MXPA99008941A - Preparacion del complejo de protrombina inmunotolerante - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una preparación de complejo de protrombina inmunotolerante, un procedimiento para producir esa preparación asícomo el uso de la preparación para producir un medicamento.

Description

PREPARACIÓN DEL COMPLEJO DE PROTROMBINA INMUNOTOLERANTE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una composición farmacéuti para el tratamiento de problemas de coagulación, en especial paciente de inhibidor del factor VIII . La invención se refie además a un procedimiento para la preparación de es composición asi como su uso. La coagulación de la sangre es provocada por u sección de reacciones de diferentes proteínas o enzimas . Por u carencia en factor de coagulación sanguínea se evita l formación de fibrina a partir de fibrinogeno y por lo tanto e cierre de las heridas; la consecuencia son hemorragia. Un cas tal se presenta en el caso de la hemofilia A. Esta es l enfermedad hemorrágica mas ampliamente extendida y es provoca por una carencia de factor VI11. Para el tratamiento substitución de la hemofilia A se utilizan preparados gu contienen el factor VIII. El tratamiento con esos preparado conduce en la mayoría de los casos a una rápida hemostasis. Sin embargo también existen pacientes en los gue n solo se presenta una falta de factor VIII, sino también ha desarrollado un inhibidor dirigido al factor VIII. Otro grupo d pacientes presenta inhibidores de factor VII, sin gue sufran d hemofilia A. Dependiendo de la cantidad presente de inhibidore de factor BII se inhibe el efecto del factor VIII administrad por medio de su neutralización.

REF.: 31317 Para el tratamiento de pacientes de inhibidor de factor VIII se ofrecen actualmente preparados a base de fracción de plasma, gue contiene una mezcla de factores de coagulación. La fracción plasmática puede contener por ejemplo los factores del complejo de protombina (factor II, VII, IX y X) . Una preparación gue promueve la coagulación sanguínea con actividad de desvío del inhibidor de factor VIII (FEIBA TI 4, firma IMMUNO AG) se obtiene por ejemplo de acuerdo con AT-B 0 368 883 por medio de un tratamiento del crioresiduo. Esa preparación contiene igualmente los factores de coagulación II, VII, IX y X. La acción de un preparado FEIBA debido a su composición compleja es múltiple. ariani et al. (Thrombosis Res. 31, 475-488 (1983)) menciona como principio de acción al factor VII en su forma activada. Se determinó gue después de la infusión de una preparación de FEIBA se encuentra un mayor contenido de factor Vlla en el plasma de hemofílicos . Igualmente Teitel (en Thrombosis and Haemostasis 66 (5) 559-664 (1991)), describe el papel del factor Vlla en concentrados de complejos de protrombina con una "actividad desviadora del factor VIII". Simultáneamente se presenta el principio de efecto, del factor Xa en ese tipo de preparados. Los concentrados de complejo de protrombina estudiados contenían factor Vlla, expresado como la proporciona entre la actividad de factor il al antígeno del factor VII de 2.1 y 2.5.

Las composiciones terapéuticas gue contienen protrombina preparadas de acuerdo con EP 0 044 343 Bl es adecuada para el tratamiento de inhibidores del factor de coagulación y contiene un complejo de protrombina activado, en el cual los factores están activados parcialmente. La proporción de factor Vlla es de 8-80 Unidades/ml. La concentración de factor IX se encuentra en el rango de 15 a 112 Unidades/ml. Correspondientemente el contenido de factor Vlla, en relación al factor IX, es 0.07-5.3 unidades de factor Vlla/Unidades de factor IX. Vinazzer (Thromb.Res. 26:21-29 (1982)) muestra la diferencia del preparado AUTOPLEX, gue se prepara de acuerdo con EP 0 044 343, y FEIBA. Como se muestra allí, se caracteriza AUTOPLEX por un mayor contenido de trombina (factor lia) , medido en unidades NIH, en comparación a FEIBA (ver tabla 1 página 24) . Pero también se proponen preparaciones de factor Vlla altamente purificadas para la terapia de estados de inhibición del factor de coagulación (por ejemplo en EP 0 082 182-Bl) y Hedner et al. (Haemostasis 19, 335-343 (1989)). Una ventaja de las preparaciones de factor Vlla es su carencia de factor VIII. El contenido de factor VIII en los preparados de complejo de protrombina o en preparados activados de complejo de protrombina como por ejemplo FEIBA en pacientes con inhibidores funcionales de factor VIII, tiene el efecto de que esos anticuerpos inhibidores se disparan por la administración del factor VIII, con lo cual el estado de hemofilia por el inhibidor hasta se empeora temporalmente. Se ha determinado ya gue para la hemostasis efectiva con las preparaciones de inhibidor de factor VIII factor de hemofilia Vlla en su efecto superan a los preparados de factores de complejo de protrombina (Turecek P. et. al., Thromboeis & Haemostasis, 1997, pág. 222) . Una tarea de la presente invención es por lo tanto el presentar una preparación, gue posea la efectividad o la eficiencia de los preparados de complejo de protrombina sin presentar las reacciones secundarias inmunológicas indeseadas de ese tipo de preparaciones . La tarea antes mencionada se resuelve al preparar de acuerdo con la invención una preparación farmacéutica de complejo de protrombina inmunotolerante gue contiene los factores II, IX, X y eventualmente VII con un contenido reducido de antígeno de factor VIII. El contenido de antígeno de factor VIII de la preparación de acuerdo con la invención preferentemente es menor a 10%, en especial menor al 5%. El contenido de factor VIII preferentemente es menor gue 0.1 antígeno de factor VIII :C/Unidad FEIBA. En una forma de realización especialmente preferida el contenido de antígeno de factor VIII es hasta menor a 0.03/unidad de FEIBA, mas preferentemente menor a 0.02/unidad FEIBA y lo mas preferido menor al limite determinable . El hallazgo de gue en especial en el caso de una posterior purificación de los factores