JP2001518133A

JP2001518133A - 高い抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類

Info

Publication number: JP2001518133A
Application number: JP54488398A
Authority: JP
Inventors: カス・ベニト; ナッジ・アンナマリア; トッリ・ジャンジアコモ
Original assignee: イナルコソシエタペルアチオニ
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2001-10-09
Also published as: WO1998042754A2; ITMI970678A1; DK0970130T3; AU7040598A; CA2285383C; DE69806468T2; EP0970130B1; ES2180161T3; EP0970130A2; ATE220410T1; IT1290814B1; CA2285383A1; DE69806468D1; US6197943B1; WO1998042754A3; KR20000075663A

Abstract

(57)【要約】インビトロ高抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類であって、出発の高硫酸化されたグリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、この塩を加溶媒分解によって部分的に脱硫酸化し、次いで、その部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化することによって高硫酸化された種々のグリコサミノグリカン類によって得られる、上記グリコサミノグリカン類。

Description

【発明の詳細な説明】高い抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類発明の分野本発明の目的は、インビトロ(in vitro)高抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類であって、出発の高硫酸化されたグリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、その塩を加溶媒分解により部分脱硫酸化し、次いで部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化することによって高硫酸化された種々のグリコサミノグリカン類から得られる上記グリコサミノグリカン類を提供することにある。ヘパリンは動物の器官から抽出された多糖類であり、抗凝固剤及び抗血栓剤として５０年以上の間採用されてきた。ヘパリンは、ヘパラン硫酸と同様、グリコサミノグリカン類であって、組織及び動物種(グリコサミノグリカン類は組織及び動物種から得られてきた)に依存しつつ、ある程度は分離工程にも依存しつつ様々に硫酸化され、ウロン酸(イズロン酸又はグルクロン酸)とグリコサミンとの交互配列(alternate sequences)から成るグリコサミノグリカン類に属する。ヘパリンの構造は、式 (式中、単位Ｕはイズロン酸(IdoA)又はグルクロン酸(GlcA)を示し、単位ＡはＮ −硫酸化グリコサミン(GlcNAc)を示し；Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₆は硫酸基又は水素を示し；Ｒ'はＳＯ₃又はＡｃを示す)による統計用語によって示される。病院で使用されるヘパリンに大抵表示されている配列は、三硫酸化二糖(１ｄｏＡ２ＳＯ₃−ＧｌｃＮＳＯ₃６ＳＯ₃)のものである。一方、普通のヘパリンを形成している鎖の約3分の1にのみ含まれ、3の位置が硫酸化されたグルコサミン単位(ＧｌｃＮＳＯ₃3ＳＯ₃)を特徴し、しかも、抗トロンビンIIIとしてのヘパリン及びヘパラン硫酸の活性部位を形成している二級五糖の配列は、有意な抗凝固性活性及び抗血栓症活性を発現するためには極めて重要である。3−Ｏ−硫酸化グルコサミン単位は、前記活性部位の標識(marker)と考えられ、また、Ｘ活性化(X a)済みトロンビン(IIa)凝固因子の抑制能力によって通常表現される抗血栓症活性は、ヘパリン類中の前記単位の含有量％と関連付けることができる。ヘパリン及びヘパラン硫酸の抗凝固特性及び抗血栓症特性はまた、それらを構成する多糖の鎖長さによって調整される。例えば、低分子量(LMWH)を有するヘパリンは、一層低い抗凝固活性であるが従来のヘパリンのものに類似した抗血栓症特性を有する。また、それらヘパリンは、幾つかの治療に適用されるときは、特に、出血の危険性、及び血小板減少等のヘパリンの他の副作用を低減するために、後者のヘパリンの代用となる傾向がある。更に、LMWHのものは、それらが皮下経路で投与されるとき、その生体内利用効率は従来のヘパリンのものよりも一層優れているという特徴があるが、静脈血栓症の予防においては実際上大したことはない。[(B．