DE69829174T2

DE69829174T2 - Exprimierung eines modifiziertem "foamy virus envelope protein" (hüllenprotein)

Info

Publication number: DE69829174T2
Application number: DE1998629174
Authority: DE
Inventors: Axel Rethwilm; Dirk Lindemann; Jan Arend WINTER
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Vectoria Forschungsfoerderungs Verein Ev 97 De
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2018-03-14
Also published as: DE69829174D1; EP0977881B1; CA2199989A1; EP0977881A1; ATE290093T1; JP2001514517A; ES2236888T3; AU733948B2; AU6110698A; WO1998040507A1

Description

Die Foamy-Virus (FV)-Untergruppe von retroiden Viren hat aufgrund ihrer einzigartigen Replikationsstrategie und aufgrund ihrer potentiellen Verwendung als Gentransfervektoren (35) wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen. Es ist vorgeschlagen worden, dass FVs ideale Werkzeuge (Tools) für die Entwicklung eines Genabgabesystems sein könnten aufgrund von speziellen Eigenschaften dieser Virusgruppe, wie dem Fehlen von FV-Antikörpern in der humanen Population, dem gutartigen Verlauf von natürlichen FV-Infektionen, deren sehr breitem Wirtszellspektrum und einer erweiterten Verpackungsgrenze aufgrund der Größe des FV-Genoms (4, 30, 32). Jedoch haben die begrenzten Kenntnisse der Molekularbiologie dieser Virusgruppe bislang die Entwicklung von sicheren Verpackungszelllinien und Vektoren, wie jene, die unter anderem für Mäuse-Retroviren abgeleitet worden sind (27), nicht erlaubt. Beispielsweise ist das FV ein DNA-Virus mit einer komplexen Genomorganisation. Zusätzlich zu LTRs (lange terminale Wiederholung), einer Verpackungsregion und gag-, pol-, env-Genen umfasst es auch mehrere Gene, wie bel1, bel2, bel3, bet, beo und bes, die zwischen env und der 3'-LTR lokalisiert sind. Das env-Gen kodiert einen glycosylierten 130 kDa-Vorläufer, der gespalten wird unter Erzeugung der Oberflächen (SU)-Untereinheit und der Transmembran (TM)-Untereinheit (siehe 1 und 4). Die TM-Untereinheit umfasst in deren 3'-Abschnitt eine Transmembranankerdomäne (A in 4), welche aus hydrophoben Resten gebildet wird, der ein zytoplasmatischer Schwanz folgt. Darüber hinaus exprimieren FVs ihr Pol-Protein ausgehend von einer gespleißten mRNA unabhängig von dem Gag-Protein, und der Mechanismus der FV-Genom-Verpackung und des Partikel-Zusammenbaus wie auch die Signifikanz von hohen Mengen von revers transkribierter DNA in dem extrazellulären Partikel sind weitgehend unbekannt (10, 18, 39). Andere einzigartige Merkmale umfassen die nukleäre Lokalisation des Gag-Vorläuferproteins (31, 40) und das vorherrschende Knospen in intrazytoplasmatische Vesikel, was eine Folge des Zurückhaltens des Env-Vorläuferproteins in dem ER sein könnte (13).
Auf dem Moloney-Retrovirus basierende Gentransfervektoren sind gegenwärtig die hauptsächlichen Vehikel für einen stabilen hocheffizienten Gentransfer in eine große Vielzahl von Zellarten (20). Die bedeutenderen Beschränkungen dieses Vektorsystems sind das eingeschränkte Wirtszellspektrum und die uneffiziente Infektiosität hinsichtlich einiger humaner Zellen (als Übersicht dargestellt in (1)). Unlängst ist gezeigt worden, dass mehrere Verfahren unter Verwendung der Pseudotypisierung mit fremden Hüllproteinen, wie dem Glycoprotein G des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV; „vesicular stomatitis virus") (6, 38) oder dem Hüllprotein des Gibbonaffen-Leukämievirus (GALV; „gibbon ape leukemia virus") (2, 34), diese Nachteile überwinden.
Jedoch ist die Expression von VSV-G beispielsweise für die Produzentenzellen hochgradig toxisch und hat die Erzeugung einer stabilen VSV-G-Verpackungszelllinie verhindert (8, 22, 37).
Es sind bereits einige Modifikationen in dem env-Protein des Foamy-Virus offenbart worden. Tatsächlich offenbaren Mahnke et al. (J. Virol. Methods, 29(1), 1990, 13-22) Konstrukte für die Expression des env-Proteins des HSRV („Human Foamy Virus") fusioniert an das MS2-Polymerasepeptid, und die resultierende Expression des Fusionsproteins in E. coli, und Goepfert et al. (Journal of Virology, Band 71, Nr. 1, 1997, 778-784) offenbaren Konstrukte mit veränderten HFV-env-Codons.
Die Erfindung betrifft jedoch Konstrukte für die Expression eines Proteins, welches wenigstens ein modifiziertes FV-Hüllprotein umfasst, welches an AS 975 oder, mehr bevorzugt, 981 verkürzt ist. Die Verkürzung kann sich bis zu dem Stop-Codon erstrecken oder alternativ vor dem Stop-Codon optional einen oder mehrere Reste von dem ursprünglichen FV-env-Protein umfassen.
Das im Rahmen der Erfindung verwendete modifizierte FV-env-Protein ist ein Fusionsprotein, das darüber hinaus die Gesamtheit oder vorzugsweise einen Teil eines Nicht-FV-Hüllproteins umfasst.
Das bevorzugte FV gemäß der Erfindung ist das humane Foamy-Virus (HFV), es können aber andere verwendet werden (z.B. Affen-FV).
Beispiele von geeigneten Nicht-FV-Viren umfassen Vogel-Retroviren, Rinder-Retroviren, Katzen-Retroviren, Mäuse-Retroviren, wie das Mäuse- Leukämievirus (MuLV; „Murine Leukemia Virus") und insbesondere das Moloney-MuLV (MoMuLV), das „Friend Murine Leukemia Virus" (FrMuLV), speziell den Stamm FB 29, das Mäuse-Sarkom-Virus (MSV; „Murine Sarcome Virus"), Primaten-Retroviren, wie GALV, VSV, oder Lentiviren, wie HIV („Human Immunodeficiency Virus") oder SIV („Simian Immunodeficiency Virus").
Die Fusion zwischen FV und Nicht-FV-env-Proteinen kann an unterschiedlichen Positionen erfolgen. Fusionen innerhalb der TM-Untereinheit sind vorteilhaft. Gemäß einer ersten Alternative befindet sich die Fusion innerhalb der Transmembranankerdomäne des FV-Hüllproteins und des Nicht-FV-Hüllproteins. Ein bevorzugtes Beispiel ist ein Protein, das die extrazelluläre Domäne und den 5'-Abschnitt der Transmembranankerdomäne des HFV-Hüllproteins und den 3'-Abschnitt der Transmembranankerdomäne und die zytoplasmatische Domäne des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins umfasst.
Eine zweite Alternative besteht darin, dass die Fusion innerhalb der Spaltstelle der FV- und Nicht-FV-Hüllproteine erfolgt. Ein bevorzugtes Beispiel ist ein Protein, welches die SU-Domäne und die Gesamtheit oder einen Teil der Spaltstelle des HFV-Hüllproteins und die Gesamtheit oder einen Teil der Spaltstelle und die TM-Domäne, umfassend die Transmembranankerdomäne und die zytoplasmatische Domäne, des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins umfasst. Das Ersetzen der Spaltstelle des FV-Hüllproteins durch dessen Äquivalent aus dem Nicht-FV-Hüllprotein kann ebenfalls in Betracht gezogen werden.
Eine andere Alternative besteht darin, dass die Fusion an der Verbindungsstelle zwischen der Transmembranankerdomäne und der zytoplasmatischen Domäne oder innerhalb der zytoplasmatischen Domänen des FV- und Nicht-FV-Hüllproteins erfolgt. Ein bevorzugtes Beispiel ist ein Protein, welches die extrazelluläre Domäne, die Transmembranankerdomäne und die Gesamtheit oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne des HFV-Hüllproteins und die Gesamtheit oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht ein erfindungsgemäßes Protein aus dem HFV-Hüll-Protein, in welchem die Gesamtheit oder ein Teil der zytoplasmatischen Domäne durch die Gesamtheit oder einen Teil einer zytoplasmatischen Domäne eines Nicht-FV-Virus-Hüllproteins, insbesondere eines MuLV-Hüllproteins ersetzt ist. Vorteilhafterweise besteht das Fusionsprotein aus der Fusion einer zytoplasmatischen Domäne eines MuLV mit einem modifizierten HFV-Hüllprotein. Die zytoplasmatische Domäne eines MuLV, welche im Rahmen der Erfindung verwendet wird, kann prozessiert oder unprozessiert sein. „Prozessiert" bedeutet, dass sie die Spaltstelle, die normalerweise durch die entsprechende retrovirale Protease erkannt wird, enthält, und „unprozessiert", dass sie diese nicht enthält oder dass sie nicht funktional ist (Mutation, Deletion oder Verkürzung).
Das bevorzugte Konstrukt der Erfindung ist dasjenige, das die Expression des Fusionsproteins, welches nachfolgend als HFV Δ2 MuLV bezeichnet wird, erlaubt.
