JP2001517064A

JP2001517064A - トランスフォーミング増殖因子アルファｈｉ

Info

Publication number: JP2001517064A
Application number: JP50176497A
Authority: JP
Inventors: メイスナー，ポール・エス; フルドナー，レベッカ・エイ; ウェイ，イン・フェイ; アダムズ，マーク・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2001-10-02
Also published as: US6265543B1; AU717005B2; KR19990022316A; CN1240836C; CA2223957A1; AU6260496A; MX9709237A; US6074839A; EP0856050A1; WO1996039497A1; CN1186515A; EP0856050A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、トランスフォーミング増殖因子アルファHIIポリペプチドと、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開示する。組換え技術による当該ポリペプチドの生産法と、創傷治癒の刺激、神経学的障害の治療、目の障害の治療、腎障害と肝障害の治療及び胚形成と脈管形成の刺激を含む該ポリペプチドの治療的使用も提供される。また、当該ポリペプチドに対する拮抗薬と、腫瘍形成処置用治療薬としてのそれらの使用をも開示する。さらに、本発明ポリペプチドのレベルの変化及び本発明ポリペプチドをコードする核酸配列中の突然変異を検出するための診断的検定法をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】トランスフォーミング増殖因子アルファHI 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、そのポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにそのポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関する。本発明のポリペプチドは、ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファ相同体であろうと同定された。より具体的に述べると、本発明のポリペプチドは、ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファHIIであろうと同定された。以下、これを「TGFα-HI」という場合もある。本発明は、上記ポリペプチドの作用を阻害することにも関する。細胞の増殖と分化は、様々な刺激因子、阻害因子、共同作用因子及びホルモンによって開始、促進、維持及び調節されているようである。細胞ホメオスタシス機構の変化及び/又は破壊は、腫瘍形成を含む増殖関連疾患の根本的な原因であると思われる。増殖モジュラー（modular）因子は、シグナル変換、細胞連絡、増殖と発生、胚形成、免疫応答、造血細胞の生存と分化、炎症、組織の修復と再生、アテローム性動脈硬化及び癌を含む、極めて多様な病理学的及び生理学的過程に関係する。特に、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォーミング増殖因子α （TGFα）、ベータセルリン（betacellulin）、アンフィレグリン（amphireguli n）及びワクシニア増殖因子は、種々の細胞タイプが正常な生理学的条件下に又は外因性の刺激に応答して生産する増殖及び分化調節タンパク質であり、EGFファミリーの構成要素である。これらのペプチド増殖因子は、自己分泌機構及び傍分泌機構によって創傷細胞に影響を及ぼす。また、これらの増殖因子は、皮膚、角膜及び胃腸路のような組織における正常な創傷治癒にも重要な役割を果たし、3つの鎖間ジスルフィド結合の配置が保存されていることを含めて、すべての因子が本質的なアミノ酸配列相同性を共有する。さらに、このファミリーの因子はすべて、分子量170,000の膜貫通型糖タンパク質受容体に結合し、その受容体の細胞質ドメインにあるチロシンキナーゼ活性を活性化する（Buhrow，S.A．ら，J ．Bio．Chem.，258:7824-7 826（1983））。これらの受容体は、皮膚ケラチン生成細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞及びGI 路の上皮細胞を含む多くのタイプの細胞に発現する。これらのペプチド増殖因子は、創傷治療に関与するいくつかの細胞（血小板、ケラチン生成細胞及び活性化マクロファージを含む）によって合成される。また、これらの増殖因子は、ある種の細胞の増殖及び分化の刺激（例えば腫瘍形成）にも関係付けられているし、他のタイプの細胞の阻害にも関係付けられている。ベータセルリンは32キロダルトンの糖タンパク質であり、これはタンパク質加水分解的切断によって、より大きい膜貫通型前駆体からプロセシングされるようである。ベータセルリンのカルボキシル末端ドメインは、ラットのトランスフォーミング増殖因子αの対応部分と50%の配列類似性を持つ。ベータセルリンは、レチナール色素上皮細胞と血管平滑筋細胞にとって、強力な有糸***促進物質である。アンフィレグリンは、新生物細胞におけるDNA合成に対して強力な阻害活性を示し、ある種の正常細胞の増殖をも促進する、二作用性細胞増殖調節因子である。アンフィレグリンには、創傷と癌の治療を含む種々の用途が挙げられている。例えば、アンフィレグリンは、上皮由来の数種類のヒト癌細胞系に対して、試験管内で強力な抗増殖作用を持つ。また、アンフィレグリンは、米国特許出願第5, 115,096号に示されるように、ヒト***繊維芽細胞の増殖を誘導する。 TGFαは、多面発現性の生物学的作用を持つ。TGFαの構成要素のうち、あるものは、発ガン的にトランスフォームした繊維芽細胞のいくつかによって（Ciardi elloら，J ．Cell．Biochem.，42:45-57（1990））、また、腎臓癌、乳癌、偏平上皮癌、黒色腫及び膠芽腫を含む種々の腫瘍によって（Derynck，R．ら，Cancer Res. ，47:707-712（1987））合成される。高レベルのTGFαを発現させる腫瘍細胞を持つ形質転換マウスを分析することによって、TGFαの発現が、正常細胞が腫瘍形成細胞に変換する際の原因因子になりうることが直接的に立証されている。TGFα形質転換動物は、TGFα発現を制御するプロモーターの選択とマウスの株によって、種々の新生物病変を示す（Sandgrenら，Cell，61:1121-1135（1990））。 TGFαは、正常な胚の発生と成体の生理機能にもある役割を果たす（Derynck， R．Adv ．Cancer Res.，58:27-5（1992））。TGFαは、皮膚、脳、胃腸粘膜及び活性化マクロファージを含む多くの組織で発現されている。したがって、TGFα は、上皮細胞の成長を制御する重要な因子であり、創傷治癒に関与する。また、 TGFαは、脈管形成性であることもわかっている（Schreiberら，Science，232:1 250-1253（1986））。本発明のポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子TGFα-HIであろうと同定された。この同定は、ヒトTGFαに対するアミノ酸相同性の結果としてなされた。本発明の一側面によれば、新規成熟ポリペプチド並びに生物学的に活性かつ診断又は治療に有用なその断片、類縁体及び誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト由来のものである。本発明のもう1つの側面によると、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）並びに類縁体及び生物学的に活性かつ診断又は治療に有用なその断片が提供される。本発明のさらなる側面によれば、組換え技術によって上記ポリペプチドを生産する方法であって、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する組換え原核及び/又は真核宿主細胞を培養することからなる方法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、創傷治療を刺激してAIDS痴呆又は外傷後の正常な神経学的機能を修復するため、目の障害を治療するため、ある種の細胞を標的にするため、腎障害及び肝障害を治療するため、毛包の発育を促進するため、火傷、潰瘍及び角膜切開の治療として血管形成を刺激するため、胚形成を刺激するためなどといった治療目的で、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリッド形成しうる長さを持つ核酸分子を含む核酸プローブも提供される。本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のさらなる側面によれば、本発明ポリペプチドに対するアゴニスト（作用薬）が提供される。本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチドに対するアンタゴニスト（拮抗薬）が提供される。これらのアンタゴニストは、例えば、角膜炎、新生組織形成（腫瘍、癌など）及び乾癬の治療において、上記ポリペプチドの作用を阻害するために使用できる。本発明のさらなる側面によれば、本発明ポリペプチドの過剰発現及び上記ポリペプチドをコードする核酸配列中の突然変異に関係する疾患を検出するための診断的検定法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、科学的研究、DNAの合成及びDNAベクターの製造に関係する試験管内用途に、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。当業者にとって、本発明のこれらの側面とその他の側面は、本明細書の教示から明らかなはずである。以下の図面は本発明の実施態様を例示するものであって、請求の範囲によって包含される本発明の範囲を限定するものではない。図1は、TGFα-HIの推定アミノ酸配列に対応させたcDNA配列を表す。アミノ酸には標準的な一文字略号を使用している。推定シグナル配列には下線を引いてあり、推定可溶性部分には二重下線を引いてある。図2は、ヒトアンフィレグリン、ヒトベータセルリン、ヒト表皮増殖因子、ヒトヘレグリン（heregulin）及びTGFα-HI（第5列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図である。白抜き部分は、本発明のポリペプチドに保存されていることがわかった保存EGFモチーフを表す。本発明の一側面によれば、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つ成熟ポリペプチド若しくは1994年3月4日にATCC寄託番号75698として寄託されたクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒトの脳と初期段階の脳組織から得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、8週齢の胚から得たcDNAライブラリー中に発見された。これは、構造的にTGFα遺伝子ファミリーに関係している。このポリヌクレオチドは、TGFα遺伝子ファミリーのいくつかの構成要素と有意な相同性を示す380アミノ酸のポリペプチドをコードする読み取り枠を含有している。それらの構成要素には、TGFαそのものと、アンフィレグリンやクリプト（cripto）などの他の構成要素が含まれる。また、すべての構成要素の特徴的なモチーフ中に現われる6つのシステイン残基も、TGFα-H1に保存されている。図1（配列番号2）に記載の本発明の完全長ポリペプチドは、図1（配列番号2）のアミノ酸1からアミノ酸39までを含む推定シグナル配列を持ち、これは、このポリペプチドの細胞からの分泌を促進する。図1（配列番号2）のアミノ酸40からアミノ酸266までは前駆体配列と推定されるから、このポリペプチドはさらにプロセシングされて、この部分が切り離される。また、アミノ酸317からアミノ酸3 80までは、膜貫通部分であると推定される。この部分は、このポリペプチドを特定の標的部位に誘導して、後述する生物学的機能を発揮するのに必要だと考えられる。この膜貫通部分もこのペプチドから切り離されうるので、本発明ペプチドの推定可溶性部分は、図1（配列番号2）のアミノ酸267からアミノ酸316までを含む。本発明のポリヌクレオチドはRNA型であってもよいし、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含むDNA型であってもよい。