JP2001519790A - 生物学的材料中の病原体とりわけ特定のウイルスの不活化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 化学剤と一緒にインキュベートすることにより生物学的材料中の病原体とりわけウイルスを不活化する方法であって、少なくとも200mmol／ｌ、好ましくは少なくとも300mmoｌ／ｌのＮａＣｌ濃度に相当する溶出系列の塩の存在下でインキュベーションを行うことを特徴とする方法、並びにクロマトグラフィ一的に精製されたプロトロンビン複合体を含有する調製物。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的材料中の病原体とりわけ特定のウイルスの不活化法 本発明は、化学剤とインキュベートすることにより、生物学的材料（物質）中 の病原体、とりわけ特定のウイルスを不活化する方法に関する。 生物学的材料は生物又は体液又は微生物から導かれる。 生物学的材料は例えば感染性の分子又は微生物及びウイルスなどの病原体、及 び発熱物質で汚染されているかもしれないので、それぞれ、病原体及び発熱物質 を不活化または除去する様々な方法が開発されてきた。 そのような方法は物理的及び／又は化学的な処置、例えば様々なろ過法（ナノ −、ジア−又は限外ろ過）、熱処理、酸又はアルカリ処理、洗剤及び／又は有機 溶媒処理、並びにＵＶ光又はレーザー光線による処理などを含む。また、そのよ うな病原体の不活化及び枯渇化法の種々の組み合わせも先行技術では示唆されて いる。 ＥＰ 0 197 554から、例えば生物学的又は製薬的生成物の、脱発熱原及びウイ ルス不活化の方法が既知である。該方法は生成物が吸着している固相上を例えば 、両親媒性物質及び／又は溶媒でウイルス不活化及び脱発熱原剤で処理すること からなる。この処理の後、ウイルス不活化及び脱発熱原剤を固相から分離し、吸 着した生成物を洗浄し最後に固相から溶離する。 ＥＰ 0 131 740から、溶液中のタンパク含有組成物をジー又はトリアルキルホ スフェートのような有機溶媒で、所望により洗浄剤(界面活性剤；detergent)の 存在下で処理する（溶媒／洗剤処理）ことにより脂質含有ウイルスを含まないタ ンパク組成物を得ることが出来ることが既知である。 AT特許402，151から、水溶液中に存在する調製物に界面活性剤水溶液を少なく とも濃度１重量％で加えたのち、加熱することからなる熱処理が既知である。 さらに、EP 0 083 999から、生物学的又は製薬的生成物中の望ましくない活性 を減少又は抑制する方法が既知である。後者は非−変性性の両親媒性剤の溶液又 は懸濁液との広範な接触に基づく。脱発熱原された生成物をイオン交換体で処理 し両親媒性剤を除去する。 これらの先行技術で知られている多くの方法の不利な点は、往々にして処理す べき組成物に含まれる変化しやすいタンパク、例えば血液タンパクの活性が失わ れることである。特に、クロマトグラフィー的な精製工程を行うときに、かなり 大きいタンパクの不活化が起きる。タンパクの分解（デグラデーション）は活性 化を起こしうる。即ち、例えば、因子VIIはクロマトグラフィー精製の間に自己 触媒プロセスによって容易に活性化され因子VIIaなるが、該因子は非常に不安定 であり、これは望ましくない。 さらに、不利益として多くの方法が膨大な時間と装置を必要とし、そのことが それら方法の実用化の可能性を著しく減少し、多くの場合、大量工業規模での使 用が不適当になる。 本発明は生物学的材料中の病原体の効率的な不活化法を提供するという目的に 基づいており、該方法はタンパク、特に不安定な血液タンパクに保存的であり、 該方法は大量工業規模に容易に転用でき、経済的に実施可能である。特に、病原 体の不活化法において、感受性のタンパクのデグラデーション及び不活化の可能 性が最大限回避されるべきである。 上記の目的は生物学的材料中の病原体、特にウイルスを、化学剤と一緒にイン キュベートすることにより不活化する方法において、インキュベーションを少な くとも200mmol／ｌ、好ましくは少なくとも300mmol／ｌのＮａＣｌに相当する溶 出系列の塩(eluotropic salt)の存在下で行うことからなる方法により達成され る。 溶液中の病原体の不活化は吸着剤の処理より有利な点がある。即ち、例えば、 そのような方法の実用性は均質な単一相系においてより高く、不活化工程の確認 もより可能になる。