カシュ(Casu)，ヘパリンの構造，Hemostasis ンダル(Lindall)編集，ヘパリンと関連多糖類，Plenum Press，ニューヨーク，1 992]。上述の通り、主として抗血栓症活性の原因となっている、ヘパリンの五糖の配列は、天然ヘパリンの鎖の約３分の１の中にしか含まれていないので、前記配列を含む鎖を集中させながら、又は既に活性部位を有する鎖の中か若しくは活性部位が不足しているこれらの鎖の中に新たな活性部位を生成しながら、前記活性度を強化することは実務的に興味を引く。抗トロンビンIIIに関するアフィニティクロマトグラフィーによるか又は(有効性は劣るが)カチオン樹脂によるヘパリンの処理によって達成し得る第一目的は、普通のヘパリンのかなりの部分( 約３分の２)を使用しないこともあって、未だにコスト高であるものと考えられている。他方、従来の方法を用いたヘパリンの硫酸化によって、抗トロンビンのための更なる活性部位を生成する目的を達成することはできない。これらの従来方法では、抗トロンビンのための活性部位は過剰の硫酸基によってマスクされる(maske d)。偶然にもそれらが出発ヘパリンの抗凝固活性より大きな抗凝固活性を示したとしても(大抵は抗トロンビンによって提供される作用機構とは異なる作用機構による)、それら生成物は、抗血栓剤としてのヘパリンに比べて活性は通常低く、しかも、それら生成物は、他の血漿タンパク質との特異な相互作用によって望ましくない副作用を生じることがある。[B．カシュ，ヘパリンの構造と生物活性，Advances Carbohydr．Chem．Biochem．43，51〜134(1985)]。一方、部分的に又は全体的に脱硫酸化したヘパリン類を再硫酸化することによって、ヘパリンの活性な配列を「再構築する(reconstruct)」ことが試みられたが、得られた生成物は、抗血栓症活性が強化されるというよりむしろ低減した。これは、特に、イズロン単位(iduronic units)が位置2よりむしろ位置3で硫酸化する傾向があるため、及び／又はグルコサミン単位の位置３での硫酸化が不充分であるためである。[R．N．レジ(Rej)，K．G．ラドウィグ-バクスタ(Ludwig-Bax ter)，A．S．ペリン(Perlin)，Carbohydr．Res．210，299〜310(1995)]。発明の概要我々は今回、インビトロ高抗血栓症活性を有し、位置２で硫酸化されているが位置３では硫酸化されていないイズロン単位を少なくとも２０％有し、位置３及び位置６で硫酸化されたスルファミノグルコサミン単位 (sufaminoglucosaminic units)を少なくとも３０％有し、しかも、２．０〜３．５の範囲の硫酸塩／カルボキシルのモル比を有する、グリコサミノグリカン類を得ることを可能にする方法を見出した。この方法は、出発原料として種々の高硫酸化グリコサミノグリカン類を使用し、しかも、この方法は、 (a) 出発の高硫酸化されたグリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、 (b) 工程(a)の有機塩基の塩を加溶媒分解によって部分的に脱硫酸化し、 (c) 工程(b)の部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化し、 (d) 工程(c)の生成物をできるだけ6−Ｏ−再硫酸化する、諸工程を含むことを特徴とする。得られた生成物は、抗血栓症治療に適した薬剤組成物の調製において、活性な物質として使用することができる。発明の詳細な説明本発明による高抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類の特性及び利点は大部分、以下の詳細な説明の中に例証する。本発明の方法では、出発物質として幾種類かの高硫酸化グリコサミノグリカン類を使用することができ、特に、1,500〜8,000ダルトンの低分子量の高硫酸化ヘパリン(ssLMWH)、8,000〜20,000ダルトンの高分子量の高硫酸化ヘパリン、1,500 〜8,000ダルトンの低分子量の高硫酸化ヘパラン硫酸、8,000〜25,000ダルトンの高分子量の高硫酸化ヘパラン硫酸、バイオテクノロジーによる高硫酸化ヘパラン硫酸、及びＮ−硫酸化Ｋ５多糖から得られた、エピマー化した又はエピマー化していないヘパリン類を使用することができる。既知の通り、高硫酸化グリコサミノグリカン類とは、ヒドロキシル基の全水素 (又は水素の大部分)が、ＳＯ^3-基で置換されたグリコサミノグリカン類であって、それらは種々の著者によって記述された手順によって調製される［M．L．ウォルフロム(Wolfrom)等，J．Am．Chem．Soc．75，1519(1953);ナガサワ等，Carboh ydr．Res．158，183〜190(1986);欧州特許第214,879号明細書(1986);米国特許第 4,727,063号明細書;ナッギ等，Biochem．Pharmacol． 36，1895〜1900(1987);オガモ等，Carbohydr．Res．193，165〜172(1989)］。その方法は次の工程によって行われる。 (a) 出発の高硫酸化グリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製する工程であって、その有機塩基がピリジン、テトラメチルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムから選ばれる上記工程。出発の高硫酸化グリコサミノグリカンは、ナトリウム塩の形態で、蒸留水に溶解させ、次いで、カチオン交換柱を通過させる。得られた溶液に有機塩基を、ｐＨ９が達成されるような量で室温で添加して、塩を得る。次いで、この塩は凍結乾燥される。 (b) 工程(a)の塩の、加溶媒分解による部分脱硫酸化。工程(a)で得た有機塩基の塩は、Ｈ₂Ｏ又はメタノールを含有する非プロトン性極性溶媒の溶液を用い、この溶液と前記有機塩基塩の重量比を５０：１〜１００：１にして処理する。得られた溶液は、５０〜９０℃の範囲の温度で撹拌しながら、５〜４８０分の範囲の時間加熱して、前記塩を部分的に脱硫酸化する。次いで、反応混合物に、水と０．２５ＮＮａＯＨを添加して中性のｐＨにし、生成物は、酢酸ナトリウムを飽和させたＥｔＯＨを添加することによって沈降させる。次いで、生成物は、カットオフ２０００の膜を通して透析し、ゲルろ過によって脱塩する。 (c) 工程(b)から得られた生成物のＮ−再硫酸化工程(b)から得られた生成物は、１０／０．１〜１０／１ｍｌ／ｇの水の量で溶解し、次いで、その溶液にＮａＨＣＯ₃を添加してｐＨ９にし、次いで、トリメチルアミン三酸化イオウ(trimethylamine sulfur trioxlde)を前記生成物の重量と同じ量で添加する。それを５０〜６０℃に２時間の間加熱し、次いで、トリメチルアミン三酸化イオウの等量を再び添加し、同じ温度で２４時間の間加熱を続ける。生成物は、酢酸ナトリウムを飽和させたＥｔＯＨを添加することによって沈降させ、最初ＮａＣｌ溶液中で次いで蒸留水中でカットオフ２０００の膜を通して透析し、次いで、最終的にゲルろ過によって脱塩する。 (d) 工程(c)から得られた生成物の可能な限りの６−Ｏ−再硫酸化。ＮＭＲ分析に基づき、グルコサミン単位の位置６に３０％を超える量が脱硫酸化されていることが分かった生成物は、既知の方法により［即ち、K．ナガサワ(Nagasawa)，H ．ウチヤマ(Vchiyama)，N．ワジアマ(Wajiama)，Carbohydr．Res．158，183〜19 0(1986)］、６−Ｏ−再硫酸化させてもよい。得られた生成物は次の特性を呈する。・イズロン単位の少なくとも２０％は位置２で硫酸化し、位置３では硫酸化していないこと；・スルファミノグルコサミン単位の少なくとも３０％は、天然ヘパリンの抗トロンビンのための活性部位と同様、位置３及び位置６で硫酸化していること・硫酸塩／カルボキシルのモル比は２．０〜３．５の範囲であること：・インビトロ(in vitro)抗Ｘａ活性度は１００〜１５０Ｕ／ｍｇの範囲であること。位置２で硫酸化されているが位置３では硫酸化されていないイズロン単位、及び位置３で硫酸化されたスルファミノグルコサミン単位の含有量は、ＮＭＲ分析によって決定された。このＮＭＲ分析は、決定される単位と決定される硫酸化の型とに特に起因する信号を統合することに基づいている［E．A．ヤテス(Yates) ，F．サンチニ(Santini)，M．グエリニ(Guerrini)，A．ナッギ(Naggi)，G．トリ (Torri)，B．カシュ：体系的に変性された１２種のヘパリン誘導体の主要シーケンスの¹Ｈと¹³ＣＮＭＲスペクトル帰属(¹Ｈ and ¹³ＣＮＭＲ spectral ass ignments of the major sequences of twelve systematically modified heparin derivatives)，Carbohydr．Res．294，15〜27(1996)］。硫酸塩／カルボキシルのモル比は、溶液導電率法(conductometric method)［B ．カシュ，U．ジェナロ(Gennaro)：ヘパリン及びコンドロイチン硫酸の硫酸基とカルボキシレート基を決定するための簡便な溶液導電率法(A simple co nductometric method for determining the sulfate and carboxylate groups of heparin and Chondroitin sulfates)，Carbohydr．Res．39，16 8〜176(1975)］によって決定した。インビトロ抗Ｘａ活性度は、発色法(chromogenic method)［A．N．タイエン( Teien)等，Thrombosis Res．8，413〜416(1976)］によって決定した。本発明は特に、低分子量のヘパリン類(1,500〜8,000ダルトン)、高分子量のヘパリン類(8 ,000〜18,000ダルトン)、低分子量のヘパラン硫酸類(1,500〜8,000ダルトン)、高分子量のヘパラン硫酸類(8,000〜25,000ダルトン)、及びＫ５多糖からヘパリン類とヘパラン硫酸類から成る群に属するグリコサミノグリカン類に関する。