JP2001518191A - 無担体偏向電気泳動法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は無担体偏向電気泳動法に関するものであり、担体として使用される分離媒体および検査する試料は入口端から出口端まで分離チャンバ(１)を通り流れ、電極により発生させる電界により試料を画留に物理的に分離し、収集する。前記方法は、電極に電圧を印加していない状態で電極間の分離チャンバへ試料を導入し、試料が分離領域に導入された後電極に電圧を印加し、電極間の分離領域に試料全体が実質的に存在している間のみ電気泳動分離を行うことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 無担体偏向電気泳動法 本発明は、無担体偏向電気泳動に関するものである。 従来、無担体偏向電気泳動は連続方法においてのみ使用されていた。分離する 物質のバンド幅への層流プロファイルのマイナス影響を最小化できる場合、また は、マイナス影響が全く作用しない場合、実際この方法は、連続操作において特 に優れた結果をもたらす。これは、特に、連続等電点電気泳動法に当てはまる。 偏向電気泳動の全ての電気移動法において、分離媒体(単数または複数)の層流 プロファイルによって生じるバンド拡幅は、分離能の深刻な低下を引き起こす。 連続方法における無担体偏向電気泳動の基本については既に３０年以上前に文 献において説明されており、マックス−プランク社(Max-Planck Company)の１９ ６８年年鑑、１１７〜１３７頁の説明が挙げられる。この方法はまた、ＦＦＥ( 自由流電気泳動(free flow electrophoresis))またはＣＦＥ(連続流電気泳動(co ntinuous flow electrophoresis))といった用語の下でも説明されている。(ケイ ．ハニッヒ(K．Hannig)：無担体連続電気泳動およびその応用(Carrier-free con tinuous electrophoresis and its application)アナル．ケミ．(Anal．Chem.)1 81、233(1961)；エム．シー．ローマン(M．C．Roman)およびピー．アール．ブラ ウン(P．R．Brown)；アナル．ケミ．(Anal．Chem.)自由流電気泳動(Free Flow E lectrophoresis)、66(N2)、86〜94、(1994)；アール．ブラウン(R．Braun)、エ イチ．ヴァーグナー(H．Wagner)およびジー．ヴェーバー(G．Weber)：調製用自 由流電気泳動−強力な天然物質分離法(Preparative Free Flow Electrophoresis −a powerful procedure for separating natural substances)、ゲーイーテー ファッハツァイトシュリフト フューア ダス ラボラトリウム(GIT Fachzeits ch rift fuer das Laboratorium)39(1995)、317〜322)。 ＦＦＥ分離方法は、生物性粒子(bioparticles)に至るまであらゆる分子量のイ オンを分離するために使用される。ここでは、分離する試料がそれ自体帯電して いるかどうか、または、その帯電がイオンの付加または吸着によって生じたもの であるかどうかは関係ない。 この方法は、調製用および分析用分離のいずれにも使用される。 本出願人は、連続偏向電気泳動法(ドイツ特許出願第4139472号明細書(未公開) )の本質的態様を向上させた これら向上の度合いは、以下のように様々なＦＦＥ分離手法において異なって いた。 全てのＦＦＥ分離手法において、分離の長期安定性は明らかに向上した。 分離能は、連続等電点電気泳動法に関しては１０〜５０倍に向上し、一方、電 気移動法においては２〜４倍向上しただけであった。そして、この向上は、前記 特許明細書において説明されているような向流を用いた新規の「デッドボリュー ムの無い(dead volume-free)」分別によってもっぱら達成された。電気移動法の 分離能への層流プロファイルのマイナス影響は、前記向上によって影響を受けな かった。 以下、「典型的」電気移動法、つまりゾーン電気泳動法に基づいて、連続偏向 電気泳動法を説明する。 