Alternativ besteht ein bevorzugtes Protein gemäß der Erfindung in einem HFV-Hüllprotein, in welchem die Gesamtheit oder ein Teil des zytoplasmatischen Schwanzes durch die Gesamtheit oder einen Teil einer zytoplasmatischen Domäne eines SIV-Hüllproteins ersetzt ist. Es gibt zwei Versionen des SIV-Hüllproteins: eine lange Form mit einem zytoplasmatischen Schwanz von 164 Aminosäuren, die in SIV-Partikeln vorhanden ist, die sich in dem natürlichen Wirt, dem Rhesus-Affen (Macaca mulatta), vermehren, und eine kurze Form, die nur 18 Aminosäuren enthält. Diese kurze Form wird gewählt, wenn aus dem Affen isolierte Viren auf humanen Zelllinien kultiviert werden (42).
Es ist auch möglich, dass das Konstrukt der Erfindung in der Donor- und/oder der Akzeptor-Spleißstelle, die natürlicherweise in der das FV-env-Protein kodierenden Sequenz vorhanden sind, mutiert ist.
Das Konstrukt der Erfindung kann regulatorische Elemente umfassen, um eine Transkription und Translation der das modifizierte FV-env-Protein kodierenden Sequenz zu ermöglichen. Insbesondere kann ein geeigneter Promotor strangaufwärts von der FV-env kodierenden Sequenz in einer operativen bzw. funktionsfähigen Weise durch herkömmliche Techniken der in vitro-DNA-Rekombination hinzugefügt werden. Ein solcher Promotor kann von prokaryotischem, eukaryotischem oder viralem Ursprung sein und kann konstitutiv oder reguliert sein. Solche regulatorischen Elemente sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt.
Es liegt gleichfalls im Umfang der Erfindung, dass das Konstrukt der Erfindung zusätzlich ein der Selektion dienendes Gen umfassen kann, welches die Detektion und Isolierung der das modifizierte FV-env-Protein exprimierenden Zellen ermöglicht. Im Kontext der Erfindung kann das der Selektion dienende Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors, welcher die Expression des modifizierten FV-env-Proteins steuert, stehen, was zu einem bicistronischen Transkript führt, oder unter der Kontrolle einer zusätzlichen Promotorregion stehen. Die möglichen der Selektion dienenden Gene sind zahlreich, beispielsweise das neo-Gen, welches Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht, das Dihydrofolatreductase (dhFr)-Gen, das Puromycinacetyltransferase (pac)-Gen oder (das) Xanthinphosphoribosyltransferase (gpt) (-Gen).
Das Konstrukt der Erfindung kann in einen jeglichen geeigneten Vektor, einen viralen Vektor (z.B. einen retroviralen Vektor) oder ein Plasmid inseriert werden. Die Auswahl des geeigneten Vektors ist groß und liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns auf diesem Gebiet. Ein solcher Vektor kann integrativ sein oder nicht. Um die Möglichkeit, Replikations-kompetente Viruspartikel zu erzeugen, zu verringern, ist es vorteilhaft, dass dem Konstrukt eine jegliche retrovirale LTR und Verpackungsregion fehlt.
Die Erfindung betrifft auch Fusionsproteine, wie sie durch die obigen Expressionskonstrukte exprimiert werden, wie auch pseudotypisierte Viruspartikel, die ein FV-env-Protein umfassen. Dieses Letztgenannte kann von einem nativen FV-env-Protein, einem Teil davon oder einem modifizierten FV-env-Protein abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das pseudotypisierte Viruspartikel an seiner Oberfläche ein modifiziertes FV-env-Protein, wie es durch ein erfindungsgemäßes Konstrukt exprimiert wird. Das pseudotypisierte Viruspartikel der Erfindung kann nach Transfektion einer Komplementationszelllinie mit dem rekombinanten viralen Vektor erzeugt werden. Die Technik ist konventionell und wird in zahlreichen Dokumenten des Standes der Technik beschrieben. Ein im Rahmen der Erfindung verwendeter viraler Vektor umfasst vorzugsweise wenigstens eine 5'-LTR, eine Verpackungsregion und eine 3'-LTR, welche abgeleitet sind von einem beliebigen Retrovirus, wie jene, die zuvor aufgeführt worden sind, und ein Gen, welches in der Lage ist, ein Ribozym, ein Antisinn-RNA-Molekül oder eine mRNA, um weiter ein Polypeptid von Interesse zu produzieren, zu exprimieren. Von besonderem Interesse sind therapeutische Polypeptide, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zytokine (IL-2, IFN α, β oder γ), die Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus vom Typ 1 (HSV-1), den „Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator" (CFTR; zystische Fibrose-Transmembranleitfähigkeitsregulator), Dystrophin, Gerinnungsfaktoren (FVIII, FIX, ...), Tumor-assoziierte Antigene (MUC-1, HPV-Antigene), Antikörper, Immunotoxine, anti-HIV-Arzneimittel, Wachstumsfaktoren (Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)), Apoptose-Induktionsmittel (Bax...), Apoptose-Inhibitoren (Bcl2, Bclx...), Zytostatika (p21, p16, Rb), Apolipoproteine, Stickoxidsynthetase (NOS), Sauerstoffradikalfänger (SOD, Katalase...), Tumorsuppressorprodukte (p53, p73) und Marker. Diese Liste ist nicht einschränkend. Darüber hinaus kann der im Rahmen der Erfindung verwendete virale Vektor ein oder mehrere Gene in einer nativen, verkürzten, mutierten oder hybriden Form transferieren. Das oder die Gen(e) ist bzw. sind unter die Kontrolle von Elementen, die dessen bzw. deren Expression in einer eukaryotischen Zelle erlauben, gestellt. Solche Elemente umfassen einen Promotor, der von einer jeglichen Herkunft sein kann (retrovirale LTR oder interner Promotor). Er kann konstitutiv oder auf Zell- oder Gewebe-spezifische Faktoren ansprechen.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf eine Komplementationszelllinie, welche die Produktion der pseudotypisierten Viruspartikel erlaubt, und auf das Verfahren zu deren Herstellung.
Die Erfindung betrifft ferner eine Komplementationszelllinie, welche ein Konstrukt der Erfindung umfasst.
Die Komplementationszelllinie umfasst vorzugsweise ein Konstrukt der Erfindung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Fusion an der Verbindungsstelle zwischen der Transmembranankerdomäne und der zytoplasmatischen Domäne oder innerhalb der zytoplasmatischen Domänen des FV- und Nicht-FV-Hüllproteins vorliegt und dass das exprimierte Protein die extrazelluläre Domäne, die Transmembranankerdomäne und die Gesamtheit oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne des HFV-Hüllproteins und die Gesamtheit oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins umfasst.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Komplementationszelllinie ein Konstrukt der Erfindung für die Expression eines Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein HFV Δ2 MuLV ist.
Die Komplementationszelllinie der Erfindung kann sich von einer beliebigen Zelle und insbesondere von einer eukaryotischen Zelle ableiten. Man kann Mäuse-Zelllinien, aus pharmazeutischer Sicht annehmbare Zelllinien (Vero, CHO, ...) oder eine humane Zelllinie, wie 293 oder A549, in Betracht ziehen. Sie kann erzeugt werden durch Transfektion mit einem erfindungsgemäßen Konstrukt zusammen mit einem ersten der Selektion dienenden Gen. Die stärksten env-Produzentenzellen werden dann hinsichtlich einer Expression von hohen Konzentrationen von FV-env-Protein durch Immundetektion unter Verwendung von Antikörpern gegen FV-env, Western-Blot, FACS („Fluorescence Activated Cell Sorter"; Fluoreszenz-aktivierter Zellsorter) oder eine jegliche andere Methode gescreent. Alternativ kann die Komplementationszelllinie der Erfindung auch ein Konstrukt umfassen, welches ein virales gag/pol-Gen exprimiert, mehr bevorzugt von MuLV, FB 29, SIV oder HFV, zusammen mit einem zweiten der Selektion dienenden Gen, welches sich von dem ersten unterscheidet. Die env- und gag/pol-Gene befinden sich vorzugsweise auf einem separaten Expressionsvektor, welchem LTR und Verpackungsregion fehlt. Die Selektions- und Screeningschritte werden wiederholt, um einen env produzierenden Klon zu selektieren, der des Weiteren das gag/pol-Expressionsprodukt exprimiert.
Eine Komplementationszelllinie der Erfindung kann verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren zu verpacken. Der Titer kann unter Verwendung eines herkömmlichen viralen Vektors, welcher ein drittes der Selektion dienendes Gen, welches sich von den vorigen unterscheidet, oder ein Markergen (z.B. Lac Z) exprimiert, getestet werden. Als Ergebnis werden Zellen, die hohe Titer von pseudotypisierten Viruspartikeln produzieren, selektiert und können kultiviert werden, um eine stabile Komplementationszelllinie bereitzustellen. Die Zellen können auch transient getestet werden, wie dies üblicherweise ausgeführt und nachfolgend beschrieben wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines pseudotypisierten Viruspartikels der Erfindung bereitgestellt. Ein solches Verfahren umfasst die Schritte, (1) einen rekombinanten retroviralen Vektor in eine Komplementationszelllinie der Erfindung einzuführen, (2) die Komplementationszelllinie unter geeigneten Bedingungen, um die Produktion des pseudotypisierten Viruspartikels zu ermöglichen, zu kultivieren und (3) das resultierende pseudotypisierte Viruspartikel aus der Zellkultur zu gewinnen.