それらの諸特性のおかげで、本発明のグリコサミノグリカン類は、薬理学的に許容できる賦形剤(excipients，添加剤)又は希釈剤と混合して使用し、抗血栓症の治療に適した薬剤組成物を調製することができる。それによって、本発明は更に、血栓症を治療し予防するための治療法であって、前記グリコサミノグリカン類を１〜１,５００ｍｇ／日の量で投与することからなる治療法にも関する。本発明を例証するために、次の諸例を公表する。例1 …高い抗トロンビン活性を有する低分子量ヘパリンの調製(a) 高硫酸化された低分子量ヘパリン（ssLMWH）のピリジン塩の調製（G1074/4 ）米国特許第４,７２７,０６３号明細書及び刊行物「ナッギ(Naggi)等，Biochem ．Pharmacol．36，1895〜1900(1987)」に記載の手順に従って、豚の腸粘膜からの市販ヘパリンから得られた、５,０００ダルトンに等しい分子量を有するｓｓＬＭＷＨのナトリウム塩(これは、抗Ｘａ活性度＝８７Ｕ／ｍｇ、図１Ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する)３６０ｍｇを、蒸留水(３０ｍｌ)に溶解させ、次いで、カチオン交換柱(Ｈ⁺形態のアンバーライト(AMBERLITE)IR 120)を通過させた。得られた溶液は、ピリジンを用いてｐＨ９に調整した。かくして得られた高硫酸化済み低分子量ヘパリンのピリジン塩を凍結乾燥した。 (b) ssLMWHのピリジン塩の脱硫酸化得られた上記高硫酸化済み低分子量ヘパリンのピリジン塩は、１０％ＤＭＳＯＭ／ＭｅＯＨ溶液(２５ｍｌ)に溶解させた。その溶液は、８０℃の油浴で撹拌しながら１５分間の間加熱した。反応の終わりに、水１５ｍｌを添加し、次いで溶液は０．２５ＮＮａＯＨで中和した。反応生成物は、酢酸ナトリウムで飽和させたＥｔＯＨ６０ｍｌを添加することによって沈降させ、蒸留水でカットオフ２０００膜を通して４８時間の間透析し、次いで、セファデックス(Sephadex)Ｇ２５のゲルろ過によって脱塩した。得られた生成物は次の諸特性を示す。¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル(図１Ｂ)は、全体的にＮ−脱硫酸化され(Ｃ２ＮＨ２：５６ｐｐｍ)、且つ部分的に６−Ｏ−脱硫酸化された(Ｃ６ＯＨ：６２ｐｐｍ)ヘパリンからの典型的な信号と、位置３では硫酸化されず位置２で硫酸化されたイズロン単位の典型的な６５ｐｐｍの信号とを示す。(c) 部分的に脱硫酸化した工程(b)の生成物のＮ−再硫酸化(G 2291) 工程(b)で得られた生成物１００ｍｇを、水１０ｍｌに溶解させ、ＮａＨＣＯ₃ を用いてｐＨ９に調整した。次いで、同じ重量のトリメチルアミン三酸化イオウ (ＴＭＡ．ＳＯ₃)を添加し、次いで、溶液は、５５℃の油浴で撹拌しながら加熱した。２時間後、同じ重量のＴＭＡ．ＳＯ₃を添加し、次いで、２４時間放置し反応させた。反応の終わりに、その混合物はｐＨ９に調節した。試料は、酢酸ナトリウムで飽和させたＥｔＯＨ４体積を添加することによって沈降させ、１ＮＮａＣｌで２４時間の間、０．５ＮＮａＣｌで２４時間の間、且つ蒸留水で２４時間の間、カットオフ２０００膜を通過させ、次いで、セファデックスＧ２５上でゲルろ過することによって、脱塩した。得られた生成物は次の特性を呈する。硫酸塩／カルボキシルのモル比：３．２２、抗−Ｘａ活性度：１５２Ｕ／ｍｇ。 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって、完全なＮ−硫酸化を確認した。例2（G2 309）脱硫酸化の反応時間を３０分間に等しくして、例１を繰り返した。脱硫酸化から得られた生成物は、図１Ｃに示される¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、例１の項目(b)に記載の特性を有している。Ｎ−再硫酸化の後、得られた生成物は、次の特性を示す。抗−Ｘａ活性度：１１０Ｕ／ｍｇ、 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって、完全なＮ−硫酸化を確認した。例3（G2 301） (a) 脱硫酸化の反応時間を４５分間に等しくして、例１を繰り返した。脱硫酸化から得られた生成物は、図１Ｄに示される¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、例１の項目(c)に記載の特性を有している。Ｎ−再硫酸化の後、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって、完全なＮ−硫酸化を確認した。 (b)Ｎ−再硫酸化済み生成物は、詳細な説明に引用されている手順に従って、６ −Ｏ−再硫酸化した。例4 項目(b)の時間と温度を変えながら、且つ、６５℃で１．５時間の間精確に操作しながら、例１を繰り返した。脱硫酸化から得られた生成物は、図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄに示される¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルに類似したスペクトルを示した。