JP2001510682A

JP2001510682A - 免疫グロブリンヒンジ領域リンカーを有する融合タンパク質

Info

Publication number: JP2001510682A
Application number: JP2000502205A
Authority: JP
Inventors: ストローム，テリー，ビー．; シトコウスキー，アーサー，ジェイ．; チェン，シン，シアオ
Original assignee: ベスイスラエルディーコネスメディカルセンター
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2001-08-07
Also published as: AU8392198A; WO1999002711A3; WO1999002711A2; AU731583B2; CA2295149A1; US6165476A; EP0998573A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫グロブリンヒンジ領域リンカーを有する融合タンパク質の製造および使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景生化学的技術または分子生物学技術を用いて、新規な性質または増強された性
質を有する治療用タンパク質を生産することに多くの興味がある。１つの望まし
い性質は、生物学的活性の増大、特にタンパク質の循環半減期の増加である。

【０００２】治療用タンパク質の生物学的活性を増大させるために、いくつもの方法が利用
されている。これらの方法は、しばしば治療剤の大きさを増大することに焦点が
置かれる。タンパク質の大きさを増大させる１つの方法は、他のタンパク質との
化学架橋を介するものである。例えば、タンパク質の抗原性を増大させるために
、化学架橋剤を用いて免疫原性タンパク質を免疫グロブリンまたは血清アルブミ
ンなどの担体分子に結合させる。

【０００３】しかしながら、化合物または内因性分子のタンパク質への結合は、例えば、修
飾の結果として、生じる立体構造変化または立体障害の増加などにより、タンパ
ク質の全生物学的活性の顕著な減少をもたらす〔Ｋｎｕｓｌｉ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，８２：６５４−６６３（１９９２）
〕。

【０００４】ペプチドリンカーなどの別法も用いられている。例えば、米国特許第５，０７
３，６２７号明細書は、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
タンパク質分子とインターロイキン−３（ＩＬ−３）タンパク質分子とを結合し
て融合タンパク質を形成させるためのペプチドリンカーの使用を記載する。しか
しながら、慣用のペプチドリンカーは、柔軟性がなく、フレキシブルではないで
あろう。結果として、連結タンパク質は、野生型タンパク質により奏される所望
の生物学的に活性な立体構造に「曲げる」ことができないか、あるいは架橋また
は担体タンパク質が、生物学的活性を立体的に妨害する。したがって、イン・ビ
ボでの半減期を増加することなどの生物学的活性が増加するような様式でタンパ
ク質を連結するのに適するリンカーの必要性がある。

【０００５】発明の要旨本発明は、生物学的活性を有する融合タンパク質、ならびに２つ以上のタンパ
ク質、ポリペプチド、または生物学的活性なそれらの断片、バリアント、変異体
、アナログもしくは誘導体の共有結合的な結合を介したこれらの融合タンパク質
の製造方法に関する。また、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載のよう
に、増大した生物学的活性を発揮しうる。前記共有結合は、免疫グロブリン（Ｉ
ｇ）ヒンジ領域アミノ酸配列を用いて形成される。融合タンパク質のタンパク質
をコードする核酸は、タンデムに連結し、Ｉｇヒンジ領域配列をコードする核酸
を介して、連続的に核酸を連結することを意味する。タンデムという用語は、本
発明の融合タンパク質を説明する別の意味でもある。

【０００６】連結（ｌｉｎｋｅｄ）または接合（ｊｏｉｎｅｄ）対象のタンパク質は、同一
のタンパク質、実質的に類似したタンパク質または異なるタンパク質のいずれか
である。重要なことに、タンパク質は、該タンパク質のカルボキシル末端または
アミノ末端のいずれかを介してヒンジリンカーと付着されうる。このことは、か
かる付着により、タンパク質のカルボキシル末端が、例えば、リガンドまたはレ
セプターとの相互作用または結合から免れさせることに特に有利である。

【０００７】同一のタンパク質のみまたは実質的に類似したタンパク質のみを含有した融合
タンパク質を説明する場合、「ホモ」の接頭語を用いる。例えば、ホモ融合タン
パク質は、２つ以上の同一の、実質的に類似した、Ｉｇヒンジ領域アミノ酸配列
リンカーを介して接合したタンパク質分子を含有した融合タンパク質を説明する
。１種を超えるタンパク質を含有した融合タンパク質を説明する場合、「ヘテロ
」の接頭語を用いる。例えば、ヘテロ融合タンパク質は、１以上の残部タンパク
質と異なる１以上のタンパク質をともに接合した２つ以上のタンパク質を含有す
る。

【０００８】本発明の融合タンパク質は、生物学的活性を発揮する。本明細書に用いられる
「生物学的活性」という用語は、内因性または野生型の非融合タンパク質の活性
をいう。例えば、サイトカインヒンジ−サイトカイン融合タンパク質は、該融合
タンパク質が非融合サイトカイン（または異なるサイトカインを融合した場合、
サイトカイン類）の活性を発揮する場合、生物学的活性を有する。

【０００９】一方、本発明の融合タンパク質は、増加した生物学的活性を発揮しうる。増加
した生物学的活性は、同一のタンパク質または実質的に類似したタンパク質を含
有した融合タンパク質に関して用いられた場合、延長された血漿半減期（すなわ
ち、天然由来のモノマータンパク質に比べて、より長い循環半減期）、またはよ
り高いポテンシー（すなわち、天然由来のタンパク質に比べて、特定レベルの生
物学的活性に達するのにより少量を要求すること）として定義される。また、増
加した生物学的活性は、前記活性の組み合わせ、例えば、延長された循環半減期
をも発揮する、より高いポテンシーの融合タンパク質を包含する。本発明のタン
パク質は、増加した生物学的活性を有するため、該タンパク質を投与するべき頻
度を減少させるか、または有効投与量を達成する投与量を減少させる。天然由来
のタンパク質が用いられた場合に必要である量よりも、融合タンパク質の減少し
た量が治療のコースで必要とされるであろう。

【００１０】異なるタンパク質を含有した融合タンパク質は、前記増加した生物学的活性お
よび／またはその構築に用いられる異なる構成成分タンパク質の新規な特徴を発
揮させる目的のために作成される。例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）とヒト
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）とからなる融合タンパク質は、ＰＤＥＦ構成成
分が損傷結合組織の修復に有益であるが、融合タンパク質のＥＰＯ構成成分は、
哺乳類における血液ロスの治療を促進するであろう外傷性損傷の症例に有益であ
ろう。２種以上の異なるタンパク質を含むヘテロ融合タンパク質は、相乗作用的
な特性を発揮し、したがって、各タンパク質構成成分が単独で投与された場合、
融合タンパク質中に見出される類似した量の各タンパク質により発揮されるであ
ろう活性より多い生物学的活性を発揮しうる。

【００１１】本発明には、免疫グロブリンヒンジ領域に連結されうる、治療的活性を有する
、いかなるタンパク質、ポリペプチド、または生物学的に活性なそれらの断片、
バリアント、変異体、アナログもしくは誘導体をも用いることができる。サイト
カイン類、成長因子類およびホルモン類が本発明により具体的に包含され、例え
ば、下記：インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−
γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、イ
ンターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インター
ロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキ
ン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキ
ン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキ
ン−１６、エリスロポエチン、コロニー刺激因子−１、顆粒コロニー刺激因子、
顆粒マクロファージコロニー刺激因子、白血病阻害因子、腫瘍壊死因子、リンフ
ォトキシン、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子
、表皮成長因子、トランスフォーミング成長因子−β、トランスフォーミング成
長因子−α、トロンボポエチン、幹細胞因子、オンコスタチンＭ、アンフィレギ
ュリン、ミュレリアン阻害基質、Ｂ細胞成長因子、マクロファージ移動阻害因子
、エンドスタチン、アンジオスタチンなどが挙げられる。

【００１２】より具体的には、本発明は、免疫グロブリンヒンジ領域を含有したアミノ酸配
列により、２つのエリスロポエチン（ＥＰＯ）分子が連結され、かつ前記で規定
したように、ホモ融合タンパク質が増加した生物学的活性を有するものであるホ
モ融合タンパク質に関する。また、本発明は、ヒンジ領域配列を介してＩＬ２が
ＦａｓＬに連結し、かつＩＬ２−ＦａｓＬ融合タンパク質が生物学的活性を有す
るものであるヘテロ融合タンパク質に関する。

