JP2001514517A

JP2001514517A - 修飾泡沫状ウイルスエンベロープタンパク質の発現

Info

Publication number: JP2001514517A
Application number: JP53938598A
Authority: JP
Inventors: レテビルム，アクセル; リンデマン，デイルク; ビンテル，アラン・ジヤン
Original assignee: トランスジエヌ・エス・アー
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2001-09-11
Also published as: DE69829174D1; EP0977881B1; CA2199989A1; EP0977881A1; ATE290093T1; ES2236888T3; AU733948B2; AU6110698A; DE69829174T2; WO1998040507A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも修飾ＦＶエンベロープタンパク質を含むタンパク質を発現させる構築物、得られるタンパク質および偽型ウイルス粒子の産生を可能にする補完細胞系に関する。更に本願は、該粒子を含む医薬組成物及び疾患治療法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】修飾泡沫状ウイルスエンベロープタンパク質の発現レトロウイルス科のサブグループである泡沫状ウイルス（ＦＶ）はそのユニークな複製法と遺伝子移入ベクターとしての潜在的用途により科学的関心を集めている（３５）。ＦＶは、例えばヒト集団にＦＶ抗体が存在せず、自然ＦＶ感染が良性経路を辿り、宿主細胞範囲が非常に広く、ＦＶゲノムの寸法によりパッケージング限度が広いなどのこのウイルス群の固有の性質により、遺伝子送達システムの開発に理想的なツールであり得ると記載されている（４，３０，３２）。しかし、このウイルス群の分子生物学的な情報は限られているため、特にマウスレトロウイルスに由来するもののように安全なパッケージング細胞系及びベクターは開発されていない（２７）。例えば、ＦＶは複雑なゲノム構造をもつＤＮＡウイルスである。ＬＴＲ（長い末端反復配列）、パッケージング領域並びにｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加え、ｅｎｖと３’ＬＴＲの間に位置するｂｅｌ１、ｂｅｌ２、ｂｅｌ３、ｂｅｔ、ｂｅｏ及びｂｅｓ等の数個の遺伝子も含む。ｅｎｖ遺伝子は１３０ｋＤａグリコシル化前駆体をコードし、この前駆体は切断されると、表面（ＳＵ）及び膜貫通（ＴＭ）タンパク質を生じる（図１及び４参照）。ＴＭサブユニットは、その３’部分に細胞質尾部につながる疎水性残基から成る膜貫通アンカー領域を含む（図４Ａ）。更に、ＦＶはスプライスしたｍＲＮＡからＧａｇタンパク質とは別にそのＰｏｌタンパク質を発現し、ＦＶゲノムパッケージング及び粒子アセンブリのメカニズムや、細胞外粒子に多量の逆転写ＤＮＡが存在する意味は殆ど分かっていない（１０，１８，３９）。他のユニークな特徴としては、Ｇａｇ前駆体タンパク質の核局在（３１，４０）や、おそらくＥＲにＥｎｖ前駆体タンパク質が保持される結果として主に細胞質内小胞に出芽すること（１３）などが挙げられる。モロニーのレトロウイルス系遺伝子移入ベクターは現在主要なビークルであり、多種多様な細胞型に高い効率で安定に遺伝子を移入することができる（２０）。このベクター系の最大の欠点は、宿主細胞範囲が限られており、ヒト細胞に感染できない場合もある点である（（１）で報告）。最近、水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（６，３８）又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質（２，３４）等の外来エンベロープタンパク質による偽型化を用いた数種の方法でこれらの欠点を克服できることが判明した。しかし、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は産生細胞に高毒性であり、安定なＶＳＶ− Ｇパッケージング細胞系を作製することはできなかった（８，２２，３７）。本発明は少なくとも１種の修飾ＦＶエンベロープタンパク質を含むタンパク質の発現用構築物に関する。本発明による好適ＦＶはヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）であるが、他のウイルス（例えばサルＦＶ）も使用できる。修飾は、上記修飾ＦＶエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質の１もしくは数個のアミノ酸（ａａ）の突然変異、欠失、置換及び／又は付加の少なくとも１種又はその組み合わせから構成され得る。このような修飾は細胞質尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔａｉｌ）に導入するのが好ましい。有利には、修飾ＦＶエンベロープタンパク質はａａ９７５又はより好ましくは９８１で切断されている。切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は終止コドンまで延びていてもよいし、あるいは場合により原ＦＶｅｎｖタンパク質の１又は数個の残基を終止コドンの前に含んでいてもよい。更に、本発明の構築物は、成熟修飾ＦＶエンベロープタンパク質又はその前駆体又は種々の起源の配列の融合により得られるキメラタンパク質を発現することができる。特に好適な態様では、本発明で使用される修飾ＦＶｅｎｖタンパク質は非ＦＶエンベロープタンパク質の全部又は好ましくは一部を更に含む融合タンパク質である。適切な非ＦＶウイルスの例としては、ニワトリレトロウイルス、ウシレトロウイルス、ネコレトロウイルス、マウスレトロウイルス（例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、特にモロニーＭｕＬＶ（ＭｏＭｕＬＶ）、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭｕＬＶ）、特にＦＢ２９株、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ））、霊長類レトロウイルス（例えばＧａＬＶ、ＶＳＶ、又はＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）もしくはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）等のレンチウイルスが挙げられる。ＦＶと非ＦＶｅｎｖタンパク質の融合は、様々な位置で行うことができる。ＴＭサブユニット内での融合が有利である。第１の選択として、融合は、該ＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域内に存在する。好適な例としては、ＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞外領域及び５’部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の３’部分及び細胞質領域を含むことを特徴とするタンパク質があげられる。第２の選択としては、融合は、ＦＶおよび非ＦＶエンベロープタンパク質の切断部位内に存在する。好適な例として、ＨＦＶエンベロープタンパク質のＳＵ領域並びに切断部位の全て及び一部、並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特に、ＳＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域を含むＴＭ領域を含むことを特徴とするタンパク質があげられる。ＦＶエンベロープタンパク質の切断部位を非ＦＶエンベロープタンパク質由来の切断部位と置換することも考えられる。その他の選択としては、融合は、ＦＶおよび非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域と細胞質領域の接点あるいは細胞質領域の内部に存在する。好適な例としては、ＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アンカー領域及び細胞質領域の全体又は部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の細胞質領域の全体又は部分を含むことを特徴とするタンパク質があげられる。特に好適な態様では、本発明によるタンパク質は、細胞質領域の全部又は一部が非ＦＶウイルスエンベロープタンパク質、特にＭｕＬＶエンベロープタンパク質の細胞質領域の全部又は一部で置換されたＨＦＶタンパク質エンベロープから構成される。有利には、融合タンパク質はＭｕＬＶ細胞質領域を修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質と融合することにより構成される。本発明で使用されるＭｕＬＶ細胞質領域はプロセッシングされていてもよいし、プロセッシングされていなくてもよい。「プロセッシングされている」とは、対応するレトロウイルスプロテアーゼにより通常認識される開裂部位を含むことを意味し、「プロセッシングされていない」とはこのような部位を含まないか又は機能的でない（突然変異、欠失又は截断）ことを意味する。