を取り除き、脾臓細胞を単離し、不死化マウス細胞と融合させる。ハイブ
リッド細胞（またはハイブリドーマ）を培養し、抗体を分泌する細胞を選択する
。抗体を分析し、もしｈＶＩＰに特異的に結合することが観察されたら、それら
を産生するハイブリドーマを培養し、抗体の持続的供給を行う。
【００６７】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片に関する。Ｖｐｒは細胞周期を停止させる能力を有することが知られて
いる。細胞周期の停止と関連してＶｐｒが相互作用する細胞性タンパク質ｈＶＩ
Ｐの発見は、Ｖｐｒおよび細胞周期を停止させる能力を維持しているＶｐｒの断
片によるｈＶＩＰの標的化を提供する。いくつかの態様に従うと、断片はまた核
に局在化するその能力を保持している。
【００６８】 Ｖｐｒのアミノ酸配列は１９９３年１２月１５日に出願された米国特許第０８
／１６７，６０８号（本明細書において援用される）に開示されている。本発明
に従うと、ｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒ断片を含む医薬組成物が提供される。特異的に相互作用し、細胞周期を停止
させる領域を同定するためのＶｐｒタンパク質マッピングからのデータは１９９
７年８月１４日に出願された仮出願６０／０５５，７５４号（本明細書において
援用される）に開示されている。
【００６９】 Ｖｐｒの断片は細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するためｈＶＩＰと相互
作用することで同定できる。本発明のいくつかの態様は少なくとも３アミノ酸を
含み、ｈＶＩＰと結合するＶｐｒの断片である。いくつかの態様においては、Ｖ
ｐｒの断片は５０アミノ酸未満である。いくつかの態様においては、Ｖｐｒの断
片は２５アミノ酸未満である。いくつかの態様においては、Ｖｐｒの断片は２０
アミノ酸未満である。いくつかの態様においては、Ｖｐｒの断片は１５アミノ酸
未満である。いくつかの態様においては、Ｖｐｒの断片は１３アミノ酸未満であ
る。いくつかの態様においては、Ｖｐｒの断片は１０アミノ酸未満である。いく
つかの態様においては、Ｖｐｒの断片は８アミノ酸未満である。いくつかの態様
においては、Ｖｐｒの断片は５アミノ酸未満である。
【００７０】 本発明のいくつかの態様は少なくとも３アミノ酸を含み、ｈＶＩＰと結合する
Ｖｐｒの断片を含むペプチドである。いくつかの態様においては、ペプチドは２
５アミノ酸未満である。いくつかの態様においては、ペプチドは２５アミノ酸未
満であるＶｐｒ断片を含む。いくつかの態様においては、ペプチドは２０アミノ
酸未満であるＶｐｒ断片を含む。いくつかの態様においては、ペプチドは１５ア
ミノ酸未満であるＶｐｒ断片を含む。いくつかの態様においては、ペプチドは１
０アミノ酸未満であるＶｐｒ断片を含む。いくつかの態様においては、ペプチド
は８アミノ酸未満であるＶｐｒ断片を含む。いくつかの態様においては、ペプチ
ドは５アミノ酸未満であるＶｐｒ断片を含む。いくつかの態様においては、ペプ
チドは４アミノ酸未満であるＶｐｒ断片を含む。
【００７１】 いくつかの態様において、本発明の化合物は：２０アミノ酸またはそれ未満；
少なくとも３アミノ酸であり、およびｈＶＩＰに結合するＶｐｒの断片から成る
または含む；および細胞周期を停止させるのに有用である。本発明のペプチドは
２０アミノ酸またはそれ未満、好適には１０−１５アミノ酸またはそれ未満から
成るアミノ酸配列を含む。本明細書で使用される場合、用語”化合物”とはペプ
チドおよび少なくともいくつかの非ペプチジル結合により連結されたアミノ酸残
基を含む分子（これらに制限されるわけではない）から成る非ペプチドを含む分
子を示す。本明細書で使用される場合、用語”ペプチド”とは天然のペプチド結
合により連結されたアミノ酸サブユニットから形成されたポリペプチドを示す。
用語”アミノ酸”とは天然に存在するアミノ酸残基、および天然に存在するペプ
チドと類似する部分を有するが、天然に存在しない部分も有する残基を示すこと
を意味する。それ故、ペプチドは改変されたアミノ酸または結合を持っていても
よい。ペプチドはまた、本発明の精神に一致する他の修飾を含んでいてもよい。
そのようなペプチドは天然のペプチドとは構造的に異なっているが、機能的には
相互交換可能であるということで最もよく説明される。本明細書において、用語
”化合物”および”ペプチド”は相互交換的に使用される。
【００７２】 ｖｐｒ断片のアミノ酸配列の保存的置換が企図された。本明細書で使用される
場合、用語”保存的置換”とは類似の構造的および／または荷電特性を共有する
他の残基によるＶｐｒ残基のアミノ酸置換を示すことを意味する。当業者はよく
知られた保存的基に基づいたアミノ酸によるｖｐｒ断片の置換を容易に設計でき
る。
【００７３】 本発明のいくつかの態様のペプチドは、少なくとも約３から約２０アミノ酸ま
での長さである。本発明のいくつかの態様において、本発明のペプチドは約５か
ら約１５アミノ酸の長さである。本発明の好適な態様において、本発明のペプチ
ドは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８または１９アミノ酸長である。ペプチドは可能な限り小さいのが好適で
ある。
【００７４】 本発明のペプチドにおいて、ペプチドの少なくとも３アミノ酸はＶｐｒ断片で
ある。Ｖｐｒ由来部分がペプチドアミノ酸配列の少なくとも１０％を構成するこ
とが好適である。いくつかの態様において、本発明のペプチドアミノ酸配列の約
２０−２５％より多くがＶｐｒ由来であることが好適であり、より好適には３０
−４０％、およびより好適には５０％以上である。いくつかの態様において、Ｖ
ｐｒに由来する本発明のペプチドアミノ酸配列の比率は約６０％または約７５％
またはそれ以上に達する。
【００７５】 本発明の合成されたペプチドは、それらがｖｐｒ中で存在しているごとく、そ
れらの部分の幾何学を模倣するために環化されるであろう。環化はシステイン残
基間のジスルフィド橋により容易に行えるであろう。システイン残基はｖｐｒか
ら誘導されたペプチド部分に隣接するペプチド上の位置に含まれているであろう
。ｖｐｒから誘導されたペプチド部分内のシステイン残基は、そのような残基を
含むジスルフィド橋の形成を除去するために欠損および／または保存的に置換さ
れているであろう。もしくは、ペプチドを環化する他の手段もよく知られている
。ペプチドは、アミノおよびカルボキシ末端または近傍で、ペプチドのアミノ酸
残基間のアミド結合のような共有結合をつくる方法により環化されるであろう。
【００７６】 本発明のいくつかの態様において、ペプチドは１５アミノ酸残基またはそれ未
満から成り、Ｎ−およびＣ−末端システインから生じるジスルフィド結合により
環化さもなくばコンホメーション的に制限されている。
【００７７】 本発明のペプチドは以下の既知の技術により製造されるであろう。都合良くは
、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１５：２１４
９−２１５４（１９６３）、本明細書において援用される）最初に記載されてい
る固相合成技術を用いてペプチドが製造される。他のペプチド合成技術は、例え
ば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，（１９７６）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｄ Ｅｄ．（本明
細書において援用される）；Ｋｅｎｔ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ，ｐ．２９５−３５８，ｅｄｓ．Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）（
本明細書において援用される）；ならびに当業者には既知の他の参考文献に見る
ことができる。ペプチド合成技術の要約はＪ．Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．
Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ，
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（
１９８４）（本明細書において援用される）に見ることができる。溶液法による
