JP2001517433A - 非霊長類レンチウイルスベクターおよびパッケージングシステム - Google Patents
非霊長類レンチウイルスベクターおよびパッケージングシステムInfo
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- JP2001517433A JP2001517433A JP2000512934A JP2000512934A JP2001517433A JP 2001517433 A JP2001517433 A JP 2001517433A JP 2000512934 A JP2000512934 A JP 2000512934A JP 2000512934 A JP2000512934 A JP 2000512934A JP 2001517433 A JP2001517433 A JP 2001517433A
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- fiv
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒト細胞中で活性な非霊長類レトロウイルスベクターの発見と設計に基づき、レトロウイルスパッケージングシステム、ベクター、パッケージャブル核酸および他の特徴につき記載する。該ベクターは、FIVなど非霊長類レトロウイルスによりパッケージング可能なものであり、非***ヒト細胞を形質導入する。該パッケージングシステムはベクターパッケージング成分をヒト細胞中でトランスに産生し、それによって新しい病原体がヒトの集団に入り込む可能性を回避する。これらのベクターおよびパッケージング成分は、一般の遺伝子伝達ベクターの構築およびヒト遺伝子治療にとって有用である。
Description
【0001】 連邦政府助成に関する供述 本発明は退役軍人協会供与政府助成金により、また米国立保健研究所供与研究
費番号Ca67394およびAI36612のもとで実施された。米国政府は本
発明に応分の権利を有する。
費番号Ca67394およびAI36612のもとで実施された。米国政府は本
発明に応分の権利を有する。
【0002】 (発明の背景) 遺伝子療法は慢性感染性疾患(例えば、HIV感染症)ならびに癌およびある
形態の先天性欠損症、例えば、酵素欠損症などを含む非感染性疾患に対する治療
法を提供する。核酸を細胞に導入する数種の方法が、生体内、生体外および試験
管内で使用されている。これらの方法は、リポソームによる遺伝子送達(デブス
およびズー(Debs and Zhu)(1993)WO93/24640およびUSP5
,641,662);マンニーノおよびゴールド−フォゲライト(Mannino and
Gould-Fogerite)(1988)BioTechniques 6(7):682〜691;ロー
ズ(Rose)USP5,279,833;ブリガム(Brigham)(1991)WO 91/06309;およびフェルグナー(Felgner)ら(1987)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:7413〜7414)および、例えば、癌治療のための
アデノウイルス・ベクター介在遺伝子送達(例えば、チェン(Chen)ら(199
4)Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:3054〜3057;トン(Tong)ら
(1996)Gynecol. Oncol. 61:175〜179;クレイマン(Clayman) ら(1995)Cancer Res. 5:1〜6;オ'マレイ(O'Malley)ら(1995 )Cancer Res. 55:1080〜1085;ホワン(Hwang)ら(1995)Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol. 13:7〜16;ハッダダ(Haddada)ら(19 95)Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199(Pt. 3):297〜306; アディソン(Addison)ら(1995)Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:8 522〜8526;コラック(Colak)ら(1995)Brain Res. 691:76
〜82;クリスタル(Crystal)(1995)Science 270:404〜410 ;エルシャミ(Elshami)ら(1996)Human Gene Ther. 7:141〜148
;ビンセント(Vincent)ら(1996)J. Neurosurg. 85:648〜654 参照)を含む。レトロウイルスゲノムの一部として治療ポリヌクレオチド配列を
取込む複製能欠損レトロウイルスベクターは、特に単純MuLVベクターについ
て使用されている。参照文献:ミラー(Miller)ら、Mol. Cell. Biol. 10: 4239(1990);コルベルグ(Kolberg)J. NIH Res. 4:43(199 2);およびコルネッタ(Cornetta)ら、Hum. Gene Ther. 2:215(199
1))。
形態の先天性欠損症、例えば、酵素欠損症などを含む非感染性疾患に対する治療
法を提供する。核酸を細胞に導入する数種の方法が、生体内、生体外および試験
管内で使用されている。これらの方法は、リポソームによる遺伝子送達(デブス
およびズー(Debs and Zhu)(1993)WO93/24640およびUSP5
,641,662);マンニーノおよびゴールド−フォゲライト(Mannino and
Gould-Fogerite)(1988)BioTechniques 6(7):682〜691;ロー
ズ(Rose)USP5,279,833;ブリガム(Brigham)(1991)WO 91/06309;およびフェルグナー(Felgner)ら(1987)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:7413〜7414)および、例えば、癌治療のための
アデノウイルス・ベクター介在遺伝子送達(例えば、チェン(Chen)ら(199
4)Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:3054〜3057;トン(Tong)ら
(1996)Gynecol. Oncol. 61:175〜179;クレイマン(Clayman) ら(1995)Cancer Res. 5:1〜6;オ'マレイ(O'Malley)ら(1995 )Cancer Res. 55:1080〜1085;ホワン(Hwang)ら(1995)Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol. 13:7〜16;ハッダダ(Haddada)ら(19 95)Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199(Pt. 3):297〜306; アディソン(Addison)ら(1995)Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:8 522〜8526;コラック(Colak)ら(1995)Brain Res. 691:76
〜82;クリスタル(Crystal)(1995)Science 270:404〜410 ;エルシャミ(Elshami)ら(1996)Human Gene Ther. 7:141〜148
;ビンセント(Vincent)ら(1996)J. Neurosurg. 85:648〜654 参照)を含む。レトロウイルスゲノムの一部として治療ポリヌクレオチド配列を
取込む複製能欠損レトロウイルスベクターは、特に単純MuLVベクターについ
て使用されている。参照文献:ミラー(Miller)ら、Mol. Cell. Biol. 10: 4239(1990);コルベルグ(Kolberg)J. NIH Res. 4:43(199 2);およびコルネッタ(Cornetta)ら、Hum. Gene Ther. 2:215(199
1))。
【0003】 遺伝子治療にとって最も興味をそそる標的の一つはHIV感染症である。HI
V流行の拡大は、これらウイルスの分子メカニズムおよびライフサイクル解明の
ため、世界中での懸命な努力を駆り立てている。HIVのライフサイクルは、遺
伝子治療による阻害のための多くの潜在的標的、例えば、ウイルスの侵入を阻止
するトランス優先突然変異体gagおよびenv核酸の細胞性発現、転写とトラ
ンス活性化を阻害するTAR(tatの結合部位であり、トランス活性化に対し
一般に必要とされる)誘引物、およびRNAプロセシングを阻害するRRE(R
evの結合部位、すなわち、Rev応答性要素;Rev Response El
ement)誘引物とトランス優性Rev突然変異体などを提供する。参照文献
:ローゼンブルグおよびフォウシ(Rosenburg and Fauci)(1993)Fundame
ntal Immunology, 第3版、ポール(編纂)、ラーベン・プレス(株)、ニュー ヨークおよびHIV感染症とHIVライフサイクルの概観に関する引用文献。リ
ボザイムをコードする遺伝子治療ベクター、アンチセンス分子、誘引物遺伝子、
トランス優性遺伝子および自殺遺伝子は、レトロウイルスも含め、ユー(Yu)ら
、Gene Therapy (1994)1:13〜26に記載されている。アンチセンス およびリボザイム治療剤はHIV感染症の治療と予防にその重要性が増大してい
る。
V流行の拡大は、これらウイルスの分子メカニズムおよびライフサイクル解明の
ため、世界中での懸命な努力を駆り立てている。HIVのライフサイクルは、遺
伝子治療による阻害のための多くの潜在的標的、例えば、ウイルスの侵入を阻止
するトランス優先突然変異体gagおよびenv核酸の細胞性発現、転写とトラ
ンス活性化を阻害するTAR(tatの結合部位であり、トランス活性化に対し
一般に必要とされる)誘引物、およびRNAプロセシングを阻害するRRE(R
evの結合部位、すなわち、Rev応答性要素;Rev Response El
ement)誘引物とトランス優性Rev突然変異体などを提供する。参照文献
:ローゼンブルグおよびフォウシ(Rosenburg and Fauci)(1993)Fundame
ntal Immunology, 第3版、ポール(編纂)、ラーベン・プレス(株)、ニュー ヨークおよびHIV感染症とHIVライフサイクルの概観に関する引用文献。リ
ボザイムをコードする遺伝子治療ベクター、アンチセンス分子、誘引物遺伝子、
トランス優性遺伝子および自殺遺伝子は、レトロウイルスも含め、ユー(Yu)ら
、Gene Therapy (1994)1:13〜26に記載されている。アンチセンス およびリボザイム治療剤はHIV感染症の治療と予防にその重要性が増大してい
る。
【0004】 種々の遺伝子治療方法が今や癌、HIVなどの治療のために利用されているに
もかかわらず、現在遺伝子治療に用いられている送達システムには様々な制限が
ある。例えば、HIV治療に関して、広範に使用されているマウスレトロウイル
スベクターはヒト末梢血リンパ球の形質導入(核酸の伝達)が乏しく、HIVの
貯蔵器であることが判明している単球/マクロファージなど非***細胞を形質導
入し得ない。ウイルスインヒビターの送達のためにより安全な新しいベクター、
特にHIV感染症の治療のために非***性造血幹細胞に送達し得るベクターが望
まれている。
もかかわらず、現在遺伝子治療に用いられている送達システムには様々な制限が
ある。例えば、HIV治療に関して、広範に使用されているマウスレトロウイル
スベクターはヒト末梢血リンパ球の形質導入(核酸の伝達)が乏しく、HIVの
貯蔵器であることが判明している単球/マクロファージなど非***細胞を形質導
入し得ない。ウイルスインヒビターの送達のためにより安全な新しいベクター、
特にHIV感染症の治療のために非***性造血幹細胞に送達し得るベクターが望
まれている。
【0005】 非霊長類レンチウイルスは新しいベクター系開発のための可能なシステムを提
供する;しかし、これらのウイルスについてはあまり知られていない。非霊長類
レンチウイルスの生物学は霊長類レンチウイルス(例えば、HIV−1、HIV
−2およびSIV)に比べあまり調べられていないが、それらはレンチウイルス
の比較生物学にとっても興味があり、またより安全なレンチウイルスベクターの
有力な起源としても興味がある。HIVベースのレトロウイルスベクターは最近
治療用遺伝子伝達体として有望であることが示されているが、その理由は永続的
に感染する非***細胞のレンチレトロウイルス−特異性を示すからである(ナル
ディニ(Naldini)ら(1996)Science 272、263〜267参照)。そ れに対し、より単純なレトロウイルス(例えば、オンコビリナーエ)から誘導さ
れたレトロウイルスベクターは逆転写および組込みを遂行するための有糸***に
際し、核エンベロープの崩壊を必要とする。従って、これらのベクターは非***
細胞の形質導入が乏しく、それが静止状態にあるまたは有糸***後の細胞標的に
遺伝子を伝達するという有用性を制限する。しかし、HIVベクターは厄介な安
全性の問題を提起する(エマーマン(Emerman)(1996)Nature Biotechnol
ogy 14、943)。
供する;しかし、これらのウイルスについてはあまり知られていない。非霊長類
レンチウイルスの生物学は霊長類レンチウイルス(例えば、HIV−1、HIV
−2およびSIV)に比べあまり調べられていないが、それらはレンチウイルス
の比較生物学にとっても興味があり、またより安全なレンチウイルスベクターの
有力な起源としても興味がある。HIVベースのレトロウイルスベクターは最近
治療用遺伝子伝達体として有望であることが示されているが、その理由は永続的
に感染する非***細胞のレンチレトロウイルス−特異性を示すからである(ナル
ディニ(Naldini)ら(1996)Science 272、263〜267参照)。そ れに対し、より単純なレトロウイルス(例えば、オンコビリナーエ)から誘導さ
れたレトロウイルスベクターは逆転写および組込みを遂行するための有糸***に
際し、核エンベロープの崩壊を必要とする。従って、これらのベクターは非***
細胞の形質導入が乏しく、それが静止状態にあるまたは有糸***後の細胞標的に
遺伝子を伝達するという有用性を制限する。しかし、HIVベクターは厄介な安
全性の問題を提起する(エマーマン(Emerman)(1996)Nature Biotechnol
ogy 14、943)。
【0006】 非霊長類レンチウイルスは、有蹄類レンチウイルス、例えば、ビンサ/マエデ
ィ・ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAVE)、ウマ感染性貧血性ウイル
ス(EIAV)、およびウシ免疫不全ウイルス(BIV)などを包含する。これ
らのレンチウイルスは有蹄動物(有蹄類)のみに感染し、一般には有蹄類の特定
種にのみ感染する。
ィ・ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAVE)、ウマ感染性貧血性ウイル
ス(EIAV)、およびウシ免疫不全ウイルス(BIV)などを包含する。これ
らのレンチウイルスは有蹄動物(有蹄類)のみに感染し、一般には有蹄類の特定
種にのみ感染する。
【0007】 非霊長類レンチウイルスはまた、ネコ科の免疫不全ウイルス(FIV)をも包
含するが(クレメンツおよびジンク(Clements & Zink)(1996)Clinical
Microbiology Review 9、100〜117)、これはネコ科にのみ感染する。数
種のFIVが同定されている。
含するが(クレメンツおよびジンク(Clements & Zink)(1996)Clinical
Microbiology Review 9、100〜117)、これはネコ科にのみ感染する。数
種のFIVが同定されている。
【0008】 非霊長類(例えば、ネコ科および有蹄類)レンチウイルスは霊長類のレンチウ
イルスベクターよりも安全な代替物を提供するが、その使用については、その分
子的性質についての知識、特に非宿主動物細胞への適用可能性についての知識が
比較的欠如しているために複雑である(エマーマン、上記)。すべてのレンチウ
イルスが高度に制限された指向性を示す(クレメンツおよびジンク(Clements &
Zink)(1996)上記;およびハース(Haase)(1994)Annals of the
New York Academy of Sciences 724、75〜86参照)。
イルスベクターよりも安全な代替物を提供するが、その使用については、その分
子的性質についての知識、特に非宿主動物細胞への適用可能性についての知識が
比較的欠如しているために複雑である(エマーマン、上記)。すべてのレンチウ
イルスが高度に制限された指向性を示す(クレメンツおよびジンク(Clements &
Zink)(1996)上記;およびハース(Haase)(1994)Annals of the
New York Academy of Sciences 724、75〜86参照)。
【0009】 FIVは1986年、飼いネコ(フェリス・キャタス)に、またネコのみに後
天性免疫不全および神経性疾患の原因として発見された[ペダーセン(Pedersen
n)ら(1987)Science 235、790〜793(1987);エルダーお よびフィリップス(Elder & Phillips)(1993)Infectious Agents and Di
sease 2、361〜374;ペダーセン(Pedersen)(1993)「ネコ科免疫
不全ウイルス」、The Retroviridae(レビイ(Levy, J.A.)編纂、181〜22
8、プレナム・プレス、ニューヨーク、ベンディネリ(Bendinelli)ら(199
5)Clinical Microbiology Reviews 8、87〜112;およびスパーガー(Sp
arger)(1993) Veterinary Clinics of North America, Small Animal Prac
tice 23、173〜191)]。大型のネコ類では、FIVが地理的にも広く 拡散しており、偏共性であると思われる;自由徘徊性非飼育ネコ族の37種中1
8種が世界中で感染していることが知られているが、疾病に進展しているものは
ない(エルダーおよびフィリップス(1993)上記;オルムシュテッド(Olms
ted)ら(1992)Journal of Virology 66、6008〜6018;バー(B
arr)ら(1995)Journal of Virology 69、7371〜7374;クーチ ャンプ&ポンチエル(Courchamp & Pontier)(1994)「ネコ族免疫不全ウ イルス:疫学的検討」Comptes Rendus de Academie des Sciences. Serie III,
Sciences de la Vie 317、1123〜1134)。このウイルスは流行性で あり、北アメリカ、ヨーロッパおよび日本での飼いネコ母集団の2〜20%が感
染している;より高い罹病率は獣医の注意を惹くネコに見られる(ペダーセン(
1993)上記;およびクーチャンプ&ポンチエル(1994)上記)。多様な
ネコ族でのFIVの世界的流行と1960年代の日付のフェリス・キャタス血清
が同様の高陽性率を示すという観察は、FIVが飼いネコに最近入ってきたもの
ではないことを示唆している(ベンディネリ(Bendinelli)ら(1995)、上
記;オルムシュテッドら(1992)上記;クーチャンプ、エフ&ポンチエル(
1994)上記;シェルトン(Shelton)ら(1990)Journal of Acquired I
mmune Deficiency Syndromes 3、623〜630;ベンネット&スミス(Benne
tt & Smyth)(1992)British Veterinary Journal 148、399〜41 2;ブラウン(Brown)ら(1993)Journal of Zoo and Wildlife Medicine
24、357〜364;カーペンター&オ'ブライアン(Carpenter & O'Brien)
(1995)Current Opinion in Genetics and Development 5、739〜74
5)。
天性免疫不全および神経性疾患の原因として発見された[ペダーセン(Pedersen
n)ら(1987)Science 235、790〜793(1987);エルダーお よびフィリップス(Elder & Phillips)(1993)Infectious Agents and Di
sease 2、361〜374;ペダーセン(Pedersen)(1993)「ネコ科免疫
不全ウイルス」、The Retroviridae(レビイ(Levy, J.A.)編纂、181〜22
8、プレナム・プレス、ニューヨーク、ベンディネリ(Bendinelli)ら(199
5)Clinical Microbiology Reviews 8、87〜112;およびスパーガー(Sp
arger)(1993) Veterinary Clinics of North America, Small Animal Prac
tice 23、173〜191)]。大型のネコ類では、FIVが地理的にも広く 拡散しており、偏共性であると思われる;自由徘徊性非飼育ネコ族の37種中1
8種が世界中で感染していることが知られているが、疾病に進展しているものは
ない(エルダーおよびフィリップス(1993)上記;オルムシュテッド(Olms
ted)ら(1992)Journal of Virology 66、6008〜6018;バー(B
arr)ら(1995)Journal of Virology 69、7371〜7374;クーチ ャンプ&ポンチエル(Courchamp & Pontier)(1994)「ネコ族免疫不全ウ イルス:疫学的検討」Comptes Rendus de Academie des Sciences. Serie III,
Sciences de la Vie 317、1123〜1134)。このウイルスは流行性で あり、北アメリカ、ヨーロッパおよび日本での飼いネコ母集団の2〜20%が感
染している;より高い罹病率は獣医の注意を惹くネコに見られる(ペダーセン(
1993)上記;およびクーチャンプ&ポンチエル(1994)上記)。多様な
ネコ族でのFIVの世界的流行と1960年代の日付のフェリス・キャタス血清
が同様の高陽性率を示すという観察は、FIVが飼いネコに最近入ってきたもの
ではないことを示唆している(ベンディネリ(Bendinelli)ら(1995)、上
記;オルムシュテッドら(1992)上記;クーチャンプ、エフ&ポンチエル(
1994)上記;シェルトン(Shelton)ら(1990)Journal of Acquired I
mmune Deficiency Syndromes 3、623〜630;ベンネット&スミス(Benne
tt & Smyth)(1992)British Veterinary Journal 148、399〜41 2;ブラウン(Brown)ら(1993)Journal of Zoo and Wildlife Medicine
24、357〜364;カーペンター&オ'ブライアン(Carpenter & O'Brien)
(1995)Current Opinion in Genetics and Development 5、739〜74
5)。
【0010】 非野外のFIV感染については証拠がない。有蹄類またはネコ科レンチウイル
スのいずれかによる交差感染は、非有蹄類においてもまた非野外種においても観
察されていない。HIVおよびFIVはその伝染様式が顕著に異なっているが、
それはFIVが原則として噛み付きにより拡散するからである(ペダーセン(1
993)上記)。ヒトは飼いネコの噛み付きによりしばしばFIVに曝されるに
もかかわらず、この疑いもなく有効な接種手段はヒトのセロコンバーションに至
らず、あるいはヒトの感染または疾患の他の検出し得る証拠にも至らない(ペダ
ーセン(1993)上記;ベンディネリら(1995)上記;スパーガー(Spar
ger)(1993)上記;クーチャンプ、エフ&ポンチエル(1994)上記;ブ ラウンら(1993))。
スのいずれかによる交差感染は、非有蹄類においてもまた非野外種においても観
察されていない。HIVおよびFIVはその伝染様式が顕著に異なっているが、
それはFIVが原則として噛み付きにより拡散するからである(ペダーセン(1
993)上記)。ヒトは飼いネコの噛み付きによりしばしばFIVに曝されるに
もかかわらず、この疑いもなく有効な接種手段はヒトのセロコンバーションに至
らず、あるいはヒトの感染または疾患の他の検出し得る証拠にも至らない(ペダ
ーセン(1993)上記;ベンディネリら(1995)上記;スパーガー(Spar
ger)(1993)上記;クーチャンプ、エフ&ポンチエル(1994)上記;ブ ラウンら(1993))。
【0011】 FIVはまた、霊長類レンチウイルスとは遺伝子的にも抗原的にも離れている
。ヌクレオチド配列を比較すると、HIVおよびSIVに対してよりも有蹄類レ
ンチウイルスにより密接な関連性を示す(オルムシュテッド(Olmsted)ら(1 989)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United St
ates of America 86、2448〜2452(オルムシュテッドら(1989)
A);オルムシュテッドら(1989)Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 86、8088〜8092(オ
ルムシュテッドら(1989)B)。FIVコアタンパク質が数種の有蹄類レン
チウイルスと血清学的に交差反応することが観察されているが、HIV−1、H
IV−2またはSIVに対しては何も起こらない(エルダーおよびフィリップス
(Elder, J.H. & Phillips(1993)上記;ベンネットおよびスミス(Bennet
t, M. & Smyth)(1992)上記;オルムシュテッドら(1989)A、上記 ;タルボット(Talbott)ら(1989)Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 86、5743〜5747; 宮沢(Miyazawa)ら(1994)Archives of Virology 134、221〜23 4)。このウイルスはdUTPアーゼをコードする;この5番目のポル−コード
酵素活性は非霊長類レンチウイルスにのみ見出される特徴である(ワガマン(Wa
gaman)ら(1993)Virology 196、451〜457)。系統発生学的およ
び疫学的データはFIVと野生ネコ類の先祖間の古代適応のエピソード並びに他
のレンチウイルス先祖からの早期進化の多様性を示唆している(オルムシュテッ
ド(Olmsted、R.A.)ら(1992)上記;ブラウンら(1993)上記;カー ペンター&オ'ブライアン(Carpenter & O'Brien)(1995)タルボット(Ta
lbott)ら(1989)上記)。
。ヌクレオチド配列を比較すると、HIVおよびSIVに対してよりも有蹄類レ
ンチウイルスにより密接な関連性を示す(オルムシュテッド(Olmsted)ら(1 989)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United St
ates of America 86、2448〜2452(オルムシュテッドら(1989)
A);オルムシュテッドら(1989)Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 86、8088〜8092(オ
ルムシュテッドら(1989)B)。FIVコアタンパク質が数種の有蹄類レン
チウイルスと血清学的に交差反応することが観察されているが、HIV−1、H
IV−2またはSIVに対しては何も起こらない(エルダーおよびフィリップス
(Elder, J.H. & Phillips(1993)上記;ベンネットおよびスミス(Bennet
t, M. & Smyth)(1992)上記;オルムシュテッドら(1989)A、上記 ;タルボット(Talbott)ら(1989)Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 86、5743〜5747; 宮沢(Miyazawa)ら(1994)Archives of Virology 134、221〜23 4)。このウイルスはdUTPアーゼをコードする;この5番目のポル−コード
酵素活性は非霊長類レンチウイルスにのみ見出される特徴である(ワガマン(Wa
gaman)ら(1993)Virology 196、451〜457)。系統発生学的およ
び疫学的データはFIVと野生ネコ類の先祖間の古代適応のエピソード並びに他
のレンチウイルス先祖からの早期進化の多様性を示唆している(オルムシュテッ
ド(Olmsted、R.A.)ら(1992)上記;ブラウンら(1993)上記;カー ペンター&オ'ブライアン(Carpenter & O'Brien)(1995)タルボット(Ta
lbott)ら(1989)上記)。
【0012】 細胞レベルでは、非霊長類レンチウイルス・ライフサイクルの増殖期および感
染期両方に対するヒト細胞での制限もまた明瞭である(朝永ら(1994)Jour
nal of Veterinary Medical Science 56、199〜201;宮沢ら(1992
)Journal of General Virology 73、1543〜1546;トーマーおよびシ
ガーダルドッター(Thormar & Sigurdardottir)(1962)Acta Pathol Micr
obiol Scandinav 55、180〜186;ギルデン(Gilden)ら(1981)Ar
chives of Virology 67、181〜185;カーレイおよびダルジール(Carey
& Dalziel)(1993)British Veterinary Journal 149、437〜45 4)。これらの妨害について、非霊長類レンチウイルスベースのベクターをヒト
に応用するための開発を妨げるような基本的問題は十分に理解されていない。
染期両方に対するヒト細胞での制限もまた明瞭である(朝永ら(1994)Jour
nal of Veterinary Medical Science 56、199〜201;宮沢ら(1992
)Journal of General Virology 73、1543〜1546;トーマーおよびシ
ガーダルドッター(Thormar & Sigurdardottir)(1962)Acta Pathol Micr
obiol Scandinav 55、180〜186;ギルデン(Gilden)ら(1981)Ar
chives of Virology 67、181〜185;カーレイおよびダルジール(Carey
& Dalziel)(1993)British Veterinary Journal 149、437〜45 4)。これらの妨害について、非霊長類レンチウイルスベースのベクターをヒト
に応用するための開発を妨げるような基本的問題は十分に理解されていない。
【0013】 霊長類のCD4分子は唯一既知のレンチウイルスレセプターである(例えば、
HIVに対して)。一次レセプターも二次レセプターも非霊長類レンチウイルス
のいずれについてもこれまで決定されていない。CD9のネコ同族体に結合する
抗体が組織培養においてFIVの感染を阻害する(ウイレット(Willett)(1 994)Immunology 81、228〜233)が、引続き行われた研究がCD9 もCD4のネコ同族体もFIVレセプターではないことを確立している(ウイレ
ットら(1997)Journal of General Virology 78、611〜618)。報
告されているヒト細胞でのFIV発現に対する障害は、例えば、Rev/RRE
調節軸などのコアウイルス機能が貧弱なことであり(朝永(Tomonaga、K.)ら(
1994)上記;シモンら(1995)Journal of Virology 69、4166〜
172)、長鎖末端繰返し(LTR)のプロモーター活性が貧弱なことである(
宮沢ら(1992)上記;スパーガー(Sparger)ら(1992)Virology 18
7、165〜177)。これらの障害のために、非宿主動物細胞における非霊長
類レンチウイルスRev−依存性構造タンパク質の発現研究は非常に限られたも
のでしかない。
HIVに対して)。一次レセプターも二次レセプターも非霊長類レンチウイルス
のいずれについてもこれまで決定されていない。CD9のネコ同族体に結合する
抗体が組織培養においてFIVの感染を阻害する(ウイレット(Willett)(1 994)Immunology 81、228〜233)が、引続き行われた研究がCD9 もCD4のネコ同族体もFIVレセプターではないことを確立している(ウイレ
ットら(1997)Journal of General Virology 78、611〜618)。報
告されているヒト細胞でのFIV発現に対する障害は、例えば、Rev/RRE
調節軸などのコアウイルス機能が貧弱なことであり(朝永(Tomonaga、K.)ら(
1994)上記;シモンら(1995)Journal of Virology 69、4166〜
172)、長鎖末端繰返し(LTR)のプロモーター活性が貧弱なことである(
宮沢ら(1992)上記;スパーガー(Sparger)ら(1992)Virology 18
7、165〜177)。これらの障害のために、非宿主動物細胞における非霊長
類レンチウイルスRev−依存性構造タンパク質の発現研究は非常に限られたも
のでしかない。
【0014】 限られた指向性の問題に加えて、臨床使用のために有蹄類またはネコの細胞に
おいて非霊長類レンチウイルスベクターを産生させることは、内在性レトロウイ
ルスまたは他の潜在的な病原体の伝染という危険性が生じる。この危険性は多様
な動物起源の細胞について文献となっている(ストイおよびコフィン(Stoye &
Coffin)(1995)Nature Medicine 1、1100;バン・デル・クイル(v
an der Kuyl)ら(1997)Journal of Virology 71、3666〜3676 )。ネコの細胞はまた複製感応性タイプCの内在性レトロウイルス(RD114 )の多数コピーを含んでおり、これがヒト細胞中で複製して、他のレトロウイル
スと表現型混合し、そしてヌクレオチド配列レベルで霊長類レトロウイルスに関
係する(ヒヒ内在性ウイルス)(マック・アリスター(McAllister)ら(197
2)Nature New Biol 235、3〜6)。さらに、殆どの他のC型哺乳類レトロ
ウイルスと違って、RD114はヒト血清補体による不活性化に抵抗する(武内
ら(1994)Journal of Virology 68、8001〜8007)。ネコの細胞
はまた他の未知な潜在的病原性感染作因を含んでいることがある。
おいて非霊長類レンチウイルスベクターを産生させることは、内在性レトロウイ
ルスまたは他の潜在的な病原体の伝染という危険性が生じる。この危険性は多様
な動物起源の細胞について文献となっている(ストイおよびコフィン(Stoye &
Coffin)(1995)Nature Medicine 1、1100;バン・デル・クイル(v
an der Kuyl)ら(1997)Journal of Virology 71、3666〜3676 )。ネコの細胞はまた複製感応性タイプCの内在性レトロウイルス(RD114 )の多数コピーを含んでおり、これがヒト細胞中で複製して、他のレトロウイル
スと表現型混合し、そしてヌクレオチド配列レベルで霊長類レトロウイルスに関
係する(ヒヒ内在性ウイルス)(マック・アリスター(McAllister)ら(197
2)Nature New Biol 235、3〜6)。さらに、殆どの他のC型哺乳類レトロ
ウイルスと違って、RD114はヒト血清補体による不活性化に抵抗する(武内
ら(1994)Journal of Virology 68、8001〜8007)。ネコの細胞
はまた他の未知な潜在的病原性感染作因を含んでいることがある。
【0015】 従って、より安定なレトロウイルスベクター、例えば、遺伝子送達、癌治療、
ウイルスインヒビター等々のための、非***細胞、例えば、造血幹細胞およびニ
ューロン細胞に対するベクター、および非霊長類レトロウイルスベクターをパッ
ケージング得るヒトベクターパッケージング細胞に対するベクターについて、技
術上の必要性がある。本発明はこれらの特徴および他の特徴を提供する。
ウイルスインヒビター等々のための、非***細胞、例えば、造血幹細胞およびニ
ューロン細胞に対するベクター、および非霊長類レトロウイルスベクターをパッ
ケージング得るヒトベクターパッケージング細胞に対するベクターについて、技
術上の必要性がある。本発明はこれらの特徴および他の特徴を提供する。
【0016】 (発明の要約) 本発明は、ヒト細胞中で活性な非霊長類レトロウイルスベクターの発見と設計
に基づき、レトロウイルスパッケージングシステム、ベクター、パッケージャブ
ル核酸および他の特徴につき記載する。該ベクターは、FIVなど非霊長類レト
ロウイルスによりパッケージング可能なものであり、非***ヒト細胞を形質導入
する。該パッケージングシステムはベクターパッケージング成分をヒト細胞中で
トランスに産生し、それによって新しい病原体がヒトの集団に入り込む可能性を
回避する。これらのベクターおよびパッケージング成分は、一般の遺伝子伝達ベ
クターの構築およびヒト遺伝子治療にとって有用である。
に基づき、レトロウイルスパッケージングシステム、ベクター、パッケージャブ
ル核酸および他の特徴につき記載する。該ベクターは、FIVなど非霊長類レト
ロウイルスによりパッケージング可能なものであり、非***ヒト細胞を形質導入
する。該パッケージングシステムはベクターパッケージング成分をヒト細胞中で
トランスに産生し、それによって新しい病原体がヒトの集団に入り込む可能性を
回避する。これらのベクターおよびパッケージング成分は、一般の遺伝子伝達ベ
クターの構築およびヒト遺伝子治療にとって有用である。
【0017】 本発明により提供される一群のレトロウイルスベクターは、非霊長類レトロウ
イルス、例えば、FIVまたは有蹄類レトロウイルスなどにより詰込まれたベク
ター核酸を有する。このように、該ベクターはパッケージャブル核酸をもち、そ
の核酸が、選択したレトロウイルス(例、FIV)によりコードされたウイルス
パッケージングタンパク質により認識され、詰込まれる。該ベクター核酸はまた
治療遺伝子などの異種的標的核酸を含む。このベクター核酸には病原性はない、
その理由はこの核酸がウイルス複製に必要な1個またはそれ以上の遺伝子を欠失
しているか、または遺伝子に欠陥があるからである。しかし、その欠失または欠
陥成分(例えば、レトロウイルスタンパク質)がトランスに(例えば、パッケー
ジング細胞に)供給されるとき、該ベクター核酸はレトロウイルスのウイルス粒
子に詰込まれる。ベクターはベクターパッケージングまたは複製要素、例えば、
ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、逆転写酵素活性、等々を任意に包含する。
イルス、例えば、FIVまたは有蹄類レトロウイルスなどにより詰込まれたベク
ター核酸を有する。このように、該ベクターはパッケージャブル核酸をもち、そ
の核酸が、選択したレトロウイルス(例、FIV)によりコードされたウイルス
パッケージングタンパク質により認識され、詰込まれる。該ベクター核酸はまた
治療遺伝子などの異種的標的核酸を含む。このベクター核酸には病原性はない、
その理由はこの核酸がウイルス複製に必要な1個またはそれ以上の遺伝子を欠失
しているか、または遺伝子に欠陥があるからである。しかし、その欠失または欠
陥成分(例えば、レトロウイルスタンパク質)がトランスに(例えば、パッケー
ジング細胞に)供給されるとき、該ベクター核酸はレトロウイルスのウイルス粒
子に詰込まれる。ベクターはベクターパッケージングまたは複製要素、例えば、
ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、逆転写酵素活性、等々を任意に包含する。
【0018】 本発明ベクターの好適な一群の標的はヒト細胞、特に最終的に分化した造血系
細胞およびニューロンなどの非***細胞である(細胞は試験管内または生体内の
ものである)。従って、ヒト細胞の形質導入および感染をもたらす形質は好まし
い形質となる。例えば、ベクター表面上に水疱性口内炎(VSV)糖タンパク質
を取込ませる態様は、多様なヒト細胞にベクターが侵入するのを容易にし、好ま
しい。同様に、ヒト細胞中でベクターがコードする1個またはそれ以上の核酸の
発現を誘導するプロモーター(例えば、CMVプロモーターまたはt−RNAプ
ロモーター)を導入することは、核酸の産生にとって、また任意にはヒト標的細
胞中でのベクターがコードするタンパク質の産生にとって望ましい。
細胞およびニューロンなどの非***細胞である(細胞は試験管内または生体内の
ものである)。従って、ヒト細胞の形質導入および感染をもたらす形質は好まし
い形質となる。例えば、ベクター表面上に水疱性口内炎(VSV)糖タンパク質
を取込ませる態様は、多様なヒト細胞にベクターが侵入するのを容易にし、好ま
しい。同様に、ヒト細胞中でベクターがコードする1個またはそれ以上の核酸の
発現を誘導するプロモーター(例えば、CMVプロモーターまたはt−RNAプ
ロモーター)を導入することは、核酸の産生にとって、また任意にはヒト標的細
胞中でのベクターがコードするタンパク質の産生にとって望ましい。
【0019】 ベクター核酸をトランスにパッケージングするウイルス成分がコードされてい
るパッケージングプラスミドもまた提供される。該パッケージングプラスミドは
ヒト細胞(例えば、ベクターパッケージングに使用するヒト細胞)において活性
なプロモーターを含む。このプロモーターは、ベクター核酸、例えば、FIVま
たは他の非霊長類レンチウイルスパッケージング核酸などをパッケージングする
のに必要な少なくとも1個のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結して
いる。該パッケージングプラスミドはFIVパッケージング部位を欠如している
。
るパッケージングプラスミドもまた提供される。該パッケージングプラスミドは
ヒト細胞(例えば、ベクターパッケージングに使用するヒト細胞)において活性
なプロモーターを含む。このプロモーターは、ベクター核酸、例えば、FIVま
たは他の非霊長類レンチウイルスパッケージング核酸などをパッケージングする
のに必要な少なくとも1個のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結して
いる。該パッケージングプラスミドはFIVパッケージング部位を欠如している
。
【0020】 好適な一態様において、該パッケージングプラスミドはU3プロモーター欠失
を有するFIV LTRを、一般的にはその欠失部位への異種的プロモーター挿 入部とともにもつ。この配列は内在性FIV LTRプロモーター機能を除き、 異種的プロモーターによる調節を可能とするようになる。
を有するFIV LTRを、一般的にはその欠失部位への異種的プロモーター挿 入部とともにもつ。この配列は内在性FIV LTRプロモーター機能を除き、 異種的プロモーターによる調節を可能とするようになる。
【0021】 非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸をパッケージングするレトロウ
イルスパッケージング細胞は、上記のパッケージングプラスミドにより提供され
るということが認識されるだろう。特に、該細胞は、好ましくはヒトの細胞であ
るが、必要なウイルスパッケージング要素(例えば、GagおよびEnvタンパ
ク質)をコードするパッケージングプラスミドを含んでなる。これらのパッケー
ジング要素はパッケージャブルベクター核酸をトランスにパッケージングするの
に使用される。安全性の理由から、該細胞は個々のパッケージングプラスミドを
含むことが時として好ましく、その各々が異なるパッケージングタンパク質をコ
ードする。例えば、パッケージング細胞は別個のレトロウイルスパッケージング
タンパク質(例えば、FIV GagおよびEnvタンパク質)をコードする個 々のパッケージングプラスミドを含む。該細胞はさらにVSVエンベロープ糖タ
ンパク質などのシュードタイプ構成要素をコードするプラスミドを含んでなり、
その詰込まれたプラスミドの宿主領域を拡大する。シュードタイプ構成要素は他
の非霊長類レトロウイルス要素と同じプラスミド上、あるいは個々のプラスミド
上にコードすることができる。いずれにしても、所望のパッケージング要素は、
ヒト細胞において該組成の発現を誘導する適切な調節要素の制御下にある。パッ
ケージャブル核酸(例えば、FIVパッケージング部位および異種的核酸を含む
)が本発明の細胞に任意に(安定してまたは一過性に)形質導入される。
