【発明の詳細な説明】
疾患におけるエンドセリン-1の過剰産生の阻害のためのレチノイド関連分子
承認
本発明は、国立衛生研究所の国立ガン研究所により授与された認可CA55681の
もと、政府の支持によりなされた。政府は本発明について特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、概してエンドセリン-1メッセンジャーRNA転写の強力なインヒビタ
ーであり、従ってエンドセリン-1の産生を阻害し得るレチノイド分子に関する。
本発明は、増加したレベルのエンドセリン-1の存在および生成に関する種々の疾
患の処置、および増加したレベルのエンドセリン-1による痛みの処置に対する適
用を有する。
発明の背景
エンドセリン-1(ET-1)は、非常に強力な血管収縮活性を有するポリペプチドで
ある(38)。しかしながら、上昇した血漿ET-1レベルが、以下を含む種々の疾患に
おいて見いだされることもまた知られている(39〜50)：全身性硬化症、川崎病、
心臓性ショック、急性心筋梗塞、進行性アテローム硬化症、進行性前立腺ガン、
限局性前立腺ガン、血管内皮種、肺高血圧症、敗血症、鬱血性心不全、および肝
腎症候群。
ET-1は血管収縮薬として機能するだけではなく、例えば、単独でまたは前立腺
ガンにおけるように他のホルモンおよびペプチドとの組合せで、成長因子として
働く他の機能もまた有することが発見されてきている(51)。さらに、ET-1は、At
ractapsis属の特定の蛇の毒液中の有痛性で致死性の部分であるソラホトキシン(
sorafotoxin)に関連している(52、53)。蛇の噛み付きにおける毒液と同様に、組
換えET-1は、高濃度での局所注入後、ヒトにおいて強烈な痛みを生じることが報
告されている(54)。従って、例えば前立腺ガンにおいて、ガン細胞により産生
される局在化した高濃度のET-1は、疾患の末期の段階に伴う高度の痛みの主な誘
因であるようである。それ故、ET-1の産生を予防または阻害する分子は、ET-1が
過剰産生される疾患全ての処置に対して、およびまたET-1の産生または過剰産生
が痛みを誘導する状況に置いて、有用であることが期待され得る。
遺伝子発現を調節することにより細胞分化を調整し、従って細胞の新生物発生
前の(preneoplastic)形質転換を逆転し得るレチノイドは、ガンの処置および予
防のための治療薬として優れた可能性を有する(58、59)。レチノイド、特にレチ
ノール酸(RA)アナログは、白血病、菌状息肉腫、基底細胞癌腫、乾癬および他の
皮膚の過剰増殖疾患の処置において使用されてきた(60)。データの増加する量（
１〜５）は、レチノイド(ビタミンＡ誘導体およびそれらの合成アナログ)が増殖
性疾患に対する新規の治療薬を約束することを示唆している。
しかしながら、それらの化合物の全身性副作用およびそれらの催奇形性はそれ
らの有用性を制限する。副作用は、例えば、骨再構築、掌蹠剥離(palmoplantar
peeling)、皮膚炎、脱毛症、肝細胞毒性および全身性毒性を含む(61、62)。
それ故に、レチノイドが機能する所以である機構は、有用な活性を望ましくな
いものから分離するという目的とともに、大きな関心を引き寄せ、そして多くの
レチノイドが合成されてきた(６)。しかしながら、レチノイド活性の機構の詳細
な理解の欠如は、臨床上の使用に対するレチノイドの開発における発展を、以前
に阻害してきた。それらの応答経路の分子分析においてなされたより最近の進歩
ならびに定義され得るレセプターおよび経路選択性化合物の観測(７〜10)は、狭
い生物学的活性-従って減少された副作用-を持つレチノイドが設計され得る可能
性を大きく向上させた。
驚くべきことに、ET-1の発現を阻害するレチノイド化合物のクラスが同定され
てきた。このレチノイドのクラスは、全-transレチノール酸(tRA)および9-cisレ
チノール酸(9-cisRA)と構造的に関連した非常に多数の小分子を含む。レチノイ
ドは、ET-1の過剰産生に伴う疾患または痛みの処置において有用である。他のレ
チノイドとは異なり、本発明のレチノイド分子は副作用を減少し、このことは、
F9奇形ガン細胞(ATCC受託番号CRL 1720)およびS19多能性奇形ガン細胞(ATCC受託
番号CRL 1825)における分化誘導の、それらの減少された能力または不能性と
相関する。
発明の要旨
１つの実施態様において、本発明は被験体においてET-1を阻害する方法を提供
し、これは被験体にET-1阻害量の適したレチノイドを投与する工程を含む。
別の実施態様において、本発明は被験体において増加したレベルのET-1の存在
が伴う疾患を処置する方法を提供し、これは被験体にET-1阻害量の適したレチノ
イドを投与する工程を含む。
さらなる実施態様において、本発明は被験体において増加したレベルのET-1の
存在が伴う痛みを処置する方法を提供し、これは被験体にET-1阻害量の適したレ
チノイドを投与する工程を含む。
本発明のさらなる利点は、一部は以下に続く記載において記述され、そして一
部は記載から明らかとなるか、または本発明の実施により学ばれ得る。本発明の
利点は、特に添付される請求の範囲において指摘される要素および組合せにより
理解され、そして達成される。前述の一般的な記載と以下の詳細な記載との両方
が、例示的および説明的であるに過ぎず、そして請求されるように、本発明を制
限するのではないことが理解されるべきである。
詳細な説明
本発明は、本発明の好適な実施態様についての、以下の詳細な説明を参考にす
ることにより、より容易に理解され得る。
本発明の化合物、組成物、および方法が開示されそして記載される前に、本発
明が特定の合成方法、特定の薬学的キャリアに、または特定の薬学的処方物もし
くは投与レジメン(regimen)に、もちろん変化し得るように、制限されないこと
が理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法が特定の実施態様を記
述する目的のためのみであり、そして制限することを意図しないこともまた理解
されるべきである。
本明細書および添付の請求の範囲において使用されるように、単数形「a」「a
n」および「the」は、文脈が明らかにその他のものを指図するのではない限り、
複数形の指示物を含むことを注意されなければならない。従って、例えば、「芳
香族化合物」に関して芳香族化合物の混合物を含み、「薬学的キャリア」に関し
て２種以上のそのようなキャリアの混合物を含む、などがある。
本明細書中および続く請求の範囲において、多くの用語に対して指示がなされ
、それらは以下の意味を有するとして定義される：
本明細書中で使用されるように、用語「アルキル」は、メチル、エチル、n-プ
ロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクチル、デシル、
テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどのような、１〜24
個の炭素原子を含む分岐した、または分岐していない飽和炭化水素基を示す。本
明細書中の好ましいアルキル基は、１〜12個の炭素原子を含む。用語「低級アル
キル」は、１〜６個の炭素原子を含む、好ましくは１〜４個の炭素原子を含む、
さらにより好ましくは１〜２個の炭素原子を含むアルキル基を意味する。用語「
シクロアルキル」は３〜８個、好ましくは５〜６個の炭素原子からなる環状アル
キル基を意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「アルコキシ」は、単一の末端エーテル
連結を通して結合されたアルキル基を意味する；すなわち、「アルコキシ」基は
-ORとして定義され得、ここでRは上記で定義されるようなアルキルである。「低
級アルコキシ」基は、１〜６個、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含むアル
コキシ基を意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「アルキレン」は、１〜24個の炭素原子
を含む、二官能性の分岐した、または分岐していない飽和炭化水素鎖を示し、そ
して、例えばメチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2-CH2-)、プロピレン(-CH2-CH2-CH2
-)、2-メチルプロピレン[-CH2-CH(CH3)-CH2-]、ヘキシレン[-(CH2)6-]などを含
む。「低級アルキレン」は１〜６個、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含む
アルキレン基を示す。本明細書中で使用されるように、用語「シクロアルキレン
」は環状アルキレン基、代表的には５または６員環を示す。
本明細書中で使用されるように、用語「アルケン」は２〜24個の炭素原子を含
む一不飽和または二不飽和炭化水素基を意味する。このクラスの範囲内で好適な
基は、２〜12個の炭素原子を含む。(AB)C=C(CD)のような非対称の構造は、Eおよ
びZ異性体の両方を含むことが意図される。このことは、本明細書中の構造式に
おいて仮定され得、ここで非対称なアルケンは存在するか、またはそれは結合の
記号＝により明示的に指示され得る。
本明細書中で使用されるように、用語「アルキン」は、一般式CnH2n-2、およ
び三重結合を含む構造式を有する、２〜24個の炭素原子を含む一不飽和または二
不飽和炭化水素基を意味する。このクラスの範囲内で好適な基は、２〜12個の炭
化水素を含む。
用語「アリール」は、芳香族炭化水素から誘導される任意の化合物を含み、そ
して、例えばベンゼンおよびナフタレン、ならびにピリジン、フラン、およびピ
ロールのようなヘテロアリールを含む。
本明細書中で使用されるように、用語「ヘテロ原子」は、硫黄、酸素、または
窒素を示し、そして好ましくは硫黄または酸素を示す。本明細書中で使用される
ように、接頭辞「ヘテロ-」は、構造単位において、炭素原子の代わりに存在す