比較的均質な相では病原体により接近可能であることから、 方法工程の効率が向上するとも考えられる。 生物学的材料はヒトタンパクを含有するもの、特に、血漿または血漿画分であ るか細胞培養物から誘導されたものであることが好ましい。好ましくは、生物学 的材料は因子XII、XI、VIII、V、フォンビルブラント因子又はフィブリノゲンの ような血液因子を含有することが好ましく、特に因子II因子VII、因子IX、因 子X、プロテインＣ、プロテインＳ又はプロテインＺのようなビタミンK-依存性 タンパクを含有することが好ましい。 タンパクは単一因子として、好ましくは精製された形で存在していても、ある いは複合混合物として存在していてもよい。特に極めて好ましい態様において、 生物学的材料は、プロトロンビン複合体の少なくとも１つの因子を含有しており 、特に、プロトロンビン複合体含有画分（フラクション）又は因子ＶＩＩ含有材 料であって、例えば、血漿の寒冷沈降（クリオ沈殿）後、対応する上清（クリオ 上清）から分離された材料である。 本発明の調製物はＦＥＩＢ活性(因子ＶＩＩＩインヒビター回避活性；Factor Eight Inhibitor Byapssing Activity)を有するもの、即ち因子ＶＩＩＩ阻害患 者の治療に適したものであることが好ましい。 細胞培養物から導かれる材料は、好ましくは、組換え法で調製された血液因子 を含有する材料であり、血液因子中、内因性又は外因性の、凝固因子、フィブリ ン溶解因子、血栓溶解因子、又はそれらのインヒビター、特にビタミンＫ依存性 血液因子類を含有する材料である。細胞としては、一般に組換えタンパクの発現 に用いられる細胞が適し、好ましくは例えばＶeｒｏ，ＣＨＯ又はＢＨＫ細胞の ような哺乳動物細胞である。対応するタンパクは、粗細胞抽出物を直接、本発明 に付して存在し得る病原体を不活化することができるが、予め精製した細胞画分 であってもよい。 化学剤は、例えば洗浄剤（両親媒性化合物、界面活性剤）であり、それが好ま しくは少なくとも１％、より好ましくは５％以上、最も好ましくは１０％以上含 有されているが、他の化学剤、特に、殺ウイルス性、殺菌性、又は脱発熱原効果 を有することが知られている他の化学剤、または多種多様な化学剤の組合せも本 発明方法に用いることができる。 しかしながら、選択は、生物学的材料の固有の性質が実質上悪影響を受けない という事実により制限される。方法の経済性（節約モード）のために、インキュ ベーション前の材料の生物学的活性に基づいて、５０％以上、好ましくは少なく とも７０％、特に８５％以上の活性が保持される化学剤を選択する。生物学的活 性の保持とは、生物学的材料中に含有されるタンパクが、天然状態でそれに帰す とされている機能又は機能類を充足しうることを意味する。この生物学的活性は 既述のとおりタンパクのタイプに応じて、例えば標準化された発色試験又は抗原 決定法によって決定される。 所望により、化学剤をインキュベーション後に分離する。 「洗浄剤」なる語句は一般に合成、有機、表面活性剤と理解されるべきである 。 好ましくは非イオン性洗浄剤を本発明方法に用いる。ポリエーテル、特にアル キルフェノールポリグリコールエーテルのような非イオン性界面活性剤は、なか んずく、脂肪酸、脂肪酸アミド、脂肪属アミン、脂肪属アルコール、アミンオキ シド、ポリアルコール類の脂肪酸エステル、及び糖エステルのエトキシル化生成 物である。 そのような界面活性剤はタンパクに対して変性的に作用せず、ポリソルベート 及びトリトンからなる群から選択されることが好ましい。ポリソルベートとして 洗浄剤を化学剤として用いる場合、本発明の好ましい実施態様では他の剤、特 に、例えばＴＮＰＢのような有害な有機物質又は溶媒を添加せずにそれらを用い る。このような方法で汚染のリスクを最小にする。 本発明方法に従い、生物学的材料を化学剤と一緒にインキュベートする。イン キュベーションは生物学的材料と化学剤の溶液、懸濁液、又はエマルションとを 、存在し得る病原体又は発熱原それぞれの不活化に充分な期間、特定の温度で接 触させることを意味する。接触は単に混合物をある一定の時間放置することによ っても行われる。 本発明に従い、インキュベーションは溶出系列の塩の存在下で行う。以下、「 溶出系列の塩」という語句は、化学剤との混合物中の塩、又は複合組成物 (com plex composition)中の塩であって、吸着した物質を固体又は液体含浸、またゲ ル型吸着剤から溶出させる、及び／又は置換する性質を有する塩であると理解さ れるべきである。