DNAは二本鎖であってよいし、一本鎖であってもよく、一本鎖の場合はコーディング鎖でもよいし、非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図1 に示すコーディング配列（配列番号1）又は上記寄託クローンのコーディング配列と同一であってもよいし、その遺伝コードの重複性又は縮重性の結果として図 1のDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なるコーディング配列であってもよい。図1の成熟ポリペプチド（配列番号2）をコードするポリヌクレオチド又は上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、その成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；その成熟ポリペプチドのコーディング配列と付加的コーディング配列（リーダー又は分泌配列など）若しくはプロタンパク質配列；その成熟ポリペプチド（付加的コーディング配列を伴ってもよい）と非コーディング配列（イントロンや成熟ポリペプチドに関するコーディング配列の5'及び/又は3'側にある非コーディング配列など）などを挙げることができるが、これらに限るわけではない。したがって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、そのポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、さらに付加的なコーディング配列及び/又は非コーディング配列をも含むポリヌクレオチドとを包含する。また本発明は、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド又は上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体をコードする、上述のポリヌクレオチドの変種にも関係する。このポリヌクレオチドの変種は、上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変種であってもよいし、上記ポリヌクレオチドの非天然変種であってもよい。したがって本発明は、図1に示す成熟ポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託クローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図1のポリペプチド（配列番号2）若しくは上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体又は類縁体をコードする上記ポリヌクレオチドの変種を包含する。そのようなヌクレオチド変種としては、欠失変種、置換変種及び付加又は挿入変種が挙げられる。上述のように、本発明のポリヌクレオチドは、図1に示すコーディング配列（配列番号1）若しくは上記寄託クローンのコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を持ってもよい。当技術分野で知られているように、対立遺伝子変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変えない1以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を持ちうる代替型のポリヌクレオチド配列である。本発明は、上記成熟ポリペプチドのコーディング配列が宿主細胞によるポリペプチドの発現と分泌を促進するポリヌクレオチド配列（例えばポリペプチドの細胞からの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じ読み枠で融合しているポリヌクレオチドをも包含する。リーダー配列を持つポリペプチドはプレタンパク質であり、これは、そのリーダー配列が宿主によって切断されることにより、そのポリペプチドの成熟型を形成しうる。本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に5'アミノ酸残基が追加されたプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配列を持つ成熟タンパク質はプロタンパク質であり、これは、そのタンパク質の不活性型である。そのプロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、プロ配列を持つタンパク質、又はプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を持つタンパク質をコードできる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレーム（in frame）融合したコーディング配列を持ってもよい。細菌宿主の場合は、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン標識をマーカー配列にして、そのマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備えることができ、また、COS-7細胞のような哺乳類宿主を使用する場合は、例えば血球凝集素（HA）標識をマーカー配列にすることができる。HA標識は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I．ら，Cell ，37:767（1984））。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生産に関与するDNAの区分を意味し、コーディング配列の前後の領域（リーダー及びトレーラー）と、個々のコーディング部分（エクソン）間の介在配列（イントロン）とを含む。完全長TGFα-HI遺伝子の断片をcDNAライブラリー用のハイブリッド形成プローブとして用いることにより、その完全長遺伝子や、その遺伝子に対して高い配列類似性又は類似の生物学的活性を持つ他の遺伝子を単離することができる。このタイプのプローブは、少なくとも30塩基からなることが好ましく、例えば50又はそれ以上の塩基を含んでもよい。また、このプローブは、完全長転写物に相当するcDNAクローン、ゲノムクローン、又は調節及びプロモーター領域、エクソン並びにイントロンを含む完全なTGFα-HI遺伝子を含有するクローンを同定するためにも使用できる。スクリーニングの一例では、オリゴヌクレオチドプローブの合成に既知のDNA配列を用いることによって、上記遺伝子のコーディング領域を単離する。本発明遺伝子の配列に相補的な配列を持つ標識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトのcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのプローブがハイブリッド形成するライブラリーの構成要素を決定する。さらに、本発明は、配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性がある場合に上述の配列にハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、厳密な条件下で上述のポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用するところの「厳密な条件」という用語は、配列間に少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合にのみ、ハイブリッド形成が起こることを意味する。好ましい態様として、上述のポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、図1のcDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする。また、上記ポリヌクレオチドは、上述のように、本発明のポリヌクレオチドにハイブリッド形成し、かつ、該ポリヌクレオチドに対して同一性を持つ（活性は保持しても、保持しなくてもよい）、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、より好ましくは少なくとも50塩基を含んでもよい。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号1のポリヌクレオチドに関するポリペプチド回収用プローブや診断用プローブなどとして、又はPCRプライマーとして使用できる。したがって、本発明は、配列番号2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性を持つポリヌクレオチド、及び少なくとも30 塩基、好ましくは少なくとも50塩基からなるその断片、並びにそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本明細書で言及する寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて維持されるだろう。これらの寄託物は当業者の利便のために提供されるに過ぎず、これが35U.S.C§112で求められる寄託であると認めるわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列とそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書の一部を構成し、万一、本明細書に記載する配列の説明と矛盾する場合は、これが支配的となる。上記寄託物を製造、使用又は販売するには承諾が必要な場合があり、本明細書はそのような承諾を与えるものではない。さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド又は上記寄託cDNAによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペプチド、及び当該ポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体に関する。図1のポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドに関して「断片」、「誘導体」及び「類縁体」という場合、これらの用語は、当該ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意味する。したがって類縁体には、プロタンパク質部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成しうるプロタンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド及び合成ポリペプチドのいずれであってもよく、組換えポリペプチドが好ましい。図1のポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体又は類縁体は、（i）1又はそれ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているもの（その置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであってもよいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、（ii）1又はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであってもよく、或いは（iii）成熟ポリペプチドがもう1つの化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大させるための化合物（ポリエチレングリコールなど））に融合しているものや、（iv）リーダー又は分泌配列や、成熟ポリペプチド又はプロタンパク質配列の精製に使用される配列などといった付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであってもよい。そのような断片、誘導体及び類縁体は、本明細書の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、単離型で提供されることが好ましく、また、均一に精製されることが好ましい。「単離された」という用語は、その物質がその当初の環境（例えばそれが天然物ならばその自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、その天然系中に共在する物質の一部又は全部から分離されたそのポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部であったり、かつ/または、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドが組成物の一部であっても、そのようなベクター又は組成物はその自然環境の一部ではないので、それらは単離されている。