る少なくとも１個のヘテロ原子を有する化合物を示す。例えば、ヘテロアリール
はアリール環にヘテロ原子を有するアリール基を示す。
用語「Me」はメチルに対する略語である。「Ac」はアセチルに対する略語であ
る。「Ad」はアダマンチルに対する略語である。
「２つの結合部位を有する基(radical)」は、共有結合を通して他の２個の部
分と結合しているが、しかし単離において、別の適した部分(単数または複数)と
結合するために、部分との間の結合が切断され、そして２個の不対電子がその基
の別々の位置において得られるかのように見られる部分を示す。従って、「２つ
の結合部位を有する基」は、例えば二価のラジカルを含む。
「骨格」は、「２つの結合部位を有する基」を示すために使用される場合は、
基に対する２つの結合部位の間の最も短い連続した炭素原子鎖を意味し、ここで
そのような鎖にある炭素原子は、ヘテロ原子またはアリール部分により置換され
得る。
「アリールまたはヘテロアリール縮合による結合」は、２個のアリールまたは
ヘテロアリール部分それぞれの１側面に沿って生じる結合を意味する。それ故、
アリール縮合による結合はナフチル結合を含む。
増加したまたは上昇したレベルのET-1の存在が伴う疾患は、増加したまたは上
昇したレベルのET-1の存在により引き起こされる任意の疾患、ならびにET-1の過
剰産生を引き起こす任意の疾患を含む。本明細書中で使用されるように、ET-1の
「増加したまたは上昇したレベル」は、当該分野で周知のプロトコルにより測定
されるように、被験体にとって正常レベルのET-1よりも大きい、被験体における
ET-1のレベルを意味する；すなわち正常レベルのET-1は、疾患または痛みを伴う
状態が存在しない被験体において存在するものである。例えば、ヒト被験体にお
けるET-1の正常血漿レベルは、Nelsonらにおいて記載される(51)。また本明細書
中で使用されるように、ET-1の「過剰産生」または「過剰産生された」ET-1は、
疾患または痛みを伴う状態が存在しない被験体において通常産生される量よりも
多い量での被験体におけるET-1の産生を意味する。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、それに続いて記載される出来事
または状況が生じてもまたは生じなくてもよく、そして記述が、前述の出来事ま
たは状況が生じる事例およびそれが生じない事例を含むことを意味する。例えば
、語句「必要に応じて置換された低級アルキル」は、低級アルキル基が置換され
てもまたは置換されていなくてもよく、そして記述が無置換の低級アルキルおよ
び置換が存在する低級アルキルの両方を含むことを意味する。
本明細書中で提供されるように、用語「有効量」の化合物は、非毒性の、しか
し遺伝子発現または他の活性の所望の調整を提供するために十分な量の化合物を
意味する。以下で指摘されるように、必要とされる正確な量は、被験体にわたり
変化し、被験体の種、年齢、および一般的な状態、処置されている疾患の重篤度
、使用される特定の化合物、その投与様態などに依存する。従って、正確な「有
効量」を指定することは不可能である。しかしながら、適切な有効量は、日常的
な実験法を使用してのみ、当業者により決定され得る。
「薬学的に受容可能」は、生物学的でないか、またはそうでなければ望ましく
なくはない材料を意味する、すなわち、材料は、任意の望ましくない生物学的効
果を生じることなく、または材料が包含される薬学的組成物の任意の他の成分を
用いて有害な様式で相互作用することなく、選択された化合物とともに個体に投
与され得る。
選択的遺伝子発現の「顕在化」、「調節」または「調整」は、化合物が特定の
機構(例えばリガンドがレチノール酸ファミリーにおいてレセプターと結合する)
により遺伝子発現の活性化因子またはアンタゴニストとして作用し得ることを意
味することを意図する。
利点を達成するために、および本発明の目的に従って、本明細書中で具体化さ
れそして広く記載されるように、本発明は、第一の実施態様において、被験体に
おいてエンドセリン-1を阻害する方法を包含し、これは被験体にET-1阻害量の適
切なレチノイドを投与する工程を含む。本発明の適切なレチノイドは、レチノー
ル酸レセプターRARα、β、もしくはγ、またはRXRα、β、もしくはγを介して
結合することにより機能する。このクラスの適切なレチノイド分子は、ET-1メッ
センジャーRNA転写の強力なインヒピターを含み、これはET-1の産生を効果的に
阻害する。しかしながら、これらの分子は典型的なレチノイドについて周知であ
る代表的な活性、とりわけ種々の細胞株において分化を誘導する能力を所有しな
い。詳細には、本発明の適切なレチノイドは、10-6Ｍ以下の濃度で、F9奇形ガン
細胞および／またはP19多能性奇形ガン細胞において分化を誘導し得ない。さら
に、本発明の適切なレチノイドは、代表的なレチノイド毒性をインビボで示さず
、それ故、哺乳動物およびヒトにおいて十分に許容される。
適切なレチノイドは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイを使用す
ることにより、ET-1メッセンジャーRNA(mRNA)転写の阻害についてスクリーニン
グされ得る。RNAは、試験されるべきレチノイド分子の非存在下または存在下で
、培地で増殖した細胞から単離される。細胞は、ET-1発現を試験することが望ま
れる任意の細胞型であり得、血管細胞、心筋細胞、および前立腺ガン細胞、なら
びにET-1が産生される任意の細胞型を含むが、それらに限定されない。RNA単離
は、当該分野で周知の手順に従うか、または市販されるキットを使用することに
より行われる。単離されたRNAは、その後、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、適切
な緩衝液およびET-1遺伝子配列に対して特異的な上流および下流プライマーとと
もにインキュベートされる。例えば、これらの全ての成分を含むPromega製の試
薬キットが使用され得る。コントロールとして、GAPDHのような、レチノイドの
活性により調整されないハウスキーピング遺伝子に対して特異的なプライマーを
用い
て、同じ反応が行われ得る。RT-PCR反応は、当該分野で周知の手順により、サー
マルサイクラーで行われる。その後、増幅されたDNAサンプルが２％アガロース
ゲル上にロードされ、そしてET-1 mRNA転写の阻害について分析される。
ET-1 mRNA転写を阻害するレチノイドはまた、本発明に適切な特定のレチノイ
ドを同定するために、アッセイされて細胞分化の誘導の程度を測定し得る。先に
注記されるとおり、適切なレチノイドは10-6Ｍ以下の濃度で、F9奇形ガン細胞お
よび／またはP19多能性奇形ガン細胞において分化を誘導し得ない。本発明のレ
チノイドの、この細胞分化誘導活性は、F9奇形ガン細胞および／またはP19多能
性奇形ガン細胞において簡便にアッセイされ、ここで分化は、全-トランスレチ
ノール酸の分化誘導活性と比較して、本発明のレチノイドにより誘導されないか
、またはごくわずかに誘導されるのみである。分化誘導活性は、化合物(10-6Ｍ
以下の濃度で)にさらされた後、形態的変化について、細胞を検査することによ
り測定され得る(55)。あるいは、分化誘導活性は、F9および／またはP19細胞に
おける分化の誘導が細胞増殖の強力な阻害を伴うという前提において、本発明の
レチノイドに曝露する際に、F9および／またはP19細胞増殖の阻害を測定するこ
とによりアッセイされ得る。細胞増殖を測定するために、Promegaまたは他の製
造者製の標準比色分析アッセイキット(MTTまたはMTS)が使用され得る。
本発明の適切なレチノイドは、本明細書中以下、ときどき本発明の化合物とし
て参照される。本発明の化合物は、少なくとも１種以上の特定の細胞型において
、ET-1 mRNA転写の強力なインヒビターである。これらのレチノイドによるET-1
転写の阻害は、ET-1ペプチドの濃度の減少を生じ、これはET-1が過剰産生されて
いる疾患において、または上昇したET-1濃度による痛みの緩和において、有益な
効果を有する。本発明の化合物は、AP-1選択的レチノイドとしてすでに記載され
ている特定の公知の構造的実体(55)、およびRXR選択的化合物としてすでに報告
されている分子(56、57)もまた含み得るが、ただしこれらの化合物はET-1阻害活
性を有する。さらに、適切なレチノイドは、その選択性がこれまでに報告されて
いなかった分子を含み、それは本明細書中で議論される。
特に適切なレチノイド化合物は、以下の構造A(i)〜A(ii)の化合物を含む：
ここで：(a)R11は以下の構造B(i)〜B(iv)の化合物であり：
(b)R1は２つの結合部位を有する基であり、ここで結合は、単一の共有結合によ
り、またはアリールもしくはヘテロアリール縮合により、２つの結合部位のそれ
ぞれにおいて独立して生じ得、(c)R2、R3、R4、R5、およびR10は独立して同一の
または異なる低級アルキルであり、(d)R6は水素またはメチルであり、(e)R7、R8
、およびR9は、水素、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アルキル、またはアダマン
チルであり、そして(f)XおよびYは、独立してヘテロ原子である。本明細書中な
ら
合または二重結合を表す。上記ならびに本願および請求の範囲全体にわたり使用
適切なレチノイド化合物はまた、前述の化合物の塩、アミド、およびエステル
を含む。本発明の特定の実施態様において、R11のための式B(i)においてCOOHは
パラ位にある。別の特定の実施態様において、R11のための式B(iii)においてCOO
Hは2位にある。
好ましくは、R1は、１〜５個、好ましくは１〜３個の炭素原子、ヘテロ原子、
および／またはアリール部分をその骨格中に有する炭化水素またはヘテロ炭化水
素であるが、ただし骨格中に１個より多いアリール部分は存在しない。
R1はまた好ましくは以下のものである：(a)ヘテロ原子、メチル、メチルヒド