イルスパッケージング細胞は、上記のパッケージングプラスミドにより提供され
るということが認識されるだろう。特に、該細胞は、好ましくはヒトの細胞であ
るが、必要なウイルスパッケージング要素(例えば、GagおよびEnvタンパ
ク質)をコードするパッケージングプラスミドを含んでなる。これらのパッケー
ジング要素はパッケージャブルベクター核酸をトランスにパッケージングするの
に使用される。安全性の理由から、該細胞は個々のパッケージングプラスミドを
含むことが時として好ましく、その各々が異なるパッケージングタンパク質をコ
ードする。例えば、パッケージング細胞は別個のレトロウイルスパッケージング
タンパク質(例えば、FIV GagおよびEnvタンパク質)をコードする個 々のパッケージングプラスミドを含む。該細胞はさらにVSVエンベロープ糖タ
ンパク質などのシュードタイプ構成要素をコードするプラスミドを含んでなり、
その詰込まれたプラスミドの宿主領域を拡大する。シュードタイプ構成要素は他
の非霊長類レトロウイルス要素と同じプラスミド上、あるいは個々のプラスミド
上にコードすることができる。いずれにしても、所望のパッケージング要素は、
ヒト細胞において該組成の発現を誘導する適切な調節要素の制御下にある。パッ
ケージャブル核酸(例えば、FIVパッケージング部位および異種的核酸を含む
)が本発明の細胞に任意に(安定してまたは一過性に)形質導入される。
【0022】 (定義) 本発明のために、以下の用語を次のように定義する。
【0023】 「ベクター」とは、細胞を形質導入、形質転換または感染させ、それによって
細胞が、ベクターコード核酸を発現し、そして任意には該細胞にとって本来的で
あるタンパク質以外のタンパク質を発現させるか、または細胞にとって本来的で
はない様式で発現させる組成である。ベクターは該細胞が発現すべき核酸(通常
はRNAまたはDNA)を含んでいる。ベクターは、任意には、細胞への核酸侵
入達成を介助する物質、例えば、レトロウイルス粒子、リポソーム、タンパク質
コーティングなどを含む。
細胞が、ベクターコード核酸を発現し、そして任意には該細胞にとって本来的で
あるタンパク質以外のタンパク質を発現させるか、または細胞にとって本来的で
はない様式で発現させる組成である。ベクターは該細胞が発現すべき核酸(通常
はRNAまたはDNA)を含んでいる。ベクターは、任意には、細胞への核酸侵
入達成を介助する物質、例えば、レトロウイルス粒子、リポソーム、タンパク質
コーティングなどを含む。
【0024】 「非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸」とは有蹄類レンチウイルス
またはFIVレンチウイルスに由来する機能的ウイルスパッケージング部位をも
つ核酸である。このパッケージング部位をもつ核酸は、対応する野生型ウイルス
がトランスに供給したウイルス成分によりウイルス粒子に取込ませることが可能
であり、野生型ウイルス(または野生型ウイルスから誘導される適切なパッケー
ジング成分)によりパッケージングされる。
またはFIVレンチウイルスに由来する機能的ウイルスパッケージング部位をも
つ核酸である。このパッケージング部位をもつ核酸は、対応する野生型ウイルス
がトランスに供給したウイルス成分によりウイルス粒子に取込ませることが可能
であり、野生型ウイルス(または野生型ウイルスから誘導される適切なパッケー
ジング成分)によりパッケージングされる。
【0025】 非霊長類レンチウイルスベクター核酸の「自己パッケージングをブロックする
パッケージング能欠損」とは、細胞との関係で、ベクター核酸をウイルス粒子に
パッケージングするのに必要な少なくとも1種のウイルスタンパク質を産生する
ことができない核酸の能力である。例えば、GagまたはEnvタンパク質がレ
ンチウイルスベクターによりコードされない場合、ベクター核酸を細胞にパッケ
ージングする前に該タンパク質をトランスに供給しなければならない。そのウイ
ルス蛋白質産生能の欠損は、関連する遺伝子の翻訳領域もしくは非翻訳領域(例
えば、プロモーター)での、ウイルスクローンからのウイルスパッケージングに
必要な遺伝子の欠失または突然変異である。ベクター核酸は、それがFIVなど
の非霊長類レンチウイルスベクターが認識するウイルスパッケージング部位をコ
ードする場合、トランスに救済可能である。
パッケージング能欠損」とは、細胞との関係で、ベクター核酸をウイルス粒子に
パッケージングするのに必要な少なくとも1種のウイルスタンパク質を産生する
ことができない核酸の能力である。例えば、GagまたはEnvタンパク質がレ
ンチウイルスベクターによりコードされない場合、ベクター核酸を細胞にパッケ
ージングする前に該タンパク質をトランスに供給しなければならない。そのウイ
ルス蛋白質産生能の欠損は、関連する遺伝子の翻訳領域もしくは非翻訳領域(例
えば、プロモーター)での、ウイルスクローンからのウイルスパッケージングに
必要な遺伝子の欠失または突然変異である。ベクター核酸は、それがFIVなど
の非霊長類レンチウイルスベクターが認識するウイルスパッケージング部位をコ
ードする場合、トランスに救済可能である。
【0026】 「パッケージングプラスミド」とはパッケージングプラスミドにより形質導入
された細胞によるウイルス粒子の産生に必要な成分をコードするプラスミドであ
る。パッケージングプラスミドは、ウイルス粒子の産生に必要なすべての成分を
任意にコードするか、あるいはパッケージングに必要な成分のサブセットを任意
に包含する。例えば、好適な一態様において、パッケージング細胞は1以上のパ
ッケージングプラスミドで形質転換され、その各々が非霊長類レンチウイルス粒
子の産生において相補的な役割をもつ(例えば、FIVに対して)。パッケージ
ングプラスミドは機能的なパッケージング部位、すなわち、プラスミドがコード
する非霊長類レンチウイル成分により認識されるパッケージング部位を欠失し、
該プラスミドを自己パッケージングし得ないものとする。
された細胞によるウイルス粒子の産生に必要な成分をコードするプラスミドであ
る。パッケージングプラスミドは、ウイルス粒子の産生に必要なすべての成分を
任意にコードするか、あるいはパッケージングに必要な成分のサブセットを任意
に包含する。例えば、好適な一態様において、パッケージング細胞は1以上のパ
ッケージングプラスミドで形質転換され、その各々が非霊長類レンチウイルス粒
子の産生において相補的な役割をもつ(例えば、FIVに対して)。パッケージ
ングプラスミドは機能的なパッケージング部位、すなわち、プラスミドがコード
する非霊長類レンチウイル成分により認識されるパッケージング部位を欠失し、
該プラスミドを自己パッケージングし得ないものとする。
【0027】 2種(またはそれ以上)の非霊長類レンチウイルベースパッケージングプラス
ミドは、それらがウイルスパッケージングに必要な機能のすべてをコードする場
合、また、個々それぞれがパッケージングに必要な機能のすべてをコードしてい
ない場合、「相補的」である。このように、例えば、2つのプラスミドが単一の
細胞を形質導入し、そしてそれらが一緒になってFIVパッケージング粒子の産
生についての情報をコードする場合、2つのベクターは「相補的」である。相補
的プラスミドの使用は、パッケージングプラスミドの形質転換により調製された
パッケージング細胞の安全性を増す故に好ましいが、それは組換えにより感染性
ウイルスを産生する可能性が低下したことによる。
ミドは、それらがウイルスパッケージングに必要な機能のすべてをコードする場
合、また、個々それぞれがパッケージングに必要な機能のすべてをコードしてい
ない場合、「相補的」である。このように、例えば、2つのプラスミドが単一の
細胞を形質導入し、そしてそれらが一緒になってFIVパッケージング粒子の産
生についての情報をコードする場合、2つのベクターは「相補的」である。相補
的プラスミドの使用は、パッケージングプラスミドの形質転換により調製された
パッケージング細胞の安全性を増す故に好ましいが、それは組換えにより感染性
ウイルスを産生する可能性が低下したことによる。
【0028】 パッケージングプラスミドはウイルス粒子の成分をコードする。該粒子は対応
するパッケージング部位をもつ標的RNAをパッケージングすることができる。
「高効率パッケージングプラスミド」はパッケージング部位をもつ標的RNAを
パッケージングしており、その結果パッケージング細胞は一過性にまたは安定に
パッケージングプラスミドで形質導入され、標的パッケージャブル核酸、標的パ
ッケージャブルベクターRNAにより、その力価が1ml当たり少なくとも約1
05または106ないし約107または108形質導入単位またはさらにそれ以上で
形質導入される。生じる正確な力価はパッケージャブル核酸の性質および選択し
たパッケージング細胞の性質により変化する。より高い感染性はパッケージング
ベクターが完全なパッケージング部位をもつときに一般に得られる。
するパッケージング部位をもつ標的RNAをパッケージングすることができる。
「高効率パッケージングプラスミド」はパッケージング部位をもつ標的RNAを
パッケージングしており、その結果パッケージング細胞は一過性にまたは安定に
パッケージングプラスミドで形質導入され、標的パッケージャブル核酸、標的パ
ッケージャブルベクターRNAにより、その力価が1ml当たり少なくとも約1
05または106ないし約107または108形質導入単位またはさらにそれ以上で
形質導入される。生じる正確な力価はパッケージャブル核酸の性質および選択し
たパッケージング細胞の性質により変化する。より高い感染性はパッケージング
ベクターが完全なパッケージング部位をもつときに一般に得られる。
【0029】 「インヒビター」または「ウイルスインヒビター」とは、最も典型的には、活
性な抗ウイルス作因をコードする核酸であるか、またはそれ自体抗ウイルス作因
である。このよに、一態様において、該インヒビターは「直接インヒビター」で
ある、すなわち、該インヒビターはウイルス成分に直接作用し、細胞中のウイル
スの感染、複製、組込みまたは増殖を阻害する。例えば、特に好ましい一態様に
おいて、該インヒビターはHIV転写物を切断するトランス−活性リボザイムを
含んでなる。この立体配置において、該インヒビターは、典型的には触媒ヌクレ
アーゼ活性をもつRNA分子である。他の態様において、該インヒビターは「間
接的インヒビター」である、すなわち、該インヒビターは直接インヒビターをコ
ードする。インヒビターは、もしそれが直接インヒビターに対応するセンスまた
はアンチセンス・コーディングまたは相補的核酸を含むならば、活性リボザイム
、タンパク質、RNA分子誘引物などの直接インヒビターを「コードする」。慣
習により、リボザイムなどの直接インヒビターRNAは一般にその対応するDN
A配列として掲載される。これは対応する活性RNAの視覚化を単純化するため
になされ、U残基が置換わったT残基をもつ所定の配列に等価である。
性な抗ウイルス作因をコードする核酸であるか、またはそれ自体抗ウイルス作因
である。このよに、一態様において、該インヒビターは「直接インヒビター」で
ある、すなわち、該インヒビターはウイルス成分に直接作用し、細胞中のウイル
スの感染、複製、組込みまたは増殖を阻害する。例えば、特に好ましい一態様に
おいて、該インヒビターはHIV転写物を切断するトランス−活性リボザイムを
含んでなる。この立体配置において、該インヒビターは、典型的には触媒ヌクレ
アーゼ活性をもつRNA分子である。他の態様において、該インヒビターは「間
接的インヒビター」である、すなわち、該インヒビターは直接インヒビターをコ
ードする。インヒビターは、もしそれが直接インヒビターに対応するセンスまた
はアンチセンス・コーディングまたは相補的核酸を含むならば、活性リボザイム
、タンパク質、RNA分子誘引物などの直接インヒビターを「コードする」。慣
習により、リボザイムなどの直接インヒビターRNAは一般にその対応するDN
A配列として掲載される。これは対応する活性RNAの視覚化を単純化するため
になされ、U残基が置換わったT残基をもつ所定の配列に等価である。
【0030】 「ウイルス阻害」とは細胞内でのウイルスの感染、増殖、組込み、または複製
を阻害する成分の能力をいう。阻害は一般に細胞のウイルス負荷(すなわち、細
胞、細胞培養物または生体に存在するウイルスおよび/またはウイルスタンパク
質または核酸の数)の変化をモニターすることにより、または感染にたいする細
胞、細胞培養物または生体による抵抗をモニターすることにより測定する。
を阻害する成分の能力をいう。阻害は一般に細胞のウイルス負荷(すなわち、細
胞、細胞培養物または生体に存在するウイルスおよび/またはウイルスタンパク
質または核酸の数)の変化をモニターすることにより、または感染にたいする細
胞、細胞培養物または生体による抵抗をモニターすることにより測定する。
【0031】 「プロモーター」とは核酸の転写を誘導する一連の核酸制御配列である。本明
細書にて用いる場合、プロモーターは転写の開始部位に近い必要核酸配列であり
、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATA要素である。プロモ
ーターはまた、任意には、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素をも包含す
るが、これらは転写開始部位から数千塩基対離れて位置している。
細書にて用いる場合、プロモーターは転写の開始部位に近い必要核酸配列であり
、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATA要素である。プロモ
ーターはまた、任意には、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素をも包含す
るが、これらは転写開始部位から数千塩基対離れて位置している。
【0032】 「構成」プロモーターは殆どの環境的および発生的条件下で活性なプロモータ
ーである。「誘導し得る」プロモーターとは環境的および発生的調節下にあるプ
ロモーターである。
ーである。「誘導し得る」プロモーターとは環境的および発生的調節下にあるプ
ロモーターである。
【0033】 用語「単離した」または「生物学的に純粋な」とは、通常その自然の状態で見
出されたときには混ざっている成分から実質的にまたは本質的に遊離している物
質をいう。
出されたときには混ざっている成分から実質的にまたは本質的に遊離している物
質をいう。
【0034】 用語「異種的」とは、核酸の部分を参照して使用する場合、該核酸が自然界で
は互いにそのような関係では存在し得ない2つ以上のサブシーケンスからなるこ
とをいう。例えば、該核酸は一般に組換えにより産生され、新しい機能的核酸を
造るために配列された無関係の遺伝子からの2つ以上の配列をもつものである。
例えば、一態様において、核酸は、抗ウイルスリボザイムなどの異なる遺伝子か
らのコーディング配列を発現するように配列された1遺伝子からのプロモーター
を有する。このように、リボザイムコーディング配列についていえば、プロモー
ターは異種的である。
は互いにそのような関係では存在し得ない2つ以上のサブシーケンスからなるこ
とをいう。例えば、該核酸は一般に組換えにより産生され、新しい機能的核酸を
造るために配列された無関係の遺伝子からの2つ以上の配列をもつものである。
例えば、一態様において、核酸は、抗ウイルスリボザイムなどの異なる遺伝子か
らのコーディング配列を発現するように配列された1遺伝子からのプロモーター
を有する。このように、リボザイムコーディング配列についていえば、プロモー
ターは異種的である。
【0035】 2つの核酸配列またはポリペプチド配列との関連での用語「同一である」とは
、2つの配列を最大に対応するように一列に整列させたときに同じである残基を
いう。配列同一性の割合をタンパク質またはペプチドを参照して用いるとき、同
一ではない残基の位置が同類アミノ酸置換によりしばしば異なることが認められ
るが、その場合アミノ酸残基は同様の化学的性質(例えば、電荷または疎水性)
をもつ他のアミノ酸残基に置換わり、従って分子の機能的性質を変化させない。
配列が同類置換において異なる場合、配列同一性の割合は該置換の保存的性質に
対し上方に訂正、調整することができる。この調整方法は当業者周知である。一
般には、この方法は同類置換を全体のミスマッチよりもむしろ部分的ミスマッチ
として点数を付け、それによって配列同一性の割合を上昇させる。このように、
例えば、同一アミノ酸をスコア1とし、非同類置換のスコアをゼロとした場合、
同類置換のスコアはゼロと1の間とする。同類置換の点数化は例えば、マイヤー
およびミラー(Meyers and Miller)の演算法(Computer Applic. Biol. Sci.、
4:11〜17(1988))に従い、例えば、PC/GENEプログラム(イ
ンテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、USA)により
実施する。「比較ウインドウ」とは、本明細書にて用いる場合、少なくとも約5
0の隣接位置の区分、通常約50ないし約200、より一般的には約100ない
し約150の区分をいい、その配列と同一数の隣接位置の参照配列とを、2つの
配列を最適に整列した後、比較する。比較に際しての配列の整列法は技術上周知
である。比較に際しての配列の最適整列は以下の方法により実施し得る:スミス
およびウオーターマン(Smith and Waterman)(Adv. Appln. Math. 2:482 (1981)) のローカル相同性演算法;ニードルマンおよびウンシュ(Needle
man and Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:443(1970))の相同性直線整列
演算法;パーソンおよびリップマン(Pearson and Lipman)(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:2444(1988))の類似法の検索;これらの演算法のコ ンピューター化実施(例えば、PC/遺伝子プログラムにおけるCLUSTAL
(インテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア)、GAP、
BESTFIT、FASTA、およびウイスコンシン・ジェネティックス・ソフ
トウエア・パッケージにおけるTFASTA(ジェネティックス・コンピュータ
ー・グループ(GCG)、575サイエンスドクター、マジソン、ウイスコンシ
ン、USA);CLUSTALプログラムは以下に詳しく記載されている:ヒギ
ンズおよびシャープ(Higgins and Sharp)Gene、73:237〜244(19 88)およびヒギンズおよびシャープ、CABIOS 5:151〜153(1 989);コーペット(Corpet)ら、Nucleic Acids Research 16、1088 1〜90(1988);ハン(Huang)ら、Computer Applications in the Bios
ciences 8、155〜65(1992);およびパーソン(Pearson)ら、Metho
ds in Molecular Biology 24、307〜31(1994)。直線整列はしばし
ば検査および手動整列により実施する。特定核酸配列の「保存的改変」とは同一
のまたは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または該核酸がアミノ
酸配列をコードしない場合には、実質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮
退のために、大多数の機能的に同一の核酸が所定のポリペプチドをコードする。
例えば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGAおよびAGGはすべて
アミノ酸アルギニンをコードする。このように、アルギニンが1つのコドンによ
り特定されているそれぞれの位置において、該コドンはコードされたポリペプチ
ドを変えることなく、相当する上記コドンのいずれかに変更することができる。
かかる核酸の変更は「サイレント変更」であり、これが「保存的改変」の一態様
である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列について、それぞれ可能
なサイレント変更を記載することができる。当業者は核酸の各コドン(メチオニ
ンに対する通常唯一のコドンであるAUGを除く)を標準的技法により改変して
、機能的に同一の分子を生じさせ得ることを認識するだろう。従って、ポリペプ
チドをコードする核酸の各「サイレント変更」は記載された配列に暗示されてい
る。さらに、当業者は、コードされた配列内の単一アミノ酸またはアミノ酸の僅
かな割合(一般には5%以下、より一般には1%以下)が変更、付加または欠失
を受ける個々の置換、欠失または付加が「保存的改変」であり、該変更は1つの
アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換することである、と認識するだろう。
機能的に類似のアミノ酸を示す同類置換の一覧表は技術上周知である。以下の6
つの群はそれぞれ互いにとって同類置換であるアミノ酸を含んでいる:1)アラ
ニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グ
ルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニ
ン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニ
ン(M)、バリン(V);および6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)
、トリプトファン(W)。参照:クレイトン(Creighton)(1984)Protein
s W.H. フリーマン・アンド・カンパニー。最後に、核酸分子の活性を変化させ ない配列、例えば、非機能性配列などの付加は基礎となる核酸の同類置換である
。
、2つの配列を最大に対応するように一列に整列させたときに同じである残基を
いう。配列同一性の割合をタンパク質またはペプチドを参照して用いるとき、同
一ではない残基の位置が同類アミノ酸置換によりしばしば異なることが認められ
るが、その場合アミノ酸残基は同様の化学的性質(例えば、電荷または疎水性)
をもつ他のアミノ酸残基に置換わり、従って分子の機能的性質を変化させない。
配列が同類置換において異なる場合、配列同一性の割合は該置換の保存的性質に
対し上方に訂正、調整することができる。この調整方法は当業者周知である。一
般には、この方法は同類置換を全体のミスマッチよりもむしろ部分的ミスマッチ
として点数を付け、それによって配列同一性の割合を上昇させる。このように、
例えば、同一アミノ酸をスコア1とし、非同類置換のスコアをゼロとした場合、
同類置換のスコアはゼロと1の間とする。同類置換の点数化は例えば、マイヤー
およびミラー(Meyers and Miller)の演算法(Computer Applic. Biol. Sci.、
4:11〜17(1988))に従い、例えば、PC/GENEプログラム(イ
ンテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、USA)により
実施する。「比較ウインドウ」とは、本明細書にて用いる場合、少なくとも約5
0の隣接位置の区分、通常約50ないし約200、より一般的には約100ない
し約150の区分をいい、その配列と同一数の隣接位置の参照配列とを、2つの
配列を最適に整列した後、比較する。比較に際しての配列の整列法は技術上周知
である。比較に際しての配列の最適整列は以下の方法により実施し得る:スミス
およびウオーターマン(Smith and Waterman)(Adv. Appln. Math. 2:482 (1981)) のローカル相同性演算法;ニードルマンおよびウンシュ(Needle
man and Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:443(1970))の相同性直線整列
演算法;パーソンおよびリップマン(Pearson and Lipman)(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:2444(1988))の類似法の検索;これらの演算法のコ ンピューター化実施(例えば、PC/遺伝子プログラムにおけるCLUSTAL
(インテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア)、GAP、
BESTFIT、FASTA、およびウイスコンシン・ジェネティックス・ソフ
トウエア・パッケージにおけるTFASTA(ジェネティックス・コンピュータ
ー・グループ(GCG)、575サイエンスドクター、マジソン、ウイスコンシ
ン、USA);CLUSTALプログラムは以下に詳しく記載されている:ヒギ
ンズおよびシャープ(Higgins and Sharp)Gene、73:237〜244(19 88)およびヒギンズおよびシャープ、CABIOS 5:151〜153(1 989);コーペット(Corpet)ら、Nucleic Acids Research 16、1088 1〜90(1988);ハン(Huang)ら、Computer Applications in the Bios
ciences 8、155〜65(1992);およびパーソン(Pearson)ら、Metho
ds in Molecular Biology 24、307〜31(1994)。直線整列はしばし
ば検査および手動整列により実施する。特定核酸配列の「保存的改変」とは同一
のまたは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または該核酸がアミノ
酸配列をコードしない場合には、実質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮
退のために、大多数の機能的に同一の核酸が所定のポリペプチドをコードする。
例えば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGAおよびAGGはすべて
アミノ酸アルギニンをコードする。このように、アルギニンが1つのコドンによ
り特定されているそれぞれの位置において、該コドンはコードされたポリペプチ
ドを変えることなく、相当する上記コドンのいずれかに変更することができる。
かかる核酸の変更は「サイレント変更」であり、これが「保存的改変」の一態様
である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列について、それぞれ可能
なサイレント変更を記載することができる。当業者は核酸の各コドン(メチオニ
ンに対する通常唯一のコドンであるAUGを除く)を標準的技法により改変して
、機能的に同一の分子を生じさせ得ることを認識するだろう。従って、ポリペプ
チドをコードする核酸の各「サイレント変更」は記載された配列に暗示されてい
る。さらに、当業者は、コードされた配列内の単一アミノ酸またはアミノ酸の僅
かな割合(一般には5%以下、より一般には1%以下)が変更、付加または欠失
を受ける個々の置換、欠失または付加が「保存的改変」であり、該変更は1つの
アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換することである、と認識するだろう。
機能的に類似のアミノ酸を示す同類置換の一覧表は技術上周知である。以下の6
つの群はそれぞれ互いにとって同類置換であるアミノ酸を含んでいる:1)アラ
ニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グ
ルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニ
ン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニ
ン(M)、バリン(V);および6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)
、トリプトファン(W)。参照:クレイトン(Creighton)(1984)Protein
s W.H. フリーマン・アンド・カンパニー。最後に、核酸分子の活性を変化させ ない配列、例えば、非機能性配列などの付加は基礎となる核酸の同類置換である
。
【0036】 核酸のハイブリッド形成実験、例えば、サザーンおよびノーザンハイブリッド
形成に関連する「緊縮ハイブリッド形成洗浄条件」は配列依存性であり、異なる
環境パラメーターのもとで異なっている。核酸ハイブリッド形成への広範な指針
が以下に見出される:チジュセン(Tijssen)(1993)Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Biology(生化学と分子生物学における研究
室技法)−核酸プローブでのハイブリッド形成、パートI、第2章「ハイブリッ ド形成の原理と核酸プローブアッセイの戦略概観」、エルスビアー、ニューヨー
ク。一般に、高度緊縮ハイブリッド形成洗浄条件は規定されたイオン強度および
pHで特定の配列に対して熱融点(Tm)よりも約5℃低い温度に選定される。 Tmとは標的配列の50%が完全に適合したプローブとハイブリッド形成する温 度(規定されたイオン強度およびpHの下で)である。ある種のプローブに対し
ては、Tmと同じ程度の強い条件を用いる。
形成に関連する「緊縮ハイブリッド形成洗浄条件」は配列依存性であり、異なる
環境パラメーターのもとで異なっている。核酸ハイブリッド形成への広範な指針
が以下に見出される:チジュセン(Tijssen)(1993)Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Biology(生化学と分子生物学における研究
室技法)−核酸プローブでのハイブリッド形成、パートI、第2章「ハイブリッ ド形成の原理と核酸プローブアッセイの戦略概観」、エルスビアー、ニューヨー
ク。一般に、高度緊縮ハイブリッド形成洗浄条件は規定されたイオン強度および
pHで特定の配列に対して熱融点(Tm)よりも約5℃低い温度に選定される。 Tmとは標的配列の50%が完全に適合したプローブとハイブリッド形成する温 度(規定されたイオン強度およびpHの下で)である。ある種のプローブに対し
ては、Tmと同じ程度の強い条件を用いる。
【0037】 相補的核酸ハイブリッド形成のための緊縮ハイブリッド形成条件の事例は、サ
ザーンおよびノーザンブロットにおいてフィルター上該核酸が100以上の相補
的残基をもつものの例では、1mgヘパリン含有50%ホルマリンで、42℃で
ハイブリッド形成を一夜実施することである。緊縮洗浄条件の例は、65℃で1
5分間の2×SSC洗浄である(SSCバッファーの説明については上記サムブ
ルークの著書参照)。多くの場合、バックグランドプローブシグナル除去のため
には、高度緊縮洗浄の前に低緊縮洗浄を行う。低緊縮洗浄の例は40℃15分間
の2×SSCである。一般に、シグナル/ノイズ比が特定のハイブリッド形成に
おいて非関連プローブに対し観測されるものの2×(またはそれ以上)であると
きは、特異的ハイブリッド形成が検出されていることを示す。
ザーンおよびノーザンブロットにおいてフィルター上該核酸が100以上の相補
的残基をもつものの例では、1mgヘパリン含有50%ホルマリンで、42℃で
ハイブリッド形成を一夜実施することである。緊縮洗浄条件の例は、65℃で1
5分間の2×SSC洗浄である(SSCバッファーの説明については上記サムブ
ルークの著書参照)。多くの場合、バックグランドプローブシグナル除去のため
には、高度緊縮洗浄の前に低緊縮洗浄を行う。低緊縮洗浄の例は40℃15分間
の2×SSCである。一般に、シグナル/ノイズ比が特定のハイブリッド形成に
おいて非関連プローブに対し観測されるものの2×(またはそれ以上)であると
きは、特異的ハイブリッド形成が検出されていることを示す。
【0038】 緊縮条件下互いにハイブリッド形成しない核酸は、その核酸がコードするポリ
ぺプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは例えば
、核酸のコピーが遺伝子コードにより許される最大コドン縮退を用い作られる場
合に生じる。
ぺプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは例えば
、核酸のコピーが遺伝子コードにより許される最大コドン縮退を用い作られる場
合に生じる。
【0039】 「FIV−1Gagタンパク質」はFIV−1gag遺伝子によりコードされ
たタンパク質である。Gagタンパク質は一般に大きなプレタンパク質として翻
訳され、それが切断されて構造コアタンパク質を形成し、それが野生型のゲノム
RNAをパッケージングする。短小化されたGagタンパク質とは野生型配列に
比べて短いgag遺伝子から産生されたタンパク質のことである。同様に、FI
V逆転写酵素タンパク質およびFIVエンベロープタンパク質はpolおよびe
nv遺伝子によりそれぞれコードされる。
たタンパク質である。Gagタンパク質は一般に大きなプレタンパク質として翻
訳され、それが切断されて構造コアタンパク質を形成し、それが野生型のゲノム
RNAをパッケージングする。短小化されたGagタンパク質とは野生型配列に
比べて短いgag遺伝子から産生されたタンパク質のことである。同様に、FI
V逆転写酵素タンパク質およびFIVエンベロープタンパク質はpolおよびe
nv遺伝子によりそれぞれコードされる。
【0040】 「核酸」という用語は一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチドをいい、特に限定しない限り、天然産ヌクレオチドと類似の
様式で核酸にハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの既知類似体を包含する。
特に断わりのない限り、特定の核酸配列はその相補配列を任意に包含する。
はリボヌクレオチドをいい、特に限定しない限り、天然産ヌクレオチドと類似の
様式で核酸にハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの既知類似体を包含する。
特に断わりのない限り、特定の核酸配列はその相補配列を任意に包含する。
【0041】 「操作可能に結合した」という用語は、核酸発現制御配列(例えば、プロモー
ター、または配置された転写因子結合部位)と第二核酸配列間の機能的連鎖をい
い、そこでは該発現制御配列が第二配列に相当する核酸の転写を誘導する。
ター、または配置された転写因子結合部位)と第二核酸配列間の機能的連鎖をい
い、そこでは該発現制御配列が第二配列に相当する核酸の転写を誘導する。
【0042】 「組換え」という用語は、細胞に関して用いる場合、該細胞が核酸を複製する
かまたは発現すること、またはその起源が細胞に対して外来性である核酸により
コードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを意味する。組換え細胞
は細胞の未変性(非組換え)型内には見出されない遺伝子を発現することができ
る。組換え細胞はまた、細胞の未変性型に見出される遺伝子であって、当該遺伝
子が人工的手段により該細胞中に再導入された場合、その遺伝子も発現する。
かまたは発現すること、またはその起源が細胞に対して外来性である核酸により
コードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを意味する。組換え細胞
は細胞の未変性(非組換え)型内には見出されない遺伝子を発現することができ
る。組換え細胞はまた、細胞の未変性型に見出される遺伝子であって、当該遺伝
子が人工的手段により該細胞中に再導入された場合、その遺伝子も発現する。
【0043】 「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」という場合、それは核酸
構築物であって、細胞内で特定の核酸の転写を可能とする核酸要素により、組換
えによりまたは合成により調製した核酸構築物である。組換え発現カセットはプ
ラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であってもよい。一般に、組
換え発現カセットは転写すべき核酸およびプロモーターを含む。幾つかの態様に
おいて、発現カセットはまた、例えば、複製の起源、および/または染色体組込
み要素(例えば、レトロウイルスLTR)を含む。
構築物であって、細胞内で特定の核酸の転写を可能とする核酸要素により、組換
えによりまたは合成により調製した核酸構築物である。組換え発現カセットはプ
ラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であってもよい。一般に、組
換え発現カセットは転写すべき核酸およびプロモーターを含む。幾つかの態様に
おいて、発現カセットはまた、例えば、複製の起源、および/または染色体組込
み要素(例えば、レトロウイルスLTR)を含む。
【0044】 特定の核酸配列に関連して「サブシーケンス」という用語は、特定した核酸に
等しいか、またはより小さい核酸の領域をいう。
等しいか、またはより小さい核酸の領域をいう。
【0045】 ウイルスまたはベクターは、それが核酸を細胞内に伝達する際に細胞を「形質
導入する」。ウイルスまたはベクターは、それが細胞を形質導入し、複製し、そ
して(相補性ウイルスまたはベクターの介助なしに)同じ型の子孫ベクターまた
はウイルスを生体または細胞培養物内の他の細胞に拡散する場合、「感染性」で
あり、その場合、子孫のベクターまたはウイルスは生体または細胞培養物を通し
て再生産され、拡散する同じ能力を有する。このように、例えば、FIV粒子を
コードする核酸は、その核酸がFIV粒子により詰込まれ得ないならば(例えば
、もし該核酸がFIVパッケージング部位を欠くならば)、たとえ該核酸が細胞
を形質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。同様に、
FIV粒子により詰込まれたFIV−パッケージャブル核酸は、もしそれがパッ
ケージングされるFIV粒子をコードしていないならば、たとえそれが細胞を形
質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。ウイルスパッ
ケージング成分(例えば、GagおよびEnvタンパク質)の完全セットをコー
ドしていないベクターは「パッケージング能欠損」である。これらのベクターは
該ベクターがパッケージング細胞中トランスに供給されたウイルスタンパク質に
よりパッケージングされる場合、「トランス救済可能」である。細胞培養物中F
IVを感染させた細胞またはFIVを感染させた生体を形質転換するために、も
しFIV−パッケージャブル核酸が用いられるならば、FIV−パッケージャブ
ル核酸は複製され、感染性FIVウイルスと協力して生体中に拡散される。しか
し、FIV−パッケージャブル核酸それ自体は「感染性」ではない、というのは
、パッケージング機能はトランス相補性を介して感染性FIVウイルスにより与
えられるからである。
導入する」。ウイルスまたはベクターは、それが細胞を形質導入し、複製し、そ
して(相補性ウイルスまたはベクターの介助なしに)同じ型の子孫ベクターまた
はウイルスを生体または細胞培養物内の他の細胞に拡散する場合、「感染性」で
あり、その場合、子孫のベクターまたはウイルスは生体または細胞培養物を通し
て再生産され、拡散する同じ能力を有する。このように、例えば、FIV粒子を
コードする核酸は、その核酸がFIV粒子により詰込まれ得ないならば(例えば
、もし該核酸がFIVパッケージング部位を欠くならば)、たとえ該核酸が細胞
を形質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。同様に、
FIV粒子により詰込まれたFIV−パッケージャブル核酸は、もしそれがパッ
ケージングされるFIV粒子をコードしていないならば、たとえそれが細胞を形
質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。ウイルスパッ
ケージング成分(例えば、GagおよびEnvタンパク質)の完全セットをコー
ドしていないベクターは「パッケージング能欠損」である。これらのベクターは
該ベクターがパッケージング細胞中トランスに供給されたウイルスタンパク質に
よりパッケージングされる場合、「トランス救済可能」である。細胞培養物中F
IVを感染させた細胞またはFIVを感染させた生体を形質転換するために、も
しFIV−パッケージャブル核酸が用いられるならば、FIV−パッケージャブ
ル核酸は複製され、感染性FIVウイルスと協力して生体中に拡散される。しか
し、FIV−パッケージャブル核酸それ自体は「感染性」ではない、というのは
、パッケージング機能はトランス相補性を介して感染性FIVウイルスにより与
えられるからである。
【0046】 細胞「上清」は細胞が増殖する培地である。該培地は細胞からの物質、例えば
、細胞膜から伸び出し、培地に侵入するFIVウイルス粒子などを含むものであ
る。
、細胞膜から伸び出し、培地に侵入するFIVウイルス粒子などを含むものであ
る。
【0047】 (発明の詳細な議論) 非霊長類レンチウイルスクローンCF1の、ヒトHeLa、293、および2
93−T腎臓細胞へのリン酸カルシウム共沈法によるトランスフェクションは、
50ないし数百個の核と高レベル(100万cpmを超える)の上清逆転写酵素
とを含む、広く膨れた合胞体細胞(エンベロープを発現している細胞が他の細胞
と融合して生じる多核の巨大細胞)という驚くべき結果をもたらす。意外なこと
に、CF1の一過性のトランスフェクション(たとえば75cm2フラスコにおい て10μgのCF1のトランスフェクションによる)の後、ヒト293および2 93−T細胞およびHeLaの単層培養物は、90ないし95%が合胞体細胞に
よって再現可能に破壊されたが、しかし感染性があるかまたは複製可能なウイル
スは産生されなかった:CF1でトランスフェクトされた293−T細胞の大量
の上清を、新鮮な293または293−T細胞か、またはクランドール(Cranda
ll)ネコ腎臓細胞に移した結果は、なんら合胞体細胞またはRTの産生を生じな
かった。FIVエンベロープの欠失以外はCF1と同等なCF1Δenvは、合
胞体細胞を生じないが、高レベルの逆転写酵素およびベクターのパッケージング
に必要な高レベルのウイルス機能を産生する。このような前例のない結果は、も
しFIVプロモーターがヒト細胞中で活性のあるプロモーターに置換されるなら
、調節のRev/RRE軸、F1Vgag/pol産生、およびエンベロープに
媒介される合胞体細胞を含め、タンパク質産生に必要とされるFIV等の非哺乳
類ベクターのすべての機能が、ヒト細胞において起こり得るだろうという新たな
洞察を生みだす。
93−T腎臓細胞へのリン酸カルシウム共沈法によるトランスフェクションは、
50ないし数百個の核と高レベル(100万cpmを超える)の上清逆転写酵素
とを含む、広く膨れた合胞体細胞(エンベロープを発現している細胞が他の細胞
と融合して生じる多核の巨大細胞)という驚くべき結果をもたらす。意外なこと
に、CF1の一過性のトランスフェクション(たとえば75cm2フラスコにおい て10μgのCF1のトランスフェクションによる)の後、ヒト293および2 93−T細胞およびHeLaの単層培養物は、90ないし95%が合胞体細胞に
よって再現可能に破壊されたが、しかし感染性があるかまたは複製可能なウイル
スは産生されなかった:CF1でトランスフェクトされた293−T細胞の大量
の上清を、新鮮な293または293−T細胞か、またはクランドール(Cranda
ll)ネコ腎臓細胞に移した結果は、なんら合胞体細胞またはRTの産生を生じな
かった。FIVエンベロープの欠失以外はCF1と同等なCF1Δenvは、合
胞体細胞を生じないが、高レベルの逆転写酵素およびベクターのパッケージング
に必要な高レベルのウイルス機能を産生する。このような前例のない結果は、も
しFIVプロモーターがヒト細胞中で活性のあるプロモーターに置換されるなら
、調節のRev/RRE軸、F1Vgag/pol産生、およびエンベロープに
媒介される合胞体細胞を含め、タンパク質産生に必要とされるFIV等の非哺乳
類ベクターのすべての機能が、ヒト細胞において起こり得るだろうという新たな
洞察を生みだす。
【0048】 したがって本発明は、ヒト標的細胞の形質導入のための、ヒトのパッケージン
グ細胞においてパッケージングされた非哺乳類レンチウイルスベクターの初めて
の使用法を提供する。本発明より前には、このようなパッケージングシステムが
ヒト細胞において開発できるのか、パッケージングされた非哺乳類レンチウイル
スベクターがヒト細胞の形質導入に使用できるのか、またかかるベクターの調節
用の、プロセッシングならびにパッケージング成分がヒト細胞において活性を持
つことができるのかどうかを知る手だてがなかった。本発明のベクターならびに
パッケージング細胞において特に有用な、所望の配列または特定の構築物、たと