本発明のポリペプチドは、配列番号2のポリペプチド（特にその成熟ポリペプチド）及び配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも70%の類似性（好ましくは70%の同一性）、より好ましくは配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも 90%の類似性（より好ましくは90%の同一性）、さらに好ましくは配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも95%の類似性（さらに好ましくは95%の同一性）を持つポリペプチドを包含し、また、一般的には少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を含有する上記ポリペプチドの一部をも包含する。当技術分野では知られているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列と保存的アミノ酸置換を、他方のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本発明ポリペプチドの断片又は一部を用いて、対応する完全長ポリペプチドを、ペプチド合成によって生産することができる。つまり、これらの断片は、完全長ポリペプチドを生産するための中間体として使用できる。本発明ポリヌクレオチドの断片又は一部は、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に使用できる。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による本発明ポリペプチドの生産にも関係する。宿主細胞は、本発明のベクター（例えばクローニングベクターであってもよいし、発現ベクターであってもよい）によって遺伝子操作（形質導入又は形質転換若しくはトランスフェクション）される。ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は本発明遺伝子の増幅に適するように改良された従来の栄養培地で培養できる。温度やpHなどといった培養条件は、発現用に選択したその宿主細胞に対して過去に用いられた条件であり、当業者には明らかだろう。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを生産するために使用できる。したがって、例えば、そのポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現用の種々の発現ベクターのいずれにも組込むことができる。そのようなベクターとしては、染色体DNA配列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列、例えばSV40 の誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バクロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽性狂犬病ウイルス）などが挙げられる。ただし、その他のベクターであっても、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能であるかぎり使用できる。適当なDNA配列は、種々の手法によってベクターに挿入できる。一般的には、当技術分野で知られる手法で、適当な制限部位にDNA配列を挿入する。そのような手法その他は、当業者の範囲内にあると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令するための適当な発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結される。そのようなプロモーターの代表例としては、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、ファージラムダP_Lプロモーター、及び原核細胞、真核細胞若しくはそれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーターを挙げることができる。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位と転写終結区（ターミネーター）をも含有する。またベクターは、発現を増幅させるための適当な配列を含んでもよい。さらに発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択に利用できる表現型上の特徴を与えるために、1又はそれ以上の選択可能マーカー遺伝子（例えば真核細胞培養用のネオマイシン耐性やジヒドロ葉酸レダクターゼ、大腸菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性など）を含有することが好ましい。上述の適当なDNA配列と適当なプロモーター又は制御配列とを含有するベクターを、適当な宿主の形質転換に使用することによって、その宿主にそのタンパク質を発現させることができる。適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、キイロショウジョウバエS2及びSpodoptera Sf9などの昆虫細胞、CHO、COS又はボーズ黒色腫などの動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などを挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。より具体的に述べると、本発明は、上に広く記述した配列の1又はそれ以上を含む組換え構築物をも包含する。これらの構築物は、本発明の配列が正方向又は逆方向に挿入されているベクター（プラスミドやウイルスベクターなど）を含む。この態様の好ましい側面では、上記構築物がさらに、上記配列に機能的に連結した調節配列（プロモーターなどを含む）をも含有する。好適なベクターとプロモーターは当業者に多数知られており、市販されている。次に挙げるベクターはその一例である。細菌用：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、pD10、phages cript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（St ratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）。真核細胞用：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、 pMSG、pSVL（Pharmacia）。ただし、その他のプラスミド又はベクターであっても、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能である限り使用できる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターや、選択可能マーカーを持つ他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択できる。適当なベクターはpKK232-8とpCM7である。特に有名な細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP_R、P_L及びtrpが挙げられる。真核プロモーターとしては、CMV即時型初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスのLTR、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適当なベクターとプロモーターの選択は、当技術分野の通常の技術水準に十分含まれる。さらなる態様として、本発明は、上述の構築物を含有する宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよいし、酵母細胞のような下等真核細胞であってもよく、また、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。宿主細胞への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって達成できる（Davis，L.，Dibner，M．Battey，I.，Basic Me thods in Molecular Biology（1986））。宿主細胞中の構築物を従来のように使用することによって、その組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生産することができる。別法として、本発明のポリペプチドを従来のペプチド合成装置で合成することもできる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下に、哺乳類細胞、酵母、細菌その他の細胞中で発現させることができる。本発明のDNA構築物から得られるRNA を用いて当該タンパク質を生産するには、無細胞翻訳系も使用できる。原核宿主及び真核宿主での使用に適したクローニングベクターと発現ベクターは、Sambro okら，Molecular Cloning:ALaboratory Manual（第2版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989））に記述されており、その開示は参考文献として本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、そのベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーは通常10〜300bpのシス作用性DNA要素であり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。複製起点の後期側100〜270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーなどがその例である。一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点、その宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカロミセス・セレビシェTRP1遺伝子）及び下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含むだろう。そのようなプロモーターは、なかんずく、3- ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵素、α-因子、酸性ホスファターゼ又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。異種構造配列は、翻訳開始配列と終止配列及び好ましくは翻訳されたタンパク質の周辺腔又は細胞外培地への分泌を指令することのできるリーダー配列に対して、適当な位相で組み立てられる。任意に、その異種配列が、発現した組換え産物の安定化や簡便な精製などといった所望の特徴を付与するN-末端同定ペプチド（identification peptide）を含む融合タンパク質をコードしてもよい。細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、機能的プロモーターに対して機能的な解読位相（reading phase）に挿入することによって、構築される。ベクターは、そのベクターの維持を保証し、かつ、所望であれば、その宿主内での増幅を提供するために、1又はそれ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むだろう。形質転換に好適な原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌並びにシュードモナス属、ストレプトミセス属及びスタフィロコッカス属に属する様々な種が挙げられる。ただし、その他の宿主も選択肢として使用できる。細菌の使用に有用な発現ベクターの典型例としては、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーと細菌性複製起点とを含むものを挙げることができる（ただしこれに限るわけではない）。そのような市販ベクターとしては、例えばpKK223-3（Phar macia Fine Chemicals，スウェーデン国ウプサラ）及びGEM1（Promega Biotec. ，米国ウィスコンシン州マディソン）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」部分を、適当なプロモーター及び発現させようとする構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば温度変化や化学誘導）によって誘導し、細胞をさらに培養する。典型的には、細胞を遠心分離によって収集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために確保する。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用などといった任意の便利な方法で破壊することができ、そのような方法は当業者にはよく知られている。組換えタンパク質の発現には、種々の哺乳類細胞培養系も使用できる。