JP2001522047A - 蛍光を増強する方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、蛍光の増強のための方法に関し、発蛍光団はテクスチャ付けた材料へ接続されている。この方法は、特に、約1μg/ml未満の濃度を有する分子が存在するか否かを望ましく判定される、法廷上のまたは医学上の診断アッセイの両方で使用できる。
Description
【0001】
本出願は、Zanzucchi による1997年10月31日に出願された米国特許出
願第08/961,860号の優先権を主張する。
願第08/961,860号の優先権を主張する。
【0002】 本発明は、契約番号第N66001−96−C−8630の下で米国政府の援
助でなされたものである。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
助でなされたものである。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【0003】 本発明は分子同定の分野に関し、より詳細には、発蛍光団が、特に対象分子種
へ付着される場合、そのような蛍光団を増強するための方法の使用に関する。
へ付着される場合、そのような蛍光団を増強するための方法の使用に関する。
【0004】
臨床アッセイ用材料の量は、実行されるアッセイの種類、アッセイの効率、ア
ッセイでの化学的増幅度等に依存して、6から12桁の大きさにわたり変化し得
る。例えば、当該技術分野で既知の、従来からのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応
)法を使用して配列が増幅されるようになした、DNAの特定配列に対する臨床
アッセイでは、結果としての単位複製配列(すなわち、対象とする配列の生成さ
れた複製)の濃度範囲は、6桁以上変化し得る。対象とする配列が単一の複製で
ある場合、従来のPCRプロトコルを実行すると、約100万の複製を供給でき
、これは、200塩基対の単位複製配列長を仮定すると、約1ピコグラム(10 -12 g)となろう。対照的に、対象とする配列の大量複製は、増幅後には結果と して、1010から1012の複製、すなわち、ナノグラムからマイクログラムの増
幅されたDNAの量の結果となり得る。このように、種々のDNAアッセイは、
6桁以上にわたる材料の検出を必要とし得る。同様な問題は、抗原の広い濃度範
囲が、そのような臨床アッセイで一般的である場合の、免疫アッセイでの抗体検
出においても存在する。従がって、広範な用途をもつ感度の高い検出方法が必須
である。
ッセイでの化学的増幅度等に依存して、6から12桁の大きさにわたり変化し得
る。例えば、当該技術分野で既知の、従来からのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応
)法を使用して配列が増幅されるようになした、DNAの特定配列に対する臨床
アッセイでは、結果としての単位複製配列(すなわち、対象とする配列の生成さ
れた複製)の濃度範囲は、6桁以上変化し得る。対象とする配列が単一の複製で
ある場合、従来のPCRプロトコルを実行すると、約100万の複製を供給でき
、これは、200塩基対の単位複製配列長を仮定すると、約1ピコグラム(10 -12 g)となろう。対照的に、対象とする配列の大量複製は、増幅後には結果と して、1010から1012の複製、すなわち、ナノグラムからマイクログラムの増
幅されたDNAの量の結果となり得る。このように、種々のDNAアッセイは、
6桁以上にわたる材料の検出を必要とし得る。同様な問題は、抗原の広い濃度範
囲が、そのような臨床アッセイで一般的である場合の、免疫アッセイでの抗体検
出においても存在する。従がって、広範な用途をもつ感度の高い検出方法が必須
である。
【0005】 Kricka が Nonisotopic DNA Probe Techniques(アイソトープによらないDN
Aプローブ技術)(Academic Press, Inc., San Diego, CA. 1992) で概説してい
るように、DNAおよび他のアッセイ生成物を検出する、蛍光および光を媒介と
するまたは色生成法を含む、種々の非放射性の方法が存在するが、これらの方法
は、アイソトープの廃棄のコストと比較して相対的に廃棄コストが低いので、選
ばれることが多い。実際、上記PCRアッセイで、単位複製配列の、結果として
の広範囲な濃度により提起される問題をより良く解決するのはアイソトープの検
出法であるが、しかし、アイソトープ検出法の使用は、これら材料の輸送、貯蔵
、および廃棄に対する規制故に、禁止同様である。従がって、分析物の広範囲の
濃度を検出する、アイソトープによらぬ方法が望ましい。
Aプローブ技術)(Academic Press, Inc., San Diego, CA. 1992) で概説してい
るように、DNAおよび他のアッセイ生成物を検出する、蛍光および光を媒介と
するまたは色生成法を含む、種々の非放射性の方法が存在するが、これらの方法
は、アイソトープの廃棄のコストと比較して相対的に廃棄コストが低いので、選
ばれることが多い。実際、上記PCRアッセイで、単位複製配列の、結果として
の広範囲な濃度により提起される問題をより良く解決するのはアイソトープの検
出法であるが、しかし、アイソトープ検出法の使用は、これら材料の輸送、貯蔵
、および廃棄に対する規制故に、禁止同様である。従がって、分析物の広範囲の
濃度を検出する、アイソトープによらぬ方法が望ましい。
【0006】 そのようなアプローチの1つは、対象分析物へ選択的に付着され得る蛍光染料
の検出に拠るものである。蛍光検出は、発蛍光団(すなわち、蛍光染料)の濃度
、蛍光反応ソースとその検出器との間の経路長、発蛍光団の吸収率、入射レーザ
ー強度、および、発蛍光団の量子収率に依存する。発蛍光団でラベル付けされた
DNAの検出のような、生化学物質の蛍光によるそのような検出は、約フェムト
モルのDNA、すなわち略10-11グラムという検出下限に制限されるが、良く 知られている。そのような蛍光検出が、約アトモル(10-18モル)未満のDN A,例えば、略10-14グラム未満の濃度を有する、対象分析物の痕跡量までも の検出を提供することが望ましい。
の検出に拠るものである。蛍光検出は、発蛍光団(すなわち、蛍光染料)の濃度
、蛍光反応ソースとその検出器との間の経路長、発蛍光団の吸収率、入射レーザ
ー強度、および、発蛍光団の量子収率に依存する。発蛍光団でラベル付けされた
DNAの検出のような、生化学物質の蛍光によるそのような検出は、約フェムト
モルのDNA、すなわち略10-11グラムという検出下限に制限されるが、良く 知られている。そのような蛍光検出が、約アトモル(10-18モル)未満のDN A,例えば、略10-14グラム未満の濃度を有する、対象分析物の痕跡量までも の検出を提供することが望ましい。
【0007】
一実施の形態では、本発明は蛍光を増強するための方法に関し、発蛍光団をテ
クスチャ付けた材料と接触させること、それにより複合体を形成することを含む
。第2の実施の形態では、本発明は分析物を同定する方法に関し、分析物を結合
種と接触させることを含み、ここで、結合種はテクスチャ付けた材料と接続され
ているか、あるいはその中にある発蛍光団と接続されている。
クスチャ付けた材料と接触させること、それにより複合体を形成することを含む
。第2の実施の形態では、本発明は分析物を同定する方法に関し、分析物を結合
種と接触させることを含み、ここで、結合種はテクスチャ付けた材料と接続され
ているか、あるいはその中にある発蛍光団と接続されている。
【0008】 より詳細には、本発明は蛍光を増強するための方法を提供し、発蛍光団をテク
スチャ付けた材料と接触させ、これにより複合体を形成する工程と、テクスチャ
付けた材料上または材料内に、発蛍光団複合体に関連付けられた蛍光があれば、
それを検出する工程とを含む。好ましい一実施形態では、テクスチャ付けた材料
は、ひとつのビード、または多数のウエルを有するプレートのひとつのウエルの
面上に組込まれる。
スチャ付けた材料と接触させ、これにより複合体を形成する工程と、テクスチャ
付けた材料上または材料内に、発蛍光団複合体に関連付けられた蛍光があれば、
それを検出する工程とを含む。好ましい一実施形態では、テクスチャ付けた材料
は、ひとつのビード、または多数のウエルを有するプレートのひとつのウエルの
面上に組込まれる。
【0009】 この方法は、反応プロセスを行なうためのカセットまたはチップ内で、分析的
反応を行なう工程と、その反応の、発蛍光団含有生成物をテクスチャ付けた材料
に接触させる工程とを含み、ここで、テクスチャ付けた材料は、カセットまたは
チップの検出または反応チャンバ内に組込まれ、およびテクスチャ付けた材料か
らの蛍光を検出する工程とを含むことができる。更に、この方法は、励起光をテ
クスチャ面へ実質的に90°の入射角で当てる工程と、そして入射励起光の反射
軸の周囲20°の円錐内にある放射を収集する工程とを含むことができる。
反応を行なう工程と、その反応の、発蛍光団含有生成物をテクスチャ付けた材料
に接触させる工程とを含み、ここで、テクスチャ付けた材料は、カセットまたは
チップの検出または反応チャンバ内に組込まれ、およびテクスチャ付けた材料か
らの蛍光を検出する工程とを含むことができる。更に、この方法は、励起光をテ
クスチャ面へ実質的に90°の入射角で当てる工程と、そして入射励起光の反射
軸の周囲20°の円錐内にある放射を収集する工程とを含むことができる。
【0010】 別の好ましい実施の形態では、方法は、基体の発蛍光団が液相にとどまり、か
つ生成発蛍光団がテクスチャ付けた基体に付帯するよう、テクスチャ付けた材料
の存在するところで分析的反応をさせること、ここで、分析的反応は、生成発蛍
光団の蛍光生成率を実質的に増加させず、励起光源を液相を通しテクスチャ付け
た材料へ当てることによりテクスチャ付けた材料からの蛍光を検出すること、を
含むことができる。反応(単数または複数)による蛍光生成率の「著しい増加」
とは、テクスチャ付けた材料に付帯することによる増加に匹敵するであろう増加
のことであり、後者の増加の信頼できる検出を妨害する。
つ生成発蛍光団がテクスチャ付けた基体に付帯するよう、テクスチャ付けた材料
の存在するところで分析的反応をさせること、ここで、分析的反応は、生成発蛍
光団の蛍光生成率を実質的に増加させず、励起光源を液相を通しテクスチャ付け
た材料へ当てることによりテクスチャ付けた材料からの蛍光を検出すること、を
含むことができる。反応(単数または複数)による蛍光生成率の「著しい増加」
とは、テクスチャ付けた材料に付帯することによる増加に匹敵するであろう増加
のことであり、後者の増加の信頼できる検出を妨害する。
【0011】 本発明は、更に、反応を行なうための器具を提供し、器具は、付帯する発蛍光
団の蛍光を増強するテクスチャ付けた材料を入れる少なくとも1つの検出チャン
バまたは反応チャンバを備える、反応プロセスを行なうためのカセットはたはチ
ップと、蛍光増強を減少させるのに有効な量の、テクスチャ付けた材料により吸
収されない光を放射するよう選定された光源であって、少なくとも1つの検出ま
たは反応チャンバと光軸合わせされた光源と、および光源により放射された光に
対して、テクスチャ付けた基体からの反射軸と光軸合わせされた検出器とを備え
る。
団の蛍光を増強するテクスチャ付けた材料を入れる少なくとも1つの検出チャン
バまたは反応チャンバを備える、反応プロセスを行なうためのカセットはたはチ
ップと、蛍光増強を減少させるのに有効な量の、テクスチャ付けた材料により吸
収されない光を放射するよう選定された光源であって、少なくとも1つの検出ま
たは反応チャンバと光軸合わせされた光源と、および光源により放射された光に
対して、テクスチャ付けた基体からの反射軸と光軸合わせされた検出器とを備え
る。
【0012】 本発明は、反応ウエルまたはチャンバを画成するエンボス付きのテクスチャ付
けた材料を備える、蛍光測定を行うための装置も提供する。
けた材料を備える、蛍光測定を行うための装置も提供する。
【0013】
【発明の実施の形態】定義 下記用語は、本出願の目的のために、それぞれが以下の意味を持つこととする
。特に、特許請求の範囲の解釈を目的とする際、これらの用語定義は、本明細書
中の他の文脈に基づく矛盾する何れの断定的意味をも規制することとする。
。特に、特許請求の範囲の解釈を目的とする際、これらの用語定義は、本明細書
中の他の文脈に基づく矛盾する何れの断定的意味をも規制することとする。
【0014】 ・緩和語「約 (about)」は、ここでは、pH、材料量、および温度範囲のよう
な、一定の好ましい操作範囲が、固定的に決定されないことを示すように使用さ
れる。意味は、大体、当業者には明らかであろう。例えば、酵素駆動反応に関し
て、例えば、約15°Cから約40°Cの温度範囲という記載は、その酵素に対
して有用な触媒速度に有利であると予測されるような他の温度、例えば11°C
または44°Cを含むと解釈されるであろう。しかし、上記例において、好まし
い範囲である10°Cから45°Cは、含められた範囲内に入る「約」の温度が
、より広い範囲のエンドポイントまでの半分より近くへ入ってはならないことを
示すであろうように、他の好ましい範囲も指針を提供できる。通常に精通する人
に指針の経験が無く、前後関係からの指針が欠如ている場合、そしてより詳細な
規則が以下に記載されていない場合、「約」の範囲は、エンドポイントの絶対値
の15%、または記載の範囲の15%のいずれか少ない方を上回ることはない。
な、一定の好ましい操作範囲が、固定的に決定されないことを示すように使用さ
れる。意味は、大体、当業者には明らかであろう。例えば、酵素駆動反応に関し
て、例えば、約15°Cから約40°Cの温度範囲という記載は、その酵素に対
して有用な触媒速度に有利であると予測されるような他の温度、例えば11°C
または44°Cを含むと解釈されるであろう。しかし、上記例において、好まし
い範囲である10°Cから45°Cは、含められた範囲内に入る「約」の温度が
、より広い範囲のエンドポイントまでの半分より近くへ入ってはならないことを
示すであろうように、他の好ましい範囲も指針を提供できる。通常に精通する人
に指針の経験が無く、前後関係からの指針が欠如ている場合、そしてより詳細な
規則が以下に記載されていない場合、「約」の範囲は、エンドポイントの絶対値
の15%、または記載の範囲の15%のいずれか少ない方を上回ることはない。
【0015】 ・「分析物 (analyte)」は、分析される試料を意味し、溶液中の、懸濁液中の
、または基体へ付着された分子であることができる。
、または基体へ付着された分子であることができる。
【0016】 ・「後方散乱 (backscatter)」は、初期の伝播方向から略180°の角度での
放射線の偏向を意味する、すなわち、放射線は、放射線ソースの方向へ偏向され
る。レーザー励起蛍光の場合、後方散乱された放射は励起レーザーの方向へ向か
う。
放射線の偏向を意味する、すなわち、放射線は、放射線ソースの方向へ偏向され
る。レーザー励起蛍光の場合、後方散乱された放射は励起レーザーの方向へ向か
う。
【0017】 ・「カセット (cassette)」または「化学カセット (chemistry cassette)」は
、そこでの反応を行なうための使い捨て器具を意味する。1つの例では、カセッ
トは、本体、1つ以上の上部膜、および1つ以上の下部膜を有し、それらは共に
、少なくとも1つの供給チャンバと1つの反応チャンバを含めて、2つ以上のチ
ャンバと、チャンバを接続する流体交換チャネルとを画成し、カセットのチャン
バは、約10μlから約500μlの範囲の容積を備える。
、そこでの反応を行なうための使い捨て器具を意味する。1つの例では、カセッ
トは、本体、1つ以上の上部膜、および1つ以上の下部膜を有し、それらは共に
、少なくとも1つの供給チャンバと1つの反応チャンバを含めて、2つ以上のチ
ャンバと、チャンバを接続する流体交換チャネルとを画成し、カセットのチャン
バは、約10μlから約500μlの範囲の容積を備える。
【0018】 ・「チャンバ (chamber)」または「流体チャンバ (fluid chamber)」は、流体
または特定物質を収容する構造体であり、これらの構造体にはどのようなリザー
バも含まれる。つまり、チャンバまたは流体チャンバは、反応のため(それ故「
反応チャンバ」)、反応物の貯蔵のため(それ故「供給チャンバ」)、廃棄物の
貯蔵のため(それ故「廃棄チャンバ」)、容積の計量のため(それ故「計量チャ
ンバ」)、および、試料(単数または複数)の貯蔵のため(それ故「試料貯蔵チ
ャンバ」)のサイトとして機能できる。
または特定物質を収容する構造体であり、これらの構造体にはどのようなリザー
バも含まれる。つまり、チャンバまたは流体チャンバは、反応のため(それ故「
反応チャンバ」)、反応物の貯蔵のため(それ故「供給チャンバ」)、廃棄物の
貯蔵のため(それ故「廃棄チャンバ」)、容積の計量のため(それ故「計量チャ
ンバ」)、および、試料(単数または複数)の貯蔵のため(それ故「試料貯蔵チ
ャンバ」)のサイトとして機能できる。
【0019】 ・「チャネル (channel)」または「キャピラリ (capillary)」は、導管 (cond
uit) を意味し、流体がそこを通って、チャンバ間、またはチャンバとマイクロ 流体器具の入口または出口との間を通過する、「流体交換チャネル (fluid exch
ange channel)」ともいう。
uit) を意味し、流体がそこを通って、チャンバ間、またはチャンバとマイクロ 流体器具の入口または出口との間を通過する、「流体交換チャネル (fluid exch
ange channel)」ともいう。
【0020】 ・「チップ (chip)」または「マイクロ製作された器具 (microfabricated dev
ice)」は、チャンバと少なくとも1つの反応流路と有する構造体を意味し、一般
に、カセットの容積より実質的に小さな容積を備える。例えば、チップのチャン
バは、一般に約0.01μlから約10μlの範囲の容積を備える。
ice)」は、チャンバと少なくとも1つの反応流路と有する構造体を意味し、一般
に、カセットの容積より実質的に小さな容積を備える。例えば、チップのチャン
バは、一般に約0.01μlから約10μlの範囲の容積を備える。
【0021】 ・チャンバ、入口、チャネル、およびキャピラリから選定される2つの構造体
間の「接続 (connection)」または「連通 (communication)」は、流体が一方か ら他方へ移動できるような、前記2つを接合する1つ以上のチャネルまたはキャ
ピラリがある場合、その間に「接続され」ている、または「接続のルート (rout
e of connection)」または「連通」を有する、または「流体連通 (fluid commun
ication)」にあると言われる。
間の「接続 (connection)」または「連通 (communication)」は、流体が一方か ら他方へ移動できるような、前記2つを接合する1つ以上のチャネルまたはキャ
ピラリがある場合、その間に「接続され」ている、または「接続のルート (rout
e of connection)」または「連通」を有する、または「流体連通 (fluid commun
ication)」にあると言われる。
【0022】 ・「蛍光 (fluorescence)」は、特に、可視光の電磁放射線の放射を意味し、 入射放射線の吸収により物質内で励起され、励起する放射線が継続する間のみ持
続する。
続する。
【0023】 ・「発蛍光団 (fluorophor)」は、蛍光を発する物質を意味する。
【0024】 ・「ロケーション (location)」は、サイトであり、そこへ、または、そこで 、プライマ、プローブ、標的核酸、またはそのいずれかの組合わせが、例えば、
磁気的基体や直接化学的結合を使用して、移送され、付着され、または保持され
る。つまり、サイトは、マイクロ流体器具の内部のようなどんな種類の容器内、
微小粒子のようなどんな種類の基体内にもあることができる。
磁気的基体や直接化学的結合を使用して、移送され、付着され、または保持され
る。つまり、サイトは、マイクロ流体器具の内部のようなどんな種類の容器内、
微小粒子のようなどんな種類の基体内にもあることができる。
【0025】 ・「マイクロ流体器具 (microfluidic device)」は、カセットまたはチップを
備える器具である。
備える器具である。
【0026】 ・「半体 (moiety)」は配位子であって、微小粒子のような基体へ付着でき、 特に他の配位子と結合して結合対を形成する。
【0027】 ・「プローブ (probe)」は分子であり、抗原に対して特異性を有する抗体にお
けるように、または、第2の核酸に相補である核酸におけるように、特に、第2
の分子へ結合した分子である。
けるように、または、第2の核酸に相補である核酸におけるように、特に、第2
の分子へ結合した分子である。