図１は、分離チャンバ１の概略図を示している。前記分離チャンバ１の下端に は、少なくとも三つの導入口２、３、４があり、これらは、三つのラインによっ て多チャンネルポンプ５の運搬経路と接続されている。分離媒体は、中央導入口 ３を介して分離スペースに導入され、一方、安定化媒体は、二つの外側導入口２ および４を介して導入される。 これらの媒体は、層流状態で前記分離スペースを通り流れる。前記分離チャン バの側端部に平行に電極６、７が位置しており、これらは、高流量の付属ポンプ による循環流で洗浄される。膜８、９は電流を伝導するもので、分離スペースか ら電極スペースを分割し、流体流による媒体どうしのあらゆる交換を防ぐ。 ここで、流動している分離媒体に、独立測定ポンプ１０を用いて最適な計量比 で試料混合物を導入した場合、この試料は微噴流として分離媒体と共に運搬され る。 電極に高圧を印加した場合、媒体および試料中の全ての帯電成分は本来の方向 からそれ、これらイオン成分が有する電荷数が増加するにつれてこの偏向(それ) が増大する。 従って、様々な電荷の成分は、分離スペースを通って分離路(図１参照)に添っ て移動し、異なった位置で流れの方向に対して横切るように配置された一列に並 んだホース穴１１に達する。その後、前記成分は媒体と共に別々の貯溜容器１２ に送られる。穴どうしの間隔を可能な限り狭くしたこの一連のホース穴は、分別 装置と呼ばれ、平行に配置されたこれらのホースの数は、３０から最高で１６０ までの範囲内である。 付加媒体(向流媒体)は、分離チャンバの上端から入口１３を介して分離媒体と 反対方向に流れ、分別装置のホース穴を介して分離スペースを出る。 上記説明に従って考案された装置による分離では、連続偏向電気泳動の全ての 分離手法において分離プロファイルに関し顕著な長期安定性を示す。しかし、そ の分離の質(分離度)は、連続等電点電気泳動の場合においてのみ類似の分析分離 手法において達成されるレベルに匹敵し得る。 分離能は、全ての連続電気移動法において、類似の分析分離手法と比較してさ さやかなものである。 多数の出版物に、連続偏向電気泳動における分離中の分析物のいわゆるバンド 拡幅の一因となる自然科学上又は電気化学上の影響について記載されている(ジ ェイ．エイ．ジアンノヴァリオ(J.A．Giannovario)、アール．グリフィン(R．Gr iffin)、イー．エル．グレイ(E.L．Gray)：自由流電気泳動の数理モデル(A math ematical model of free-flow electrophoresis)。ジャーナル オブ クロマトグ ラフィー(Journal of Chromatography)、153、329〜352(1978)；エフ．ジー．ベ ーゼ(F.G．Boese)：自由流電気泳動の数学的論理への貢献(Contribution to a m athematical theory of free flow electrophoresis)、ジェイ．クロマト．(J.C hromat.)483、145〜170(1988)；ケイ．ハニッヒ(K．Hannig)およびエイチ．ジー ．ハイドリッヒ(H.G．Heidrich)：自由流電気泳動(Free-Flow Electrophoresis) 、1990 GIT出版社ダルムシュタット国際標準図書番号(ISBN)3-921956-88-9)。 これらの効果のうち最も重要なものは： 層流プロファイルによる拡幅、 熱対流による拡幅、 電気浸透による拡幅、 界面動電効果による拡幅がある。 ここまで説明した全ての界面動電効果のマイナス影響は、十分に高いイオン強 度を有する適切なイオン成分を含む分離媒体を用いると同時に、試料の濃度を過 度に高めないことにより最小にできるかまたは排除できる。 電気浸透のマイナス影響を最小にするためには多くの方法があり、例えば、適 切な壁材(グラスまたは石英ではなくプラスチック)を選択すること、または、最 も好ましくは、電気浸透を防止する分離媒体に界面活性化学薬品を添加すること があげられる。この方法は、文献中、「動的被覆(dynamic coating)」と呼ばれ ている。 熱対流のマイナス影響は、分離チャンバを鉛直ではなく水平に配置することに より非常に簡単に減少させることができる。 