de complejo de protrombina de plasma o una fracción plasmática, el contenido de factor VIII y eventualmente el contenido de fosfolipidos puede reducirse de tal forma, gue mientras tanto se mantiene constante la actividad de los factores de complejo de protrombina, debe considerarse sorprendente. En especial la preparación farmacéutica de acuerdo con la invención contiene cuando menos los factores iXa, Xa y Vlla y presenta una actividad FEIB reduce también el tiempo de coagulación de un plasma deficiente en factor VIII con un inhibidor funcional (ver por ejemplo AT-B 350 726) . Una preparación de acuerdo con la invención puede prepararse a partir de plasma o una fracción plasmática. La fracción plasmática puede prepararse a partir de plasma, en especial de origen humano, por medio de un tratamiento cromatsgráfico, precipitación o centrifugación, o puede utilizarse el residuo de la crioprecipitación. La fracción plasmática incluye factores dependientes de la vitamina K como factores del complejo de protrombina, pero también contiene preferentemente proteína S, C y/o Z. En una forma de realización especialmente preferida la preparación esta libre de fosfolipidos. Preferentemente el limite superior de los fosfolipidos obtenidos es de 0. inmol/unidad de FEIBA (sobre el calculo ver los ejemplos). Debido a esa carencia de fosfolipidos, puede reducirse o evitarse la formación de anticuerpos indeseados contra el factor VIII. De acuerdo con la presente solicitud se presenta también un procedimiento para producir esa preparación. Ese procedimiento abarca los siguientes pasos : a) obtención de plasma o una fracción plasmática gue contenga los factores II, IX, X y eventualmente VII, b) poner en contacto el plasma o la fracción plasmática con un material portador, eventualmente en la presencia de un detergente, de tal forma gue el factor VIII y eventualmente los fosfolipidos se separan de los factores II, IX, X y eventualmente VII, c) purificar el plasma o la fracción plasmática, y d) recuperar una fracción gue contenga los factores II, IX, X y eventualmente VII. En una variante preferida se realizan los pasos b y c o b, c y d en un solo paso de procedimiento. La fracción plasmática utilizada se trata preferentemente de una fracción plasmática con una pureza intermedia. Bajo una preparación con pureza intermedia debe entenderse una fracción plasmática de tal tipo gue es análoga a la definición de propiedad intermedia de preparados de factor VIII (ver para esto por ejemplo ood Clive (ed.), Factor VIII: Purity and prophylaxis, Royal Society of Medicine) .

Proteínas adicionales, gue no se separan por medio de una pureza cromatográfica, pueden estar presentes en un preparado con pureza intermedia. Como material de partida puede utilizarse también una preparación de factores de complejo de protrombina común y comercial, como por ejemplo FEIBA S-TIM 4, IMMUNO o complejo de protrombina activado. Como procedimiento de purificación correspondiente puede utilizarse los métodos conocidos en el estado de la técnica, preferentemente se realiza un tratamiento cromatográfico, precipitación o centrifugación. Como fracción plasmática también puede usarse el residuo de la crioprecipitación. El material portador es un material adecuado para la cromatografía la filtración y/o la nanofiltración. En el caso de filtración se trata en especial de filtración de afinidad o de membrana . Si se utiliza un material previamente purificado, por ejemplo un material previamente purificado por ejemplo por medio de un intercambiador de aniones, entonces puede realizarse bajo condiciones modificadas una readsorbción en otro material portador,preferentemente en el mismo material portador utilizado para la purificación previa. En una forma de realización preferida el material portador es un material portador especifico para el factor VIII, en especial una matriz adecuada para la cromatografía por afinidad. En especial se prefiere usar una matriz gue contenga v F. En un material portador de ese tipo se adsorbe preferentemente el factor VIII y eventualmente el fosfolipido, mientras gue no se adhieren los factores II, IX, X y eventualmente VII. El material portador puede ser también un material portador no especifico para el factor VIII, por ejemplo un intercambiador de iones débil, por ejemplo un intercambiador de iones DEAE, TMAE u otro suficientemente conocido por el estado de la técnica. Dependiendo de las condiciones seleccionadas se adsorbe el factor VIII y eventualmente fosfolipidos en el material portador, mientras gue los factores II, IX, X y eventualmente VII no se adhieren o viceversa. En otra forma de realización preferida el material portador presenta una mayor afinidad para el complejo de protrombina gue para el factor VIII. Asi por ejemplo se adsorben los factores II, IX, X y eventualmente VIII, mientras que el factor VIII y eventualmente los fosfolipidos son eluidos . El factor Vil puede ser inactivado de forma selectiva y entonces en esa forma inactiva por ejemplo ya no adherirse al material portador. Una inactivación de ese tipo del factor VIII puede obtenerse por ejemplo utilizando por ejemplo un ligante de guelato, por medio de degradación, por ejemplo por medio de proteasas de serina como trombina o una proteína C activada, por medio de ligado de modelos de afinidad, como anticuerpos o peptidos . Todas las variantes de procedimiento descritas pueden realizarse también en la presencia de un detergente, en especial un detergente no iónico. Preferentemente se utiliza como detergente un poliéter o un polisorbato, en especial Tween o Tritón. Si se usa detergente, entonces en una forma de realización preferida se retira o se elimina. En otra forma de realización preferida se prevé un paso para la inactivación de patógenos eventualmente presentes, en especial seleccionado del grupo de tratamiento térmico tratamiento con vapor, tratamiento con un solvente y/o tratamiento con un detergente . La preparación de acuerdo también puede obtenerse en