【0028】 ・「反応チャンバ (reaction chamber)」は、反応を受けているまたは受ける ことになる反応体を配置するためのチャンバを意味し、適切な材料、すなわち、
最少の非特異性吸収率を示すように処理された、または、最少の非特異性吸収率
を示すよう処理された材料から成り、その材料は、例えば、ガラス、プラスチッ
ク、ナイロン、セラミック、またはその組合わせであることができ、材料を反応
チャンバへ、およびそこから通過させるために、少なくとも2つのチャネルへ接
続されており、「第1チャンバ」とも称する。
最少の非特異性吸収率を示すように処理された、または、最少の非特異性吸収率
を示すよう処理された材料から成り、その材料は、例えば、ガラス、プラスチッ
ク、ナイロン、セラミック、またはその組合わせであることができ、材料を反応
チャンバへ、およびそこから通過させるために、少なくとも2つのチャネルへ接
続されており、「第1チャンバ」とも称する。
【0029】 ・「反応流路 (reaction flow-way)」は、2つ以上の直列に接続されたチャン
バの配列を意味し、そこを通して流体が移動でき、そこへの接続が1つ以上のチ
ャネルまたはキャピラリにより提供されている。
バの配列を意味し、そこを通して流体が移動でき、そこへの接続が1つ以上のチ
ャネルまたはキャピラリにより提供されている。
【0030】 ・「直列に接続された (serially connected)」は、チャネルまたはキャピラ リを介して接続された2つ以上のチャンバおよび入口または出口ポートを称し、
それにより、流体は、直列に接続されたチャンバまたはポートの第1チャンバま
たは第1ポートから、直列に接続されたチャンバまたはポートの第2チャンバま
たは第2ポートへ、およびそこから直列に接続されたチャンバまたはポートの第
3チャンバまたは第3ポートへ、など、直列に接続されたチャンバまたはポート
の最後へ流体が通過するまで、通過できる。
それにより、流体は、直列に接続されたチャンバまたはポートの第1チャンバま
たは第1ポートから、直列に接続されたチャンバまたはポートの第2チャンバま
たは第2ポートへ、およびそこから直列に接続されたチャンバまたはポートの第
3チャンバまたは第3ポートへ、など、直列に接続されたチャンバまたはポート
の最後へ流体が通過するまで、通過できる。
【0031】 ・「基体 (substrate)」は、分子が吸着または付着できる面を意味し、マイク
ロ流体器具の内面または微小粒子の外面のような面であり、そのいずれかまたは
両者が、テクスチャ付けた材料を含むことができる。
ロ流体器具の内面または微小粒子の外面のような面であり、そのいずれかまたは
両者が、テクスチャ付けた材料を含むことができる。
【0032】 ・「標的核酸 (target nucleic acid)」または「標的 (target)」は、試料内 で同定され、測定され、または増幅されるよう求められる部位を有する核酸を意
味し、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、またはLCR(リガーゼ連鎖反応)
法のような核酸の増幅反応において増幅される、もしあれば、目標の配列のよう
な部位であり、標的の核酸部位は、普通には、試料中に見られる更により大きな
核酸分子の一部である。
味し、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、またはLCR(リガーゼ連鎖反応)
法のような核酸の増幅反応において増幅される、もしあれば、目標の配列のよう
な部位であり、標的の核酸部位は、普通には、試料中に見られる更により大きな
核酸分子の一部である。
【0033】 ・「容器 (vessel)」は、中に液体反応物が貯蔵される、または中で化合され る容器を意味し、例えば、マイクロタイターディッシュ、またはエッペンドルフ
管のウエルに関してミリリットルから、カセットに含まれる流体チャンバに関し
て10μlから500μl、および、チップ中のそのようなチャンバに関して0
.01μlから10μlの収容容積範囲を有する。
管のウエルに関してミリリットルから、カセットに含まれる流体チャンバに関し
て10μlから500μl、および、チップ中のそのようなチャンバに関して0
.01μlから10μlの収容容積範囲を有する。
【0034】 本発明は、発蛍光団当りの蛍光生成率を増加させることに関する蛍光の増強に
向けられる。そのような増加された蛍光生成率の用途の1つが、発蛍光団でラベ
ル付けされた(1)ハイブリダイズされたDNA、または(2)抗体−抗原の複
合体、の検出ような、生化学種の蛍光による検出限界を増加させるためであるこ
とが熟慮されるが、ここで、そのような種の蛍光検出は、例えば、約フェムトモ
ルを超える濃度に対して良く知られている。その限界以下、および特にその限界
の著しく下(例えば、約フェムトモル未満から約アトモルまでの範囲)の検出は
、現在のところ利用できない。本発明は、その限界を実質的に下回る量の生化学
種の蛍光検出を実用的なものにする。
向けられる。そのような増加された蛍光生成率の用途の1つが、発蛍光団でラベ
ル付けされた(1)ハイブリダイズされたDNA、または(2)抗体−抗原の複
合体、の検出ような、生化学種の蛍光による検出限界を増加させるためであるこ
とが熟慮されるが、ここで、そのような種の蛍光検出は、例えば、約フェムトモ
ルを超える濃度に対して良く知られている。その限界以下、および特にその限界
の著しく下(例えば、約フェムトモル未満から約アトモルまでの範囲)の検出は
、現在のところ利用できない。本発明は、その限界を実質的に下回る量の生化学
種の蛍光検出を実用的なものにする。
【0035】 詳細には、発蛍光団が、例えば、市販で入手可能なナイロンまたはニトロセル
ロース膜のような、テクスチャ付けた材料へ結合される場合、蛍光は、テクスチ
ャ付けされていない材料上の同じ発蛍光団と比較して、または適切な溶液中で、
より効率的に励起される。テクスチャ付けた材料は、異なる方向へ配向され、レ
ーザーのような電磁放射線に関して反射特性を有する面を含む。そのようなテク
スチャ付けた材料は、多重散乱、内部反射、および、干渉作用を提供し、好まし
くは、そのような材料は、多孔性であり、所定サイズの材料の通過を妨げる所定
の孔サイズを有する。しかし、繊維質またはガラス材料が蛍光の増強を示さない
ので、そのような材料は、単独に存在する紙または類似の繊維質の材料、または
ガラスビーズのようなアセンブリではない。効率がより高いこの蛍光励起は、増
強されたプロセスであり、それ自体の方法、およびそれに伴って有益に使用され
るテクスチャ付けた材料に関して以下開示される。
ロース膜のような、テクスチャ付けた材料へ結合される場合、蛍光は、テクスチ
ャ付けされていない材料上の同じ発蛍光団と比較して、または適切な溶液中で、
より効率的に励起される。テクスチャ付けた材料は、異なる方向へ配向され、レ
ーザーのような電磁放射線に関して反射特性を有する面を含む。そのようなテク
スチャ付けた材料は、多重散乱、内部反射、および、干渉作用を提供し、好まし
くは、そのような材料は、多孔性であり、所定サイズの材料の通過を妨げる所定
の孔サイズを有する。しかし、繊維質またはガラス材料が蛍光の増強を示さない
ので、そのような材料は、単独に存在する紙または類似の繊維質の材料、または
ガラスビーズのようなアセンブリではない。効率がより高いこの蛍光励起は、増
強されたプロセスであり、それ自体の方法、およびそれに伴って有益に使用され
るテクスチャ付けた材料に関して以下開示される。
【0036】 本発明に沿ってどんな色のどんな発蛍光団も使用できるが、特に、テクスチャ
付けた材料が発蛍光団に対する励起エネルギーに半透明である場合、好ましくは
、赤色の領域で蛍光を発する市販で入手可能な発蛍光団が使用される。例えば、
異フィコシアニン(シグマ)のような、しかしそれに限定されないプロテインベ
ースの発蛍光団、または、インドジカーボシアニン ("Cy5"; Jackson ImmunoRes
earch Laboratories, Inc.) のような、しかしそれに限定されない有機シアニン
発蛍光団は、本発明に従がい使用される場合に増強を示す染料の代表的カテゴリ
および種である。加えて、JA22 (Niehren 他, Anal. Chem., 67(15), 1 (1995))
およびその変種のような、ローダミン誘導体、および上記染料の種の変種は、 本発明に従がい使用される場合に増強を示す。この増強は、膜の物理的構造に依
存して、内部反射およびローカル干渉と組合された、またはそれを含む後方散乱
に関連する良く知られたプロセスにより達成されると信じられる。
付けた材料が発蛍光団に対する励起エネルギーに半透明である場合、好ましくは
、赤色の領域で蛍光を発する市販で入手可能な発蛍光団が使用される。例えば、
異フィコシアニン(シグマ)のような、しかしそれに限定されないプロテインベ
ースの発蛍光団、または、インドジカーボシアニン ("Cy5"; Jackson ImmunoRes
earch Laboratories, Inc.) のような、しかしそれに限定されない有機シアニン
発蛍光団は、本発明に従がい使用される場合に増強を示す染料の代表的カテゴリ
および種である。加えて、JA22 (Niehren 他, Anal. Chem., 67(15), 1 (1995))
およびその変種のような、ローダミン誘導体、および上記染料の種の変種は、 本発明に従がい使用される場合に増強を示す。この増強は、膜の物理的構造に依
存して、内部反射およびローカル干渉と組合された、またはそれを含む後方散乱
に関連する良く知られたプロセスにより達成されると信じられる。
【0037】 本質的に、テクスチャ付けた材料ベースの蛍光増強は、ナイロンまたはニトロ
セルロース膜のような使用されるテクスチャ付けた材料の高度に画成された構造
による、独特の多重散乱、内部反射、および干渉作用に関連すると信じられ、1
0倍以上、100倍のような程度の増強が結果として得られる。この大きさの増
強は、診断アッセイのための感度改善および最適化型式を支持するのに十分なほ
ど大きい。
セルロース膜のような使用されるテクスチャ付けた材料の高度に画成された構造
による、独特の多重散乱、内部反射、および干渉作用に関連すると信じられ、1
0倍以上、100倍のような程度の増強が結果として得られる。この大きさの増
強は、診断アッセイのための感度改善および最適化型式を支持するのに十分なほ
ど大きい。
【0038】 そのようなアッセイは、例えば、当該技術で既知のELISA試験のような、
免疫アッセイで検出される、患者の疾病または状態の指標である、サザンブロッ
トで検出される変数縦列反復 (variable number tandem repeat)(VNTR)ま
たは抗原の検出を含む、医学上のまたは法廷上などの目的に適する使用が可能で
ある。サザンブロットは、分子生物学の標準的分析方法であり、そこで、個体の
ゲノムのDNAが、この技術で既知で、市販で入手可能なエンドヌクレアーゼを
使用して、組織的な方法で切断され、サイズ毎に分離され、(通例)ニトロセル
ロース膜フィルタ、DNAが付着している「ブロット」、へ移送され、および(
通例)放射性ラベル付けたDNA(「プローブ」)の短い、所定の配列の小片と
相補性をプローブし、それにより、プローブに相補である切断されたゲノムのD
NAのサイズを検出する。
免疫アッセイで検出される、患者の疾病または状態の指標である、サザンブロッ
トで検出される変数縦列反復 (variable number tandem repeat)(VNTR)ま
たは抗原の検出を含む、医学上のまたは法廷上などの目的に適する使用が可能で
ある。サザンブロットは、分子生物学の標準的分析方法であり、そこで、個体の
ゲノムのDNAが、この技術で既知で、市販で入手可能なエンドヌクレアーゼを
使用して、組織的な方法で切断され、サイズ毎に分離され、(通例)ニトロセル
ロース膜フィルタ、DNAが付着している「ブロット」、へ移送され、および(
通例)放射性ラベル付けたDNA(「プローブ」)の短い、所定の配列の小片と
相補性をプローブし、それにより、プローブに相補である切断されたゲノムのD
NAのサイズを検出する。
【0039】 増強された蛍光を使用して法廷上のまたは医学上の診断のための自動検出シス
テムの設計と製作に対する主たる技術的問題は、以下の通りである: 第1に、蛍光を励起するための入射放射線ソースは、後方散乱構成およびレー
ザービーム幅に関して較正されねばならず、蛍光検出ユニットに沿って検討され
るのが好ましい。本発明の蛍光検出器の実施の形態の1つが図1に示され、ここ
で、Aは光電子増倍管(PMT)、Bは遮断フィルタ、Cはミラー、Dは試料ホ
ルダー、Eは試料、Fは焦点を合わせた放射線ソース、およびGはシャッターで
ある。この構成は、試料(E)に配置される、ナイロン膜のような適切にテクス
チャ付けた材料へ付着された発蛍光団の後方散乱を測定し、ここで、放射線励起
はPMT検出器Aに対向する。蛍光は、他の実施の形態ではレンズが採用できる
が、レンズを使用せずにPMT検出器Aを直接照明する。例えば、紫外光または
レーザーの放射ソースを含む、任意の適切な焦点を合わせた放射ソースが、本方
法で発蛍光団を励起するのに使用できる。好ましくは、レーザーが採用され、そ
のソースが本発明の方法の空間的解像度を決定できるのが好ましい。例えば、ガ
スレーザービーム径は、0.8mm程度であり、それに対し、固体レーザーは、
種々の楕円の径を生成するために採用でき、コンパクトな計器のために好んで使
用される。何れの種類のレーザーのビーム径も、これら装置の焦点レンズにより
決められる。
テムの設計と製作に対する主たる技術的問題は、以下の通りである: 第1に、蛍光を励起するための入射放射線ソースは、後方散乱構成およびレー
ザービーム幅に関して較正されねばならず、蛍光検出ユニットに沿って検討され
るのが好ましい。本発明の蛍光検出器の実施の形態の1つが図1に示され、ここ
で、Aは光電子増倍管(PMT)、Bは遮断フィルタ、Cはミラー、Dは試料ホ
ルダー、Eは試料、Fは焦点を合わせた放射線ソース、およびGはシャッターで
ある。この構成は、試料(E)に配置される、ナイロン膜のような適切にテクス
チャ付けた材料へ付着された発蛍光団の後方散乱を測定し、ここで、放射線励起
はPMT検出器Aに対向する。蛍光は、他の実施の形態ではレンズが採用できる
が、レンズを使用せずにPMT検出器Aを直接照明する。例えば、紫外光または
レーザーの放射ソースを含む、任意の適切な焦点を合わせた放射ソースが、本方
法で発蛍光団を励起するのに使用できる。好ましくは、レーザーが採用され、そ
のソースが本発明の方法の空間的解像度を決定できるのが好ましい。例えば、ガ
スレーザービーム径は、0.8mm程度であり、それに対し、固体レーザーは、
種々の楕円の径を生成するために採用でき、コンパクトな計器のために好んで使
用される。何れの種類のレーザーのビーム径も、これら装置の焦点レンズにより
決められる。
【0040】 第2に、VNTRサザンブロットでのような、テクスチャ付けた材料上の発蛍
光団の存在の量子化は、従来手段を使用して、上記ブロット上の領域のような、
テクスチャ付けた材料上の特定のサイトに付帯する蛍光の集積により最大化でき
る。
光団の存在の量子化は、従来手段を使用して、上記ブロット上の領域のような、
テクスチャ付けた材料上の特定のサイトに付帯する蛍光の集積により最大化でき
る。
【0041】 第3に、バックグラウンド蛍光が突止められ、定量化されねばならない。非特
異性の結合はナイロン膜のようなテクスチャ付けた材料で起り得て、蛍光の増強
はハイブリダイゼーションアッセイでの高いバックグラウンドとなり得る。従が
って、発蛍光団の非特異性結合は最小化されるのが好ましい。それは、標準の遮
断プロトコルを使用して行なわれる。例えば、発蛍光団の非特異性吸収を減殺す
るよう適切な洗浄剤を使用できる。適切な洗浄剤は、硫酸ドデシルナトリウムま
たはタージトールタイプNP−40として知られるポリエチレンモノ(ノニルフ
ェニル)エーテルグリコールのようなポリエチレンアルキルフェニルエーテルグ
リコールであることができ、タージトールが好ましい。
異性の結合はナイロン膜のようなテクスチャ付けた材料で起り得て、蛍光の増強
はハイブリダイゼーションアッセイでの高いバックグラウンドとなり得る。従が
って、発蛍光団の非特異性結合は最小化されるのが好ましい。それは、標準の遮
断プロトコルを使用して行なわれる。例えば、発蛍光団の非特異性吸収を減殺す
るよう適切な洗浄剤を使用できる。適切な洗浄剤は、硫酸ドデシルナトリウムま
たはタージトールタイプNP−40として知られるポリエチレンモノ(ノニルフ
ェニル)エーテルグリコールのようなポリエチレンアルキルフェニルエーテルグ
リコールであることができ、タージトールが好ましい。
【0042】 更に、先に記載したように、適切にテクスチャ付けた材料が同定されねばなら
ない。そのような材料は、顕微鏡的ポケットを有し、その中へおよびそこへ第1
の配位子が結合でき、その配位子は、特に対象の分析物へ結合する。そのような
配位子は、好ましくは、対象分析物の免疫原の認知を有する抗体、または対象の
分析物の配列補体を有する核酸を含む。適切にテクスチャ付けた材料は、ナイロ
ン.ポリ(カーボネート)、ポリ(2フッ化ビニリデン)(PVDF)、および
ニトロセルロース膜を含み、しかしそれに限定されない。好ましくは、ナイロン
膜が使用され、Pall Corp. (East Hill, NY. または、特に、Biosupport Divisi
on, Port Washington, NY), Amersham Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway,
NJ), および Cuno Inc. (Meriden, CT) から得られるような市販のナイロン膜を
含む。膜の孔のサイズにより実質的に異なる増強の変動があるようには見えない
。しかし、非特異性の結合を遮断する能力は、膜の、そしてそのメーカーの特性
である。先に記載したように、非特異性の結合は、増強された蛍光の検出システ
ムの開発で重要なファクタである。
ない。そのような材料は、顕微鏡的ポケットを有し、その中へおよびそこへ第1
の配位子が結合でき、その配位子は、特に対象の分析物へ結合する。そのような
配位子は、好ましくは、対象分析物の免疫原の認知を有する抗体、または対象の
分析物の配列補体を有する核酸を含む。適切にテクスチャ付けた材料は、ナイロ
ン.ポリ(カーボネート)、ポリ(2フッ化ビニリデン)(PVDF)、および
ニトロセルロース膜を含み、しかしそれに限定されない。好ましくは、ナイロン
膜が使用され、Pall Corp. (East Hill, NY. または、特に、Biosupport Divisi
on, Port Washington, NY), Amersham Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway,
NJ), および Cuno Inc. (Meriden, CT) から得られるような市販のナイロン膜を
含む。膜の孔のサイズにより実質的に異なる増強の変動があるようには見えない
。しかし、非特異性の結合を遮断する能力は、膜の、そしてそのメーカーの特性
である。先に記載したように、非特異性の結合は、増強された蛍光の検出システ
ムの開発で重要なファクタである。
【0043】 増強のために不適当であり得る材料は、多くの紙、大多数の綿、ガラスビーズ
のアセンブリ、および類似の材料を含み得る。これらの材料での光学的性質、ま
たは、ボイドの存在が、増強のために不適当であり得る。多重反射および干渉作
用に対するニーズと一致して、蛍光励起のための放射線を吸収し過ぎる材料も蛍
光の増強を示さない。しかし、ここに定められたテクスチャ付けた材料は、例え
ば、ガラスまたはその他のビーズ、または紙材料へ付着できることが、本発明に
沿って熟慮され、それらは、特定用途、使用の容易さ、輸送などを提供できる。
のアセンブリ、および類似の材料を含み得る。これらの材料での光学的性質、ま
たは、ボイドの存在が、増強のために不適当であり得る。多重反射および干渉作
用に対するニーズと一致して、蛍光励起のための放射線を吸収し過ぎる材料も蛍
光の増強を示さない。しかし、ここに定められたテクスチャ付けた材料は、例え
ば、ガラスまたはその他のビーズ、または紙材料へ付着できることが、本発明に
沿って熟慮され、それらは、特定用途、使用の容易さ、輸送などを提供できる。
【0044】 本発明は、均質のまたは運動のアッセイに沿って使用できる。蛍光の増強は、
図2に関して記述されるアッセイのために、例えば、Cy5をタグ付けた単位複
製配列の溶液中で膜で起る。膜が、反転点ブロットとして適切なプローブで前処
理される場合、Cy5をタグ付けた単位複製配列の結合は、結合された単位複製
配列の量に比例した増強信号を与えるであろう。結合が、時間と共に監視される
場合、結合イベントの運動が決定できる。運動が監視されるか否かによらず、ア