Das pseudotypisierte Viruspartikel wird vorzugsweise aus dem Zellkulturüberstand gewonnen, es kann aber auch ein Zelllyseschritt in Betracht gezogen werden. Das pseudotypisierte Viruspartikel kann auch durch herkömmliche Techniken (z.B. Ultrazentrifugation auf Saccharose- oder CsCl-Gradienten) weiter gereinigt werden. Das so hergestellte pseudotypisierte Viruspartikel ist vorteilhafterweise in der Lage, eine große Vielzahl von Zellen zu infizieren (vorzugsweise in Abwesenheit von Polykationen, wie Polybren) und gegebenenfalls einer Inaktivierung durch humanes Serum zu widerstehen.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird auch eine Säugetier-Wirtszelle bereitgestellt, welche mit dem pseudotypisierten Viruspartikel der Erfindung oder mit einem pseudotypisierten Viruspartikel, welches durch ein Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, infiziert ist. Eine solche Wirtszelle umfasst, ohne Einschränkung, humane Epithel-, Lungen-, Muskel-, Leberzellen, hämopoetische Zellen, Fibroblasten und Lymphozyten.
Ein pseudotypisiertes infektiöses Partikel wie auch eine Säugetierzelle der Erfindung können bei der Verhütung oder Behandlung von verschiedenen Krankheiten, als Impfstoff oder als ein therapeutisches Mittel angewendet werden.
Es liegt gleichfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, welche eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines pseudotypisierten Viruspartikels der Erfindung, oder welches durch ein Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, wie auch einer Säugetierzelle der Erfindung als therapeutisches Mittel umfasst. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann auf eine herkömmliche Weise hergestellt werden. Insbesondere können das Partikel oder die Säugetierzelle der Erfindung mit geeigneten Substanzen, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, wie einem Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Vehikel, kombiniert werden. Die jeweilige Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung hängt von verschiedenen Parametern ab, beispielsweise dem zu exprimierenden Polypeptid von Interesse, dem gewünschten Wirkort, dem Verabreichungsverfahren und dem zu behandelnden Individuum. Eine solche Formulierung kann durch die Fachleute auf diesem Gebiet und durch herkömmliche Kenntnisse festgelegt werden.
Typischerweise werden die pseudotypisierten Partikel als eine Lösung in einem annehmbaren Verdünnungsmittel, wie Kochsalzlösung, Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, oder einem anderen aus pharmazeutischer Sicht annehmbaren Verdünnungsmittel hergestellt. Die Inokulationsroute kann intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal, intrapulmonal, intratracheal, intragastrisch und intratumoral sein. Die Dosis kann eine einmalige oder eine wiederholt verabreichte sein. Die Menge wird abhängig von individuellen Parametern (Gewicht, Geschlecht, Alter, medizinischer Zustand...) und der zu behandelnden Krankheit variieren. Im Allgemeinen ist es wünschenswert, die pseudotypisierten Viruspartikel der Erfindung in einem Bereich von ungefähr 10⁴ bis 10¹³ Plaque-bildenden Einheiten (pfu)/Dosis, vorteilhafterweise von ungefähr 10⁵ bis ungefähr 10¹⁰ und vorzugsweise von ungefähr 10⁶ bis ungefähr 10⁹ Plaquebildenden Einheiten (pfu)/Dosis bereitzustellen. Die Zusammensetzung der Erfindung kann in ein Säugetier (einen Menschen) ex vivo eingeführt werden durch vorab erfolgende Exposition von Zielzellen gegenüber den pseudotypisierten Viruspartikeln vor einer Einführung der transduzierten Zellen in ein Säugetier, oder in vivo in das betroffene Gewebe, in den Blutkreislauf oder lokal injiziert werden.
In einer letzten Ausführungsform der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Behandlung einer genetisch-bedingten Erkrankung oder einer Erkrankung, die durch ein beliebiges pathogenes Gen induziert wird, wie Krebs, oder einer durch ein Virus induzierten Erkrankung bereitgestellt, welches umfasst, eine therapeutisch wirksame Menge eines pseudotypisierten Viruspartikels oder einer Säugetierzelle der Erfindung an ein Individuum, welches einer Behandlung bedarf, zu verabreichen.
Diese und andere Vorteile der Erfindung werden aus den folgenden Beispielen und beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Diese Ausführungsformen repräsentieren nicht den vollen Umfang der Erfindung.
Insbesondere wurde der Einbau von Hüllproteinen des humanen Foamy-Virus (HFV) in Mäuse-Leukämievirus (MuLV)-Partikel in einem transienten Transfektions-Verpackungs-Zellsystem untersucht. Wir berichten hier, dass Wildtyp-HFV-Hüllprotein MuLV-Partikel pseudotypisieren kann, obgleich mit geringer Effizienz. Eine vollständige oder teilweise Entfernung des zytoplasmatischen HFV-Schwanzes führte zu einer Vernichtung oder Verringerung der HFV-vermittelten Infektiosität, was eine Rolle des zytoplasmatischen Schwanzes des HFV-Hüllproteins bei der Pseudotypisierung von MuLV-Partikeln nahe legt. Eine Mutation des in dem zytoplasmatischen Schwanz des HFV-Hüllproteins enthaltenen ER-Retentionssignals führte nicht zu einer höheren relativen Infektiosität von pseudotypisierten retroviralen Vektoren. Jedoch zeigte ein chimäres Hüllprotein, welches eine unprozessierte zytoplasmatische Domäne des MuLV-Hüllproteins fusioniert an ein verkürztes HFV-Hüllprotein enthielt, eine verstärkte HFV-spezifische Infektiosität als Ergebnis eines erhöhten Einbaus von chimären Hüllproteinen in MuLV-Partikel.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1
Schematische Veranschaulichung der HFV-Hüllprotein-Expressionskonstrukte
Die extrazelluläre, Membran-durchdringende Domäne (auch bezeichnet als Transmembranankerdomäne A) und die zytoplasmatische Domäne der TM-Komponenten des HFV-Hüllproteins (leere Rahmen) und des MuLV-Hüllproteins (schattierte Rahmen) sind gemäß (11, 24) gezeigt. Die A minosäuresequenz der Wildtyp-HFV- und MuLV-Proteine sind unter der schematischen Veranschaulichung angegeben. Die Aminosäurepositionen in den HFV-Hüllproteinkonstrukten sind auf dem Lineal markiert. Die Lage des Sequenzmotivs in der zytoplasmatischen Domäne des HFV-Hüllproteins, welches für die ER-Retention verantwortlich ist (13), ist als ausgefüllter Rahmen, die mutierte Sequenz als schraffierter Rahmen angegeben. Die Spaltstelle der MuLV-Protease in der zytoplasmatischen Domäne des MuLV-Hüllproteins voller Länge wird durch zwei invertierte Pfeile angegeben.
2
Infektiosität von MuLV-Partikeln, die mit verschiedenen Hüllproteinen pseudotypisiert sind
NIH3T3 (schraffierter Balken)- oder QT-6 (ausgefüllter Balken)-Zellen wurden mit unterschiedlichen pseudotypisierten MuLV-Partikeln, die durch transiente Transfektion von 293T-Zellen erzeugt worden sind, infiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transduktion wurde der Prozentsatz von GFP exprimierenden Zellen durch FACS-Analyse quantifiziert. Die mittlere Fluoreszenz von GFP exprimierenden Zellen lag 100- bis 300-fach über jener von Mock-infizierten Zellen. Die individuellen Hüllkonstrukte, die für die Pseudotypisierung verwendet wurden, sind auf der y-Achse des Graphs angegeben. Der mittlere Prozentsatz von GFP exprimierenden Zellen ist für jedes Konstrukt auf der x-Achse mit der entsprechenden Standardabweichung gezeigt. Individuelle Konstrukte wurden zwei- bis sechsmal getestet.
3
Neutralisierung von HFV-Hüllprotein-spezifischer Infektiosität
Mit verschiedenen Hüllproteinen, wie auf der y-Achse angegeben, pseudotypisierte MuLV-Partikel wurden durch transiente Transfektion von 293T-Zellen erzeugt. Überstände (1 ml) wurden vor der Zugabe zu NIH3T3 (A)- oder QT-6 (B)-Zellen mit anti-HFV-spezifischem Schimpansenserum (1:60) (ausgefüllter Balken) oder humanem Serum (1:60) von einem gesunden Individuum (schraffierter Balken) 1 h bei 37°C inkubiert. Der Überstand wurde vier Stunden später abgesaugt und durch frisches Vermehrungsmedium ersetzt. Achtundvierzig Stunden nach der Transduktion wurde der Prozentsatz von GFP exprimierenden Zellen bestimmt, wie in der Legende von 2 beschrieben. Das Experiment wurde zweimal mit einem neutralisierenden Affenserum und zusätzlich mit einem anti-HFV-Oberflächen-Kaninchen-Serum ausgeführt (Daten nicht gezeigt), was zu einer ähnlichen relativen Hemmung der Infektiosität von mit HFV-Hüllproteinen pseudotypisierten retroviralen Vektoren führte.