本発明の好適構築物は、以下の文中でＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶと呼ぶ融合タンパク質を発現させることが可能な構築物である。あるいは、本発明に係る好ましいタンパク質は、細胞質尾部がＳＩＶエンベロープタンパク質の細胞質領域の全体又は部分と置換されているＨＦＶエンベロープタンパク質である。このＳＩＶエンベロープタンパク質には、天然の宿主、アカゲザル（ベンガルザル）の体内で複製されるＳＩＶ粒子内に存在する、１６４個のアミノ酸から成る細胞質尾部を有する長鎖型と、１８個のアミノ酸のみから成る短鎖型の２種類が存在する。サルから単離されたウイルスが、ヒト細胞株において培養される場合に、この短鎖型が選択される。本発明の構築物は、ＦＶｅｎｖタンパク質をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又はアクセプタースプライシング部位を突然変異させたものでもよい。本発明の構築物は、修飾ＦＶｅｎｖタンパク質をコードする配列を転写及び翻訳できるように調節エレメントを含み得る。特に、ＦＶｅｎｖをコードする配列の上流に慣用組換え技術により適切なプロモーターを作動的に連結することができる。このようなプロモーターは原核、真核又はウイルスのいずれの起源でもよく、構成性でも調節性でもよい。このような調節エレメントは当業者に周知である。本発明の構築物は修飾ＦＶｅｎｖタンパク質を発現する細胞の検出及び単離を可能にする選択遺伝子を更に含んでもよく、このような態様も本発明の範囲内である。本発明の関連では、選択遺伝子は修飾ＦＶｅｎｖタンパク質の発現を誘導して２シストロン転写物を生じるプロモーターの転写制御下に置いてもよいし、付加的プロモーター領域の制御下に置いてもよい。考えられる選択遺伝子は多数あり、例えば抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈＦｒ）遺伝子、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子又はキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。本発明の構築物は任意の適当なベクター、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター）又はプラスミドに挿入することができる。適当なベクターの選択肢は広く、当業者の能力の範囲内である。このようなベクターは組込み型でもよいし、そうでなくてもよい。複製適合性（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルス粒子を生じる可能性を減らすためには、構築物がレトロウイルスＬＴＲとパッケージング領域を欠損していると有利である。本発明は上記発現構築物により発現される融合タンパク質及びＦＶｅｎｖタンパク質を含む偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ウイルス粒子にも関する。ＦＶｅｎｖタンパク質は天然ＦＶｅｎｖタンパク質、その一部又はその修飾物から誘導することができる。好適態様では、偽型ウイルス粒子は本発明による構築物により発現される修飾ＦＶｅｎｖタンパク質をその表面に含む。本発明の偽型ウイルス粒子は、組換えレトロウイルスベクターを補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）細胞系にトランスフェクトすることにより作製することができる。このような技術は公知であり、多数の従来技術文献に記載されている。本発明で使用されるレトロウイルスベクターは、上記のような任意のレトロウイルスに由来する少なくとも５’ＬＴＲ、パッケージング領域及び３’ＬＴＲと、更に目的ポリペプチドを産生するためにリボザイム、アンチセンスＲＮＡ分子又はｍＲＮＡを発現することが可能な遺伝子を含む。非限定的な例としてサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮα、β又はγ）、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（ＤＦＴＲ）、ジストロフィン、凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ等）、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−１、ＨＰＶ抗原）、抗体、イムノトキシン、抗ＨＩＶ薬剤、増殖因子（線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ、血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦ）、アポトーシス誘導体（Ｂａｘ等）、アポトーシス阻害物（Ｂｃｌ２、Ｂｃｌｘ等）、細胞増殖抑制因子（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ）、アポリポタンパク質、一酸化窒素合成酵素（Ｎｏｓ）、酸素ラジカルスカベンジャー（ＳＯＤ、カタラーゼ等）、ガン抑制産物（ｐ５３、ｐ７３）及びマーカー等の治療用ポリペプチドが特に有用である。この一覧は限定的に列挙するものではない。更に、本発明において使用に供されるウイルスベクターは、ひとつ以上の遺伝子を天然型、切断した型、変異型又はハイブリッド型の形態で移転させる。遺伝子は、真核細胞質における発現を可能にするようなエレメントによって制御される。これらのエレメントには、どのような起源由来であってもよいプロモーター（レトロウイルスＬＴＲ又は内部プロモーター）が含まれる。このエレメントは細胞又は組織選択的因子に制御されるかあるいは応答する。本発明の別の目的は、偽型ウイルス粒子を産生することが可能な補完細胞系及び前記ウイルス粒子の製造方法を提供することである。本発明は更に、本発明の構成物を含む補完細胞系に関する。好ましくは、該補完細胞系は、ＦＶおよび非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域の接点又は細胞質領域の内部に融合が存在し、発現したタンパク質がＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アンカー領域及び細胞質領域の全体又は部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の細胞質領域の全体又は部分を含むことを特徴とする本発明の構成を含む。その他の好ましい態様では、タンパク質がＨＦＶΔ２ＭｕＬＶであることを特徴とする、タンパク質の発現に関する本発明の構成物を、該補完細胞系が含む。本発明の補完細胞系は任意の細胞、特に真核細胞に由来し得る。例えばマウス細胞系、医薬的に許容可能な細胞系（Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ等）又はヒト細胞系（例えば２９３又はＡ５４９）が考えられる。このような細胞系は本発明による構築物を第１の選択遺伝子とともにトランスフェクトすることにより作製することができる。その後、ＦＶｅｎｖに対する抗体を用いる免疫検出、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）又は他の任意の方法により、ｅｎｖ産生能の最も高い細胞が高レベルのＦＶｅｎｖタンパク質の発現に対してスクリーニングされる。あるいは、本発明の補完細胞系は、第１の選択遺伝子とは異なる第２の選択遺伝子と共に、より好ましくはＭｕＬＶ、ＦＢ２９、ＳＩＶ又はＨＦＶのウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する構築物を更に含んでいてもよい。好ましくは、ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子はＬＴＲ及びパッケージング領域をもたない別個の発現ベクターに担持される。選択及びスクリーニング段階を繰り返し、ｇａｇ／ｐｏｌ発現産物をも発現するｅｎｖ産生クローンを選択する。本発明の補完細胞系は組換えレトロウイルスベクターをパッケージングするために使用することができる。第１及び第２の選択遺伝子とは異なる第３の選択遺伝子又はマーカー遺伝子（例えばＬａｃＺ）を発現する慣用レトロウイルスベクターを使用して力価を試験することができる。その結果、高力価の偽型ウイルス粒子を産生する細胞を選択し、安定な補完細胞系を提供するように培養することができる。細胞は通常実施されているように後記方法で一過性試験してもよい。本発明の別の態様によると、本発明の偽型ウイルス粒子の製造方法が提供される。このような方法は、（１）本発明の補完細胞系に組換えレトロウイルスベクターを導入する段階と、（２）前記偽型ウイルス粒子の産生を可能にする適切な条件下で前記補完細胞系を培養する段階と、（３）細胞培養物から偽型ウイルス粒子を回収する段階を含む。好ましくは、偽型ウイルス粒子は細胞培養物上清から回収されるが、細胞溶解工程も考えられる。慣用技術（例えばスクロース又はＣｌＣｓ勾配での超遠心分離）により偽型ウイルス粒子を更に精製してもよい。有利には、こうして製造した偽型ウイルス粒子は（好ましくはポリブレンの不在下で）多種多様の細胞に感染することができ、場合によってはヒト血清による失活を阻止することができる。本発明の別の態様によると、本発明の偽型ウイルス粒子に感染した、又は本発明の方法により得られる哺乳動物宿主細胞も提供される。このような宿主細胞の非限定的な例としてはヒト上皮細胞、肺細胞、筋細胞、肝細胞、造血細胞、繊維芽細胞及びリンパ球が挙げられる。