ッセイは、テクスチャ付けた材料による蛍光の増強の故に均質なアッセイであろ
う。
図2に関して記述されるアッセイのために、例えば、Cy5をタグ付けた単位複
製配列の溶液中で膜で起る。膜が、反転点ブロットとして適切なプローブで前処
理される場合、Cy5をタグ付けた単位複製配列の結合は、結合された単位複製
配列の量に比例した増強信号を与えるであろう。結合が、時間と共に監視される
場合、結合イベントの運動が決定できる。運動が監視されるか否かによらず、ア
ッセイは、テクスチャ付けた材料による蛍光の増強の故に均質なアッセイであろ
う。
【0045】 本発明のいずれかの実施の形態に沿って使用されるハイブリダイゼーションま
たはアニールの条件は、プライマまたはプローブの長さ、および特定の標的核酸
の相補性部分に関して、好ましくは少なくとも約80%の同一性 (identity) を
有する、好ましくは、核酸のハイブリダイゼーションを提供し、より好ましくは
少なくとも約85%の同一性、より更に好ましくは少なくとも約90%の同一性
、もっと好ましくは少なくとも約95%の同一性、最も好ましくは少なくとも約
97%の同一性を有する。厳格なハイブリダイゼーション条件の例は、42°C
で、次の溶液中で、1晩の培養であり、溶液は:50%ホルムアミド、5xSS
C(150mM NaCl、15mM クエン酸3ナトリウム (trisodium citr
ate))、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5x Denhardt の溶液、
10%硫酸デキストラン (dextran sulfate)、および20μg/mlの変性され
、せん断された鮭の***のDNA、から成り、ハイブリダイゼーション支持を約
65°Cで0.1xSSCでの洗浄がこれに続く。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄の条件は、良く知られ、Sambrook, 他., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)、特にその1 1章に例示されている。この技術に精通した当業者が知るように、約80%から
約90%の同一性の範囲のパーセント同一性を有する核酸のハイブリダイゼーシ
ョンのための最適な条件は、より少ない厳格性を必要とし、一般に温度を少なく
するおよび/またはホルムアミドの濃度を少なくすることにより達成される。
たはアニールの条件は、プライマまたはプローブの長さ、および特定の標的核酸
の相補性部分に関して、好ましくは少なくとも約80%の同一性 (identity) を
有する、好ましくは、核酸のハイブリダイゼーションを提供し、より好ましくは
少なくとも約85%の同一性、より更に好ましくは少なくとも約90%の同一性
、もっと好ましくは少なくとも約95%の同一性、最も好ましくは少なくとも約
97%の同一性を有する。厳格なハイブリダイゼーション条件の例は、42°C
で、次の溶液中で、1晩の培養であり、溶液は:50%ホルムアミド、5xSS
C(150mM NaCl、15mM クエン酸3ナトリウム (trisodium citr
ate))、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5x Denhardt の溶液、
10%硫酸デキストラン (dextran sulfate)、および20μg/mlの変性され
、せん断された鮭の***のDNA、から成り、ハイブリダイゼーション支持を約
65°Cで0.1xSSCでの洗浄がこれに続く。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄の条件は、良く知られ、Sambrook, 他., Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)、特にその1 1章に例示されている。この技術に精通した当業者が知るように、約80%から
約90%の同一性の範囲のパーセント同一性を有する核酸のハイブリダイゼーシ
ョンのための最適な条件は、より少ない厳格性を必要とし、一般に温度を少なく
するおよび/またはホルムアミドの濃度を少なくすることにより達成される。
【0046】 DNAプローブを使用するここに開示される診断方法は、いずれか適切な手段
を使用して対象の分析物を変性することを含む。対象の分析物がDNAであると
仮定すると、2重撚り核酸 (double stranded nucleic acid) の2つの糸状体 (
two strands)(ここでは、「W」および「C」糸状体と称する)を分離しなくて
はならず、これは、熱、酵素、または化学薬品の適用により遂行できる。好まし
くは、ヘリカーゼs または細菌性酵素 RecA として知られるクラスの酵素からの
酵素の適用のような、熱的でない手段が使用され、酵素 RecA は、ヘリカーゼ 活動を有し、リボATPの存在で、DNAを変性すると知られている。ヘリカー
ゼ により核酸の糸状体を分離するための適切な反応条件は、Kuhn 他.,により C old Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , Vol., XLIII, 63-67 (
1978) に記述され、RecA を使用する技術は、Redding により Ann. Rev. Geneti cs , 16, 405-437 (1982) に概観されている。代替の、好ましい手段は、核酸の WとC糸状体が分離するように、標的の核酸を適切な塩基と接触させることを課
す。適切な塩基は、NaOHを含み、それは、好ましくは、約0.1Mから約0
.3M、より好ましくは約0.1Mから約0.2Mの濃度で使用される。この技
術で既知の他の塩基も化学的変性のために使用できる。この技術の当業者は、経
験的に所定の塩基に対して標準技術が使用している適切な濃度を決定でき、その
濃度は、更に、使用される核酸の所定の長さの範囲に対して調整できる。
を使用して対象の分析物を変性することを含む。対象の分析物がDNAであると
仮定すると、2重撚り核酸 (double stranded nucleic acid) の2つの糸状体 (
two strands)(ここでは、「W」および「C」糸状体と称する)を分離しなくて
はならず、これは、熱、酵素、または化学薬品の適用により遂行できる。好まし
くは、ヘリカーゼs または細菌性酵素 RecA として知られるクラスの酵素からの
酵素の適用のような、熱的でない手段が使用され、酵素 RecA は、ヘリカーゼ 活動を有し、リボATPの存在で、DNAを変性すると知られている。ヘリカー
ゼ により核酸の糸状体を分離するための適切な反応条件は、Kuhn 他.,により C old Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , Vol., XLIII, 63-67 (
1978) に記述され、RecA を使用する技術は、Redding により Ann. Rev. Geneti cs , 16, 405-437 (1982) に概観されている。代替の、好ましい手段は、核酸の WとC糸状体が分離するように、標的の核酸を適切な塩基と接触させることを課
す。適切な塩基は、NaOHを含み、それは、好ましくは、約0.1Mから約0
.3M、より好ましくは約0.1Mから約0.2Mの濃度で使用される。この技
術で既知の他の塩基も化学的変性のために使用できる。この技術の当業者は、経
験的に所定の塩基に対して標準技術が使用している適切な濃度を決定でき、その
濃度は、更に、使用される核酸の所定の長さの範囲に対して調整できる。
【0047】 本発明は、適切なテクスチャ付けた材料を含む、またはそれ自体がそれから成
る容器に沿って適切に使用できる。例えば、Pall Corporation により準備され るような、適切なナイロン膜が、増強された蛍光アッセイのためにマイクロウエ
ル滴定プレートで使用でき、標準の96ウエル・プレートの底がナイロン膜で覆
われる。濾過することを含む、この構成への種々の化学薬品の適用、および、プ
レート読取構成での蛍光検出は、実行可能である。以下に更に説明するように、
本発明は、マイクロ流体器具に沿って使用でき、ここで、テクスチャ付けた材料
は、チャネルまたはチャンバに配置され、放射線のソースおよびPMTは、テク
スチャ付けた材料、すなわち試験される試料の位置に対してここに述べられたよ
うに組立てられる。代替として、または、加えて、微小粒子がマイクロ流体器具
に含めることができ、ここで、微小粒子自体がテクスチャ付けた材料から成り、
および/または、テクスチャ付けた材料が直接または間接に微小粒子へ付着され
る。マイクロ流体器具の他の局面を以下に説明する。
る容器に沿って適切に使用できる。例えば、Pall Corporation により準備され るような、適切なナイロン膜が、増強された蛍光アッセイのためにマイクロウエ
ル滴定プレートで使用でき、標準の96ウエル・プレートの底がナイロン膜で覆
われる。濾過することを含む、この構成への種々の化学薬品の適用、および、プ
レート読取構成での蛍光検出は、実行可能である。以下に更に説明するように、
本発明は、マイクロ流体器具に沿って使用でき、ここで、テクスチャ付けた材料
は、チャネルまたはチャンバに配置され、放射線のソースおよびPMTは、テク
スチャ付けた材料、すなわち試験される試料の位置に対してここに述べられたよ
うに組立てられる。代替として、または、加えて、微小粒子がマイクロ流体器具
に含めることができ、ここで、微小粒子自体がテクスチャ付けた材料から成り、
および/または、テクスチャ付けた材料が直接または間接に微小粒子へ付着され
る。マイクロ流体器具の他の局面を以下に説明する。
【0048】 本発明による蛍光検出のための計器のための好ましい構成の1つは、上述のよ
うに、96または384ウエル滴定プレートの使用に関する。この実施の形態に
よるプレートおよび計器両方のコンセプトの概略を図2に示し、ここで、Aは光
電子増倍管、Bは遮断フィルタ、Cはミラー、Dは試料ホルダー、Eはテクスチ
ャ付けた材料を有するマイクロウエル・プレート、Fはレーザー、およびGはシ
ャッターである。図2は、マイクロウエル滴定プレートによるDNAアッセイの
一般的特徴を示し、そのウエルは、本発明のテクスチャ付けた材料を含む。マイ
クロウエル・プレートEのウエルの拡大で示すように、テクスチャ付けた材料は
ウエルの底に付着でき、DNAプローブはテクスチャ付けた材料に付着できる。
DNAプローブに相補である発蛍光団でタグ付けたDNA単位複製配列は、ハイ
ブリダイゼーションのための従来の条件を使用して、プローブへハイブリダイズ
でき、その後、蛍光の存在または不在が記録できる。プレートおよびテクスチャ
付けた材料の構造は、各ウエルに対して「流れ通る (flow thru)」または以下に
説明する均質アッセイのための閉鎖構造のような、種々の特徴を有することがで
きる。このコンセプトの必須の特徴は、この用途のための効率的な蛍光とプレー
ト読取の適切な設計のために、膜のような、テクスチャ付けた材料の使用である
。
うに、96または384ウエル滴定プレートの使用に関する。この実施の形態に
よるプレートおよび計器両方のコンセプトの概略を図2に示し、ここで、Aは光
電子増倍管、Bは遮断フィルタ、Cはミラー、Dは試料ホルダー、Eはテクスチ
ャ付けた材料を有するマイクロウエル・プレート、Fはレーザー、およびGはシ
ャッターである。図2は、マイクロウエル滴定プレートによるDNAアッセイの
一般的特徴を示し、そのウエルは、本発明のテクスチャ付けた材料を含む。マイ
クロウエル・プレートEのウエルの拡大で示すように、テクスチャ付けた材料は
ウエルの底に付着でき、DNAプローブはテクスチャ付けた材料に付着できる。
DNAプローブに相補である発蛍光団でタグ付けたDNA単位複製配列は、ハイ
ブリダイゼーションのための従来の条件を使用して、プローブへハイブリダイズ
でき、その後、蛍光の存在または不在が記録できる。プレートおよびテクスチャ
付けた材料の構造は、各ウエルに対して「流れ通る (flow thru)」または以下に
説明する均質アッセイのための閉鎖構造のような、種々の特徴を有することがで
きる。このコンセプトの必須の特徴は、この用途のための効率的な蛍光とプレー
ト読取の適切な設計のために、膜のような、テクスチャ付けた材料の使用である
。
【0049】 別の実施の形態では、本発明は、反応物、ポリヌクレオチド (polynucleotide
s)、抗原、抗体および/または基体が移送できるロケーションに関して説明でき
、そのロケーションは、例えば、図3で方形の領域として一般的に表されている
。ここに記載したように、そのように表されたロケーションは、任意の適当な形
状を有してよく、特定の器具内で一様でもなくてもよいランダムまたは均一な形
状を含み、どんなサイズまたは形状の容器であってよく、多数のそのようなロケ
ーションが単一の領域を占有してもよい。本明細書の他所に更に記載したように
、上述のロケーションに含まれ、本発明に沿って使用される、反応物、ポリヌク
レオチド、および基体は、好ましくは、そのような物質をロケーション間に移送
するいずれか適当な方法を使用してその間に移送される。好ましくは、以下に更
に説明するように、ここにいうロケーションは、マイクロ流体器具の構成要素で
ある。しかし、より大きな構造も、ここに開示される方法を操作する有用な器具
であると考えられる。分離できるロケーションを有するどんな器具も満足である
。実際、本発明の方法は、上記で記載のようにマイクロ滴定皿、エッペンドルフ
管、および類似のような、しかしそれに限定されない、非マイクロ流体容器を使
用して、手動または自動で遂行でき、または、マイクロ流体、または非マイクロ
流体器具に関らず、ロケーションは、例えば、磁気的に位置決めする磁気的微小
粒子により定められることもできる。
s)、抗原、抗体および/または基体が移送できるロケーションに関して説明でき
、そのロケーションは、例えば、図3で方形の領域として一般的に表されている
。ここに記載したように、そのように表されたロケーションは、任意の適当な形
状を有してよく、特定の器具内で一様でもなくてもよいランダムまたは均一な形
状を含み、どんなサイズまたは形状の容器であってよく、多数のそのようなロケ
ーションが単一の領域を占有してもよい。本明細書の他所に更に記載したように
、上述のロケーションに含まれ、本発明に沿って使用される、反応物、ポリヌク
レオチド、および基体は、好ましくは、そのような物質をロケーション間に移送
するいずれか適当な方法を使用してその間に移送される。好ましくは、以下に更
に説明するように、ここにいうロケーションは、マイクロ流体器具の構成要素で
ある。しかし、より大きな構造も、ここに開示される方法を操作する有用な器具
であると考えられる。分離できるロケーションを有するどんな器具も満足である
。実際、本発明の方法は、上記で記載のようにマイクロ滴定皿、エッペンドルフ
管、および類似のような、しかしそれに限定されない、非マイクロ流体容器を使
用して、手動または自動で遂行でき、または、マイクロ流体、または非マイクロ
流体器具に関らず、ロケーションは、例えば、磁気的に位置決めする磁気的微小
粒子により定められることもできる。
【0050】 本明細書で後により詳細に説明するように、上記で記載されたロケーションは
、およびこの目的に実用的である他のものは、マイクロ流体器具の一部である。
最も好ましくは、そのようなマイクロ流体器具は、取外し可能な化学薬品カセッ
トまたはマイクロ製作された器具、すなわちチップを備える。カセットまたはチ
ップのいずれかは、好ましくは、第1チャンバを備え、それは1つ以上の第2チ
ャンバと連通にあり、そのチャンバは流体反応物または反応体の貯蔵のため、す
なわち供給チャンバ、反応を受ける反応体の配置のため、すなわち、反応チャン
バ、流体の容積を測定するため、すなわち、計量チャンバ、など、に設計されて
いる。そのようなチャンバは、好ましくは、約0.001μlから約700μl
、より好ましくは、約0.01μlから約500μl、更により好ましくは、0
.01μlから約250μlの容積を有する。チャンバは、いずれか適切な材料
から成り、適切な材料は、モールドされ、加熱され、高分子の吸収を最小化する
、および他のパラメータの能力に対して選定される。適切な材料は、例えば、ガ
ラス、プラスチック、セラミック、またはその組合わせを含む。実施の形態の1
つでは、本発明に沿って使用される反応チャンバは、反応チャンバへ、およびか
ら材料を通過させるための少なくとも2つの流体交換チャネルへ接続され、それ
は、診断手順で変性の化学的手段を採用するために特に重要である。反応チャン
バは、好ましくは、約20°Cと75°C間の温度で、約2°C内の一定の温度
に維持される。反応チャンバは、増強された蛍光法のために上述のテクスチャ付
けた材料を含むことが、更に好ましい。
、およびこの目的に実用的である他のものは、マイクロ流体器具の一部である。
最も好ましくは、そのようなマイクロ流体器具は、取外し可能な化学薬品カセッ
トまたはマイクロ製作された器具、すなわちチップを備える。カセットまたはチ
ップのいずれかは、好ましくは、第1チャンバを備え、それは1つ以上の第2チ
ャンバと連通にあり、そのチャンバは流体反応物または反応体の貯蔵のため、す
なわち供給チャンバ、反応を受ける反応体の配置のため、すなわち、反応チャン
バ、流体の容積を測定するため、すなわち、計量チャンバ、など、に設計されて
いる。そのようなチャンバは、好ましくは、約0.001μlから約700μl
、より好ましくは、約0.01μlから約500μl、更により好ましくは、0
.01μlから約250μlの容積を有する。チャンバは、いずれか適切な材料
から成り、適切な材料は、モールドされ、加熱され、高分子の吸収を最小化する
、および他のパラメータの能力に対して選定される。適切な材料は、例えば、ガ
ラス、プラスチック、セラミック、またはその組合わせを含む。実施の形態の1
つでは、本発明に沿って使用される反応チャンバは、反応チャンバへ、およびか
ら材料を通過させるための少なくとも2つの流体交換チャネルへ接続され、それ
は、診断手順で変性の化学的手段を採用するために特に重要である。反応チャン
バは、好ましくは、約20°Cと75°C間の温度で、約2°C内の一定の温度
に維持される。反応チャンバは、増強された蛍光法のために上述のテクスチャ付
けた材料を含むことが、更に好ましい。
【0051】 膜のようなプローブおよびテクスチャ付けた面が配置されるロケーションは、
好ましくは、例えば、容器またはチャンバ内の任意の位置である。プローブは、
好ましくは、抗体または核酸であり、それらは、それぞれ、対象の抗原に特異性
を持ち、または対象の核酸に相補性を持つ。好ましくは、ロケーションは、マイ
クロ流体器具内の任意の内側部位に配置される。代替として、プローブは、付着
でない形態で使用でき、マイクロ流体器具内で、抗原または単位複製配列のよう
な特定の生化学分子が配置されているロケーションまで移動させられ、例えば、
核酸ハイブリダイゼーションを介する特異性認知または妥当な免疫学的認知を提
供でき、結果としてそのような特異性認知が生じた場合、プローブは特定の生化
学分子へ付着する。上記テクスチャ付けた材料も、プローブと生化学分子間の特
異性の認知のこのサイトに配置され、好ましくは発蛍光団を含むプローブが特異
性の認知のサイトに付着され、そのサイトで蛍光の局在化を介して検出されるよ
うに手段が提供されることが更に好ましい。そのような付着のための手段は、結
合半体の使用を含み、特異的に付着する対の各々が使用でき、それにより、対の
一方の半体がテクスチャ付けた材料へ付着でき、対の他方の半体がプローブへ付
着できる。
好ましくは、例えば、容器またはチャンバ内の任意の位置である。プローブは、
好ましくは、抗体または核酸であり、それらは、それぞれ、対象の抗原に特異性
を持ち、または対象の核酸に相補性を持つ。好ましくは、ロケーションは、マイ
クロ流体器具内の任意の内側部位に配置される。代替として、プローブは、付着
でない形態で使用でき、マイクロ流体器具内で、抗原または単位複製配列のよう
な特定の生化学分子が配置されているロケーションまで移動させられ、例えば、
核酸ハイブリダイゼーションを介する特異性認知または妥当な免疫学的認知を提
供でき、結果としてそのような特異性認知が生じた場合、プローブは特定の生化
学分子へ付着する。上記テクスチャ付けた材料も、プローブと生化学分子間の特
異性の認知のこのサイトに配置され、好ましくは発蛍光団を含むプローブが特異
性の認知のサイトに付着され、そのサイトで蛍光の局在化を介して検出されるよ
うに手段が提供されることが更に好ましい。そのような付着のための手段は、結
合半体の使用を含み、特異的に付着する対の各々が使用でき、それにより、対の
一方の半体がテクスチャ付けた材料へ付着でき、対の他方の半体がプローブへ付
着できる。
【0052】 そのような結合半体は、本発明において種々の方法で使用され、それにより、
