JP2001513788A - 二重特異性、共刺激性を有するキメラタンパク質によるｔ−細胞増殖の共刺激 - Google Patents

二重特異性、共刺激性を有するキメラタンパク質によるｔ−細胞増殖の共刺激

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Abstract

(57)【要約】 ａ）標的細胞上の特異的表面細胞を認識する結合性領域およびｂ）これと共有結合したＴ細胞増殖を共刺激する能力を有する領域からなる可溶性の、二重特異性融合タンパク質は，前記標的細胞に対するＴ細胞を特異的に共刺激させるために使用することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】 二重特異性、共刺激性を有するキメラタンパク質によるＴ−細胞増殖の共刺激 本発明は、新規なキメラタンパク質をコードする核酸、その相当する遺伝子産物 およびその用途に係り、かかる発明において、当該キメラタンパク質が、特異的 に標的細胞上の表面分子を認識する結合性領域およびＢリンパ球、Ｔリンパ球ま たは抗原提示細胞の表面上に自然発現する共刺激性リーガンドの細胞外領域また はかかる共刺激性リーガンドの対抗レセプター（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏ ｒ）から由来する結合性領域とからなる二つの結合性領域を有するものである。 腫瘍拒絶反応の最も有効な機構は、腫瘍特異的Ｔリンパ球によって仲介されるの である(Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｐ．Ｄ.、１９９１、Ｍｅｌｉｅｆ、Ｃ．Ｊ.、１ ９９２)。このことは、腫瘍発達に好都合である。即ち，腫瘍は、例えば主要組 織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）細胞の欠失による効率的な抗原提示を防止する（ Ｄｏｙｌ、Ａ．ら、１９８５、Ｌａｓｓａｍ、Ｎ．およびＪａｙ、Ｇ.、１９８ ９）または抗原処理の欠陥（Ｒｅｓｔｉｆｏ、Ｎ．Ｐ．ら、１９９３、Ｃｒｏｍ ｍｅ、Ｆ．Ｖ．ら、１９９４）など種々の方策によって免疫監視を逃れるからで ある。腫瘍細胞が免疫監視系を逃れるもう一つの機構は、共刺激性分子が不存在 しないことである(Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ａ．ら、１９９３)。活性化とクローン増 殖のためには、Ｔ細胞は、ペプチド保有ＭＨＣ分子と相互作用を及ぼすＴ細胞受 容体（ＴＣＲ）から供与される一次シグナルに加えて共刺激性シグナルを必要と する(Ｒｕｄｄ、Ｃ．Ｅ．ら、１９９４)。共刺激が共存しないＴＣＲ刺激によっ て、免疫不応答性およびクローンアネルギー誘導とが生起され得る(Ｈａｒｄｉ ｎｇ、Ｆ．Ａ．ら、１９９２；Ｇｉｍｍｉ、Ｃ．Ｄ．ら、１９９３；Ｔａｎ、Ｐ ．Ｃ．ら、１９９３)。ＣＤ２８は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の主要な共 刺激性シグナルレセプターである。Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ ８６）を含むＢ７ファミリータンパク質のメンバーは、抗原提示細胞（ＡＰＣ） 上の自然のリガンドである(Ｇｉｍｍｉ、Ｃ．Ｄら、１９９１；Ｌｉｎｓｌｅｙ 、Ｐ．Ｗ．ら、１９９１；Ｇａｌｖｉｎ、Ｆ．ら、１９９２；Ｈａｔｈｃｏｃｋ 、Ｋ．Ｓ．ら、１９９３；Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｇ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９ ９３；Ａｚｕｍａ、Ｍ．ら、１９９３)。 腫瘍免疫原性を増大させるべく多くの試みが、これまでに行われてきた。この際 、Ｂ７ファミリーの共刺激分子のメンバーを有する腫瘍細胞を得るためのいくつ かの方策が、将来性のある結果を生み出している。最近、Ｂ分子の膜貫通領域と 分子内領域は、Ｔ細胞の共刺激剤としてその活性には必要とされないことが明ら かにされている。マウスＢ７−１またはＢ７−２の細胞外領域が細胞表面で発現 しかつＧＰＩアンカーを経由して細胞膜中に挿入することが、イン ビトロおよびインビボでＴ細胞を共刺激させるには充分である(Ｂｒｕｎｓｃｈ ｗｉｇ、Ｅ．Ｇ．ら、１９９５)。Ｔ細胞のインビボ増殖を共刺激することも、 腫瘍細胞中にてＣＨＯ細胞で発現させた後、細胞ライゼートから精製した組み換 えＧＰＩ−結合型ヒトＢ７−１を組入れることによって行われている(ＭｃＨｕ ｇｈら、１９９５)。この方策は、腫瘍細胞を異質遺伝子でトランスフェクトす ることなく、細胞膜にＢ７分子を挿入することを可能ならしめるのであるが、一 方ではこのような分子をインビボで利用する可能性は、標的細胞特異性を持たな いため制限されている。 プロフェッショナルＡＰＣの利用可能性とは別に、腫瘍細胞に対するＴ細胞依存 的拒絶反応は、共刺激性シグナルを腫瘍細胞表面に直接提示することによって実 現できる。いくつかのマウス腫瘍細胞をＢ７−１（Ｃｈｅｎ．Ｌ．ら、１９９２ ；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、Ｓ．Ｅ．およびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．Ｐ.、１９９３；Ｌ ｉ、Ｙ，ら、１９９４）またはＢ７−２（Ｈｏｄｇｅ、Ｊ．Ｗ．ら、１９９４； Ｙａｎｇ，Ｇ．ら、１９９５）でトランスフェクトすることによって、マウスに おいてＢ７発現腫瘍に対するＴ細胞依存的拒絶反応を誘導させ、かつ非経口的Ｂ ７−陰性腫瘍細胞によるその後の攻撃を防御するするのである(Ｃｈｅｎら、１ ９９２；Ｙａｎｇら、１９９５；Ｂａｓｋｅｒ、Ｓ．ら、１９９３)。 Ａｌｖａｒｅｚ−ＶａｌｌｉｎａらはＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９ ９６）２３０４−２３０９において，ｓｃＦｖ−ＣＤ２８融合遺伝子とその構築 および機能的特性化について報告している。この遺伝子産物は、遺伝子導入後Ｔ 細胞内において産生させ、次いで膜貫通タンパク質として細胞膜中に挿入される 。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｖａｌｌｉｎａらによって報告されたこの融合タンパク質は 、、Ｔ細胞それ自体で産生されるシグナル伝達キメラ分子である。 本発明は、標的細胞の表面に対する共刺激性分子についての新規なアプローチか らなる。かかるアプローチは、好ましくは腫瘍特異的抗原に特異的な単鎖抗体領 域（ｓｃＦｖ）に融合せしめた共刺激性分子の細胞外領域（即ち膜貫通領域また は細胞内領域を伴わない）からなり、好ましくは高率で過発現されたヒト腺ガン のＩ型成長因子レセプターからなるキメラ融合タンパク質に基づくものである。 