ロキシ、カルボニル、イミン、ヘテロアリール、または二重結合もしくは単結合
を通して低級アルキルもしくはメチルアリールで置換された二価のメチル；(b)
以下の式C(i)の化合物：
ここで、R1およびR2は、メチルまたはヘテロ原子であり、必要に応じて一緒に連
結して、3、5、または6員の環状脂肪族環またはヘテロ環状脂肪族環を形成する
；あるいは(c)以下の式C(ii)の化合物：
ここで、R3はヘテロ原子、メチル、メチルヒドロキシ、カルボニル、イミン、ヘ
テロアリール、二重結合もしくは単結合を通して低級アルキルもしくはメチルア
リールで置換された二価のメチルであり；そしてR4はヘテロ原子、カルボニル、
メトキシカルボニル、エテン、メトキシ、アセチレン、アリール、またはカルボ
ニルアミンである。
本発明のさらに別の実施態様において、R1は式C(iii)からC(xxiv)までの中か
ら選択される部分である：
R12およびR13は、好ましくはそれぞれ独立して、低級アルキルであり、そしてよ
り好ましくは、独立してメチルであり、そしてXおよびYは、それぞれ独立してヘ
テロ原子である。
C(iii)からC(xxiv)までにより表される部分は、２つの結合部位を有する基で
あり、ここで結合は、単一の共有結合により、またはアリールもしくはヘテロア
リール縮合により、２つの結合部位のそれぞれにおいて独立して生じ得る。結合
部位は、波線により表され、波線を１本だけ有する構造において、第二の結合部
位は末端のアリール基の１側面に沿っている。例えば、構造C(xxii)において、
１つの波線により表される１つの結合部位とアリール基とが存在し、それを通し
てアリール縮合による結合が生じる。
特に適切なレチノイドはまた、以下の構造D(i)からD(xxxx)までの化合物を含
み得る： 上記の構造Ｄにおいて、結合の記号−および＝は、低級アルキル基、好ましくは
メチルにより末端された結合を表す。
本発明はまた、カルボン酸部分を含む本発明の化合物の薬学的に受容可能な非
毒性のエステル、アミド、および塩誘導体を包含する。
薬学的に受容可能な塩は、遊離の酸を適切な量の薬学的に受容可能な塩基で処
理することにより調製される。代表的な薬学的に受容可能な塩基は、水酸化アン
モニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシ
ウム、水酸化マグネシウム、水酸化鉄(II)、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アル
ミニウム、水酸化鉄(III)、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチル
アミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチ
ルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒス
チジンなどである。反応は、約０℃〜約100℃の温度で、好ましくは室温で、水
中で、単独または不活性物（水混和性有機溶媒）と組み合わせて行われる。レチ
ノイド対使用される塩基のモル比は、任意の特定の塩に対して望まれる比を提供
するように選択される。例えば、遊離酸である出発物質のアンモニウム塩を調製
するために、出発物質はほぼ１当量の薬学的に受容可能な塩基で処理されて中性
の塩を生じ得る。カルシウム塩が調製される場合、ほぼ1/2モル当量の塩基が使
用されて中性の塩を生じるが、一方アンモニウム塩については、ほぼ1/3モル当
量の塩基が使用される。
エステル誘導体は、代表的には化合物の酸型に対する前駆体として調製され、
従ってプロドラッグとして働き得る。一般に、これらの誘導体はメチル、エチル
などのような低級アルキルエステルである。アミド誘導体である-(CO)NH2、-(CO
)NHR、および-(CO)NR2（ここで、Rは低級アルキルである)は、カルボン酸含有化
合物の反応性誘導体と、アンモニアまたは置換アミンとの反応により調製され得
る。
本発明はまた、本発明の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学
的組成物を提供する。好ましいのは、治療的量の本発明の化合物および薬学的に
受容可能なキャリアを含む、ET-1 mRNA転写を阻害するための薬学的組成物であ
る。合成方法：
本発明の化合物は、合成有機化学者に一般に知られている技術を使用して、容
易に合成され得る。化合物を合成し、そして誘導するための一般に適切な実験的
方法が記載される(例えば、参考文献63〜72を参照のこと、これらの開示は参考
として本明細書中で援用される)。有用性および投与：
本発明の化合物（薬理学的に受容可能なエステル、アミドまたはそれらの塩を
含む）は、多くの意図される適用において、有用である。本発明の化合物と方法
についての主な使用は、種々の疾患（種々の疾患と関連する疼痛を含む）の予防
および処置においてである。このような疾患としては、例えば、全身性硬化症、
川崎病、心臓性ショック、急性心筋梗塞、進行性アテローム硬化症、進行性前立
腺ガン、限局性前立腺ガン、血管内皮腫、肺高血圧症、敗血症、鬱血性心不全お
よび肝腎症候群が、挙げられる。本発明のレチノイドの別の使用は、増大したレ
ベルのET-1の存在に関連する疼痛の処置においてである。
本発明の化合物および方法はまた、ET-1発現を阻害するために投与され得る治
療用化合物の同定を可能とする。具体的には、本発明は、ET-1産生の阻害活性に
ついてレチノイドをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、レチノイド
を、ET-1産生細胞と接触させる工程およびET-1産生について細胞をアッセイする
工程を包含し、ここでレチノイドと接触しないET-1産生細胞と比較したET-1産生
の減少がET-1産生を阻害する活性を有するレチノイドを示す。ET-1産生は、当該
分野のプロトコル標準に従って、細胞培養上清中に分泌されるET-1の量を測定す
ることにより、ならびに本明細書で記載するようにRT-PCRによって転写されたET
-1 mRNAの量をアッセイすることにより、アッセイされ得る。
本発明はさらに、ET-1過剰発現により生じる疾患または疼痛関連状態を有する
被験体の処置に適切なレチノイドを同定する方法を提供し、この方法は、レチノ
イドをET-1産生細胞と接触させる工程、ET-1産生について細胞をアッセイする工
程、レチノイドを、レチノイド存在下で分化する細胞（例えば、F9奇形ガン細胞
およびSl9奇形ガン多能性細胞）と接触させる工程、および分化について細胞を
アッセイする工程を包含し、ここでレチノイドと接触しないET-1産生細胞と比較
したET-1産生の減少およびレチノイド存在下で分化する細胞の分化誘導の不能が
、ET-1過剰発現により生じる疾患または疼痛関連状態を有する被験体の処置に適
切なレチノイドを示す。上記のように、ET-1産生は、当該分野のプロトコル標準
に従って、細胞培養上清中に分泌されるET-1の量を測定することにより、ならび
に本明細書で記載するようにRT-PCRによって転写されたET-1 mRNAの量をアッセ
イすることにより、アッセイされ得る。レチノイド存在下で分化する細胞におけ
る、レチノイドの分化誘導の不能は、本明細書に記載する分化および/または増
殖アッセイにより判定され得る。
それによって、種々の疾患および疼痛関連状態は、本方法によって本発明の化
合物（特に、増加したET-1レベルの存在または発現と関連する化合物）であると
して同定されるレチノイドにより処置され得る。ET-1 mRNA転写の阻害は、ET-1
ペプチドのレベルの減少を生じる。この減少は、ET-1が過剰産生される上述の疾
患または疼痛状態に有利な効果を有する。
言及されるべき特定の疾患と関連した本発明のいくつかの特定の実施態様が存
在する。例えば、前立腺ガンを処置する場合、好ましくは、構造D(i)-D(xxii)お
よびD(xxxv)から選択されるレチノイドが使用される。なおより好ましくは、構
造D(i)-D(v)、D(vii)、D(xiv)、D(xix)-D(xxi)およびD(xxv)から選択されるレチ
ノイドが使用される。なおよりさらに好ましくは、構造D(xxxvii)のレチノイド
が使用される。
卵巣ガンの処置の場合、レチノイドは、好ましくは、構造D(i)-D(xxi)およびD
(xxxv)から選択され、なおより好ましくは、構造D(i)-D(v)、D(vii)、D(xiv)、D
(xix)-D(xxi)およびD(xxv)から選択される。***ガンを処置する場合、レチノイ
ドは、好ましくは、構造D(i)-D(xiv)、D(xvi)-D(xxi)およびD(xxxv)から選択さ
れ、さらにより好ましくは、構造D(i)-D(v)、D(vii)、D(xiv)、D(xix)-D(xxi)お
よびD(xxv)から選択され、なおよりさらに好ましくは、構造D(xxxvii)である。
前記したように、本発明の方法はまた、心臓に関連した状態（例えば、心臓性
ショック、急性心筋梗塞および鬱血性心不全）の処置に使用され得る。本発明は
、慢性心臓疾患および/または心筋肥大を抑制するため、心筋梗塞の経験を有す
る患者の処置に対する特定の適用を有する。心臓疾患を処置する場合、レチノイ
ドは、好ましくは、構造D(xxiv)-D(xxxiv)およびD(xxxvi)-D(xxxx)から選択され
る。もっとも好ましくは、レチノイドは、構造D(xxxvii)である。
本発明はまた、増大したレベルのエンドセリン-1の存在と関連することが公知
である疾患から特定の疾患を除外することにより特徴付けられ得る。例えば、１
つの実施態様において、本発明は、適切なレチノイドを投与することにより、増
加したレベルのエンドセリン-1の存在と関連する、ガンおよび心臓疾患以外の疾
患の処置方法を提供する。好ましい実施態様において、ガンまたは心臓疾患以外
の疾患を処置するために本発明の方法を用いる場合、レチノイドは、好ましくは
、構造D(i)-D(xxii)およびD(xxxv)から選択される。別の実施態様において、ガ