えば本文に記述したFIVを主成分とするベクターならびにパッケージングシス
テムの配列ならびに構築については、何ら情報がなかった。ベクターにとっての
利点は、ベクターならびにパッケージングシステムが基盤としているウイルスに
、ヒトへの病原性がないこと、およびベクターが非***ヒト細胞を形質導入する
能力である。かかる非***細胞は、ヒト神経系、目、造血系、外皮、内分泌系、
胆肝道系、胃腸管、泌尿生殖路、骨、筋肉、心臓血管系、および呼吸系の細胞を
含むがこれらに限定されない。これらの細胞はすべて、本発明のベクターを用い
てインヴィトロならびにインヴィヴォにおいて形質導入される。このようなベク
ターはまた患者の、非ヒト細胞との接触を防ぎ、さらに既知の病原体由来のレン
チウイルス遺伝子またはレンチウイルスタンパク質との接触を防ぐ。
グ細胞においてパッケージングされた非哺乳類レンチウイルスベクターの初めて
の使用法を提供する。本発明より前には、このようなパッケージングシステムが
ヒト細胞において開発できるのか、パッケージングされた非哺乳類レンチウイル
スベクターがヒト細胞の形質導入に使用できるのか、またかかるベクターの調節
用の、プロセッシングならびにパッケージング成分がヒト細胞において活性を持
つことができるのかどうかを知る手だてがなかった。本発明のベクターならびに
パッケージング細胞において特に有用な、所望の配列または特定の構築物、たと
えば本文に記述したFIVを主成分とするベクターならびにパッケージングシス
テムの配列ならびに構築については、何ら情報がなかった。ベクターにとっての
利点は、ベクターならびにパッケージングシステムが基盤としているウイルスに
、ヒトへの病原性がないこと、およびベクターが非***ヒト細胞を形質導入する
能力である。かかる非***細胞は、ヒト神経系、目、造血系、外皮、内分泌系、
胆肝道系、胃腸管、泌尿生殖路、骨、筋肉、心臓血管系、および呼吸系の細胞を
含むがこれらに限定されない。これらの細胞はすべて、本発明のベクターを用い
てインヴィトロならびにインヴィヴォにおいて形質導入される。このようなベク
ターはまた患者の、非ヒト細胞との接触を防ぎ、さらに既知の病原体由来のレン
チウイルス遺伝子またはレンチウイルスタンパク質との接触を防ぐ。
【0049】 ヒト細胞におけるFIVのライフサイクルのメカニズムは本文中に記述されて
いる。ここでは、パッケージングプラスミドにコードされたネコ免疫不全ウイル
ス(FIV)タンパク質が、FIVゲノムの長い末端反復をヒトサイトメガロウ
イルスの急性期プロモーター(CMVプロモーター)等の異種的プロモーターで
置換することにより、ヒト細胞において、複製欠損様式にて高濃度に発現され、
さらにFIVパッケージャブルベクターに対しトランスに供給されることを初め
て報告する。とくに、FIV LTRのプロモーターエレメントを異種のpol II
プロモーターで置換することは、ヒト細胞における高濃度のFIVタンパク質の
、トランスでの産生を可能にする。さらに、FIVの5プライムU3エレメント
を、異種的プロモーターをR反復に正確に融合することにより選択的に置換する
と、ネコ細胞においてのみ複製可能な野性型FIVが、ヒト細胞において高濃度
に産生される結果となった。三つのプラスミド、複製欠損、env欠失、完全に
異種的のプロモーターによりプロモートされる、FIVベクターシステムが構築
され、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G(VSV−G)−シュードタイプF
IV粒子を用いて、ヒトの***ならびに非***細胞が効率よく形質導入されるこ
とが発見された。ネコ細胞に対する形質導入には利点はなかった:ヒトならびに
ネコの多様な系統の***細胞においては、相対的な形質導入効率は、モロニーマ
ウス白血病ウイルス(M−MuLV)を主成分とするベクターについてのものと
同様であった。この共通したM−MuLVベクターとは全く対照的に、FIVベ
クターは末期的に分化したヒトマクロファージならびにニューロン(hNTニュ
ーロン)を含むヒトの非***細胞を効果的に形質導入した。ヒト細胞においてF
IVの発現が可能である場合には、広大な合胞体細胞を形成する;この活性は、
合胞体細胞を誘導するHIV分離株のコリセプター、CXCR4/fusin35の 発現を必要とする。ネコCRFK細胞におけるヒトCXCR4細胞の発現は、ウ
イルスの表現型を高度に合胞体細胞誘導性に変え、かつFIVエンベロープをつ
けたベクターの侵入を媒介する。研究により、ヒト、齧歯類、およびネコの細胞
における合胞体細胞形成のため、FIVはヒトのCXCR4相同物を利用するこ
とができること、さらにネコ細胞におけるウイルス侵入についてのコリセプター
の役割と一致することが示されている。
いる。ここでは、パッケージングプラスミドにコードされたネコ免疫不全ウイル
ス(FIV)タンパク質が、FIVゲノムの長い末端反復をヒトサイトメガロウ
イルスの急性期プロモーター(CMVプロモーター)等の異種的プロモーターで
置換することにより、ヒト細胞において、複製欠損様式にて高濃度に発現され、
さらにFIVパッケージャブルベクターに対しトランスに供給されることを初め
て報告する。とくに、FIV LTRのプロモーターエレメントを異種のpol II
プロモーターで置換することは、ヒト細胞における高濃度のFIVタンパク質の
、トランスでの産生を可能にする。さらに、FIVの5プライムU3エレメント
を、異種的プロモーターをR反復に正確に融合することにより選択的に置換する
と、ネコ細胞においてのみ複製可能な野性型FIVが、ヒト細胞において高濃度
に産生される結果となった。三つのプラスミド、複製欠損、env欠失、完全に
異種的のプロモーターによりプロモートされる、FIVベクターシステムが構築
され、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G(VSV−G)−シュードタイプF
IV粒子を用いて、ヒトの***ならびに非***細胞が効率よく形質導入されるこ
とが発見された。ネコ細胞に対する形質導入には利点はなかった:ヒトならびに
ネコの多様な系統の***細胞においては、相対的な形質導入効率は、モロニーマ
ウス白血病ウイルス(M−MuLV)を主成分とするベクターについてのものと
同様であった。この共通したM−MuLVベクターとは全く対照的に、FIVベ
クターは末期的に分化したヒトマクロファージならびにニューロン(hNTニュ
ーロン)を含むヒトの非***細胞を効果的に形質導入した。ヒト細胞においてF
IVの発現が可能である場合には、広大な合胞体細胞を形成する;この活性は、
合胞体細胞を誘導するHIV分離株のコリセプター、CXCR4/fusin35の 発現を必要とする。ネコCRFK細胞におけるヒトCXCR4細胞の発現は、ウ
イルスの表現型を高度に合胞体細胞誘導性に変え、かつFIVエンベロープをつ
けたベクターの侵入を媒介する。研究により、ヒト、齧歯類、およびネコの細胞
における合胞体細胞形成のため、FIVはヒトのCXCR4相同物を利用するこ
とができること、さらにネコ細胞におけるウイルス侵入についてのコリセプター
の役割と一致することが示されている。
【0050】 ネコ免疫不全ウイルスは、ネコ細胞については複製可能であるがヒト細胞につい
てはそうではなく、前述のヒトサイトメガロウイルスの急性期プロモーター(C
MVプロモーター)等の異種的プロモーターと、FIVのR反復のすぐ上流のF
IVゲノムとの正確な融合により、ヒトおよびネコ細胞において高レベルに産生
される。一つの態様においては、融合はTATAボックスにかけて正確に結合さ
れる(CMVプロモーターのTATAボックが使用される;FIV配列は、TA
TAボックのすぐ下流のSacI部位で始まる)。mRNAの転写開始部位の空
間配置に対してTATAボックスを保存するこの融合の詳細は、実施例に図解さ
れている。
てはそうではなく、前述のヒトサイトメガロウイルスの急性期プロモーター(C
MVプロモーター)等の異種的プロモーターと、FIVのR反復のすぐ上流のF
IVゲノムとの正確な融合により、ヒトおよびネコ細胞において高レベルに産生
される。一つの態様においては、融合はTATAボックスにかけて正確に結合さ
れる(CMVプロモーターのTATAボックが使用される;FIV配列は、TA
TAボックのすぐ下流のSacI部位で始まる)。mRNAの転写開始部位の空
間配置に対してTATAボックスを保存するこの融合の詳細は、実施例に図解さ
れている。
【0051】 FIV由来のレトロウイルスベクターは、FIVベクターの5プライムU3エ
レメントが異種的プロモーターによって正確に置換されている同様の異種的プロ
モーターR反復融合物から高いレベルで任意に発現される。このようなFIVベ
クターは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質G(VSV−G)に
よるシュードタイプを含むがそれに限定されない異種のエンベロープを介し、ヒ
トの***中および増殖停止細胞の両者を含む非ネコ哺乳類細胞に、複製欠損様式
にて高い力価でデリバーされることが可能である;これは非哺乳類レンチウイル
スを用いたヒト細胞への遺伝子デリバリーの最初の証明である。
レメントが異種的プロモーターによって正確に置換されている同様の異種的プロ
モーターR反復融合物から高いレベルで任意に発現される。このようなFIVベ
クターは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質G(VSV−G)に
よるシュードタイプを含むがそれに限定されない異種のエンベロープを介し、ヒ
トの***中および増殖停止細胞の両者を含む非ネコ哺乳類細胞に、複製欠損様式
にて高い力価でデリバーされることが可能である;これは非哺乳類レンチウイル
スを用いたヒト細胞への遺伝子デリバリーの最初の証明である。
【0052】 FIVタンパク質とFIVベクターとの同時産生(co-production)の結果、ヒ
ト細胞ならびにネコ細胞に遺伝子をデリバーすることが可能な、高力価の複製欠
損レンチウイルスベクターが得られる。ヒト細胞について、107/mlを超えるF
IVベクターの力価が達成され、入手可能な方法を用いた産生ならびに濃縮の改
善をもってより高い力価が達成される。したがって、本発明はヒトの遺伝子治療
への直接的な適応の可能性を有する。ヒト細胞において活性のある他のプロモー
ターもまた、いくつかの態様では有用であろう。
ト細胞ならびにネコ細胞に遺伝子をデリバーすることが可能な、高力価の複製欠
損レンチウイルスベクターが得られる。ヒト細胞について、107/mlを超えるF
IVベクターの力価が達成され、入手可能な方法を用いた産生ならびに濃縮の改
善をもってより高い力価が達成される。したがって、本発明はヒトの遺伝子治療
への直接的な適応の可能性を有する。ヒト細胞において活性のある他のプロモー
ターもまた、いくつかの態様では有用であろう。
【0053】 本発明はいくつかの安全上の利点を具現化している。本発明の一つの重要な安
全上の利点は、ヒト細胞においては完全に複製欠損性のベクターの産生である。
ネイティブなFIVプロモーター(LTR)は、ヒト細胞においては不活性かま
たは最小限の活性を有する。事実、本文において実施されたようなhCMVIE
プロモーターは、ネコならびにヒト細胞においてFIV LTRよりも高い発現 を可能にする。ネコの産生細胞においては、ネイティブなFIV LTRが発現 を誘導するべく(MoMLVを主成分とするシステムにおいて、モロニーマウス
白血病(MoMLV)ウイルスプロモーターを使用することに類似して)用いら
れるが、かかる使用は避けられることが好ましい明確な安全上の問題を呈示する
。ネコ細胞は、ヒト細胞において複製する複製可能なC型内在レトロウイルス(
RD114)を含むことがある。ヒト細胞よりも科学的な研究を受けていないネ
コ細胞は、潜在的に病原性のある他の未知の感染性因子を含む可能性もある。R
D114は、初めネコ胎児において継代されたヒト横紋筋肉腫細胞から単離され
た。複製可能RD114もまた、ヒトと他の非ネコ細胞との同時培養により、培
養されたネコ細胞系から単離されている。さらに、RD144は核酸配列のレベ
ルにおいて霊長類レトロウイルス(ヒヒの内在性ウイルスまたはBaEV)に著
しい関連性がある。この事実は、ヒト細胞系において証明された複製コンピテン
スに加えて、ヒトへの種を超えた伝染についての明らかな可能性を示唆している
。異物移植か、または動物の細胞または組織由来の生体材料との接触を介しての
、RD114等の内在性ウイルスまたは他のウイルスのヒトへの伝染の危険性は
、最近大きな懸念を生みだしている。たとえばブタは、RD114と同様にヒト
細胞において複製することができる内在性レトロウイルスを潜伏させることが示
されている。この発見は現在この分野の専門家により、動物の臓器をヒトへ異物
移植すること、あるいは動物由来の滅菌可能ではない生体物質を治療を目的とし
て使用することの安全性について、重大な疑問を掲げるべく検討されている。し
たがって、ヒトまたは齧歯類の細胞系よりはるかに少ししか特徴づけられていな
いネコまたは有蹄類の細胞系に由来するベクターにヒトを接触させることは問題
となるであろう。本発明のベクターのキメラ状の設計は、293T細胞等のよく
明らかにされたヒトの産生細胞系における産生を完全に可能にする。安全上の利
点は、産生のいかなる段階においてもネコの細胞または組織との接触が避けられ
ることである。したがって、細胞またはベクターを患者へ導入することを含む適
用には、ヒトのパッケージング細胞においてパッケージングされたベクターを用
いることが好ましい。
全上の利点は、ヒト細胞においては完全に複製欠損性のベクターの産生である。
ネイティブなFIVプロモーター(LTR)は、ヒト細胞においては不活性かま
たは最小限の活性を有する。事実、本文において実施されたようなhCMVIE
プロモーターは、ネコならびにヒト細胞においてFIV LTRよりも高い発現 を可能にする。ネコの産生細胞においては、ネイティブなFIV LTRが発現 を誘導するべく(MoMLVを主成分とするシステムにおいて、モロニーマウス
白血病(MoMLV)ウイルスプロモーターを使用することに類似して)用いら
れるが、かかる使用は避けられることが好ましい明確な安全上の問題を呈示する
。ネコ細胞は、ヒト細胞において複製する複製可能なC型内在レトロウイルス(
RD114)を含むことがある。ヒト細胞よりも科学的な研究を受けていないネ
コ細胞は、潜在的に病原性のある他の未知の感染性因子を含む可能性もある。R
D114は、初めネコ胎児において継代されたヒト横紋筋肉腫細胞から単離され
た。複製可能RD114もまた、ヒトと他の非ネコ細胞との同時培養により、培
養されたネコ細胞系から単離されている。さらに、RD144は核酸配列のレベ
ルにおいて霊長類レトロウイルス(ヒヒの内在性ウイルスまたはBaEV)に著
しい関連性がある。この事実は、ヒト細胞系において証明された複製コンピテン
スに加えて、ヒトへの種を超えた伝染についての明らかな可能性を示唆している
。異物移植か、または動物の細胞または組織由来の生体材料との接触を介しての
、RD114等の内在性ウイルスまたは他のウイルスのヒトへの伝染の危険性は
、最近大きな懸念を生みだしている。たとえばブタは、RD114と同様にヒト
細胞において複製することができる内在性レトロウイルスを潜伏させることが示
されている。この発見は現在この分野の専門家により、動物の臓器をヒトへ異物
移植すること、あるいは動物由来の滅菌可能ではない生体物質を治療を目的とし
て使用することの安全性について、重大な疑問を掲げるべく検討されている。し
たがって、ヒトまたは齧歯類の細胞系よりはるかに少ししか特徴づけられていな
いネコまたは有蹄類の細胞系に由来するベクターにヒトを接触させることは問題
となるであろう。本発明のベクターのキメラ状の設計は、293T細胞等のよく
明らかにされたヒトの産生細胞系における産生を完全に可能にする。安全上の利
点は、産生のいかなる段階においてもネコの細胞または組織との接触が避けられ
ることである。したがって、細胞またはベクターを患者へ導入することを含む適
用には、ヒトのパッケージング細胞においてパッケージングされたベクターを用
いることが好ましい。
【0054】 すべての態様において、このシステムはHIVを主成分とするレンチウイルス
ベクターに比べて有意な安全上の利点があるが、それは前文に記したように、F
IVにはヒトへの伝染性もヒトにおける病原性もないからである。本発明はした
がって、FIVにはヒトにおける病原性の証拠が何もないというよく証明された
事実を利用する。本発明の実用への適用の可能性もまた、ヒトにおける親和性ま
たは病原性の欠如が他のいかなる非霊長類レンチウイルス(これらはVisna
/Maedi、CAEV、EIAV、およびBIVを含む)よりもFIVについ
てよく立証されているという事実から利益を得ているが、それは自然界でFIV
が野性および飼育ネコの両者の間で主に伝染されるのと同一の手段、すなわちネ
コがかむことにより、毎年何千人ものヒトが接触しているからである。
ベクターに比べて有意な安全上の利点があるが、それは前文に記したように、F
IVにはヒトへの伝染性もヒトにおける病原性もないからである。本発明はした
がって、FIVにはヒトにおける病原性の証拠が何もないというよく証明された
事実を利用する。本発明の実用への適用の可能性もまた、ヒトにおける親和性ま
たは病原性の欠如が他のいかなる非霊長類レンチウイルス(これらはVisna
/Maedi、CAEV、EIAV、およびBIVを含む)よりもFIVについ
てよく立証されているという事実から利益を得ているが、それは自然界でFIV
が野性および飼育ネコの両者の間で主に伝染されるのと同一の手段、すなわちネ
コがかむことにより、毎年何千人ものヒトが接触しているからである。
【0055】 すべてのレンチウイルスは、もっぱら体液の交換により伝染する。HIVは主
として***渉により伝染する;自然界でFIVが***渉により伝染するという証
拠はほとんどない;そのかわりに、ネコがかむこと(これにはヒトもまた普通に
接触しているが)が主たる機構である。これらの動物はなわばりをもち、オスは
特になわばりおよび優位性をめぐってしばしば戦いを交えるため、かみ傷はネコ
の間では日常的なものである;したがってFIV感染はメスネコよりもオスネコ
において、より一般的である。
として***渉により伝染する;自然界でFIVが***渉により伝染するという証
拠はほとんどない;そのかわりに、ネコがかむこと(これにはヒトもまた普通に
接触しているが)が主たる機構である。これらの動物はなわばりをもち、オスは
特になわばりおよび優位性をめぐってしばしば戦いを交えるため、かみ傷はネコ
の間では日常的なものである;したがってFIV感染はメスネコよりもオスネコ
において、より一般的である。
【0056】 要約すると、ネコ科以外の動物についてはFIV感染の証拠はない:この限定
された親和性はすべての既知のレンチウイルスの性質である。かむことは、ネコ
間でのFIVの蔓延の自然の手段であり、ネコがかむことによるヒトへのFIV
の頻繁な接触にもかかわらず、このもっともらしく効率的な接種手段は、結果的
に何らヒトのセロコンバージョンまたはヒトの感染についての他の検出可能な証
拠を生じない。非霊長類レンチウイルスの中では、それゆえヒトへの病原性に対
する疫学的証拠はFIVについてはなくてはならないものである。
された親和性はすべての既知のレンチウイルスの性質である。かむことは、ネコ
間でのFIVの蔓延の自然の手段であり、ネコがかむことによるヒトへのFIV
の頻繁な接触にもかかわらず、このもっともらしく効率的な接種手段は、結果的
に何らヒトのセロコンバージョンまたはヒトの感染についての他の検出可能な証
拠を生じない。非霊長類レンチウイルスの中では、それゆえヒトへの病原性に対
する疫学的証拠はFIVについてはなくてはならないものである。
【0057】 FIVはバイオセイフティーレベル-2(BL−2)での実施を利用して日常 的に作業されるため、ベクターはBL−2施設を用いて日常的に作業することが
可能であり、その開発ならびに製造にかかわる人々に生じる危険度はHIVベク
ターに比較してより少なく、また製造の容易性ならびに便利性は亢進される。
可能であり、その開発ならびに製造にかかわる人々に生じる危険度はHIVベク
ターに比較してより少なく、また製造の容易性ならびに便利性は亢進される。
【0058】 細胞への遺伝子導入ならびに遺伝子治療に、非哺乳類レンチウイルスを用いる
ことに固有の、安全上の利点に加えて、FIVの分子クローン(34TF10)
からの本発明に記述されている好ましいシステムは、重要なFIV遺伝子(OR
F2)が欠損しており、したがって弱毒化ウイルスである。34TF10は接着
性のネコ細胞系では複製するが、リンパ球においては複製しない;ネコリンパ球
における複製コンピテンスはORF2にマップされている。さらに、ORF2マ
イナスのウイルスは向神経性である。もしある細胞型にデリバリーが必要とされ
れば、ORF2は修復されることが可能である。さらに、他の態様においては、
FIVの他の株または分子クローンが同様の様式で用いられているが、それは本
発明がヒト細胞の形質導入に対するそれらの適用の可能性を明らかにしているか
らである。
ことに固有の、安全上の利点に加えて、FIVの分子クローン(34TF10)
からの本発明に記述されている好ましいシステムは、重要なFIV遺伝子(OR
F2)が欠損しており、したがって弱毒化ウイルスである。34TF10は接着
性のネコ細胞系では複製するが、リンパ球においては複製しない;ネコリンパ球
における複製コンピテンスはORF2にマップされている。さらに、ORF2マ
イナスのウイルスは向神経性である。もしある細胞型にデリバリーが必要とされ
れば、ORF2は修復されることが可能である。さらに、他の態様においては、
FIVの他の株または分子クローンが同様の様式で用いられているが、それは本
発明がヒト細胞の形質導入に対するそれらの適用の可能性を明らかにしているか
らである。
【0059】 本文の一つの実施例においては異種的プロモーターをFIV配列に融合させる
キメラ構築物が用いられているが、融合部は転写の開始部位に局在しているため
、FIV配列のみが転写される(すなわち、FIVプロモーター配列のみがこの
システムによって生じるmRNA中に現われる;異種的プロモーター配列は転写
されない)。したがって、RNAレベルの組換えによって生じる複製可能キメラ
ウイルスの可能性は減じられる。
キメラ構築物が用いられているが、融合部は転写の開始部位に局在しているため
、FIV配列のみが転写される(すなわち、FIVプロモーター配列のみがこの
システムによって生じるmRNA中に現われる;異種的プロモーター配列は転写
されない)。したがって、RNAレベルの組換えによって生じる複製可能キメラ
ウイルスの可能性は減じられる。
【0060】 さらに、系統発生学的にHIVから遠いこのレンチウイルスが、この発明にお
いて、ヒト細胞の形質導入に適応可能であることが今示されていることから、他
の非霊長類、とくに有蹄類レンチウイルスが同様に利用可能であることは今や明
らかである。
いて、ヒト細胞の形質導入に適応可能であることが今示されていることから、他
の非霊長類、とくに有蹄類レンチウイルスが同様に利用可能であることは今や明
らかである。
【0061】 パッケージングプラスミドからの発現を巧みに工作することにより、ベクター
とエンベロープ発現プラスミドとが同一のヒトプロモーターから発生し、タンパ
ク質発現の同調した発現(すなわち時間的な調和)が促進される。
とエンベロープ発現プラスミドとが同一のヒトプロモーターから発生し、タンパ
ク質発現の同調した発現(すなわち時間的な調和)が促進される。
【0062】 (パッケージングプラスミドおよびパッケージャブル核酸の作成) 本発明は、前述の通り、種々のパッケージングプラスミドおよびパッケージャ
ブル核酸を提供する。パッケージングプラスミドは非霊長類レンチウイルス由来
の核酸、とくにFIVならびに有蹄類レンチウイルスに由来するものを含む。パ
ッケージャブルベクターは、レンチウイルスのパッケージング部位(たとえばF
IVまたは有蹄類由来)と、任意に他の非霊長類レンチウイルス核酸か、または
異種の核酸を含むRNAをコードしている。
ブル核酸を提供する。パッケージングプラスミドは非霊長類レンチウイルス由来
の核酸、とくにFIVならびに有蹄類レンチウイルスに由来するものを含む。パ
ッケージャブルベクターは、レンチウイルスのパッケージング部位(たとえばF
IVまたは有蹄類由来)と、任意に他の非霊長類レンチウイルス核酸か、または
異種の核酸を含むRNAをコードしている。
【0063】 本発明のパッケージャブルベクターおよびパッケージングプラスミドは、レン
チウイルスクローンから由来したものである。かかるクローンの多くは熟練者に
は周知であり、一般に市販されている。よく確立された配列情報の貯蔵所は、G
enBank、EMBL、DDBJ、およびNCBIを含む。よく特徴づけられ
たHIVクローンは:HIV−1NL43、HIV−1SF2、HIV−1BRU、HIV
−1MNを含む。
チウイルスクローンから由来したものである。かかるクローンの多くは熟練者に
は周知であり、一般に市販されている。よく確立された配列情報の貯蔵所は、G
enBank、EMBL、DDBJ、およびNCBIを含む。よく特徴づけられ
たHIVクローンは:HIV−1NL43、HIV−1SF2、HIV−1BRU、HIV
−1MNを含む。
【0064】 さらに、ウイルスクローンは野性型ウイルスから既知の技術を用いて単離する
ことができる。典型的には、完全長のレンチウイルスのプロウイルスを含んでい
るラムダファージクローンは、血清陽性動物の末梢血単核細胞から単離されたウ
イルス株に感染された細胞系の、ゲノムDNAから得られる。このウイルスはイ
ンヴィトロにおいて複製可能であって、個体からの標的細胞(たとえばCD4+ 細胞)に直接トランスフェクトした後、感染性の子孫ウイルス粒子を産生する。
一般には、完全なビルレントなゲノムが、パッケージングプラスミドを作成する
べく用いられる。FIVパッケージングベクターに関して「完全長のFIVゲノ
ム」は、FIVウイルスまたはウイルスクローン(たとえばDNAファージ)に
よりコード化されている核酸(RNAまたはDNA)からなり、5'および3'L
TR領域と、LTR領域の間の、典型的な対応ウイルスに存在する遺伝子とを含
む。FIVについては、これらの遺伝子は:gag−pol、env、およびo
rf−2を含み、またさらにいくつかのまだ特徴づけされていない読み枠が、特
にenvに存在する。
ことができる。典型的には、完全長のレンチウイルスのプロウイルスを含んでい
るラムダファージクローンは、血清陽性動物の末梢血単核細胞から単離されたウ
イルス株に感染された細胞系の、ゲノムDNAから得られる。このウイルスはイ
ンヴィトロにおいて複製可能であって、個体からの標的細胞(たとえばCD4+ 細胞)に直接トランスフェクトした後、感染性の子孫ウイルス粒子を産生する。
一般には、完全なビルレントなゲノムが、パッケージングプラスミドを作成する
べく用いられる。FIVパッケージングベクターに関して「完全長のFIVゲノ
ム」は、FIVウイルスまたはウイルスクローン(たとえばDNAファージ)に
よりコード化されている核酸(RNAまたはDNA)からなり、5'および3'L
TR領域と、LTR領域の間の、典型的な対応ウイルスに存在する遺伝子とを含
む。FIVについては、これらの遺伝子は:gag−pol、env、およびo
rf−2を含み、またさらにいくつかのまだ特徴づけされていない読み枠が、特
にenvに存在する。
【0065】 パッケージングプラスミドは完全長のゲノムからパッケージング部位を欠失す
ることにより作られ、クローンにウイルスタンパク質の産生を可能にするが、ウ
イルスRNAが自らパッケージングできないようにする。FIVパッケージング
部位のRNAの二次構造は、MSDとgag−polとの間の領域を含むらしい
;適切なパッケージングには、さらに他の領域が重要であるのかもしれない。パ
ッケージング部位の精密な特性は、欠失分析を行なうことにより決定することが
できる。
ることにより作られ、クローンにウイルスタンパク質の産生を可能にするが、ウ
イルスRNAが自らパッケージングできないようにする。FIVパッケージング
部位のRNAの二次構造は、MSDとgag−polとの間の領域を含むらしい
;適切なパッケージングには、さらに他の領域が重要であるのかもしれない。パ
ッケージング部位の精密な特性は、欠失分析を行なうことにより決定することが
できる。
【0066】 パッケージングプラスミドにおいては、全psi部位(パッケージング部位)
が欠失されていることが好ましいが、パッケージングを阻害するために十分な部
位を欠失または突然変異させる、いかなる突然変異または欠失でも十分である。
このことは、典型的には主要スプライスドナー部位(「MSD])とgag遺伝
子の始めの部分との間の領域に実質的な欠失を生じる結果となるが、他の領域も
同様に含んでもよい。コード化されたウイルスタンパク質のウイルスによる発現
を支持するプロモーターエレメントの欠失や、異種的プロモーターの取り込みは
望ましい。とくに、ヒトのプロモーター(すなわちヒト細胞において活性があり
、典型的には、しかし必ずではないが、ヒト由来であるか、またはヒトにおいて
活性があるウイルス等のヒト病原体に由来する)の取り込みは好ましい。
が欠失されていることが好ましいが、パッケージングを阻害するために十分な部
位を欠失または突然変異させる、いかなる突然変異または欠失でも十分である。
このことは、典型的には主要スプライスドナー部位(「MSD])とgag遺伝
子の始めの部分との間の領域に実質的な欠失を生じる結果となるが、他の領域も
同様に含んでもよい。コード化されたウイルスタンパク質のウイルスによる発現
を支持するプロモーターエレメントの欠失や、異種的プロモーターの取り込みは
望ましい。とくに、ヒトのプロモーター(すなわちヒト細胞において活性があり
、典型的には、しかし必ずではないが、ヒト由来であるか、またはヒトにおいて
活性があるウイルス等のヒト病原体に由来する)の取り込みは好ましい。
【0067】 結果として得られる本発明のパッケージングプラスミドは、この欠失クローン
をパッケージング細胞(典型的には293等のヒト細胞か、またはいかなる不要
成分も含まない他のよく特徴づけされた細胞)に形質導入すること、およびこの
プラスミドを発現させることにより、ウイルス粒子を作成するべく用いられる。
このプラスミドはレンチウイルスのパッケージング部位を欠くため、ウイルス粒
子内にはパッケージングされない。
をパッケージング細胞(典型的には293等のヒト細胞か、またはいかなる不要
成分も含まない他のよく特徴づけされた細胞)に形質導入すること、およびこの
プラスミドを発現させることにより、ウイルス粒子を作成するべく用いられる。
このプラスミドはレンチウイルスのパッケージング部位を欠くため、ウイルス粒
子内にはパッケージングされない。
【0068】 形質導入されたパッケージング細胞の安全性を増すためには、パッケージング
プラスミド(または相同なクローン)を相補機能のある多数のパッケージングプ
ラスミドに切断(たとえばサブクローニングにより)することが好ましい。この
ことは、組換えの結果として感染性の粒子を産みだすことになる機会を減少させ
る。
プラスミド(または相同なクローン)を相補機能のある多数のパッケージングプ
ラスミドに切断(たとえばサブクローニングにより)することが好ましい。この
ことは、組換えの結果として感染性の粒子を産みだすことになる機会を減少させ
る。
【0069】 パッケージング可能な核酸は、FIV粒子によりパッケージングされることが
できるRNAをコード化している。かかる核酸は、FIVパッケージング部位を
、選択した核酸と組換え結合することにより構築することができる。パッケージ
ング部位(psi部位)は5'LTRに隣接して局在しており、主としてMSD 部位と、gag遺伝子のリーダー配列のgag開始コドン(AUG)との間であ
る。したがって、最小のパッケージング部位はMSDと、関連するレンチウイル
スからのgag開始コドンとの間の核酸の大部分を含む。好ましくは完全なパッ
ケージング部位は、最大のパッケージング効率のために5'LTRからの配列と gag遺伝子の5'領域とを含む。このようなパッケージング配列は、典型的に はgag遺伝子、たとえばgagをコードしている領域に約100塩基またはそ
れ以上延ばした部分と、FIV5'LTRに約100塩基またはそれ以上延ばし た部分とを含む。さらに、env遺伝子からの配列が任意にパッケージング部位
、特にRREに含まれる。
できるRNAをコード化している。かかる核酸は、FIVパッケージング部位を
、選択した核酸と組換え結合することにより構築することができる。パッケージ
ング部位(psi部位)は5'LTRに隣接して局在しており、主としてMSD 部位と、gag遺伝子のリーダー配列のgag開始コドン(AUG)との間であ
る。したがって、最小のパッケージング部位はMSDと、関連するレンチウイル
スからのgag開始コドンとの間の核酸の大部分を含む。好ましくは完全なパッ
ケージング部位は、最大のパッケージング効率のために5'LTRからの配列と gag遺伝子の5'領域とを含む。このようなパッケージング配列は、典型的に はgag遺伝子、たとえばgagをコードしている領域に約100塩基またはそ
れ以上延ばした部分と、FIV5'LTRに約100塩基またはそれ以上延ばし た部分とを含む。さらに、env遺伝子からの配列が任意にパッケージング部位
、特にRREに含まれる。
【0070】 本発明のパッケージングプラスミドと標的のパッケージング可能なベクター核
酸とを作成するための戦略が与えられれば、熟練者は機能的に同等な核酸を含む
種々のクローンを構築することができる。これらの目的を達成するためのクロー
ニングの方法論と、核酸の配列を確認するための配列法とはこの技術では周知で
ある。適切なクローニングならびに配列技術の実例および、数多くのクローニン
グ実習を通して熟練者を指導するのに十分な指示は、Berger および Kimmel, Gu
ide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology 152巻、アカデ ミック・プレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州(Berger);Sambrook 等 、(1989)Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第2版)1-3巻、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー出版、ニュ
ーヨーク州、(Sambrook);およびCurrent Protocols in Molecular Biology、
F. M. Ausubel 等共編、Current Protocols, グリーンパブリッシングアソシエ ーツ社(Greene Publishing Associates, Inc.)とジョンウィリー&サンズ社(
John Wiley & Sons, Inc)との合弁企業、(1994年増刊)(Ausubel)、に見られ る。生物学的試薬および実験器材の製造業者からの製品情報もまた、既知の生物
学的手法に有用な情報を提供する。かかる製造業者は、シグマ化学社(セントル
イス、ミズーリ州)、R&Dシステムズ(ミネアポリス、ミネソタ州)、ファル
マシアLKBバイオケミストリー(ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャー
ジー州)、クロンテックラボラトリーズ社(パロウアルトウ、カリフォルニア州
)、ケムジーンズコープ(Chem. Genes Corp.)、オールドリッチケミカルカン パニー(Aldrich Chemical Company) (ミルウォーキー、ウィスコンシン州)、
グレンリサーチ社(Glen Research, Inc)、ギブコBRLライフテクノロジーズ社 (GIBCO BRL Life Technologies, Inc.)(ガイザースバーグ(Gaithersberg)、
メリーランド州)、フルカケミカ-ビオケミカアナリティカ(Fluka Chemica-Bio
chemika Analytika(Fluka Chemie AG、ブックス(Buchs)、スイス)、インヴィ
トロジェン(Invitrogen)、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびアプライ ドバイオシステムズ(Applied Biosystems )(フォスターシティー、カリフォル
ニア州)、ならびに熟練者に周知の他の多くの商業用の供給源を含む。
酸とを作成するための戦略が与えられれば、熟練者は機能的に同等な核酸を含む
種々のクローンを構築することができる。これらの目的を達成するためのクロー
ニングの方法論と、核酸の配列を確認するための配列法とはこの技術では周知で
ある。適切なクローニングならびに配列技術の実例および、数多くのクローニン
グ実習を通して熟練者を指導するのに十分な指示は、Berger および Kimmel, Gu
ide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology 152巻、アカデ ミック・プレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州(Berger);Sambrook 等 、(1989)Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第2版)1-3巻、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー出版、ニュ
ーヨーク州、(Sambrook);およびCurrent Protocols in Molecular Biology、
F. M. Ausubel 等共編、Current Protocols, グリーンパブリッシングアソシエ ーツ社(Greene Publishing Associates, Inc.)とジョンウィリー&サンズ社(
John Wiley & Sons, Inc)との合弁企業、(1994年増刊)(Ausubel)、に見られ る。生物学的試薬および実験器材の製造業者からの製品情報もまた、既知の生物
学的手法に有用な情報を提供する。かかる製造業者は、シグマ化学社(セントル
イス、ミズーリ州)、R&Dシステムズ(ミネアポリス、ミネソタ州)、ファル
マシアLKBバイオケミストリー(ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャー
ジー州)、クロンテックラボラトリーズ社(パロウアルトウ、カリフォルニア州
)、ケムジーンズコープ(Chem. Genes Corp.)、オールドリッチケミカルカン パニー(Aldrich Chemical Company) (ミルウォーキー、ウィスコンシン州)、
グレンリサーチ社(Glen Research, Inc)、ギブコBRLライフテクノロジーズ社 (GIBCO BRL Life Technologies, Inc.)(ガイザースバーグ(Gaithersberg)、
メリーランド州)、フルカケミカ-ビオケミカアナリティカ(Fluka Chemica-Bio
chemika Analytika(Fluka Chemie AG、ブックス(Buchs)、スイス)、インヴィ
トロジェン(Invitrogen)、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびアプライ ドバイオシステムズ(Applied Biosystems )(フォスターシティー、カリフォル
ニア州)、ならびに熟練者に周知の他の多くの商業用の供給源を含む。
【0071】 本発明の核酸組成物は、RNAであれ、cDNAであれ、ゲノムDNAであれ
、あるいは種々の組み合わせによるハイブリッドであれ、生体供給源から単離さ
れるか、またはインヴィトロにおいて合成される。本発明の核酸は、トランスフ
ォームまたはトランスフェクトされた全細胞中か、トランスフォームまたはトラ
ンスフェクトされた細胞溶解物中に存在するか、または部分的に精製されたかま
たは実質的に純粋な形で存在する。
、あるいは種々の組み合わせによるハイブリッドであれ、生体供給源から単離さ
れるか、またはインヴィトロにおいて合成される。本発明の核酸は、トランスフ
ォームまたはトランスフェクトされた全細胞中か、トランスフォームまたはトラ
ンスフェクトされた細胞溶解物中に存在するか、または部分的に精製されたかま
たは実質的に純粋な形で存在する。
【0072】 分子プローブとして用いるための配列の増幅に、あるいは次に続くサブクロー
ニングのための核酸フラグメントの生成に適した、インヴィトロの増幅技術につ
いては周知である。かかるインヴィトロの増幅法を通して熟練者を指示するのに
十分な技術の実例は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) リガーゼ連鎖反応(L CR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼを介する技術(
たとえばNASBA)を含み、Berger、Sambrook、およびAusubelならびに、Mul
lis等(1987)の米国特許第4,683,202号;PCR Protocols A Guide to Methods a
nd Applications(Innis等編)アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォ
ルニア州(1990)(Innis);Arnheim および Levinson(1990年10月1日)C& EN
36 - 47;The Journal Of NIH Research(1991)3, 81 - 94;(Kwoh 等(1989 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173;Guatelli 等(1990) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 87, 1874;Lomell 等(1989)J. Clin. Chem 35, 1826;Landegr
en 等,(1988)Science 241, 1077 - 1080;Van Brunt(1990)Biochemistry 8,
291 - 294;Wu および Wallace,(1989)Gene 4, 560;Barringer 等(1990)G
ene 89, 117、およびSooknanan および Malek(1995)Biotechnology 13 : 563
- 564に見られる。増幅された核酸のインビトロにおける改良されたクローニン グ法は、Wallace等の米国特許第5,426,039号に記述されている。
ニングのための核酸フラグメントの生成に適した、インヴィトロの増幅技術につ
いては周知である。かかるインヴィトロの増幅法を通して熟練者を指示するのに
十分な技術の実例は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) リガーゼ連鎖反応(L CR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼを介する技術(
たとえばNASBA)を含み、Berger、Sambrook、およびAusubelならびに、Mul
lis等(1987)の米国特許第4,683,202号;PCR Protocols A Guide to Methods a
nd Applications(Innis等編)アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォ
ルニア州(1990)(Innis);Arnheim および Levinson(1990年10月1日)C& EN
36 - 47;The Journal Of NIH Research(1991)3, 81 - 94;(Kwoh 等(1989 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173;Guatelli 等(1990) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 87, 1874;Lomell 等(1989)J. Clin. Chem 35, 1826;Landegr
en 等,(1988)Science 241, 1077 - 1080;Van Brunt(1990)Biochemistry 8,
291 - 294;Wu および Wallace,(1989)Gene 4, 560;Barringer 等(1990)G
ene 89, 117、およびSooknanan および Malek(1995)Biotechnology 13 : 563
- 564に見られる。増幅された核酸のインビトロにおける改良されたクローニン グ法は、Wallace等の米国特許第5,426,039号に記述されている。