例えば、その結合対が基体をプローブへ付着でき、ここで基体はテクスチャ付け
た材料を含むことができる。このように、例えば、マイクロ流体器具の内部、ま
たは微小粒子の外面は、そこへ第1の半体を付着してよく、プローブはそこへ第
2の半体を付着してよく、それにより、第1の半体は、特異的に、または優先し
て第2の半体へ結合し、それで、結合対を形成する。適切な結合対は、(a)ビ
オチンとストレプトアビジン、(b)抗原と抗原を特異的に認知する抗体、(c
)アミンとヒドラジド、(d)プロテインAと免疫グロブリンG、(e)炭水化
物と炭水化物を認知するレクチン、(f)核酸とその補体、およびその類似を含
み、しかしそれに限定されず、ここで、そのような結合対の各構成員は、ここで
「半体」と称する。従がって、第1の半体は、例えば、ビオチンであり得て、第
2の半体はストレプトアビジンであり得て、それは相互に結合するが、そのいず
れも、例えばアミンまたはヒドラジドのような、しかし、特異的に相互に結合す
る、例えば、第3または第4の半体へは結合しない。結合対の化学種は、それぞ
れのプローブまたは基体へ直接的に化学的にリンクでき、またはこの技術で既知
であるようなリンク基を介して化学的に結合され、第1または第2のプライマ上
に含まれる結合対の対応化学種を含む面に関して、それもまた、直接、または適
切なリンク基の手段を介して結合できる。
例えば、その結合対が基体をプローブへ付着でき、ここで基体はテクスチャ付け
た材料を含むことができる。このように、例えば、マイクロ流体器具の内部、ま
たは微小粒子の外面は、そこへ第1の半体を付着してよく、プローブはそこへ第
2の半体を付着してよく、それにより、第1の半体は、特異的に、または優先し
て第2の半体へ結合し、それで、結合対を形成する。適切な結合対は、(a)ビ
オチンとストレプトアビジン、(b)抗原と抗原を特異的に認知する抗体、(c
)アミンとヒドラジド、(d)プロテインAと免疫グロブリンG、(e)炭水化
物と炭水化物を認知するレクチン、(f)核酸とその補体、およびその類似を含
み、しかしそれに限定されず、ここで、そのような結合対の各構成員は、ここで
「半体」と称する。従がって、第1の半体は、例えば、ビオチンであり得て、第
2の半体はストレプトアビジンであり得て、それは相互に結合するが、そのいず
れも、例えばアミンまたはヒドラジドのような、しかし、特異的に相互に結合す
る、例えば、第3または第4の半体へは結合しない。結合対の化学種は、それぞ
れのプローブまたは基体へ直接的に化学的にリンクでき、またはこの技術で既知
であるようなリンク基を介して化学的に結合され、第1または第2のプライマ上
に含まれる結合対の対応化学種を含む面に関して、それもまた、直接、または適
切なリンク基の手段を介して結合できる。
【0053】 好ましくは、本発明の蛍光増強方法は、マイクロ流体器具、好ましくは、カセ
ットまたはチップにおいて実施され、その2つの間の本質的な差は、使用される
試料または反応物の量、およびそこに含まれるチャネルとチャンバのサイズであ
る。ある実施の形態では、チャンバは反応のサイトとして機能し、ここでは「第
1チャンバ」と称される。チャンバはまた、反応物または増幅されたポリヌクレ
オチドに対する貯蔵サイトとして、または廃棄物容器として機能でき、各チャン
バは、ここでは「第2チャンバ」と称される。ある実施の形態では、特定のチャ
ンバが反応のためのサイトとして機能できるので、それが第1チャンバであるが
、ここで実施される方法の別の工程では、同じチャンバが、対象の分析物の存在
の診断のための、または廃棄物容器のためのサイトとして機能するので、それが
第2チャンバである。
ットまたはチップにおいて実施され、その2つの間の本質的な差は、使用される
試料または反応物の量、およびそこに含まれるチャネルとチャンバのサイズであ
る。ある実施の形態では、チャンバは反応のサイトとして機能し、ここでは「第
1チャンバ」と称される。チャンバはまた、反応物または増幅されたポリヌクレ
オチドに対する貯蔵サイトとして、または廃棄物容器として機能でき、各チャン
バは、ここでは「第2チャンバ」と称される。ある実施の形態では、特定のチャ
ンバが反応のためのサイトとして機能できるので、それが第1チャンバであるが
、ここで実施される方法の別の工程では、同じチャンバが、対象の分析物の存在
の診断のための、または廃棄物容器のためのサイトとして機能するので、それが
第2チャンバである。
【0054】 カセットまたはチップで使用されるチャンバは、1つ以上の第1チャンバであ
り、その中で蛍光増強に関するステップが起り得る、勿論、同じステップが、特
定の実施の形態で使用される設計に依存して第2チャンバまたはチャネルで起る
こともできる。本発明において使用されるカセットまたはチップは、少なくとも
1つの第2チャンバも含み、蛍光増強法で使用される反応物を入れる容器として
、または蛍光増強法からの結果としての廃棄物のための容器として使用される。
初期には反応物の貯蔵設備であった同じ第2チャンバは、方法の早い段階で廃棄
物の容器として、または反応チャンバとして、または時間が経て両方としての役
を再度果たすことができる。単にカセットおよびチップを置く設計は、第1また
は第2チャンバの配置、および流体交換チャネルの相互接続に対する設計バリエ
ーションの非常な許容度を提供する。それ自体の非可逆的「バルブ」を提供する
Bursapak (登録商標)タイプのチャンバを含め、可逆的、非可逆的両種のバル
ブがこれに関連して使用できる。米国特許出願第08/664,780号および
PCT/US97/00298を参照されたい。
り、その中で蛍光増強に関するステップが起り得る、勿論、同じステップが、特
定の実施の形態で使用される設計に依存して第2チャンバまたはチャネルで起る
こともできる。本発明において使用されるカセットまたはチップは、少なくとも
1つの第2チャンバも含み、蛍光増強法で使用される反応物を入れる容器として
、または蛍光増強法からの結果としての廃棄物のための容器として使用される。
初期には反応物の貯蔵設備であった同じ第2チャンバは、方法の早い段階で廃棄
物の容器として、または反応チャンバとして、または時間が経て両方としての役
を再度果たすことができる。単にカセットおよびチップを置く設計は、第1また
は第2チャンバの配置、および流体交換チャネルの相互接続に対する設計バリエ
ーションの非常な許容度を提供する。それ自体の非可逆的「バルブ」を提供する
Bursapak (登録商標)タイプのチャンバを含め、可逆的、非可逆的両種のバル
ブがこれに関連して使用できる。米国特許出願第08/664,780号および
PCT/US97/00298を参照されたい。
【0055】 これに関連して、膜ベースのハイブリダイゼーションは、従来のペトリ皿での
ハイブリダイゼーションに比較して、マイクロ構成された器具でより効率的であ
るかもしれない。効率は、例えば、以下のような、これらの構造の寸法により決
定されるこれらの器具の流体の流れ特性に関係するようである。
ハイブリダイゼーションに比較して、マイクロ構成された器具でより効率的であ
るかもしれない。効率は、例えば、以下のような、これらの構造の寸法により決
定されるこれらの器具の流体の流れ特性に関係するようである。
【0056】 本発明において使用されるカセットに関して、より詳細には、カセット自体は
、カセットを形成するために十分なモールド成形性、化学的作用への十分な強度
および抵抗性、および類似の特性を有するいずれか適切な材料で作成できる。す
なわち、例えば、カセットは、好ましくは、高密度ポリエチレンのようなモール
ド成形プラスチックで形成されるが、ガラスおよびシリコンベース材料のような
、核酸同定または増幅で使用される化学薬品に適切な抵抗性のある他の材料も使
用できる。カセットがプラスチックで成形される場合、好ましくは、モールド成
形プロセスで成形され、キャビティおよびチャネルを形成するように使用され、
上部および下部プラスチックフィルムでシールされ、図3に示すような、チャン
バと流体交換チャネルを形成する。そのようなチャンバA、B、C、およびチャ
ネル101と102は、化学的エッチングまたはレーザー切削 (ablation) によ
り、ガラスおよびシリコン材料のような適切な材料で形成される。上部および下
部のフィルムは、普通には、約0.3ミルから約5ミル、好ましくは、約1ミル
から約3ミルの厚さを有する。約1cm以上の直径を有するチャンバに対しては
、フィルムの厚さは、より好ましくは約2ミルである。図3の例によりここに設
定される例で、蛍光増強に関する反応が起る第1チャンバCは、普通には、上部
と下部のフィルム間で、約0.1mmから約3mm、好ましくは、約0.5mm
から約1.0mmの厚さ、および上部と下部のフィルムの内面により規定され、
好ましくは約0.05cm2から約2cm2、より好ましくは、約0.1cm2か ら約1cm2、更により好ましくは約0.5cm2の面積を有する。第1チャンバ
の寸法は、好ましくは、流体の迅速なスループットを許すのに十分小さいサイズ
とされ、それにより、そこに付着された半体を有する基体の化学的条件(以下に
更に検討する)は、予測できて迅速に(約1から約10秒の程度)交換できる。
好ましくは、カセットでの各第1チャンバの全容積は、約5μlと約250μl
の間、より好ましくは、約10μlと約100μlの間である。好ましくは、各
第1チャンバは、約1mm以下の厚さ(すなわち、上部フィルムと下部フィルム
の間の距離)を有する。
、カセットを形成するために十分なモールド成形性、化学的作用への十分な強度
および抵抗性、および類似の特性を有するいずれか適切な材料で作成できる。す
なわち、例えば、カセットは、好ましくは、高密度ポリエチレンのようなモール
ド成形プラスチックで形成されるが、ガラスおよびシリコンベース材料のような
、核酸同定または増幅で使用される化学薬品に適切な抵抗性のある他の材料も使
用できる。カセットがプラスチックで成形される場合、好ましくは、モールド成
形プロセスで成形され、キャビティおよびチャネルを形成するように使用され、
上部および下部プラスチックフィルムでシールされ、図3に示すような、チャン
バと流体交換チャネルを形成する。そのようなチャンバA、B、C、およびチャ
ネル101と102は、化学的エッチングまたはレーザー切削 (ablation) によ
り、ガラスおよびシリコン材料のような適切な材料で形成される。上部および下
部のフィルムは、普通には、約0.3ミルから約5ミル、好ましくは、約1ミル
から約3ミルの厚さを有する。約1cm以上の直径を有するチャンバに対しては
、フィルムの厚さは、より好ましくは約2ミルである。図3の例によりここに設
定される例で、蛍光増強に関する反応が起る第1チャンバCは、普通には、上部
と下部のフィルム間で、約0.1mmから約3mm、好ましくは、約0.5mm
から約1.0mmの厚さ、および上部と下部のフィルムの内面により規定され、
好ましくは約0.05cm2から約2cm2、より好ましくは、約0.1cm2か ら約1cm2、更により好ましくは約0.5cm2の面積を有する。第1チャンバ
の寸法は、好ましくは、流体の迅速なスループットを許すのに十分小さいサイズ
とされ、それにより、そこに付着された半体を有する基体の化学的条件(以下に
更に検討する)は、予測できて迅速に(約1から約10秒の程度)交換できる。
好ましくは、カセットでの各第1チャンバの全容積は、約5μlと約250μl
の間、より好ましくは、約10μlと約100μlの間である。好ましくは、各
第1チャンバは、約1mm以下の厚さ(すなわち、上部フィルムと下部フィルム
の間の距離)を有する。
【0057】 カセットでの流体交換チャネルは、普通には円筒形を描き、約200μmと約
500μm間の直径を有し、代替として、チャネルは、約200μmから約50
0μmのそれぞれ幅または深さを有する他の形状で構成できる。第2チャンバは
、普通には、約5μlと約500μlの間、好ましくは、約10μlから約20
0μl、より好ましくは、約30μlから約160μlの体積容量を有する。第
2チャンバは、特に、非特異性の結合の減少で、増強された蛍光によるハイブリ
ダイゼーションで必要な反応物を収容できる。反応物は、ハイブリッド反応物、
洗浄流体、微小粒子、Tris-EDTA(TE)バッファ、およびそれらの類似を含む ことができ、そのような反応物は、乾燥または液体の形態で第2チャンバに入れ
ることができ、乾燥形態の場合、他の第2チャンバに収容された水または他の液
体反応物、または外部ソースから供給される水または他の液体反応物から構成で
きる。所定の容積を計量するために使用される第2チャンバの容積は、好ましく
は、約5μlから約50μlである。
500μm間の直径を有し、代替として、チャネルは、約200μmから約50
0μmのそれぞれ幅または深さを有する他の形状で構成できる。第2チャンバは
、普通には、約5μlと約500μlの間、好ましくは、約10μlから約20
0μl、より好ましくは、約30μlから約160μlの体積容量を有する。第
2チャンバは、特に、非特異性の結合の減少で、増強された蛍光によるハイブリ
ダイゼーションで必要な反応物を収容できる。反応物は、ハイブリッド反応物、
洗浄流体、微小粒子、Tris-EDTA(TE)バッファ、およびそれらの類似を含む ことができ、そのような反応物は、乾燥または液体の形態で第2チャンバに入れ
ることができ、乾燥形態の場合、他の第2チャンバに収容された水または他の液
体反応物、または外部ソースから供給される水または他の液体反応物から構成で
きる。所定の容積を計量するために使用される第2チャンバの容積は、好ましく
は、約5μlから約50μlである。
【0058】 上部と下部のフィルムは、好ましくは、少なくとも約120°Cの温度に耐え
、厚さで、約0.5と4ミルの間、より好ましくは、約1と約3ミルの間である
。膜の薄さは、第1チャンバ内またはカセット内で実行される反応が配置される
ことになる任意の場所と、所望の場合、試験される分析物の試料のために一定の
温度に安定させるのに使用できる、隣接の加熱または冷却装置との間の迅速な熱
交換を容易にする。
、厚さで、約0.5と4ミルの間、より好ましくは、約1と約3ミルの間である
。膜の薄さは、第1チャンバ内またはカセット内で実行される反応が配置される
ことになる任意の場所と、所望の場合、試験される分析物の試料のために一定の
温度に安定させるのに使用できる、隣接の加熱または冷却装置との間の迅速な熱
交換を容易にする。
【0059】 供給、廃棄、および計量チャンバを含む、上記第1チャンバ、第2チャンバ、
流体交換チャネル、および、先に更に検討したバルブと圧送(例えば、米国出願
第08/664,780号参照)を備えるカセットは、どんな適切な設計であっ
てもよい。実際、少なくとも1つの第2チャンバ、少なくとも1つの第1チャン
バ、およびその間の連通の手段(すなわち、流体交換チャネル)を含み、分析物
の存在の有無の診断に対して適切な、いずれのカセットの設計も好ましい。その
ような設計は図3に示され、ここで、第1チャンバCは、第2チャンバAおよび
Bと、流体交換チャネル101および102の手段により流体連通にある。より
好ましくは、カセットは、試料の容器とその内容物の取入れのために6個までの
ウエルを備え、それは、増幅される試料が分配される1つ以上の第1チャンバへ
接続されている。そこ付着されたプローブ、または分析物を有する面は、第1チ
ャンバの内面のようなマイクロ流体器具の内面であることができ、または、上記
で検討したように、面は第2チャンバに貯蔵できる微小粒子であり得る。
流体交換チャネル、および、先に更に検討したバルブと圧送(例えば、米国出願
第08/664,780号参照)を備えるカセットは、どんな適切な設計であっ
てもよい。実際、少なくとも1つの第2チャンバ、少なくとも1つの第1チャン
バ、およびその間の連通の手段(すなわち、流体交換チャネル)を含み、分析物
の存在の有無の診断に対して適切な、いずれのカセットの設計も好ましい。その
ような設計は図3に示され、ここで、第1チャンバCは、第2チャンバAおよび
Bと、流体交換チャネル101および102の手段により流体連通にある。より
好ましくは、カセットは、試料の容器とその内容物の取入れのために6個までの
ウエルを備え、それは、増幅される試料が分配される1つ以上の第1チャンバへ
接続されている。そこ付着されたプローブ、または分析物を有する面は、第1チ
ャンバの内面のようなマイクロ流体器具の内面であることができ、または、上記
で検討したように、面は第2チャンバに貯蔵できる微小粒子であり得る。
【0060】 代替として、本発明に沿って使用されるマイクロ製作された器具、すなわち、
チップは、好ましくは、流体で満たされたチャネルまたはキャピラリを含み、こ
こで、チャネルは、好ましくは、約300μm未満の幅と300μm未満の深さ
であり、より好ましくは約200μm未満の幅と深さであり、更により好ましく
は約100μm未満の幅と深さである。マイクロ製作された器具は、ガラス、プ
ラスチック、およびそれらの類似を含むが、それらに限定されないいずれか適切
な材料または材料の組合わせで構成でき、適切な材料は、室温(約25°C)で
、少なくとも40°Cまで実質的に強固であり、少なくとも120°Cまでの温
度で固体のままである。マイクロ製作された器具に含まれるチャネルに加え、好
ましい器具は、図3に示すように、チャネルにより相互に接続された第1チャン
バと1つ以上の第2チャンバを備える。図3は、上で説明したようなチップとカ
セット間のサイズの違いにかかわらないマイクロ流体器具を図解する。第1チャ
ンバは、代替として反応チャンバと称されるが、しかし、本方法の利点の1つは
、以下更に検討するように、どのチャンバ、またはどのチャネル、またはそのど
の部分も対象の分析物を検出するために必要なステップのサイトとして使用する
能力である。第2チャンバは、代替として、保持、供給、または廃棄のチャンバ
と称される。チップが構成される上記材料は、例えば、チャンバ、好ましくは第
2チャンバのところに少なくとも1つの変形可能な壁を含むように、チャンバの
ところで、あるいはその付近で変えることができる。好ましくは、チップは、変
形可能な壁を有する少なくとも2つの第2チャンバを有する。
チップは、好ましくは、流体で満たされたチャネルまたはキャピラリを含み、こ
こで、チャネルは、好ましくは、約300μm未満の幅と300μm未満の深さ
であり、より好ましくは約200μm未満の幅と深さであり、更により好ましく
は約100μm未満の幅と深さである。マイクロ製作された器具は、ガラス、プ
ラスチック、およびそれらの類似を含むが、それらに限定されないいずれか適切
な材料または材料の組合わせで構成でき、適切な材料は、室温(約25°C)で
、少なくとも40°Cまで実質的に強固であり、少なくとも120°Cまでの温
度で固体のままである。マイクロ製作された器具に含まれるチャネルに加え、好
ましい器具は、図3に示すように、チャネルにより相互に接続された第1チャン
バと1つ以上の第2チャンバを備える。図3は、上で説明したようなチップとカ
セット間のサイズの違いにかかわらないマイクロ流体器具を図解する。第1チャ
ンバは、代替として反応チャンバと称されるが、しかし、本方法の利点の1つは
、以下更に検討するように、どのチャンバ、またはどのチャネル、またはそのど
の部分も対象の分析物を検出するために必要なステップのサイトとして使用する
能力である。第2チャンバは、代替として、保持、供給、または廃棄のチャンバ
と称される。チップが構成される上記材料は、例えば、チャンバ、好ましくは第
2チャンバのところに少なくとも1つの変形可能な壁を含むように、チャンバの
ところで、あるいはその付近で変えることができる。好ましくは、チップは、変
形可能な壁を有する少なくとも2つの第2チャンバを有する。
【0061】 チップの第1チャンバの寸法は、例えば、幅約1500μmから約10μm、
長さ約1500μmから約10μm、および深さ約5μmから約500μmの寸
法である。より好ましくは、第1チャンバの寸法は、幅約1000μmから約1
00μm、長さ約1000μmから約50μm、および深さ約10μmから約1
00μmである。更により好ましくは、第1チャンバの寸法は、幅約1000μ
mから約500μm、長さ約1000μmから約70μm、および深さ約20μ
mから約50μmである。チップの第1チャンバの体積容量は、好ましくは約0
.05μlから約50μl、より好ましくは約0.1μlから約10μl、更に
より好ましくは約0.1μlから約1μlである。
長さ約1500μmから約10μm、および深さ約5μmから約500μmの寸
法である。より好ましくは、第1チャンバの寸法は、幅約1000μmから約1
00μm、長さ約1000μmから約50μm、および深さ約10μmから約1
00μmである。更により好ましくは、第1チャンバの寸法は、幅約1000μ
mから約500μm、長さ約1000μmから約70μm、および深さ約20μ
mから約50μmである。チップの第1チャンバの体積容量は、好ましくは約0