好ましくは、溶出系列の塩はクロマトグラフィー法で用いられ る脱着剤である。吸着した物質が、なかんずく溶出系列塩の存在下で充分な溶解 性を有する、すなわち、生物学的材料を沈殿させない条件を選択することが好ま しい。 塩又は組成物それぞれのタイプ又は濃度は一般に用いる吸着剤に応じて選択さ れる。塩の溶出効果は、例えば、溶媒の極性に依存しておりそれは、例えば、エ タノール−アセトン−メタノール−水の順番で増大する。吸着剤はまた、固相、 特にイオン交換クロマトグラフィーに適したマトリックスであってもよい。溶出 系列の塩を含有する組成物中には、さらなる添加物（例えばさらなる塩）が含有 されていてもよい。組成物はｐＨ範囲が6.0〜8.0、好ましくは約７.０の水性組 成物であることが好ましい。 好ましい実施態様では、塩化ナトリウムを溶出系列塩として用いるが、他のア ルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、なかんずくＣａＣｌ₂も用いることができ る。溶出系列の塩として、いわゆるカオトロピックな物質、例えば、尿素、ロダ ン化合物又はグアニジニウムも用いることができる。塩の濃度は少なくとも≧20 0mmol／ｌ、好ましくは≧300mmol／ｌである。用いる濃度の上限は特に個々の塩 の溶解性に依存しており、ＮａＣｌに関しては例えば、2mol／ｌである。例えば 尿素のようなカオトロピック物質は所望により8mol/lまでの濃度で用いることが できる。 生物学的材料と化学剤とのインキュベーションは存在し得る病原体を不活化す るに充分な時間、好ましくは10分〜10時間の間、最も好ましくは１時間〜5時間 の間行う。本発明方法に必要な時間は、予備検定(pre-assay)で、HIV、Sindbis 、TBE又は肝炎ウイルスのようなモデルウイルスを用いて決定することができる 。 また、温度の選択は採用時間の長さに影響する。本発明方法では、インキュベ ーションは、室温、例えば１５〜４５℃の間の温度範囲、特に２０〜３０℃の温 度範囲で行うことが好ましい。 本発明方法においては、生物学的材料を固体担体（キャリア）に吸着させ、精 製し、精製された材料を溶出直後にインキュベーションすることが好ましい。溶 出及びインキュベーションは連続的に行うことができるが、同時に行ってもよい 。 さらに本発明の好ましい実施態様では、生物学的材料をクロマトグラフィー精 製し、溶出液をさらに、例えば、遠心、ろ過又は他の物理的な方法で処理した後 、ィンキュベーションを行う。 好ましくは、固体担体はクロマトグラフィーに適した材料、特にイオン交換ク ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグ 材料が用いられる。 使用できる。 生物学的材料は複合混合物から直接担体に吸着させ、精製することができるが 、不活化工程の前、又は後にさらなる材料の精製工程があってもよく、さらなる クロマトグラフィー精製工程のあることが本発明の範囲内で好ましい。 本発明方法により、病原体は不活化される。病原体という語句はまた、例えば ウイルスフラグメント、特に単離されたゲノム又はそのフラグメントを意味する と理解される。 病原体はＢ型肝炎ウイルスのような脂質エンベロープを有する病原体、又はＡ 型肝炎ウイルスのような非脂質エンベロープを有する病原体であってよい。 現在では、ウイルス不活化法は、高用量の試験ウイルス、例えば肝炎ウイルス のモデルウイルスとしてのＨＩＶウイルス又はSindbisウイルスと予め混合して おいた生物学的材料のサンプルにその方法を適用した後、ウイルスが試料中に検 出されずウイルス力価が検出限界以下に減少していれば、有効とみなされる。核 酸の検出及び定量は例えばＡＴ特許401,062に記載のＰＣＲ法又は直接滴定法で 行うことができる。 不活化の基準として、いわゆるリダクションファクターが知られており、それ は試験ウイルスを一回添加した後、最初の、及び最終的なウイルス力価の比率の 常用対数で表すことで計算される。さらに、欧州共同体委員会(Commisi on of t he European Communities)の欧州ガイドラインＥＣＩＩＩ／８１１５／８９−Ｅ Ｎから、いわゆる総リダクションファクターが知られている。