JP2001511349A - Genes for 6-deoxyhexose biosynthesis and transfer in Saccharopolysporaerythraea and Streptomycesantibioticus - Google Patents
Genes for 6-deoxyhexose biosynthesis and transfer in Saccharopolysporaerythraea and StreptomycesantibioticusInfo
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Abstract
(57)【要約】 この発明は、エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域に対応する図２に表示された単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１)及びエリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙＫ領域に対応する図３に表示された単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:６)に関係する。この発明は又、オレアンドマイシン生合成遺伝子の領域に対応する図２２に表示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５の配列)にも関係する。 (57) [Summary] The present invention relates to the isolated DNA sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1) corresponding to the eryG-eryAIII region of the erythromycin biosynthesis gene cluster and to the eryAI-eryK region of the erythromycin biosynthesis gene cluster. Related to the corresponding isolated DNA sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 6). The invention also relates to the isolated DNA sequence shown in FIG. 22 corresponding to the region of the oleandmycin biosynthesis gene (SEQ ID NO: 15).
Description
【０００１】 本発明は、Saccharopolyspora erythraeaにおける６−デオキシヘキソースの 生合成及び移送に関与する遺伝子並びに遺伝子操作によるエリスロマイシンのア
ナログの生産におけるそれらの利用を記載する。The present invention describes genes involved in the biosynthesis and transfer of 6-deoxyhexose in Saccharopolyspora erythraea and their use in the production of analogs of erythromycin by genetic engineering.
【０００２】 エリスロマイシンＡは、グラム陽性細菌Sac. erythraeaにより生成される臨床
的に重要なマクロライド系抗生物質である。エリスロマイシンの生合成のための
遺伝子は、ｅｒｙ遺伝子のクラスター内に組織化されており、それは又、エリス
ロマイシンに対する自己耐性のための遺伝子ｅｒｍＥをも含んでいる。Erythromycin A is a clinically important macrolide antibiotic produced by the gram-positive bacterium Sac. Erythraea. The genes for erythromycin biosynthesis are organized into a cluster of ery genes, which also contains the gene ermE for self-resistance to erythromycin.
【０００３】 ｅｒｙクラスターは、ポリケチドシンテターゼ(ＰＫＳと呼ばれる)及びこれに
隣接する２つの領域であってラクトン核(６−デオキシエリスロノリドＢ)のエリ
スロマイシンＡへの変換の後続段階に関与する遺伝子を含む２つの領域を含む３
つのポリペプチドをコードする３つの主要な遺伝子ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ及
びｅｒｙＡＩＩＩ(遺伝子座ｅｒｙＡ)を含んでいる。The ery cluster is a polyketide synthetase (referred to as PKS) and two adjacent regions, the genes involved in the subsequent steps of the conversion of the lactone nucleus (6-deoxyerythronolide B) to erythromycin A. Including two regions including 3
It contains three major genes, eryAI, eryAII and eryAIII (locus eryA), which encode three polypeptides.
【０００４】 図１に表したエリスロマイシンＡ生合成プロセスにおいて、６−デオキシヘキ
ソースの生合成は、グルコース−１−ホスフェートから最終的な活性化された糖
ｄＴＤＰ−Ｌ−ミカロース又はｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミンへ導く全酵素反応を含
む。こうして生成されたｄＴＤＰ−Ｌ−ミカロース又はｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミ
ンは、次に、これら２つのデオキシヘキソースのラクトン核への移送の基質とし
て用いられる。エリスロマイシンの形成は、ラクトン核のＣ−３位のヒドリルを
介するミカロースの結合及びＣ−５位のヒドリルを介するデソサミンの結合を必
要とする。ミカロースの生合成又は移送に関与するすべてのｅｒｙＢ遺伝子及び
デソサミンの生合成又は移送に関与するすべてのｅｒｙＣ遺伝子は、未だ、明確
には同定されていない。In the erythromycin A biosynthesis process depicted in FIG. 1, the biosynthesis of 6-deoxyhexose is converted from glucose-1-phosphate to the final activated sugar dTDP-L-mycalose or dTDP-D-desosamine. Includes all enzymatic reactions leading. The dTDP-L-mycalose or dTDP-D-desosamine thus produced is then used as a substrate for the transfer of these two deoxyhexoses to the lactone nucleus. Erythromycin formation requires the binding of mycalose via the hydryl at position C-3 and the binding of desosamine via the hydryl at position C-5 of the lactone nucleus. All eryB genes involved in the biosynthesis or transport of micarose and all eryC genes involved in the biosynthesis or transport of desosamine have not yet been clearly identified.
【０００５】 ５６ｋｂの長さを有するｅｒｙクラスターは、２１のオープンリーディングフ
レーム(ＯＲＦ)を含んでおり、その番号付けは、Haydock等(1991)及びDonadio等
(1993)により確立されている。ｅｒｙＡ遺伝子座は、ＯＲＦ１０、１１及び１２
を含んでいる。[0005] An ery cluster having a length of 56 kb contains 21 open reading frames (ORFs), numbered by Haydock et al. (1991) and Donadio et al.
(1993). The eryA locus is associated with ORFs 10, 11 and 12
Contains.
【０００６】 ｅｒｙクラスターの左部分における遺伝子中断又は置換の初期の研究は、ｅｒ
ｙＣＩ遺伝子(ＯＲＦ１)の最初の同定、その後のｅｒｙＢＩ遺伝子(ＯＲＦ２)の
同定、ｅｒｙＨ遺伝子座(ＯＲＦ３、４及び５)(これらの不活性化は、６−デオ キシエリスロノリドＢの生成へと導く)の同定、ｅｒｙＢＩＩ遺伝子座(ＯＲＦ７
及び８)及びｅｒｙＣＩＩ遺伝子の同定を与えた(Weber等、1990)。[0006] Early studies of gene disruption or replacement in the left part of the ery cluster
Initial identification of the yCI gene (ORF1), followed by identification of the eryBI gene (ORF2), the eryH locus (ORF3, 4 and 5) (these inactivations lead to the production of 6-deoxyerythronolide B). Identification, the eryBII locus (ORF7
And 8) and the identification of the eryCII gene was provided (Weber et al., 1990).
【０００７】 後続のラクトン核の修飾に関与する酵素活性の内で、Ｃ６位のヒドロキシル化
の原因であるｅｒｙＦ遺伝子(ＯＲＦ４)(Weber等、1991)及びＣ１２位のヒドロ キシル化の原因であるｅｒｙＫ遺伝子(ＯＲＦ２０)(Stassi等、1993)は、同定さ
れている。更に、クラジノースへのミカロースのＯ−メチル化(３”位ＯＨ)の原
因であるｅｒｙＧ遺伝子(ＯＲＦ６)は、同定されている(Weber等、1989)。エリ スロマイシンＡは、こうして、エリスロマイシンＢ又はエリスロマイシンＣを介
してエリスロマイシンＤから、提示した図式(図１)に従って形成される。[0007] Among the enzymatic activities involved in the subsequent modification of the lactone nucleus, the eryF gene (ORF4) (Weber et al., 1991) responsible for hydroxylation at position C6 and eryK responsible for hydroxylation at position C12. The gene (ORF20) (Stassi et al., 1993) has been identified. In addition, the eryG gene (ORF6) responsible for O-methylation of mycalose to cladinose (3'-OH) has been identified (Weber et al., 1989). Erythromycin A is thus erythromycin B or erythromycin Formed from erythromycin D via C according to the scheme presented (FIG. 1).
【０００８】 ｅｒｙクラスターの右部分(ＯＲＦ１３〜１９)に位置するｅｒｙＢ及びｅｒｙ
Ｃ遺伝子の機能的特性決定は、様々な雑誌に報告された断片的情報(Donadio等、
1993；Liu及びThorson、1994；Katz及びDonadio、1995)にもかかわらず、未だ、
正確には確立されていない。[0008] eryB and ery located in the right part (ORF13-19) of the ery cluster
Functional characterization of the C gene is based on fragmentary information reported in various journals (Donadio et al.,
1993; Liu and Thorson, 1994; Katz and Donadio, 1995)
Not exactly established.
【０００９】 マクロライド系抗生物質に対する商業的関心のために、新規な誘導体(特に、 有利な特性を有するエリスロマイシンアナログ)の獲得が熱心に追求されている 。エリスロマイシンのアグリコン部分(マクロラクトン)において又は／及びその
第二のヒドロキシル化において並びに糖部分(クラジノース及び／又はデソサミ ン)において、修飾は、望ましいであろう。Due to the commercial interest in macrolide antibiotics, the acquisition of new derivatives, especially erythromycin analogs with advantageous properties, has been eagerly pursued. Modifications may be desirable at the aglycone portion of erythromycin (macrolactone) or / and at its second hydroxylation and at the sugar portion (clazinose and / or desosamine).
【００１０】 現在の方法例えば化学的修飾は、困難であり且つエリスロマイシンから得るこ
とのできる生成物の種類が限られている。例えば、Sakakibara等(1984)は、エリ
スロマイシンＡ又はＢから実施される化学的修飾(糖部分及びマクロラクトンの 両方)を概説している。[0010] Current methods, such as chemical modification, are difficult and the types of products that can be obtained from erythromycin are limited. For example, Sakakibara et al. (1984) review chemical modifications (both sugar moieties and macrolactones) performed from erythromycin A or B.
【００１１】 微生物Sac. erythraeaの遺伝子操作によるエリスロマイシンＡのマクロラクト
ンの修飾は、国際特許出願ＷＯ９３／１３６６３に記載されており、ＰＫＳをコ
ードする染色体のｅｒｙＡ遺伝子座の特異的な遺伝的変化による新規なポリケチ
ド分子の獲得も記載されている。例えば、７−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、
６−デオキシ−７−ヒドロキシエリスロマイシンＡ又は３−オキソ−３−デオキ
シ−５−デソサミニル−エリスロノリドＡが、この方法で得られている。[0011] Modification of the macrolactone of erythromycin A by genetic manipulation of the microorganism Sac. Erythraea is described in International Patent Application WO 93/13663 and is novel due to specific genetic alterations in the eryA locus of the chromosome encoding PKS. The acquisition of novel polyketide molecules has also been described. For example, 7-hydroxyerythromycin A,
6-Deoxy-7-hydroxyerythromycin A or 3-oxo-3-deoxy-5-desosaminyl-erythronolide A has been obtained in this way.
【００１２】 本発明は、ミカロース及びデソサミンの生合成又は結合に関与するSac. eryth
raeaの遺伝子(ｅｒｙＡ遺伝子座の下流に位置するｅｒｙＢＩＩ、ｅｒｙＣＩＩ Ｉ及びｅｒｙＣＩＩ並びに上流に位置するｅｒｙＢＩＶ、ｅｒｙＢＶ、ｅｒｙＣ
ＶＩ、ｅｒｙＢＶＩ、ｅｒｙＣＩＶ、ｅｒｙＣＶ及びｅｒｙＢＶＩＩ)の機能的 特性決定、それらのエリスロマイシンアナログの生産における利用並びにそれら
の製造方法に関するものである。The present invention relates to Sac. Eryth involved in the biosynthesis or binding of mycalose and desosamine.
raea genes (eryBII, eryCII I and eryCII located downstream of the eryA locus and eryBIV, eryBV, eryC located upstream
VI, eryBVI, eryCIV, eryCV and eryBVII), their use in the production of erythromycin analogs and methods for their production.
【００１３】 それ故に、本発明の主題は、図２に示した単離された一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ
配列(SEQ ID NO:１の順行配列及び相補性配列)であって、これは、エリスロマイ
シン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域に対応しており
、特別の主題は、下記を含む上記のＤＮＡ配列である： − ＯＲＦ７(SEQ ID NO:１のヌクレオチド４８〜１０４６の相補性配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼを
コードするｅｒｙＢＩＩ配列、 − ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４６〜２３０８の相補性配列)に
対応し、デソサミニルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＣＩＩＩ配列、及
び − ＯＲＦ９(SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に
対応し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラー
ゼをコードするｅｒｙＣＩＩ。Therefore, the subject of the present invention is the isolated single-stranded or double-stranded DNA shown in FIG.
Sequence (forward and complementary sequence of SEQ ID NO: 1), which corresponds to the eryG-eryAIII region of the cluster of erythromycin biosynthesis genes, the particular subject matter including: DNA sequence: eryBII sequence corresponding to ORF7 (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1) and encoding dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase; -An eryCIII sequence corresponding to ORF8 (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1) and encoding desosaminyltransferase; and ORF9 (complementary sequence of nucleotides 2322 to 3404 of SEQ ID NO: 1). ), Corresponding to dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase.
【００１４】 図２に示した上記のＤＮＡ配列は、例えば、以下に詳しい説明を与える操作条
件に従ってSac. erythraeaのゲノムＤＮＡ断片の制限断片をサブクローン化する
ことにより得ることのできるゲノムＤＮＡ配列である。The above DNA sequence shown in FIG. 2 is, for example, a genomic DNA sequence obtainable by subcloning a restriction fragment of a genomic DNA fragment of Sac. Erythraea in accordance with the operating conditions given in detail below. is there.
【００１５】 この発明の一層特別の主題は、ＯＲＦ７(SEQ ID NO:１のヌクレオチド４８〜 １０４６の相補性配列)に対応するｅｒｙＢＩＩ配列、ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１の
ヌクレオチド１０４６〜２３０８の相補性配列)に対応するｅｒｙＣＩＩＩ配列 又はＯＲＦ９(SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に
対応するｅｒｙＣＩＩ配列から選択する図２に示した単離されたＤＮＡ配列及び
この配列又はその断片とハイブリダイズし且つ／又は有意の相同性を有し且つ同
じ機能を有する配列である。A more particular subject of this invention is the eryBII sequence corresponding to ORF7 (complementary sequence from nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1), ORF8 (complementary sequence from nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1). Selected from the eryCIII sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 or the eryCII sequence corresponding to ORF9 (complementary sequence of nucleotides 2322 to 3404 of SEQ ID NO: 1) and this sequence or a fragment thereof And / or have significant homology and the same function.
【００１６】 この発明の全く特別の主題は、ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４ ６〜２３０８の相補性配列＝SEQ ID NO:４の相補性配列)に対応し且つデソサミ ニルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＣＩＩＩ単離されたＤＮＡ配列(図 ２に 表示)である。A very specific subject of the invention corresponds to ORF8 (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1 = complementary sequence of SEQ ID NO: 4) and encodes a desosaminol transferase eryCIII isolated DNA sequence (shown in FIG. 2).
【００１７】 ＯＲＦ７に対応するｅｒｙＢＩＩ配列は、３３３アミノ酸を有するポリペプチ
ド(SEQ ID NO:２の配列)をコードし、ＯＲＦ８に対応するｅｒｙＣＩＩＩ配列は
、４２１アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:５の配列)をコードし、そし
てＯＲＦ９に対応するｅｒｙＣＩＩ配列は、３６１アミノ酸を有するポリペプチ
ド(SEQ ID NO:３の配列)をコードする。The eryBII sequence corresponding to ORF7 encodes a polypeptide having 333 amino acids (sequence of SEQ ID NO: 2), and the eryCIII sequence corresponding to ORF8 is a polypeptide having 421 amino acids (SEQ ID NO: 5). And the eryCII sequence corresponding to ORF9 encodes a polypeptide having 361 amino acids (SEQ ID NO: 3 sequence).
【００１８】 上に示したそれぞれの酵素活性は、以下に実験部において説明するように、対
応する遺伝子への内部欠失の導入により示されたものである。Each of the above enzyme activities is indicated by the introduction of an internal deletion into the corresponding gene, as described in the experimental section below.
【００１９】 ハイブリダイズし且つ同じ機能を有する配列は、Sambrook等(1989)により記載
された高緊縮又は中緊縮の標準条件下で上記のＤＮＡ配列の１つとハイブリダイ
ズし且つ同じ酵素機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を包含すると理解
される。用語同じ酵素機能は、類似の性質の基質例えばｄＴＤＰ−６−デオキシ
ヘキソース又は裸の若しくはグリコシル化されたマクロラクトンに対する所定の
酵素活性を意味すると理解される。高緊縮の条件は、例えば、５×ＳＳＰＥ、１
０×デンハート、１００μｇ／ｍｌＤＮＡｓｓ、１％ＳＤＳ溶液中での６５℃で
１８時間でのハイブリダイゼーション(その後、２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ 溶液での２０分間の洗浄を６５℃で２回行い、その後、最後に１回、０．１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での４５分間の洗浄を６５℃で行う)を含む。中緊縮 の条件は、例えば、最後の２０分間にわたる０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶
液での６５℃で１回の洗浄を含む。A sequence that hybridizes and has the same function is a protein that hybridizes to one of the above DNA sequences under standard conditions of high stringency or medium stringency described by Sambrook et al. (1989) and has the same enzyme function. Is understood to encompass the DNA sequence encoding The term enzymatic function is understood to mean a given enzymatic activity on substrates of similar nature, for example dTDP-6-deoxyhexose or on naked or glycosylated macrolactones. Conditions of high stringency are, for example, 5 × SSPE, 1
Hybridization at 65 ° C. for 18 hours in 0 × Denhardt, 100 μg / ml DNAss, 1% SDS solution (then, washing twice at 65 ° C. for 20 minutes with 2 × SSC, 0.05% SDS solution) , Then one last time, 0.1 × S
SC, a 45 minute wash with 0.1% SDS solution at 65 ° C.). Moderate stringency conditions include, for example, one wash at 65 ° C. with 0.2 × SSC, 0.1% SDS solution for the last 20 minutes.
【００２０】 有意の均一性を示し且つ同じ機能を有する配列は、上記のＤＮＡ配列の１つと
少なくとも６０％のヌクレオチド配列同一性を有し且つ同じ酵素機能を有する蛋
白質をコードする配列を包含すると理解される。Sequences which exhibit significant homogeneity and have the same function are understood to include sequences which have at least 60% nucleotide sequence identity with one of the above DNA sequences and which code for a protein which has the same enzymatic function. Is done.
【００２１】 この発明の主題は、上記のＤＮＡ配列の１つによりコードされるポリペプチド
でもあり、特別の主題は、ＯＲＦ７(SEQ ID NO:２の配列を有する)、ＯＲＦ８(S
EQ ID NO:５の配列を有する)又はＯＲＦ９(SEQ ID NO:３の配列を有する)より選
択する図２に示したＯＲＦに対応するポリペプチド及びこのポリペプチドのアナ
ログである。A subject of the invention is also a polypeptide encoded by one of the above DNA sequences, a particular subject being ORF7 (having the sequence of SEQ ID NO: 2), ORF8 (S
2 is a polypeptide corresponding to the ORF shown in FIG. 2 and an analog of this polypeptide, selected from EQID NO: 5 (having the sequence of SEQ ID NO: 3) or ORF9 (having the sequence of SEQ ID NO: 3).
【００２２】 アナログは、生成物が同じ酵素機能を保持する限り、少なくとも一のアミノ酸
の置換、欠失又は付加により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包
含すると理解される。これらの改変された配列は、例えば、当業者に公知の位置
指定突然変異導入技術を用いて製造することができる。Analogs are understood to include polypeptides having an altered amino acid sequence by substitution, deletion or addition of at least one amino acid, so long as the product retains the same enzymatic function. These modified sequences can be produced, for example, using site-directed mutagenesis techniques known to those skilled in the art.
【００２３】 この発明の一層特別の主題は、図２に示したＯＲＦ８に対応するポリペプチド
(SEQ ID NO:５の配列を有する)である(デソサミニルトランスフェラーゼ活性を 有し、ＥｒｙＣＩＩＩと呼ばれる)。A more particular subject of the invention is a polypeptide corresponding to ORF8 shown in FIG.
(Having the sequence of SEQ ID NO: 5) (having desosaminyltransferase activity and called EryCIII).
【００２４】 この発明は、公知の遺伝子工学及び細胞培養法により、宿主細胞内での発現に
より得られるSac. erythraeaのＥｒｙＣＩＩＩ組換え蛋白質を記載する。The present invention describes an EryCIII recombinant protein of Sac. Erythraea obtained by expression in a host cell by known genetic engineering and cell culture methods.
【００２５】 精製された組換え蛋白質の獲得は、活性な糖ｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミンのラク
トン核への移送を示すイン・ビトロ試験において、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子産物と
関連するグリコシルトランスフェラーゼ機能の特性表示の確認を与えた。The acquisition of the purified recombinant protein confirms the characterization of the glycosyltransferase function associated with the eryCIII gene product in an in vitro test showing the transfer of the active sugar dTDP-D-desosamine to the lactone nucleus. Gave.
【００２６】 この発明の主題は又、チミジン５’−(トリヒドロゲンジホスフェート)、Ｐ’
−[３．４，６−トリデオキシ−３−(ジメチルアミノ)−Ｄ−．キシロ．−ヘキ ソピラノシル]エステル(ｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミン)及び塩基付加塩でもある(そ
の製造例は、以下に、実験部で記載する)。The subject of the present invention also relates to thymidine 5 ′-(trihydrogen diphosphate), P ′
-[3.4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-. Kishiro. [Hexopyranosyl] ester (dTDP-D-desosamine) and base addition salts (manufacture examples thereof are described below in the experimental section).
【００２７】 この発明の主題は又、エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡ
Ｉ−ｅｒｙＫ領域に対応する図３に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:６ の配列)でもあり、特別の主題は、下記を含む上記のＤＮＡ配列である： − ＯＲＦ１３(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)に対応し
、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼをコード
するｅｒｙＢＩＶ配列、 − ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応
し、ミカロシルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＢＶ配列、 − ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
をコードするｅｒｙＢＶＩ配列、 − ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼをコードす
るｅｒｙＣＩＶ配列、 − ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼをコー
ドするｅｒｙＣＶ配列及び − ＯＲＦ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５エピメラーゼをコ
ードするｅｒｙＢＶＩＩ。The subject of the present invention also relates to eryA, a cluster of erythromycin biosynthesis genes.
Also the isolated DNA sequence shown in FIG. 3 corresponding to the I-eryK region (sequence of SEQ ID NO: 6), a particular subject is the above DNA sequence which comprises: ORF13 (SEQ ID NO: EryBIV sequence corresponding to dTDP-4-set-L-6-deoxyhexose 4-reductase, corresponding to nucleotides 242-1207 of NO: 6) ORF14 (of nucleotides 1210-2454 of SEQ ID NO: 6). EryBV sequence encoding mycarosyltransferase, corresponding to ORF15 (sequence of nucleotides 2510-3220 of SEQ ID NO: 6), dTDP-D-6-deoxyhexose 3-N-methyltransferase -Corresponding to ORF16 (sequence of nucleotides 3308 to 4837 of SEQ ID NO: 6), dTDP-4-cet-L-6-deo An eryBVI sequence encoding sihexose 2,3-dehydratase; an eryCIV sequence corresponding to ORF17 (sequence of nucleotides 4837-6039 of SEQ ID NO: 6) and encoding dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase An eryCV sequence corresponding to ORF18 (sequence of nucleotides 6080 to 7546 of SEQ ID NO: 6) and encoding dTDP-D-4,6-dideoxyhexose 3,4-reductase; and ORF19 (SEQ ID NO: 6). EryBVII, which encodes dTDP-4-set-D-6-deoxyhexose 3,5 epimerase.
【００２８】 図３に示した上記のＤＮＡ配列は、例えば、以下に詳しい説明を与える操作条
件に従って、Sac. erythraeaのゲノムＤＮＡライブラリーを含むコスミドの制限
断片をサブクローン化することにより得ることができるゲノムＤＮＡ配列である
。The above-described DNA sequence shown in FIG. 3 can be obtained, for example, by subcloning a cosmid restriction fragment containing a genomic DNA library of Sac. Erythraea according to the operating conditions described in detail below. A possible genomic DNA sequence.
【００２９】 この発明の一層特別の主題は、図３に示したＯＲＦ１３(SEQ ID NO:６のヌク レオチド２４２〜１２０７の配列)に対応するｅｒｙＢＩＶ配列、ＯＲＦ１４(SE
Q ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応するｅｒｙＢＶ配 列、ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応
するｅｒｙＣＶＩ配列、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４ ８３７の配列)に対応するｅｒｙＢＶＩ配列、ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレ
オチド４８３７〜６０３９の配列)に対応するｅｒｙＣＩＶ配列、ＯＲＦ１８(SE
Q ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応するｅｒｙＣＶ配 列又はＯＲＦ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対
応するｅｒｙＢＶＩＩ配列及びこの配列とハイブリダイズし且つ／又はこの配列
との有意の相同性を示す配列又はその断片(同じ機能を有するもの)より選択する
単離されたＤＮＡ配列である。A more particular subject of this invention is the eryBIV sequence corresponding to ORF13 (sequence of nucleotides 242-1207 of SEQ ID NO: 6) shown in FIG. 3, ORF14 (SE
An eryBV sequence corresponding to QID NO: 6 nucleotides 1210-2454), an eryCVI sequence corresponding to ORF15 (SEQ ID NO: 6 nucleotides 2510-3220), ORF16 (nucleotides of SEQ ID NO: 6) EryBVI sequence corresponding to ORF17 (sequence of nucleotides 4837-6039 of SEQ ID NO: 6), ORF18 (SE
The eryCV sequence corresponding to QID NO: 6 nucleotides 6080-7546) or the eryBVII sequence corresponding to ORF19 (SEQ ID NO: 6 nucleotides 7578-8156) and hybridized and / or with this sequence An isolated DNA sequence selected from a sequence showing significant homology to this sequence or a fragment thereof (having the same function).
【００３０】 この発明の全く特別の主題は、ｅｒｙＢＶという図３に示したＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応し、ミカロシルトラ
ンスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列である。A completely specific subject of this invention is the isolated DNA corresponding to ORF14 shown in FIG. 3 (sequence from nucleotides 1210 to 2454 of SEQ ID NO: 6), encoding eryBV, and encoding mycarosyltransferase. Is an array.
【００３１】 ＯＲＦ１３に対応するｅｒｙＢＩＶ配列は、３２２アミノ酸を有するポリペプ
チド(SEQ ID NO:７)をコードし、ＲＦ１４に対応するｅｒｙＢＶ配列は、４１５
アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:８)をコードし、ＯＲＦ１５に対応す
るｅｒｙＣＶＩ配列は、２３７アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:９)を
コードし、ＯＲＦ１６に対応するｅｒｙＢＶＩ配列は、５１０アミノ酸を有する
ポリペプチド(SEQ ID NO:１０)をコードし、ＯＲＦ１７に対応するｅｒｙＣＩＶ
配列は、４０１アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１４)をコードし、Ｏ
ＲＦ１８に対応するｅｒｙＣＶ配列は、４８９アミノ酸を有するポリペプチド(S
EQ ID NO:１１)をコードし且つＯＲＦ１９に対応するｅｒｙＢＶＩＩ配列は、１
９３アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１２)をコードする。The eryBIV sequence corresponding to ORF13 encodes a polypeptide having 322 amino acids (SEQ ID NO: 7), and the eryBV sequence corresponding to RF14 is 415
The eryCVI sequence encoding a polypeptide having amino acids (SEQ ID NO: 8) and corresponding to ORF15 encodes a polypeptide having 237 amino acids (SEQ ID NO: 9) and the eryBVI sequence corresponding to ORF16 is 510 EryCIV encoding a polypeptide having amino acids (SEQ ID NO: 10) and corresponding to ORF17
The sequence encodes a polypeptide having 401 amino acids (SEQ ID NO: 14),
The eryCV sequence corresponding to RF18 has a polypeptide with 489 amino acids (S
The eryBVII sequence encoding EQ ID NO: 11) and corresponding to ORF19 contains 1
Encodes a polypeptide having 93 amino acids (SEQ ID NO: 12).
【００３２】 上に示したそれぞれの酵素活性は、以下に実験部で示すように、内部欠失の対
応遺伝子への導入により示されたものである。The respective enzyme activities shown above are shown by introducing an internal deletion into the corresponding gene, as shown in the experimental section below.
【００３３】 ハイブリダイズするＤＮＡ配列並びに有意の相同性を示し且つ同じ機能を有す
るＤＮＡ配列は、前に示したものと同じ意味を有する。DNA sequences which hybridize as well as DNA sequences which show significant homology and have the same function have the same meanings as indicated above.
【００３４】 この発明の主題は又、上記のＤＮＡ配列の１つによりコードされるポリペプチ
ドでもあり、特別の主題は、図３に示したＯＲＦ１３(SEQ ID NO:７の配列を有 する)、ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:８の配列を有する)、ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:９の
配列を有する)、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:１０の配列を有する)、ＯＲＦ１７(SEQ
ID NO:１４の配列を有する)、ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:１１の配列を有する)又は ＯＲＦ１９(SEQ ID NO:１２の配列を有する)及びこのペプチドのアナログから選
択するＯＲＦに対応するポリペプチドである。A subject of the invention is also a polypeptide encoded by one of the above DNA sequences, a particular subject being ORF13 (having the sequence of SEQ ID NO: 7) shown in FIG. ORF14 (having the sequence of SEQ ID NO: 8), ORF15 (having the sequence of SEQ ID NO: 9), ORF16 (having the sequence of SEQ ID NO: 10), ORF17 (having the sequence of SEQ ID NO: 10)
A polypeptide corresponding to an ORF selected from ORF18 (having the sequence of SEQ ID NO: 11) or ORF19 (having the sequence of SEQ ID NO: 12) or an analog of this peptide. is there.
【００３５】 ポリペプチドのアナログは、前に示したものと同じ意味を有する。[0035] Analogs of the polypeptide have the same meaning as set forth above.
【００３６】 この発明の一層特別の主題は、図３に示したＯＲＦ１４に対応し且つミカロシ
ルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO:８の配列を有する)
である(ＥｒｙＢＶと呼ばれる)。A more particular subject of this invention is a polypeptide corresponding to ORF14 shown in FIG. 3 and having mycarosyltransferase activity (having the sequence of SEQ ID NO: 8)
(Called EryBV).
【００３７】 上に示した及び図２又は３に示したこの発明の各ｅｒｙＢ又はｅｒｙＣＤＮＡ
配列の知識は、本発明を、例えば、化学合成の公知の方法により又は公知のハイ
ブリダイゼーション技術により若しくはＰＣＲ増幅によりオリゴヌクレオチド合
成プローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって再現
することを可能にする。Each eryB or eryC DNA of the invention shown above and shown in FIG. 2 or 3
Sequence knowledge allows the invention to be reproduced, for example, by screening genomic libraries using oligonucleotide synthesis probes by known methods of chemical synthesis or by known hybridization techniques or by PCR amplification. I do.
【００３８】 この発明のポリペプチドは、公知の方法により、例えば、化学合成により又は
組換えＤＮＡ法により原核若しくは真核宿主細胞内での発現により得ることがで
きる。The polypeptides of the invention can be obtained by known methods, for example by chemical synthesis or by recombinant DNA methods, by expression in prokaryotic or eukaryotic host cells.
【００３９】 この発明の他の主題は、図２に示した配列ｅｒｙＢＩＩ(SEQ ID NO:１のヌク レオチド４８〜１０４６の相補性配列)、ｅｒｙＣＩＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレ
オチド１０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌク
レオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌ
クレオチド１２１０〜２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオ
チド２５１０〜３２２０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３
３０８〜４８３７の配列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７
〜６０３９の配列)、ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４
６の配列)又はｅｒｙＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６
の配列)から選択するＤＮＡ配列の少なくとも１つの、Sac. erythraeaにおける ハイブリッド二次代謝産物を合成するための利用に関係する。Another subject of the invention is the sequence eryBII (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1), eryCIII (complement of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1) shown in FIG. EryBIV (sequence of nucleotides 242 to 1207 of SEQ ID NO: 6), eryBIV (sequence complementary to nucleotides 232 to 3404 of SEQ ID NO: 1) or eryBV (SEQ ID NO: 6). EryCVI (sequence of nucleotides 2510-3220 of SEQ ID NO: 6), eryBVI (nucleotide 3 of SEQ ID NO: 6)
308-4837), eryCIV (nucleotide 4837 of SEQ ID NO: 6)
-6039), eryCV (nucleotides 6080-754 of SEQ ID NO: 6).
6) or eryBVII (nucleotides 7578-8156 of SEQ ID NO: 6).
Erythraea for the synthesis of a hybrid secondary metabolite of at least one of the DNA sequences selected from Sac. Erythraea.
【００４０】 ハイブリッド二次代謝産物は、エリスロマイシンのアナログ即ち糖部分に影響
を与える少なくとも一つの改変をを有し且つ抗生物質活性を有するエリスロマイ
シン誘導体又は ６−デオキシエリスロノリドＢ若しくは改変された若しくはさ
れてない少なくとも一つの糖残基が付加された抗生物質活性を有しないエリスロ
ノリドＢ等のエリスロマイシン前駆体の何れかを意味すると理解される。The hybrid secondary metabolite may be an erythromycin derivative or 6-deoxyerythronolide B or modified or modified with at least one modification affecting the erythromycin analog or sugar moiety and having antibiotic activity. It is understood to mean any erythromycin precursor such as erythronolide B, which does not have antibiotic activity with at least one additional sugar residue added.
【００４１】 この発明のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣＤＮＡ合成の利用によるSac. erythraeaにお
けるハイブリッド二次代謝産物の合成は、例えば、上記のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣ
遺伝子の少なくとも一つの不活性化及び少なくとも一つの外因性遺伝子又は例え
ば突然変異導入により得られるそれらの誘導体(他のマクロライド系抗生物質例 えばタイロジン、ピクロマイシン又はメチマイシンを生成する株において同じ機
能を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を有する)の導入により行うこと ができる。特に、外因性遺伝子の導入は、「ＤＮＡシャッフリング」法(Stemmer
、1994)により又は例えば糖残基の移送に介入するこの発明のｅｒｙＢ若しくは ｅｒｙＣ配列例えばｅｒｙＣＩＩＩ若しくはｅｒｙＢＶ配列に由来するキメラＤ
ＮＡ配列の構築により得られるＤＮＡ配列の、及びマクロライド系抗生物質を産
生する株例えばStreptomyces fradiae、Streptomyces olivaceus、Streptomyces venezuelae若しくはStreptomyces antibioticusから単離された相同遺伝子のイ
ンテグレーションにより行うことができる。The synthesis of hybrid secondary metabolites in Sac. Erythraea by utilizing the eryB or eryC DNA synthesis of the present invention is described, for example, in eryB or eryC described above.
At least one inactivation of the gene and at least one exogenous gene or a derivative thereof obtained, for example, by mutagenesis (having the same function in strains producing other macrolide antibiotics, e.g., tyrosin, picromycin or methimicin) (Having a nucleotide sequence encoding an enzyme). In particular, the introduction of an exogenous gene is performed by the “DNA shuffling” method (Stemmer).
Or an chimeric D derived from an eryB or eryC sequence of the invention, eg, an eryCIII or eryBV sequence, which intervenes in the transfer of sugar residues, for example.
The DNA sequence obtained by constructing the NA sequence can be integrated with a homologous gene isolated from a macrolide antibiotic-producing strain such as Streptomyces fradiae, Streptomyces olivaceus, Streptomyces venezuelae or Streptomyces antibioticus.
【００４２】 この発明は又、図２に示した配列ｅｒｙＢＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチド ４８〜１０４６の相補性配列)、ｅｒｙＣＩＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１
０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオチド
２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:６の
２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜
２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２
０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配
列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列)、 ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)又はｅｒｙ
ＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)から選択する
ＤＮＡ配列又はこの配列の断片の少なくとも１つのハイブリダイゼーションプロ
ーブとしての利用に関係する。The present invention also relates to the sequence eryBII (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1), eryCIII (nucleotide 1 of SEQ ID NO: 1) shown in FIG.
046-2308) or eryCII (complementary sequence of nucleotides 2322 to 3404 of SEQ ID NO: 1), eryBIV shown in FIG. 3 (sequence of 242 to 1207 of SEQ ID NO: 6), eryBV (SEQ Nucleotides 1210 of ID NO: 6
2454), eryCVI (nucleotides 2510-322 of SEQ ID NO: 6).
0), eryBVI (sequence of nucleotides 3308-4837 of SEQ ID NO: 6), eryCIV (sequence of nucleotides 4837-6039 of SEQ ID NO: 6), eryCV (sequence of nucleotides 6080-7546 of SEQ ID NO: 6) Array) or ery
BVII (sequences of nucleotides 7578 to 8156 of SEQ ID NO: 6) or a fragment of this sequence as a probe for use as at least one hybridization probe.
【００４３】 この発明のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣＤＮＡ配列を用いて、少なくとも１９ヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションプローブを構成することができ、これは、フィ
ルター上に固定化した核酸の標準的ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲ増幅を
用いることにより、Sambrook等(1989)により記載された条件に従って、マクロラ
イド系抗生物質を産生する株において相同な遺伝子を単離することを可能にする
。The eryB or eryC DNA sequence of the invention can be used to construct a hybridization probe of at least 19 nucleotides, using standard hybridization techniques or PCR amplification of nucleic acids immobilized on filters. Makes it possible to isolate homologous genes in strains producing macrolide antibiotics according to the conditions described by Sambrook et al. (1989).
【００４４】 この発明は、特に、図２に示したｅｒｙＣＩＩＩＤＮＡ(SEQ ID NO:１のヌク レオチド１０４６〜２３０８の相補性配列＝SEQ ID NO:４の相補性配列)の、マ クロライド系抗生物質の産生株におけるマクロラクトンのグリコシル化の原因の
相同遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしての利用に関
係する。The present invention particularly relates to a macrolide antibiotic of the eryCIII DNA shown in FIG. 2 (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1 = complementary sequence of SEQ ID NO: 4). It relates to its use as a hybridization probe to isolate homologous genes responsible for macrolactone glycosylation in producer strains.
【００４５】 この発明は、一層特に、相同遺伝子が、S. antibioticusにおけるオレアンド マイシン生合成遺伝子である上記の利用に関係する。The invention more particularly relates to the above uses, wherein the homologous gene is the oleandycin biosynthesis gene in S. antibioticus.