このような分子は、機能的に活性であり、可溶性でありかつ細胞内領域がないた め膜局在性ではなく、例えばＢ７対抗レセプターやＥｒｂＢ２に結合する。この 融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原を発現する標的細胞の表面に特異的に局在し ており、これによって共刺激シグナルを発するので、Ｔ細胞増殖が増大するので ある。本発明は、ガンの免疫療法に有効な腫瘍ワクチンをこのようなキメラリガ ンドを腫瘍細胞表面に向けて適合させることによって創 製することができることを証明するものである。 本発明は、以下から構成される可溶性で、二重特異性融合タンパク質を使用する ことを含んで成るものである：即ち、標的細胞に対するＴ細胞を特異的に共刺激 させるための以下からなる可溶性の二重特異性融合タンパク質を使用することか ら成る：即ち、 ａ）標的細胞上の特異的表面細胞を認識する結合性領域、および ｂ）これと共有結合したＴ細胞増殖を共刺激する能力を有する領域。 本発明は更には、患者の前記標的細胞に対するＴ細胞を特異的に共刺激させるた めの前記融合細胞を含んでなる治療剤を製造する方法をも含むものである。この 治療剤は、局所的にまたは全身的に投与することができる。 驚くべきことに、本発明に従ったキメラ融合タンパク質を用いることによって極 めて特異的な細胞活性化が可能であることが見出されたのである。公知の細胞刺 激方法（例えば、当該細胞表面上でのＢ７刺激など）とは異なり、本発明に従え ば、腫瘍特異的表面抗原を有さない標的細胞を共存させた状態では細胞刺激を実 質的に一切行うことがないのである。従って、本発明に従った方法を使用した場 合、細胞のバックグラウンド刺激は一切行われない。 本発明に従った融合タンパク質は、細胞内領域を一切有さないが故にそれ自体で はシグナル伝達機能を有さない二つの結合性領域から構成されているのであるが 、細胞外に局在している場合は可溶状態で存在し、ｓｃＦｖ領域を介した抗原と Ｂ７領域を介したＣＤ２８との双方と結合を行った場合Ｔ細胞の野生型ＣＤ２８ を活性化するはずである。即ち、本発明の分子は、抗原依存性のシグナル伝達活 性化作用を有するのである。本発明に従った融合タンパク質は、結果的に特異的 免疫応答を刺激するに到る効果を有するが故に特異性を有するのである。 本発明に従った”標的細胞”なる用語は、好ましくは同遺伝子型細胞、腫瘍細胞 または病原体（例えば、ウイルス、最近、酵母、菌など）に感染した細胞を意味 する。 従って、本発明のもう一つの実施態様においては、例えばＴ細胞群に由来する細 胞毒性Ｔ細胞を特異的に活性化することも、本発明に従った融合タンパク質を用 いて実施することができるのであり、この場合当該融合タンパク質は、当該Ｔ細 胞上の共刺激性領域の特異的対抗レセプターに結合するのである。かかる場合、 ＩＬ−２を使用することによって事前処理を行うことが適当である。本発明のま たもう一つの実施態様においては、かかる共刺激は、Ｔ細胞の生体外または生体 内トランスフェクションと組合せることができる。この場合、Ｔ細胞は、所望と する遺伝子を有するウイルス性または非ウイルス性の遺伝子治療用ベクターで形 質導入させ、かくして得られた形質導入細胞を例えばポジテ ィブまたはネガティブ選択システムによって選別するのである。次いで、かかる Ｔ細胞は未だ静止状態にあるので、好ましくは本発明に従って共刺激性シグナル を介して刺激させ、インビトロまたはインビボでの増殖を開始させるのである。 本発明に従えば、共刺激性分子は、標的細胞の表面に対して方向ずけられるので あるが、かかる標的細胞は、好ましくはヒトＢ７−２の細胞外ＣＤ２８結合性領 域に標的細胞特異的認識領域を付与されてなるものである。細胞表面抗原の均質 的な変性・代替物が、ヒトのガン細胞中においてすでに同定されている。このよ うなｅｒｂＢ２遺伝子は、１８５−キロダルトンの膜貫通糖タンパク質であって 、上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプター、ＥｒｂＢ−３やＥｒｂＢ−４なども含む Ｉ型レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの一員である(Ｐｅｌｅ ｓ、Ｅ．およびＹａｒｄｅｎ、Ｙ.、１９９３)。ＥｒｂＢ２の過剰発現は、*** 、卵巣、肺、胃や唾液腺など、患者にとって好ましくない予後と相関関係を有す る種々の部位において発生するヒト腺ガンにおいてしばしば観察されている(Ｈ ｙｎｅｓ、Ｎ．Ｅ.、１９９３)。ガン発生においてこのものが果たす役割とその 位置が、細胞表面上の接近可能な個所であるため、ＥｒｂＢ２は、直接治療の対 象となるのである。ヒトＥｒｂＢ２の細胞外領域に対して特異的であるモノクロ ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡから、抗体の重鎖と軽鎖と の可変領域が合成リンカー配列を介して接続されてなる組み換え型単一鎖(ｓｃ Ｆｖ)抗体領域が以前構築されたことがある(Ｗｅｌｓ、Ｗ．ら、１９９２)。こ の組み換え型結合性領域をいくつかの融合タンパク質に導入し、例えば酵素、ト キシンまたは遺伝子形質導入した細胞毒性Ｔ細胞（Ｍｏｒｉｔｚ、Ｄ．ら、１９ ９４）などの異種のエフェクター機能を、腫瘍細胞を発現するＥｒｂＢ２に対し て特異的に対向させるために使用されてきた(Ｗｅｌｓ、Ｗ．ら、、Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２；Ｗｅｌｓ、Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、 １９９２)。 このような方策は、現実の抗腫瘍免疫応答とは独立しており、定着確立した腫瘍 を除去する上で有効となり得るが(Ｗｅｌｓ、Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、 １９９２)、腫瘍の再発可能性を防止し得るだけの長期間の保護または全身的免 疫を付与するものではない。逆に、本発明に従った分子は、特異的、Ｔ細胞依存 性抗腫瘍免疫応答の生成を支持・促進する可能性がある。本発明によれば、かか るキメラタンパク質は二重機能を有することが明らかとなっている；即ち、本キ メラタンパク質は、標的細胞を発現するＥｒｂＢ２の表面にｓｃＦｖ領域を介し て特異的に局在しかつ可溶性または細胞表面上ＣＴＬＡ−４と相互作用を行うの である。また同様に、この融合タンパク質は、ＦＡＣＳ分析で測定した場合に低 いレベルのＣＤ２８を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の表面 にも結合する。標的細胞を発現するＥｒｂＢ２を用いたインビトロ実験において 、本発明に従ったキメラタンパク質は、Ｂ７領域を介してＰＭＡ活性化同遺伝子 型のＴ細胞に対して共刺激作用を発揮したのである。 