.05μlから約50μl、より好ましくは約0.1μlから約10μl、更に
より好ましくは約0.1μlから約1μlである。
【0062】 第2チャンバは、いずれか適切な容積を有し、それによりチップが設計された
核酸の増幅プロトコルのために、十分な反応物および廃棄物のチャンバが、そこ
でチップに提供される。多くの用途で要求される第2チャンバの容積は、好まし
くは、約500μlを超えず、より詳細には、廃棄物の廃棄のために使用される
第2チャンバの体積容量は、好ましくは約200μlから約500μlであり、
反応物の貯蔵のために使用される第2チャンバの体積容量は好ましくは約50μ
lから約250μlである。
核酸の増幅プロトコルのために、十分な反応物および廃棄物のチャンバが、そこ
でチップに提供される。多くの用途で要求される第2チャンバの容積は、好まし
くは、約500μlを超えず、より詳細には、廃棄物の廃棄のために使用される
第2チャンバの体積容量は、好ましくは約200μlから約500μlであり、
反応物の貯蔵のために使用される第2チャンバの体積容量は好ましくは約50μ
lから約250μlである。
【0063】 チップに含まれるチャネルの寸法は、好ましくは幅約5μmから約500μm
、深さ約5μmから約500μm、および長さ約500μmから約250μmで
ある。より好ましくは、チップに含まれるチャネルの寸法は、好ましくは幅約1
5μmから約300μm、深さ約10μmから約300μm、および長さ約50
0μmから約100μmである。最も好ましくは、チャネルの寸法は、幅が例え
ば50μmのような約30μmから約150μm、深さが例えば20μmのよう
な約20μmから約100μm、および長さ約500μmから約50μmである
。
、深さ約5μmから約500μm、および長さ約500μmから約250μmで
ある。より好ましくは、チップに含まれるチャネルの寸法は、好ましくは幅約1
5μmから約300μm、深さ約10μmから約300μm、および長さ約50
0μmから約100μmである。最も好ましくは、チャネルの寸法は、幅が例え
ば50μmのような約30μmから約150μm、深さが例えば20μmのよう
な約20μmから約100μm、および長さ約500μmから約50μmである
。
【0064】 チャネルは、マイクロ流体器具の第1チャンバに関して同一直線に、または同
一直線でなく配置されることができる。例えば、チャネルとチャンバの同一直線
編成を有する1つの実施の形態では、全てのチャネルとチャンバは、チップの壁
と平行である1つの同一面に整列される。対照的に、同一直線でない編成を有す
る代替の実施の形態は、チップの1つの壁に隣接して位置するチャンバ、および
チップの他の壁に隣接して位置する全てのまたは一部のチャネルを有することが
でき、すなわち、チャネルまたは一部のチャネルは、少なくとも1つのチャンバ
とは異なる平面に位置する。そのような実施の形態では、チャネルは、チャンバ
の方へ曲がる隣接壁と平行な面から、曲りによりチャンバへ接続する。代替とし
て、チャンバへ接続するチャネルはチャンバとインタフェースでき、それにより
、1つのチャネルは、例えば、四角のまたは立方体形状のチャンバの対向角へ接
続できる。
一直線でなく配置されることができる。例えば、チャネルとチャンバの同一直線
編成を有する1つの実施の形態では、全てのチャネルとチャンバは、チップの壁
と平行である1つの同一面に整列される。対照的に、同一直線でない編成を有す
る代替の実施の形態は、チップの1つの壁に隣接して位置するチャンバ、および
チップの他の壁に隣接して位置する全てのまたは一部のチャネルを有することが
でき、すなわち、チャネルまたは一部のチャネルは、少なくとも1つのチャンバ
とは異なる平面に位置する。そのような実施の形態では、チャネルは、チャンバ
の方へ曲がる隣接壁と平行な面から、曲りによりチャンバへ接続する。代替とし
て、チャンバへ接続するチャネルはチャンバとインタフェースでき、それにより
、1つのチャネルは、例えば、四角のまたは立方体形状のチャンバの対向角へ接
続できる。
【0065】 どのマイクロ流体器具においても、2つのチャンバは物理的に相互に隣接して
配置でき、それにより、流体連通を生ずる共通オリフィルを有するが、好ましく
は可逆的にシールされている。代替として、チャンバは、物理的に相互に離れて
配置でき、それは、ここで「非接触 (non-touching) チャンバ」と称し、その例
は図3に示され、ここで非接触チャンバはA、B、およびCとラベル付けされて
いる。好ましくは、非接触チャンバは、チャネルまたはキャピラリを介して相互
に流体連通にあり、図3で101および102とラベル付けされている。チャン
バは、楕円体、立方体、長円体およびそれらの類似を含むが、それらに限定され
ない任意の形状を持つことができる。
配置でき、それにより、流体連通を生ずる共通オリフィルを有するが、好ましく
は可逆的にシールされている。代替として、チャンバは、物理的に相互に離れて
配置でき、それは、ここで「非接触 (non-touching) チャンバ」と称し、その例
は図3に示され、ここで非接触チャンバはA、B、およびCとラベル付けされて
いる。好ましくは、非接触チャンバは、チャネルまたはキャピラリを介して相互
に流体連通にあり、図3で101および102とラベル付けされている。チャン
バは、楕円体、立方体、長円体およびそれらの類似を含むが、それらに限定され
ない任意の形状を持つことができる。
【0066】 本発明が、好ましくはマイクロ流体器具で実現される理由の1つは、そのよう
な器具は、そこに、本発明で使用される対象のプローブおよび分析物を含む、微
小粒子または反応物を移転する手段を含むからである。例えば、そのような移転
は、器具に含まれる流体を圧送して行なうことができ、流体に接続された注射器
手段のような機械的手段を使用する圧送を含むが、それには限定されず、ここで
、そのプランジャを押すことで正圧を生じ、マイクロ流体器具内で移動を誘発し
、注射器の胴からプランジャを引くことで負圧を生じ、マイクロ流体内で反対の
方向へ移動を誘発する。マイクロ流体器具内で流体および粒状物質を含んだ流体
を動かす代替の方法は、導電性流体を使用する電極ベースの圧送を含むが、それ
に限定されない。例えば、米国出願第08/838,102号を参照されたい。
な器具は、そこに、本発明で使用される対象のプローブおよび分析物を含む、微
小粒子または反応物を移転する手段を含むからである。例えば、そのような移転
は、器具に含まれる流体を圧送して行なうことができ、流体に接続された注射器
手段のような機械的手段を使用する圧送を含むが、それには限定されず、ここで
、そのプランジャを押すことで正圧を生じ、マイクロ流体器具内で移動を誘発し
、注射器の胴からプランジャを引くことで負圧を生じ、マイクロ流体内で反対の
方向へ移動を誘発する。マイクロ流体器具内で流体および粒状物質を含んだ流体
を動かす代替の方法は、導電性流体を使用する電極ベースの圧送を含むが、それ
に限定されない。例えば、米国出願第08/838,102号を参照されたい。
【0067】 上で記載したように、本発明は、チップまたはカセット中で、微小粒子および
他の反応物、同様に分析物および他の反応物、同様に分析物の移転を含む。微小
粒子は、何れの形状であってもよく、好ましくは、球状であり、球状の場合、「
ビーズ」と称する。好ましくは、微小粒子の直径は約1mmを超えない長さまた
は直径であり、より好ましくは約500μm未満、および更により好ましくは約
100μm未満である。好ましい実施の形態のあるものでは、微小粒子の最大寸
法は約0.5μmから約25μmであり、より好ましくは約1μmから10μm
、更により好ましくは約2μmから約5μmである。本発明に沿って使用される
ビーズの直径は、チャネルを通る通過が好ましい場合、好ましくは、チャネルの
断面寸法未満である。円筒の直径のような断面寸法は、チャネルの通過許容差を
規定する。逆に、微小粒子が、チャネルを通る通過から排除されるのが好ましい
場合、微小粒子は、少なくとも1つの断面寸法、すなわち以下に更に記載するよ
うに、チャネルの通過許容差を超える直径を有するのが好ましい。
他の反応物、同様に分析物および他の反応物、同様に分析物の移転を含む。微小
粒子は、何れの形状であってもよく、好ましくは、球状であり、球状の場合、「
ビーズ」と称する。好ましくは、微小粒子の直径は約1mmを超えない長さまた
は直径であり、より好ましくは約500μm未満、および更により好ましくは約
100μm未満である。好ましい実施の形態のあるものでは、微小粒子の最大寸
法は約0.5μmから約25μmであり、より好ましくは約1μmから10μm
、更により好ましくは約2μmから約5μmである。本発明に沿って使用される
ビーズの直径は、チャネルを通る通過が好ましい場合、好ましくは、チャネルの
断面寸法未満である。円筒の直径のような断面寸法は、チャネルの通過許容差を
規定する。逆に、微小粒子が、チャネルを通る通過から排除されるのが好ましい
場合、微小粒子は、少なくとも1つの断面寸法、すなわち以下に更に記載するよ
うに、チャネルの通過許容差を超える直径を有するのが好ましい。
【0068】 微小粒子は、適切などのような材料から成ってもよく、材料の選定は、その特
性により導かれ、その特性は、好ましくは、ポリスチレンのような最少の非特異
性吸着特性を含む。特定の好ましい実施の形態では、微小粒子は、上記テクスチ
ャ付けた材料を、微小粒子それ自体 (per se) の内容として、またはそこへの付
着として含む。微小粒子は、例えば、ガラス、セルロース、または、セルロース
誘導体、ナイロンまたはポリテトラフルオロエチレン(「テフロン」)のような
プラスチック、金属、セラミック、およびそれらの類似および組合わせから成る
ことができ、好ましくは、上記のように、更にテクスチャ付けた材料を備える。
移転が所望され、好ましい微小粒子は、微小粒子が、採用されるキャピラリまた
はチャネルの断面値と接近した長さまたは直径を有する場合、この技術に精通し
た者は柔軟性を有する材料を選択できる。そのような柔軟な微小粒子は、キャピ
ラリまたはチャネルの通過許容差に近い、または、たとえ通過許容より大きい、
直径を有するにも関らず、微小粒子を移転するために、マイクロ流体器具内で流
体を、例えば、電極ベースの圧送による動きを起こさせる場合、チャネルを「ス
クイーズする」ことができる。逆に、微小粒子がチャネルの開口より少しだけ大
きく、微小粒子が特定の貯蔵所に留まることを要する特定のチップまたはカセッ
トの設計の場合、硬い材料が好ましい。
性により導かれ、その特性は、好ましくは、ポリスチレンのような最少の非特異
性吸着特性を含む。特定の好ましい実施の形態では、微小粒子は、上記テクスチ
ャ付けた材料を、微小粒子それ自体 (per se) の内容として、またはそこへの付
着として含む。微小粒子は、例えば、ガラス、セルロース、または、セルロース
誘導体、ナイロンまたはポリテトラフルオロエチレン(「テフロン」)のような
プラスチック、金属、セラミック、およびそれらの類似および組合わせから成る
ことができ、好ましくは、上記のように、更にテクスチャ付けた材料を備える。
移転が所望され、好ましい微小粒子は、微小粒子が、採用されるキャピラリまた
はチャネルの断面値と接近した長さまたは直径を有する場合、この技術に精通し
た者は柔軟性を有する材料を選択できる。そのような柔軟な微小粒子は、キャピ
ラリまたはチャネルの通過許容差に近い、または、たとえ通過許容より大きい、
直径を有するにも関らず、微小粒子を移転するために、マイクロ流体器具内で流
体を、例えば、電極ベースの圧送による動きを起こさせる場合、チャネルを「ス
クイーズする」ことができる。逆に、微小粒子がチャネルの開口より少しだけ大
きく、微小粒子が特定の貯蔵所に留まることを要する特定のチップまたはカセッ
トの設計の場合、硬い材料が好ましい。
【0069】 本発明に沿って使用される好ましい微小粒子は、磁気を帯びているか、または
マイクロ流体器具あるいはその一部分へ印加される磁界により捕捉されまたは操
作されることにより応答する。例えば、磁気的粒子は、磁石を直近の位置に配置
することにより、チャンバのようなマイクロ流体器具の特定の位置に局在化でき
、それにより流体連通状態にあるチャネルへ微小粒子が侵入することを防ぐ。そ
のような磁気的微小粒子は、上記テクスチャ付けた材料を含むことができ、その
テクスチャ付けた材料は、好ましくは、磁気成分が蛍光プロセスを抑制しないよ
うに微小粒子へ付着される。例えば、テクスチャ付けた材料は、化学的リンカー
を介して付着でき、それにより、テクスチャ付けた材料と蛍光のサイトは、微小
粒子の磁気的特性のサイトから離される。
マイクロ流体器具あるいはその一部分へ印加される磁界により捕捉されまたは操
作されることにより応答する。例えば、磁気的粒子は、磁石を直近の位置に配置
することにより、チャンバのようなマイクロ流体器具の特定の位置に局在化でき
、それにより流体連通状態にあるチャネルへ微小粒子が侵入することを防ぐ。そ
のような磁気的微小粒子は、上記テクスチャ付けた材料を含むことができ、その
テクスチャ付けた材料は、好ましくは、磁気成分が蛍光プロセスを抑制しないよ
うに微小粒子へ付着される。例えば、テクスチャ付けた材料は、化学的リンカー
を介して付着でき、それにより、テクスチャ付けた材料と蛍光のサイトは、微小
粒子の磁気的特性のサイトから離される。
【0070】 より好ましくは、微小粒子は、強磁性である。強磁性微小粒子は、例えば、ポ
リスチレンマトリックス中に分散された鉄から成ることができ、例えば、Dynal (ノルウェー国、オスロ)から入手することができる。より好ましくは、微小粒
子は、Dynal (Oslo, Norway) および他の市販メーカーにより販売される超強磁 性である。超強磁性微小粒子は、実質的に残留磁化またはヒステリシスを有しな
いという点で、強磁性微小粒子とは異なる。換言すれば、超強磁性微小粒子は、
強磁性微小粒子と同じ様に磁界に反応するが、強磁性粒子は残留磁化とヒステリ
シスを示し、従がって、磁界への暴露後に共に群がる傾向があるのに対し、超強
磁性微小粒子は、磁界が除去されると完全に減磁され、それにより磁界除去後に
即時に群がることなく再分散されることを超強磁性微小粒子に可能にする。好ま
しい微小粒子は、そこへ付着された半体を有する。適切な半体は、好ましくは第
2の半体の手段により、微小粒子を別の基体へ結合するための手段を提供する。
リスチレンマトリックス中に分散された鉄から成ることができ、例えば、Dynal (ノルウェー国、オスロ)から入手することができる。より好ましくは、微小粒
子は、Dynal (Oslo, Norway) および他の市販メーカーにより販売される超強磁 性である。超強磁性微小粒子は、実質的に残留磁化またはヒステリシスを有しな
いという点で、強磁性微小粒子とは異なる。換言すれば、超強磁性微小粒子は、
強磁性微小粒子と同じ様に磁界に反応するが、強磁性粒子は残留磁化とヒステリ
シスを示し、従がって、磁界への暴露後に共に群がる傾向があるのに対し、超強
磁性微小粒子は、磁界が除去されると完全に減磁され、それにより磁界除去後に
即時に群がることなく再分散されることを超強磁性微小粒子に可能にする。好ま
しい微小粒子は、そこへ付着された半体を有する。適切な半体は、好ましくは第
2の半体の手段により、微小粒子を別の基体へ結合するための手段を提供する。
【0071】 半体の別の実施の形態は、有機または無機の化合物を含む。好ましくは、その
ような化合物は、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸
、炭水化物、または有機化合物、またはその組合わせを含む。より好ましくは、
半体は、優先的に、または、更により好ましくは、独占的に第2の分子へ結合す
る分子を含む結合半体である。そのような分子は、アビジン、ビオチン、ストレ
プトアビジン、フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)、抗体、プロテイ
ンAのような免疫グロブリンへ結合するプロテイン、またはレクチンを含むが、
それらに限定されない。
ような化合物は、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸
、炭水化物、または有機化合物、またはその組合わせを含む。より好ましくは、
半体は、優先的に、または、更により好ましくは、独占的に第2の分子へ結合す
る分子を含む結合半体である。そのような分子は、アビジン、ビオチン、ストレ
プトアビジン、フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)、抗体、プロテイ
ンAのような免疫グロブリンへ結合するプロテイン、またはレクチンを含むが、
それらに限定されない。
【0072】 器具は、圧送手段により微小粒子の移動を許容するように設計されているが、
それは以下に更に検討するが、実施の形態のあるもの、およびその使用において
、微小粒子を一定の場所に保持するまたは捕捉する、またはそれを分離したグル
ープとして移動することが好ましい。そうするための好ましい方法は、上で検討
したように、磁気的微小粒子の使用を含み、器具は、更に1つ以上の磁石を備え
る必要がある。そのような磁石は、好ましくは、米国出願第08/742,97
1号に開示されたように形作られて、構成される。好ましくは、磁石は、ネオジ
ウム・鉄・ボロン級の永久磁石(例えば、Edmund Scientific, Barrington, NJ
から入手可能)から形成されるような、希土類から形成される高度に磁気的な永
久磁石により提供されるような、適切な磁界を提供する。代替として、磁石は、
電磁石である。永久磁石または電磁石はマイクロ加工可能であり、例えば、Ahn
他 J. Microelectromech. Syst., 5, 151 (1996) に記載されるように、従来方 法を使用してチップまたはカセットへ統合される。
それは以下に更に検討するが、実施の形態のあるもの、およびその使用において
、微小粒子を一定の場所に保持するまたは捕捉する、またはそれを分離したグル
ープとして移動することが好ましい。そうするための好ましい方法は、上で検討
したように、磁気的微小粒子の使用を含み、器具は、更に1つ以上の磁石を備え
る必要がある。そのような磁石は、好ましくは、米国出願第08/742,97
1号に開示されたように形作られて、構成される。好ましくは、磁石は、ネオジ
ウム・鉄・ボロン級の永久磁石(例えば、Edmund Scientific, Barrington, NJ
から入手可能)から形成されるような、希土類から形成される高度に磁気的な永
久磁石により提供されるような、適切な磁界を提供する。代替として、磁石は、
電磁石である。永久磁石または電磁石はマイクロ加工可能であり、例えば、Ahn
他 J. Microelectromech. Syst., 5, 151 (1996) に記載されるように、従来方 法を使用してチップまたはカセットへ統合される。
【0073】 微小粒子を所定の場所に固定して保持するために、微小粒子が配置されている
場所と、その場所と連通する器具の領域との間の経路を、例えば、微小粒子の一
番広い寸法より狭くできる。例えば、直径約100μmの球状微小粒子は、特に
、寸法の不均衡が著しい場合、上記直径より小さい寸法を有するチャネルへ入る
ことから排除されるであろう。従がって、第1チャンバは、幅1mm、長さ1m
m、および深さ1mmの寸法を有して構成でき、上記球状微小粒子を包含し、幅
と深さで100μmより著しく小さいチャネルへ接続できる。著しく小さいとは
、差が、少なくとも5%であることが好ましく、より好ましくは少なくとも10
%、更により好ましくは少なくとも20%である。そのような第1チャンバは、
上述の微小粒子を必然的に包含するであろう。微小粒子を固定位置に保持する代
替のアプローチは、磁気的微小粒子、好ましくは、強磁性微小粒子、より好まし
くは超強磁性微小粒子と、磁石の使用とを必要とし、粒子は、磁石の位置に固定
される。好ましくは、磁石は、第1チャンバ、第2チャンバ、またはその組合わ
せのような、貯蔵所に隣接して固定される。より好ましくは、磁石は、第1チャ
ンバ、第2チャンバ、またはその組合わせのような、貯蔵所に隣接した位置へ、
または器具に隣接でない位置へ移動可能である。このように、本発明に沿って使
用される器具は、器具の設計に関する試験の要求事項に従がい、微小粒子を器具
内で移動させるか場所に固定させる融通性を有する。
場所と、その場所と連通する器具の領域との間の経路を、例えば、微小粒子の一
番広い寸法より狭くできる。例えば、直径約100μmの球状微小粒子は、特に
、寸法の不均衡が著しい場合、上記直径より小さい寸法を有するチャネルへ入る
ことから排除されるであろう。従がって、第1チャンバは、幅1mm、長さ1m
m、および深さ1mmの寸法を有して構成でき、上記球状微小粒子を包含し、幅
と深さで100μmより著しく小さいチャネルへ接続できる。著しく小さいとは
、差が、少なくとも5%であることが好ましく、より好ましくは少なくとも10