【0073】 たとえばインヴィトロの増幅法においてプローブとして使用するための、また
は遺伝子プローブとして、あるいは阻害成分(たとえばリボザイム)として使用
するためのオリゴヌクレオチドは、典型的にはBeaucageおよび Caruthers(1981
), Tetrahedron Letts., 22 (20) : 1859 - 1862に記述されている固相ホスホロ
アミダイトトリエステル法により、たとえばNeedham - VanDevanter 等(1984)
Nucleic Acid Res., 12 : 6159 - 6168に述べられているような自動合成装置を 用いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドはまた熟練者には周知の種々の
商業的な供給源に誂えて作らせ、取り寄せることも可能である。オリゴヌクレオ
チドの精製は、必要な場合には、典型的にはPersonおよび Regnier(1983)J. C
hrom. 255 : 137 - 149に記述されているように、未変性のアクリルアミドゲル 電気泳動法かまたは陰イオン交換HPLCのいずれかにより行なわれる。合成オ
リゴヌクレオチドの配列は、Grossman & Moldave(共編)アカデミックプレス、ニ
ューヨーク、Methods in Enzymology 65 : 499 - 560のMaxam およびGilbert(1
980)による化学的分解法を用いて確認することができる。
は遺伝子プローブとして、あるいは阻害成分(たとえばリボザイム)として使用
するためのオリゴヌクレオチドは、典型的にはBeaucageおよび Caruthers(1981
), Tetrahedron Letts., 22 (20) : 1859 - 1862に記述されている固相ホスホロ
アミダイトトリエステル法により、たとえばNeedham - VanDevanter 等(1984)
Nucleic Acid Res., 12 : 6159 - 6168に述べられているような自動合成装置を 用いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドはまた熟練者には周知の種々の
商業的な供給源に誂えて作らせ、取り寄せることも可能である。オリゴヌクレオ
チドの精製は、必要な場合には、典型的にはPersonおよび Regnier(1983)J. C
hrom. 255 : 137 - 149に記述されているように、未変性のアクリルアミドゲル 電気泳動法かまたは陰イオン交換HPLCのいずれかにより行なわれる。合成オ
リゴヌクレオチドの配列は、Grossman & Moldave(共編)アカデミックプレス、ニ
ューヨーク、Methods in Enzymology 65 : 499 - 560のMaxam およびGilbert(1
980)による化学的分解法を用いて確認することができる。
【0074】 (保存的置換の作成) 熟練者には、開示された核酸構築物の数多の保存性の変異が機能的に同等な構
築物をもたらすことが理解されよう。たとえば、遺伝コードの縮重による「サイ
レントな置換」(すなわち、コード化されたポリペプチドに変化を生じる結果に
ならない核酸配列の置換)は、アミノ酸をコード化している核酸配列のすべてが
暗に含んでいる特性である。同様に、パッケージングまたはパッケージング可能
な構築物のアミノ酸配列における一つまたは数個のアミノ酸における「保存的ア
ミノ酸置換」は、非常に類似した性質をもつ異なるアミノ酸によって置換されて
おり(定義の章、前出、参照)、また開示された構築物に非常に類似しているこ
とで容易に同定される。各々明白に開示された配列についての、保存的に置換さ
れたかかる変異体は、本発明の一つの特徴である。
築物をもたらすことが理解されよう。たとえば、遺伝コードの縮重による「サイ
レントな置換」(すなわち、コード化されたポリペプチドに変化を生じる結果に
ならない核酸配列の置換)は、アミノ酸をコード化している核酸配列のすべてが
暗に含んでいる特性である。同様に、パッケージングまたはパッケージング可能
な構築物のアミノ酸配列における一つまたは数個のアミノ酸における「保存的ア
ミノ酸置換」は、非常に類似した性質をもつ異なるアミノ酸によって置換されて
おり(定義の章、前出、参照)、また開示された構築物に非常に類似しているこ
とで容易に同定される。各々明白に開示された配列についての、保存的に置換さ
れたかかる変異体は、本発明の一つの特徴である。
【0075】 熟練者には、所与の核酸構築物に変異を産みだす数多の方法が認識されよう。
かかる周知の方法は、部位特異的突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを用い
るPCR増幅、当該核酸を含んでいる細胞の、突然変異誘発剤または放射線への
接触、所望のオリゴヌクレオチドの化学的合成(たとえば連結および/または巨
大核酸を生じるためのクローニングと関連して)、および他の周知な方法を含む
。Giliman Smith(1979)Gene 8 : 81 - 97、Roberts 等(1987)Nature 328 :
731 - 734、ならびにSambrook, Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter
およびMullis(すべて前出)参照のこと。
かかる周知の方法は、部位特異的突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを用い
るPCR増幅、当該核酸を含んでいる細胞の、突然変異誘発剤または放射線への
接触、所望のオリゴヌクレオチドの化学的合成(たとえば連結および/または巨
大核酸を生じるためのクローニングと関連して)、および他の周知な方法を含む
。Giliman Smith(1979)Gene 8 : 81 - 97、Roberts 等(1987)Nature 328 :
731 - 734、ならびにSambrook, Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter
およびMullis(すべて前出)参照のこと。
【0076】 熟練者は、提供された配列と、レトロウイルス全般についてのこの技術の知識
とに基づき、本発明の所望の核酸を選択することができる。レトロウイルスゲノ
ムにおける多数の突然変異の特異的な影響が知られている。さらに、タンパク質
ならびに核酸の性質に関する全般的な知識は、熟練者に、本文の一覧表に開示さ
れた核酸ならびにタンパク質に類似または同等の活性をもつ適切な配列を選択す
ることができるようにする。本文の定義の章は、見本となる保存的なアミノ酸置
換について述べている。
とに基づき、本発明の所望の核酸を選択することができる。レトロウイルスゲノ
ムにおける多数の突然変異の特異的な影響が知られている。さらに、タンパク質
ならびに核酸の性質に関する全般的な知識は、熟練者に、本文の一覧表に開示さ
れた核酸ならびにタンパク質に類似または同等の活性をもつ適切な配列を選択す
ることができるようにする。本文の定義の章は、見本となる保存的なアミノ酸置
換について述べている。
【0077】 最後に、核酸に対する修飾はほとんどが、所望の特徴に適した分析法における
型通りのスクリーニング技術により評価される。たとえば、コード化されたポリ
ペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免疫学的分析法によって検出す
ることができる。相補的な核酸に対する核酸のハイブリッド形成、コード化され
たタンパク質の酸化還元または熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受
性、または凝集する傾向等の、他の特性の修飾は、すべて標準的な技術により分
析した。
型通りのスクリーニング技術により評価される。たとえば、コード化されたポリ
ペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免疫学的分析法によって検出す
ることができる。相補的な核酸に対する核酸のハイブリッド形成、コード化され
たタンパク質の酸化還元または熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受
性、または凝集する傾向等の、他の特性の修飾は、すべて標準的な技術により分
析した。
【0078】 (安定なパッケージング細胞系の作成) 安定なパッケージング細胞系は、哺乳類細胞をパッケージングプラスミドを用
いて安定性に、または一過性に形質導入することにより、最も好ましくはヒト細
胞を形質導入することにより作成される。哺乳類(ヒトを含む)細胞の形質導入
は、この技術では周知である。宿主細胞は形質転換についてコンピテントである
か、または種々の既知の手段によりコンピテントにされる。動物細胞内にDNA
を導入するいくつかの周知の方法がある。これらは:リン酸カルシウム沈殿法、
DNAを含んでいる細菌プロトプラストと受容細胞との融合、DNAを含んでい
るリポソームを用いた受容細胞の処理、DEAEデキストラン法、受容体仲介エ
ンドサイトーシス、電気穿孔、および細胞内へのDNAの直接的なマイクロイン
ジェクションを含む。
いて安定性に、または一過性に形質導入することにより、最も好ましくはヒト細
胞を形質導入することにより作成される。哺乳類(ヒトを含む)細胞の形質導入
は、この技術では周知である。宿主細胞は形質転換についてコンピテントである
か、または種々の既知の手段によりコンピテントにされる。動物細胞内にDNA
を導入するいくつかの周知の方法がある。これらは:リン酸カルシウム沈殿法、
DNAを含んでいる細菌プロトプラストと受容細胞との融合、DNAを含んでい
るリポソームを用いた受容細胞の処理、DEAEデキストラン法、受容体仲介エ
ンドサイトーシス、電気穿孔、および細胞内へのDNAの直接的なマイクロイン
ジェクションを含む。
【0079】 本発明と関連して使用される細胞培養物は、細胞系と、組織または血液検体か
らの培養細胞とを含み、この技術においては周知である。Freshney(Culture of
Animal Cells, a Manual of Basic Technique、第3版ウィリー-リス(Wiley-Li
ss)、ニューヨーク(1994))およびそれに引用された参考文献は、細胞培養に
ついての全般的な手引きを提供する。形質転換された細胞はこの技術に周知の手
段により培養される。Kuchler et al. (1977)Biochemical Methods in Cell Cu
lture and Virology, Kuchler, R. J.、ダウドン、ハチンソン、およびロス社(
Dowden, Hutchinson and Ross, Inc)も参照のこと。哺乳類細胞のシステムはし
ばしば単層の細胞形態をとることがあるが、哺乳類細胞の懸濁物もまた使用され
る。例証となる哺乳類の細胞系は、VEROならびにHeLa細胞、293胚性
腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、W138、BHK、
Cos−7、またはMDCK細胞系を含む(たとえばFreshney、前出、参照)。
ヒトの細胞は最も好ましい。
らの培養細胞とを含み、この技術においては周知である。Freshney(Culture of
Animal Cells, a Manual of Basic Technique、第3版ウィリー-リス(Wiley-Li
ss)、ニューヨーク(1994))およびそれに引用された参考文献は、細胞培養に
ついての全般的な手引きを提供する。形質転換された細胞はこの技術に周知の手
段により培養される。Kuchler et al. (1977)Biochemical Methods in Cell Cu
lture and Virology, Kuchler, R. J.、ダウドン、ハチンソン、およびロス社(
Dowden, Hutchinson and Ross, Inc)も参照のこと。哺乳類細胞のシステムはし
ばしば単層の細胞形態をとることがあるが、哺乳類細胞の懸濁物もまた使用され
る。例証となる哺乳類の細胞系は、VEROならびにHeLa細胞、293胚性
腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、W138、BHK、
Cos−7、またはMDCK細胞系を含む(たとえばFreshney、前出、参照)。
ヒトの細胞は最も好ましい。
【0080】 本発明のパッケージング細胞の細胞培養物からの上清は、前出のFreshneyに教
示されたものと同様の標準的な技術を用いて取得される。また、Corbeau 等(19
96)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 14070 - 14075およびその参考文献も参 照のこと。細胞上清からの成分は、標準的な技術を用いてさらに精製することが
できる。たとえば、この上清中のFIV粒子は遠心分離法、クロマトグラフ法、
親和性による精製法、その他のようなウイルス精製に典型的に用いられる方法に
より、当該上清から精製することができる。
示されたものと同様の標準的な技術を用いて取得される。また、Corbeau 等(19
96)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 14070 - 14075およびその参考文献も参 照のこと。細胞上清からの成分は、標準的な技術を用いてさらに精製することが
できる。たとえば、この上清中のFIV粒子は遠心分離法、クロマトグラフ法、
親和性による精製法、その他のようなウイルス精製に典型的に用いられる方法に
より、当該上清から精製することができる。
【0081】 核酸を用いた哺乳類細胞の形質転換は、たとえば、FIV粒子をコード化して
いる核酸を含んでいるプラスミドと共にコンピテント細胞をインキュベートする
ことを含んでもよい。宿主細胞を形質転換するべく用いられるプラスミドは、好
ましくは、転写を開始するための核酸配列と、コード化された配列の翻訳を調節
するための配列とを含む。このような配列は一般的に発現調節配列と呼ばれる。
哺乳類の発現調節配列の実例は、SV−40プロモーター(Science(1983)222
: 524 - 527)、CMV I.E.プロモーター(Proc. Natl. Acad. Sci. (1984
)81 : 659 - 663)、CMVプロモーター、またはメタロチオネインプロモータ
ー(Nature(1982)296 : 39 - 42)から得られる。発現調節配列を含んでいる クローニングベクターは、制限酵素を用いて切断され、必要な、または所望の大
きさに調整され、さらにこの技術に周知の手段により、興味のHIV配列をコー
ドしているDNAと連結される。ヒト細胞において活性のある非常に多種類の特
異的なpolIIおよびpolIIIプロモーターはこの技術においては周知であり 、熟練者は所望の発現レベル、パターン、形質転換細胞、またはその他に基づき
、かかるプロモーターを選択して使用することができる。
いる核酸を含んでいるプラスミドと共にコンピテント細胞をインキュベートする
ことを含んでもよい。宿主細胞を形質転換するべく用いられるプラスミドは、好
ましくは、転写を開始するための核酸配列と、コード化された配列の翻訳を調節
するための配列とを含む。このような配列は一般的に発現調節配列と呼ばれる。
哺乳類の発現調節配列の実例は、SV−40プロモーター(Science(1983)222
: 524 - 527)、CMV I.E.プロモーター(Proc. Natl. Acad. Sci. (1984
)81 : 659 - 663)、CMVプロモーター、またはメタロチオネインプロモータ
ー(Nature(1982)296 : 39 - 42)から得られる。発現調節配列を含んでいる クローニングベクターは、制限酵素を用いて切断され、必要な、または所望の大
きさに調整され、さらにこの技術に周知の手段により、興味のHIV配列をコー
ドしているDNAと連結される。ヒト細胞において活性のある非常に多種類の特
異的なpolIIおよびpolIIIプロモーターはこの技術においては周知であり 、熟練者は所望の発現レベル、パターン、形質転換細胞、またはその他に基づき
、かかるプロモーターを選択して使用することができる。
【0082】 既知の哺乳動物の遺伝子からのポリアデニル化または転写終結配列は、典型的
には本発明のベクターに取り込まれる。ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデ
ニル化配列は、終結配列の一例である。転写物の正確なスプラシシングのための
配列もまた含まれてよい。スプライシング配列の実例はSV40からのVP1イ
ントロンである(Sprague等(1983)J. Virol. 45 : 773 - 781)。さらに、特 定の宿主細胞における複製を調節する遺伝子配列は、ウシパピローマウイルス型
のベクターに見られるようなベクターに取り込まれる。Saveria - Campo(1985 )の、DNA Cloning 第2巻a Practical Approach、第213 - 238頁における"Bovi
ne Papillooma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector"、Glover(編)、IR
L出版、アーリントン、バージニア州、参照のこと。
には本発明のベクターに取り込まれる。ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデ
ニル化配列は、終結配列の一例である。転写物の正確なスプラシシングのための
配列もまた含まれてよい。スプライシング配列の実例はSV40からのVP1イ
ントロンである(Sprague等(1983)J. Virol. 45 : 773 - 781)。さらに、特 定の宿主細胞における複製を調節する遺伝子配列は、ウシパピローマウイルス型
のベクターに見られるようなベクターに取り込まれる。Saveria - Campo(1985 )の、DNA Cloning 第2巻a Practical Approach、第213 - 238頁における"Bovi
ne Papillooma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector"、Glover(編)、IR
L出版、アーリントン、バージニア州、参照のこと。
【0083】 コプラスミドを選択法に用いることができる。このような方法においては、抗
生物質耐性遺伝子等の選択可能マーカーを含んでいるプラスミドが、HIVパッ
ケージング核酸をコード化しているプラスミドと共に細胞をコトランスフェクト
するべく用いられる。細胞は抗生物質耐性について選択され、興味のプラスミド
の存在はサザン分析法、ノーザン分析法、またはPCRにより確認される。HI
V粒子の表面上に発現されるべきタンパク質(たとえば、VSVエンベロープ等
のキャプシドの宿主範囲を広げるタンパク質、細胞リセプターリガンド、または
細胞リセプターに対する抗体)をコード化しているコプラスミドは、任意にパッ
ケージング細胞に形質導入される。VSVに加えて、他の脂質エンベロープに被
われたウイルスのエンベロープタンパク質は、任意に本発明の粒子に取り込まれ
、それにより粒子の形質導入範囲が拡張される。
生物質耐性遺伝子等の選択可能マーカーを含んでいるプラスミドが、HIVパッ
ケージング核酸をコード化しているプラスミドと共に細胞をコトランスフェクト
するべく用いられる。細胞は抗生物質耐性について選択され、興味のプラスミド
の存在はサザン分析法、ノーザン分析法、またはPCRにより確認される。HI
V粒子の表面上に発現されるべきタンパク質(たとえば、VSVエンベロープ等
のキャプシドの宿主範囲を広げるタンパク質、細胞リセプターリガンド、または
細胞リセプターに対する抗体)をコード化しているコプラスミドは、任意にパッ
ケージング細胞に形質導入される。VSVに加えて、他の脂質エンベロープに被
われたウイルスのエンベロープタンパク質は、任意に本発明の粒子に取り込まれ
、それにより粒子の形質導入範囲が拡張される。
【0084】 選択された配列をコード化する核酸を含んでいるウイルスベクターもまた、ベ
クターの宿主範囲内の細胞を形質転換するべく用いられる。Method in Enzymolo
gy第185巻、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州(C. V. G
oeddel編)(1990)、またはM. Krieger、Gene Transfer and Expression - - A
Laboratory Manual、ストックトン出版、ニューヨーク、ニューヨーク州(1990
)およびそれに引用された参考文献参照のこと。
クターの宿主範囲内の細胞を形質転換するべく用いられる。Method in Enzymolo
gy第185巻、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州(C. V. G
oeddel編)(1990)、またはM. Krieger、Gene Transfer and Expression - - A
Laboratory Manual、ストックトン出版、ニューヨーク、ニューヨーク州(1990
)およびそれに引用された参考文献参照のこと。
【0085】 一旦安定な形質転換された細胞系が作られ、それがFIV粒子を発現すれば、
この形質転換された細胞系は、FIVベクターに取り込まれるべき核酸をコード
化しているベクターを用いてトランスフェクトされる。典型的には、このような
ベクターはプラスミドであるか、またはウイルスベクター内にコード化されてい
る。パッケージングされた核酸は、ウイルスインヒビターまたは他の治療用遺伝
子等の興味の配列とと共に、FIVのパッケージング部位のサブシーケンス(su
bsequence)を含む(HIV感染、HTLV感染、リンパ腫、白血病、神経腫、そ
の他を含め、非***細胞またはそれらの子孫に媒介されるいかなる状態も、本発
明のベクターを用いて処置できることが理解されよう)。
この形質転換された細胞系は、FIVベクターに取り込まれるべき核酸をコード
化しているベクターを用いてトランスフェクトされる。典型的には、このような
ベクターはプラスミドであるか、またはウイルスベクター内にコード化されてい
る。パッケージングされた核酸は、ウイルスインヒビターまたは他の治療用遺伝
子等の興味の配列とと共に、FIVのパッケージング部位のサブシーケンス(su
bsequence)を含む(HIV感染、HTLV感染、リンパ腫、白血病、神経腫、そ
の他を含め、非***細胞またはそれらの子孫に媒介されるいかなる状態も、本発
明のベクターを用いて処置できることが理解されよう)。
【0086】 ヒトの細胞は好ましいパッケージング細胞系であり、上記の技術により形質転
換を可能にすることができる。たとえば、安定したFIVパッケージング細胞系
を産生するために、FIV細胞は本文の実施例に述べられたカルシウムリン酸法
によりトランスフェクトされる。たとえば、6ウェルプレート(カスター(Cost
ar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)中の集密に近い培養物を、直鎖化し 、リン酸カルシウム法により沈殿したプラスミド(10μg)により、たとえば、 10%FCS、抗生物質、およびグルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培
養液(DMEM - 10%FCS)において、任意にコプラスミドマーカーと共にトランス フェクトする。18時間後、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)pH7.
8を用いてウェルを洗浄し、HEPES緩衝化生理食塩水(50 mM HEPES pH 7.1, 280
m M NaCl, 1.5 m M Na2HPO4)中の15%グリセロール溶液と共に20℃にて2
分間インキュベートし、PBSを用いて2回洗浄し、さらにDMEM - 10%FCS中で培養
する。細胞を形質導入マーカー遺伝子に適した選択にかける。
換を可能にすることができる。たとえば、安定したFIVパッケージング細胞系
を産生するために、FIV細胞は本文の実施例に述べられたカルシウムリン酸法
によりトランスフェクトされる。たとえば、6ウェルプレート(カスター(Cost
ar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)中の集密に近い培養物を、直鎖化し 、リン酸カルシウム法により沈殿したプラスミド(10μg)により、たとえば、 10%FCS、抗生物質、およびグルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培
養液(DMEM - 10%FCS)において、任意にコプラスミドマーカーと共にトランス フェクトする。18時間後、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)pH7.
8を用いてウェルを洗浄し、HEPES緩衝化生理食塩水(50 mM HEPES pH 7.1, 280
m M NaCl, 1.5 m M Na2HPO4)中の15%グリセロール溶液と共に20℃にて2
分間インキュベートし、PBSを用いて2回洗浄し、さらにDMEM - 10%FCS中で培養
する。細胞を形質導入マーカー遺伝子に適した選択にかける。
【0087】 (パッケージング細胞系、標的細胞、および細胞溶解物におけるパッケージング
プラスミド、パッケージング可能な核酸、およびFIV粒子の分析) 広く多様な方式ならびに標識が、パッケージング細胞、標的細胞、患者、およ
び細胞溶解物におけるパッケージングプラスミド、パッケージング可能な核酸、
およびレンチウイルス粒子の検出に利用でき、また適している。レンチウイルス
成分に対する抗体と、本発明のポリペプチドならびに核酸(ベクター、パッケー
ジングプラスミド、コード化された核酸およびポリペプチド、その他)は、当業
者に周知の数多くの手段により検出ならびに定量される。これらは、分光光度法
、X線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフ
法(HPLC)、薄層クロマトグラフ法(TLC)、超拡散クロマトグラフ法そ
の他のような分析用の生化学的方法と、液体またはゲル沈降反応法、免疫拡散法
(一重または二重)、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIAS)、エ
ンザイムイムノアッセイ(ELISA)、免疫蛍光分析法その他のような種々の
免疫学的方法とを含む。レンチウイルス成分(たとえばFIV)の検出用には、
いくつかの入手可能なELISA分析法が利用でき、熟練者が非霊長類レンチウ
イルス粒子か、または非哺乳類レンチウイルスを生体試料中に検出することを可
能にする。
プラスミド、パッケージング可能な核酸、およびFIV粒子の分析) 広く多様な方式ならびに標識が、パッケージング細胞、標的細胞、患者、およ
び細胞溶解物におけるパッケージングプラスミド、パッケージング可能な核酸、
およびレンチウイルス粒子の検出に利用でき、また適している。レンチウイルス
成分に対する抗体と、本発明のポリペプチドならびに核酸(ベクター、パッケー
ジングプラスミド、コード化された核酸およびポリペプチド、その他)は、当業
者に周知の数多くの手段により検出ならびに定量される。これらは、分光光度法
、X線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフ
法(HPLC)、薄層クロマトグラフ法(TLC)、超拡散クロマトグラフ法そ
の他のような分析用の生化学的方法と、液体またはゲル沈降反応法、免疫拡散法
(一重または二重)、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIAS)、エ
ンザイムイムノアッセイ(ELISA)、免疫蛍光分析法その他のような種々の
免疫学的方法とを含む。レンチウイルス成分(たとえばFIV)の検出用には、
いくつかの入手可能なELISA分析法が利用でき、熟練者が非霊長類レンチウ
イルス粒子か、または非哺乳類レンチウイルスを生体試料中に検出することを可
能にする。
【0088】 核酸の検出は、サザン分析法、ノーザン分析法、ゲル電気泳動法、PCR、放
射標識ならびにシンチレーションカウンティング、およびアフィニティクロマト
グラフィーのような周知の方法により進められる。Tijssen(1993)Laboratory
Techniques in biochemistry and molecular biology - hybridization with nu
cleic acid probes 第I部および第II部、エルセヴィア(Elsevier)、ニューヨ ークおよびChoo(編)(1994)Methods In Molecular Biology 第33巻 - In S
itu Hybridization Protocols フマーナプレス社(Humana Press Inc.)、ニュー
ジャージー州(Methods in Molecular Biologyシリーズの他の本も参照のこと)
において総説されたものを含む多くの分析方式が適しており、特にChoo(同著)
の“Detection of Virus Nucleic Acid by Radioactive and Nonisotopic in Si
tu Hybridization”の第21章を参照のこと。種々の自動化された固相検出技術
も適している。たとえば、超大量固定化ポリマーアレイ(VLSIPSTM)が核
酸の検出に用いられる。Tijssen(前出)、Fodor等、(1991) Science, 251 : 7
67 - 777およびSheldon等(1993)Clinical Chemistry 39(4) : 718 - 719参照 。最後に、生体試料中の核酸検出には、PCRもまた日常的に用いられる(PC
R技術の全般的な記述についてはInnis、前出参照)。
射標識ならびにシンチレーションカウンティング、およびアフィニティクロマト
グラフィーのような周知の方法により進められる。Tijssen(1993)Laboratory
Techniques in biochemistry and molecular biology - hybridization with nu
cleic acid probes 第I部および第II部、エルセヴィア(Elsevier)、ニューヨ ークおよびChoo(編)(1994)Methods In Molecular Biology 第33巻 - In S
itu Hybridization Protocols フマーナプレス社(Humana Press Inc.)、ニュー
ジャージー州(Methods in Molecular Biologyシリーズの他の本も参照のこと)
において総説されたものを含む多くの分析方式が適しており、特にChoo(同著)
の“Detection of Virus Nucleic Acid by Radioactive and Nonisotopic in Si
tu Hybridization”の第21章を参照のこと。種々の自動化された固相検出技術
も適している。たとえば、超大量固定化ポリマーアレイ(VLSIPSTM)が核
酸の検出に用いられる。Tijssen(前出)、Fodor等、(1991) Science, 251 : 7
67 - 777およびSheldon等(1993)Clinical Chemistry 39(4) : 718 - 719参照 。最後に、生体試料中の核酸検出には、PCRもまた日常的に用いられる(PC
R技術の全般的な記述についてはInnis、前出参照)。
【0089】 一つの好ましい態様においては、抗体は、パッケージングされたベクターによ
り発現されたタンパク質、パッケージング核酸、を検出するため、または循環し
ているHIV、HTLV(または他の関連する病原体)、ヒト血液中のレベルを
監視するため、たとえばFIVをパッケージングされた核酸にコード化された遺
伝子治療薬剤のインヴィヴォの影響を監視するために用いられる。他の態様にお
いては、抗体はウイルス粒子に取り込まれるべく、パッケージング細胞において
同時発現される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造法は、当業者
には周知であり、多くの抗体が利用できる。Coligan(1991)Current Protocols
in Immunology ウィリー/グリーン(Wiley/Greene)、ニューヨーク;およびH
arlowおよびLane(1989)Antibodies : A Laboratory Manualコールドスプリン グハーバー出版、ニューヨーク;Stites等(共編)Basic and Clinical Immunol
ogy(第4版)ランゲメディカルパブリケイションズ(Lange Medical Publicati
ons)、ロスアルトス、カリフォルニア州、およびそれに引用された参考文献;Go
ding(1986)Monoclonal Antibodies : Princeples and Practice(第2版)アカ
デミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク州;およびKohlerおよびMilstein
(1975)Nature 256 : 495 - 497参照のこと。抗体の調製についての他の適切な
技術は、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選
択を含む。Hues等(1989)Science 246 : 1275 - 1281;およびWard等(1989)N
ature 341 : 544 - 546参照のこと。特異的なモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体および抗血清は、少なくとも約 .1μMのKDをもち、好ましくは少なく
とも約 .01μMまたはそれよりよく、また最も典型的かつ好ましくは .001 μMかまたはそれよりよい。
り発現されたタンパク質、パッケージング核酸、を検出するため、または循環し
ているHIV、HTLV(または他の関連する病原体)、ヒト血液中のレベルを
監視するため、たとえばFIVをパッケージングされた核酸にコード化された遺
伝子治療薬剤のインヴィヴォの影響を監視するために用いられる。他の態様にお
いては、抗体はウイルス粒子に取り込まれるべく、パッケージング細胞において
同時発現される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造法は、当業者
には周知であり、多くの抗体が利用できる。Coligan(1991)Current Protocols
in Immunology ウィリー/グリーン(Wiley/Greene)、ニューヨーク;およびH
arlowおよびLane(1989)Antibodies : A Laboratory Manualコールドスプリン グハーバー出版、ニューヨーク;Stites等(共編)Basic and Clinical Immunol
ogy(第4版)ランゲメディカルパブリケイションズ(Lange Medical Publicati
ons)、ロスアルトス、カリフォルニア州、およびそれに引用された参考文献;Go
ding(1986)Monoclonal Antibodies : Princeples and Practice(第2版)アカ
デミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク州;およびKohlerおよびMilstein
(1975)Nature 256 : 495 - 497参照のこと。抗体の調製についての他の適切な
技術は、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選
択を含む。Hues等(1989)Science 246 : 1275 - 1281;およびWard等(1989)N
ature 341 : 544 - 546参照のこと。特異的なモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体および抗血清は、少なくとも約 .1μMのKDをもち、好ましくは少なく
とも約 .01μMまたはそれよりよく、また最も典型的かつ好ましくは .001 μMかまたはそれよりよい。
【0090】 (本発明の核酸の分子プローブとしての使用) パッケージング細胞系の作成に利用することに加えて、本発明の非感染性のパ
ッケージングプラスミドは、サザンまたはノーザンブロット分析法を用いた生体
試料中の野性型ウイルスの検出に使用することができる。簡単に言えば、パッケ
ージングプラスミドにコード化された核酸を、典型的には放射性または生物発光
標識を用いて標識し、ウイルス(FIV、有蹄類レトロウイルス等)を含んでい
ると思われる試料のノーザンまたはサザンブロットをプローブするべく用いられ
る。プローブとしてのパッケージングプラスミドの使用は、感染性ウイルスのプ
ローブとしての使用よりも安全である。パッケージングプラスミドはまた、より
小さいプローブよりも野性型ウイルスを検出しやすいが、それは小さいプローブ
と異なり、パッケージングプラスミドプローブは、野性型ウイルスと同じように
(パッケージング部位を除いて)任意に事実上完全なゲノムをもち、プローブ結
合部位の突然変異によって野性型ウイルスが検出を免れることがないようにする
からである。
ッケージングプラスミドは、サザンまたはノーザンブロット分析法を用いた生体
試料中の野性型ウイルスの検出に使用することができる。簡単に言えば、パッケ
ージングプラスミドにコード化された核酸を、典型的には放射性または生物発光
標識を用いて標識し、ウイルス(FIV、有蹄類レトロウイルス等)を含んでい
ると思われる試料のノーザンまたはサザンブロットをプローブするべく用いられ
る。プローブとしてのパッケージングプラスミドの使用は、感染性ウイルスのプ
ローブとしての使用よりも安全である。パッケージングプラスミドはまた、より
小さいプローブよりも野性型ウイルスを検出しやすいが、それは小さいプローブ
と異なり、パッケージングプラスミドプローブは、野性型ウイルスと同じように
(パッケージング部位を除いて)任意に事実上完全なゲノムをもち、プローブ結
合部位の突然変異によって野性型ウイルスが検出を免れることがないようにする
からである。
【0091】 さらに、パッケージングプラスミドはポジテジブコントロールとして、対応す
るレトロウイルス(たとえばFIV)の検出のための、基本的にすべての既知の
検出法に用いることができる。この態様においては、パッケージングプラスミド
の核酸またはコード化されたタンパク質は、FIV検出分析が適切に機能してい
ることを立証するべく、ポジティブコントロールとして用いられる。たとえばオ
リゴヌクレオチドは、獣医学的な背景においてネコの血液等の生体試料中のFI
V核酸を検出するべく、PCR反応におけるプライマーとして用いられる。パッ
ケージングプラスミドは、増幅されるべき領域に相当する核酸のサブシーケンス
を含んでおり、ヒト血液などの生体試料からの別の反応において、増殖の鋳型と
して、PCR試薬ならびにハイブリッド形成条件が適切であることを決定するべ
く用いられる。同様に、パッケージングプラスミドにコード化されたポリペプチ
ドは、生体試料中のFIV発現産物の検出のための分析において、ELISA試
薬をチェックするべく用いることができる。
るレトロウイルス(たとえばFIV)の検出のための、基本的にすべての既知の
検出法に用いることができる。この態様においては、パッケージングプラスミド
の核酸またはコード化されたタンパク質は、FIV検出分析が適切に機能してい
ることを立証するべく、ポジティブコントロールとして用いられる。たとえばオ
リゴヌクレオチドは、獣医学的な背景においてネコの血液等の生体試料中のFI
V核酸を検出するべく、PCR反応におけるプライマーとして用いられる。パッ
ケージングプラスミドは、増幅されるべき領域に相当する核酸のサブシーケンス
を含んでおり、ヒト血液などの生体試料からの別の反応において、増殖の鋳型と
して、PCR試薬ならびにハイブリッド形成条件が適切であることを決定するべ
く用いられる。同様に、パッケージングプラスミドにコード化されたポリペプチ
ドは、生体試料中のFIV発現産物の検出のための分析において、ELISA試
薬をチェックするべく用いることができる。
【0092】 パッケージング可能な核酸もまた、たとえばそれらがHIVパッケージング部
位、HIV LTRs、トランスドミナントTatまたはRevタンパク質、ま たはその他のようなHIV成分をコード化している場合には、HIVの検出のた
めの分子プローブとして、またはHIV検出試薬として、同様なやり方で用いる
ことができる。
位、HIV LTRs、トランスドミナントTatまたはRevタンパク質、ま たはその他のようなHIV成分をコード化している場合には、HIVの検出のた
めの分子プローブとして、またはHIV検出試薬として、同様なやり方で用いる
ことができる。
【0093】 (細胞の形質転換と遺伝子治療) 本発明はインヴィトロおよびインヴィヴォでの細胞の形質転換のためのパッケ
ージャブル核酸を提供する。これらのパッケージャブル核酸は、本文に述べたレ
ンチウイルスパッケージング細胞系において、FIV粒子等の非霊長類レンチウ
イルス粒子内にパッケージングされる。好ましくは、標的がVSVウイルスの宿
主範囲にある場合(たとえば造血幹細胞)、粒子もまたVSV糖タンパク質を含
む。核酸は、核酸を取り囲んでいるFIV粒子と、FIVまたはVSVの細胞リ
セプターとの相互作用を介して細胞内にトランスフェクトされる。
ージャブル核酸を提供する。これらのパッケージャブル核酸は、本文に述べたレ
ンチウイルスパッケージング細胞系において、FIV粒子等の非霊長類レンチウ
イルス粒子内にパッケージングされる。好ましくは、標的がVSVウイルスの宿
主範囲にある場合(たとえば造血幹細胞)、粒子もまたVSV糖タンパク質を含
む。核酸は、核酸を取り囲んでいるFIV粒子と、FIVまたはVSVの細胞リ
セプターとの相互作用を介して細胞内にトランスフェクトされる。
【0094】 一つの特にこのましい部類の態様においては、本発明のパッケージャブル核酸
は、遺伝子治療のための細胞形質転換法に使用される。遺伝子治療は、HIV等
の慢性感染症ならびに癌および酵素欠損症のような先天性異常等の非感染症と戦
うための方法を提供する。Yu等(1994)Gen Therapy 1 : 13 - 26およびその参 考文献は、HIV感染についての遺伝子治療戦略に対する全般的な手引きを提供
する。またSodoski等のPCT/US91/04335も参照のこと。マウスレトロウイルス 等の共通な遺伝子治療ベクターの一つの一般的な限界は、それらが活発に***し
ている細胞のみに感染すること、およびそれらが一般的に非特異的であることで
ある。本発明は熟練者に、インヴィヴォにおいて幹細胞を特異的に標的としかつ
インヴィトロにおいて多くの細胞型を形質転換する強力なレトロウイルス遺伝子
治療ベクターの生成を可能にするいくつかの特徴を提供する。CD4+細胞、神 経細胞、および他の非***細胞(しばしばCXCR4ポジティブ)は、FIV粒
子内にパッケージングされた核酸により形質導入される。さらにベクターは任意
に、幹細胞の形質転換のためのシュードタイプである。
は、遺伝子治療のための細胞形質転換法に使用される。遺伝子治療は、HIV等
の慢性感染症ならびに癌および酵素欠損症のような先天性異常等の非感染症と戦
うための方法を提供する。Yu等(1994)Gen Therapy 1 : 13 - 26およびその参 考文献は、HIV感染についての遺伝子治療戦略に対する全般的な手引きを提供
する。またSodoski等のPCT/US91/04335も参照のこと。マウスレトロウイルス 等の共通な遺伝子治療ベクターの一つの一般的な限界は、それらが活発に***し
ている細胞のみに感染すること、およびそれらが一般的に非特異的であることで
ある。本発明は熟練者に、インヴィヴォにおいて幹細胞を特異的に標的としかつ
インヴィトロにおいて多くの細胞型を形質転換する強力なレトロウイルス遺伝子
治療ベクターの生成を可能にするいくつかの特徴を提供する。CD4+細胞、神 経細胞、および他の非***細胞(しばしばCXCR4ポジティブ)は、FIV粒
子内にパッケージングされた核酸により形質導入される。さらにベクターは任意
に、幹細胞の形質転換のためのシュードタイプである。
【0095】 (パッケージャブルベクターのシュードタイプ化(pseudotyping)) 造血幹細胞は一般的に細胞の形質転換のための、また特に遺伝子治療(特に抗
HIV遺伝子治療)のための特に好ましい標的である。パッケージャブルベクタ
ーは、ベクターをシュードタイプ化することによりCD34+細胞を形質転換す ることができるようにされる。このことは、ベクターをパッケージングするため