ペプチドの合成も、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｄ Ｅｄ．，ｐ．１０
５−２３７，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７６）（本明細書において援用さ
れる）に説明されているように使用される。そのような合成で使用するための適
当な保護基は前記のテキストならびにＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７３）（本明細書において
援用される）に見いだされるであろう。
【００７８】 一般に、これらの合成法には成長しているペプチド鎖への一つまたはそれ以上
のアミノ酸残基または適した保護アミノ酸残基の連続的添加が含まれている。通
常、第一のアミノ酸残基のアミノかまたはカルボキシル基は適した、選択的に除
去可能な保護基により保護されている。異なった、選択的に除去可能な保護基が
リジンのような反応性側鎖を含むアミノ酸で利用される。
【００７９】 固相合成を用いる場合、例えば、保護されたまたは誘導体化されたアミノ酸を
その非保護カルボキシルまたはアミノ基を通して不活性固体支持体へ結合する。
次にアミノまたはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された
相補的（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列の次のアミノ酸を混合して
固体支持体にすでに結合されている残基と反応させる。この新しく加えたアミノ
酸残基からアミノまたはカルボキシル基の保護基を除去し、続いて次のアミノ酸
（適切に保護された）を加える、以下同じ。すべての所望のアミノ酸が適切な配
列で連結された後、残っている末端および側鎖保護基（および固体支持体）は連
続的にまたは同時に除去され、最終ペプチドが得られる。本発明のペプチドは好
適にはベンジル化またはメチルベンジル化アミノ酸を含んでいない。そのような
保護基部分は合成の途中では使用してもよいがペプチドが使用される前には除去
される。コンホメーションを保持するために分子内結合を形成させるには、別の
所に説明されているような追加の反応が必要とされる。
【００８０】 ペプチドが、ｈＶＩＰへ結合し、および細胞周期を停止させるかどうかを決定
するためには本明細書の方法に従って試験できる。ｈＶＩＰへ結合し、細胞周期
を停止させるペプチドは、癌のような望まれない細胞増殖により特徴付けられる
状態、疾患および障害の処置に有用である。
【００８１】 本発明は本発明の化合物および医薬として受容可能な担体または希釈剤を含む
医薬組成物を提供する。
【００８２】 本発明の医薬組成物は当業者により選択された投与様式に依存して選択される
組成物で処方される。適した医薬担体はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａ．Ｏｓｏｌ（この分野での標準参考本）
に記載されている。本発明の方法の実施では、本発明のペプチドは単独でまたは
他の診断薬、治療薬または追加の薬剤と組み合わせて使用できる。そのような追
加の薬剤には芳香剤、着色剤、安定化剤、濃厚化剤、浸透圧剤および抗菌剤のよ
うな添加物が含まれる。そのような薬剤はインビトロでのペプチドの使用、貯蔵
中の組成物の安定性、または最適な効力を達成するために重要な他の特性を促進
する。
【００８３】 本発明に従った静脈内投与に適した医薬組成物は滅菌されており、発熱性物質
を含んでいない。前記の医薬処方は出発材料としてｈＶＩＰと相互作用して細胞
のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶｐｒの断片を使用し、本発明に従って処
方される。
【００８４】 非経口投与にためには、本発明のペプチドは、例えば、溶液、懸濁液、乳剤ま
たは凍結乾燥粉末として処方できる。そのような賦形剤の例は水、塩溶液、リン
ガー液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンである。リポソーム
および固定油のような非水賦形剤もまた使用されるであろう。賦形剤または凍結
乾燥粉末はその等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的
安定性（例えば、緩衝液および保存剤）を維持する添加物を含む。処方は通常使
用される技術により滅菌される。例えば、注射による投与に適した非経口組成物
は重量で１．５％の活性成分を０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解することによ
り処方される。
【００８５】 本発明に従った医薬組成物は１回量としてまたは複数回量で投与される。本発
明の医薬組成物は個々の治療薬としてまたは他の治療薬と組み合わせて投与され
る。本発明の処置は通常の治療と組み合わせてもよく、連続的にまたは同時に投
与される。
【００８６】 本発明の医薬組成物は活性薬剤が標的細胞へ到達することを可能にする任意の
手段により投与される。ペプチドは経口で投与された場合は消化されるので、非
経口投与（即ち、静脈内、皮下、経皮、筋肉内）が最適な吸収のために通常使用
されるであろう。静脈内投与は注入ポンプの助けにより達成されるであろう。本
発明の医薬組成物は乳化剤として処方してもよい。もしくは、鼻孔内または吸入
投与のためのエアロゾル医薬として処方してもよい。いくつかの場合、局所投与
が望ましいであろう。
【００８７】 投与される用量は：薬力学的特性；投与様式および経路；受容者の年齢、健康
状態および体重；徴候の性質および程度；同時に行っている処置；および処置の
頻度のような因子に依存して変化する。通常、ペプチドの用量は５０キログラム
の体重当たり約１から３０００ミリグラム；好適には５０キログラムの体重当た
り約１０から１０００ミリグラム；より好適には５０キログラムの体重当たり約
２５から８００ミリグラムであろう。通常、１日当たり個体へ８から８００ミリ
グラムを、１日１回から６回の分割量で、または徐放性放出形で投与すると所望
の効果を得ることが達成される。
【００８８】 処置されている疾患または障害に依存して、本発明の医薬組成物は最も有効で
あるように処方されおよび投与される。投与様式は本開示を考慮すると当業者に
は明らかであろう。
【００８９】 本発明はｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶ
ｐｒの断片をコードする単離された核酸分子に関する。断片をコードするＤＮＡ
分子は単離または合成でき、タンパク質生成に有用な発現ベクターまたは遺伝子
治療プロトコールにおいて医薬薬剤として送達できる遺伝子治療ベクターのよう
なベクター内へクローン化される。タンパク質生成応用においては、標準組換え
ＤＮＡ方法論および前記のような出発材料を用いて、発現ベクターは適当な宿主
細胞内へ挿入され、宿主細胞が培養され、それからタンパク質が単離される。遺
伝子治療応用においては、ＤＮＡは停止されることが意図されている細胞内へＤ
ＮＡを導入するために選択されたベクター内へ挿入される。
【００９０】 ｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶｐｒ断片
またはそれらをコードするＤＮＡ分子はＭからＧ２への移行から細胞を阻害する
方法で使用される。本方法は細胞とｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行
を防止または阻害するＶｐｒ断片または細胞により発現され、ｈＶＩＰと相互作
用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻害するＶｐｒ断片をコードするヌクレ
オチド配列を接触させる工程から成る。そのような方法は、過増殖性疾患および
いくつかの自己免疫疾患のような増殖が望まれない細胞により特徴付けられる疾
患を持つ患者を処置するために有用である。過増殖性細胞または望ましくない免
疫応答に関連した増殖性細胞の分割は停止または阻害され、従って、そのような
望ましくない細胞の数が減少し、それにより患者に治療利益を生みだしている。
【００９１】 本発明の別の態様は抗ＨＩＶ化合物を同定する方法に関する。この態様に従う
と、Ｖｐｒと相互作用することが知られているｈＶＩＰまたはｈＶＩＰの断片が
試験化合物存在下、ｈＶＩＰと相互作用して細胞のＧ２／Ｍ移行を防止または阻