4
Schematische Darstellung der chimären HFV/SN-Hüllprotein-Konstrukte
HFV WT und SIV sind Wildtyp-Versionen der Hüllproteingene des humanen Foamy-Virus und des „Simian Immunodeficiency Virus" (molekularer Klon mm251). Domänen aus HFV sind in weiß und Domänen aus SIV sind in grau. Die Spaltstelle, die die SU- und die TM-Domäne voneinander trennt, ist mit einer vertikalen Linie angegeben. RRE steht für „rev responsive element" (auf rev ansprechendes (responsives) Element) und A für die Transmembranankerdomäne. Die extrazelluläre Domäne 5' von der Transmembranankerdomäne und die zytoplasmatische Domäne 3' von der Transmembranankerdomäne sind ebenfalls angegeben. Env 1 bis 9 sind Darstellungen der chimären HFV/SIV-env-Konstrukte, welche eine Fusion mit der langen Version (Env 1, 3 und 5) oder kurzen Version (Env 2, 4, 6, 7, 8 und 9) des SIV-Hüllproteins umfassen.
5
Sequenz der HFV-, SIV- und chimären env-Gene, welche die Fusionsstellen flankieren, und Aminosäuresequenzen des langen und kurzen zytoplasmatischen Schwanzes von SIV-env
A. veranschaulicht die Transmembranankerdomänen der env-Gene von HFV und SIV mm251 und die Fusion in der Transmembranankerdomäne von HFV und SIV mm251 (Schimp.): identische Aminosäuren in den HFV- und SIV-Hüllproteinen sind fettgedruckt, die Sequenzen der Transmembranankerdomäne der HFV- und SIV-Hüllproteine sind unterstrichen. B. veranschaulicht die Fusion an der Spaltstelle zwischen der SU- und der TM-Domäne der HFV- und SIV mm251-Hüllproteine: die Consensus-Sequenz der Spaltstelle ist fettgedruckt, die Spaltstelle ist durch einen Abstand in der Aminosäuresequenz angegeben. C. veranschaulicht das Ersetzen des zytoplasmatischen Schwanzes des HFV-Hüllproteins durch den zytoplasmatischen Schwanz des SIV mm251-Hüllproteins: die Transmembranankersequenzen sind unterstrichen, (141) bezeichnet die letzten 141 Aminosäuren von dem langen zytoplasmatischen Schwanz aus SIV. D. Aminosäuresequenzen des langen und des kurzen zytoplasmatischen Schwanzes des SIV-Hüllproteins: die Transmembranankerdomänen sind unterstrichen, * bezeichnet ein Stop-Codon, (141) bezeichnet die letzten 141 Aminosäuren aus dem langen zytoplasmatischen Schwanz aus SIV.
6
Zerstörung der internen 3'-Spleißstelle von SIV mm251-env
Die oben gezeigte Aminosäuresequenz stammt von dem SIV mm251-env-Gen, * bezeichnet das Stop-Codon des humanisierten env-Gens. A bezeichnet die G→A-Mutation, welche zu der Zerstörung der 3'-Spleißstelle führt. Das Exon 2 von Tat/Rev beginnt bei der Sequenz TAGACT, aber das Leseraster unterscheidet sich von dem env-Leseraster.
Die Erfindung wird jetzt in den folgenden und nicht-einschränkenden Beispielen veranschaulicht.
BEISPIELE
Alle Konstruktionen erfolgen durch Verwendung von Standard-in vitro-DNA-Rekombinationstechniken wie jene, die in T. Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY 1982, beschrieben werden. Die Zelllinien sind von den Kultursammlungen, wie der ATCC, erhältlich und werden durch Standardbedingungen kultiviert (NIH3T3: CRL-1658, Mv.1.Lu CCL64, HT 1080 CCL 121, BHK 21 CCL 10, QT 26 CRL 1708 und 293 CRL 1573). Die Sequenz des HFV-env-Proteins ist bereits veröffentlicht worden und ist in der EMBL-Datenbank erhältlich (Aufnahmenummer 407725).
BEISPIEL 1: HFV/MLV-Chimäre.
1. Erzeugung eines FV-env-Expressionskonstrukts
Es wurde ein eukaryotisches Expressionskonstrukt für das Hüllproteingen des humanen FV-Isolats (HFV) erzeugt, indem ein 3076 bp-AflII/EcoRI-Fragment des proviralen HFV-Klons pHSR VI (28), welches das offene Leseraster (ORF) von env in voller Länge enthält, in den pCDNA3-Vektor (Invitrogen) inseriert wurde. Dieses Konstrukt wurde als pCHFV wt bezeichnet und verwendet, um die in 1 gezeigten mutierten und chimären HFV-Hüllproteine zu erzeugen. Kurz zusammengefasst, wurden verkürzte oder chimäre env-Konstrukte hergestellt durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion an HFV- und/oder MuLV-env-Genen als Matrizen und von Oligonukleotiden, die die gewünschten Mutationen ent hielten. Die Mutanten wurden in den oben beschriebenen Basisvektor inseriert und sequenziert, um von den Zielstellen abweichende Mutationen auszuschließen. Es wurden drei Konstrukte mit mutierten HFV-Hüllproteinen erzeugt. pCHFV Δ1 und pCHFV Δ2 kodieren HFV-Hüllproteine, die an AS 975 bzw. 981 verkürzt sind. pCHFV Δ2 weist ein hinzugefügtes C-terminales Arginin auf, das in der ursprünglichen HFV-env-Sequenz nicht vorhanden ist. Gemäß der von Flugel et al. (11) vorgeschlagenen Domänenstruktur des HFV-Hüllproteins führten die Verkürzungen zu einer vollständigen (pCHFV Δ1) oder teilweisen Entfernung (pCHFV Δ2) der zytoplasmatischen Domäne. Schließlich produziert das pCHFV SSS-Konstrukt ein HFV-Hüllprotein, bei welchem das dreifache Lysin-Motiv (AS 984-986) an dem C-terminalen Ende des zytoplasmatischen Schwanzes des Transmembran (TM)-Proteins durch Serinreste ersetzt ist. Es ist gezeigt worden, dass dieses Sequenzmotiv für die ER-Retention des HFV-Hüllproteins verantwortlich ist (13, 14).
Insgesamt 6 chimäre Hüllproteine wurden durch C-terminale Fusion von Sequenzen, die die unprozessierte oder prozessierte zytoplasmatische Domäne des MuLV-Hüllproteins kodieren (16, 17), konstruiert. pCHFV Δ1MuLVR-, pCHFV Δ2MuLVR- und pCHFV SSSMuLVR- kodieren Fusionsproteine, bestehend aus den 3 oben beschriebenen Mutationen und einer prozessierten zytoplasmatischen Domäne (AS 634-649) des MuLV-Hüllproteins, wohingegen pCHFV Δ1MuLV, p CHFV Δ2MuLV und pCHFV SSSMuLV die jeweiligen Fusionsproteine kodieren, die eine unprozessierte zytoplasmatische Domäne (AS 634-665) des MuLV-Hüllproteins am C-Terminus enthalten.
Die Expressionskonstrukte für MuLV-gag/pol (pHIT60), das ekotrope (pHIT123) und amphotrope (pHIT456) MuLV-Hüllprotein wurden freundlicherweise von A. Kingsman (33) zur Verfügung gestellt. Der retrovirale Vektor SFG GFPS65T enthält das humanisierte ORF des grünen fluoreszierenden Proteins (7) (ein Geschenk von M. Vogel), welches in die Klonierungsstellen des auf MuLV basierenden retroviralen Vektors SFG (5, 22) inseriert ist, wohingegen MFG.S NLS-LacZ (22) das β-Galactosidasegen enthält, welches an das Kernlokalisierungssignal (NLS) von SV40 fusioniert ist (ein Geschenk von R. Mulligan). Das VSV-G-Expressionskonstrukt wurde erzeugt, indem ein 1,6 kb-EcoRI-Fragment des Plasmids pSVGL-1 (29) (ein Geschenk von J. Rose), welches das VSV-G-ORF enthielt, in den pHIT-Vektor inseriert wurde.
2. Infektiosität von MuLV-Partikeln, die mit verschiedenen AFV-env-Proteinen pseudotypisiert sind
Rekombinante retrovirale Partikel wurden erzeugt unter Verwendung des pHIT-Verpackungssystems im Wesentlichen, wie zuvor beschrieben (33). Kurz zusammengefasst, wurden 293T-Zellen (9) transient mit einem Expressionskonstrukt für MuLV-gag/pol (pHIT60), dem auf MuLV basierenden retroviralen Vektor SFG GFPS65T und den verschiedenen Hüllprotein-Expressionskonstrukten, die oben beschrieben worden sind, cotransfiziert. Virusüberstände wurden 48-72 h nach der Transfektion geerntet. Überstände von unabhängigen Transfektionen mit den gleichen Plasmiden wurden gepoolt, filtriert (0,45 μm Porengröße), es wurde Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 μg/ml zugesetzt und die Überstände wurden unverzüglich verwendet oder bei –80°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Zielzellen, welche das GFP-Protein nach retroviraler Transduktion exprimierten, wurden durch FACS-Analyse an einem FACScan identifiziert, und die Anzahl von positiven Zellen wurde unter Verwendung des LysisII- und CellQuest-Softwarepakets (Becton Dickinson) quantifiziert.