それは不活化法の 後の個々のリダクションファクターの合計として計算される。 好ましくは、病原体を不活化又は枯渇化するための独立した工程をさらに実施 する。このためには、感染のリスクを最小にするために、先行技術で既知のあら ゆる方法を用いることができる。 特に、ろ過及び／又は熱処理を不活化又は枯渇化それぞれの更なる工程として 行う。 ろ過としては好ましくはナノろ過を行う。熱処理はＥＰ０１５９３１１に記載 のように、固体生物学的材料、例えば制御した水分含量、例えば水分含量が５及 び８％の範囲の凍結乾燥品に対し、温度５０〜８０℃の範囲で行うことが好まし い 好ましい態様では、化学剤として洗浄剤による２工程処理が提供される。その 方法では、洗浄剤を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、最も好ましく は少なくとも１０％の量で用いる。第２工程では、さらに洗浄剤を少なくとも１ ０％、好ましくは少なくとも１２％、最も好ましくは少なくとも１４％の量で用 いる。用いる洗浄剤は両工程で同じであってもよい；しかし、異なる洗浄剤を用 いることもできる。極めて一般的に、ウイルス不活化工程を組合わせることで、 対応する製品の投与後にウイルス感染の危険性を大いに減少又は消失させること ができる。 本発明方法はまた、自己起動的に(autodynamically)活性化し得る血液因子で あって、活性化血液因子及び非活性化血液因子の含有量に基づいて、活性化され た血液因子部分が５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以 下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、最も好ましく は１％以下である血液因子、及びある洗浄剤含量を含有するクロマトグラフィー 的に精製された調製物が得られる。 特に、調製物は活性化及び非活性化因子ＶＩＩの含有量に基づいて因子ＶＩＩ ａ活性が５０％以下、好ましくは１０％以下、最も好ましくは１％以下であるプ ロトロンビン複合体を含有する調製物である。本発明の調製物における洗浄剤含 有量は製薬的に許容される含有量であり、好ましくは１％から洗浄剤の検出限界 の範囲である。 本発明において「自己起動的に活性化しうる血液因子」という語句は、表面接 触又は処理工程、例えばクロマトグラフィー処理、により自己触媒的に活性化さ れうる血液因子を指すと理解されるべきである。特に、そのような血液因子は因 子ＶＩＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩ、及びプレカリクレインからなる群から選択さ れる。 さらに好ましい態様では、調製物はセリンプロテアーゼインヒビター、例えば トロンビンインヒビター、又は補因子、例えばヘパリンを含有しない。特別の態 様では、クロマトグラフィー工程でそのような物質の非含有は既に現れている。 従って、本発明はまた、本発明方法により得ることができる対応する調製物に も関する。 本発明方法による調製物は例えば、安定化作用をするアミノ酸のような添加物 をも含有していてよい。 以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限 定されるものではない。 ＢＡの洗浄剤処理 一緒に室温で15分間、膨潤するまでインキュベートした。次いで、ゲルを膨潤上 清から遠心分離した。ゲルを緩衝液各１ｍｌ（９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、 ７g/l ＮａＣｌ，ｐＨ7.0）で５回洗浄した後、さらに緩衝液（７g/l Ｎａ₃クエ ン酸・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ）により、再懸濁及び遠心し２回洗浄した。 新鮮な凍結ヒトクエン酸処理血漿30ｍｌを0℃〜＋4℃で解凍し、生成したクリ オ沈殿物を＋2℃で遠心分離した。得られた「クリオ上清」を洗浄したＤＥＡＥ 性タンパクと一緒に生成したＦＥＩＢＡ１をゲルに吸着させた。その後、ＤＥＡ Ｅゲルを緩衝液（９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ）で洗浄し、 一緒に吸着した不活性タンパクをゲルから除去した。 ０及び３０mg/ｍｌ ＮａＣｌの溶液1.5mlを用いて２６℃で１時間懸濁した。