害するｈＶＩＰまたはｈＶＩＰの断片と接触させられる。Ｖｐｒまたはその断片
へのｈＶＩＰまたはその断片の親和性が測定され、試験化合物不在下でのＶｐｒ
またはその断片へのｈＶＩＰまたはその断片の親和性が比較される。ｈＶＩＰへ
のＶｐｒの結合を破壊できる化合物が抗ＨＩＶ化合物として有用である。この薬
剤スクリーニングアッセイにおいての陽性対照の例はＶｐｒに関してｈＶＩＰと
競合的に結合する抗ｈＶＩＰ抗体であろう。この薬剤スクリーニングアッセイに
おいての陽性対照の別の例はｈＶＩＰに関してＶｐｒと競合的に結合する抗Ｖｐ
ｒ抗体であろう。そのような抗体はｈＶＩＰ／Ｖｐｒ相互作用を破壊する既知の
化合物として有用である。結合に適した条件下、既知の量のＶｐｒおよびｈＶＩ
Ｐを混合する。本発明のいくつかの態様において、試験化合物の好適な濃度は１
μＭから５００μＭの間である。好適な濃度は１０μＭから１００μＭである。
いくつかの好適な態様において、試験化合物の一連の希釈を使用することが望ま
しい。
【００９２】 本発明は以下の実施例によりさらに例示されるが、これらは少しも制限的であ
ることは意図されていない。 実施例 実施例１：ｈＶＩＰのクローニング １０２３ｂｐ読み取り枠を含む完全長１．３５ｋｂ ｃＤＮＡを単離するため
に酵母二ハイブリッドスクリーニングおよび５’ＲＡＣＥが使用された。ｈＶＩ
Ｐの全ｃＤＮＡ配列は配列番号：１に示されており、それらによりコードされる
アミノ酸配列は配列番号：２に示される。配列番号：３は非翻訳配列を含む別の
ｃＤＮＡ配列を含む。配列番号：３によりコードされるアミノ酸配列は配列番号
：４に示される。完全ｈＶＩＰアミノ酸配列とデータバンクは既知の配列と有意
な相同性を示さなかった。９つのジペプチドロイシン−イソロイシンモチーフお
よびいくつかのＬｅｕ−Ｉｓｏｌｅｕ反復がｈＶＩＰのアミノ酸配列で注目され
た。一般に、そのようなＬｅｕ−Ｉｓｏｌｅｕ反復はタンパク質−タンパク質相
互作用を媒介すると信じられている。Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，９２，３７９４−３７９８；
およびＤｒａｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４
，１４，４５２２−４５３１。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡは約１．３５ｋｂであり、そ
れはプローブとしてｈＶＩＰ ｃＤＮＡを用いた、いくつかのヒト器官からのポ
リ（Ａ）+含有およびＣＥＭ、ＰＢＭＣｓおよびヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ） からのＲＮＡのノーザンブロットで検出されたサイズに相当する（図１Ｂ参照）
。この多様な発現パターンは、分岐細胞株の生物学におけるｈＶＩＰの役割は単
にＨＩＶの細胞標的ではないことを示唆する。 実施例２：ｈＶＩＰタンパク質の製造 ｈＶＩＰの生物学が完全長ｈＶＩＰ ｃＤＮＡインフレームとＡｎｔｉ−Ｘｐ
ｒｅｓｓエピトープタグ化６Ｈｉｓ哺乳動物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．Ｈｉ
ｓと融合させることにより研究された。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡはモノクローナルＡ
ｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープ抗体を用いる免疫沈降により検出された３９，
０００（Ｍｒ３９ｋ）の相対分子質量のペプチドを発現する（図１Ｃ参照）。ヒ
ーラ細胞をｈＶＩＰ発現ベクターでトランスフェクトし、35Ｓタンパク質標識混
合物（ＮＥＮ）で標識し、ｈＶＩＰをＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ抗体を使用して免
疫沈降させ、ＳＤＳ１５％−ＰＡＧＥで分析した。酵母二ハイブリッドアッセイ
で示唆されたようなＶｐｒおよびｈＶＩＰ間の物理的相互作用の存在を示す過程
において、インビトロでＶｐｒはｈＶＩＰと複合体を形成するかどうかを検討し
た。この目的のため、等量の35Ｓ標識インビトロ翻訳ｈＶＩＰと35Ｓ標識Ｖｐｒ
および／またはＨＩＶ−１ ｐ５５ｇａｇ前駆体ポリタンパク質（対照として）
を混合した。適切な混合物は各々の抗血清とインキュベートし、それらの相互作
用は共免疫沈降により分析された。図２はＶｐｒおよびｈＶＩＰの両方が抗Ｖｐ
ｒ抗血清により共免疫沈降されたことを示す。等量の35Ｓ放射性標識インビトロ
翻訳ｈＶＩＰを、結合緩衝液中、氷上で３０分間、ＨＩＶ−１ Ｖｐｒおよびｐ
５５ｇａｇ前駆体ポリタンパク質とインキュベートした。タンパク質複合体は抗
Ｖｐｒ、Ａｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓまたは抗ｐ２４抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ１
５％−ＰＡＧＥで分析した。ｈＶＩＰタンパク質は抗ｐ２４抗体によるｐ５５ｇ
ａｇでは共免疫沈降しなかったが、抗Ｖｐｒ抗血清によるＶｐｒで特異的に共免
疫沈降した。ｐ５５ｇａｇに対するポリクローナル抗血清はｈＶＩＰを免疫沈降
させない。興味あることに、ｐ５５ｇａｇおよびｈＶＩＰにより免疫沈降された
抗Ｖｐｒは競合がないことおよび両方のリガンドのためのＶｐｒ上の異なった結
合部位を示唆する。これらのデータはｈＶＩＰおよびＶｐｒの特異的相互作用を
インビトロで繰り返すことができること、および相互作用が直接的であることを
示す。 実施例３：ｈＶＩＰの局在化 ｈＶＩＰは点状の染色パターンで核へ局在化し、Ｖｐｒは核の周辺に局在化し
た。ヒーラ細胞をｈＶＩＰおよびＨＩＶ−１ Ｖｐｒ発現ベクターで同時にトラ
ンスフェクトし、免疫蛍光法で固定した。固定化細胞は抗ウサギポリクローナル
第一抗体で探査し、続いてＶｐｒのためのローダミン結合ヤギ抗ウサギ第二抗体
で染色した。細胞はモノクローナルＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ抗体で探査し、続い
てｈＶＩＰのためのフルオレセイン結合ヤギ抗マウス第二抗体で染色した。
【００９３】 事実上、発現されたｈＶＩＰのすべてが核へ局在化し、点状の染色パターンを
形成した（図３、パネルｄ参照）。対照的に、Ｖｐｒは核の周辺に局在化する（
図３、パネルｃ参照）。次に、ｈＶＩＰおよびＶｐｒ染色が同時にトランスフェ
クトされた細胞の同じ所に局在化するかどうかを検討した。ウサギポリクローナ
ルＶｐｒ抗体およびＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープモノクローナル抗体によ
る２色免疫染色が実施された。これらのアッセイは、ｈＶＩＰおよびＶｐｒの同
時発現は、ｈＶＩＰの分布を点状の核から核周辺パターンへ大きく変化したこと
を明らかにした（図３、パネルｇ参照）。Ｖｐｒ存在下では、ｈＶＩＰおよびＶ
ｐｒの有意な同じ場所での局在化が核の周辺で観察された（図３、パネルｆ参照
）。野生型Ｖｐｒとの同時発現により誘導されたｈＶＩＰの細胞内分布の変化は
特異的であり、突然変異体Ｖｐｒ分子（図４Ｂ参照）またはＨＩＶ−１ ｐ５５
ｇａｇ前駆体ポリタンパク質（データは示されていない）によるコトランスフェ
クションでは変化しなかった。このことは、ＨＩＶ−１ ＶｐｒはｈＶＩＰと相
互作用し、ｈＶＩＰの細胞内分布を変化させることを示唆しており、ｈＶＩＰお
よびＶｐｒがインビボで相互作用するという主張を指示する。 実施例４：ｈＶＩＰとＶｐｒの相互作用 ｈＶＩＰとの相互作用および細胞周期停止に必要とされるＶｐｒのドメインを
同定するため、前記のように重複ＰＣＲにより異なった突然変異体Ｖｐｒ分子を
発生させた。Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９
５，２１２，３３１−３３９。Ｖｐｒ突然変異体の局在化および細胞周期停止間
の相関が評価された。ヒーラ細胞を異なったＶｐｒ突然変異体（Ａ３０Ｌ、αＬ
−Ａ、Ａ５９Ｐ、Ｌ６７Ｓ、Ｈ７１Ｃ、Ｇ７５ＡおよびＣ７６Ｓ）およびｈＶＩ
Ｐ発現プラスミドでコトランスフェクトし、それらの細胞内局在化を研究した。
トランスフェクトされた細胞は固定し、前記のように染色し、フルオレセインお
よびローダミンの波長のフィルターで発現を検出し、およびＶｐｒ突然変異体の