本発明に従った細胞表面を標的とした融合タンパク質は、予め活性化したＴ細胞 を共刺激することができたのである。以前に、可溶性Ｂ７−１−Ｉｇ融合タンパ ク質は１ないし１０ｕｇ／ｍｌの濃度においては、抗ＣＤ３抗体と組合せ使用し てもＴ細胞増殖をほんの僅かしか増大せしめなかったのであるが、プラスチック 表面に固定化した場合活性が高くなっていた(Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１)。こ れらの知見に対して最も可能性のある説明は、ＣＤ２８表面は、ある程度のＴ細 胞活性化閾値に到達するためにはＴ細胞の表面でクラスターを形成する必要があ る、ということである(Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、Ｊ．Ａ．ら、１９９０)。最近にな って、ジサルファイド−結合ＣＴＬＡ−４ホモダイマーが、極めて早い速度でモ ノマー性のＢ７−１またはＢ７−２の二分子と結合することが証明されたのであ る(Ｌｉｎｓｌｅｙ、Ｐ．Ｓ．ら、１９９５)。このことはまた、ＣＤＣＤ２８が Ｂ７ファミリーのメンバーと結合する場合−この結合は、Ｂ７−１よりもＢ７− ２に対してより早い速度で生起するのであるが一にも当てはまることは、大いに あり得ることである(Ｌｉｎｓｌｅｙ、Ｐ．Ｓ．ら、１９９４)。抗体領域または 膜にアンカー固定したＢ７分子を介して標的細胞表面にアンカー固定したＢ７融 合タンパク質は一般的には、同時にＣＤ２８分子と多重に接触するのであり、こ れによって相互作用を安定化し、またＣＤ２８の架橋を生じさせるに到る可能性 がある。 本発明によれば、共刺激性分子、好ましくはヒトＢ７−２の細胞外領域は、抗体 領域を介して細胞表面に対向せた場合、Ｔ細胞を活性化させるための共刺激性シ グナルを発することができるのである。マウスモデル系における最近の研究の結 果、Ｂ７−１をトランスフェクトさせた腫瘍細胞は、Ｂ７−２遺伝子でトランス フェクトさせた腫瘍細胞よりもＴ細胞を活性化させる上でより効果的であること が示唆されている(Ｇａｊｅｗｓｋｉ、Ｔ．Ｆ．ら、１９９６；Ｍａｔｕｌｏｎ ｉｓ、Ｕ．ら、１９９６)。最近の報文において、マウスＢ７−１およびＢ７− ２の細胞外領域は、Ｔ−リンパ腫瘍細胞系ＥＬ−４の表面においてＧＰＩアンカ ー固定されたペプチドとして発現している旨が発表されたが、これに基づくと、 ＥＬ−４トランスフェクタントを発現するＢ７−２は、ＰＭＡ−刺激した一次Ｔ 細胞の増殖を高めるうえで少なくともＢ７−１トランスフェクタントと同時程度 の効果を有するように思われる(Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇら、１９９５)。 Ｅ．ｃｏｌｉ発現系における組み換え型Ｂ７−２225タンパク質（アミノ酸 １−２２５）も作成されているが、このものは、Ｂ７対抗レセプターには結合す ることができなかった。このことは異なって、本発明に従えば、生物学的に活性 な、可溶性のリンパ球レセプターおよびそのリガンドは、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐ ａｓｔｏｒｉｓにおいて産生させることができるのである。Ｂ7-2225およびＢ７ −２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質およびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ ｓ培養上済み液から精製して得られた切断型ヒトＣＴＬＡ−４分子は、それぞれ のレセプターに対して特異的な結合性を示した。 本発明に従えば、機能的に活性であるＢ７−２融合タンパク質は、特異的な結合 性領域を介してＳＴＹ細胞の表面に対向せることができる。この融合タンパク質 がモジュラー構造を有するがゆえに、類似した分子であって、標的細胞特異性を 変えるかまたは免疫調節領域を変えた分子も得ることができる。このような分子 は従って、ガンの免疫治療のための有用な試薬である。 標的細胞上の表面抗原を認識する好ましい結合性領域としては、レセプターチロ シンキナーゼＥｒｂＢファミリーのメンバーに対して特異的な成長因子領域また は組み換え型抗体領域（例えば、単鎖Ｆｖ領域；ジサルファイド架橋Ｆｖ領域） が挙げられれ、例えばＥＧＦレセプター、変異型ＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲｖ ＩＩＩ)、ＥｒｂＢ２(ＨＥＲ２、ｎｅｗ)、ＥｒｂＢ３(ＨＥＲ３)、ＥｒｂＢ４ （ＨＥＲ４）など上皮由来の種々の腫瘍細胞上に過剰発現されているものが挙げ られる。このような結合性領域はそこで、腫瘍細胞または病原体に感染した細胞 など標的細胞の表面における発現が増大しているかまたはそこに限定している異 なった分子に結合することができるのである。このような結合性領域には、他の 成長因子およびサイトカインレセプターに結合する結合性領域、またはメラノー マ細胞の表面に発現するアルファ−ＭＳＨなどのペプチドリガンドレセプターと 結合する領域、または成長因子、サイトカインまたは例えばＥＧＰ−２またはモ ノクローナル抗体ＭＯＣ−３１によって認識される３８キロダルトンのすい臓ガ ン抗体などのペプチドリガンドレセプターではない表面分子に結合する領域、ま たは感染宿主細胞の表面に発現する病原体抗体に結合する領域などが挙げられる 。 共刺激性リガンドおよび共刺激性リガンドの対抗レセプターの好ましい領域は、 Ｂリンパ球、プロフェッショナル抗体提示細胞またはＴリンパ球の表面に発現す るＢ７−１(ＣＤ８０)、Ｂ７−２(ＣＤ８６)、Ｂ７−３、ＣＤ４０、ＣＤ１１ａ ／１８(ＬＦＡ−１)、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ５８(ＬＦＡ−３)、ＣＤ５９、 ＣＤ５４、ＣＤ１０６(ＶＣＡＭ)、ＣＤ７２、ＶＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ４ ０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)、ＣＤ５４(ＩＣＡＭ−１)、ＣＤ４５ ＲＯ、ＣＤ４３、ＣＤ４９ｄ／２９、ＣＤ５などから誘導される。 少なくとも二つの結合性領域を有する組み換え型キメラ分子は、標的細胞の表面 分子を認識する結合性領域をコードする核酸および共刺激性リガンドまたはその 対抗レセプターから誘導された結合性領域をコードする核酸を単離し、次いでこ れらの核酸を単一のオープンリーディングフレームで融合することによって誘導 させるのである。 