高 イオン強度の溶液で処理することによりタンパクをプロトロンビン複合体の因子 類及び存在し得る病原体と一緒に脱着した。続いて、懸濁液に水6.5mlを加えて 希釈し、室温で１時間再吸着することにより、タンパク画分を再吸着させ、一方 、不活性化された病原体の成分を洗浄剤と一緒に溶液中に残存させた。次いで、 洗浄剤を除くためにゲル/タンパク複合体を、各１ｍｌの7g/l ＮａＣｌ水溶液 で５回洗浄した。 溶離のために撹拌下、３０g/l ＮａＣｌ水溶液0.7ｍｌでゲルを処理した。次 いで溶出液を蒸留水に対して透析し、凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥品を再構 成した後、ＡＴ−Ｂ３５０７２６に従ってＦＥＩＢ活性を決定した 洗浄剤不在下、同方法で得られたＦＥＩＢＡ調製物を対照に用いた。 得られた調製物を分析し、凍結乾燥品を再構成した後のタンパク含量は16.6mg /mlで比活性3.2ＵＦＥＩＢＡ／ｍｇタンパクであり、洗浄剤を使用しない変法の 場合におけるタンパク含量は16.5ｍｇ/mlで比活性2.8Ｕ／ｍｇタンパクに匹敵す るものであった。 実施例２ 長時間インキュベーションによるＦＥＩＢＡの脱着時の洗浄剤処理 （desorbe）した。しかしながら、タンパク画分は、脱着した状態で、それ以外 は同じ条件下、それぞれ２又は３時間維持した。その後、実施例１と同様に後処 理して最終生成物を得た。 ョンによればタンパク含量16.6ｍｇ/mlで比活性２.５UFEIBA/ｍｇタンパクであ り、洗浄剤の存在下、３時間のインキュベーションによればタンパク含量１７． ４ｍｇ/mlで比活性２.３UFEIBA/ｍｇタンパクであることが明らかになった。 このように、洗浄剤との長時間の接触がなんらの実質的な活性物質の不活化又 は収率の減少につながらないことも証明された。 実施例３ 異なるゲルへの再吸着によるＦＥＩＢΛの洗浄剤処理 実施例１と同様にＦＥＩＢΛを調製した。洗浄剤処理及び脱着後、得られた溶 液を、容器内で30g/l ＮａＣｌ溶液中でプレインキュベーションして膨潤させ 、緩衝液１ｍｌ（９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ，ｐＨ7.0）で ５回、さらに緩衝液（７g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ）により ５０(Pharmacia)の入った容器に移した。洗浄剤を除くために、希釈したタンパ ク複合体を１時間吸着させたのち、実施例１と同様に後処理した。このようにし て得られた最終生成物は標準的な変法、即ち洗浄剤不在下での処理による生成物 と比較すると、収率は９５％でありそれと匹敵する比活性を有していた。 ビン複合体ＦＥＩＢＡの洗浄剤処理 ｍｌと膨潤するまで室温でインキュベーションした。次いで、ゲルを膨潤上清か ら遠心分離した。次いでゲルを緩衝液各１ｍｌ（９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ 、７g/l ＮａＣ１，ｐＨ7.0）で５回、さらに緩衝液（７g/l Ｎａ₃クエン酸・２ Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ）により２回、再懸濁及び遠心により洗浄した。 新鮮な凍結クエン酸処理ヒト血漿30mlを0℃〜＋4℃で解凍し、生成したクリオ 沈殿物を＋2℃で遠心分離した。得られた「クリオ上清」を洗浄したＤＥＡＥ性タンパクと一緒に、生成したＦＥＩＢＡをゲルに吸着させた。その後、ＤＥＡ Ｅゲルを緩衝液（９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ）で洗浄し、 一緒に吸着した不活性なタンパクをゲルから除去した。 び30mg/L ＮａＣｌの溶液1.5mlを用いて１時間、室温で懸濁し、タンパク画分 及び非特異的に吸着した不純物を脱着した。次いで、ゲルをろ過して分離した。 150mg/mlにした後、あらゆる存在し得る病原体を不活化するために２６℃で１時 間又は４０℃で１時間、撹拌下でインキュベートした。その後、水６．５ｍｌを せた。次いで各１ｍｌの７g/l ＮａＣｌの水溶液１mlを用いて５回洗浄して洗 浄剤を除き、最後に調製物を実施例１と同様に後処理した。 ２６℃及び４０℃での処理による２つの変法を分析した結果、ＦＥＩＢＡ製品 の比活性はウイルス不活化をしていない標準に匹敵していた。収率は標準品に比 較して７５％であった。 （現時点での、本発明の実施におけるベストモード） 新鮮な凍結クエン酸処理ヒト血漿30mlを0℃〜＋4℃で解凍し、生成したクリオ 沈殿物を＋2℃で遠心分離した。得られた「クリオ上清」を２ ＩＵ ヘパリン/ mlと混合した。次いで、プロトロンビン複合体のタンパクをＤＥＡＥ− ／タンパク複合体を溶液から分離し緩衝液１（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、 ７g/l ＮａＣｌ、９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、５００ ＩＵ／ｌヘパリン、 ｐＨ７．５）、次いで緩衝液２（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣ l、９g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、５００ＩＵ／ｌヘパリン、ｐＨ７．５）によ り洗浄した後、緩衝液２（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ、５ ００ＩＵヘパリン／ｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。−８０及び３０mg/ml ＮａＣｌを含有する溶液1.5mlに２６℃で１時間懸濁した 。この処理によりタンパク画分は、存在し得る病原体又は病原体フラクションと 一緒に脱着され、洗浄剤とのインキュベーションの過程でそのような病原体は不 活化された。続いて、実施例１に記載のごとく水６mlで希釈し、活性物質を含む タンパク画分をイオン交換マトリックスに室温で１時間再吸着した。次いで、そ れを緩衝液（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ、５００ＩＵ／ｌ ヘパリン、ｐＨ７．５）で５回洗浄して洗浄剤を除去し、１g/l Ｎａ₃クエン酸 ・２Ｈ₂Ｏ、３０g/l ＮａＣｌ、１０００ＩＵ／ｌヘパリン、ｐＨ７．０で溶離 した。溶出液に１ＩＵ／ｍｌのヘパリンを加えた。このプロトロンビン複合体含 有溶液を緩衝液（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、８g/l ＮａＣ１含有、 ｐＨ７．０）に対して再緩衝化し、凍結乾燥した。再構成した、凍結乾燥したプ ロトロンビン複合体中のタンパク含量及びプロトロンビン複合体因子類の含量を テストし、結果を表１に示した。 れている。 表１ 本発明方法を実施した後、該方法不存在の場合のプロトロンビン複合体 の活性の比較 洗浄剤処理によりプロトロンビン複合体の組成物に実質的な変化は認められな かった。 因子ＶIＩのウイルス不活化法との比較 実施例５の記載に従い、クエン酸処理したヒト血漿から、凝固因子プロトロン ビン、少量部分の因子ＶＩＩ，因子ＩＸ及び因子Ｘを含有するプロトロンビン複 子ＶＩＩの大部分を水酸化アルミニウムに吸着させることにより回収した。コの 目的のために、プロトロンビン複合体を分離した後の上清１１について、２％ア ルミニウムヒドロゲル懸濁液１0ｍｌを混合し、４℃で３０分間撹拌した。次い で、水酸化アルミニウム／タンパク複合体をソルボールＲＣ３ＢローターＨ６０ ００Ａにより、約4℃で、5,000rpmにおいて10分間遠心分離し、上清を捨て、沈 殿を溶液（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ、７g/l ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に 、吸着に用いたプロトロンビン複合体上清の容量の３．５％で懸濁し、30分間撹 拌した。これにより、不活性タンパクは水酸化アルミニウムから脱着された。水 酸化アルミニウム上に残存する因子ＶＩＩを、上記の遠心を繰り返すことにより ペ レット化した。上清を捨て、沈殿をさらに次の工程に用いた。タンパク画分の脱 着のために水酸化アルミニウム/因子ＶＩＩ複合体をプロトロンビン複合体上清 ン酸緩衝液（pH8.6）(５３．４g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏを４１．