細胞周期停止活性はフローサイトメトリー分析により決定した。図４Ａおよび４
Ｂは、Ｖｐｒ突然変異体Ａ３０Ｌ、Ａ５９Ｐ、Ｌ６７Ｓ、Ｈ７１Ｃ、Ｇ７５Ａお
よびＣ７６ＳはｈＶＩＰの細胞内分布を変化させなかっただけでなく（図４Ａお
よび４Ｂ参照）、細胞増殖も阻害しなかった（図４Ａ参照）。Ｖｐｒ突然変異体
αＬ−Ａと同時発現した場合、ｈＶＩＰは細胞質に局在化された。興味あること
に、この突然変異体は野生型Ｖｐｒの細胞周期停止機能を維持しており、ｈＶＩ
Ｐの核輸送を防止した（図４Ｂ参照）。これらのデータは、カルボキシ末端のア
ミノ酸残基がＶｐｒおよびｈＶＩＰ間の相互作用および細胞周期停止におけるｈ
ＶＩＰの細胞内局在化の改変に必須であることを明瞭に示す。 実施例５：ｈＶＩＰおよび細胞周期 ｈＶＩＰが細胞分割のＧ２からＭ期への移行に必須であることを確認するため
、アンチセンスｈＶＩＰおよび対照発現ベクターｐＢａｂｅｐｕｒｏ（ピューロ
マイシン耐性を与えるベクター）を構築した。アンチセンスｈＶＩＰはアンチセ
ンス分子の生成に向きを合わされた完全長ｈＶＩＰヌクレオチド配列を含む。Ｒ
Ｄ細胞をＶｐｒ、ｈＶＩＰセンスおよびアンチセンス発現ベクターでトランスフ
ェクトし、ピューロマイシンで選択した。図５Ａおよび５ＢはＶｐｒおよびｈＶ
ＩＰアンチセンスでトランスフェクトしたプレートでの有意な細胞数の減少を明
らかにしており、ＶｐｒおよびアンチセンスｈＶＩＰを発現している細胞は細胞
周期のＧ２／Ｍ期でブロックされたことを示す（図５Ｂ参照）。同様の結果が、
ヒーラ、ＭＣＦ−７およびＳＷ４８０を含むいくつかの別種のヒト腫瘍細胞株で
得られた。細胞周期が進行している細胞において、Ｇ２からＭ期への移行はサイ
クリン依存性キナーゼｐ３４cdc2およびサイクリンＢ複合体により調節されてい
る。Ｎｏｒｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，１９８９，９８９，８５−８９；およびＭｕｒｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９
９２，３５９，５９９−６０４。Ｇ２後期において、ｐ３４cdcはアミノ酸残基 Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１５が脱リン酸化される。このことが複合体を活性化し
、続いてＭ期の複雑な出来事に関係するいくつかの細胞性基質をリン酸化する。
ｈＶＩＰはＭ期の開始に必要とされる必須の細胞性因子である。ｈＶＩＰがサイ
クリンＢまたはｐ３４cdcまたは細胞周期カスケードの他の構成物と直接的にま たは間接的に相互作用するかどうかを決定するにはさらなる研究が必要である。
実施例６：酵母二ハイブリッド相互作用アッセイ 完全長ＨＩＶ−１ ＶｐｒをＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合ドメイン酵母発現ベクタ
ーｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とフレーム内に融合させた。二ハイブリッド
スクリーンは、ＧＡＬ−４活性化ドメインタグ付けＰＢＬ ｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施し、ＧＡＬ−４ Ｖｐｒ構築物を餌とし
て使用した。培養プレート上で４日選択後、二重形質転換体をフィルター濾紙（
ＶＷＲ）へ移し、使用説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って、β−ｇａｌ発現を
分析した。三つのクローンが回収され、すべてがアミノ酸３１から始まるｈＶＩ
Ｐのカルボキシル末端部分を含んでいた。使用説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従い、ＣＥＭおよびヒーラ細胞からの全ＲＮＡを用い、ｈ
ＶＩＰ遺伝子断片の５’末端を単離するために５’ＲＡＣＥを実施した。すべて
の分子クローンはジデオキシ鎖終止法（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）およびＡｍｐｌｉｔａｇ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用
した自動化配列決定法を用いて配列決定した。 実施例７：ＲＮＡおよびタンパク質発現 多組織ノーザンブロットはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、全ＲＮＡはＣＥＭ、
ＲＤおよびＰＢＭＣｓから単離した。ブロットは内部１００９ｂｐＥｃｏＲＩ
ｈＶＩＰ ｃＤＮＡ断片から調製されたランダムプライム32Ｐ ｄＣＴＰ標識プ
ローブで探査した。組織培養細胞におけるｈＶＩＰの発現をアッセイするために
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＦＴ７−３）に基づいた発現系を使用した。Ｍａ
ｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３
１−３３９；およびＦｕｅｒｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．，１９８７，７，２５３８−２５４４。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡはＡｎｔｉ−Ｘｐ
ｒｅｓｓ抗体エピトープタグ付け６Ｈｉｓ哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．
Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とフレーム内融合し、発現研究に使用した。ヒ
ーラ細胞はｖＦＴ７−３で感染させ、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を
使用してｈＶＩＰ発現プラスミドでトランスフェクトした。一夜トランスフェク
ション後、細胞を35Ｓ Ｅｘｐｒｅｓｓタンパク質標識混合物（ＮＥＮ）で２時
間標識した。ｈＶＩＰはモノクローナルＡｎｔｉ−Ｅｘｐｒｅｓｓ抗体を用いて
免疫沈降させ、ＳＤＳ１５％−ＰＡＧＥで分析した。 実施例８：共免疫沈降アッセイ 等レベルのインビトロ翻訳ｈＶＩＰ、ＨＩＶ−１ Ｖｐｒおよびｐ５５Ｇａｇ
前駆体ポリタンパク質を混合し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１５０
ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ＮＰ４０、５％グリセロール、０．５ｍＭジチオスレイ
トール０．４ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む結合緩衝液中、４
℃で３０分インキュベートした。１５０ｍｌの結合緩衝液を加えた各々のチュー
ブに各々の抗体を加え、４℃で９０分インキュベートした。プロテインＡセファ
ロース（５ｍｇ／チューブ）をすべてのチューブに加え、回転式振盪機中、４℃
で９０分インキュベートした。ビーズは３回結合緩衝液で洗浄した。免疫沈降さ
れたタンパク質複合体をセファロースビーズから溶出し、ＳＤＳ１５％−ＰＡＧ
Ｅで分析した。ゲルは前記のように蛍光光度法のために処理した。Ｍａｈａｌｉ
ｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９７，１６，１
３７−１５３。 実施例９：細胞周期分析 ヒーラまたはＲＤ細胞を、ｐＢａｂｅｐｕｒｏ（ピューロマイシン耐性を発現
するベクター）を持つ野生型または突然変異体ＶｐｒおよびｈＶＩＰセンス、ま
たはアンチセンス発現ベクターでコトランスフェクトした。２日後、非トランス
フェクト細胞を除くため、２μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシンを加えた。ト
ランスフェクトされた細胞はフローサイトメトリーによりＤＮＡ内容物を分析す
るため、トランスフェクション５から７日後にヨウ化プロピジウムで染色した。 実施例１０：間接的免疫蛍光法 ヒーラ細胞をＶｐｒまたはｈＶＩＰ発現ベクター単独または組み合わせてトラ
ンスフェクトした。示された第一抗体による、続いてのＦＩＴＣ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはローダミン（Ｓｉｇｍａ）結合第二抗体に