【００４６】 この発明は、例として、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の配列の、オレアンドマイシン
産生株において相同遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブと
しての利用を記載する。用いたｅｒｙＣＩＩＩプローブは、デソサミン及びオレ
アンドロースのラクトン核への移送に関与するS. antibioticusにおけるグリコ シルトランスフェラーゼをコードするｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子の単離を
与えた。The present invention describes, by way of example, the use of the sequence of the eryCIII gene as a hybridization probe for isolating homologous genes in an oleandmycin producing strain. The eryCIII probe used provided isolation of the oleG1 and oleG2 genes encoding glycosyltransferases in S. antibioticus involved in the transfer of desosamine and oleandrose to the lactone nucleus.
【００４７】 ｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子の機能的特性決定は、S. antibioticusにお けるオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスターの右部分の構成を規定するこ
とを可能にした。Functional characterization of the oleG1 and oleG2 genes has made it possible to define the organization of the right part of the cluster of oleandmycin biosynthesis genes in S. antibioticus.
【００４８】 それ故、この発明の主題は、図２２に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO
:１５の配列)であり、それは、下記を含むオレアンドマイシン生合成遺伝子のク
ラスターの領域に対応する： − ＯＲＦｏｌｅＰ１のヌクレオチド１８４〜１３８６に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ１のヌクレ
オチド１４３７〜２７１４に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ２のヌクレ
オチド２７２２〜３９９９に対応する配列、 − ＯＲＦｏｌｅＭのヌクレオチド３９９２〜４７２０に対応する配列(＝SEQ I
D NO:２０の配列)及び − ＯＲＦｏｌｅＹのヌクレオチド４８１０〜５９６７に対応する配列。Thus, the subject of the present invention is the isolated DNA sequence shown in FIG.
: 15 sequence), which corresponds to the region of the cluster of oleandmycin biosynthesis genes, including:-a sequence corresponding to nucleotides 184-1386 of ORFolePl-nucleotide 1437 of ORFoleGl encoding glycosyltransferase activity A sequence corresponding to nucleotides 2722 to 3999 of ORFoleG2 encoding glycosyltransferase activity; a sequence corresponding to nucleotides 3992 to 4720 of ORFoleM (= SEQ I
D NO: 20) and-a sequence corresponding to nucleotides 4810-5967 of ORFoleY.
【００４９】 図２２に示した上記のＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５の配列)は、例えば、オレア
ンドマイシン生合成遺伝子のクラスターの右部分をカバーするコスミドから以下
に詳述する操作条件に従ってｅｒｙＣＩＩＩプローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより得ることのできるゲノムＤＮＡ配列である。The above DNA sequence (sequence of SEQ ID NO: 15) shown in FIG. 22 can be obtained, for example, from a cosmid covering the right part of the cluster of oleandmycin biosynthesis genes according to the operating conditions described in detail below. Genomic DNA sequence that can be obtained by hybridization with a probe.
【００５０】 この発明の一層特別の主題は、図２２に示したＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO: １５のヌクレオチド１４３７〜２７１４の配列)に対応しグリコシルトランスフ ェラーゼ活性をコードする配列及びＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:１５のヌクレ オチド２７２２〜３９９９の配列)に対応しグリコシルトランスフェラーゼ活性 をコードする配列より選択する単離されたＤＮＡ配列である。A more particular subject of this invention is a sequence corresponding to ORFoleG1 shown in FIG. 22 (sequence of nucleotides 1437 to 2714 of SEQ ID NO: 15) and encoding glycosyltransferase activity and ORFoleG2 (SEQ ID NO: 15 nucleotide sequences 2722-3999) and are selected from sequences encoding glycosyltransferase activity.
【００５１】 この発明の全く特別の主題は、ＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオ チド１４３７〜２７１４の配列)に対応し、デソサミニルトランスフェラーゼ活 性をコードする上記の単離されたＤＮＡ配列、並びにＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID
NO:１５のヌクレオチド２７２２〜３９９９の配列)に対応し、オレアンドロシル
トランスフェラーゼ活性をコードする上記の単離されたＤＮＡ配列である。A very particular subject of this invention is the isolated DNA sequence described above, which corresponds to ORFoleG1 (sequence of nucleotides 1437-2714 of SEQ ID NO: 15) and encodes desosaminyltransferase activity; And ORFoleG2 (SEQ ID
NO: 15 (nucleotide 2722-3999 sequence) and is the above isolated DNA sequence encoding oleandrosyltransferase activity.
【００５２】 ＯＲＦｏｌｅＧ１に対応する配列は、４２６アミノ酸を有するポリペプチド(S
EQ ID NO:１７の配列)をコードし且つＯＲＦｏｌｅＧ２に対応する配列は、４２
６アミノ酸を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１８の配列)をコードする。The sequence corresponding to ORFoleG1 has a polypeptide with 426 amino acids (S
SEQ ID NO: 17) and the sequence corresponding to ORFoleG2 is 42
Encodes a polypeptide having 6 amino acids (SEQ ID NO: 18).
【００５３】 上に示したそれぞれの酵素活性は、以下に実験部で示すように、対応遺伝子の
変化により示されたものである。Each of the above enzyme activities is indicated by a change in the corresponding gene, as shown in the experimental section below.
【００５４】 この発明の主題は又、ＯＲＦｏｌｅＧ１に対応するＤＮＡ配列によりコードさ
れ且つデソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO: １７の配列)及びＯＲＦｏｌｅＧ２に対応するＤＮＡ配列によりコードされ且つ オレアンドロシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１ ８)でもある。The subject of the present invention is also a polypeptide encoded by a DNA sequence corresponding to ORFoleG1 and having desosaminyltransferase activity (sequence of SEQ ID NO: 17) and a DNA sequence corresponding to ORFoleG2 and It is also a polypeptide having androsyl transferase activity (SEQ ID NO: 18).
【００５５】 それぞれＯｌｅＧ１及びＯｌｅＧ２と呼ばれる上記のポリペプチドは、上に示
した公知の方法により得ることができる。The above-mentioned polypeptides called OleG1 and OleG2, respectively, can be obtained by the above-mentioned known methods.
【００５６】 この発明の主題は又、Sac. erythraeaにおけるハイブリッド二次代謝産物の製
造方法でもあり、該方法においては： − 図２(SEQ ID NO:１の相補性配列)又は図３(SEQ ID NO:６の配列)に示したエ
リスロマイシンの生合成遺伝子のクラスターの少なくとも一のｅｒｙＢ配列又は
ｅｒｙＣ配列を含むＤＮＡ配列を単離し、 − 該配列中に改変を造って、変化した配列を得、 − この変化した配列を宿主株の染色体中にインテグレートして、改変された株
を得、 − この改変された株を、ハイブリッド二次代謝産物の形成を与える条件下で培
養し、そして − このハイブリッド二次代謝産物を単離する。The subject of the present invention is also a process for the preparation of hybrid secondary metabolites in Sac. Erythraea, in which: FIG. 2 (complementary sequence of SEQ ID NO: 1) or FIG. Isolating a DNA sequence comprising at least one eryB or eryC sequence of the cluster of erythromycin biosynthetic genes shown in SEQ ID NO: 6),-making a modification in said sequence to obtain an altered sequence; Integrating the altered sequence into the chromosome of the host strain to obtain a modified strain; culturing the modified strain under conditions that provide for the formation of a hybrid secondary metabolite; and The next metabolite is isolated.
【００５７】 このＤＮＡ配列の改変は、例えば、上記の対応する酵素の１つをコードするこ
の発明のｅｒｙＢ又はｅｒｙＣ配列における少なくとも１ヌクレオチドのＤＮＡ
配列の付加及び／又は欠失により行うことができる。The modification of the DNA sequence may be, for example, a DNA of at least one nucleotide in the eryB or eryC sequence of the invention encoding one of the corresponding enzymes described above.
This can be done by adding and / or deleting sequences.
【００５８】 変化した配列の宿主株へのインテグレーションは、例えば、図４に示した図式
に従って行うことのできる相同組換え法により行うことができ、該方法は、Sac. erythraea株の染色体変異体の生成へと導くが、次いで、該変異体を細胞培養の
公知の一般的方法に従って培養する。The integration of the altered sequence into the host strain can be carried out, for example, by a homologous recombination method which can be carried out according to the scheme shown in FIG. 4, wherein the method is based on the chromosomal variant of the Sac. Erythraea strain. The variants are then cultured according to known general methods of cell culture.
【００５９】 この発明の特別の主題は、上記の方法であり、該方法においては、ＤＮＡ配列
は、下記より選択する酵素の１つをコードする − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。A particular subject of the invention is the above method, wherein the DNA sequence encodes one of the enzymes selected from: dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 2,3-reductase, -desosaminyltransferase, -dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase, -mica Rosyltransferase, -dTDP-D-6-deoxyhexose 3-N-methyltransferase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-dehydratase, -dTDP-D-6-deoxyhexose 3, 4-dehydratase, dTDP-D-4,6-dideoxyhexose 3,4- Reductase or -dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,5-epimerase.
【００６０】 この発明の一層特別の主題は、配列の変化が少なくとも一の上記の酵素の不活
性化を生じる上記の方法である。A more particular subject of the invention is a method as described above, wherein a sequence change results in the inactivation of at least one of the abovementioned enzymes.
【００６１】 少なくとも一の酵素の不活性化は、一方では、エリスロマイシンの産生のない
ことにより示され、他方では、エリスロマイシンの前駆体例えば６−デオキシエ
リスロノリドＢ、エリスロノリドＢ又は３−α−ミカロシルエリスロノリドＢの
蓄積及び／又は前に規定したハイブリッド二次代謝産物の対応改変株の培養上清
中への蓄積により示される。Inactivation of at least one enzyme is indicated on the one hand by the absence of the production of erythromycin, on the other hand a precursor of erythromycin such as 6-deoxyerythronolide B, erythronolide B or 3-α-mica It is indicated by the accumulation of Rosylerythronolide B and / or the accumulation of the previously defined hybrid secondary metabolite in the culture supernatant of the corresponding modified strain.
【００６２】 この発明は、全く特に、不活性化された酵素がｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−
デオキシヘキソース４−レダクターゼであるか又は不活性化された酵素がｄＴＤ
Ｐ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼであるか又は酵素がミ
カロシルトランスフェラーゼであるか又は不活性化された酵素がｄＴＤＰ−４−
ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼである上記の方法に関
係するものである。[0062] This invention is very particularly directed to the case where the inactivated enzyme is dTDP-4-keto-L-6-
The enzyme deoxyhexose 4-reductase or inactivated is dTD
Either PD-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase, or the enzyme is mycarosyltransferase, or the inactivated enzyme is dTDP-4-
It is related to the above method, which is keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase.
【００６３】 この発明は又、単離されたハイブリッド二次代謝産物が４”−ケト−エリスロ
マイシン、４’−ヒドロキシ−エリスロマイシン又は３”−Ｃデスメチル−２”
，３”−エン−エリスロマイシンから選択するエリスロマイシンアナログである
か又は単離されたハイブリッド二次代謝産物がデソサミニルエリスロノリドＢで
ある上記の方法にも関係する。The invention also provides that the isolated hybrid secondary metabolite is 4 "-keto-erythromycin, 4'-hydroxy-erythromycin or 3" -C desmethyl-2 "
, 3 "-en-erythromycin, or an isolated hybrid secondary metabolite is desosaminylerythronolide B.
【００６４】 この発明によるプロセスの手段の例を、実験部に与える。Sac. erythraeaの改
変株におけるハイブリッド二次代謝産物の蓄積も又、以下に記載する。An example of the means of the process according to the invention is given to the laboratory. The accumulation of hybrid secondary metabolites in the modified strain of Sac. Erythraea is also described below.
【００６５】 この発明は又、下記より選択する酵素の少なくとも１つが不活性化され且つ少
なくとも一のハイブリッド二次代謝産物を生成しているSac. erythraeaの改変株
にも関係する − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。The present invention also relates to a modified strain of Sac. Erythraea wherein at least one of the enzymes selected from the following is inactivated and produces at least one hybrid secondary metabolite-dTDP-4- Keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase, desosaminyltransferase, dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase, dTDP-4-keto-L-6 Deoxyhexose 4-reductase, -micarosyltransferase, -dTDP-D-6-deoxyhexose3-N-methyltransferase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose2,3-dehydratase, -dTDP- D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase, dTDP-D 4,6-di-deoxy hexose 3,4 reductase or - dTDP-4-keto--D-6- deoxyhexose 3,5-epimerase.
【００６６】 この発明は、特に、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３
−レダクターゼが不活性化されていて３”−Ｃデスメチル−２”、３”−エン−
エリスロマイシンＣを産生するSac. erythraeaの改変株ＢＩＩ９２、ｄＴＤＰ−
４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼが不活性化されていて
４”−ケト−エリスロマイシンを産生するSac. erythraeaの改変株ＢＩＶ８７、
ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼが不活性化され
ていて４’−ヒドロキシエリスロマイシンＤを産生するSac. erythraeaの改変株
ＣＩＶ８９並びにミカロシルトランスフェラーゼが不活性化されていてデソアミ
ニルエリスロマイシンＢを産生するSac. erythraeaの改変株ＢＶ８８に関係する
。上記の株の詳細な構築は、以下に、実験部で与える。The invention is particularly directed to dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3
-Reductase is inactivated and 3 "-C desmethyl-2", 3 "-ene-
Erythraea modified strain BII92 producing erythromycin C, dTDP-
A modified Sac. Erythraea strain BIV87 in which 4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase is inactivated to produce 4 "-keto-erythromycin;
erythraea modified strain CIV89, which produces 4'-hydroxyerythromycin D, in which dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase is inactivated, and in which micarosyltransferase is inactivated, Erythraea, which produces Minylerythromycin B. Detailed construction of the above strains is provided below in the experimental section.
【００６７】 この発明は又、S. antibioticusにおけるオレアンドマイシンの前駆体の製造 方法にも関係し、該方法においては、 − 宿主株の染色体中のＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド１４ ３７〜２７１４の配列)に対応するＤＮＡ配列及びＯＲＦｏｌｅＧ２(SEQ ID NO:
１５のヌクレオチド２７２２〜３９９９の配列)に対応するＤＮＡ配列から選択 した遺伝子の配列中に変化を造って、改変株を得、 − この改変株を、オレアンドマイシンの前駆体の蓄積を与える条件下で培養し
、そして − これらの前駆体を単離する。The present invention also relates to a method for producing a precursor of oleandmycin in S. antibioticus, which comprises:-ORFoleG1 (nucleotide 1437 to SEQ ID NO: 15) in the chromosome of the host strain. DNA sequence corresponding to ORFoleG2 (SEQ ID NO: 2714).
(A sequence of 15 nucleotides 2722-3999) to produce a modified strain in the sequence of the gene selected from the DNA sequence corresponding to the modified strain under conditions that provide for the accumulation of oleandmycin precursors. And-isolating these precursors.
【００６８】 このＤＮＡ配列の変化は、例えば、相同組換え法によるプラスミドのインテグ
レーションによる例えばS. antibioticus株の標的遺伝子の中断によって行うこ とができ、野生型株の染色体変異体の生成を生じる。This change in DNA sequence can be effected, for example, by interruption of the target gene of, for example, an S. antibioticus strain by integration of the plasmid by homologous recombination, resulting in the generation of a chromosomal mutant of the wild-type strain.
【００６９】 この発明は、特に、変化をＯＲＦｏｌｅＧ１(SEQ ID NO:１５のヌクレオチド １４３７〜２７１４の配列)に対応するＤＮＡ配列中に造る上記のプロセスに関 係し、その結果は、少なくともデソアミニルトランスフェラーゼ活性の排除とオ
レアンドマイシン前駆体８，８ａ−デオキシオレアンドリドの蓄積である。The invention particularly relates to the above-described process of making changes in the DNA sequence corresponding to ORFoleG1 (sequence of nucleotides 1437 to 2714 of SEQ ID NO: 15), the result being that at least desoaminil Elimination of transferase activity and accumulation of the oleandmycin precursor 8,8a-deoxyoleandlide.
【００７０】 ｏｌｅＧ１遺伝子の中断により認められるオレアンドマイシンの非グリコシル
化前駆体８，８ａ−デオキシオレアンドリドの蓄積は、ｏｌｅＧ２遺伝子を不活
性化する転写極性効果のためである。The accumulation of the non-glycosylated precursor of oleandmycin 8,8a-deoxyoleandlide, which is observed by interruption of the oleG1 gene, is due to a transcriptional polarity effect that inactivates the oleG2 gene.
【００７１】 上記のプロセスの手段の例は、以下に、実験部で与える。Examples of means of the above process are given below in the experimental part.
【００７２】 材料及び一般的方法 １．細菌株、プラスミド及び成長条件 この発明の実現のために用いたSac. erythraea株は、Sac. erythraea野生型株
ＮＲＲＬ２３３８の「レッドバリアント」と呼ばれる天然の表現型変異体(Hessl
er等、1997)であり、その成長は、固体培地Ｒ２Ｔ２(Weber等、1985により記載 されたペプトンを含まない培地Ｒ２Ｔ)、Ｒ２Ｔ２０(Yamamoto等、1986)上で又 は寒天上Ｍ１−１０２(Kaneda等、1962)にて、又は液体培地ＴＳＢ()にて３０℃
で日常的方法にて行われる。Materials and General Methods Bacterial Strains, Plasmids and Growth Conditions The Sac. Erythraea strain used for the realization of the present invention is a naturally occurring phenotypic variant called the “red variant” of Sac. Erythraea wild type strain NRRL2338 (Hessl
er et al., 1997) and its growth was on solid medium R2T2 (peptone-free medium R2T described by Weber et al., 1985), R2T20 (Yamamoto et al., 1986) or M1-102 (Kaneda) on agar. Etc., 1962) or in liquid medium TSB () at 30 ° C
In a routine manner.
【００７３】 Hopwood等(1983)により記載されたStreptomyces lividans株１３２６(John In
nes Culture Collection)(大腸菌の複製起点のないプラスミド例えばｐＩＪ７０
２及びｐＩＪ４８６の調製に使用)を、固体培地Ｒ２ＹＥ(Ｒ５)(Hopwood等、198
5)上に維持した。The Streptomyces lividans strain 1326 described by Hopwood et al. (1983) (John In
nes Culture Collection) (a plasmid without an E. coli origin of replication, such as pIJ70)
2 and pIJ486) were used in solid medium R2YE (R5) (Hopwood et al., 198).
5) Maintained above.
【００７４】 大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ(Stratagene)、ＪＭ１１０(Stratagene)及びＤＨ５α
．ＭＣＲ(GibcoBRL)株の成長を、日常的方法で、液体培地２×ＹＴ若しくはＬＢ
中で又は寒天上の固体培地ＬＢにて、Sambrook等(1989)により記載されたように
行った。大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を日常的クローニングに用いる。ＪＭ１１０
株を、制限部位例えばＢｃｌＩを用いるクローニングに用いる。ＤＨ５α．ＭＣ
Ｒ株は、最適トランスフォーメーションのためにSac. erythraea中に導入するこ
とを意図したプラスミドの調製のために用いる。E. coli XL1-blue (Stratagene), JM110 (Stratagene) and DH5α
. The growth of the MCR (GibcoBRL) strain was determined in a routine manner using liquid medium 2 × YT or LB.
In solid media LB in or on agar as described by Sambrook et al. (1989). The E. coli XL1-blue strain is used for routine cloning. JM110
The strain is used for cloning using restriction sites such as BclI. DH5α. MC
The R strain is used for the preparation of a plasmid intended to be introduced into Sac. Erythraea for optimal transformation.
【００７５】 大腸菌におけるプラスミドの選択を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン(Sigma
)にて行った。The selection of plasmids in E. coli was carried out using 100 μg / ml ampicillin (Sigma
).
【００７６】 Bacillus subtilisＡＴＣＣ６６３３又はBacillus pumilusＡＴＣＣ１４８８ ４株を指標株として用いて、エリスロマイシンの産生を、抗生物質に対する細菌
の感受性の記録を用いる生物学的試験において評価した。Using Bacillus subtilis ATCC 6633 or Bacillus pumilus ATCC 14884 strain as an indicator strain, erythromycin production was assessed in a biological test using a record of bacterial susceptibility to antibiotics.
【００７７】 Ｌｉｔｍｕｓ２８、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９プラスミド(New England Biola
bs)を、日常的方法においてサブクローン化のために用いた。ｐＩＪ７０２ベク ター(Katz等、1983)を、John Innes Instituteから得た。ｐＩＪ４８６ベクター
(Ward等、1986)を、C.J.Thompson(Basle大学、スイス国)から得た。ファージミ ドｐＴＺ１８ＲをPharmacia Biotech.から得た。Sac. erythraea中への染色体イ
ンテグレーションに用いられたシャトルベクターcoli-streptomycesｐＵＷＬ２ １８(Wehmeier、1995)を、W.Piepersberg(Wuppertal大学、ドイツ国)から得た。The Litmus28, pUC18 and pUC19 plasmids (New England Biola
bs) was used for subcloning in a routine manner. pIJ702 vector (Katz et al., 1983) was obtained from the John Innes Institute. pIJ486 vector
(Ward et al., 1986) was obtained from CJ Thompson (Basle University, Switzerland). Phagemid pTZ18R was obtained from Pharmacia Biotech. The shuttle vector coli-streptomyces pUWL218 (Wehmeier, 1995) used for chromosome integration into Sac. Erythraea was obtained from W. Piepersberg (University of Wuppertal, Germany).
【００７８】 ２．ＤＮＡ操作及び配列決定 用いた分子生物学の一般的方法は、Sambrook等、1989に記載されている。2. DNA Manipulation and Sequencing General methods of molecular biology used have been described in Sambrook et al., 1989.
【００７９】 制限酵素(New England Biolabs及びBoehringer Mannheim)、ＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片(Boehringer Mannheim)を含む商業的起源の試薬を用いた。 「ＤＮＡライゲーションシステム」キット(Amersham)を用いて連結を行い、プラ
スミドＭｉｄｉキット(Quiagen)又はＲＰＭキット(Bio101 Inc.)をプラスミドＤ
ＮＡの精製に用いた。Reagents of commercial origin including restriction enzymes (New England Biolabs and Boehringer Mannheim), Klenow fragment of DNA polymerase I (Boehringer Mannheim) were used. Ligation was performed using the "DNA ligation system" kit (Amersham), and plasmid Midi kit (Quiagen) or RPM kit (Bio101 Inc.)
Used for NA purification.
【００８０】 λバクテリオファージのＤＮＡの調製を、Ausubel等(1995)に従って行い、Sac
. erythraeaの染色体ＤＮＡの単離をHopwood等(1985)に従って行った。Preparation of λ bacteriophage DNA was performed according to Ausubel et al.
erythraea chromosomal DNA was isolated according to Hopwood et al. (1985).
【００８１】 S. lividansのトランスフォーメーション及びプラスミドの単離をHopwood等(1
985)に従って行った。Transformation of S. lividans and isolation of plasmids were performed as described by Hopwood et al.
985).
【００８２】 ３．エリスロノリドＢ及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢの調製 エリスロノリドＢ及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢを、変異体ｅｒｙ
ＣＩ(Dhillon等、1989により記載されたクローンＷＨＢ２２２１)の培養抽出物 からアミノプロピルゲル上のクロマトグラフィー(LichroprepNH2 25-40μ、Merc
k)により、連続的ブチルクロリド／メチレンクロリド混合物(１００：０、８０ ：２０、５０：５０及び２０：８０)による溶出勾配とその後のブチルクロリド ／メタノール混合物(９９：１〜９０：１０まで変化する)による直線的溶出勾配
を用いて精製した。期待される生成物を含む画分を真空下で乾燥させ、次いで、
薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)により分析する。次いで、エリスロノリドＢを
酢酸エチル／ヘキサン混合物から結晶化し、次いで、エタノールから再結晶させ
る。３−α−ミカロシルエリスロノリドＢを酢酸エチル／ヘキサン混合物から２
回結晶化させる。[0082] 3. Preparation of erythronolide B and 3-α-mycarosyl erythronolide B Erythronolide B and 3-α-mycarosyl erythronolide B were converted to mutant ery
Chromatography on aminopropyl gel (Lichroprep NH2 25-40μ, Merc) from a culture extract of CI (clone WHB2221 described by Dhillon et al., 1989)
k), an elution gradient with a continuous butyl chloride / methylene chloride mixture (100: 0, 80:20, 50:50 and 20:80) followed by a butyl chloride / methanol mixture (changed from 99: 1 to 90:10) Purification using a linear elution gradient according to The fractions containing the expected product are dried under vacuum and then
Analyze by thin layer chromatography (TLC). Erythronolide B is then crystallized from an ethyl acetate / hexane mixture and then recrystallized from ethanol. 3-α-Micarosyl erythronolide B was converted from an ethyl acetate / hexane mixture to 2
Crystallize once.
【００８３】 挙げられる培地 １．Ｒ２Ｔ２： １リットルの水溶液の調製に要するもの：ショ糖１０３ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ
；イーストエキストラクト６．５ｇ；トリプトン５．０ｇ；バクトアガー２２．
０ｇ；蒸留水ｓｑｆ８６０ｍｌ。この溶液を３０分間１２０℃でオートクレーブ
にかけることにより滅菌する。使用時に、下記の無菌溶液を加える：２０ｍｌの
５０％グルコース；２５ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)；５ｍｌの０．
５％ＫＨ2ＰＯ4；２．５ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨ；５０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ2； ５０ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ2・Ｈ2Ｏ及び２ｍｌの「痕跡的元素」の溶液(Hopwood
等、1985)。Media to be mentioned R2T2: required for preparing 1 liter aqueous solution: sucrose 103 g; K 2 SO 4 0.25 g
6.5 g of yeast extract; 5.0 g of tryptone;
0 g; 860 ml of distilled water sqf. The solution is sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 30 minutes. At the time of use, add the following sterile solution: 20 ml of 50% glucose; 25 ml of 1 M Tris-HCl (pH 7.0);
5% KH 2 PO 4 ; 2.5 ml of 1N NaOH; 50 ml of 1 M CaCl 2 ; 50 ml of 1 M MgCl 2 .H 2 O and 2 ml of a “trace element” solution (Hopwood
Et al., 1985).
【００８４】 ２．Ｒ２Ｔ２０： １リットルの水溶液の調製に要するもの：２０６ｇのショ糖を含むＲ２Ｔ２培地
。2. R2T20: Preparation of 1 liter of aqueous solution: R2T2 medium containing 206 g of sucrose.
【００８５】 ３．Ｍ１−１０２(Kaneda等、1962)： １リットルの水溶液の調製に要するもの：グルコース５ｇ；市販の赤砂糖１０ｇ
；トリプトン５ｇ；イーストエキストラクト２．５ｇ；ベルセン３６ｍｇ；水道
水１０００ｍｌ；最終ｐＨをＫＯＨで７．０〜７．２に調節する。この溶液を１
２０℃で３０分間オートクレーブにかけて滅菌する。[0085] 3. M1-102 (Kaneda et al., 1962): Preparation of a 1 liter aqueous solution: glucose 5 g; commercial brown sugar 10 g
5 g tryptone; 2.5 g yeast extract; 36 mg versene; 1000 ml tap water; adjust the final pH to 7.0-7.2 with KOH. This solution is
Sterilize by autoclaving at 20 ° C. for 30 minutes.
【００８６】 ４．Ｒ２ＹＥ(Ｒ５)(Hopwood等、1985) １リットルの水溶液の調製に要するもの：ショ糖１０３ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ
；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １０．１２ｇ；カザミノ酸０．１ｇ；「痕跡的元素」の
溶液２ｍｌ；イーストエキストラクト５ｇ；ＴＥＳ５．７２ｇ；バクトアガー１
５ｇ；蒸留水ｓｑｆ９４０ｍｌ。この溶液を１２０℃で３０分間オートクレーブ
にかけて滅菌する。使用時に、次の無菌溶液を加える：１０ｍｌの０．５％ＫＨ 2 ＰＯ4；２０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ2；１５ｍｌの２０％Ｌ−プロリン；２０ｍ ｌの５０％グルコース及び１ｍｌの１０ｍＭＣｕＣｌ2。[0086] 4. R2YE (R5) (Hopwood et al., 1985) Preparation of 1 L aqueous solution: 103 g sucrose; KTwoSOFour0.25g
; MgClTwo・ 6HTwoO. 10.12 g; casamino acid 0.1 g; of "trace elements"
2 ml of solution; 5 g of yeast extract; 5.72 g of TES;
5 g; 940 ml of distilled water sqf. Autoclave this solution at 120 ° C for 30 minutes
And sterilize. At the time of use, add the following sterile solution: 10 ml of 0.5% KH Two POFour20 ml of 1 M CaClTwo15 ml of 20% L-proline; 20 ml of 50% glucose and 1 ml of 10 mM CuClTwo.
【００８７】 ５．２×ＴＹ： １リットルの水溶液を調製するのに要するもの：トリプトン１０ｇ；イーストエ
キストラクト１０ｇ；ＮａＣｌ５ｇ。5.2 × TY: What is required to prepare a 1 liter aqueous solution: 10 g of tryptone; 10 g of yeast extract; 5 g of NaCl.
【００８８】 ６．ＰＴ緩衝液： １リットルの水溶液を調製するのに要するもの：ショ糖１００ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．
２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ５．１ｇ；「痕跡的元素」の溶液２ｍｌ；蒸留水
ｓｑｆ８７５ｍｌ。この溶液を１２０℃で３０分間オートクレーブにかけて滅菌
する。使用時に、次の無菌溶液を加える：５ｍｌのＣａＣｌ2及び２０ｍｌの５ ．３％ＴＥＳ。6. PT buffer: required to prepare 1 liter aqueous solution: 100 g sucrose; K 2 SO 4 0.
5.1 g of MgCl 2 .6H 2 O; 2 ml of “trace element” solution; 875 ml of distilled water sqf. The solution is autoclaved at 120 ° C. for 30 minutes and sterilized. At the time of use, add the following sterile solution: 5 ml CaCl 2 and 20 ml 5. 3% TES.
【００８９】 ７．ショ糖−スクシネート(Caffrey等、1992) １リットルの水溶液を調製するのに要するもの：ショ糖０．２Ｍ；コハク酸２０
ｍＭ；リン酸カリウム２０ｍＭ(ｐＨ６．６)；硫酸マグネシウム５ｍＭ；硝酸カ
リウム１００ｍＭ；「痕跡的元素」の溶液２ｍｌ。この溶液を１２０℃で３０分
間オートクレーブにかけて滅菌する。7. Sucrose-succinate (Caffrey et al., 1992) What is needed to prepare a 1 liter aqueous solution: sucrose 0.2M; succinic acid 20
mM; potassium phosphate 20 mM (pH 6.6); magnesium sulfate 5 mM; potassium nitrate 100 mM; 2 ml of a "trace element" solution. The solution is autoclaved at 120 ° C. for 30 minutes and sterilized.
【００９０】 添付の図面は、この発明のある面を説明している。 図１は、エリスロマイシンＡの生合成経路を表している。 図２は、ＯＲＦ７、８及び９を含むエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラス
ターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:１の順行 配列及び相補性配列)及びそれらの演繹された蛋白質配列を表している。 図３は、ＯＲＦ１３〜１９を含むエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラスタ
ーのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙＫ領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:６の配列)及びそ
れらの演繹された蛋白質配列を表している。 図４は、相同組換えによる遺伝子置換についての図式を示している。 図５Ａは、Sac. erythraeaにおけるエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラス
ターの左部分の構成(ＯＲＦ１〜９を矢印により示してある)並びにプラスミドｐ
Ｋ６２、ｐＢＣＫ１、ｐＫＢ２２、ｐＢＫ４４、ｐＢＩＩＳＢ、ｐＥｃｏ２及び
ｐＫ２３(ゲノムクローンλＳＥ５．５より生成)の制限地図を表している。(制 限酵素の略号：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｃ、ＢｃｌＩ；Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ；Ｅ、Ｅｃ
ｏＲＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｍ、ＭｌｕＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳａｃＩ；Ｓａ、Ｓ
ａｌＩ。) 図５Ｂは、Sac. erythraeaにおけるエリスロマイシンの生合成遺伝子のクラス
ターの右部分の構成(ＯＲＦ１３〜２１を矢印により示してある)並びにプラスミ
ドｐＢＫ６−１２、ｐＣＮ９、ｐＮＣＯ２８、ｐＮＢ４９、ｐＮＣＯ６２、ｐＰ
ＳＰ４、ｐＮＣＯ６２Ｘ及びｐＢＡＢ１８の制限地図を表している。(制限酵素 の略号：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂａ、ＢａｌＩ；Ｂｃ、ＢｃｌＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ
、ＥｃｏＲＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｎ、ＮｃｏＩ；Ｎｓ、ＮｓｉＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；
Ｐｖ、ＰｖｕＩＩ；Ｓ、ＳａｃＩ；Ｓｃ、ＳｃａＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；Ｓｐ、Ｓ
ｐｅＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｘｈ、ＸｈｏＩ)。 図６Ａは、プラスミドｐＢＩＩΔの構築の図式を表している。 図６Ｂは、プラスミドｐＵＷＬ２１８の制限地図を表している。 図６Ｃは、プラスミドｐＢＩＩΔの制限地図を表している。 図７Ａは、プラスミドｐｄｅ１８８の構築の図式を表している。 図７Ｂは、プラスミドｐｄｅ１８８Ａの構築の図式を表している。 図７Ｃは、プラスミドｐＯＢＢの構築の図式を表している。 図７Ｄは、プラスミドｐＣＩＩＩΔの構築の図式及び制限地図を表している。 図８Ａは、プラスミドｐＣＩＩΔの構築の図式を表している。 図８Ｂは、プラスミドｐＯＲＴ１の制限地図を表している。 図８Ｃは、プラスミドｐＣＩＩΔの制限地図を表している。 図９Ａは、プラスミドｐＢＩＶΔの構築の図式を表している。 図９Ｂは、プラスミドｐＢＩＶΔの制限地図を表している。 図１０Ａは、プラスミドｐＢＶΔの構築の図式を表している。 図１０Ｂは、プラスミドｐＢＶΔの制限地図を表している。 図１１Ａは、プラスミドｐＰＳＴＩの構築の図式を表している。 図１１Ｂは、プラスミドｐＰＳＴＩの制限地図を表している。 図１２Ａは、プラスミドｐＸｈｏＩの構築の図式を表している。 図１２Ｂは、プラスミドｐＸｈｏＩの制限地図を表している。 図１３Ａは、プラスミドｐＣＩＶΔの構築の図式を表している。 図１３Ｂは、プラスミドｐＣＩＶΔの制限地図を表している。 図１４Ａは、プラスミドｐＣＶΔの構築の図式を表している。 図１４Ｂは、プラスミドｐＣＶΔの制限地図を表している。 図１５は、変異株ＢＩＩ９２、ＣＩＩＩ６８、ＣＩＩ６２、ＢＩＶ８７、ＢＶ
８８、ＣＩＶ８９及びＣＶ９０のサザーンブロットによる分析(Ｗｔと記した野 生型株「レッドバリアント」との比較)を表している。各変異体について、用い た制限酵素を各ブロットの下に示し、各ブロットの前に検出されたバンドのサイ
ズを分子量マーカーλ−ＨｉｎｄＩＩＩ及びλ−ＢｓｔＥＩＩに対して評価して
ある(オートラジオグラフィーでは検出できない)。 図１６は、変異株ＢＩＩ９１、ＣＩＩＩ６８、ＣＩＩ６２、ＢＩＶ８７、ＢＶ
８８、ＣＩＶ８９及びＣＶ９０のＰＣＲによる分析(Ｗｔで記した野生型株「レ ッドバリアント」との比較並びに相同組換えにより変異体を得るためにそれぞれ
用いたプラスミドｐＢＩＩΔ、ｐＣＩＩＩΔ、ｐＣＩＩΔ、ｐＢＩＶΔ、ｐＢＶ
Δ、ＰＣＩＶΔ及びｐＣＶΔとの比較)を表している。エチジウムブロミド染色 により検出されたバンドのサイズを、分子量マーカーΦＸ１７４−ＨａｅＩＩＩ
又はλ−ＢｓｔＥＩＩに対して評価してある。 図１７は、変異株ＢＩＩ９２、ＣＩＩＩ６８、ＣＩＩ６２、ＢＩＶ８７、ＢＶ
８８、ＣＩＶ８９及びＣＶ９０により生成された代謝産物のＴＬＣによる分析( 標準生成物エリスロマイシンＡ(ＥｒＡ)、エリスロマイシンＢ(ＥＢ)及び３−α
−ミカロシルエリスロノリドＢ(ＭＥＢ)との比較)を表している。 図１８は、７Ｍ尿素(ライン２)、Ｑセファロースクロマトグラフィー(ライン ３)、スーパーデックスクロマトグラフィー(ライン４)、Ｑソースクロマトグラ フィー(ライン６)を連続的に用いる抽出の後の、ＥｒｙＣＩＩＩ蛋白質の精製物
のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析(標準分子量マーカー(ライン１及び５)使用)を表
している。 図１９は、ＥｒｙＣＩＩＩ蛋白質の、ｄ−ＴＤＰ−Ｄ−デソサミン(ライン２)
との又はｄ−ＴＤＰ−Ｄ−デソサミン及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ
(ＭＥＢ)(ライン３)とのインキュベーション(ＭＥＢ対照(ライン１)及びエリス ロマイシンＡ対照(ライン４)との比較)による生物活性試験のＴＬＣによる分析 を表している。点線は、B. pumilusについてのオートラジオグラムを用いて、抗
生物質活性を示す領域を表している。 図２０は、オレアンドマイシン生合成遺伝子の全クラスターをカバーする６つ
のコスミド(ｃｏｓＡＢ３５、ｃｏｓＡＢ７６、ｃｏｓＡＢ８７、ｃｏｓＡＢ６ ７、ｃｏｓＡＢ６３及びｃｏｓＡＢ６１)の局在性を表している。ｓｔｒＭ、Ｄ 、Ｅと記したプローブとハイブリダイズする制限断片ＢａｍＨＩ(Ｂと記してあ る)及びプローブｅｒｙＣＩＩＩとハイブリダイズするＢａｍＨＩ断片(３．５ｋ
ｂ及び２．７ｋｂ)を示してある。 図２１は、S.antibioticusにおけるオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラス
ターの右部分の構成(種々のＯＲＦ(ｏｌｅＰ１、ｏｌｅＧ１、ｏｌｅＧ２、ｏｌ
ｅＭ、ｏｌｅＹ、ｏｌｅＰ及びｏｌｅＢと記してある)を矢印で示してある)並び
にプラスミドｐＣＯ３５−Ｓ及びｐＣＯ３５−Ｓから生成されたプラスミドｐＣ
Ｏ３のインサートの制限地図を表している。二重矢印は、図２２の配列に対応す
るインサートを示している(制限酵素の略号：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｇ、ＢｇｌＩ Ｉ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｓ、ＳａｃＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；星印は、それがユニーク部
位でないことを示している)。 図２２は、ｏｌｅＰ１、ｏｌｅＧ１、ｏｌｅＧ２、ｏｌｅＭ及びｏｌｅＹオレ
アンドマイシン生合成遺伝子をカバーする領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: １５の配列)及びそれらの演繹された蛋白質配列を表している。The accompanying drawings illustrate certain aspects of the present invention. FIG. 1 shows the erythromycin A biosynthetic pathway. FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the eryG-eryAIII region of the cluster of erythromycin biosynthesis genes including ORFs 7, 8 and 9 (forward sequence and complementary sequence of SEQ ID NO: 1) and their deduced protein sequences. Represents. FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the eryAI-eryK region of the cluster of erythromycin biosynthetic genes including ORFs 13 to 19 (sequence of SEQ ID NO: 6) and their deduced protein sequences. FIG. 4 shows a scheme for gene replacement by homologous recombination. FIG. 5A shows the composition of the left part of the cluster of erythromycin biosynthesis genes in Sac. Erythraea (ORFs 1-9 indicated by arrows) and plasmid p.