ンまたは心臓疾患以外の疾患を処置するために本発明を用いる場合、レチノイ
ドは、構造D(xxiv)-D(xxxiv)およびD(xxxvi)-D(xxxx)から、好ましくは、選択さ
れる。
別の特に適切な実施態様において、レチノイドは、上記の構造A(ii)を有し、
ここでR7はアダマンチル、R8はアルコキシ（好ましくはメトキシ）、R9は水素、
R1は構造C(ii)（ここでR3はカルボニル、およびR4はヘテロ原子（好ましくは硫
黄））、ならびにR11は、構造B(i)（ここでCOOHはパラ位にある）であり、ここ
のような実施態様は、特に心臓疾患、前立腺ガン、卵巣ガン、および/または乳
ガンの処置に適切である。
本発明のレチノイドは、ET-1を産生する任意の被験体に投与され得る。被験体
は、哺乳動物であり得、そしてもっとも好ましくは、ヒトである。本発明のこれ
らの使用および他の使用は、当業者にとって明らかである。
本発明の化合物は、薬学的に受容可能なキャリアに関連する１つ以上の化合物
より構成される薬学的組成物に、都合よく処方され得る。例えば、Remington's
Pharmaceutical Sciences(74)を参照のこと。これは、代表的なキャリアおよび
、本発明の化合物の処方物の調製に関連して用いられ得る薬学的組成物の調製の
従来の方法を開示し、本明細書において参考として援用される。
経口投与が好ましいが、化合物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に
）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、局所的に、経皮的になどで、投与さ
れ得る。投与される活性化合物の量は、当然、処置される被験体、被験体の重量
、投与の様式および処方する医師の判断に依存する。しかし、一般的に、投薬量
は、レチノイン酸の投与について代表的である量に近似であり、好ましくはヒト
について約0.5μg/kg/日〜60mg/kg/日であり、ヒトについてさらにより好ましく
は約2.0μg/kg/日〜30mg/kg/日の範囲である。正確な投薬量は、レチノイドを投
与する臨床医によって決定され、所定の被験体についてのバイオアベイラビリテ
ィー、毒性症状の存在または不在、および他の副作用に基づき最適化される。こ
のような毒性症状および副作用としては、悪心、骨成長に対する副作用；催奇形
性、頭痛、皮膚発疹などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
レチノイドは、疾患の症状または疼痛関連状態が鎮静するかまたは減少するま
で被験体に治療的に投与され得るか、あるいは、レチノイドは予防的に延長した
不定期間投与され得、例えば、慢性心臓疾患を予防し得る。疾患または疼痛関連
状態の処置においてレチノイドの効力を測定する場合、臨床医によってモニター
され得る種々の臨床的パラメーターとしては、全体的症候の減少（例えば、痛覚
の低下；運動機能または運動性の増加；全体としての状態の改善；重量または成
長速度の変化）；血漿または血清中のET-1レベルの減少；特異的腫瘍マーカー（
例えば、前立腺血清抗原）のレベルの減少；腫瘍サイズの縮小などが挙げられ得
るが、これらに限定されない。これらのパラメーターは、当該分野で周知のプロ
トコルに従い、モニターされ、測定される。
増加したET-1レベルにより生じる疾患または疼痛関連状態の処置または予防に
おける、本発明のレチノイドの効力を試験するための適切なモデルとしては、腫
瘍増殖および悪性腫瘍により生じる死亡率についての動物モデル、ならびに急性
および慢性心臓疾患についての動物モデルが挙げられる。例えば、Sakaiら（74
）のラットモデル（急性心筋梗塞が誘導される）は、これらの動物における心臓
血管組織に対する本発明の化合物の影響の研究に用いられ得る。別の例として、
ガンの動物モデルを本発明において使用し得る。例えば、腫瘍増殖が確立された
動物モデルは、本発明のレチノイドの投与による腫瘍サイズの減少についてアッ
セイされ得るか、または悪性腫瘍細胞はレチノイドが投与された動物に導入され
得、動物における悪性腫瘍細胞の生存または確立についてのアッセイが行われ得
る。
さらに、本発明のレチノイドは、ガンおよび上昇したET-1レベルにより生じる
他の疾患または疼痛関連状態を有するヒト被験体に投与され得る。例えば、本発
明の化合物は、前立腺ガンについて診断されるヒト患者に投与され得る（51）。
これらの患者におけるレチノイドの効力は、前立腺血清抗原レベル；ET-1の血清
または血漿レベル、腫瘍サイズの縮小、重量の減少または獲得などのような臨床
パラメーターをアッセイすることによりモニターされ得る。このような患者はま
た、本発明のレチノイドの投与の疼痛減少効果を評価するために、適切な被験体
である。この評価は、前立腺ガン患者（特にガンの後期段階の）は、骨疼痛の有
意な程度を経験し、一般的に、これは従来の鎮痛治療では、軽減され得ないこと
に基づく。従って、本発明の化合物の前立腺ガン患者での疼痛減少における効力
はまた、痛覚を評価する当該分野で公知の標準的な方法により測定され得る。
投与の意図される様態に依存し、薬学的組成物は、固形、半固形または液体投
薬形態（例えば、錠剤、坐薬、丸薬、カプセル、粉末、液体、懸濁液、ローショ
ン、クリーム、ゲルなど）の形態であり得、好ましくは、正確な投薬量の単独投
与に適切な単位投薬形態であり得る。組成物は、上記のように、薬学的に受容可
能なキャリアと組み合わせられた選択された薬物の有効量を含み、それに加えて
、他の薬用薬物、医薬品薬物、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る
。
固形組成物において、通常の非毒性固形キャリアとしては、例えば、製薬等級
のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナト
リウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げ
られる。液体の薬学的投与可能組成物は、例えば、本明細書記載の活性化合物お
よび任意の賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロー
ル、エタノールなど）中の薬学的アジュバントを、溶解すること、分散すること
などにより調製され得、これにより溶液または懸濁液を形成し得る。所望される
場合、投与されるべき薬学的組成物はまた、少量の非毒性の補助的物質（例えば
、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤など）、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸
ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノール
アミンなどの少量を含み得る。このような投薬形態を調製する実際の方法は、当
業者にとって公知または明らかである。例えば、Remlngton's Pharmaceutical S
ciences(73)を参照のこと。
経口投与のために、微粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤、および/または界
面活性剤を含み得、水中またはシロップ中、乾燥状態におけるカプセル中または
サシェ(sachet)中、あるいは懸濁剤が含まれ得る非水性溶液中または懸濁液中、
結合剤と潤滑剤が含まれ得る錠剤中、あるいは水またはシロップ中の懸濁液中に
存在し得る。所望される場合または必要とされる場合、香味料、保存剤、懸濁剤
、増粘剤(thickening agent)、または乳化剤が、含まれ得る。錠剤および顆粒は
、経口投与形態に好ましく、これらはコーティングされ得る。
用いられる場合、非経口的投与は、一般的に、注入により特徴付けられる。注
入可能物は、従来の形態（液体溶液または懸濁液、注入の前の液体中の溶液また
は懸濁液に適切な固体形態、あるいは乳濁液としてのいずれか）で調製され得る
。より近年、修正された非経口的投与のためのアプローチは、低速放出系または
持続放出系の使用を含み、これにより一定レベルの投薬量が維持される。例えば
、米国特許第3,710,795号を参照のこと（これは、本明細書において参考として
援用される）。
局所的な投与のために、液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなどが、
活性化合物が皮膚表面に送達され得る限り、使用され得る。
本願の全体に渡り、種々の刊行物が列挙されるかまたは参照される。これら刊
行物のその全体としての開示は、本発明の属する最新技術をより十分に記載する
ために、本願における参考として本明細書において援用される。
本発明は、本発明の特定の実施態様の具体的な詳細に対する参考文献を用いて
記載されてきたが、このような詳説は、本発明の範囲の限定とみなされないこと
が、意図される。当業者にとって、本発明の範囲または精神を逸脱することなく
種々の修飾および改変が本発明においてなされ得ることは、明らかである。本発
明の他の実施態様は、本明細書において開示する明細書および本発明の実施の考
慮により、当業者に明らかである。明細書および実施例は、例示のみとして考慮
されることを意図し、本発明の真の範囲および精神は、以下の請求の範囲によっ
て示される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Retinoid-related molecules for inhibition of endothelin-1 overproduction in disease
Approval
The present invention is an approved CA55681 awarded by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health.