よる固定化ヒーラ細胞の免疫蛍光染色が前記のように実施された。Ｍａｈａｌｉ
ｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３１−３３
９。間接免疫蛍光法はウサギ抗Ｖｐｒ（１：５０）またはマウスＡｎｔｉ−Ｘｐ
ｒｅｓｓモノクローナル（１：１００）（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を単独または
組み合わせて実施された。これらは続いてローダミン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（
１：７５）またはＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）または両方
で染色される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａは、ｈＶＩＰ ｃＤＮＡが第一のフレーム内開始コドンから
翻訳される単一の長いＯＲＦを含むことを示す。ジペプチドロイシンおよびイソ
ロイシンモチーフおよび反復は下線が引かれている。図１Ｂは32Ｐ標識ｈＶＩＰ
断片で探査された、種々のヒト器官からのポリ（Ａ）+ＲＮＡおよびＣＥＭ、Ｒ ＤおよびＰＢＭＣｓからのＲＮＡのノーザンブロットを示す。図１Ｃは免疫沈降
アッセイで検出されたｈＶＩＰ発現を示す。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡは６Ｈｉｓ哺乳
動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタグ付けさ
れたＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープとフレーム内融合されている。
【図２】 共免疫沈降アッセイによるインビトロでのｈＶＩＰおよびＨＩＶ−
１ Ｖｐｒの相互作用を示す。マーカータンパク質の相対移動度は左側にキロダ
ルトンのサイズで示される。
【図３】 図３は間接免疫蛍光アッセイにょるｈＶＩＰおよびＶｐｒの細胞内
分布および同位置局在化を示す。パネルａ−ｄはヒーラ細胞を示しており、それ
らはｈＶＩＰかまたはＨＩＶ−１ Ｖｐｒ発現ベクターでトランスフェクトされ
、以前に記載されているように免疫蛍光法のために固定され（Ｍａｈａｌｉｎｇ
ａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３１−３３９）
、抗Ｖｐｒ（パネルａおよびｃ）およびＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ抗体（パネルｂ
およびｄ）で探査され、Ｖｐｒのためのフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギまたは
ｈＶＩＰのためのヤギ抗マウス第二抗体で染色された。パネルａおよびｂはベク
タートランスフェクトされた；パネルｃ、Ｖｐｒおよびパネルｄ、ｈＶＩＰ。パ
ネルｅ−ｈはｈＶＩＰおよびＶｐｒの同位置局在化を示す。パネルｅは位相差視
野を示す；パネルｆはローダミン特異的Ｖｐｒ蛍光を示す；パネルｇはフルオレ
セイン特異的ｈＶＩＰ蛍光を示しており；およびパネルｈは二重暴露を示してお
り、ここでローダミンおよびフルオレセインの着色は黄色として現れる。
【図４】 図４Ａおよび４ＢはｈＶＩＰとＨＩＶ−１ Ｖｐｒ突然変異体の同
位置局在化および相互作用を示す。図４Ａは以前に記載されているような重複Ｐ
ＣＲ（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２
１２，３３１−３３９；およびＨｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７
，５１−５９）により発生された突然変異体Ｖｐｒ分子を示す。図４Ｂは間接免
疫蛍光法でアッセイされたｈＶＩＰと異なったＶｐｒ突然変異体の細胞内分布を
示す。
【図５】 図５Ａおよび５Ｂ１から５Ｂ４はアンチセンスｈＶＩＰが細胞増殖
を阻害することを示す。図５ＡはＶｐｒ、ｈＶＩＰセンスおよびアンチセンス発
現ベクターでトランスフェクトされたヒト胎児性横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞を示し
ており、細胞は２μｇ／ｍｌのピューロマイシン含有ＤＭＥＭ培地中で維持され
た。細胞は５から７日後にニコン位相差顕微鏡を用いて撮影した。パネルａは対
照ベクターｐＢａｂｅｐｕｒｏを示しており；パネルｂはＶｐｒを示しており；
パネルｃはｈＶＩＰセンスを示しており；およびパネルｄはｈＶＩＰアンチセン
スを示す。図５Ｂ１から５Ｂ４はヨウ化プロピジウムで染色され、以前に記載さ
れているようなフローサイトメトリー分析（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ ｅｔ．ａｌ
．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９７，１６，１３７−１５３）に使用
されたトランスフェクトＲＤ細胞を示す。ＶｐｒおよびｈＶＩＰアンチセンスを
発現しているＲＤ細胞は４ｎ ＤＮＡ含量を持つ細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止し
ている。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月２１日（２０００．４．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正書】
【提出日】平成１２年５月２２日（２０００．５．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９２】 本発明は以下の実施例によりさらに例示されるが、これらは少しも制限的であ
ることは意図されていない。 実施例 実施例１：ｈＶＩＰのクローニング １０２３ｂｐ読み取り枠を含む完全長１．３５ｋｂ ｃＤＮＡを単離するため
に酵母二ハイブリッドスクリーニングおよび５’ＲＡＣＥが使用された。ｈＶＩ
Ｐの全ｃＤＮＡ配列は配列番号：１に示されており、それらによりコードされる
アミノ酸配列は配列番号：２に示される。配列番号：３は非翻訳配列を含む別の
ｃＤＮＡ配列を含む。配列番号：３によりコードされるアミノ酸配列は配列番号
：４に示される。完全ｈＶＩＰアミノ酸配列とデータバンクは既知の配列と有意
な相同性を示さなかった。９つのジペプチドロイシン−イソロイシンモチーフお
よびいくつかのＬｅｕ−Ｉｓｏｌｅｕ反復がｈＶＩＰのアミノ酸配列で注目され
た。一般に、そのようなＬｅｕ−Ｉｓｏｌｅｕ反復はタンパク質−タンパク質相
互作用を媒介すると信じられている。Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，９２，３７９４−３７９８；
およびＤｒａｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４
，１４，４５２２−４５３１。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡは約１．３５ｋｂであり、そ
れはプローブとしてｈＶＩＰ ｃＤＮＡを用いた、いくつかのヒト器官からのポ
リ（Ａ）+含有およびＣＥＭ、ＰＢＭＣｓおよびヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ） からのＲＮＡのノーザンブロットで検出されたサイズに相当する（図１Ｂおよび １Ｃ 参照）。この多様な発現パターンは、分岐細胞株の生物学におけるｈＶＩＰ
の役割は単にＨＩＶの細胞標的ではないことを示唆する。 実施例２：ｈＶＩＰタンパク質の製造 ｈＶＩＰの生物学が完全長ｈＶＩＰ ｃＤＮＡインフレームとＡｎｔｉ−Ｘｐ
ｒｅｓｓエピトープタグ化６Ｈｉｓ哺乳動物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．Ｈｉ
ｓと融合させることにより研究された。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡはモノクローナルＡ
ｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープ抗体を用いる免疫沈降により検出された３９，
０００（Ｍｒ３９ｋ）の相対分子質量のペプチドを発現する（図１Ｄ参照）。ヒ