に用いられる細胞系を、レトロウイルスのenv機能に取って代るかまたは補足
するEnvタンパク質をコード化している核酸を用いて形質導入することによっ
て行なわれる。このエンベロープ機能は、いくつかの異種のウイルスのエンベロ
ープタンパク質によりトランスに供給されることが可能である。これらはVSV
−G、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)の両栄養性エンベロープ
、およびテナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープを含むがこれに制
限されない。ベクターの表面に発現された、水泡性口内炎ウイルス(VSV)の
エンベロープ糖タンパク質は、好ましいシュードタイプ化成分である。VSVは
***および非***CD34+細胞の両者に感染し、またVSVエンベロープタン パク質を発現しているシュードタイプベクターはこれらの細胞を形質導入するこ
とができる。
HIV遺伝子治療)のための特に好ましい標的である。パッケージャブルベクタ
ーは、ベクターをシュードタイプ化することによりCD34+細胞を形質転換す ることができるようにされる。このことは、ベクターをパッケージングするため
に用いられる細胞系を、レトロウイルスのenv機能に取って代るかまたは補足
するEnvタンパク質をコード化している核酸を用いて形質導入することによっ
て行なわれる。このエンベロープ機能は、いくつかの異種のウイルスのエンベロ
ープタンパク質によりトランスに供給されることが可能である。これらはVSV
−G、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)の両栄養性エンベロープ
、およびテナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープを含むがこれに制
限されない。ベクターの表面に発現された、水泡性口内炎ウイルス(VSV)の
エンベロープ糖タンパク質は、好ましいシュードタイプ化成分である。VSVは
***および非***CD34+細胞の両者に感染し、またVSVエンベロープタン パク質を発現しているシュードタイプベクターはこれらの細胞を形質導入するこ
とができる。
【0096】 同様に、ウイルスまたは細胞のタンパク質は一般にFIVを主成分とするベク
ターの宿主範囲を増すべく同時発現されることが可能である。典型的には、選択
されたタンパク質をコード化している核酸が、本発明のFIVパッケージング細
胞において同時発現される。核酸によってコード化されたタンパク質は、FIV
のパッケージャブル核酸をパッケージングする粒子内に取り込まれ、それはパッ
ケージング細胞の膜から出芽する。もしこのタンパク質が標的細胞上の細胞リセ
プターによって認識されれば、受容体仲介エンドサイトーシスにより、粒子は細
胞内へ形質導入される。好ましいタンパク質はウイルスエンベロープまたは外皮
タンパク質、細胞リセプターリガンド、抗体、または標的細胞上の細胞リセプタ
ーと結合する抗体フラグメント、その他を含む。
ターの宿主範囲を増すべく同時発現されることが可能である。典型的には、選択
されたタンパク質をコード化している核酸が、本発明のFIVパッケージング細
胞において同時発現される。核酸によってコード化されたタンパク質は、FIV
のパッケージャブル核酸をパッケージングする粒子内に取り込まれ、それはパッ
ケージング細胞の膜から出芽する。もしこのタンパク質が標的細胞上の細胞リセ
プターによって認識されれば、受容体仲介エンドサイトーシスにより、粒子は細
胞内へ形質導入される。好ましいタンパク質はウイルスエンベロープまたは外皮
タンパク質、細胞リセプターリガンド、抗体、または標的細胞上の細胞リセプタ
ーと結合する抗体フラグメント、その他を含む。
【0097】 (好ましいプロモーター) 一つの部類の態様はFIVパッケージャブルベクター用のプロモーターとして
、HIV LTR配列を利用する。これらのLTR配列は、LTRプロモーター を含んでいる細胞の感染に際し、 感染しているHIVウイルスによってトラン スに活性化される。HIV LTRプロモーターは、tatならびにrevとの 結合に加えて、感染に際しHIVゲノムの転写を許すべく作用する細胞内サイト
カイン(IL−2およびSP−1等の)に反応性がある。したがって一つの態様
においては、選択された治療用核酸はLTRプロモーターの支配下に置かれ、通
常はHIV感染に対して最も傷つきやすい細胞を、感染に対して抵抗性にする。
さらに、一つの態様においては、HIVパッケージング部位(FIVまたは他の
非霊長類レンチウイルスパッケージング部位に加えて)は、FIVパッケージャ
ブルベクターに含まれる。これにより、FIVを主成分とするベクターにコード
化された抗HIV治療薬剤が感染性HIVウイルスによりパッケージングされか
つ散布されることが可能となり、HIV感染と組み合わされて伝播されるという
二次的な予防効果を生じ、それにより感染が減速される。HIVのパッケージン
グ部位は詳細に記述されており、Poznansky等、(1991)Journal or Virology 6
5 (1) : 532 - 536;Aldovini およびYoung(1990)Journal of Virology 64 (5
) : 1920 - 1926、およびClever等、(1995)Journal of Virology 69 (4) : 21
01 - 2109参照のこと。二次予防効果を提供するべくHIVによりパッケージン グされるベクターの記述については、Wong - Stall等の米国特許第5,650,309号 参照のこと。
、HIV LTR配列を利用する。これらのLTR配列は、LTRプロモーター を含んでいる細胞の感染に際し、 感染しているHIVウイルスによってトラン スに活性化される。HIV LTRプロモーターは、tatならびにrevとの 結合に加えて、感染に際しHIVゲノムの転写を許すべく作用する細胞内サイト
カイン(IL−2およびSP−1等の)に反応性がある。したがって一つの態様
においては、選択された治療用核酸はLTRプロモーターの支配下に置かれ、通
常はHIV感染に対して最も傷つきやすい細胞を、感染に対して抵抗性にする。
さらに、一つの態様においては、HIVパッケージング部位(FIVまたは他の
非霊長類レンチウイルスパッケージング部位に加えて)は、FIVパッケージャ
ブルベクターに含まれる。これにより、FIVを主成分とするベクターにコード
化された抗HIV治療薬剤が感染性HIVウイルスによりパッケージングされか
つ散布されることが可能となり、HIV感染と組み合わされて伝播されるという
二次的な予防効果を生じ、それにより感染が減速される。HIVのパッケージン
グ部位は詳細に記述されており、Poznansky等、(1991)Journal or Virology 6
5 (1) : 532 - 536;Aldovini およびYoung(1990)Journal of Virology 64 (5
) : 1920 - 1926、およびClever等、(1995)Journal of Virology 69 (4) : 21
01 - 2109参照のこと。二次予防効果を提供するべくHIVによりパッケージン グされるベクターの記述については、Wong - Stall等の米国特許第5,650,309号 参照のこと。
【0098】 治療用核酸の発現を指示するための、polIIIプロモーター等の構成プロモ ーターもまた好ましい。PCT出願PCT/US94/05700(WO 94/26877)およびC
hatterjee等(Science(1992), 258 : 1485 - 1488、下文のChetterjee等、1 )は、標的細胞におけるHIVー1の感染性のアンチセンス阻害を、抗TAR RNAを発現している構成されたpolIII発現カセットをもつウイルスベクタ ーを用いて記述している。Chatterjee等(PCT出願PCT/US91/03440(1991)
、下文のChetterjee等、2)は、アンチセンスTAR配列を発現するAAVを主
成分とするベクターを含むウイルスベクターについて記述している。Chatterjee
およびWong (Methods, A companion to Methods in Enzymology(1993), 5 : 5
1 - 59)は、さらにアンチセンスRNAのデリバリーのためのウイルスベクター
を記述している。PCT公告WO 94/26877(PCT/US94/05700)は、種々の抗H
IV治療遺伝子と、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、リボザイム、およ
びアンチセンス遺伝子、および遺伝子治療ベクターのおとり遺伝子を含む、一般
的な遺伝子治療戦略を記述している。Yu等(1994)Gene Therapy 1 : 13 - 26お
よびそれに引用された参考文献は、HIV感染に対して有用な遺伝子治療戦略へ
の全般的な手引きを提供する。
hatterjee等(Science(1992), 258 : 1485 - 1488、下文のChetterjee等、1 )は、標的細胞におけるHIVー1の感染性のアンチセンス阻害を、抗TAR RNAを発現している構成されたpolIII発現カセットをもつウイルスベクタ ーを用いて記述している。Chatterjee等(PCT出願PCT/US91/03440(1991)
、下文のChetterjee等、2)は、アンチセンスTAR配列を発現するAAVを主
成分とするベクターを含むウイルスベクターについて記述している。Chatterjee
およびWong (Methods, A companion to Methods in Enzymology(1993), 5 : 5
1 - 59)は、さらにアンチセンスRNAのデリバリーのためのウイルスベクター
を記述している。PCT公告WO 94/26877(PCT/US94/05700)は、種々の抗H
IV治療遺伝子と、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、リボザイム、およ
びアンチセンス遺伝子、および遺伝子治療ベクターのおとり遺伝子を含む、一般
的な遺伝子治療戦略を記述している。Yu等(1994)Gene Therapy 1 : 13 - 26お
よびそれに引用された参考文献は、HIV感染に対して有用な遺伝子治療戦略へ
の全般的な手引きを提供する。
【0099】 (エクスヴィヴォ(生体外)における細胞の形質転換) 生物体の中の細胞におけるウイルスの複製を阻害するためのエクスヴィヴォの
方法(または治療用遺伝子を細胞内へ形質導入する他の方法)は、本発明の治療
用核酸を用いてエクスヴィヴォで細胞を形質導入することと、さらにその細胞を
生物体に導入することを含む。標的細胞は、CD4+T細胞等のCD4+細胞、患
者から単離および培養されたマクロファージ、幹細胞、またはその種の他のもの
を含む。Freshney等、前出、および、いかにして患者から細胞を単離し培養する
かについての議論のためにそれに引用された参考文献を参照のこと。別法として
、細胞は細胞バンク(たとえば血液バンク)に貯蔵されたものでもよい。好まし
い態様の一つの部類においては、パッケージャブル核酸は抗ウイルス治療薬剤(
たとえば、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、抗HIVリボザイム、アン
チセンス遺伝子、またはおとり遺伝子)をコード化しており、それは活性化また
は構成されたプロモーターの支配の下にHIVウイルスの生育ならびに複製を阻
害する。細胞形質転換ベクターは、HIVに未感染の細胞に対して予防効果を付
与すると共に、既にHIVウイルスに感染した細胞のいずれにおいても、ウイル
スの複製を阻害する。さらに好ましい態様においては、ベクターはHIVの複製
機構を用いて複製され、さらにHIVキャプシド内へパッケージングされ、それ
により抗HIV治療遺伝子の、HIVウイルスの複製に関連した伝播を引き起こ
す。したがって、HIVに感染した生物体は、その細胞の一集団を本発明のベク
ターを用いて形質転換し、かつ形質転換された細胞を本文に記述したように生物
体に戻すことにより、感染に対する治療が可能である。したがって本発明は、た
とえ細胞が、予防が探究されているウイルスに既に感染されている場合でも、イ
ンヴィトロ、エクスヴィヴォ、またはインヴィヴォにおいて細胞を防護する方法
を提供する。
方法(または治療用遺伝子を細胞内へ形質導入する他の方法)は、本発明の治療
用核酸を用いてエクスヴィヴォで細胞を形質導入することと、さらにその細胞を
生物体に導入することを含む。標的細胞は、CD4+T細胞等のCD4+細胞、患
者から単離および培養されたマクロファージ、幹細胞、またはその種の他のもの
を含む。Freshney等、前出、および、いかにして患者から細胞を単離し培養する
かについての議論のためにそれに引用された参考文献を参照のこと。別法として
、細胞は細胞バンク(たとえば血液バンク)に貯蔵されたものでもよい。好まし
い態様の一つの部類においては、パッケージャブル核酸は抗ウイルス治療薬剤(
たとえば、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、抗HIVリボザイム、アン
チセンス遺伝子、またはおとり遺伝子)をコード化しており、それは活性化また
は構成されたプロモーターの支配の下にHIVウイルスの生育ならびに複製を阻
害する。細胞形質転換ベクターは、HIVに未感染の細胞に対して予防効果を付
与すると共に、既にHIVウイルスに感染した細胞のいずれにおいても、ウイル
スの複製を阻害する。さらに好ましい態様においては、ベクターはHIVの複製
機構を用いて複製され、さらにHIVキャプシド内へパッケージングされ、それ
により抗HIV治療遺伝子の、HIVウイルスの複製に関連した伝播を引き起こ
す。したがって、HIVに感染した生物体は、その細胞の一集団を本発明のベク
ターを用いて形質転換し、かつ形質転換された細胞を本文に記述したように生物
体に戻すことにより、感染に対する治療が可能である。したがって本発明は、た
とえ細胞が、予防が探究されているウイルスに既に感染されている場合でも、イ
ンヴィトロ、エクスヴィヴォ、またはインヴィヴォにおいて細胞を防護する方法
を提供する。
【0100】 一つの特に好ましい態様においては、細胞の形質転換および遺伝子治療のため
のエクスヴィヴォの方法において幹細胞(典型的にはCD4+ではない)が用い られる。幹細胞を用いることの利点は、それらがインヴィトロで他の細胞型に分
化すること、あるいは哺乳類(細胞のドナー等の)に導入され、そこで骨髄に植
え付けられることになることである。GM−CSF、IFN−γ、およびTNF
−α等のサイトカインを用い、CD34+細胞を臨床上重要な細胞型に分化させ る方法が知られている(Inaba等(1992) J. Exp. Med. 176, 1693 - 1702および
Szabolcs等(1995) 154 : 5851 - 5861参照のこと)。FIVベクターをシュー ドタイプ化してそれらが幹細胞を形質転換できるようにする方法は前文に記述さ
れている。アフィニティーカラムによる単離法を、CD34に結合する細胞、ま
たはCD34に結合する抗体を単離するべく用いることができる。Ho等(1995)
Stem Cells 13(前出3) :100 - 105参照。また、Brenner(1993) Journal of
Hematotherapy 2 : 7 - 17も参照のこと。もう一つの態様においては、造血幹 細胞は胎児の脈管血から単離される。Yu等(1995)PNAS 92 : 699 - 703は、レ トロウイルスベクターを用いてヒト胎児脈管血からのCD34+細胞を形質導入 する好ましい方法を記述している。エクスヴィヴォ方法における好ましい態様で
は、幹細胞を用いるよりもむしろT細胞がまた形質導入される。T細胞の単離に
はいくつかの技術が知られている。一つの方法では、フィコール-ハイパック密 度勾配遠心法が、確立された手技による赤血球および好中球からPBMCを分離
するべく用いられる。細胞は、1%ウシ胎児血清(FBS)を補足した、改造さ
れたAIM−V(2mMグルタミン、10μg/mlの硫酸ゲンタマイシン、50μg
/mlのストレプトマイシンを加えたAIM-V(ギブコ)からなる)を用いて洗浄され
る。T細胞の濃縮は、カラムまたは磁気ビーズに結合された適切なモノクローナ
ル抗体によるネガティブまたはポジティブな選別により、標準的な技術を用いて
行なわれる。細胞のアリコートが、所望の細胞表面の表現型について分析される
(たとえば、CD4、CD8、CD3、CD14、その他)。
のエクスヴィヴォの方法において幹細胞(典型的にはCD4+ではない)が用い られる。幹細胞を用いることの利点は、それらがインヴィトロで他の細胞型に分
化すること、あるいは哺乳類(細胞のドナー等の)に導入され、そこで骨髄に植
え付けられることになることである。GM−CSF、IFN−γ、およびTNF
−α等のサイトカインを用い、CD34+細胞を臨床上重要な細胞型に分化させ る方法が知られている(Inaba等(1992) J. Exp. Med. 176, 1693 - 1702および
Szabolcs等(1995) 154 : 5851 - 5861参照のこと)。FIVベクターをシュー ドタイプ化してそれらが幹細胞を形質転換できるようにする方法は前文に記述さ
れている。アフィニティーカラムによる単離法を、CD34に結合する細胞、ま
たはCD34に結合する抗体を単離するべく用いることができる。Ho等(1995)
Stem Cells 13(前出3) :100 - 105参照。また、Brenner(1993) Journal of
Hematotherapy 2 : 7 - 17も参照のこと。もう一つの態様においては、造血幹 細胞は胎児の脈管血から単離される。Yu等(1995)PNAS 92 : 699 - 703は、レ トロウイルスベクターを用いてヒト胎児脈管血からのCD34+細胞を形質導入 する好ましい方法を記述している。エクスヴィヴォ方法における好ましい態様で
は、幹細胞を用いるよりもむしろT細胞がまた形質導入される。T細胞の単離に
はいくつかの技術が知られている。一つの方法では、フィコール-ハイパック密 度勾配遠心法が、確立された手技による赤血球および好中球からPBMCを分離
するべく用いられる。細胞は、1%ウシ胎児血清(FBS)を補足した、改造さ
れたAIM−V(2mMグルタミン、10μg/mlの硫酸ゲンタマイシン、50μg
/mlのストレプトマイシンを加えたAIM-V(ギブコ)からなる)を用いて洗浄され
る。T細胞の濃縮は、カラムまたは磁気ビーズに結合された適切なモノクローナ
ル抗体によるネガティブまたはポジティブな選別により、標準的な技術を用いて
行なわれる。細胞のアリコートが、所望の細胞表面の表現型について分析される
(たとえば、CD4、CD8、CD3、CD14、その他)。
【0101】 一般的に、表面マーカーの発現はT細胞の同定ならびに精製を容易にする。T
細胞の同定ならびに単離法は、FACS、カラムクロマトグラフ法、磁気ビーズ
を用いたより分け、ウェスタン法、X線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気
泳動法、高速液体クロマトグラフ法(HPLC)、薄層クロマトグラフ法(TL
C)、超拡散クロマトグラフ法、その他と、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散
法(一重または二重)、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIAs)、
エンザイムイムノアッセイ(ELISA)、免疫蛍光分析法その他を含む。免疫
学的ならびにイムノアッセイの方法についての全般的な総説は、StitesおよびTe
rr(共編)1991 Basic and Clinical Immunology(第7版)およびPaul(前出 )を参照。抗原を選択するべくいかに抗体を作成するかについての議論は、たと
えば、Coligan(1991)Current Protocols in Immunology ウィリー/グリーン 、ニューヨーク州;およびHarlowおよびLane(1989)Antibodies : A Laborator
y Manual コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州;Stites等(共編 )Basic and Clinical Immunology(第4版)参照のこと。
細胞の同定ならびに単離法は、FACS、カラムクロマトグラフ法、磁気ビーズ
を用いたより分け、ウェスタン法、X線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気
泳動法、高速液体クロマトグラフ法(HPLC)、薄層クロマトグラフ法(TL
C)、超拡散クロマトグラフ法、その他と、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散
法(一重または二重)、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ(RIAs)、
エンザイムイムノアッセイ(ELISA)、免疫蛍光分析法その他を含む。免疫
学的ならびにイムノアッセイの方法についての全般的な総説は、StitesおよびTe
rr(共編)1991 Basic and Clinical Immunology(第7版)およびPaul(前出 )を参照。抗原を選択するべくいかに抗体を作成するかについての議論は、たと
えば、Coligan(1991)Current Protocols in Immunology ウィリー/グリーン 、ニューヨーク州;およびHarlowおよびLane(1989)Antibodies : A Laborator
y Manual コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州;Stites等(共編 )Basic and Clinical Immunology(第4版)参照のこと。
【0102】 上記のエクスヴィヴォでの使用に加えて、本発明のパッケージング細胞系なら
びに本発明のHIVパッケージャブル核酸は、全般的にクローニング法において
有用である。パッケージャブル核酸は、FIV粒子内にパッケージングされ、イ
ンヴィトロまたはインヴィヴォにおいてFIV感染性細胞(たとえばネコ造血細
胞)を形質転換するべく使用される。このことは熟練者に、たとえば薬物発見分
析法において、あるいは遺伝子調節の研究における道具として、あるいは一般的
なクローニングベクターとして、選択された核酸を用いて細胞を形質転換するた
めの技術ならびにベクターを提供する。
びに本発明のHIVパッケージャブル核酸は、全般的にクローニング法において
有用である。パッケージャブル核酸は、FIV粒子内にパッケージングされ、イ
ンヴィトロまたはインヴィヴォにおいてFIV感染性細胞(たとえばネコ造血細
胞)を形質転換するべく使用される。このことは熟練者に、たとえば薬物発見分
析法において、あるいは遺伝子調節の研究における道具として、あるいは一般的
なクローニングベクターとして、選択された核酸を用いて細胞を形質転換するた
めの技術ならびにベクターを提供する。
【0103】 (インヴィヴォにおける形質転換) 治療用遺伝子を含んでいる非霊長類レンチウイルス粒子は、インヴィヴォにお
ける細胞の形質導入のため、個体に直接投与することができる。投与は、分子を
最終的に血液または組織細胞と接するべく導入するために通常用いられるいずれ
かの経路による。FIVまたは他の非霊長類レンチウイルス粒子にパッケージン
グされたパッケージャブル核酸は、動物ならびにヒトの患者におけるAIDSな
どのウイルスに媒介される疾患を、治療ならびに予防するべく用いられる。パッ
ケージングされた核酸はいずれかの適切な方法で投与され、好ましくは製薬上許
容される担体と共に投与される。かかるパッケージャブル核酸を、本発明の状況
において患者へ投与する適切な方法は入手可能であり、また、特定の組成物の投
与に一より多くの経路が使用可能であっても、ある特定の経路が他の経路よりさ
らに速効性の、かつ有効な反応をしばしば提供することが可能である。
ける細胞の形質導入のため、個体に直接投与することができる。投与は、分子を
最終的に血液または組織細胞と接するべく導入するために通常用いられるいずれ
かの経路による。FIVまたは他の非霊長類レンチウイルス粒子にパッケージン
グされたパッケージャブル核酸は、動物ならびにヒトの患者におけるAIDSな
どのウイルスに媒介される疾患を、治療ならびに予防するべく用いられる。パッ
ケージングされた核酸はいずれかの適切な方法で投与され、好ましくは製薬上許
容される担体と共に投与される。かかるパッケージャブル核酸を、本発明の状況
において患者へ投与する適切な方法は入手可能であり、また、特定の組成物の投
与に一より多くの経路が使用可能であっても、ある特定の経路が他の経路よりさ
らに速効性の、かつ有効な反応をしばしば提供することが可能である。
【0104】 製剤上許容される担体は、部分的には投与される特定の組成物により、ならび
に当該組成物の投与に用いられる特定の方法により決定される。したがって、本
発明の製剤組成物の適切な製剤には幅広い多様性がある。
に当該組成物の投与に用いられる特定の方法により決定される。したがって、本
発明の製剤組成物の適切な製剤には幅広い多様性がある。
【0105】 パッケージングされた核酸は、単独または他の適当な組成物と組み合わせて、
吸入により投与されるべく、エアロゾル製剤(すなわちそれらは「噴霧状」にさ
れ得る)に製造されてもよい。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、
プロパン、窒素、その他のような加圧された許容される噴射剤の中に入れられて
もよい。
吸入により投与されるべく、エアロゾル製剤(すなわちそれらは「噴霧状」にさ
れ得る)に製造されてもよい。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、
プロパン、窒素、その他のような加圧された許容される噴射剤の中に入れられて
もよい。
【0106】 たとえば関節内(関節の中へ)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下
経路等の非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および当該
製剤を所期の患者の血液と等張にする溶質を含有することが可能な、水性および
非水性の等張の無菌注入溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、糊料、安定化剤、および
保存料を含有することが可能な水性または非水性の無菌懸濁液とを含む。非経口
投与ならびに静脈内投与は、好ましい投与法である。パッケージングされた核酸
の製剤は、アンプルおよびバイアル等の、単位用量または多用量の密封容器に入
れて提供される。
経路等の非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および当該
製剤を所期の患者の血液と等張にする溶質を含有することが可能な、水性および
非水性の等張の無菌注入溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、糊料、安定化剤、および
保存料を含有することが可能な水性または非水性の無菌懸濁液とを含む。非経口
投与ならびに静脈内投与は、好ましい投与法である。パッケージングされた核酸
の製剤は、アンプルおよびバイアル等の、単位用量または多用量の密封容器に入
れて提供される。
【0107】 エクスヴィヴォの治療状況において、上記のようにパッケージングされた核酸
により形質導入された細胞もまた、静脈内かまたは上記のように非経口に投与さ
れてよい。
により形質導入された細胞もまた、静脈内かまたは上記のように非経口に投与さ
れてよい。
【0108】 本発明の状況において患者に投与される用量は、時間を通じて患者に有益な治
療反応を生じさせるべく、あるいは病原体による感染を阻害するべく十分である
べきである。この用量は、用いられた特定のベクターの効能と、患者の状態、な
らびに治療されるべき患者の体重および表面積により決定されることになる。用
量の大きさはまた、特定のベクターの投与に伴う逆の副作用の存在、性質、およ
び大きさと、特定の患者において形質導入された細胞の型とによって決定されて
もよい。
療反応を生じさせるべく、あるいは病原体による感染を阻害するべく十分である
べきである。この用量は、用いられた特定のベクターの効能と、患者の状態、な
らびに治療されるべき患者の体重および表面積により決定されることになる。用
量の大きさはまた、特定のベクターの投与に伴う逆の副作用の存在、性質、およ
び大きさと、特定の患者において形質導入された細胞の型とによって決定されて
もよい。
【0109】 AIDS等のウイルスに媒介される疾患の治療または予防法においては、投与
されるベクターの有効量の決定に際し、内科医は循環している血漿レベル、ベク
ターの毒性、疾患の悪化、および抗ベクター抗体の産生を評価する。一般的に、
ベクターからのむきだしの核酸と同等の用量は、典型的な70キログラムの患者
について約1μgないし100μgであり、レトロウイルス粒子を含むベクターの
用量は、阻害剤である核酸の同等量を生じるべく算出される。本発明のベクター
は、ウイルスに媒介される状態に対する、細胞毒性薬剤、ヌクレオチド類似体、
および生物学的反応の調節剤を含むいかなる既知の通常の治療法も補足すること
ができる。
されるベクターの有効量の決定に際し、内科医は循環している血漿レベル、ベク
ターの毒性、疾患の悪化、および抗ベクター抗体の産生を評価する。一般的に、
ベクターからのむきだしの核酸と同等の用量は、典型的な70キログラムの患者
について約1μgないし100μgであり、レトロウイルス粒子を含むベクターの
用量は、阻害剤である核酸の同等量を生じるべく算出される。本発明のベクター
は、ウイルスに媒介される状態に対する、細胞毒性薬剤、ヌクレオチド類似体、
および生物学的反応の調節剤を含むいかなる既知の通常の治療法も補足すること
ができる。
【0110】 投与については、本発明の阻害剤および形質導入された細胞は、阻害剤のLD
-50、ベクター、または形質導入された細胞の型と、患者の質量ならびに総体 的な健康状態に適合するようにした種々の濃度における、阻害剤、ベクター、ま
たは細胞型の副作用とにより決定される割合で投与されてよい。
-50、ベクター、または形質導入された細胞の型と、患者の質量ならびに総体 的な健康状態に適合するようにした種々の濃度における、阻害剤、ベクター、ま
たは細胞型の副作用とにより決定される割合で投与されてよい。
【0111】 形質導入された細胞の導入に関しては、注入に先立ち、血液試料を取得して分
析用に取っておく。1x 108個と1x1012個の間の形質導入された細胞を、6
0ないし200分間にわたり静脈内へ注入する。バイタルサインおよびパルス酸
素測定法による酸素飽和度を詳しく監視する。血液試料は、注入の5分および1
時間後に取得し、後の分析用に取っておく。白血球フェレーシス、形質導入、お
よび再注入を、合計4ないし6回の治療について、2ないし3ヵ月ごとに一年周
期で繰り返す。初回の治療の後、外来患者の基準に基づき、臨床医の自由裁量で
注入を行なうことができる。もし外来患者として再注入が与えられる場合には、
治療の後、患者は少なくとも4、また好ましくは8時間にわたり監視される。
析用に取っておく。1x 108個と1x1012個の間の形質導入された細胞を、6
0ないし200分間にわたり静脈内へ注入する。バイタルサインおよびパルス酸
素測定法による酸素飽和度を詳しく監視する。血液試料は、注入の5分および1
時間後に取得し、後の分析用に取っておく。白血球フェレーシス、形質導入、お
よび再注入を、合計4ないし6回の治療について、2ないし3ヵ月ごとに一年周
期で繰り返す。初回の治療の後、外来患者の基準に基づき、臨床医の自由裁量で
注入を行なうことができる。もし外来患者として再注入が与えられる場合には、
治療の後、患者は少なくとも4、また好ましくは8時間にわたり監視される。
【0112】 形質導入された、細胞は確立された方法により再注入用に調製される。Abraha
msen等(1991)J. Clin. Apheresis 6 : 48 - 53;Carter等(1988)J. Clin. A
rpheresis 4 : 113 - 117;Aebersold等(1988), J. Immunol. Methods 112 : 1
- 7;Muul等(1987)J. Immunol. Methods 101: 171 - 181、およびCarter等(
1987)Transfusion 27 : 362 - 365参照。約2ないし4週間の培養期間の後、細
胞は1x 108個と1x1012個の間であるはずである。この点については、細胞
の生育特性は患者ごとに、また細胞型ごとに異なっている。形質導入された細胞
の再注入の約72時間前に、表現型の分析用、ならびに治療用薬剤を発現してい
る細胞のパーセンテージ用にアリコートをとる。
msen等(1991)J. Clin. Apheresis 6 : 48 - 53;Carter等(1988)J. Clin. A
rpheresis 4 : 113 - 117;Aebersold等(1988), J. Immunol. Methods 112 : 1
- 7;Muul等(1987)J. Immunol. Methods 101: 171 - 181、およびCarter等(
1987)Transfusion 27 : 362 - 365参照。約2ないし4週間の培養期間の後、細
胞は1x 108個と1x1012個の間であるはずである。この点については、細胞
の生育特性は患者ごとに、また細胞型ごとに異なっている。形質導入された細胞
の再注入の約72時間前に、表現型の分析用、ならびに治療用薬剤を発現してい
る細胞のパーセンテージ用にアリコートをとる。
【0113】 もしベクターまたは形質導入された細胞の注入を受けている患者が発熱、冷え
、または筋肉痛を生じる場合には、彼/彼女は適切な用量のアスピリン、イブプ
ロフェン、またはアセトアミノフェンを受ける。注入に対し、発熱、筋肉痛、お
よび冷え等の反応を経験する患者は、以降の注入の30分前に、アスピリン、ア
セトアミノフェン、またはジフェンヒドラミンのいずれかを前投薬される。解熱
剤および抗ヒスタミン剤に対して速やかに反応しない、さらに重い冷えおよび筋
肉痛には、メペリジンが用いられる。細胞の注入は、反応の激しさに依存して遅
くするかまたは中断される。
、または筋肉痛を生じる場合には、彼/彼女は適切な用量のアスピリン、イブプ
ロフェン、またはアセトアミノフェンを受ける。注入に対し、発熱、筋肉痛、お
よび冷え等の反応を経験する患者は、以降の注入の30分前に、アスピリン、ア
セトアミノフェン、またはジフェンヒドラミンのいずれかを前投薬される。解熱
剤および抗ヒスタミン剤に対して速やかに反応しない、さらに重い冷えおよび筋
肉痛には、メペリジンが用いられる。細胞の注入は、反応の激しさに依存して遅
くするかまたは中断される。
【0114】 (ウイルス阻害剤) 使用の意図するところがウイルス(たとえばHIV)の阻害である場合には、
特殊化されたウイルス阻害剤が典型的には本発明のパッケージングされた核酸に
コードされる。したがって、核酸の構築ならびに維持に適用できる技術は、本発
明の阻害剤に適合する。本発明のウイルス阻害剤に任意に取り込まれる抗ウイル
ス剤は、アンチセンス遺伝子、リボザイム、おとり遺伝子、およびトランスドミ
ナントな核酸である。
特殊化されたウイルス阻害剤が典型的には本発明のパッケージングされた核酸に
コードされる。したがって、核酸の構築ならびに維持に適用できる技術は、本発
明の阻害剤に適合する。本発明のウイルス阻害剤に任意に取り込まれる抗ウイル
ス剤は、アンチセンス遺伝子、リボザイム、おとり遺伝子、およびトランスドミ
ナントな核酸である。
【0115】 アンチセンス核酸は、発現に際し、特定のRNA分子か、転写プロモーターか
、または遺伝子のセンス鎖とハイブリッド形成する核酸である。ハイブリッド形
成により、アンチセンス核酸は相補的な核酸の転写か、mRNAの翻訳か、また
は触媒RNAの機能を妨げる。本発明に有用なアンチセンス分子は、ウイルス遺
伝子転写物とハイブリッド形成するものを含む。アンチセンス分子の二つの標的
配列は、HIV遺伝子の第一および第二のエクソン、tatおよびrevである
。ChatterjeeおよびWong、前出、ならびにMarcus-Sekura(Analytical Biochemi
stry(1988)172, 289 - 285)は、遺伝子の発現を阻止または修飾するアンチセ
ンス遺伝子の使用を記述している。
、または遺伝子のセンス鎖とハイブリッド形成する核酸である。ハイブリッド形
成により、アンチセンス核酸は相補的な核酸の転写か、mRNAの翻訳か、また
は触媒RNAの機能を妨げる。本発明に有用なアンチセンス分子は、ウイルス遺
伝子転写物とハイブリッド形成するものを含む。アンチセンス分子の二つの標的
配列は、HIV遺伝子の第一および第二のエクソン、tatおよびrevである
。ChatterjeeおよびWong、前出、ならびにMarcus-Sekura(Analytical Biochemi
stry(1988)172, 289 - 285)は、遺伝子の発現を阻止または修飾するアンチセ
ンス遺伝子の使用を記述している。
【0116】 リボザイムは触媒性のRNA分子であり、特定の核酸配列を有する他のRNA
分子を切断する。ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、RNアーゼ
Pリボザイム(すなわち、原核生物または真核生物からの天然に生じたRNアー
ゼPリボザイムに由来するリボザイム)を含むリボザイムの一般的な構築法は、
この技術では周知である。Castanotto等(1994)Adavnces in Pharmacology 25
: 289 - 317は、グループIのリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピ ンリバザイム、RNアーゼP、およびアクスヘッド(axhead)リボザイムを含む全
般的なリボザイムを提供し総説している。本発明に有用なリボザイムは、ウイル
ス転写物、特にHIV遺伝子転写物を切断するものを含む。Ojwang等、Proc. Na
tl. Acad. Sci., U. S. A., 89 : 10802 - 06(1992);Wong-Staal等(PCT/US
94/05700);Ojwang等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344;Yam
ada等(1994)Human Gene Therapy 1 : 39 - 45;Leavitt等(1995)Proc Natl
Acad Sci USA 92 : 699 - 703;Leavitt等(1994) Human Gene Therapy 5 : 115
1 ? 1120;Yamada等(1994)Virology205 : 121 - 126、およびDropulic等(19
92)Journal of Virology 66(3) : 1432 - 1441は、HIV-1に特異的なヘアピ
ンおよびハンマーヘッドリボザイムを提供している。
分子を切断する。ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、RNアーゼ
Pリボザイム(すなわち、原核生物または真核生物からの天然に生じたRNアー
ゼPリボザイムに由来するリボザイム)を含むリボザイムの一般的な構築法は、
この技術では周知である。Castanotto等(1994)Adavnces in Pharmacology 25
: 289 - 317は、グループIのリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピ ンリバザイム、RNアーゼP、およびアクスヘッド(axhead)リボザイムを含む全
般的なリボザイムを提供し総説している。本発明に有用なリボザイムは、ウイル
ス転写物、特にHIV遺伝子転写物を切断するものを含む。Ojwang等、Proc. Na
tl. Acad. Sci., U. S. A., 89 : 10802 - 06(1992);Wong-Staal等(PCT/US
94/05700);Ojwang等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344;Yam
ada等(1994)Human Gene Therapy 1 : 39 - 45;Leavitt等(1995)Proc Natl
Acad Sci USA 92 : 699 - 703;Leavitt等(1994) Human Gene Therapy 5 : 115
1 ? 1120;Yamada等(1994)Virology205 : 121 - 126、およびDropulic等(19
92)Journal of Virology 66(3) : 1432 - 1441は、HIV-1に特異的なヘアピ
ンおよびハンマーヘッドリボザイムを提供している。
【0117】 手短にいえば、本発明に特に有用な二つの型のリボザイムは、ヘアピンリボザ
イムとハンマーヘッドリボザイムを含む。ハンマーヘッドリボザイム(Rossie等
(1991)Pharmac. Ther. 50 : 245 - 254;ForsterおよびSymons(1987)Cell 4
8 : 211 - 220;HaseloffおよびGerlacn(1988)Nature328 : 596 - 600;Walbo
tおよびBruening(1988)Nture334 : 196;HaseloffおよびGerlach(1988)Natu
re 334 : 585;およびDropulic等およびCastanotto等、およびそれに引用された
参考文献、前出、参照のこと)およびヘアピンリボザイム(Hampel等(1990)Nu
cl. Acids Res. 18 : 229 - 304;Hempel等(1990)欧州特許公告第0 360 257号
;1993年10月3日発行の合衆国特許第5,254,678号;Wong-Staal等、PCT/US94/
05700;Ojwang等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344;Yamada等
(1994)Human Gene Therapy 1 : 39 - 45;Leavitt等(1995)Proc Natl Acad
Sci USA 92 : 699 - 703;Leavitt等(1994)Human Gene Therapy 5 : 1151 ?
1120;およびYamada等(1994)Virology 205 : 121 - 126参照)は、アンチセン
スおよびエンドリボヌレオチダーゼ活性を有する触媒分子である。HIV RN Aに向けられたハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムの細胞内で
の発現は、HIV感染に対する有意な抵抗性を与えることが示されている。この
ようなリボザイムは、HIVゲノムの一部、または当該ゲノムにコード化された
核酸を標的とするべく構築される。HIV-1の好ましい標的部位はU5領域と 、ポリメラーゼ遺伝子を含む。GUCおよびGUA切断性のトランスアクティブ
な抗HIVリボザイムが知られている。
イムとハンマーヘッドリボザイムを含む。ハンマーヘッドリボザイム(Rossie等
(1991)Pharmac. Ther. 50 : 245 - 254;ForsterおよびSymons(1987)Cell 4
8 : 211 - 220;HaseloffおよびGerlacn(1988)Nature328 : 596 - 600;Walbo
tおよびBruening(1988)Nture334 : 196;HaseloffおよびGerlach(1988)Natu
re 334 : 585;およびDropulic等およびCastanotto等、およびそれに引用された
参考文献、前出、参照のこと)およびヘアピンリボザイム(Hampel等(1990)Nu
cl. Acids Res. 18 : 229 - 304;Hempel等(1990)欧州特許公告第0 360 257号
;1993年10月3日発行の合衆国特許第5,254,678号;Wong-Staal等、PCT/US94/
05700;Ojwang等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344;Yamada等
(1994)Human Gene Therapy 1 : 39 - 45;Leavitt等(1995)Proc Natl Acad
Sci USA 92 : 699 - 703;Leavitt等(1994)Human Gene Therapy 5 : 1151 ?