本発明の感染性偽型粒子及び哺乳動物細胞はワクチン又は治療薬として種々の疾病の予防又は治療に利用できる。本発明の別の目的は、治療又は予防に有効な量の本発明の、又は本発明の方法により得られる偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を治療薬として含有する医薬組成物を提供することである。このような医薬組成物は慣用方法で製造することができる。特に、本発明の粒子又は哺乳動物細胞をキャリヤー、希釈剤、アジュバント又は賦形剤等の当該技術分野で周知の適当な物質と組み合わせることができる。医薬組成物の特定組成は例えば発現させようとする目的ポリペプチド、所望の作用部位、投与方法及び治療対象等の種々のパラメーターによって異なる。このような組成は当業者が通常の知識によって決定できる。典型的には、偽型粒子は生理食塩水、燐酸緩衝生理食塩水等の希釈液あるいはその他の医薬上許容される希釈液中に溶液として調製される。接種経路は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、気管内、胃内および腫瘍内投与が可能である。投与は、単回あるいは反復投与が可能である。投与量は、個体の体重、性別、年齢、健康状態等および治療対象疾患に応じて調整される。一般には、本発明の偽ウイルス粒子を約１０⁴から約１０¹³プラーク形成単位（pfu）／投与、より有効には約１０⁵から約１０¹⁰、好ましくは約１０⁶から約１０⁹投与する。本発明の組成物は、標的細胞を偽型ウイルス粒子に予め暴露した後、形質導入された細胞を哺乳動物（ヒト）に導入することにより、ex vivoで哺乳動物に導入が可能であり、又は、静脈内若しくは局所的に、罹患組織に注射投与することが可能である。本発明の最後の態様によると、遺伝病又は任意の病原遺伝子により誘発される疾病（例えば癌又はウイルス誘発病）の治療方法も提供され、該方法は治療を必要とする対象に治療に有効な量の本発明の偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を投与することを特徴とする。本発明の上記及び他の目的は以下の実施例及び添付図面から容易に理解されよう。但し、これらの態様は本発明の全範囲を網羅するものではない。特に、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）粒子へのヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）エンベロープタンパク質の取込みは、一過性トランスフェクションパッケージングセルシステムで試験した。ここで、効率は低いが、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質でＭｕＬＶ粒子を偽型化できることを報告しておく。ＨＦＶ細胞質尾部を完全又は部分的に除去すると、ＨＦＶに仲介される感染性が失われるか又は低下し、ＭｕＬＶ粒子の偽型化におけるＨＦＶエンベロープ細胞質尾部の役割が予想された。ＨＦＶエンベロープ細胞質尾部に存在するＥＲ保持シグナルを突然変異させても偽型レトロウイルスベクターの相対感染性は増加しなかった。他方、プロセッシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質領域を截断ＨＦＶエンベロープタンパク質に融合したキメラエンベロープタンパク質は、ＭｕＬＶ粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みの増加の結果として高いＨＦＶ特異的感染性を示した。図面の簡単な説明図１ＨＦＶエンベロープ発現構築物の模式図である。ＨＦＶ（白部分）及びＭｕＬＶ（影部分）エンベロープのＴＭ成分の細胞外、膜間（膜貫通アンカー領域Ａとも称される）及び細胞質領域を（１１，２４）に従って示す。模式図の下に野生型ＨＦＶ及びＭｕＬＶタンパク質のアミノ酸配列も示す。ＨＦＶエンベロープ構築物のアミノ酸位置を目盛りに示す。ＨＦＶエンベロープの細胞質領域でＥＲ保持（１３）関与する配列モチーフの位置を黒部分として示し、突然変異配列を斜線部分として示す。ＭｕＬＶエンベロープタンパク質の完全長細胞質領域におけるＭｕＬＶプロテアーゼの切断部位は２本の逆向き矢印により示す。図２種々のエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ粒子の感染性を示す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより作製した種々の偽型ＭｕＬＶ粒子をＮＩＨ３Ｔ３（グレーの棒）又はＱＴ− ６（黒の棒）細胞に感染させた。形質導入から４８時間後にＧＦＰ発現細胞の百分率をＦＡＣＳ分析により定量した。ＧＦＰ発現細胞の平均蛍光はモック感染細胞の１００〜３００倍であった。偽型化に使用した各エンベロープ構築物をグラフのｙ軸に示す。各構築物のＧＦＰ発現細胞の平均百分率を対応する標準偏差と共にｘ軸に示す。各構築物を２〜６回試験した。図３ＨＦＶエンベロープ特異的感染性の中和を示す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりｙ軸に示すような種々のエンベロープタンパク質で偽型化合したＭｕＬＶ粒子を作製した。ＮＩＨ３Ｔ３（Ａ）又はＱＴ−６（Ｂ）細胞に加える前に、上清（１ｍｌ）を抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清（１：６０）（黒の棒）又は健康な個体からのヒト血清（１：６０）（グレーの棒）と共に３７ ℃で１時間インキュベートした。４時間後に上清を吸引し、新鮮な成長培地に交換した。形質導入から４８時間後に図２の説明に記載したようにＧＦＰ発現細胞の百分率を測定した。実験は中和性サル血清及びこれに抗ＨＦＶ表面ウサギ血清（データは示さず）を加えて２回実施し、その結果、ＨＦＶエンベロープ偽型レトロウイルスベクターの感染性に同様の相対阻害が生じた。図４ＨＦＶ／ＳＩＶキメラエンベロープ構築物の模式図である。ＨＦＶＷＴ及びＳＩＶはヒト泡沫状ウイルスおよびサル免疫不全ウイルス（分子クローンｍｍ２５）エンベロープ遺伝子の野生型である。ＨＦＶ由来の領域は白で、ＳＩＶ由来の領域は灰色で示される。ＳＵおよびＴＭを分断している切断部位は、縦線で示される。ＲＲＥはｒｅｖ応答性エレメントを示し、Ａは膜貫通アンカー領域を示す。膜貫通アンカー領域の５’側の細胞外領域及び膜貫通アンカー領域の３’側の細胞質領域も示す。Ｅｎｖ１乃至９は、ＳＩＶエンベロープの長鎖型（Ｅｎｖ１、３及び５）又は短鎖型（Ｅｎｖ２、４、６、７、８及び９）との融合を含むＨＦＶ／ＳＩＶキメラｅｎｖ構築物を示す。図５融合部位に隣接するＨＦＶ、ＳＩＶ及びｅｎｖキメラ遺伝子の配列並びにＳＩＶｅｎｖ由来の短鎖及び長鎖細胞質尾部のアミノ酸配列である。Ａは、ＨＦＶおよびＳＩＶｍｍ２５１ｅｎｖ遺伝子及びＨＦＶおよびＳＩＶｍｍ２５１の膜貫通アンカー領域内の融合（Ｃｈｉｍ）を図示する。ＨＦＶおよびＳＩＶエンベロープ内の共通アミノ酸配列を太字で示し、下線部は、ＨＦＶおよびＳＩＶエンベロープの膜貫通アンカー領域を示す。Ｂは、ＨＦＶおよびＳＩＶｍｍ２５１エンベロープのＳＵおよびＴＭ領域間の切断部位に位置する融合を図示する。切断部位の共通（コンセンサス）配列を太字で示し、切断部位は、アミノ酸配列の空欄で示す。Ｃは、ＨＦＶエンベロープの細胞質尾部のＳＩＶｍｍ２５１エンベロープの細胞質尾部による置換を図示する。膜貫通アンカー領域を下線で示し、（１４１）は、ＳＩＶ長鎖細胞質尾部由来の最後の１４１アミノ酸を示す。Ｄは、ＳＩＶエンベロープ由来の長鎖および短鎖細胞質尾部のアミノ酸配列を示す。膜貫通アンカー領域を下線で示し、＊は、終結コドン、（１４１）は、ＳＩＶ長鎖細胞質尾部由来の最後の１４１アミノ酸を示す。図６ＳＩＶｍｍ２５ｅｎｖ内部３’スプライス部位の破壊を示す。最上位に記載されているアミノ酸配列はＳＩＶｍｍ２５１ｅｎｖ遺伝子由来であり、＊はヒト化ｅｎｖ遺伝子の終結コドンを示す。ＧをＡに変異させることにより３’スプライス部位が破壊されていることを示す。Ｔａｔ／Ｒｅｖエキソン２は配列ＴＡＧＡＣＴから始まるが、読取枠はｅｎｖの読取枠と異なっている。以下、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。実施例全構築は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ１９８２に記載されているような標準組換えＤＮＡ技術を使用することにより実施する。細胞系はＡＴＣＣ等の培養寄託機関から入手でき、標準条件で培養する（ＮＩＨ３Ｔ３：ＣＲＬ１６５８、Ｍｖ．１．Ｌｕ：ＣＣＬ６４、ＨＴ１０８０：ＣＣＬ１２１、ＢＨＫ２１：ＣＣＬ１０、ＱＴ２６：ＣＲＬ１７０８及び２９３：ＣＲＬ１５７３）。ＨＦＶｅｎｖタンパク質の配列は既に公知であり、ＥＭＢＬデータベースにおいて利用可能である（受入番号４０７７２５）。実施例１：ＨＦＶ／ＭＬＶキメラ１．ＦＶｅｎｖ発現構築物の作製完全長ｅｎｖオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＨＦＶプロウイルスクローンｐＨＳＲＶ１（２８）の３０７６ｂｐＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入することにより、ヒトＦＶ単離体（ＨＦＶ）のエンベロープ遺伝子の真核発現構築物を作製した。この構築物をｐＣＨＦＶｗｔと名づけ、図１に示す突然変異及びキメラＨＦＶエンベロープタンパク質を作製するために使用した。