%、更により好ましくは少なくとも20%である。そのような第1チャンバは、
上述の微小粒子を必然的に包含するであろう。微小粒子を固定位置に保持する代
替のアプローチは、磁気的微小粒子、好ましくは、強磁性微小粒子、より好まし
くは超強磁性微小粒子と、磁石の使用とを必要とし、粒子は、磁石の位置に固定
される。好ましくは、磁石は、第1チャンバ、第2チャンバ、またはその組合わ
せのような、貯蔵所に隣接して固定される。より好ましくは、磁石は、第1チャ
ンバ、第2チャンバ、またはその組合わせのような、貯蔵所に隣接した位置へ、
または器具に隣接でない位置へ移動可能である。このように、本発明に沿って使
用される器具は、器具の設計に関する試験の要求事項に従がい、微小粒子を器具
内で移動させるか場所に固定させる融通性を有する。
【0074】 上記のように、マイクロ製作された器具内で、微小粒子または液体の反応物を
場所から場所へ移動させる別の方法は、器具内で流体を圧送することである。適
切な寸法のどのような圧送装置も、本発明のマイクロ流体器具に沿って内部圧送
として使用できる。そのような圧送は、Shoji 他 Electronics and Communicati ons in Japan , Part 2, 70, 52-59 (1989)、または、Esashi 他 Sensors and Ac tuators , 20, 163-169 (1989) に報告されたような、マイクロ電気機械的システ
ム(MEMS)、または Moroney 他 Proc. MEMS, 91, 277-282 (1991) に記載 されるような、圧電圧送を含むことができる。他の適切な圧送は、この技術でよ
く知られた技術を使用して、Rose and Jorgensen, Analytical Chemistry, 60,
642-648 (1988) に示されるような、例えば流体力学的圧力; Burns 他 Proc. N atl. Acad. Sci. U.S.A. , 93, 5556-5561 (1996) により示されるような熱エネ ルギー; Shoji and Esashi, Journal of Micormechanics & Microengineering,
4, 147-171 (1994) に示されるような熱空気力; Shoji and Esashi 前出、に より示されるような圧電力; Shoji and Esashi 前出、に示されるような静電気
力;の各手段により動作する。
場所から場所へ移動させる別の方法は、器具内で流体を圧送することである。適
切な寸法のどのような圧送装置も、本発明のマイクロ流体器具に沿って内部圧送
として使用できる。そのような圧送は、Shoji 他 Electronics and Communicati ons in Japan , Part 2, 70, 52-59 (1989)、または、Esashi 他 Sensors and Ac tuators , 20, 163-169 (1989) に報告されたような、マイクロ電気機械的システ
ム(MEMS)、または Moroney 他 Proc. MEMS, 91, 277-282 (1991) に記載 されるような、圧電圧送を含むことができる。他の適切な圧送は、この技術でよ
く知られた技術を使用して、Rose and Jorgensen, Analytical Chemistry, 60,
642-648 (1988) に示されるような、例えば流体力学的圧力; Burns 他 Proc. N atl. Acad. Sci. U.S.A. , 93, 5556-5561 (1996) により示されるような熱エネ ルギー; Shoji and Esashi, Journal of Micormechanics & Microengineering,
4, 147-171 (1994) に示されるような熱空気力; Shoji and Esashi 前出、に より示されるような圧電力; Shoji and Esashi 前出、に示されるような静電気
力;の各手段により動作する。
【0075】 好ましくは、本発明で使用される圧送は可動部分を有しない。そのような圧送
は、電極ベースの圧送を備えることができ、それはここで総称して電気運動圧送
と称する。少なくとも2つのタイプのそのような電極ベースの圧送が、普通には
、「電気流体力学圧送 (electrohydrodynamic pumping)」(EHD)と「電気浸
透 (electroosmosis)」(EO)の名で記載されている。EHD圧送は、Bart 他
Sensors and Actuators, A21-A23, 193-197 (1990) と Richter 他 Sensors an d Actuators , A29, 159-168 (1991) に記載されている。EO圧送は、Dasgupta
他 Anal. Chem., 66, 1792-1798 (1994) と Rose and Jorgensen 前出、に記載 されている。
は、電極ベースの圧送を備えることができ、それはここで総称して電気運動圧送
と称する。少なくとも2つのタイプのそのような電極ベースの圧送が、普通には
、「電気流体力学圧送 (electrohydrodynamic pumping)」(EHD)と「電気浸
透 (electroosmosis)」(EO)の名で記載されている。EHD圧送は、Bart 他
Sensors and Actuators, A21-A23, 193-197 (1990) と Richter 他 Sensors an d Actuators , A29, 159-168 (1991) に記載されている。EO圧送は、Dasgupta
他 Anal. Chem., 66, 1792-1798 (1994) と Rose and Jorgensen 前出、に記載 されている。
【0076】 EO圧送は、石英、ガラス、およびそれらの類似を含め、多くの固体の面は、
塩、酸、または塩基のようなイオン物質の存在で、負または正に帯電する原理を
利用すると考えられる。帯電面は、適切な導電性の溶液中で、反対に帯電した対
イオンを誘引する。そのような溶液への電圧の印加は、反対に帯電した電極への
対イオンの移動を結果としてもたらし、大量の流体も同様に移動する。容積フロ
ー速度は電流に比例し、流体中で生成される容積フローも印加電圧に比例する。
普通には、キャピラリ寸法のチャネルでは、フローを起こす電極は、電極は力を
加えることにだけ関与し、EHDでのように、力が作用する電荷を生成すること
には関与しないので、EHD圧送におけるより間隔を更に広くできる。一般にE
O圧送が、導電性溶液を圧送するために好ましい。
塩、酸、または塩基のようなイオン物質の存在で、負または正に帯電する原理を
利用すると考えられる。帯電面は、適切な導電性の溶液中で、反対に帯電した対
イオンを誘引する。そのような溶液への電圧の印加は、反対に帯電した電極への
対イオンの移動を結果としてもたらし、大量の流体も同様に移動する。容積フロ
ー速度は電流に比例し、流体中で生成される容積フローも印加電圧に比例する。
普通には、キャピラリ寸法のチャネルでは、フローを起こす電極は、電極は力を
加えることにだけ関与し、EHDでのように、力が作用する電荷を生成すること
には関与しないので、EHD圧送におけるより間隔を更に広くできる。一般にE
O圧送が、導電性溶液を圧送するために好ましい。
【0077】 EHD圧送は、一般に極端に低い導電率、例えば10-14から10-9S/cm の流体を移動するために適している。広範な溶媒と溶液が、圧送を容易にする適
切な溶質を使用して、適切な電極の間隔と幾何学的形状を使用して、または、電
極に電力を与える適切なパルスまたはDC電圧を使用して圧送できることが、米
国出願第08/730,636号で実証された。
切な溶質を使用して、適切な電極の間隔と幾何学的形状を使用して、または、電
極に電力を与える適切なパルスまたはDC電圧を使用して圧送できることが、米
国出願第08/730,636号で実証された。
【0078】 より好ましい圧送方法は電気浸透を使用する。器具内の流体移動は、キャピラ
リまたは器具への電界の印加からの結果であり、ここで、微小粒子が通されるか
、または圧送されるキャピラリ、貯蔵所、およびチャネルは、導電性緩衝剤で満
たされる。好ましくは、電界は、約100ボルトから約30,000ボルト、よ
り好ましくは約200ボルトから約20,000ボルト、更により好ましくは約
200ボルトから約10,000ボルト、もっとより好ましくは約200ボルト
から約5,000ボルトの電位により提供され、ここで、電位はチャンバの外部
境界に、またはその間に圧送が作用するチャネルまたはキャピラリ内に、配置さ
れる電極の手段により印加される。そのような圧送の電気運動法は、上記関連出
願第08/556,423号および第08/645,966号に更に検討されて
いる。
リまたは器具への電界の印加からの結果であり、ここで、微小粒子が通されるか
、または圧送されるキャピラリ、貯蔵所、およびチャネルは、導電性緩衝剤で満
たされる。好ましくは、電界は、約100ボルトから約30,000ボルト、よ
り好ましくは約200ボルトから約20,000ボルト、更により好ましくは約
200ボルトから約10,000ボルト、もっとより好ましくは約200ボルト
から約5,000ボルトの電位により提供され、ここで、電位はチャンバの外部
境界に、またはその間に圧送が作用するチャネルまたはキャピラリ内に、配置さ
れる電極の手段により印加される。そのような圧送の電気運動法は、上記関連出
願第08/556,423号および第08/645,966号に更に検討されて
いる。
【0079】 別の好ましい圧送方法は、変形可能な壁を有する貯蔵所の壁を変形させる可逆
性のアクチュエータまたはローラにより遂行される。そのようなアクチュエータ
またはローラを形成または動作させるのに必要なハードウエアは、この技術でよ
く知られ、例えば、Shoji 他 Electronics and Communications in Japan, Part 2 , 70, 52-59 (1989)、または、Esashi 他 Sensors and Actuators, 20, 163-1
69 (1989) に開示されている。
性のアクチュエータまたはローラにより遂行される。そのようなアクチュエータ
またはローラを形成または動作させるのに必要なハードウエアは、この技術でよ
く知られ、例えば、Shoji 他 Electronics and Communications in Japan, Part 2 , 70, 52-59 (1989)、または、Esashi 他 Sensors and Actuators, 20, 163-1
69 (1989) に開示されている。
【0080】 好ましくは、本増幅法は自動化され、それにより、コンピュータの制御機能が
、未結合の未使用物質洗い流しを感知し、増幅された生成物の蓄積を査定するこ
とを含み、増幅プロセスを調整し評価する。本開示によりそのように指示された
、ソフトウエア技術に普通に精通する者は、この機能を遂行する適切なソフトウ
エアプログラムを準備できる。
、未結合の未使用物質洗い流しを感知し、増幅された生成物の蓄積を査定するこ
とを含み、増幅プロセスを調整し評価する。本開示によりそのように指示された
、ソフトウエア技術に普通に精通する者は、この機能を遂行する適切なソフトウ
エアプログラムを準備できる。
【0081】 本発明は、特に、蛍光を増強するための方法に関し、発蛍光団をテクスチャ付
けた材料と接触させるステップ、それにより複合体を形成するステップを含む。
発蛍光団は、好ましくは、任意の蛍光物質であり、より好ましくは、発蛍光団が
赤外、赤、オレンジ、または黄色領域で蛍光を発し、更により好ましくは赤の領
域で蛍光を発する。特に有用な発蛍光団は、Cy5、JA22、アロフィコシア
ニン、ローダミン、フルオロセイン、または前記発蛍光団の1つ以上に構造的に
関連する発蛍光団試験を含むが、それに限定されない。テクスチャ付けた材料は
いずれか適切な化学組成を有し、その適切性は、上で更に検討したように、蛍光
でタグ付けされたプロテインまたは核酸、すなわち分析物のような高分子、また
はプローブの非特異性吸着を抑制または遮断することにより決定される。好まし
いテクスチャ付けた材料は、任意の多孔性材料を含み、好ましくは、ナイロン、
ポリ(カーボネート)、PUDF、またはニトロセルロースのような、しかしそ
れらに限定されないポリマーから成り、その中で、膜に形成されたナイロンが最
も好ましい。テクスチャ付けた材料は、Pall BioSupport(登録商標) ナイロン
膜、Amersham ナイロン膜、または、Cuno Zetabind(登録商標)膜のような市販
で入手可能な製品で提供されるような、好ましくは、化学的、物理的、または生
物学的手段により形成される。
けた材料と接触させるステップ、それにより複合体を形成するステップを含む。
発蛍光団は、好ましくは、任意の蛍光物質であり、より好ましくは、発蛍光団が
赤外、赤、オレンジ、または黄色領域で蛍光を発し、更により好ましくは赤の領
域で蛍光を発する。特に有用な発蛍光団は、Cy5、JA22、アロフィコシア
ニン、ローダミン、フルオロセイン、または前記発蛍光団の1つ以上に構造的に
関連する発蛍光団試験を含むが、それに限定されない。テクスチャ付けた材料は
いずれか適切な化学組成を有し、その適切性は、上で更に検討したように、蛍光
でタグ付けされたプロテインまたは核酸、すなわち分析物のような高分子、また
はプローブの非特異性吸着を抑制または遮断することにより決定される。好まし
いテクスチャ付けた材料は、任意の多孔性材料を含み、好ましくは、ナイロン、
ポリ(カーボネート)、PUDF、またはニトロセルロースのような、しかしそ
れらに限定されないポリマーから成り、その中で、膜に形成されたナイロンが最
も好ましい。テクスチャ付けた材料は、Pall BioSupport(登録商標) ナイロン
膜、Amersham ナイロン膜、または、Cuno Zetabind(登録商標)膜のような市販
で入手可能な製品で提供されるような、好ましくは、化学的、物理的、または生
物学的手段により形成される。
【0082】 好ましくは、テクスチャ付けた材料は、ランダムにも、規則的にも形成される
。ランダムにも規則的にも構成されたテクスチャは両方とも、本発明の増強され
た蛍光に貢献する。例として、ナイロン膜製品が、ここに記述されたマイクロ構
成の器具で達成されるように、よく規定された構成を持たない不規則なボイドの
配列を有する、またはで形成される。対照的に、ポリ(カーボネート)膜はほと
んど均一な孔寸法で形成される。ポリカーボネート膜は、普通には、膜に構造を
作成するようエネルギーを当てる核追跡手法 (nuclear tracking techniques) で形成され、それにより、普通には、ナイロン膜のそれより規則的である構造を
作成する。例として、この2つのタイプの膜は非常に異なる後方散乱特性を有す
るが、両タイプとも、本発明による増強された蛍光を示す。
。ランダムにも規則的にも構成されたテクスチャは両方とも、本発明の増強され
た蛍光に貢献する。例として、ナイロン膜製品が、ここに記述されたマイクロ構
成の器具で達成されるように、よく規定された構成を持たない不規則なボイドの
配列を有する、またはで形成される。対照的に、ポリ(カーボネート)膜はほと
んど均一な孔寸法で形成される。ポリカーボネート膜は、普通には、膜に構造を
作成するようエネルギーを当てる核追跡手法 (nuclear tracking techniques) で形成され、それにより、普通には、ナイロン膜のそれより規則的である構造を
作成する。例として、この2つのタイプの膜は非常に異なる後方散乱特性を有す
るが、両タイプとも、本発明による増強された蛍光を示す。
【0083】 本発明の好ましい実施の形態は、ビーズまたは多ウエルのプレート内または上
に含まれるテクスチャ付けた材料を使用する。特に、ビーズの実施の形態は、容
器、より好ましくはチャンバに使用できる。
に含まれるテクスチャ付けた材料を使用する。特に、ビーズの実施の形態は、容
器、より好ましくはチャンバに使用できる。
【0084】 好ましくは、発蛍光団は配位子へ結合され、その配位子は、好ましくは、1つ
以上の、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、抗原、抗原に特異性の抗体
、炭水化物基、炭水化物基に特異性のレクチン、プロテインA、免疫グロブリン
、対象の第2の核酸に相補の核酸である。従がって、発蛍光団は、マイクロ流体
器具の内面または微小粒子の外面のような基体へ結合できる。
以上の、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、抗原、抗原に特異性の抗体
、炭水化物基、炭水化物基に特異性のレクチン、プロテインA、免疫グロブリン
、対象の第2の核酸に相補の核酸である。従がって、発蛍光団は、マイクロ流体
器具の内面または微小粒子の外面のような基体へ結合できる。
【0085】 本方法は、テクスチャ付けた材料の不在である発蛍光団の蛍光に対し、結果と
して約10倍以上の蛍光の増強をもたらす。より好ましくは、増強は少なくとも
約50倍であり、更により好ましくは、少なくとも約80倍である。従がって、
対象の標的分析物は、約1μg/mlより低い、より好ましくは100ng/m
lより低い、更により好ましくは、10ng/mlより低い濃度を有することが
できる。そのような増強および結果としての感度は、増強された蛍光が後方散乱
モードで検出される場合に、好ましくは効果を上げる。観測される増強は、この
現象に最適化されていない市販の膜で達成されるので、ここに例証されたものを
超える増強が達成可能であることは明らかである。
して約10倍以上の蛍光の増強をもたらす。より好ましくは、増強は少なくとも
約50倍であり、更により好ましくは、少なくとも約80倍である。従がって、
対象の標的分析物は、約1μg/mlより低い、より好ましくは100ng/m
lより低い、更により好ましくは、10ng/mlより低い濃度を有することが
できる。そのような増強および結果としての感度は、増強された蛍光が後方散乱
モードで検出される場合に、好ましくは効果を上げる。観測される増強は、この
現象に最適化されていない市販の膜で達成されるので、ここに例証されたものを
超える増強が達成可能であることは明らかである。
【0086】 多孔性膜は光を散乱し、後方散乱での蛍光の検出が必須である。Pitter and J
akeman (Optics Letters, 22 (6), 393-395 (1977)) は、後方散乱の増強を確認
する最新データを提供している。増強された後方散乱に関連する積上げ的な干渉
は蛍光の増強に効果的であるが、ランダム媒体での内部反射のような、他の光学
的プロセスも寄与できる。これに関連して、膜に固有の「ボイド」または円筒形
構造も増強での要因である。Videen 他 (Phys. Rev., A43 (10), 5655-5664 (1
991)) は、円筒からの蛍光について発行されたが、ここで円筒の直径は波長と同
等である。
akeman (Optics Letters, 22 (6), 393-395 (1977)) は、後方散乱の増強を確認
する最新データを提供している。増強された後方散乱に関連する積上げ的な干渉
は蛍光の増強に効果的であるが、ランダム媒体での内部反射のような、他の光学
的プロセスも寄与できる。これに関連して、膜に固有の「ボイド」または円筒形
構造も増強での要因である。Videen 他 (Phys. Rev., A43 (10), 5655-5664 (1
991)) は、円筒からの蛍光について発行されたが、ここで円筒の直径は波長と同
等である。
【0087】 本方法は、好ましくは、更に発蛍光団を励起することを含む。そのような発蛍
光団の励起は、好ましくは、発蛍光団の吸収特性に相当する強度と波長を有する
放射線により遂行される。任意の適切な放射線ソースも使用でき、好ましくは、
放射線はガスまたは固体レーザーにより生成される。
光団の励起は、好ましくは、発蛍光団の吸収特性に相当する強度と波長を有する
放射線により遂行される。任意の適切な放射線ソースも使用でき、好ましくは、
放射線はガスまたは固体レーザーにより生成される。
【0088】 好ましくは、複合体は、標的分析物、および相補標的プローブを含み、そのい
ずれかまたは両方が発蛍光団を含む。しかし、標的分析物、および相補標的プロ
ーブの両方が発蛍光団を含む場合、標的分析物、および相補標的プローブの各々
は、励起により異なる色を示すような、識別できる蛍光を有する発蛍光団を含む
。本方法の1つの実施の形態では、標的分析物は、第1の核酸または抗原であり
、相補標的プローブは、第2の核酸または抗体であり、ここで、第2と第1の核
酸は、少なくとも厳格なハイブリダイゼーション条件下で相補であり、抗体は、
免疫学的に抗原に対して特異性を持つ。別の好ましい実施の形態では、標的プロ