本発明に従った、腫瘍細胞または病原体に感染した細胞等の標的細胞の表面分子 を認識する結合性領域および共刺激性リガンドから誘導された結合性領域（例え ばＢ７−１、Ｂ７−２など）とを包含するキメラ分子は、ワクチンとして機能す る可能性があり、また標的細胞の表面に特異的に局在し、かくして標的細胞に共 刺激活性を付与しかつまた標的細胞に特異的な細胞性免疫応答を容易にすること となる(例えば、Ｔリンパ球の活性化を共刺激することによって)。このことは、 ほ乳動物（患者；農場動物；ペット）をこのようなキメラ融合タンパク質で全身 処理するか、かかるキメラ融合タンパク質を腫瘍内に注入するか、またはかかる キメラ融合タンパク質を病原体に感染した組織内に注入することによって達成す ることができるであろう。またはその代わりに、かかるキメラ融合タンパク質は 、患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球、即ちリンパ球活性化キラー細胞(ＬＡＫ)、ま たはその他の患者由来のリンパ球製剤を、可能ならば例えばインターロイキン２ 、インターロイキン１２などの活性化サイトカインの共存下に加えて標的抗原を 発現する細胞の存在下で活性化させ、次いでかかる活性化リンパ球を患者の体内 に養子免疫伝達させるために生体外で使用することができるであろう。または、 かかる患者由来のリンパ球を、キメラ抗体レセプター（例えば、このキメラ共刺 激性分子で認識される標的細胞の表面上の同一抗原に特異的な結合性領域、即ち 標的細胞の表面上の異なる抗原を認識する結合性領域と例えばＤ３複合体のゼー タ鎖またはその他の分子などの分子から誘導せられた細胞内領域とから構成され るキメラタンパク質をコードする核酸）で形質導入したリンパ球から構成されて いてもよい。 下記する実施例、参考例、配列および図面は、本発明の理解を援助するために記 載されるものであり、本発明の範囲は添付したクレームにおいて記載されている 。修正・変更は、本明細書において記載された方法について本発明の精神から逸 脱することなく種々可能である旨了解される。 図の説明 図１：組み換え型Ｂ７−２タンパク質の構築と酵母における発現。（Ａ）は、ヒ トＢ７−２のアミノ酸１ないし２２５をコードする酵母発現プラスミドｐＰＩ Ｃ９−Ｂ７−２225（上部パネル）とＢ７−２フラグメントをＥｒｂＢ２に特異 的な単一鎖抗体領域ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）に融合させたものをコードするｐＰＩ Ｃ９−Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＶ５）（下部パネル）内部におけるＢ７− ２遺伝子の概略図である。酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内における発現 は、アルコールオキシダーゼプロモータ（ＡＯＸ１）によって調節され、酵母α 因子分泌シグナル（α）を介して細胞外空間に配向される。Ｍ、ｃ−Ｍｙｃ ｔ ａｇ；Ｈ、ポリヒスチジン ｔａｇ。（Ｂ）Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５ ）融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓ 培養上済み液から精製したクーマッシー染色したＢ７−２225−ｓｃ Ｆｖ（ＦＲＶ５）タンパク質；レーン２および３、融合タンパク質のＣ−末端ｃ −Ｍｙｃ ｔａｇに特異的なモノクローナル抗体９Ｅ１０を用いた精製Ｂ７−２225 −ｓｃＦｖ（ＦＲＶ５）（レーン２）およびＮ−グリコシダーゼＦ処理後の Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＶ５）(レーン３)のイムノブロット分析。Ｍ、分 子量標準物質(ｋＤａ)。 図２：Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）とＣＴＬＡ−４との結合。Ｂ７−２2 25 −ｓｃＦｖ（ＦＲＶ５）とＣＨＯ細胞（Ａ）および５０倍モル過剰の可溶性Ｃ ＴＬＡ−４タンパク質（Ｃ）の不存在下（Ａ，Ｂ）または存在下でヒトＣＴＬＡ −４ｃＤＮＡによって安定にトランスフェクトしたＣＨＯ−ＣＴＬＡ−４細胞と の結合は、モノクローナル抗体９Ｅ１０とＦＩＴＣ標識（Ａ）またはＰＥ標識（ Ｂ、Ｃ）したヤギ抗マウスＩｇＧを用いたＦＡＣＳ分析によって検出した。 図３：Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＶ５）とＥｒｂＢ２との結合。（Ａ）は、 バクテリアで発現させたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｅｒ ｂＢ２融合タンパク質(レーン２)またはＧＳＴコントロールタンパク質(レーン ３)とともに培養した後グルタチオン結合アガロースビーズで沈殿させたＢ７− ２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質のモノクローナル抗体９Ｅ１ ０によるイムノブロット分析。Ｍ、分子量標準物質(ｋＤａ)。（Ｂ）Ｂ７−２22 5 −ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）のマウスＨＣ１１細胞およびヒトＥｒｂＢ２ｃＤＮＡ で安定にトランスフェクトしたＨＣ１１−ＥｒｂＢ２細胞との結合は、モノクロ ーナル抗体９Ｅ１０とＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇＧによるＦＡＣＳ分析 によって検出した。 図４：Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）による同一遺伝子型Ｔ細胞の共刺激 。(Ａ)ＨＣ１１−ＥｒｂＢ２細胞およびＰＭＡで事前刺激したＢａｌｂ／ｃマウ ス由来の一次Ｔ細胞を明示したように１０ｎｇ／ｍｌの精製Ｂ７−２225−ｓｃ Ｆｖ（ＦＲＰ５）の存在下または不存在下で培養した。細胞の増殖は、［3Ｈ］ −チミジン取り込みによって測定した。（Ｂ）細胞を（Ａ）において記述したよ うに、明示した可溶ＣＴＬＡ−４タンパク質または０．５ｕｇ／ｍｌの抗−Ｂ７ −２抗体を添加するかまたは添加せずに処理した。それぞれの数値は、三回の測 定から求めた。標準偏差は、誤差バーで示してある。 図５：Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）による共刺激は、細胞表面のＥｒｂ Ｂ２への結合に依存して変わる。(Ａ)ＨＣ１１−ＥｒｂＢ２細胞を図４の凡例に おいて記載したように事前刺激したＴ細胞で明示した通り濃度を上げた精製Ｂ７ −２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）またはＢ７−２225の存在下で培養した。コント ロール細胞は、組み換え型タンパク質の不存在下で処理した。