要約すると、鋳型としてＨＦＶ及び／又はＭｕＬＶｅｎｖ遺伝子と、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドでポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより截断又はキメラｅｎｖ構築物を作製した。突然変異体を上記基本ベクターに挿入し、配列決定して部位外の突然変異を排除した。３種の突然変異ＨＦＶエンベロープ構築物を作製した。ｐＣＨＦＶΔ１とｐＣＨＦＶ Δ２はそれぞれａａ９７５又は９８１で截断されたＨＦＶエンベロープタンパク質をコードする。ｐＣＨＦＶΔ２には、元のＨＦＶｅｎｖ配列に存在しないＣ末端アルギニンを付加した。Ｆｌｕｇｅｌら（１１）により提案されているＨＦＶエンベロープ領域構造に従い、截断の結果、細胞質領域は完全（ｐＣＨＦＶ Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶ Δ２）に除去された。最後に、ｐＣＨＦＶＳＳＳ構築物はセリン残基により置換された膜貫通（ＴＭ）タンパク質の細胞質尾部のＣ末端に三重リシンモチーフ（ａａ９８４〜９８６）をもつＨＦＶエンベロープタンパク質を産生する。この配列モチーフはＨＦＶエンベロープのＥＲ保持に関与することが示されている（１３，１４）。ＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロセッシングされているか又はプロセッシングされていない細胞質領域をコードする配列のＣ末端融合により合計６個のキメラエンベロープタンパク質を構築した（１６，１７）。ｐＣＨＦＶ Δ１ＭｕＬＶＲ−、ｐＣＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶＲ−及びｐＣＨＦＶＳＳＳＭｕＬＶＲ −は上記３種の突然変異とプロセッシングされているＭｕＬＶエンベロープ細胞質領域（ａａ６３４〜６４９）から構成される融合タンパク質をコードし、ｐＣＨＦＶ Δ１ＭｕＬＶ、ｐＣＨＦＶΔ２ＭｕＬＶ及びｐＣＨＦＶＳＳＳＭｕＬＶはＣ末端にプロセッシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質領域（ａａ６３４〜６６５）を含むそれぞれの融合タンパク質をコードする。ＭｕＬＶｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６０）、エコトロピック（ｐＨＩＴ１２３）及びアンホトロピック（ｐＨＩＴ４５６）ＭｕＬＶエンベロープの発現構築物はＡ．Ｋｉｎｇｓｍａｎ（３３）から提供された。レトロウイルスベクターＳＦＧＧＦＰＳ６５Ｔは、ＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターＳＦＧ（５，２２）のクローニング部位に挿入された緑色蛍光タンパク質のヒト化ＯＲＦ（７）（Ｍ．Ｖｏｇｅｌの寄贈品）を含み、ＭＦＧ．ＳＮＬＳ−ＬａｃＺ（２２）はＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）に融合したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎの寄贈物）を含む。ＶＳＶ−ＧＯＲＦを含むプラスミドｐＳＶＧＬ−１（２９）（Ｊ．Ｒｏｓｅの寄贈物）からの１．６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＩＴベクターに挿入することにより、ＶＳＶ−Ｇ発現構築物を作製した。２．種々のＨＦＶｅｎｖタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ粒子の感染性ほぼ従来技術（３３）に記載されているようなｐＨＩＴパッケージングシステムを使用して組換えレトロウイルス粒子を作製した。要約すると、ＭｕＬＶｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６０）の発現構築物、ＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターＳＦＧＧＦＰＳ６５Ｔ及び上記種々のエンベロープ発現構築物を２９３Ｔ細胞（９）に一過性同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８〜７２時間後にウイルス上清を回収した。同一プラスミドをトランスフェクトした各トランスフェクション産物からの上清をプールし、濾過（０．４５μｍ細孔寸法）し、最終濃度８μｇ／ｍｌまでポリブレンを加え、上清を直接使用するか又は使用まで−８０℃で保存した。レトロウイルス形質導入後にＧＦＰタンパク質を発現する標的細胞をＦＡＣＳｃａｎでＦＡＣＳ分析により同定し、ＬｙｓｉｓＩＩａｎｄＣｅｌｌＱｕｅｓｔＳｏｆｔｗａｒｅパッケージ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して陽性細胞の数を定量した。ｐＣＨＦＶｗｔ発現構築物を使用した初期実験によると、効率は低いが、ＨＦＶｗｔエンベロープタンパク質でＭｕＬＶ粒子を偽型化することができ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入できることが判明した（図２）。ＨＦＶエンベロープタンパク質は、発現細胞のＥＲへの保持を誘導するシグナル配列をその細胞質領域に含む（１３，１４）。従って、細胞質的に截断又は突然変異を含むＨＦＶエンベロープタンパク質をコードする３種の構築物ｐＣＨＦＶ Δ１、ｐＣＨＦＶ Δ２及びｐＣＨＦＶＳＳＳを試験し、ＨＦＶエンベロープの細胞質領域とそのＥＲ保持が偽型効率に及ぼす影響を調べた。野生型タンパク質に既に観察されている低い偽型活性は、ＨＦＶエンベロープの細胞質領域を完全（ｐＣＨＦＶ Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶ Δ２）に除去すると失われるか又は低下する（図２）。細胞質ＥＲ保持シグナルの突然変異（ｐＣＨＦＶＳＳＳ）はＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞表面発現を増加することが従来示されている（１３）。しかし、このような突然変異タンパク質でウイルス粒子を偽型化しても、これらのウイルスの感染性は増加しなかった（図２）。ＨＦＶ細胞質領域を除去又は修飾しても偽型ウイルスの感染効率を増加することはできなかったので、次に第２のアプローチを使用し、ＨＦＶ細胞質領域をＭｕＬＶ細胞質領域で置換するか又はＭｕＬＶ細胞質領域を修飾完全長ＨＦＶエンベロープと融合して所望の効果が得られるか否かを試験した。ＭｕＬＶエンベロープの細胞質領域はウイルス粒子内でＭｕＬＶプロテアーゼによりプロセッシングされることが示された（１６，１７）。既にプロセッシングされている形態のＭｕＬＶエンベロープタンパク質を細胞で発現させると、大きい多核シンシチウムが形成され、ウイルス感染性が低下した（２４，２６）。従って、上記３種の突然変異体とＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロセッシングされているか（ＭｕＬＶＲ−）又はプロセッシングされていない（ＭｕＬＶ）細胞質領域のＣ末端融合タンパク質を作製し、これらのキメラエンベロープタンパク質で偽型化した粒子の感染性をＮＩＨ３Ｔ３細胞で試験した。興味深いことに、１種の突然変異体であるＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶタンパク質で偽型化したウイルスは野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒子よりも１０〜２０倍高い活性を示した（図２）。ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶタンパク質による感染性のこの増加はＮＩＨ３Ｔ３又はマウス細胞に特異的ではなく、ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で被覆したウイルス粒子を感染させることができないウズラ繊維芽細胞系ＱＴ−６でも同様の結果が得られた（図２）。これらの細胞において、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒子の感染性はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化した粒子よりも一貫して高かった。分析した他の全タンパク質は、どちらの細胞系でも野生型ＨＦＶエンベロープよりも低いか又は同等の相対感染性をもつ偽型ウイルスを生じた（図２）。更に、プロセッシングされているＭｕＬＶ細胞質領域を含むキメラＨＦＶエンベロープタンパク質をＬ９２９細胞でレトロウイルスベクターにより発現させると、プロセッシングされていないＭｕＬＶ細胞質領域をもつ対応するタンパク質よりも高い融合活性を示した（データは示さず）。この結果は、ＭｕＬＶエンベロープの細胞質領域がキメラエンベロープタンパク質として発現されるときにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）等の外来エンベロープタンパク質の融合活性を制御できることを示すデータ（３６）に一致する。更に、種々のエンベロープタンパク質で偽型化した核局在β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするレトロウイルスベクターを含む上清を種々の種の細胞系で力価測定した（表１）。