ーラ細胞をｈＶＩＰ発現ベクターでトランスフェクトし、35Ｓタンパク質標識混
合物（ＮＥＮ）で標識し、ｈＶＩＰをＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ抗体を使用して免
疫沈降させ、ＳＤＳ１５％−ＰＡＧＥで分析した。酵母二ハイブリッドアッセイ
で示唆されたようなＶｐｒおよびｈＶＩＰ間の物理的相互作用の存在を示す過程
において、インビトロでＶｐｒはｈＶＩＰと複合体を形成するかどうかを検討し
た。この目的のため、等量の35Ｓ標識インビトロ翻訳ｈＶＩＰと35Ｓ標識Ｖｐｒ
および／またはＨＩＶ−１ ｐ５５ｇａｇ前駆体ポリタンパク質（対照として）
を混合した。適切な混合物は各々の抗血清とインキュベートし、それらの相互作
用は共免疫沈降により分析された。図２はＶｐｒおよびｈＶＩＰの両方が抗Ｖｐ
ｒ抗血清により共免疫沈降されたことを示す。等量の35Ｓ放射性標識インビトロ
翻訳ｈＶＩＰを、結合緩衝液中、氷上で３０分間、ＨＩＶ−１ Ｖｐｒおよびｐ
５５ｇａｇ前駆体ポリタンパク質とインキュベートした。タンパク質複合体は抗
Ｖｐｒ、Ａｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓまたは抗ｐ２４抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ１
５％−ＰＡＧＥで分析した。ｈＶＩＰタンパク質は抗ｐ２４抗体によるｐ５５ｇ
ａｇでは共免疫沈降しなかったが、抗Ｖｐｒ抗血清によるＶｐｒで特異的に共免
疫沈降した。ｐ５５ｇａｇに対するポリクローナル抗血清はｈＶＩＰを免疫沈降
させない。興味あることに、ｐ５５ｇａｇおよびｈＶＩＰにより免疫沈降された
抗Ｖｐｒは競合がないことおよび両方のリガンドのためのＶｐｒ上の異なった結
合部位を示唆する。これらのデータはｈＶＩＰおよびＶｐｒの特異的相互作用を
インビトロで繰り返すことができること、および相互作用が直接的であることを
示す。 実施例３：ｈＶＩＰの局在化 ｈＶＩＰは点状の染色パターンで核へ局在化し、Ｖｐｒは核の周辺に局在化し
た。ヒーラ細胞をｈＶＩＰおよびＨＩＶ−１ Ｖｐｒ発現ベクターで同時にトラ
ンスフェクトし、免疫蛍光法で固定した。固定化細胞は抗ウサギポリクローナル
第一抗体で探査し、続いてＶｐｒのためのローダミン結合ヤギ抗ウサギ第二抗体
で染色した。細胞はモノクローナルＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ抗体で探査し、続い
てｈＶＩＰのためのフルオレセイン結合ヤギ抗マウス第二抗体で染色した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９３】 事実上、発現されたｈＶＩＰのすべてが核へ局在化し、点状の染色パターンを
形成した（図３、パネルｄ参照）。対照的に、Ｖｐｒは核の周辺に局在化する（
図３、パネルｃ参照）。次に、ｈＶＩＰおよびＶｐｒ染色が同時にトランスフェ
クトされた細胞の同じ所に局在化するかどうかを検討した。ウサギポリクローナ
ルＶｐｒ抗体およびＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープモノクローナル抗体によ
る２色免疫染色が実施された。これらのアッセイは、ｈＶＩＰおよびＶｐｒの同
時発現は、ｈＶＩＰの分布を点状の核から核周辺パターンへ大きく変化したこと
を明らかにした（図３、パネルｇ参照）。Ｖｐｒ存在下では、ｈＶＩＰおよびＶ
ｐｒの有意な同じ場所での局在化が核の周辺で観察された（図３、パネルｆ参照
）。野生型Ｖｐｒとの同時発現により誘導されたｈＶＩＰの細胞内分布の変化は
特異的であり、突然変異体Ｖｐｒ分子（図４Ｂ参照）またはＨＩＶ−１ ｐ５５
ｇａｇ前駆体ポリタンパク質（データは示されていない）によるコトランスフェ
クションでは変化しなかった。このことは、ＨＩＶ−１ ＶｐｒはｈＶＩＰと相
互作用し、ｈＶＩＰの細胞内分布を変化させることを示唆しており、ｈＶＩＰお
よびＶｐｒがインビボで相互作用するという主張を指示する。 実施例４：ｈＶＩＰとＶｐｒの相互作用 ｈＶＩＰとの相互作用および細胞周期停止に必要とされるＶｐｒのドメインを
同定するため、前記のように重複ＰＣＲにより異なった突然変異体Ｖｐｒ分子を
発生させた。Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９
５，２１２，３３１−３３９。Ｖｐｒ突然変異体の局在化および細胞周期停止間
の相関が評価された。ヒーラ細胞を異なったＶｐｒ突然変異体（Ａ３０Ｌ、αＬ
−Ａ、Ａ５９Ｐ、Ｌ６７Ｓ、Ｈ７１Ｃ、Ｇ７５ＡおよびＣ７６Ｓ）およびｈＶＩ
Ｐ発現プラスミドでコトランスフェクトし、それらの細胞内局在化を研究した。
トランスフェクトされた細胞は固定し、前記のように染色し、フルオレセインお
よびローダミンの波長のフィルターで発現を検出し、およびＶｐｒ突然変異体の
細胞周期停止活性はフローサイトメトリー分析により決定した。図４Ａおよび４
Ｂは、Ｖｐｒ突然変異体Ａ３０Ｌ、Ａ５９Ｐ、Ｌ６７Ｓ、Ｈ７１Ｃ、Ｇ７５Ａお
よびＣ７６ＳはｈＶＩＰの細胞内分布を変化させなかっただけでなく（図４Ａお
よび４Ｂ参照）、細胞増殖も阻害しなかった（図４Ａ参照）。Ｖｐｒ突然変異体
αＬ−Ａと同時発現した場合、ｈＶＩＰは細胞質に局在化された。興味あること
に、この突然変異体は野生型Ｖｐｒの細胞周期停止機能を維持しており、ｈＶＩ
Ｐの核輸送を防止した（図４Ｂ参照）。これらのデータは、カルボキシ末端のア
ミノ酸残基がＶｐｒおよびｈＶＩＰ間の相互作用および細胞周期停止におけるｈ
ＶＩＰの細胞内局在化の改変に必須であることを明瞭に示す。 実施例５：ｈＶＩＰおよび細胞周期 ｈＶＩＰが細胞分割のＧ２からＭ期への移行に必須であることを確認するため
、アンチセンスｈＶＩＰおよび対照発現ベクターｐＢａｂｅｐｕｒｏ（ピューロ
マイシン耐性を与えるベクター）を構築した。アンチセンスｈＶＩＰはアンチセ
ンス分子の生成に向きを合わされた完全長ｈＶＩＰヌクレオチド配列を含む。Ｒ
Ｄ細胞をＶｐｒ、ｈＶＩＰセンスおよびアンチセンス発現ベクターでトランスフ
ェクトし、ピューロマイシンで選択した。図５Ａおよび５Ｂ１から５Ｂ４はＶｐ
ｒおよびｈＶＩＰアンチセンスでトランスフェクトしたプレートでの有意な細胞
数の減少を明らかにしており、ＶｐｒおよびアンチセンスｈＶＩＰを発現してい
る細胞は細胞周期のＧ２／Ｍ期でブロックされたことを示す（図５Ｂ１から５Ｂ ４ 参照）。同様の結果が、ヒーラ、ＭＣＦ−７およびＳＷ４８０を含むいくつか
の別種のヒト腫瘍細胞株で得られた。細胞周期が進行している細胞において、Ｇ
２からＭ期への移行はサイクリン依存性キナーゼｐ３４cdc2およびサイクリンＢ
複合体により調節されている。Ｎｏｒｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８９，９８９，８５−８９；およびＭｕｒｒ
ａｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５９，５９９−６０４。Ｇ２後期において、
ｐ３４cdcはアミノ酸残基Ｔｈｒ１４およびＴｈｒ１５が脱リン酸化される。こ のことが複合体を活性化し、続いてＭ期の複雑な出来事に関係するいくつかの細
胞性基質をリン酸化する。ｈＶＩＰはＭ期の開始に必要とされる必須の細胞性因
子である。ｈＶＩＰがサイクリンＢまたはｐ３４cdcまたは細胞周期カスケード の他の構成物と直接的にまたは間接的に相互作用するかどうかを決定するにはさ
らなる研究が必要である。 実施例６：酵母二ハイブリッド相互作用アッセイ 完全長ＨＩＶ−１ ＶｐｒをＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合ドメイン酵母発現ベクタ
ーｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とフレーム内に融合させた。二ハイブリッド
スクリーンは、ＧＡＬ−４活性化ドメインタグ付けＰＢＬ ｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施し、ＧＡＬ−４ Ｖｐｒ構築物を餌とし
て使用した。培養プレート上で４日選択後、二重形質転換体をフィルター濾紙（
ＶＷＲ）へ移し、使用説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って、β−ｇａｌ発現を
分析した。三つのクローンが回収され、すべてがアミノ酸３１から始まるｈＶＩ