【００１３】さらに、本発明は、前記で規定したように、同一、実質的に類似、または異な
る２つ以上のタンパク質分子を結合するのに用いられる免疫グロブリンヒンジ領
域を含有した融合タンパク質の製造方法に関する。

【００１４】また、本発明は、本明細書に記載された融合タンパク質を用いる方法に関する
。本発明の融合タンパク質は、非融合野生型タンパク質と同様の様式で特に増加
した生物学的活性が望まれうる場合に用いられうる。例えば、非融合野生型ＥＰ
Ｏよりもより長いイン・ビボ半減期を有する本発明のＥＰＯ融合タンパク質は、
さらに下記に記載するように、様々な貧血状態を治療するために用いられうる。

【００１５】本明細書に記載された研究の結果、増加した生物学的活性を有する、ホモ融合
タンパク質、ヘテロ融合タンパク質が目下利用可能である。これらの融合タンパ
ク質は、より少ない頻度、または同じ頻度であるが、野生型タンパク質に比べて
、より少ない投与量で、あるいはより少ない副作用で注射されうる。

【００１６】発明の詳細な説明本発明は、免疫グロブリンヒンジ領域配列を含有したアミノ酸配列により連結
した１つ以上のタンパク質を含有した、生物学的に活性な融合タンパク質に関す
る。

【００１７】基本的な免疫グロブリン、すなわちＩｇ、構造単位は、テトラマーを含有する
ことが知られており、各テトラマーはポリペプチド鎖の２つの同一ペアを有する
。これらのポリペプチド鎖は、それらの分子量に関して、「軽」（Ｌ）および「
重」（Ｈ）として示される。各鎖のＮ末端部分は、抗原認識に最初に応答しうる
可変（Ｖ）領域と定義する。各鎖のＣ末端部分は、最初にエフェクター機能に応
答しうる定常（Ｃ）領域と定義する。

【００１８】軽鎖および重鎖内で、約１１０アミノ酸から構成される単位は、別個のドメイ
ンを形成する。各ドメインは、１つの内部ジスルフィド結合により共に維持され
る。重鎖は、一般的には、４つのかかるドメインを含み、一方、軽鎖は、一般的
には２ドメインを含む。重鎖の最初のＮ末端ドメインのＣＯＯＨ末端であるＶ_H は、軽鎖のＮ末端ドメインであるＶ_Lと相互作用し、抗体の結合領域を生産する
。Ｃ末端に向かって、重鎖の次の３つのドメインをそれぞれＣ_H１、Ｃ_H２およ
びＣ_H３と示す。

【００１９】ほとんどの重鎖は、少数のアミノ酸からなるＣ_H１ドメインとＣ_H２ドメイン
との間にヒンジ領域を有する。前記ヒンジは、フレキシブルであり、結合領域が
残りの分子に比べて自由に動くことを可能にする。２つのダイマーを共に保持す
るジスルフィド架橋は、ヒンジ領域にあり、テトラマー構造単位をつくる。

【００２０】高等脊椎動物において、５つのクラスの免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）があり、その全てがヒンジ領域を含む。さらに、こ
れらのクラスの免疫グロブリンのいくつかは、サブクラスを有し、例えば、Ｉｇ
Ｇは４つのサブクラス（ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃およびＩｇＧ₄）を有す
る。（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ，第３版，ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ中，第２３章：ＴｈｅＩｍｍｕｎｅＳ
ｙｓｔｅｍ）。これらのクラスの免疫グロブリンおよびサブクラス由来のヒンジ
領域のアミノ酸配列、ならびに他の種由来のクラスおよびサブクラスは、本発明
に包含される。

【００２１】前記ヒンジ領域は、しばしば、３つの領域：上流ヒンジ、中央ヒンジ、および
下流ヒンジに分けられる。上流ヒンジは、重鎖の最初のドメイン（Ｃ_H１）の末
端と内部重鎖ジスルフィド架橋を形成する最初のシステインとの間のアミノ酸の
数として定義される。中央ヒンジは、プロリンに富み、かつ内部重鎖システイン
ジスルフィド架橋を含む。下流ヒンジは、中央ヒンジをＣ_H２ドメインに結合す
る。Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．およびＭｉｃｈａｅｌｓｅｎ，Ｔ．，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ中、第３章
：ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅＨｉｎｇｅＲｅｇｉｏｎｔｏＯｐｔ
ｉｍｉｚｅＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄＣｙｔｏｌｙｓｉｓ，Ｗ
．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹを参照のこと
。Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．，ＮａｔｕｒａｌｌｙＯｃｃｕｒ
ｒｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＤｅｖｏｉｄｏｆＬｉｇｈｔＣｈａｉ
ｎｓ，３６３Ｎａｔｕｒｅ４４６（１９９３）およびＴｅｒｓｋｉｋｈ，
Ａ．Ｖ．，”Ｐｅｐｔａｂｏｄｙ”：ＡＮｅｗＴｙｐｅｏｆＨｉｇｈ
ＡｖｉｄｉｔｙＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ，９４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１６６３（１９９７）も参照のこと。

【００２２】以前の研究は、表に示されるいくつかのヒトサブクラスおよびマウスサブクラ
スにおけるこれら３つのヒンジ領域のアミノ酸配列を同定している。

【００２３】

【表１】

【００２４】本明細書に用いられるように、Ｉｇ「ヒンジ」領域という用語は、天然由来の
Ｉｇヒンジ領域配列の部分と同一または類似した配列を有するアミノ酸配列を含
有したポリペプチドをいい、ジスルフィド結合が免疫グロブリンの２つの重鎖を
連結するシステイン残基が挙げられる。本発明のヒンジ領域リンカーの天然由来
の免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列との配列類似性は、少なくとも５０％
から約７５〜８０％の範囲であり、典型的には、約９０％よりも大きい範囲であ
りうる。

【００２５】ヒンジ領域の誘導体およびアナログは、変異により得られうる。本明細書でい
う、誘導体またはアナログは、欠失、挿入および／または置換に帰する１以上の
アミノ酸配列の差異を有することをのぞく、野生型（または天然由来のタンパク
質）の全長配列との配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を含有した
ポリペプチドである。

【００２６】また、本発明は、前記ヒンジ領域の断片を包含する。かかる断片は、ただヒン
ジ領域断片により付着されたタンパク質が生物学的に活性な立体構造を獲得させ
るに十分な長さであることのみが必要である。

【００２７】本発明の融合タンパク質は、一般的に、あるタンパク質のＣ末端とＩｇヒンジ
領域のＮ末端との融合および別のタンパク質のＮ末端とタンパク質−ヒンジ複合
体のＣ末端との融合により接合される。したがって、本発明の融合タンパク質は
、Ｒ₁がタンパク質であり、Ｒ₂がＲ₁と同一のタンパク質または実質的に類似
したタンパク質であり、Ｌ（リンカー）は、Ｉｇヒンジ領域配列である、式Ｒ₁ −Ｌ−Ｒ₂を有する。一方、本発明の融合タンパク質は、Ｒ₁がタンパク質であ
り、Ｒ₂がＲ₁と異なるまたは実質的に異なるタンパク質であり、Ｌ（リンカー
）は、Ｉｇヒンジ領域である、式Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂を有する。タンパク質は、融合
タンパク質中のタンパク質のそれぞれの生物学的活性を残す単独のタンパク質を
生産するような様式で他者と連結される。

【００２８】しかしながら、天然由来のタンパク質、またはそれらの断片、アナログ、変異
体、バリアントもしくは誘導体の生物学的活性のレベルは、天然由来のタンパク
質（本明細書中においては、親タンパク質ともいう）の活性と同じである必要は
ない。例えば、サイトカインタンパク質の断片は、２つ以上のサイトカインが連
結して融合タンパク質を形成するため、該融合タンパク質が１分子の天然由来の
サイトカインと比べて増加した生物学的活性をいまだ呈するであろうにもかかわ
らず、天然由来のサイトカインの活性の５０〜８０％しか示さないであろう。各
タンパク質構成成分に特異的な生物学的活性を決定するための試験は、当業者に
熟知されており、例えば、造血、血小板生産またはレセプター結合の増加を測定
することなどが挙げられる。例えば、エリスロポエチンの変異体の生物学的活性
は、米国特許第５，６１４，１８４号明細書および第５，５８０，８５３号明細
書に記載のように測定されうる。