より詳細に説明すると、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清の系列希釈液で感染させる２４時間前に標的細胞（１×１０⁴細胞／ウェル）をプレーティングした。感染から４８時間後に青いフォーカスの数を２回数え、力価を計算した。２回測定の値は３倍の範囲であった。表に示す結果は、指定細胞系で全て同一トランスフェクションからの無細胞上清を用いて独立して２回実施した力価測定の代表値であり、２回の実験で再現性のある相対力価が得られた。偽型粒子を含む上清をＮＩＨ３Ｔ３細胞中で６回まで力価測定し、再現性のある結果を得た。ＨＦＶｗｔエンベロープタンパク質又はＨＦＶ Δ ２ＭｕＬＶキメラタンパク質で偽型化したレトロウイルス粒子は、マウス細胞以外にヒト、ミンク及びハムスター由来の細胞にも感染させることができた（表１）。ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で偽型化したレトロウイルスベクターの力価は、使用した標的細胞に依存して野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した場合の力価よりも８〜３５倍高かった。３．ＨＦＶ特異的抗血清によるＨＦＶｅｎｖ偽型粒子の感染性の中和種々のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ粒子の感染性がＨＦＶエンベロープに特異的であることを確認するために、偽型粒子を標的細胞に加える前に抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清と共にプレインキュベートした（３）。アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したウイルス粒子をＨＦＶ特異的抗血清と共にプレインキュベートした場合の感染性は、これらのウイルスを標準熱不活化ヒト血清（図３）又はモックインキュベートしたウイルス粒子（データは示さず）と共にプレインキュベートした場合に比較して低下しなかった。他方、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質又はＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラで偽型化した粒子の感染性は、ＨＦＶ特異的抗血清と共にプレインキュベートすると完全に失われたが、ヒト対照血清と共にプレインキュベートした場合には失われなかった（図３）。ＨＦＶエンベロープ特異的感染性のこの中和は、ＮＩＨ３Ｔ３（図３Ａ）及びＱＴ−６（図３Ｂ）細胞で観察された。ＨＦＶエンベロープタンパク質のバキュロウイルス発現ＳＵ領域に対するウサギ血清を使用した実験でも、ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したウイルス粒子の同様の特異的中和が得られた（データは示さず）。４．ＨＦＶｅｎｖタンパク質の発現及び粒子取込み一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の放射性免疫沈降分析（ＲＩＰＡ）により、種々のＨＦＶエンベロープタンパク質の発現及びＭｕＬＶ粒子への取込みを測定した。ＤＮＡ（ｐＨＩＴ６０、ＳＦＧＧＦＰＳ６５Ｔ及び種々のｅｎｖ構築物）の添加から４８時間後に細胞を［³⁵Ｓ］メチオニンで約２０時間代謝標識した。上清中に存在するウイルス粒子を溶解バッファーで可溶化する前に２０％スクロースクッションで２５０００ｒｐｍで遠心分離してペレット化した。次に、試料を免疫沈降させた。ウイルス粒子とその対応する細胞溶解物をＨＦＶ特異的チンパンジー血清又は抗ＭｕＬＶｇａｇハイブリドーマ上清で免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。ペレット化ウイルス又は細胞溶解物からの免疫沈降物中のＨＦＶ特異的バンドはＨＦＶｅｎｖ発現構築物をトランスフェクトした試料でしか観察されず、ＭｕＬＶアンホトロピックエンベロープタンパク質を発現する試料又はモックトランスフェクト培養物では観察されなかった。ＨＦＶｅｎｖをトランスフェクトした細胞の細胞溶解物の免疫沈降物には１３０及び１１０ＫＤの２つの主要なＨＦＶエンベロープ前駆体バンドが観察された（１２，２１）。更に、より長時間暴露後にはプロセッシングされている〜９０ＫＤＳＵ及び〜４５〜５０ＫＤＴＭタンパク質に対応する２つのバンドを観察することができた。種々のＨＦＶ突然変異体をトランスフェクトした細胞試料におけるＴＭタンパク質の見掛寸法は種々異なり、個々のタンパク質のＴＭ部分が修飾されたことを示した。ＨＦＶＳＳＳＭｕＬＶＲ−及びＨＦＶＳＳＳＭｕＬＶは細胞発現の明白な低下を示したが、それ以外は、トランスフェクトした細胞における種々のエンベロープタンパク質の定常状態レベルには並の差異しか観察されなかった。ペレット化ウイルス粒子の免疫沈降物には両者エンベロープ前駆体タンパク質とプロセッシングされているＳＵ及びＴＭタンパク質も検出された。他方、一般に前駆体タンパク質に対するプロセッシングされているタンパク質の相対比はウイルス粒子免疫沈降物のほうが細胞溶解物よりも高かった。興味深いことに、ウイルス粒子の個々の免疫沈降物におけるプロセッシングされているＳＵ及びＴＭタンパク質の量と、対応する偽型粒子の相対感染性（図２）の間に良好な相関を観察することができた。最高の相対感染性をもつ偽型粒子を生じたＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラエンベロープはＲＩＰＡでも最強のＳＵ及びＴＭバンドを示した。粗ウイルスペレット又は抗ｇａｇハイブリドーマ上清で免疫沈降させた沈降物で個々のウイルス粒子調製物中のＭｕＬＶｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の量を測定した処、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープトランスフェクションを除く全試料で同様であった。この試料は粒子会合ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の有意低下を示し、この調製物には他のウイルスペレットよりも少数のＭｕＬＶ粒子しか存在しないことを示した。従って、各ウイルス粒子当たりのプロセッシングされているＨＦＶＳＵ及びＴＭタンパク質の相対量は、ウイルス粒子調製物をＨＦＶ特異抗体で免疫沈降させた沈降物から予想されるよりも更に高いと思われる。この現象の一因として、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子の感染性が他のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒子よりも高い結果、これらの粒子がＨＦＶｅｎｖタンパク質を発現しないトランスフェクト細胞により多量に吸収されるためであると考えられる。この結果、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子は上清から除去され得る。更に、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又はＶＳＶ−Ｇで偽型化したＭｕＬＶ粒子とは対照的に、ＨＦＶで偽型化したウイルスはポリブレン等のポリカチオンの不在下で感染性の低下を全く示さなかった（３０）。従って、一過性トランスフェクションによりＨＦＶエンベロープで偽型化したレトロウイルスベクターの相対力価は、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又はＶＳＶ−Ｇで偽型化した場合よりも過小評価されると思われる。但し、これらの現象を更に詳細に解明するには、ＨＦＶエンベロープで偽型化したウイルスによる感染に耐性のＨＦＶエンベロープを安定的に発現する細胞系を使用して更に進んだ実験を行う必要がある。５．ＦＶｅｎｖ遺伝子に配置したスプライスドナー及びアクセプター部位の失活更に、ＨＦＶエンベロープＯＲＦ（６３１０〜９２７６位）内に位置する内部ＨＦＶプロモーター（５’ＬＴＲの転写始点に対して８４１９位）から誘導されるＢｅｌ−１及びＢｅｔ転写産物は、ｅｎｖタンパク質のＴＭサブユニットのコーディング領域内のスプライスドナー（ＳＤ、９１１９位）及びスプライスアクセプター（ＳＡ、９２３７位）部位を有効に利用する。あるいは、これらのＳＤ及びＳＡ部位を利用してＨＦＶｅｎｖタンパク質をコードするｍＲＮＡをスプライスすると、潜在的エンベロープ／ｂｅｌ融合タンパク質が得られる。〜１７０ＫＤは免疫沈降によりＨＦＶ感染細胞で検出することができ、ｍＲＮＡはＨＦＶに感染したヒト繊維芽細胞からの全ｍＲＮＡのＲＴ（逆転写酵素）ＰＣＲにより検出することができる。ＳＤ（９１１９位）をＧＴ→ＧＧ突然変異により失活させると、１７０ＫＤエンベロープ融合タンパク質は消失するが、１３０ＫＤエンベロープ前駆体タンパク質の発現は変わらない。ｅｎｖ／ｂｅｌ融合タンパク質の生物学的機能とウイルス力価に及ぼす偽型ＭｕＬＶ粒子の影響については現在のところ不明である。要約すると、ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターを製造するためのシステムを作製した。ＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞質領域を前進的に欠失させると、遺伝子移入とウイルス粒子へのＨＦＶｅｎｖＳＵ及びＴＭサブユニットの取込みが低下するので、ＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞質領域はＭｕＬＶ粒子の偽型化に少なくとも部分的に関与していた。