６５ｐｐｍでの信号(位置３で脱硫酸化され位置２で硫酸化されたイズロン単位の典型的なもの)は、例え例１の項目(b)の条件下で得られたものより小さかろうと、有意な量で存在する。例5 (a) 脱硫酸化の温度を９０℃に等しくし、時間を４５分間に等しくして、例１を繰り返した。脱硫酸化から得られた生成物は、例１の項目(b)に記載の特性に類似の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。しかし、一層高い温度及び一層短い時間で得られた生成物のスペクトルの信号特性に比べて、位置６で硫酸化されたグルコサミンの信号特性はかなり小さく、且つ、その位置で硫酸化されていないグルコサミンの信号特性はかなり大きい。 (b) N−再硫酸化済み生成物は、詳細な説明に引用されている手順に従って、６ −Ｏ−再硫酸化を行った。例6 ５５℃のＤＭＦ中のピリジン塩をＳＯ₃／ピリジンの付加物(遊離ヒドロキシルに対するモル比３：１)で５時間の間処理しながら高硫酸化された高分子量のヘパリン(１２,０００ダルトン)から出発して、例１を繰り返した。得られた生成物(硫酸塩／カルボキシルのモル比＞３；７５ｐｐｍの¹³Ｃ−ＮＭＲ信号は、位置２で硫酸化され位置３では硫酸化されていないイズロン単位の特性)は、例１( c)に記載される通り、Ｎ−再硫酸化された。表１に例証される通り、低分子量のヘパリン類についての、得られた生成物の抗血栓症活性度(Ｘａ因子のインビトロ抑制で表現される)は、出発の高硫酸化生成物のものと比べて、或いは現在市販されている低分子量ヘパリン類のものと比べて著しく大きく、治療に使用される。表１抗−Ｘａ活性度★ 第１群第２群ＬＭＷ−Ｈ − １００ｓｓＬＭＷＨ(G1074/4) １００ − G1074/4からの15分間脱硫酸化(G2281) １７５１６２ G1074/4からの30分間脱硫酸化(G2309) １２５１２５ ★）Ｕ／ｍｇ．第１群では高硫酸化済み低分子量ヘパリン(ssLMWH)に対する規準化値であり、第２群では市販の生成物「フラキシエパリン(Fraxieparin)」と「ラブノックス(Lovenox)」(LMWH)の１：１混合物に対する規準化値である。例7〜17 使用されたグリコサミノグリカン類の説明・豚の腸粘膜から得られた、市販の高分子量ヘパリン(ＨＭＷＨ)(Ｍｗ＝１２, ０００Ｄａ，抗−Ｘａ活性度１９２Ｕ／ｍｇ)(例７、８、９、１０) ・市販のヘパラン硫酸(ＨＳ)。イズロン酸とグルクロン酸との間の比は、使用されたヘパランの効用として変化する：イズロン酸３０％、グルクロン酸７０％（例１１）イズロン酸４０％、グルクロン酸６０％（例１２）・Ｋ５多糖(Ｋ５−ＰＳ)（例１３、１４）・エピマー化されたＫ５多糖(ｅＫ５−ＰＳ)。エピマー化の度合いは、使用されたｅＫ５−ＰＳの効用として変化する：イズロン酸３０％、グルクロン酸７０％（例１５）イズロン酸６０％、グルクロン酸６０％（例１６、１７） (a) 高硫酸化された基質の調製使用する基質のナトリウム塩１．５ｇを蒸留水(３０ｍｌ)に溶解し、次いで、カチオン交換柱(Ｈ⁺形熊のアンバーライトＩＲ１２０）を通過させた。得られた溶液は、エタノール中の１０％テトラブチルアンモニウム水酸化物ノ溶液を用いて、ｐＨ９に調整した。かくして得られたテトラブチルアンモニウム塩を凍結乾燥した。基質のテトラブチルアンモニウム塩はＤＭＦ（６０ｍｌ)に溶解させ、次いで、ピリジン三酸化イオウ(Ｐｙ．ＳＯ₃)を、遊離ヒドロキシルの３当量の量で添加し、次いで、その溶液は、５５℃の油浴中で撹拌しながら一晩中加熱した。反応の終わりに、水５ｍｌを添加し、次いで、反応性生物は、酢酸ナトリウムで飽和させたＥｔＯＨ２００ｍｌを添加することによって沈降させ、蒸留水で４８時間の間、カットオフ６０００〜８０００の透析膜を通して透析し、次いで、セファデックスＧ２５上でゲルろ過することによって脱塩した。得られた生成物は次の特性を呈する。 ¹³Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、完全にＮ−脱硫酸化された(Ａ２ＮＨ２)Ｃ２：５６ｐｐｍグルコサミン及び全体的に６−Ｏ−硫酸化された(Ａ６Ｓ)Ｃ６６９ｐｐｍの典型的な信号と、同一の残基(Ｕ２，３Ｓ)Ｃ１Å１０１．５ｐｐｍ上の位置２及び３で硫酸化されたウロン単位(Uronic units)の信号とを示す。ウロン単位上に得られた硫酸化の度合いは、使用されるグリコサミノグリカンの効用として変化する。得られた高硫酸化済み生成物について得られたデータは、表２に記載する。 (b) 高硫酸化済み基質のピリジン塩の調製(ｓｓＨＭＷＨ) 工程(a)に記載の方法によって得られたナトリウム塩１ｇを、蒸留水(３０ｍｌ)に溶解させ、次いで、カチオン交換柱(Ｈ⁺形態のアンバーライトＩＲ１２０)を通過させた。得られた溶液は、ピリジンを用いてｐＨ９に調整した。かくして得られた高硫酸化済み基質のピリジン塩を凍結乾燥した。 (c) 高硫酸化済み基質のピリジン塩の脱硫酸化上述の通りにして得たピリジン塩１００ｍｇを、ＤＭＳＯ／ＭｅＯＨ１０％溶液(１０ｍｌ)に溶解させた。その溶液は、表３に記載の温度と時間と使用して (油浴で)撹拌しながら加熱した。