ーブまたは分析物は、更に、結合半体を含み、その結合半体は、ビオチン、スト
レプトアビジン、ジゴキシゲン (digoxigen)、アビジン、抗原、抗原に特異性の
ある抗体、炭水化物、炭水化物に特異性のレクチン、プロテインA、免疫グロブ
リンGを含む。
ずれかまたは両方が発蛍光団を含む。しかし、標的分析物、および相補標的プロ
ーブの両方が発蛍光団を含む場合、標的分析物、および相補標的プローブの各々
は、励起により異なる色を示すような、識別できる蛍光を有する発蛍光団を含む
。本方法の1つの実施の形態では、標的分析物は、第1の核酸または抗原であり
、相補標的プローブは、第2の核酸または抗体であり、ここで、第2と第1の核
酸は、少なくとも厳格なハイブリダイゼーション条件下で相補であり、抗体は、
免疫学的に抗原に対して特異性を持つ。別の好ましい実施の形態では、標的プロ
ーブまたは分析物は、更に、結合半体を含み、その結合半体は、ビオチン、スト
レプトアビジン、ジゴキシゲン (digoxigen)、アビジン、抗原、抗原に特異性の
ある抗体、炭水化物、炭水化物に特異性のレクチン、プロテインA、免疫グロブ
リンGを含む。
【0089】 好ましくは、標的分析物、または標的プローブは、化学的または物理的手段に
よりテクスチャ付けた材料へ結合されている。そのような手段は、上記結合半体
、共通の共有結合またはイオン化学、または、疎水性、ファンデルワールス (va
n der Waals)、またはその他の力の結果として分子の基体への物理的吸着、の使
用を含む。DNAの結合のために、好ましい手段は、例えば、プローブまたは分
析物上の5'ポリチミジンテイル、およびテクスチャ付けた材料上の3'ポリアデ
ニンテイルの使用を含む。 ポリA/ポリT以外に、他の相補オリゴ核酸塩対が 使用できる。また、DNAは、 Saiki 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 62
30-6234 (1989) の研究に従がい紫外線の照射を介してナイロンに結合できる。
よりテクスチャ付けた材料へ結合されている。そのような手段は、上記結合半体
、共通の共有結合またはイオン化学、または、疎水性、ファンデルワールス (va
n der Waals)、またはその他の力の結果として分子の基体への物理的吸着、の使
用を含む。DNAの結合のために、好ましい手段は、例えば、プローブまたは分
析物上の5'ポリチミジンテイル、およびテクスチャ付けた材料上の3'ポリアデ
ニンテイルの使用を含む。 ポリA/ポリT以外に、他の相補オリゴ核酸塩対が 使用できる。また、DNAは、 Saiki 他 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 62
30-6234 (1989) の研究に従がい紫外線の照射を介してナイロンに結合できる。
【0090】 本方法へ修正可能である診断アッセイは、運動アッセイを含み、ここで標的分
析物は、相補標的プローブにより結合されている。代替として、増強された蛍光
法が均質なアッセイのために使用される。そのようなアッセイ、およびその後の
増強された蛍光検出は、好ましくは、マイクロ流体器具内で起る。
析物は、相補標的プローブにより結合されている。代替として、増強された蛍光
法が均質なアッセイのために使用される。そのようなアッセイ、およびその後の
増強された蛍光検出は、好ましくは、マイクロ流体器具内で起る。
【0091】 実際、本発明の好ましい実施の形態は、分析物を同定するための方法に関し、
分析物を結合種と接触させるステップを含み、ここで、結合種は、テクスチャ付
けた材料へまたは内に接続された発蛍光団へ接続されている。上で更に検討した
ように、好ましくは、テクスチャ付けた材料は多孔性の膜である。
分析物を結合種と接触させるステップを含み、ここで、結合種は、テクスチャ付
けた材料へまたは内に接続された発蛍光団へ接続されている。上で更に検討した
ように、好ましくは、テクスチャ付けた材料は多孔性の膜である。
【0092】テクスチャ付けた材料 本発明は、同定された現象がここに同定された材料で生ずるので、ここに提示
された理論により限定されないものとする。しかし、ここに記載の蛍光増強結果
を達成するための重要な特性は、材料の面または内部のボイドの存在であると考
えられる。そのようなボイドは、基本的に、励起放射エネルギーの経路長を増加
させ、それにより、蛍光励起イベントの確率を増加させることにより、現象に寄
与する「散乱セル (scatter cell)」を提供すると考えられる。ボイドは、励起 光ビームがそのような散乱セルの一様な密度を見るように、十分な密度で存在す
るのがよいと考えられる。
された理論により限定されないものとする。しかし、ここに記載の蛍光増強結果
を達成するための重要な特性は、材料の面または内部のボイドの存在であると考
えられる。そのようなボイドは、基本的に、励起放射エネルギーの経路長を増加
させ、それにより、蛍光励起イベントの確率を増加させることにより、現象に寄
与する「散乱セル (scatter cell)」を提供すると考えられる。ボイドは、励起 光ビームがそのような散乱セルの一様な密度を見るように、十分な密度で存在す
るのがよいと考えられる。
【0093】 材料は、蛍光を誘発するのに使用される励起波長の光を吸収することがよいと
更に考えられる。広帯域光が使用される場合、材料は、蛍光を誘発するのに有効
である光の部分を吸収してはならない。狭帯域光、またはレーザー光源でさえも
、励起光のソースとして好ましい。ナイロン膜が使用される場合、例えば、He
−Neレーザーにより励起される蛍光反応物がアルゴンレーザーにより励起され
るものより好ましいのは、吸収の問題によるからである。
更に考えられる。広帯域光が使用される場合、材料は、蛍光を誘発するのに有効
である光の部分を吸収してはならない。狭帯域光、またはレーザー光源でさえも
、励起光のソースとして好ましい。ナイロン膜が使用される場合、例えば、He
−Neレーザーにより励起される蛍光反応物がアルゴンレーザーにより励起され
るものより好ましいのは、吸収の問題によるからである。
【0094】 多くのテクスチャ付けた材料で、放射が励起光に対する反射の角度に対応する
軸のところとそのまわりに位置する比較的狭い収集面にわたり収集される場合、
増強効果が最も明らかであると更に考えられる。より好ましくは、収集面は、テ
クスチャ付けた面から延在する20°の円錐形の、上記軸のまわりで対称に位置
する領域を超えないあたりをカバーする。より好ましくは、収集面は10°また
は5°の円錐領域を超えないあたりをカバーする。好ましくは、励起光の入射角
度は、テクスチャ付けた面に対し実質的に90°であり、それにより、収集帯域
は、図1に示すように同じ軸に沿う。これに関連する「実質的に」90°は、9
0°の角度で利用可能である蛍光生成率の少なくとも75%、好ましくは、少な
くとも85%、90%、または95%、の維持を助ける角度を称する。
軸のところとそのまわりに位置する比較的狭い収集面にわたり収集される場合、
増強効果が最も明らかであると更に考えられる。より好ましくは、収集面は、テ
クスチャ付けた面から延在する20°の円錐形の、上記軸のまわりで対称に位置
する領域を超えないあたりをカバーする。より好ましくは、収集面は10°また
は5°の円錐領域を超えないあたりをカバーする。好ましくは、励起光の入射角
度は、テクスチャ付けた面に対し実質的に90°であり、それにより、収集帯域
は、図1に示すように同じ軸に沿う。これに関連する「実質的に」90°は、9
0°の角度で利用可能である蛍光生成率の少なくとも75%、好ましくは、少な
くとも85%、90%、または95%、の維持を助ける角度を称する。
【0095】器具 上記本文で検討したように、テクスチャ付けた面は、上記カセットまたはチッ
プのような、反応を導くための完結した器具内へ組込むことができる。従がって
、そのような器具は、分析的反応のサイトで、または検出されることになるその
ような反応の生成物を受取るサイトで、膜により構成できる。そのような器具は
、好ましくは、器具を開くことなく、励起光が組込まれたテクスチャ付けた面に
当てることができ、放射光を収集できる。このように、封入された材料は、光源
と検出器の間に介在し、テクスチャ付けた材料は、好ましくは、適切なガラス、
石英、プラスチックのように、適切な波長の範囲で、透明な材料である。
プのような、反応を導くための完結した器具内へ組込むことができる。従がって
、そのような器具は、分析的反応のサイトで、または検出されることになるその
ような反応の生成物を受取るサイトで、膜により構成できる。そのような器具は
、好ましくは、器具を開くことなく、励起光が組込まれたテクスチャ付けた面に
当てることができ、放射光を収集できる。このように、封入された材料は、光源
と検出器の間に介在し、テクスチャ付けた材料は、好ましくは、適切なガラス、
石英、プラスチックのように、適切な波長の範囲で、透明な材料である。
【0096】 ナイロンのようなテクスチャ付けた材料は、反応ウエルまたはチャンバのよう
な構造をその上に形成するようエンボス加工できることがここで確認された。従
がって、器具は、テクスチャ付けた材料で少なくとも一部分を形成するチャンネ
ルのような構造を備えることができる。テクスチャ付けた材料は、流体が一面か
ら他面へ移動できるようにともかく十分に多孔性である場合、テクスチャ付けた
材料の1面は、多孔性でない材料でシールできる。
な構造をその上に形成するようエンボス加工できることがここで確認された。従
がって、器具は、テクスチャ付けた材料で少なくとも一部分を形成するチャンネ
ルのような構造を備えることができる。テクスチャ付けた材料は、流体が一面か
ら他面へ移動できるようにともかく十分に多孔性である場合、テクスチャ付けた
材料の1面は、多孔性でない材料でシールできる。
【0097】増加された発蛍光団勾配 テクスチャ付けた面への発蛍光団の浸透を制限するよう設計され、かつ、それ
によって、小容積に配置される発蛍光団の質量を増加させる、テクスチャ付けた
面への発蛍光団の付加が、テクスチャ付けた面からの蛍光の生成率を増加させる
ことを実験が示した。例えば、担体が各付加間で乾燥できるようにして、発蛍光
団を、複数の小容積(例えば、0.1マイクロリットル)に、繰返し付加できる
。代替として、エンボス加工、1つの面上にシールされた薄いテクスチャ付けた
材料の使用、またはいずれか他の適当な方法を用いて、テクスチャ付けた材料の
より少ない容積に大量の発蛍光団を保証することができる。小容積での発蛍光団
の隔離を制限するかもしれない横方向の拡散は、ビーズまたは粒子上にシールさ
れたテクスチャ付けた材料、または不浸透性の材料で形成されたウエルにシール
されたテクスチャ付けた材料を使用することにより制限できる。
によって、小容積に配置される発蛍光団の質量を増加させる、テクスチャ付けた
面への発蛍光団の付加が、テクスチャ付けた面からの蛍光の生成率を増加させる
ことを実験が示した。例えば、担体が各付加間で乾燥できるようにして、発蛍光
団を、複数の小容積(例えば、0.1マイクロリットル)に、繰返し付加できる
。代替として、エンボス加工、1つの面上にシールされた薄いテクスチャ付けた
材料の使用、またはいずれか他の適当な方法を用いて、テクスチャ付けた材料の
より少ない容積に大量の発蛍光団を保証することができる。小容積での発蛍光団
の隔離を制限するかもしれない横方向の拡散は、ビーズまたは粒子上にシールさ
れたテクスチャ付けた材料、または不浸透性の材料で形成されたウエルにシール
されたテクスチャ付けた材料を使用することにより制限できる。
【0098】 実施の形態の1つでは、テクスチャ付けた材料は、約80μm以下、好ましく
は約40、20、または10μm以下の深さへ、発蛍光団を吸収するよう適合さ
れる。
は約40、20、または10μm以下の深さへ、発蛍光団を吸収するよう適合さ
れる。
【0099】最適化 本開示により提供される知識により、テクスチャ付けた材料は、蛍光増強を増
加させるよう最適化できる。例えば、製造技術を変更して、ボイドの特徴、また
はサイズあるいは密度を変えることができ、および観測される増強のレベルに相
関して変えることができる。上記で検討したように、材料は、従来材料で普通に
達成されるよりも小さい容積へ発蛍光団を限定するよう構成できる。
加させるよう最適化できる。例えば、製造技術を変更して、ボイドの特徴、また
はサイズあるいは密度を変えることができ、および観測される増強のレベルに相
関して変えることができる。上記で検討したように、材料は、従来材料で普通に
達成されるよりも小さい容積へ発蛍光団を限定するよう構成できる。
【0100】液相と固相との組合せアッセイ 本発明で達成される蛍光は、発蛍光団がテクスチャ付けた材料へ付帯されるよ
うになり著しく増強されるので、アッセイは、当初の発蛍光団でなく生成物がテ
クスチャ付けた材料へ付帯しない限り、生成物でない発蛍光団を除去することな
く、増加された生成率が観測できるところで確立できる。従がって、アッセイ手
順は簡略化でき、または、例えば、アッセイは、運動情報を提供するよう、また
は適切な終了時点を識別できるよう、リアルタイムで監視できる。
うになり著しく増強されるので、アッセイは、当初の発蛍光団でなく生成物がテ
クスチャ付けた材料へ付帯しない限り、生成物でない発蛍光団を除去することな
く、増加された生成率が観測できるところで確立できる。従がって、アッセイ手
順は簡略化でき、または、例えば、アッセイは、運動情報を提供するよう、また
は適切な終了時点を識別できるよう、リアルタイムで監視できる。
【0101】 そのようなアッセイの例は、ハイブリダイゼーション・アッセイ、(例えば、
ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する)増幅アッセイを含み、それは、テクス
チャ付けた材料、配位子結合アッセイおよびその類似へハイブリダイズする延長
生成物を作成する。別の実施例は、増幅アッセイであり、ここで、一方の生成物
糸状体が発蛍光団を含み、他方が、テクスチャ付けた面へそれを結合するのに使
用される結合対の構成員を有する。発蛍光団と結合要素をリンクすることに成功
する増幅がなければ、発蛍光団は液相のままであろう。
ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する)増幅アッセイを含み、それは、テクス
チャ付けた材料、配位子結合アッセイおよびその類似へハイブリダイズする延長
生成物を作成する。別の実施例は、増幅アッセイであり、ここで、一方の生成物
糸状体が発蛍光団を含み、他方が、テクスチャ付けた面へそれを結合するのに使
用される結合対の構成員を有する。発蛍光団と結合要素をリンクすることに成功
する増幅がなければ、発蛍光団は液相のままであろう。
【0102】文献の援用 本明細書で引用された特許および特許出願を含むが、それに限定されない全て
の出版物および引用文献は、この文書の本文で全体が記載されているとして、あ
たかも各個別の出版物または引用文献が、ここに援用するように特定的および個
別に指示されているように、その全体を本明細書に援用する。本出願が優先権を
主張するいずれの特許出願も、出版物と引用文献に対して上で説明した方法で、
その全体を本明細書に援用する。
の出版物および引用文献は、この文書の本文で全体が記載されているとして、あ
たかも各個別の出版物または引用文献が、ここに援用するように特定的および個
別に指示されているように、その全体を本明細書に援用する。本出願が優先権を
主張するいずれの特許出願も、出版物と引用文献に対して上で説明した方法で、
その全体を本明細書に援用する。
【0103】 以下の実施例は、本発明を更に例証するが、いかなる方法でも本範囲を限定す
ると解釈してはならない。
ると解釈してはならない。
【0104】実施例1 この実施例は、本発明により提供される蛍光増強を査定するための分析的ツー
ルを示す。
ルを示す。
【0105】 本明細書で説明するように、膜増強された蛍光は、ナイロン膜上のブロットで
、Cy5のような発蛍光団に対して観測される。増強Eは、96ウエルプレート
の標準ウエルまたは、8ウエルのストリップでの同一のウエルで達成される蛍光
に対して定義する。96ウエルプレートのウエル、または Nunc HLAプレート
(Takasaki プレート)のより小さいウエルで乾燥されたストレプトアビジン− Cy5のような乾燥材料との比較も使用した。しかし、乾燥フィルムは連続層を
形成せず、再現性の達成は非常に困難である。従がって、増強は、レーザービー
ムにより定められる容積のような励起放射線の寸法により定められる容積での発
蛍光団濃度に対して定められる。
、Cy5のような発蛍光団に対して観測される。増強Eは、96ウエルプレート
の標準ウエルまたは、8ウエルのストリップでの同一のウエルで達成される蛍光
に対して定義する。96ウエルプレートのウエル、または Nunc HLAプレート
(Takasaki プレート)のより小さいウエルで乾燥されたストレプトアビジン− Cy5のような乾燥材料との比較も使用した。しかし、乾燥フィルムは連続層を
形成せず、再現性の達成は非常に困難である。従がって、増強は、レーザービー
ムにより定められる容積のような励起放射線の寸法により定められる容積での発
蛍光団濃度に対して定められる。
【0106】 HeNeレーザーについては、1/e2直径は0.08cmで与えられる。し かし、特にストレプトアビジンによる散乱は、幅をほぼ0.1cmまで増加させ
るかもしれない。溶液での蛍光励起に対するおよび膜に対する容積を、以下の通
り表1に示す:
るかもしれない。溶液での蛍光励起に対するおよび膜に対する容積を、以下の通
り表1に示す:
【0107】
【表1】
【0108】 溶液の容積は、コラム1のレーザービーム直径と、ウエル内の液体高さ、普通
には溶液の容積400μlに対して8mmとから計算する。膜容積は、2、3、
または4mmのような点ブロットの寸法と、一般に1マイクロリットルである試
料の容量と、レーザービームの面積とから計算する。コラム3での3つの値は、
それぞれ3つの点ブロット寸法と、レーザービームにより実際に励起される試料
の推定容積とに対応する。コラム4に示す増強Eは、同様な蛍光信号に対する2
つの励起容積の比である。事実上、膜からの蛍光は、溶液からのそれより25〜
150のファクタだけ少ない材料を必要とすることを、コラム4のデータは示す
。プロセスは最適化されていないので、与えられた染料に対する増強は、少なく
とも表1のデータに示す大きさである。
には溶液の容積400μlに対して8mmとから計算する。膜容積は、2、3、
または4mmのような点ブロットの寸法と、一般に1マイクロリットルである試
料の容量と、レーザービームの面積とから計算する。コラム3での3つの値は、
それぞれ3つの点ブロット寸法と、レーザービームにより実際に励起される試料
の推定容積とに対応する。コラム4に示す増強Eは、同様な蛍光信号に対する2
つの励起容積の比である。事実上、膜からの蛍光は、溶液からのそれより25〜
150のファクタだけ少ない材料を必要とすることを、コラム4のデータは示す
。プロセスは最適化されていないので、与えられた染料に対する増強は、少なく
とも表1のデータに示す大きさである。
【0109】実施例2 この実施例は、本発明の方法を使用するCy5ラベル付ストレプトアビジンの
増強された蛍光を例証し、それにより較正曲線を提供する。
増強された蛍光を例証し、それにより較正曲線を提供する。
【0110】 ストレプトアビジン−共役Cy5を、Jackson Immunoresearch Laboratories,
Inc., から入手し、PBS緩衝剤(0.05Mリン酸塩と0.15M塩化ナト リウム)で順次希釈し、それにより、71、5.68、4.26、2.84、1
.42、および0.71ピコグラム(10-12g)または約10-17−10-15モ ル(107−109分子)を、Pall BioSupportDiv., Pall Corporation から購入
したナイロン膜(Biodyne A(登録商標), 0.45μm)上に、1マイクロリット ルの溶液を使用して公称2mmの点ブロットとして、次々に配置した。蛍光信号
を、そのように処理したナイロン膜で、後方散乱法を使用して検出した。後方散
乱法は、蛍光の光をレーザー励起の光と膜と同じ側で収集することを引用する。
バックグラウンドを補正した蛍光信号を、ストレプトアビジン−Cy5の上に記
載した量毎に表2に示す。
Inc., から入手し、PBS緩衝剤(0.05Mリン酸塩と0.15M塩化ナト リウム)で順次希釈し、それにより、71、5.68、4.26、2.84、1
.42、および0.71ピコグラム(10-12g)または約10-17−10-15モ ル(107−109分子)を、Pall BioSupportDiv., Pall Corporation から購入
したナイロン膜(Biodyne A(登録商標), 0.45μm)上に、1マイクロリット ルの溶液を使用して公称2mmの点ブロットとして、次々に配置した。蛍光信号