Ｐのカルボキシル末端部分を含んでいた。使用説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従い、ＣＥＭおよびヒーラ細胞からの全ＲＮＡを用い、ｈ
ＶＩＰ遺伝子断片の５’末端を単離するために５’ＲＡＣＥを実施した。すべて
の分子クローンはジデオキシ鎖終止法（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）およびＡｍｐｌｉｔａｇ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用
した自動化配列決定法を用いて配列決定した。 実施例７：ＲＮＡおよびタンパク質発現 多組織ノーザンブロットはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、全ＲＮＡはＣＥＭ、
ＲＤおよびＰＢＭＣｓから単離した。ブロットは内部１００９ｂｐＥｃｏＲＩ
ｈＶＩＰ ｃＤＮＡ断片から調製されたランダムプライム32Ｐ ｄＣＴＰ標識プ
ローブで探査した。組織培養細胞におけるｈＶＩＰの発現をアッセイするために
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＦＴ７−３）に基づいた発現系を使用した。Ｍａ
ｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３
１−３３９；およびＦｕｅｒｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．，１９８７，７，２５３８−２５４４。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡはＡｎｔｉ−Ｘｐ
ｒｅｓｓ抗体エピトープタグ付け６Ｈｉｓ哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．
Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とフレーム内融合し、発現研究に使用した。ヒ
ーラ細胞はｖＦＴ７−３で感染させ、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を
使用してｈＶＩＰ発現プラスミドでトランスフェクトした。一夜トランスフェク
ション後、細胞を35Ｓ Ｅｘｐｒｅｓｓタンパク質標識混合物（ＮＥＮ）で２時
間標識した。ｈＶＩＰはモノクローナルＡｎｔｉ−Ｅｘｐｒｅｓｓ抗体を用いて
免疫沈降させ、ＳＤＳ１５％−ＰＡＧＥで分析した。 実施例８：共免疫沈降アッセイ 等レベルのインビトロ翻訳ｈＶＩＰ、ＨＩＶ−１ Ｖｐｒおよびｐ５５Ｇａｇ
前駆体ポリタンパク質を混合し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１５０
ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ＮＰ４０、５％グリセロール、０．５ｍＭジチオスレイ
トール０．４ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む結合緩衝液中、４
℃で３０分インキュベートした。１５０ｍｌの結合緩衝液を加えた各々のチュー
ブに各々の抗体を加え、４℃で９０分インキュベートした。プロテインＡセファ
ロース（５ｍｇ／チューブ）をすべてのチューブに加え、回転式振盪機中、４℃
で９０分インキュベートした。ビーズは３回結合緩衝液で洗浄した。免疫沈降さ
れたタンパク質複合体をセファロースビーズから溶出し、ＳＤＳ１５％−ＰＡＧ
Ｅで分析した。ゲルは前記のように蛍光光度法のために処理した。Ｍａｈａｌｉ
ｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９７，１６，１
３７−１５３。 実施例９：細胞周期分析 ヒーラまたはＲＤ細胞を、ｐＢａｂｅｐｕｒｏ（ピューロマイシン耐性を発現
するベクター）を持つ野生型または突然変異体ＶｐｒおよびｈＶＩＰセンス、ま
たはアンチセンス発現ベクターでコトランスフェクトした。２日後、非トランス
フェクト細胞を除くため、２μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシンを加えた。ト
ランスフェクトされた細胞はフローサイトメトリーによりＤＮＡ内容物を分析す
るため、トランスフェクション５から７日後にヨウ化プロピジウムで染色した。 実施例１０：間接的免疫蛍光法 ヒーラ細胞をＶｐｒまたはｈＶＩＰ発現ベクター単独または組み合わせてトラ
ンスフェクトした。示された第一抗体による、続いてのＦＩＴＣ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはローダミン（Ｓｉｇｍａ）結合第二抗体に
よる固定化ヒーラ細胞の免疫蛍光染色が前記のように実施された。Ｍａｈａｌｉ
ｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３１−３３
９。間接免疫蛍光法はウサギ抗Ｖｐｒ（１：５０）またはマウスＡｎｔｉ−Ｘｐ
ｒｅｓｓモノクローナル（１：１００）（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を単独または
組み合わせて実施された。これらは続いてローダミン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（
１：７５）またはＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）または両方
で染色される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａは、ｈＶＩＰ ｃＤＮＡが第一のフレーム内開始コドンから
翻訳される単一の長いＯＲＦを含むことを示す。ジペプチドロイシンおよびイソ
ロイシンモチーフおよび反復は下線が引かれている。図１Ｂと１Ｃは32Ｐ標識ｈ
ＶＩＰ断片で探査された、種々のヒト器官からのポリ（Ａ）+ＲＮＡおよびＣＥ Ｍ、ＲＤおよびＰＢＭＣｓからのＲＮＡのノーザンブロットを示す。図１Ｄは免
疫沈降アッセイで検出されたｈＶＩＰ発現を示す。ｈＶＩＰ ｃＤＮＡは６Ｈｉ
ｓ哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタグ
付けされたＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓエピトープとフレーム内融合されている。
【図２】 共免疫沈降アッセイによるインビトロでのｈＶＩＰおよびＨＩＶ−
１ Ｖｐｒの相互作用を示す。マーカータンパク質の相対移動度は左側にキロダ
ルトンのサイズで示される。
【図３】 図３は間接免疫蛍光アッセイにょるｈＶＩＰおよびＶｐｒの細胞内
分布および同位置局在化を示す。パネルａ−ｄはヒーラ細胞を示しており、それ
らはｈＶＩＰかまたはＨＩＶ−１ Ｖｐｒ発現ベクターでトランスフェクトされ
、以前に記載されているように免疫蛍光法のために固定され（Ｍａｈａｌｉｎｇ
ａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２，３３１−３３９）
、抗Ｖｐｒ（パネルａおよびｃ）およびＡｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ抗体（パネルｂ
およびｄ）で探査され、Ｖｐｒのためのフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギまたは
ｈＶＩＰのためのヤギ抗マウス第二抗体で染色された。パネルａおよびｂはベク
タートランスフェクトされた；パネルｃ、Ｖｐｒおよびパネルｄ、ｈＶＩＰ。パ
ネルｅ−ｈはｈＶＩＰおよびＶｐｒの同位置局在化を示す。パネルｅは位相差視
野を示す；パネルｆはローダミン特異的Ｖｐｒ蛍光を示す；パネルｇはフルオレ
セイン特異的ｈＶＩＰ蛍光を示しており；およびパネルｈは二重暴露を示してお
り、ここでローダミンおよびフルオレセインの着色は黄色として現れる。
【図４】 図４Ａおよび４ＢはｈＶＩＰとＨＩＶ−１ Ｖｐｒ突然変異体の同
位置局在化および相互作用を示す。図４Ａは以前に記載されているような重複Ｐ
ＣＲ（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２
１２，３３１−３３９；およびＨｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７