層流プロファイルのマイナス影響は、分離チャンバギャップの中央において最 高線速度で運搬される分析物の集中も可能にする十分に長い分離時間を選択する 限り、連続等電点電気泳動では見られない。 これに対して、そのマイナス影響は、電気移動法の場合には非常に重要である 。分離チャンバの壁近傍または壁との境界面を移動する分析物は、分離チャンバ ギャップの中央の分析物よりもかなり長い時間をかけて分離チャンバを通過し( 図２．１および２．２参照)、従って明らかにより高度に偏向される。この影響 により、電気移動の方向にテーリングとして検出可能なバンド拡幅が生じる。図 ３．１は、互いに反対電荷を有する２低分子分析物に対するこの影響のバンド拡 幅を示し、一方図３．２は高分子粒子に対するものを示している。 無担体電気泳動の周辺条件のもと連続的に実施する電気移動法において、層流 プロファイルのマイナス影響は、低分子分析物に関しては防ぐ事はできない。分 析物の移動距離が増加するにつれて、バンド拡幅の絶対値が上がる。粘性を高め た分離媒体を使用することにより拡散を減少させても役に立たない。というのも 、これにより層流プロファイルは更に不都合なものとなるからである(図２．２) 。 生物性粒子を分離する場合、分離チャンバギャップの中央に供給する試料を量 的に減少させると、分離度を向上させることができる。なぜならば、極めて低い 拡散性により、粒子が１０分未満の滞留時間内に分離チャンバ壁の領域に入るこ とができないからである(図３．２も参照)。層流プロファイルの影響は、試料処 理量を明らかに減少させる(０．３〜０．０５倍)ことによるこの方法においての み最小化することができる。 本発明の目的は、層流プロファイルの影響を排除する無担体偏向電気泳動法を 提供する事である。 前記目的は、請求項１に記載の特性を備えた方法により本発明に従って達成さ れる。本発明の有益な実施形態は、従属クレームの主題となっている。 本発明に係る間隔操作における方法は、電界を印加していない状態で試料を分 離スペースに導入し、その後、試料の全部分が依然電界中に残留している間のみ 電気泳動分離を行うものである。この方法は、分離チャンバ壁の領域における低 流量の層流プロファイルが電界中の試料の異なった部分の滞留時間を変化させる ことにより分離度を低下させるといった連続方法の短所を克服する。 流れの方向における電極の長さを制限すると同時に、十分多量の試料を確保す るため、試料および担体媒体が静止した状態、または少なくとも試料を導入する 際の流量と比較してかなり低下させた、出口に向かった分離スペース中の試料の ゆっくりとした流れと同等の流量で、電気泳動分離を行うことが好ましい。 知られている方法では、試料を分離媒体または担体媒体と共に連続的に添加し 、電界を連続的に印加した状態で、電気泳動分離を連続的に行う。本発明では、 かわりに、少なくとも試料は電界を印加していない状態で断続的に導入し、好ま しくは、試料が分離媒体と共に静止した状態で、または試料が分離媒体と共にゆ っくりと流れている状態で、分離スペース中に依然として試料の全部分が残留し ている間のみ電気泳動分離を行う。このようにして、試料の異なった部分の様々 な流量が電気泳動の結果に影響することを防ぐことによって、分離度を向上させ る。 以下、本発明の一実施形態を添付の図面に基づいて説明する。 図１は、偏向電気泳動を実施するための周知となっている装置、 図２．１は、比較的低粘性の媒体に関する層流プロファイルであり、分離チャ ンバギャップが、流れ方向を包含した断面図に示されており、 図２．２は、粘性を高めた媒体に関する層流プロファイルであり、分離チャン バギャップが、流れ方向を包含した断面図に示されており、 図３．１は、高拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物の分離によるバ ンド拡幅であり、分離チャンバギャップが、流れ方向に対して垂直な断面図に示 されており、 図３．２は、低拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物の分離によるバ ンド拡幅であり、分離チャンバギャップが、流れ方向に対して垂直な断面図に示 されており、 図３．