1 shows a restriction map of K62, pBCK1, pKB22, pBK44, pBIISB, pEco2 and pK23 (generated from genomic clone λSE5.5). (Abbreviation of restriction enzymes: B, BamHI; Bc, BclI; Bg, BglII; E, Ec
oRI; K, KpnI; M, MluI; P, PstI; S, SacI; Sa, S
alI. 5B) Construction of the right part of the cluster of erythromycin biosynthesis genes in Sac. Erythraea (ORFs 13-21 are indicated by arrows) and plasmids pBK6-12, pCN9, pNCO28, pNB49, pNCO62, pP
Figure 4 shows a restriction map of SP4, pNCO62X and pBAB18. (Abbreviation of restriction enzymes: B, BamHI; Ba, BalI; Bc, BclI; C, ClaI; E
, EcoRI; K, KpnI; N, NcoI; Ns, NsiI; P, PstI;
Pv, PvuII; S, SacI; Sc, ScaI; Sh, SphI; Sp, S
peI; X, XbaI; Xh, XhoI). FIG. 6A shows a schematic of the construction of plasmid pBIIΔ. FIG. 6B shows a restriction map of plasmid pUWL218. FIG. 6C shows a restriction map of plasmid pBIIΔ. FIG. 7A shows a schematic of the construction of plasmid pde188. FIG. 7B shows a schematic of the construction of plasmid pde188A. FIG. 7C shows a schematic of the construction of plasmid pOBB. FIG. 7D shows a schematic and restriction map of the construction of plasmid pCIIIΔ. FIG. 8A shows a schematic of the construction of plasmid pCIIΔ. FIG. 8B shows a restriction map of plasmid pORT1. FIG. 8C shows a restriction map of plasmid pCIIΔ. FIG. 9A depicts a schematic of the construction of plasmid pBIVΔ. FIG. 9B shows a restriction map of plasmid pBIVΔ. FIG. 10A shows a schematic of the construction of plasmid pBVΔ. FIG. 10B shows a restriction map of plasmid pBVΔ. FIG. 11A shows a schematic of the construction of plasmid pPSTI. FIG. 11B shows a restriction map of plasmid pPSTI. FIG. 12A shows a schematic of the construction of plasmid pXhoI. FIG. 12B shows a restriction map of plasmid pXhoI. FIG. 13A shows a schematic of the construction of plasmid pCIVΔ. FIG. 13B shows a restriction map of plasmid pCIVΔ. FIG. 14A shows a schematic of the construction of plasmid pCVΔ. FIG. 14B shows a restriction map of plasmid pCVΔ. FIG. 15 shows that mutants BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV
FIG. 9 shows the analysis by Southern blot of 88, CIV89 and CV90 (comparison with the wild type strain “Red Variant” marked Wt). For each mutant, the restriction enzyme used is indicated below each blot, and the size of the band detected before each blot is evaluated against the molecular weight markers λ-HindIII and λ-BstEII (autoradiography. Not detectable). FIG. 16 shows that the mutants BII91, CIII68, CII62, BIV87, BV
Analysis by PCR of 88, CIV89 and CV90 (comparison with wild-type strain "Red variant" indicated by Wt and plasmids pBIIΔ, pCIIIΔ, pCIIΔ, pBIVΔ, pBV used to obtain mutants by homologous recombination, respectively.
Δ, PCIVΔ and pCVΔ). The size of the band detected by ethidium bromide staining was compared with the molecular weight marker ΦX174-HaeIII.
Or, it has been evaluated against λ-BstEII. FIG. 17 shows mutants BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV
Analysis by TLC of metabolites produced by 88, CIV89 and CV90 (standard products erythromycin A (ErA), erythromycin B (EB) and 3-α
-Comparison with micarosyl erythronolide B (MEB)). FIG. 18 shows the EryCIII protein after extraction using successively 7M urea (line 2), Q Sepharose chromatography (line 3), superdex chromatography (line 4), Q source chromatography (line 6). FIG. 6 shows the analysis of the purified product by SDS-PAGE (using standard molecular weight markers (lines 1 and 5)). FIG. 19 shows d-TDP-D-desosamine (line 2) of the EryCIII protein.
Or with d-TDP-D-desosamine and 3-α-mycarosyl erythronolide B
FIG. 4 represents the analysis by TLC of a bioactivity test by incubation with (MEB) (line 3) (comparison with MEB control (line 1) and erythromycin A control (line 4)). Dotted lines represent regions showing antibiotic activity using autoradiograms for B. pumilus. FIG. 20 shows the localization of six cosmids (cosAB35, cosAB76, cosAB87, cosAB67, cosAB63 and cosAB61) covering the entire cluster of oleandmycin biosynthesis genes. A restriction fragment BamHI (labeled B) that hybridizes with the probes labeled strM, D, and E and a BamHI fragment (3.5 kB) that hybridizes with the probe eryCIII
b and 2.7 kb). FIG. 21 shows the composition of the right part of the cluster of oleandmycin biosynthesis genes in S. antibioticus (various ORFs (oleP1, oleG1, oleG2, olG2,
eM, oleY, oleP and oleB) are indicated by arrows) and plasmids pCO35-S and plasmid pC generated from pCO35-S.
3 shows a restriction map of the O3 insert. Double arrows indicate inserts corresponding to the sequence of FIG. 22 (abbreviations of restriction enzymes: B, BamHI; Bg, BglI; K, KpnI; S, SacI; Sh, SphI; Indicating that it is not a unique site). FIG. 22 shows the nucleotide sequence of the region covering the oleP1, oleG1, oleG2, oleM and oleY oleandomycin biosynthesis genes (sequence of SEQ ID NO: 15) and their deduced protein sequences.
【００９１】実施例１ ：エリスロマイシンの生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡ
ＩＩＩ領域のクローニング及び配列決定 特にＯＲＦ３〜９をカバーし、クローンλＳＥ５．５に対応するｅｒｍＥ遺伝
子の下流の＞２０ｋｂを有するSac. erythraeaＮＲＲＬ２３３８のゲノムＤＮＡ
断片並びにｅｒｍＥ遺伝子の３’末端から３．７〜８．０ｋｂの間に含まれるｅ
ｒｙクラスターの領域に対応しＯＲＦ３、４、５及び６を含む４．５ｋｂの断片
のヌクレオチド配列がHaydock等(1991)により記載された。 Example 1 EryG-eryA of a cluster of erythromycin biosynthetic genes
Cloning and Sequencing of Region III Genomic DNA of Sac. Erythraea NRRL2338, covering ORFs 3-9 in particular and having> 20 kb downstream of the ermE gene corresponding to clone λSE5.5
The fragment and e contained between 3.7 and 8.0 kb from the 3 'end of the ermE gene
The nucleotide sequence of a 4.5 kb fragment corresponding to the region of the ry cluster and containing ORFs 3, 4, 5, and 6 was described by Haydock et al. (1991).
【００９２】 Haydock等(1991)により示された制限地図を考慮して、サブクローンをクロー ンλＳＥ５．５から制限断片をｐＵＣ１９中にサブクローン化することにより導
いた。こうして、プラスミドｐＫＢ２２、ｐＢＫ４４、ｐＢＩＩＳＢ及びｐＥｃ
ｏ２を、下記の仕方で図５Ａに従って生成した：In view of the restriction map shown by Haydock et al. (1991), subclones were derived from clone λSE5.5 by subcloning restriction fragments into pUC19. Thus, plasmids pKB22, pBK44, pBIISB and pEc
o2 was generated according to FIG. 5A in the following manner:
【００９３】 ＫｐｎＩ制限酵素により消化したクローンλＳＥ５．５のＤＮＡから、プラス
ミドｐＫ６２及びｐＫ６６を、５．８ｋｂのＫｐｎＩ断片のｐＵＣ１９中でのサ
ブクローニングにより直接構築した(プラスミドｐＫ６６は、ベクターに対して インサートを逆向きでサブクローン化した同じＫｐｎＩ断片に対応する)。次い で、２．９ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＫＢ２２を、プラスミドｐＫ６
６から、ＯＲＦ８並びにＯＲＦ７及び９の部分をカバーするＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ断片(２．９ｋｂ)のＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素消化による切り出し
により導いた。同様にして、２．９ｋｂのインサートを含むプラスミドｐＫＢ４
４をプラスミドｐＫ６２から、ＯＲＦ５及び６に対応するｅｒｙＧ遺伝子並びに
ＯＲＦ４に対応するｅｒｙＦ遺伝子をカバーするＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片( ２．９ｋｂ)の切り出しにより得た。Plasmids pK62 and pK66 were constructed directly from the DNA of clone λSE5.5 digested with the KpnI restriction enzyme by subcloning a 5.8 kb KpnI fragment into pUC19. Corresponding to the same KpnI fragment subcloned in the reverse orientation). The plasmid pKB22 containing the 2.9 kb insert was then replaced with plasmid pK6.
BamHI-Bgl covering part of ORF8 and ORF7 and 9 from 6
The II fragment (2.9 kb) was derived by excision by digestion with BamHI and BglII restriction enzymes. Similarly, plasmid pKB4 containing a 2.9 kb insert
No. 4 was obtained from plasmid pK62 by cutting out a BamHI-BglII fragment (2.9 kb) covering the eryG gene corresponding to ORF5 and 6, and the eryF gene corresponding to ORF4.
【００９４】 プラスミドｐＢＩＩＳＢを、プラスミドｐＢＫ４４から、ＳａｌＩ制限酵素で
消化したプラスミドｐＢＫ４４から得た６００ｂｐのＳａｌＩ断片のｐＵＣ１９
中でのサブクローン化により導いた(図５Ａ)。Plasmid pBIISB was converted from plasmid pBK44 to pUC19, a 600 bp SalI fragment obtained from plasmid pBK44 digested with SalI restriction enzyme.
(Figure 5A).
【００９５】 ＥｃｏＲＩ制限酵素により消化したクローンλＳＥ５．５のＤＮＡから、プラ
スミドｐＥｃｏ２を、ＥｃｏＲＩ断片(２．２ｋｂ)のｐＵＣ１９中でのサブクロ
ーン化により直接構築した。From the DNA of clone λSE5.5 digested with EcoRI restriction enzyme, plasmid pEco2 was constructed directly by subcloning the EcoRI fragment (2.2 kb) in pUC19.
【００９６】 こうして得たサブクローンｐＫＢ２２、ｐＢＫ４４、ｐＢＩＩＳＢ及びｐＥｃ
ｏ２を、次いで、配列決定した。分析を、Quiagen100カラム(Quiagen)で前もっ て精製したプラスミド化ＤＮＡ試料につき、ＡＢＩプリズム３７７自動シーケン
サーにて行った。配列決定反応を、慣用のＭ１３プライマー又は合成プライマー
及び蛍光化ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＴａｑＦＳポリメラーゼ(Perki
n Elmer)を用いるサンガー法(1977)により、５％ジメチルスルホキシドの存在下
で行い、用いた合成プライマーは、下記の配列を有した： Ｃ３Ｒ２ TCCTCGATGGAGACCTGCC (SEQ ID NO:２２) Ｂ２Ｒ１ GAGACCATGCCCAGGGAGT (SEQ ID NO:２３) Ｃ３Ｓ２ TCTGGGAGCCGCTCACCTT (SEQ ID NO:２４) Ｃ２Ｒ１ GACGAGGCCGAAGAGGTGG (SEQ ID NO:２５) Ｃ２Ｓ GCACACCGGAATGGATGCG (SEQ ID NO:２６) fullＣ３Ｓ CCGTCGAGCTCTGAGGTAA (SEQ ID NO:２７) fullＣ３Ｒ GCCCGAGCCGCACGTGCGT (SEQ ID NO:２８)及び Ｃ４ TGCACGCGCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO:２９)。The subclones pKB22, pBK44, pBIISB and pEc thus obtained
o2 was then sequenced. Analysis was performed on an ABI prism 377 automated sequencer on plasmidized DNA samples previously purified on a Quiagen 100 column (Quiagen). The sequencing reaction was performed using conventional M13 or synthetic primers and a fluorescent dideoxynucleoside triphosphate and TaqFS polymerase (Perkis).
n Elmer) (1977) in the presence of 5% dimethyl sulfoxide, the synthetic primers used had the following sequence: C3R2 TCCTCGATGGAGACCTGCC (SEQ ID NO: 22) B2R1 GAGACCATGCCCAGGGAGT (SEQ ID NO : 23) C3S2 TCTGGGAGCCGCTCACCTT (SEQ ID NO: 24) C2R1 GACGAGGCCGAAGAGGTGG (SEQ ID NO: 25) C2S GCACACCGGAATGGATGCG (SEQ ID NO: 26) fullC3S CCGTCGAGCTCTGAGGTAA (SEQ ID NO: 27) fullC3R GCCCGAGCCGCGCGGTGC (SEQ ID NO: 28) TGCACGCGCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO: 29).
【００９７】 配列データの編集を、オートアセンブラー(商標)ソフトウェアパッケージ(App
lied Biosystem)を用いて行った。これらの配列を、ソフトウェアのＧＣＧセッ ト(Devereux 1984)を用いて分析した。Editing of sequence data is performed using the Auto Assembler (trademark) software package (App
lied Biosystem). These sequences were analyzed using the software GCG set (Devereux 1984).
【００９８】 得られたヌクレオチド配列は、図２の３４１２ｂｐのヌクレオチド配列(SEQ I
D NO:１の順行及び相補性配列)を確立させたが、その中に３つのＯＲＦ(７、８ 及び９)が、それぞれ、ヌクレオチド８９５７〜７９５９、１０２１９〜８９５ ７及び１１３１５〜１０２３３(図２では、ｅｒｍＥ遺伝子の５’末端に位置す るＢａｍＨＩ部位から番号付けしてある)に同定され(それぞれ、SEQ ID NO:１の
相補性配列、ヌクレオチド４８〜１０４６、１０４６〜２３０８及び２３２２〜
３４０４)、それぞれ、Liu及びThorson(1994)によるｅｒｙＢＩＩ、ｅｒｙＣＩ ＩＩ及びｅｒｙＣＩＩ遺伝子(これらの機能的特性表示は、未だ同定されていな かった)に対応している。これら３つのＯＲＦ７、８及び９は、同じ向きを有し 、読みは、ｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子の３’領域から行われる。The obtained nucleotide sequence is the nucleotide sequence of 3412 bp shown in FIG.
DNO: 1 ancestral and complementary sequences) in which three ORFs (7, 8, and 9) had nucleotides 8957-7959, 10219-8957 and 11315-10233 (Fig. 2 (numbered from the BamHI site located at the 5 'end of the ermE gene) (complementary sequence of SEQ ID NO: 1, nucleotides 48-1046, 1046-2308 and 2322-, respectively).
3404), respectively, corresponding to the eryBII, eryCIII and eryCII genes by Liu and Thorson (1994), whose functional characterization has not yet been identified. These three ORFs 7, 8 and 9 have the same orientation and the reading is taken from the 3 'region of the eryAIII gene.
【００９９】 上記のＯＲＦのコード領域を含む大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの試料を、Collecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25
,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCEに、１９９７年７月１６日
に寄託した： − ＯＲＦ７、ＯＲＦ８及びＯＲＦ９の部分のコード配列を含むプラスミドｐＫ
６２を番号Ｉ−１８９７で寄託、 − ＯＲＦ９及びＯＲＦ８の部分のコード配列を含むプラスミドｐＥｃｏ２を番
号Ｉ−１８９９で寄託。A sample of E. coli XL1-blue containing the coding region of the ORF was
on Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25
, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCE, deposited on July 16, 1997:-Plasmid pK containing the coding sequence of the parts ORF7, ORF8 and ORF9
No. 62 was deposited under the number I-1897, the plasmid pEco2 containing the coding sequence for the parts of ORF9 and ORF8 was deposited under the number I-1899.
【０１００】実施例２ ：プラスミドｐＢＩＩΔの構築 ＯＲＦ７をコードするｅｒｙＢＩＩ遺伝子中に欠失を有するｐＢＩＩΔと呼ば
れる組込み型プラスミドを、図６Ａの図式に従って構築した。 Example 2 Construction of Plasmid pBIIΔ An integrative plasmid called pBIIΔ with a deletion in the eryBII gene encoding ORF7 was constructed according to the scheme of FIG. 6A.
【０１０１】 実施例１で得たプラスミドｐＫ６２中の５９８ｂｐのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩ断
片を、ＢｃｌＩ及びＢａｍＨＩ酵素での消化により欠失させた。その結果生成し
たプラスミドｐＢＣＫ１を、次いで、図２の配列のヌクレオチド８０１１〜８８
６３のＯＲＦ７内の８５３ｂｐを欠失するようにＭｌｕＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵
素で消化した。これらの末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて埋
めた後に、この欠失を含むプラスミドを連結して大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ中にト
ランスフォームした。こうして生成したプラスミドｐ１９ＢＩＩΔから、この欠
失を有するＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片(４．３ｋｂ)を、プラスミドｐＵＷＬ
２１８中にサブクローン化した(図６Ｂ)。こうして生成したプラスミドｐＢＩＩ
Δ(図６Ｃ)中のヌクレオチド８０１１〜８８６３の８５３ｂｐの欠失の存在を、
配列決定により確認した。このプラスミドｐＢＩＩΔを、次いで、大腸菌ＤＨ５
αＭＲＣ株中に移し、その後、Sac. erythraeaをトランスフォームするのに用い
た。The 598 bp BclI-BamHI fragment in the plasmid pK62 obtained in Example 1 was deleted by digestion with BclI and BamHI enzymes. The resulting plasmid pBCK1 was then replaced with nucleotides 8011-88 of the sequence of FIG.
Digestion with MluI and BglII restriction enzymes to delete 853 bp in 63 ORF7. After filling these ends with the Klenow fragment of DNA polymerase I, the plasmid containing this deletion was ligated and transformed into E. coli XL1-blue. From the plasmid p19BIIΔ thus generated, a KpnI-HindIII fragment (4.3 kb) having this deletion was replaced with the plasmid pUWL.
218 (FIG. 6B). Plasmid pBII thus generated
The presence of an 853 bp deletion of nucleotides 8011 to 8863 in Δ (FIG. 6C)
Confirmed by sequencing. This plasmid pBIIΔ was then transformed into E. coli DH5
It was transferred into the αMRC strain and subsequently used to transform Sac. erythraea.
【０１０２】実施例３ ：Sac. erythraea ｅｒｙＢＩＩΔ株(ＢＩＩ９２)の構築 ｅｒｙＢＩＩ遺伝子が実施例２で作製したプラスミドｐＢＩＩΔ中に導入した
ような内部欠失を有するSac. erythraea株の構築及びインテグレーションプロセ
スを下記の仕方で行った： Example 3 Construction of Sac. Erythraea eryBIIΔ Strain (BII92) The construction and integration process of a Sac. Erythraea strain having an internal deletion such that the eryBII gene was introduced into the plasmid pBIIΔ prepared in Example 2 is described below. I went in the following way:
【０１０３】 プロトプラストの調製を、Weber及びLosick(1988)により記載された方法に従 って、記載されたＰＥＧ１０００の代わりのＰＥＧ３３５０(Sigma)及びＰ、Ｌ 又はＴ緩衝液の代わりのＭｇＣｌ2を含みＰＯ4Ｈ2Ｋを含まない改変Ｐ緩衝液(Ｐ
Ｔと呼ばれる)を用いて、下記の操作条件に従って行った：Preparation of protoplasts was performed according to the method described by Weber and Losick (1988), including PEG 3350 (Sigma) instead of PEG 1000 as described and MgCl 2 instead of P, L or T buffer. Modified P buffer without PO 4 H 2 K (P
T)) according to the following operating conditions:
【０１０４】 Sac. erythraea「レッドバリアント」(その試料を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCEに、１９９７年７月１６日に、番号Ｉ−１ ９０２で寄託した)の細胞(少なくとも１０8の芽胞)を５０ｍｌのＴＢＳ培地にて
３〜５日間、３０℃で成長させ、その後、１０．３％ショ糖で洗った。これらの
細胞を、２〜５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム(Sigma)を含む５０ｍｌのＰＴ緩衝液中 に再懸濁させ、次いで、３０℃で、１〜２時間インキュベートした(菌糸体マス 非分離で、菌糸体の少なくとも５０％がプロトプラストに変換されるまで)。こ れらのプロトプラストを、５０ｍｌのＰＴ緩衝液で洗い、同緩衝液１２．５〜２
５ｍｌに再懸濁させ、ゆっくり凍結させてから−８０℃に２００μｌのアリコー
トで保存した。Sac. Erythraea “Red Variant” (sample was collected from the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCE on July 16, 1997, number I -1 902) cells (at least 10 8 spores) were grown in 50 ml TBS medium for 3-5 days at 30 ° C. and then washed with 10.3% sucrose. These cells were resuspended in 50 ml of PT buffer containing 2-5 mg / ml lysozyme (Sigma) and then incubated at 30 ° C. for 1-2 hours. Until at least 50% of the body is converted to protoplasts). Wash these protoplasts with 50 ml of PT buffer,
Resuspended in 5 ml, slowly frozen and stored in 200 μl aliquots at -80 ° C.
【０１０５】 トランスフォーメーションのために、一のアリコートを解凍して、５０μｌを
取り出し、次いで、１５ｍｌの試験管に移した。１〜１０μｇのプラスミドＤＮ
ＡｐＢＩＩΔ(実施例２で大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株から調製)を、５〜１０μｌの
ＴＥ緩衝液(１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶解さ
せ、次いで、傾けた試験管壁に付着させ、それに２×ＰＴ緩衝液中で１／２に希
釈する５０％水溶液から即座に調製したＰＴ緩衝液中のＰＥＧ３３５０溶液０．
５ｍｌを加えた。３〜５ｍｌのＰＴ緩衝液での希釈とその後の２５００ｒｐｍで
１５分間の遠心分離の後に、ペレットを０．５ｍｌのＰＴ緩衝液中に解離させ、
こうして得られたトランスフォームされたプロトプラストの懸濁液を直ちに２〜
３の非常に乾燥したＲ２Ｔ２ディッシュ上に分配する(層流フード中で３時間)。
これらのディッシュを、次いで、３２℃で１６〜２４時間、プロトプラストの再
生フィルムが現れるまでインキュベートした。ＤＭＳＯ中の５０ｍｇ／ｍｌのチ
オストレプトン(Sigma)のストック溶液から適当量を０．５〜１ｍｌの水で希釈 してから、これらのディッシュ上に、ゲロース１ｍｌ当たり２０μｇのチオスト
レプトンの終濃度になるように噴霧した。抗生物質の完全な吸収の後に、これら
のディッシュを３２℃で３〜４日間インキュベートして、これらのトランスフォ
ーマントを可視化した。これらのディッシュを更に数日間、芽胞が完全に発生す
るまでインキュベートした。For transformation, one aliquot was thawed and 50 μl was removed and then transferred to a 15 ml tube. 1 to 10 μg of plasmid DN
ApBIIΔ (prepared from E. coli DH5α MRC strain in Example 2) was dissolved in 5-10 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA) and then attached to the tilted tube wall and 2 × A solution of PEG3350 in PT buffer prepared immediately from a 50% aqueous solution diluted 1/2 in PT buffer.
5 ml was added. After dilution with 3-5 ml of PT buffer and subsequent centrifugation at 2500 rpm for 15 minutes, the pellet was dissociated in 0.5 ml of PT buffer,
The suspension of the transformed protoplasts thus obtained is immediately
Dispense onto 3 very dry R2T2 dishes (3 hours in laminar flow hood).
The dishes were then incubated at 32 ° C. for 16-24 hours until the appearance of regenerated film of protoplasts. Dilute an appropriate amount from a stock solution of 50 mg / ml thiostrepton (Sigma) in DMSO with 0.5-1 ml of water and then place on these dishes a final concentration of 20 μg thiostrepton per ml of gelose. Sprayed. After complete absorption of the antibiotics, the dishes were incubated at 32 ° C. for 3-4 days to visualize the transformants. These dishes were incubated for a few more days until the spores were completely developed.
【０１０６】 最初の組換え事象(図４)に対応するインテグラントの選択を、胞子形成したデ
ィッシュのビロードを用いる複製により又は芽胞の懸濁液をチオストレプトンを
含むＲ２Ｔ２ディッシュ上に広げてから、潜在的インテグラントのクローンを成
長させる３２℃でのインキュベーションにより行った。The selection of integrants corresponding to the first recombination event (FIG. 4) was determined by replication using velvet of sporulated dishes or after spreading the spore suspension on R2T2 dishes containing thiostrepton. Grow potential integrant clones by incubation at 32 ° C.
【０１０７】 第二の組換え事象(図４)を受けたクローンの選択のために、上で得られた５〜
１０のチオストレプトン耐性クローンを、８ｍｌのＴＳＢ液体培地中で、３０℃
で３〜４日間培養した。５０〜１００μｌを取り出して同じ条件下で再培養した
。チオストレプトン耐性マーカーの喪失を促進することを意図した希釈と培養の
４連続サイクルの後に、これらの細胞から上に示したようにプロトプラストを、
プラスミドを放出するように調製した。次いで、これらのプロトプラストを、個
別化されたコロニーを得るように、Ｒ２Ｔ２ディッシュ上に広げ、それらのチオ
ストレプトンに対する感受性を、チオストレプトンを含むＲ２Ｔ２ディッシュ上
での複製により測定した。For selection of clones that have undergone a second recombination event (FIG. 4),
Ten thiostrepton resistant clones were grown at 30 ° C. in 8 ml TSB broth.
For 3 to 4 days. 50 to 100 μl were removed and recultured under the same conditions. After four consecutive cycles of dilution and culture, intended to promote loss of the thiostrepton resistance marker, protoplasts as indicated above from these cells were
It was prepared to release the plasmid. These protoplasts were then spread on R2T2 dishes to obtain individualized colonies, and their susceptibility to thiostrepton was determined by replication on R2T2 dishes containing thiostrepton.
【０１０８】 第二の組換え事象の欠失部位に対する位置に依って(図４)、チオストレプトン
に感受性のコロニーの表現型が野生型であるか又は欠失を有する変異型であるこ
とが予想され得る。Depending on the location of the second recombination event relative to the deletion site (FIG. 4), the phenotype of the thiostrepton-sensitive colonies may be wild-type or mutant with the deletion. Can be expected.
【０１０９】 チオストレプトンに感受性のコロニーの内で、ｅｒｙ-の表現型を有する変異 体の選択を、エリスロマイシンに感受性であるB. pumilusＡＴＣＣ１４８８４株
についての抗生物質に対する細菌の感受性の記録によって、行った。このB. pum
ilus株を、抗生物質に対する細菌の感受性の記録による生物学的試験においてエ
リスロマイシンの産生を評価するための指標株として用いた。これらのコロニー
を、白金耳を用いてＲ２Ｔ２ディッシュ上に広げ、次いで、３０℃で３〜４日間
インキュベートした。次いで、変異体が集密的に成長したこれらの寒天領域をパ
ンチを用いて取り出して、B. pumilusの芽胞の懸濁液を接種した０．５×ＡＭｅ
ｒｃｋ(抗生物質寒天Ｎｏ．１Ｍｅｒｃｋ)の４ｍｌの上層で被覆したＡ−Ｍｅｒ
ｃｋディッシュ上に置き、その後、３７℃に一晩インキュベートした。[0109] Among the colonies sensitive to thiostrepton, ery - the selection of mutants having phenotypes, the recording of bacterial susceptibility to antibiotics for B. PumilusATCC14884 strain is sensitive to erythromycin was performed . This B. pum
The ilus strain was used as an indicator strain to assess erythromycin production in biological tests by recording bacterial susceptibility to antibiotics. These colonies were spread on R2T2 dishes using a platinum loop and then incubated at 30 ° C. for 3-4 days. These agar areas where the mutants grew confluent were then removed using a punch and 0.5 × AMe inoculated with a suspension of spores of B. pumilus.
rck (antibiotic agar No. 1 Merck) coated with 4 ml top layer
The plate was placed on a ck dish and then incubated at 37 ° C. overnight.
【０１１０】 次いで、この変異体の染色体中の予想される欠失(図２のヌクレオチド８０１ １〜８８６３の８５３ｂｐの欠失)の存在を、サザーンブロットを用いるゲノム 分析並びに下記の様式のＰＣＲによって確認した：The presence of the predicted deletion (853 bp deletion of nucleotides 8011 to 8863 in FIG. 2) in the chromosome of this mutant was then confirmed by genomic analysis using Southern blots and PCR in the following manner. did:
【０１１１】 サザーンブロットによる分析のために、適当な制限酵素で予め消化したゲノム
ＤＮＡのジーンスクリーンプラス(Dupont NEN)膜上への移送を、Ausubel等(1995
)に従って、０．４Ｎ ＮａＯＨ中で行った。これらのハイブリダイゼーション を、Sambrook等(1989)に従って、[γ32Ｐ]ＡＴＰ(Amersham)及びポリヌクレオチ
ドキナーゼ(Boehringer Mannheim)を用いて５’末端を標識した下記の配列を有 するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて行った： Ｂ２−Ｓ TTGGCGAAGTCGACCAGGTC (SEQ ID NO:３０) (ＥＭＢＬベースに参照番号Ｘ６０３７９で寄託されHaydock等(1991)により記載
された配列の４１１８〜４１３７位に位置するｅｒｙＧ遺伝子の開始のＤＮＡ領
域に対応する)。これらのハイブリダイゼーションを、迅速ハイブリダイゼーシ ョン緩衝液(Amersham)及び次の洗浄条件を用いて行った：２×５分間、２×ＳＳ
Ｃ、２０℃；３０分間、２×ＳＳＣ、６５℃；３０分間、０．１×ＳＳＣ、２０
℃。For analysis by Southern blot, transfer of genomic DNA, previously digested with appropriate restriction enzymes, onto a Dupont NEN membrane was performed as described by Ausubel et al. (1995).
) In 0.4 N NaOH. According to Sambrook et al. (1989), these hybridizations were performed using oligonucleotides having the following sequences labeled at the 5 ′ end with [γ 32 P] ATP (Amersham) and polynucleotide kinase (Boehringer Mannheim) as probes. B2-S TTGGCGAAGTCGACCAGGTC (SEQ ID NO: 30) (DNA of the start of the eryG gene located at positions 4118-4137 of the sequence deposited at EMBL reference number X60379 and described by Haydock et al. (1991). Corresponding to the area). These hybridizations were performed using a rapid hybridization buffer (Amersham) and the following washing conditions: 2 × 5 minutes, 2 × SS
C, 20 ° C .; 30 minutes, 2 × SSC, 65 ° C .; 30 minutes, 0.1 × SSC, 20
° C.
【０１１２】 Hopwood等(1985)に従って単離し、その後、ＫｐｎＩ制限酵素により消化した ゲノムＤＮＡについてのサザーンハイブリダイゼーションにより、「レッドバリ
アント」野生型株からの５．８ｋｂのバンド及び変異体ＢＩＩ９２からの４．９
ｋｂのバンドが検出された。図１５に示したこれらの結果は、この変異体中のこ
の染色体領域における約９００ｂｐの欠失の存在を示している。A 5.8 kb band from the “red variant” wild-type strain and 4 from mutant BII92 were isolated by Southern hybridization on genomic DNA isolated according to Hopwood et al. (1985) and then digested with KpnI restriction enzyme. .9
A kb band was detected. These results, shown in FIG. 15, indicate the presence of an approximately 900 bp deletion in this chromosomal region in this mutant.
【０１１３】 ＰＣＲによる分析のために、ＴＳＢ培地での３日培養の試料１００μｌを遠心
分離した。得られたペレットを１０μｌのＴＳＢ培地に再懸濁し、その後、ｇｅ
ｎＡｍｐＰＣＲシステム９６００装置(Perkin Elmer Cetus)での増幅に用いた。
この試料を３分間９４℃に加熱した後に、次の増幅条件を用い：９４℃、１分間
；５５℃、１分間；７２℃、３分間；３０サイクル；ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラ
ーゼ(Perkin Elmer)(１０％ジメチルスルホキシド(ｖ／ｖ)の存在下)、その後、
７２℃で３分間の伸長を行った。この増幅を、上記のオリゴヌクレオチドＢ２Ｓ
及び下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて行った： Ｂ２−Ｒ GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA (SEQ ID NO:３１) (５’末端に３つのヌクレオチドを加えた図２の配列の８８７３〜８８９２位に 位置するＤＮＡ領域の相補鎖の配列に対応し、ＯＲＦ７に内部欠失を有する領域
のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)。For analysis by PCR, a 100 μl sample of a 3 day culture in TSB medium was centrifuged. The resulting pellet was resuspended in 10 μl of TSB medium,
Used for amplification on the nAmp PCR System 9600 instrument (Perkin Elmer Cetus).
After heating the sample to 94 ° C for 3 minutes, the following amplification conditions were used: 94 ° C for 1 minute; 55 ° C for 1 minute; 72 ° C for 3 minutes; 30 cycles; AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer) (10% dimethyl Sulfoxide (v / v)), then
Extension was performed at 72 ° C. for 3 minutes. This amplification is performed using the oligonucleotide B2S described above.
And an oligonucleotide having the following sequence: B2-R GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA (SEQ ID NO: 31) (DNA region located at positions 8873-8892 of the sequence of FIG. 2 with three nucleotides added at the 5 'end. Corresponding to the sequence of the complementary strand of ORF7 and allowing framing by PCR amplification of a region having an internal deletion in ORF7).
【０１１４】 全細胞についてのＰＣＲ増幅による分析は、野生型株において約１ｋｂのバン
ドを、変異体ＢＩＩ９２において０．１６ｋｂのバンドを、プラスミドｐＢＩＩ
Δを用いて得られたシグナルと同じ様式で検出した。図１６に示したこれらの結
果は、サザーン分析により検出された約９００ｂｐの欠失がプラスミドｐＢＩＩ
Δにより運ばれるもの(８５３ｂｐ)と同じであることを確認した。Analysis of all cells by PCR amplification revealed that the wild type strain had a band of about 1 kb, the mutant BII92 had a band of 0.16 kb, and the plasmid pBII
The signal was detected in the same manner as the signal obtained using Δ. These results, shown in FIG. 16, show that the deletion of about 900 bp detected by Southern analysis indicates that the plasmid pBII
It was confirmed to be the same as that carried by Δ (853 bp).
【０１１５】 こうして得られた組換え株(ＢＩＩ９２と呼ぶ)を、次いで、この株により生成
される代謝産物を同定するために培養した。The recombinant strain thus obtained (designated BII92) was then cultured to identify the metabolites produced by this strain.
【０１１６】実施例４ ：ＢＩＩ９２株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 この株の肉汁培養培地の抽出物を、エリスロマイシンＡ、エリスロマイシンＢ
及び３−α−ミカロシルエリスロノリドＢを標準として薄層クロマトグラフィー
(ＴＬＣ)により分析した。 Example 4 : Fermentation of strain BII92 and identification of secondary metabolites produced The extract of the broth culture medium of this strain was used for erythromycin A, erythromycin B
-Layer chromatography using and α-micalosylerythronolide B as a standard
(TLC).
【０１１７】 ＢＩＩ９２株を、５０ｍｌ三角フラスコ内で、エリスロマイシンＡ及びその誘
導体の最適生成を与える条件下で培養した。それは、細胞の予備培養を、ＥＰ１
培地(ソルリスＬ−コーンスティープリカー(Roquette freres)５ｇ／ｌ；脱脂し
た大豆粉末(Cargill)１０ｇ／ｌ；ＣＯ3Ｃａ２ｇ／ｌ；ＮａＣｌ５ｇ／ｌ；ｐＨ
＝６．８；グルコースｓｑｆ１５ｇ／ｌ(オートクレーブ後添加))中で、２８℃ で４８時間行うことと、その後の、ＥＰ２培地(脱脂した大豆粉末１０ｇ／ｌ； ＣＯ3Ｃａ０．２ｇ／ｌ；Ｃｌ2Ｃｏ−６Ｈ2Ｏ１ｍｇ／ｌ；ｐＨ＝６．８〜７． ０；グルコースｓｑｆ２０ｇ／ｌ(オートクレーブ後添加))での７％ｖ／ｖへの 希釈後の７２時間の培養からなる。Strain BII92 was cultured in 50 ml Erlenmeyer flasks under conditions that give optimal production of erythromycin A and its derivatives. It involves pre-culture of cells, EP1
Medium (Sorris L-Roquette freres 5 g / l; defatted soybean powder (Cargill) 10 g / l; CO 3 Ca 2 g / l; NaCl 5 g / l; pH
= 6.8; glucose sqf 15 g / l (added after autoclaving)) at 28 ° C. for 48 hours, followed by EP2 medium (defatted soybean powder 10 g / l; CO 3 Ca 0.2 g / l; Cl) 2 Co-6H 2 O1mg / l ;. pH = 6.8~7 0; consisting 72 hours of culture after the dilution to 7% v / v of glucose sqf20g / l (added after autoclaving)).