細胞の増殖は、［3 Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。（Ｂ）ＨＣ１１−ＥｒｂＢ２細胞 または非経口ＨＣ１１細胞をＢ７−２225−ｓｃＦｖ(ＦＲＰ５)で処理し、明示 した通り５倍過剰量の事前刺激した同一遺伝子型Ｔ細胞とともに培養し、細胞の 増殖は、［3Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。コントロールは、Ｔ細 胞または標的細胞の不存在下での［3Ｈ］−チミジン取り込みのバックグラウン ドを示す。それぞれの数値は、三回の測定から求めた。標準偏差は、誤差バーで 示してある。 実施例１ Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）融合遺伝子の構築 ヒトＢ７−２（アミノ酸１ないし２２５、Ｂ７−２225と称する）の細胞外領域 、ＥｒｂＢ２特異的ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）および免疫学的検出とアフィニティー 精製を容易にする合成配列タグをコードする融合遺伝子を酵母発現ベクターｐＰ ＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＡｖｒＩＩ部位とＮｏｔＩ部位に挿入した。 このベクターにおいては、遺伝子発現は、メタノール誘導アルコールオキシダー ゼＩ（ＡＯＸＩ）プロモータによって制御されており、またこの遺伝子産物は、 Ｎ−末端α−因子分泌シグナルを介して媒体中に分泌される。ｐＰＩＣ９もまた 、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＩＳ４変異下部ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ）でのポジティブ選択を行うための機能性ヒスチジノールデヒドロゲ ナーゼ（ＨＩＳ４）遺伝子を含んでいる。Ｂ７−２２２５ｃＤＮＡは、ヒト末梢 血単角細胞（ＰＢＭＣ）ｃＤＮＡの全ＲＮＡから逆転写を行い、次いで、ｐＣＲ 産物の５’−末端にＳaＩＩとＮｈｅＩ制限部位を、また３’−末端にＣｌａＩ 、ＢｇＩＩＩとＸｂａＩ制限部位をそれぞれ導入するオリゴヌクレオチドＢ７− ２センス５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＧ− ３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１)とＢ７−２−アンチセンス５’−ＡＡＡＡＣＴＣ ＴＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧ−３’(ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：２)を用いてＰＣＲを行うことによって誘導されたものである 。このＢ７−２225ｃＤＮＡ断片、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）をコードするｃＤＮＡ （Ｗｅｌｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２）およびモノクローナ ル抗体（Ｍａｂ）９Ｅ１０によって認識されるＭｙｅタグをコードする合成配列 （Ｅｖａｎ、Ｅ．Ｉ．ら、１９８５）ならびにポリヒスチジンタグをシングルオ ープンリーディングフレーム内に組み込んで、その後発現ベクターｐＰＩＣ９に 挿入した。対照として、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）領域を欠落する類似Ｂ７−２225 遺伝子を構築した。この構築物の完全さを制限解析とＤＮＡ配列決定によって確 認した。 実施例２ ａ）細胞系と細胞培養条件 ＣＨＯ細胞およびヒトＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＣＨ Ｏ−ＣＴＬＡ−４細胞を、２ｍＭのグルタミン、５０ｕＭβ−メルカプトエタノ ール、１０％加熱不活性化処理したウシ胎子血清（ＦＢＳ）と１ｍｇ／ｍ １Ｇ４１８（ＣＨＯ−ＣＴＬＡ−４）とを含むデオキシリボヌクレオシドによる ＭＥＭα中に保持した。Ｂａｌｂ／ｃ誘導ＨＣ１１マウス乳腺上皮細胞およびヒ トｅｒｂＢ２ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＨＣ１１−ＥｒｂＢ２細胞 （ＨＣ１１ Ｒ１＃１１）を上記したように８％ＦＢＳと５ｕｇ／ｍｌウシイン スリンを添加したＲＰＭＩ１６４０で増殖させた(Ｈｙｎｅｓ，Ｎ．Ｅ．ら、１ ９９０)。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ １１５酵母細胞（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ）を、緩衝処理した最小グリセリン−コンプレックス培地（ＢＭＧ Ｙ）中で伝播させ、組み換えタンパク質の発現を、販売業者の勧告に従って緩衝 処理した最小メタノールコンプレックス培地（ＢＭＭＹ）で誘発させた。 ｂ）組み換えタンパク質の発現と精製 キメラ融合タンパク質Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の構築と酵母中での 発現 ＥｒｂＢ２特異的ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体領域（Ｗｅｌｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２）に融合させたヒトＢ７−２（アミノ酸１ないし２２ ５、Ｂ７−２225と称する）の細胞外領域をコードするキメラ遺伝子を構築し、 １Ａ図に図示する酵母発現ベクターｐＰＩＣ９に挿入した。得られたプラスミド ｐＰＩＣ９−Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）は、メタノール誘導性アルコ ールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下にＢ７−２225−ｓｃＦ ｖ（ＦＲＰ５）と称するキメラ融合タンパク質をコードするものであるが、この タンパク質は、酵母由来のＮ−末端α−因子分泌シグナル、ヒトＢ７−２のアミ ノ酸１ないし２２５領域，ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体領域、Ｍａｂ ９Ｅ１０に よって認識されるＭｙｃエピトープ（Ｅｖａｎら、１９８５）および組み換えタ ンパク質のＮｉ2+アフィニティ−クロマトグラフィーによる精製を容易ならしめ るポリヒスチジンクラスターとから構成されるものである。 このＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株内において発現させ、Ｎｉ2+アフィニティークロマト グラフィーとゲル濾過によって精製した。