1120;およびYamada等(1994)Virology 205 : 121 - 126参照)は、アンチセン
スおよびエンドリボヌレオチダーゼ活性を有する触媒分子である。HIV RN Aに向けられたハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムの細胞内で
の発現は、HIV感染に対する有意な抵抗性を与えることが示されている。この
ようなリボザイムは、HIVゲノムの一部、または当該ゲノムにコード化された
核酸を標的とするべく構築される。HIV-1の好ましい標的部位はU5領域と 、ポリメラーゼ遺伝子を含む。GUCおよびGUA切断性のトランスアクティブ
な抗HIVリボザイムが知られている。
【0118】 おとり核酸は、調節核酸結合タンパク質(すなわち、転写因子、細胞転送因子
、その他)によって認識される配列を有する核酸である。発現に際し、転写因子
はゲノム中のその天然の標的よりもむしろ、おとり核酸に結合する。有用なおと
り核酸配列は、ウイルスの転写因子が結合するいかなる配列をも含む。たとえば
、tatタンパク質が結合するTAR配列、およびrevタンパク質が結合する
HIV RRE配列(特にSLII配列)は、おとり核酸としての使用に適した配 列である。
、その他)によって認識される配列を有する核酸である。発現に際し、転写因子
はゲノム中のその天然の標的よりもむしろ、おとり核酸に結合する。有用なおと
り核酸配列は、ウイルスの転写因子が結合するいかなる配列をも含む。たとえば
、tatタンパク質が結合するTAR配列、およびrevタンパク質が結合する
HIV RRE配列(特にSLII配列)は、おとり核酸としての使用に適した配 列である。
【0119】 トランスドミナントな核酸は一つのタンパク質を発現する核酸であって、トラ
ンス相補性に供給された場合には、その表現型が当該タンパク質の生来の形態の
効果に打ち勝つこととなる。たとえば、tatおよびrevはTARおよびRR
Eにそれぞれ結合する能力は保持するが、これらのタンパク質の適切な調整機能
を欠くべく突然変異されることが可能である。特にrevは、適切な正常の転写
調節に必須であるC末端に近いロイシンに富むドメインを除去することにより、
トランスドメインにされることが可能である。Tatのトランスドミナントタン
パク質は、RNA結合性/核局在性ドメインにおける突然変異によって生じるこ
とが可能である。欠損HIV分子クローンの相互の相補性は、たとえば、Lori等
(1992)Journal of virology 66 (9) 5553 - 5560に記述されている。
ンス相補性に供給された場合には、その表現型が当該タンパク質の生来の形態の
効果に打ち勝つこととなる。たとえば、tatおよびrevはTARおよびRR
Eにそれぞれ結合する能力は保持するが、これらのタンパク質の適切な調整機能
を欠くべく突然変異されることが可能である。特にrevは、適切な正常の転写
調節に必須であるC末端に近いロイシンに富むドメインを除去することにより、
トランスドメインにされることが可能である。Tatのトランスドミナントタン
パク質は、RNA結合性/核局在性ドメインにおける突然変異によって生じるこ
とが可能である。欠損HIV分子クローンの相互の相補性は、たとえば、Lori等
(1992)Journal of virology 66 (9) 5553 - 5560に記述されている。
【0120】 (実施例) 以下の実施例は説明のためだけに提供するものであって、限定のために提供す
るものではない。熟練者は、重大でない多様なパラメータを容易に認識し、そし
てこれを変更又は修正して本質的に類似の結果を得るであろう。 実施例1:FIVパッケージングプラスミド及びベクターの構築
るものではない。熟練者は、重大でない多様なパラメータを容易に認識し、そし
てこれを変更又は修正して本質的に類似の結果を得るであろう。 実施例1:FIVパッケージングプラスミド及びベクターの構築
【0121】 FIVの長い末端反復配列(LTR)はヒト細胞内で不活性であるか又はごく
僅かに活性である。非霊長類レンチウイルスタンパク質の全長補体をヒト細胞内
においてトランスでそして複製欠陥型で高レベルで発現する先行方法はこれまで
に記載されていない。それ故、ヒト細胞内において複製欠陥態様でトランスで高
レベルのFIVタンパク質を発現させるため且つ複製に必要とされるFIVの重
要な部分を置換して安全性を高めるために、FIVクローン34TF10をEs
pIで開裂し、200μMのdNTPの存在下Klenowポリメラーゼで処理
し、次いでSacIで開裂し、200μMのdNTPの存在下T4 DNAポリ メラーゼで処理し、そして得られたウイルスコード化領域含有(しかしLTRは
含有していない)フラグメントをゲル精製した。次いで、このフラグメントをN
otI及びXbaIで開裂し、Klenow酵素で処理し、仔ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ処理したCMV−発現プラスミドpRc/CMVのバックボーンに平滑末
端連結させた。得られたプラスミド(CF1)は多重診断的制限消化によって確
認された。CF1はCMVプロモーターに続いて、LTR後の5’側リーダーの
遠位部(主要スプライスドナーの93ヌクレオチド上流)からFIVの最後のO
RF(Rev)の38ヌクレオチド下流までのFIVゲノムを含有している。
僅かに活性である。非霊長類レンチウイルスタンパク質の全長補体をヒト細胞内
においてトランスでそして複製欠陥型で高レベルで発現する先行方法はこれまで
に記載されていない。それ故、ヒト細胞内において複製欠陥態様でトランスで高
レベルのFIVタンパク質を発現させるため且つ複製に必要とされるFIVの重
要な部分を置換して安全性を高めるために、FIVクローン34TF10をEs
pIで開裂し、200μMのdNTPの存在下Klenowポリメラーゼで処理
し、次いでSacIで開裂し、200μMのdNTPの存在下T4 DNAポリ メラーゼで処理し、そして得られたウイルスコード化領域含有(しかしLTRは
含有していない)フラグメントをゲル精製した。次いで、このフラグメントをN
otI及びXbaIで開裂し、Klenow酵素で処理し、仔ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ処理したCMV−発現プラスミドpRc/CMVのバックボーンに平滑末
端連結させた。得られたプラスミド(CF1)は多重診断的制限消化によって確
認された。CF1はCMVプロモーターに続いて、LTR後の5’側リーダーの
遠位部(主要スプライスドナーの93ヌクレオチド上流)からFIVの最後のO
RF(Rev)の38ヌクレオチド下流までのFIVゲノムを含有している。
【0122】 FIVクローン34TF10は、このFIVクローンが既にORF2遺伝子を
不活性化する突然変異を有しているという理由で本研究用に選択した。タルッボ
ット・アール.エル.(Talbott, R.L.)他(1989年)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86、5743〜5747参照。ORF2は推定上のトランスアクチベーターであり、
そしてこれはネコ末梢血リンパ球の複製に必要であることが示されている。かく
して、34TF10は弱毒化ウイルスであり、この弱毒化はベクターの性能に影
響を与えないで野生型病原性FIVの危険性を更に最小限にするので本発明にと
って有益である。しかしながら、同様の特性を有する他のクローンは、組換え方
法を使用して野生型ウイルスを同様に不活性化することによって入手できるか又
は容易に誘導することができる。
不活性化する突然変異を有しているという理由で本研究用に選択した。タルッボ
ット・アール.エル.(Talbott, R.L.)他(1989年)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86、5743〜5747参照。ORF2は推定上のトランスアクチベーターであり、
そしてこれはネコ末梢血リンパ球の複製に必要であることが示されている。かく
して、34TF10は弱毒化ウイルスであり、この弱毒化はベクターの性能に影
響を与えないで野生型病原性FIVの危険性を更に最小限にするので本発明にと
って有益である。しかしながら、同様の特性を有する他のクローンは、組換え方
法を使用して野生型ウイルスを同様に不活性化することによって入手できるか又
は容易に誘導することができる。
【0123】 リン酸カルシウム共沈殿法でCF1をヒトHeLa、293及び293−T腎
細胞中にトランスフェクションすると、50から数百個の核を含有する合胞体細
胞(エンベロープ発現細胞と他の細胞との融合によって産生される多核巨大細胞
)の広範囲に及ぶ出現と培養上静中の高レベル(百万cpmを超える)の逆転写
酵素の産生いう驚くべき結果が得られた。実際、本発明者はヒト293及び29
3−T細胞並びにHeLa単層培養物がCF1による一過性トランスフェクショ
ン後に(例えば、75cm2のフラスコ中で10μgのCF1によるトランスフ ェクションによって)合胞体細胞によって再現可能的に90〜95%破壊される
ことを見いだしたが、設計されそして予期されたように、感染又は複製可能イル
スは産生されない。すなわち、大量のCF1でトランスフェクションした293
−T細胞上清液を新鮮な293若しくは293−T細胞又はクランダールネコ腎
細胞に移しても合胞体細胞又はRT産生は生じなかった。FIVエンベロープの
欠失(詳細については以下参照)を除いてCF1と同一のCF1△envは合胞
体細胞を生じさせないが、高レベルの逆転写酵素などのベクターのパッケージン
グに必要とされるウイルス機能は有していた。FIVプロモーターがヒト細胞内
で活性のプロモーターによって特異的に置換されている場合、上記の先例のない
結果から、Rev/RRE調節軸、FIV gag/pol産生及びエンベロー プ介在性合胞体細胞を含めてタンパク質産生に必要なFIVの機能は全てヒト細
胞内で生じる可能性があるという新規な識見が得られた。
細胞中にトランスフェクションすると、50から数百個の核を含有する合胞体細
胞(エンベロープ発現細胞と他の細胞との融合によって産生される多核巨大細胞
)の広範囲に及ぶ出現と培養上静中の高レベル(百万cpmを超える)の逆転写
酵素の産生いう驚くべき結果が得られた。実際、本発明者はヒト293及び29
3−T細胞並びにHeLa単層培養物がCF1による一過性トランスフェクショ
ン後に(例えば、75cm2のフラスコ中で10μgのCF1によるトランスフ ェクションによって)合胞体細胞によって再現可能的に90〜95%破壊される
ことを見いだしたが、設計されそして予期されたように、感染又は複製可能イル
スは産生されない。すなわち、大量のCF1でトランスフェクションした293
−T細胞上清液を新鮮な293若しくは293−T細胞又はクランダールネコ腎
細胞に移しても合胞体細胞又はRT産生は生じなかった。FIVエンベロープの
欠失(詳細については以下参照)を除いてCF1と同一のCF1△envは合胞
体細胞を生じさせないが、高レベルの逆転写酵素などのベクターのパッケージン
グに必要とされるウイルス機能は有していた。FIVプロモーターがヒト細胞内
で活性のプロモーターによって特異的に置換されている場合、上記の先例のない
結果から、Rev/RRE調節軸、FIV gag/pol産生及びエンベロー プ介在性合胞体細胞を含めてタンパク質産生に必要なFIVの機能は全てヒト細
胞内で生じる可能性があるという新規な識見が得られた。
【0124】 CF1及びCT5(下記)をヒト細胞に導入することにより産生された合胞体
細胞は、FIVに感染したネコから得られた血漿の1:1000希釈物を含める
ことによって完全に阻害された(1:10,000から1:30,000の間の
IC50)が、感染していない飼い猫から得られた血漿ではどの希釈物でも(1
:10であっても)全く阻害されなかった。抗FIV抗体によるこの特異的な阻
害によって、上記合胞体細胞がFIVエンベロープ特異的であるという更なる証
拠が提供された。
細胞は、FIVに感染したネコから得られた血漿の1:1000希釈物を含める
ことによって完全に阻害された(1:10,000から1:30,000の間の
IC50)が、感染していない飼い猫から得られた血漿ではどの希釈物でも(1
:10であっても)全く阻害されなかった。抗FIV抗体によるこの特異的な阻
害によって、上記合胞体細胞がFIVエンベロープ特異的であるという更なる証
拠が提供された。
【0125】 35S−メチオニン及び35S−システイン−標識し、CF1及び親ウイルス
(34TF10)でトランスフェクションした、ヒト(293−T、HeLa)
及びネコ(CRFK)細胞を放射線免疫沈降法により解析すると、、FIV+ど
ちらかのプラスミドでトランスフェクションしたCRFK細胞からもFIVウイ
ルスタンパク質はFIV陽性血清で特異的に免疫沈降できることが示された。ヒ
ト細胞では、34TF10は殆ど又は全くタンパク質を産生せず、これはFIV
プロモーターの活性がヒトでは最小限であることを示しているが、CF1は大量
のFIVタンパク質を産生した。これらのタンパク質は対照プラスミドでトラン
スフェクションした同じ細胞の免疫沈降物中には存在しなかったので、FIVに
特異的であることが示された。
(34TF10)でトランスフェクションした、ヒト(293−T、HeLa)
及びネコ(CRFK)細胞を放射線免疫沈降法により解析すると、、FIV+ど
ちらかのプラスミドでトランスフェクションしたCRFK細胞からもFIVウイ
ルスタンパク質はFIV陽性血清で特異的に免疫沈降できることが示された。ヒ
ト細胞では、34TF10は殆ど又は全くタンパク質を産生せず、これはFIV
プロモーターの活性がヒトでは最小限であることを示しているが、CF1は大量
のFIVタンパク質を産生した。これらのタンパク質は対照プラスミドでトラン
スフェクションした同じ細胞の免疫沈降物中には存在しなかったので、FIVに
特異的であることが示された。
【0126】 異種(例えば、VSV−G)エンベロープを使用できるように、CF1由来の
FIVエンベロープ(env遺伝子の産生物)の特異的欠失を3パート結合によ
って行った。すなわち、CF1はPflmI(これはCF1中に4回存在する)
で切断した。env遺伝子内の問題の2つのPflM部位は共存できず、そして
これらのPflM部位を単に平滑末端化しただけでフレーム内env欠失がもた
らされるであろうから、PflM消化物をT4ポリメラーゼで処理して3’Pf
lmI突出部を除去しそしてフレーム・シフト化sacIIリンカーに連結し、
SacIIで消化し、そしてゲル精製した。次いで、PflMI/SacII連
結消化物の分別物をsacIIで切断し、そしてpvuIか又はBsu36Iの
どちらかで別個に切断した。次いで、3パート連結を行った(PvuI−BsU
36IプラスBsU36I−PflM(SacIIリンカー)プラス(SacI
Iリンカー)PflMI−PvuI)。得られたプラスミド(CF1△env)
は多重診断的制限消化によって確認された。CF1△envはenv中に875
ヌクレオチドを欠失していた。これはトランスフェクション後にヒト細胞中で高
レベルの逆転写酵素を産生したが、合胞体細胞は産生せず、上述した血漿阻害実
験に加えて、CF1で見られた合胞体細胞はFIVエンベロープで特異的に介在
されたという更なる証拠が提供された。
FIVエンベロープ(env遺伝子の産生物)の特異的欠失を3パート結合によ
って行った。すなわち、CF1はPflmI(これはCF1中に4回存在する)
で切断した。env遺伝子内の問題の2つのPflM部位は共存できず、そして
これらのPflM部位を単に平滑末端化しただけでフレーム内env欠失がもた
らされるであろうから、PflM消化物をT4ポリメラーゼで処理して3’Pf
lmI突出部を除去しそしてフレーム・シフト化sacIIリンカーに連結し、
SacIIで消化し、そしてゲル精製した。次いで、PflMI/SacII連
結消化物の分別物をsacIIで切断し、そしてpvuIか又はBsu36Iの
どちらかで別個に切断した。次いで、3パート連結を行った(PvuI−BsU
36IプラスBsU36I−PflM(SacIIリンカー)プラス(SacI
Iリンカー)PflMI−PvuI)。得られたプラスミド(CF1△env)
は多重診断的制限消化によって確認された。CF1△envはenv中に875
ヌクレオチドを欠失していた。これはトランスフェクション後にヒト細胞中で高
レベルの逆転写酵素を産生したが、合胞体細胞は産生せず、上述した血漿阻害実
験に加えて、CF1で見られた合胞体細胞はFIVエンベロープで特異的に介在
されたという更なる証拠が提供された。
【0127】 CF1△envの上記エンベロープ機能は、任意の数の異種ウイルスエンベロ
ープタンパク質によってトランスで供給することができる。これらには、レトロ
ウイルスのエンベロープ機能に効率的に取って替わり得るため当該技術分野の熟
練者に良く知られているVSV−G、モロニー(Moloney)マウス白血病ウイル ス(MoMuLV)のアンホトロピックエンベロープ、及びテナガザル白血病ウ
イルス(GALV)エンベロープが含まれるが、これらに限定されない。
ープタンパク質によってトランスで供給することができる。これらには、レトロ
ウイルスのエンベロープ機能に効率的に取って替わり得るため当該技術分野の熟
練者に良く知られているVSV−G、モロニー(Moloney)マウス白血病ウイル ス(MoMuLV)のアンホトロピックエンベロープ、及びテナガザル白血病ウ
イルス(GALV)エンベロープが含まれるが、これらに限定されない。
【0128】 他の実施態様では、FIV配列の追加的な欠失がCF1△envから作成され
る。例えば、主要な5’スプライスドナーとgagATGコドン間の領域は、F
IVでは僅か20ヌクレオチドである(HIV−1における40以上及びHIV
−2における70以上と比較して)が、配列中で欠失又は変更させることができ
る。追加的なenv配列を除去して試験し、そして欠失vifまたは他の領域の
影響を試験する。
る。例えば、主要な5’スプライスドナーとgagATGコドン間の領域は、F
IVでは僅か20ヌクレオチドである(HIV−1における40以上及びHIV
−2における70以上と比較して)が、配列中で欠失又は変更させることができ
る。追加的なenv配列を除去して試験し、そして欠失vifまたは他の領域の
影響を試験する。
【0129】 好ましい実施態様では、幾つかの理由(U3、又は3−プライム固有領域はレ
トロウイルスのプロモーター/エンハンサーエレメントを有している)のために
、この系では(即ち、パッケージング及びベクター構築物の両方で)FIV U 3のプロモーター機能を完全に置換することが決定された。第1に、FIV L TRはヒト細胞では不活性であるか又は殆ど活性でないのに対し、ヒト細胞への
形質導入の親和性を高めることができまたネコ細胞を使用する良好なトランスフ
ェクション系が良好に特徴化されていないという理由で、ヒト細胞内でベクター
産生を試みることが望まれた。第2に、一定の系(例えば、293Tヒト胚性腎
細胞系)中でのhCMV急性期プロモーターのようなプロモーターによって誘導
される良く知られた高レベルの発現が好ましい。第3に、ベクターとパッケージ
ング構築物の両方においてU3を置換することが複製可能FIVの危険性除去に
更に役立つであろう。他の修飾では、特にTATAボックスを含めて3−プライ
ムU3領域の80塩基もベクターから欠失させた。それ故、この欠失によりそし
てパッケージングプラスミドがenv遺伝子欠失とORF2不活性化停止コドン
の両方を有しているという理由により、複製可能FIVは再生され得ない。第4
に、同じプロモーターで作用する3つの成分(パッケージングプラスミド、ベク
ター、エンベロープ発現プラスミド)を全て有していることは同調発現及び効率
的な粒子形成を高める可能性がある。第5に、上記したように、ネコ細胞は既知
又は未知の感染性物質をヒトに導入する危険性を提起するので、臨床用途にはヒ
ト細胞産生の方がネコ細胞産生より安全である。
トロウイルスのプロモーター/エンハンサーエレメントを有している)のために
、この系では(即ち、パッケージング及びベクター構築物の両方で)FIV U 3のプロモーター機能を完全に置換することが決定された。第1に、FIV L TRはヒト細胞では不活性であるか又は殆ど活性でないのに対し、ヒト細胞への
形質導入の親和性を高めることができまたネコ細胞を使用する良好なトランスフ
ェクション系が良好に特徴化されていないという理由で、ヒト細胞内でベクター
産生を試みることが望まれた。第2に、一定の系(例えば、293Tヒト胚性腎
細胞系)中でのhCMV急性期プロモーターのようなプロモーターによって誘導
される良く知られた高レベルの発現が好ましい。第3に、ベクターとパッケージ
ング構築物の両方においてU3を置換することが複製可能FIVの危険性除去に
更に役立つであろう。他の修飾では、特にTATAボックスを含めて3−プライ
ムU3領域の80塩基もベクターから欠失させた。それ故、この欠失によりそし
てパッケージングプラスミドがenv遺伝子欠失とORF2不活性化停止コドン
の両方を有しているという理由により、複製可能FIVは再生され得ない。第4
に、同じプロモーターで作用する3つの成分(パッケージングプラスミド、ベク
ター、エンベロープ発現プラスミド)を全て有していることは同調発現及び効率
的な粒子形成を高める可能性がある。第5に、上記したように、ネコ細胞は既知
又は未知の感染性物質をヒトに導入する危険性を提起するので、臨床用途にはヒ
ト細胞産生の方がネコ細胞産生より安全である。
【0130】 この構築物の設計は、正しくTATAボックスにおけるCMVプロモーターと
FIVゲノム(5’R反復配列から続いている)の融合に関係している。先ず、
PCR(合成PCRはエキソヌクレアーゼ+Ventポリメラーゼを使用して行
った)は、FIV TATAボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なSa cI−テール付加センスPCRプライマー(5’−atataGAGCTCtg
tgaaacttcgaggagtctc−3’)を、FIV gag遺伝子の 反対側ストランドと相同的なアンチセンスPCRプライマー(5’−ccaat
ctcgcccctgtccattcccc−3’)と組み合わせて使用して行
った。生成したPCR産生物は450bpであった。このPCR産生物は、sa
cI消化前にXhoIで消化した(何故なら、FIV LTRにはXhoI部位 のすぐ後にsac部位が存在しており、そしてこのようにして消化しない場合S
acI−SacIフラグメントが生成されるので)。XhoI消化とその後のS
acI消化の後、得られた310bpフラグメントは次のとおりであった: GAGCT/Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttga
ggacttttgagttctcccttgaggctcccacagata
caataaatatttgagattgaaccctgtcgagtatct
gtgtaatcttttttacctgtgaggtctcggaatccg
ggccgagaacttcgcagttggcgcccgaacagggac
ttgattgagagtgattgaggaagtgaagctagagca
atagaaagctgttaagcagaactcctgctgacctaa
atagggaagcagtagcagacgctgctaacagtgagt
atctctagtgaagcggaC\TCGAGctc。
FIVゲノム(5’R反復配列から続いている)の融合に関係している。先ず、
PCR(合成PCRはエキソヌクレアーゼ+Ventポリメラーゼを使用して行
った)は、FIV TATAボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なSa cI−テール付加センスPCRプライマー(5’−atataGAGCTCtg
tgaaacttcgaggagtctc−3’)を、FIV gag遺伝子の 反対側ストランドと相同的なアンチセンスPCRプライマー(5’−ccaat
ctcgcccctgtccattcccc−3’)と組み合わせて使用して行
った。生成したPCR産生物は450bpであった。このPCR産生物は、sa
cI消化前にXhoIで消化した(何故なら、FIV LTRにはXhoI部位 のすぐ後にsac部位が存在しており、そしてこのようにして消化しない場合S
acI−SacIフラグメントが生成されるので)。XhoI消化とその後のS
acI消化の後、得られた310bpフラグメントは次のとおりであった: GAGCT/Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttga
ggacttttgagttctcccttgaggctcccacagata
caataaatatttgagattgaaccctgtcgagtatct
gtgtaatcttttttacctgtgaggtctcggaatccg
ggccgagaacttcgcagttggcgcccgaacagggac
ttgattgagagtgattgaggaagtgaagctagagca
atagaaagctgttaagcagaactcctgctgacctaa
atagggaagcagtagcagacgctgctaacagtgagt
atctctagtgaagcggaC\TCGAGctc。
【0131】 このフラグメントを140bp残基からゲル精製して離し、そしてpRc/C
MVプラスミドのSacI−XhoIバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではFIV LTR配列をTATAボックスの下流に、CMVプ ロモーターのTATAボックスとFIVの置換されたTATAボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する:これは、正に、SacI部位がhCMVプ
ロモーター中のTATAボックスの3ヌクレオチド下流に存在するように、Sa
cI部位をTATAボックスの3ヌクレオチド下流に配置し、そしてFIV R 反復配列を、FIVゲノム中と同様に、TATAボックスから正確に9ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってCMVプロモーターとFIV転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され(且つ連結しており)、そして以下
の配列で詳記される: ..acgtataagttgttccattgtaagagtaTATAAc
cagtgctttgtgaaacttcgaggagtctctttgttg agga FIVAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG CAGAGCTC TCTGGCTAACTAGAGAACC.........
.. pRc/CMV AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttgagga CR
F1
MVプラスミドのSacI−XhoIバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではFIV LTR配列をTATAボックスの下流に、CMVプ ロモーターのTATAボックスとFIVの置換されたTATAボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する:これは、正に、SacI部位がhCMVプ
ロモーター中のTATAボックスの3ヌクレオチド下流に存在するように、Sa
cI部位をTATAボックスの3ヌクレオチド下流に配置し、そしてFIV R 反復配列を、FIVゲノム中と同様に、TATAボックスから正確に9ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってCMVプロモーターとFIV転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され(且つ連結しており)、そして以下
の配列で詳記される: ..acgtataagttgttccattgtaagagtaTATAAc
cagtgctttgtgaaacttcgaggagtctctttgttg agga FIVAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAG CAGAGCTC TCTGGCTAACTAGAGAACC.........
.. pRc/CMV AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttgagga CR
F1
【0132】 CRF1はCMVプロモーターとFIV R反復配列の5−プライム融合を完 了したが、3−プライムLTRとFIVゲノムの残りは下流に置かれたままであ
った。それ故、salI−テール付加PCRプライマーF3’S(tatata
GTCgactagggactgtttacgaac)及びF3’A/Not(
atatatagtcgacGCGGCCGCtgcgaagttctcg)を
使用して3’FIV LTRを増幅した:SaLIで消化したPCR産生物は、 アルカリホスファターゼで処理したCRF1の適合性XhoI部位に連結し、そ
してこの連結は加熱不活性化し、そしてXhoIを使用して野生型に対して選択
した。得られた、CRF(L)と命名されたプラスミドは上記の両LTRを有し
ており、そして3’LTRの3’末端に固有のNotI部位を配置している。
った。それ故、salI−テール付加PCRプライマーF3’S(tatata
GTCgactagggactgtttacgaac)及びF3’A/Not(
atatatagtcgacGCGGCCGCtgcgaagttctcg)を
使用して3’FIV LTRを増幅した:SaLIで消化したPCR産生物は、 アルカリホスファターゼで処理したCRF1の適合性XhoI部位に連結し、そ
してこの連結は加熱不活性化し、そしてXhoIを使用して野生型に対して選択
した。得られた、CRF(L)と命名されたプラスミドは上記の両LTRを有し
ており、そして3’LTRの3’末端に固有のNotI部位を配置している。
【0133】 次に、FIVゲノムの主要コード化領域は、p34TF10の8,845ヌク
レオチドのBbeI−EspIフラグメントを連結してCRF(L)のリン酸化
BbeI−EspIバックボーン中に挿入した。得られたプラスミドはCT5と
呼称した(CMVプロモーター−−>Tataボックスでの融合−−>3’LT
R U5エレメントにおけるR反復配列から正常なプロウイルス末端までの完全 なFIVゲノムから)。CT5は、最初のラウンドにおいてCMVプロモーター
でプロモートされる全長の感染性FIVをコードしている(その後のラウンドで
は、逆転写によって5’プロウイルス末端で野生型U3が産生されるので、FI
V LTRでプロモートされる)。ヒト293−T細胞におけるCT5か又は野 生型34TF10によるトランスフェクションは、FIV複製に関する標準的な
アッセイにおいて上清液と広範囲に及んでいる合胞体細胞の両方で等レベルのR
Tを生じさせた。すなわち、トランスフェクションした293−T細胞から得ら
れたろ過上清液を伝達した後に0.5%血清で維持したネコのクランダール(Cr
andall)ネコ腎細胞(CRFK細胞)での合胞体細胞形成(Tozzini他(1992年 )Journal of Virological Methods 37、241〜252も参照)。しかしながら、3 4TF10で産生したウイルスと同じく、CT5で産生したウイルスはその向性
において完全に野生型である:これはヒト細胞では複製しない。このことは、C
T5の3−プライムU3が野生型であるので予期される(レトロウイルスはビリ
オンmRNAの3−プライム末端にプロモーターを有している。すなわち、逆転
写によって、感受性細胞でその後の転写ラウンドをプロモートする能力を獲得し
ている組み込まれたプロウイルスの5’末端に3−プライムU3のコピーが配置
される)。要約すると、ネコ細胞に対して複製可能であるFIVは、293T細
胞を含む付着細胞系へのCT5のトランスフェクションによって産生され、複製
ではなくて、ライフサイクルの生産相がヒト細胞で効率的に達成されたことを証
明している。
レオチドのBbeI−EspIフラグメントを連結してCRF(L)のリン酸化
BbeI−EspIバックボーン中に挿入した。得られたプラスミドはCT5と
呼称した(CMVプロモーター−−>Tataボックスでの融合−−>3’LT
R U5エレメントにおけるR反復配列から正常なプロウイルス末端までの完全 なFIVゲノムから)。CT5は、最初のラウンドにおいてCMVプロモーター
でプロモートされる全長の感染性FIVをコードしている(その後のラウンドで
は、逆転写によって5’プロウイルス末端で野生型U3が産生されるので、FI
V LTRでプロモートされる)。ヒト293−T細胞におけるCT5か又は野 生型34TF10によるトランスフェクションは、FIV複製に関する標準的な
アッセイにおいて上清液と広範囲に及んでいる合胞体細胞の両方で等レベルのR
Tを生じさせた。すなわち、トランスフェクションした293−T細胞から得ら
れたろ過上清液を伝達した後に0.5%血清で維持したネコのクランダール(Cr
andall)ネコ腎細胞(CRFK細胞)での合胞体細胞形成(Tozzini他(1992年 )Journal of Virological Methods 37、241〜252も参照)。しかしながら、3 4TF10で産生したウイルスと同じく、CT5で産生したウイルスはその向性
において完全に野生型である:これはヒト細胞では複製しない。このことは、C
T5の3−プライムU3が野生型であるので予期される(レトロウイルスはビリ
オンmRNAの3−プライム末端にプロモーターを有している。すなわち、逆転
写によって、感受性細胞でその後の転写ラウンドをプロモートする能力を獲得し
ている組み込まれたプロウイルスの5’末端に3−プライムU3のコピーが配置
される)。要約すると、ネコ細胞に対して複製可能であるFIVは、293T細
胞を含む付着細胞系へのCT5のトランスフェクションによって産生され、複製
ではなくて、ライフサイクルの生産相がヒト細胞で効率的に達成されたことを証
明している。
【0134】 (CT5から誘導されたFIVベクター) CT5は、ヒト細胞中であれネコ細胞中であれトランスフェクションされると
、ネコ細胞に対して複製可能であるがヒト細胞に対しては複製可能でないFIV
を産生する:このウイルス転写物はプロデューサー細胞内でネコプロモーターで
はなくてヒトプロモーターで発現されるが、ネコの3−プライムU3は無傷のま
まであり、そしてその後の複製ラウンドにおける5−プライムU3プロモーター
の供給源は常にプロデューサー細胞転写物の3−プライムU3である。この残っ
ている3−プライムU3エレメントを欠失させることもできる。
、ネコ細胞に対して複製可能であるがヒト細胞に対しては複製可能でないFIV
を産生する:このウイルス転写物はプロデューサー細胞内でネコプロモーターで
はなくてヒトプロモーターで発現されるが、ネコの3−プライムU3は無傷のま
まであり、そしてその後の複製ラウンドにおける5−プライムU3プロモーター
の供給源は常にプロデューサー細胞転写物の3−プライムU3である。この残っ
ている3−プライムU3エレメントを欠失させることもできる。
【0135】 CT5の修飾物からレトロウイルスベクターを産生するために、2つの戦略を
使用した。1つの実施態様では、FIVのRREがFIVのコード配列に対して
3−プライムに(他のレンチウイルスと同様に、SU/TM結合部というよりは
むしろTMタンパク質の末端に)位置しているという事実に注目する。それ故、
それ自体のポリアデニル化p(A)シグナルを有しているレポーター遺伝子カセ
ットがFIV配列に関してアンチセンス方向に配置されている場合、RREの位
置は保存され、シス作用性シグナルの使用とパッケージングを高めるであろう。
第2の実施態様では、RREを通常の3−プライム位置から除去し、そして標準
的なクローニング技術によってFIV gag/pol遺伝子部分の直後に配置 し、gag配列を含有するベクター転写物のRev保護とレポーター遺伝子カセ
ットのセンス方向下流での挿入を可能にした。gag遺伝子配列は他のレトロウ
イルスではパッケージングを高めることが示されているので、この遺伝子配列を
これらのベクター内に含める。しかしながら、これらのベクターでは、gag遺
伝子はgagのヌクレオチド298に位置するTth III 1部位(Tth III1消化、Klenowポリメラーゼ介在性充填、連結、リガーゼ不活性化
、そして最後に野生型に対するTth III1選択によってクローン化されて いる)の平滑化閉鎖によってフレームシフトさせて、機能的なgagの組換えを
妨げ、そしてトランス優先的に抑制するGagタンパク質の産生を妨げる。この
フレームシフトを超えるか又は更には先行しているgagの追加的な部分は力価
に影響を与えることなくベクターから除去することができる。
使用した。1つの実施態様では、FIVのRREがFIVのコード配列に対して
3−プライムに(他のレンチウイルスと同様に、SU/TM結合部というよりは
むしろTMタンパク質の末端に)位置しているという事実に注目する。それ故、
それ自体のポリアデニル化p(A)シグナルを有しているレポーター遺伝子カセ
ットがFIV配列に関してアンチセンス方向に配置されている場合、RREの位
置は保存され、シス作用性シグナルの使用とパッケージングを高めるであろう。
第2の実施態様では、RREを通常の3−プライム位置から除去し、そして標準
的なクローニング技術によってFIV gag/pol遺伝子部分の直後に配置 し、gag配列を含有するベクター転写物のRev保護とレポーター遺伝子カセ
ットのセンス方向下流での挿入を可能にした。gag遺伝子配列は他のレトロウ
イルスではパッケージングを高めることが示されているので、この遺伝子配列を
これらのベクター内に含める。しかしながら、これらのベクターでは、gag遺
伝子はgagのヌクレオチド298に位置するTth III 1部位(Tth III1消化、Klenowポリメラーゼ介在性充填、連結、リガーゼ不活性化
、そして最後に野生型に対するTth III1選択によってクローン化されて いる)の平滑化閉鎖によってフレームシフトさせて、機能的なgagの組換えを
妨げ、そしてトランス優先的に抑制するGagタンパク質の産生を妨げる。この
フレームシフトを超えるか又は更には先行しているgagの追加的な部分は力価
に影響を与えることなくベクターから除去することができる。
【0136】 これらのベクターの転写はCMVプロモーターで生起し、そしてFIVプロモ
ーターでは生起しないことに注意されたい。他のプロモーターは任意に使用する
ことができる。加えて、FIVゲノムの追加的な領域、例えばgagの領域を以
下に詳記するようにして欠失させることによって多数の修飾が可能である。
ーターでは生起しないことに注意されたい。他のプロモーターは任意に使用する
ことができる。加えて、FIVゲノムの追加的な領域、例えばgagの領域を以
下に詳記するようにして欠失させることによって多数の修飾が可能である。
【0137】 このようなベクターを以下に記載しそして説明する: 1.ベクターCTAGCgfsB。 括弧内の記載中で下線を引いたボールド
体文字はベクターの名称の由来を示す(CMVプロモーターがTATAボックス
で結合し、逆方向の内部レポーター遺伝子カセットCMV−GFP−p(A)の
発現を行い、そしてgag遺伝子フレームシフト(gene frame shift)突然変異
とそれに続くsv40T抗原結合部位の挿入を有しており、SV40T抗原発現
細胞内でトランスフェクション後にプラスミドの増幅を生起させる)。CTAG
CgfsBは、CT5のpvuI−EcoRIフラグメント、緑色蛍光タンパク
質(GFP)遺伝子を含有するプラスミドであるpZcmvGFPpAのEco
RI−SpeIフラグメント、及びCT5のSpeI−PvuIフラグメントの
3−パートライゲーションによって構築した。このライゲーションはCMVプロ
モーター−GFP−p(A)シグナルカセットをFIVゲノム内のEcoRIと
SpeI間で逆方向に配置する。次に、上記ベクター内に残っているgag/p
ol部分のTth III1部位を開裂し、200μMのdNTPの存在下でK lenowポリメラーゼを使用して充填し、そしてT4 DNAリガーゼを使用 して閉鎖した。この平滑化によって、Tth III1部位の2,3の塩基内で gagフラグメントをフレームシフトするエキストラG残基が挿入される。po
l配列は全く存在していない。それ故、gag/polのプリカーサーはCF1
△env又はその後のCF1△envの修飾物からトランスで供給されなければ
ならない。更に、このステップは野生型組換えの機会及びトランス優先的に干渉
するGagタンパク質フラグメントが産生される機会を減少させる。最後に、S
v40T抗原で作用するプラスミド増幅による利益を得るためにそして必要な場
合neoRの選択を可能にするために、pRc/CMV由来のsv40−プロモ
ーター−neoRカセットをプラスミドのベクター配列の外側に挿入した。1つ
の実施態様では、gag遺伝子ATG開始コドンは停止コドンに突然変異させる
ことができる。さらに、BsRG1部位と上流のPstI部位間の領域を任意に
欠失させてより多くのgagを除去する。
体文字はベクターの名称の由来を示す(CMVプロモーターがTATAボックス
で結合し、逆方向の内部レポーター遺伝子カセットCMV−GFP−p(A)の
発現を行い、そしてgag遺伝子フレームシフト(gene frame shift)突然変異
とそれに続くsv40T抗原結合部位の挿入を有しており、SV40T抗原発現
細胞内でトランスフェクション後にプラスミドの増幅を生起させる)。CTAG
CgfsBは、CT5のpvuI−EcoRIフラグメント、緑色蛍光タンパク
質(GFP)遺伝子を含有するプラスミドであるpZcmvGFPpAのEco
RI−SpeIフラグメント、及びCT5のSpeI−PvuIフラグメントの
3−パートライゲーションによって構築した。このライゲーションはCMVプロ
モーター−GFP−p(A)シグナルカセットをFIVゲノム内のEcoRIと
SpeI間で逆方向に配置する。次に、上記ベクター内に残っているgag/p
ol部分のTth III1部位を開裂し、200μMのdNTPの存在下でK lenowポリメラーゼを使用して充填し、そしてT4 DNAリガーゼを使用 して閉鎖した。この平滑化によって、Tth III1部位の2,3の塩基内で gagフラグメントをフレームシフトするエキストラG残基が挿入される。po
l配列は全く存在していない。それ故、gag/polのプリカーサーはCF1
△env又はその後のCF1△envの修飾物からトランスで供給されなければ
ならない。更に、このステップは野生型組換えの機会及びトランス優先的に干渉
するGagタンパク質フラグメントが産生される機会を減少させる。最後に、S
v40T抗原で作用するプラスミド増幅による利益を得るためにそして必要な場
合neoRの選択を可能にするために、pRc/CMV由来のsv40−プロモ
ーター−neoRカセットをプラスミドのベクター配列の外側に挿入した。1つ
の実施態様では、gag遺伝子ATG開始コドンは停止コドンに突然変異させる
ことができる。さらに、BsRG1部位と上流のPstI部位間の領域を任意に
欠失させてより多くのgagを除去する。
【0138】 2.ベクターCTRZLb。(CMVプロモーターがTATAボックスで結合
し、内部センス方向のLacZレポーター遺伝子カセットのR反復配列で始まる
発現を行い、そしてlacZ後に3’LTRを有している;これもTth II I1部位にgag遺伝子フレームシフト突然変異とそれに続くsv40T抗原結
合(binding)部位の挿入を有しており、トランスフェクション後にプラスミド の増幅を生起させる)。このベクターを構築するために、EcoRI及びBsr
GI酵素での開裂によってEcoRIとBsrGI間でCTAGCgfsを欠失
させ、200μMのdNTPを用いてKlenow酵素で処理し、T4リガーゼ平滑化
閉鎖連結し、そしてEcoRIを使用して野生型に対して選択した。BsrGI
部位を再生させた。pz−laczのBsrgI−EcoNIフラグメントをKl
enow酵素で処理し、そして固有のEcoNI部位に平滑化した。構造は次のとお
りであった:CMVプロモーター−−FIV R反復配列とのTaTaボックス 融合−−U5−−△gag−−FIV Rev応答エレメント−−cmvプロモ ーター−−LacZ遺伝子−−LTR。最後に、pRc/CMV由来のsv40
−プロモーター−neoR領域は、Sv40T抗原で作用するプラスミド増幅の
利益を得るため、そして必要な場合neoRの選択を可能にするために、プラス
ミドのベクター下流に挿入してT抗原結合部位を提供した。gag遺伝子のAT
G開始コドンは停止コドンに突然変異させることができ、そしてgagの追加的
な部分は任意に欠失させる。
し、内部センス方向のLacZレポーター遺伝子カセットのR反復配列で始まる
発現を行い、そしてlacZ後に3’LTRを有している;これもTth II I1部位にgag遺伝子フレームシフト突然変異とそれに続くsv40T抗原結
合(binding)部位の挿入を有しており、トランスフェクション後にプラスミド の増幅を生起させる)。このベクターを構築するために、EcoRI及びBsr
GI酵素での開裂によってEcoRIとBsrGI間でCTAGCgfsを欠失
させ、200μMのdNTPを用いてKlenow酵素で処理し、T4リガーゼ平滑化
閉鎖連結し、そしてEcoRIを使用して野生型に対して選択した。BsrGI
部位を再生させた。pz−laczのBsrgI−EcoNIフラグメントをKl
enow酵素で処理し、そして固有のEcoNI部位に平滑化した。構造は次のとお
りであった:CMVプロモーター−−FIV R反復配列とのTaTaボックス 融合−−U5−−△gag−−FIV Rev応答エレメント−−cmvプロモ ーター−−LacZ遺伝子−−LTR。最後に、pRc/CMV由来のsv40
−プロモーター−neoR領域は、Sv40T抗原で作用するプラスミド増幅の
利益を得るため、そして必要な場合neoRの選択を可能にするために、プラス
ミドのベクター下流に挿入してT抗原結合部位を提供した。gag遺伝子のAT