【０１１８】 次いで、この培養上清を、ｐＨ９〜１０で、酢酸エチルで抽出した。有機相を
ＭｇＳＯ4上で乾燥し、減圧下で乾燥してから、６０Ｆ２５４シリカゲル(Merck)
上のでＴＬＣ[ジクロロメタン／メタノール(９０：１０、ｖ／ｖ)又はイソプロ ピルエーテル／メタノール／２５％ＮＨ4ＯＨ(７５：３５：２、ｖ／ｖ)]により
分析した。或いは、この分析を、ＮＨ2Ｆ２５４型の結合シリカゲルプレート(Me
rck)上でのＴＬＣ[塩化ブチル／メタノール(９０：１０、ｖ／ｖ)]により行った
。Next, the culture supernatant was extracted with ethyl acetate at pH 9-10. The organic phase is dried over MgSO 4 , dried under reduced pressure and then 60F254 silica gel (Merck)
Analyzed above by TLC [dichloromethane / methanol (90:10, v / v) or isopropyl ether / methanol / 25% NH 4 OH (75: 35: 2, v / v)]. Alternatively, the analysis may be performed using NH 2 F254-type bonded silica gel plates (Me
rck) on TLC [butyl chloride / methanol (90:10, v / v)].
【０１１９】 これらのプレートの化学的暴露を、ｐ−アニスアルデヒド−９８％硫酸−エタ
ノール(１：１：９、ｖ／ｖ)溶液の噴霧化とその後数分間の８０℃での加熱によ
り行った。潜在的抗生物質活性を、ＴＬＣプレートの、B. pumilusＡＴＣＣ１４
８８４を接種した寒天上での直接バイオオートグラフィーにより分析した。Chemical exposure of these plates was performed by atomization of a solution of p-anisaldehyde-98% sulfuric acid-ethanol (1: 1: 9, v / v) and subsequent heating at 80 ° C. for several minutes. . Potential antibiotic activity was determined using B. pumilus ATCC14 on TLC plates.
Analysis was performed by direct bioautography on agar inoculated with 884.
【０１２０】 化学的暴露により得られた結果(図１７)は、ＢＩＩ９２株が、ｅｒｙＢ変異体
に期待されるように、優先的にエリスロマイシンＢを蓄積することを示している
。The results obtained from the chemical exposure (FIG. 17) show that strain BII92 accumulates erythromycin B preferentially, as expected for the eryB mutant.
【０１２１】 抗生物質活性を示す低移動度の少しの代謝産物も検出された。これらの代謝産
物を、酢酸エチルで抽出して、質量分析法と結合した逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)により同定した。ＲＰ−ＨＰＬＣを、Kromasil C18５
μのカラム(２５０×４．６ｍｍ)にて、アセトニトリル／メタノール／酢酸アン
モニウム０．０６５Ｍ ｐＨ６．７混合物(３５０：１５０：５００、ｖ／ｖ)を
移動相として用いて、ＦｉｎｎｉｎｇａｎＴＳＱ７０００質量分析機を備えたＷ
ａｔｅｒｓクロマトグラフにて行った。Some low-mobility metabolites exhibiting antibiotic activity were also detected. These metabolites were extracted with ethyl acetate and identified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) coupled to mass spectrometry. RP-HPLC was performed using Kromasil C185
equipped with a Finningan TSQ7000 mass spectrometer using a mixture of acetonitrile / methanol / ammonium acetate 0.065M pH6.7 (350: 150: 500, v / v) as a mobile phase on a μ column (250 × 4.6 mm). W
Performed by aters chromatograph.
【０１２２】 エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの証跡と並んで、Ｍ１〜Ｍ４と呼ばれる４
つの少量の代謝産物が検出された： − Ｍ１は、ｍ／ｚ７０４に親ピークを、ｍ／ｚ５７６とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。デサミニル−エリスロノリドＡ(ｍ／ｚ５７６)の存在は、ｍ／
ｚの、エリスロマイシンＡ(ｍ／ｚ７３４)と比べての３０の差又はエリスロマイ
シンＣ(ｍ／ｚ７２０)と比べての１６の差が、中性糖残基により運ばれることを
示している。Ｍ１について提案される構造は、３”−Ｃデスメチル−２”，３”
−エン−エリスロマイシンＣである。 − Ｍ２は、ｍ／ｚ７０６に親ピークを、ｍ／ｚ５７６とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。デサミニル−エリスロノリドＡ(ｍ／ｚ５７６)の存在は、ｍ／
ｚの、エリスロマイシンＡ(ｍ／ｚ７３４)と比べての２８の差又はエリスロマイ
シンＣ(ｍ／ｚ７２０)と比べての１４の差が、中性糖残基により運ばれることを
示している。Ｍ２について提案される構造は、３”−Ｃデスメチル−エリスロマ
イシンＣである。 − Ｍ３は、ｍ／ｚ６９０に親ピークを、ｍ／ｚ５６０とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。デサミニル−エリスロノリドＢ(ｍ／ｚ５６０)の存在は、ｍ／
ｚの、エリスロマイシンＢ(ｍ／ｚ７１８)と比べての２８の差又はエリスロマイ
シンＤ(ｍ／ｚ７０４)と比べての１４の差が、中性糖残基により運ばれることを
示している。Ｍ３について提案される構造は、３”−Ｃデスメチル−エリスロマ
イシンＤである。 − Ｍ４は、ｍ／ｚ７２０に親ピークを、ｍ／ｚ５７６とｍ／ｚ１５８に断片化
生成物を生じる。このプロフィルは、デソサミニルエリスロノリドＡ(ｍ／ｚ５ ７６)の存在とアミノ化糖残基の消失を伴うエリスロマイシンＣ(ｍ／ｚ７２０) のものと同じであるが、代謝産物Ｍ４は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてエリスロマイ
シンと同じ滞留間を有しない。Ｍ４について提案される構造は、３”−Ｃデスメ
チル−エリスロマイシンＡである。Alongside the trails of erythromycins A, B, C and D, 4 called M1-M4
Two minor metabolites were detected:-M1 produces a parent peak at m / z 704 and fragmentation products at m / z 576 and m / z 158. The presence of desaminyl-erythronolide A (m / z 576) is
It is shown that 30 differences of z compared to erythromycin A (m / z734) or 16 compared to erythromycin C (m / z720) are carried by neutral sugar residues. The proposed structure for M1 is 3 "-C desmethyl-2", 3 "
-En-erythromycin C. -M2 gives a parent peak at m / z 706 and fragmentation products at m / z 576 and m / z 158. The presence of desaminyl-erythronolide A (m / z 576) is
A difference of 28 compared to erythromycin A (m / z734) or 14 compared to erythromycin C (m / z720) indicates that z is carried by neutral sugar residues. The proposed structure for M2 is 3 "-C desmethyl-erythromycin C.-M3 gives a parent peak at m / z 690 and a fragmentation product at m / z 560 and m / z 158. Desaminyl-erythronolide B The presence of (m / z 560) is
A difference of 28 compared to erythromycin B (m / z 718) or 14 compared to erythromycin D (m / z 704) indicates that z is carried by neutral sugar residues. The proposed structure for M3 is 3 "-C desmethyl-erythromycin D.-M4 gives a parent peak at m / z 720 and fragmentation products at m / z 576 and m / z 158. The profile is Metabolite M4 is identical to that of erythromycin C (m / z 720) with the presence of desosaminylerythronolide A (m / z576) and loss of aminated sugar residues, but the metabolite M4 The proposed structure for M4 is 3 "-C desmethyl-erythromycin A.
【０１２３】 不飽和中性糖を有する少量代謝産物Ｍ１(３”−Ｃデスメチル−２”，３”− エン−エリスロマイシンＣ)のＭＳ−ＭＳによる検出は、ｄＴＤＰ−ミカロース の生合成経路において、ｅｒｙＢＩＩ遺伝子がｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デ
オキシヘキソース２，３−レダクターゼをコードすることを示す。 ＢＩＩ９２株を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNC
M) INSTITUTE PASTEUR, 25,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCE
に、１９９７年７月１６日に、番号Ｉ−１９０３で寄託した。Detection of the minor metabolite M1 (3 ″ -C desmethyl-2 ″, 3 ″ -en-erythromycin C) with unsaturated neutral sugars by MS-MS showed that eryBII was involved in the dTDP-mycarose biosynthesis pathway. 2 shows that the gene encodes dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase BII92 strain was collected from Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNC
M) INSTITUTE PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCE
On July 16, 1997, under the number I-1903.
【０１２４】実施例５ ：プラスミドｐＣＩＩＩΔの構築 ＯＲＦ８は、翻訳において、下流に位置するＯＲＦ７と結合され得る(極性効 果を回避するために、同相(in phase)欠失を導入した)。かかる欠失を運ぶｐＣ ＩＩＩΔと呼ばれる組込みプラスミドを、図７(Ａ〜Ｄ)の図式に従って構築した
。 Example 5 : Construction of plasmid pCIIIΔ ORF8 can be ligated in translation with ORF7 located downstream (in order to avoid polar effects, an in-phase deletion has been introduced). An integrated plasmid called pCIIIΔ carrying such a deletion was constructed according to the diagram in FIG. 7 (A-D).
【０１２５】 プラスミドｐｄｅ１８８(図７Ａ)を生成するために、ＯＲＦ８中に、６６３ｂ
ｐのＳａｌＩ欠失を、図２の配列のヌクレオチド９３８４〜１００４６に、実施
例１で得たプラスミドｐＢＫ４４から単離した２つのＳａｌＩ断片(図５Ａに示 したａ：７９４ｂｐ及びｂ：６３１ｂｐ)をプラスミドｐＵＣ１９中にサブクロ ーン化することにより導入した。この６６３ｂｐの欠失の存在を、配列決定によ
り確認した。次いで、このプラスミドｐｄｅ１８８を、欠失部位の両側の相同組
換えに利用できる染色体領域を広げるように、更なる２つのサブクローニングに
かけた。先ず、プラスミドｐｄｅ１８８Ａ(図７Ｂ)を生成するために、プラスミ
ドｐｄｅ１８８のＳａｃＩ断片(４５０ｂｐ)を、実施例１で得られたプラスミド
ｐＥｃｏ２のＳａｃＩ断片(１．１ｋｂ)により置き換えた。次いで、ＯＲＦ８中
に欠失を有するＥｃｏＲＩ断片(１．５ｋｂ)を、プラスミドｐｄｅ１８８Ａから
単離してプラスミドｐＯＢＢ中の完全なＯＲＦを有するＥｃｏＲＩ断片(１．６ ６ｋｂ)を置き換えるのに用いた。図７Ｃに表示したプラスミドｐＯＢＢは、実 施例１で調製したプラスミドｐＢＫ４４に対応し、そのＰｓｔＩ部位には、スト
レプトミセス複製起点並びにチオストレプトン耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＩ
Ｊ４８６の４ｋｂのＰｓｔＩ断片(ＰｓｔＩ制限酵素消化により得られたもの)が
サブクローン化された。合成されたプラスミドｐＣＩＩＩΔは、欠失部位の上流
及び下流にそれぞれ１．２７ｋｂ及び１．３８ｋｂの相同組換えのための染色体
領域を有する。こうして得られたプラスミドｐＣＩＩＩΔ(図７Ｄ)を、次いで、
大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株中に移してから、Sac. erythraeaをトランスフォームす
るために用いた。In order to generate plasmid pde188 (FIG. 7A), 663b
The SalI deletion of p was performed by replacing the two SalI fragments (a: 794 bp and b: 631 bp shown in FIG. 5A) isolated from plasmid pBK44 obtained in Example 1 with nucleotides 9384 to 10046 of the sequence of FIG. It was introduced by subcloning into pUC19. The presence of this 663 bp deletion was confirmed by sequencing. This plasmid pde188 was then subjected to two additional subclonings to expand the chromosomal region available for homologous recombination on both sides of the deletion site. First, the SacI fragment (450 bp) of plasmid pde188 was replaced by the SacI fragment (1.1 kb) of plasmid pEco2 obtained in Example 1 to generate plasmid pde188A (FIG. 7B). The EcoRI fragment with a deletion in ORF8 (1.5 kb) was then isolated from plasmid pde188A and used to replace the EcoRI fragment with the complete ORF (1.66 kb) in plasmid pOBB. The plasmid pOBB shown in FIG. 7C corresponds to the plasmid pBK44 prepared in Example 1, and the PstI site has the plasmid pI carrying the Streptomyces replication origin and the thiostrepton resistance gene.
A 4 kb PstI fragment of J486 (obtained by PstI restriction enzyme digestion) was subcloned. The synthesized plasmid pCIIIΔ has chromosomal regions for homologous recombination of 1.27 kb and 1.38 kb, respectively, upstream and downstream of the deletion site. The thus obtained plasmid pCIIIΔ (FIG. 7D) was then
After transfer into the E. coli DH5α MRC strain, it was used to transform Sac. Erythraea.
【０１２６】実施例６ ：Sac. erythraeaｅｒｙＣＩＩＩΔ株(ＣＩＩＩ６８)の構築 ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子が実施例５で得られたプラスミドｐＣＩＩＩΔ中に導入
されたような内部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストのプラス
ミドｐＣＩＩＩΔでのトランスフォーメーションにより調製した。 Example 6 : Construction of Sac. Erythraeaery CIIIΔ strain (CIII68) A strain having an internal deletion such as that in which the eryCIII gene was introduced into the plasmid pCIIIΔ obtained in Example 5 was used as a plasmid for the protoplast of Sac. Erythraea. Prepared by transformation on pCIIIΔ.
【０１２７】 プロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の 選択は、実施例３と同様にして行った。The preparation of protoplasts, the integration process and the selection of mutants having the ery − phenotype were carried out as in Example 3.
【０１２８】 更に、染色体中に予想される欠失(図２の配列のヌクレオチド９３８４〜１０ ０４６の６６３ｂｐの欠失)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザーン ブロット並びにＰＣＲ増幅によるゲノム分析により確認した。In addition, the presence of the predicted deletion in the chromosome (a 663 bp deletion of nucleotides 9384 to 10046 of the sequence of FIG. 2) was determined by Southern blotting according to the conditions described in Example 3 and genomic analysis by PCR amplification. Confirmed by
【０１２９】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＥｃｏＲＩ制
限酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーションを
用いて、野生型株から２．２ｋｂのバンド及び変異体ＣＩＩＩ６８から１．５ｋ
ｂのバンドが検出された： Ｃ３−Ｓ ATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID NO:３２) (図２の配列の１０１９６〜１０２１９位に位置するＤＮＡ領域の相補鎖に対応 する)。図１５に示した結果は、この変異体において、染色体のこの位置に約７ ００ｂｐの欠失が存在することを示している。Using Southern hybridization to genomic DNA digested with EcoRI restriction enzyme using oligonucleotides having the following sequences as probes, a 2.2 kb band from the wild type strain and 1.5 kB from the mutant CIII68
The band b was detected: C3-S ATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID NO: 32) (corresponding to the complementary strand of the DNA region located at positions 10196 to 10219 in the sequence of FIG. 2). The results shown in FIG. 15 indicate that in this mutant there is an approximately 700 bp deletion at this position on the chromosome.
【０１３０】 ＰＣＲ増幅を、上記のオリゴヌクレオチドＣ３−Ｓ及び下記の配列を有するオ
リゴヌクレオチドを用いて行った Ｃ３−Ｒ TCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID NO:３３) (図２の配列の８９５４〜８９７４位に位置する配列に対応し、ＯＲＦ８に内部 欠失を有する領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)。ＰＣＲ増幅 による分析は、ｐＢＩＩデルタで得られたシグナルと同じ様式で、野生型株にお
いて約１．２ｋｂのバンドを及び変異体ＣＩＩＩ６８において約０．６ｋｂのバ
ンドを検出を与えた。図１６に示した結果は、サザーン分析により検出された約
７００ｂｐの欠失がプラスミドｐＣＩＩＩΔにより運ばれたもの(６３３ｂｐ)と
同じであることを確認した。PCR amplification was performed using oligonucleotide C3-S above and an oligonucleotide having the following sequence: C3-R TCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID NO: 33) (located at positions 8954-8974 of the sequence of FIG. 2) Framing by PCR amplification of a region corresponding to the sequence to be deleted and having an internal deletion in ORF8). Analysis by PCR amplification gave detection of an approximately 1.2 kb band in the wild type strain and an approximately 0.6 kb band in the mutant CIII68 in the same manner as the signal obtained with pBIIdelta. The results shown in FIG. 16 confirmed that the approximately 700 bp deletion detected by Southern analysis was the same as that carried by plasmid pCIIIΔ (633 bp).
【０１３１】 こうして得られた組換え株(ＣＩＩＩ６８と呼ばれる)を、次いで、この株によ
り生成される代謝産物を同定するために培養した。The resulting recombinant strain (designated CIII68) was then cultured to identify the metabolites produced by this strain.
【０１３２】実施例７ ：ＣＩＩＩ６８株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 ＣＩＩＩ６８株の培養及びＴＬＣとその後のバイオオートグラフィーによる分
析を実施例４に示した条件に従って行った。 Example 7 : Fermentation of strain CIII68 and identification of secondary metabolites produced CIII68 strain was cultured and analyzed by TLC and subsequent bioautography according to the conditions described in Example 4.
【０１３３】 これらのＴＬＣの結果(図１７)は、ＣＩＩ６８株が、ｅｒｙＣ変異体に予想さ
れるように、優先的に、３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ並びに少量のエリ
スロノリドＢを蓄積することを示している。These TLC results (FIG. 17) show that strain CII68 preferentially accumulates 3-α-mycarosyl erythronolide B as well as small amounts of erythronolide B, as expected for the eryC mutant. It indicates that you want to.
【０１３４】 ｅｒｙＣＩＩＩ配列は、他の推定のグルコシルトランスフェラーゼ例えばS. p
euceticus(Otten等、1995)及びStreptomyces sp C5 (Dickens等、1996)における
ダウノルビシンの生合成に関与するＤａｕＨ(蛋白質レベルで４３％同一性)及び
ＤｎｒＳ(４７％同一性)並びにS. fradiae中でのチロシンの生合成経路における
ミカミノースのチラクトン上への移送に関与するＴｙｌＭ２(５０％同一性)と強
い相同性を有する(Gandecha等、1997)。The eryCIII sequence may contain other putative glucosyltransferases such as S. p.
eauticus (Otten et al., 1995) and DauH (43% identity at the protein level) and DnrS (47% identity) involved in the biosynthesis of daunorubicin in Streptomyces sp C5 (Dickens et al., 1996) and in S. fradiae. It has strong homology to TylM2 (50% identity), which is involved in the transfer of mycaminonose onto tylactone in the tyrosine biosynthetic pathway (Gandecha et al., 1997).
【０１３５】 これらの観察は、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子がエリスロマイシンの生合成経路にお
けるデソサミニルトランスフェラーゼをコードすることを示す。These observations indicate that the eryCIII gene encodes a desosaminyltransferase in the erythromycin biosynthetic pathway.
【０１３６】実施例８ ：プラスミドｐＣＩＩΔの構築 ｐＣＩＩΔと呼ばれ且つＯＲＦ９をコードするｅｒｙＢＩＩ遺伝子中に欠失を
有する組込みプラスミドを、図８Ａの図式に従って構築した。 Example 8 : Construction of plasmid pCIIΔ An integration plasmid called pCIIΔ and having a deletion in the eryBII gene encoding ORF9 was constructed according to the scheme of FIG. 8A.
【０１３７】 プラスミドｐＫ２３(図５Ａ)を、ＫｐｎＩ制限酵素により消化したクローンλ
ＳＥ５．５のＤＮＡから単離された１０ｋｂのＫｐｎＩ断片をｐＵＣ１９中にサ
ブクローニングすることにより得た。Plasmid pK23 (FIG. 5A) was digested with KpnI restriction enzyme
A 10 kb KpnI fragment isolated from SE5.5 DNA was obtained by subcloning into pUC19.
【０１３８】 先ず第一に、図８Ｂに示したシャトルベクターｐＯＲＴ１を、チオストレプト
ン耐性遺伝子及びストレプトミセスレプリコンを含むプラスミドｐＩＪ４８６の
ＰｓｔＩ制限酵素での消化により単離した４ｋｂのＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１９の
ＰｓｔＩ部位にサブクローニングすることにより得た。First, the shuttle vector pORT1 shown in FIG. 8B was isolated from the 4 kb PstI fragment isolated by digestion of the plasmid pIJ486 containing the thiostrepton resistance gene and the Streptomyces replicon with the PstI restriction enzyme. Obtained by subcloning into the site.
【０１３９】 ３０４ｂｐの相外(out-of-phase)欠失を、ＯＲＦ９中に、図２の配列のヌクレ
オチド１０８８１〜１１１８４に、プラスミドｐＫ２３のＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断
片(１．１ｋｂ)を、実施例１で得たプラスミドｐＥｃｏ２のＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ
Ｉ断片(１．７ｋｂ)と共に、予めＳａｃＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した上記
のプラスミドｐＯＲＴ１中にサブクローニングすることにより導入した。こうし
て得られた組込みプラスミドｐＣＩＩ(図８Ｃ)を、次いで、大腸菌ＤＨ５αＭＲ
Ｃ株中に移してからSac. erythraeaをトランスフォームするのに用いた。The 304 bp out-of-phase deletion was performed by placing the SacI-KpnI fragment of plasmid pK23 (1.1 kb) in ORF9 at nucleotides 10881-11184 of the sequence of FIG. EcoRI-Kpn of plasmid pEco2 obtained in
It was introduced together with the I fragment (1.7 kb) by subcloning into the above plasmid pORT1, which had been digested with SacI and EcoRI restriction enzymes in advance. The thus obtained integration plasmid pCII (FIG. 8C) was then transformed into E. coli DH5αMR.
After transfer into strain C, it was used to transform Sac. Erythraea.
【０１４０】実施例９ ：Sac. erythraeaｅｒｙＣＩＩΔ株(ＣＩＩ６２)の構築 ｅｒｙＣＩＩ遺伝子が実施例８で得たプラスミドｐＣＩＩΔに導入したような
内部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストをプラスミドｐＣＩＩ
Δを用いてトランスフォームすることにより調製した。 Example 9 : Construction of Sac. Erythraeaery CIIΔ strain (CII62) A strain having an internal deletion such that the eryCII gene was introduced into the plasmid pCIIΔ obtained in Example 8 was replaced with a Sac. Erythraea protoplast of plasmid pCII.
Prepared by transforming with Δ.
【０１４１】 これらのプロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する 変異体の選択は、実施例３のようにして行った。The preparation of these protoplasts, the integration process and the selection of variants with an ery - phenotype were performed as in Example 3.
【０１４２】 更に、染色体中に予想される欠失(図２の配列のヌクレオチド１０８８１〜１ １１８４の３０４ｂｐ)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザーンブロ ット並びにＰＣＲによるゲノム分析により確認した。In addition, the presence of the expected deletion in the chromosome (304 bp of nucleotides 10881-11184 in the sequence of FIG. 2) was confirmed by Southern blotting according to the conditions described in Example 3 and by genomic analysis by PCR. .
【０１４３】 上記の配列を有するオリゴヌクレオチドＣ３−Ｓをプローブとして用いるＥｃ
ｏＲＩ制限酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼー
ションを用いて、２．２ｋｂのバンドが野生型株から、１．８ｋｂのバンドが変
異体ＣＩＩ６２から検出された。図１５に示したこれらの結果は、変異体におけ
る染色体のこの領域内の約４００ｂｐの欠失の存在を示している。Ec using oligonucleotide C3-S having the above sequence as a probe
Using Southern hybridization to genomic DNA digested with the oRI restriction enzyme, a 2.2 kb band was detected from the wild-type strain and a 1.8 kb band was detected from the mutant CII62. These results, shown in FIG. 15, indicate the presence of an approximately 400 bp deletion in this region of the chromosome in the mutant.
【０１４４】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチド Ｃ２−Ｓ GGAATTCATGACCACGACCGATC (SEQ ID NO:３４) (参照番号Ｘ６２５６９でＥＭＢＬベースに寄託され、Bevitt等、1992により記 載された配列の２０２５８〜２０２８０位に位置するｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子の末
端のＤＮＡ領域の相補鎖に対応する)及び下記の配列 Ｃ２−Ｒ CGCTCCAGGTGCAATGCCGGGTGCAGGC (SEQ ID NO:３５) (図２の配列の１０５５８〜１０５８５位に位置する配列に対応し、ＯＲＦ９に 内部欠失を有する領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)を有する オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅による分析は、プ
ラスミドｐＣＩＩΔで得られたシグナルと同じ様式で、野生型株において約７６
０ｂｐのバンドを、変異体ＣＩＩ６２において約４６０ｂｐのバンドの検出を与
えた。図１６に示した結果は、サザーン分析により検出された約４００ｂｐの欠
失がプラスミドｐＣＩＩΔにより運ばれたもの(３０４ｂｐ)と同じであることを
確認した。Oligonucleotide having the following sequence C2-S GGAATTCATGACCACGACCGATC (SEQ ID NO: 34) (deposited at EMBL base under reference number X62569 and located at positions 20258-20280 of the sequence described by Bevitt et al., 1992) (corresponding to the complementary strand of the DNA region at the end of the eryAIII gene) and the following sequence C2-R CGCTCCAGGTGCAATGCCGGGTGCAGGC (SEQ ID NO: 35) (corresponding to the sequence located at positions 10558 to 10585 of the sequence in FIG. PCR amplification was performed using oligonucleotides having a deletion framing of the region by PCR amplification. Analysis by PCR amplification showed that in the same manner as the signal obtained with plasmid pCIIΔ, about 76
The 0 bp band gave detection of an approximately 460 bp band in mutant CII62. The results shown in FIG. 16 confirmed that the approximately 400 bp deletion detected by Southern analysis was the same as that carried by plasmid pCIIΔ (304 bp).
【０１４５】 こうして得られた組換え株(ＣＩＩ６２と呼ばれる)を、次いで、この株により
生成される代謝産物を同定するために培養した。The resulting recombinant strain (designated CII62) was then cultured to identify the metabolites produced by this strain.
【０１４６】実施例１０ ：ＣＩＩ６２株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 ＣＩＩ株の培養及びＴＬＣとその後のバイオオートグラフィーによる分析を、
実施例４に示した条件に従って行った。 Example 10 : Fermentation of strain CII62 and identification of secondary metabolites produced. Culture of strain CII and analysis by TLC and subsequent bioautography were performed as follows.
This was performed according to the conditions described in Example 4.
【０１４７】 これらのＴＬＣの結果(図１７)は、ＣＩＩ６２株が、ｅｒｙＣ変異体に予想さ
れるように、優先的に３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ並びに少量のエリス
ロノリドＢを蓄積することを示している。These TLC results (FIG. 17) show that strain CII62 preferentially accumulates 3-α-mycarosyl erythronolide B as well as small amounts of erythronolide B, as expected for the eryC mutant. It is shown that.
【０１４８】 ｅｒｙＣＩＩ配列は、ダウノサミン(ＤｎｒＱ、蛋白質レベルで３８％同一性 、Otten等、1995)及びミカミノース(ＯＲＦ１*によりコードされる蛋白質、蛋白
質レベルで４０％同一性、Gandecha等、1997)の生合成経路に関与する遺伝子(ケ
ト基を隣接する炭素から３位に移すのにも必要である)と強い相同性を有する。The eryCII sequence was produced from daunosamine (DnrQ, 38% identity at the protein level, Otten et al., 1995) and micaminose (protein encoded by ORF1 * , 40% identity at the protein level, Gandecha et al., 1997). It has strong homology to genes involved in the synthetic pathway (which is also necessary to move the keto group from the adjacent carbon to position 3).
【０１４９】 これらの観察は、ｅｒｙＣＩＩ遺伝子が、ｄＴＤＰ−デソサミンの生合成経路
におけるｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラー
ゼをコードすることを示している。These observations indicate that the eryCII gene encodes dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase in the dTDP-desosamine biosynthetic pathway.
【０１５０】実施例１１ ：エリスロマイシン生合成遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙ
Ｋ領域のクローニング及び配列決定 ｅｒｙ遺伝子のクラスターのｅｒｙＡＩ−ｅｒｙＫ領域を含むコスミド例えば
コスミドＣｏｓ６Ｂを、コスミドベクターｐＷＥ１５(Stratagene)中のSac. ery
thraeaのゲノムＤＮＡライブラリーを、ｅｒｙＡＩ遺伝子の全体を含む１３．２
ｋｂのプローブＤＮＡ断片(図３の配列の４４３８２位に位置するＮｃｏＩ部位 とＸ６２５６９配列(Bevitt等、1992)の３９２位に位置するＮｃｏＩ部位との間
に含まれるＤＮＡ領域に対応する)を用いてスクリーニングすることにより単離 した。このプローブを、次の仕方で調製した：先ず、１３．２ｋｂのＮｃｏＩ断
片をBevitt等、1992に記載されたプラスミドｐＢＫ２５から単離し、ＮｃｏＩ末
端をクレノー断片を用いて埋めた後にｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位中にサブクロー
ニングした。こうして生成したプラスミドｐＮＣＯ１２から、１３．２ｋｂの断
片を、ＮｃｏＩ制限酵素での消化により単離した。 Example 11 : eryAI-ery of erythromycin biosynthesis gene cluster
Cloning and Sequencing of the K Region A cosmid containing the eryAI-eryK region of the ery gene cluster, such as cosmid Cos6B, was cloned into Sac. Ery in the cosmid vector pWE15 (Stratagene).
A thraea genomic DNA library was constructed with 13.2 containing the entire eryAI gene.
Using the kb probe DNA fragment (corresponding to the DNA region contained between the NcoI site located at position 44382 in the sequence of FIG. 3 and the NcoI site located at position 392 of the X62569 sequence (Bevitt et al., 1992)) It was isolated by screening. This probe was prepared in the following manner: first, a 13.2 kb NcoI fragment was isolated from the plasmid pBK25 described in Bevitt et al. Was subcloned. From the plasmid pNCO12 thus generated, a 13.2 kb fragment was isolated by digestion with the NcoI restriction enzyme.
【０１５１】 こうして得たコスミドｃｏｓ６Ｂを、ＮｃｏＩ制限酵素により消化し、生成し
た２．８ｋｂ及び６．１ｋｂの断片をベクターＬｉｔｍｕｓ２８のＮｃｏＩ部位
にクローン化して、それぞれ、図５Ｂに示したプラスミドｐＮＣＯ２８及びｐＮ
ＣＯ６２を生成した。The cosmid cos6B thus obtained was digested with the NcoI restriction enzyme, and the resulting 2.8 kb and 6.1 kb fragments were cloned into the NcoI site of the vector Litmus28, and the plasmids pNCO28 and pN shown in FIG. 5B, respectively.
CO62 was produced.
【０１５２】 プラスミドｐＮＣＯ２８を、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅキット(Promega)の供 給業者の指示に従って、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いてサブクローンを生成
することにより、それぞれ逆向きに、制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩ及びＮｓｉＩ
／ＢａｍＨＩでの消化により配列決定した。この配列を、下記の配列を有する合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて完成させた ６４４ GATCACGCTCTTCGAGCGGCAG (SEQ ID NO:３６) ６４５ GAACTCGGTGGAGTCGATGTC (SEQ ID NO:３７)及び ６５０ GTTGTCGATCAAGACCCGCAC (SEQ ID NO:３８)。Plasmid pNCO28 was subcloned with exonuclease III according to the supplier's instructions of the Erase-a-Base kit (Promega), thereby reversing the restriction enzymes SacI / XbaI and NsiI, respectively.
Sequenced by digestion with / BamHI. This sequence was completed using a synthetic oligonucleotide having the following sequence as a primer: 644 GATCACGCTCTTCGAGCGGCAG (SEQ ID NO: 36) 645 GAACTCGGTGGAGTCGATGTC (SEQ ID NO: 37) and 650 GTTGTCGATCAAGACCCGCAC (SEQ ID NO: 38).
【０１５３】 プラスミドｐＮＣＯ６２の配列決定のために、テンプレートをBankier等(1987
)に従ってＤＮＡの超音波処理によりプライマーとしてｐＵＣ１８例えばベクタ ーを用いて生成した。この配列を、下記の配列を有する合成オリゴヌクレオチド
を用いて完成させた： ６４６ CATCGTCAAGGAGTTCGACGGT (SEQ ID NO:３９) ６４７ TGCGCAGGTCCATGTTCACCACGTT (SEQ ID NO:４０) ６４８ GCTACGCCCTGGAGAGCCTG (SEQ ID NO:４１) ６４９ GTCGCGGTCGGAGAGCACGAC (SEQ ID NO:４２)及び ８７４ GCCAGCTCGGCGACGTCCATC (SEQ ID NO:４３)。For sequencing plasmid pNCO62, the template was prepared using the method of Bankier et al. (1987).
) Was generated by sonication of the DNA using pUC18, eg, vector, as a primer. This sequence was completed using a synthetic oligonucleotide having the following sequence: 646 CATCGTCAAGGAGTTCGACGGT (SEQ ID NO: 39) 647 TGCGCAGGTCCATGTTCACCACGTT (SEQ ID NO: 40) 648 GCTACGCCCTGGAGAGCCTG (SEQ ID NO: 41) 649 GTCGCGGTCGGAGAGCACC ID NO: 42) and 874 GCCAGCTCGGCGACGTCCATC (SEQ ID NO: 43).
【０１５４】 ＮｃｏＩ接合部を、上で得たコスミドｃｏｓ６ＢのＤＮＡをテンプレートとし
て用いて配列決定した(ＮｃｏＩ部位をカバーするその領域を上記の配列６４４ 及び６４５を有するプライマーを用いて配列決定した)。The NcoI junction was sequenced using the cosmid cos6B DNA obtained above as a template (the region covering the NcoI site was sequenced using primers having sequences 644 and 645 above).
【０１５５】 更に、０．９ｋｂのＣｌａＩ−ＮｃｏＩ断片(ｅｒｙＡＩ遺伝子の配列の出発 点とＯＲＦ１３の５’部分を含む)をｐＵＣ１８中にクローン化した。この断片 を、次の仕方で調製した：図５Ｂに表示したプラスミドｐＢＫ６−１２を、Bevi
tt等、1992に記載されたプラスミドｐＢＫ２５から単離した４．５ｋｂのＫｐｎ
Ｉ断片をファージミドｐＴＺ１８Ｒ中にサブクローニングすることにより最初に
生成した。次いで、サブクローンｐＣＮ９を、プラスミドｐＢＫ６−１２から単
離した０．９ｋｂのＣｌａＩ−ＮｃｏＩ断片のｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位中のサ
ブクローニングにより生成した(クレノー断片を用いて末端を埋めた後に)。こう
して得たプラスミドｐＣＮ９(図５Ｂ)を配列決定した。テンプレートを、Bankie
r等(1987)に従って、ｐＵＣ１８をベクターとして用いて、ＤＮＡの超音波処理 により生成した。In addition, a 0.9 kb ClaI-NcoI fragment (including the starting point of the eryAI gene sequence and the 5 ′ portion of ORF13) was cloned into pUC18. This fragment was prepared in the following manner: Plasmid pBK6-12, shown in FIG.
A 4.5 kb Kpn isolated from the plasmid pBK25 described in tt et al., 1992.
The I fragment was first generated by subcloning into the phagemid pTZ18R. Subclone pCN9 was then generated by subcloning a 0.9 kb ClaI-NcoI fragment isolated from plasmid pBK6-12 into the SmaI site of pUC19 (after filling in the ends with the Klenow fragment). The plasmid pCN9 (FIG. 5B) thus obtained was sequenced. Template, Bankie
According to R et al. (1987), DNA was generated by sonication using pUC18 as a vector.
【０１５６】 この配列を、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて
完成させた： ８７５ CGACGAGGTCGTGCATCAG (SEQ ID NO:４４) 。This sequence was completed using an oligonucleotide having the following sequence as a probe: 875 CGACGAGGTCGTGCATCAG (SEQ ID NO: 44).
【０１５７】 このＤＮＡの配列決定を、サンガー法(1977)により自動シーケンサーを用いて
二本鎖ＤＮＡテンプレートについてApplied Biosystem 373 A シーケンサーを用
いて行った。配列データの編集は、ＳＡＰソフトウェア(Staden, 1984)を用いて
行った。これらの配列を、ＧＣＧソフトウェア(Devereux, 1984)を用いて分析し
た。The DNA was sequenced on a double-stranded DNA template using the Applied Biosystem 373A sequencer by the Sanger method (1977) using an automated sequencer. Editing of sequence data was performed using SAP software (Staden, 1984). These sequences were analyzed using GCG software (Devereux, 1984).
【０１５８】 得られたヌクレオチド配列は、図３の８１６０ｂｐのヌクレオチド配列(SEQ I
D NO:６の配列)を確立することを可能にしたが、この配列中には、７つのＯＲＦ
(１３−１９)が、それぞれ、ヌクレオチド４３８４１〜４４８０６、４４８０９
〜４６０５３、４６１０９〜４６８１９、４６９０７〜４８４３６、４８４３６
〜４９６３８、４９６７９〜５１１４５及び５１１７７〜５１７５５に同定され
(図３でｅｒｍＥ遺伝子の５’末端に位置するＢａｍＨＩ部位から番号付けした)
(それぞれ、SEQ ID NO:６の配列のヌクレオチド２４２〜１２０７、１２１０〜 ２４５４、２５１０〜３２２０、３３０８〜４８３７、４８３７〜６０３９、６
０８０〜７５４６及び７５７８〜８１５６である)、それぞれ、ｅｒｙＢＩＶ、 ｅｒｙＢＶ、ｅｒｙＣＶＩ、ｅｒｙＢＶＩ、ｅｒｙＣＩＶ、ｅｒｙＣＶ及びｅｒ
ｙＢＶＩＩ遺伝子に対応する(Liu及びThorson(1994)によるが、これらの機能的 特性決定は、未だ、同定されていなかった)。これらの７つのＯＲＦ(１３−１９
)は、同じ向きにあり、読みは、ｅｒｙＡＩ遺伝子の５’領域から行われる。The nucleotide sequence obtained was the nucleotide sequence of 8160 bp shown in FIG.
