JP2001510452A - Ｉｃｅ阻害ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はICE及び／またはICEファミリーの酵素に結合可能なペプチドに関し、そのペプチドは、任意にＮ末端及び／またはＣ末端に１以上のアミノ酸を含有する、配列表に報告された配列番号１のアミノ酸配列から本質的になり、そこで、XaaはAsp及びAlaの間で選択される。本発明は、上記ペプチドのICE阻害及び／またはICEファミリーの酵素の阻害を必要とする病状に活性な医薬組成物の製造のための使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ICE阻害ペプチド 発明の属する技術分野 本発明はICE及び／またはICEファミリーの酵素に結合可能なペプチドに関し、 そのペプチドは任意にＮ末端及び／またはＣ末端に１以上のアミノ酸を有する、 配列番号１のアミノ酸配列から本質的になり、そこでXaaはAsp及びAlaの間で選 択される。 本発明は上記ペプチドをICE阻害及び／またはICEファミリーの酵素の阻害を必 要とする病状において活性な医薬組成物の製造に使用することにも関する。 発明の背景 ICE(インターロイキン−１β−変換酵素」は最近精製され、クローン化された ヘテロ２量体システインプロテアーゼである（１）。インターロイキン−１β（ IL−１β）は、不活性な33KDaまたは３1KDaの前駆体(pIL−１β)として合成され る。IL−１βの完全に活性な17.5KDaの成熟型はAla¹¹⁷で始まり、Asp¹¹⁶及びAla¹¹⁷ の間のプロセシングに起因するようである（２，３）。したがって、ＩＬ− １β前駆体タンパク質はICEにより、成熟し、かつ、生物学的に活性な形に開裂 する。 ICE活性は単球及びTHP １細胞において確認され、それらはpIL−１βをAsp¹¹⁶ −Ala¹¹⁷並びにAsp²⁷−Gly²⁸で開裂し、それぞれ17.5KDaと28KDaの生成物を生じ る（３，４）。各部位での開裂はＰＩ位置におけるアスパラギン酸に依存する（ ４，６，７）。 ケノルハブジチス・エレガンス（Caenorhobditis elegans）細胞 死タンパク質ced−３に関連するシステインプロテアーゼは細胞消滅機構のエフ ェクター成分に相当する。ICEは最初に記載されたCED−３の同族体であり、Rat −１線維芽細胞におけるICEまたはCED−３の過発現がアポプトシスを誘導したこ とが知られている（８）。さらに、研究は、ICEファミリーのプロテアーゼは細 胞消滅メカニズムにおいて重要な役割を演ずるかもしれないことも示唆している 。 多くのAsp−Ｘ結合を含有するIL−１αまたはいくつかの他のタンパク質は開 裂しないから、ICEはpIL−１β特異的プロセシング酵素であるようである。 インターロイキンIL−１α及びIL−１βは多面作用性（theotropic）サイトカ インであり、それらの配列は類似性が少ないけれども、それらは種々の組織に多 数の同様な影響を及ぼし、多くのヒトの病状、特に生物の免疫応答及び炎症過程 に作用する（９）。両タンパク質は約17.5KDaの分子量を有し、約31KDaの分子量 を有するより大きいサイズの前駆体分子として以前に合成されている。 IL−１ｓは通常は有益な効果を有するが、生物に極めて不健康な作用も有する ことがある、推定の（potent）炎症及び発熱原性サイトカインである。それらは 、たとえば、全身性エリマトーデスのような自己免疫病状の症状の病因に関係す ることがあり、特に、それらは、たとえば、慢性関節リウマチにおけるような組 織に損傷を引き起こす仲介者として関係する。 IL−１の多くの生物学的影響は敗血症の出来事の間に認められるものと同様で ある。最近の研究は、１〜10ng／kgの用量のIL−１の静脈内投与は、熱、眠け、 食欲不振、一般化した筋肉痛、関節痛及び頭痛を起こすことを示した。 IL−１ｓは多面発現の活性（その多くは生物体に負の影響を及ぼ す）を有しているから、IL−１の強力な影響は厳格な生理学的制御の下に置くべ きである。 IL−１合成は抗炎症性サイトカイン、プロスタグランジン及びグルココルチコ イドにより阻害され、IL−１の阻害の多数倍のレベルの存在は、この仲介者の厳 格な制御の必要性を示す。 