general de acuerdo con uno de los procedimientos descritos antes . Es adecuada en especial para la preparación de un medicamento, gue es adecuado para el tratamiento de pacientes con inhibidor de factor VIII (=hemofílica A) , en especial para esos pacientes con una titulación de inhibidor mayor a l unidad Bethesda/ml de plasma, preferentemente mayor a 5 unidades Bethesda/ml plasma. Puede prepararse también por medio de la combinación de factores individuales II, IX y X altamente purificados asi como eventualmente VII . Ya gue el material biológico, es material gue también se origina de organismos o líquidos corporales o microorganismos, gue pueden estar contaminados con patógenos como por ejemplo moléculas infecciosas o microorganismos o virtud o pirógenos, se han desarrollado diferentes procedimientos para la inactivación o reducción de patógenos o pirógenos . Ese tipo de procedimientos incluyen tratamientos físicos y/o químicos, como por ejemplo diferentes métodos de filtrado (por ejemplo nano-, dia- o ultrafiltración), tratamiento térmico, tratamiento con ácido o lejía, tratamiento con detergente y/o solvente orgánico asi como tratamiento con luz UV o con luz láser. También diferentes combinaciones de esos procedimientos para la inactivación o reducción de patógenos han sido propuestas múltiples veces en el estado de la técnica. De la EP 0 197 554 se conoce por ejemplo un procedimiento para despirogenizar e inactivar virus en un producto biológico o farmacéutico, gue abarca el tratamiento con un agente inactivante viral y despirogenizante, como por ejemplo una substancia anifilica y/o un solvente en la fase sólida, en el cual el producto se encuentra adsorbido. Por medio de este procedimiento el agente inactivador viral o despirogenizante se separa de la fase sólida el producto adsorbido se lava y finalmente se eluye de la fase sólida.

Por la EP 0 131 740 se conoce el tratamiento de una composición gue contiene proteínas en una solución con solventes orgánicas como di- o trialguilfosfato, eventualmente en presencia de un detergente (tratamiento con solvente/ detergente) , pudiéndose obtener composiciones de proteína libres de virus gue contengan lípidos . Por la AT-PS 402151 se conoce un tratamiento térmico, en el cual a un preparado gue se encuentra en solución acuosa, antes de calentarlo se le agrega un tensoactivo en una concentración de cuando menos 1% en peso. Otro procedimiento para la reducción o supresión de actividades indeseadas en productos biológicos o farmacéuticos se conoce por la ep 0 083 999. Esta se basa en un contacto prolongado con una solución o suspensión de un anfifilo de efecto no desnaturalizante. El producto despirogenizado se trata con un intercambiador de iones para retirar el anfifilo. Una desventaja de muchos de esos procedimientos conocidos en el estado de la técnica es gue frecuentemente se presentan perdidas de actividad en las proteínas lábiles obtenidas en las composiciones a tratar, por ejemplo en las proteínas sanguíneas. En especial al realizar un paso de purificación cromatográfica se presenta una inactivación de las proteínas relativamente extensa. Una desintegración de las proteínas puede también conducir a la activación. Asi por ejemplo se conoce gue el factor VII en el caso de una purificación cromatográfica debido a fenómenos autocatalíticos, fácilmente se activa en factor Vlla indeseable porgue es muy lábil . Otra desventaja se encuentra en el alto gasto en tiempo y aparatos de muchos procedimientos, gue reducen fuertemente su practicabilidad y por lo tanto hacen gue su uso sea frecuentemente inadecuado técnicamente en gran medida. En el marco de la presente invención debe utilizarse asi un procedimiento cuidadoso para proteínas, en especial para proteínas sanguíneas lábiles, para la inactivación efectiva de patógenos en materiales biológicos, gue puede utilizarse a un nivel técnicamente superior y que sea de realización económica. En especial para el procedimiento para inactivar patógenos debe evitarse continuamente una desintegración y una posible activación de proteínas sensibles. En este procedimiento para inactivar patógenos, en especial de virus, en un material biológico este material se incuba con un agente químico, realizándose la incubación en presencia de una sal eluotrópica correspondiente a una concentración de NaCl de cuando menos 200 mmol/1, preferentemente cuando menos 300 mmol/1. La inactivación de patógenos en la solución frente al tratamiento de un adsorbente ofrece algunas ventajas. Asi por ejemplo es mas posible el practicar un procedimiento de ese tipo en un sistema homogéneo de una fase y también la validación del paso de inactivación. También parece que el mejor acceso a los patógenos en una fase relativamente homogénea aumenta l eficiencia del paso de procedimiento. El material biológico contiene preferentemente un proteína humana y es en especial plasma o una fracció plasmática o se origina de un cultivo celular. Preferentement el material biológico contiene un factor sanguíneo, como el factor XII, XI, VIII, V, el factor de von Willebrand o fibrinogeno, en especial una proteína derivada de vitamina como factor II, factor Vil, factor IX, factor X, proteína C, proteína S o proteína Z . Las proteínas pueden estar presentes como factores individuales, preferentemente en forma purificada, o en una mezcla compleja. En una forma de realización especialmente preferida, el material biológico contiene cuando menos un factor del complejo de protrombina y es especialmente una fracción que contiene complejo de protrombina o un material que contiene factor VII, se deriva por ejemplo después de la crioprecipitación del plasma del residuo correspondiente (crioresiduo) . La preparación de acuerdo con la invención es preferentemente una con actividad FEIB (Factor eight Inhibitor Byoassing Activity - actividad desviadora del inhibidor del factor ocho) , también una preparación que es adecuada para el tratamiento de pacientes con inhibidor de factor VIII.