酵母培養液の上済み液１リット ルから精製した可溶性組み換えタンパク質の収量は、典型的には０．５ｍｇであ った。この生成物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥとＭａｂ ９Ｅ１０イムノブロット による分析を行ったところ、二段階の精製の後で９０％以上の精度であることが 判った(図１Ｂ)。このＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）分子は、非還元条件 下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定されているようにモノマーとして酵母培養液の上 済み液中および精製フラクション中に存在しているのである(データはここに示 さない)。分子量の計算値が５５．９５ｋＤａであるのとは異なり、このタンパ ク質は、還元性の条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、見かけの分子量 がほぼ８０ないし１１０ｋＤａであるいくつかのバンドのスミアとして移動する (図１Ｂ)。このタンパク質をＮ−グリコシダーゼで処理したところ、見かけの分 子量がほぼ６０ｋＤａにまで低下したが、このことは、酵母発現のＢ７−２225 −ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質の見かけの分子量が高くなるのは、主として Ｎ−結合グルコシル化による翻訳後修飾に起因するものであることを示している 。 線状化ｐＰＩＣ９−Ｂ７−２225とｐＰＩＣ９−Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ ５）プラスミドとのＤＮＡを、エレクトロポレーションによるＰｉｃｈｉａ ｐ ａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５細胞の形質転換を行うために使用した(Ｓｃｏｒｅ ｒ、Ｃ．Ａ．ら、１９９４)。Ｈｉｓ４+／メタノール資化+（ｍｕｔ+）酵母コロ ニーを選択培地上において確立された慣用プロトコールに従って（Ｂａｒｒ、Ｋ ．Ａ．ら、１９９２）単離し、メタノールで誘導したところ、Ｂ７−２225また はＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）発現クローンを、Ｍａｂ ９Ｅ１０を用 いた培養上済み液をイムノブロット分析することによって同定した。大規模な発 現を行わせるために、単一コロニーをそれぞれｐＨ８のＢＭＧＹ培地において３ のＯＤ６００になるまで成育させ、培地をｐＨ８のメタノール含有ＢＭＭＹ培地 と交換し、タンパク質発現を３０℃で誘発させた。酵母細胞を２０、０００Ｇで の遠心分離することによって除去した。可溶性のＢ７−２225およびＢ７−２225 −ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）融合タンパク質を含有する上済み液を４５ｕｍのフィル ターに通し、次いでＮｉ２＋−飽和キレート性セファロースカラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にかけ、Ｃ−末端ポリヒスチジンタグを介して結合 させた組み換えタンパク質を ＰＢＳ中２５０ｍＭのイミダゾールを用いて溶出させた。このＢ７−２225−ｓ ｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質をさらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたゲル濾過によって精製し、この融合タ ンパク質を含有するフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭａｂ ９Ｅ１０を 用いたイムノブロッティングで同定し、収集し、限外濾過で濃縮し、次いでＰＢ Ｓに対して透析した。酵母由来のＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク 質の翻訳後修飾を脱グルコシル化反応で分析した。０．２ｕｇの精製融合タンパ ク質を０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳ中において１００℃にまで１０分間加熱した 。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を最終濃度が１％となるように添加し、このタンパ ク質をＮ−グルコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｇ ｍｂＨ、ＤＥ）とともに全反応容積を１００ｕｌとして３７℃において１６時間 培養した。次いでこの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥとＭａｂ ９Ｅ１０によるイムノ ブロッティングで分析した。 実施例３ 結合分析 ａ）精製したＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）が、ＣＴＬＡ−４発現細胞に 特異的に結合する。 Ｂ７−２は、Ｔ細胞の表面上のＢ７対抗レセプターＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４ と結合するのである(Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９３；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｓｃ ｉｅｎｃｅ、１９９３；Ａｚｕｍａら、１９９３)。Ｂ７−２領域の機能性を検 討するために、組み換えＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の細胞表面上のＣ ＴＬＡ−４に対する結合性をＦＡＣＳ分析によって試験した。ヒトＣＴＬＡ−４ のｃＤＮＡで安定にトランスフェクトさせたＣＨＯ−ＣＴＬＡ−４細胞をＢ７− ２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）とともに培養し、特異的に結合させた融合タンパ ク質をＭａｂ ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて検出 した。得られた結果を図２Ａに示す。ＣＨＯ対照細胞ではなくＣＨＯ−ＣＴＬＡ −４細胞に対するＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の有意な結合は、検出す ることが可能であった。相当する結果は、ｓｃＦｖ領域を 欠落するＢ７−２225および抗−ＣＴＬＡ−４抗体を用いて得られた。