【００２９】融合タンパク質構築物は、各分子を列挙することにより命名される。例えば、
ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯは、Ｉｇヒンジ領域により接合された２つのＥＰＯ分子を含
有したホモ融合タンパク質をいう。同様に、ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯは
、３つのＥＰＯ分子のそれぞれの間にＩｇヒンジ領域を有する３つのＥＰＯ分子
を含有したホモ融合タンパク質を称しうる。ヘテロ融合タンパク質などの他の組
み合わせは、例えば、ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯ−Ｌ−ＩＬ３、ＥＰＯ−Ｌ−ＩＬ３−
Ｌ−ＩＬ３などが可能である。１を超えるＩｇヒンジ領域が有る場合、１つのＩ
ｇヒンジ領域は、例えば、ＥＰＯ−Ｌ−Ｌ−ＥＰＯなど、融合タンパク質中の他
のＩｇヒンジ領域に連結されうる。

【００３０】例えば、エリスロポエチンなどのタンパク質は、そのアミノ末端またはカルボ
キシル末端のいずれかを介してヒンジに付着（例えば、接合または連結）させう
ることに留意するのが重要である。例えば、本明細書に記載のように、融合タン
パク質を生産し、ＩＬ２−ヒンジ−ＦａｓＬにおいては、タンパク質はアミノ末
端を介してヒンジに付着される。一方、タンパク質のカルボキシル末端を介して
ヒンジと付着される。

【００３１】融合タンパク質の生産本明細書に用いられる「組換え」という用語は、タンパク質が、組換え（例え
ば、微生物、ウイルス、昆虫または哺乳類）発現系由来であることを意味する。
「微生物」とは、細菌または真菌、例えば、酵母の発現系でつくられた組換えタ
ンパク質をいう。ほとんどの細菌培養物で発現されたタンパク質は、グリカンが
ないであろう。酵母で発現されたタンパク質は、哺乳類細胞で発現されたタンパ
ク質のものとは異なるグリコシル化パターンを有するであろう。

【００３２】本明細書に用いられる、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」の用語は、
デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のヘテ
ロポリマーをいう。本発明により提供されるタンパク質をコードする核酸配列は
、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡと短オリゴヌ
クレオチドリンカーとから集められ、組換え転写単位で発現されうる合成核酸配
列を提供することができる。

【００３３】本明細書に用いられる「組換え発現ベクター」の用語は、本発明の融合タンパ
ク質をコードし、かつ（１）遺伝子エレメントまたは遺伝子発現に調節的な役割
を有するエレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーなど；（２）ｍ
ＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、構造配列またはコード配列；なら
びに（３）適切な転写開始および翻訳開始配列ならびに転写終結および翻訳終結
配列の集合体を含有した転写単位を含むＤＮＡの増幅または発現のいずれかに用
いられる複製可能なＤＮＡ構築物をいう。酵母発現系における使用を意図する構
造エレメントは、好ましくは、宿主細胞により翻訳タンパク質の細胞外分泌を可
能にするリーダー配列を含む。一方、組換えタンパク質がリーダー配列または移
送配列なしで発現される場合、Ｎ末端メチオニン残基を含んでもよい。本残基は
、発現組換えタンパク質から任意に順次切断され、最終産物を提供する。

【００３４】融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、タンパク質およびＩｇヒンジ領域
をコードする別々のＤＮＡ配列を組み立てる組換えＤＮＡ技術を用いて生産され
うる。ついで、タンパク質−リンカー−タンパク質配列をコードする本ＤＮＡ構
築物を適切な発現ベクターに挿入する。例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ
配列の３’末端をＩｇヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結する
。ついで、本タンパク質−ヒンジＤＮＡ配列の３’末端を同じタンパク質または
異なるタンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列の５’末端に、１つの生物学的
に活性な融合タンパク質への配列のｍＲＮＡ翻訳を可能にする状態で配列の読み
枠にあわせて連結する。ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写に応答しうる調節エレメント
は、タンパク質−ヒンジ複合体ＤＮＡ配列を保持するが、一方、第２のタンパク
質ＤＮＡ配列への通し読みを妨げる結合シグナルまたは終止コドンを除去する。
逆に、第２のタンパク質ＤＮＡ配列から調節エレメントを除去するが、翻訳を終
わらせるのに必要な終止コドンを保持する。

【００３５】また、本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、プリン塩基およびピリミ
ジン塩基と当該分野において熟知された核酸合成技術とを用いて合成的に生産さ
れうる。

【００３６】本発明は、２つ以上の分子のタンパク質を含有した融合タンパク質を提供する
。また、本発明の融合タンパク質は、生物学的活性を保持する第１のタンパク質
の多様な構造形態を含む。例えば、酸化または還元により、個々のアミノ酸残基
を改変してもよい。例えば、米国特許第５，６１４，１８４号明細書を参照のこ
と。

【００３７】本発明は、本明細書記載のタンパク質の生物学的に活性な断片、アナログ、変
異体、バリアントおよび誘導体を本質的に包含する。本明細書において「アナロ
グ」は、内因性タンパク質の生物学的活性を有する内因性タンパク質のアミノ酸
配列に類似した十分なアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を意味することが定義
される。例えば、ポリペプチドのアナログは、１つ以上のアミノ酸残基がタンパ
ク質のアミノ酸配列と相違するが、タンパク質の品質を有するポリペプチドをも
たらす配列中の「サイレント」変化を有する核酸配列によりコードされうる。か
かる相違の例示としては、残基の付加、欠失または置換が挙げられる。

【００３８】本発明は、タンパク質の生物学的に活性な断片をも包含する。かかる断片は、
タンパク質の全長アミノ酸配列の一部のみを含むが生物学的活性を有することが
できる。本明細書に用いられる「生物学的に活性な断片」は、全長タンパク質の
生物学的または生理学的作用を発揮しうるか、または全長タンパク質の生物学的
特性を有する断片を意味する。かかる断片は、アミノ末端およびカルボキシル末
端欠失ならびに内部欠失により生産されうる。酵素消化により得られたタンパク
質の活性断片をも含む。

【００３９】当業者に熟知された方法を用いて生物学的活性を試験しうる。例えば、本発明
の融合タンパク質は、哺乳類（獣医学的使用）、とりわけヒトにおける使用のた
めの生物学的活性または治療活性を有する。融合タンパク質がヘテロ融合タンパ
ク質である場合、ヘテロ融合タンパク質を含有した２つ以上のタンパク質のそれ
ぞれの活性が試験されうる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質は
、イヌにおける白血病を治療するために用いられうる。ＧＭ−ＣＳＦ活性は、米
国特許第５，０７３，６２７号明細書に記載のように、チミジン取り込みアッセ
イにおけるＡＭＬ−１９３細胞の増殖を刺激する能力についてを試験しうる。当
業者に熟知された技術によりＩＬ−３活性を試験しうる。

【００４０】例えば、エリスロポエチン融合タンパク質は、Ｋｒｙｓｔａｌの方法〔Ｋｒｙ
ｓｔａｌ，Ｇ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：６４９−６６０（１９８３
）〕を用いて生物学的活性について、試験されうる。簡単には、Ｋｒｙｓｔａｌ
のバイオアッセイは、エリスロポエチンのインタクトマウス脾臓細胞への作用を
測定する。マウスは、脾臓における赤血球細胞前駆体細胞の生産を刺激するため
に、フェニルヒドラジンで処理する。処理後、脾臓を取り出し、インタクト脾臓
細胞を注意深く単離し、種々の量の野生型エリスロポエチンまたは本明細書に記
載のエリスロポエチン融合タンパク質とともにインキュベートする。一晩培養後
、³Ｈチミジンを添加し、その細胞ＤＮＡへの取り込みを測定する。³Ｈチミジ
ン取り込み量は、エリスロポエチンの細胞レセプターとの相互作用を介する赤血
球細胞のエリスロポエチン刺激生産の指標である。