El material originario de un cultivo celular es preferentemente un material que contiene factores sanguíneos preparados de forma recombinante, entre ellos factores de coagulación intrínsecos e intrínsecos, de fibrinólisis, de trombólisis o sus inhibidores, en especia factores sanguíneos dependientes de la vitamina K. Como células entran en consideración células comunes para la expresión de proteínas recombinantes, preferente células de mamíferos, como por ejemplo células Vero, CHO o BHK. Las proteínas correspondientes pueden someterse directamente a partir del extracto celular crudo al procedimiento de acuerdo con la invención para la inactivación de los patógenos eventualmente presentes, sin embargo puede tratarse también de una fracción celular previamente purificada. El agente guímico es por ejemplo un detergente (anfifilo, tensoactivo que preferentemente esta contenido en una cantidad de cuando menos 1%, mas preferentemente mas de 5%, lo mas preferentemente 10%; sin embargo pueden utilizarse otros agentes químicos de acuerdo con la invención, en especial aquellos de los cuales ya se sabe presentan un efecto virucida, bactericida o despirogenicida, o mezclas de los agentes guímicos mas diversos . La selección sin embargo esta limitada porgue la naturaleza del material biológico no debe ser perjudicado de manera esencial. Para un procedimiento económico se selecciona una substancia guímica gue contenga mas del 50% de actividad biológica del material, en relación a la actividad antes de la incubación, preferentemente cuando menos 70%, en especial mas del 85%. El termino contenido de actividad biológica significa gue las proteínas contenidas en el material biológico pueden ejercer su función inherente natural o diferentes funciones. Esa actividad biológica puede determinarse e indicarse dependiendo del tipo de la proteína por ejemplo por medio de un análisis de cromógeno estandarizado o por medio de la determinación de antígenos. Eventualmente el agente químico se retira después de la incubación. Por detergente debe entenderse en general una substancia sintética, orgánica, tensoactiva. Preferentemente en el procedimiento de acuerdo con al invención se utiliza un detergente no iónico. Los tensoactivos no iónicos como poliéter, en especial éter de alquilfenolpoliglicol, son entre otras cosas productos de la etoxilación de ácidos grasos, amidas de ácido grasos, aminas grasas, alcoholes grasos, amino-óxidos, esteres de ácidos grasos de polialcoholes y esteres de sacarosa. Un tensoactivo de ese tipo actúa sobre las proteínas de forma no desnaturalizante y preferentemente se selecciona del grupo de polisorbats y Tritón. Como polisorbato se utiliza por ejemplo Tween™. Cuando se utilizan detergentes como agentes guímicos entonces en una forma de realización preferida se utilizan sin la adición de otros agentes, en especial sin la adición de substancias orgánicas tóxicas o solventes como por ejemplo TNBP. Con esto se minimiza el riesgo de contaminación. El material biológico según el procedimiento de acuerdo con la invención se incuba con un agente guímico. Incubación significa la puesta en contacto del material biológico con una solución, suspensión o emulsión de un agente guímico para un patógeno o pirógeno eventualmente presente para la inactivación, durante un período de tiempo suficientemente largo a una temperatura determinada. La puesta en contacto puede realizarse simplemente al dejar reposar la mezcla durante un período de tiempo definido. La incubación se realiza de acuerdo con la presente invención en la presencia de una sal eluotrópica. Bajo el termino "sal eleutrópica" debe entenderse de aguí en adelante sal mezclada con un agente químico o sal en una composición compleja, con la propiedad de que libera y/o expulsa de las substancias adsorbidas, los adsorbentes sólidos o impregnados con liquido o también gelatinosos. Preferentemente se trata aquí en el caso de sales eluotrópicas de un agente de desorbción, como el que se utiliza en procedimientos cromatográficos . Las substancias adsorbidas entre otras cosas es suficientemente soluble en presencia de la sal eluotrópica esto es, preferentemente se seleccionan condiciones, que no provoquen la precipitación del material biológico. El tipo y la concentración de la sal o de la composición por lo general se selecciona de acuerdo con el adsorbente seleccionado. El efecto eluyente de una sal depende por ejemplo de la polaridad del solvente, aumenta por ejemplo en la secuencia etanol - acetona - metanol - agua. El adsorbente puede ser una fase sólida, en especial una matriz adecuada para la cromatografía por intercambio iónico. En la composición que contiene la sal eluotrópica pueden estar contenidos también otros aditivos, como por ejemplo otras sales. Preferentemente aquí la composición se trata de una composición acuosa con un valor de pH en el margen entre 6.0 y 8.0, preferentemente alrededor de 7.0. En una forma de realización preferida se utiliza cloruro de sodio como sal eluotrópica, pero también otras sales alcalinas o también alcalinotérreas, entre ellas CaCl2 . Como sales eluotrópicas pueden utilizarse también los llamados caotrópicos, como por ejemplo urea, rodanuro o guanidina. La concentración de la sal es cuando menos >200 mmol/1, preferentemente >300 mmol/1. El limite superior de la concentración utilizada depende en especial de la solubilidad de la sal en cuestión y para el caso de NaCl es por ejemplo de aproximadamente 2 mol/1. Substancias caotrópicas, como por ejemplo urea, pueden utilizarse hasta una concentración de 8 mol/1.