Anfängliche Experimente unter Verwendung des pCHFV wt-Expressionskonstrukts zeigten, dass MuLV-Partikel mit dem HFV wt-Hüllprotein pseudotypisiert werden können und in der Lage sind, NIH3T3-Zellen zu transduzieren, obgleich mit niedriger Effizienz (2). Das HFV-Hüllprotein enthält in seiner zytoplasmatischen Domäne eine Signalsequenz, die zu einer Retention im ER von exprimierenden Zellen führt (13, 14). Dementsprechend wurden drei Konstrukte, pCHFV Δ1, pCHFV Δ2 und pCHFV SSS, welche zytoplasmatisch verkürzte oder mutierte HFV-Hüllproteine kodieren, untersucht, um den Einfluss der zytoplasmatischen Domäne des HFV-Hüllproteins und von dessen ER-Retention auf die Pseudotypisierungseffizienz zu bestimmen. Die vollständige (pCHFV Δ1) oder teilweise Entfernung (pCHFV Δ2) der zytoplasmatischen Domäne des HFV-Hüllproteins führt zu einer Vernichtung oder Verringerung der bereits geringen Pseudotypisierungsaktivität, die für das Wildtyp-Protein beobachtet wird (2). Es ist zuvor gezeigt worden, dass eine Mutation des zytoplasmatischen ER-Retentionssignals (pCHFV SSS) die Zelloberflächenexpression des HFV-Hüllproteins erhöht (13). Jedoch führte eine Pseudotypisierung von Viruspartikeln mit einem solchen mutierten Pro tein ebenfalls nicht zu einer höheren Infektiosität dieser Viren (2).
Da die Entfernung oder Modifizierung der zytoplasmatischen HFV-Domäne unwirksam war, die Infektionseffizienz von pseudotypisierten Viren zu erhöhen, ist nachfolgend ein zweiter Ansatz verwendet worden, um zu testen, ob das Ersetzen der zytoplasmatischen HFV-Domäne durch die zytoplasmatische MuLV-Domäne oder die Fusion der zytoplasmatischen MuLV-Domäne mit einem modifizierten Volllängen-HFV-Hüllprotein die gewünschte Wirkung haben würde. Es ist gezeigt worden, dass die zytoplasmatische Domäne des MuLV-Hüllproteins durch die MuLV-Protease in dem Viruspartikel prozessiert wird (16, 17). Eine Expression einer bereits prozessierten Form des MuLV-Hüllproteins in Zellen führte zu der Bildung von großen multinukleären Synzytien und einer Abnahme der Virusinfektiosität (24, 26). Dementsprechend wurden C-terminale Fusionsproteine der drei oben beschriebenen Mutanten und der prozessierten (MuLVR-) oder der unprozessierten (MuLV) zytoplasmatischen Domäne des MuLV-Hüllproteins erzeugt und mit diesen chimären Hüllproteinen pseudotypisierte Partikel wurden hinsichtlich ihrer Infektiosität an NIH3T3-Zellen getestet. Interessanterweise zeigten Viren, die mit einer Mutante, dem HFV Δ2MuLV-Protein, pseudotypisiert sind, eine 10-20-fach höhere Infektiosität als Partikel, die mit dem Wildtyp-HFV-Hüllprotein pseudotypisiert sind (2). Diese Zunahme der Infektiosität durch das HFV Δ2MuLV-Protein war nicht spezifisch für NIH3T3- oder Mäusezellen, da ähnliche Ergebnisse für die Wachtel-Fibroblasten-Zelllinie QT-6, die durch Viruspartikel, die mit MuLV-Hüllproteinen überzogen sind, nicht infizierbar ist, erhalten wurden (2). Bei diesen Zellen war die Infektiosität von Partikeln, die mit dem HFV Δ2MuLV-Hüllprotein pseudotypisiert waren, konsistent höher als von jenen, die mit dem VSV-G-Protein pseudotypisiert waren. Alle anderen analysierten Proteine erzeugten pseudotypisierte Viren mit geringerer oder ähnlicher relativer Infektiosität verglichen mit dem Wildtyp-HFV-Hüllprotein bei beiden Zelllinien (2). Zusätzlich zeigten chimäre HFV-Hüllproteine, die eine prozessierte zytoplasmatische MuLV-Domäne enthielten, eine höhere Fusionsaktivität als die entsprechenden Proteine, die eine unprozessierte zytoplasmatische MuLV-Domäne aufwiesen, bei einer Expression in L929-Zellen durch retrovirale Vektoren (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis steht in Einklang mit Daten, die zei gen, dass die zytoplasmatische Domäne des MuLV-Hüllproteins die Fusionsaktivität von fremden Hüllproteinen, wie des „Simian immunodeficiency virus" (SIV), kontrollieren kann, wenn diese als ein chimäres Hüllprotein exprimiert werden (36). Darüber hinaus wurden Überstände, die einen ein nukleär lokalisiertes β-Galactosidaseprotein kodierenden retroviralen Vektor enthielten, welcher mit den verschiedenen Hüllproteinen pseudotypisiert war, mittels Zelllinien von verschiedenen Spezies titriert (Tabelle). Genauer wurden Zielzellen (1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) 24 h vor der Infektion mit Reihenverdünnungen von Überständen von transfizierten 293T-Zellen ausplattiert. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion wurden die Anzahlen von blauen Foci an doppelt erstellten Proben gezählt und die Titer berechnet. Die Werte der doppelt erstellten Proben lagen innerhalb eines 3-fachen Bereichs. Die gezeigten Ergebnisse repräsentieren zwei unabhängige Titrationen mittels der angegebenen Zelllinien, wobei für alle Zelllinien zellfreie Überstände aus den gleichen Transfektionen verwendet wurden, mit reproduzierbaren relativen Titern in beiden Experimenten. Überstände, welche pseudotypisierte Partikel enthielten, wurden bis zu sechsmal mittels NIH3T3-Zellen mit reproduzierbaren Ergebnissen titriert. Retrovirale Partikel, die mit dem HFV wt-Hüllprotein oder der HFV Δ2MuLV-Chimäre pseudotypisiert waren, waren in der Lage, Zellen von humanem, Nerz-, Wachtel- und Hamster-Ursprung zusätzlich zu Mäusezellen zu infizieren (Tabelle 1). Die Titer von retroviralen Vektoren, die mit dem HFV Δ2MuLV-Hüllprotein pseudotypisiert waren, waren abhängig von den verwendeten Zielzellen 8-35-fach höher als von jenen, die mit dem Wildtyp-HFV-Hüllprotein pseudotypisiert waren.
3. Neutralisation der Infektiosität von HFV-env-pseudotypisierten Partikeln durch HFV-spezifische Antiseren
Um zu bestätigen, dass die Infektiosität von mit verschiedenen HFV-Hüllproteinen pseudotypisierten MuLV-Partikeln für das HFV-Hüllprotein spezifisch war, wurden pseudotypisierte Partikel mit einem anti-HFV-spezifischen Schimpansen-Serum vor der Zugabe zu Zielzellen vorinkubiert (3). Die Infektiosität von mit dem amphotropen MuLV-Hüllprotein oder dem VSV-G-Protein pseudotypisierten Viruspartikeln wurde durch eine Vorinkubation mit dem HFV-spezifischen Antiserum verglichen mit der Vorinkubation dieser Viren mit normalem hitzeinaktiviertem humanem Serum (3) oder Mock-inkubierten Viruspartikeln (Daten nicht gezeigt) nicht verringert. Im Gegensatz dazu wurde die Infektiosität von mit dem Wildtyp-HFV-Hüllprotein oder der HFV Δ2MuLV-Chimäre pseudotypisierten Partikeln vollständig vernichtet durch die Vorinkubation mit dem HFV-spezifischen Antiserum, nicht aber mit dem humanen Kontrollserum (3). Diese Neutralisation von HFV-Hüllprotein-spezifischer Infektiosität wurde bei NIH3T3- (3A) und QT-6- (3B)-Zellen beobachtet. Eine ähnliche spezifische Neutralisation von mit HFV-Hüllproteinen pseudotypisierten Viruspartikeln wurde in Experimenten unter Verwendung eines gegen die durch Baculovirus exprimierte SU-Domäne des HFV-Hüllproteins erzeugten Kaninchenserums erhalten (Daten nicht gezeigt).