１g/l Ｎａ Ｈ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ溶液中でｐＨ８．６に調節)と一緒に30分間撹拌した。次いで、 うに加えて40℃で１時間撹拌した。次いで、溶液を約22℃に冷却し、９部の水性 destで希釈した。次いで、因子ＶＩＩ画分を約22℃で１ｇ／ｌ ＤＥＡＥ- ００ｍｌの緩衝液（４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂Ｏ及び７g/l ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５と、５００ＩＵ／ｌヘパリンを含有する）により３回洗浄することにより 洗浄剤不含にした。因子ＶＩＩ画分の溶離はイオン交換タンパク複合体を、８５ ２２℃で３０分間撹拌することにより実施した。溶離液中の因子ＶＩＩ含有量を 発色因子ＶＩＩ試験(Imrnunochrom Faktor VII:C，IMMUNO AG，Vienna，国際プ ロトロンビン複合体標準に対する測定）で連続的に測定し、タンパク含量はブラ ッドフォードの方法[Bradford，Anal．Biochem．72:248-254(1976)]で定量し、 因子ＶＩＩａはＵＳ１，６８３，６８２の方法（国際因子ＶＩＩａ標準に対する 測定）に従って測定した。結果を表２に示す。 比較のために、上記のごとく、水酸化アルミニウムへの吸着により因子ＶＩＩ をプロトロンビン複合体の他のタンパクから分離し、吸着状態でEP0 197 554に −（Ｎ−ブチル）−ホスフェート（ＴＮＢＰ）を用いて処理した。このために、 （Ｎ−ブチル）−ホスフェート（ＴＮＢＰ）の水溶液中、容量50ml/lのプロトロ ンビン複合体上清と一緒に４℃で１８時間撹拌した。次いで、上記のごとく遠心 して水酸化アルミニウムタンパク複合体を分離し、４g/l Ｎａ₃クエン酸・２Ｈ₂ Ｏ、７g/l ＮａＣｌ、ｐＨ７．５溶液で再懸濁することにより洗浄（３×１０ トを除去した。各洗浄の中間に、遠心分離を行い水酸化アルミニウム／タンパク 複合体をペレット化した。溶離は本発明方法に従い、並行する試験混合物と同一 条件下で行った。同様に、最終生成物の分析は同様に行った。結果を表2に示す 。 表２ 本発明方法及びEP 0 197 554の方法を実施した後の因子ＶIＩａ活性 本方法を適用することにより、発明方法に比較して因子VIIa含量は顕著に増加 したが、後者では因子ＶＩＩの複雑な処理にもかかわらず活性化は認められなか った。さらに、本発明方法によれば、得られた生成物の比活性は比較調製物のそ れよりも高かった。 実施例７ Ｇ型肝炎ウイルスの半定量的な測定 実施例１〜６の病原体不活化処方において、試料はそれぞれ出発原料、クリオ 沈殿の上清、又は凝固因子ＩＩ，ＩＸ及びＸを分離した後の吸着上清、並びに対 応する精製及び濃縮凝固因子調製物の各々から導かれた。これらの試料０．５ｍ ｌを生理的リン酸−食塩水緩衝液で１＋１希釈し、存在し得るウイルスを超遠心 分離してペレット化した。ウイルスペレットからＲＮＡゾル試薬法(Biotecx，Ho uston，Texas)によってＲＮＡを抽出し、滅菌a.destに溶解した。 Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）核酸のためのＲＴ−ＰＣＲはプライマー対ＮＳ５ ａｌ及びＮＳ５ａ２(Linnen，J．et al.，Science 271:505-508(1996))を用いて 行った。用いたプライマー（Boehringer Mannheim，Germanyから入手可能）の配 列は、ＮＳ５ａ１について： であり、ＮＳ５ａ２について： である。これらのプライマーは蛍光染料でラベルされ、通常の一般的なＰＣＲプ ロトコルに従ってそれから得られる蛍光性アンプリコンをＡＢＩ３７７−Sequen cer(Applied Biosystems)を用いて分析した。試料中にＲＴ−ＰＣＲインヒビタ ーが存在することを排除しうるように、試料をＣ型肝炎ウイルス−ＲＮＡミミッ クでスパイクしEP 0 714 988に従って実施するＣ型肝炎−ＰＣＲで分析した。Ｈ ＣＶ−ＰＣＲ中でなんら阻害を示さない抽出物のみをＨＣＶ−ＰＣＲのために評 価し得るものとして用いた。蛍光の強度をＣ型肝炎ウイルスの含量の測定値とし て得た。