哺乳類発現系の例としては、Gluzman，Cell，23:175（1981）に記載のサル腎繊維芽細胞のCOS-7系や、適合するベクターを発現させることのできる他の細胞系（例えばC127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサーを含み、さらに必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位とスプライス受容部位、転写終止配列及び5'隣接非転写配列をも含むだろう。必要な非転写遺伝要素を提供するには、SV40のスプライス部位とポリアデニル化部位に由来するDNA配列を使用することができる。本発明ポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収、精製できる。必要に応じて、成熟タンパク質の配置の完成に、タンパク質再生段階を使用することができる。最後に、最終的な精製段階として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然の精製産物であってもよいし、化学合成法の生成物であってもよく、また組換え技術によって原核宿主又は真核宿主（例えば培養された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞など）から生産されるものであってもよい。組換え生産法に使用する宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されることもあるし、グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは、ヒト疾患の治療法又は診断法を発見するための研究用試薬及び研究材料として使用できる。本発明のポリペプチドは、受容体の特性化に使用できる。現在、EGFファミリー受容体には、EGFR1、EGFR2、EGFR3、EGFR4と呼ばれる4種類のEGF受容体が含まれる。EGFR2受容体はERB-2とも呼ばれ、この分子は様々な診断的又は治療的適応に有用である（Prignet，S.A.及びLemoine，N.R.,Prog ．Growth Factor Res.，4 :1-24（1992））。TGFα-HIポリペプチドは、おそらくこれら受容体の1又はそれ以上のリガンドであると思われ、さらに同定される新しいEGF型受容体のリガンドでもあるだろう。TGFα-HIの使用は、そのような受容体の同定、特性化及びクローニングに役立ちうる。例えば、EGF受容体遺伝子は、鳥類赤芽球症ウイルスのv-erb-B癌遺伝子の細胞相同体である。EGF受容体の過剰発現や、そのタンパク質のキナーゼ調節部分の欠失は、細胞の腫瘍形成性トランスフォーメーションを引き起こしうる（Manjusri，D．ら，Human Cytokines，364及び381（1991））。本発明のポリペプチドは、外傷その他の損傷性病理（例えばAIDS痴呆、老人性痴呆など）の結果として減少した神経学的機能の回復又は増進にも使用できる。 TGFαとその相同体は、脳のほとんどの部分で、EGF/TGFα受容体に対する最も豊富なリガンドであることがわかっている（Kaserら，Brain Res Mol Brain Res:1 6:316-322（1992））。EGFが小さく不連続な領域にしか存在しないのに対して、 TGFαは脳の様々な領域に広く分布しているようである。このことは、TGFαが脳組織において生理学的な役割を果たしているのかもしれないことを示唆している。脳内にTGFαに対する受容体部位がこれほど数多く存在するということは、TGF が正常な脳細胞の分化と機能の促進に関して重要な効用を持つことを示唆している。したがって、神経学的機能が減少している場合は、本発明のポリペプチドを投与することによって、脳を刺激し、適正な神経学的機能を増進することができる。 TGFα-HI又はその可溶型は、目の障害（例えば角膜炎）の治療にも使用できる。様々な実験によって、このような病理にTGFα遺伝子ファミリーの構成要素が関連付けられている。最近の報文に、これらの増殖因子が目の疾患に果たす役割に関するデータのいくつかが要約されている（Mannら，Cell 73:249-261（1993））。最近の実験では、TGFα遺伝子を欠くいくつかのマウスが、目の固有質に対する白血球その他の細胞の浸潤による角膜炎を示すことがわかっている。さらに、TGFα増殖因子の標的細胞に対する特異性を、標的細胞を破壊するための仕組みとして活用することもできる。例えば、TGFα-HI又はその可溶型を毒性分子（例えば標的細胞を不活化する放射性医薬）に（種々の方法で）カップリングすることができる。これらの増殖因子−毒素融合物は標的細胞を殺す（種々の「傍観者（bystander）」効果によって、隣接細胞を殺す場合もある）。このような毒素融合物遺伝子の最近の例は、Mesriら，J．Biol．Chem．268:4853-62 （1993）に公表されている。TGFα-HIとその関連分子をリポソームに封入したり、腫瘍又は細胞特異的抗原を認識、結合する抗体と共役させることによって、細胞を「標的化する（targeting）」手段にすることもできる。これと同じ方法で、TGFα-HIを抗新生物化合物として使用することもできる。 EGFファミリーの構成要素はトランスフォームした細胞に対して抗増殖作用を示すからである。生体内で使用する場合、本発明のポリプチドは、注射、注入、局所投与、非経口投与など（ただしこれらに限らない）、種々の方法で投与できる。投与は、生理学的に許容できる任意の担体（リン酸緩衝食塩水、食塩水、滅菌水など）を使用して行なうことができる。TGFα-HIポリペプチド断片は、ある種の腎疾患の治療にも使用できる。これらの増殖因子が腎臓で発現することがわかっているからである。したがって、これらの因子は、この器官の適正な生理学的維持に必要なのだろう。 TGFαとその相同体及び肝細胞増殖因子は、部分的肝切除及び急性肝細胞壊死後の肝細胞再生を誘発するので（Masuhara，M．ら，Hepatology 16:1241-1249（ 1992））、肝再生又は肝不全に関する処置も可能である。 TGFα-HIが関与する重要な処置は、創傷治癒に関する処置である。本発明の組成物は、実質上あらゆる皮膚創傷、角膜創傷及び上皮で裏打ちされた身体の中空器官に対する損傷を含む、様々な創傷の処置に使用できる。処置に適した創傷としては、火傷、擦傷、切り傷などの外傷によるものと、外科的切開及び皮膚移植などの手術によるものが挙げられる。本発明ポリペプチドによる処置に適したその他の状態としては、慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍などの慢性病や、非治癒（non-he aling）（栄養）状態が挙げられる。 TGFα-HIやその可溶性断片は、患部に適用するための生理学的に許容できる担体に組込むことができる。担体の性質は、意図する適用部位によって大きく異なる。皮膚への適用には、通常、クリーム基剤や軟膏基剤が好ましい。好適な基剤としては、ラノリン、シルバデン（Silvadene；Marion）（特に火傷の治療用）、アクアフォア（Aquaphor;Duke Laboratories，コネチカット州サウスノーウォーク）などが挙げられる。所望であれば、TGFα-HI含有組成物を包帯その他の創傷用治療材料に組込むことによって、創傷を本発明ペプチドに継続してさらすこともできる。エアゾールにも用途があるだろう。治療組成物中のTGFα-HI濃度は決定的な問題ではないが、上皮細胞増殖を誘導するに足る濃度でなければならない。本発明組成物は、患部に局所的に（一般的には点眼剤として目に、あるいはクリーム、軟膏又はローションとして皮膚に）適用することができる。目の場合、頻繁な処置が望ましく、通常は、4時間未満の間隔で適用する。皮膚には、1日に2〜4回又はそれ以上頻繁に治療組成物を適用しながら、治癒中は継続して患部上に治療組成物を保持することが望ましい。本発明ポリペプチドの使用量は、投与法、他の活性化合物の使用などによって変動するが、一般的には、約1μg〜100μgの範囲である。本発明ポリペプチドは、食塩水、リン酸緩衝食塩水などといった生理学的に許容できる担体と共に使用することができる。使用する化合物の量は、試験管内での細胞の応答や本発明ポリペプチド又は本発明ポリペプチドを含有する製剤に対する実験動物の反応に基づいて、実験的に決定されるだろう。 TGFα-HIやその可溶性断片は、血管形成、骨再吸収、免疫反応、シナプスエフェクター機能及びニューロンエフェクター機能の調節に使用できる。TGFα-HIは、アラキドン酸カスケードの調節にも使用できる。 TGFα-HIやその可溶性断片は、最終分化（terminal differentiation）に関係する応用にも使用できる。多くのTGFα因子とそれらの相同体は、それらの標的細胞における最終分化を誘導する。この性質は、その因子を投与し、標的細胞の死を誘導することによって、生体内で活用することができる。この方法は、医学的に望ましくない細胞タイプ（癌など）の過剰増殖に関係する障害やその他の増殖性障害（例えば炎症、乾癬など）について検討されている。生体内投与に加えて、試験管内投与が妥当な場合も種々ある。例えば、骨髄の場合は、細胞を増殖因子及び/又はその誘導体で細胞を処理することによって、骨髄から望ましくない細胞集団を試験管内で除去することができる。また、脱毛症、抜け毛、その他毛包の発育に影響を与える皮膚状態に関する応用もある。TGFα増殖因子がそのような状態に関与することは、数系統の証拠が示唆している。上述のように、TGFα遺伝子中にヌル（無効）突然変異を含有するように操作された「ノックアウト」マウスは、毛髪合成に関して量的及び質的な異常を示す。さらに、マウスにおけるマッピング研究によって、毛髪の成長に影響を与えるいくつかの突然変異がTGFα遺伝子座にマッピングされることがわかっている（Mannら，Cell 73:249-261（1993））。いくつかの形態の脱毛症と抜け毛の治療には、TGFα-HI又はその誘導体の局所的又は全身的投与を使用することができ、これらの主張は本発明の範囲に包含される。ある種の疾患病理は、TGFα-HI増殖因子の全身的臨床投与によって、部分的又は完全に改善できる。この投与は、遺伝子療法（下記参照）の形態をとることもできるし、TGFα-HI DNAの組換え構築物から又はペプチド化学合成によって合成されたペプチド又はタンパク質の投与によって行なうこともできる（Wooら，Pro tein Engineering 3:29-37（1989））。本発明は、本発明のポリペプチドに対するアゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物を同定するための化合物スクリーニング法を提供する。例えば、TGFα- HI受容体を発現させる哺乳類細胞又は膜調製物を、候補化合物と共にインキュベートし、その受容体から第2シグナルを発生させる（その化合物の）能力を測定することによって、それが有効なアゴニストであるかどうかを決定する。そのような第2伝達子（メッセンジャー）系としては、cAMPグアニル酸環化酵素、イオンチャンネル又はホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限るわけではない。有効なアンタゴニストは、上述の方法で、受容体に結合するが、第2 メッセンジャー応答を引き出さず、したがってその受容体をTGFα-HIから遮断するアンタゴニスト化合物を検出することによって決定される。本発明ポリペプチドに対する受容体に特異的な潜在的アンタゴニストを同定するためのもう1つの検定法は、競争検定法である。この競争検定法では、本発明ポリペプチドに対する受容体を過剰に発現させる原形質膜（例えばヒトA431癌細胞）を単離する。10nM ¹²⁵I-TGFα-HIを含有する培地で連続希釈した試験試料（体積は約10μl）を、潜在的アンタゴニスト化合物の存在下に、上記原形質膜5μ gに加え、4℃で4時間インキュベートする。その反応混合物を希釈し、直ちにミリポアフィルターに通す。次にそのフィルターをすばやく洗浄し、結合した放射活性をガンマカウンターで測定する。次に、結合したTGFα-HIの量を測定する。上記化合物の不在下に対照検定をも行なって、そのアンタゴニストが、結合した TGFα-HIの量を減少させるかどうかを決定する。潜在的アンタゴニスト化合物としては、そのポリペプチドに結合する抗体や（場合によっては）オリゴペプチドが挙げられる。また、密接に関係するタンパク質であって、その受容体に結合するが、そのポリペプチドの不活性型であるので、本発明ポリペプチドの作用を妨害するものも、潜在的アンタゴニストになりうる。もう1つのアンタゴニスト化合物は、アンチセンス技術を用いて作成されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA又はRNAもしくは三重らせん形成による遺伝子発現の制御に使用でき、これらの方法は共に、DN A又はRNAに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コーディング部分を用いて、約 10〜40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になる（三重らせん−Lee ら，Nucl．