ＣＴＬＡ −４へのＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）結合特異性は、競合検定試験でさ らに確認した。可溶性Ｂ７−２タンパク質と同様にして、ヒトＣＴＬＡ−４のア ミノ酸１ないし１２５を含んで成る組み換えタンパク質をＰｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓ において発現させ、培養上済み液から精製した。ＣＨＯ−ＣＴＬＡ− ４細胞をＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）とともに特異的競合物として５０ 倍モル過剰の可溶性ＣＴＬＡ−４タンパク質の存在下または不存在下で培養し、 Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の結合性をＭａｂ ９Ｅ１０およびＰＥ− 標識可ヤギ抗マウスＩｇＧを用いたＦＡＣＳ分析によって検討した。図２Ｂおよ び図Ｃにおいて示すように、可溶性ＣＴＬＡ−４タンパク質は、Ｂ７−２225− ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）のＶＨＯ−ＣＴＬＡ−４細胞への結合を殆ど完璧に阻止し た。これらのデータから、Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）のＢ７−２領域 が機能的に活性でありかつ特異的にＢ７対抗レセプターと相互作用することが明 らかとなった。 Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）のＢ７対抗レセプターＣＴＬＡ−４に対す る結合性は、ＣＨＯ−ＣＴＬＡ−４と対照として親のＣＨＯ細胞を用いたＦＡＣ Ｓ分析によって測定決定した。５ ｘ １０５のトリプシン化細胞を０．１また はｌｕｇのＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質とともに４℃におい て４５分間培養し、次いで３ｕｇのＭａｂ ９Ｅ１０およびＦＩＴＣ−またはＰ Ｅで標識化したヤギ抗マウスＩｇＧ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共に３０分間培 養した。Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の結合は、ＦＡＣＳスキャン（Ｂ ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて検出した。同様に、マウス乳腺表皮 細胞を発現するＥｒｂＢ２へのＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の結合は、 ＦＡＣＳ分析によって求めた。同様にＥｒｂＢ２に対するＢ７−２225−ｓｃＦ ｖ（ＦＲＰ５）の結合も、ＥｒｂＢ２タンパク質の Ｎ−末端部を含有しかつＥｒｂＢ２特異的Ｍａｂ ＦＲＰ５によって認識される 組み換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を用い て試験した。バクテリアを用いて発現させたＧＳＴまたはＧＳＴ−ＥｒｂＢ２融 合タンパク質（１９ｕｇ）をそれぞれ２００ｕｌのグルタチオン結合アガロース ビーズに結合させた。このビーズを４ｕｇのＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５ ）とともに培養し、ＰＢＳで洗浄し、特異的に結合させたタンパク質をＳＤＳ− ＰＡＧＥおよびＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質に特異的に結合 するＭａｂを用いたイムノブロッティングによって分析した。 実施例４ 細胞増殖測定 ａ）Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）は、同遺伝子型Ｔ細胞増殖に対する共 刺激作用を有する。 キメラＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）タンパク質は、ＣＴＬＡ−４および 細胞表面上のＥｒｂＢ２に結合するので、二重特異性を有する。いくつかの研究 報告によれば、ヒトＢ７−１またはＢ７−２は、マウスＢ７対抗レセプターＣＤ ２８またはＣＴＬＡ−４と機能的に相互作用を及ぼすことができまたそれとは逆 の相互作用が可能であることが明らかとなっている(Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｇ．Ｊ． ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ.、１９９３；Ｃａｉ、Ｙ．Ｃ．ら、１９９５)。精製し たＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）が細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞 増殖を共刺激することができるか否かを決定するために、同遺伝子型リンパ球反 応（ＳＬＲ）を、ＭＰＡとＩＬ−２で事前刺激処理したＢａｌｂ／ｃマウス由来 の一次Ｔ細胞およびＢａｌｂ／ｃ揺らいで、その表面においてヒトＥｒｂＢ２を 発現するマウスＨＣ１１−ＥｒｂＢ２とを用いて実施した。このＨＣ１１−Ｅｒ ｂＢ２細胞をＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し 、次いで５倍過剰量の事前刺激処理Ｔ細胞とともに培養した。Ｂ７−２225−ｓ ｃＦｖ（ＦＲＰ５）処理を行った場合、この融合タンパク質の不存在下で処理し た細胞と比較してＴ細胞増殖が強度の増大し た(図４Ａ)。５００モル倍の可溶性ＣＴＬＡ−４または３０モル倍の阻害性抗Ｂ ７−２抗体ＦＵＮ−１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を添加することによって、Ｂ７ −２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の持つ刺激性効果が全く低減した(図４Ｂ)。こ のことは、観察されたＴ細胞増殖の刺激が、Ｂ７−２領域がＴ細胞上にあるその 同族対抗レゼプターと特異的に相互作用を及ぼすことに起因することを示してい る。 ｂ）Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）の細胞表面ＥｒｂＢ２への結合が、Ｔ 細胞の共刺激には必要である。 細胞表面に結合したＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）は、Ｔ細胞増殖のため の共刺激性シグナルを付与する。