分画に用いた出発物質は、本発明方法による病原体不活化の前には高い 陽性シグナル（即ち、ＨＣＶ核酸増幅物濃度が高い）を示したが再吸着及びウイ ルス不活化剤の分離の後はＨＧＶ−ＲＮＡはもはや検出されなかった。 洗浄剤処理を行わない並行アッセイでは溶出液並びに用いた出発物質のいずれ もＨＧＶ−ＰＣＲ陽性であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 トゥレツェック，ペーター オーストリア、アー―3400クロスターノイ ブルク、ヴァイトリング、ハウプトシュト ラーセ59ゲー番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化学剤と一緒にインキュベートすることにより生物学的材料中の病原体、 特にウイルスを不活化する方法であって、少なくとも200mmol／ｌ、好ましくは 少なくとも300mmol／ｌのＮａＣｌ濃度に相当する溶出系列の塩の存在下でイン キュベーションを行うことを特徴とする方法。 ２．化学剤として用いる洗浄剤が少なくとも１％、より好ましくは５％以上、 さらに好ましくは１０％以上含有されていることを特徴とする請求項１記載の方 法。 ３．溶出系列の塩として塩化ナトリウムを用いることを特徴とする請求項１又 は２記載の方法。 ４．インキュベーションを１０分から１０時間、好ましくは１時間〜５時間の 間行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５．血漿、血漿画分又は細胞培養物から得た材料を生物学的材料として用いる ことを特徴とする請求項1〜４のいずれかに記載の方法。 ６．血液因子、特にビタミンＫ依存性タンパクを含有する生物学的材料を用い ることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７．プロトロンビン複合体含有画分を含有する生物学的材料を用いることを特 徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．生物学的材料を固体担体に吸着させ、精製し、精製した材料を溶離した後 インキュベーションを行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方 法。 ９．溶離及びインキュベーションを同時に行うことを特徴とする請求項８に記 載の方法。 １０．固体担体として、特にイオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティ ークロマトグラフィーに適したクロマトグラフィー用材料を用いることを特徴と する請求項８又は９に記載の方法。 １１．さらに、材料を精製する工程、特にクロマトグラフィー精製する工程を も行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 １２．さらに、病原体を不活化又は枯渇化するための更なる工程、特にろ過又 は熱処理をも行うことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。 １３．化学剤としてTween及びTritonからなる群から選択される非イオン界面 活性剤を使用する請求項１から１２のいずれかに記載の方法。 １４．活性化血液因子及び非活性化血液因子の含有量に基づいて５０％以下、 好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以 下、さらに好ましくは１０％以下、最も好ましくは１％以下の部分が申己起動的 に活性化し得る血液因子と、ある洗浄剤含量を含有するクロマトグラフィー的に 精製された調製物。 １５．血液因子が、因子ＶＩＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩ及びプレカリクレインか らなる群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の調製物。 １６．活性化及び非活性化因子ＶＩＩの含有量に基づいて因子ＶＩＩａ活性が５ ０％以下、好ましくは１０％以下、最も好ましくは１％以下であるプロトロンビ ン複合体を含有することを特徴とする請求項１４又は１５記載の調製物。 １７．調製物がセリンプロテアーゼインヒビター及びその補因子を含有しないこ とを特徴とする請求項１４又は１５のいずれかに記載の調製物。 １８．請求項１〜１３のいずれかに記載の方法で得ることができる調製物。