【００４１】タンパク質の「誘導体」および「バリアント」は、すでに改変されているタン
パク質である。これらは、それらのアミノ酸配列における変化により、すでに改
変されているタンパク質を含む。さらに、これらは、タンパク質の切形型および
ハイブリッド型を含む。「切形」型は、典型的には結合または分泌に影響するＣ
末端領域を除去するように改変した、タンパク質の短いバージョンである。「ハ
イブリッド」または「キメラ」型は、１つ以上の他のタンパク質と組み合わせた
１つ以上のタンパク質から構成されるタンパク質である。

【００４２】また、本発明は、天然のタンパク質グリコシル化に関連するまたは関連しない
タンパク質を提供する。大腸菌などの細菌における、融合タンパク質をコードす
るＤＮＡの発現は、非グリコシル化分子を提供する。オリゴヌクレオチド合成と
ライゲーションとにより、または部位特異的変異導入技術により、不活性化Ｎ−
グリコシル化部位を有する機能的な変異体アナログを生産しうる。これらのアナ
ログタンパク質は、酵母発現系を用いて良好な収率で、均質な還元炭水化物型で
生産されうる。真核タンパク質中におけるＮ−グリコシル化部位は、Ａ₁がＰｒ
ｏを除くいずれかのアミノ酸であり、ＺがＳｅｒまたはＴｈｒであるアミノ酸ト
リプレットＡｓｎ−Ａ₁−Ｚにより特徴付けられる。この配列中において、アス
パラギン（Ａｓｎ）は、炭水化物の共有結合的な付着のための側鎖アミノ基を提
供する。かかる部位は、Ａｓｎもしくは残基Ｚを他のアミノ酸に置換すること、
ＡｓｎもしくはＺを欠失すること、またはＡ₁とＺとの間にＺでないアミノ酸も
しくはＡｓｎとＡ₁との間にＡｓｎの他のアミノ酸を挿入することにより除去す
ることができる。

【００４３】また、融合タンパク質の変異により、誘導体およびアナログを得てもよい。融
合タンパク質のアナログは、例えば、残基または配列の様々な置換を作成するこ
とにより構築されてもよい。例えば、システイン残基は、再生時に、誤った分子
内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、欠失されるか、または他のアミノ酸と
置き換えられうる。変異導入のための他のアプローチは、ＫＥＸ２プロテアーゼ
活性が存在する酵母系における発現を促進するために隣接の２塩基アミノ酸残基
の改変に関連する。一般的に、置換は、保守的になされるべきであろう。最も好
ましい置換アミノ酸は、置換対象の残基のものと似た理化学的性質を有するもの
である。同様に、欠失または挿入ストラテジーが適用される場合、欠失または挿
入の生物学的活性における潜在的作用が考慮されるべきであろう。

【００４４】アナログの発現のために構築されたヌクレオチド配列における変異は、もちろ
ん、コード配列の読み枠部分を保存し、かつ好ましくは、ハイブリダイズして、
ｍＲＮＡの翻訳に不利に影響するであろうループまたはヘアピンなどのｍＲＮＡ
二次構造を生じうる相補的な領域を生成しないであろう。予め変異部位を決定し
てもよいが、予め変異などの性質を決定することは必須ではない。例えば、与え
られた部位での変異体の最適な特性を選択するために、ランダム変異導入が標的
コドンで行なわれてもよく、所望の活性をスクリーニングした発現した変異体で
行なわれてもよい。

【００４５】変異は、所望のアミノ酸残基をコードするオリゴヌクレオチドを合成すること
により、天然の配列の断片へのライゲーションが可能な制限部位に隣接した一定
の座に導入されうる。ライゲーション後、得られた再構築配列は、所望のアミノ
酸挿入、置換または欠失を有するアナログをコードする。

【００４６】一方、要求された置換、欠失または挿入により改変された特定のコドンを有す
る変異遺伝子を提供するためにオリゴヌクレオチド−部位特異的変異導入手法を
利用することができる。前述の変異を作成する方法例は、Ｗａｌｄｅｒｅｔ
ａｌ．（Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒｅｔａｌ．（Ｇ
ｅｎｅ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｊａｎｕａｒｙ１９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈ
ｏｄｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９８１）；および米国特許第４，５１８
，５８４および４，７３７，４６２号明細書により開示される。

【００４７】また、本発明は、哺乳類、微生物、ウイルスもしくは昆虫の遺伝子由来の適切
な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結した融合タン
パク質を含有した融合タンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ由
来ＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターを提供する。かかる調節エレメントとし
ては、下記に詳細に記載されるように、転写プロモーター、転写を制御するため
の任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配
列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。通常、複製開始
起点により付与される宿主中における複製能および形質転換体の認識を促進する
選択配列は、さらに取り込まれるであろう。一般的に、作動可能な連結は、連続
的であることを意味する。

【００４８】宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築した融合タンパク質ベクターでト
ランスフェクトした細胞である。通常、形質転換宿主細胞は、所望の融合タンパ
ク質を発現するが、ＤＮＡのクローニングまたは増幅の目的のため、形質転換さ
れた宿主細胞は、タンパク質を発現する必要がない。発現された融合タンパク質
は、一般的に培地上清中に分泌されるであろう。融合タンパク質の発現に適した
宿主細胞としては、遺伝子が適当なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母
、または高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、例えば、大腸菌などの
グラム陰性生物またはグラム陽性生物が挙げられる。高等真核細胞としては、以
下に説明する哺乳類起源の樹立細胞株が挙げられる。また、無細胞翻訳系は、本
発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いた融合タンパク質を製造することに用い
られうる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主との使用のための適当なクロ
ーニングベクターおよび発現ベクターについては、Ｐｏｕｗｅｌｓｅｔａｌ
．（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，１９８５）に記載されている。

【００４９】原核細胞発現ベクターは、通常、１つ以上の表現型選択マーカー、例えば、抗
生物質耐性を付与するタンパク質または独立栄養要求性を提供するタンパク質を
コードする遺伝子などと、宿主内の増幅を保証する宿主によって認識される複製
開始起点とを含有する。形質転換に適した原核生物宿主としては、大腸菌、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロ
コッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に属する様々な種が挙げられるが、
これら以外のものも、選択対象として用いてもよい。

【００５０】細菌における使用に適する発現ベクターは、よく知られたクローニングベクタ
ーｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含有した市販プラ
スミド由来の選択可能マーカーと細菌の複製開始起点とを含有しうる。かかる市
販ベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎ
ｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（
ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。これ
らのｐＢＲ３２２「骨格」部分を、適当なプロモーターと発現対象の構造配列と
に組み合わせる。大腸菌は、通常、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２
２の誘導体を用いて、形質転換される〔Ｂｏｌｉｖａｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎ
ｅ２：９５，１９７７〕。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性遺伝子を含んでおり、したがって、簡便な形質転換細胞の同定手段が提
供される。

【００５１】組換え微生物発現ベクターにおいてよく用いられるプロモーターとしては、ブ
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系〔Ｃｈａｎｇ
ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄ
ｅｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４，１９７９〕、トリプトフ
ァン（ｔｒｐ）プロモーター系〔Ｇｏｅｄｄｅｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，８：４０５７，１９８０〕、およびｔａｃプロモータ
ー〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２〕が挙げられる。

【００５２】また、組換え融合タンパク質は、酵母宿主、好ましくは、Ｓ．セレビジエ（ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス種に由来する酵母宿主中で発現させ
てもよい。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クライベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ）など他の属の酵母も、利用してもよい。酵母ベクターは、一般に、酵母
プラスミド由来の複製開始起点、または自己複製配列( ＡＲＳ) 、プロモーター
、融合タンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための
配列、および選択遺伝子を含む。好ましくは、酵母ベクターは、例えば、大腸菌
のアンピシリン耐性遺伝子やトリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然
変異株に選択マーカーを提供するＳ．セレビジエｔｒｐ１遺伝子などの酵母と大
腸菌との両者の形質転換を可能にする複製開始起点および選択可能マーカー、な
らびに下流構造配列の転写を誘導する高度発現酵母遺伝子由来プロモーターを含
む。酵母宿主細胞ゲノム中におけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファン非存
在下での生育による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。