La incubación del material biológico con el agente guímico se realiza para la inactivación de los patógenos eventualmente presentes, durante un período de tiempo suficientemente largo, preferentemente durante un período de tiempo entre 10 minutos y 10 horas, lo mas preferido entre 1 y 5 horas . El período de tiempo requerido para el procedimiento de acuerdo con la invención puede determinarse en un estudio previo por medio de virus modelo como el VIH, los virus Sindbis, FSM.E o de hepatitis . También la selección de la temperatura influye sobre el período de tiempo a utilizar. En el procedimiento de acuerdo con la invención se incuba de la manera mas preferente a la temperatura ambiente, por ejemplo en un intervalo de temperatura entre 15 y 45°C, en especial entre 20 y 30°C. En el procedimiento de acuerdo con la invención el material biológico preferentemente se adsorbe en un portador sólido, se purifica y se realiza la incubación directamente después de la elusión del material purificado. La elusión y la incubación pueden realizarse consecutivamente, pero también simultáneamente. De acuerdo con otra forma de realización preferida se realiza la incubación de un material biológico después de una purificación cromatográfica, con lo cual el eluato fue procesado posteriormente, por ejemplo por medio de centrifugación , filtrado u otros métodos físicos.

El portador sólido en la forma mas preferida u material adecuado para la cromatografía, en especial un material adecuado para la cromatografía por intercambio iónico, cromatografía hidrófoba o cromatografía por afinidad. Po ejemplo se utilizan materiales como Sepharose®, Superdex, Sephadex®, Spherodex®, Toyoperarl® o materiales inorgánicos com hidroxilapatit . Como intercambiador de iones pueden utilizars materiales intercambiadores de aniones como por ejemplo DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose®, CL6B, DEAE-Sepharose®Fast Flow, QAE-Sephadex®, Q-Sepharose® Fast Flow, Q-Sepharose®High Performance, DEA-Tris-acrilo, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D (obtenible de la firma Sepracor) , DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Fractogel® EMD-TMAE u oro material fractogel . Como ejemplos de materiales de cromatografía hidrófobos deben mencionarse por ejemplo butil-Sepharose®™, octil-Sepharose®, fenil-Sepharose®, Fractogel®TSK-butilo, soporte de t-butil-HIC o TSK-gel butilo Toyoparl®. El material biológico puede directamente adsorberse de una mezcla compleja en un portador y purificarse , al paso de inactivación sin embargo pueden precederlo o seguirlo otros pasos para la purificación del material, prefiriéndose en el marco de la presente invención, otros pasos de purificación cromatográfica . Por medio del procedimiento de acuerdo con la invención se inactivan los patógenos. Bajo patógenos se entienden fragmentos de por ejemplo virus, en especial también el genoma aislado o sus fragmentos . Los patógenos pueden ser patógenos recubiertos en lípidos, como por ejemplo virus de hepatitis B o patógenos no envueltos en lípidos como por ejemplo el virus de hepatitis A. Los procedimientos de inactivación de virus son catalogados hoy en dia como efectivos cuando después del uso del procedimiento en una muestra de un material biológico que se mezclo con una alta dosis de un virus de prueba, por ejemplo el virus IH o el Sinbis como virus modelo, ninguno de los virus pudo demostrarse en la muestra y la concentración de virus se redujo asi por debajo de los limites determinables . La determinación y cuantificación de ácidos nucleicos puede realizarse por ejemplo por medio de un método PCT, como se describe en AT-PS 401 062 o por medio de titulación directa. Como medida de la inactivación se conoce el llamado factor de reducción, el cual se calcula después de una adición del virus de prueba del logaritmo decimal del cociente de la concentración inicial y final. A partir del lineamiento europeo EC III-8115/89-EN de la comisión de comunidades europeas se conoce el llamado factor de reducción total. Se calcula a partir de la suma de los factores de reducción de medidas de inactivación individuales subsecuentes . También se realiza preferentemente otro paso independiente para la inactivación o reducción de patógenos . Aquí entran en consideración todos los procedimientos conocidos en el estado de la técnica, para minimizar el riesgo de infección. En especial como paso adicional para la inactivación o reducción, se realiza un filtrado y/o un tratamiento térmico. Como filtrado se realiza preferentemente un nanofiltrado. Un tratamiento térmico preferido se realiza en el material biológico sólido, por ejemplo en un liofilizado con un contenido de agua controlado, por ejemplo un contenido de agua entre 5 y 8% y una temperatura entre 50 y 80°C, como se describe en EP-0 159 311. En una forma de realización preferida se prevé un tratamiento en 2 etapas con un detergente como agente químico. Asi se utiliza en una primera etapa un detergente en una cantidad de cuando menos 1%, preferentemente cuando menos 5%, lo mas preferentemente cuando menos 10% . En una segunda etapa se utiliza otro detergente en una cantidad de cuando menos 10%, preferentemente cuando menos 12%, lo mas preferentemente cuando menos 14%. El detergente utilizado puede ser el mismo en ambas etapas, pero también pueden utilizarse diferentes detergentes. Generalmente por medio de la combinación de pasos para la inactivación de virus se reduce o excluye ampliamente el riesgo de una infección viral después de la administración de la correspondiente preparación.