It was originally supported by the government. The government has certain rights in the invention.
Field of the invention
The present invention is generally directed to potent inhibitors of endothelin-1 messenger RNA transcription.
And thus retinoid molecules capable of inhibiting the production of endothelin-1.
The present invention relates to various diseases related to the presence and production of increased levels of endothelin-1.
Suitable for treating pain and for treating pain with increased levels of endothelin-1.
Having
Background of the Invention
Endothelin-1 (ET-1) is a polypeptide with very strong vasoconstrictor activity
There is (38). However, elevated plasma ET-1 levels are associated with various diseases, including:
It is also known to be found in (39-50): systemic sclerosis, Kawasaki disease,
Cardiac shock, acute myocardial infarction, progressive atherosclerosis, progressive prostate cancer,
Localized prostate cancer, endothelial species, pulmonary hypertension, sepsis, congestive heart failure, and liver
Renal syndrome.
ET-1 not only functions as a vasoconstrictor, but also, for example, alone or in the prostate
As a growth factor, in combination with other hormones and peptides as in cancer
It has been discovered that it also has other functions that work (51). In addition, ET-1
Soraphotoxin, a painful and lethal part in the venom of certain snakes of the genus Ractapsis
sorafotoxin) (52, 53). Like the venom of the snake bite,
Recombinant ET-1 reports severe pain in humans after high-dose local injection
(54). Thus, for example, in prostate cancer, produced by cancer cells
Localized high levels of ET-1 are a major inducer of severe pain associated with the late stages of the disease
It seems to be the cause. Therefore, molecules that prevent or inhibit the production of ET-1
For the treatment of all overproduced diseases, and also for the production or overproduction of ET-1
Can be expected to be useful in situations that induce pain.
Regulates cell differentiation by modulating gene expression and thus neoplasia of cells
Retinoids that can reverse preneoplastic transformation are useful for treating and predicting cancer.
It has excellent potential as a therapeutic agent for prevention (58, 59). Retinoids, especially retic
Noroic acid (RA) analogs are useful in leukemias, mycosis fungoides, basal cell carcinomas, psoriasis and other
It has been used in the treatment of skin hyperproliferative disorders (60). Increasing amount of data (
1 to 5) show that retinoids (vitamin A derivatives and their synthetic analogs) grow
It suggests promising new therapeutics for sexually transmitted diseases.
However, the systemic side effects of these compounds and their teratogenicity are
Limit their usefulness. Side effects include, for example, bone remodeling, palmoplantar detachment (palmoplantar
peeling), dermatitis, alopecia, hepatotoxicity and systemic toxicity (61, 62).
Therefore, the mechanisms by which retinoids function may provide useful activity in an undesired manner.
Attracts great interest, with the purpose of separating from the
Retinoids have been synthesized (6). However, details of the mechanism of retinoid activity
Lack of understanding has led to the development in the development of retinoids for clinical use,
Has been hindered. More recent advances made in molecular analysis of their response pathways
And the observation of receptors and pathway-selective compounds that can be defined (7-10)
Retinoids with low biological activity-and thus reduced side effects-could be designed
The performance has been greatly improved.
Surprisingly, a class of retinoid compounds that inhibit ET-1 expression has been identified.
Have been. This class of retinoids includes all-trans retinoic acid (tRA) and 9-cis
It contains a very large number of small molecules structurally related to tinoleic acid (9-cisRA). Retinoi
The compounds are useful in treating diseases or pain associated with overproduction of ET-1. Other records
Unlike tinoids, the retinoid molecules of the present invention have reduced side effects,
F9 teratocarcinoma cells (ATCC accession number CRL 1720) and S19 pluripotent teratocarcinoma cells (ATCC accession number)
No. CRL 1825) with their reduced ability or inability to induce differentiation.
Correlate.
Summary of the Invention
In one embodiment, the invention provides a method of inhibiting ET-1 in a subject
This involves administering to the subject an ET-1 inhibiting amount of a suitable retinoid.
In another embodiment, the invention relates to the presence of increased levels of ET-1 in the subject.
Provide a method of treating a disease associated with
Administering the id.
In a further embodiment, the present invention relates to a method for increasing the level of ET-1 in a subject.
Provide a method of treating the pain associated with presence, which provides a subject with an appropriate level of ET-1 inhibition.
Administering a tinoid.
Further advantages of the invention are set forth in part in the description which follows, and
Sections will be apparent from the description or may be learned by practice of the invention. Of the present invention
The advantages are particularly attributable to the elements and combinations pointed out in the appended claims.
Understood and achieved. Both the above general description and the following detailed description
Is intended to be exemplary and explanatory only, and to limit the invention as claimed.
It should be understood that this is not a limitation.
Detailed description
The present invention refers to the following detailed description of the preferred embodiments of the present invention.
By doing so, it can be more easily understood.
Before the compounds, compositions and methods of the present invention are disclosed and described,
Ming is in a particular synthetic method, in a particular pharmaceutical carrier, or in a particular pharmaceutical formulation.
Or the dosing regimen is, of course, unlimited, as may vary.
Should be understood. The terminology used herein describes particular embodiments.
I also understand that it is only for the purpose of description and is not intended to be limiting
It should be.
As used in this specification and the appended claims, the singular forms "a", "a
n "and" the ", unless the context clearly dictates otherwise
It should be noted that it includes plural indicators. Thus, for example,
The term "aromatic compound" includes a mixture of aromatic compounds, and the term "pharmaceutical carrier"
And a mixture of two or more such carriers.
In this specification and in the claims that follow, reference will be made to a number of terms.
, They are defined as having the following meaning:
As used herein, the term "alkyl" refers to methyl, ethyl, n-propyl.
Propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, octyl, decyl,
1-24, such as tetradecyl, hexadecyl, eicosyl, tetracosyl, etc.
Represents a branched or unbranched saturated hydrocarbon group containing carbon atoms. Book
Preferred alkyl groups herein contain 1 to 12 carbon atoms. The term "lower al
"Kill" includes 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms,
Even more preferably, it refers to an alkyl group containing 1-2 carbon atoms. the term"
“Cycloalkyl” is a cyclic alkyl having 3 to 8, preferably 5 to 6, carbon atoms.
Means a kill group.
As used herein, the term “alkoxy” refers to a single terminal ether
An alkyl group attached through a linkage is meant; that is, an "alkoxy" group is
May be defined as -OR, where R is alkyl as defined above. "Low
“Alkoxy” groups are alkyl groups containing one to six, more preferably one to four, carbon atoms.
It means a coxy group.
As used herein, the term “alkylene” refers to 1 to 24 carbon atoms
A bifunctional branched or unbranched saturated hydrocarbon chain containing
Then, for example, methylene (-CHTwo-), Ethylene (-CHTwo-CHTwo-), Propylene (-CHTwo-CHTwo-CHTwo
-), 2-methylpropylene [-CHTwo-CH (CHThree) -CHTwo-], Hexylene [-(CHTwo)6-]
No. "Lower alkylene" contains 1 to 6, more preferably 1 to 4 carbon atoms
Shows an alkylene group. As used herein, the term "cycloalkylene
"Represents a cyclic alkylene group, typically a 5- or 6-membered ring.
As used herein, the term "alkene" contains from 2 to 24 carbon atoms.
A mono- or di-unsaturated hydrocarbon group. Suitable within the scope of this class
The groups contain 2 to 12 carbon atoms. Asymmetric structures such as (AB) C = C (CD) have E and
And Z isomers. This is shown in the structural formula in the present specification.