１種の欠失突然変異体であるＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープにプロセッシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質領域を付加すると、ＨＦＶ野生型エンベロープタンパク質に比較して感染性が１０〜２０倍増加し、偽型粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みが増加した。レトロウイルス力価は、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化することにより達せられる力価の８〜３５倍であった。標的細胞型によっては、遺伝子移入効率がＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したレトロウイルスベクターと同等以上のものもあった。野生型ＭｕＬＶエンベロープタンパク質の場合には、ウイルス粒子へのエンベロープの特異的取込みにおける細胞質領域の役割は不明である。細胞質尾部欠失突然変異体のうちには粒子会合エンベロープタンパク質が減少するものもあり（１５）、また、突然変異エンベロープタンパク質によっては粒子会合の低下を殆ど〜全く示さないものもあった（２５，２６）。本発明の結果は、エンベロープタンパク質の粒子会合、少なくともＭｕＬＶ粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みの増加におけるＭｕＬＶｅｎｖ細胞質領域の役割を裏付けるものである。最近、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇ（６，３８）又はＧＡＬＶエンベロープ（２，３４）等の外来エンベロープタンパク質でＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターを偽型化した結果、ウイルス安定性が増加し、宿主細胞範囲が広がり、所定の細胞型の形質導入効率が増加した。ＦＶの宿主範囲が広く、ヒト血清による失活を阻止し（３０）、ポリカチオンの不在下で種々の起源の細胞に有効に感染できる（未公開資料及び（３０））ため、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターは種々の細胞型に遺伝子を有効に導入するための有用な新規ツールになるであろう。ＶＳＶ−Ｇは産生細胞に高毒性であり、最近まで安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細胞系を作製することはできなかった（８，２２，３７）が、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープの一過性発現の結果、２９３Ｔ細胞で明白な毒性は生じなかった（データは示さず、（１９））。実施例２：ＨＦＶ／ＳＩＶｅｎｖキメラ本実施例は、ＨＦＶおよびＳＩＶエンペロープタンパク質のキメラエンベロープの構築について記載する。３種類の異なったキメラエンベロープが構築された。以下の異なったエレメントの配列はＧｅｎｂａｎｋにおいて、利用可能である。：受入番号Ｍ１９４９９のＳＩＶｍｍ２５１ゲノム、受入番号Ｘ０３９２２のＣＭＶプロモーター及び受入番号Ｕ５５７６３のｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＧＦＰ遺伝子）第１のタイプでは、ＳＩＶの細胞質尾部がＨＦＶの細胞外領域（ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｅｃｔｏｄｏｍａｉｎとしても称される）と膜貫通アンカー領域内部で融合する（図４及び５Ａの構築物１、２及び７）。ＨＦＶｅｎｖの膜貫通アンカー領域はそのアミノ酸配列から推定されたものであり、従って、仮説的なものである。ＳＩＶｅｎｖタンパク質の膜貫通アンカー領域は、ＨＦＶｅｎｖと同一のアミノ酸の小さな領域を含む。融合されているのは、この領域内である。従って、キメラｅｎｖ遺伝子の細胞外領域の全体はＨＦＶ由来であり、表面サブユニット（ＳＵ）の全体及び膜貫通サブユニット（ＴＭ）の大部分を含んでいる。細胞質尾部はその全体がＳＩＶ由来である。キメラエンベロープの第２のタイプでは、融合遺伝子は、ＳＵおよびＴＭサブユニット間の切断部位にある（図４及び５Ｂの構築物３、４および８）。従って、ＳＵサブユニットはＨＦＶ由来であり、ＴＭサブユニットはＳＩＶ由来である。キメラエンベロープタンパク質において、ＳＩＶｅｎｖの切断部位（Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を用いた。キメラエンベロープの第３のタイプでは、ＳＩＶ細胞質尾部が細胞質領域内のＨＦＶエンベロープと融合する（図４及び５Ｃの構築物５、６及び９）。この構築物は、設計においてキメラエンベロープΔ２ＭｕＬＶと類似し、ＨＦＶエンベロープ由来の最初の６細胞質アミノ酸が保存されている。ＳＩＶ由来の細胞質尾部の全体がこのエンベロープタンパク質と融合している。ＳＩＶエンベロープ遺伝子には、天然宿主、アカゲザル（ベンガルザル）の体内において複製されるＳＩＶ粒子内に存在する１６４アミノ酸から成る尾部を有する長鎖型と、１８アミノ酸のみを含む「ヒト化」と称される短鎖型の２つのタイプが存在する（図５Ｄおよび引用文献４２参照）。この短鎖型は、サルから単離されたウイルスが、ヒト細胞株において培養される場合に選択される。キメラエンベロープを、両方の尾部を使用して構築した。構築物１、３及び５は、長鎖型を含むことを特徴とし、その他の構築物は短鎖型である。ＳＩＶエンベロープ遺伝子内にｃｉｓ活性化抑制配列（ＣＲＳ）が存在する可能性があることから、ｅｎｖのｍＲＮＡを産生細胞の核内に保留する可能性がある。ｅｎｖ遺伝子の発現に対するこの抑制効果は、これらのｍＲＮＡがｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むとともにｒｅｖが発現されることによって解消される。これは、ＲＲＥがＳＩＶのＴＭサブユニット内に存在し、ｒｅｖがＳＩＶプロウイルスゲノムを含むプラスミドから発現されることから、第２のタイプのキメラエンベロープ構築物が該当する。しかし、ＲＲＥはその他のエンベロープ構築物中には存在しない。ＳＩＶｅｎｖ遺伝子の正確な性質が明らかになっていないが、ｅｎｖ遺伝子中の２番目のｔａｔ／ｒｅｖエクソンの３’スプライス部位がＣＲＳを構成することは可能である。従って、本発明者は、この３’スプライス部位が破壊されているキメラｅｎｖ構築物の第３の変異体を構築することとした（４３、４４図６）。３’スプライス部位の破壊は、短鎖、即ち、ＳＩＶｅｎｖ由来のヒト化細胞質尾部とのキメラエンベロープ内においてのみ実施した。最終的に９つのキメラエンベロープを構築した（図４）。Ｅｎｖ１、２および７においては、融合が膜貫通アンカー領域内に存在し、Ｅｎｖ１は長鎖ＳＩＶ細胞質尾部を有し、Ｅｎｖ２および７は短鎖を有する。ｅｎｖ遺伝子の３’スプライス部位は、ｅｎｖ２内に存在するがｅｎｖ７内においては、削除されている。Ｅｎｖ２および７のアミノ酸配列は同一である。Ｅｎｖ３、４および８においては、融合は切断部位に存在し、Ｅｎｖ３は長鎖細胞質尾部を有し、Ｅｎｖ４および８は短鎖を有する。ｅｎｖ遺伝子の３’スプライス部位は、ｅｎｖ４内に存在するが、ｅｎｖ８においては削除されている。Ｅｎｖ４及び８のアミノ酸配列は同一である。Ｅｎｖ５、６および９においては、融合は切断部位に存在し、Ｅｎｖ５は長鎖細胞質尾部を有し、Ｅｎｖ４および８は短鎖を有する。ｅｎｖ遺伝子の３’スプライス部位は、ｅｎｖ６内に存在するが、ｅｎｖ９においては削除されている。Ｅｎｖ６及び９のアミノ酸配列は同一である。１．キメラｅｎｖ遺伝子の構築全てのキメラｅｎｖ遺伝子はプラスミドｐｃｚＨＦＶｅｎｖｗｔ内の適当なＨＦＶｅｎｖ配列をＳＩＶｅｎｖ遺伝子由来の配列に置換することによってクローニングした。ｐｃｚＨＦＶｅｎｖｗｔは、ｐｃＤＮＡ３．Ｉ／Ｚｅｏ（インビトロジーン）中にクローニングされ、ＣＮＶプロモーターの制御を受けているＨＦＶ野生型ｅｎｖコーディング配列を含む。ＳＩＶｅｎｖ配列は、エンベロープ構築物１、３および５には、ｅｎｖ遺伝子の長鎖型を含むプラスミド（ｐＴＧ６６４）から、その他の構築物には、ｅｎｖ遺伝子の短鎖型を含むプラスミド(ｐＴＧ６２６ｍａ＋) から、それぞれ増幅した。当業者は、ＳＩＶｅｎｖをｐｐｏｌｙ III＊Ｉ（４５）中にクローニングすることによって、これら２つのプラスミドを合成することができる。ＨＦＶｅｎｖ遺伝子由来の５０ヌクレオチドの５’エクソンを有する上流プライマーおよびＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素の認識部位を含む１５ヌクレオチドの３’エクソンを有する下流プライマーを用いて、増幅を実施した。両プライマーは、ＳＩＶｅｎｖ遺伝子の特定の部分の増幅を可能にするＳＩＶｅｎｖ遺伝子に相補的な２０ヌクレオチドの領域を有する。ＳＩＶｅｎｖ遺伝子のＣ末端部分のＰＣＲの後に、増幅物をゲルから単離し、ＸｈｏＩで切断することにより、この増幅物から３’末端のヌクレオチドを除いた。プラスミドｐｃｚＨＦＶｎｅｖｗｔをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。増幅物をＸｈｏＩ多重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）末端を用いて直鎖ｐｃｚＨＦＶｎｅｖｗｔに連結した。