D NO: 6 sequence), which contained seven ORFs.
(13-19) has nucleotides 43841-44806 and 44809, respectively.
46053, 46109-46819, 46907-48436, 48436
49638, 49679-51145 and 51177-51755.
(Numbered from the BamHI site located at the 5 'end of the ermE gene in FIG. 3)
(Respectively, nucleotides 242-1207, 1210-2454, 2510-3220, 3308-4837, 4837-6039, 6 of the sequence of SEQ ID NO: 6
080-7546 and 7578-8156), eryBIV, eryBV, eryCVI, eryBVI, eryCIV, eryCV and er, respectively.
corresponding to the yBVII gene (according to Liu and Thorson (1994), but their functional characterization has not yet been identified). These seven ORFs (13-19)
) Are in the same orientation and readings are taken from the 5 'region of the eryAI gene.
【０１５９】 上記のＯＲＦのコード領域を含む大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの試料を、Collecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25
,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCEに、１９９７年７月１６日
に寄託した： − ＯＲＦ１３及びＯＲＦ１４の部分のコード領域を含むプラスミドｐＢＫ６−
１２(番号Ｉ−１８９８) − ＯＲＦ１４及び１５並びにＯＲＦ１３と１６の部分のコード領域を含むプラ
スミドｐＮＣＯ２８(番号Ｉ−１９０１)及び − ＯＲＦ１７、１８及び１９並びにＯＲＦ１６の部分のコード配列を含むプラ
スミドｐＮＣＯ６２(番号Ｉ−１９００)。A sample of Escherichia coli XL1-blue containing the coding region of the ORF described above was collected by Collecti.
on Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUTE PASTEUR, 25
, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCE, deposited on July 16, 1997:-Plasmid pBK6- containing the coding region of the ORF13 and ORF14 parts
12 (number I-1898)-plasmid pNCO28 (number I-1901) containing the coding regions of ORFs 14 and 15 and ORFs 13 and 16; and-plasmid pNCO62 (numbering of I-1900).
【０１６０】実施例１２ ：プラスミドｐＢＩＶΔの構築 ＯＲＦ１３は、翻訳において、下流に位置するＯＲＦ１４に結合されるので、
同相欠失を導入しなければならなかった。ｐＢＩＶΔと呼ばれ、この欠失を運ぶ
組込みプラスミドを、図９Ａの図式に従って構築した。 Example 12 : Construction of plasmid pBIVΔ ORF13 is linked to ORF14 located downstream in translation.
An in-phase deletion had to be introduced. An integration plasmid carrying this deletion, called pBIVΔ, was constructed according to the scheme in FIG. 9A.
【０１６１】 プラスミドｐＰＳＰ４(図５Ｂ)を、先ず、実施例１１で得たプラスミドｐＢＫ
６−１２から単離したＰｖｕＩＩ−ＳｐｅＩ断片(２．７ｋｂ)と実施例１１で得
たプラスミドｐＮＣＯ２８から単離したＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ断片(１．６ｋｂ)を
予めＳｍａＩ及びＰｓｔＩ制限酵素を用いて消化したベクターｐＵＣ１９中にサ
ブクローニングすることにより構築した。Plasmid pPSP4 (FIG. 5B) was firstly cloned into plasmid pBK obtained in Example 11.
The PvuII-SpeI fragment (2.7 kb) isolated from 6-12 and the SpeI-PstI fragment (1.6 kb) isolated from the plasmid pNCO28 obtained in Example 11 were previously digested with SmaI and PstI restriction enzymes. It was constructed by subcloning into the vector pUC19.
【０１６２】 プラスミドｐＰＳＰ４から、プラスミドｐＢＩＶΔを、ＯＲＦ１３の内部に５
１０ｂｐのＢｃｌＩ−ＮｃｏＩ断片を欠失させ且つ５４ｂｐの合成アダプターか
ら生じた４５ｂｐをその代わりとすることにより生成した。このアダプターは、
下記の配列 ＳＥＱＡ AATTGATCAAGGTGAACACGGTCATGCGCAGGATCCTCGAGCGGAACTCCATGGGG (SEQ ID NO:４５)及び ＳＥＱＢ CCCCATGGAGTTCCGCTCGAGGATCCTGCGCATGACCGTGTTCACCTTGATCAATT (SEQ ID NO:４６) を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドを対合させて４５ｂｐの配列をはさむ
ＢｃｌＩ部位及びＮｃｏＩ部位を造ることにより生成した。From plasmid pPSP4, plasmid pBIVΔ was inserted into ORF13 at 5
It was generated by deleting the 10 bp BclI-NcoI fragment and substituting the 45 bp resulting from the 54 bp synthetic adapter. This adapter is
The two complementary oligonucleotides having the sites SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 have the following sequences SEQA AATTGATCAAGGTGAACACGGTCATGCGCAGGATCCTCGAGCGGAACTCCATGGGG (SEQ ID NO: 45) and SEQB CCCCATGGAGTTCCGCTCGAGGATCCTGCGCATGACCGTGTTCACCTTGATCAATT (SEQ ID NO: 46). did.
【０１６３】 対合のために、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液(５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．４、２ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ)中で１．８μＭの終濃度にし、５分間１００℃に加熱し てからゆっくり周囲温度に冷却した。ＮｃｏＩ及びＢｃｌＩ制限酵素での消化の
後に、プラスミドｐＰＳＰ４中で結紮を行った(予め、該プラスミドの５１０ｂ ｐのＢｃｌＩ−ＮｃｏＩ断片を除去しておいた)。こうして生成したプラスミド ｐ１９ＢＩＶΔから、改変したＯＲＦ１３を有するＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片( ２．２ｋｂ)を、予めＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化したプラスミドｐ ＵＷＬ２１８中にサブクローニングした。こうして得られた組込みプラスミドｐ
ＢＩＶΔ(図９Ｂ)を、次いで、大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株中に移し、その後、Sac.
erythraeaをトランスフォームするのに用いた。For pairing, these two oligonucleotides were brought to a final concentration of 1.8 μM in hybridization buffer (50 mM NaCl, 20 mM Tris HCl pH 7.4, 2 mM MgCl 2 .6H 2 O) Heat to 100 ° C. for 5 minutes then slowly cool to ambient temperature. After digestion with NcoI and BclI restriction enzymes, ligation was performed in plasmid pPSP4 (the 510 bp BclI-NcoI fragment of the plasmid was previously removed). From the plasmid p19BIVΔ thus generated, a SacI-EcoRI fragment (2.2 kb) having the modified ORF13 was subcloned into the plasmid pUWL218 previously digested with SacI and EcoRI restriction enzymes. The thus obtained integrated plasmid p
BIVΔ (FIG. 9B) was then transferred into the E. coli DH5α MRC strain, followed by Sac.
erythraea was used to transform.
【０１６４】実施例１３ ：Sac. erythraeaｅｒｙＢＩＶΔ株(ＢＩＶ８７)の構築 ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子が実施例１２で得たプラスミドｐＢＩＶΔ中に導入した
ような内部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストのプラスミドｐ
ＢＩＶΔによるトランスフォーメーションにより調製した。 Example 13 : Construction of Sac. ErythraeaeryBIVΔ strain (BIV87) A strain having an internal deletion such that the eryCIII gene was introduced into the plasmid pBIVΔ obtained in Example 12 was transformed into a plasmid p of the Sac. Erythraea protoplast.
It was prepared by transformation with BIVΔ.
【０１６５】 プロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の 選択を実施例３のように行った。The preparation of protoplasts, the integration process and the selection of variants with the ery - phenotype were carried out as in Example 3.
【０１６６】 更に、染色体中に予想される欠失(図３の配列のヌクレオチド４３８７２〜４ ４３８２の５１０ｂｐの欠失)の存在及びその４５ｂｐの合成配列での置換を、 実施例３に記載した条件に従うサザーンブロット並びにＰＣＲによるゲノム分析
により確認した。In addition, the presence of the expected deletion in the chromosome (510 bp deletion of nucleotides 43872-44382 in the sequence of FIG. 3) and its replacement with a 45 bp synthetic sequence were determined by the conditions described in Example 3. And by genomic analysis by PCR.
【０１６７】 下記の配列を有するＢ４−Ｒオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＸＨ
ｏＩ制限酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーシ
ョンを用いて Ｂ４−Ｒ AACTCGGTGGAGTCGATGTCGTCGCTGCGGAA (SEQ ID NO:４７) （図３の配列の４４６８７〜４４７１８位に位置する相補鎖に対応する）、５．
４ｋｂのバンドを野生型株から、２．７ｋｂのバンドを変異体ＢＩＶ８７から検
出した。図１５に示したこれらの結果は、図３の配列の４７１１４位に位置する
ＸｈｏＩ部位の上流２．７ｋｂの距離にある追加のＸｈｏＩ部位の存在を示して
おり、それ故、この変異体染色体中のアダプターの取込み(プラスミドｐＢＩＶ Δの生成に用いた上記の合成アダプターの取込みにより予想される)を確認して いる。XH using a B4-R oligonucleotide having the following sequence as a probe
4. Using Southern hybridization to genomic DNA digested with the oI restriction enzyme, B4-RAACTCGGTGGAGTCGATGTCGTCGCTGCGGAA (SEQ ID NO: 47) (corresponding to the complementary strand located at positions 44687-44718 in the sequence of FIG. 3).
A 4 kb band was detected from the wild type strain and a 2.7 kb band was detected from mutant BIV87. These results, shown in FIG. 15, indicate the presence of an additional XhoI site 2.7 kb upstream of the XhoI site located at position 47114 of the sequence of FIG. 3, and therefore, in the mutant chromosome Incorporation (predicted by the incorporation of the above-mentioned synthetic adapter used to generate plasmid pBIVΔ).
【０１６８】 ＰＣＲ増幅を、下記の配列を有するオリゴヌクレオチド Ｂ４−Ｓ CAATATAGGAAGGATCAAGAGGTTGAC (SEQ ID NO:４８) (図３の配列の４３６５２〜４３６７８位に位置するＤＮＡ領域に対応する)及び
上記の配列を有するオリゴヌクレオチドＢ４−Ｒ(ＯＲＦ１３に内部欠失を有す る領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)を用いて行った。ＰＣＲ 増幅による分析は、野生型株において約１ｋｂのバンドを、変異体ＢＩＶ８７に
おいて約５００ｂｐのバンドを、プラスミドｐＢＩＶ８７で得られたシグナルと
同じ様式で検出した(図１６)。PCR amplification was performed with oligonucleotide B4-S CAATATAGGAAGGATCAAGAGGTTGAC (SEQ ID NO: 48) (corresponding to the DNA region located at positions 43652-43678 in the sequence of FIG. 3) and the sequence described above. This was performed using oligonucleotide B4-R, which allows framing by PCR amplification of regions with internal deletions in ORF13. Analysis by PCR amplification detected an approximately 1 kb band in the wild-type strain and an approximately 500 bp band in the mutant BIV87 in the same manner as the signal obtained with plasmid pBIV87 (FIG. 16).
【０１６９】 サザーン分析及びＰＣＲの結果の全体は、５１０ｂｐの欠失及び合成アダプタ
ーの存在を変異体の染色体のレベルで確認した。The overall Southern analysis and PCR results confirmed the deletion of the 510 bp and the presence of the synthetic adapter at the chromosomal level of the mutant.
【０１７０】 こうして得られた組換え株(ＢＩＶ８７と呼ぶ)を、次いで、その株により生成
される代謝産物を同定するために培養した。The resulting recombinant strain (designated BIV87) was then cultured to identify metabolites produced by the strain.
【０１７１】実施例１４ ：ＢＩＶ８７株の発酵及び生成された二次代謝産物の同定 ＢＩＶ８７株の培養及びＴＬＣによる分析を、実施例４に示した条件に従って
行った。 Example 14 Fermentation of BIV87 Strain and Identification of Secondary Metabolites Produced The cultivation of BIV87 strain and analysis by TLC were carried out in accordance with the conditions described in Example 4.
【０１７２】 ＴＬＣの結果(図１７)は、ＢＩＶ８７株が、ｅｒｙＢ変異体に予想されるよう
に、優先的にエリスロノリドＢを蓄積することを示している。The TLC results (FIG. 17) show that strain BIV87 accumulates erythronolide B preferentially, as expected for the eryB mutant.
【０１７３】 抗生物質活性を示す低い移動度の少ない代謝産物も検出された。これらの代謝
産物を抽出して、実施例４に記載したように、質量分析法と結合したＲＰ−ＨＰ
ＬＣにより分析した。Low, low-mobility metabolites exhibiting antibiotic activity were also detected. These metabolites were extracted and RP-HP coupled to mass spectrometry as described in Example 4.
Analyzed by LC.
【０１７４】 質量スペクトルの結果は、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの改変型が生成
されたことを示している。主要代謝産物及び３つの少量代謝産物が検出された。The mass spectrum results indicate that modified forms of erythromycin A, B, C and D were produced. The major metabolite and three minor metabolites were detected.
【０１７５】 主要な代謝産物Ｍ５は、親ピークをｍ／ｚ７０２に、加水分解及び断片化生成
物をｍ／ｚ６８４、ｍ／ｚ５６０及びｍ／ｚ１５８に生じ、エリスロマイシンＤ
における２水素原子の除去に対応する(ｍ／ｚ７０４、ｍ／ｚ６８６)。デソサミ
ニルエリスロマイシンＢ(５６０の断片ｍ／ｚ)の存在は、質量の差異が中性糖に
より運ばれることを示している。この代謝産物について提案される構造は、４”
−ケトエリスロマイシンＤである。The major metabolite M5 has a parent peak at m / z 702, hydrolysis and fragmentation products at m / z 684, m / z 560 and m / z 158, and erythromycin D
(M / z 704, m / z 686). The presence of desosaminylerythromycin B (560 fragment m / z) indicates that the difference in mass is carried by the neutral sugar. The proposed structure for this metabolite is 4 "
-Ketoerythromycin D.
【０１７６】 少ない代謝産物も又、それぞれ、ｍ／ｚの値に２の差を有するプロフィルを生
じる： − Ｍ６(７１８のｍ／ｚ、ｍ／ｚ７００、ｍ／ｚ５７６、ｍ／ｚ１５８)(エリ スロマイシンＣについてのｍ／ｚ７２０、ｍ／ｚ７０２の代わりに) − Ｍ７(７３２のｍ／ｚ、ｍ／ｚ７１４、ｍ／ｚ５７６、ｍ／ｚ１５８)(エリ スロマイシンＡについてのｍ／ｚ７３４、ｍ／ｚ７１６の代わりに) − Ｍ８(７１６のｍ／ｚ、ｍ／ｚ６９８、ｍ／ｚ５６０、ｍ／ｚ１５８)(エリ スロマイシンＢについてのｍ／ｚ７１８、ｍ／ｚ７００の代わりに)。The small metabolites also each result in a profile with a difference in m / z value of 2: M6 (718 m / z, m / z 700, m / z 576, m / z 158) (erythromycin M / z 720 for C, instead of m / z 702)-M7 (732 m / z, m / z 714, m / z 576, m / z 158) (for m / z 734, m / z 716 for erythromycin A) M8 (m / z at 716, m / z 698, m / z 560, m / z 158) (instead of m / z 718 for erythromycin B, m / z 700).
【０１７７】 提案される構造は、それぞれ、Ｍ６は、４”−ケトエリスロマイシンＣであり
、Ｍ７は、４”−ケトエリスロマイシンＡであり、Ｍ８は、４”−ケトエリスロ
マイシンＢである。The proposed structures are as follows: M6 is 4 "-ketoerythromycin C; M7 is 4" -ketoerythromycin A; and M8 is 4 "-ketoerythromycin B.
【０１７８】 これらの観察は、ｅｒｙＢＩＶが、ｄＴＤＰ−ミカロースの生合成経路におけ
るｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼをコード
するということを示す。These observations indicate that eryBIV encodes dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase in the dTDP-micalose biosynthetic pathway.
【０１７９】 ＢＩＶ８７株を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C
NCM) INSTITUTE PASTEUR, 25,Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRAN
CEに、１９９７年７月１６日に、番号Ｉ−１９０４で寄託した。The BIV87 strain was transferred to the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C
NCM) INSTITUTE PASTEUR, 25, Rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX 15 FRAN
Deposited with the CE on July 16, 1997, under the number I-1904.
【０１８０】実施例１５ ：プラスミドｐＢＶΔの構築 ｐＢＶΔという、ＯＲＦ１４をコードするｅｒｙＢＶ遺伝子中に欠失を運ぶ組
込みプラスミドを、図１０Ａの図式に従って構築した。 Example 15 : Construction of plasmid pBVΔ An integration plasmid carrying the deletion in the eryBV gene encoding ORF14, called pBVΔ, was constructed according to the scheme of FIG. 10A.
【０１８１】 図３の配列のヌクレオチド４４９６３〜４５６８８の７２６ｂｐの欠失を、実
施例１１で得たプラスミドｐＢＫ６−１２から単離したＢｃｌＩ−ＫｐｎＩ断片
(１．１ｋｂ)と実施例１１で得たプラスミドｐＮＣＯ２８から単離したＫｐｎＩ
−ＢａｍＨＩ断片(１．１ｋｂ)との連結により、ＯＲＦ１４中に生成した（予め
ＢａｍＨＩ制限酵素で消化したプラスミドｐＵＷＬ２１８中に）。こうして得た
組込みプラスミドｐＢＶΔ(図１０Ｂ)を、次いで、大腸菌ＤＨ５αＭＲＣ株に移
し、その後、Sac. erythraeaをトランスフォームするのに用いた。A BclI-KpnI fragment isolated from the plasmid pBK6-12 obtained in Example 11 by deleting a 726 bp deletion of nucleotides 44963-45688 of the sequence of FIG.
(1.1 kb) and KpnI isolated from plasmid pNCO28 obtained in Example 11.
-Was generated in ORF14 by ligation with a BamHI fragment (1.1 kb) (in plasmid pUWL218 previously digested with BamHI restriction enzyme). The integration plasmid pBVΔ (FIG. 10B) thus obtained was then transferred to the E. coli DH5α MRC strain and subsequently used to transform Sac. Erythraea.
【０１８２】実施例１６ ：Sac. erythraeaｅｒｙＢＶΔ株(ＢＶ８８)の構築 ｅｒｙＢＶ遺伝子が実施例１５で得たプラスミドｐＢＶΔに導入したような内
部欠失を有する株を、Sac. erythraeaのプロトプラストのプラスミドｐＢＶΔで
のトランスフォーメーションにより調製した。 Example 16 : Construction of Sac. ErythraeaeryBVΔ strain (BV88) A strain having an internal deletion such that the eryBV gene was introduced into the plasmid pBVΔ obtained in Example 15 was used to construct the Sac. Erythraea protoplast plasmid pBVΔ. Prepared by transformation.
【０１８３】 これらのプロトプラストの調製、組込みプロセス及びｅｒｙ-表現型を有する 変異体の選択を、実施例３のようにして行った。The preparation of these protoplasts, the integration process and the selection of variants with an ery - phenotype were carried out as in Example 3.
【０１８４】 更に、染色体中に予想される欠失(図３の配列のヌクレオチド４４９６３〜４ ５６８８の７２６ｂｐの欠失)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザー ンブロット並びにＰＣＲ増幅によるゲノム分析により確認した。Furthermore, the presence of the expected deletion in the chromosome (deletion of 726 bp from nucleotides 44963 to 45688 of the sequence of FIG. 3) was determined by genomic analysis by Southern blot and PCR amplification according to the conditions described in Example 3. Confirmed by
【０１８５】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＮｃｏＩ制限
酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーションを用
いて：Using Southern hybridization to genomic DNA digested with NcoI restriction enzyme using oligonucleotides having the following sequences as probes:
【０１８６】 更に、染色体中に予想される欠失(図３の配列のヌクレオチド４４９６３〜４ ５６８８の７２６ｂｐの欠失)の存在を、実施例３に記載した条件に従うサザー ンブロット並びにＰＣＲ増幅によるゲノム分析により確認した。In addition, the presence of the predicted deletion in the chromosome (deletion of 726 bp from nucleotides 44963-45688 of the sequence of FIG. 3) was determined by genomic analysis by Southern blot and PCR amplification according to the conditions described in Example 3. Confirmed by
【０１８７】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＮｃｏＩ制限
酵素により消化したゲノムＤＮＡに対するサザーンハイブリダイゼーションを用
いて： Ｂ５−Ｒ TCCGGAGGTGTGCTGTCGGACGGACTTGTCGGTCGGAAA (SEQ ID NO:４９) (図３の配列の４６０６０〜４６０９８位に位置するＤＮＡ領域の相補鎖に対応 する)、２．７ｋｂのバンドを野生型株から、２．０ｋｂのバンドを変異体ＢＶ ８８から検出した。図１５に示したこれらの結果は、この変異体における、染色
体のこの領域内の約７００ｂｐの欠失の存在を示している。Using Southern hybridization to genomic DNA digested with NcoI restriction enzyme using an oligonucleotide having the following sequence as a probe: B5-R TCCGGAGGTGTGCTGTCGGACGGACTTGTCGGTCGGAAA (SEQ ID NO: 49) (46060-46098 of the sequence of FIG. 3) 2.7 kb band was detected from the wild-type strain, and a 2.0 kb band was detected from the mutant BV88. These results, shown in FIG. 15, indicate the presence of an approximately 700 bp deletion in this region of the chromosome in this mutant.
【０１８８】 下記の配列を有するオリゴヌクレオチド： Ｂ５−Ｓ AGGAGCACTAGTGCGGGTACTGCTGACGTCCTT (SEQ ID NO:５０) (図３の配列の４４７９９〜４４８３１位に位置するＤＮＡ領域に対応する)及び
上記の配列を有するオリゴヌクレオチドＢ５−Ｒ(ＯＲＦ１４に内部欠失を有す る領域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にする)を用いて、ＰＣＲ増幅を 行った。ＰＣＲ増幅による分析は、プラスミドｐＢＶ８８で得られたシグナルと
同じ様式で、約１．３ｋｂのバンドを野生型株において、約５７０ｂｐのバンド
を変異体ＢＶ８８において検出した(図１６)。これらの結果は、サザーン分析に
より検出された７１０ｂｐの欠失がプラスミドｐＢＶΔにより運ばれるもの(７ ２６ｂｐ)と同じであることを確認する。An oligonucleotide having the following sequence: B5-S AGGAGCACTAGTGCGGGTACTGCTGACGTCCTT (SEQ ID NO: 50) (corresponding to the DNA region located at positions 44799-44831 in the sequence of FIG. 3) and an oligonucleotide B5 having the above sequence PCR amplification was performed using -R (which allows framing by PCR amplification of a region having an internal deletion in ORF14). Analysis by PCR amplification detected an approximately 1.3 kb band in the wild type strain and an approximately 570 bp band in the mutant BV88 in the same manner as the signal obtained with plasmid pBV88 (FIG. 16). These results confirm that the 710 bp deletion detected by Southern analysis is the same as that carried by plasmid pBVΔ (726 bp).
【０１８９】 こうして得られた組換え株(ＢＶ８８という)を、次いで、その株により生成さ
れる代謝産物を同定するために培養した。The recombinant strain thus obtained (referred to as BV88) was then cultured to identify the metabolites produced by the strain.
【０１９０】例１７ ：ＢＶ８８株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 ＢＶ８８株の培養及びＴＬＣによる分析を例４に示した条件に従って実施した
。 ＴＬＣの結果（図１７）は、ＢＶ８８株がｅｒｙＢ変異体に期待されるように
エリスロノリドＢを優先的に蓄積することを示す。 低い易動性を有する少ない代謝産物も検出され、次いで抽出し、例４で使用し
た条件下で質量分光法を組合わせたＲＰ−ＨＰＬＣにより同定した。 質量スペクトルは、ｍ／ｚ５６０で親ピークを有する代謝産物及びｍ／ｚ５４
２及びｍ／ｚ１５８で脱水生成物及び断片化生成物であってその提案された構造
がデソサミニルエリスロノリドＢであるものの存在を示す。 ｅｒｙＢＶ配列は、他のグリコシルトランスフェラーゼ及び上記のｅｒｙＣＩ
ＩＩ遺伝子との強い相同性を示す（ヌクレオチドレベルで６０．７％の同一性、
蛋白質レベルで４４％同一性）。 これらの観察は、ｅｒｙＢＶ遺伝子がエリスロマイシンの生合成に係わるミカ
ロシルトランスフェラーゼをコード化することを示す。 Example 17 : Fermentation of strain BV88 and identification of secondary metabolites produced The cultivation of the strain BV88 and analysis by TLC were carried out according to the conditions described in Example 4. TLC results (FIG. 17) show that strain BV88 accumulates erythronolide B preferentially as expected for the eryB mutant. Small metabolites with low mobility were also detected and then extracted and identified by RP-HPLC combined with mass spectroscopy under the conditions used in Example 4. The mass spectrum shows the metabolite with parent peak at m / z 560 and m / z 54
2 and at m / z 158 indicate the presence of dehydration and fragmentation products whose proposed structure is desosaminylerythronolide B. The eryBV sequence is identical to other glycosyltransferases and the eryCI described above.
Shows strong homology to the II gene (60.7% identity at the nucleotide level,
44% identity at the protein level). These observations indicate that the eryBV gene encodes a mycarosyltransferase involved in erythromycin biosynthesis.
【０１９１】例１８ ：プラスミドｐＣＶＩΔ（ｐＰＳＴＩ）の構築 ｐＰＳＴＩと称され、ＯＲＦ１５をコード化するｅｒｙＣＶＩ遺伝子に欠失を
持っている組込みプラスミドを以下の態様で図１１Ａのダイアグラムに従って構
築した。 最初に、プラスミドｐＮＢ４９を、ＮｓｉＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により予
め消化させた例１１で得たプラスミドｐＮＣＯ２８をエキソヌクレアーゼＩＩＩ
で処理することによって生成させた。次いで、図３の配列のヌクレオチド４４３
８２〜４６５６２を含有するプラスミドｐＮＢ４９（図５）をＰｓｔＩ制限酵素
により消化させ、次いでサムブルック他、１９８９により報告されたようにヤエ
ナリ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）のヌクレアーゼ（ＮＥ ビオラブ社）により処理し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて再連結し、形質転換した後、アン
ピシリン耐性のコロニーをＰｓｔＩ酵素による制限分析により選択した。Ｐｓｔ
Ｉ部位の喪失を逆Ｍ１３プライマーを使用してクローンをシーケンシングするこ
とによって確認し、図３の配列のヌクレオチド４６３６４の欠失が観察され、し
かしてこのように生成させたプラスミドｐＮＢ４９ΔＰｓｔにおいてＯＲＦ１５
に相変化が作り出された。次いで、ＢｇｌＩＩ制限酵素により消化されたプラス
ミドｐＩＪ７０２を、プラスミドｐＰＳＴＩを生成するプラスミドｐＮＢ４９Δ
ＰｓｔのＢｇｌＩＩ部位と連結した。ｐＰＳＴＩにおけるｐＩＪ７０２の配向を
、ＳｐｈＩ制限酵素により消化させた後に０．９ｋｂを有するＤＮＡ断片の存在
により確認した。このようにして得られた組込みプラスミドｐＰＳＴＩ（図１１
Ｂ）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＲＣ株に移し、次いでＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａ
ｅａを形質転換するために使用した。 Example 18 : Construction of plasmid pCVIΔ (pPSTI) An integration plasmid, designated pPSTI and having a deletion in the eryCVI gene encoding ORF15, was constructed according to the diagram of FIG. 11A in the following manner. First, plasmid pNCO28 obtained in Example 11 obtained by previously digesting plasmid pNB49 with NsiI and BamHI restriction enzymes was used to prepare exonuclease III.
Generated by treating with. Then, nucleotides 443 of the sequence of FIG.
Plasmid pNB49 containing 82-46562 (FIG. 5) was digested with PstI restriction enzyme and then treated with mung bean nuclease (NE Biolab) as reported by Sambrook et al., 1989. E. FIG. After religation and transformation in E. coli XL1-Blue, ampicillin-resistant colonies were selected by restriction analysis with the PstI enzyme. Pst
The loss of the I site was confirmed by sequencing the clones using the reverse M13 primer, and a deletion of nucleotide 46364 of the sequence of FIG. 3 was observed, thus ORF15 in the plasmid pNB49ΔPst thus generated.
A phase change was created. Next, the plasmid pIJ702 digested with the BglII restriction enzyme was replaced with the plasmid pNB49Δ producing the plasmid pPSTI.
Ligation with the BglII site of Pst. The orientation of pIJ702 in pPSTI was confirmed by the presence of a DNA fragment having 0.9 kb after digestion with SphI restriction enzyme. The thus obtained integration plasmid pPSTI (FIG. 11)
B). coli DH5α MRC strain and then Sac. erythra
ea was used to transform.
【０１９２】例１９ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＥｒｙＣＶＩΔ株（Ｐｓｔ１０）の構築 ｅｒｙＢＶ遺伝子が例１８で得たプラスミドｐＰＳＴＩに導入されたもののよ
うな内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＰＳＴＩを有するＳａｃ．ｅｒｙ
ｔｈｒａｅａのプロトプラストの形質転換によって調製した。 プロトプラストの調製及び組込み方法は、例３のように実施した。 ｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択は、指標株としてＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ株 の代わりにエリスロマイシン感性のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を使用して例３にお
けるように実施した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＡＴＣＣ６６３３を使用して、分
析すべき変異体を接種し且つ３０℃で３日間インキュベ−ションしたＭ１−１０
２培地中の寒天皿上での生物学的試験でエリスロマイシンの産生を評価した。次
いで、細菌により覆われた寒天帯域をパンチで採取し、次いで２００μｌのＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ６６３３の培養物を含有するＴＹ培地中の５ｍｌの
寒天の上層で覆われた２個のＴＹ皿上に置き、次いで３７℃で一夜インキュベ−
ションした。 また、エリスロマイシンの産生の無いことを、切り抜かれた寒天帯域上のそれ
ぞれの代謝産物の１０ｍＭ溶液を１０μｌの量で適用し、次いで３０℃で終夜イ
ンキュベーションしてから皿を上記のようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養物で再
び覆うことによりエリスロノリドＢ又は３−α−ミカロシルエリスロノリドＢの
ような添加先駆物質の存在下に評価した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ“レッド
バリアント”野生型株を対照として使用した。 プロトプラストをプラスミドｐＰＳＴＩにより形質転換し、チオストレプトン
耐性のコロニーを選択した後に、染色体への組込みを例３に記載した一般的方法
に従うサザーン分析法により確認した。 次の配列： １４−１：GGGGGATCCCATATGCGGGTACTGCTGACGTCCTTCG（SEQ ID No.51）及び １４−２：GAAAAGATCTGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTC（SEQ ID No.52） を有する合成オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより生成させたＯＲＦ１４
に相当する１２６９ｐｂのＤＮＡ断片をプローブとして使用した。 １４−１オリゴヌクレオチドは、図３の配列の位置４４８１１〜位置４４８３
３に位置するＤＮＡ領域に相当する配列の上流にＢａｍＨＩ部位及びＮｄｅＩ部
位を導入するように設計した。 １４−２オリゴヌクレオチドは、図３の配列の位置４６０２７〜位置４６０５
３に位置するＤＮＡ領域の相補鎖に相当する配列の下流にＢｇｌＩＩ部位を導入
するように設計した。ＣｌａＩ及びＰｓｔＩ制限酵素により予め消化させた染色
体ＤＮＡはインテグラントから４ｋｂ及び７ｋｂの所期のバンドを示したが、野
生型株は３ｋｂの所期のバンドを示した。 インテグラントを繰り返し培養した後に、得られた個別化したコロニーをチオ
ストレプトンに対する感受性及びエリスロマイシンの産生について分析し、次い
でｅｒｙ-表現型を有する変異体クローン（Ｐｓｔ１０）の染色体への所期の失 欠（図３の配列のヌクレオチド４６３６４からの欠失）の組込みをサザーン分析
法により確認した。野生型株及びＰｓｔ１０変異体からそれぞれ単離された染色
体ＤＮＡをＰｓｔＩ制限酵素により消化させた。０．８ｋｂのＰｓｔＩ−Ｎｃｏ
Ｉプローブによるハイブリダイゼーションは、野生型株から図３の配列のヌクレ
オチド４６３６８〜４７３９７に相当する１ｋｂのＰｓｔＩバンド並びに変異体
からの＞２０ｋｂのバンドを有する所期のプロフィルを生じた。また、上記の位
置４６３６８でのＰｓｔＩ部位の喪失が、ＰｓｔＩ及びＮｃｏＩ酵素による二重
消化の後に示され、野生型株から０．８ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩバンド（ヌク
レオチド４６３６８〜４７１４２）及び変異体による２．８ｋｂのＮｃｏＩバン
ド（ヌクレオチド４４３８２〜４７１４２）を生じた。 次いで、このようにした得られた組換え株（Ｐｓｔ１０と称する）を、産生し
た代謝産物を同定するために培養した。 Example 19 : Sac. Construction of S. erythrea EryCVIΔ strain (Pst10) A strain having an internal deletion such as that in which the eryBV gene was introduced into plasmid pPSTI obtained in Example 18 was designated Sac. ery
thraea prepared by transformation of protoplasts. Protoplast preparation and incorporation procedures were performed as in Example 3. Selection of mutants having the ery - phenotype was performed using B. as a marker strain. erythromycin-sensitive B. pumilus strain Subtilis strain was used as in Example 3. B. Subtilis strain ATCC 6633 was used to inoculate the mutants to be analyzed and incubated at 30 ° C. for 3 days for M1-10.
Erythromycin production was assessed by biological tests on agar plates in medium 2. The bacterially covered agar zone was then punched out and then 200 μl of B.
C. subtilis ATCC 6633, placed on two TY dishes covered with a top layer of 5 ml agar in TY medium, then incubated at 37 ° C. overnight.
Was done. Also, the absence of erythromycin production was confirmed by applying a 10 μl solution of a 10 mM solution of each metabolite on the cut-out agar band, then incubating overnight at 30 ° C. before disposing the dish as described above. Subtilis cultures were evaluated by re-covering in the presence of added precursors such as erythronolide B or 3-α-mycarosyl erythronolide B. Sac. erythraea "red variant" wild type strain was used as a control. After transforming protoplasts with the plasmid pPSTI and selecting thiostrepton-resistant colonies, integration into the chromosome was confirmed by Southern analysis according to the general method described in Example 3. ORF14 generated by PCR using synthetic oligonucleotides having the following sequences: 14-1: GGGGGATCCCATATGCGGGTACTGCTGACGTCCTTCG (SEQ ID No. 51) and 14-2: GAAAAGATCTGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTC (SEQ ID No. 52)
A 1269 pb DNA fragment corresponding to was used as a probe. The 14-1 oligonucleotide corresponds to positions 44811 to 4483 of the sequence of FIG.
It was designed such that a BamHI site and an NdeI site were introduced upstream of the sequence corresponding to the DNA region located at position 3. The 14-2 oligonucleotide corresponds to positions 46027 to 4605 of the sequence of FIG.
It was designed to introduce a BglII site downstream of the sequence corresponding to the complementary strand of the DNA region located at position 3. Chromosomal DNA pre-digested with ClaI and PstI restriction enzymes showed the expected bands of 4 kb and 7 kb from the integrant, whereas the wild type strain showed the expected bands of 3 kb. After repeated culture of the integrant, the resulting individualized colonies were analyzed for susceptibility to thiostrepton and erythromycin production, and then the desired loss of the chromosome of the mutant clone with the ery - phenotype (Pst10) to the chromosome. Incorporation of the deletion (deletion from nucleotide 46364 of the sequence of FIG. 3) was confirmed by Southern analysis. Chromosomal DNA isolated from the wild-type strain and the Pst10 mutant, respectively, was digested with PstI restriction enzyme. 0.8 kb PstI-Nco
Hybridization with the I probe resulted in the desired profile with a 1 kb PstI band corresponding to nucleotides 46368-47397 of the sequence of FIG. 3 from the wild type strain as well as a> 20 kb band from the mutant. Also, loss of the PstI site at position 46368 above was shown after double digestion with PstI and NcoI enzymes, with a 0.8 kb PstI-NcoI band (nucleotides 46368-47142) from the wild-type strain and 2 mutants. A .8 kb NcoI band (nucleotides 44382-47142) resulted. The resulting recombinant strain (designated Pst10) was then cultured in order to identify the metabolite produced.
【０１９３】例２０ ：Ｐｓｔ１０株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 Ｐｓｔ１０株をカフレー他、１９９２により報告されたシュクロース・スクシ
ネート培地で３０℃で３日間培養した。次いで、培養物の上層液をｐＨ９で酢酸
エチルにより抽出した。得られた有機相をＭｇ2ＳＯ4で乾燥し、次いで減圧下に
乾固させた。残留物をアセトニトリル−水混合物（１：１、ｖ／ｖ）に溶解し、
次いでＢｉｏＱ（マイクロマス社、マンチェスター、英国）又はフィニンガンＬ
ＣＯ（フィニンガグ社、カナダ）分光計での質量分光法によって分析した。 エリスロマイシンＡの産生（ｍ／ｚ７３４及びｍ／ｚ７１６）は観察されなか
ったが、立証されたエリスロノリドＢ（ＭＫ＋：ｍ／ｚ４４１及びＭＮａ＋：ｍ
／ｚ４２５）並びに３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ（ＭＫ＋：ｍ／ｚ５８
５及びＭＮａ＋：ｍ／ｚ５６９）の存在はＰｓｔ１０株をｅｒｙＣ変異体として
特徴づける。 ｅｒｙＣＶＩ配列は、Ｓ．ｎｏｇａｌａｔｅｒ（受入番号ＥＭＢ ＬＳ５２４
０３）におけるノガラマイシンの生合成に係わるＳｎｏＸ（蛋白質レベルで５５
．５％の同一性）、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ（受入番号ＥＭＢＬ Ｘ８１８８５）に
よるチロシンの生合成に係わるＴｙｌＭ１（蛋白質レベルで６５％の同一性）、
及びＳ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ（受入番号ＥＭＢＬ Ｓ２５２０４）における
スピラマイシンの生合成に係わるＳｒｍＸ（蛋白質レベルで５２．８％の同一性
）ような他のメチルトランスフェラーゼとの強い相同性を示す。 これらの観察は、ｅｒｙＣＶＩ遺伝子がｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの生合成経
路に係わるｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース−３−Ｎ−メチルトランスフ
ェラーゼをコード化することを示す。 Example 20 : Fermentation of the Pst10 strain and identification of secondary metabolites produced The Pst10 strain was cultured in a sucrose succinate medium reported by Kaffle et al., 1992 at 30 ° C. for 3 days. The supernatant of the culture was then extracted at pH 9 with ethyl acetate. The resulting organic phase was dried over Mg 2 SO 4, then dryness allowed under reduced pressure. The residue was dissolved in an acetonitrile-water mixture (1: 1, v / v),
Then BioQ (Micromass, Manchester, UK) or Finingan L
Analyzed by mass spectroscopy on a CO (Finingag, Canada) spectrometer. Erythromycin A production (m / z 734 and m / z 716) was not observed, but demonstrated erythronolide B (MK +: m / z 441 and MNa +: m
/ Z425) and 3-α-mycarosylerythronolide B (MK +: m / z58).