Where an asymmetric alkene is present, or
It can be explicitly indicated by the symbol =.
As used herein, the term "alkyne" refers to the general formula CnH2n-2, And
Monounsaturated or divalent containing 2 to 24 carbon atoms having a structural formula containing
It means an unsaturated hydrocarbon group. Preferred groups within this class include 2-12 carbons
Contains hydrogen chloride.
The term “aryl” includes any compound derived from an aromatic hydrocarbon and includes
For example, benzene and naphthalene, and pyridine, furan, and
Contains heteroaryls such as rolls.
As used herein, the term "heteroatom" refers to sulfur, oxygen, or
Represents nitrogen, and preferably sulfur or oxygen. As used herein
As such, the prefix "hetero-" occurs in place of a carbon atom in a structural unit.
2 shows compounds having at least one heteroatom. For example, heteroaryl
Represents an aryl group having a hetero atom in the aryl ring.
The term "Me" is an abbreviation for methyl. “Ac” is an abbreviation for acetyl
You. "Ad" is an abbreviation for Adamantyl.
A "radical having two binding sites" is defined as the other two moieties through a covalent bond.
But with another suitable moiety (s) in isolation.
To bond, the bond between the moiety is broken, and two unpaired electrons are
Shows parts that appear to be obtained at different locations of Therefore, "two
The group having a binding site of, for example, includes a divalent radical.
"Skeleton" is used to indicate "a group having two binding sites,"
Means the shortest contiguous chain of carbon atoms between the two attachment sites for the group, where
Carbon atoms in such chains are replaced by heteroatoms or aryl moieties.
obtain.
"A linkage by aryl or heteroaryl condensation" is defined as two aryl or two
A bond occurs along one side of each of the heteroaryl moieties. Therefore,
Bonds by aryl condensation include naphthyl bonds.
Diseases associated with the presence of increased or elevated levels of ET-1 are increased or
Any disease caused by the presence of elevated levels of ET-1, as well as
Includes any disease that causes overproduction. As used herein, ET-1
"Increased or elevated level" is measured by protocols well known in the art.
Greater than the normal level of ET-1 for the subject, as
Mean level of ET-1; ie normal levels of ET-1 are disease or painful
It is present in subjects where the condition is not present. For example, human subjects
Normal plasma levels of ET-1 in Nelson et al. Are described (51). Also in this specification
As used in, `` over-produced '' or `` over-produced '' ET-1 of ET-1
Than normally produced in a subject in the absence of a disease or painful condition
Refers to the production of ET-1 in a subject in large amounts.
"As needed" or "as needed" means an event that follows
Or the situation may or may not occur, and the description indicates that
Or cases where a situation occurs and cases where it does not. For example
The phrase "optionally substituted lower alkyl" refers to a lower alkyl group substituted
Or unsubstituted, and the description is unsubstituted lower alkyl and
And substitution includes both lower alkyls where present.
As provided herein, the term "effective amount" of a compound is nontoxic,
Sufficient amount of the compound to provide the desired modulation of gene expression or other activity.
means. As pointed out below, the exact amount required will vary
The species, age, and general condition of the subject being altered, the severity of the disease being treated
The particular compound used, its mode of administration, and the like. Therefore, the exact
It is impossible to specify "effective amount". However, an appropriate effective amount is
It can only be determined by one of ordinary skill in the art using appropriate experimental methods.
"Pharmaceutically acceptable" is non-biological or otherwise desirable
Means a material that is not lost, i.e., the material has any undesired biological effects.
Or any other ingredient of the pharmaceutical composition in which the material is included.
To the individual with the selected compound without interacting in a deleterious manner.
Can be given.
The “expression”, “modulation” or “modulation” of selective gene expression is when a compound is
Mechanism (eg, ligand binds to receptor in retinoic acid family)
Can act as an activator or antagonist of gene expression.
Intended to taste.
In order to achieve the advantages and according to the objects of the present invention, it is embodied herein.
As described and broadly described, the present invention provides, in a first embodiment, a subject
A method of inhibiting endothelin-1 in a subject, which provides the subject with an appropriate amount of ET-1 inhibition.
Administering a sharp retinoid. Suitable retinoids of the present invention are
Via the lurate receptor RARα, β, or γ, or RXRα, β, or γ
It works by combining. Suitable retinoid molecules of this class are ET-1
Contains a potent inhibitor of sender RNA transcription, which effectively enhances ET-1 production
Inhibit. However, these molecules are well known for typical retinoids.
Do not possess typical activities, especially the ability to induce differentiation in a variety of cell lines.
No. In particular, suitable retinoids of the invention include 10-6F9 malformed cancer at concentrations below M
Cannot induce differentiation in cells and / or P19 pluripotent teratocarcinoma cells. Further
In addition, suitable retinoids of the present invention do not exhibit typical retinoid toxicity in vivo.
Therefore, it is well tolerated in mammals and humans.
Suitable retinoids use a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay.
Screening for inhibition of ET-1 messenger RNA (mRNA) transcription
Can be RNA is present in the absence or presence of the retinoid molecule to be tested.
Isolated from cells grown in culture. Cells should test for ET-1 expression
Vascular cells, cardiomyocytes, and prostate cancer cells,
And any cell type in which ET-1 is produced. RNA isolation
Can follow procedures well known in the art or use commercially available kits.
Done by The isolated RNA is then treated with reverse transcriptase, DNA polymerase,
Buffer and upstream and downstream primers specific for the ET-1 gene sequence
Is also incubated. For example, a Promega trial containing all these components
A drug kit may be used. As a control, a retinoid like GAPDH
Specific primers for housekeeping genes not regulated by activity
Use
Thus, the same reaction can be performed. The RT-PCR reaction is performed using procedures well known in the art.
It takes place in the Marcycler. Then, the amplified DNA sample is 2% agarose
Loaded on a gel and analyzed for inhibition of ET-1 mRNA transcription.
Retinoids that inhibit ET-1 mRNA transcription are also specific retinoids suitable for the present invention.
To identify the key, the assay can be used to determine the degree of induction of cell differentiation. First
As noted, suitable retinoids are 10-6At concentrations below M, F9 teratocarcinoma cells and
And / or cannot induce differentiation in P19 pluripotent teratocarcinoma cells. The present invention
This cell differentiation-inducing activity of tinoids is dependent on F9 teratocarcinoma cells and / or
Assays are conveniently performed on sex teratocarcinoma cells, where differentiation is
Compared to the differentiation-inducing activity of noric acid, is it not induced by the retinoids of the present invention?
, Or only marginally induced. Differentiation-inducing activity was measured for compound (10-6M
(At the following concentrations) by examining the cells for morphological changes.
Can be measured (55). Alternatively, the differentiation-inducing activity is exerted on F9 and / or P19 cells.
Of the present invention, on the assumption that the induction of differentiation in
Measuring inhibition of F9 and / or P19 cell proliferation upon exposure to retinoids
And can be assayed by: Promega or other manufacturer to measure cell proliferation
A standard colorimetric assay kit (MTT or MTS) from the manufacturer can be used.
Suitable retinoids of the present invention are hereinbelow sometimes referred to as compounds of the present invention.
Referred to. The compounds of the invention may be used in at least one or more specific cell types.
, Is a potent inhibitor of ET-1 mRNA transcription. ET-1 by these retinoids
Inhibition of transcription results in a decrease in the concentration of the ET-1 peptide, which is
In certain diseases or in the relief of pain from elevated ET-1 levels
Has an effect. The compounds of the present invention have already been described as AP-1 selective retinoids.
Certain known structural entities (55), and already reported as RXR selective compounds
(56, 57), provided that these compounds have ET-1 inhibitory activity.
Has the property. Furthermore, suitable retinoids have been reported for their selectivity to date.
Absent molecules, which are discussed herein.
Particularly suitable retinoid compounds include compounds of the following structures A (i) -A (ii):
Where: (a) R11Is a compound of the following structures B (i) -B (iv):
(b) R1Is a group having two binding sites, wherein the linkage is through a single covalent bond.
Or by aryl or heteroaryl condensation, that of two binding sites
(C) RTwo, RThree, RFour, RFive, And RTenAre independently identical
Or a different lower alkyl, and (d) R6Is hydrogen or methyl; (e) R7, R8
, And R9Is hydrogen, hydroxy, lower alkoxy, alkyl, or adaman
Chill, and (f) X and Y are independently heteroatoms. In this specification
La
Represents a bond or a double bond. Used above and throughout the application and claims.
Suitable retinoid compounds also include salts, amides, and esters of the foregoing compounds.
including. In certain embodiments of the invention, R11In formula B (i) for
It is in the para position. In another specific embodiment, R11COO in formula B (iii) for
H is in second place.
Preferably, R1Is 1-5, preferably 1-3 carbon atoms, heteroatoms,
And / or hydrocarbon or heterohydrocarbon having an aryl moiety in its skeleton
But there is no more than one aryl moiety in the backbone.