３は、本発明に従って実施したＦＦＥ分離工程中の、高拡散率のアニオ ンおよびカチオン分析物の分離によるバンド拡幅であり、分離チャンバギャップ が、流れ方向に対して垂直な断面図に示されており、 図４．１、４．２および４．３は、図１に示した装置における本発明に係る方 法の一実施形態に関する時間的進行を示しており、その中で、 図４．１は、電界をゼロに設定した状態での媒体および試料を導入した初期段 階、 図４．２は、電界を印加し、媒体および試料が運搬されていない後続段階、そ して 図４．３は、電界を印加していない状態での媒体導入および試料除去の後続段 階であり、および 図５は、本発明に係る方法(上)と連続方法(下)とにおける分離された分析物に 関する分布パターンの比較を示している。 図４．１〜図４．３は、図１に示したものと同一の分離チャンバ１を同様に概 略形態で示している。図１に示しされている同一部は、同一参照記号で示してい る。 図４．１に示している初期段階では、分離媒体が中央導入口３を介して分離ス ペースに導入され、一方、安定化媒体が二つの外側入口２および４を介して分離 スペースに導入される。同時に、向流媒体が入口１３を介して流入する。試料は 、入口２０を介して導入される。電極６および７(ダッシュ線で表された電極で 示されている)間に電圧は印加されていない。 その後試料は、電極(入口２０を介して走っている矢印の先から端を発してい る鉛直線で示されている)に対し本質的に平行に広がる。 図４．２に示している次の段階では、電極６および７に電圧を印加することに より、電界(図面中、水平電界方向)が分離チャンバ内に形成される。媒体および 試料の運搬が中断され、試料の成分が、図面中水平方向に空間的に分離される( 図４．２において、二つの鉛直方向の平行な実線で示されている)。 図４．３に示した最終段階では、再び電界を印加せず、入口２、３、４および １３を介して媒体を再度導入するが、試料は導入しない。このようにして、電気 泳動により空間的に分離した試料成分を、ホース穴１１を介して運び去る。 最初の段階で電極６および７間に導入された試料が、電気泳動分離の後続段階 の間にその全部分を備え電界中に残留することが確実である限り、試料は、電気 泳動分離中、静止したままである代わりに、ゆっくりと流れていてもよく、また 、適正な寸法の電極を用いた場合には、導入された時と同じ速さで流れてもよい 。 本発明に係る間隔操作における方法を実施することにより、周知の連続方法と 比較して分離度において明らかな向上がもたらされる。 これは、一旦連続自由流電気泳動を行い、その後本発明による断続的自由流ゾ ーン電気泳動により、電気的に帯電した染料の混合物を分離することにより説明 できる。 図５は、本発明に係る方法、および周知となっている連続方法による各収集容 器(マイクロタイタープレートの窪み(microtiter plate cavity))内の分離され た分析物の分布パターンの比較を示す。本発明に係る間隔操作の場合(図面上部 の結果)、分離の質は全分析物に関して同等に優れており、連続方法の比較テス ト(図面下部の結果)よりはるかに優れている。 同一装置を使用し、比較可能な電気泳動条件下(同一分離媒体、類似電気泳動 移動経路、類似電気泳動性能)で比較を行った。 間隔操作では、連続操作において可能なレベルの分離の質を得るために、かな り短い分離時間で十分であるため、間隔操作においてもより多くの処理量が得ら れる。 連続操作に対して間隔操作において分離度が向上した理由は、流れの方向に対 して垂直であり、且つ、電界方向に対して平行である分離チャンバを通る断面を 示す図３．１〜３．３から明らかである。 図３．１および３．２は、高拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物、 または低拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物に関する連続操作におけ るバンド拡幅を示している。図３．３は、静止媒体(standing media)の場合の高 拡散率を有するアニオンおよびカチオン分析物に関するバンド拡幅を示している 。 連続操作において、バンド拡幅は、層流断面により生じ(図２．