De acuerdo con la presente invención se prepara también una preparación purificada cromatográficamente, gue contiene un factor sanguíneo activable autodinámicamente con una fracción de factor sanguíneo activado menor al 50%, en relación al contenido de factor sanguíneo activado y no activado, preferentemente menor al 40%, mas preferentemente menor al 30%, todavía mas preferentemente menor al 20%, aun mas preferentemente menor al 10% y lo mas preferentemente menor al 1% y un contenido de detergente . En especial la preparación se trata de una preparación que contiene un complejo de protrombina con una actividad de factor Vlla menor al 50%, en relación al contenido de factor VII activado y no activado preferentemente menor al 10%, lo mas preferentemente menor al 1% . El contenido de detergente del preparado de acuerdo con la invención se encuentra en una cantidad farmacéuticamente aceptable, preferentemente entre 1% y el limite determinable del detergente. Bajo el termino factor sanguíneo activable autodinamicamente, de acuerdo con la presente invención debe entenderse un factor sanguíneo que es activable autocataliticamente por medio de contacto superficial o por medio de procesos, como por ejemplo procesos cromatográficos . En especial ese tipo de factor sanguíneo es uno seleccionado del grupo formado por factor VII, factor XII, factor XI y pre-calicreina.

En otra forma de realización preferida la preparación esta libre de inhibidores de proteasa de serina, como por ejemplo inhibidores de trombina o cofactores como por ejemplo heparina. En una forma de realización especial, se muestra la ausencia de ese tipo de substancia ya durante un proceso cromatográfico . Por lo tanto la presente invención se refiere también a las correspondientes preparaciones obtenibles por medio del procedimiento de acuerdo con la invención. En la preparación de acuerdo con la invención pueden estar contenidos también otros aditivos, por ejemplo substancias de efecto estabilizante como aminoácidos . Los siguientes ejemplos deben aclarar detalladamente la presente invención, sin limitarla a ellos. Ejemplo 1: Determinación del factor VIII La determinación del antígeno de factor VIII en FEIBA se realizó de acuerdo con el método de Moritz B. al. (Thromb. Haemost. 1997, suplemento:31) . En esta determinación por medio de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cadena ligera de la molécula como anticuerpo de captura y por medio de un anticuerpo monoclonal igualmente contra la cadena ligera de la molécula del factor VIII, pero contra otro epitope, como anticuerpo de detección, se demuestra selectivamente la presencia de factor VIII junto a otras proteínas plasmáticas en FEIBA.

Ejemplo 2: Determinación de fosfolipido Fosfato unido orgánicamente se extrae del polvo liofilizado de la fracción FEIBA por medio del método de Folch J. et al. (J.Biol.Chem. 1957, 226:497-509) por medio de una mezcla de solventes consistente de cloroformo, metanol en una proporción de 2 partes volumétricas de cloroformo a 1 parte volumétrica de metanol . El extracto obtenido que contiene toda la fracción de fosfolipidos se condujo posteriormente en recipientes de teflon y el solvente orgánico se evapora bajo una corriente de nitrógeno. Después de la adición de un amortiguador (20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) y reactivo Oxisolv (firma Merck) se cerraron los recipientes de teflon herméticamente y se digirieron durante 5 horas a 160°. El fosfato liberado por medio del procedimiento de digestión se determinó cuantitativamente por medio de fotometría como complejo de molibdato de acuerdo con el método de Ames B.N. (Methods un Enzymlogy 1966, 8:115-118). Ejemplo 3: Preparación de un portador de afinidad ligante a un factor VII Un clon celular CHO que produce el factor de von Willebrand recombinante se prepara como se describe en FEBS.Lett. 1994; 351:345-348. Por medio de la transfección con un vector codificante el cADN de furina humana (van den Ouweland et al.; Nucleic Acids Res. 1990; 18:664) se llevó la familia celular a la co-expresión de furina humana. Ese tipo de clones celulares estables se fermentan en gran medida en reactores de perfusión sobre microportadores (Blüml et al., en. Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology, Oxford, Londres: Butterworth-Heinemann 1994:267-269). La purificación se realizó por medio de un procedimiento cromatográfico de 2 etapas de acuerdo con Thromb.Haemost. 1995; 73:1160. Se obtuvo la fracción desorbida por medio de la elusión con sal común y se cambio de amortiguador por medio de filtración en gel sobre Sephadex G25 (Firma Pharmacia) en un amortiguador que contenía 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5. A continuación la preparación por medio de ultraconcentración sobre una membrana Amicon YM30 (corte: 30.000 D) se concentró a una concentración de proteínas de 3 mg/ml . La concentración de factor de von Willebrand en esta preparación consistió de 60 Unidades antígeno vWF/mg de proteína . La preparación del factor de von Willebrand recombinante se diluyó hasta 1.5 mg/ml con un amortiguador que contenía 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5. Un gel previamente activado adecuado para la cromatografía por afinidad (Actigel, ALD-Superflow, Firma Sterofene) , se pre-lavó excesivamente con un amortiguador que contenía 20 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5. Una parte en volumen del gel previamente lavado se mezcló con 1.1 partes volumétricas de la solución de proteínas a inmovilizar y a continuación se agregaron 0.15 partes volumétricas de una solución de 0.1 M cianborohidruro (NaCNBH3) en 0.1 M de amortiguador de fosfato, pH 7.0. El gel se suspendió en el amortiguador por medio de agitación y por medio de agitación posterior se incubó durante 16 horas a la temperatura ambiente. A continuación el gel se lavó en un embudo de sinterización con 10 veces el volumen