5 and MNa +: m / z569) characterize the Pst10 strain as an eryC mutant. The eryCVI sequence was derived from S. elegans. nogalator (accession number EMB LS524
03) involved in the biosynthesis of nogalamycin (55 at the protein level).
. 5% identity); TylM1 (65% identity at the protein level) involved in tyrosine biosynthesis by S. fradiae (accession number EMBL X818885);
And S.I. It shows strong homology with other methyltransferases such as SrmX (52.8% identity at the protein level) involved in spiramycin biosynthesis in Ambofaciens (accession number EMBL S25204). These observations indicate that the eryCVI gene encodes dTDP-D-6-deoxyhexose-3-N-methyltransferase, which is involved in the biosynthetic pathway of dTDP-D-desosamine.
【０１９４】例２１ ：プラスミドｐＢＶＩΔ（ｐＸｈｏＩ）の構築 ｐＸｈｏＩと称され且つＯＲＦ１６をコード化するｅｒｙＢＶＩ遺伝子に欠失
を持っている組込みプラスミドを図１２Ａのダイアグラムに従って以下の態様で
構築した。 例１１で得られ且つ図３の配列のヌクレオチド４７１４２〜５０２５４を含有
するプラスミドｐＮＣＯ６２のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片（３．１ｋｂ）をプラス
ミドリトマス２８のＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ部位でサブクローニングした。このよ
うに生成したプラスミドｐＮＣＯ６２Ｘ（図５Ｂ）をＰｓｔＩ制限酵素により消
化し、次いでＤＮＡポリメラーゼＴ４（ベーリンガーマンハイム社）により処理
した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて再連結し、形質転換した後、図
３の配列のヌクレオチド４７３９７でのＰｓｔＩ部位の喪失をシーケンシングに
より確認し、図３の配列のヌクレオチド４７３３７からヌクレオチド４７３９７
までの６０ｐｂの欠失を観察した。次いで、ＢｇｌＩＩ制限酵素により消化させ
たプラスミドｐＩＪ７０２をこの構築物のＢｇｌＩＩ部位に連結した。この構築
物におけるｐＩＪ７０２の配向を、ＸｈｏＩ制限酵素により消化させた後に４．
３ｋｂを有するＤＮＡ断片の存在によて確認した。このようにして得られた組込
型プラスミドｐＸｈｏＩ（図１２Ｂ）をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換
するために使用した。 Example 21 : Construction of plasmid pBVIΔ (pXhoI) An integrated plasmid, designated pXhoI and having a deletion in the eryBVI gene encoding ORF16, was constructed according to the diagram of FIG. 12A in the following manner. The NcoI-XhoI fragment of plasmid pNCO62 (3.1 kb) obtained in Example 11 and containing nucleotides 47142 to 50254 of the sequence of FIG. 3 was subcloned into the NcoI and XhoI sites of plasmid litmus 28. The plasmid pNCO62X (FIG. 5B) thus generated was digested with PstI restriction enzyme and then treated with DNA polymerase T4 (Boehringer Mannheim). E. FIG. After religation and transformation in E. coli XL1-Blue, the loss of the PstI site at nucleotide 47397 of the sequence of FIG. 3 was confirmed by sequencing, and from nucleotide 47337 to nucleotide 47397 of the sequence of FIG.
Up to 60 pb deletion was observed. Plasmid pIJ702, digested with BglII restriction enzyme, was then ligated into the BglII site of this construct. 3. The orientation of pIJ702 in this construct was determined after digestion with XhoI restriction enzyme.
It was confirmed by the presence of a DNA fragment having 3 kb. The thus obtained integrative plasmid pXhoI (FIG. 12B) was used for Sac. erythraea.
【０１９５】例２２ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ｅｒｙＢＶＩΔ（Ｘｈｏ９１）の構築 ｅｒｙＢＶＩ遺伝子が例２１で得たプラスミドｐＸｈｏＩに導入されたものの
ような内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＸｈｏＩによるＳａｃ．ｅｒｙ
ｔｈｒａｅａのプロトプラストの形質転換によって調製した。 プロトプラストの調製及び組込み方法は、例３のように実施した。 ｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択及び分析は、例１９に記載した条件で実 施した。 染色体への組込み及び所期の欠失の存在は、例１９に記載した一般的方法に従
ってサザーン分析法により確認した。 プラスミドｐＸｈｏＩによるプロトプラストの形質転換及びチオストレプトン
耐性のコロニーの選択の後、染色体への組込みをサザーン分析法により確認した
。プラスミドｐＮＣＯ６２の３．３ｋｂのＰｓｔＩ断片をプローブとして使用す
ることによって、ＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素により予め消化させたインテ
グラントの染色体ＤＮＡは所期の３ｋｂ及び６ｋｂのバンドを示した。 インテグラントを繰り返し培養した後、得られた個性化したコロニーをチオス
トレプトンに対する感受性及びエリスロマイシンの産生について分析し、次いで
ｅｒｙ−表現型を有する変異体クローンの染色体（ＸｈｏＩ）への所期の欠失（
図３の配列のヌクレオチド４７３３８からヌクレオチド４７３９７までの６０ｐ
ｂの欠失）の組込みをサザーン分析法により確認した。それぞれ野生型株及び変
異体ＸｈｏＩから単離した染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ制限酵素により消化させた。
０．８ｋｂのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩプローブ（図３の配列のヌクレオチド４６３６
８〜４７１４２）によるハイブリダイゼーションは、野生型株から図３の配列の
ヌクレオチド４６３６８〜４７３９７に相当する１ｋｂのＰｓｔＩバンド及び変
異体から４ｋｂのバンドを有する予期したプロフィルを与え、上記の位置４７３
９７でのＰｓｔＩ部位が喪失したことを示した。 また、位置４７３９７でのＰｓｔＩ部位の喪失は、ＰＣＲにより確認された。
染色体ＤＮＡを、図３の配列のヌクレオチド４７３００〜ヌクレオチド５７３２
０の配列及びヌクレオチド４７６６１〜ヌクレオチド４７６３６にそれぞれ相当
するプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅処理に付した。このようにして、
ＰｓｔＩ制限酵素により消化させた後にほぼ１００及び３００ｂｐの２個のバン
ドを生成する野生型株から３０６ｂｐの予期した断片が増幅された。変異体Ｘｈ
ｏ９１から３００ｂｐの断片が増幅され、６０ｂｐの欠失を生じた。次いで、こ
の断片を単離し、ＰｓｔＩ酵素による消化に対して抵抗性であることがわかった
。 次いで、このようにして得られ、Ｘｈｏ９１と称される組換え株を培養して産
生する代謝産物を同定した。 Example 22 : Sac. Construction of erythraea strain eryBVIΔ (Xho91) A strain having an internal deletion such as that in which the eryBVI gene was introduced into plasmid pXhoI obtained in Example 21 was designated Sac. ery
thraea prepared by transformation of protoplasts. Protoplast preparation and incorporation procedures were performed as in Example 3. Selection and analysis of mutants having the ery - phenotype were performed under the conditions described in Example 19. Chromosomal integration and the presence of the desired deletion were confirmed by Southern analysis according to the general method described in Example 19. After transformation of protoplasts with plasmid pXhoI and selection of thiostrepton-resistant colonies, integration into the chromosome was confirmed by Southern analysis. By using the 3.3 kb PstI fragment of plasmid pNCO62 as a probe, the integrant chromosomal DNA previously digested with PstI and BglII restriction enzymes showed the expected 3 kb and 6 kb bands. After repeated culture of the integrant, the resulting individualized colonies were analyzed for susceptibility to thiostrepton and erythromycin production, and then the mutant clone with the ery-phenotype was cloned into the desired chromosome (XhoI). Lost (
60p from nucleotide 47338 to nucleotide 47397 of the sequence of FIG.
b deletion) was confirmed by Southern analysis. Chromosomal DNA isolated from wild-type strain and mutant XhoI, respectively, were digested with PstI restriction enzyme.
The 0.8 kb PstI-NcoI probe (nucleotide 4636 of the sequence of FIG. 3)
Hybridization according to SEQ ID Nos. 8 to 47142) gives the expected profile with a 1 kb PstI band corresponding to nucleotides 46368 to 47397 of the sequence of FIG.
It indicated that the PstI site at 97 was lost. Also, loss of the PstI site at position 47397 was confirmed by PCR.
The chromosomal DNA was converted from nucleotide 47300 to nucleotide 5732 of the sequence of FIG.
Amplification was performed by PCR using the sequence 0 and primers corresponding to nucleotides 47661 to 47636, respectively. In this way,
The expected fragment of 306 bp was amplified from a wild type strain that produced two bands of approximately 100 and 300 bp after digestion with the PstI restriction enzyme. Mutant Xh
A 300 bp fragment was amplified from o91, resulting in a 60 bp deletion. This fragment was then isolated and found to be resistant to digestion by the PstI enzyme. Then, the metabolites obtained by culturing the recombinant strain thus obtained and designated Xho91 were identified.
【０１９６】例２３ ：Ｘｈｏ９１株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 Ｘｈｏ９１株の培養及び培養上層液の質量分光法による分析を、例２０に記載
した条件に従って実施した。 エリスロマイシンＡの産生（ｍ／ｚ７３４及びｍ／ｚ７１６）は観察されなか
ったが、証明された過半量のエリスロノリドＢの存在（ＭＫ+：ｍ／ｚ４４１； ＭＮａ+：ｍ／ｚ４２５；Ｍ−Ｈ2Ｏ Ｈ+：ｍ／ｚ３８５）並びにデソサミニル エリスロノリドＢの存在（ｍ／ｚ５６０）はＰｓｔ１０株をｅｒｙＢ変異体とし
て特徴づける。 質量分光法の結果は、ブルッカーＦＴ−ＩＣＲ分光計での高分解能質量分光法
により確認された。 ｅｒｙＢＶＩ配列は、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ（受入番号ＥＭＢＬ Ｕ７７８
９１）におけるダウノルビシンの生合成に係わるＤｎｍＴとの強い相同性を有す
る（蛋白質レベルで４３．９％の同一性）。 これらの観察は、ｅｒｙＢＶＩ遺伝子がスコッチ及びハッチンソン、１９９６
により示唆されたように、ｄＴＤＰ−ミカロースの生合成に係わるｄＴＤＰ−４
−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼをコード化するこ
とを示す。 Example 23 : Fermentation of strain Xho91 and identification of secondary metabolites produced The culture of strain Xho91 and analysis of the culture supernatant by mass spectrometry were carried out according to the conditions described in Example 20. Erythromycin A production (m / z 734 and m / z 716) was not observed, but the presence of a proven majority of erythronolide B (MK + : m / z 441; MNa + : m / z 425; M-H 2 O) H + : m / z 385) as well as the presence of desosaminyl erythronolide B (m / z 560) characterize strain Pst10 as an eryB mutant. Mass spectroscopy results were confirmed by high resolution mass spectroscopy on a Brooker FT-ICR spectrometer. The eryBVI sequence is S. peeucetius (accession number EMBL U778
91) has strong homology with DnmT involved in the biosynthesis of daunorubicin (43.9% identity at the protein level). These observations indicate that the eryBVI gene was transformed by Scotch and Hutchinson, 1996.
DTDP-4 involved in the biosynthesis of dTDP-mycarose, as suggested by
-Keto-L-6-deoxyhexose 2,3-dehydratase.
【０１９７】例２４ ：プラスミドｐＣＩＶΔの構築 ｐＣＩＶΔと称され、ＯＲＦ１７をコード化するｅｒｙＣＩＶ遺伝子に欠失を
持っている組込みプラスミドを以下の態様で図１３Ａのダイアグラムに従って構
築した。 例１１で得たプラスミドｐＮＣＯ６２を、ＢａｌＩ及びＢｃｌＩ制限酵素を使
用して、図３の配列のヌクレオチド４８６５０〜ヌクレオチド４９５９８のＯＲ
Ｆ１７内の９４９ｂｐを有する断片を除去するように消化した。ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片を使用して末端に充填した後に、プラスミドをＥ．ｃｏｌ
ｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて再連結し、形質転換した。このようにして生成し
たプラスミドｐＢＣＢ１７から、欠失を持っている２．６８ｋｂの断片をＸｂａ
Ｉ及びＳｐｈＩ酵素を使用して消化させることにより単離し、次いでプラスミド
ｐＵＷＬ２１８に相当する部位においてサブクローニングした。図３の配列のヌ
クレオチド４８６５０からヌクレオチド４９５９８までの９４９ｂｐの欠失の存
在をシーケンシングすることにより確認した。次いで、このようにして得られた
組込型プラスミドｐＣＩＶΔ（図１３Ｂ）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＲＣ株に
移し、次いでＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換するのに使用した。 Example 24 : Construction of plasmid pCIVΔ An integration plasmid, designated pCIVΔ, which has a deletion in the eryCIV gene encoding ORF17, was constructed according to the diagram of FIG. 13A in the following manner. The plasmid pNCO62 obtained in Example 11 was ORed with nucleotides 48650 to 49598 of the sequence of FIG. 3 using BalI and BclI restriction enzymes.
Digestion was performed to remove the fragment having 949 bp in F17. After filling in the ends using the Klenow fragment of DNA polymerase I, the plasmid was col
Re-ligated in iXL1-Blue and transformed. From the plasmid pBCB17 thus generated, a 2.68 kb fragment containing the deletion was replaced with Xba
It was isolated by digestion using the I and SphI enzymes and then subcloned at a site corresponding to plasmid pUWL218. The presence of a 949 bp deletion from nucleotide 48650 to nucleotide 49598 of the sequence of FIG. 3 was confirmed by sequencing. Next, the thus obtained integrative plasmid pCIVΔ (FIG. 13B) was used in E. coli. coli DH5α MRC strain and then Sac. erythraea.
【０１９８】例２５ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ｅｒｙＣＩＶΔ（ＣＩＶ８９）の構築 ｅｒｙＣＩＶ遺伝子が例２４で得たプラスミドｐＣＩＶΔに導入されたものの
ような内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＣＩＶΔによりＳａｃ．ｅｒｙ
ｔｈｒａｅａのプロトプラストを形質転換することによって調製した。 プロトプラストの調製、組込み方法及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択 は例３におけるように実施した。 さらに、染色体における予期した欠失（図３の配列のヌクレオチド４８６５０
からヌクレオチド４９５９８までの９４９ｂｐの欠失）の存在は、サザーンブロ
ットによるゲノム解析並びに例３に記載した条件に従うＰＣＲにより確認された
。 ＮｃｏＩ制限酵素によって消化されたゲノムＤＮＡについてサザーンのハイブ
リダイゼーションを使用し、図３の配列の位置４９９９６〜位置５００２２に位
置するＤＮＡ領域の相補鎖に相当する下記の配列： Ｃ４−Ｒ：AGCGGCTTGATCGTGTTGGACCAGTAC (SEQ ID No.53) を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、野生型株から６．２ｋ
ｂのバンド及び変異体ＣＩＶ８９から５．２ｋｂのバンドが検出された。図１５
に示す結果は、染色体のこの領域にほぼ１ｋｂの欠失が変異体に存在することを
示している。 ＰＣＲによる増幅を、図３の配列の位置４８１６９〜位置４８１９５に位置す
るＤＮＡ領域に相当する下記の配列： Ｃ４−Ｓ：GGCCTATGTGGACTACGTGTTGAACGT （SEQ ID No.54） を有するオリゴヌクレオチド及び上で示した配列を有するＣ４−Ｒオリゴヌクレ
オチドを使用して実施し、しかしてＯＲＦ１７で内部欠失を持っている領域のＰ
ＣＲ増幅によるフレーミングを可能にした。ＰＣＲ増幅による分析は、野生型株
における１．８ｋｂのバンド及び変異体ＣＩＶ８９における９００ｂｐのバンド
を、プラスミドｐＣＩＶΔにより得たシグナルと同等の態様で検出するのを可能
にした。図１６に示した結果は、サザーン分析法により検出されたほぼ９００ｂ
ｐの欠失がプラスミドｐＣＩＶΔが持ているもの（９４９ｂｐ）と同等であるこ
とを確認させる。 次いで、このように得られた組換え株（ＣＩＶ８９と称する）を、この株によ
り産生する代謝産物を同定するために培養した。 Example 25 : Sac. Construction of erythraea strain eryCIVΔ (CIV89) A strain having an internal deletion, such as that in which the eryCIV gene was introduced into plasmid pCIVΔ obtained in Example 24, was transformed with plasmid pCIVΔ by Sac. ery
It was prepared by transforming thraea protoplasts. The preparation of protoplasts, the method of integration and the selection of variants with the ery - phenotype were performed as in Example 3. In addition, the expected deletion in the chromosome (nucleotide 48650 of the sequence of FIG. 3)
The presence of a 949 bp deletion from 1 to nucleotide 49598) was confirmed by genomic analysis by Southern blot and PCR according to the conditions described in Example 3. Using Southern hybridization on genomic DNA digested with the NcoI restriction enzyme, the following sequence corresponding to the complement of the DNA region located from position 49996 to position 50022 in the sequence of FIG. 3: C4-R: AGCGGCTTGATCGTGTTGGACCAGTAC (SEQ Using the oligonucleotide having ID No. 53) as a probe, 6.2 k
A band of 5.2 kb was detected from band b and mutant CIV89. FIG.
Indicate that there is an approximately 1 kb deletion in this region of the chromosome in the mutant. Amplification by PCR was performed using the following sequence corresponding to the DNA region located from position 48169 to position 48195 in the sequence of FIG. 3: C4-S: GGCCTATGTGGACTACGTGTTGAACGT (SEQ ID No. 54) and the sequence shown above Performed using a C4-R oligonucleotide having the P4 region of the ORF17 having an internal deletion.
Framing by CR amplification was enabled. Analysis by PCR amplification made it possible to detect a 1.8 kb band in the wild type strain and a 900 bp band in the mutant CIV89 in a manner equivalent to the signal obtained with the plasmid pCIVΔ. The results shown in FIG. 16 indicate that approximately 900 b
This confirms that the deletion of p is equivalent to that carried by the plasmid pCIVΔ (949 bp). The recombinant strain thus obtained (designated CIV89) was then cultured to identify the metabolites produced by this strain.
【０１９９】例２６ ：ＣＩＶ８９株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 ＣＩＶ８９株の培養及びＴＬＣによる分析を例４に示した条件に従って実施し
た。 ＴＬＣの結果（図１７）は、ＣＩＶ８９株がｅｒｙＣ変異体について予期され
るように３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ並びにエリスロノリドＢを優先的
に蓄積させることを示す。 また、低い易動性を持つ少量の代謝産物も検出され、次いで抽出し、例４で使
用した条件に従って質量分光法と組合わせたＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。 少量の代謝産物は、ｍ／ｚ７２０で親ピーク、ｍ／ｚ７０２、ｍ／ｚ５７６及
びｍ／ｚ１７４で脱水及び断片化生成物を生じる。ピーク１７４は４−ヒドロキ
シデソサミンに、ピーク５７６は４’−ヒドロキシデソサミニルエリスロノリド
Ｂに相当しよう。 これらの結果は、エリスロノリドＤ（親ピークｍ／ｚ７０４）と比べて１６の
ｍ／ｚの差はアミノ化糖が持ているを示唆している。この代謝産物について提案
される構造は４’−ヒドロキシエリスロマイシンＤである。 これらの観察は、該酵素がエリスロマイシンの生合成経路でヒドロキシル基の
引抜きに関与すること、ｅｒｙＣＩＶ遺伝子がｄＴＤＰ−６−デオキシヘキソー
ス３，４−デヒドラターゼをコード化することを示している。 ＣＩＶ８９株は、１９９７年７月１６日に微生物培養物国際収集機関（ＣＮＣ
Ｍ）であるパスツール研究所（フランス、７５７２４パリ セデックス１５、リ
ュ・ジュ・ドクチュール・ロウ２５）に番号Ｉ−１９０５として寄託された。 Example 26 : Fermentation of strain CIV89 and identification of secondary metabolite produced CIV89 strain was cultured and analyzed by TLC according to the conditions described in Example 4. TLC results (FIG. 17) show that strain CIV89 preferentially accumulates 3-α-mycarosylerythronolide B as well as erythronolide B as expected for the eryC mutant. Also, small amounts of metabolites with low mobility were detected and then extracted and analyzed by RP-HPLC combined with mass spectroscopy according to the conditions used in Example 4. Small amounts of metabolites give parental peaks at m / z 720 and dehydration and fragmentation products at m / z 702, m / z 576 and m / z 174. Peak 174 would correspond to 4-hydroxydesosamine and peak 576 would correspond to 4'-hydroxydesosaminylerythronolide B. These results suggest that the aminated sugar has a difference of 16 m / z compared to erythronolide D (parent peak m / z 704). The proposed structure for this metabolite is 4'-hydroxyerythromycin D. These observations indicate that the enzyme is involved in hydroxyl group abstraction in the erythromycin biosynthetic pathway, and that the eryCIV gene encodes dTDP-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase. The CIV89 strain was established on July 16, 1997 by the International Collection of Microorganism Cultures (CNC).
M) at the Institute of Pasteur (Paris Cedex 15, 75724 Paris, 75724, Rue du Docture Row 25) under the number I-1905.
【０２００】例２７ ：プラスミドｐＣＶΔの構築 ｐＣＶΔと称され、ＯＲＦ１８をコード化するｅｒｙＣＶ遺伝子に欠失を持っ
ている組込みプラスミドを以下の態様で図１４Ａに示したダイアグラムに従って
構築した。 ＢａｌＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による消化によって例１１で調製したプラス
ミドｐＮＣＯ６２から得たＢａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片（３．４８ｋｂ）をベクタ
ーｐＵＣ１９のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位においてサブクーロニングさせた。次
いで、生じたプラスミドｐＢＡＢ１８（図５Ｂ）から、ＳｃａＩ酵素による消化
によってＳｃａＩ内部断片（１ｋｂ）を欠失させてＯＲＦ１８にいおて図３の配
列のヌクレオチド４９９９８からヌクレオチド５１０４１までの１０４４ｂｐの
欠失を生成させた。このようにして得たプラスミドｐＢＡＢΔＣＶから、次いで
、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素による消化によって、欠失を持ってい
る断片をｐＵＣ１９のポリリンカーから再び単離し、次いでプラスミドｐＵＷＬ
２１８においてサブクローニングさせた。このようにして得られた組込みプラス
ミドｐＣＶΔ（図１４Ｂ）をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＲＣ株に移し、次いでＳ
ａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換するために使用した。 Example 27 : Construction of plasmid pCVΔ An integrated plasmid, designated pCVΔ and having a deletion in the eryCV gene encoding ORF18, was constructed in the following manner according to the diagram shown in FIG. 14A. A BalI-BamHI fragment (3.48 kb) obtained from plasmid pNCO62 prepared in Example 11 by digestion with BalI and BamHI restriction enzymes was subcooled at the SmaI-BamHI site of vector pUC19. The resulting plasmid pBAB18 (FIG. 5B) was then deleted by digestion with the ScaI enzyme to delete the ScaI internal fragment (1 kb) to remove the 1044 bp deletion from ORF18 from nucleotide 49998 to nucleotide 51041 of the sequence of FIG. Generated. From the plasmid pBABΔCV thus obtained, the fragment carrying the deletion was again isolated from the polylinker of pUC19 by digestion with HindIII and EcoRI restriction enzymes, and then the plasmid pUWL
At 218, it was subcloned. The thus obtained integration plasmid pCVΔ (FIG. 14B) was used in E. coli. coli DH5α MRC strain, then
ac. erythraea.
【０２０１】例２８ ：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ｅｒｙＣＶΔ（ＣＶ９０）の構築 ｅｒｙＣＶ遺伝子が例２７で得たプラスミドｐＣＶΔに導入されたもののよう
な内部欠失を持っている株を、プラスミドｐＣＶΔによるＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒ
ａｅａのプロトプラストの形質転換によって調製した。 プロトプラストの調製、組込み方法及びｅｒｙ-表現型を有する変異体の選択 は例３におけるように実施した。 さらに、染色体における所期の欠失（ヌクレオチド４９９９８からヌクレオチ
ド５１０４１までの１０４４ｂｐの欠失）の存在は、サザーンプロットによるゲ
ノム解析並びに例３に記載した条件に従うＰＣＲにより確認した。 ＮｃｏＩ制限酵素によって消化されたゲノムＤＮＡについてサザーンのハイブ
リダイゼーションを使用し、図３の配列の位置５１２２９〜位置５１２５９に位
置するＤＮＡ領域の相補鎖に相当する下記の配列： Ｃ５−Ｒ：AACGCCTCGTCCTGCAGCGGAGACACGAACA (SEQ ID No.55) を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、野生型株から６．２ｋ
ｂのバンド及び変異体ＣＶ９０から５．１ｋｂのバンドが検出された。図１５に
示す結果は、染色体のこの領域にほぼ１．１ｋｂの欠失が変異体に存在すること
を示している。 ＰＣＲによる増幅を、図３の配列の位置４９６６８〜位置４９６９４に位置す
るＤＮＡ領域に相当する下記の配列： Ｃ５−Ｓ：TTCGCTCCCCGATGAACACAACTCGTA （SEQ ID NO.56） を有するオリゴヌクレオチド及び上で示した配列を有するＣ５−Ｒオリゴヌクレ
オチドを使用して実施し、しかしてＯＲＦ１８において内部欠失を持っている領
域のＰＣＲ増幅によるフレーミングを可能にした。ＰＣＲ増幅による分析は、野
生型株においてほぼ１．６ｋｂのバンド及び変異体ＣＩＶ９０においてほぼ５０
０ｂｐのバンドを、プラスミドｐＣＶΔにより得られるシグナルと同等の態様で
検出するのを可能にした。図１６に示した結果は、サザーン分析法により検出さ
れたほぼ１．１ｋｂの欠失がプラスミドｐＣＶΔが持っているもの（１０４４ｂ
ｐ）と同等であることを確認させる。 次いで、このように得られた組換え株（ＣＩＶ９０と称する）を、この株によ
り産生する代謝産物を同定するために培養した。 Example 28 : Sac. Construction of erythraea strain eryCVΔ (CV90) A strain having an internal deletion such as that in which the eryCV gene was introduced into plasmid pCVΔ obtained in Example 27 was designated Sac. erythr
aea protoplasts. The preparation of protoplasts, the method of integration and the selection of variants with the ery - phenotype were performed as in Example 3. In addition, the presence of the desired deletion in the chromosome (deletion of 1044 bp from nucleotide 49998 to nucleotide 51041) was confirmed by genomic analysis by Southern plot and PCR according to the conditions described in Example 3. Using Southern hybridization on genomic DNA digested with the NcoI restriction enzyme, the following sequence corresponding to the complement of the DNA region located at positions 51229 to 51259 of the sequence of FIG. 3: C5-R: AACGCCTCGTCCTGCAGCGGAGACACGAACA (SEQ Using the oligonucleotide having ID No. 55) as a probe, 6.2 k
b band and a 5.1 kb band from mutant CV90 were detected. The results shown in FIG. 15 indicate that the mutant has a deletion of approximately 1.1 kb in this region of the chromosome. Amplification by PCR was performed using an oligonucleotide having the following sequence corresponding to the DNA region located from position 49668 to position 49694 of the sequence of FIG. 3: C5-S: TTCGCTCCCCGATGAACACAACTCGTA (SEQ ID NO.56) and the sequence shown above. This was carried out using C5-R oligonucleotides, which allowed framing by PCR amplification of regions with internal deletions in ORF18. Analysis by PCR amplification showed a band of approximately 1.6 kb in the wild-type strain and approximately 50 in the mutant CIV90.
The 0 bp band was allowed to be detected in a manner equivalent to the signal obtained by plasmid pCVΔ. The results shown in FIG. 16 show that the plasmid pCVΔ has a deletion of approximately 1.1 kb detected by Southern analysis (1044b
Make sure it is equivalent to p). The recombinant strain thus obtained (designated CIV90) was then cultured to identify the metabolites produced by this strain.
【０２０２】例２９ ：ＣＶ９０株の発酵及び産生した二次代謝産物の同定 株ＣＶ９０の培養及びＴＬＣによる分析を例４に示した条件に従って実施した
。 ＴＬＣの結果（図１７）は、ＣＶ９０株がｅｒｙＣ変異体について予期される
ように３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ及びエリスロノリドＢを優先的に蓄
積させることを示す。 ｅｒｙＣＶによりコード化された蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１の配列）
の残基３８〜５０（ＶＴＧＡＧＤＧＤＡＤＶＱＡ）の配列： Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gln Ala （SEQ ID No.61） は、ウイーレンガ他、１９８５及びスクラットン他、１９９０により報告された
ＮＡＤ＋に結合する合意された配列と酷似する。 これらの観察は、ｅｒｙＣＶ遺伝子がｄ−ＴＤＰ−デソサミンの生合成経路で
ｄＴＤＰ−４，６−デオキシヘキソース３，４−レダクターゼとして関与するで
あろうレダクターゼをコード化することを示している。 Example 29 : Fermentation of strain CV90 and identification of secondary metabolites produced Culturing of strain CV90 and analysis by TLC were carried out according to the conditions described in Example 4. TLC results (FIG. 17) show that strain CV90 preferentially accumulates 3-α-mycarosyl erythronolide B and erythronolide B as expected for the eryC mutant. eryCV encoded protein (sequence of SEQ ID No. 11)
The sequence of residues 38-50 of (VTGAGDGDADVQA): Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gln Ala (SEQ ID No. 61) binds to NAD + as reported by Wericka et al., 1985 and Skraton et al., 1990. Much like an agreed array. These observations indicate that the eryCV gene encodes a reductase that will be involved as dTDP-4,6-deoxyhexose 3,4-reductase in the d-TDP-desosamine biosynthetic pathway.
【０２０３】例３０ ：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の生成物の過剰発現 例１に記載したＯＲＦ８に相当し、例７で同定したデソサミニルトランスフェ
ラーゼ活性をコード化するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子
の生成物の異種発現を宿主株としてＥ．ｃｏｌｉを使用して実施した。このよう
にして封入体の形で産生した蛋白質を次いで精製し、その酵素活性をインビトロ
で決定した。 Example 30 : E. Overexpression of the product of the eryCIII gene in E. coli Sac. Heterologous expression of the product of the eryCIII gene of E. erythraea was used as a host strain in E. coli. E. coli. The protein thus produced in the form of inclusion bodies was then purified and its enzymatic activity was determined in vitro.
【０２０４】 １）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の発現 発現は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御
下でＥ．ｃｏｌｉにおける組換え蛋白質のクローニング及び発現のためのベクタ
ーｐＥＴ１１ａ（ストラトジェン社）を使用して実施した。 まず、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子を、例１に記載したプラスミドｐＫ６２から以下
の態様で増幅した。 ＰＣＲによる増幅は、生のＰｆｕポリメラーゼ（ストラトジェン社）を使用し
、そしてｅｒｙＣＩＩＩの開始剤ＡＴＧの上流にＮｄｅＩ部位を導入するのを可
能にさせる次の配列： Ａ：GAAGGAGATATACATATGCGCGTCGTCTTCTCCTC （SEQ ID No.57） を有するオリゴヌクレオチド同族体Ａ及びｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の停止コドンの
下流にＢａｍＨＩ部位を導入するのを可能にさせる次の配列： Ｂ：CGGGATCCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCCTGC （SEQ ID No.58） を有するｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の相補鎖を有するオリゴヌクレオチド同族体Ｂを
プライマーとして使用して実施した。 次いで、増幅されたＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により消化し、
次いでｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の全体を含有する得られた１．２ｋｂのＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、アンピシリン耐性のβ−ラクタマーゼ遺伝子と、複製起点Ｃ
ｏｌＥ１と、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素により予め消化されたクローニン
グ部位ＮｄｅＩの上流に位置するＲＮＡポリメラーゼＴ７の遺伝子のプロモータ
ーとを含有する発現ベクターｐＥＴ１１ａ（ストラトジェン社）において連結し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいて連結し、形質転換した後に、得ら
れたプラスミドｐＣＥＩＩＩを制限マップ及びシーケンシングにより確認した。 次いで、その染色体ＤＮＡにｌａｃＩq遺伝子を含有し、ＲＮＡポリメラーゼ Ｔ７の遺伝子の上流にｌａｃＵＶ５プロモーターを含有するｐＥＴキット（スト
ラトジェン社）のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＣＩＩ
Ｉ．５により形質転換させた。 得られた形質転換した株（ＢＬ２１／ｐＥＣＩＩＩと称する）を５０ｍｌのエ
ルレンメイヤーフラスコにおいて、予備培養物からＯＤ600＝０．１で播種し、 次いで１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に
よりＯＤ600＝１で誘発させたＬＢ媒体中で３７℃で培養した。導入して３時間 ３０分後に、培養物の１ｍｌを取り出し、濃縮し、次いで得られた細菌ペレット
を２４０μｌの水及び１２０μｌのＳＤＳ ３Ｘ試料緩衝液（トリス−ＨＣｌ、
１Ｍ、ｐＨ＝６．８：１．９ｍｌ；グリセリン：３ｍｌ；β−メルカプトエタノ
ール：１．５ｍｌ；ＳＤＳ ２０％：３ｍｌ；ブロモフェノールブルー１％、ｐ
Ｈ＝７；０．３ｍｌ；Ｈ2Ｏ：１０ｍｌに要する量）に溶解した。得られた溶液 の１５μｌから、抽出された総蛋白質を、コマシエブルーによる染色を使用して
１０％ポリアクリルアミドを含むゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 プラスミドｐＥＴ１１ａにより形質転換された対照株の総蛋白質と比べて、ｅ
ｒｙＣＩＩＩ蛋白質について予期されたＭＷに相当するほぼ４６Ｋｄの見掛け分
子量を有する蛋白質の過剰発現が観察された。1) E. Expression of eryCIII protein in E. coli Expression was controlled by E. coli under the control of the bacteriophage T7 RNA polymerase promoter. This was performed using the vector pET11a (Stratogen) for cloning and expression of the recombinant protein in E. coli. First, the eryCIII gene was amplified from the plasmid pK62 described in Example 1 in the following manner. Amplification by PCR uses raw Pfu polymerase (Stratogen) and allows the introduction of an NdeI site upstream of the initiator ATG of eryCIII: A: GAAGGAGATATACATATGCGCGTCGTCTTCTCCTC (SEQ ID No. 57 Has the complementary sequence of the eryCIII gene having the following sequence enabling the introduction of a BamHI site downstream of the stop codon of the oligonucleotide homolog A and the eryCIII gene: B: CGGGATCCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCCTGC (SEQ ID No. 58) Performed using oligonucleotide homolog B as a primer. Then, the amplified DNA was digested with NdeI and BamHI restriction enzymes,
The resulting 1.2 kb NdeI- containing the entire eryCIII gene was then
The BamHI fragment was replaced with the ampicillin-resistant β-lactamase gene and the replication origin C.
Ligation was performed in an expression vector pET11a (Stratogen) containing olE1 and a promoter for the RNA polymerase T7 gene located upstream of a cloning site NdeI previously digested with NdeI and BamHI restriction enzymes. E. FIG. After ligation and transformation in E. coli XL1-Blue, the resulting plasmid pCEIII was confirmed by restriction map and sequencing. Then, it contains lacI q gene on its chromosome DNA, E. of pET kits containing lacUV5 promoter upstream of the gene of RNA polymerase T7 (Stratford Gen Corp.) coli BL21 strain (DE3) was transformed into plasmid pECII.
I. 5 was used. The resulting transformed strain (designated BL21 / pECIII) was inoculated from the preculture at OD 600 = 0.1 in a 50 ml Erlenmeyer flask and then 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyrano Cultured at 37 ° C. in LB medium induced by SID (IPTG) at OD 600 = 1. Three hours and 30 minutes after introduction, 1 ml of the culture was removed and concentrated, and the resulting bacterial pellet was combined with 240 μl water and 120 μl SDS 3X sample buffer (Tris-HCl,
1 M, pH = 6.8: 1.9 ml; glycerin: 3 ml; β-mercaptoethanol: 1.5 ml; SDS 20%: 3 ml; bromophenol blue 1%, p
H = 7; 0.3 ml; H 2 O: amount required for 10 ml). From 15 μl of the resulting solution, total protein extracted was analyzed by SDS-PAGE on a gel containing 10% polyacrylamide using staining with Coomassie blue. Compared to the total protein of the control strain transformed with plasmid pET11a, e
Overexpression of a protein with an apparent molecular weight of approximately 46 Kd, corresponding to the expected MW for the ryCIII protein, was observed.