4. Expression und Einbau von HFV-env-Proteinen in Partikel
Die Expression und der Einbau der verschiedenen HFV-Hüllproteine in MuLV-Partikel wurden durch Radioimmunpräzipitationsanalyse (RIPA) von transient transfizierten 293T-Zellen bestimmt. Achtundvierzig Stunden nach der Zugabe der DNA (pHIT60, SFG GFPS65T und verschiedene env-Konstrukte) wurden Zellen ungefähr 20 h metabolisch mit [³⁵S]-Methionin markiert. Im Überstand vorhandene Viruspartikel wurden durch Zentrifugation bei 25000 Upm durch ein 20%-iges Saccharose-Kissen vor der Solubilisierung in Lysepuffer pelletiert. Nachfolgend wurden die Proben einer Immunpräzipitation unterworfen. Immunpräzipitate der Viruspartikel mit einem HFV-spezifischen Schimpansenserum oder antiMuLV-gag-Hybridom-Überständen wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) zusammen mit ihren entsprechenden Zelllysaten analysiert. HFV-spezifische Banden in Immunpräzipitaten von pelletiertem Virus oder Zelllysaten wurden nur in Proben beobachtet, die mit den HFV-env- Expressionskonstrukten transfiziert waren, nicht aber in Proben, die das amphotrope MuLV-Hüllprotein exprimierten, oder Mock-transfizierten Kulturen. In Immunpräzipitaten von Zelllysaten von HFV-env-transfizierten Zellen (12, 21) wurden zwei vorherrschende HFV-Hüllprotein-Vorläufer-Banden von 130 und 110 kd beobachtet. Zusätzlich konnten zwei Banden, welche dem prozessierten ~90 kd-SU-Protein und dem ~45-50 kd-TM-Protein entsprachen, nach längerer Exposition beobachtet werden. Die unterschiedlichen apparenten Größen der TM-Proteine in den mit den verschiedenen HFV-Mutanten transfizierten zellulären Proben reflektierten die Modifikationen in dem TM-Abschnitt der individuellen Proteine. Es wurden nur moderate Unterschiede bei der Steady-State-Konzentration der verschiedenen Hüllproteine in den transfizierten Zellen beobachtet mit Ausnahme der Proteine HFV SSSMuLVR- und HFV SSSMuLV, die eine klar verringerte zelluläre Expression zeigten. Beide Hüll-Vorläuferproteine wie auch die prozessierten SU- und TM-Proteine wurden ebenfalls in Immunpräzipitaten von pelletierten Viruspartikeln detektiert. Jedoch war im Allgemeinen das relative Verhältnis von prozessierten Proteinen zu Vorläuferproteinen in den Viruspartikel-Immunpräzipitaten verglichen mit den Zelllysaten erhöht.
Interessanterweise konnte eine gute Korrelation zwischen der Menge von prozessierten SU- und TM-Proteinen in den individuellen Immunpräzipitaten der Viruspartikel und der relativen Infektiosität der entsprechenden pseudotypisierten Partikel (2) beobachtet werden. Das chimäre HFV Δ2MuLV-Hüllprotein, welches pseudotypisierte Partikel mit der höchsten relativen Infektiosität erzeugte, zeigte auch in der RIPA die stärksten SU- und TM-Banden. Die Menge von MuLV-gag/pol-Proteinen in den individuellen Viruspartikel-Präparaten, wie in rohen viralen Pellets oder Immunpräzipitaten mit anti-gag-Hybridom-Überständen bestimmt, war für alle Proben ähnlich mit Ausnahme der HFV Δ2MuLV-Hüllprotein-Transfektion. Diese Probe zeigte eine signifikante Abnahme von Partikel-assoziierten gag/pol-Proteinen, was anzeigt, dass weniger MuLV-Partikel in diesem Präparat verglichen mit den anderen viralen Pellets vorhanden waren. Als Ergebnis könnte die relative Menge von prozessierten HFV-SU- und -TM-Proteinen pro individuelles Viruspartikel sogar noch höher sein, als ausgehend von den Immunpräzipitaten von Viruspartikelpräparaten mit HFV-spezifischen Antikörpern abgeschätzt worden war. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist eine ver stärkte Absorption dieser Partikel durch transfizierte Zellen, die das HFV-env-Protein nicht exprimieren, als Ergebnis der erhöhten Infektiosität von mit HFV Δ2MuLV pseudotypisierten Partikeln verglichen mit Partikeln, die mit den anderen HFV-Hüllproteinen pseudotypisiert waren. Dies könnte zu einer Eliminierung der mit HFV Δ2MuLV pseudotypisierten Partikel aus dem Überstand führen. Darüber hinaus zeigten im Gegensatz zu MuLV-Partikeln, die mit dem amphotropen MuLV-Hüllprotein oder VSV-G pseudotypisiert waren, mit HFV pseudotypisierte Viren keine Verringerung der Infektiosität in Abwesenheit von Polykationen, wie Polybren (30). Dementsprechend werden die relativen Titer von retroviralen Vektoren, die mit dem HFV-Hüllprotein durch transiente Transfektion pseudotypisiert sind, möglicherweise verglichen mit Pseudotypen mit dem amphotropen MuLV-Hüllprotein oder VSV-G unterschätzt. Es sind jedoch weitere Experimente unter Verwendung von das HFV-Hüllprotein stabil exprimierenden Zelllinien, die gegenüber einer Infektion durch mit dem HFV-Hüllprotein pseudotypisierten Viren resistent sein sollten, erforderlich, um diese Phänomene detaillierter zu klären.
5. Inaktivierung der Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Stellen, die in dem FV-env-Gen lokalisiert sind.
Darüber hinaus nutzen Bel-1- und Bet-Transkripte, die sich von dem internen HFV-Promotor ableiten (Pos. 5419 bezogen auf den Transkriptionsstart in der 5'-LTR), welcher sich innerhalb des ORF des HFV-Hüllproteins (Pos. 6310-9276) befindet, effizient eine Spleiß-Donor-(SD, Pos. 9119) und eine Spleiß-Akzeptor-Stelle (SA, Pos. 9237) innerhalb der kodierenden Region der TM-Untereinheit des env-Proteins. Ein alternatives Spleißen der das HFV-env-Protein kodierenden mRNA unter Verwendung dieser SD- und SA-Stellen führt zu potentiellen Hüllprotein/bel-Fusionsproteinen. In HFV-infizierten Zellen kann eine 170 kd-Bande durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden und die mRNA ist durch RT (Reverse-Transkriptase)-PCR von Gesamt-mRNA aus mit HFV infizierten humanen Fibroblasten nachweisbar. Eine Inaktivierung von SD (Pos. 9119) durch eine GT→GG-Mutation führt zu dem Verschwinden des 170 kd-Hüll-Fusionsproteins, während die Expression des 130 kd-Hüll-Vorläuferproteins nicht verändert wird. Die biologische Funktion der env/bel-Fusionsproteine wie auch der Einfluss von pseudotypisierten MuLV-Partikeln auf die Virustiter sind gegenwärtig noch nicht bekannt.
Zusammengefasst ist ein System erzeugt worden, um auf MuLV basierende retrovirale Vektoren, die mit HFV-Hüllproteinen pseudotypisiert sind, herzustellen. Die zytoplasmatische Domäne des HFV-Hüllproteins war wenigstens teilweise an der Pseudotypisierung von MuLV-Partikeln beteiligt, da eine fortschreitende Deletion der zytoplasmatischen Domäne zu einer Verringerung des Gentransfers und des Einbaus von HFV-env-SU- und -TM-Untereinheiten in das Viruspartikel führten. Das Hinzufügen einer unprozessierten zytoplasmatischen Domäne des MuLV-Hüllproteins zu einer Deletionsmutante, dem HFV Δ2MuLV-Hüllprotein, führte zu einer 10-20-fachen Zunahme der Infektiosität verglichen mit dem HFV-Wildtyp-Hüllprotein und einem verstärkten Einbau des chimären Hüllproteins in pseudotypisierte Partikel. Die retroviralen Titer waren 8-35-mal höher als jene, die durch Pseudotypisierung mit dem Wildtyp-HFV-Hüllprotein erzielt wurden. Bei einigen Zielzelltypen war die Gentransfer-Effizienz ähnlich oder höher als jene von retroviralen Vektoren, die mit dem VSV-G-Protein pseudotypisiert waren. In dem Falle des Wildtyp-MuLV-Hüllproteins ist die Bedeutung der zytoplasmatischen Domäne für den spezifischen Einbau des Hüllproteins in das Viruspartikel unklar. Einige Mutanten, die eine Deletion innerhalb des zytoplasmatischen Schwanzes aufweisen, führten zu einem Verlust von mit den Partikeln assoziierten Hüllproteinen (15), wohingegen andere mutierte Hüllproteine wenig oder gar keine Verringerung bei der Partikelassozüerung zeigten (25, 26). Unsere Ergebnisse sprechen für eine Rolle der zytoplasmatischen Domäne von MuLV-env bei der Partikelassozüerung des Hüllproteins, wenigstens bei dem verstärkten Einbau von chimären Hüllproteinen in MuLV-Partikel.
Unlängst hat die Pseudotypisierung von auf MuLV basierenden retroviralen Vektoren mit fremden Hüllproteinen, wie dem VSV-Glycoprotein G (6, 38) oder dem GALV-Hüllprotein (2, 34), zu einer Zunahme der Virusstabilität, einem verbreiterten Wirtszellspektrum und einer verstärkten Transduktionseffizienz von bestimmten Zelltypen geführt. Das breite Wirtsspektrum von FVs, die Resistenz gegenüber einer Inaktivierung durch humanes Serum (30) und die effiziente Infektion von Zellen unterschiedlicher Herkunft in Abwesenheit von Polykationen (unveröffentlichte Beobachtungen und (30)) sollten auf MuLV basierende retrovirale Vektoren, die mit dem chimären HFV Δ2MuLV-Hüllprotein pseudotypisiert sind, zu einem nützlichen neuen Werkzeug oder Tool für den effizienten Gentransfer in unterschiedliche Zelltypen machen. Anders als die Expression von VSV-G, welches für die Produzentenzellen hochgradig toxisch ist und die Erzeugung von stabilen VSV-G-Verpackungszelllinien bis unlängst verhindert hat (8, 22, 37), führte die transiente Expression des HFV Δ2MuLV-Hüllproteins zu keiner offensichtlichen Toxizität in 293T-Zellen (Daten nicht gezeigt, (19)).