G開始コドンは停止コドンに突然変異させることができ、そしてgagの追加的
な部分は任意に欠失させる。
【0139】 リン酸カルシウム コ・トランスフェクション法によって産生されたベクター 上清液をヒト(HeLa、293)及びネコ(CRFK、Fc3Tg)細胞で力
価検定した。慣用のモロニーマウス白血病ウイルス(Mo−MuLV)に基づく
レトロウイルスベクターと比較して、FIVベクターはヒト及びネコ細胞の形質
導入で同等に有効であった。超遠心による1回の濃縮ラウンド後に、ネコ及びヒ
ト細胞の両方で107の力価が達成された。より高い力価は、トランスフェクシ ョンを純化しそして更に超遠心することによって達成することができる。加えて
、形質導入の24時間前に添加しそしてlacZ染色により毎日取り替えた培養
培地中でアフィジコリン15μg/mlを使用して増殖を停止させるとき、ヒト
(HeLa)及びネコ(CRFK)細胞は共に効率的に形質導入される。アフィ
ジコリン停止細胞中でのFIVベクターによるlacZ力価は***中の細胞にお
ける力価の80〜90%であり、一方Mo−MuLVベクター形質導入はアフィ
ジコリン処理によって消失した。これらの結果は、FIVベクターがヒト細胞を
形質導入でき、そして慣用の(例えば、マウス)レトロウイルスベクター中では
欠失しているレンチウイルス特異的生物学的特性である、非***細胞を形質導入
する能力を明らかに有していることを示している。重要なことは、本発明者はネ
コ細胞に対するFIVベクターの優先性を検出しなかったことである。つまり種
々のヒト及びネコ細胞の相対的な形質導入は細胞特異的であってベクター特異的
ではなかった。換言すると、FIVベクターによる形質導入が効率的であった細
胞はまた、慣用のモロニーマウス白血病ウイルスベクターによっても効率的に形
質導入され、そしてその逆も同じであった。
価検定した。慣用のモロニーマウス白血病ウイルス(Mo−MuLV)に基づく
レトロウイルスベクターと比較して、FIVベクターはヒト及びネコ細胞の形質
導入で同等に有効であった。超遠心による1回の濃縮ラウンド後に、ネコ及びヒ
ト細胞の両方で107の力価が達成された。より高い力価は、トランスフェクシ ョンを純化しそして更に超遠心することによって達成することができる。加えて
、形質導入の24時間前に添加しそしてlacZ染色により毎日取り替えた培養
培地中でアフィジコリン15μg/mlを使用して増殖を停止させるとき、ヒト
(HeLa)及びネコ(CRFK)細胞は共に効率的に形質導入される。アフィ
ジコリン停止細胞中でのFIVベクターによるlacZ力価は***中の細胞にお
ける力価の80〜90%であり、一方Mo−MuLVベクター形質導入はアフィ
ジコリン処理によって消失した。これらの結果は、FIVベクターがヒト細胞を
形質導入でき、そして慣用の(例えば、マウス)レトロウイルスベクター中では
欠失しているレンチウイルス特異的生物学的特性である、非***細胞を形質導入
する能力を明らかに有していることを示している。重要なことは、本発明者はネ
コ細胞に対するFIVベクターの優先性を検出しなかったことである。つまり種
々のヒト及びネコ細胞の相対的な形質導入は細胞特異的であってベクター特異的
ではなかった。換言すると、FIVベクターによる形質導入が効率的であった細
胞はまた、慣用のモロニーマウス白血病ウイルスベクターによっても効率的に形
質導入され、そしてその逆も同じであった。
【0140】 本発明はヒト遺伝子療法に適用可能である。上記で詳記したように、これらの
レトロウイルスベクターは、HIVベクターが致命的にヒト病原体から誘導され
ることから、HIVに基づくレンチウイルスベクターを超える安全性利益を有し
ている。FIVベクターはBL−2レベルの施設内で研究することができるので
、これらの産生に関与するヒトに引き起こされる危険性はHIVベクターと比較
して低下し、そして産生の容易さや便利さが高められる。これらのベクターは、
***しないか又は稀に***する細胞への安定な遺伝子伝達が望まれる場合、他の
遺伝子送達方法を超える利点を有している。このような細胞にはヒト神経系、目
、造血系、外皮、内分泌系、肝胆汁系、胃腸管、尿生殖路、骨、筋肉、心血管系
及び呼吸器系の細胞が含まれるが、これらに限定されない。これらのベクターは
また患者の非ヒト細胞への接触も防止し、そして既知の病原体から誘導されるレ
ンチウイルス遺伝子又はレンチウイルスタンパク質への接触も防止する。 実施例2:FIVに基づくレンチウイルスベクターによる非***ヒト細胞の形質
導入並びにFIV感染及び細胞変性に対するCXCR4要件の証明。
レトロウイルスベクターは、HIVベクターが致命的にヒト病原体から誘導され
ることから、HIVに基づくレンチウイルスベクターを超える安全性利益を有し
ている。FIVベクターはBL−2レベルの施設内で研究することができるので
、これらの産生に関与するヒトに引き起こされる危険性はHIVベクターと比較
して低下し、そして産生の容易さや便利さが高められる。これらのベクターは、
***しないか又は稀に***する細胞への安定な遺伝子伝達が望まれる場合、他の
遺伝子送達方法を超える利点を有している。このような細胞にはヒト神経系、目
、造血系、外皮、内分泌系、肝胆汁系、胃腸管、尿生殖路、骨、筋肉、心血管系
及び呼吸器系の細胞が含まれるが、これらに限定されない。これらのベクターは
また患者の非ヒト細胞への接触も防止し、そして既知の病原体から誘導されるレ
ンチウイルス遺伝子又はレンチウイルスタンパク質への接触も防止する。 実施例2:FIVに基づくレンチウイルスベクターによる非***ヒト細胞の形質
導入並びにFIV感染及び細胞変性に対するCXCR4要件の証明。
【0141】 HIVに基づくレンチウイルスベクターは非***中の細胞を効率的に形質導入
するが、このようなベクターは致命的にヒト病原体から誘導されるために問題が
多い。しかしながら、非霊長類レンチウイルスの使用はこれらの分子特性、特に
ヒト細胞への適合可能性に関する知識が比較的存在していないため複雑であった
。この実施例はヒト細胞内におけるFIVライフサイクルの生産的及びレセプタ
ー感染後のメカニズムの両方を記載し、そしてレンチウイルスベクター形質導入
に必要な感染が高い効率で生起し得ることを示す。非ネコ細胞では殆ど機能を果
たさないFIVプロモーターの置換を行った。全く異種的にプロモートされそし
てenv−プソイド型化されたFIVベクター系は、トランスでのFIVタンパ
ク質の高レベルヒト細胞発現とプロセシングを証明し、そして増殖を停止した有
糸***後の***ヒト細胞(マクロファージ及びhNTニューロン)を高い力価で
形質導入するFIVレトロウイルスベクターを産生した。この系はネコプロデュ
ーサー細胞の安全性リスクを消失させる。ヒト細胞において異種的にプロモート
されたFIVエンベロープタンパク質による重篤な細胞変性が観察され、そして
本発明のベクターを使用してこの現象を研究した。ヒトサイトメガロウイルスプ
ロモーターによるFIVゲノムの発現は、多種多様なヒト細胞では膨大なEnv
特異的合胞体細胞を誘導したが、齧歯類細胞では誘導しなかった。さらに、この
融合誘導活性にはCXCR4、即ちHIVの合胞体細胞誘導株のコ・レセプター
の共発現が必要であった。しかしながら、そのCXCR4−依存性にもかかわら
ず、非宿主細胞FIV Env合胞体細胞誘導はウイルス侵入から分離すること ができた。すなわち、非ネコ細胞でのCXCR4発現はFIV Env特異的細 胞融合を可能にしたが、FIV Env介在性ベクター形質導入もそしてウイル ス複製も可能にしなかった。コ・レセプターの役割と一致して、ネコ細胞でのヒ
トCXCR4発現はウイルス表現型を非細胞変性から高い細胞変性に変化させ、
そしてウイルスの感染性とFIVにエンベロープされたベクターによる形質導入
の両方を高めた。進化的に離れたレンチウイルスによるCXCR4の利用は、レ
ンチウイルス複製と細胞変性におけるこのケモカインレセプターの基本的な役割
を暗示している。これらの結果は比較レンチウイルス生物学並びにヒト遺伝子療
法に関して密接な関係を有している。
するが、このようなベクターは致命的にヒト病原体から誘導されるために問題が
多い。しかしながら、非霊長類レンチウイルスの使用はこれらの分子特性、特に
ヒト細胞への適合可能性に関する知識が比較的存在していないため複雑であった
。この実施例はヒト細胞内におけるFIVライフサイクルの生産的及びレセプタ
ー感染後のメカニズムの両方を記載し、そしてレンチウイルスベクター形質導入
に必要な感染が高い効率で生起し得ることを示す。非ネコ細胞では殆ど機能を果
たさないFIVプロモーターの置換を行った。全く異種的にプロモートされそし
てenv−プソイド型化されたFIVベクター系は、トランスでのFIVタンパ
ク質の高レベルヒト細胞発現とプロセシングを証明し、そして増殖を停止した有
糸***後の***ヒト細胞(マクロファージ及びhNTニューロン)を高い力価で
形質導入するFIVレトロウイルスベクターを産生した。この系はネコプロデュ
ーサー細胞の安全性リスクを消失させる。ヒト細胞において異種的にプロモート
されたFIVエンベロープタンパク質による重篤な細胞変性が観察され、そして
本発明のベクターを使用してこの現象を研究した。ヒトサイトメガロウイルスプ
ロモーターによるFIVゲノムの発現は、多種多様なヒト細胞では膨大なEnv
特異的合胞体細胞を誘導したが、齧歯類細胞では誘導しなかった。さらに、この
融合誘導活性にはCXCR4、即ちHIVの合胞体細胞誘導株のコ・レセプター
の共発現が必要であった。しかしながら、そのCXCR4−依存性にもかかわら
ず、非宿主細胞FIV Env合胞体細胞誘導はウイルス侵入から分離すること ができた。すなわち、非ネコ細胞でのCXCR4発現はFIV Env特異的細 胞融合を可能にしたが、FIV Env介在性ベクター形質導入もそしてウイル ス複製も可能にしなかった。コ・レセプターの役割と一致して、ネコ細胞でのヒ
トCXCR4発現はウイルス表現型を非細胞変性から高い細胞変性に変化させ、
そしてウイルスの感染性とFIVにエンベロープされたベクターによる形質導入
の両方を高めた。進化的に離れたレンチウイルスによるCXCR4の利用は、レ
ンチウイルス複製と細胞変性におけるこのケモカインレセプターの基本的な役割
を暗示している。これらの結果は比較レンチウイルス生物学並びにヒト遺伝子療
法に関して密接な関係を有している。
【0142】 ペタルマ(Petaluma)株のORF2欠失分子クローン(FIV 34TF10 )19を使用した(図1)。図1の上部に、FIV 34TF10とプラスミド CF1が示されている。この研究で使用したCF1の更なる修飾物はFIV 3 4TF10に関する図面の下に示されそして記載されている。CF1を産生する
ために、34TF10のSacI−EspIフラグメントを、hCMVIEプロ
モーター発現プラスミドpRc/CMV(Invitrogen)のポリリンカーのNot
IとXbaI間に平滑末端連結した。プラスミドCT5(SacI部位で結合)
では、TATAボックス(CMVIEp由来の)とR反復配列(FIV由来の)
の開始間でhCMVIEプロモーターとFIVゲノムの融合が行われ、そしてこ
れが示されている。PCR産生融合物は、CMV TATAボックスの下流のF IV R反復配列を、置換FIV TATAボックスの位置に正確に重ねて配置し
ている;これはまた、vif、ORF2、pol及びenv配列を全て欠いてい
るベクター(下部)の発現も行う。マーカー遺伝子カセットはlacZに対して
センス方向でありそしてGFPに対してはアンチセンス方向であり、追加的なポ
リ(A)シグナルを有している。フレームシフトは、残っているgagフラグメ
ントのヌクレオチド298で上記ベクターに導入された。プソイド型ベクターを
産生させるために、VSV−G発現プラスミドpHCMV−G42(示されてい
ない)をCF1△env及び示されたベクターを使用して293T細胞内でコ・
トランスフェクションした。追加的なクローニングの詳細は実施例1に見られる
。
ために、34TF10のSacI−EspIフラグメントを、hCMVIEプロ
モーター発現プラスミドpRc/CMV(Invitrogen)のポリリンカーのNot
IとXbaI間に平滑末端連結した。プラスミドCT5(SacI部位で結合)
では、TATAボックス(CMVIEp由来の)とR反復配列(FIV由来の)
の開始間でhCMVIEプロモーターとFIVゲノムの融合が行われ、そしてこ
れが示されている。PCR産生融合物は、CMV TATAボックスの下流のF IV R反復配列を、置換FIV TATAボックスの位置に正確に重ねて配置し
ている;これはまた、vif、ORF2、pol及びenv配列を全て欠いてい
るベクター(下部)の発現も行う。マーカー遺伝子カセットはlacZに対して
センス方向でありそしてGFPに対してはアンチセンス方向であり、追加的なポ
リ(A)シグナルを有している。フレームシフトは、残っているgagフラグメ
ントのヌクレオチド298で上記ベクターに導入された。プソイド型ベクターを
産生させるために、VSV−G発現プラスミドpHCMV−G42(示されてい
ない)をCF1△env及び示されたベクターを使用して293T細胞内でコ・
トランスフェクションした。追加的なクローニングの詳細は実施例1に見られる
。
【0143】 34TF10はクランデルネコ腎細胞(CRFK細胞)を生産的に感染するが
、ネコ末梢血リンパ球又は一次ネコマクロファージを感染しない(Carpenter &
O'Brien(1995年)Current Opinion in Genetics and Development 5、739〜745
;Waters他(1996年)Virology 215、10〜16;Sparger他(1994年)Virology 20 5 、546〜553;Bandecchi他(1995年)New Microbiologica 18、241〜252;Tozzi
ni他(1992年)Journal of Virological Methods 37、241〜252(1992年);Olm
sted他(1989年)Proceedings of the National Academy of Sciences of the U
nited States of America 86、2448〜2452)。この制限された屈性はenvにで
はなくてORF2突然変異に位置する。つまり、ORF2、即ち推定上のLTR
トランスアクチベーターの修復はこれら36のネコ細胞型の全ての生産的34T
F10感染を生じさせる。かくして、34TF10エンベロープは、HIVとの
ゆるやかな類似性によって「二重屈性」であると考えることができる。しかしな
がら、lab適合性/T−屈性対一次/マクロファージ屈性分類はFIV株又は
クローンに関しては確立されていない。実際、エイズ(AIDS)になるCD4
枯渇は特徴的であるが、FIVは感染したネコにおいてCD4+T細胞だけでな
くCD8+T細胞及びB細胞も感染させる(Pedersen(1993年)上述)。34T
F10又は任意の他の飼いネコ株若しくはクローンはいずれもCRFK細胞内で
細胞溶解性である。小さな多核巨大細胞(4〜12個の核)が最大限感染させた
培養物中で検出されることがあるが、広範囲の細胞死は生起していない(Barr他
(1995年)、上述;Tozzini他(1992年)Journal of Virological Methods 37、
241〜252;Barr(1997年)Virology 228、84〜91)。34TF10は実験的に感
染させた飼いネコでは重大なウイルス血症又は疾病を引き起こさず、ORF2修
復クローンのインビボ表現型は未だ知られていない(Sparger他(1994年)Virol
ogy 205、546〜553)。
、ネコ末梢血リンパ球又は一次ネコマクロファージを感染しない(Carpenter &
O'Brien(1995年)Current Opinion in Genetics and Development 5、739〜745
;Waters他(1996年)Virology 215、10〜16;Sparger他(1994年)Virology 20 5 、546〜553;Bandecchi他(1995年)New Microbiologica 18、241〜252;Tozzi
ni他(1992年)Journal of Virological Methods 37、241〜252(1992年);Olm
sted他(1989年)Proceedings of the National Academy of Sciences of the U
nited States of America 86、2448〜2452)。この制限された屈性はenvにで
はなくてORF2突然変異に位置する。つまり、ORF2、即ち推定上のLTR
トランスアクチベーターの修復はこれら36のネコ細胞型の全ての生産的34T
F10感染を生じさせる。かくして、34TF10エンベロープは、HIVとの
ゆるやかな類似性によって「二重屈性」であると考えることができる。しかしな
がら、lab適合性/T−屈性対一次/マクロファージ屈性分類はFIV株又は
クローンに関しては確立されていない。実際、エイズ(AIDS)になるCD4
枯渇は特徴的であるが、FIVは感染したネコにおいてCD4+T細胞だけでな
くCD8+T細胞及びB細胞も感染させる(Pedersen(1993年)上述)。34T
F10又は任意の他の飼いネコ株若しくはクローンはいずれもCRFK細胞内で
細胞溶解性である。小さな多核巨大細胞(4〜12個の核)が最大限感染させた
培養物中で検出されることがあるが、広範囲の細胞死は生起していない(Barr他
(1995年)、上述;Tozzini他(1992年)Journal of Virological Methods 37、
241〜252;Barr(1997年)Virology 228、84〜91)。34TF10は実験的に感
染させた飼いネコでは重大なウイルス血症又は疾病を引き起こさず、ORF2修
復クローンのインビボ表現型は未だ知られていない(Sparger他(1994年)Virol
ogy 205、546〜553)。
【0144】 図1に図示されているように、ヒトサイトメガロウイルス急性期遺伝子プロモ
ーター(hCMVIEp)を、(a)FIV主要5’スプライスドナー(プラス
ミドCF1中)の上流97ヌクレオチドの結合部と共にFIV LTRを全て置 換するように、又は(b)TATAボックスと転写開始、即ちR反復配列間の−
14位における融合によってFIV U3プロモーターエレメント(プラスミド CT5中とFIVベクター中)を選択的に置換するように配列させた。この配列
によって、CMV TATAボックスは転写開始部(−27位)に関して置換F IV TATAボックスの位置に正確に重ねて配置される。CF1は、rev O
RFと重複している3−プライムU3の89ヌクレオチド部分を除いて両LTR
を欠いている(FIVはHIV nefと相同性を有していない)ので、複製や 組込みに必要なシス作用性配列(U3プロモーター配列、tRNAプライマー結
合部位、R反復配列、U5エレメント)を欠いている。この実施例に記載した構
築物のクローニングに関する詳細については実施例1も参照されたい。CF1△
envはenvにおいて、SU−TM結合部に及んでおり且つフレームシフトも
している更なる875ヌクレオチド欠失を有している:それ故、プソイド型ベク
ターのパッケージングに使用したこのプラスミドはORF−2、env及び認め
られたシス作用性レトロウイルスエレメントを欠いている。対照的に、CT5は
野生型の複製可能34TF10を完全にコードしている。それ故、この系はネコ
プロモーターの必要性を排除している。それ故、ORF2の機能は決定的には特
定されていないが、この遺伝子産生物36に関して記載されたFIV LTRト ランス活性化活性も不要であろう。
ーター(hCMVIEp)を、(a)FIV主要5’スプライスドナー(プラス
ミドCF1中)の上流97ヌクレオチドの結合部と共にFIV LTRを全て置 換するように、又は(b)TATAボックスと転写開始、即ちR反復配列間の−
14位における融合によってFIV U3プロモーターエレメント(プラスミド CT5中とFIVベクター中)を選択的に置換するように配列させた。この配列
によって、CMV TATAボックスは転写開始部(−27位)に関して置換F IV TATAボックスの位置に正確に重ねて配置される。CF1は、rev O
RFと重複している3−プライムU3の89ヌクレオチド部分を除いて両LTR
を欠いている(FIVはHIV nefと相同性を有していない)ので、複製や 組込みに必要なシス作用性配列(U3プロモーター配列、tRNAプライマー結
合部位、R反復配列、U5エレメント)を欠いている。この実施例に記載した構
築物のクローニングに関する詳細については実施例1も参照されたい。CF1△
envはenvにおいて、SU−TM結合部に及んでおり且つフレームシフトも
している更なる875ヌクレオチド欠失を有している:それ故、プソイド型ベク
ターのパッケージングに使用したこのプラスミドはORF−2、env及び認め
られたシス作用性レトロウイルスエレメントを欠いている。対照的に、CT5は
野生型の複製可能34TF10を完全にコードしている。それ故、この系はネコ
プロモーターの必要性を排除している。それ故、ORF2の機能は決定的には特
定されていないが、この遺伝子産生物36に関して記載されたFIV LTRト ランス活性化活性も不要であろう。
【0145】 ヒト細胞中に34TF10ではなくてCF1又はCT5(図1)をトランスフ
ェクションすると12〜18時間以内に爆発的な合胞体細胞形成が生じた。He
La細胞及び293ヒト胚性腎細胞単層は、CF1又はCT5のトランスフェク
ション後48〜60時間以内に合胞体細胞溶解によって、再現可能的に90〜9
5%破壊された。3つのプラスミドは全て常に、より少なく(400倍)より小
さな(4〜12個の核)多数の合胞体細胞を産生し、そしてCRFK細胞では認
識可能な細胞溶解は得られなかった。
ェクションすると12〜18時間以内に爆発的な合胞体細胞形成が生じた。He
La細胞及び293ヒト胚性腎細胞単層は、CF1又はCT5のトランスフェク
ション後48〜60時間以内に合胞体細胞溶解によって、再現可能的に90〜9
5%破壊された。3つのプラスミドは全て常に、より少なく(400倍)より小
さな(4〜12個の核)多数の合胞体細胞を産生し、そしてCRFK細胞では認
識可能な細胞溶解は得られなかった。
【0146】 エレクトロポレートしたU87MG及びU87MG.CXCR4細胞を除いて
、トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法によるものであった。全ての
場合において、この研究でトランスフェクションした細胞は、同一のリン酸カル
シウム沈殿物で同時にトランスフェクションした細胞を使用して定量的合胞体細
胞巣状アッセイで比較した。細胞はクリスタル・バイオレットによってか又は、
巣状感染性アッセイでは、FIV−ペタルマ血清及びネコIgG41に対するホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ二次抗体を用いるイムノペルオキ
シダーゼ染色によって染色した。比較は全て、hCMVIEでプロモートしたG
FP又はLacZレポータープラスミドのコ・トランスフェクションによってイ
ンプットDNAの10%として制御した。トランスフェクション効率が比較細胞
系間で<5%で変化する実験だけ報告する。溶解がCF1に対して24時間目に
広範囲であった場合、GFP蛍光による比較トランスフェクション効率は、合胞
体細胞形成を阻止するためにFIV感染飼いネコ血漿の1:300希釈物の存在
下平行ウェル中でアッセイした。細胞は全て、抗生物質を有する10%ウシ血清
中で増殖させたATCC系であり、CRFK細胞は記載されているようにしてL
50培地中で増殖させた。CRFKのATCC番号はATCCCCL94であっ
た。
、トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法によるものであった。全ての
場合において、この研究でトランスフェクションした細胞は、同一のリン酸カル
シウム沈殿物で同時にトランスフェクションした細胞を使用して定量的合胞体細
胞巣状アッセイで比較した。細胞はクリスタル・バイオレットによってか又は、
巣状感染性アッセイでは、FIV−ペタルマ血清及びネコIgG41に対するホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ二次抗体を用いるイムノペルオキ
シダーゼ染色によって染色した。比較は全て、hCMVIEでプロモートしたG
FP又はLacZレポータープラスミドのコ・トランスフェクションによってイ
ンプットDNAの10%として制御した。トランスフェクション効率が比較細胞
系間で<5%で変化する実験だけ報告する。溶解がCF1に対して24時間目に
広範囲であった場合、GFP蛍光による比較トランスフェクション効率は、合胞
体細胞形成を阻止するためにFIV感染飼いネコ血漿の1:300希釈物の存在
下平行ウェル中でアッセイした。細胞は全て、抗生物質を有する10%ウシ血清
中で増殖させたATCC系であり、CRFK細胞は記載されているようにしてL
50培地中で増殖させた。CRFKのATCC番号はATCCCCL94であっ
た。
【0147】 以前の研究(Bar他(1995年)Journal of Virology 69、7371〜7374)と一致 して、CRFK細胞(ATCCCCL94)の34TF10及びCT5トランス
フェクションによって、7〜14日までに高いRT値(>5×105cpm/m l)による永続的感染が確立されたが、細胞変性効果は最小限であった(6ウェ
ルプレートの9.6cm2ウェル当たり6〜12±4個の合胞体細胞、4〜8個 の核)。しかしながら、予期されたように、CF1は感染性ウイルスを産生しな
かった。すなわち、107個のCRFK細胞又は107個のヒト細胞(HeLa、
293、H9、Molt4、supT1、U937)に対してCF1でトランス
フェクションしたヒト又はネコ細胞から得られたろ過上清液を継代しても合胞体
細胞又はRT産生をもたらさなかった。付着細胞系も、以前に記載された巣状感
染性アッセイ(FIA)(Remington他(1991年)Journal of Virology 65、308
〜312)で陰性であり、34TF10−又はCT5−感染CRFK細胞では1m l当たり<5感染単位に対して感受性であった。
フェクションによって、7〜14日までに高いRT値(>5×105cpm/m l)による永続的感染が確立されたが、細胞変性効果は最小限であった(6ウェ
ルプレートの9.6cm2ウェル当たり6〜12±4個の合胞体細胞、4〜8個 の核)。しかしながら、予期されたように、CF1は感染性ウイルスを産生しな
かった。すなわち、107個のCRFK細胞又は107個のヒト細胞(HeLa、
293、H9、Molt4、supT1、U937)に対してCF1でトランス
フェクションしたヒト又はネコ細胞から得られたろ過上清液を継代しても合胞体
細胞又はRT産生をもたらさなかった。付着細胞系も、以前に記載された巣状感
染性アッセイ(FIA)(Remington他(1991年)Journal of Virology 65、308
〜312)で陰性であり、34TF10−又はCT5−感染CRFK細胞では1m l当たり<5感染単位に対して感受性であった。
【0148】 ヒト細胞又はCRFK細胞のどちらで産生させたとしても、p34TF10−
又はCT5−産生FIVはどちらもヒト細胞内で複製しなかった。それにも拘わ
らず、CF1△envのトランスフェクションではどの細胞内でも合胞体細胞は
産生されなかったが比較的高いRT値を生じさせたので、ヒト及びネコ細胞内へ
のCF1及びCT5トランスフェクションで産生された合胞体細胞はFIVエン
ベロープタンパク質によって特異的に生起させられた。
又はCT5−産生FIVはどちらもヒト細胞内で複製しなかった。それにも拘わ
らず、CF1△envのトランスフェクションではどの細胞内でも合胞体細胞は
産生されなかったが比較的高いRT値を生じさせたので、ヒト及びネコ細胞内へ
のCF1及びCT5トランスフェクションで産生された合胞体細胞はFIVエン
ベロープタンパク質によって特異的に生起させられた。
【0149】 Mg2+依存性逆転写酵素は、指示されたプラスミドをCRFK細胞、HeL a、293及び293T細胞内でトランスフェクションして52時間後に以前に
記載された(Willey他(1988年)Journal of Virology 62、139〜147)ようにし
て測定した。広範な合胞体細胞溶解はCT5、CF1、CF1△pol及びpH
CMV−Gでトランスフェクションした細胞内で見られた。後者の2つのプラス
ミドはウイルス特異性を証明するために細胞溶解用の対照として含めた。1.0
の感染多重度のHIV−1及びHIV−2を使用して2週間早く感染させたH9
細胞から得られた上清液も比較のためにアッセイした。図2において、各点は三
重複測定平均値±S.E.である。 FIV(ペタルマ株)で感染させた飼いネコ血漿でトランスフェクションした
細胞の放射線免疫沈降法を行った。293細胞、HeLa及びCRFK細胞は、
25cm2のフラスコ内でリン酸カルシウム沈殿法によって、指示されたプラス ミドでトランスフェクションさせた。トランスフェクション後27時間(293
細胞)又は48時間(HeLa及びCRFK細胞)目に、7.5%の透析ウシ胎
児血清を有するシステイン及びメチオニン不含培地中で35S−システイン及び35 S−メチオニンを使用して、同位元素を有していない上記培地中で1時間予めイ
ンキュベートした後に、細胞を5時間放射線標識した。溶解物は正常ネコ血清及
びプロテインAセファロースを使用して予め清浄化し、FIV感染ネコ血漿10
μlと共に一夜インキュベートし、プロテインAセファロースで沈殿させ、そし
て10又は12.5%のSDSポリアクリルアミドゲル中で予め染色したマーカ
ーを使用して電気泳動にかけた。溶解物は、広範な合胞体細胞溶解により細胞が
損失したので、概ね15〜25%の量の他のレーンの細胞から誘導した。パネル
Bは、293T及びHeLa細胞におけるFIV感染飼いネコ血漿によるCF1
誘導合胞体細胞の阻害を示す。合胞体細胞はメタノール固定細胞のクリスタル・
バイオレット染色によって、≧8個の核を有する巣状物として48時間目に記録
した。12ウエルプレート内でのトランスフェクション時にFIV+(四角、丸
)か又はFIV−(菱形、三角)血漿のどちらかの希釈物を細胞に添加し、そし
て14時間後に再度培地を交換した。
記載された(Willey他(1988年)Journal of Virology 62、139〜147)ようにし
て測定した。広範な合胞体細胞溶解はCT5、CF1、CF1△pol及びpH
CMV−Gでトランスフェクションした細胞内で見られた。後者の2つのプラス
ミドはウイルス特異性を証明するために細胞溶解用の対照として含めた。1.0
の感染多重度のHIV−1及びHIV−2を使用して2週間早く感染させたH9
細胞から得られた上清液も比較のためにアッセイした。図2において、各点は三
重複測定平均値±S.E.である。 FIV(ペタルマ株)で感染させた飼いネコ血漿でトランスフェクションした
細胞の放射線免疫沈降法を行った。293細胞、HeLa及びCRFK細胞は、
25cm2のフラスコ内でリン酸カルシウム沈殿法によって、指示されたプラス ミドでトランスフェクションさせた。トランスフェクション後27時間(293
細胞)又は48時間(HeLa及びCRFK細胞)目に、7.5%の透析ウシ胎
児血清を有するシステイン及びメチオニン不含培地中で35S−システイン及び35 S−メチオニンを使用して、同位元素を有していない上記培地中で1時間予めイ
ンキュベートした後に、細胞を5時間放射線標識した。溶解物は正常ネコ血清及
びプロテインAセファロースを使用して予め清浄化し、FIV感染ネコ血漿10
μlと共に一夜インキュベートし、プロテインAセファロースで沈殿させ、そし
て10又は12.5%のSDSポリアクリルアミドゲル中で予め染色したマーカ
ーを使用して電気泳動にかけた。溶解物は、広範な合胞体細胞溶解により細胞が
損失したので、概ね15〜25%の量の他のレーンの細胞から誘導した。パネル
Bは、293T及びHeLa細胞におけるFIV感染飼いネコ血漿によるCF1
誘導合胞体細胞の阻害を示す。合胞体細胞はメタノール固定細胞のクリスタル・
バイオレット染色によって、≧8個の核を有する巣状物として48時間目に記録
した。12ウエルプレート内でのトランスフェクション時にFIV+(四角、丸
)か又はFIV−(菱形、三角)血漿のどちらかの希釈物を細胞に添加し、そし
て14時間後に再度培地を交換した。
【0150】 CF1でトランスフェクションしたヒト細胞内の合胞体細胞はFIVペタムラ
株で感染させた飼いネコ血漿によって強力に抑制され、293T及びHeLa細
胞において、それぞれ1:32,000倍及び1:12,700倍希釈で50%
阻害され、一方前免疫飼いネコ血漿は、どのような希釈であっても、1:10で
さえ合胞体細胞形成に対して効果を全く有していなかった(図2B)。さらに、
合胞体細胞誘導は、envのSU部分に限定されたフレームシフトしていない5
39ヌクレオチド(ヌクレオチド7322〜7861)のより小さな欠失(TM
ドメインと上流のタンパク質溶解開裂部位を割愛;図1のCF1△SU参照)に
よって終了したので、合胞体細胞誘導にはエンベロープのSU及びTMドメイン
の両方が必要であることを示唆している。これらの実験用の1:300希釈抗血
清の存在下で、平行ウエルにおいてGFPレポーター コ・トランスフェクショ ンによって決定されたトランスフェクション効率は≦10%であったので、合胞
体細胞溶解が非トランスフェクション細胞とトランスフェクション細胞との融合
によって媒介されることを示していた。
株で感染させた飼いネコ血漿によって強力に抑制され、293T及びHeLa細
胞において、それぞれ1:32,000倍及び1:12,700倍希釈で50%
阻害され、一方前免疫飼いネコ血漿は、どのような希釈であっても、1:10で
さえ合胞体細胞形成に対して効果を全く有していなかった(図2B)。さらに、
合胞体細胞誘導は、envのSU部分に限定されたフレームシフトしていない5
39ヌクレオチド(ヌクレオチド7322〜7861)のより小さな欠失(TM
ドメインと上流のタンパク質溶解開裂部位を割愛;図1のCF1△SU参照)に
よって終了したので、合胞体細胞誘導にはエンベロープのSU及びTMドメイン
の両方が必要であることを示唆している。これらの実験用の1:300希釈抗血
清の存在下で、平行ウエルにおいてGFPレポーター コ・トランスフェクショ ンによって決定されたトランスフェクション効率は≦10%であったので、合胞
体細胞溶解が非トランスフェクション細胞とトランスフェクション細胞との融合
によって媒介されることを示していた。
【0151】 次いで、逆転写酵素(RT)アッセイ及びFIV感染飼いネコから得られた血
漿を使用する放射線標識細胞の免疫沈降法によってヒト細胞における発現を更に
試験した。hCMVIEでプロモートされた構築物はヒト細胞(HeLa、29
3、293T)内で高いMg2+依存性RT値を発現し、そしてさらにまた、ネ コ(CRFK)細胞及びヒト細胞の両方でp34TF10の天然LTRより優れ
ていた(図2A)。対照的に、ヒト細胞内での34TF10によるLTR誘導R
T発現は最小限であった:hCMVIEp−キメラ構築物によるタンパク質発現
もネコ細胞内での34TF10発現を概ね6倍のファクターだけ上回っていた。
pol−欠失突然変異体(CF1△pol)はRTを全く産生しなかった(図2
A)が、CF1と同様に広範に合胞体細胞を産生した。
漿を使用する放射線標識細胞の免疫沈降法によってヒト細胞における発現を更に
試験した。hCMVIEでプロモートされた構築物はヒト細胞(HeLa、29
3、293T)内で高いMg2+依存性RT値を発現し、そしてさらにまた、ネ コ(CRFK)細胞及びヒト細胞の両方でp34TF10の天然LTRより優れ
ていた(図2A)。対照的に、ヒト細胞内での34TF10によるLTR誘導R
T発現は最小限であった:hCMVIEp−キメラ構築物によるタンパク質発現
もネコ細胞内での34TF10発現を概ね6倍のファクターだけ上回っていた。
pol−欠失突然変異体(CF1△pol)はRTを全く産生しなかった(図2
A)が、CF1と同様に広範に合胞体細胞を産生した。
【0152】 トランスフェクションし、放射線標識したヒト及びネコ細胞の免疫沈降法によ
って、RTアッセイと同等の量でヒト細胞内でのCF1又はCT5による野生型
34TF10発現パターンが証明された。それにも拘わらず、p34TF10発
現はHeLa細胞ではRIPAによって明白に検出可能であったが、CMVIE
p−キメラよりかなり低い値であり、そして293又は293T細胞では検出で
きなかった(フィルム暴露を延長した後であっても)。この結果と一致して、小
さな合胞体細胞(4〜6個の核、11〜14個の合胞体細胞±4、n=4、6ウ
エルプレートの1ウエル当たり)はp34TF10トランスフェクション48時
間後のHeLa細胞で検出可能であった。CF1△SUのフレーム保持SU欠失
によって、予測される切断エンベローププリカーサーが生じ、これは短縮SU/
gp100開裂産生物を有する殆ど解析されていない塗沫標本と一致する。使用
した血漿はどの細胞から得られるTMタンパク質も沈殿させなかった。他の2つ
のenv突然変異体は免疫沈降性Env産生を終了し、そしてどのエンベロープ
突然変異体も全ての細胞内で合胞体細胞を形成しなかった。RTデータと一致し
て、CF1発現もCRFK細胞内のLTR作用性発現より優れていた。
って、RTアッセイと同等の量でヒト細胞内でのCF1又はCT5による野生型
34TF10発現パターンが証明された。それにも拘わらず、p34TF10発
現はHeLa細胞ではRIPAによって明白に検出可能であったが、CMVIE
p−キメラよりかなり低い値であり、そして293又は293T細胞では検出で
きなかった(フィルム暴露を延長した後であっても)。この結果と一致して、小
さな合胞体細胞(4〜6個の核、11〜14個の合胞体細胞±4、n=4、6ウ
エルプレートの1ウエル当たり)はp34TF10トランスフェクション48時
間後のHeLa細胞で検出可能であった。CF1△SUのフレーム保持SU欠失
によって、予測される切断エンベローププリカーサーが生じ、これは短縮SU/
gp100開裂産生物を有する殆ど解析されていない塗沫標本と一致する。使用
した血漿はどの細胞から得られるTMタンパク質も沈殿させなかった。他の2つ
のenv突然変異体は免疫沈降性Env産生を終了し、そしてどのエンベロープ
突然変異体も全ての細胞内で合胞体細胞を形成しなかった。RTデータと一致し
て、CF1発現もCRFK細胞内のLTR作用性発現より優れていた。
【0153】 総合すると、これらのデータは、非霊長類レンチウイルスの全ゲノムレパート
リーの高レベル発現がヒト細胞内で生起しておりそしてプロモーター置換によっ
て、ヒト細胞内で生産相のFIV複製が最大限の効率で且つCRFK細胞中の天
然プロモーターか又はCMVIEプロモーターのどちらかで見られる値より高い
値で生起できるようになる(Rev/RRE調節軸、スプライシング、Gag/
PolとEnvプリカーサーの両者の産生、及び各々の正しいタンパク質溶解プ
ロセシングを含めて)ことを示している。選択的U3置換(CT5で、そして以
下に記載するベクターで使用するために)と全LTR置換(トランスでタンパク
質を産生するために)は共に有効であった。
リーの高レベル発現がヒト細胞内で生起しておりそしてプロモーター置換によっ
て、ヒト細胞内で生産相のFIV複製が最大限の効率で且つCRFK細胞中の天
然プロモーターか又はCMVIEプロモーターのどちらかで見られる値より高い
値で生起できるようになる(Rev/RRE調節軸、スプライシング、Gag/
PolとEnvプリカーサーの両者の産生、及び各々の正しいタンパク質溶解プ
ロセシングを含めて)ことを示している。選択的U3置換(CT5で、そして以
下に記載するベクターで使用するために)と全LTR置換(トランスでタンパク
質を産生するために)は共に有効であった。
【0154】 ヒト細胞におけるFIVライフサイクルの侵入後相を試験するために、pol
、env及びアクセサリー遺伝子並びにgagの一部分を置換している内部的に
プロモートされるマーカー遺伝子カセットを含有するレトロウイルスベクターを
構築するための出発点としてCT5を使用した。TthIII1部位を平滑化閉
鎖して全てのベクターの残っているgagORFのヌクレオチド298にフレー
ムシフト突然変異を導入し、ヌクレオチド319に停止コドンを産生させた(図
1)。ベクターCTRZLbは、リン酸カルシウム共沈殿法によって293T細
胞内でCF1△env及びVSV−G発現プラスミドpHCMV−Gを使用して
コ・トランスフェクションさせた。トランスフェクション後48〜96時間目に
、FIVベクターと対照VSV−Gプソイド型化Mu−MLV lacZベクタ ーの上清液を清明化し、ろ過し(0.45μM)、HeLa細胞上で滴定し、そ
してその後ネコ及びヒト細胞系集団に対する限定希釈によって再度滴定した。こ
れらの実験は増殖中か又は20μg/mlのアフィジコリンを使用してG1/S
に停止させた細胞を使用して行った。慣用のモロニーマウス白血病ウイルスレト
ロウイルスベクターの力価と同等の高力価(106)は、超遠心による単一ラウ ンド濃縮(Burns他(1993年)Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America 90、8033〜8037)によって達成すること ができた。HIVベクターと同様に、FIVベクターは細胞周期停止では最小限
にしか影響を受けなかったが、Mu−MLVベクター形質導入は消失したので、
FIVベクターのこのレンチウイルス特異的特性及びこの特性をヒト細胞に伝達
できることが証明された。同等に重要なことは、増殖中の細胞内でVSV−Gプ
ソイド型化モロニーマウス白血病ウイルスlacZベクターと比較したとき、F
IVベクターはネコ細胞に対する顕著な優先性を示さなかったことである(力価
比の比較、挿入表のプロット参照)。CTRZLbで形質導入した後の増殖が可
能になったとき、大きな(100〜400個の細胞)同種lacZ陽性コロニー
が産生され、導入遺伝子の安定でクローン的維持を示していた。細胞系は予期さ
れたように形質導入性がかなり変化したが、これらの差異はモロニーとFIVベ
クターで同等であった。即ち、これらの差異はベクター特異的というよりはむし
ろ細胞特異的であったので、VSV−G介在性形質導入を受け易いことを示して
いる。それ故、非ネコ細胞におけるFIVライフサイクルの感染段階に対する主
要な遮断は更に下流というよりはむしろビリオン侵入段階であることが示されて
いる。
、env及びアクセサリー遺伝子並びにgagの一部分を置換している内部的に
プロモートされるマーカー遺伝子カセットを含有するレトロウイルスベクターを
構築するための出発点としてCT5を使用した。TthIII1部位を平滑化閉
鎖して全てのベクターの残っているgagORFのヌクレオチド298にフレー
ムシフト突然変異を導入し、ヌクレオチド319に停止コドンを産生させた(図
1)。ベクターCTRZLbは、リン酸カルシウム共沈殿法によって293T細
胞内でCF1△env及びVSV−G発現プラスミドpHCMV−Gを使用して
コ・トランスフェクションさせた。トランスフェクション後48〜96時間目に
、FIVベクターと対照VSV−Gプソイド型化Mu−MLV lacZベクタ ーの上清液を清明化し、ろ過し(0.45μM)、HeLa細胞上で滴定し、そ
してその後ネコ及びヒト細胞系集団に対する限定希釈によって再度滴定した。こ
れらの実験は増殖中か又は20μg/mlのアフィジコリンを使用してG1/S
に停止させた細胞を使用して行った。慣用のモロニーマウス白血病ウイルスレト
ロウイルスベクターの力価と同等の高力価(106)は、超遠心による単一ラウ ンド濃縮(Burns他(1993年)Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America 90、8033〜8037)によって達成すること ができた。HIVベクターと同様に、FIVベクターは細胞周期停止では最小限
にしか影響を受けなかったが、Mu−MLVベクター形質導入は消失したので、
FIVベクターのこのレンチウイルス特異的特性及びこの特性をヒト細胞に伝達
できることが証明された。同等に重要なことは、増殖中の細胞内でVSV−Gプ
ソイド型化モロニーマウス白血病ウイルスlacZベクターと比較したとき、F
IVベクターはネコ細胞に対する顕著な優先性を示さなかったことである(力価
比の比較、挿入表のプロット参照)。CTRZLbで形質導入した後の増殖が可
能になったとき、大きな(100〜400個の細胞)同種lacZ陽性コロニー
が産生され、導入遺伝子の安定でクローン的維持を示していた。細胞系は予期さ
れたように形質導入性がかなり変化したが、これらの差異はモロニーとFIVベ
クターで同等であった。即ち、これらの差異はベクター特異的というよりはむし
ろ細胞特異的であったので、VSV−G介在性形質導入を受け易いことを示して
いる。それ故、非ネコ細胞におけるFIVライフサイクルの感染段階に対する主
要な遮断は更に下流というよりはむしろビリオン侵入段階であることが示されて
いる。
【0155】 FIVベクターが非***ヒト細胞を形質導入できる能力を更に評価するために
、本発明者は、2つの最も進展した限定的なヒト組織培養モデル、すなわち一次
ヒトマクロファージ及びhNTニューロンを使用して有糸***後ヒト細胞を形質
導入した。hNTニューロンは不可逆的に分化され、偏光ヒトニューロンは、レ
チノイン酸及び幾つかの有糸***インヒビターを使用して6週間処理することに
よってNT2奇形癌腫細胞から誘導される。ここで使用した、3回目に播いたh
NT細胞は不可逆的に有糸***後であるので、ヌードマウスの脳内に移植して1
年後にそのままであり、一次ニューロンと形態学的に類似しており、多量のニュ
ーロン特異的マーカーを発現し、そして機能的軸索及び樹状突起を構成するニュ
ーロン集団を成長させた。lacZ染色を示した1.0の感染多重度で形質導入
されたhNTニューロンは細胞体と突起の両方で見ることができた。一次ヒトマ
クロファージは高いバックグラウンドlacZ染色を示したので、正常ドナーの