IL−ＩＲＩ及びIL−ＩＲIIと名づけられた２つの型のIL−１レセプターがあり 、IL−ＩＲIIは、IL−１のための制御されたおとり(decoy)標的として行動する 非−シグナルIL−１結合分子である（10〜12）。 IL−１のレセプターのためのアンタゴニストポリペプチドが現在まで記載され ていた。すなわち、レセプター−結合タンパク質のファミリーの今日までの第３ 番目の公知の成分はIL−１レセプター（IL−１ra）のためのアンタゴニストであ る（13〜15）。これらの３つの成分（II−１α、II−１β、IL−１ra）は細胞表 面上の同じレセプター（IL−１Ｒ）を認識し及び結合する。IL−１Ｒに結合する IL−１α及びIL−１βはシグナルを伝達するのに、IL−１raは伝達しない。 IL−１raはIL−１ＲＩに結合するポリペプチドで、IL−ＩＲIIとの親和性は少 なく、いかなるアゴニスト活性も有しない。IL−１raの生産は、単核食細胞、多 形核細胞(PMN)及び線維芽細胞を包含する種々の細胞型中に、IgG、サイトカイン 及び細菌の生成物により誘導される。 現在まで、IL−１raの２つの分子形が同定され、クローン化された。すなわち 、１）選択されたIL−１raは152アミノ酸の成熟したタンパク質を与える25アミ ノ酸の古典的なリーダー配列を含有する、２）細胞内IL−１ra（icIL−１ra）は リーダー配列を欠き、したがってこのタンパク質は細胞内に留まることを予測さ せる。 sIL−１ra及びicIL−１raは同じ遺伝子から発生する。icIL−１raトランスク リプトは、代りの出発部位から及び第１の代りのエキソンのスプライシングから 、sIL−１raの第１エキソン中に位置する内部スプライスアクセプター部位に起 こる。したがって、予測されたタンパク質は、それらのNH₂末端を除いて等しく 、sIL−１raの最初の21アミノ酸がicIL−１raにおいて４つのアミノ酸により置 換されている。 sIL−１ra及びicIL−１raをコードするトランスクリプトの発現は、異なるよ うに制御される。icIL−１raの生物学的重要性はいまだに不明である。 IL−１が多くの病気の病因に関係することを考慮すると、IL−１の不健康な影 響を制限するのに有用な利用し得る薬剤を有する必要性が明らかである。 icIL−１raの新しい分子形が最近同定され、クローン化された(16及びPCT／EP 95／04023)。この分子はicIL−１raの特異形の第１及び第２エキソンの間の新し い63bpエキソンのフレーム挿入により生じる。この新しいトランスクリプトは、 線維芽細胞、ケラチン生成細胞、活性化単球及び多形核細胞において発現される ことが見い出された。COS細胞における発現は、この新しい分子がほとんど細胞 内であって、SDS−PAGEにおいて、ほぼ、25KDaの分子量を有することを明らかに した。上記新しい分子はicIL−１ra型II（icIL−１raII）と呼ばれている。icIL −１raIIがICEと同様に細胞内タンパク質であることを考慮して、出願人はICE活 性を阻害するicIL−１raの能力も試験した。結果をこの特許出願の例において報 告し、icIL−１raIIがICE活性を阻害することを示す。 発明の説明 本発明の主な目的は、ICEに結合可能で、したがって、IL−１βの活性形の生 産を妨げることが可能な新規なペプチド及び／または、より一般的には、ICEフ ァミリーの酵素に結合可能で、したがって、そのような酵素の活性を妨げること が可能な新規なペプチドを提供することである。だから、本発明はICE及び／ま たはICEファミリーの酵素に結合可能なペプチドに関し、そのペプチドは、本質 的には配列番号１のアミノ酸配列からなり、そこで、Xaaは特に配列番号２また は３において報告されているように、Asp及びAlaの間で選択される。任意に、こ のペプチドはＮ末端及びＣ末端に１以上のアミノ酸も含有する。したがって、本 発明のペプチドは19〜40、好ましくは19〜25のアミノ酸の長さであり得る。 特に、本発明の１態様によると、ペプチドは本質的に配列番号４または５のア ミノ酸配列からなる。 ICEファミリーのシステインプロテアーゼの非限定のリストは、CED−３（17） 、Nedd−２／ICH−１（18，19）、Yama／CPP−32／Apopain（20，21，22）、Tx ／ICH−２／ICEre１−II（23，24，25）、ICEre１−III（25）、Mch−２（26） 、ICE−LAP ３／Mch−３／CMH−１（27，28，29）、ICE−LAP−６（30）及びFL ICE／MACH（31，32）を包含する。 