BEISPIEL 2: HFV/SIV-env-Chimäre
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von chimären Hüllproteinen zwischen HFV- und SIV-Hüllproteinen. Es wurden drei unterschiedliche Arten von chimären Hüllproteinen konstruiert. Die Sequenz der unterschiedlichen Elemente, die hier nachfolgend verwendet wurden, ist bei Genbank verfügbar: das SIV mm251-Genom unter der Aufnahmenummer M19499, der CMV-Promotor unter X03922 und pEGFP-C1 (GFP-Gen) unter U55763.
Bei der ersten Art wird der zytoplasmatische Schwanz von SIV an die extrazelluläre Domäne (in der Literatur auch als Ectodomäne bezeichnet) von HFV innerhalb der Transmembranankerdomäne fusioniert (Konstrukte 1, 2 und 7 von 4 und 5A). Die Transmembranankerdomäne von HFV-env ist aus dessen Aminosäuresequenz abgeleitet und ist dementsprechend hypothetisch. Die Transmembranankerdomäne des SIV-env-Proteins enthält eine kleine Region von identischen Aminosäuren bezogen auf HFV-env. In genau dieser Region ist die Fusion vorgenommen worden. So stammt die gesamte extrazelluläre Domäne des chimären env-Gens einschließlich der gesamten Oberflächen-Untereinheit (SU) und des größten Teils der Transmembran-Untereinheit (TM) von HFV. Der zytoplasmatische Schwanz stammt vollständig von SIV.
Bei der zweiten Art von chimären Hüllproteinen erfolgt die Fusion der Gene auf der Höhe der Spaltstelle zwischen der SU- und der TM-Untereinheit (Konstrukte 3, 4 und 8 von 4 und 5B). Dementsprechend stammen die SU-Untereinheit von HFV und die TM-Untereinheit von SIV. In dem chimären Hüllprotein wurde die Spaltstelle des SIV-env (Arg-Gln-Lys-Arg) verwendet.
Bei der dritten Art von chimärem Hüllprotein ist der zytoplasmatische Schwanz von SIV mit dem HFV-Hüllprotein in der zytoplasmatischen Domä ne fusioniert (Konstrukte 5, 6 und 9 von 4 und 5C). Dieses Konstrukt ist hinsichtlich der Gestaltung ähnlich zu dem chimären Hüllprotein Δ2MuLV und bewahrt die ersten 6 zytoplasmatischen Aminosäuren von dem HFV-Hüllprotein. Der vollständige zytoplasmatische Schwanz von SIV ist an dieses Hüllprotein fusioniert.
Es gibt zwei Versionen des SIV-Hüllproteingens (siehe 5D und Referenz 42): eine lange Form mit einem Schwanz von 164 Aminosäuren, die in SIV-Partikeln vorhanden ist, die sich in dem natürlichen Wirt, dem Rhesus-Affen (Macaca mulatta), replizieren, und eine kurze Form, welche als „humanisiert" bezeichnet wird, welche nur 18 Aminosäuren enthält. Diese kurze Form wird gewählt, wenn aus dem Affen isolierte Viren mittels humanen Zelllinien kultiviert werden. Chimäre Hüllproteine sind unter Verwendung beider Schwänze konstruiert worden. Die Konstrukte 1, 3 und 5 umfassen die lange Version und die übrigen Konstrukte die kurze Version.
Das mögliche Vorhandensein von cis-wirkenden Repressorsequenzen (CRS) in den SIV-Hüllproteingenen könnte die env-Messenger-RNA in dem Zellkern von Produzentenzellen zurückhalten. Die inhibitorische Wirkung auf die Expression von env-Genen kann überwunden werden, wenn diese Messenger-RNAs das „rev responsive element" (RRE; „auf rev ansprechendes oder responsives Element") enthalten und wenn zur gleichen Zeit rev exprimiert wird. Dies ist der Fall bei der zweiten Art von chimären Hüllproteinkonstrukten, da das RRE in der TM-Untereinheit von SIV vorhanden ist und rev ausgehend von einem Plasmid, welches das provirale SIV-Genom enthält, exprimiert wird. Das RRE ist jedoch in den anderen Hüllproteinkonstrukten nicht vorhanden. Obwohl die genaue Natur der CRS-Sequenzen in dem SIV-env-Gen nicht bekannt ist, ist es möglich, dass die 3'-Spleißstelle des zweiten tat/rev-Exons in dem env-Gen eine CRS bildet. Wir entschieden uns dementsprechend dafür, eine dritte Variante der chimären env-Konstrukte zu konstruieren, in welchen diese 3'-Spleißstelle zerstört war (43, 44, 6). Die Zerstörung der 3'-Spleißstelle erfolgte nur in chimären Hüllproteinen mit dem kurzen „humanisierten" zytoplasmatischen Schwanz aus SIV-env.
Insgesamt sind 9 chimäre Hüllproteine konstruiert worden (4):
Env 1, 2 und 7, in welchen die Fusion in der Transmembranankerdomäne vorliegt; Env 1 weist einen langen zytoplasmatischen SIV-Schwanz auf, Env 2 und 7 einen kurzen. Die 3'-Spleißstelle in dem env-Gen ist in env 2 vorhanden, ist aber in env 7 deletiert worden. Die Aminosäuresequenzen von Env 2 und 7 sind identisch.
Env 3, 4 und 8, in welchen die Fusion an der Spleißstelle vorliegt; Env 3 weist einen langen zytoplasmatischen Schwanz auf, Env 4 und 8 einen kurzen. Die 3'-Spleißstelle in dem env-Gen ist in env 4 vorhanden, ist aber in env 8 deletiert worden. Die Aminosäuresequenzen von Env 4 und 8 sind identisch.
Env 5, 6 und 9, in welchen die Fusion in dem zytoplasmatischen Schwanz vorliegt; Env 5 weist einen langen zytoplasmatischen Schwanz auf, Env 6 und 9 einen kurzen. Die 3'-Spleißstelle in dem env-Gen ist in env 6 vorhanden, ist aber in env 9 deletiert worden. Die Aminosäuresequenzen von Env 6 und 6 sind identisch.
1. Konstruktion der chimären env-Gene
Alle chimären env-Gene sind kloniert worden, indem die geeigneten HFV-env-Sequenzen in dem Plasmid pczHFVenv wt durch Sequenzen aus dem SIV-env-Gen ersetzt worden sind. pczHFVenv wt enthält die das HFV-Wildtyp-env kodierenden Sequenzen kloniert in pcDNA3.1/Zeo (Invitrogene) unter der Kontrolle des CMV-Promotors. SIV-env-Sequenzen wurden ausgehend von einem Plasmid, welches die lange Version des env-Gens enthält, (pTG664) für die Hüllproteinkonstrukte 1, 3 und 5 und ausgehend von einem Plasmid, welches die kurze Version des env-Gens enthält, (pTG 626Sma+) für die übrigen Konstrukte amplifiziert. Diese beiden Plasmide können durch einen Fachmann auf diesem Gebiet durch Klonierung von SIV-env-Versionen in p poly III*I (45) erzeugt werden. Die Amplifizierung wurde ausgeführt mit einem Upstream-Primer mit einer 5'-Verlängerung von 50 Nukleotiden ausgehend von dem HFV-env-Gen und eines Downstream-Primer mit einer 3'-Verlängerung von 15 Nukleotiden, der Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme XhoI und EcoRI enthält. Beide Primer weisen eine Region von 20 Nukleotiden auf, welche zu dem SIV-env-Gen komplementär ist, was eine Amplifizierung von spezifischen Teilen der SIV-env-Gene erlaubt.
Nach einer PCR von C-terminalen Abschnitten des SIVenv-Gens wurden Amplimere aus einem Gel isoliert und mit XhoI verdaut, um die 3'-terminalen Nukleotide aus dem Amplimer zu entfernen. Das Plasmid pczHFVenv wt wurde mit XhoI und EcoRI verdaut. Die Amplimere wurden an das lineare pczHFVenv wt-Plasmid unter Verwendung der redundanten XhoI-Enden ligiert. Dies führt zu einem linearen DNA-Fragment, welches das vollständige HFV-env-Gen und den zytoplasmatischen Schwanz von SIV enthält. Das 5'-Ende des zytoplasmatischen Schwanzes enthält Sequenzen, die zu dem HFV-env-Gen homolog sind, das durch Transformation von E. coli BJ 5183-Zellen (46) mit diesem Plasmid gemäß der in (41) beschriebenen Technik rekombiniert wird. Dies führt zu einem geschlossenen zirkulären Plasmid, in welchem der 3'-terminale Abschnitt von HFV-env durch das 3'-Ende von SIV-env ersetzt worden ist. Unter Verwendung von verschiedenen Kombinationen von Primern sind alle chimären Hüllproteine auf diese Weise konstruiert worden (siehe Tabelle 2). In dem resultierenden Plasmid sind die die Chimäre kodierenden Sequenzen unter die Kontrolle des unmittelbar frühen („immediate early") CMV-Promotors gestellt.