この結果、ＨＦＶｅｎｖ遺伝子の全長及びＳＩＶの細胞質尾部を含む直鎖ＤＮＡフラグメントが得られた。細胞質尾部の５’末端は、（４１）に記載されている技術に従い、このプラスミドを大腸菌ＢＪ５１８３細胞に形質転換することにより組換えたＨＦＶｅｎｖ遺伝子に相同な配列を含む。この結果、ＨＦＶｅｎｖの３’末端部分がＳＩＶｅｎｖの３’末端によって置換されている閉環状プラスミドが得られる。プライマーを、異なった組合せで用いることにより全てのキメラエンベロープを同様に構築した（表２参照）。得られたプラスミドのうち、配列をコードしているキメラは、直接早期ＣＭＶプロモーターの制御下においた。２．偽型ＳＩＶ粒子の産生及び標的細胞の形質導入２９３細胞を、キメラエンベロープを発現する異なったプラスミド並びに直接早期ＣＭＶプロモーター及び亢進緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列Ｕ５５７６３のｎｔ６１３から１３３０）の発現カセットの挿入によりｅｎｖ遺伝子が非働化されたプロウイルスＳＩＶゲノムを含むプラスミドで同時トランスフェクションすることにより、偽型レトロウイルス粒子を産生した。プロトコールは、以下の通りである。２９３細胞を、１０％牛胎児血清、非必須アミノ酸、ゲンタマイシン及びグルタミンを加えたＤＭＥＭ培養液（補完ＤＭＥＭ）中、１枚あたり２×１０⁶の密度で１０ｃｍペトリ皿中に入れた。翌日、標準燐酸カルシウムトランスフェクション法により、２５μｇのＳＩＶプロウイルスプラスミド及び５μｇエンベローププラスミド（９つのキメラエンベロープ発現プラスミド又はコントロールプラスミド：空の発現プラスミド：ＶＳＶ−Ｇタンパク質発現プラスミド又はｐｃｚＨＦＶｎｅＷＴ）を用いて細胞をトランスフェクトした。翌日、培養液を除去し、細胞を５％胎児牛血清、非必須アミノ酸、ゲンタマイシン及びグルタミンで補完したＤＭＥＭ培養液で１回洗浄し、６ｍｌの同培養液中においてインキュベートした。２日後にウイルスを含む培養液を回収し、遠心分離により上清分離した（３，５００ｒｐｍにて５分間）。６穴プレートにおいて５×１０⁵細胞／穴細胞密度で予め播種した標的細胞（２９３又はＨＴ１０８０）を以下のように形質導入した。標的細胞をＤＭＥＭ（血清不含）１ｍｌで洗浄し、ＤＭＥＭ３００μ ｌを上層した。１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを補足したウイルス含有上清３００μｌを加え、細胞を５％ＣＯ₂、３７℃環境下で２時間インキュベートした。補完ＤＭＥＭ３ｍｌを加えた後、３日間インキュベーションを継続した。ＦＡＣＳｃａｎを用いて産生細胞及び標的細胞を以下のように分析した。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄する。１ｍｌＰＢＳ／４％ホルムアルデヒドで１０分間、４℃で処理することにより細胞を固定した。再度洗浄工程を繰り返した後、細胞をＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアーを用いて、ベクトン−ディッキンソンＦＡＣＳｃａｎにより分析した。ＦＩＴＣフィルターを用いて蛍光を測定した。全ての細胞は、効率よくトランスフェクトされていた。標的細胞の対象群の形質導入は、予想したとおりであった：ＶＳＶ−Ｇ偽型粒子は２９３細胞及びＨＴ１０８０細胞を形質導入することが可能である。エンベロープタンパク質又はＨＥＶｅｎｖの偽型粒子を含まない、形質転換された細胞由来の上清は、いずれの標的細胞をも形質導入することができなかった。構築物６及び９により産生されたウイルス粒子は２９３及びＨＴ１０８０細胞を形質導入することが可能であり、そのキメラエンベロープが機能的であることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月７日（１９９９．６．７）【補正内容】請求の範囲１．タンパク質が少なくとも１種の修飾泡沫状ウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含むことを特徴とする、偽型ウイルス粒子を産生するためのタンパク質の発現用構築物。２．泡沫状ウイルスがヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の発現用構築物。３．修飾が少なくとも１種の突然変異及び／又は少なくとも１種の截断であることを特徴とする請求項１及び２に記載のタンパク質の発現用構築物。４．修飾が前記タンパク質の残基９７５又は９８１における少なくとも１種の截断であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の発現用構築物。５．前記タンパク質が非ＦＶエンベロープタンパク質の全部又は一部を更に含む融合タンパク質であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。６．非ＦＶエンベロープタンパク質がＭｕＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＦＢ２９、ＨＩＶ及びＳＩＶを含む群から選択されるウイルスに由来することを特徴とする請求項５に記載のタンパク質の発現用構築物。７．融合がＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域内に存在することを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質の発現用構築物。８．タンパク質が、ＨＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の細胞外領域及び５’部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の３’部分及び細胞質領域を含むことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質の発現用構築物。９．融合がＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の切断部位内に存在することを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質の発現用構築物。１０．タンパク質が、ＨＦＶエンベロープタンパク質のＳＵ領域及び切断部位の全体又は部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特に、ＳＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域を含むＴＭ領域を含むことを特徴とする請求項９に記載のタンパク質の発現用構築物。１１．融合が膜貫通アンカー領域及び細胞質領域間の接点又はＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の細胞質領域内に存在することを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質の発現用構築物。１２．タンパク質がＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アンカー領域及び細胞質領域の全体及び部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の細胞質領域全体又は部分を含むことを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質の発現用構築物。１３．タンパク質が、細胞質領域の全体又は部分が非ＦＶウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＭｕＬＶレトロウイルスエンベロープタンパク質の全体又は部分により置換されていることを特徴とするＨＦＶエンベロープタンパク質から成ることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。１４．タンパク質がＭｕＬＶ細胞質領域の全体及び部分と修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質の融合物から成ることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。１５．ＭｕＬＶ細胞質領域がプロセッシングされている又はプロセッシングされていないことを特徴とする請求項１３および１４に記載のタンパク質の発現用構築物。１６．タンパク質がＨＦＶΔ２ＭｕＬＶであることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。１７．構築物がＦＶエンベロープタンパク質をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又はアクセプタースプライシング部位の突然変異を含むことを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかに記載のタンパク質の発現用構築物。１８．請求項１乃至１７のいずれかに記載の構築物により発現されるタンパク質。１９．ＦＶエンベロープタンパク質を含むことを特徴とする偽型ウイルス粒子。２０．請求項１８に記載のタンパク質を含むことを特徴とする偽型ウイルス粒子。２１．請求項１乃至１７のいずれかに記載の構築物を含むことを特徴とする補完細胞系。２２．請求項１２乃至１６に記載の構築物を含むことを特徴とする請求項２１に記載の補完細胞系。２３．更に、ウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する構築物を含むことを特徴とする請求項２１または２２に記載の補完細胞系。２４．レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子がＭｕＬＶ、ＦＢ２９又はＳＩＶに由来することを特徴とする請求項２３に記載の補完細胞系。２５．細胞系が２９３細胞系に由来することを特徴とする請求項２１乃至２４のいずれか１項に記載の補完細胞系。２６．請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子の製造方法であって、（ｉ）請求項２１から２５のいずれかに記載の補完細胞に組換えレトロウイルスベクターを導入する段階と、（ｉｉ）前記偽型ウイルス粒子を産生させるのに適した条件下で前記補完細胞系を培養する段階と、（ｉｉｉ）細胞培養物から前記偽型ウイルス粒子を回収する段階を含む前記方法。２７．請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子又は請求項２６に記載の方法で得られる偽型ウイルス粒子に感染している哺乳類細胞。２８．請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項２６に記載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子又は請求項２７に記載の哺乳類細胞の治療的又は予防的有効量を含むことを特徴とする医薬組成物。２９．治療を必要としている個体に、治療的に有効量の請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項２６に記載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子又は請求項２７に記載の哺乳類細胞を投与することを含む疾患の治療方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質が少なくとも１種の修飾泡沫状ウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含むことを特徴とする、タンパク質の発現用構築物。２．泡沫状ウイルスがヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の発現用構築物。３．修飾が少なくとも１種の突然変異及び／又は少なくとも１種の截断であることを特徴とする請求項１及び２に記載のタンパク質の発現用構築物。４．修飾が前記タンパク質の残基９７５又は９８１における少なくとも１種の截断であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の発現用構築物。５．前記タンパク質が非ＦＶエンベロープタンパク質の全部又は一部を更に含む融合タンパク質であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。６．非ＦＶエンベロープタンパク質がＭｕＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＦＢ２９、ＨＩＶ及びＳＩＶを含む群から選択されるウイルスに由来することを特徴とする請求項５に記載のタンパク質の発現用構築物。７．融合がＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域内に存在することを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質の発現用構築物。８．タンパク質が、ＨＦＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の細胞外領域及び５’部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の３’部分及び細胞質領域を含むことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質の発現用構築物。９．融合がＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の切断部位内に存在することを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質の発現用構築物。１０．タンパク質が、ＨＦＶエンベロープタンパク質のＳＵ領域及び切断部位の全体又は部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特に、ＳＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域を含むＴＭ領域を含むことを特徴とする請求項９に記載のタンパク質の発現用構築物。１１．融合が膜貫通アンカー領域及び細胞質領域間の接点又はＦＶ及び非ＦＶエンベロープタンパク質の細胞質領域内に存在することを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質の発現用構築物。１２．タンパク質がＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アンカー領域及び細胞質領域の全体及び部分並びに非ＦＶエンベロープタンパク質、特にＳＩＶエンベロープタンパク質の細胞質領域全体又は部分を含むことを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質の発現用構築物。１３．タンパク質が、細胞質領域の全体又は部分が非ＦＶウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＭｕＬＶレトロウイルスエンベロープタンパク質の全体又は部分により置換されていることを特徴とするＨＦＶエンベロープタンパク質から成ることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。１４．タンパク質がＭｕＬＶ細胞質領域の全体及び部分と修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質の融合物から成ることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。１５．ＭｕＬＶ細胞質領域がプロセッシングされている又はプロセッシングされていないことを特徴とする請求項１３および１４に記載のタンパク質の発現用構築物。１６．タンパク質がＨＦＶΔ２ＭｕＬＶであることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のタンパク質の発現用構築物。１７．構築物がＦＶエンベロープタンパク質をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又はアクセプタースプライシング部位の突然変異を含むことを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかに記載のタンパク質の発現用構築物。１８．請求項１乃至１７のいずれかに記載の構築物により発現されるタンパク質。１９．ＦＶエンベロープタンパク質を含むことを特徴とする偽型化ウイルス粒子。２０．請求項１８に記載のタンパク質を含むことを特徴とする偽型化ウイルス粒子。２１．請求項１乃至１７のいずれかに記載の構築物を含むことを特徴とする補完細胞系。２２．請求項１２乃至１６に記載の構築物を含むことを特徴とする請求項２１に記載の補完細胞系。２３．更に、ウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する構築物を含むことを特徴とする請求項２１または２２に記載の補完細胞系。２４．レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子がＭｕＬＶ、ＦＢ２９又はＳＩＶに由来することを特徴とする請求項２３に記載の補完細胞系。２５．細胞系が２９３細胞系に由来することを特徴とする請求項２１乃至２４のいずれか１項に記載の補完細胞系。２６．請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子の製造方法であって、（ｉ）請求項２１から２５のいずれかに記載の補完細胞に組換えレトロウイルスベクターを導入する段階と、（ｉｉ）前記偽型ウイルス粒子を産生させるのに適した条件下で前記補完細胞系を培養する段階と、（ｉｉｉ）細胞培養物から前記偽型ウイルス粒子を回収する段階を含む前記方法。２７．請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子又は請求項２６に記載の方法で得られる偽型ウイルス粒子に感染している哺乳類細胞。２８．請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項２６に記載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子又は請求項２７に記載の哺乳類細胞の治療的又は予防的有効量を含むことを特徴とする医薬組成物。２９．治療を必要としている個体に、治療的に有効量の請求項１９又は２０に記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項２６に記載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子又は請求項２７に記載の哺乳類細胞を投与することを含む疾患の治療方法。