反応の終わりに、水５ｍｌを添加し、次いで、反応性生物は、酢酸ナトリウムで飽和させたＥｔＯＨ１００ｍｌを添加することによって沈降させ、蒸留水で４８時間の間、カットオフ６０００〜８０００の透析膜を通して透析し、次いで、セファデックスＧ２５上でゲルろ過することによって脱塩した。得られた生成物は表３に記載の特性を示す。 (d) 工程(c)から得られた、部分的に脱硫酸化した生成物のＮ−再硫酸化工程(c)から得られた生成物１００ｍｇを水１０ｍｌに溶解させ、ＮａＨＣＯ₃ を用いてｐＨ９に調整した。次いで、同じ重量のトリメチルアミン三酸化イオウ (ＴＭＡ．ＳＯ₃)を添加し、次いで、その溶液は、５５℃の油浴で撹拌しながら加熱した。２時間後、同一重量のＴＭＡ．ＳＯ₃を更に添加し、次いで、２４時間の間放置した。反応の終わりに、水５ｍｌを添加し、次いで、反応性生物は、酢酸ナトリウムで飽和させたＥｔＯＨ５０ｍｌを添加することによって沈降させ、蒸留水で４８時間の間、カットオフ６０００〜８０００の透析膜を通して透析し、次いで、セファデックスＧ２５上でゲルろ過することによって脱塩した。 ¹³Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、得られた生成物の完全なＮ−脱硫酸化を示す。得られた諸生成物の、硫酸塩／カルボキシル(ＤＳ)の比として表される硫酸化度合いと、分子量(Ｍｗ)と、生物活性度(ａＰＴＴ、抗IIａ及びＸａ)とを決定した。得られたデータを表４に記載する。表２項目(a)に記述の通りにして得られた高硫酸化済みグリコサミノグリカン類の説明。表１の第１欄は、諸例においてそのような生成物が使用されたことを示す。表３使用された反応条件(基質、温度及び時間)と、得られた諸生成物の特性との説明。表４Ｎ−再硫酸後に得られた諸生成物とそれらの特性との説明。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月６日（１９９９．４．６）【補正内容】明細書高い抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類発明の分野本発明の目的は、インビトロ(in vitro)高抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類であって、出発の高硫酸化されたグリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、その塩を加溶媒分解により部分脱硫酸化し、次いで部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化することによって高硫酸化された種々のグリコサミノグリカン類から得られる上記グリコサミノグリカン類を提供することにある。ヘパリンは動物の器官から抽出された多糖類であり、抗凝固剤及び抗血栓剤として５０年以上の間採用されてきた。ヘパリンは、ヘパラン硫酸と同様、グリコサミノグリカン類であって、組織及び動物種(グリコサミノグリカン類は組織及び動物種から得られてきた)に依存しつつ、ある程度は分離工程にも依存しつつ様々に硫酸化され、ウロン酸(イズロン酸又はグルクロン酸)とグリコサミンとの交互配列(alternate sequences)から成るグリコサミノグリカン類に属する。ヘパリンの構造は、式 (式中、単位Ｕはイズロン酸(IdoA)又はグルクロン酸(GlcA)を示し、単位ＡはＮ硫酸化グリコサミン(GlcNAc)を示し；Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₆は硫酸基又は水素を示しＲ'はＳＯ₃又はＡｃを示す)による統計用語によって示される。病院で使用されるヘパリンに大抵表示されている配列は、三硫酸化二糖(ｄｏＡ２ＳＯ₃−ＧｌｃＮＳＯ₃６ＳＯ₃）のものである。一方、…二級…。これらの従来方法では、抗トロンビンのための活性部位は過剰の硫酸基によってマスクされる(masked)。偶然にもそれらが出発ヘパリンの抗凝固活性より大きな抗凝固活性を示したとしても(大抵は抗トロンビンによって提供される作用機構とは異なる作用機構による)、それら生成物は、抗血栓剤としてのヘパリンに比べて活性は通常低く、しかも、それら生成物は、他の血漿タンパク質との特異な相互作用によって望ましくない副作用を生じることがある。[B．カシュ，ヘパリンの構造と生物活性，Advances Carbohydr．Chem．Biochem．43，51〜134(198 5)]。一方、部分的に又は全体的に脱硫酸化したヘパリン類を再硫酸化することによって、ヘパリンの活性な配列を「再構築する(reconstruct)」ことが試みられたが、得られた生成物は、抗血栓症活性が強化されるというよりむしろ低減した。これは、特に、イズロン単位(iduronic units)が位置2よりむしろ位置3で硫酸化する傾向があるため、及び／又はグルコサミン単位の位置３での硫酸化が不充分であるためである。[R．N．レジ(Rej)，K．G．ラドウィグ-バクスタ(Ludwig-Bax ter)，A．S．ペリン(Perlin)，Carbohydr．