１と比較)、電 界中での分析物の滞留時間が長くなり、従って、分離チャンバ壁の領域において 横への移動がより強くなる。これにより、拡散によるバンド拡幅に重ね合わされ る付加的な鎌状バンド拡幅が生じる。 間隔操作において、電界が静止分析物に作用する場合、バンド拡幅はもっぱら 拡散により生じ、従って連続操作の場合より少ない。バンド拡幅がより少なけれ ば、より高い分離度が結果として得られる。従って、連続操作より間隔操作にお いて分離度はより優れている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年３月３０日（１９９９．３．３０） 【補正内容】 請求の範囲 １．担体としての分離媒体および分析する試料が入口端から出口端まで分離チャ ンバ(１)を通過して流れ、前記試料は、電極(６、７)により発生させる電界によ り空間的に画分に分離され収集される無担体偏向電気泳動法であって、前記試料 を、前記電極(６、７)に電圧を印加していない状態で前記電極(６、７)間にある 分離スペースに導入し、前記試料を前記分離スペースに導入した後前記電極(６ 、７)に電圧を印加し、前記試料の導入中の流量に対して、前記入口端から出口 端までの前記電極(６、７)間のゆっくりとした流れまで低下させた分離媒体およ び試料の流量で電気泳動分離を実施し、且つ、前記電極(６、７)間の分離スペー スに、実質的に試料全体が依然存在している間のみ電気泳動分離を実施すること を特徴とする無担体偏向電気泳動法。 ２．担体としての分離媒体および分析する試料が入口端から出口端まで分離チャ ンバ(１)を通過して流れ、前記試料は、電極(６、７)により発生させる電界によ り空間的に画分に分離され収集される無担体偏向電気泳動法であって、前記試料 を、前記電極(６、７)に電圧を印加していない状態で前記電極(６、７)間にある 分離スペースに導入し、前記試料を前記分離スペースに導入した後前記電極(６ 、７)に電圧を印加し、且つ、前記試料が前記分離媒体とともに静止している状 態で前記電気泳動分離を実施することを特徴とする無担体偏向電気泳動法。 ３．試料の成分または標識物質が、前記分離チャンバ(１)内の一定空間位置に達 したことを外部検出器が確認したらすぐに前記電気泳動分離法を終了することを 特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。 ４．分離された試料の成分が、電界を印加していない状態で、高流量で分別装置 を介して分離された試料用容器に運搬されることを特徴とする前記請求項のいず れかに記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．担体としての分離媒体および分析する試料が入口端から出口端まで分離チャ ンバ(１)を通り流れ、前記試料は、電極(６、７)により発生させる電界により空 間的に画分に分離され収集される無担体偏向電気泳動法であって、前記試料を、 前記電極(６、７)に電圧を印加していない状態で前記電極(６、７)間にある分離 スペースに導入し、前記試料を前記分離スペースに導入した後前記電極(６、７) に電圧を印加し、前記電極(６、７)間の分離スペースに、実質的に試料全体が依 然存在している間のみ電気泳動分離を実施することを特徴とする無担体偏向電気 泳動法。 ２．前記試料が前記分離媒体とともに静止している状態で前記電気泳動分離を実 施することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．前記試料の導入中の流量に対して、前記入口端から出口端までの前記電極( ６、７)間のゆっくりとした流れまで低下させた分離媒体および試料の流量で電 気泳動分離を実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．試料の成分または標識物質が、前記分離チャンバ(１)内の一定空間位置に達 したことを外部検出器が確認したらすぐに前記電気泳動分離法を終了することを 特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。 ５．分離された試料の成分が、電界を印加していない状態で、高流量で分別装置 を介して分離された試料用容器に運搬されることを特徴とする請求項１に記載の 方法。