Acids．Res.，6:3073（1979）；Cooneyら，Science，241:456（1988 ）；Dervanら，Science，251:1360（1991）を参照）ことによって本発明ポリペプチドの転写と生産を妨害するように、設計される。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは生体内でmRNAにハイブリッド形成し、そのmRNA分子の本発明ポリペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス−Okano，J．Neurochem.，56:560（19 91）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression， CRC Press，フロリダ州ボカラトン（1988）を参照）。アンチセンスRNA又はDNA が生体内で発現して、本発明ポリペプチドの生産を阻害しうるように、上述のオリゴヌクレオチドを細胞に送達することもできる。アンタゴニスト化合物には、本発明ポリペプチドに結合し、受容体におけるその作用を遮断することによって、正常な生物学的活性を妨害する小分子も含まれる。小分子が、本発明ポリペプチドに対する受容体を結合してもよい。そのような小分子の例としては、小ペプチド又は小さいペプチド様分子が挙げられるが、これらに限るわけではない。上記アンタゴニストは、新生組織形成（例えば癌や腫瘍）の治療に使用できる。腫瘍細胞によるEGFファミリー構成要素の分泌又は生産を阻害すると、腫瘍が退行することが知られている。本発明ポリペプチドに対するアンタゴニストは、ある種の皮膚障害（例えば乾癬）の処置にも治療的に使用できる。乾癬病巣などの疾患から採取した皮膚生検中では、この増殖因子ファミリーの構成要素の発現レベルが、上昇していることがわかっている（Cookら，Cancer Research，52:3224-3227（1992））。上記アンタゴニストは、後述するような医薬的に許容できる担体との組成物として使用できる。本発明のポリペプチド、アゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物は、適当な医薬担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療有効量の上記ペプチド又は化合物と、医薬的に許容できる担体又は賦形剤とを含有する。そのような担体としては、塩水、緩衝塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限わけではない。製剤は投与法に適するものでなければならない。本発明は、本発明医薬組成物の1又はそれ以上の成分で満たされた1又はそれ以上の容器を含む医薬パック又はキットをも提供する。そのような容器には、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式で、ヒト投与に関する製造、使用又は販売の該機関による認可を反映する情報を付すことができる。さらに、本発明のポリペプチド又は化合物を他の治療用化合物と併用してもよい。上記医薬組成物は、経口経路、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻孔内経路又は皮内経路など、都合の良い方法で投与することができる。上記医薬組成物は、特定の適応症の処置及び／又は予防に有効な量で投与される。一般的には、少なくとも約10μg/kg-体重の量で投与され、ほとんど場合は、約8mg/kg-体重/日を超えない量で投与されるだろう。ほとんどの場合、日用量は、投与経路、症状などを考慮して、約10μg/kg〜約1mg/kg-体重になる。本発明のポリペプチドと、ポリペプチドであるアゴニスト及びアンタゴニストを、本発明に従って使用する場合は、それを生体内における当該ポリペプチドの発現によってすることもできる。これはしばしば「遺伝子療法」と呼ばれる。したがって、例えば、患者から得た細胞を、生体外で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）で操作し、そのポリペプチドで処置しようとする患者に、操作したその細胞を与えることができる。このような方法は当技術分野では良く知られており、本明細書の教示から明らかである。例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、細胞を操作することができる。また、生体内でポリペプチドを発現させるために、例えば当技術分野で知られる手法によって、生体内で細胞を操作することもできる。例えば、本発明ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターをパッケージング細胞に形質導入すると、そのパッケージング細胞力泪的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生産するようになる。生体内で細胞を操作し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させるには、これらの生産細胞を患者に投与すればよい。そのような方法による本発明ポリペプチドの上記その他の投与法は、本発明の教示から、当業者には明らかなはずである。上述のレトロウイルスプラスミドベクターの供給源となりうるレトロウイルスとしては、モロニーネズミ白血病ウイルス、牌臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスなどが挙げられるが、これらに限るわけではない。一態様として、レトロウイルスプラスミドベクターをモロニーネズミ白血病ウイルスから得る。ベクターは1又はそれ以上のプロモーターを含む。使用できる好適なプロモーターとしては、レトロウイルスLTR、SV40プロモーター、Millerら，Biotechniqu es ,第7巻,第9号，980-990（1989）に記載のヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、その他のプロモーター（例えばヒストンプロモーター、pol IIIプロモーター、β-アクチンプロモーター（ただしこれらに限らない）のような真核細胞プロモーターなどの細胞性プロモーター）が挙げられるが、これらに限るわけではない。使用できるその他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限るわけではない。適当なプロモーターの選択は、本明細書の教示から、当業者には明らかだろう。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、好適なプロモーターの制御下に置かれる。使用できる好適なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（アデノウイルス主要後期プロモーターなど）、異種プロモーター（サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターなど）、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモーター、誘導性プロモーター（MMTプロモーターやメタロチオネインプロモーターなど）、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ApoAIプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（単純疱疹チミジンキナーゼプロモーターなど）、レトロウイルスLTR（上述の修飾レトロウイルスLTRを含む）、β-アクチンプロモーター、ヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限るわけではない。プロモーターは、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。上記レトロウイルスプラスミドベクターでパッケージング細胞を形質導入することによって、生産細胞系を作成する。トランスフェクションできるパッケージング細胞の例としては、Miller，Human Gene Therapy,第1巻，5-14（1990）（この刊行物の全内容は参考文献として本明細書の一部を構成する）に記載のDAN、P E501、PA317、φ-2、φ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、φCRE、φCRIP、GP+ E-86及びGP+envAm12細胞系が挙げられるが、これらに限るわけではない。ベクターは、当技術分野で知られる任意の手段で、パッケージング細胞に導入される。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用及びリン酸カルシウム沈降法が挙げられるが、これらに限るわけではない。もう1つの方法として、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームに封入するか、脂質にカップリングした後、宿主に投与してもよい。上記生産細胞系は、本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子は、試験管内又は生体内で、真核細胞の形質導入に使用することができる。形質導入された真核細胞は、本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるだろう。形質導入できる真核細胞としては、胚幹細胞、胚癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限るわけではない。本発明は、診断薬としての本発明遺伝子の使用にも関係する。本発明遺伝子の突然変異型の検出は、本発明ポリペプチドの過少発現がもたらす疾患（例えば不適当な創傷治癒、不適当な神経学的機能、目の障害、腎障害、肝障害、毛包発育、血管形成、胚形成など）又はその疾患に対する罹病性の診断を可能にするだろう。本発明のヒト遺伝子に突然変異を持つ個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出することができる。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検及び検死体などといった患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAは、検出に直接使用してもよいし、分析に先立って、PCRを用いて酵素的に増幅してもよい（Saiki ら，Nautre，324:163-166（1986））。RNAやcDNAも同じ目的に使用できる。例えば、本発明ポリペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーを使用して、その突然変異を同定及び分析することができる。例えば、欠失や挿入は、増幅産物のサイズが正常な遺伝子型とは異なることによって検出できる。点変異は、放射線で標識したRNA配列若しくは放射線で標識したアンチセンスDNA配列に、増幅したDNAをハイブリッド形成させることによって同定できる。完全に一致する配列は、RNase A消化又は融解温度の相違によって、ミスマッチを持つ二本鎖分子と識別することができる。参照遺伝子と突然変異を持つ遺伝子の間の配列の相違は、直接DNA配列決定法によって明らかにできる。また、クローン化したDNA部分をプローブとして使用することにより、特定のDNA部分を検出することもできる。この方法の感度は、P CRと組み合わせると著しく増大する。例えば、配列決定プライマーを、改良PCR によって生成した二本鎖PCR産物又は一本鎖鋳型分子と共に使用する。配列決定は、放射線標識ヌクレオチドを用いる従来の手法か、蛍光標識を用いる自動配列決定法によって行なう。 DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変性剤を含む（若しくは含まない）ゲルにおけるDNA断片の電位泳動移動度の変化を検出することによって、達成することができる。小さい配列の欠失と挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化できる。配列が異なるDNA断片は、変性ホルムアミド勾配ゲルで識別できる。この場合、異なるDNA断片の移動度は、それぞれの融解温度又は部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えばMyersら，Science，230:1242 （1985）を参照のこと）。特定の位置における配列の変化は、化学的切断法や、RNase及びS1保護などのヌクレアーゼ保護検定法でも明らかにできる（例えばCottonら，PNAS，USA，85: 4397-4401（1985）を参照）。したがって、特定のDNA配列の検出は、ハイブリッド形成、RNase保護、化学的切断、直接DNA配列決定などの方法、又は制限酵素の使用（例えば制限断片長多形（Restriction Fragment Length Polymorphisms；RFLP））及びゲノムDNAのサザンブロッティングによって達成できる。