【０２０５】 ２）ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の精製 上記の形質転換されたＢＬ２１／ｐＥＣＩＩＩ株を６Ｌの発酵器において炭素
源としてグリセリンを含有する最小量の媒体（コルツ他、１９９５）中で２５℃
でＯＤ600＝１２まで培養し、次いでＩＰＴＧにより１８時間ＯＤ600＝５４まで
誘発させた。集めた培養液から５０００Ｇで３０分間遠心分離することによって
封入体を含有する細菌ペレットを単離した。 ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の誘発は、集めた培養液に直接か又は燐酸塩緩衝液中で
超音波により第一溶菌処理した後の細菌ペレットのいずれかについて、アリコー
トを１％ＳＤＳ緩衝液中で１００℃で５分間溶菌した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポ
リアクリルアミド勾配：１０〜２０％）とコマシエブルーによる染色を使用して
検査した。 集めた培養液の１Ｌに相当する１９０ｇの細菌ペレットを、２．５ｍＭのＥＤ
ＴＡ及び２．５ｍＭのＤＴＴを含有する２．５容のＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）に再懸濁させた。次いで、ラニー装置（ミニラボ、
８−３０Ｈタイプ，ＡＰＶホモジナイザーズＡｓ社、デンマーク）を使用して、
１０００バールの圧力下に３回通して溶菌処理した。４６，０００Ｇで３時間遠
心分離した後に、得られたペレットを２．５容の２Ｍ尿素中に懸濁させ、同じ条
件下で遠心分離した。 次いで、洗浄したペレットを、７Ｍ尿素をトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．
５）（緩衝液Ａ）に溶解してなる溶液の２．５容に懸濁させてｅｒｙＣＩＩＩ蛋
白質を可溶化させた。同じ条件下で遠心分離した後に、得られた集めた上層液は
、市販のキット（ピアース社）を使用してブラッドホード法により決定して２．
１ｇの総蛋白質を含有する。 次いで、７ｍＭ尿素液中の抽出物を、上記の緩衝液Ａにより予め平衡化したＱ
セファロース（ファルマシア社）の１８０ｍｌのカラム（５ｃｍ×９ｃｍ）に０
．５ｍ／ｈの割合で４〜８℃で装入し、２８０ｎｍで検出した。次いで、ｅｒｙ
ＣＩＩＩ蛋白質を、０．３ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａにより溶離した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド勾配：１０〜２０％）により立証され、コ
マシエブルーによる染色によって明示されたｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を含有する一
緒にした画分及び８３５ｍｇの総蛋白質を、次いで、上記の緩衝液Ａにより予め
平衡化したスーパーデックス２００（Ｐｒｅｐグレード、ファルマシア社）の５
．５Ｌのカラム（１０ｃｍ×７０ｃｍ）に装入した。カラムを緩衝液Ａにより溶
離し、２８０ｎｍで検出することによって、蛋白質ピークであって、その画分が
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明されるｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を含有するものを得、
これと２００ｍｇの総蛋白質を一緒にし、次いで緩衝液Ａにより予め平衡化した
Ｑソース（ファルマシア社）の１８０ｍｌのカラム（５ｃｍ×９ｃｍ）で精製し
た。緩衝液Ａ中で０〜０．３Ｍの間のＮａＣｌの線状勾配でもって溶離すること
によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと硝酸銀による明示により評価された均一純度の変
性ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を１００ｍｇ含有する３０ｍｌの溶液を得た。 図１８は、５００ｎｇの総蛋白質の付着量についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリア
クリルアミド勾配：１０〜１５％）及び硝酸銀による明示によってモニターされ
たｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質について、連続して７Ｍ尿素による抽出（線２）、Ｑセ
ファロースクロマトグラフィー（線３）、スーパーデックスクロマトグラフィー
（線４、Ｑソースクロマトグラフィー（線６）の後の純度のパターンを、分子量
マーカー（線１及び５）と対比して示す。 次いで、均一溶離物を１０ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液Ａにより希釈するこ
とによってｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を変性させて０．１ｍｇ／ｍｌの最終蛋白質濃
度を得た。次いで、希釈された溶液をトリス緩衝液 ５０ｍＭ；ＮａＣｌ ０．
１５Ｍ；０．３％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシル（ＮＯＧ）；ＤＴＴ １０ｍＭ、ｐＨ８．３に向けて透析し、次いで１０，０００のカットオフ限界
値を有するＰＬＧＣ０４３１０膜（ミリポア社）で限外ろ過することによって４
ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。 次いで、精製したｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を５００μｌのアリコートとして−２
０℃で冷凍状態で貯蔵した。2) Purification of eryCIII protein The above transformed BL21 / pECIII strain was placed in a 6 L fermentor at 25 ° C. in a minimal medium containing glycerin as a carbon source (Kolts et al., 1995).
At OD 600 = 12 and then induced to OD 600 = 54 with IPTG for 18 hours. Bacterial pellets containing inclusion bodies were isolated from the collected cultures by centrifugation at 5000 G for 30 minutes. The induction of the eryCIII protein was determined by aliquots of the bacterial pellet, either directly into the harvested culture or after sonication first in phosphate buffer, at 100 ° C. in 1% SDS buffer at 5 ° C. After lysed for 1 minute, the cells were examined using SDS-PAGE (polyacrylamide gradient: 10-20%) and staining with Coomassie blue. 190 g of bacterial pellet, equivalent to 1 L of the collected culture, was added to 2.5 mM ED.
Resuspended in 2.5 volumes of KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 buffer (20 mM, pH 7.2) containing TA and 2.5 mM DTT. Next, the Raney device (Minilab,
8-30H type, APV Homogenizers As, Denmark)
Lysis was carried out three times under a pressure of 1000 bar. After centrifugation at 46,000 G for 3 hours, the resulting pellet was suspended in 2.5 volumes of 2M urea and centrifuged under the same conditions. The washed pellet was then washed with 7 M urea in Tris buffer (50 mM, pH 7.0).
5) The eryCIII protein was solubilized by suspending it in 2.5 volumes of a solution dissolved in (buffer A). After centrifugation under the same conditions, the resulting collected upper layer solution was determined by the blood-hord method using a commercially available kit (Pierce).
Contains 1 g of total protein. The extract in a 7 mM urea solution was then combined with Q pre-equilibrated with buffer A described above.
Sepharose (Pharmacia) 180 ml column (5cm x 9cm)
. It was charged at a rate of 5 m / h at 4 to 8 ° C. and detected at 280 nm. Then ery
CIII protein was eluted with buffer A containing 0.3 M NaCl. S
Combined fractions containing eryCIII protein and 835 mg of total protein, verified by DS-PAGE (polyacrylamide gradient: 10-20%) and revealed by staining with Coomassie blue, were then pre-treated with buffer A as described above. 5 of equilibrated Superdex 200 (Prep grade, Pharmacia)
. The column was charged to a 5 L column (10 cm × 70 cm). The column was eluted with buffer A and detected at 280 nm to obtain a protein peak whose fraction contained the eryCIII protein, as evidenced by SDS-PAGE,
This was combined with 200 mg of total protein and then purified on a 180 ml column (5 cm × 9 cm) of Q Source (Pharmacia) pre-equilibrated with buffer A. Elution with a linear gradient of NaCl between 0 and 0.3 M in buffer A gave 30 ml of a solution containing 100 mg of homogenously purified denatured eryCIII protein as assessed by SDS-PAGE and silver nitrate expression. Obtained. FIG. 18 shows eryCIII protein monitored by SDS-PAGE (polyacrylamide gradient: 10-15%) for 500 ng total protein coverage and by silver nitrate expression, followed by continuous 7M urea extraction (line 2), Q The pattern of purity after Sepharose chromatography (line 3), superdex chromatography (line 4, Q source chromatography (line 6) is shown relative to molecular weight markers (lines 1 and 5). The eryCIII protein was denatured by diluting the product with 10 mM DTT in Buffer A to give a final protein concentration of 0.1 mg / ml, then dilute the solution to 50 mM Tris buffer;
15M; 0.3% n-octyl-β-D-glucopyranosyl (NOG); dialyzed against DTT 10 mM, pH 8.3, then limited with PLGC04310 membrane (Millipore) with a cut-off limit of 10,000. 4 by external filtration
Concentrated to mg / ml. The purified eryCIII protein was then used as a 500 μl aliquot for -2.
Stored frozen at 0 ° C.
【０２０６】 ３）ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の特徴付け このようにして得られたｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質の特徴付けを以下の性質につい
て検査した。 ａ）均一性 Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ装置（ファルマシア社）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（ポリアクリルアミド勾配：１０〜１５％）及び硝酸銀による明示による電気
泳動は、２０００ｎｇの付着量について９９％以上の純度を示す。 ｂ）電気泳動及び質量分光法による分子量 電気泳動を使用して、４６ｋＤａの見掛けＭＷは４５９２９の計算ＭＷと一致
すると決定された。 質量分光法と結びつけたＲＰ−ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ：ＥＳＩ−ＳＭ）による分
析は、４５９３４ｕｍａの質量を生じる。 ｃ）Ｎ−末端アミノ酸配列 Ｎ−末端配列は、ＰＴＨ−アミノ酸のＨＰＬＣ分析器と結びつけたモデルＡ４
９２蛋白質マイクロシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社）でマイ
クロシークエンシングすることによって決定した。 図２に記載したアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の配列）と一致する１
０個の第一残基について二次的配列は明示されなかった。 ｄ）生物学的活性 ｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質のデソサミニルトランスフェラーゼ活性を、ｄＴＤＰ−
Ｄ−デソサミン（この調製は以下に記載する）からのエリスロマイシンＤ並びに
３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ（ＭＥＢ）（この調製は文献及び一般的方
法で上記した）の形成を証明することによってインビトロで決定した。 反応媒体は、以下の操作条件を使用して、１５０ｎモルのｄＴＤＰ−Ｄ−デソ
サミン、１３７．４ｎモルのＭＥＢ及び１ｍｇのｅｒｙＣＩＩＩ蛋白質を含有す
る。 ４．７８ｍｌのトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．３（緩衝液Ｂ）；１ｍＭのＥ
ＤＴＡ及び４ｍＭのＰＥＦＡＢＬＯＣ Ｏ（メルク社）を含有する緩衝液Ｂにｄ
ＴＤＰ−Ｄ−デソサミントリエチルアミン塩（１５０ｎモル）を溶解してなる２
０μｌの溶液；ＭＥＢ（１３７．４ｎＭ）を緩衝液Ｂに溶解してなる１００μｌ
の溶液及び上で得た冷凍溶液の２５０μｌのアリコートに相当する１ｍｇのｅｒ
ｙＣＩＩＩ蛋白質を続けて、スクリュー栓を備えたガラス管に導入する。 渦巻きによりホモジネーションした後に、栓をしたガラス管を３０℃に恒温制
御した浴に５時間入れ、次いでｐＨを３２％ＮａＯＨにより９〜１０に調節し、
次いで反応混合物を５ｍｌの酢酸エチルにより３回抽出する。得られた抽出物を
減圧下に乾固させ、次いで１００μｌの塩化メチレンで溶解したものを、次いで
、溶離剤として塩化メチレン／メタノール混合物（９０：１０、ｖ／ｖ）を使用
して、例４に示した条件下でＴＬＣにより分析する。 対照試験（ｔ＝０）（このインキュベーションはＮａＯＨの添加により直ちに
停止する）を同じ条件下で実施する。 化学的な明示により得られた結果は、予期されたエリスロマイシンＤに近似す
るＲｆを有し、その弱い抗生物質活性がＢ．ｐｕｍｉｌｕｓについてのプレート
の直接オートバイオグラムにより検出される易動性でない生成物の出現を示す。 これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉで産生し、上記のように精製されたｅｒｙＣＩ
ＩＩ蛋白質が予期したデソサミニルトランスフェラーゼ活性を有し、正確に変性
されたことを確認させる。3) Characterization of eryCIII protein The eryCIII protein thus obtained was characterized for the following properties. a) Uniformity SDS-PAG using a Phast System apparatus (Pharmacia)
Electrophoresis by E (polyacrylamide gradient: 10-15%) and silver nitrate reveals a purity of 99% or more for a 2,000 ng coverage. b) Molecular weight by electrophoresis and mass spectroscopy Using electrophoresis, the apparent MW of 46 kDa was determined to be consistent with the calculated MW of 45929. Analysis by RP-HPLC coupled with mass spectroscopy (HPLC: ESI-SM) gives a mass of 45934 uma. c) N-terminal amino acid sequence The N-terminal amino acid sequence is model A4 coupled to a PTH-amino acid HPLC analyzer.
It was determined by microsequencing with a 92 protein microsequencer (Applied Biosystems). 1 corresponding to the amino acid sequence (sequence of SEQ ID No. 5) described in FIG.
No secondary sequence was specified for the 0 first residue. d) Biological activity The desosaminyltransferase activity of the eryCIII protein was measured using dTDP-
Demonstrating the formation of erythromycin D and 3-α-mycarosylerythronolide B (MEB) from D-desosamine (the preparation of which is described below), the preparation of which has been described in the literature and in general methods Determined in vitro. The reaction medium contains 150 nmol dTDP-D-desosamine, 137.4 nmol MEB and 1 mg eryCIII protein using the following operating conditions. 4.78 ml Tris buffer 50 mM, pH 7.3 (buffer B); 1 mM E
In buffer B containing DTA and 4 mM PEFABLOC O (Merck)
2 prepared by dissolving TDP-D-desosamine triethylamine salt (150 nmol)
0 μl of solution; 100 μl of MEB (137.4 nM) dissolved in buffer B
1 mg of er corresponding to a 250 μl aliquot of the solution obtained above and the frozen solution obtained above
The yCIII protein is subsequently introduced into a glass tube equipped with a screw stopper. After homogenization by swirling, the stoppered glass tube was placed in a thermostatically controlled bath at 30 ° C. for 5 hours, and then the pH was adjusted to 9 to 10 with 32% NaOH.
Then the reaction mixture is extracted three times with 5 ml of ethyl acetate. The extract obtained was evaporated to dryness under reduced pressure and then dissolved in 100 μl of methylene chloride, then using methylene chloride / methanol mixture (90:10, v / v) as eluent, Example 4 Analyze by TLC under the conditions shown in. A control test (t = 0) (this incubation is stopped immediately by the addition of NaOH) is performed under the same conditions. The results obtained by chemical manifestation have an Rf close to the expected erythromycin D, and its weak antibiotic activity indicates that 9 shows the appearance of non-mobile products detected by direct autobiogram of the plate for P. pumilus. These results indicate that eryCI produced in E. coli and purified as described above.
It confirms that the II protein has the expected desosaminyltransferase activity and has been correctly denatured.
【０２０７】例３１ ：Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおけるグリコシルトランスフェラーゼ
をコード化するｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子を単離するためのプローブとし
てｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の配列の使用 Example 31 : S.M. Use of the sequence of the eryCIII gene as a probe to isolate the oleG1 and oleG2 genes encoding glycosyltransferases in antibiotics
【０２０８】 １）ｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺伝子のクローニング デソサミニルトランスフェラーゼ活性をコード化する例１に記載したＯＲＦ８
に相当するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の配列を使用し
てハイブリダイゼーションプローブを調製し、サザーンハイブリダイゼーション
によりオレアンドマイシンを産生するＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ
１１８９１における相同性遺伝子の単離を可能にさせた。 例３に記載した操作条件に従い、生のｐｆｕポリメラーゼ（ストラトジェン社
）を使用し、次の配列： ｅｒｙＣＩＩＩ−１：CGGGTACCATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG （SEQ ID No.59） を有するオリゴヌクレオチドであってその５’領域にＫｐｎＩ制限部位を含み且
つその３’部分が図２の配列の位置１０１９６〜位置１０２１９に位置するＤＮ
Ａ領域の相補鎖に相当するもの並びに次の配列： ｅｒｙＣＩＩＩ−２：CGGGTACCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCC （SEQ ID No.60 ） を有するオリゴヌクレオチドであってその５’領域にＫｐｎＩ部位を含み且つそ
の３’部分が図２の配列の位置８９５４〜位置８９７４に位置するＤＮＡ領域の
相補鎖に相当するものをプライマーとして使用して、ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の全
体を例１で得た６ｎｇのプラスミドｐＫ６２からＰＣＲにより増幅させた。 次いで、増幅により得られたほぼ１．２ｋｂのバンドをＫｐｎＩ制限酵素によ
り消化し、ＫｐｎＩ酵素により予め消化させたプラスミドｐＵＣ１９においてク
ローニングした。次いで、このようにして得られたプラスミドｐＣＩＩＩＰＣＲ
１を使用して、図２に示したｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子の全てに相当する１．２ｋｂ
のＫｐｎＩ断片を再単離した。このようにして単離した断片を次いでサムブルッ
ク他、１９８９により報告された“ランダムプライミング”を使用して32Ｐによ
り標識化し、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＴＣ１１８９１のゲノムＤＮ
Ａライブラリーから得られ且つ以下の態様（図２０）で調節されたコスミドクロ
ーンをサザーンハイブリダイゼーションにより分析するためのｅｒｙＣＩＩＩプ
ローブとして使用した。 スワン他、１９９４により報告された方法に従い、エリスロマイシンの生合成
遺伝子のクラスター内のＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのポリテチドシンターゼの
第三サブユニットで２ｋｂのＳｍａＩ内部断片をプローブとして使用し、次いで
染色体ウオーキングによって、オレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスターに
相当する領域のほぼ１００ｋｂをオーバーラップし、カバーする一連の６個のコ
スミド（ｃｏｓＡＢ３５、ｃｏｓＡＢ７６、ｃｏｓＡＢ８７、ｃｏｓＡＢ６７、
ｃｏｓＡＢ６３及びｃｏｓＡＢ６１）を単離した。Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのｄＴＤ
Ｐ−グルコースシンターゼ、ｄＴＤＰ−グルコース４，６−デスヒドラターゼ及
びｄＴＤＰ−６−デオキシグルコース３，５−エピメラーゼ（ストックマン及び
ピーパースベルグ、１９９２）をそれぞれコード化するｓｔｒＤ、ｓｔｒＥ及び
ｓｔｒＭは、ｃｏｓＡＢ６１及びｃｏｓＡＢ６３コスミドによりハイブリダイゼ
ーションする（図２０）。類似の態様で、ホップウッド他、１９８５により報告
された標準的条件下で実施する上記のように調製したｅｒｙＣＩＩＩプローブに
よるサザーンハイブリダイゼーションによって、ｃｏｓＡＢ３５コスミド（スワ
ン他、１９９４）は、図２０に表わされた３．５ｋｂ及び２．７ｋｂの２個のＢ
ａｍＨＩ制限断片に正のシグナルを生じさせる。これに続くサブクローニング及
びシークエンシングは、これらの２個の断片がハイブリダイゼーションにより検
出されない０．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片により分離されることを示す。 図２１に表わされ、ｏｌｅＢ遺伝子の１．４ｋｂ上流に位置するＥＭＢＬ Ｎ
ｏ．Ｌ０９６５４配列のＰＫＳのＯＬＥ−ＯＲＦ３遺伝子の位置１１０８１のＳ
ｓｔＩ部位とＥＭＢＬ Ｎｏ．Ｌ３６６０１配列の位置５のＳｓｔＩ部位との間
に含まれるオレアンドマイシン生合成遺伝子のクラスターの右部分に相当し、及
び上で調製したｅｒｙＣＩＩＩプローブによりハイブリダイゼーションするＳ．
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＴＣ１１８９１のゲノムＤＮＡの１０．８ｋｂ
のＳｓｔＩ断片をｃｏｓＡＢ３５コスミドから単離し、プラスミドベクターｐＳ
Ｌ１１８０（ファルマシア・バイオテク社）においてサブクローニングさせた。
このようにして得たｐＣＯ３５−Ｓクローンを使用して、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ
Ｐ１３ｍｐ１９バクテリオファージ（ニューイングランド・バイオラボ社）にお
いて異なったＤＮＡ断片をサブクローニングすることによって一本鎖鋳型を生成
させ、次いでこれらの断片のヌクレオチド配列をサンガー他（１９７７）の方法
に従い、バンドの圧縮の問題を制約するために供給者の勧めに従ってα［35Ｓ］
ｄＣＴＰ（アメルシャム社）及び７−デアザ−ｄＧＴＰの存在下に変性Ｔ７ポリ
メラーゼ（セクイナーゼバージョン２．０、米国バイオケミカルズ社）を使用し
て決定した。セクイナーゼキットから供給した標準プライマー及び内部合成プラ
イマー（１７ｍｅｒ）を使用した。 断片組立プログラム（ゲネチック・コンピューター・グループ、ウイスコンシ
ン大学）及びコドンプレファレンスプログラムを使用するオープンリーデイング
フレーム（ドゥブロー他、１９８４）の同定を使用して、配列データの組立を実
施した。 得られたヌクレオチド配列は、図２１に示すＳｐｈＩ*部位とＫｐｎＩ部位の 間に含まれる図２２で表わされる６０９３ｂｐのヌクレオチド配列（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１５の配列）を立証させた。ここに、５個のＯＲＦがヌクレオチド１
８４からヌクレオチド１３８６（ｏｌｅＰ１と称するＯＲＦ）、ヌクレオチド１
４３７からヌクレオチド２７１４（ｏｌｅＧ１と称するＯＲＦ）、ヌクレオチド
２７２２からヌクレオチド３９９９（ｏｌｅＧ２と称するＯＲＦ）、ヌクレオチ
ド３９９２からヌクレオチド４７２９（ｏｌｅＭと称するＯＲＦ）及びヌクレオ
チド４８１０からヌクレオチド５９６７（ｏｌｅＹと称するＯＲＦ）と同定され
た。５個のＯＲＦは同じ方向で転写される。 ＯＲＦのｏｌｅＰ１、ｏｌｅＧ１、ｏｌｅＧ２、ｏｌｅＭ及びｏｌｅＹのコー
ド化領域を含むプラスミドｐＣＯ３５−Ｓを含有するＥ．ｃｏｌｉの試料は、１
９９８年４月８日に微生物培養物国際収集機関（ＣＮＣＭ）であるパスツール研
究所（フランス、７５７２４パリ セデックス１５、リュ・ジュ・ドクチュール
・ロウ２５）に番号Ｉ−２００３として寄託された。 ｏｌｅＧ１遺伝子は、４２６個のアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）を有
するポリペプチドをコード化する。しかし、ＧＴＧコドンのすぐ上流に位置する
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるこのクラスのグリコシルトランスフェラーゼ
で高く保持されたアルギニンをコード化するＣＧＣコドンの存在は、開始コドン
が配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０．１７の位置１４３１にあるＣＴＧコドンであり得る
ことを示すであろう。 ｏｌｅＧ２遺伝子は、４２６個のアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）を有
するポリペプチドをコード化する。 ブラストプログラム（アルツシュール他、１９９０）を使用して上記のｏｌｅ
Ｇ１及びｏｌｅＧ２のＯＲＦの誘導されたアミノ酸配列とデータベースの蛋白質
とを比較すると、異なった出所からのグリコシルトランスフェラーゼとの類似性
、特に、例３０に記載したｅｒｙＣＩＩＩデソサミニルトランスフェラーゼと７
２％の類似性及び５３％の同一性が示された。 次いで、ｏｌｅＧ１遺伝子又はｏｌｅＧ２遺伝子の機能の同定をＳ．ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｕｓ ＡＴＴＣ１１８９１における標的遺伝子の妨害によって及び
例３〜４に記載した方法を使用して変異体株により産生したオレアンドマイシン
の非グリコシル化先駆物質の同定によって実施した。1) Cloning of oleG1 and oleG2 Genes ORF8 described in Example 1 encoding desosaminyltransferase activity
Corresponding to Sac. A hybridization probe is prepared using the sequence of the eryCIII gene of E. erythraea, and S. cerevisiae that produces oleandmycin by Southern hybridization. antibioticus ATCC
This enabled the isolation of the homologous gene at 11891. An oligonucleotide having the following sequence: rawCIII-1: CGGGTACCATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID No. 59), using the raw pfu polymerase (Stratogen) according to the operating conditions described in Example 3 and in its 5 'region DN containing a KpnI restriction site and whose 3 'portion is located at position 10196 to position 10219 of the sequence of FIG.
2. An oligonucleotide having the complement of the A region and the following sequence: eryCIII-2: CGGGTACCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID No. 60), comprising a KpnI site in the 5 'region and a 3' portion in FIG. The entire eryCIII gene was amplified from 6 ng of plasmid pK62 obtained in Example 1 by PCR using a primer corresponding to the complementary strand of the DNA region located at positions 8954 to 8974 of the above sequence. The approximately 1.2 kb band obtained from the amplification was then digested with KpnI restriction enzyme and cloned in plasmid pUC19 that had been previously digested with KpnI enzyme. Subsequently, the thus obtained plasmid pCIIIPCR
1 using 1.2 kb corresponding to all of the eryCIII genes shown in FIG.
The KpnI fragment was re-isolated. The fragment thus isolated was then labeled with 32 P using "random priming" reported by Sambrook et al. Genomic DN of antibioticus ATTC11891
Cosmid clones obtained from the A library and regulated in the following manner (FIG. 20) were used as eryCIII probes for analysis by Southern hybridization. According to the method reported by Swan et al., 1994, Sac. The second subunit of Erythraea polytetide synthase uses a 2 kb SmaI internal fragment as a probe, and then overlaps and covers approximately 100 kb of the region corresponding to the cluster of oleandmycin biosynthetic genes by chromosome walking. A series of six cosmids (cosAB35, cosAB76, cosAB87, cosAB67,
cosAB63 and cosAB61) were isolated. S. griseus dTD
The strD, strE and strM encoding P-glucose synthase, dTDP-glucose 4,6-deshydratase and dTDP-6-deoxyglucose 3,5-epimerase (Stockman and Peipersberg, 1992), respectively, are cosAB61 And cosAB63 cosmid (FIG. 20). In a similar manner, the cosAB35 cosmid (Swan et al., 1994) is represented in FIG. 20 by Southern hybridization with an eryCIII probe prepared as described above, performed under standard conditions reported by Hopwood et al., 1985. 3.5 kb and 2.7 kb B
The amHI restriction fragment gives a positive signal. Subsequent subcloning and sequencing show that these two fragments are separated by a 0.6 kb BamHI fragment that is not detected by hybridization. EMBL N, represented in FIG. 21 and located 1.4 kb upstream of the oleB gene.
o. S at position 11081 of the OLE-ORF3 gene of the PKS of the L09654 sequence
stI site and EMBL No. This corresponds to the right part of the oleandmycin biosynthesis gene cluster between the SstI site at position 5 of the L36601 sequence and hybridizes with the eryCIII probe prepared above.
10.8 kb of genomic DNA of antibioticus ATTC11891
Was isolated from the cosAB35 cosmid and the plasmid vector pS
It was subcloned in L1180 (Pharmacia Biotech).
Using the pCO35-S clone thus obtained, M13mp18 and M13mp18
Single-stranded templates were generated by subcloning the different DNA fragments in the P13mp19 bacteriophage (New England Biolabs) and then the nucleotide sequence of these fragments was determined according to the method of Sanger et al. (1977) with the problem of band compression. Α [ 35 S] according to the supplier's recommendation to constrain
Determined using denatured T7 polymerase (Sequinase version 2.0, Biochemicals, USA) in the presence of dCTP (Amersham) and 7-deaza-dGTP. Standard primers and internally synthesized primers (17 mer) supplied from Sequinase kit were used. Assembly of sequence data was performed using the fragment assembly program (Genetic Computer Group, University of Wisconsin) and identification of an open reading frame (Dubrow et al., 1984) using a codon preference program. The obtained nucleotide sequence is the nucleotide sequence of 6093 bp shown in FIG. 22 and contained between the SphI * site and the KpnI site shown in FIG.
D No. 15 sequences). Where 5 ORFs are nucleotide 1
84 to nucleotide 1386 (ORF referred to as oleP1), nucleotide 1
From 437 to nucleotide 2714 (ORF referred to as oleG1), from nucleotide 2722 to nucleotide 3999 (ORF as oleG2), from nucleotide 3992 to nucleotide 4729 (ORF as oleM) and from nucleotide 4810 to nucleotide 5967 (ORF as oleY). . The five ORFs are transferred in the same direction. E. coli containing the plasmid pCO35-S containing the coding regions for oleP1, oleG1, oleG2, oleM and oleY of the ORF. coli sample is 1
It was deposited on April 8, 998, with the International Collection of Microorganisms and Cultures (CNCM), the Institute of Pasteurs (Paris Cedex 15, 75724, Rue-Jou-d'Couture-Row 25, France) under the number I-2003. The oleG1 gene encodes a polypeptide having 426 amino acids (SEQ ID No. 17). However, the presence of a CGC codon encoding an arginine highly conserved in this class of glycosyltransferases in Streptomyces, located immediately upstream of the GTG codon, is due to the CTG codon whose start codon is at position 1431 of sequence SEQ ID N0.17. It will show what is possible. The oleG2 gene encodes a polypeptide having 426 amino acids (SEQ ID No. 18). Using the blast program (Arts Sur et al., 1990)
A comparison of the derived amino acid sequences of the G1 and oleG2 ORFs with the proteins in the database shows similarities with glycosyltransferases from different sources, in particular with the eryCIII desosaminyltransferase described in Example 30 and 7
A 2% similarity and 53% identity were shown. Next, identification of the function of the oleG1 gene or the oleG2 gene was performed by S. et al. anti
bioticus ATTC11891 and by the identification of nonglycosylated precursors of oleandmycin produced by the mutant strain using the methods described in Examples 3-4.
【０２０９】 ２）Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｏｌｅＧ１Δ株（Ａ３５Ｇ１）の生成 オレアンドマイシンを産生するＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株ＡＴＴＣ１１
８９１の染色体ＤＮＡの相同性領域にプラスミドｐＣＯ３を組み込むことによっ
てｏｌｅＧ１遺伝子が妨害された株を調製した。 まず、上で調製したプラスミドｐＣＯ３５−ＳをＢａｍＨＩ制限酵素により消
化することによって得たｏｌｅＧ１遺伝子より０．６ｋｂ内部のＢａｍＨＩ断片
（図２１）をプラスミドｐＯＪ２６０ ＮＲＲＬ Ｂ−１４７８５のＢａｍＨＩ
部位においてサブクローニングした。 次いで、このようにして生成したプラスミドｐＣＯ３をＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１ ｒｅｃＯ１５０４：：Ｔｎ５（コロドナー他、１９８５）中に移し、次いでＳ
．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのプロトプラストを形質転換するのに使用した。ト
ランスフォーマントの選択は、アプラマイシン（注射用等級のアプラマイシン、
ローヌ・メリウ社）に対する抵抗性によって実施した。 プロトプラストの調製は、ホプウッド他、１９８５により報告された条件に従
ってＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株ＡＴＴＣ１１８９１から実施した。 形質転換は、プロトプラストの５０μｌアリコート及び５μｇのプラスミドＤ
ＮＡ ｐＣＯ３を使用し、チオストレプトンを２５μｇ／ｍｌの最終濃度でアプ
ラマイシンで置き換えることにより実施した。 アプラマイシンに対する抵抗性によって実施したインテグラントの選択はＡ３
５Ｇ１と称するクローンを単離するのを可能にした。 Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓの染色体の相当領域における予期された変化が
サザーンブロット法によるゲノム解析によって確認された。単離し、次いで野生
型Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株又はＡ３５Ｇ１変異体からのＰｓｔＩ制限酵
素により消化された染色体ＤＮＡを、上記の０．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片をハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用してサザーン法により分析した。このよ
うにして野生型株で検出された４．７ｋｂのＰｓｔＩ断片をＡ３５Ｇ１変異体に
おける２．４及び６．５ｋｂの２個のＰｓｔＩ断片により置き換えることによっ
てプラスミドｐＣＯ３がＡ３５Ｇ１株の染色体にｏｌｅＧ１ ＯＲＦのレベルで
組み込まれることが確認される。 次いで、このようにして得られたＡ３５Ｇ１組換え株をこれより産生する先駆
物質を同定するために培養した。2) S.I. Generation of antibioticus oleG1Δ strain (A35G1) antibioticus strain ATTC11
A strain in which the oleG1 gene was disrupted by incorporating the plasmid pCO3 into the homologous region of the chromosomal DNA of 891 was prepared. First, a BamHI fragment within 0.6 kb of the oleG1 gene obtained by digesting the above-prepared plasmid pCO35-S with BamHI restriction enzyme (FIG. 21) was used to obtain the BamHI fragment of plasmid pOJ260 NRRL B-14785.
Subcloned at the site. The plasmid pCO3 thus produced was then transformed into E. coli. E. coli strain TG1 recO1504 :: Tn5 (Kolodner et al., 1985).
. Antibiotics were used to transform protoplasts. Transformants were selected for apramycin (injection grade apramycin,
Rhone Meliu). The preparation of protoplasts was carried out according to the conditions reported by Hopwood et al., 1985. Antibiotic strain ATTC11891. Transformations were performed with 50 μl aliquots of protoplasts and 5 μg of plasmid D
This was performed using NA pCO3 and replacing thiostrepton with apramycin at a final concentration of 25 μg / ml. The selection of integrants performed by resistance to apramycin was A3
It was possible to isolate a clone designated 5G1. S. The expected changes in the corresponding regions of the chromosomes of antibioticus were confirmed by Southern blot genomic analysis. Isolated and then wild-type S. Chromosomal DNA digested with the PstI restriction enzyme from the antibioticus strain or the A35G1 mutant was analyzed by the Southern method using the 0.6 kb BamHI fragment described above as a hybridization probe. By replacing the 4.7 kb PstI fragment thus detected in the wild type strain with the two PstI fragments of 2.4 and 6.5 kb in the A35G1 mutant, the plasmid pCO3 was added to the chromosome of the A35G1 strain with the oleG1 ORF. Confirmed to be incorporated at the level. Next, the thus obtained A35G1 recombinant strain was cultured in order to identify a precursor produced therefrom.
【０２１０】 ３）Ａ３５Ｇ１株の発酵及び産生するオレアンドマイシン先駆物質の同定 Ａ３５Ｇ１株を、例４に記載した条件下でＥＰ１培地での４８時間予備培養か
らのＥＰ２培地中で５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにおいて７２時間培養
した。 酢酸エチルによる培養液抽出物を次いで例３及び４で使用した方法に従って分
析した。 ａ）抗生物質に対する細菌感受性を記録することによる生物学的試験を以下の
態様で実施した。 Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ株をＴＳＢ培地で３７℃で終夜増殖させた後、培養物を５
０％（ｗ／ｖ）のグリセリンを含有する媒体中で１／１００まで希釈し、次いで
得られた細胞懸濁液を−２０℃に保存してから使用する。 次いで、１％の寒天を含有し且つ５５℃に保持した１００ｍｌのＴＳＢ培地中
に１５０μｌの解凍した細胞懸濁液を導入することによって生物学的試験を実施
した。次いで、この混合物をペトリ皿に注いだ。冷却した後、５０〜２００μｌ
の酢酸エチル抽出物を含有するオックスホードシリンダーを寒天皿上に置き、４
℃で２時間保持し、次いで３７℃で終夜インキュベーションした。 抽出物はＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ ＡＴＴＣ１４８８４の増殖に対して抑止効果を
示さない。 ｂ）標準物質としてエリスロマイシンＡ、エリスロノリドＢ及び６−デオキシ
エリスロノリドＢを使用して、化学的明示を伴うＴＬＣによる分析を例４に記載
した条件に従って実施した。 ＴＬＣによる分析は、Ａ３５Ｇ１株がオレアンドマイシンを産生しないが、エ
リスロノリドＢよりも大きく且つ６−デオキシエリスロノリドＢに近似する易動
性を有するクリムソン生成物を優先的に蓄積させること、アグリコン８，８ａ−
デオキシオレアンドリド部分が予期できないことを示す。 ｃ）質量分光法を結びつけたＲＨ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる分析を
例４に記載した条件に従って実施した。２個の主要な代謝産物（Ｍ９及びＭ１０
と称する）が検出された（それぞれ６．１２ｍｎ及び１７．２３ｍｎで溶離）。
二つの生成物は、ｍ／ｚ３７３で親ピーク及び構造［８，８ａ−デオキシオレア
ンドリド］Ｈ+と一致し得る類似の断片化プロフィルを生じる。 しかし、Ｍ１０代謝産物の保持時間のみが提案した構造と一致するが、Ｍ９代
謝産物は異性体構造又は開環したラクトン分子に相当しよう。 また、例６に記載したＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＣＩＩＩ６８及び例１６
に記載したＢＶ８８の変異体株を補足する実験を、ｏｌｅＧ１及びｏｌｅＧ２遺
伝子のそれぞれを発現させるプラスミド構築物を使用して実施した。 これらの観察及びオレアンドロシル８，８ａ−デオキシオレアンドリド又はデ
ソサミニル８，８ａ−デオキシオレアンドリドの検出の不存在は、ｏｌｅＧ１遺
伝子がオレアンドマイシンの生合成に係わるデソサミニルトランスフェラーゼを
コード化し、またｏｌｅＧ２がオレアンドロシルトランスフェラーゼをコード化
することをそれぞれ示す。3) Fermentation of Strain A35G1 and Identification of Producing Oleandomycin Precursor Strain A35G1 was isolated from 50 ml Erlenmeyer in EP2 medium from a 48-hour preculture in EP1 medium under the conditions described in Example 4. Cultured in flask for 72 hours. The culture extract with ethyl acetate was then analyzed according to the method used in Examples 3 and 4. a) Biological tests by recording bacterial susceptibility to antibiotics were performed in the following manner. B. After growing the S. pumilus strain in TSB medium overnight at 37 ° C.,
Dilute to 1/100 in a medium containing 0% (w / v) glycerin and then store the resulting cell suspension at -20 ° C before use. Biological tests were then performed by introducing 150 μl of the thawed cell suspension into 100 ml of TSB medium containing 1% agar and kept at 55 ° C. This mixture was then poured into a Petri dish. After cooling, 50-200 μl
Place the Oxford cylinder containing the ethyl acetate extract of
C. for 2 hours and then incubated at 37.degree. C. overnight. The extract is B.A. No inhibition effect on the growth of S. pumilus ATTC14884. b) Analysis by TLC with chemical manifestation was carried out according to the conditions described in Example 4, using erythromycin A, erythronolide B and 6-deoxyerythronolide B as standards. Analysis by TLC shows that the A35G1 strain does not produce oleandomycin, but preferentially accumulates the Crimson product, which is larger than erythronolide B and has a mobility similar to 6-deoxyerythronolide B, aglycone 8 , 8a-
Indicates that the deoxyoleandlide moiety is unexpected. c) Analysis by RH-HPLC chromatography coupled with mass spectroscopy was performed according to the conditions described in Example 4. Two major metabolites (M9 and M10
(Eluted at 6.12 mn and 17.23 mn, respectively).