de una amortiguador gue contiene 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, y se lavó con 5 veces el volumen de un amortiguador, que contiene 20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7.5. Entonces se equilibró otra vez con 5 partes volumétricas del amortiguador 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCL, pH 7.5 y el gel se transfirió a una columna cromatográfica con un diámetro dimensional a la altura del lecho de gel de 1:4. Por medio de la determinación de la concentración de proteína en las soluciones separadas del embudo de sinterización del residuo de incubación de la solución del factor de von Willebrand y el gel de afinidad asi como de las soluciones de lavado pudo determinarse una tasa de acoplamiento mayor al 90% de la proteína utilizada. Ejemplo 4: Preparación de complejo de protrombina libre de factor VIII por medio del contacto con un gel de afinidad {en este momento considerado por la solicitante como la mejor manera de realizar la invención) : El preparado farmacéutico FEIBA S-TIM4 IMMUNO (1000 unidades) se reconstituyó con 2 mi de agua destilada. Después de la completa disolución del polvo seco por congelación, la solución presentaba una concentración de substancia activa de 5 unidades por mi . 10 ral de esa solución se pusieron en contact con 100 mg del factor de von Willebrand inmovilizado como s describió previamente y se incubó durante 1 hora a l temperatura ambiente bajo ligera agitación. A continuación e inmovilizadose retiró por medio de filtrado a través de u embudo de sinterización. La solución de FEIBA obtenido en el filtrado presentó una actividad de 49 unidades FEIBA/ml . Po medio del ligado del factor VIII contenido en el preparado e factor de von Willebrand inmovilizado, el antigeno de facto VIII en esta preparación se encontró por debajo del limite determinable . Ejemplo 5: Preparación de complejo de protrombina activado libr de factor VIII por medio de la readsorbción en un portado inespecífico 15 mg de DEAE-Sephadex®A-50, Firma Pharmacia, se incubaron a la temperatura ambiente con 1 mi de una solución de 30 g/1 NaCl en agua para su hinchamiento. Después el gel se separa del residuo superior por medio de centrifugación. A continuación se realización cinco lavados del el con sendos i mi de amortiguador (9 g/1 Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl, pH 7.0) y otros dos lavados con un amortiguador (7 g/1 citrato de Na3..2H,,0 7 g/1 NaCl) igualmente por medio de resuspensión y centrifugación. 30 mi de plasma citrato humano recién congelado se descongeló a 0-+4°C y el crioprecipitado se separó por medio de centrifugación a +2°C. El "crioresiduo" resultante se incubó con el DEAE-Sephadex® lavado, con lo cual se generó FEIBA y junto con los factores del complejo de protrombina , el factor VIII y una proteína inerte se adsorbió en el gel. Después la proteína inerte coadsorbida se separó del gel de DEAE por medio de lavado con un amortiguador (9 g/1 Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl) . El complejo de gel-proteína humedecido con amortiguador se suspendió ahora con 1.5 mi de una solución de 150 mg/ml TWEEN®-80 y 30 mg/ml NaCl 1 hora a 26°C. Por medio del tratamiento con la solución de mayor fuerza iónica se desorbieron la proteína junto con los factores del complejo de protrombina el factor VIII. A continuación se diluyó la suspensión por medio de la adición de 6.5 mi de agua y se readsorvio durante 1 hora a la temperatura ambiente, volviéndose a readsorber la fracción de complejo de protrombina. Simultáneamente solo se readsorbio en el gel una parte reducida del factor VIII contenido en la fracción de proteína. El complejo gel/proteína se lavó cinco veces con sendos 1 mi de una solución de 7 g/1 NaCl en agua libre de detergentes. Para la elusión se trató el gel con 0.7 mi de una solución de 30 g/1 NaCl en agua bajo agitación. El eluato se dializo frente agua destilada, se congeló y liofilizo. Después de la reconstitución del liofilizado se determinó la actividad FEIB de acuerdo con AT 350 726. Además se determinó el contenido de antígeno de factor VIII. Como control sirvió un preparado de FEIBA preparado de forma convencional, como el que se describe en AT 350 726. La preparación obtenida de acuerdo con el procedimiento descrito presentó un contenido de factor VIII reducido en un factor de 10 en comparación con el control . Por medio del contacto con el detergente se inactivaron también los patógenos eventualmente presentes, en especial los virus envueltos en lípidos. Ejemplo 6: Preparación del complejo de protrombina activado libre de factor VIII y libre de fosfolipidos por medio de readsorbción en un portador inespecífico. 15 mg de DEAE-Sephadex® -50, firma Pharmacia, se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente con 1 mi de una solución de 30 g/1 NaCl en agua hasta que se hincho. Después se separó el gel por medio de centrifugación del residuo de hinchado. A continuación se realizaron 5 lavados del gel con sendos 1 mi de amortiguador (9 g/1 Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl, pH 7.0) y otros dos lavados con un amortiguador (7 g/1 citrato Na3.2H20, 7 g/1 NaCl) igualmente por medio de resuspensión y centrifugación. 