より従来的なゲル電気泳動とDNA配列決定に加えて、インシチュー分析でも突然変異を検出することができる。また、本発明は、種々の組織における本発明ポリペプチドのレベルの変化を検出する診断的検定法に関する。正常な対照組織試料に比べて本発明タンパク質の発現が過剰であることは、新生組織形成、皮膚障害、目の障害及び炎症などといったある種の疾患状態の存在を示しうるからである。宿主から得た試料中の本発明ポリペプチドのレベルを検出するために使用される検定法は、当業者には良く知られており、ラジオイムノアッセイ、競争結合検定、ウェスタンブロット分析、そして好ましくはELISA検定が挙げられる。ELISA検定法では、先ず、本発明ポリペプチドの抗原に特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する。さらに、そのモノクローナル抗体に対するリポーター抗体を調製する。リポーター抗体には、放射活性や蛍光などの検出可能な試薬（この例では西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）を結合する。次に、宿主から試料を取り出し、その試料中のタンパク質を結合する固体支持体（例えばポリスチレン皿）上でインキュベートする。次に、非特異的タンパク質（ウシ血清アルブミンなど）と共にインキュベートすることによって、皿上の遊離のタンパク質結合部位をすべて覆う。次に、上記モノクローナル抗体をその皿中でインキュベートする。この間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合した本発明ポリペプチドのすべてに結合する。未結合のモノクローナル抗体を緩衝液で洗い流す。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体をその皿に入れ、本発明ポリペプチドに結合したモノクローナル抗体にレポーター抗体を結合させる。次に、未結合のリポーター抗体を洗い流す。次に、ペルオキシダーゼ基質をその皿に加える。与えられた期間中に発色する色の量を標準曲線と比較すれば、与えられた体積の患者試料中に存在するタンパク質量の測定値が得られる。競争検定法を用いて、宿主から得た試料中の本発明ポリペプチドのレベルを決定することもできる。この検定法では、本発明ポリペプチドに対する受容体を過剰発現させる原形質膜を単離する。次に、標識された本発明ポリペプチドを含有する試験試料をその原形質膜に加え、規定の時間インキュベートする。その反応混合物には、本発明ポリペプチドを含有すると思われる宿主から得た試料も加える。次に、その反応混合物をフィルターに通し、そのフィルターをすばやく洗浄した後、結合した放射活性を測定することによって、受容体に関する競争の量（したがってその試料中の本発明ポリペプチドの量）を決定する。 TGFα-HIに特異的な抗体は、癌の診断と治療に使用できる。癌細胞の多くは、新生組織形成又は過形成の過程で、種々のTGFαファミリー構成要素を上方調節するからである。これらの抗体はTGFα-HIに結合して、それを不活化する。TGF α-HI（及び/又はそのファミリー構成要素）に対するモノクローナル抗体は、ある種の障害（例えば過形成及び新生組織形成増殖異常など（ただしこれに限らない））の診断と治療に、臨床的に用いられる。新生物組織による増殖因子発現の上方調節は、患者の血液中の増殖因子の増大を検出する種々の血清検定法の基礎をなす。これらの検定法は、通常、診断的に応用されるばかりでなく、予後（手術や化学療法などに続いて、ごく微量な腫瘍細胞の存在を検出するため）にも応用される。また、TGFα-HI受容体を発現させる悪性細胞は、標識したTGFα-HIを受容体結合検定法で用いるか、又はTGFα-HI受容体自体に対する抗体を使用することによって検出できる。細胞はTGFα-HIに対する受容体の存在と密度によって識別できるので、これは、TGFα-HIの生物学的活性に対するそれら細胞の感受性を予測する手段となる。本発明の配列は、染色体同定にも役立つ。本発明の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に誘導され、それにハイブリッド形成することができる。また、染色体上の特定の部位を同定することは、現在必要とされていることでもある。現在のところ、染色***置の標識に利用できる、実際の配列データ（反復多形（repeat polymorphisms））に基づく染色体標識試薬はほとんどない。本発明による染色体に対するDNAのマッピングは、それらの配列を疾患に関係する遺伝子と相関させる重要な第1段階である。簡単に述べると、配列は、そのcDNAからPCRプライマー（15〜25bpが好ましい）を調製することによって、染色体に対してマッピングすることができる。ゲノムDNA中の2エクソン以上にまたがることによって増幅過程を複雑にすることのないプライマーをすばやく選択するには、3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いる。次に、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに、これらのプライマーを用いる。そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅断片を生成するだろう。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当てる迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを使って本発明を用いると、同様の方法で、特定の染色体に由来する断片のパネル又は大きいゲノムクローンのプールで、サブマッピング（sublocalization）を達成できる。染色体に対するマッピングに同様に使用できるその他のマッピング法としては、インシチューハイブリッド形成、染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリッド形成による予備選択及び標識フロー選別（labeled flow-sorted）染色体を用いる予備スクリーニングが挙げられる。中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光インシチューハイブリッド形成（FISH ）を用いると、1段階で正確な染色***置を得ることができる。この技術は50又は60塩基程度のcDNAでも使用できる。この技術の総説としては、Vermaら，Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press,ニューヨーク（ 1988）を参照のこと。配列を正確な染色***置にマッピングしたら、その配列の染色体上の物理的位置を遺伝子マップデータと相関させることができる。そのようなデータは、例えばV．McKusick，Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズホプキンス大学ウェルチメディカルライブラリーからオンラインで入手できる）に認められる。次に、同じ染色体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖分析（linkag e an alysis）（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定する。次に、患者と非患者の間で、そのcDNA又はゲノム配列の相違を決定する必要がある。ある突然変異がその患者の一部又は全部に観測され、正常な個体には観測されない場合、その突然変異はその疾患の原因因子であるかもしれない。物理的マッピング技術と遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、その疾患に関係する染色体領域に正確にその位置が特定されるcDNAは、50〜500個の潜在的原因因子のうちの一つであろう（マッピング解像度1メガ塩基かつ20kbにつき1 遺伝子と仮定した場合）。本発明ポリペプチド、その断片その他の誘導体、その類縁体、又はそれらを発現させる細胞は、それらに対する抗体を生産するための免疫原として使用できる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体でありうる。本発明は、キメラ抗体、一本鎖抗体、擬人化抗体及びFab断片又はFab発現ライブラリーの産物をも包含する。このような抗体及び断片の生産法は、当技術分野で種々知られている。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じる抗体は、動物（好ましくはヒト以外の動物）にそのポリペプチドを直接注射するか、投与することによって得ることができる。そのようにして得た抗体は、そのポリペプチド自体に結合するだろう。この方法では、そのペプチドの断片のみをコードする配列を使用しても、その全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成させることができる。そのような抗体は、そのポリペプチドを発現させる組織からそのポリペプチドを単離するために使用できる。モノクローナル抗体の製造には、連続的継代細胞系培養によって生産される抗体を与える任意の技術を使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hler及びMilstein，1975，Nature，256:495-497）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，1983，Immunology Today 4:72）及びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら，1 985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，77-96 頁）が挙げられる。一本鎖抗体の生産について記述した技術（米国特許4,946,778）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることができる。また、形質転換マウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する擬人化抗体を発現させることもできる。以下の実施例を参照して、本発明をさらに説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や量はすべて重量に基づく。以下の実施例の理解を容易にするため、頻繁に使用する方法及び/又は用語をいくつか説明しておく。「プラスミド」は、小文字pとその前後の大文字及び/又は数字で指定する。本明細書における出発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手できるか、若しくは入手できるプラスミドから公表された方法に従って構築できる。さらに、当技術分野では、本明細書に記述するプラスミドと等価なプラスミドが知られており、それらは当業者には明らかだろう。 DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素によるDN Aの触媒的切断を意味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補助因子その他の必要条件は、当業者に知られているであろうものを使用した。分析には、通常、1μgのプラスミド又はDNA断片を約2単位の酵素と共に約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築用のDNA断片を単離する場合は、通常、より大きい体積中で、5〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は、製造者によって指定される。通常は37℃で約1時間のインキュベーション時間を使用するが、これは供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応液をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断片を単離する。切断した断片のサイズ分離は、Goeddel，D．ら，Nucleic Acids Res.，8:4057 （1980）に記載の8%ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は2本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないので、キナーゼの存在下にATPでリン酸基を付加しないと、もう1つのオリゴヌクレオチドには連結しないだろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片に連結するだろう。「連結」とは、2本の二本鎖核酸断片間のリン酸ジエステル結合の形成過程をいう（Maniatis，T.ら，同上,146頁）。