末梢血から単離した後9日目にGFPベクターCTAGCbを使用して形質導入
した。これらの細胞はFIVベクターによって高力価で形質導入されたが、GF
P形質導入Mu−MLVベクターでは形質導入されなかった。
、本発明者は、2つの最も進展した限定的なヒト組織培養モデル、すなわち一次
ヒトマクロファージ及びhNTニューロンを使用して有糸***後ヒト細胞を形質
導入した。hNTニューロンは不可逆的に分化され、偏光ヒトニューロンは、レ
チノイン酸及び幾つかの有糸***インヒビターを使用して6週間処理することに
よってNT2奇形癌腫細胞から誘導される。ここで使用した、3回目に播いたh
NT細胞は不可逆的に有糸***後であるので、ヌードマウスの脳内に移植して1
年後にそのままであり、一次ニューロンと形態学的に類似しており、多量のニュ
ーロン特異的マーカーを発現し、そして機能的軸索及び樹状突起を構成するニュ
ーロン集団を成長させた。lacZ染色を示した1.0の感染多重度で形質導入
されたhNTニューロンは細胞体と突起の両方で見ることができた。一次ヒトマ
クロファージは高いバックグラウンドlacZ染色を示したので、正常ドナーの
末梢血から単離した後9日目にGFPベクターCTAGCbを使用して形質導入
した。これらの細胞はFIVベクターによって高力価で形質導入されたが、GF
P形質導入Mu−MLVベクターでは形質導入されなかった。
【0156】 FIVキャプシド化の決定因子はこれまで研究されていない。レンチウイルス
キャプシド化シグナルはマウスオンコウイルスより複雑である(Lever、(1996 年)Gene Therapy 3、470〜471)。LTRをCF1△envから欠失させてパッ
ケージングを妨げそして逆転写及び組込みに必要な配列を除去した。主要スプラ
イスドナーとgag遺伝子間の20ヌクレオチド、即ち推定上レンチウイルスパ
ッケージングに寄与するものはFIVでは例外的に短い(HIV−1の44ヌク
レオチド、HIV−2の75ヌクレオチド、そしてMu−MLVの375ヌクレ
オチドと比較して20ヌクレオチド)。この領域のスクランブリングや欠失は力
価を改善する可能性がある。
キャプシド化シグナルはマウスオンコウイルスより複雑である(Lever、(1996 年)Gene Therapy 3、470〜471)。LTRをCF1△envから欠失させてパッ
ケージングを妨げそして逆転写及び組込みに必要な配列を除去した。主要スプラ
イスドナーとgag遺伝子間の20ヌクレオチド、即ち推定上レンチウイルスパ
ッケージングに寄与するものはFIVでは例外的に短い(HIV−1の44ヌク
レオチド、HIV−2の75ヌクレオチド、そしてMu−MLVの375ヌクレ
オチドと比較して20ヌクレオチド)。この領域のスクランブリングや欠失は力
価を改善する可能性がある。
【0157】 FIV構造遺伝子をコードする配列が、CF1パッケージング化ベクターを使
用する形質導入によって標的細胞に伝達されたかどうかを試験するために、DN
AsedCTRZLbベクターを使用して、106個のCRFK細胞に感染多重 度=10で形質導入し、99%の形質導入が得られた。これらの細胞から得られ
た1μgのゲノムDNAはgag配列のPCRで陰性であったが、34TF10
で長期に感染させたCRFK培養物から得られた10個ほどもの少ない細胞から
得られたゲノムDNAを加えた同じ量のこのDNAの同時増幅は陽性であった。
用する形質導入によって標的細胞に伝達されたかどうかを試験するために、DN
AsedCTRZLbベクターを使用して、106個のCRFK細胞に感染多重 度=10で形質導入し、99%の形質導入が得られた。これらの細胞から得られ
た1μgのゲノムDNAはgag配列のPCRで陰性であったが、34TF10
で長期に感染させたCRFK培養物から得られた10個ほどもの少ない細胞から
得られたゲノムDNAを加えた同じ量のこのDNAの同時増幅は陽性であった。
【0158】 FIVエンベロープ発現がヒト細胞内で可能であったとき、重篤な細胞変性が
生じた。HIVの合胞体細胞誘導株のコ・レセプターとしてCXCR4が最近発
見されたので、これらの観察によって特異的なメカニズムに関する直接的な問題
が提起された。FIV一次レセプターは依然として知られていない。大部分のヒ
ト細胞系は、HeLa及び293細胞を含めて、かなりのレベルのCXCR4を
発現するので、本発明者は次に、CXCR4を全く発現しない(U87MG及び
SK−N−MC細胞)か又は極端に低いレベルのCXCR4(HOS細胞)を発
現することが知られている珍しいヒト細胞系を使用した(Berson他(1996年)Jo
urnal of Virology 70、6288〜6295;Endres他(1996年)Cell 87、745〜756;H
arouse & Gonzalez-Scarano(1996年)Journal of Virology 70、7290〜7294) 。CF1又はCT5をU87MG及びSK−N−MC細胞中にトランスフェクシ
ョン(エレクトロポレーション又はリン酸カルシウム共沈殿法によって)しても
決して合胞体細胞を形成しなかった(各系でn=9、GFPレポーター コ・ト ランスフェクションによるトランスフェクション効率≧10%)。加えて、CF
1でトランスフェクションしたラット208F細胞は多様なヒト細胞系及びCR
FK細胞と容易に融合したが、SK−N−MC又はU87MG細胞では融合は生
起しなかった。さらに、他の齧歯類細胞(NIH3T3、CHO細胞)のトラン
スフェクッションは合胞体細胞を産生しなかった(n=8、GFPコ・トランス
フェクションによる効率≧10%)。
生じた。HIVの合胞体細胞誘導株のコ・レセプターとしてCXCR4が最近発
見されたので、これらの観察によって特異的なメカニズムに関する直接的な問題
が提起された。FIV一次レセプターは依然として知られていない。大部分のヒ
ト細胞系は、HeLa及び293細胞を含めて、かなりのレベルのCXCR4を
発現するので、本発明者は次に、CXCR4を全く発現しない(U87MG及び
SK−N−MC細胞)か又は極端に低いレベルのCXCR4(HOS細胞)を発
現することが知られている珍しいヒト細胞系を使用した(Berson他(1996年)Jo
urnal of Virology 70、6288〜6295;Endres他(1996年)Cell 87、745〜756;H
arouse & Gonzalez-Scarano(1996年)Journal of Virology 70、7290〜7294) 。CF1又はCT5をU87MG及びSK−N−MC細胞中にトランスフェクシ
ョン(エレクトロポレーション又はリン酸カルシウム共沈殿法によって)しても
決して合胞体細胞を形成しなかった(各系でn=9、GFPレポーター コ・ト ランスフェクションによるトランスフェクション効率≧10%)。加えて、CF
1でトランスフェクションしたラット208F細胞は多様なヒト細胞系及びCR
FK細胞と容易に融合したが、SK−N−MC又はU87MG細胞では融合は生
起しなかった。さらに、他の齧歯類細胞(NIH3T3、CHO細胞)のトラン
スフェクッションは合胞体細胞を産生しなかった(n=8、GFPコ・トランス
フェクションによる効率≧10%)。
【0159】 それ故、本発明者は、ビシストロンmRNAからヒトCXCR4及びneoR
を発現するMMLVに基づくレトロウイルスベクター、pZ.CXCR4を構築
し、そしてこれを使用して、ヒトCXCR4を発現し、G418で選択されるU
87MG、HOS、SK−N−MC、NIH3T3及びCRFK細胞系のパネル
を産生させた。G418で選択される対照系は親レトロウイルスベクター、pJ
Z30854を使用して産生された。CXCR4の発現はpZ.CXCR4で形
質導入した全ての細胞系で記録された。CF1又はCT5をU87MG.CXC
R4、SK−N−MC.CXCR4、3T3.CXCR4中にはトランスフェク
ションするが、それぞれの対照系(CF1についてはn=8、CT5については
n=6)には同時にトランスフェクションしない場合、多数の合胞体細胞を産生
した。さらに、CF1でトランスフェクションしたHOS細胞内では常に小さな
4〜8個の合胞体細胞を観察することができたが、CF1でトランスフェクショ
ンしたHOS.CXCR4細胞は数百個の核を含有する大量の多核巨大細胞を産
生した。これらの結果を確認するために、本発明者は3201−FIV細胞(長
期FIV感染ネコリンパ腫細胞、ATCC CRL 10909)を使用してネコ
/ヒト細胞混合研究も実施した。U87MG、SK−N−MC、HOS、3T3
細胞、これらのそれぞれのpZ.CXCR4ベクターで選択した対応する系統及
びHeLa細胞をそれぞれ6ウエルプレートに播いた(3×105個の細胞)。 翌日、1ウエル当たり105個の3201−FIV細胞を加えた。18時間目に 、HeLa細胞及び各CXCR4発現系統の大きな急増中の合胞体細胞(30〜
80%の単層を含む)が観察された。U87MG、SK−N−MC、HOS又は
3T3細胞ではどの時点でも合胞体細胞は全く見られなかった。
を発現するMMLVに基づくレトロウイルスベクター、pZ.CXCR4を構築
し、そしてこれを使用して、ヒトCXCR4を発現し、G418で選択されるU
87MG、HOS、SK−N−MC、NIH3T3及びCRFK細胞系のパネル
を産生させた。G418で選択される対照系は親レトロウイルスベクター、pJ
Z30854を使用して産生された。CXCR4の発現はpZ.CXCR4で形
質導入した全ての細胞系で記録された。CF1又はCT5をU87MG.CXC
R4、SK−N−MC.CXCR4、3T3.CXCR4中にはトランスフェク
ションするが、それぞれの対照系(CF1についてはn=8、CT5については
n=6)には同時にトランスフェクションしない場合、多数の合胞体細胞を産生
した。さらに、CF1でトランスフェクションしたHOS細胞内では常に小さな
4〜8個の合胞体細胞を観察することができたが、CF1でトランスフェクショ
ンしたHOS.CXCR4細胞は数百個の核を含有する大量の多核巨大細胞を産
生した。これらの結果を確認するために、本発明者は3201−FIV細胞(長
期FIV感染ネコリンパ腫細胞、ATCC CRL 10909)を使用してネコ
/ヒト細胞混合研究も実施した。U87MG、SK−N−MC、HOS、3T3
細胞、これらのそれぞれのpZ.CXCR4ベクターで選択した対応する系統及
びHeLa細胞をそれぞれ6ウエルプレートに播いた(3×105個の細胞)。 翌日、1ウエル当たり105個の3201−FIV細胞を加えた。18時間目に 、HeLa細胞及び各CXCR4発現系統の大きな急増中の合胞体細胞(30〜
80%の単層を含む)が観察された。U87MG、SK−N−MC、HOS又は
3T3細胞ではどの時点でも合胞体細胞は全く見られなかった。
【0160】 次いで、FIV Envによる形質導入は、293T細胞内でのCF1とCT RZLbのコ・トランスフェクションを使用して試験した。表1に示されている
ように、このベクターは、CXCR4発現に関係なく、どのヒト細胞系も形質導
入することができなかった;形質導入はCRFK細胞で検出できたが、力価は非
常に低かった(<10形質導入単位/ml)。対照的に、CRFK CXCR4 細胞はCRFKより少なくとも100倍高い力価(3.6×102)で形質導入 することができた。さらに、CXCR4のリガンドはFIVエンベロープによる
ベクター形質導入を阻害した。
ように、このベクターは、CXCR4発現に関係なく、どのヒト細胞系も形質導
入することができなかった;形質導入はCRFK細胞で検出できたが、力価は非
常に低かった(<10形質導入単位/ml)。対照的に、CRFK CXCR4 細胞はCRFKより少なくとも100倍高い力価(3.6×102)で形質導入 することができた。さらに、CXCR4のリガンドはFIVエンベロープによる
ベクター形質導入を阻害した。
【0161】 ベクターのデータによって、CXCR4がネコ細胞ウイルス侵入並びにより広
範に介在する融合誘導を高めることが示されたので、本発明者は次に、CRFK
細胞とCRFK.CXCR4細胞に対する複製可能FIVの感染性を比較した。
各系統は1ウエル当たり104個の細胞を48ウエルプレート中に播き、そして 翌日、CRFK細胞内で産生させた34TF10ウイルスストックの連続4倍希
釈物で感染させた。CRFK.CXCR4細胞における34TF10の顕著な細
胞変性による人工的な力価損失を減少させるために、プレートを固定し、そして
106個中1個の感染細胞に感受性の巣状感染性アッセイ(FIV陽性血清の1 :500希釈及びホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合抗ネコIgG二次抗
体を使用する)によって感染後40時間目に試験した(Remington他(1991年)J
ournal of Virology 65、308〜312及びChesebro & Wehrly(1988年)Journal of
Virology 62、3779〜3788も参照)。34TF10はCRFKよりCRFK.C
XCR4に対して8倍感染性であった(p=0.0002)。本発明者はこれを
、IFAで染色される多数の丸い浮遊しているか又は殆ど付着しない細胞が40
時間ほどもの早い時期に感染CRFK.CXCR4ウエル中に存在し(しかし非
感染対照ウエル又は感染CRFKウエル中では存在していなかった)そして数え
られなかったので、感染性比率の最小見積もりと考える。これらの結果を確認す
るために、2つの細胞系での34TF10の限定的希釈力価滴定を、上記したよ
うにして感染させることによって実施した;細胞は4〜5日間隔で3週間分割し
、そして陽性ウエルはRTアッセイによって同定した。
範に介在する融合誘導を高めることが示されたので、本発明者は次に、CRFK
細胞とCRFK.CXCR4細胞に対する複製可能FIVの感染性を比較した。
各系統は1ウエル当たり104個の細胞を48ウエルプレート中に播き、そして 翌日、CRFK細胞内で産生させた34TF10ウイルスストックの連続4倍希
釈物で感染させた。CRFK.CXCR4細胞における34TF10の顕著な細
胞変性による人工的な力価損失を減少させるために、プレートを固定し、そして
106個中1個の感染細胞に感受性の巣状感染性アッセイ(FIV陽性血清の1 :500希釈及びホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合抗ネコIgG二次抗
体を使用する)によって感染後40時間目に試験した(Remington他(1991年)J
ournal of Virology 65、308〜312及びChesebro & Wehrly(1988年)Journal of
Virology 62、3779〜3788も参照)。34TF10はCRFKよりCRFK.C
XCR4に対して8倍感染性であった(p=0.0002)。本発明者はこれを
、IFAで染色される多数の丸い浮遊しているか又は殆ど付着しない細胞が40
時間ほどもの早い時期に感染CRFK.CXCR4ウエル中に存在し(しかし非
感染対照ウエル又は感染CRFKウエル中では存在していなかった)そして数え
られなかったので、感染性比率の最小見積もりと考える。これらの結果を確認す
るために、2つの細胞系での34TF10の限定的希釈力価滴定を、上記したよ
うにして感染させることによって実施した;細胞は4〜5日間隔で3週間分割し
、そして陽性ウエルはRTアッセイによって同定した。
【0162】 これらの結果を総合すると、関連性の遠い霊長類及び非霊長類レンチウイルス
の融合誘導活性及びウイルス侵入が同一の細胞表面分子で媒介されることが示さ
れる。一次レセプターとしてCD4を使用しない非霊長類レンチウイルスにCX
CR4がこのように広範に利用されることは、レンチウイルスの合胞体細胞形成
及びエイズ病因論におけるCXCR4の根本的な役割を黙示している。本発明者
の実験は、ヒト細胞の低レベルFIVエンベロープ介在性感染が、HIV−1及
びHIV−2の幾つかの単離物に関して良好に記載されている(Endres他(1996
年)Cell 87、745〜756;Harouse & Gonzalez-Scarano(1996年)Journal of Vi
rology 70、7290〜7294;McKnight他(1994年)Virology 201、8〜18;Reeves他
(1997年)Virology 231、130〜134;Potempa他(1997年)Journal of Virology
71、4419〜4424;Harouse他(1995年)Journal of Virology 69、7383〜7390;
Talbot他(1995年)Journal of Virology 69、3399〜3406;Tateno他(1989年)
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 86、4287〜4290(1989年);Clapham他(1992年)Journal of Virology
66、3531〜3537)ように、多分CXCR4単独によって生起するということを 排除しているのではなくて、これらの実施例の大部分と同様に、このような処理
が無効であることを示している。同様に、ウサギもHIV−1で感染させること
ができるが、上記のプロセスでは全く無効である(Gardner & Luciw(1989年)F
aseb Journal 3、2593〜2606)。本発明者のデータは一次FIVレセプターの存
在と一致している。例えば、ベクターのデータに加えて、HeLa細胞は生産的
FIV複製を支持しないが、VSV−Gプソイド型を使用すると容易に形質導入
可能であり、豊富なCXCR4を発現し、広範なEnv特異的細胞変性を示し、
低いがかなりのレベルのFIV LTR誘導発現を示し、正常なウイルスタンパ ク質プロセシングを可能にし、そしてプラスミドCT5から複製可能FIVを産
生した。
の融合誘導活性及びウイルス侵入が同一の細胞表面分子で媒介されることが示さ
れる。一次レセプターとしてCD4を使用しない非霊長類レンチウイルスにCX
CR4がこのように広範に利用されることは、レンチウイルスの合胞体細胞形成
及びエイズ病因論におけるCXCR4の根本的な役割を黙示している。本発明者
の実験は、ヒト細胞の低レベルFIVエンベロープ介在性感染が、HIV−1及
びHIV−2の幾つかの単離物に関して良好に記載されている(Endres他(1996
年)Cell 87、745〜756;Harouse & Gonzalez-Scarano(1996年)Journal of Vi
rology 70、7290〜7294;McKnight他(1994年)Virology 201、8〜18;Reeves他
(1997年)Virology 231、130〜134;Potempa他(1997年)Journal of Virology
71、4419〜4424;Harouse他(1995年)Journal of Virology 69、7383〜7390;
Talbot他(1995年)Journal of Virology 69、3399〜3406;Tateno他(1989年)
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 86、4287〜4290(1989年);Clapham他(1992年)Journal of Virology
66、3531〜3537)ように、多分CXCR4単独によって生起するということを 排除しているのではなくて、これらの実施例の大部分と同様に、このような処理
が無効であることを示している。同様に、ウサギもHIV−1で感染させること
ができるが、上記のプロセスでは全く無効である(Gardner & Luciw(1989年)F
aseb Journal 3、2593〜2606)。本発明者のデータは一次FIVレセプターの存
在と一致している。例えば、ベクターのデータに加えて、HeLa細胞は生産的
FIV複製を支持しないが、VSV−Gプソイド型を使用すると容易に形質導入
可能であり、豊富なCXCR4を発現し、広範なEnv特異的細胞変性を示し、
低いがかなりのレベルのFIV LTR誘導発現を示し、正常なウイルスタンパ ク質プロセシングを可能にし、そしてプラスミドCT5から複製可能FIVを産
生した。
【0163】 それ故、上記の結果はレンチウイルス生物学及びヒト遺伝子療法にとって重要
な意味を有している。非霊長類レンチウイルスも細胞融合とウイルス侵入の両方
にCXCR−4を利用することを示すことによって、本発明者のデータは、この
ケモカインレセプターがレンチウイルス複製、合胞体細胞形成、そして多分病因
論において広く根本的な役割を果たしていることを示している。FIVのインビ
ボ複製は更なるそして一層微妙な要件を有しているようにも思われる。それ故、
FIVベクターはHIVベクターの本来的により安全な代替物を表している。こ
の仮説に対する疫学的支持は、ネコで作用する同一の主要感染経路(ネコのかみ
傷)により長年に亘って多数のヒトで自然に接種された後、FIVがヒトで疾病
を感染させるか又は引き起こす能力を示していないので、他の非霊長類レンチウ
イルスよりFIVに対して最も強力である。さらに、U3、ORF2及びenv
に加えて、ベクター及びパッケージングプラスミドの両方からFIV配列を追加
的に欠失させることも可能である。FIVベクターは、感染性FIVが生物安全
性レベル(Biosafety Level)2の組織培養物中で定型的に増殖するので、論理 的にはより容易に産生される(本発明のベクターはUCサンジエゴ施設生物安全
性委員会(UC San Diego Institutional Biosafety Committee)によってBL−
2使用が承認されている)。
な意味を有している。非霊長類レンチウイルスも細胞融合とウイルス侵入の両方
にCXCR−4を利用することを示すことによって、本発明者のデータは、この
ケモカインレセプターがレンチウイルス複製、合胞体細胞形成、そして多分病因
論において広く根本的な役割を果たしていることを示している。FIVのインビ
ボ複製は更なるそして一層微妙な要件を有しているようにも思われる。それ故、
FIVベクターはHIVベクターの本来的により安全な代替物を表している。こ
の仮説に対する疫学的支持は、ネコで作用する同一の主要感染経路(ネコのかみ
傷)により長年に亘って多数のヒトで自然に接種された後、FIVがヒトで疾病
を感染させるか又は引き起こす能力を示していないので、他の非霊長類レンチウ
イルスよりFIVに対して最も強力である。さらに、U3、ORF2及びenv
に加えて、ベクター及びパッケージングプラスミドの両方からFIV配列を追加
的に欠失させることも可能である。FIVベクターは、感染性FIVが生物安全
性レベル(Biosafety Level)2の組織培養物中で定型的に増殖するので、論理 的にはより容易に産生される(本発明のベクターはUCサンジエゴ施設生物安全
性委員会(UC San Diego Institutional Biosafety Committee)によってBL−
2使用が承認されている)。
【0164】 本明細書で引用した刊行物や特許出願は全て、個々の各刊行物又は特許出願が
あたかも、全ての目的で全体として参照して組み入れるように明示的にそして個
々に示されているかのように、参照して本明細書に組み入れる。上記発明は明白
な理解を目的として説明及び実施例によって幾らか詳細に記載されているが、下
記特許請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく、本発明の教示を考慮して
一定の変更及び修飾を行い得ることは当該技術分野の通常の技倆を有する者に容
易に明白であろう。
あたかも、全ての目的で全体として参照して組み入れるように明示的にそして個
々に示されているかのように、参照して本明細書に組み入れる。上記発明は明白
な理解を目的として説明及び実施例によって幾らか詳細に記載されているが、下
記特許請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく、本発明の教示を考慮して
一定の変更及び修飾を行い得ることは当該技術分野の通常の技倆を有する者に容
易に明白であろう。
【図1】 本発明核酸構築物の模式図であり、FIV34TF−10、CT5、CTRZ
LbおよびCTAGCbを包含する。
LbおよびCTAGCbを包含する。
【図2】 実験結果をグラフ化して示す。
【手続補正書】
【提出日】平成12年10月4日(2000.10.4)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0130
【補正方法】変更
【補正内容】
【0130】 この構築物の設計は、正しくTATAボックスにおけるCMVプロモーターと
FIVゲノム(5’R反復配列から続いている)の融合に関係している。先ず、
PCR(合成PCRはエキソヌクレアーゼ+Ventポリメラーゼを使用して行
った)は、FIV TATAボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なSa cI−テール付加センスPCRプライマー(5’−atataGAGCTCtg
tgaaacttcgaggagtctc−3’(配列番号4))を、FIV gag遺伝子の反対側ストランドと相同的なアンチセンスPCRプライマー(5
’−ccaatctcgcccctgtccattcccc−3’ (配列番号 5) )と組み合わせて使用して行った。生成したPCR産生物は450bpであ
った。このPCR産生物は、sacI消化前にXhoIで消化した(何故なら、
FIV LTRにはXhoI部位のすぐ後にsac部位が存在しており、そして このようにして消化しない場合SacI−SacIフラグメントが生成されるの
で)。XhoI消化とその後のSacI消化の後、得られた310bpフラグメ
ントは次のとおりであった: GAGCT/Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttga
ggacttttgagttctcccttgaggctcccacagata
caataaatatttgagattgaaccctgtcgagtatct
gtgtaatcttttttacctgtgaggtctcggaatccg
ggccgagaacttcgcagttggcgcccgaacagggac
ttgattgagagtgattgaggaagtgaagctagagca
atagaaagctgttaagcagaactcctgctgacctaa
atagggaagcagtagcagacgctgctaacagtgagt
atctctagtgaagcggaC\TCGAGctc(配列番号6)。
FIVゲノム(5’R反復配列から続いている)の融合に関係している。先ず、
PCR(合成PCRはエキソヌクレアーゼ+Ventポリメラーゼを使用して行
った)は、FIV TATAボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なSa cI−テール付加センスPCRプライマー(5’−atataGAGCTCtg
tgaaacttcgaggagtctc−3’(配列番号4))を、FIV gag遺伝子の反対側ストランドと相同的なアンチセンスPCRプライマー(5
’−ccaatctcgcccctgtccattcccc−3’ (配列番号 5) )と組み合わせて使用して行った。生成したPCR産生物は450bpであ
った。このPCR産生物は、sacI消化前にXhoIで消化した(何故なら、
FIV LTRにはXhoI部位のすぐ後にsac部位が存在しており、そして このようにして消化しない場合SacI−SacIフラグメントが生成されるの
で)。XhoI消化とその後のSacI消化の後、得られた310bpフラグメ
ントは次のとおりであった: GAGCT/Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttga
ggacttttgagttctcccttgaggctcccacagata
caataaatatttgagattgaaccctgtcgagtatct
gtgtaatcttttttacctgtgaggtctcggaatccg
ggccgagaacttcgcagttggcgcccgaacagggac
ttgattgagagtgattgaggaagtgaagctagagca
atagaaagctgttaagcagaactcctgctgacctaa
atagggaagcagtagcagacgctgctaacagtgagt
atctctagtgaagcggaC\TCGAGctc(配列番号6)。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0131
【補正方法】変更
【補正内容】
【0131】 このフラグメントを140bp残基からゲル精製して離し、そしてpRc/C
MVプラスミドのSacI−XhoIバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではFIV LTR配列をTATAボックスの下流に、CMVプ ロモーターのTATAボックスとFIVの置換されたTATAボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する:これは、正に、SacI部位がhCMVプ
ロモーター中のTATAボックスの3ヌクレオチド下流に存在するように、Sa
cI部位をTATAボックスの3ヌクレオチド下流に配置し、そしてFIV R 反復配列を、FIVゲノム中と同様に、TATAボックスから正確に9ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってCMVプロモーターとFIV転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され(且つ連結しており)、そして以下
の配列で詳記される: ..acgtataagttgttccattgtaagagtaTATAAc
cagtgctttgtgaaacttcgaggagtctctttgttg agga FIV(配列番号7) AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT C TCTGGCTAACTAGAGAACC........ pRc/CMV (配列番号8) AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttgagga CR
F1(配列番号9)
MVプラスミドのSacI−XhoIバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではFIV LTR配列をTATAボックスの下流に、CMVプ ロモーターのTATAボックスとFIVの置換されたTATAボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する:これは、正に、SacI部位がhCMVプ
ロモーター中のTATAボックスの3ヌクレオチド下流に存在するように、Sa
cI部位をTATAボックスの3ヌクレオチド下流に配置し、そしてFIV R 反復配列を、FIVゲノム中と同様に、TATAボックスから正確に9ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってCMVプロモーターとFIV転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され(且つ連結しており)、そして以下
の配列で詳記される: ..acgtataagttgttccattgtaagagtaTATAAc
cagtgctttgtgaaacttcgaggagtctctttgttg agga FIV(配列番号7) AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT C TCTGGCTAACTAGAGAACC........ pRc/CMV (配列番号8) AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
Ctgtgaaacttcgaggagtctctttgttgagga CR
F1(配列番号9)
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0132
【補正方法】変更
【補正内容】
【0132】 CRF1はCMVプロモーターとFIV R反復配列の5−プライム融合を完 了したが、3−プライムLTRとFIVゲノムの残りは下流に置かれたままであ
った。それ故、salI−テール付加PCRプライマーF3’S(tatata
GTCgactagggactgtttacgaac(配列番号10))及びF
3’A/Not(atatatagtcgacGCGGCCGCtgcgaag
ttctcg(配列番号11))を使用して3’FIV LTRを増幅した:S aLIで消化したPCR産生物は、アルカリホスファターゼで処理したCRF1
の適合性XhoI部位に連結し、そしてこの連結は加熱不活性化し、そしてXh
oIを使用して野生型に対して選択した。得られた、CRF(L)と命名された
プラスミドは上記の両LTRを有しており、そして3’LTRの3’末端に固有
のNotI部位を配置している。
った。それ故、salI−テール付加PCRプライマーF3’S(tatata
GTCgactagggactgtttacgaac(配列番号10))及びF
3’A/Not(atatatagtcgacGCGGCCGCtgcgaag
ttctcg(配列番号11))を使用して3’FIV LTRを増幅した:S aLIで消化したPCR産生物は、アルカリホスファターゼで処理したCRF1
の適合性XhoI部位に連結し、そしてこの連結は加熱不活性化し、そしてXh
oIを使用して野生型に対して選択した。得られた、CRF(L)と命名された
プラスミドは上記の両LTRを有しており、そして3’LTRの3’末端に固有
のNotI部位を配置している。
【手続補正4】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図1−1
【補正方法】変更
【補正内容】
【図1−1】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GE,GH,GM,HR ,HU,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP, KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,L V,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI, SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,U Z,VN,YU,ZW (72)発明者 ルーニイ、 ディビッド ジェイ. アメリカ合衆国 92024 カリフォルニア 州 エンツニタス ナンタケット コート 519 (72)発明者 ウォン−スタール、 フロッシー アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サン ディエゴ モンテレー サイプ レス ウェイ 12737 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA20 BA32 BA80 CA04 CA11 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA17 HA20 4B064 AG32 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA26 CA44
Claims (37)
- 【請求項1】 非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸を含んでなる
レトロウイルスベクターであって、該核酸が異種的標的核酸と非霊長類レンチウ
イルスパッケージング部位からなり、該標的核酸がヒト細胞中で活性なプロモー
ターに操作可能に結合しており、そこで該パッケージャブル核酸が自己パッケー
ジングをブロックするパッケージング能欠損をもち、かつ、該パッケージング能
欠損がトランスで救済可能であることを特徴とするレトロウイルスベクター。 - 【請求項2】 該レトロウイルスベクターがFIVパッケージング部位を有
し、また、該標的核酸がトランスに供給されたFIVパッケージング成分により
パッケージングされることを特徴とする請求項1記載のレトロウイルスベクター
。 - 【請求項3】 非FIVプロモーターがCMV中期領域プロモーターである
請求項2記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項4】 FIV Gagタンパク質、FIV逆転写酵素(RT)タン パク質およびFIVエンベロープ(Env)タンパク質からなる群より選択され
る1またはそれ以上のFIVタンパク質を含む、レトロウイルス粒子を含んでな
る請求項2記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項5】 該粒子が逆転写酵素活性を含み、ヒト細胞に感染性ではない
請求項4記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項6】 該粒子がHIVのコレセプターであるCXCR4を有するヒ
ト細胞に感染する請求項4記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項7】 水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を含むレトロウイルス粒
子を含む請求項1記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項8】 水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を含むレトロウイルス粒
子を含み、該レトロウイルス粒子が非***ヒト細胞に形質導入し得る請求項1記
載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項9】 ヒト細胞中にて活性を有するプロモーターを含むパッケージ
ングプラスミドであって、該プロモーターが請求項1のベクターをパッケージン
グするのに必要なタンパク質の少なくとも1種をコードする核酸サブシーケンス に操作可能に結合しており、該パッケージングプラスミドが機能的非霊長類レン
チウイルスパッケージング部位を欠くことを特徴とするパッケージングプラスミ
ド。 - 【請求項10】 該パッケージングプラスミドが有蹄類−パッケージャブル
核酸をトランスにパッケージングするのに必要な少なくとも1種の有蹄類パッケ ージングタンパク質をコードする請求項9記載のパッケージングプラスミド。 - 【請求項11】 該パッケージングプラスミドがFIV−パッケージャブル
核酸をトランスにパッケージングするのに必要な少なくとも1種のFIV−パッ ケージングタンパク質をコードする請求項9記載のパッケージングプラスミド。 - 【請求項12】 該パッケージングプラスミドの核酸サブシーケンスがFI
V Gagタンパク質をコードする翻訳領域配列を含む請求項11記載のパッケ ージングプラスミド。 - 【請求項13】 該パッケージングプラスミドの核酸サブシーケンスがFI
V envタンパク質をコードする翻訳領域配列を含む請求項11記載のパッケ ージングプラスミド。 - 【請求項14】 該プラスミドがU3プロモーターの欠失を有するFIV LTRを含む請求項11記載のパッケージングプラスミド。
- 【請求項15】 該プラスミドがU3プロモーターの欠失を有するFIV LTRを含み、該U3プロモーター欠失部位に異種的プロモーターの挿入を含む
請求項11記載のパッケージングプラスミド。 - 【請求項16】 該プラスミドがU3プロモーター欠失を有するFIV L TRを含み、該U3プロモーター欠失部位に異種的プロモーターの挿入を含むの
もであって、該異種的プロモーターがCMVプロモーターである請求項11記載
のパッケージングプラスミド。 - 【請求項17】 請求項1記載のベクターをトランスにパッケージングする
能力を有する非霊長類レンチウイルスパッケージング細胞であって、異種的ヒト
プロモーターに操作可能に結合した少なくとも1種の非霊長類レンチウイルスパ ッケージングタンパク質をコードする組換え核酸プラスミドを少なくとも1種含 み、パッケージングタンパク質がトランスに供給されたときにベクターに組込ま
れるパッケージング細胞。 - 【請求項18】 該異種的プロモーターに操作可能に結合した第二の非霊長
類レンチウイルスをコードする第二の核酸を含み、パッケージングタンパク質が
トランスに供給されたときにベクターに組込まれる請求項17記載のパッケージ
ング細胞。 - 【請求項19】 該パッケージングプラスミドがFIVパッケージングタン
パク質をコードする請求項17記載のパッケージング細胞。 - 【請求項20】 請求項1記載のベクターを含む請求項17記載のパッケー
ジング細胞。 - 【請求項21】 該細胞が、救済可能な複製能欠損型FIVパッケージャブ
ル核酸を含み、該核酸が異種的プロモーターの制御下に標的核酸をコードする請
求項17記載のパッケージング細胞。 - 【請求項22】 該標的核酸がウイルスインヒビターをコードする請求項2
1記載の方法。 - 【請求項23】 該標的核酸がリボザイムをコードする請求項21記載の方
法。 - 【請求項24】 該細胞がヒト細胞である請求項17記載のパッケージング
細胞。 - 【請求項25】 VSVタンパク質をコードする組換え核酸を含む請求項1
7記載のパッケージング細胞。 - 【請求項26】 該異種的プロモーターがヒト細胞中で活性である請求項1
7記載のパッケージング細胞。 - 【請求項27】 トランスに救済可能な複製能欠損型FIVパッケージャブ
ル核酸を含む請求項17記載のパッケージング細胞。 - 【請求項28】 該パッケージャブル核酸がヒト細胞中で活性なプロモータ
ーに操作可能に結合した異種的核酸を含む請求項26記載のパッケージング細胞
。 - 【請求項29】 FIV Gagタンパク質、FIV逆転写酵素、およびV SVエンベロープ糖タンパク質を少なくとも1つ含むレトロウイルスキャプシド にパッケージャブル核酸がパッケージングされる請求項26記載のパッケージン
グ細胞。 - 【請求項30】 標的核酸をコードする非霊長類レンチウイルスパッケージ
ャブル核酸を含んでなるレトロウイルスベクターとヒト細胞を接触させ、それに
よってレトロウイルスベクターにより該細胞に形質導入させることを特徴とする
標的核酸によるヒト細胞の形質導入方法。 - 【請求項31】 標的核酸を発現することを特徴とする請求項30記載の方
法。 - 【請求項32】 標的核酸を発現し、該核酸がウイルスインヒビターをコー
ドすることを特徴とする請求項30記載の方法。 - 【請求項33】 標的核酸を発現し、その場合該標的核酸が生体外細胞中で
HIV複製を阻害するリボザイムをコードすることを特徴とする請求項30記載
の方法。 - 【請求項34】 形質導入した細胞を哺乳動物に導入することを特徴とする
請求項30記載の方法。 - 【請求項35】 該細胞が造血幹細胞、最終分化ニューロン細胞、および最
終分化造血細胞からなる群より選択される非***細胞である請求項30記載の方
法。 - 【請求項36】 該細胞が生体内でレトロウイルスベクターと接触する請求
項30記載の方法。 - 【請求項37】 該非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸がFIV
パッケージング成分により詰込まれる請求項30記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US93663397A | 1997-09-24 | 1997-09-24 | |
US08/936,633 | 1997-09-24 | ||
PCT/US1998/019162 WO1999015641A1 (en) | 1997-09-24 | 1998-09-15 | Non-primate lentiviral vectors and packaging systems |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001517433A true JP2001517433A (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=25468901
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP2000512934A Withdrawn JP2001517433A (ja) | 1997-09-24 | 1998-09-15 | 非霊長類レンチウイルスベクターおよびパッケージングシステム |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6555107B2 (ja) |
EP (1) | EP1017797B1 (ja) |
JP (1) | JP2001517433A (ja) |
AT (1) | ATE298371T1 (ja) |
AU (1) | AU747438B2 (ja) |
CA (1) | CA2304983A1 (ja) |
DE (1) | DE69830663T2 (ja) |
ES (1) | ES2245042T3 (ja) |
WO (1) | WO1999015641A1 (ja) |
Families Citing this family (46)
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US6451592B1 (en) | 1996-04-05 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
GB2334257B (en) * | 1997-12-22 | 2001-07-04 | Oxford Biomedica Ltd | Rectroviral vectors |
CN1322137C (zh) * | 1997-12-22 | 2007-06-20 | 牛津生物医学(英国)有限公司 | 基于马传染性贫血病毒(eiav)的逆转录病毒载体 |
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