Tabelle 2
2. Produktion von pseudotypisierten SIV-Partikeln und Transduktion von Zielzellen
Die Produktion von pseudotypisierten retroviralen Partikeln wird erzielt durch die Cotransfektion von 293-Zellen mit den verschiedenen Plasmiden, die die Hüllprotein-Chimäre kodieren, und einem das provirale SIV-Genom kodierenden Plasmid, in welchem das env-Gen aufgrund der Insertion einer Expressionskassette, bestehend aus dem unmittelbar frühen („immediate early") CMV-Promotor und dem das „Enhanced Green Fluorescent Protein" (GFP) kodierenden Gen (nt 613 bis 1330 der Genbank-Sequenz U55763), nicht funktional ist.
Das Protokoll ist das folgende: 293-Zellen wurden in 10 cm-Petrischalen in einer Dichte von 2 × 10⁶ pro Schale in DMEM-Medium, komplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, nicht-essentiellen Aminosäuren, Gentamycin und Glutamin (vollständiges DMEM), ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen unter Verwendung der Standard-Calciumphosphat-Transfektionstechnik mit 25 μg proviralem SIV-Plasmid und 5 μg Hüllprotein-Plasmid (die 9 chimäres Hüllprotein-Expressionsplasmide oder Kontrollplasmide: leeres Expressionsplasmid; VSV-G-Protein-Expressionsplasmid oder pczHFVenv WT) transfiziert. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden einmal in DMEM-Medium, komplementiert mit 5% fötalem Kälberserum, nicht-essentiellen Aminosäuren, Gentamycin und Glutamin, gewaschen und dann in 6 ml des gleichen Mediums inkubiert. Virusenthaltendes Medium wurde zwei Tage später geerntet und durch Zentrifugation geklärt (5 min bei 3500 Upm). Zielzellen (293 oder HT 1080), die am vorigen Tag in einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung einer 6 Vertiefungen enthaltenden Platte ausgesät worden waren, wurden, wie folgt, transduziert: Zielzellen wurden mit 1 ml DMEM (kein Serum) gewaschen und dann mit 300 μl DMEM bedeckt. 300 μl Virus enthaltender Überstand, ergänzt mit 10 μg Protaminsulfat/ml, wurde zugegeben und die Zellen 2 h bei 37°C in einer 5%-igen CO₂-Atmosphäre inkubiert. Nach der Zugabe von 3 ml vollständigem DMEM wurde die Inkubation 3 Tage fortgesetzt.
Produzenten- und Zielzellen wurden durch FACScan, wie folgt, analysiert: Zellen wurden trypsinisiert und mit PBS gewaschen. Zellen wurden mit 1 ml PBS/4% Formaldehyd 10 min bei 4°C fixiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert und mit einem Becton-Dickinson FACScan unter Verwendung der Cell-Quest-Software analysiert. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung des FITC-Filters gemessen. Alle Produzentenzellen wurden mit hoher Effizienz transfiziert. Die Transduktion von Kontroll-Zielzellen erfolgte, wie erwartet: VSV-G-pseudotypisierte Partikel waren in der Lage, 293-Zellen und HT 1080-Zellen zu transduzieren. Überstände von transfizierten Zellen ohne Hüllprotein oder mit HFV-env pseudotypisierte Partikel waren nicht in der Lage, irgendwelche Zielzellen zu transduzieren. Viruspartikel, die durch die Konstrukte 6 und 9 produziert werden, sind in der Lage, 293- und HT 1080-Zellen zu transduzieren, was zeigt, dass ihr chimäres Hüllprotein funktionsfähig ist.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Konstrukt für die Expression eines Proteins, welches wenigstens ein modifiziertes Hüllprotein eines Foamy-Virus (FV) umfasst, für die Herstellung von pseudotypisierten Viruspartikeln, wobei die Modifikation zumindest eine Verkürzung an Rest 975 oder 981 des Proteins ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Fusionsprotein ist, welches darüber hinaus die Gesamtheit oder einen Teil eines Nicht-FV-Hüllproteins umfasst.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Foamy-Virus das humane Foamy-Virus (HFV) ist.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nicht-FV-Hüllprotein von einem Virus abgeleitet ist, welches ausgewählt wird in der Gruppe, umfassend MuLV, MoMuLV, FB 29, HIV und SIV.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fusion innerhalb der Transmembranankerdomäne der FV- und Nicht-FV-Hüllproteine erfolgt.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die extrazelluläre Domäne und den 5'-Abschnitt der Transmembranankerdomäne des HFV-Hüllproteins und den 3'-Abschnitt der Transmembranankerdomäne und die zytoplasmatische Domäne des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins, umfasst.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fusion innerhalb der Spaltstelle der FV- und Nicht-FV-Hüllproteine erfolgt.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die SU-Domäne und die Gesamtheit oder einen Teil der Spaltstelle des HFV-Hüllproteins und die Ge samtheit oder einen Teil der Spaltstelle und die TM-Domäne, umfassend die Transmembranankerdomäne und die zytoplasmatische Domäne, des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins, umfasst.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fusion an der Verbindungsstelle zwischen der Transmembranankerdomäne und der zytoplasmatischen Domäne oder innerhalb der zytoplasmatischen Domänen der FV- und Nicht-FV-Hüllproteine erfolgt.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die extrazelluläre Domäne, die Transmembranankerdomäne und die Gesamtheit oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne des HFV-Hüllproteins und die Gesamtheit oder einen Teil der zytoplasmatischen Domäne des Nicht-FV-Hüllproteins, insbesondere des SIV-Hüllproteins, umfasst.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus dem HFV-Hüllprotein besteht, bei dem die Gesamtheit oder ein Teil der zytoplasmatischen Domäne durch die Gesamtheit oder einen Teil eines Hüllproteins eines Nicht-FV-Virus, und vorzugsweise eines Hüllproteins eines MuLV-Retrovirus, ersetzt ist.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus der Fusion der Gesamtheit oder eines Teils einer zytoplasmatischen MuLV-Domäne an ein modifiziertes HFV-Hüllprotein besteht.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zytoplasmatische MuLV-Domäne prozessiert oder unprozessiert ist.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein modifiziertes, um Rest 981 verkürztes HFV-Hüllprotein, welches mit einem Argininrest fusioniert ist, und die unprozessierte zytoplasmatische MuLV-Domäne, welche sich von Rest 634 bis Rest 665 des Wildtyp-MuLV-Hüllproteins erstreckt, umfasst.
Konstrukt für die Expression eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt eine Mutation der Donor- und/oder der Akzeptor-Spleißstelle(n), welche von Natur aus in der das FV-Hüllprotein kodierenden Sequenz vorhanden ist bzw. sind, umfasst.
Protein, wie es durch ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 14 exprimiert wird.
Pseudotypisiertes Viruspartikel, umfassend ein Protein nach Anspruch 15.
Komplementationszelllinie, welche ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst.
Komplementationszelllinie nach Anspruch 17, welche ein Konstrukt nach Anspruch 9 oder 13 umfasst.
Komplementationszelllinie nach Anspruch 17 oder 18, welche ferner ein Konstrukt, welches ein virales gag/pol-Gen exprimiert, umfasst.
Komplementationszelllinie nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sich das retrovirale gag/pol-Gen von MuLV oder FB 29 oder SIV ableitet.
Komplementationszelllinie nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie sich von der Linie 293 ableitet.
Verfahren zur Herstellung eines pseudotypisierten Viruspartikels nach Anspruch 16, welches umfasst: (i) einen rekombinanten retroviralen Vektor in eine Komplementationszelle nach einem der Ansprüche 17 bis 21 einzuführen, (ii) die Komplementationszelllinie unter geeigneten Bedingungen, um die Produktion des pseudotypisierten Viruspartikels zu ermöglichen, zu kultivieren und (iii) das pseudotypisierte Viruspartikel aus der Zellkultur zu gewinnen.
Säugetierzelle, welche mit einem pseudotypisierten Viruspartikel nach Anspruch 16 oder mit einem pseudotypisierten Viruspartikel, welches durch ein Verfahren nach Anspruch 22 erhalten werden kann, infiziert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines pseudotypisierten Viruspartikels nach Anspruch 16, oder welches durch ein Verfahren nach Anspruch 22 erhalten werden kann, oder einer Säugetierzelle nach Anspruch 23 umfasst.
Verwendung eines pseudotypisierten Viruspartikels nach Anspruch 16, oder welches durch ein Verfahren nach Anspruch 22 erhalten werden kann, oder einer Säugetierzelle nach Anspruch 23 zur Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung einer genetisch-bedingten Erkrankung, einer Krebserkrankung oder einer viral induzierten Erkrankung bestimmt ist.
Verwendung eines Konstrukts, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 definiert, für die Expression eines Proteins für die Produktion von pseudotypisierten Viruspartikeln, wobei das Protein wenigstens ein modifiziertes Hüllprotein eines Foamy-Virus (FV) umfasst und die Modifikation zumindest eine Verkürzung an Rest 975 oder 981 des Proteins ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Foamy-Virus das humane Foamy-Virus (HFV) ist.