特に規定しない限り、連結は、既知の緩衝液と条件を用いて、連結すべきほぼ等モル量のDNA断片0.5μgにつき10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）で、達成することができる。特に明言しない限り、形質転換はGraham，F.及びVan der Eb，A.，Virology， 52:456-457（1973）の方法で行なった。実施例1 可溶型TGFα-HIの細菌発現と精製 TGFα-HIをコードするDNA配列（ATCC番号75698）を、まず、プロセシングされたTGFα-HIタンパク質（シグナルペプチド配列を欠く）の5'配列に対応するPCR オリゴヌクレオチドプライマーと、TGFα-HI遺伝子の3'側にあるベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて増幅した。TGFα-HIに対応する追加のヌクレオチドを、その5'配列と3'配列のそれぞれに付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、5'CCCGGATCCGCACGAGACATACCTTGTCCG3'（配列番号3）という配列を持ち、BamHI制限酵素部位（太字部分）と、それに続く、プロセシングされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まるTGFα-HIコーディング配列の21ヌクレオチドとを含有する。3'配列(5'GGGAAGCTTTTAATACTGAAATC GTACAGGAC3'；配列番号4）は、HindIII部位に相補的な配列を含有し、それに、T GFα-HIの23ヌクレオチドが続いている。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Quiagen，Inc.,カリフォルニア州91311チャッツワース）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は抗生物質耐性（Amp^r）、細菌性複製起点（ori）、 IPTGで制御できるプロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS ）、6-His標識及び制限酵素部位をコードする。pQE-9をBamHIとHindIIIで消化した。増幅した配列をpQE-9中に連結し、ヒスチジン標識及びRBSと枠を合わせて挿入した。次に、その連結混合物を用いて、Sambrook，J．ら，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Harbor Laboratory Press（1989）に記載の手法で、大腸菌M15/rep4株（Qiagen，Inc.）を形質転換した。M15/rep4は、lacI抑制因子を発現し、かつ、カナマイシン耐性（Kan^r）を付与するプラスミドpREP4の複数コピーを含有する。LBプレート上で成長するというそれらの能力によって形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドD NAを単離し、制限分析によってそれを確認した。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）の両方を補足したLB液体培地で、終夜（O/N）培養した。そのO/N培養物を、1:100〜1:250の比率で、大きい培養に接種した。光学密度600（O.D.⁶⁰⁰）が0.4〜0.6になるまで細胞を生育した。次に、 IPTG（「イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド」）を最終濃度が1mMになるように加えた。IPTGは、1acI抑制因子を不活化することによって、P/Oをきれいにし、遺伝子発現の増大をもたらす。細胞をさらに3〜4時間生育した。次に、遠心分離によって細胞を収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤6M塩酸グアニジン中で可溶化した。清浄化の後、この溶液から、6-His標識を含有するタンパク質による強固な結合が可能な条件下に、ニッケル-キレートカラムでのクロマトグラフィーによって、可溶化したTGFα-HIを精製した（Hochuli，E.ら，J． Chromatography 411:177-184（1984））。TGFα-HI（純度85%）を6M塩酸グアニジンpH5.0でカラムから溶出させ、再生のために、3M塩酸グアニジン、100mMリン酸ナトリウム、10Mグルタチオン（還元型）及び2Mグルタチオン（酸化型）に調節した。この溶液を12時間インキュベートした後、タンパク質を10Mリン酸ナトリウムに対して透析した。実施例2 バクロウイルス発現系によるTGFα-HIのクローニングと発現図1の最初のアミノ酸から活性ドメインの終わりまでを発現させるために、完全長TGFα-HIタンパク質をコードするDNA配列（ATCC番号75698）を、その遺伝子の5'及び3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。三組のプライマーを使用した。第１のプライマー対は、である。第2のプライマー対は、である。これらのプライマーは、推定活性（可溶性）ドメインを発現させるために使用される。すべての5'プライマーはBamHI制限酵素部位（太字）を持ち、その後に、真核細胞における翻訳開始の効率のよいシグナル（Kozak，M.，J．Mol．Biol.，196: 947-950（1987））に似せたヌクレオチドが続いている（翻訳開始コドンは「ATG 」である） 3'プライマーは、制限エンドヌクレアーゼXbaIの切断部位を含有し、TGFα-HI 遺伝子の3'TGFα可溶性ドメインに相補的なヌクレオチドを持つ。増幅された配列を、市販のキット（「Geneclean」，BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、1%アガロースゲルから単離した。次に、その断片をエンドヌクレアーゼBamHIとXbaIで消化した後、1%アガロースゲルで再び精製した。この断片をF 2と命名した。バクロウイルス発現系（総説としてはSummers，M.D.及びSmith，G.E.，1987， A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture proc edures（バクロウイルスベクターのための方法と昆虫細胞培養法のマニュアル），Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555を参照のこと）によるTFGα-HIタンパク質の発現には、pA2ベクター（pVL941ベクターを改良したもの、後述）を使用した。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターと、それに続く制限エンドヌクレアーゼ認識部位とを含有する。効率のよいポリアデニル化のために、シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を使用した。組換えウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに先行するポリヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入した。ポリヘドリン配列の両端には、同時にトランスフェクションされる野生型ウイルスDNAの細胞媒介相同組換え用のウイルス配列を隣接させた。pRG1の代わりに、pAc373、pVL941及びpAcIM1（Luckow，V.A.及びSummers，M.D.，Virology，170:31-39）などといった他の多くのバクロウイルスベクターも使用できる。上記プラスミドを制限酵素BamHIとXbaIで消化した後、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当技術分野で知られる手法で、脱リン酸化した。次に、市販のキット（「Geneclean」，BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、そのDN Aを1%アガロースゲルから単離した。このベクターをV2と命名した。断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNAリガーゼで連結した。次に、大腸菌 HB101細胞を形質転換し、TGFα-HI遺伝子を持つプラスミド（pBacTGFα-HI）を含有する細菌を、制限酵素BamHIとXbaIを用いて同定した。クローン化された断片の配列をDNA配列決定によって確認した。リポフェクション法（Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-741 7（1987））を用いて、5μgのプラスミドpBacTGFα-HIを、市販の直鎖化バクロウイルス（「BaculoGold^TMbaculovirus DNA」，Pharmingen，カリフォルニア州サンディエゴ）1.0μgと同時にトランスフェクションした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAと5μgのプラスミドpBac-TGFα-HIを、血清非含有グレース培地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ガイサースブルク）50μlの入ったマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン10μlとグレース培地90μlを加え、混合し、室温で15分間インキュベートした。次に、血清を含まないグレース培地1mlが入っている35mm組織培養プレートに接種したSf9毘虫細胞（ATCC CRL1711）に、上記トランスフェクション混合物を滴下した。プレートを前後にゆすって、新たに加えた溶液を混合した。次に、そのプレートを27℃で5時間培養した。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから取り除き、10%ウシ胎児血清を補足したグレース昆虫培地1mlを加えた。そのプレートを培養器に戻し、培養を27℃で4日間続けた。 4日後、上清を集め、Summers及びSmith（上記）の記述と同様に、プラーク検定を行なった。改良点として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,ガイサースブルク）を含むアガロースゲルを使用した。これは、青く染色したプラークの単離を容易にする。「プラーク検定」に関する詳細な説明は、Life Technolog ies Inc．（ガイサースブルク）が発行している昆虫細胞培養とバクロウイルス学に関するユーザーズガイドの9-10頁にも認められる。連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加え、青く染色したプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次に、組換えウイルスを含有する寒天を、グレース培地200μlの入ったエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。短い遠心分離によって寒天を除去し、組換えバクロウイルスを含有する上清を用いて、35mm 皿に接種したSf9細胞を感染させた。4日後、これらの培養皿の上清を収集し、4 ℃で保存した。 Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補足したグレース培地で生育した。その細胞を組換えバクロウイルスV-TGFα-HIに感染多重度（MOI）2で感染させた。6時間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くSF900 II培地（Life Technolog ies Inc.,ガイサースブルク）に置換した。42時間後、5μCiの³⁵S-メチオニンと 5μCiの³⁵S−システイン（Amersham）を加えた。細胞をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグラフィーで可視化した。実施例3 COS 細胞における組換えTGFα-HIの発現プラスミドTGFα-HI HAの発現は、1）SV40複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌複製起点、4）CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、SV40イントロン及びポリアデニル化部位を含有するベクターpcDNA3/Amp（Invi trogen）によった。全TGFα-HI前駆体と、その3'末端にインフレーム（in frame ）融合したHA標識とをコードするDNA断片を、上記ベクターのポリリンカー領域にクローニングした。したがって、その組換えタンパク質の発現はCMVプロモーターに制御される。HA標識は、既に記述したように、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（I．