The two products yield a similar fragmentation profile at m / z 373 that can be consistent with the parent peak and the structure [8,8a-deoxyoleandlide] H + . However, while only the retention time of the M10 metabolite is consistent with the proposed structure, the M9 metabolite would correspond to an isomeric structure or an open lactone molecule. Further, the Sac. erythraea CIII68 and Example 16
Experiments supplementing the mutant strains of BV88 described in Example 1 above were performed using plasmid constructs expressing each of the oleG1 and oleG2 genes. These observations and the absence of the detection of oleandrosyl 8,8a-deoxyoleandlide or desosaminyl 8,8a-deoxyoleandlide indicate that the oleG1 gene encodes a desosaminyltransferase involved in oleandmycin biosynthesis. OleG2 encodes oleandrosyltransferase.
【０２１１】例３０の製造例 ：チミジン５’−（トリ水素ジホスフェート），Ｐ’−［３，４
，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキソピラノシル］
エステル，Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン工程Ａ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース塩酸塩 １．５Ｌの６Ｎ塩酸に１４６ｇのエリスロマイシンＡを周囲温度で攪拌しなが
ら添加する。得られた溶液を２時間還流させる。反応媒体を周囲温度に冷却し、
ろ過し、得られた残留物を水洗する。水性相を塩化メチレンで抽出し、次いで硫
酸エーテルで洗浄する。水性相に１０ｇの黒色Ｌ2Ｓを添加し、微量のエーテル を減圧下に追い出す。ろ過し、濃縮したのち、同じ条件で第二の実験を実施する
。二つの実験を一緒にし、エタノール（１５０ｃｍ3）に溶解し、１５０ｃｍ3の
エチルエーテルを添加する。得られた結晶を脱水し、洗浄し、乾燥する。４２ｇ
の所期の生成物を得た。Ｍｐ＝１５８〜１６０℃。工程Ｂ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース １，２−ジアセテート １５．２７ｇの工程Ａの生成物と１５０ｃｍ3の塩化メチレンを含有する混合 物に６０ｃｍ3のトリエチルアミンを２０℃で攪拌しながら添加する。２０ｃｍ3 の無水酢酸及び８０ｃｍ3の塩化メチレンを含有する溶液を２０℃で添加する。 周囲温度で２０時間攪拌し、洗浄し、濃縮し、硫酸エーテル中でペースト状にす
る。ろ液を減圧下に濃縮する。得られた残留物を酢酸エチル−トリエチルアミン
混合物（９５−５）により溶離することによってクロマトグラフィーする。１８
．６ｇの所期の生成物を得た。これはそのまま次の工程に使用する。工程Ｃ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース ２−アセテート １８．６ｇの工程Ｂの生成物と５０ｃｍ3のＤＭＦを含有する混合物を５０℃ にもたらし、６．６２ｇのヒドラジン酢酸塩ＮＨ2ＮＨ2・ＡｃＯＨを添加する。
反応混合物を攪拌し、これを酸性炭酸ナトリウム飽和溶液上に注ぐ。水性相を酢
酸エチルで抽出する。有機相を一緒にし、乾燥し、ろ過し、濃縮し、減圧下に蒸
留してトルエンとの共沸連行によりＤＭＦを除去する。１１．２８ｇの生成物を
得た。これをシリカでクロマトグラフィーし、酢酸エチル−トリエチルアミン混
合物（９０−１０）により溶離する。６．５ｇの所期の生成物を得た。これはそ
のまま次の工程に使用する。工程Ｄ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース ２−アセテート ビス（フェニルメチル）ホスフェート １．７３８ｇの上記工程の生成物と４０ｃｍ3のＴＨＦを含有する溶液に、５ ．７ｃｍ3のｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液を−７０℃で添加する。即時に 調製した１０ｇのジベンジルホスフォクロリド（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５
８，ｐ．１９５７）Preparation Example 30 : Thymidine 5 '-(trihydrogen diphosphate), P'-[3,4
, 6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranosyl]
Ester, N, N-diethylethanamine Step A : 3,4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranose hydrochloride 146 g of erythromycin A in 1.5 L of 6N hydrochloric acid at ambient temperature Add with stirring. The resulting solution is refluxed for 2 hours. Cooling the reaction medium to ambient temperature,
Filter and wash the resulting residue with water. The aqueous phase is extracted with methylene chloride and then washed with ether sulfate. 10 g of black L 2 S are added to the aqueous phase and traces of ether are driven off under reduced pressure. After filtration and concentration, a second experiment is performed under the same conditions. The two experiments are combined, dissolved in ethanol (150 cm 3 ) and 150 cm 3 of ethyl ether are added. The crystals obtained are dehydrated, washed and dried. 42g
The expected product is obtained. Mp = 158-160C. Step B : 3,4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranose 1,2-diacetate A mixture containing 15.27 g of the product of Step A and 150 cm 3 of methylene chloride. triethylamine 60cm 3 added with stirring at 20 ° C. to. At 20 ° C. a solution containing 20 cm 3 of acetic anhydride and 80 cm 3 of methylene chloride is added. Stir at ambient temperature for 20 hours, wash, concentrate and paste in ether sulfate. The filtrate is concentrated under reduced pressure. The residue obtained is chromatographed by eluting with an ethyl acetate-triethylamine mixture (95-5). 18
. 6 g of the expected product are obtained. This is used for the next step as it is. Step C : 3,4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranose 2-acetate A mixture containing 18.6 g of the product of Step B and 50 cm 3 of DMF is brought to 50 ° C. , 6.62 g of hydrazine acetate NH 2 NH 2 .AcOH are added.
The reaction mixture is stirred and poured onto a saturated solution of sodium acid carbonate. The aqueous phase is extracted with ethyl acetate. The organic phases are combined, dried, filtered, concentrated and distilled under reduced pressure to remove DMF by azeotropic entrainment with toluene. 11.28 g of product were obtained. This is chromatographed on silica, eluting with an ethyl acetate-triethylamine mixture (90-10). 6.5 g of expected product are obtained. This is used for the next step as it is. Step D : 3,4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranose 2-acetate bis (phenylmethyl) phosphate containing 1.738 g of the product of the above step and 40 cm 3 of THF. Add 5. 7 cm 3 of a solution of n-butyllithium in hexane are added at -70 ° C. Immediately prepared 10 g of dibenzylphosphochloride (J. Chem. Soc. 195).
8, p. 1957)
【化１】 を２０ｃｍ3のＴＨＦに溶解してなる溶液を−７０〜−７５℃で添加する。−７ ０〜−７４℃１時間３０分攪拌し続ける。反応媒体を酸性炭酸ナトリウム飽和溶
液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し
、濃縮する。得られた生成物をシリカでクロマトグラフィーし、アセトン−塩化
メチレン混合物（５−５）で溶離する。１．０７０ｇの所期の生成物を得た。工程Ｅ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース，１−（ジ水素ホスフェート），Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン １．０７０ｇの上記工程の生成物、２０ｃｍ3の酢酸エチル、１０ｃｍ3のメタ
ノール、０．６２２ｃｍ3のトリエチルアミン及び２００ｇのパラジウム担持炭 を含有する混合物を水素気流内で周囲温度で３０分間攪拌し続ける。反応媒体を
ろ過し、メタノール及び酢酸エチルで洗浄し、ろ液を濃縮する。１ｇの油状物を
得た。これに１０ｃｍ3のメタノールを添加する。得られた溶液を２０時間攪拌 する。メタノールを減圧下に３０℃で追い出す。６８０ｍｇの所期の生成物を得
た。工程Ｆ ：３，４，６−トリデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキ
ソピラノース，１−（ジ水素ホスフェート） 上記の工程で得られ、トリエチルアミン塩の形で単離された４２０ｍｇの生成
物を１．６ｃｍ3のメタノールに溶解する。３．２ｃｍ3の硫酸エーテルを添加す
る。次いで、６．４ｃｍ3の硫酸エーテルを添加する。融点が２４２〜２４４℃ である２５０ｍｇの所期の生成物を得た。工程Ｇ ：チミジン５’−（トリ水素ジホスフェート），Ｐ’−［３，４，６−ト
リデオキシ−３−（ジメチルアミノ）−Ｄ−キシロヘキソピラノシル］エステル
，Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン ２２８ｍｇの製造１の生成物、６ｃｍ3のピリジン及び５４４ｍｇのチミジン ５’−モノホスフェートモルホリデート−４−モルホリン−Ｎ，Ｎ’−ジシクロ
ヘキシルカルボキサアミジンを混合する。温度を３０℃以下に保持しながら回転
蒸発器を使用して減圧下にピリジンを追い出す。６ｃｍ3のピリジンを添加し、 これを減圧下に追い出す。この操作を２回繰り返す。６ｃｍ3のピリジン及び１ ０５ｍｇの１Ｈ−テトラゾールを添加する。周囲温度で３日間攪拌する。減圧下
にピリジンを追い出し、水で溶解し、ろ過し、濃縮し、得られた生成物をクロマ
トグラフィーにより精製する。このようにして、所期の生成物を得た。 Ｒｆ＝０．１２（溶離剤：ＣＨ2Ｃｌ2、ＭｅＯＨ、水（６０−３５−６））。Embedded image In 20 cm < 3 > of THF is added at -70 to -75 [deg.] C. −70 to −74 ° C. for 1 hour and 30 minutes. The reaction medium is poured onto a saturated solution of acidic sodium carbonate and extracted with ethyl acetate. The organic phase is dried over sodium sulfate, filtered and concentrated. The product obtained is chromatographed on silica, eluting with an acetone-methylene chloride mixture (5-5). 1.070 g of expected product is obtained. Step E : 3,4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranose, 1- (dihydrogenphosphate), N, N-diethylethanamine 1.070 g of the product of the above step, ethyl acetate 20 cm 3, methanol 10 cm 3, kept stirred for 30 minutes at ambient temperature the mixture containing palladium on charcoal of triethylamine and 200g of 0.622Cm 3 in a hydrogen stream. The reaction medium is filtered, washed with methanol and ethyl acetate, and the filtrate is concentrated. 1 g of an oil was obtained. To this is added 10 cm 3 of methanol. The resulting solution is stirred for 20 hours. The methanol is driven off at 30 ° C. under reduced pressure. 680 mg of expected product is obtained. Step F : 3,4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranose, 1- (dihydrogen phosphate) 420 mg of the compound obtained in the above step and isolated in the form of a triethylamine salt The product is dissolved in 1.6 cm 3 of methanol. 3.2 cm 3 of sulfuric ether are added. Then 6.4 cm 3 of sulfuric ether are added. 250 mg of the expected product with a melting point of 242 ° -244 ° C. were obtained. Step G : Thymidine 5 '-(trihydrogen diphosphate), P'-[3,4,6-trideoxy-3- (dimethylamino) -D-xylohexopyranosyl] ester, N, N-diethylethanamine Mix 228 mg of the product of preparation 1, 6 cm 3 of pyridine and 544 mg of thymidine 5′-monophosphate morpholidate-4-morpholine-N, N′-dicyclohexylcarboxamidine. The pyridine is driven off under reduced pressure using a rotary evaporator, keeping the temperature below 30 ° C. 6 cm 3 of pyridine are added and this is driven off under reduced pressure. This operation is repeated twice. 6 cm 3 of pyridine and 105 mg of 1H-tetrazole are added. Stir for 3 days at ambient temperature. The pyridine is driven off under reduced pressure, dissolved in water, filtered and concentrated, and the product obtained is purified by chromatography. The expected product is thus obtained. Rf = 0.12 (eluent: CH 2 Cl 2, MeOH, water (60-35-6)).
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0 Webber JM, Shawner B, Rossic R; (1989) Gene 7
5: 235-241 Weber JM, Lung JO, Main GT, Potents RHB, Porous TJ, DeWitt JP; Bacteriol. 172:
2372-2383 Weber JM, Lung JO, Swanson SJ, Idler, KB
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ol. Biol. 187: 101-107 Yamamoto H, Maurer KH, Hutchinson CR; Antib
iol. 34: 1304-1313
【０２１３】 ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇにおけるフリーテキスト ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＩＩ” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＩＩ” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：４ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＩＩＩ” ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、１０４６〜２３０８” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：６ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＩＶ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：２４２．．２４４、ａａ：Ｍｅｔ）
／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＶ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：１２１０．．１２１２、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＶＩ” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＶＩ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：３３０８．．３３１０、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＶ” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“ミカロースの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＢＶＩＩ” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：７５７８．．７５８０、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１３ ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“デソサミンの生合成に係わる” ／ｇｅｎｅ＝“ｅｒｙＣＩＶ” ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、４８３７〜６０３９” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１５ ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＰ１” ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“８，８ａ−デオキシオレアンドリドのグリコシル化” ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＧ１” ／ｔｒａｎｓ１ ｅｘｃｅｐｔ＝（ｐｏｓ：１４３７．．１４３９、ａａ：Ｍｅ
ｔ） ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ＝“８，８ａ−デオキシオレアンドリドのグリコシル化” ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＧ２” ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＹ” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：２０ ／ｇｅｎｅ＝“ｏｌｅＭ” ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５、３９９２〜４７２９” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６０ ／ｄｅｓｃ＝“ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ” ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：６１ ／ｎｏｔｅ＝“ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１、３８〜５０”Free text in sequence listing SEQ ID No. / Function = “related to biosynthesis of micarose” / gene = “eryBII” / function = “related to biosynthesis of desosamine” / gene = “eryCII” SEQ ID No. : 4 / function = “related to desosamine biosynthesis” / gene = “eryCIII” / note = “SEQ ID No. 1, 1046-2308” SEQ ID No. : 6 / function = “related to mycalose biosynthesis” / gene = “eryBIV” / trans1 except = (pos: 242.244, aa: Met)
/ Function = “related to mycalose biosynthesis” / gene = “eryBV” / trans1 except = (pos: 1210 ... 1212, aa: Me
t) / function = "related to desosamine biosynthesis" / gene = "eryCVI" / function = "related to mycalose biosynthesis" / gene = "eryBVI" / trans1 except = (pos: 3308.3.310, aa: Me
t) / function = “related to desosamine biosynthesis” / gene = “eryCV” / function = “related to mycalose biosynthesis” / gene = “eryBVII” / trans1 except = (pos: 7578. 7580, aa: Me
t) SEQ ID No. : 13 / function = “related to desosamine biosynthesis” / gene = “eryCIV” / note = “SEQ ID No. 6, 4837-6039” SEQ ID No. : 15 / gene = “oleP1” / function = “glycosylation of 8,8a-deoxyoleandlide” / gene = “oleG1” / trans1 except = (pos: 1437.1439, aa: Me)
t) / function = "glycosylation of 8,8a-deoxyoleandlide" / gene = "oleG2" / gene = "oleY" SEQ ID No. : 20 / gene = “oleM” / note = “SEQ ID No. 15, 3992-4729” SEQ ID No. 22 to SEQ ID NO. : 60 / desc = “OLIGONUCLEOTIDE” SEQ ID No. : 61 / note = “SEQ ID No. 11, 38 to 50”
【配列表】 [Sequence list]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＭＸ，ＴＲ，ＵＳ (72)発明者 カディジャ サラウベイ フランス国 エフ75013 パリ、ブールヴ ァール マセーナ、100、アパルトマン 2042 (72)発明者 イエスス コルテス イギリス国 シービー４ １ピーゼット ケンブリッジ、ユニオン レーン、カンバ ンクス 26 (72)発明者 ザビーネ ガイザー イギリス国 シービー１ ２エルジー ケ ンブリッジ、グワイダー ストリート 37 (72)発明者 ピーター リードレイ イギリス国 シービー２ ２ビーエイチ ケンブリッジ、クラレンドン ロード 17 (72)発明者 カルメン メンデス スペイン国 エ33010 オビエド、セグン ドベ、カレ マルセリノ フェルナンデス ７ (72)発明者 ホセ ア．サラス スペイン国 エ33060 オビエド、２バホ イスクイェルダ、カレ ギリェルモ エ ストラーダ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA07 BA67 CA09 FA17 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ15 QQ98 QS17 QS31 4B064 AE47 AF02 AG01 CA03 CA04 CA19 DA02 4B065 AA01X AA50X AB01 CA34 CA44 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int. Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1:01) C12N 15/00 ZNAA (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), BR, CA, JP, MX, TR, US (72) Inventor Kadilla Salau Bay France F 75013 Paris, Boulevard Massena, 100, apartment 2042 (72) Inventor Jesus Cortes, United Kingdom CB4 1 Pijet Cambridge, Union Lane, Cambanks 26 (72) Inventor Sabine Geyser CB1, England 2 Elgy Cambridge, Gwyder Street 37 (72) Inventor Peter Reidley UK CB2 2BH Cambridge, Clarendon Road 17 (72) Inventor Carmen Mendes Spain 33010 Oviedo, Segun Dobe, Calle Marcelino Fernandes 7 (72) Inventor Jose A. Salas Spain 330330 Oviedo, 2 Bajo Isquierda, Calle Guillermo e Strada F-term (reference) 4B024 AA01 AA03 BA07 BA67 CA09 FA17 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ15 QQ98 QS17 QS31 4B064 AE47 AF02 AG01 CA03 ACO4
Claims (41)
D NO:１の順行配列及び相補性配列)であって、エリスロマイシン生合成遺伝子の
クラスターのｅｒｙＧ−ｅｒｙＡＩＩＩ領域に対応する当該単離された一本鎖又
は二本鎖ＤＮＡ配列。1. The isolated single-stranded or double-stranded DNA sequence shown in FIG.
D NO: 1 ante- and complementary sequences), wherein said isolated single- or double-stranded DNA sequence corresponds to the eryG-eryAIII region of the cluster of erythromycin biosynthesis genes.
し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼを
コードするｅｒｙＢＩＩ配列、 − ＯＲＦ８(SEQ ID NO:１のヌクレオチド１０４６〜２３０８の相補性配列)に
対応し、デソサミニルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＣＩＩＩ配列、及
び − ＯＲＦ９(SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に
対応し、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラー
ゼをコードするｅｒｙＣＩＩ。2. The DNA sequence of claim 1 which comprises:-corresponding to ORF7 (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1), and comprising dTDP-4-keto-L-6-deoxy. An eryBII sequence encoding hexose 2,3-reductase;-an eryCIII sequence corresponding to ORF8 (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1) and encoding desosaminyltransferase; and-ORF9 (SEQ ID NO: EryCII corresponding to dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase, corresponding to nucleotides 2322 to 3404 of NO: 1).
１０４６〜２３０８の相補性配列)に対応するｅｒｙＣＩＩＩ配列又はＯＲＦ９(
SEQ ID NO:１のヌクレオチド２３２２〜３４０４の相補性配列)に対応するｅｒ ｙＣＩＩ配列から選択する図２に示した単離されたＤＮＡ配列及びこの配列又は
その断片とハイブリダイズし且つ／又は有意の相同性を示し且つ同じ機能を有す
る配列。3. An eryBII sequence corresponding to ORF7 (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1) and an eryCIII corresponding to ORF8 (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1). Sequence or ORF9 (
2 and a hybridizing and / or significant sequence with the isolated DNA sequence shown in FIG. 2 and the sequence or a fragment thereof selected from the eryCII sequence corresponding to nucleotides 2322-3404 of SEQ ID NO: 1). Sequences showing homology and having the same function.
されるポリペプチド。5. A polypeptide encoded by one of the DNA sequences according to one of claims 1-4.
NO:５の配列を有する)又はＯＲＦ９(SEQ ID NO:３の配列を有する)より選択する
図２に示したＯＲＦに対応する請求項５に記載のポリペプチド及びこのポリペプ
チドのアナログ。6. ORF7 (having the sequence of SEQ ID NO: 2), ORF8 (having the sequence of SEQ ID NO: 2).
6. The polypeptide according to claim 5, which corresponds to the ORF shown in Figure 2 selected from NO: 5 (having the sequence of SEQ ID NO: 3) or ORF9 (having the sequence of SEQ ID NO: 3) and analogs of this polypeptide.
ラーゼ活性を有し、ＥｒｙＣＩＩＩと呼ばれる、請求項５に記載のポリペプチド
(SEQ ID NO:５の配列を有する)。7. The polypeptide according to claim 5, which corresponds to ORF8 shown in FIG. 2, has desosaminyltransferase activity, and is called EryCIII.
(Having the sequence of SEQ ID NO: 5).
ｅｒｙＫ領域に対応する図３に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:６の配 列)。8. The eryAI- of a cluster of erythromycin biosynthesis genes.
4. The isolated DNA sequence shown in FIG. 3 corresponding to the eryK region (SEQ ID NO: 6).
、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼをコード
するｅｒｙＢＩＶ配列、 − ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応
し、ミカロシルトランスフェラーゼをコードするｅｒｙＢＶ配列、 − ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
をコードするｅｒｙＢＶＩ配列、 − ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼをコードす
るｅｒｙＣＩＶ配列、 − ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼをコー
ドするｅｒｙＣＶ配列及び − ＯＲＦ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対応
し、ｄＴＤＰ−４−セト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５エピメラーゼをコ
ードするｅｒｙＢＶＩＩ。9. The DNA sequence of claim 8, comprising: dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose, corresponding to ORF13 (sequence of nucleotides 242 to 1207 of SEQ ID NO: 6), comprising: An eryBV sequence encoding 4-reductase,-an eryBV sequence corresponding to ORF14 (sequences of nucleotides 1210 to 2454 of SEQ ID NO: 6) and encoding mycarosyltransferase,-ORF15 (nucleotides 2510 of SEQ ID NO: 6). DTDP-D-6-deoxyhexose 3-N-methyltransferase, corresponding to ORF16 (sequence of nucleotides 3308 to 4837 of SEQ ID NO: 6), dTDP-4-set- An eryBVI sequence encoding L-6-deoxyhexose 2,3-dehydratase;-ORF17 (S An eryCIV sequence corresponding to dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase, corresponding to EQ ID NO: 6 nucleotides 4837-6039) ORF18 (SEQ ID NO: 6 nucleotides 6080-7546). EryCV sequence encoding dTDP-D-4,6-dideoxyhexose 3,4-reductase and ORF19 (sequence of nucleotides 7578-8156 of SEQ ID NO: 6), and dTDP-4 -EryBVII encoding cet-D-6-deoxyhexose 3,5 epimerase.
のヌクレオチド１２１０〜２４５４の配列)に対応するｅｒｙＢＶ配列、ＯＲＦ １５(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３２２０の配列)に対応するｅｒｙ
ＣＶＩ配列、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７の配 列)に対応するｅｒｙＢＶＩ配列、ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８
３７〜６０３９の配列)に対応するｅｒｙＣＩＶ配列、ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:６
のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)に対応するｅｒｙＣＶ配列又はＯＲ Ｆ１９(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)に対応するｅｒ
ｙＢＶＩＩ配列及びこの配列とハイブリダイズし且つ／又はこの配列との有意の
相同性を示す配列又はその断片(同じ機能を有するもの)より選択する単離された
ＤＮＡ配列。10. An eryBIV sequence corresponding to ORF13 (sequence of nucleotides 242 to 1207 of SEQ ID NO: 6) shown in FIG. 3, ORF14 (SEQ ID NO: 6)
EryBV sequence corresponding to ORF 15 (sequence of nucleotides 2510-3220 of SEQ ID NO: 6).
The eryBVI sequence ORF17 (nucleotide 48 of SEQ ID NO: 6) corresponding to the CVI sequence ORF16 (sequence of nucleotides 3308-4837 of SEQ ID NO: 6)
EryCIV sequence corresponding to ORF18 (SEQ ID NO: 6)
EryCV sequence corresponding to nucleotides 6080-7546) or er corresponding to ORF19 (sequences nucleotides 7578-8156 of SEQ ID NO: 6).
An isolated DNA sequence selected from the yBVII sequence and sequences that hybridize to and / or exhibit significant homology to this sequence or fragments thereof (having the same function).
ードされるポリペプチド。12. A polypeptide encoded by one of the DNA sequences according to one of claims 8 to 11.
ＯＲＦ１４(SEQ ID NO:８の配列を有する)、ＯＲＦ１５(SEQ ID NO:９の配列を 有する)、ＯＲＦ１６(SEQ ID NO:１０の配列を有する)、ＯＲＦ１７(SEQ ID NO:
１４の配列を有する)、ＯＲＦ１８(SEQ ID NO:１１の配列を有する)又はＯＲＦ １９(SEQ ID NO:１２の配列を有する)から選択するＯＲＦに対応する請求項１２
に記載のポリペプチド及びこのペプチドのアナログ。13. ORF13 shown in FIG. 3 (having the sequence of SEQ ID NO: 7),
ORF14 (having the sequence of SEQ ID NO: 9), ORF15 (having the sequence of SEQ ID NO: 9), ORF16 (having the sequence of SEQ ID NO: 10), ORF17 (having the sequence of SEQ ID NO: 10)
13. An ORF selected from ORF18 (having the sequence of SEQ ID NO: 12), ORF18 (having the sequence of SEQ ID NO: 12), ORF19 (having the sequence of SEQ ID NO: 12), ORF18 (having the sequence of SEQ ID NO: 12).
And the analogs of this peptide.
フェラーゼ活性を有する請求項１２に記載のポリペプチド(SEQ ID NO:８の配列 を有する)である(ＥｒｙＢＶと呼ばれる)。14. The polypeptide according to claim 12, which corresponds to ORF14 shown in FIG. 3 and has mycarosyltransferase activity (has the sequence of SEQ ID NO: 8) (referred to as EryBV).
ド１０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオ
チド２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:
６のヌクレオチド２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌクレ
オチド１２１０〜２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド
２５１０〜３２２０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０
８〜４８３７の配列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６
０３９の配列)、ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の
配列)又はｅｒｙＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配
列)から選択するＤＮＡ配列の少なくとも１つの、Sac. erythraeaにおけるハイ ブリッド二次代謝産物を合成するための利用。15. The sequence eryBII (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1), eryCIII (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1) or eryCII (SEQ ID NO: 1) shown in FIG. The complementary sequence of nucleotides 2322-3404 of SEQ ID NO: 1), eryBIV shown in FIG.
6, eryBV (sequence of nucleotides 1210 to 2454 of SEQ ID NO: 6), eryCVI (sequence of nucleotides 2510 to 3220 of SEQ ID NO: 6), eryBVI (sequence of nucleotides 2510 to 3220 of SEQ ID NO: 6). Nucleotide 330
8-4837), eryCIV (nucleotides 4837-6 of SEQ ID NO: 6).
Erythraea, at least one of the DNA sequences selected from eryCV (sequence of nucleotides 6080-7546 of SEQ ID NO: 6) or eryBVII (sequence of nucleotides 7578-8156 of SEQ ID NO: 6). Use for the synthesis of hybrid secondary metabolites.
ド１０４６〜２３０８の相補性配列)又はｅｒｙＣＩＩ(SEQ ID NO:１のヌクレオ
チド２３２２〜３４０４の相補性配列)、図３に示したｅｒｙＢＩＶ(SEQ ID NO:
６の２４２〜１２０７の配列)、ｅｒｙＢＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド１２１
０〜２４５４の配列)、ｅｒｙＣＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド２５１０〜３
２２０の配列)、ｅｒｙＢＶＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド３３０８〜４８３７
の配列)、ｅｒｙＣＩＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド４８３７〜６０３９の配列
)、ｅｒｙＣＶ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド６０８０〜７５４６の配列)又はｅ ｒｙＢＶＩＩ(SEQ ID NO:６のヌクレオチド７５７８〜８１５６の配列)から選択
するＤＮＡ配列又はこの配列の断片の少なくとも１つのハイブリダイゼーション
プローブとしての利用。16. The sequence eryBII (complementary sequence of nucleotides 48 to 1046 of SEQ ID NO: 1), eryCIII (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1) or eryCII (SEQ ID NO: 1) shown in FIG. The complementary sequence of nucleotides 2322-3404 of SEQ ID NO: 1), eryBIV shown in FIG.
6, 242 to 1207), eryBV (nucleotide 121 of SEQ ID NO: 6)
0-2454), eryCVI (nucleotides 2510-3 of SEQ ID NO: 6).
220), eryBVI (nucleotides 3308-4837 of SEQ ID NO: 6).
EryCIV (sequence of nucleotides 4837 to 6039 of SEQ ID NO: 6)
), A DNA sequence selected from eryCV (sequences of nucleotides 6080-7546 of SEQ ID NO: 6) or eryBVII (sequences of nucleotides 7578-8156 of SEQ ID NO: 6) or at least one hybridization of a fragment of this sequence Use as a probe.
遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしての利用。17. Macro of an eryCIII DNA (complementary sequence of nucleotides 1046 to 2308 of SEQ ID NO: 1 = complementary sequence of SEQ ID NO: 4) shown in FIG. Use as a hybridization probe to isolate genes responsible for lactone glycosylation.
の領域に対応する図２２に示した単離されたＤＮＡ配列(SEQ ID NO:１５の配列)
： − ＯＲＦｏｌｅＰ１のヌクレオチド１８４〜１３８６に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ１のヌクレ
オチド１４３７〜２７１４に対応する配列、 − グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードするＯＲＦｏｌｅＧ２のヌクレ
オチド２７２２〜３９９９に対応する配列、 − ＯＲＦｏｌｅＭのヌクレオチド３９９２〜４７２０に対応する配列(＝SEQ I
D NO:２０の配列)及び − ＯＲＦｏｌｅＹのヌクレオチド４８１０〜５９６７に対応する配列。19. The isolated DNA sequence shown in FIG. 22 (sequence of SEQ ID NO: 15) corresponding to the region of the oleandmycin biosynthesis gene cluster including:
-A sequence corresponding to nucleotides 184 to 1386 of ORFoleP1, a sequence corresponding to nucleotides 1437 to 2714 of ORFoleG1 encoding glycosyltransferase activity, a sequence corresponding to nucleotides 2722 to 3999 of ORFoleG2 encoding glycosyltransferase activity,- Sequence corresponding to nucleotides 3992-4720 of ORFoleM (= SEQ I
D NO: 20) and-a sequence corresponding to nucleotides 4810-5967 of ORFoleY.
且つデソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO:１ ７の配列)。23. A polypeptide encoded by the DNA sequence corresponding to ORFoleG1 and having desosaminyltransferase activity (sequence of SEQ ID NO: 17).
且つオレアンドロシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド(SEQ ID NO
:１８)。24. A polypeptide encoded by a DNA sequence corresponding to ORFoleG2 and having oleandrosyltransferase activity (SEQ ID NO:
: 18).
方法であって、該方法においては： − 図２(SEQ ID NO:１の相補性配列)又は図３(SEQ ID NO:６の配列)に示したエ
リスロマイシンの生合成遺伝子のクラスターの少なくとも一のｅｒｙＢ配列又は
ｅｒｙＣ配列を含むＤＮＡ配列を単離し、 − 該配列中に改変を造って、変化した配列を得、 − この変化した配列を宿主株の染色体中にインテグレートして、改変された株
を得、 − この改変された株を、ハイブリッド二次代謝産物の形成を与える条件下で培
養し、そして − このハイブリッド二次代謝産物を単離する、上記の製造方法。25. A method for producing a hybrid secondary metabolite in Sac. Erythraea, comprising:-Figure 2 (complementary sequence of SEQ ID NO: 1) or Figure 3 (SEQ ID NO: 6 Isolating a DNA sequence comprising at least one eryB or eryC sequence of the cluster of erythromycin biosynthesis genes shown in Is integrated into the chromosome of the host strain to obtain a modified strain,-the modified strain is cultured under conditions that provide for the formation of a hybrid secondary metabolite, and-the hybrid secondary metabolite is The above-mentioned production method to be isolated.
、請求項２５に記載の方法 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。26. The method of claim 25, wherein the DNA sequence encodes one of the following enzymes: dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase; Minyl transferase, -dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase, -mycarosyltransferase, -dTDP-D- 6-deoxyhexose 3-N-methyltransferase, dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-dehydratase, dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase, dTDP-D- 4,6-dideoxyhexose 3,4-reductase or -dTDP-4- Door -D-6- deoxy-hexose 3,5-epimerase.
じる請求項２５に記載の方法 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。27. The method of claim 25, wherein the sequence change results in inactivation of at least one of the following enzymes:-dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase; Sosaminyltransferase, -dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose4-reductase, -mycarosyltransferase, -dTDP-D -6-deoxyhexose 3-N-methyltransferase, dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-dehydratase, dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase, dTDP-D -4,6-dideoxyhexose 3,4-reductase or -dTDP-4 Keto -D-6- deoxy-hexose 3,5-epimerase.
キシヘキソース４−レダクターゼである、請求項２７に記載の方法。28. The method of claim 27, wherein the enzyme that is inactivated is dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase.
ース３，４−デヒドラターゼである、請求項２７に記載の方法。29. The method according to claim 27, wherein the enzyme to be inactivated is dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase.
る、請求項２７に記載の方法。30. The method according to claim 27, wherein the enzyme to be inactivated is mycarosyltransferase.
キシヘキソース２，３−レダクターゼである、請求項２７に記載の方法。31. The method according to claim 27, wherein the enzyme to be inactivated is dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-reductase.
スロマイシン、４’−ヒドロキシ−エリスロマイシン又は３”−Ｃデスメチル−
２”，３”−エン−エリスロマイシンから選択するエリスロマイシンアナログで
ある、請求項２５に記載の方法。32. The isolated hybrid secondary metabolite is 4 "-keto-erythromycin, 4'-hydroxy-erythromycin or 3" -C desmethyl-
26. The method of claim 25, which is an erythromycin analog selected from 2 ", 3" -en-erythromycin.
スロノリドＢである、請求項２５に記載の方法。33. The method of claim 25, wherein the isolated hybrid secondary metabolite is desosaminyl erythronolide B.
つ少なくとも一のハイブリッド二次代謝産物を生成しているSac. erythraeaの改
変株 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼ、 − デソサミニルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−イソメラーゼ、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース４−レダクターゼ、 − ミカロシルトランスフェラーゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
、 − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−デヒドラターゼ
、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，４−デヒドラターゼ、 − ｄＴＤＰ−Ｄ−４，６−ジデオキシヘキソース３，４−レダクターゼ又は − ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｄ−６−デオキシヘキソース３，５−エピメラーゼ。34. A modified strain of Sac. Erythraea-dTDP-4-keto-L-6-deoxy wherein at least one of the enzymes selected from the following is inactivated and produces at least one hybrid secondary metabolite: Hexose 2,3-reductase, -desosaminyltransferase, -dTDP-4-keto-D-6-deoxyhexose 3,4-isomerase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase,- Mycarosyltransferase, -dTDP-D-6-deoxyhexose 3-N-methyltransferase, -dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3-dehydratase, -dTDP-D-6-deoxyhexose 3 , 4-dehydratase, -dTDP-D-4,6-dideoxyhexyl Over scan 3,4 reductase or - dTDP-4-keto--D-6- deoxyhexose 3,5-epimerase.
−レダクターゼが不活性化されていて３”−Ｃデスメチル−２”、３”−エン−
エリスロマイシンＣを産生するSac. erythraeaの改変株(ＢＩＩ９２)。35. dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 2,3
-Reductase is inactivated and 3 "-C desmethyl-2", 3 "-ene-
A modified strain of Sac. Erythraea that produces erythromycin C (BII92).
ダクターゼが不活性化されていて４”−ケト−エリスロマイシンを産生するSac.
erythraeaの改変株(ＢＩＶ８７)。36. Sac. Wherein dTDP-4-keto-L-6-deoxyhexose 4-reductase is inactivated to produce 4 "-keto-erythromycin.
A modified strain of erythraea (BIV87).
ターゼが不活性化されていて４’−ヒドロキシエリスロマイシンＤを産生するSa
c. erythraeaの改変株(ＣＩＶ８９)。37. Sa wherein dTDP-D-6-deoxyhexose 3,4-dehydratase is inactivated to produce 4'-hydroxyerythromycin D
c. Modified strain of erythraea (CIV89).
アミニルエリスロマイシンＢを産生するSac. erythraeaの改変株(ＢＶ８８)。38. A modified strain of Sac. Erythraea (BV88) in which mycarosyltransferase is inactivated and produces desoaminylerythromycin B.
１５のヌクレオチド２７２２〜３９９９の配列)に対応するＤＮＡ配列から選択 した遺伝子の配列中に変化を造って、改変株を得、 − この改変株を、オレアンドマイシンの前駆体の蓄積を与える条件下で培養し
、そして − これらの前駆体を単離する、上記の製造方法。39. A process for producing a precursor of oleandmycin in S. antibioticus, comprising:-ORFoleG1 (sequence of nucleotides 1437 to 2714 of SEQ ID NO: 15) in the chromosome of the host strain. And the DNA sequence corresponding to ORFoleG2 (SEQ ID NO:
(A sequence of 15 nucleotides 2722-3999) to create a modified strain in the sequence of a gene selected from the DNA sequence corresponding to the modified strain under conditions that provide for the accumulation of oleandmycin precursors. And the isolation of these precursors.
８，８ａ−デオキシオレアンドリドの蓄積である、請求項３９に記載の製造方法
。40. An alteration is made in the DNA sequence corresponding to ORFoleG1 (sequence of nucleotides 1437-2714 of SEQ ID NO: 15), resulting in at least elimination of desoaminyltransferase activity and oleandomycin precursor. 40. The production method according to claim 39, which is accumulation of the body 8,8a-deoxyoleandlide.
[３．４，６−トリデオキシ−３−(ジメチルアミノ)−Ｄ−．キシロ．−ヘキソ ピラノシル]エステル(ｄＴＤＰ−Ｄ−デソサミン)及びその塩基付加塩。41. Thymidine 5 ′-(trihydrogen diphosphate), P′-
[3.4,6-Trideoxy-3- (dimethylamino) -D-. Kishiro. -Hexopyranosyl] ester (dTDP-D-desosamine) and base addition salts thereof.
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