R1Is also preferably (a) a heteroatom, methyl, methylhydrido
Roxy, carbonyl, imine, heteroaryl, or double or single bond
Divalent methyl substituted with lower alkyl or methylaryl through (b)
Compounds of formula C (i) below:
Where R1And RTwoAre methyl or heteroatoms, optionally joined together
Combine to form a 3-, 5-, or 6-membered cycloaliphatic or heterocycloaliphatic ring
Or (c) a compound of formula C (ii):
Where RThreeIs a heteroatom, methyl, methylhydroxy, carbonyl, imine,
Teloaryl, lower alkyl or methyl group through a double or single bond
A divalent methyl substituted by reel; and RFourIs a heteroatom, carbonyl,
Methoxycarbonyl, ethene, methoxy, acetylene, aryl, or carbo
Nylamine.
In yet another embodiment of the present invention, R1Is in formulas C (iii) to C (xxiv)
Here are the parts selected:
R12And R13Are preferably each independently a lower alkyl, and
More preferably, X is independently methyl and X and Y are each independently
It is a terrorist atom.
The portion represented by C (iii) to C (xxiv) is a group having two binding sites
Where the bond is a single covalent bond or an aryl or hetero
Reel condensation can occur independently at each of the two binding sites. Join
The site is represented by a wavy line, and in a structure having only one wavy line,
The position is along one side of the terminal aryl group. For example, in structure C (xxii):
There is one bond site represented by one wavy line and an aryl group,
To form a bond by aryl condensation.
Particularly suitable retinoids also include compounds of the following structures D (i) through D (xxxx)
Can see: In the above structure D, the bond symbols-and = represent a lower alkyl group, preferably
Represents a bond terminated by methyl.
The present invention also provides pharmaceutically acceptable non-pharmaceutically acceptable compounds of the present invention that include a carboxylic acid moiety.
Includes toxic ester, amide, and salt derivatives.
Pharmaceutically acceptable salts are prepared by treating the free acid with an appropriate amount of a pharmaceutically acceptable base.
It is prepared by processing. Representative pharmaceutically acceptable bases are
Monium, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, calcium hydroxide
, Magnesium hydroxide, iron (II) hydroxide, zinc hydroxide, copper hydroxide, aluminum hydroxide
Minium, iron (III) hydroxide, isopropylamine, trimethylamine, diethyl
Amine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, 2-dimethyl
Ruaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, lysine, arginine, hiss
Such as thidine. The reaction is carried out at a temperature of about 0 ° C. to about 100 ° C., preferably at room temperature, with water
In water alone or in combination with an inert (a water-miscible organic solvent). Retic
The molar ratio of theoid to the base used provides the desired ratio for any particular salt
To be selected. For example, prepare the ammonium salt of the starting material, which is the free acid
The starting material is treated with approximately one equivalent of a pharmaceutically acceptable base to give a neutral
Can be produced. When calcium salts are prepared, approximately 1/2 molar equivalent of base is used.
To produce neutral salts, while for ammonium salts, approximately 1/3 molar equivalent
An amount of base is used.
Ester derivatives are typically prepared as precursors to the acid form of the compound,
Therefore, it can work as a prodrug. Generally, these derivatives are methyl, ethyl
And lower alkyl esters such as Amide derivative-(CO) NHTwo,-(CO
) NHR, and-(CO) NRTwo(Where R is lower alkyl)
Can be prepared by reacting a reactive derivative of the compound with ammonia or a substituted amine.
You.
The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
A composition is provided. Preferred are therapeutic amounts of the compounds of the invention and pharmaceutically
A pharmaceutical composition for inhibiting ET-1 mRNA transcription, comprising an acceptable carrier.
You.Synthesis method:
The compounds of the present invention can be prepared using techniques commonly known to synthetic organic chemists.
It can be easily synthesized. Generally suitable experimental for synthesizing and deriving compounds
Methods are described (see, for example, references 63-72, the disclosures of which are incorporated by reference.
Hereby incorporated by reference).Usefulness and administration:
Compounds of the present invention (pharmacologically acceptable esters, amides or salts thereof)
Is useful in many intended applications. Compounds and Methods of the Invention
The main use for is the prevention of various diseases, including pain associated with various diseases
And in treatment. Such diseases include, for example, systemic sclerosis,
Kawasaki disease, cardiac shock, acute myocardial infarction, progressive atherosclerosis, progressive prostate
Adenocarcinoma, localized prostate cancer, hemangioendothelioma, pulmonary hypertension, sepsis, congestive heart failure and
And hepatorenal syndrome. Another use of the retinoids of the present invention is for increased
In the treatment of pain associated with the presence of Bell ET-1.
The compounds and methods of the present invention also provide therapeutics that can be administered to inhibit ET-1 expression.
Enables identification of therapeutic compounds. Specifically, the present invention relates to the activity of inhibiting ET-1 production.
A method of screening for retinoids, comprising the steps of:
Contacting the cells with ET-1 producing cells and assaying the cells for ET-1 production
ET-1 production compared to ET-1 producing cells that do not contact the retinoid
A decrease in is indicative of a retinoid having activity to inhibit ET-1 production. ET-1 production is
Determine the amount of ET-1 secreted into the cell culture supernatant according to the protocol standard in the field.
And ET transcribed by RT-PCR as described herein
It can be assayed by assaying the amount of -1 mRNA.
The invention further has a disease or pain-related condition caused by ET-1 overexpression
Provided is a method of identifying a retinoid suitable for treating a subject, the method comprising:
Contacting the cells with ET-1 producing cells, and assaying the cells for ET-1 production.
Cells that differentiate retinoids in the presence of retinoids (eg, F9 teratocarcinoma cells)
And Sl9 teratocarcinoma pluripotent cells) and contacting the cells for differentiation
Assay, where ET-1 producing cells are not contacted with retinoids
Decreased production of ET-1 and the inability to induce differentiation of cells that differentiate in the presence of retinoids
Suitable for treating a subject having a disease or pain-related condition caused by ET-1 overexpression.
Indicates a sharp retinoid. As noted above, ET-1 production is a protocol standard in the art.
By measuring the amount of ET-1 secreted into the cell culture supernatant according to
Assess the amount of ET-1 mRNA transcribed by RT-PCR as described herein.
By doing so, it can be assayed. In cells that differentiate in the presence of retinoids
Inability to induce retinoid differentiation can be attributed to differentiation and / or enhancement described herein.
Can be determined by a proliferation assay.
Thereby, various diseases and pain-related conditions can be realized by the method of the present invention.
Compound, particularly a compound associated with the presence or expression of increased ET-1 levels.
Can be treated with the identified retinoids. Inhibition of ET-1 mRNA transcription
This results in reduced levels of the peptide. This decrease is due to the aforementioned diseases in which ET-1 is overproduced.
It has a beneficial effect on the disease or pain state.
There are several specific embodiments of the present invention related to the particular disease to be mentioned.
Exist. For example, when treating prostate cancer, preferably the structures D (i) -D (xxii) and
And a retinoid selected from D (xxxv). Still more preferably, the structure
Retices selected from D (i) -D (v), D (vii), D (xiv), D (xix) -D (xxi) and D (xxv)
Noids are used. Still more preferably, a retinoid of structure D (xxxvii)
Is used.
For the treatment of ovarian cancer, the retinoids are preferably of the structure D (i) -D (xxi) and D
(xxxv), and even more preferably, the structures D (i) -D (v), D (vii), D (xiv), D
(xix) -Selected from D (xxi) and D (xxv). Retinoi when treating breast cancer
Is preferably selected from the structures D (i) -D (xiv), D (xvi) -D (xxi) and D (xxxv).
And even more preferably the structures D (i) -D (v), D (vii), D (xiv), D (xix) -D (xxi) and
And D (xxv), and even more preferably, the structure D (xxxvii).
As noted above, the methods of the present invention also provide for conditions associated with the heart (eg, cardiac
Shock, acute myocardial infarction and congestive heart failure). The present invention
Experience myocardial infarction to control chronic heart disease and / or myocardial hypertrophy
Have particular application to the treatment of patients. When treating heart disease, retinoi
Is preferably selected from the structures D (xxiv) -D (xxxiv) and D (xxxvi) -D (xxxx).
You. Most preferably, the retinoid is of structure D (xxxvii).
The present invention is also known to be associated with the presence of increased levels of endothelin-1.
Can be characterized by excluding certain diseases from those that are. For example, 1
In one embodiment, the present invention provides for increasing the dose by administering an appropriate retinoid.
Disease other than cancer and heart disease associated with the presence of added levels of endothelin-1
Methods for treating a disease are provided. In a preferred embodiment, other than cancer or heart disease
When using the method of the invention to treat a disease of the present invention, the retinoid is preferably
, Structures D (i) -D (xxii) and D (xxxv). In another embodiment,
When using the present invention to treat diseases other than heart disease or heart disease,
Is preferably selected from the structures D (xxiv) -D (xxxiv) and D (xxxvi) -D (xxxx).