，５１−５９）により発生された突然変異体Ｖｐｒ分子を示す。図４Ｂは間接免
疫蛍光法でアッセイされたｈＶＩＰと異なったＶｐｒ突然変異体の細胞内分布を
示す。
【図５】 図５Ａおよび５Ｂ１から５Ｂ４はアンチセンスｈＶＩＰが細胞増殖
を阻害することを示す。図５ＡはＶｐｒ、ｈＶＩＰセンスおよびアンチセンス発
現ベクターでトランスフェクトされたヒト胎児性横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞を示し
ており、細胞は２μｇ／ｍｌのピューロマイシン含有ＤＭＥＭ培地中で維持され
た。細胞は５から７日後にニコン位相差顕微鏡を用いて撮影した。パネルａは対
照ベクターｐＢａｂｅｐｕｒｏを示しており；パネルｂはＶｐｒを示しており；
パネルｃはｈＶＩＰセンスを示しており；およびパネルｄはｈＶＩＰアンチセン
スを示す。図５Ｂ１から５Ｂ４はヨウ化プロピジウムで染色され、以前に記載さ
れているようなフローサイトメトリー分析（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ ｅｔ．ａｌ
．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９７，１６，１３７−１５３）に使用
されたトランスフェクトＲＤ細胞を示す。ＶｐｒおよびｈＶＩＰアンチセンスを
発現しているＲＤ細胞は４ｎ ＤＮＡ含量を持つ細胞周期のＧ２／Ｍ期で停止し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｈ 21/04 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アイヤヴー，ヴェルパンディ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19083， ハヴァータウン，ジョアンナ・ロード 120 (72)発明者 マハリンガム，サンダラサミー アメリカ合衆国アラバマ州35209，バーミ ンガム，ゴールデン・クレスト・サーク ル，ヴァリー・リッジ・アパートメンツ， アパートメント ナンバー113 (72)発明者 パテル，ママタ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19103， フィラデルフィア，サウス・トゥエンティ セカンド・ストリート 229

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：２のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なタンパ
    ク質。
  2. 【請求項２】 請求項１のタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発
    現ベクター。
  3. 【請求項３】 配列番号：１を含む請求項２の組換え発現ベクター。
  4. 【請求項４】 請求項２の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
  5. 【請求項５】 配列番号：１を含む組換え発現ベクターを含む請求項４の宿
    主細胞。
  6. 【請求項６】 配列番号：１または少なくとも１０ヌクレオチドを有するそ
    の断片から成る単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 配列番号：１から成る請求項６の核酸分子。
  8. 【請求項８】 少なくとも１０ヌクレオチドを有する配列番号：１の断片か
    ら成る請求項６の核酸分子。
  9. 【請求項９】 １２−１５０ヌクレオチドを有する配列番号：１の断片から
    成る請求項６の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 １５−５０ヌクレオチドを有する配列番号：１の断片から
    成る請求項６の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 １８−３０ヌクレオチドを有する配列番号：１の断片から
    成る請求項６の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 ２４ヌクレオチドを有する配列番号：１の断片から成る請
    求項６の核酸分子。
  13. 【請求項１３】 配列番号：１の少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチ
    ド配列と相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド分子。
  14. 【請求項１４】 配列番号：１の１０−１５０ヌクレオチドのヌクレオチド
    配列と相補的なヌクレオチド配列から成る請求項１３のオリゴヌクレオチド分子
    。
  15. 【請求項１５】 配列番号：１の１８−２８ヌクレオチドのヌクレオチド配
    列と相補的なヌクレオチド配列から成る請求項１３のオリゴヌクレオチド分子。
  16. 【請求項１６】 請求項１のタンパク質上のエピトープへ結合する単離され
    た抗体。
  17. 【請求項１７】 該抗体がモノクローナル抗体である請求項１６の抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項６の核酸分子および医薬として受容可能な担体を含
    む医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１３のオリゴヌクレオチドおよび医薬として受容可
    能な担体を含む医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 ヒトＶｐｒ相互作用タンパク質の製造方法であって： 配列番号：１を有する核酸分子を単離し； 該核酸分子を発現ベクター内へ挿入し； 該発現ベクターを該タンパク質が発現される状態になるように宿主細胞内へ挿入
    し；および 該Ｖｐｒ相互作用タンパク質を単離する工程から成る。
  21. 【請求項２１】 細胞においてヒトＶｐｒ相互作用タンパク質の発現を阻害
    する方法であって、該細胞と配列番号：１またはその断片と相補的であるオリゴ
    ヌクレオチドを接触させる工程から成り、それにより該オリゴヌクレオチドが該
    タンパク質の発現を阻害する。
  22. 【請求項２２】 該細胞が動物の癌細胞である請求項２１の方法。
  23. 【請求項２３】 該オリゴヌクレオチドが配列番号：１の１０−１５０ヌク
    レオチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列から成る請求項２１の
    方法。
  24. 【請求項２４】 該オリゴヌクレオチドが配列番号：１の１８−２８ヌクレ
    オチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列から成る請求項２１の方
    法。
  25. 【請求項２５】 癌を持つ個体を処置する方法であって、該個体に治療的に
    有効量の配列番号：１またはその断片に相補的なオリゴヌクレオチドを投与する
    工程から成り、それにより該オリゴヌクレオチドが該タンパク質の発現を阻害す
    る。
  26. 【請求項２６】 該オリゴヌクレオチドが配列番号：１の１０−１５０ヌク
    レオチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列から成る請求項２５の
    方法。
  27. 【請求項２７】 該オリゴヌクレオチドが配列番号：１の１８−２８ヌクレ
    オチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列から成る請求項２５の方
    法。
  28. 【請求項２８】 細胞中のヒトＶｐｒ相互作用タンパク質活性を阻害する方
    法であって、該細胞をｈＶＩＰ結合断片と接触させる工程から成る。
  29. 【請求項２９】 該細胞が癌を持つ個体内に存在し、および該方法が該個体
    へ治療的に有効量のＶｐｒのｈＶＩＰ結合断片を投与する工程を含む請求項２８
    の方法。
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