30 mi de plasma citrato humano recién congelado se descongeló a 0-+4°C y el crioprecipitado se separó por medio de centrifugación a +2°C. El "crioresiduo" resultante se incubó con el DEAE-Sephadex® lavado, con lo cual se generó FEIBA y junto con los factores del complejo de protrombina , el factor VIII, fosfolipids y una proteína inerte se adsorbió en el gel. Después la proteína inerte coadsorbida se separó del gel de DEAE por medio de lavado con un amortiguador (9 g/1 Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl) . El complejo gel-proteína humedecido con amortiguador se suspensión ahora en 1.5 mi de una solución de 1 mg/ml TWEEN®-80 y 30 mg/ml de NaCl durante 1 hora a la temperatura ambiente, en donde la fracción de proteína y las impurezas inespecificamente adsorbidas fueron desorbidas . A continuación se separó el gel por medio de filtrado. La solución de proteína, por medio de la posterior adición de TWEEN®-80 se llevó a una concentración de detergente de 150 mg/ml y a continuación se incubó durante l hora a 40°c con agitación. A continuación se diluyó por medio de la adición de 6.5 mi de agua y se readsorbió en un gel DEAE-Sephadex® A-50 previamente preparado y recién lavado, en donde nuevamente se readsorbió la fracción de complejo de protrombina. Simultáneamente se ligó al gel una pequeña parte del factor VIII contenido en la fracción de proteína. A continuación por medio de cinco lavados con sendos 1 mi de una solución de 7 g/1 NaCl en agua se eliminó el detergente. Aquí también se eliminó el fosfolipido presente, que se encontraba solubilizado por medio del contacto con el anfifilo. Para la elusión se trató el gel con 0.7 mi de una solución de 30 g/1 NaCl en agua bajo agitación. El eluato se dializó frente agua destilada, se congeló y liofilizo. Despué de la reconstitución del liofilizado se determinó la activida FEIB de acuerdo con AT 350 726. Además se determinó el contenido de antígeno de facto VIII y de fosfolipido. Como control sirvió un preparado de FEIB preparado de forma convencional, obtenido de la forma que s describe en AT 350 726. La preparación obtenida de acuerdo co el procedimiento descrito presentó un contenido de factor VII menor en comparación con el control y estaba libre d fosfolipidos . Los resultados de análisis se resumen en la tabl i. Tabla 1 FEIBA: CONTENIDO DE FVIII/FOSFOLIPIDOS

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES l.- Preparación farmacéutica inmunotolerante de complejo de protrombina que contiene los factores II, IX, X y eventualmente VII, caracterizada porque presenta un contenido de antígeno de factor VIII menor a 0.1 factor VIII :antígeno C/Unidad FEIBA.
2. 2. - Preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se prepara a partir de plasma o de una fracción plasmática.
3. 3. - Preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación l o 2, caracterizado porque la preparación contiene cuando menos uno de los factores IXa, Xa y Vlla y presenta actividad FEIB.
4. 4.- Preparación farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 3, caracterizada porgue esta libre de fosfolipidos .
5. 5. - Procedimiento para producir una preparación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque consiste de los siguientes pasos: a) obtención de plasma o una fracción plasmática que contenga los factores II, IX, X y eventualmente VII, b) poner en contacto el plasma o la fracción plasmática con un material portador, eventualmente en la presencia de un detergente, de tal forma gue el factor VIII y eventualmente los fosfolipidos se separan de los factores II, IX, X y eventualmente VII, c) purificar el plasma o la fracción plasmática, y d) recuperar una fracción que contenga los factores II, IX, X y eventualmente VII.
6. 6.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque los pasos b y c se realizan como un solo paso de procedimiento .
7. 7.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque el material portador es un material adecuado para cromatografía, filtración y/o nanofiltración.
8. 8. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porgue el material portador es un material portador especifico para factor VIII, en especial una matriz adecuada para cromatografía de afinidad.
9. 9. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 , caracterizado porgue la matriz es una matriz gue contiene vWF.
10. 10. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porgue el factor VIII y eventualmente los fosfolipidos son adsorbidos en el material portador.
11. 11. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porgue el material portador presenta una mayor afinidad para el complejo de protrombina gue para el factor VIII y en especial es un intercambiador de aniones mas débil .
12. 12.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porgue los factores II, IX, X y eventualmente VII son adsorbidos mientras gue el factor VIII y los eventuales fosfolipidos son eluidos .
13. 13.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porgue los factores II, IX y X y eventualmente VII no están ligados al material portador.
14. 14. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 13 , caracterizado porgue el detergente es un detergente no iónico, en especial un poliéter.
15. 15. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 14, caracterizado porque el detergente se elimina después del contacto con el plasma o la fracción plasmática.
16. 16. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 15, caracterizado porque la fracción plasmática se prepara por medio de cromatografía, precipitación o centrifugación, o es el residuo de crioprecipitación.
17. 17. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 15, caracterizado porque la fracción plasmática presenta cuando menos una pureza intermedia.
18. 18.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 17, caracterizado porque se realiza cuando menos un paso para la inactivación o reducción de virus o partes constitutivas de virus, en especial seleccionado del grupo de tratamiento térmico, tratamiento con vapor, tratamiento con un solvente y/o tratamiento con un detergente y nanofiltración.
19. 19. - Preparación de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque puede obtenerse con un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5.
20. 20.- Uso de una preparación de acuerdo con la reivindicación l para la preparación de un medicamento para el tratamiento de pacientes con inhibidor de factor VIII (=hemofilia A) , en especial de aquellos pacientes con una concentración de inhibidor mayor a 1 unidad Bethesda /mi plasma, preferentemente mayor a 5 unidades Bethesda/ml plasma.