細胞表面での提示がＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ ＦＲＰ５）の共刺激性活性に必要であるか否かを検討するために、ＨＣ１１−Ｅ ｒｂＢ２細胞および同遺伝子型Ｔ細胞を用いたＳＬＲ実験を、精製Ｂ７−２225 −ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）またはＥｒｂＢ２特異的抗体領域を欠落する類似Ｂ７− ２225タンパク質を共存させ、かつその濃度を上昇させて上記したように実施し た。図５Ａに図示するように、Ｂ７−２225は、培養に共存させたもののＨＣ１ １−ＥｒｂＢ２細胞表面とは結合することができないので、Ｔ細胞増殖を刺激し なかったが、他方ではＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）分子は１０ｎｇ／ｍ ｌ以上の濃度では、Ｔ細胞増殖を強度に増大させた。Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ ＦＲＰ５）の共刺激活性が、細胞表面ＥｒｂＢ２への結合度に対して依存してい ることは、ＨＣ１１−Ｅｒｂ２と親ＨＣ１１細胞を用いた類似ＳＬＲ実験におい て確認された。Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）（１ｕｇ／ｍｌ）存在下で のＨＣ１１−ＥｒｂＢ２は、−ＨＣ１１細胞ではそうではないが―Ｔ細胞増殖を 強度に刺激することになったのであるが、このことは、このキメラタンパク質を ＥｒｂＢ２発現細胞の細胞表面に提示す ることが、その共刺激活性に必要であることを示している(図５Ｂ)。これらのデ ータから、Ｂ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）分子は、ＥｒｂＢ２発現標的細 胞に対して極めて特異性が高くかつＥｒｂＢ２陰性細胞とのＨＮにおいては、可 溶性形としてのみ存在する場合はＴ細胞増殖を増大させないことが明らかとなっ た。 Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞を、ＮＨ4Ｃｌを用いた低張性溶解によって それから赤血球を除去し、次いで報告において記載されているように（Ｃｏｌｉ ｇａｎ、Ｊ．Ｅ．ら、１９９３）ナイロン−ウールシリンジ中を通過させた。こ の濃縮細胞製剤は、ＦＡＣＳ分析で測定したところＴ細胞は８５％以上、Ｂ細胞 （Ｉｇ+）は５％以下また他の細胞はほぼ１０％含有していた。濃縮一次Ｔ細胞 を、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）と５０ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩ Ｌ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、ＤＥ）とを含有 する培地で４８時間事前刺激処理した。２ｘ１０4個のマイトマイシン処理ＨＣ １１またはＨＣ１１−ＥｒｂＢ２細胞を１、１０、１００または１０００ｎｇ／ ｍｌのＢ７−２225−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）融合タンパク質とともに９６個のウ エルのプレートで２時間培養した。比較対照細胞をｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）領域を 欠落したＢ７−２225融合タンパク質で処理するかまたは未処理のまま放置した 。１ｘ１０5個の事前刺激処理したＴ細胞を、各ウエルに添加し、細胞をさらに ８％のＦＢＳと２０ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ培地 で全用量を２００ｕｌ／ｗｅｌｌとして２時間培養した。得られた細胞を０．２ ５ｕＣｉ／ｗｅｌｌの［3Ｈ］−チミジン（ＤｕＰｏｎｔ）で２０時間パルス処 理し、［3Ｈ］−チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃ ｋｍａｎ）で測定した．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｋ 37/62 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 標的細胞に対するＴ細胞を特異的に共刺激させるための以下からなる可溶 状態にある二重特異性融合タンパク質を含んで成る治療剤を製造する方法： ａ）標的細胞上の特異的表面細胞を認識する結合性領域、および ｂ）これと共有結合したＴ細胞増殖を共刺激する能力を有する領域。 ２．前記結合性領域が、前記標的細胞の表面で発現した成長因子またはサイトカ インレセプターに結合している、請求項１において請求された方法。 ３． 前記結合性領域が、前記標的細胞の表面で発現したＥｒｂＢチロシンキナ ーゼに対して特異的な結合性領域である、請求項１において請求された方法。 ４． 前記結合性領域が、前記標的細胞の表面で発現した病原体（例えば、ウイ ルス、バクテリア、酵母、菌など）の抗原に結合している、請求項１において請 求された方法。 ５． 前記共刺激性領域が、Ｔ細胞の表面上のＢ７対抗レセプターを結合する、 Ｂ７分子の結合性領域である、請求項１ないし４項に記載された方法。 ６． 前記共刺激性領域が、Ｔ細胞の表面上の対抗レセプターを結合する、ＣＤ ４０Ｌ分子の結合性領域である、請求項１ないし４項に記載された方法。 ７． 前記標的細胞が腫瘍細胞である、、請求項１ないし６項に記載された方法 。 ８． 前記標的細胞が病原体（例えば、ウイルス、バクテリア、酵母、菌など） に感染した細胞である、請求項１ないし７項に記載された方法。 ９． 前記Ｔ細胞が同遺伝子型のＴ細胞である、請求項１ないし８項に記載され た方法。 １０． 前記Ｔ細胞が、患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球、リンホカイン活性化キ ラー細胞または細胞毒性Ｔ細胞である、請求項１ないし９項に記載された方法。 １１． 前記Ｔ細胞が、細胞毒性Ｔ細胞でありかつ前記患者がＩＬ−２で治療さ れ、次いで可溶状性の二重特異性融合タンパク質で治療される、請求項１ないし １０項に記載された方法。 １２． 標的細胞に対するＴ細胞を特異的に共刺激させるための以下からなる可 溶性二重特異性融合タンパク質の用途： ａ）標的細胞上の特異的表面細胞を認識する結合性領域、および ｂ）これと共有結合したＴ細胞増殖を共刺激する能力を有する領域。
JP53810898A 1997-03-04 1998-02-21 二重特異性、共刺激性を有するキメラタンパク質によるｔ−細胞増殖の共刺激 Pending JP2001513788A (ja)

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