Res．210，299〜310(1995)]。発明の概要我々は今回、インビトロ高抗血栓症活性を有し、位置２で硫酸化されているが位置３では硫酸化されていないイズロン単位を少なくとも２０％有し、位置３及び位置６で硫酸化されたスルファミノグルコサミン単位(sufaminogiucosaminic units)を少なくとも３０％有し、しかも、２．０〜３．５の範囲の硫酸塩／カルボキシルのモル比を有する、グリコサミノグリカン類を得ることを可能にする方法を見出した。この方法は、出発原料として種々の高硫酸化グリコサミノグリカン類を使用し、しかも、この方法は、 (a) 出発の高硫酸化されたグリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、 (b) 工程(a)の有機塩基の塩を加溶媒分解によって部分的に脱硫酸化し、 (c) 工程(b)の部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化し、 (d) 工程(c)の生成物をできるだけ6−Ｏ−再硫酸化する、諸工程を含むことを特徴とする。得られた生成物は、抗血栓症治療に適した薬剤組成物の調製において、活性な物質として使用することができる。発明の詳細な説明本発明による高抗血栓症活性を有するグリコサミノグリカン類の特性及び利点は大部分、以下の詳細な説明の中に例証する。本発明の方法では、出発物質として幾種類かの高硫酸化グリコサミノグリカン類を使用することができ、特に、1,500〜8,000ダルトンの低分子量の高硫酸化ヘパリン(ssLMWH)、8,000〜20,000ダルトンの高分子量の高硫酸化ヘパリン、1,500 〜8,000ダルトンの低分子量の高硫酸化ヘパラン硫酸、8,000〜25,000ダルトンの高分子量の高硫酸化ヘパラン硫酸、バイオテクノロジーによる高硫酸化ヘパラン硫酸、及びＮ−硫酸化Ｋ５多糖から得られた、エピマー化した又はエピマー化していないヘパリン類を使用することができる。既知の通り、高硫酸化グリコサミノグリカン類とは、ヒドロキシル基の全水素 (又は水素の大部分)が、ＳＯ^3-基で置換されたグリコサミノグリカン類であって、それらは種々の著者によって記述された手順によって調製される［M．L．ウォルフロム(Wolfrom)等，J．Am．Chem．Soc．75，1519(1953);ナガサワ等，Carboh ydr．Res．158，183〜190(1986);欧州特許第214,879号明細書(1986);米国特許第 4,727,063号明細書;ナッギ等，Biochem．Pharmacol．36，1895〜1900(1987);オガモ等，Carbohydr．Res．193，165〜172（1989）］。その方法は次の工程によって行われる。 (a) 出発の高硫酸化グリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製する工程であって、その有機塩基がピリジン、テトラメチルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウム塩から選ばれる上記工程。出発の高硫酸化グリコサミノグリカンは、ナトリウム塩の形態で、蒸留水に溶解させ、次いで、カチオン交換柱を通過させる。得られた溶液に有機塩基を、ｐＨ９が達成されるような量で室温で添加して、塩を得る。次いで、この塩は凍結乾燥される。 (b) 工程(a)の塩の、加溶媒分解による部分脱硫酸化。工程(a)で得た有機塩基の塩は、Ｈ₂Ｏ又はメタノールを含有する非プロトン性極性溶媒の溶液を用い、この溶液と前記有機塩基塩の重量比を５０：１〜１００：１にして処理する。得られた溶液は、５０〜…の範囲の温度で撹拌しながら、加熱して…。請求の範囲 1. インビトロ高抗血栓症活性を有し、位置２で硫酸化され位置３では硫酸化されていないイズロン単位を少なくとも２０％有し、位置３及び位置６で硫酸化されたスルファミノグルコサミン単位を少なくとも３０％有し、しかも、１．５〜３．５の範囲の硫酸塩／カルボキシルのモル比を有する、グリコサミノグリカン類。 2. 低分子量のヘパリン(１,５００〜８,００ダルトン)から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 3. 高分子量のヘパリン(８,０００〜１８,０００ダルトン)から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 4. 低分子量のヘパラン硫酸(１,５００〜８,０００ダルトン)から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 5. 高分子量のヘパラン硫酸(８,０００〜２５,０００ダルトン)から成る、請求項1記載のグリコサミノグリカン類。 6. Ｋ５多糖から得られたヘパリンとヘパラン硫酸とから成る、請求項1記載のグリコサミノグリカン類。 7. 