を、そのように処理したナイロン膜で、後方散乱法を使用して検出した。後方散
乱法は、蛍光の光をレーザー励起の光と膜と同じ側で収集することを引用する。
バックグラウンドを補正した蛍光信号を、ストレプトアビジン−Cy5の上に記
載した量毎に表2に示す。
【0111】
【表2】
【0112】 これらのデータを図4に示し、図4は、毎秒カウント数での蛍光(y軸)とピ
コグラムでのストレプトアビジン−Cy5の重量(x軸)のグラフである。最適
化されていない検出システムに対して、約107分子は100cps未満の結果 となり、106分子は、現在の蛍光の検出限界が約10cpsであることをデー タが示している。含めなかった他のデータ点は、蛍光信号とこの同じ材料の重量
との間の関係がマイクログラムまでの高濃度に対して直線的であることを示す。
マイクログラムより高い重量は調査しなかった。
コグラムでのストレプトアビジン−Cy5の重量(x軸)のグラフである。最適
化されていない検出システムに対して、約107分子は100cps未満の結果 となり、106分子は、現在の蛍光の検出限界が約10cpsであることをデー タが示している。含めなかった他のデータ点は、蛍光信号とこの同じ材料の重量
との間の関係がマイクログラムまでの高濃度に対して直線的であることを示す。
マイクログラムより高い重量は調査しなかった。
【0113】 表2および図4のデータは、システムが最適化されていないCy5を表す。他
の染料は同様またはより大きい蛍光を示し、与件のデータは例示だけを目的とす
る。
の染料は同様またはより大きい蛍光を示し、与件のデータは例示だけを目的とす
る。
【0114】実施例3 この実施例は、蛍光を増強する方法とそれの検出の実施の形態の1つを例証す
る。単一点ブロットを、均質アッセイまたは運動アッセイに対する増強された蛍
光の使用を実証するよう使用した。ベータグロビンの単位複製配列に対し特異性
であるプローブDNAの1316マイクログラム/mlの株 (stock) の1.0 マイクロリットルのアリコート、すなわち148696ピコモル/ml(分子量
8853D)を、 Pall BioSupport 膜 (Biodyne A) 上へ付加することにより
点ブロットを準備した。株は、Research Genetics (Huntsvill, AL) から入手し
た。膜上の結果の点ブロットは、直径で2〜3mmであった。635nmで放射
する、約1mmの焦点合せしたビームを有する半導体レーザー (LaserMax MDL-2
00-635-5) からのレーザービームを使用した。このように、レーザービームは点
ブロットをセルで連続照射し、そこで、膜は、ベータグロビンの単位複製配列を
含有する溶液に曝される。ベータグロビンの単位複製配列は、Wu 他 Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86, 2757-2760 (1989) により与えられる手順、または、Perk
in Elmer (Applied Bioscience Div.) から入手できた手順により、プライマの うちのひとつ (Research Genetics) の上へ、Cy5を用いて合成されたプライ マにより製造した。従がって、単位複製配列は、レーザー光により励起される場
合に蛍光を発する。1mmセルでの単位複製配列溶液への最初の露出で、蛍光信
号は、3,100cpsであり、溶液と膜の蛍光の組合せ効果を呈した。これは
均質結合アッセイの開始条件も表す。
る。単一点ブロットを、均質アッセイまたは運動アッセイに対する増強された蛍
光の使用を実証するよう使用した。ベータグロビンの単位複製配列に対し特異性
であるプローブDNAの1316マイクログラム/mlの株 (stock) の1.0 マイクロリットルのアリコート、すなわち148696ピコモル/ml(分子量
8853D)を、 Pall BioSupport 膜 (Biodyne A) 上へ付加することにより
点ブロットを準備した。株は、Research Genetics (Huntsvill, AL) から入手し
た。膜上の結果の点ブロットは、直径で2〜3mmであった。635nmで放射
する、約1mmの焦点合せしたビームを有する半導体レーザー (LaserMax MDL-2
00-635-5) からのレーザービームを使用した。このように、レーザービームは点
ブロットをセルで連続照射し、そこで、膜は、ベータグロビンの単位複製配列を
含有する溶液に曝される。ベータグロビンの単位複製配列は、Wu 他 Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86, 2757-2760 (1989) により与えられる手順、または、Perk
in Elmer (Applied Bioscience Div.) から入手できた手順により、プライマの うちのひとつ (Research Genetics) の上へ、Cy5を用いて合成されたプライ マにより製造した。従がって、単位複製配列は、レーザー光により励起される場
合に蛍光を発する。1mmセルでの単位複製配列溶液への最初の露出で、蛍光信
号は、3,100cpsであり、溶液と膜の蛍光の組合せ効果を呈した。これは
均質結合アッセイの開始条件も表す。
【0115】 時間とともに、最適化されていないが、ハイブリダイゼーションが生じた。得
られたデータを以下のように表3に示す:
られたデータを以下のように表3に示す:
【0116】
【表3】
【0117】 これらのデータを図5に示し、それは、信号の対数が時間に直線的に関係する
ことを示唆する。すなわち、信号の対数と時間との間の関係は、この特定の均質
なアッセイの特性として、運動のプロセスの点から解釈できる。より一般的に、
これらのデータを、以下を示す: (1)アッセイの時間にかかわらず、均質なアッセイは可能であり、ここで、膜
への結合は15,000cpsまでの信号を与え、他方、膜への結合が無く、溶
液だけからは、3,100cpsの信号を与える。均質なアッセイは、膜へ結合
する発蛍光団含有プローブにより、蛍光で5倍の増加に基礎を置くことができる
。 (2)アッセイの時間に関して、運動のアッセイは可能であり、膜への結合は、
時間の関数として測定される。蛍光での5倍の増加は強い信号を確立し、それは
、プローブのアレー (array) を使用するアレーアッセイに対してハイブリダイ ゼーションの速度を測定することに使用できる。
ことを示唆する。すなわち、信号の対数と時間との間の関係は、この特定の均質
なアッセイの特性として、運動のプロセスの点から解釈できる。より一般的に、
これらのデータを、以下を示す: (1)アッセイの時間にかかわらず、均質なアッセイは可能であり、ここで、膜
への結合は15,000cpsまでの信号を与え、他方、膜への結合が無く、溶
液だけからは、3,100cpsの信号を与える。均質なアッセイは、膜へ結合
する発蛍光団含有プローブにより、蛍光で5倍の増加に基礎を置くことができる
。 (2)アッセイの時間に関して、運動のアッセイは可能であり、膜への結合は、
時間の関数として測定される。蛍光での5倍の増加は強い信号を確立し、それは
、プローブのアレー (array) を使用するアレーアッセイに対してハイブリダイ ゼーションの速度を測定することに使用できる。
【0118】実施例4 この実施例は、マイクロ構造の器具内でのβ−グロビン遺伝子に相補であるD
NA単位複製配列の増強された蛍光の方法、および検出の使用を例証する。これ
らの構造での膜材料の使用は、ペトリ皿に関与するもののような従来の方法と比
較して、効率的なハイブリダイゼーションと蛍光検出を提供する。
NA単位複製配列の増強された蛍光の方法、および検出の使用を例証する。これ
らの構造での膜材料の使用は、ペトリ皿に関与するもののような従来の方法と比
較して、効率的なハイブリダイゼーションと蛍光検出を提供する。
【0119】 この実施例に対して、例えば、米国出願第08/664,780号およびPC
T/US97/00298で先に記載のプラスチックのモールド成形されたカセ
ットの構造を、Pall BioSupport (Pall Co.) の膜 (Biodyne A) を1つのチャン
バ内に保持するように、変更した。チャンバの寸法は、公称長さ1cm、幅5m
m、で、高さが約75−150μmである。膜をチャンバ内に適合する寸法に切
断した。以下の配列を有する指定されたNGPポリT、プローブDNAの株45
.4ピコモル/μgの1.0マイクロリットルを付加することにより点ブロット
を準備した。 5'−TGA−CTC−CTG−AGG−AGA−AGT−TTT−TTT−T TT−TTT−TTT−3' [配列ID No:1] NGPポリTは、β−グロビン単位複製配列(分子量 10159D)に対し
特異性であり、Pall BioSupport 膜 (Biodyne A) 上に使用した。プローブを、R
esearch Genetics により短いポリ(T)尾部で合成し、Saiki 他 前出、の手順
に従がいナイロン膜へUV結合した。膜上に結果として得られた点ブロットは、
直径2〜3mmであった。2つの追加の点ブロットも対照標準として準備し、1
つはブランクで、2つ目は、Buawan 他 Tissue Antigens 44, 137-147 (1994) に開示されている、よく特徴付けた普遍的なHLAプローブDB344である。
短いポリ(T)尾部で合成された、このプローブも、ハイブリダイゼーションの
特異性を試験するのに使用した。Sambrook 他 の標準手順に従がい、乾燥された
脂肪フリー(スキム)ミルクから調製した遮断溶液を、ハイブリダイゼーション
の前に使用した。上記のように、洗浄剤、好ましくはタージトールNP−40を
使用してもよい。β−グロビン単位複製配列のNGPポリTプローブへのハイブ
リダイゼーションを決定するよう、Cy5蛍光を測定した。β−グロビン遺伝子
をヒト白血球から隔離されたDNAに含め、標準のプロトコルを使用するポリメ
ラーゼ連鎖反応(PCR)を、Perkin Elmer によりGH20とPC04と同定 されるCy5タグ付プライマの1つまたは両方を使用して動作させた: プライマ1、GH20:5'−GAA−GAG−CCA−AGG−ACA−GG T−AC−3' [配列ID No:2] プライマ2、PC04:5'−GGT−GAA−CGT−GGA−TGA−A GT−TG−3' [配列ID No:3] Cy5は、特記しない限り、5'端でプライマ上へ合成される (Research Gene
tics)。
T/US97/00298で先に記載のプラスチックのモールド成形されたカセ
ットの構造を、Pall BioSupport (Pall Co.) の膜 (Biodyne A) を1つのチャン
バ内に保持するように、変更した。チャンバの寸法は、公称長さ1cm、幅5m
m、で、高さが約75−150μmである。膜をチャンバ内に適合する寸法に切
断した。以下の配列を有する指定されたNGPポリT、プローブDNAの株45
.4ピコモル/μgの1.0マイクロリットルを付加することにより点ブロット
を準備した。 5'−TGA−CTC−CTG−AGG−AGA−AGT−TTT−TTT−T TT−TTT−TTT−3' [配列ID No:1] NGPポリTは、β−グロビン単位複製配列(分子量 10159D)に対し
特異性であり、Pall BioSupport 膜 (Biodyne A) 上に使用した。プローブを、R
esearch Genetics により短いポリ(T)尾部で合成し、Saiki 他 前出、の手順
に従がいナイロン膜へUV結合した。膜上に結果として得られた点ブロットは、
直径2〜3mmであった。2つの追加の点ブロットも対照標準として準備し、1
つはブランクで、2つ目は、Buawan 他 Tissue Antigens 44, 137-147 (1994) に開示されている、よく特徴付けた普遍的なHLAプローブDB344である。
短いポリ(T)尾部で合成された、このプローブも、ハイブリダイゼーションの
特異性を試験するのに使用した。Sambrook 他 の標準手順に従がい、乾燥された
脂肪フリー(スキム)ミルクから調製した遮断溶液を、ハイブリダイゼーション
の前に使用した。上記のように、洗浄剤、好ましくはタージトールNP−40を
使用してもよい。β−グロビン単位複製配列のNGPポリTプローブへのハイブ
リダイゼーションを決定するよう、Cy5蛍光を測定した。β−グロビン遺伝子
をヒト白血球から隔離されたDNAに含め、標準のプロトコルを使用するポリメ
ラーゼ連鎖反応(PCR)を、Perkin Elmer によりGH20とPC04と同定 されるCy5タグ付プライマの1つまたは両方を使用して動作させた: プライマ1、GH20:5'−GAA−GAG−CCA−AGG−ACA−GG T−AC−3' [配列ID No:2] プライマ2、PC04:5'−GGT−GAA−CGT−GGA−TGA−A GT−TG−3' [配列ID No:3] Cy5は、特記しない限り、5'端でプライマ上へ合成される (Research Gene
tics)。
【0120】 実施例2に示した方法と器械を使用して、Pall Biodyne A ナイロン膜に捕捉 された蛍光の22,146毎秒カウント(cps)の信号を測定した。ブランク
(対照標準)として定義したブロット、およびHLA344プローブで定義した
ブロットは、それぞれ9,350および10,827cpsを示し、信号(単位
複製配列)対バックグラウンドの比は2.4である。遮断のその後の最適化は、
信号対ブランクバックグラウンド比のほぼ30、すなわち非常に低いバックグラ
ウンドを与えた。これらのデータは、DNA検出に対し、カセットまたはマイク
ロ流体構造内で膜を使用すること、および、緩衝剤と単位複製配列のような反応
物のフローにより、増強された蛍光信号、ここで単位複製配列のほぼマイクログ
ラム、を得ることの能力を実証した。
(対照標準)として定義したブロット、およびHLA344プローブで定義した
ブロットは、それぞれ9,350および10,827cpsを示し、信号(単位
複製配列)対バックグラウンドの比は2.4である。遮断のその後の最適化は、
信号対ブランクバックグラウンド比のほぼ30、すなわち非常に低いバックグラ
ウンドを与えた。これらのデータは、DNA検出に対し、カセットまたはマイク
ロ流体構造内で膜を使用すること、および、緩衝剤と単位複製配列のような反応
物のフローにより、増強された蛍光信号、ここで単位複製配列のほぼマイクログ
ラム、を得ることの能力を実証した。
【0121】 本発明は、好ましい実施の形態を強調して説明されたが、好ましい装置および
方法での変更が使用でき、本発明は、ここに特定的に説明された以下で実施でき
ることを意図していることは、この技術に通常に精通する者には明らかであろう
。従がって、本発明は、以下の特許請求の範囲により定義される、本発明の精神
と範囲内に含まれる全ての変更を包含する。
方法での変更が使用でき、本発明は、ここに特定的に説明された以下で実施でき
ることを意図していることは、この技術に通常に精通する者には明らかであろう
。従がって、本発明は、以下の特許請求の範囲により定義される、本発明の精神
と範囲内に含まれる全ての変更を包含する。
【配列表】
【図1】 後方散乱モード増強蛍光ユニットを示す。
【図2】 試料に対するマイクロタイタープレートを使用する増強蛍光ユニットを示す。
【図3】 マイクロ流体器具を示す。
【図4】 蛍光(cps)対ストレプトアビジン−Cy5(ピコグラム)を示す較正線図
である。
である。
【図5】 蛍光(対数cps)対時間(分)を示す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 2G054 AA06 AB02 AB04 BA04 BB05 BB11 CA22 CB02 CD01 CE02 EA03 FA02 FA06 FA07 FA10 FA20 FA21 FA22 FA28 FB02 GA05 JA07 JA10 4B063 QA01 QA19 QQ42 QR31 QR32 QR41 QR48 QR51 QR55 QR56 QR62 QR66 QR83 QR84 QS34 QS39 QX02
Claims (17)
- 【請求項1】 蛍光を増強する方法であって、 発蛍光団をテクスチャ付けた材料と接触させ、これにより複合体を形成する工程
と、および 前記テクスチャ付けた材料上または内の発蛍光団複合体に付帯する蛍光を、存
在する場合、検出する工程と を含む方法。 - 【請求項2】 更に、前記発蛍光団へ結合された配位子を介して、前記テク
スチャ付けた材料へ前記発蛍光団を結合する工程を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記配位子は、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、
抗原、抗原に対して特異性の抗体、炭水化物基、炭水化物基に対して特異性のレ
クチン、プロテインA、免疫グロブリンである請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記テクスチャ付けた材料は、多ウエル・プレートのビーズ
またはウエルの面上に組込まれている請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 反応プロセスを導くためにカセットまたはチップで分析的反
応を導く工程と、 前記反応の発蛍光団含有の生成物を前記テクスチャ付けた材料へ接触させる工
程であって、前記テクスチャ付けた材料は、前記カセットまたはチップの検出ま
たは反応チャンバに組込まれている工程と、および 前記テクスチャ付けた材料から蛍光を検出する工程と を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 更に、前記テクスチャ付けた材料がない前記発蛍光団の蛍光
に対して、少なくとも10倍の蛍光増強を達成するテクスチャ付けた材料を選定
する工程を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 励起光を前記テクスチャ付けた面へ実質的に90°の入射角
度で当てる工程と、および 前記入射励起光の反射軸のまわり20°の円錐形内にある放射を収集する工程
と を更に含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記発蛍光団を励起する工程は、ガスまたは固体レーザーに
より生成される放射線による請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記テクスチャ付けた材料は、ナイロンまたはポリカーボネ
ートである請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記テクスチャ付けた材料は、ナイロンである請求項8に
記載の方法。 - 【請求項11】 更に、前記発蛍光団を前記テクスチャ付けた材料内へ約8
0μm以下の深さで吸収する工程を含む請求項8に記載の方法。 - 【請求項12】 基体の発蛍光団が液相のままであり、生成物発蛍光団が前
記テクスチャ付けた材料に付帯するように、前記テクスチャ付けた材料の存在で
分析的反応を導く工程であって、前記分析的反応は、前記生成物発蛍光団の蛍光
発生率を実質的に増加させない工程と、および 励起光源を前記液相を通し前記テクスチャ付けた材料へ当てることにより前記
テクスチャ付けた材料から蛍光を検出する工程と を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 反応を導くための器具であって、 そこに付帯する発蛍光団の蛍光を増強するテクスチャ付けた材料を包含する少
なくとも1つの検出または反応チャンバを備える反応プロセスを導くためのカセ
ットまたはチップと、 前記蛍光増強を減少させるのに有効な量で前記テクスチャ付けた材料により吸
収されない光を放射するよう選定され、その光源は、前記少なくとも1つの検出
または反応チャンバと光軸合せされている光源と、および 前記光源により放射される前記光に対して前記テクスチャ付けた基体からの反
射の軸と光軸合せされている検出器と を備える器具。 - 【請求項14】 前記光源は、コヒーレントな光源である請求項13に記載
の器具。 - 【請求項15】 前記光源は、前記テクスチャ付けた面に対し90°の角度
で光を当て、前記検出器は、前記光源により放射される前記光の反射軸のまわり
20°の円錐形内にある放射を収集する請求項13に記載の器具。 - 【請求項16】 蛍光測定を行う器具であって、 反応ウエルまたはチャンバを画成するようエンボスされたテクスチャ付けた材
料を備える器具。 - 【請求項17】 前記エンボス加工され、テクスチャ付けた材料は、そこを
通す流体の通過を防止するよう対向する側にシールされている請求項16に記載
の器具。
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