【００５３】酵母ベクターに適したプロモーター配列としては、メタロチオネイン、３- ホスホグリセレートキナーゼ〔Ｈｉｔｚｅｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０〕、またはエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６- ホスフェートイソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース
−ホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキ
ナーゼなどその他の糖分解酵素〔Ｈｅｓｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚ
ｙｍｅＲｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．
，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８〕のプロモーターが挙げられる。
酵母発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、当該分野におい
て良く知られている。

【００５４】好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２
２由来ＤＮＡ配列（Ａｍｐ遺伝子および複製開始起点）を用いて構築することが
でき、異種タンパク質の分泌を司るグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターおよび
α- 因子リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を、プロモーターと発現対象の構造遺伝
子との間に挿入することができる〔Ｋｕｒｊａｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ３
０：９３３，１９８２；およびＢｉｔｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５３３０，１９８４〕。リーダー配列は
、そのリーダー配列の外来遺伝子への融合を促進するために、３’末端付近に１
つ以上の有用な制限部位を含むように改変してもよい。

【００５５】適切な酵母形質転換プロトコルは、当業者にとって公知であり、代表的な技術
は、０. ６７％酵母ナイトロジェンベース、０. ５％カザミノ酸、２％グ
ルコース、１０μｇ/ ｍｌアデニンおよび２０μｇ/ ｍｌウラシルからなる
選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換体を選択する方法が、Ｈｉｎｎｅｎｅｔａｌ
．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９，１９７
８に記載されている。

【００５６】ＡＤＨ２プロモーターを含有したベクターにより形質転換した宿主株は、８０
μｇ/ ｍｌアデニンおよび８０μｇ/ ｍｌのウラシルを加えた、１％イース
トエキストラクト、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる栄養培地中
で、発現のために成育させてもよい。培地グルコースが消耗すると、ＡＤＨ２プ
ロモーターの脱抑制が起きる。さらなる精製に先立ち、濾過により、粗酵母上清
を集め、４℃に保つ。様々な哺乳類または昆虫の培養細胞系を利用して、組換え
タンパク質を発現させることができる。昆虫細胞中での異種タンパク質を製造す
るためのバキュロウイルス系について、ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）により概説されている。適切な
哺乳類宿主細胞株の例示としては、Ｇｌｕｚｍａｎ〔Ｃｅｌｌ２３：１７５，
１９８１〕に記載されたサル腎臓細胞のＣＯＳ−７株、および適切なベクターを
発現しうるその他の細胞株が挙げられ、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ) 、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株などが挙げ
られる。哺乳類発現ベクターは、複製開始起点、発現対象の遺伝子に連結させた
適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’フランキ
ング非転写配列などの非転写エレメントと、必要なリボソーム結合部位、ポリ−
アデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、および転写終結配
列などの５’から３’への非翻訳配列とを含有してもよい。

【００５７】脊椎動物細胞を形質転換するのに使用する発現ベクターにおける転写制御配列
および翻訳制御配列は、ウイルス源により提供されてもよい。例えば、一般的に
使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２
、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスから得ら
れる。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期
および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部
位を、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供するために用
いてもよい。初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスオリジンオア
レプリケーション（ｏｒｉｇｉｎｏｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）も含む断
片として、どちらもウイルスから容易に得られるため、とくに有用である〔Ｆｉ
ｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３，１９７８〕。Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位からウイルス複製開始起点に位置するＢｇＩＩ部位へ向けて伸びてい
る約２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小型または大型のＳＶ４０断片も
用いることができる。代表的ベクターは、岡山（Ｏｋａｙａｍａ）とバーグ（Ｂ
ｅｒｇ）〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３〕の開示のよ
うに構築されうる。

【００５８】ＥＰＯＤＮＡの発現のための好ましい真核生物ベクターとしては、ともにｐ
ＢＣ１０２. Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７，２５５）に由来する酵母発現ベクターであ
り、かつ大腸菌および酵母における選択および複製のためのｐＢＲ３２２由来Ｄ
ＮＡ配列（Ａｐｒ遺伝子および複製開始起点）を含むｐＩＸＹ３２１およびｐＩ
ＸＹ３４４が挙げられる。

【００５９】精製哺乳類融合タンパク質またはアナログは、本発明のＤＮＡの組換え翻訳産
物を発現するに適する宿主／ベクター系を培養することにより調製され、ついで
、それらは、培地または細胞抽出物から精製される。例えば、培地に組換えタン
パク質を分泌する系から得た上清を、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）または
ミリポアペリコン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置など
の市販のタンパク質濃縮フィルターを用いてまず濃縮することができる。濃縮工
程後に、濃縮物を適切な精製マトリックスにかけることができる。

【００６０】最後に、例えば、付加的メチルまたはその他の脂肪族基を有するシリカゲルな
ど１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ- ＨＰＬＣ）担体を用いて
、融合タンパク質組成物をさらに精製することができる。上記精製工程の一部ま
たはすべてを様々に組み合わせたものも、均質な組換えタンパク質を提供する目
的に使用することができる。

【００６１】細菌培養物中で産生した組換えタンパク質は、通常、細胞ペレットからの初回
抽出によって単離された後、濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロ
マトグラフィー工程の１以上の工程に付される。最後に、高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いて、最終精製工程を行う。組換え融合タンパク質の発
現に使用する微生物細胞は、凍結解凍サイクル、音波処理、機械的破砕法、また
は細胞溶解剤の使用などを含むいかなる簡便な方法によっても、破砕することが
できる。

【００６２】分泌タンパク質として融合タンパク質を発現する酵母の発酵は、精製を大幅に
簡略化する。大規模発酵から得られた分泌組換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌｅ
ｔａｌ．〔Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４〕に開示され
ている方法と同様にして精製することができる。

【００６３】組換え培養物中で合成された融合タンパク質は、培養物から融合タンパク質を
回収するために実施する精製工程に応じた量と性質で、タンパク質を含む、非ヒ
ト細胞の成分の存在を特徴とする。これらの成分は、通常、酵母、原核生物また
はヒト以外の高等真核生物起源のものであり、スキャニングデンシトメトリーま
たはクロマトグラフィーにより約５パーセント未満のオーダーであって、無害な
汚染量で存在することが好ましい。さらに、組換え細胞培養は、自然界で例えば
、細胞、細胞滲出物、または体液中などそれぞれの起源物に含まれているがゆえ
に通常、天然由来のタンパク質と関連していてもよいタンパク質を含まない融合
タンパク質の製造が可能になる。

【００６４】融合タンパク質の使用本発明の融合タンパク質は、医者および／または獣医による、哺乳類種におけ
る多くの病態もしくは欠陥症の予防または治療のために用いられうる。種々の病
気の治療に使用される生物学的に活性な融合タンパク質の量は、もちろん、治療
される病気の重度、選択された投与経路、および融合タンパク質の比活性または
純度に依存し、かつかかりつけの医者または獣医により決定されるであろう。投
与に適する医薬組成物は、有効量の融合タンパク質と生理学的に許容されうる担
体とを含有する。本明細書で用いられる、有効量は、哺乳類が治療対象である病
気をある程度軽減するか除去する量と定義する。

【００６５】本発明のエリスロポエチン融合タンパク質は、例えば、哺乳類における腎不全
、慢性疾患、血液損失または癌に関連する貧血の治療に使用されうる。

【００６６】本発明の組成物は、限定されないが、経口（例えば、限定されないが、静脈内
、動脈内、筋肉内、皮下などの注射；限定されないが、気管支内、鼻腔内または
口腔内吸入、鼻腔滴下などの吸入；局所）および非経口（例えば、限定されない
が、食事などの口；直腸）などの種々の経路により投与されうる。