種々の高硫酸化済みグリコサミノグリカン類から出発する請求項1記載のグリコサミノグリカン類の調製方法であって、 (a) 出発の高硫酸化済みグリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、 (b) 水又はメタノールを含有する非プロトン性極性溶媒を用いて、５０〜８０℃ の温度で５〜４８０分の範囲の時間の間処理することによって、加溶媒分解により工程(a)の有機塩基の塩を部分的に脱硫酸化し、 (c) 工程(b)の部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化し、 (d) 工程(c)の生成物を可能な限り6−Ｏ−再硫酸化する、諸工程を含むことを特徴とする、上記方法。 8. 出発の高硫酸化済みグリコサミノグリカン類は、１,５００〜８,０００ダルトンの低分子量の高硫酸化済みヘパリン類、８,０００〜２０,０００ダルトンの高分子量の高硫酸化済みヘパリン類、１,５００〜８,０００ダルトンの低分子量の高硫酸化済みヘパラン硫酸類、８,０００〜２５,０００ダルトンの高分子量の高硫酸化済みヘパラン硫酸、バイオテクノロジーにより高硫酸化されたヘパラン硫酸、及びＮ−硫酸化Ｋ５多糖から得られた、エピマー化した又はエピマー化していないヘパリン類から成る群から選ばれる、請求項７記載の方法。 9. 工程(a)の調製は、出発のグリコサミノグリカンのナトリウム塩の溶液を有機塩基で処理しｐＨ９に調整することにより達成する、請求項７記載の方法。 10．工程(c)のＮ−再硫酸化は、工程(b)で得られた生成物の水溶液を、該生成物の重量に等しい量のトリメチルアミン三酸化イオウを用いてｐＨ９で処理し；５０〜６０℃まで加熱し；次いで、再び等量のトリメチルアミン三酸化イオウを添加する；ことによって行う、請求項7記載の方法。 11．請求項1に定義されるグリコサミノグリカンを１〜１,５００ｍｇ／日の量で投与することを含む、抗血栓症治療のための治療法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. インビトロ高抗血栓症活性を有し、位置２で硫酸化されているが位置３では硫酸化されていないイズロン単位を少なくとも２０％有し、位置３及び位置６で硫酸化されたスルファミノグルコサミン単位を少なくとも３０％有し、しかも、２．０〜３．５の範囲の硫酸塩／カルボキシルのモル比を有する、グリコサミノグリカン類。 2. 低分子量のヘパリン(1,500〜8,000ダルトン）から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 3. 高分子量のヘパリン(8,000〜18,000ダルトン)から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 4. 低分子量のヘパラン硫酸(1,500〜8,000ダルトン)から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 5. 高分子量のヘパラン硫酸(8,000〜25,000ダルトン)から成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 6. Ｋ5多糖から得られたヘパリンとヘパラン硫酸とから成る、請求項１記載のグリコサミノグリカン類。 7. 種々の高硫酸化グリコサミノグリカン類から出発する請求項１記載のグリコサミノグリカン類の調製方法であって、 (a) 出発の高硫酸化グリコサミノグリカンの有機塩基の塩を調製し、 (b) 工程(a)の有機塩基の塩を加溶媒分解によって部分的に脱硫酸化し、 (c) 工程(b)の部分脱硫酸化済み生成物をＮ−再硫酸化し、 (d) 工程(c)の生成物を可能な限り6−Ｏ−再硫酸化する、諸工程を含むことを特徴とする、上記方法。 8. 出発の高硫酸化グリコサミノグリカン類は、1,500〜8,000ダルトンの低分子量高硫酸化ヘパリン類、8,000〜25,000ダルトンの高分子量高硫酸化ヘパリン類、1,500〜8,000ダルトンの低分子量高硫酸化ヘパラン硫酸類、8,000〜25,000 ダルトンの高分子量高硫酸化ヘパラン硫酸、バイオテクノロジーによる高硫酸化ヘパラン硫酸、及びＮ−硫酸化Ｋ５多糖から得られた、エピマー化した又はエピマー化していないヘパリン類から成る群から選ばれる、請求項7記載の方法。 9. 工程(a)の調製は、出発のグリコサミノグリカンのナトリウム塩の溶液を有機塩基で処理してｐＨ９にすることによって達成する、請求項7記載の方法。 10．工程(b)の脱硫酸化は、工程(a)で得られた有機塩基塩を、水又はメタノールを含有する非プロトン性極性溶媒で処理することによって行い、この際、前記溶液と前記有機塩基の塩の重量比を５０：１〜１００：１にして５０〜８０℃の範囲の温度で５〜４８０分の範囲の時間間隔で行う、請求項7記載の方法。 11．工程(c)のＮ−再硫酸化は、工程(b)で得られた生成物の水溶液を、該生成物の重量に等しい量のトリメチルアミン三酸化イオウで処理することによって行い、この際、ｐＨ９で５０〜６０℃まで加熱し、次いで、再び等量のトリメチルアミン三酸化イオウを添加する、請求項7記載の方法。 12．請求項１に定義されるグリコサミノグリカンを１〜１,５００ｍｇ／日の量で投与することを含む、抗血栓症治療のための治療法。