Wilson，H．Niman，R．Height en， A．Cherenson，M．Connolly及びR．Lerner，Cell，37:767（1984））。標的タンパク質にHA標識を融合すると、HAエピトープを認識する抗体で組換えタンパク質を容易に検出できるようになる。プラスミド構築法は次の通りである。 TGFα-HIをコードするDNA配列（ATCC番号75698）を、次の2つのプライマーを用いて、クローン化した最初のEST（the original EST）に対するPCRによって構築した。5'プライマー（5'CGCGGATCCGCCATCATGGTGCTGTGGGAGTCC3'；配列番号12 ）は、BamHI部位（太字部分）と、それに続く、開始コドンから始まるTGFα-HI コーディング配列の18ヌクレオチドとを含有する。3'配列(5'GCGCTCGAGGTATAGAA CACTGTAGTCC3'；配列番号13）は、XhoI部位、TGFαドメインの最後の19ヌクレオチド並びにXhoI部位に相補的な配列を含有する。pcDNA3/Ampベクターは、BamHI/ XhoIクローニング部位を含み、このクローニング部位を利用すると、PCR挿入物の読み枠が3'HA標識とそれに続く停止コドンの読み枠に合う。したがって、PCR 産物は、BamHI部位、936塩基対のコーディング配列、及びXhoI部位を含有する。そのPCR増幅DNA断片とベクターpcDNA3/Ampを、BamHI及びXhoI制限酵素で消化し、連結した。その連結混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning Systems,カリフォルニア州92037ラジョラから入手できる）を形質転換し、その形質転換培養をアンピシリン培地プレートで培養して、耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調べた。この組換えTGFα-HIを発現させるため、DEAE-デキストラン法（J．Sambrook，E ．Fritsch，T．Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spri ng Laboratory Press（1989））によって、COS細胞を上記発現ベクターでトランスフェクションした。TGFα-HI HAタンパク質の発現は、放射線標識と免疫沈降法(E．Harlow，D．Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbo r Laboratory Press（1988））によって検出した。トランスフェクションの2日後に、細胞を³⁵S-システインで8時間標識した。次に、培養培地を集め、細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液（150mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%DOC， 50mM Tris，pH7.5）で溶解した（Wilson，I.ら,同上，37:767（1984））。細胞溶解物と培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈殿させた。沈殿したタンパク質を15%SDS-PAGEゲルで分析した。実施例4 遺伝子療法による発現皮膚生検によって対象から繊維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に入れ、小片に分割する。組識の小さい塊（chunks）を組織培養フラスコの湿った表面に乗せる。各フラスコに、約10片を入れる。そのフラスコを上下逆さにし、きつく密閉して、室温に終夜放置する。室温で24時間後、そのフラスコを逆さにし、組織塊をフラスコの底に固定したまま、新鮮な培地（例えば10%FBS、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むハムF12培地）を加える。次に、これを37℃ で約1週間培養する。この時点で、新鮮な培地を加え、以降、数日毎に交換する。さらに2週間培養すると、繊維芽細胞の単層が生じる。その単層をトリプシン処理して、より大きなフラスコに移す。モロニーネズミ肉腫ウイルスの長末端反復を持つpMV-7（Kirschmeier，P.T.ら，DNA，7:219-25（1988））を、EcoRIとHindIIIで消化した後、ウシ腸ホスファターゼで処理する。その直鎖ベクターをアガロースゲルで分画し、ガラスビーズを用いて精製する。本発明ポリペプチドをコードするcDNAを、それそれ5'末端配列及び3'末端配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。その5'プライマーはEcoRI部位を含有し、その3'プライマーはHindIII部位を含む。モロニーネズミ肉腫ウイルス直鎖骨格と増幅したEcoRI及びHindIII断片を、T4 DNAリガーゼの存在下に、等量ずつ混合する。得られた混合物を、上記2断片の連結に適した条件下に維持する。その連結混合物を用いて細菌HB101を形質転換し、それを、カナマイシン含有寒天上で培養することによって、目的の遺伝子がベクターに正しく挿入されていることを確認する。両種性pA317又はGP+am12パッケージング細胞を、10%ウシ血清（CS）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中、コンフルエント密度まで組織培養する。次に、上記遺伝子を含有するMSVベクターをその培地に加え、パッケージング細胞をそのベクターで形質導入する。パッケージング細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生産するようになる（このパッケージング細胞を生産細胞と呼ぶ）。形質導入された生産細胞に新鮮な培地を加えた後、コンフルエントな生産細胞の10cmプレートから培地を収集する。感染性ウイルス粒子を含有するその消費済み培地をミリポアフィルターに通して、剥離した生産細胞を除去し、その培地を用いて、繊維芽細胞を感染させる。繊維芽細胞の亜コンフルエント（sub-conflu ent）プレートから培地を除去し、生産細胞から得た培地にすばやく置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高ければ、実質上全ての繊維芽細胞が感染され、選択の必要はないだろう。力価が極めて低い場合は、neoやhisなどの選択可能マーカーを持つレトロウイルスベクターを使用する必要がある。次に、操作した上記繊維芽細胞を、そのまま、若しくはサイトデックス3ミクロキャリアービーズ（cytodex 3 microcarrier beads）上でコンフルエントに成長させた後、宿主に注射する。その繊維芽細胞は、上記タンパク質産物を生産するようになっている。上の教示を考慮すれば、本発明には数多くの改良や変更を加えることができるので、詳しく説明した態様以外にも、添付の請求の範囲内で本発明を実施することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 13/12 9/00 17/02 13/12 17/06 17/02 17/14 17/06 25/28 17/14 35/00 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フルドナー，レベッカ・エイアメリカ合衆国20838メリーランド州バーンズビル、バーンズビル・ロード18040 番ピー・オー・ボックス306 (72)発明者ウェイ，イン・フェイアメリカ合衆国20878メリーランド州ダーンズタウン、ストロー・ベイル・レイン 13524番 (72)発明者アダムズ，マーク・ディアメリカ合衆国20878メリーランド州ノース・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番

Claims

【特許請求の範囲】 1. （a）図1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（b）図1のアミノ酸1〜380を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（c）図1のアミノ酸1〜316を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（d）図1のアミノ酸267〜316を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（e）図1のアミノ酸40〜316を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（f）（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）のポリヌクレオチドにハイブリッド形成することができ、かつ、そのポリヌクレオチドと少なくとも70%同一なポリヌクレオチド、（h）（a）、（b）、（c）、（d）、（e）又は（f）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片、からなる群より選択される要素を含む単離されたポリヌクレオチド。 2. そのポリヌクレオチドがDNAである請求項1のポリヌクレオチド。 3. 図1に記載のアミノ酸267〜316を含むポリペプチドをコードする請求項2のポリヌクレオチド。 4. （a）ATCC寄託番号75698に含まれるDNAによって発現されるアミノ酸配列を持つ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（b）（a）のポリヌクレオチドにハイブリッド形成することができ、かつ、そのポリヌクレオチドと少なくとも70%同一なポリヌクレオチド、（c）（a）又は（b）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片、からなる群より選択される要素を含む単離されたポリヌクレオチド。 5. 請求項2のDNAを含有するベクター。 6. 請求項5のベクターで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。 7. 請求項6の宿主細胞から該DNAによってコードされるポリペプチドを発現させることからなるポリペプチドの生産法。 8. 請求項5のベクターで細胞を遺伝子操作することからなる、ポリペプチドを発現させることができる細胞の作出法。 9. （a）図1の推定アミノ酸配列を持つポリペプチド、（b）図1に記載のアミノ酸1〜380を含むポリペプチド、（c）図1に記載のアミノ酸267〜316を含むポリペプチド、（d）図1に記載のアミノ酸40〜316を含むポリペプチド、（e）図1に記載のアミノ酸1〜316を含むポリペプチド、（f）（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）のポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体、（g）ATCC寄託番号75698のcDNAによってコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体、からなる群より選択される要素を含むポリペプチド。 10．図1のアミノ酸267〜アミノ酸316を含む請求項9のポリペプチド。 11．請求項9のポリペプチドに対する抗体。 12．請求項9のポリペプチドの活性を阻害する化合物。 13．請求項9のポリペプチドを活性化する化合物。 14．TGFα-HIを必要とする患者の処置法であって、請求項9のポリペプチドの治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 15．TGFα-HIを阻害する必要のある患者の処置法であって、請求項12の化合物の治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 16．ポリペプチドの治療有効量が、該ポリペプチドをコードするDNAを該患者に与え、該ポリペプチドを生体内で発現させることによって投与される、請求項 14の方法。 17．TGFα-HI受容体を発現させる細胞タイプを含有する反応混合物とスクリーニングすべき化合物とを接触させ、その化合物が該受容体からのシグナルを生じさせるかどうかを決定することによって、その化合物が有効なアゴニストであるかどうかを決定することからなる、請求項9のポリペプチドに対するアゴニストとして活性な化合物の同定法。 18．TGFα-HI受容体を発現させる細胞タイプを含有する反応混合物とスクリーニングすべき化合物とを接触させ、該化合物の結合後に該受容体から生成するシグナルの欠如を検出することによって、その化合物が有効なアンタゴニストであるかどうかを同定することからなる、請求項9のポリペプチドに対するアンタゴニストとして活性な化合物の同定法。 19．請求項1のポリヌクレオチド中の突然変異を検出することからなる、疾患又は疾患に対する罹病性の診断法。 20．宿主から得た試料中の請求項9のポリペプチドの存在について分析することからなる診断法。