【００６７】担体は、使用する投与および濃度においてレシピエントに対して無毒のもので
ある。使用する処方は、選ばれる投与経路（例えば、溶液、エマルジョン、カプ
セル）に応じて異なる。溶液またはエマルジョンのための適当な担体としては、
例えば、食塩水や緩衝媒体などの水性またはアルコール性／水性の溶液、エマル
ジョン、またはサスペンジョンが挙げられる。非経口賦形剤は、塩化ナトリウム
溶液、リンゲル液デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リ
ンゲル液、または不揮発性油を含みうる。静脈内投与賦形剤としては、様々な添
加剤、保存料、または液体、栄養補給剤もしくは電解質補給剤が挙げられる。一
般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，第１６版，Ｍａｃｋ編（１９８０）を参照のこと。吸入の場合は、化合物
を可溶化させ、適当な投与用ディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネビュラ
イザー、または加圧エアロゾルディスペンサー）に充填することができる。融合
タンパク質は、単独で、一緒に、または他の薬物もしくは薬剤（例えば、その他
の化学療法剤、免疫系賦活剤）と組み合わせて、投与することができる。

【００６８】融合タンパク質組成物を用いて、骨髄細胞などの造血前駆細胞の増殖、分化、
および機能活性化を促進することができる。特に、融合タンパク質を含む組成物
は、骨髄抑制患者の末梢血白血球数を増加させるためおよび循環顆粒球数を増加
させるために用いてもよい。この結果を得るためには、治療有効量の融合タンパ
ク質組成物を、医薬用担体または希釈剤とともに、哺乳類、好ましくはヒトに投
与する。

【００６９】下記実施例により、本発明をさらに説明し、それらは、いかなるようにも限定
されることを意図しない。

【００７０】実施例１エリスロポエチン−ホモ融合タンパク質の生産免疫グロブリン分子のヒンジ領域への付着を通して役立つといういくつかの問
題を持つが、顕著な治療上の有用性を有する１つの分子は、エリスロポエチン（
ＥＰＯ）である。エリスロポエチンは、静脈注射又は皮下注射によって、週３回
、およそ２５〜１００Ｕ／ｋｇの投与量、数千ドルの年間コストで一般的に投与
される。さらに、注射可能な調剤を使用した時、循環における化合物の治療レベ
ルを持続するためになされる注射の頻度が問題である。

【００７１】ＥＰＯ−ＥＰＯダイマーの構築野性型エリスロポエチンのヌクレオチド配列を、Ｊａｃｏｂｓ．Ｋら、Ｎａｔ
ｕｒｅ３２３：８０６（１９８５）から得ることができる。

【００７２】ＥＰＯ−ＥＰＯ融合タンパク質を、ＥＰＯｃＤＮＡの２つの鎖を免疫グロブ
リンヒンジポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖：ＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧ
ＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡ（配列番号
：２２）と連結することによって構築する。本明細書においては初めに優先する
ＥＰＯＤＮＡ鎖は、ＥＰＯＡという、ＥＰＯ特異的合成オリゴヌクレオチド
を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生じさせる。連結したＤＮ
Ａ鎖は、テンプレートとしてｐｓｖ２−ＥＰＯとヒトＩｇＧｌのヒンジ領域をコ
ードする適切に伸ばした３’末端を持つ３’プライマーとを使用することによっ
て、目的の長さに連続的に長くした。５’オリゴヌクレオチドは、特有のＮｏｔ
Ｉ制限部位１０ヌクレオチド５’を翻訳開始コドンに挿入し、一方、３’オリ
ゴヌクレオチドは、終止コドンを除き、ヒンジの初めの６アミノ酸をコードする
１８核酸配列を伸ばす。合成３’オリゴヌクレオチドでの２回の連続的なＰＣＲ
を使用することによって、ヒンジ領域の最後の９アミノ酸をコードする２７核酸
配列を３’からＥＰＯＡ配列に伸ばし、特有のＢａｍＨＩ制限部位を３’をヒ
ンジに挿入する。リンカー後のＥＰＯＤＮＡ鎖（ＥＰＯＢＤＮＡ）の増幅
に使用する合成オリゴヌクレオチドは、最初のコドンをＡｌａからＡｓｐに変え
、成熟タンパク質をコードするＥＰＯＤＮＡの５’末端にかかる特有のＢａｍ
ＨＩ部位をつくり、かつ特有のＸｂａＩ部位３’を終止コードに導入する。

【００７３】ＥＰＯＡＤＮＡとＥＰＯＢＤＮＡとをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）を用いて生産し、ヒトＥＰＯｃＤＮＡプラスミド、ｐｓｖ２−ＥＰＯ（Ｃｈ
ｅｒｎＹ．Ｊ．ら、ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２０２：２２５（１９９１
））をテンプレートとした。ＥＰＯＡを生産するのに使用したプライマーは、
以下のとおりである：５’−ＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣ（
配列番号：２３）、３’−ＣＡＧＴＧＴＴＣＴＡＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧ
ＧＧＧＡＣＡＧＧＡＣＧＴＣＣＧＣＣ（配列番号：２４）、３’−ＡＣＣＣＧＴ
ＡＣＡＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＡＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧＡＧＡ（
配列番号：２５）および３’−ＡＴＣＣＴＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＣＧＴ
ＡＣＡＣＡＣＴＣＡＡＡＡ（配列番号：２６）。ＥＰＯＢを生産するのに使用
したプライマーは、以下のとおりである：５’−ＧＣＧＧＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣ
ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣ（配列番号：２７）および
３’−ＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣ（配列番号：２８）。

【００７４】ＰＣＲ反応（５０μｌ）は以下の成分を含む：０．５μＭの５’プライマーま
たは３’プライマー；１０ｎｇのｐｓｖ２−ＥＰＯ；２００μＭのｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰ；２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
；２ｍＭのＭｇＣｌ₂；１０ｍＭのＫＣｌ；６ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；０．
１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１０μｇ／ｍｌのヌクレアーゼフリーＢＳＡ
；および２．５ＵのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。反
応物を鉱物油（５０μｌ、分子生物学グレード、Ｓｉｇｍａ）でおおい、パーキ
ンエルマーＤＮＡサーマルサイクラー４８０で９４℃１分間（変性）、５２℃１
分間（アニーリング）および７２℃１分間（伸長）の２５サイクルにかけた。

【００７５】次に、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定する。初めに、ＰＣＲ産物をＱＩＡＱＵ
ＩＣＫ^TMゲル抽出キットを使用して１％アガロースゲルから精製する。それらは
、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔに連結させ、反応物は１０：１のベクターに対するモル比
で挿入断片を含む。ライゲーション反応（１０μｌ）は、ゲル−精製ＰＣＲ産物
、２５ｎｇのＰＣＲ−ｂｌｕｎｔ、１Ｘのライゲーションバッファーおよび４Ｕ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＺＥＲＯＢＬＵＮＴＰＣＲクローニングキット
、インビトロゲン）を含む。インキュベーションを１６℃で１時間行なう。

【００７６】トップ１０^TMコンピテントセル（インビトロゲン）をインビトロゲンでつくら
れた手順に従って形質転換する：２μｌのβ−メルカプトエタノールを氷上で細
胞に添加し、ピペットチップで穏やかに攪拌して混合し、前の段落で述べた２μ
ｌの連結物で行なう。この混合物を３０分間氷上でインキュベートし、次いで正
確に４２℃で４５秒間インキュベートする。それからガラス瓶を３０分間氷上に
放置する。２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５
ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＭｇＳＯ₄および２０ｍＭの
グルコースを含む、前もって温めておいた（３７℃）、２５０μｌのＳＯＳ培地
を添加し、細胞を３７℃で１時間振とうする。５０μｌの１：５に希釈した形質
転換細胞を５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ（ミラーの
改変物、Ｓｉｇｍａ）寒天プレート上に播種する。該プレートを３７℃で１晩イ
ンキュベートする。コロニーを取り、これらのコロニーで５０μｇ／ｍｌカナマ
イシンを含む２．５ｍｌのＬＢに接種する。プラスミドＤＮＡをプロメガのＷＩ
ＺＡＲＤＰＬＵＳＭＩＮＩＰＲＥＰＳ^TM ＤＮＡ精製システムを使用して、
１晩の培養物から調製する。クローンを制限消化断片分析によって分析する。

【００７７】ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＥＰＯＡおよびｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＥＰＯＢＤＮＡ
クローンを、正確に挿入されたＤＮＡおよび逆方向に方向づけられた挿入断片の
ため、特有の大きさの断片を与えるであろうＢｇｌＩで消化する。逆方向に挿入
断片を持つクローンを選び、（１００ｍｌのＬＢ／５０μｇ／ｍｌカナマイシン
から）より多量のＤＮＡプラスミドをプロメガのＷＩＺＡＲＤＰＬＵＳＭＡ
ＸＩＰＲＥＰＳ^TM ＤＮＡ精製システムを使用して調製する。「フォワード」方
向に挿入断片を持つクローンは目的とするＥＰＯ−ＥＰＯＤＮＡを生産する。

【００７８】以下に示す手順を用いて、ＥＰＯＡＤＮＡ鎖をＥＰＯＢＤＮＡ鎖に連
結する。ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＥＰＯＡ（−）をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで消
化し、６６７ｂｐ断片ゲルを精製する。ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＥＰＯＢ（−）を
ＢａｍＨＩとＸｂａＩとで消化し、５５７ｂｐ断片ゲルを精製する。ＥＰＯＡ
６６７ｂｐ断片とＥＰＯＢ５５７ｂｐ断片とをモル比１：１で、ＥＰＯ
Ａ６６７ｂｐ断片をＥＰＯＢ５５７ｂｐ断片に連結する。連結を、１６℃
で１晩行なう。連結したＥＰＯＡ−ＥＰＯＢＤＮＡ断片をＱＩＡＱＵＩＣ
Ｋ^TMゲル抽出キットを用いて精製し、前もってＮｏｔＩとＸｂａＩとで消化し
、ゲル精製しておいたｐｃＤＮＡ２．１（−）に連結する。このライゲーション
反応は、ＤＮＡ挿入断片とｐｃＤＮＡ２．１（−）とを５：１のモル比で含む。
インキュベーションを、１６℃で１晩行なう。クローンを制限消化分析により耐
アンピシリンコロニーからとり、マイクログラムの量で生産し、ＣＯＳＩ細胞
をトランスフェクトするために使用する。

【００７９】ＣＯＳＩ細胞中でのＥＰＯダイマーの一過性発現ＣＯＳＩ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（４．５ｇ／
Ｌ、Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕのペニシリン存在下での１０％の胎児子牛血清（ハ
イクローン）、１００μｇのストレプトマイシン、組織培養培地１ｍｌにつき２
５０ｎｇのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｇｉｂｃｏの抗生物質−抗真菌カクテル）で３
７℃、１０％ＣＯ₂で７０％のコンフルエンシーまで成育させる。細胞を０．０
５％トリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してトリプシナ
イジングによって回収し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／６ｍＭグルコー
ス溶液で２回洗浄する。細胞を前記ＰＢＳ／グルコース緩衝液で２×１０⁶細胞
／ｍｌの濃度に懸濁する。０．５ｍｌの細胞をエレクトロポレーションキュベッ
ト（０．４ｃｍ間隙、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れ、１０μｇのｐｃＤＮＡ／ＥＰＯ
−ＥＰＯを添加する。細胞を以下の条件でエレクトロポレートする。電圧＝０．
３ｋＶ、電界強度＝０．７５ｋＶ／ｃｍ、コンデンサ＝２５０μＦおよび抵抗器
＝なし（Ωでパルスコントローラをセット）。細胞を３０ｍｌの前もって温めた
ＤＭＥＭ、高グルコースおよび１０％ＦＢＳ中に播種し、３７℃で７２時間１０
％ＣＯ₂でインキュベートする。対照は、１０μｇのｐｃＤＮＡ−ＥＰＯおよび
１０μｇのｐｃＤＮＡ２．１（−）である。

【００８０】馴化培地を集め、４℃で１０分間１３，８００×ｇで遠心分離する。１ｍｌア
リコートのそれぞれの馴化培地を最小必須培地αに対して培地の３×交換で１晩
透析する。これらのサンプルをＫｒｙｓｔａｌ法でＥＰＯ活性について分析する
。

【００８１】ＣＨＯ細胞中でのＥＰＯダイマーの安定した発現チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびＮＳ．１ミエローマ細胞を
ＥＰＯ−ＥＰＯタンパク質の安定発現に使用できる。

【００８２】ＣＨＯ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（４．５ｇ／Ｌ、
Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕのペニシリン存在下での１１％の胎児子牛血清（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）、１００μｇのストレプトマイシン、組織培養培地１ｍｌにつき２５
０ｎｇのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｇｉｂｃｏの抗生物質−抗真菌カクテル）で３７
℃、１０％ＣＯ₂で７０％のコンフルエンシーまで成育させる。細胞を０．０５
％トリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してトリプシナイ
ジングによって回収し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／６ｍＭグルコース
溶液で２回洗浄する。細胞を前記ＰＢＳ／グルコース緩衝液で２×１０⁶細胞／
ｍｌの濃度に懸濁する。０．５ｍｌの細胞をエレクトロポレーションキュベット
（０．４ｃｍ間隙、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れ、２０μｇの直線のｐｃＤＮＡ／Ｅ
ＰＯ−ＥＰＯプラスミドＤＮＡを添加する。細胞を以下の条件でエレクトロポレ
ートする。電圧＝１．５ｋＶ、電界強度＝０．７５ｋＶ／ｃｍ、コンデンサ＝３
μＦおよび抵抗器＝なし（Ωでパルスコントローラをセット）。細胞を３０ｍｌ
の前もって温めたＤＭＥＭ、高グルコースおよび１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（
ジェネティシン，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有する１０％ＦＢＳ中に入れ、３７
℃で１０％ＣＯ₂でインキュベートする。サブクローニングの後、高生産クロー
ンをＥＬＩＳＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）によりＥ
ＰＯの上澄みをスクリーニングすることによって選択する。対照は、１０μｇの
ｐｃＤＮＡ−ＥＰＯおよび１０μｇのｐｃＤＮＡ２．１（−）である。

【００８３】実施例２エンプリフィケーション（ＥＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ）：ＩＬ−２
−ＦａｓＬ融合タンパク質の生産ある白血病またはリンパ腫細胞、または最近の活性化Ｔ細胞のみが３分子の高
親和性のＩＬ−２Ｒを生じる（ＩＬ−２Ｒは、高親和性結合部位、中親和性結合
部位または低親和性結合部位として発現する）。高親和性のＩＬ−２Ｒは、Ｔ細
胞活性化の特異的なマーカーであり、ＩＬ−２ＲのＩＬ−２に対する親和性の促
進に応答しうる誘発できるエレメントである（Ｓｍｉｔｈ，１９８９、Ｓｔｒｏ
ｍら、１９９３、Ｓｔｒｏｍら、１９９２）。選択的な免疫抑制および／または
抵抗性を達する方法で高親和性のＩＬ−２Ｒに対する治療を使用する原理は十分
に設立されている（Ｓｔｒｏｍら、１９９２、Ｗａｌｄｍａｎｎ，１９９３）。
抗原性、最適状態に及ばない親和性、短い循環半減期およびターゲット細胞に対
する宿主細胞溶解性免疫エフェクター機構に対する無力といういくつかの問題を
持ち、ＩＬ−２ＲおよびＩＬ−２／毒素融合タンパク質のｐ５５鎖に対するモノ
クローナル抗体を含む今の高いＩＬ−２Ｒターゲッティング方法は、臨床の効用
における制限を課する。これらの問題は、ＩＬ−２ペプチドをＦａｓＬペプチド
に免疫グロブリンヒンジ領域ペプチドを介して連結することによって処理できる
。

【００８４】ＴＮＦａに対するＦａｓＬの構造類似性は、ＦａｓＬもまたトリマーとして存
在することを暗示する。さらに、抗Ｆａｓ抗体は、ＩｇＭ（Ｙｏｎｅｈａｒａ
ら、１９８９）、凝集しない傾向があるペンタマーであり、一方、抗ＡＰＯ−１
抗体は、ＩｇＧ３（Ｔｒａｕｔｈら、１９８９）、それは凝集する傾向がある。
抗ＡＰＯ−１抗体のＦ（ａｂ）２断片およびそのアイソタイプは、ほとんどその
細胞傷害活性を持たない（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、１９９２）。しかしながら、
これらの２価の抗ＡＰＯ−１抗体は、２次抗体でクロスリンクされるとき、アポ
トーシスを誘導する。これらの結果は、Ｆａｓのダイマー化がアポトーシスシグ
ナルを伝達するのに不十分であることを示し、それはＦａｓリガンドに対するト
リマー構造に矛盾しない。それゆえに、ＩＬ−２−ＦａｓＬ融合タンパク質は、
アポトーシスを誘導するために、高親和性ＩＬ−２ＲおよびＦａｓの両方を発現
するターゲット細胞を要求する。これらの融合タンパク質は、高親和性ＩＬ−２
ＲおよびＦａｓの両方を生産するある白血病またはリンパ腫細胞、または最近の
活性化Ｔ細胞をターゲットにする。このように、ターゲット特異性をこの融合タ
ンパク質のダイマー型によって確保する。ＦａｓＬタンパク質は、細胞表面の一
部がタンパク質のＣ末端の終わりである膜貫通タンパク質である。このことを以
下に述べる融合タンパク質を作ることにより検討する。

【００８５】ネズミＩＬ−２−ＦａｓＬ融合タンパク質の構築：野生型のネズミＩＬ−２およびＦａｓＬのヌクレオチド配列をＫａｓｈｉｍａ
．Ｎら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：４０２（１９８５）およびＴａｋａｈａｓｈｉ
．Ｔら、Ｃｅｌｌ７６：９６９（１９９４）からそれぞれ得ることができる。
ＩＬ−２−ＦａｓＬ融合タンパク質を、ネズミのＩｇＧ２ａのヒンジ領域ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ鎖：ＧＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡ
ＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＣＡ（配列番号：２９）で
ＩＬ−２ｃＤＮＡとＦａｓＬｃＤＮＡとを連結することによって構築する。

【００８６】ネズミＩＬ−２およびＦａｓＬのｃＤＮＡを、ＣｏｎＡ刺激したネズミ脾細
胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａ
ｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から抽出ｓｈｉｔａＡから、合成オリゴ−ｄＴ（１２
−１８）オリゴヌクレオチド（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、逆転写酵素ＭＭＬ
Ｖ−ＲＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用する
標準の技術で生じさせる。ついで、ＩＬ−２ｃＤＮＡを、ＩＬ−２特異的合成
オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって増幅する。５’オリゴヌクレオチ
ドは、特有のＮｏｔＩ制限部位５１ヌクレオチド５’を翻訳開始コドンに挿入
し、一方、３’オリゴヌクレオチドは、終止コドンを除き、ヒンジの初めの６ア
ミノ酸をコードする１８核酸配列を伸長する。合成の３’オリゴヌクレオチドで
の２回の連続的なＰＣＲを使用することによって、ヒンジの最後の１２アミノ酸
をコードする３６核酸配列を３’からＩＬ−２配列に伸長させ、特有のＢｇｌＩ
Ｉ制限部位３’をヒンジに挿入する。ＦａｓＬの表面の細胞領域のｃＤＮＡの増
幅で使用する合成オリゴヌクレオチドは、初めの２つのコドンをＧｌｎおよびＬ
ｅｕからＡｓｐおよびＰｒｏに変化させた後、ＦａｓＬの表面の細胞領域の５’
末端にかかる特有のＢａｍＨＩ部位を造り、特有のＸｂａＩ部位３’を終止コ
ドンに導入する。ネズミＩＬ−２およびヒンジを生産するのに使用したプライマ
ーは以下のとおりである：５’−ＡＴＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＴＣＡＣＴＣＣＴＣ
ＡＧＴＧＡ（配列番号：３０）、３’−ＡＣＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＡＧ
ＧＡＣＴＣＣＣＧＡＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＡ（配列番号：３１）、３’−ＡＣ
ＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＧＡＡＣＴＡＡＣＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＡＧＧ
ＡＣ（配列番号：３２）および３’−ＡＴＣＣＴＡＧＡＣＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴ
ＡＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＧＡＡＣＴＡＡＣＡＣ（配列番号：３３）。ネズミＦ
ａｓＬを生産するのに使用したプライマーは以下のとおりである：５’−ＡＴＧ
ＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧ（配列番号：３４）および３’
−ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＴＣＧＡＡＴＡＴＧＴＴＣＧ（配列番号：３５）
。

【００８７】均等物当業者は、単なる日常的な実験を用いるだけで、本明細書に記載された発明の
特定の態様に対して数多くの均等物を認識し、確かめることができるであろう。
かかる均等物は、以下の請求の範囲に含まれることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/505 Ｃ０７Ｋ 14/705 14/55 19/00 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者チェン，シン，シアオアメリカ合衆国マサチューセッツ 02146 ブルックリン，アルトンプレース 59，ユニット６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質が、カルボイル（ｃａｒｂｏｙｌ）末端またはア
ミノ末端のいずれかを介してヒンジ領域配列に連結される、少なくとも１つの免
疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含有したペプチドにより共有結合的に連
結した２つ以上のタンパク質を含有してなる融合タンパク質。
【請求項２】該タンパク質が、同一のタンパク質または実質的に類似した
タンパク質である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】該タンパク質が、異なるタンパク質である、請求項１記載の
融合タンパク質。
【請求項４】該タンパク質が、エリスロポエチンである、請求項２記載の
融合タンパク質。
【請求項５】該タンパク質が、ＩＬ２およびＦａｓＬである、請求項３記
載の融合タンパク質。
【請求項６】該免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列が、ａ）配列番号：１〜配列番号：２１、およびＥＲＫ；ｂ）ａ）の配列の生物学的に活性な断片；ならびにｃ）ａ）の配列の生物学的に活性なアナログ、変異体、バリアントおよび誘導体
からなる群より選択された、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項７】少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を
含有したペプチドにより共有結合的に連結した２つ以上のタンパク質を含有した
融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有してなる単離核酸。
【請求項８】請求項７記載の核酸を含有してなるベクター。
【請求項９】請求項８記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項１０】治療上有効量の請求項１記載の融合タンパク質と製薬学上
許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。
【請求項１１】ａ）少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸
配列を含有したペプチドにより共有結合的に連結した２つ以上のタンパク質を含
有した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有した核酸を含有した
ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ；およびｂ）融合タンパク質を生産するに適する培地で宿主細胞を培養するステップを含む、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含有したペプチドに
より共有結合的に連結した２つ以上のタンパク質を含有した融合タンパク質を生
産する方法。
【請求項１２】治療上有効量の請求項１記載の融合タンパク質を哺乳類に
投与するステップを含む、個体の病態を予防または治療する方法。
【請求項１３】少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列
を含有したペプチドにより共有結合的に連結した２つ以上のエリスロポエチン分
子を含有してなる融合タンパク質。
【請求項１４】請求項１３記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含有してなる単離核酸。
【請求項１５】請求項１４記載の核酸を含有してなるベクター。
【請求項１６】請求項１５記載のベクターでトランスフェクトした宿主細
胞。
【請求項１７】治療上有効量の請求項１３記載の融合タンパク質と製薬学
上許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。
【請求項１８】ａ）少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸
配列を含有したペプチドにより共有結合的に連結した２つ以上のエリスロポエチ
ン分子を含有した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有した核酸
を含有したベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ；およびｂ）融合タンパク質を生産するに適する培地で宿主細胞を培養するステップを含む、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含有したペプチドに
より共有結合的に連結した２つ以上のエリスロポエチン分子を含有した融合タン
パク質を生産する方法。
【請求項１９】治療上有効量の請求項１３記載の融合タンパク質を哺乳類
に投与するステップを含む、個体の貧血を予防または治療する方法。
【請求項２０】少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列
を含有したペプチドにより共有結合的に連結したＩＬ−２とＦａｓＬとを含有し
てなる融合タンパク質。
【請求項２１】請求項２０記載の核酸を含有してなるベクター。
【請求項２２】請求項２１記載のベクターでトランスフェクトした宿主細
胞。
【請求項２３】治療上有効量の請求項２０記載の融合タンパク質と製薬学
上許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。
【請求項２４】治療上有効量の請求項２０記載の融合タンパク質を哺乳類
に投与するステップを含む、個体の白血病またはリンパ腫を予防または治療する
方法。