It is.
In another particularly suitable embodiment, the retinoid has the structure A (ii) above,
Where R7Is Adamantill, R8Is alkoxy (preferably methoxy), R9Is hydrogen,
R1Is the structure C (ii) (where RThreeIs carbonyl, and RFourIs a heteroatom (preferably sulfur
Yellow)), and R11Is the structure B (i) (where COOH is in the para position), where
Such embodiments are particularly useful for heart disease, prostate cancer, ovarian cancer, and / or breast cancer.
Suitable for treatment of cancer.
The retinoids of the present invention can be administered to any subject that produces ET-1. Subject
Can be a mammal, and most preferably a human. This of the present invention
These and other uses will be apparent to those skilled in the art.
The compounds of the present invention may comprise one or more compounds associated with a pharmaceutically acceptable carrier
May be conveniently formulated into a pharmaceutical composition comprising the same. For example, Remington 's
See Pharmaceutical Sciences (74). This is a typical career and
Preparation of pharmaceutical compositions that can be used in connection with the preparation of formulations of the compounds of the present invention.
Conventional methods are disclosed and are incorporated herein by reference.
Oral administration is preferred, but the compound may be administered orally, parenterally (eg, intravenously).
), Administered intramuscularly, intraperitoneally, topically, transdermally, etc.
Can be The amount of active compound administered will, of course, be dependent on the subject being treated, on the subject's weight.
Depends on the mode of administration and the judgment of the prescribing physician. But in general, the dosage
Is close to the amount that is typical for administration of retinoic acid, and is preferably
About 0.5 μg / kg / day to 60 mg / kg / day, even more preferred for humans
Ranges from about 2.0 μg / kg / day to 30 mg / kg / day. Precise dosages can be controlled by retinoid injection
Bioavailability for a given subject, as determined by the administering clinician
Optimized based on the presence or absence of toxic symptoms and other side effects. This
Toxic symptoms and side effects such as nausea, side effects on bone growth;
Sex, headache, skin rash, and the like, but are not limited thereto.
Retinoids may be present until the symptoms of the disease or pain related condition have subsided or diminished.
Can be administered therapeutically to subjects, or retinoids have been prophylactically prolonged
It can be administered for an indefinite period of time, for example, to prevent chronic heart disease. Disease or pain related
Monitor by a clinician when measuring retinoid efficacy in the treatment of a condition
Various clinical parameters that can be assessed include reduction in overall symptoms (eg, pain sensation).
Decrease in motor function or motility; improvement in overall condition;
Changes in plasma or serum ET-1 levels; specific tumor markers (
For example, reduced levels of prostate serum antigens); reduced tumor size and the like.
But not limited to these. These parameters are well known in the art.
Monitored and measured according to protocol.
For the treatment or prevention of diseases or pain-related conditions caused by increased ET-1 levels
A suitable model for testing the efficacy of the retinoids of the invention in
Animal models for mortality caused by tumor growth and malignancy, and acute
And animal models for chronic heart disease. For example, Sakai et al. (74
) Rat model (in which acute myocardial infarction is induced)
It can be used to study the effects of the compounds of the invention on vascular tissue. As another example,
Animal models of cancer may be used in the present invention. For example, tumor growth was established
Animal models have been shown to reduce tumor size by administration of the retinoids of the invention.
Malignant tumor cells can be introduced into animals that have been treated with retinoids.
Assays can be performed for the survival or establishment of malignant cells in animals.
You.
Furthermore, the retinoids of the present invention are caused by cancer and elevated ET-1 levels
It can be administered to human subjects with other diseases or pain related conditions. For example,
The light compounds can be administered to human patients diagnosed for prostate cancer (51).
The efficacy of retinoids in these patients was based on prostate serum antigen levels;
Or clinical, such as plasma levels, tumor size reduction, weight loss or gain, etc.
It can be monitored by assaying the parameters. Such patients
In addition, in order to evaluate the pain reducing effect of administration of the retinoid of the present invention, a suitable subject
It is. This evaluation indicates that patients with prostate cancer, especially in the late stages of cancer, have bone pain.
Experience a significant degree, and generally this cannot be alleviated with conventional analgesic treatment
based on. Thus, the efficacy of compounds of the invention in reducing pain in prostate cancer patients
Can also be measured by standard methods known in the art for assessing pain sensation.
Depending on the intended mode of administration, the pharmaceutical composition may be solid, semi-solid or liquid.
Medication forms (eg, tablets, suppositories, pills, capsules, powders, liquids, suspensions, lotions
, Creams, gels, etc.), and is preferably a single dose of the correct dosage.
It may be in a unit dosage form suitable for administration. The composition may be pharmaceutically acceptable, as described above.
Contains an effective amount of the selected drug in combination with a capable carrier, plus
May contain other medicinal drugs, pharmaceutical drugs, carriers, adjuvants, diluents, etc.
.
In solid compositions, common non-toxic solid carriers include, for example, pharmaceutical grades.
Mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, saccharin nato
Lium, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate, etc.
Can be Liquid pharmaceutically administrable compositions include, for example, active compounds and active compounds described herein.
And any excipients such as water, saline, aqueous dextrose, glycerol
Dissolving or dispersing pharmaceutical adjuvants in
Etc., which may form a solution or suspension. Desired
If so, the pharmaceutical composition to be administered may also include small amounts of non-toxic auxiliary substances (eg,
, Wetting agents, emulsifiers, pH buffers, etc.), for example, sodium acetate, monolauric acid
Sorbitan, sodium triethanolamine acetate, triethanol oleate
It may contain small amounts such as amines. The actual method of preparing such dosage forms is described in
It is known or apparent to those skilled in the art. For example, Remlngton's Pharmaceutical S
See ciences (73).
For oral administration, fine powders or granules may be added as diluents, dispersants, and / or
May contain a surfactant, in water or in a syrup, in a capsule in the dry state or
In a sachet, or in a non-aqueous solution or suspension that may contain a suspending agent,
In tablets, which may contain binders and lubricants, or in suspension in water or syrup
Can exist. Flavoring agents, preservatives, suspending agents, if desired or necessary
, Thickening agents, or emulsifiers may be included. Tablets and granules
Preferred for oral dosage forms, which may be coated.
When used, parenteral administration is generally characterized by injection. note
Entries may be in conventional form (liquid solutions or suspensions, solutions or solutions in liquids prior to injection).
Can be prepared either in a solid form suitable for suspension, or as an emulsion)
. More recently, approaches for modified parenteral administration have been slow release systems or
It involves the use of a sustained release system whereby a constant level of dosage is maintained. For example
See U.S. Patent No. 3,710,795, which is incorporated herein by reference.
Incorporated).
For topical administration, liquids, suspensions, lotions, creams, gels, etc.
It can be used as long as the active compound can be delivered to the skin surface.
Throughout this application, various publications are listed or referenced. These publications
Its overall disclosure of a work more fully describes the state of the art to which this invention pertains.
For that reason, it is incorporated herein by reference in the present application.
The present invention is described herein using references to specific details of particular embodiments of the invention.
Although described, such details are not to be considered as limiting the scope of the present invention.
Is intended. For those skilled in the art, without departing from the scope or spirit of the invention
Obviously, various modifications and alterations can be made in the present invention. Departure
Other embodiments of the invention will be considered in light of the specification and practice of the invention disclosed herein.
It will be clear to a person skilled in the art by consideration. The specification and examples are considered as exemplary only
It is intended that the true scope and spirit of the invention be determined by the following claims.
Shown.
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 31/343 Ａ６１Ｋ 31/343
31/357 31/357
31/381 31/381
31/382 31/382
31/385 31/385
Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16
9/02 9/02
9/04 9/04
9/10 9/10
１０１ １０１
9/12 9/12
13/08 13/08
13/12 13/12
17/00 17/00
25/04 25/04
35/00 35/00
43/00 １１１ 43/00 １１１
Ｃ０７Ｄ 307/79 Ｃ０７Ｄ 307/79
317/30 317/30
319/06 319/06
// Ｃ０７Ｄ 333/40 333/40
333/54 333/54
339/06 339/06
339/08 339/08
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme court ゛ (Reference) A61K 31/343 A61K 31/343 31/357 31/357 31/381 31/381 31/382 31/382 31 / 385 31/385 A61P 1/16 A61P 1/16 9/02 9/02 9/04 9/04 9/10 9/10 101 101 9/12 9/12 13/08 13/08 13/12 13 / 12 17/00 17/00 25/04 25/04 35/00 35/00 43/00 111 43/00 111 C07D 307/79 C07D 307/79 317/30 317/30 319/06 319/06 // C07D 333/40 333/40 333/54 333/54 339/06 339/06 339/08 339/08 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB , GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG) AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU , AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO , RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW