JP2001514517A - 修飾泡沫状ウイルスエンベロープタンパク質の発現 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、少なくとも修飾FVエンベロープタンパク質を含むタンパク質を発現させる構築物、得られるタンパク質および偽型ウイルス粒子の産生を可能にする補完細胞系に関する。更に本願は、該粒子を含む医薬組成物及び疾患治療法に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
修飾泡沫状ウイルスエンベロープタンパク質の発現
レトロウイルス科のサブグループである泡沫状ウイルス(FV)はそのユニー
クな複製法と遺伝子移入ベクターとしての潜在的用途により科学的関心を集めて
いる(35)。FVは、例えばヒト集団にFV抗体が存在せず、自然FV感染が
良性経路を辿り、宿主細胞範囲が非常に広く、FVゲノムの寸法によりパッケー
ジング限度が広いなどのこのウイルス群の固有の性質により、遺伝子送達システ
ムの開発に理想的なツールであり得ると記載されている(4,30,32)。し
かし、このウイルス群の分子生物学的な情報は限られているため、特にマウスレ
トロウイルスに由来するもののように安全なパッケージング細胞系及びベクター
は開発されていない(27)。例えば、FVは複雑なゲノム構造をもつDNAウ
イルスである。LTR(長い末端反復配列)、パッケージング領域並びにgag
、pol及びenv遺伝子に加え、envと3’LTRの間に位置するbel1
、bel2、bel3、bet、beo及びbes等の数個の遺伝子も含む。e
nv遺伝子は130kDaグリコシル化前駆体
をコードし、この前駆体は切断されると、表面(SU)及び膜貫通(TM)タン
パク質を生じる(図1及び4参照)。TMサブユニットは、その3’部分に細胞
質尾部につながる疎水性残基から成る膜貫通アンカー領域を含む(図4A)。更
に、FVはスプライスしたmRNAからGagタンパク質とは別にそのPolタ
ンパク質を発現し、FVゲノムパッケージング及び粒子アセンブリのメカニズム
や、細胞外粒子に多量の逆転写DNAが存在する意味は殆ど分かっていない(1
0,18,39)。他のユニークな特徴としては、Gag前駆体タンパク質の核
局在(31,40)や、おそらくERにEnv前駆体タンパク質が保持される結
果として主に細胞質内小胞に出芽すること(13)などが挙げられる。
モロニーのレトロウイルス系遺伝子移入ベクターは現在主要なビークルであり
、多種多様な細胞型に高い効率で安定に遺伝子を移入することができる(20)
。このベクター系の最大の欠点は、宿主細胞範囲が限られており、ヒト細胞に感
染できない場合もある点である((1)で報告)。最近、水疱性口炎ウイルス糖
タンパク質(VSV−G)(6,38)又はテナガザル白血病ウイルス(GAL
V)エンベロープタンパク質(2,
34)等の外来エンベロープタンパク質による偽型化を用いた数種の方法でこれ
らの欠点を克服できることが判明した。
しかし、例えばVSV−Gの発現は産生細胞に高毒性であり、安定なVSV−
Gパッケージング細胞系を作製することはできなかった(8,22,37)。
本発明は少なくとも1種の修飾FVエンベロープタンパク質を含むタンパク質
の発現用構築物に関する。
本発明による好適FVはヒト泡沫状ウイルス(HFV)であるが、他のウイル
ス(例えばサルFV)も使用できる。
修飾は、上記修飾FVエンベロープ(env)タンパク質の1もしくは数個の
アミノ酸(aa)の突然変異、欠失、置換及び/又は付加の少なくとも1種又は
その組み合わせから構成され得る。このような修飾は細胞質尾部(cytopl
asmic tail)に導入するのが好ましい。有利には、修飾FVエンベロ
ープタンパク質はaa975又はより好ましくは981で切断されている。切断
(truncation)は終止コドンまで延びていてもよいし、あるいは場合
により原FV envタンパク質の1又は数個の残基を終止コドンの前に含んで
いてもよい。
更に、本発明の構築物は、成熟修飾FVエンベロープタンパク質又はその前駆
体又は種々の起源の配列の融合により得られるキメラタンパク質を発現すること
ができる。特に好適な態様では、本発明で使用される修飾FV envタンパク
質は非FVエンベロープタンパク質の全部又は好ましくは一部を更に含む融合タ
ンパク質である。適切な非FVウイルスの例としては、ニワトリレトロウイルス
、ウシレトロウイルス、ネコレトロウイルス、マウスレトロウイルス(例えばマ
ウス白血病ウイルス(MuLV)、特にモロニーMuLV(MoMuLV)、フ
レンドマウス白血病ウイルス(FrMuLV)、特にFB29株、マウス肉腫ウ
イルス(MSV))、霊長類レトロウイルス(例えばGaLV、VSV、又はH
IV(ヒト免疫不全ウイルス)もしくはSIV(サル免疫不全ウイルス)等のレ
ンチウイルスが挙げられる。
FVと非FV envタンパク質の融合は、様々な位置で行うことができる。
TMサブユニット内での融合が有利である。第1の選択として、融合は、該FV
及び非FVエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域内に存在する。好適な
例としては、HFVエンベロープタンパク質の細胞外領域及び5’部分並
びに非FVエンベロープタンパク質、特にSIVエンベロープタンパク質の膜貫
通アンカー領域の3’部分及び細胞質領域を含むことを特徴とするタンパク質が
あげられる。
第2の選択としては、融合は、FVおよび非FVエンベロープタンパク質の切
断部位内に存在する。好適な例として、HFVエンベロープタンパク質のSU領
域並びに切断部位の全て及び一部、並びに非FVエンベロープタンパク質、特に
、SIVエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域を含むT
M領域を含むことを特徴とするタンパク質があげられる。FVエンベロープタン
パク質の切断部位を非FVエンベロープタンパク質由来の切断部位と置換するこ
とも考えられる。
その他の選択としては、融合は、FVおよび非FVエンベロープタンパク質の
膜貫通アンカー領域と細胞質領域の接点あるいは細胞質領域の内部に存在する。
好適な例としては、HFVエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アンカ
ー領域及び細胞質領域の全体又は部分並びに非FVエンベロープタンパク質、特
にSIVエンベロープタンパク質の細胞質領域の全体又は部分を含むことを特徴
とするタンパク質があげられる。
特に好適な態様では、本発明によるタンパク質は、細胞質領
域の全部又は一部が非FVウイルスエンベロープタンパク質、特にMuLVエン
ベロープタンパク質の細胞質領域の全部又は一部で置換されたHFVタンパク質
エンベロープから構成される。有利には、融合タンパク質はMuLV細胞質領域
を修飾HFVエンベロープタンパク質と融合することにより構成される。本発明
で使用されるMuLV細胞質領域はプロセッシングされていてもよいし、プロセ
ッシングされていなくてもよい。「プロセッシングされている」とは、対応する
レトロウイルスプロテアーゼにより通常認識される開裂部位を含むことを意味し
、「プロセッシングされていない」とはこのような部位を含まないか又は機能的
でない(突然変異、欠失又は截断)ことを意味する。
本発明の好適構築物は、以下の文中でHFV Δ2MuLVと呼ぶ融合タンパ
ク質を発現させることが可能な構築物である。
あるいは、本発明に係る好ましいタンパク質は、細胞質尾部がSIVエンベロ
ープタンパク質の細胞質領域の全体又は部分と置換されているHFVエンベロー
プタンパク質である。このSIVエンベロープタンパク質には、天然の宿主、ア
カゲザル(ベンガルザル)の体内で複製されるSIV粒子内に存在する、
164個のアミノ酸から成る細胞質尾部を有する長鎖型と、18個のアミノ酸の
みから成る短鎖型の2種類が存在する。サルから単離されたウイルスが、ヒト細
胞株において培養される場合に、この短鎖型が選択される。
本発明の構築物は、FV envタンパク質をコードする配列中に天然に存在
するドナー及び/又はアクセプタースプライシング部位を突然変異させたもので
もよい。
本発明の構築物は、修飾FV envタンパク質をコードする配列を転写及び
翻訳できるように調節エレメントを含み得る。特に、FV envをコードする
配列の上流に慣用組換え技術により適切なプロモーターを作動的に連結すること
ができる。このようなプロモーターは原核、真核又はウイルスのいずれの起源で
もよく、構成性でも調節性でもよい。このような調節エレメントは当業者に周知
である。
本発明の構築物は修飾FV envタンパク質を発現する細胞の検出及び単離
を可能にする選択遺伝子を更に含んでもよく、このような態様も本発明の範囲内
である。本発明の関連では、選択遺伝子は修飾FV envタンパク質の発現を
誘導して2シストロン転写物を生じるプロモーターの転写制御下に置いて
もよいし、付加的プロモーター領域の制御下に置いてもよい。考えられる選択遺
伝子は多数あり、例えば抗生物質G418に対する耐性を与えるneo遺伝子、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhFr)遺伝子、ピューロマイシンアセチルトラ
ンスフェラーゼ(pac)遺伝子又はキサンチンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ(gpt)遺伝子が挙げられる。
本発明の構築物は任意の適当なベクター、ウイルスベクター(例えばレトロウ
イルスベクター)又はプラスミドに挿入することができる。適当なベクターの選
択肢は広く、当業者の能力の範囲内である。このようなベクターは組込み型でも
よいし、そうでなくてもよい。複製適合性(competent)ウイルス粒子
を生じる可能性を減らすためには、構築物がレトロウイルスLTRとパッケージ
ング領域を欠損していると有利である。
本発明は上記発現構築物により発現される融合タンパク質及びFV envタ
ンパク質を含む偽型(pseudotyped)ウイルス粒子にも関する。FV
envタンパク質は天然FV envタンパク質、その一部又はその修飾物か
ら誘導することができる。好適態様では、偽型ウイルス粒子は本発明による構
築物により発現される修飾FV envタンパク質をその表面に含む。本発明の
偽型ウイルス粒子は、組換えレトロウイルスベクターを補完(compleme
ntation)細胞系にトランスフェクトすることにより作製することができ
る。このような技術は公知であり、多数の従来技術文献に記載されている。本発
明で使用されるレトロウイルスベクターは、上記のような任意のレトロウイルス
に由来する少なくとも5’LTR、パッケージング領域及び3’LTRと、更に
目的ポリペプチドを産生するためにリボザイム、アンチセンスRNA分子又はm
RNAを発現することが可能な遺伝子を含む。非限定的な例としてサイトカイン
(IL−2、IFNα、β又はγ)、1型単純ヘルペスウイルス(HSV−1)
、チミジンキナーゼ(TK)、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ
ー(DFTR)、ジストロフィン、凝固因子(FVIII、FIX等)、腫瘍関
連抗原(MUC−1、HPV抗原)、抗体、イムノトキシン、抗HIV薬剤、増
殖因子(線維芽細胞増殖因子 FGF、血管内皮細胞増殖因子 VEGF)、ア
ポトーシス誘導体(Bax等)、アポトーシス阻害物(Bcl2、Bclx等)
、細胞増殖抑制因子(p21、p16、Rb)、アポリポタンパク質、
一酸化窒素合成酵素(Nos)、酸素ラジカルスカベンジャー(SOD、カタラ
ーゼ等)、ガン抑制産物(p53、p73)及びマーカー等の治療用ポリペプチ
ドが特に有用である。この一覧は限定的に列挙するものではない。更に、本発明
において使用に供されるウイルスベクターは、ひとつ以上の遺伝子を天然型、切
断した型、変異型又はハイブリッド型の形態で移転させる。遺伝子は、真核細胞
質における発現を可能にするようなエレメントによって制御される。これらのエ
レメントには、どのような起源由来であってもよいプロモーター(レトロウイル
スLTR又は内部プロモーター)が含まれる。
このエレメントは細胞又は組織選択的因子に制御されるかあるいは応答する。
本発明の別の目的は、偽型ウイルス粒子を産生することが可能な補完細胞系及
び前記ウイルス粒子の製造方法を提供することである。
本発明は更に、本発明の構成物を含む補完細胞系に関する。
好ましくは、該補完細胞系は、FVおよび非FVエンベロープタンパク質の膜
貫通アンカー領域及び細胞質領域の接点又は細胞質領域の内部に融合が存在し、
発現したタンパク質がHFV
エンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アンカー領域及び細胞質領域の全
体又は部分並びに非FVエンベロープタンパク質、特にSIVエンベロープタン
パク質の細胞質領域の全体又は部分を含むことを特徴とする本発明の構成を含む
。
その他の好ましい態様では、タンパク質がHFVΔ2 MuLVであることを
特徴とする、タンパク質の発現に関する本発明の構成物を、該補完細胞系が含む
。
本発明の補完細胞系は任意の細胞、特に真核細胞に由来し得る。例えばマウス
細胞系、医薬的に許容可能な細胞系(Vero、CHO等)又はヒト細胞系(例
えば293又はA549)が考えられる。このような細胞系は本発明による構築
物を第1の選択遺伝子とともにトランスフェクトすることにより作製することが
できる。その後、FV envに対する抗体を用いる免疫検出、ウェスタンブロ
ット、FACS(蛍光活性化セルソーター)又は他の任意の方法により、env
産生能の最も高い細胞が高レベルのFV envタンパク質の発現に対してスク
リーニングされる。あるいは、本発明の補完細胞系は、第1の選択遺伝子とは異
なる第2の選択遺伝子と共に、より好ましくはMuLV、FB29、SIV又は
HFVのウイルスgag/
pol遺伝子を発現する構築物を更に含んでいてもよい。好ましくは、env及
びgag/pol遺伝子はLTR及びパッケージング領域をもたない別個の発現
ベクターに担持される。選択及びスクリーニング段階を繰り返し、gag/po
l発現産物をも発現するenv産生クローンを選択する。
本発明の補完細胞系は組換えレトロウイルスベクターをパッケージングするた
めに使用することができる。第1及び第2の選択遺伝子とは異なる第3の選択遺
伝子又はマーカー遺伝子(例えばLacZ)を発現する慣用レトロウイルスベク
ターを使用して力価を試験することができる。その結果、高力価の偽型ウイルス
粒子を産生する細胞を選択し、安定な補完細胞系を提供するように培養すること
ができる。細胞は通常実施されているように後記方法で一過性試験してもよい。
本発明の別の態様によると、本発明の偽型ウイルス粒子の製造方法が提供され
る。このような方法は、(1)本発明の補完細胞系に組換えレトロウイルスベク
ターを導入する段階と、(2)前記偽型ウイルス粒子の産生を可能にする適切な
条件下で前記補完細胞系を培養する段階と、(3)細胞培養物から偽型ウイルス
粒子を回収する段階を含む。
好ましくは、偽型ウイルス粒子は細胞培養物上清から回収されるが、細胞溶解
工程も考えられる。慣用技術(例えばスクロース又はClCs勾配での超遠心分
離)により偽型ウイルス粒子を更に精製してもよい。有利には、こうして製造し
た偽型ウイルス粒子は(好ましくはポリブレンの不在下で)多種多様の細胞に感
染することができ、場合によってはヒト血清による失活を阻止することができる
。
本発明の別の態様によると、本発明の偽型ウイルス粒子に感染した、又は本発
明の方法により得られる哺乳動物宿主細胞も提供される。このような宿主細胞の
非限定的な例としてはヒト上皮細胞、肺細胞、筋細胞、肝細胞、造血細胞、繊維
芽細胞及びリンパ球が挙げられる。
本発明の感染性偽型粒子及び哺乳動物細胞はワクチン又は治療薬として種々の
疾病の予防又は治療に利用できる。
本発明の別の目的は、治療又は予防に有効な量の本発明の、又は本発明の方法
により得られる偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を治療薬として含有する医薬
組成物を提供することである。このような医薬組成物は慣用方法で製造すること
ができる。特に、本発明の粒子又は哺乳動物細胞をキャリヤー、希釈剤、
アジュバント又は賦形剤等の当該技術分野で周知の適当な物質と組み合わせるこ
とができる。医薬組成物の特定組成は例えば発現させようとする目的ポリペプチ
ド、所望の作用部位、投与方法及び治療対象等の種々のパラメーターによって異
なる。このような組成は当業者が通常の知識によって決定できる。
典型的には、偽型粒子は生理食塩水、燐酸緩衝生理食塩水等の希釈液あるいは
その他の医薬上許容される希釈液中に溶液として調製される。接種経路は、静脈
内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、気管内、胃内および腫瘍内投与が可能である
。投与は、単回あるいは反復投与が可能である。投与量は、個体の体重、性別、
年齢、健康状態等および治療対象疾患に応じて調整される。一般には、本発明の
偽ウイルス粒子を約104から約1013プラーク形成単位(pfu)/投与、より有
効には約105から約1010、好ましくは約106から約109投与する。本発明
の組成物は、標的細胞を偽型ウイルス粒子に予め暴露した後、形質導入された細
胞を哺乳動物(ヒト)に導入することにより、ex vivoで哺乳動物に導入が可能
であり、又は、静脈内若しくは局所的に、罹患組織に注射投与することが可能で
ある。
本発明の最後の態様によると、遺伝病又は任意の病原遺伝子
により誘発される疾病(例えば癌又はウイルス誘発病)の治療方法も提供され、
該方法は治療を必要とする対象に治療に有効な量の本発明の偽型ウイルス粒子及
び哺乳動物細胞を投与することを特徴とする。
本発明の上記及び他の目的は以下の実施例及び添付図面から容易に理解されよ
う。但し、これらの態様は本発明の全範囲を網羅するものではない。
特に、マウス白血病ウイルス(MuLV)粒子へのヒト泡沫状ウイルス(HF
V)エンベロープタンパク質の取込みは、一過性トランスフェクションパッケー
ジングセルシステムで試験した。ここで、効率は低いが、野生型HFVエンベロ
ープタンパク質でMuLV粒子を偽型化できることを報告しておく。HFV細胞
質尾部を完全又は部分的に除去すると、HFVに仲介される感染性が失われるか
又は低下し、MuLV粒子の偽型化におけるHFVエンベロープ細胞質尾部の役
割が予想された。HFVエンベロープ細胞質尾部に存在するER保持シグナルを
突然変異させても偽型レトロウイルスベクターの相対感染性は増加しなかった。
他方、プロセッシングされていないMuLVエンベロープ細胞質領域を截断HF
Vエンベロープタンパク質
に融合したキメラエンベロープタンパク質は、MuLV粒子へのキメラエンベロ
ープタンパク質の取込みの増加の結果として高いHFV特異的感染性を示した。
図面の簡単な説明
図1
HFVエンベロープ発現構築物の模式図である。HFV(白部分)及びMuL
V(影部分)エンベロープのTM成分の細胞外、膜間(膜貫通アンカー領域Aと
も称される)及び細胞質領域を(11,24)に従って示す。模式図の下に野生
型HFV及びMuLVタンパク質のアミノ酸配列も示す。HFVエンベロープ構
築物のアミノ酸位置を目盛りに示す。HFVエンベロープの細胞質領域でER保
持(13)関与する配列モチーフの位置を黒部分として示し、突然変異配列を斜
線部分として示す。MuLVエンベロープタンパク質の完全長細胞質領域におけ
るMuLVプロテアーゼの切断部位は2本の逆向き矢印により示す。
図2
種々のエンベロープタンパク質で偽型化したMuLV粒子の感染性を示す。2
93T細胞の一過性トランスフェクションに
より作製した種々の偽型MuLV粒子をNIH3T3(グレーの棒)又はQT−
6(黒の棒)細胞に感染させた。形質導入から48時間後にGFP発現細胞の百
分率をFACS分析により定量した。GFP発現細胞の平均蛍光はモック感染細
胞の100〜300倍であった。偽型化に使用した各エンベロープ構築物をグラ
フのy軸に示す。各構築物のGFP発現細胞の平均百分率を対応する標準偏差と
共にx軸に示す。各構築物を2〜6回試験した。
図3
HFVエンベロープ特異的感染性の中和を示す。293T細胞の一過性トラン
スフェクションによりy軸に示すような種々のエンベロープタンパク質で偽型化
合したMuLV粒子を作製した。NIH3T3(A)又はQT−6(B)細胞に
加える前に、上清(1ml)を抗HFV特異的チンパンジー血清(1:60)(
黒の棒)又は健康な個体からのヒト血清(1:60)(グレーの棒)と共に37
℃で1時間インキュベートした。4時間後に上清を吸引し、新鮮な成長培地に交
換した。形質導入から48時間後に図2の説明に記載したようにGFP発現細胞
の百分率を測定した。実験は中和性サル血清及びこれに抗HFV
表面ウサギ血清(データは示さず)を加えて2回実施し、その結果、HFVエン
ベロープ偽型レトロウイルスベクターの感染性に同様の相対阻害が生じた。
図4
HFV/SIVキメラエンベロープ構築物の模式図である。HFV WT及び
SIVはヒト泡沫状ウイルスおよびサル免疫不全ウイルス(分子クローンmm2
5)エンベロープ遺伝子の野生型である。HFV由来の領域は白で、SIV由来
の領域は灰色で示される。SUおよびTMを分断している切断部位は、縦線で示
される。RREはrev応答性エレメントを示し、Aは膜貫通アンカー領域を示
す。膜貫通アンカー領域の5’側の細胞外領域及び膜貫通アンカー領域の3’側
の細胞質領域も示す。Env1乃至9は、SIVエンベロープの長鎖型(Env
1、3及び5)又は短鎖型(Env2、4、6、7、8及び9)との融合を含む
HFV/SIVキメラenv構築物を示す。
図5
融合部位に隣接するHFV、SIV及びenvキメラ遺伝子の配列並びにSI
V env由来の短鎖及び長鎖細胞質尾部のアミノ酸配列である。Aは、HFV
およびSIVmm251env
遺伝子及びHFVおよびSIVmm251の膜貫通アンカー領域内の融合(Ch
im)を図示する。HFVおよびSIVエンベロープ内の共通アミノ酸配列を太
字で示し、下線部は、HFVおよびSIVエンベロープの膜貫通アンカー領域を
示す。Bは、HFVおよびSIVmm251エンベロープのSUおよびTM領域
間の切断部位に位置する融合を図示する。切断部位の共通(コンセンサス)配列
を太字で示し、切断部位は、アミノ酸配列の空欄で示す。Cは、HFVエンベロ
ープの細胞質尾部のSIVmm251エンベロープの細胞質尾部による置換を図
示する。膜貫通アンカー領域を下線で示し、(141)は、SIV長鎖細胞質尾
部由来の最後の141アミノ酸を示す。Dは、SIVエンベロープ由来の長鎖お
よび短鎖細胞質尾部のアミノ酸配列を示す。膜貫通アンカー領域を下線で示し、
*は、終結コドン、(141)は、SIV長鎖細胞質尾部由来の最後の141ア
ミノ酸を示す。
図6
SIVmm25 env内部3’スプライス部位の破壊を示す。最上位に記載
されているアミノ酸配列はSIVmm251 env遺伝子由来であり、*はヒ
ト化env遺伝子の終結コドンを示
す。GをAに変異させることにより3’スプライス部位が破壊されていることを
示す。Tat/Revエキソン2は配列TAGACTから始まるが、読取枠はe
nvの読取枠と異なっている。
以下、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。
実施例
全構築は、T.Maniatisら,Molecular cloning:
a laboratory manual,Cold Spring Harb
or,NY 1982に記載されているような標準組換えDNA技術を使用する
ことにより実施する。細胞系はATCC等の培養寄託機関から入手でき、標準条
件で培養する(NIH3T3:CRL1658、Mv.1.Lu:CCL64、
HT1080:CCL121、BHK21:CCL10、QT26:CRL17
08及び293:CRL1573)。HFV envタンパク質の配列は既に公
知であり、EMBLデータベースにおいて利用可能である(受入番号40772
5)。
実施例1:HFV/MLVキメラ
1.FV env発現構築物の作製
完全長envオープンリーディングフレーム(ORF)を含むHFVプロウイ
ルスクローンpHSRV1(28)の3076bp AflII/EcoRIフ
ラグメントをpCDNA3(Invitrogen)ベクターに挿入することに
より、ヒトFV単離体(HFV)のエンベロープ遺伝子の真核発現構築物を作製
した。この構築物をpCHFV wtと名づけ、図1に示す突然変異及びキメラ
HFVエンベロープタンパク質を作製するために使用した。要約すると、鋳型と
してHFV及び/又はMuLV env遺伝子と、所望の突然変異を含むオリゴ
ヌクレオチドでポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより截断又はキメラen
v構築物を作製した。突然変異体を上記基本ベクターに挿入し、配列決定して部
位外の突然変異を排除した。3種の突然変異HFVエンベロープ構築物を作製し
た。pCHFVΔ1とpCHFV Δ2はそれぞれaa975又は981で截断
されたHFVエンベロープタンパク質をコードする。pCHFVΔ2には、元の
HFV env配列に存在しないC末端アルギニンを付加した。Flugelら
(11)により提案されてい
るHFVエンベロープ領域構造に従い、截断の結果、細胞質領域は完全(pCH
FV Δ1)又は部分的(pCHFV Δ2)に除去された。最後に、pCHF
V SSS構築物はセリン残基により置換された膜貫通(TM)タンパク質の細
胞質尾部のC末端に三重リシンモチーフ(aa984〜986)をもつHFVエ
ンベロープタンパク質を産生する。この配列モチーフはHFVエンベロープのE
R保持に関与することが示されている(13,14)。
MuLVエンベロープタンパク質のプロセッシングされているか又はプロセッ
シングされていない細胞質領域をコードする配列のC末端融合により合計6個の
キメラエンベロープタンパク質を構築した(16,17)。pCHFV Δ1M
uLVR−、pCHFV Δ2MuLVR−及びpCHFV SSSMuLVR
−は上記3種の突然変異とプロセッシングされているMuLVエンベロープ細胞
質領域(aa634〜649)から構成される融合タンパク質をコードし、pC
HFV Δ1MuLV、pCHFVΔ2MuLV及びpCHFV SSSMuL
VはC末端にプロセッシングされていないMuLVエンベロープ細胞質領域(a
a634〜665)を含むそれぞれの融合タンパク質をコ
ードする。
MuLV gag/pol(pHIT60)、エコトロピック(pHIT12
3)及びアンホトロピック(pHIT456)MuLVエンベロープの発現構築
物はA.Kingsman(33)から提供された。レトロウイルスベクターS
FG GFPS65Tは、MuLV系レトロウイルスベクターSFG(5,22
)のクローニング部位に挿入された緑色蛍光タンパク質のヒト化ORF(7)(
M.Vogelの寄贈品)を含み、MFG.S NLS−LacZ(22)はS
V40核局在シグナル(NLS)に融合したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(R.
Mulliganの寄贈物)を含む。VSV−G ORFを含むプラスミドpS
VGL−1(29)(J.Roseの寄贈物)からの1.6kb EcoRIフ
ラグメントをpHITベクターに挿入することにより、VSV−G発現構築物を
作製した。
2.種々のHFV envタンパク質で偽型化したMuLV粒子の感染性
ほぼ従来技術(33)に記載されているようなpHITパッケージングシステ
ムを使用して組換えレトロウイルス粒子を作製した。要約すると、MuLV g
ag/pol(pHIT
60)の発現構築物、MuLV系レトロウイルスベクターSFG GFPS65
T及び上記種々のエンベロープ発現構築物を293T細胞(9)に一過性同時ト
ランスフェクトした。トランスフェクションから48〜72時間後にウイルス上
清を回収した。同一プラスミドをトランスフェクトした各トランスフェクション
産物からの上清をプールし、濾過(0.45μm細孔寸法)し、最終濃度8μg
/mlまでポリブレンを加え、上清を直接使用するか又は使用まで−80℃で保
存した。レトロウイルス形質導入後にGFPタンパク質を発現する標的細胞をF
ACScanでFACS分析により同定し、LysisII and Cell
Quest Softwareパッケージ(Becton Dickinson
)を使用して陽性細胞の数を定量した。
pCHFV wt発現構築物を使用した初期実験によると、効率は低いが、H
FV wtエンベロープタンパク質でMuLV粒子を偽型化することができ、N
IH3T3細胞に形質導入できることが判明した(図2)。HFVエンベロープ
タンパク質は、発現細胞のERへの保持を誘導するシグナル配列をその細胞質領
域に含む(13,14)。従って、細胞質的に截断又は
突然変異を含むHFVエンベロープタンパク質をコードする3種の構築物pCH
FV Δ1、pCHFV Δ2及びpCHFVSSSを試験し、HFVエンベロ
ープの細胞質領域とそのER保持が偽型効率に及ぼす影響を調べた。野生型タン
パク質に既に観察されている低い偽型活性は、HFVエンベロープの細胞質領域
を完全(pCHFV Δ1)又は部分的(pCHFV Δ2)に除去すると失わ
れるか又は低下する(図2)。細胞質ER保持シグナルの突然変異(pCHFV
SSS)はHFVエンベロープタンパク質の細胞表面発現を増加することが従
来示されている(13)。しかし、このような突然変異タンパク質でウイルス粒
子を偽型化しても、これらのウイルスの感染性は増加しなかった(図2)。
HFV細胞質領域を除去又は修飾しても偽型ウイルスの感染効率を増加するこ
とはできなかったので、次に第2のアプローチを使用し、HFV細胞質領域をM
uLV細胞質領域で置換するか又はMuLV細胞質領域を修飾完全長HFVエン
ベロープと融合して所望の効果が得られるか否かを試験した。MuLVエンベロ
ープの細胞質領域はウイルス粒子内でMuLVプロテアーゼによりプロセッシン
グされることが示された(16,
17)。既にプロセッシングされている形態のMuLVエンベロープタンパク質
を細胞で発現させると、大きい多核シンシチウムが形成され、ウイルス感染性が
低下した(24,26)。従って、上記3種の突然変異体とMuLVエンベロー
プタンパク質のプロセッシングされているか(MuLVR−)又はプロセッシン
グされていない(MuLV)細胞質領域のC末端融合タンパク質を作製し、これ
らのキメラエンベロープタンパク質で偽型化した粒子の感染性をNIH3T3細
胞で試験した。興味深いことに、1種の突然変異体であるHFV Δ2MuLV
タンパク質で偽型化したウイルスは野生型HFVエンベロープタンパク質で偽型
化した粒子よりも10〜20倍高い活性を示した(図2)。HFV Δ2MuL
Vタンパク質による感染性のこの増加はNIH3T3又はマウス細胞に特異的で
はなく、MuLVエンベロープタンパク質で被覆したウイルス粒子を感染させる
ことができないウズラ繊維芽細胞系QT−6でも同様の結果が得られた(図2)
。これらの細胞において、HFV Δ2MuLVエンベロープタンパク質で偽型
化した粒子の感染性はVSV−Gタンパク質で偽型化した粒子よりも一貫して高
かった。分析した他の全タンパク質は、どちらの細胞系でも野生型
HFVエンベロープよりも低いか又は同等の相対感染性をもつ偽型ウイルスを生
じた(図2)。更に、プロセッシングされているMuLV細胞質領域を含むキメ
ラHFVエンベロープタンパク質をL929細胞でレトロウイルスベクターによ
り発現させると、プロセッシングされていないMuLV細胞質領域をもつ対応す
るタンパク質よりも高い融合活性を示した(データは示さず)。この結果は、M
uLVエンベロープの細胞質領域がキメラエンベロープタンパク質として発現さ
れるときにサル免疫不全ウイルス(SIV)等の外来エンベロープタンパク質の
融合活性を制御できることを示すデータ(36)に一致する。更に、種々のエン
ベロープタンパク質で偽型化した核局在β−ガラクトシダーゼタンパク質をコー
ドするレトロウイルスベクターを含む上清を種々の種の細胞系で力価測定した(
表1)。より詳細に説明すると、トランスフェクトした293T細胞の上清の系
列希釈液で感染させる24時間前に標的細胞(1×104細胞/ウェル)をプレ
ーティングした。感染から48時間後に青いフォーカスの数を2回数え、力価を
計算した。2回測定の値は3倍の範囲であった。表に示す結果は、指定細胞系で
全て同一トランスフェクションからの無細胞上清を用いて独立
して2回実施した力価測定の代表値であり、2回の実験で再現性のある相対力価
が得られた。偽型粒子を含む上清をNIH3T3細胞中で6回まで力価測定し、
再現性のある結果を得た。HFV wtエンベロープタンパク質又はHFV Δ
2MuLVキメラタンパク質で偽型化したレトロウイルス粒子は、マウス細胞以
外にヒト、ミンク及びハムスター由来の細胞にも感染させることができた(表1
)。HFV Δ2MuLVエンベロープタンパク質で偽型化したレトロウイルス
ベクターの力価は、使用した標的細胞に依存して野生型HFVエンベロープタン
パク質で偽型化した場合の力価よりも8〜35倍高かった。3.HFV特異的抗血清によるHFV env偽型粒子の感染性の中和
種々のHFVエンベロープタンパク質で偽型化したMuLV粒子の感染性がH
FVエンベロープに特異的であることを確認するために、偽型粒子を標的細胞に
加える前に抗HFV特異的チンパンジー血清と共にプレインキュベートした(3
)。アンホトロピックMuLVエンベロープ又はVSV−Gタンパク質で偽型化
したウイルス粒子をHFV特異的抗血清と共にプレインキュベートした場合の感
染性は、これらのウイルスを標準熱不活化ヒト血清(図3)又はモックインキュ
ベートしたウイルス粒子(データは示さず)と共にプレインキュベートした場合
に比較して低下しなかった。他方、野生型HFVエンベロープタンパク質又はH
FV Δ2MuLVキメラで偽型化した粒子の感染性は、HFV特異的抗血清と
共にプレインキュベートすると完全に失われたが、ヒト対照血清と共にプレイン
キュベートした場合には失われなかった(図3)。HFVエンベロープ特異的感
染性のこの中和は、NIH3T3(図3A)及びQT−6(図3B)細胞で観察
された。HFVエンベロープタンパク質のバキュロウイルス発現SU領域に対す
るウサギ血清を使
用した実験でも、HFVエンベロープタンパク質で偽型化したウイルス粒子の同
様の特異的中和が得られた(データは示さず)。
4.HFV envタンパク質の発現及び粒子取込み
一過性トランスフェクトした293T細胞の放射性免疫沈降分析(RIPA)
により、種々のHFVエンベロープタンパク質の発現及びMuLV粒子への取込
みを測定した。DNA(pHIT60、SFG GFPS65T及び種々のen
v構築物)の添加から48時間後に細胞を[35S]メチオニンで約20時間代謝
標識した。上清中に存在するウイルス粒子を溶解バッファーで可溶化する前に2
0%スクロースクッションで25000rpmで遠心分離してペレット化した。
次に、試料を免疫沈降させた。ウイルス粒子とその対応する細胞溶解物をHFV
特異的チンパンジー血清又は抗MuLV gagハイブリドーマ上清で免疫沈降
させ、沈降物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分
析した。ペレット化ウイルス又は細胞溶解物からの免疫沈降物中のHFV特異的
バンドはHFV env発現構築物をトランスフェクトした試料でしか観察され
ず、MuLVアンホトロピックエンベロープタ
ンパク質を発現する試料又はモックトランスフェクト培養物では観察されなかっ
た。HFV envをトランスフェクトした細胞の細胞溶解物の免疫沈降物には
130及び110KDの2つの主要なHFVエンベロープ前駆体バンドが観察さ
れた(12,21)。更に、より長時間暴露後にはプロセッシングされている〜
90KD SU及び〜45〜50KD TMタンパク質に対応する2つのバンド
を観察することができた。種々のHFV突然変異体をトランスフェクトした細胞
試料におけるTMタンパク質の見掛寸法は種々異なり、個々のタンパク質のTM
部分が修飾されたことを示した。HFV SSSMuLVR−及びHFV SS
SMuLVは細胞発現の明白な低下を示したが、それ以外は、トランスフェクト
した細胞における種々のエンベロープタンパク質の定常状態レベルには並の差異
しか観察されなかった。ペレット化ウイルス粒子の免疫沈降物には両者エンベロ
ープ前駆体タンパク質とプロセッシングされているSU及びTMタンパク質も検
出された。他方、一般に前駆体タンパク質に対するプロセッシングされているタ
ンパク質の相対比はウイルス粒子免疫沈降物のほうが細胞溶解物よりも高かった
。
興味深いことに、ウイルス粒子の個々の免疫沈降物におけるプロセッシングさ
れているSU及びTMタンパク質の量と、対応する偽型粒子の相対感染性(図2
)の間に良好な相関を観察することができた。最高の相対感染性をもつ偽型粒子
を生じたHFV Δ2MuLVキメラエンベロープはRIPAでも最強のSU及
びTMバンドを示した。粗ウイルスペレット又は抗gagハイブリドーマ上清で
免疫沈降させた沈降物で個々のウイルス粒子調製物中のMuLV gag/po
lタンパク質の量を測定した処、HFV Δ2MuLVエンベロープトランスフ
ェクションを除く全試料で同様であった。この試料は粒子会合gag/polタ
ンパク質の有意低下を示し、この調製物には他のウイルスペレットよりも少数の
MuLV粒子しか存在しないことを示した。従って、各ウイルス粒子当たりのプ
ロセッシングされているHFV SU及びTMタンパク質の相対量は、ウイルス
粒子調製物をHFV特異抗体で免疫沈降させた沈降物から予想されるよりも更に
高いと思われる。この現象の一因として、HFV Δ2MuLVで偽型化した粒
子の感染性が他のHFVエンベロープタンパク質で偽型化した粒子よりも高い結
果、これらの粒子がHFV envタンパク質を発現しないト
ランスフェクト細胞により多量に吸収されるためであると考えられる。この結果
、HFV Δ2MuLVで偽型化した粒子は上清から除去され得る。更に、アン
ホトロピックMuLVエンベロープ又はVSV−Gで偽型化したMuLV粒子と
は対照的に、HFVで偽型化したウイルスはポリブレン等のポリカチオンの不在
下で感染性の低下を全く示さなかった(30)。従って、一過性トランスフェク
ションによりHFVエンベロープで偽型化したレトロウイルスベクターの相対力
価は、アンホトロピックMuLVエンベロープ又はVSV−Gで偽型化した場合
よりも過小評価されると思われる。但し、これらの現象を更に詳細に解明するに
は、HFVエンベロープで偽型化したウイルスによる感染に耐性のHFVエンベ
ロープを安定的に発現する細胞系を使用して更に進んだ実験を行う必要がある。
5.FV env遺伝子に配置したスプライスドナー及びアクセプター部位の失 活
更に、HFVエンベロープORF(6310〜9276位)内に位置する内部
HFVプロモーター(5’LTRの転写始点に対して8419位)から誘導され
るBel−1及びBet転写産物は、envタンパク質のTMサブユニットのコ
ーディン
グ領域内のスプライスドナー(SD、9119位)及びスプライスアクセプター
(SA、9237位)部位を有効に利用する。あるいは、これらのSD及びSA
部位を利用してHFV envタンパク質をコードするmRNAをスプライスす
ると、潜在的エンベロープ/bel融合タンパク質が得られる。〜170KDは
免疫沈降によりHFV感染細胞で検出することができ、mRNAはHFVに感染
したヒト繊維芽細胞からの全mRNAのRT(逆転写酵素)PCRにより検出す
ることができる。SD(9119位)をGT→GG突然変異により失活させると
、170KDエンベロープ融合タンパク質は消失するが、130KDエンベロー
プ前駆体タンパク質の発現は変わらない。env/bel融合タンパク質の生物
学的機能とウイルス力価に及ぼす偽型MuLV粒子の影響については現在のとこ
ろ不明である。
要約すると、HFVエンベロープタンパク質で偽型化したMuLV系レトロウ
イルスベクターを製造するためのシステムを作製した。HFVエンベロープタン
パク質の細胞質領域を前進的に欠失させると、遺伝子移入とウイルス粒子へのH
FVenv SU及びTMサブユニットの取込みが低下するので、HFVエンベ
ロープタンパク質の細胞質領域はMuLV粒子の
偽型化に少なくとも部分的に関与していた。1種の欠失突然変異体であるHFV
Δ2MuLVエンベロープにプロセッシングされていないMuLVエンベロー
プ細胞質領域を付加すると、HFV野生型エンベロープタンパク質に比較して感
染性が10〜20倍増加し、偽型粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込
みが増加した。レトロウイルス力価は、野生型HFVエンベロープタンパク質で
偽型化することにより達せられる力価の8〜35倍であった。標的細胞型によっ
ては、遺伝子移入効率がVSV−Gタンパク質で偽型化したレトロウイルスベク
ターと同等以上のものもあった。野生型MuLVエンベロープタンパク質の場合
には、ウイルス粒子へのエンベロープの特異的取込みにおける細胞質領域の役割
は不明である。細胞質尾部欠失突然変異体のうちには粒子会合エンベロープタン
パク質が減少するものもあり(15)、また、突然変異エンベロープタンパク質
によっては粒子会合の低下を殆ど〜全く示さないものもあった(25,26)。
本発明の結果は、エンベロープタンパク質の粒子会合、少なくともMuLV粒子
へのキメラエンベロープタンパク質の取込みの増加におけるMuLV env細
胞質領域の役割を裏付けるものである。
最近、VSV糖タンパク質G(6,38)又はGALVエンベロープ(2,3
4)等の外来エンベロープタンパク質でMuLV系レトロウイルスベクターを偽
型化した結果、ウイルス安定性が増加し、宿主細胞範囲が広がり、所定の細胞型
の形質導入効率が増加した。FVの宿主範囲が広く、ヒト血清による失活を阻止
し(30)、ポリカチオンの不在下で種々の起源の細胞に有効に感染できる(未
公開資料及び(30))ため、HFV Δ2MuLVキメラエンベロープタンパ
ク質で偽型化したMuLV系レトロウイルスベクターは種々の細胞型に遺伝子を
有効に導入するための有用な新規ツールになるであろう。VSV−Gは産生細胞
に高毒性であり、最近まで安定なVSV−Gパッケージング細胞系を作製するこ
とはできなかった(8,22,37)が、HFV Δ2MuLVエンベロープの
一過性発現の結果、293T細胞で明白な毒性は生じなかった(データは示さず
、(19))。
実施例2:HFV/SIV envキメラ
本実施例は、HFVおよびSIVエンペロープタンパク質のキメラエンベロー
プの構築について記載する。3種類の異なったキメラエンベロープが構築された
。以下の異なったエレメン
トの配列はGenbankにおいて、利用可能である。:受入番号M19499
のSIV mm251ゲノム、受入番号X03922のCMVプロモーター及び
受入番号U55763のpEGFP−C1(GFP遺伝子)
第1のタイプでは、SIVの細胞質尾部がHFVの細胞外領域(litera
ture ectodomainとしても称される)と膜貫通アンカー領域内部
で融合する(図4及び5Aの構築物1、2及び7)。HFV envの膜貫通ア
ンカー領域はそのアミノ酸配列から推定されたものであり、従って、仮説的なも
のである。SIV envタンパク質の膜貫通アンカー領域は、HFV env
と同一のアミノ酸の小さな領域を含む。融合されているのは、この領域内である
。従って、キメラenv遺伝子の細胞外領域の全体はHFV由来であり、表面サ
ブユニット(SU)の全体及び膜貫通サブユニット(TM)の大部分を含んでい
る。細胞質尾部はその全体がSIV由来である。
キメラエンベロープの第2のタイプでは、融合遺伝子は、SUおよびTMサブ
ユニット間の切断部位にある(図4及び5Bの構築物3、4および8)。従って
、SUサブユニットはHFV
由来であり、TMサブユニットはSIV由来である。キメラエンベロープタンパ
ク質において、SIV envの切断部位(Arg−Gln−Lys−Arg)
を用いた。
キメラエンベロープの第3のタイプでは、SIV細胞質尾部が細胞質領域内の
HFVエンベロープと融合する(図4及び5Cの構築物5、6及び9)。この構
築物は、設計においてキメラエンベロープΔ2MuLVと類似し、HFVエンベ
ロープ由来の最初の6細胞質アミノ酸が保存されている。SIV由来の細胞質尾
部の全体がこのエンベロープタンパク質と融合している。
SIVエンベロープ遺伝子には、天然宿主、アカゲザル(ベンガルザル)の体
内において複製されるSIV粒子内に存在する164アミノ酸から成る尾部を有
する長鎖型と、18アミノ酸のみを含む「ヒト化」と称される短鎖型の2つのタ
イプが存在する(図5Dおよび引用文献42参照)。この短鎖型は、サルから単
離されたウイルスが、ヒト細胞株において培養される場合に選択される。キメラ
エンベロープを、両方の尾部を使用して構築した。構築物1、3及び5は、長鎖
型を含むことを特徴とし、その他の構築物は短鎖型である。SIVエンベロープ
遺伝子内にcis活性化抑制配列(CRS)が存在する可能性があることから、
envのmRNAを産生細胞の核内に保留する可能性がある。env遺伝子の発
現に対するこの抑制効果は、これらのmRNAがrev応答エレメント(RRE
)を含むとともにrevが発現されることによって解消される。これは、RRE
がSIVのTMサブユニット内に存在し、revがSIVプロウイルスゲノムを
含むプラスミドから発現されることから、第2のタイプのキメラエンベロープ構
築物が該当する。しかし、RREはその他のエンベロープ構築物中には存在しな
い。SIVenv遺伝子の正確な性質が明らかになっていないが、env遺伝子
中の2番目のtat/revエクソンの3’スプライス部位がCRSを構成する
ことは可能である。従って、本発明者は、この3’スプライス部位が破壊されて
いるキメラenv構築物の第3の変異体を構築することとした(43、44 図
6)。3’スプライス部位の破壊は、短鎖、即ち、SIVenv由来のヒト化細
胞質尾部とのキメラエンベロープ内においてのみ実施した。
最終的に9つのキメラエンベロープを構築した(図4)。
Env1、2および7においては、融合が膜貫通アンカー領
域内に存在し、Env1は長鎖SIV細胞質尾部を有し、Env2および7は短
鎖を有する。env遺伝子の3’スプライス部位は、env2内に存在するがe
nv7内においては、削除されている。Env2および7のアミノ酸配列は同一
である。
Env3、4および8においては、融合は切断部位に存在し、Env3は長鎖
細胞質尾部を有し、Env4および8は短鎖を有する。env遺伝子の3’スプ
ライス部位は、env4内に存在するが、env8においては削除されている。
Env4及び8のアミノ酸配列は同一である。
Env5、6および9においては、融合は切断部位に存在し、Env5は長
鎖細胞質尾部を有し、Env4および8は短鎖を有する。env遺伝子の3’ス
プライス部位は、env6内に存在するが、env9においては削除されている
。Env6及び9のアミノ酸配列は同一である。1.キメラenv遺伝子の構築
全てのキメラenv遺伝子はプラスミドpczHFVenvwt内の適当なH
FVenv配列をSIVenv遺伝子由来の配列に置換することによってクロー
ニングした。pczHFVenvwtは、pcDNA3.I/Zeo(インビト
ロジーン)中に
クローニングされ、CNVプロモーターの制御を受けているHFV野生型env
コーディング配列を含む。SIVenv配列は、エンベロープ構築物1、3およ
び5には、env遺伝子の長鎖型を含むプラスミド(pTG664)から、その
他の構築物には、env遺伝子の短鎖型を含むプラスミド(pTG626ma+)
から、それぞれ増幅した。当業者は、SIVenvを ppoly III*I(
45)中にクローニングすることによって、これら2つのプラスミドを合成する
ことができる。HFVenv遺伝子由来の50ヌクレオチドの5’エクソンを有
する上流プライマーおよびXhoIおよびEcoRI制限酵素の認識部位を含む
15ヌクレオチドの3’エクソンを有する下流プライマーを用いて、増幅を実施
した。両プライマーは、SIVenv遺伝子の特定の部分の増幅を可能にするS
IVenv遺伝子に相補的な20ヌクレオチドの領域を有する。
SIVenv遺伝子のC末端部分のPCRの後に、増幅物をゲルから単離し、
XhoIで切断することにより、この増幅物から3’末端のヌクレオチドを除い
た。プラスミドpczHFVnev wtをXhoIおよびEcoRIで切断し
た。増幅物をXhoI多重複(redundant)末端を用いて直鎖pczH
FVnev
wtに連結した。この結果、HFVenv遺伝子の全長及びSIVの細胞質尾部
を含む直鎖DNAフラグメントが得られた。細胞質尾部の5’末端は、(41)
に記載されている技術に従い、このプラスミドを大腸菌BJ 5183細胞に形
質転換することにより組換えたHFVenv遺伝子に相同な配列を含む。この結
果、HFVenvの3’末端部分がSIVenvの3’末端によって置換されて
いる閉環状プラスミドが得られる。プライマーを、異なった組合せで用いること
により全てのキメラエンベロープを同様に構築した(表2参照)。得られたプラ
スミドのうち、配列をコードしているキメラは、直接早期CMVプロモーターの
制御下においた。 2.偽型SIV粒子の産生及び標的細胞の形質導入
293細胞を、キメラエンベロープを発現する異なったプラスミド並びに直接
早期CMVプロモーター及び亢進緑色蛍光タンパク質(GFP)(Geneba
nk配列U55763のnt613から1330)の発現カセットの挿入により
env遺伝子が非働化されたプロウイルスSIVゲノムを含むプラスミドで同時
トランスフェクションすることにより、偽型レトロウイルス粒子を産生した。
プロトコールは、以下の通りである。
293細胞を、10%牛胎児血清、非必須アミノ酸、ゲンタマイシン及びグル
タミンを加えたDMEM培養液(補完DMEM)中、1枚あたり2×106の密
度で10cmペトリ皿中に入れた。翌日、標準燐酸カルシウムトランスフェクシ
ョン法により、25μgのSIVプロウイルスプラスミド及び5μgエンベロー
ププラスミド(9つのキメラエンベロープ発現プラスミド又はコントロールプラ
スミド:空の発現プラスミド:VSV−Gタンパク質発現プラスミド又はpcz
HFVneWT)を用いて細胞をトランスフェクトした。翌日、培養液を除去し
、細胞を5%胎児牛血清、非必須アミノ酸、ゲンタマイシン及びグルタミンで補
完したDMEM培養液で1回洗浄し、6mlの同培養液中においてインキュベー
トした。2日後にウイルスを含む培養液を回収し、遠心分離により上清分離した
(3,500rpmにて5分間)。6穴プレートにおいて5×105細胞/穴細
胞密度で予め播種した標的細胞(293又はHT1080)を以下のように形質
導入した。標的細胞をDMEM(血清不含)1mlで洗浄し、DMEM300μ
lを上層した。10μg/mlの硫酸プロタミンを補足したウイルス含有上清3
00μl
を加え、細胞を5%CO2、37℃環境下で2時間インキュベートした。補完D
MEM3mlを加えた後、3日間インキュベーションを継続した。
FACScanを用いて産生細胞及び標的細胞を以下のように分析した。細胞
をトリプシン処理し、PBSで洗浄する。1ml PBS/4%ホルムアルデヒ
ドで10分間、4℃で処理することにより細胞を固定した。再度洗浄工程を繰り
返した後、細胞をPBS1mlに再懸濁し、Cell−Questソフトウェア
ーを用いて、ベクトン−ディッキンソンFACScanにより分析した。FIT
Cフィルターを用いて蛍光を測定した。全ての細胞は、効率よくトランスフェク
トされていた。標的細胞の対象群の形質導入は、予想したとおりであった:VS
V−G偽型粒子は293細胞及びHT1080細胞を形質導入することが可能で
ある。エンベロープタンパク質又はHEVenvの偽型粒子を含まない、形質転
換された細胞由来の上清は、いずれの標的細胞をも形質導入することができなか
った。構築物6及び9により産生されたウイルス粒子は293及びHT1080
細胞を形質導入することが可能であり、そのキメラエンベロープが機能的である
ことを示している。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】平成11年6月7日(1999.6.7)
【補正内容】
請求の範囲
1. タンパク質が少なくとも1種の修飾泡沫状ウイルス(FV)エンベロープ
タンパク質を含むことを特徴とする、偽型ウイルス粒子を産生するためのタンパ
ク質の発現用構築物。
2. 泡沫状ウイルスがヒト泡沫状ウイルス(HFV)であることを特徴とする
請求項1に記載のタンパク質の発現用構築物。
3. 修飾が少なくとも1種の突然変異及び/又は少なくとも1種の截断である
ことを特徴とする請求項1及び2に記載のタンパク質の発現用構築物。
4. 修飾が前記タンパク質の残基975又は981における少なくとも1種の
截断であることを特徴とする請求項3に記載のタンパク質の発現用構築物。
5. 前記タンパク質が非FVエンベロープタンパク質の全部又は一部を更に含
む融合タンパク質であることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載
のタンパク質の発現用構築物。
6. 非FVエンベロープタンパク質がMuLV、MoMuLV、FB29、H
IV及びSIVを含む群から選択されるウイルス
に由来することを特徴とする請求項5に記載のタンパク質の発現用構築物。
7. 融合がFV及び非FVエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域内に
存在することを特徴とする請求項5又は6に記載のタンパク質の発現用構築物。
8. タンパク質が、HFVエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の細
胞外領域及び5’部分並びに非FVエンベロープタンパク質、特にSIVエンベ
ロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の3’部分及び細胞質領域を含むことを
特徴とする、請求項7に記載のタンパク質の発現用構築物。
9. 融合がFV及び非FVエンベロープタンパク質の切断部位内に存在するこ
とを特徴とする請求項5又は6に記載のタンパク質の発現用構築物。
10. タンパク質が、HFVエンベロープタンパク質のSU領域及び切断部位
の全体又は部分並びに非FVエンベロープタンパク質、特に、SIVエンベロー
プタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域を含むTM領域を含むことを
特徴とする請求項9に記載のタンパク質の発現用構築物。
11. 融合が膜貫通アンカー領域及び細胞質領域間の接点又
はFV及び非FVエンベロープタンパク質の細胞質領域内に存在することを特徴
とする請求項5又は6に記載のタンパク質の発現用構築物。
12. タンパク質がHFVエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アン
カー領域及び細胞質領域の全体及び部分並びに非FVエンベロープタンパク質、
特にSIVエンベロープタンパク質の細胞質領域全体又は部分を含むことを特徴
とする請求項11に記載のタンパク質の発現用構築物。
13. タンパク質が、細胞質領域の全体又は部分が非FVウイルスエンベロー
プタンパク質、好ましくはMuLVレトロウイルスエンベロープタンパク質の全
体又は部分により置換されていることを特徴とするHFVエンベロープタンパク
質から成ることを特徴とする請求項1乃至12のいずれか1項に記載のタンパク
質の発現用構築物。
14. タンパク質がMuLV細胞質領域の全体及び部分と修飾HFVエンベロ
ープタンパク質の融合物から成ることを特徴とする請求項1乃至13のいずれか
1項に記載のタンパク質の発現用構築物。
15. MuLV細胞質領域がプロセッシングされている又は
プロセッシングされていないことを特徴とする請求項13および14に記載のタ
ンパク質の発現用構築物。
16. タンパク質がHFVΔ2MuLVであることを特徴とする請求項1乃至
15のいずれか1項に記載のタンパク質の発現用構築物。
17. 構築物がFVエンベロープタンパク質をコードする配列中に天然に存在
するドナー及び/又はアクセプタースプライシング部位の突然変異を含むことを
特徴とする請求項1乃至16のいずれかに記載のタンパク質の発現用構築物。
18. 請求項1乃至17のいずれかに記載の構築物により発現されるタンパク
質。
19. FVエンベロープタンパク質を含むことを特徴とする偽型ウイルス粒子
。
20. 請求項18に記載のタンパク質を含むことを特徴とする偽型ウイルス粒
子。
21. 請求項1乃至17のいずれかに記載の構築物を含むことを特徴とする補
完細胞系。
22. 請求項12乃至16に記載の構築物を含むことを特徴とする請求項21
に記載の補完細胞系。
23. 更に、ウイルスgag/pol遺伝子を発現する構築物を含むことを特
徴とする請求項21または22に記載の補完細胞系。
24. レトロウイルスgag/pol遺伝子がMuLV、FB29又はSIV
に由来することを特徴とする請求項23に記載の補完細胞系。
25. 細胞系が293細胞系に由来することを特徴とする請求項21乃至24
のいずれか1項に記載の補完細胞系。
26. 請求項19又は20に記載の偽型ウイルス粒子の製造方法であって、
(i)請求項21から25のいずれかに記載の補完細胞に組換えレトロウイルス
ベクターを導入する段階と、
(ii)前記偽型ウイルス粒子を産生させるのに適した条件下で前記補完細胞系
を培養する段階と、
(iii)細胞培養物から前記偽型ウイルス粒子を回収する段階を含む前記方法
。
27. 請求項19又は20に記載の偽型ウイルス粒子又は請求項26に記載の
方法で得られる偽型ウイルス粒子に感染している哺乳類細胞。
28. 請求項19又は20に記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項26に記
載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子又は請求項27に記載の哺乳類細胞
の治療的又は予防的有効量を含むことを特徴とする医薬組成物。
29. 治療を必要としている個体に、治療的に有効量の請求項19又は20に
記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項26に記載の方法によって得られる偽型
ウイルス粒子又は請求項27に記載の哺乳類細胞を投与することを含む疾患の治
療方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 7/00 C12N 15/00 ZNAA
C12P 21/02 5/00 B
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. タンパク質が少なくとも1種の修飾泡沫状ウイルス(FV)エンベロープ タンパク質を含むことを特徴とする、タンパク質の発現用構築物。 2. 泡沫状ウイルスがヒト泡沫状ウイルス(HFV)であることを特徴とする 請求項1に記載のタンパク質の発現用構築物。 3. 修飾が少なくとも1種の突然変異及び/又は少なくとも1種の截断である ことを特徴とする請求項1及び2に記載のタンパク質の発現用構築物。 4. 修飾が前記タンパク質の残基975又は981における少なくとも1種の 截断であることを特徴とする請求項3に記載のタンパク質の発現用構築物。 5. 前記タンパク質が非FVエンベロープタンパク質の全部又は一部を更に含 む融合タンパク質であることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載 のタンパク質の発現用構築物。 6. 非FVエンベロープタンパク質がMuLV、MoMuLV、FB29、H IV及びSIVを含む群から選択されるウイルス に由来することを特徴とする請求項5に記載のタンパク質の発現用構築物。 7. 融合がFV及び非FVエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域内に 存在することを特徴とする請求項5又は6に記載のタンパク質の発現用構築物。 8. タンパク質が、HFVエンベロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の細 胞外領域及び5’部分並びに非FVエンベロープタンパク質、特にSIVエンベ ロープタンパク質の膜貫通アンカー領域の3’部分及び細胞質領域を含むことを 特徴とする、請求項7に記載のタンパク質の発現用構築物。 9. 融合がFV及び非FVエンベロープタンパク質の切断部位内に存在するこ とを特徴とする請求項5又は6に記載のタンパク質の発現用構築物。 10. タンパク質が、HFVエンベロープタンパク質のSU領域及び切断部位 の全体又は部分並びに非FVエンベロープタンパク質、特に、SIVエンベロー プタンパク質の膜貫通アンカー領域及び細胞質領域を含むTM領域を含むことを 特徴とする請求項9に記載のタンパク質の発現用構築物。 11. 融合が膜貫通アンカー領域及び細胞質領域間の接点又 はFV及び非FVエンベロープタンパク質の細胞質領域内に存在することを特徴 とする請求項5又は6に記載のタンパク質の発現用構築物。 12. タンパク質がHFVエンベロープタンパク質の細胞外領域、膜貫通アン カー領域及び細胞質領域の全体及び部分並びに非FVエンベロープタンパク質、 特にSIVエンベロープタンパク質の細胞質領域全体又は部分を含むことを特徴 とする請求項11に記載のタンパク質の発現用構築物。 13. タンパク質が、細胞質領域の全体又は部分が非FVウイルスエンベロー プタンパク質、好ましくはMuLVレトロウイルスエンベロープタンパク質の全 体又は部分により置換されていることを特徴とするHFVエンベロープタンパク 質から成ることを特徴とする請求項1乃至12のいずれか1項に記載のタンパク 質の発現用構築物。 14. タンパク質がMuLV細胞質領域の全体及び部分と修飾HFVエンベロ ープタンパク質の融合物から成ることを特徴とする請求項1乃至13のいずれか 1項に記載のタンパク質の発現用構築物。 15. MuLV細胞質領域がプロセッシングされている又は プロセッシングされていないことを特徴とする請求項13および14に記載のタ ンパク質の発現用構築物。 16. タンパク質がHFVΔ2MuLVであることを特徴とする請求項1乃至 15のいずれか1項に記載のタンパク質の発現用構築物。 17. 構築物がFVエンベロープタンパク質をコードする配列中に天然に存在 するドナー及び/又はアクセプタースプライシング部位の突然変異を含むことを 特徴とする請求項1乃至16のいずれかに記載のタンパク質の発現用構築物。 18. 請求項1乃至17のいずれかに記載の構築物により発現されるタンパク 質。 19. FVエンベロープタンパク質を含むことを特徴とする偽型化ウイルス粒 子。 20. 請求項18に記載のタンパク質を含むことを特徴とする偽型化ウイルス 粒子。 21. 請求項1乃至17のいずれかに記載の構築物を含むことを特徴とする補 完細胞系。 22. 請求項12乃至16に記載の構築物を含むことを特徴とする請求項21 に記載の補完細胞系。 23. 更に、ウイルスgag/pol遺伝子を発現する構築物を含むことを特 徴とする請求項21または22に記載の補完細胞系。 24. レトロウイルスgag/pol遺伝子がMuLV、FB29又はSIV に由来することを特徴とする請求項23に記載の補完細胞系。 25. 細胞系が293細胞系に由来することを特徴とする請求項21乃至24 のいずれか1項に記載の補完細胞系。 26. 請求項19又は20に記載の偽型ウイルス粒子の製造方法であって、 (i)請求項21から25のいずれかに記載の補完細胞に組換えレトロウイルス ベクターを導入する段階と、 (ii)前記偽型ウイルス粒子を産生させるのに適した条件下で前記補完細胞系 を培養する段階と、 (iii)細胞培養物から前記偽型ウイルス粒子を回収する段階を含む前記方法 。 27. 請求項19又は20に記載の偽型ウイルス粒子又は請求項26に記載の 方法で得られる偽型ウイルス粒子に感染している哺乳類細胞。 28. 請求項19又は20に記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項26に記 載の方法によって得られる偽型ウイルス粒子又は請求項27に記載の哺乳類細胞 の治療的又は予防的有効量を含むことを特徴とする医薬組成物。 29. 治療を必要としている個体に、治療的に有効量の請求項19又は20に 記載の偽型ウイルス粒子若しくは請求項26に記載の方法によって得られる偽型 ウイルス粒子又は請求項27に記載の哺乳類細胞を投与することを含む疾患の治 療方法。
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