本発明の他の目的は、ICE阻害及び／またはICEファミリーの酵素の阻害を必要 とする病状において、活性成分として医薬組成物に用いるのに適切であるために 、実質的に精製された形で前記ペプチドを提供することである。 本発明による新規なアンタゴニストが予防、治療または診断用途のために有利 に用いられる病状の例は、致死の細菌感染及びウイルス感染並びに自己免疫及び 炎症性疾患である。特定の例は、関節リウマチ、敗血性ショック急性骨髄白血病 、宿主に対する移植の免疫 学的反応、後天性免疫不全症候群（AIDS）、潰瘍性大腸炎及び多発性硬化症を包 含する。 本発明の目的及び利点は次の記載により明らかとなるだろう。 本発明の態様は薬理学的活性量の本発明のペプチドの、ICE阻害及び／またはI CEファミリーの酵素の阻害を要する病状を発現する恐れのある患者またはすでに そのような病状を示している患者への投与である。 活性素と適合するいかなるルートの投与も用い得るが、特に好ましいのは、短 時間で全身的効果を有することが可能であるという理由で非経口投与である。こ の理由で、外科手術の直前、間または後の静脈ボーラス投与が好ましい。投与さ れるペプチドの用量は、患者の年令、体重及び個々の応答による医療の処方箋の 基準に依存する。 投与量は１kgの体重当り0.05〜30mgであることができ、好ましい用量は１kgの 体重当り0.1〜10mgである。 非経口用途のための医薬組成物は、活性素及び適切なビヒクルを含む注射可能 な形で製造し得る。非経口投与のためのビヒクルは当技術分野で周知であり、た とえば、水、塩類溶液、リンゲル溶液及びデキストロースを含む。ビヒクルは、 溶液安定性と等張性を維持するために、より少量の賦形剤を含有し得る。 引用の溶液の製造は通常の様式に従って行うことができ、好ましくは、ペプチ ド含量は１mg/ml〜10mg/mlからなるだろう。 本発明を特定の態様を参照して記載してきたが、記載内容は、請求項の意味及 び目的を越えて広がることなく、当業者によりもたらされるすべての修正及び置 換を含む。 さて、本発明を次の例により記載する。それは、いかなる様にも本発明を制限 すると解すべきでない。例は以下に特定する図面に関 係するだろう。 図面の説明 図１：トランスフェクトされたCOS細胞におけるICE mRAN発現のノザン分析を 示す。モック（mock）ベクターまたはヒトICEをコードするcDNAでトランスフェ クトされたCOS細胞により抽出された全mRNAをICE特異的mRNAの発現を証明するた めにノザン分析により分析した。特にレーン１：MOCK、レーン２：ICE 図２：ウエスタンブロット分析を示す。pIL−１βを文献（４）の記載のよう に製造された単球溶解物とインキュベートした。37℃での60分間のインキュベー ト後反応混合物をSDS−PAGE上で動かし、前駆体または成熟IL−１βの存在をウ エスタンブロットにより証明した。特に、 レーン１：pIL−１及び レーン２：pIL−１＋単球溶解物である。 図３：研究下のペプチドのアミノ酸配列を示す。ペプチドＡ（配列番号６）及 びペプチドＣ（配列番号４）は、icIL−１raII配列を基礎にして設計された。ペ プチドＸ（配列番号７）はランダムに選択されたペプチドである。ペプチドＳ（ 配列番号５）は２つのAsp残基に代る２つのAlaの存在以外はペプチドＣと同一で ある。ペプチドＢ（配列番号８）は公知のICE阻害剤（１ａ）である。 図４：研究下の低濃度のペプチドによるICE活性の阻害を示す。pIL−１β（５ ng）をペプチド（0.25または2.5μＭ）の存在または不存在でICEとインキュベー トし、図２に記載したように前駆体または成熟IL−１βの存在を証明した。特に 、 レーン１：pIL−１、 レーン２：pIL−１＋ペプチドＡ、 レーン３：pIL−１＋ペプチドＢ、 レーン４：pIL−１＋ペプチドＣ、 レーン５：pIL−１＋ICE、 レーン６：pIL−１＋ICE＋ペプチドＡ(2.5μＭ)、 レーン７：pIL−１＋ICE＋ペプチドＡ（0.25μＭ）、 レーン８：pIL−１＋ICE＋ペプチドＢ(2.5μＭ)、 レーン９：pIL−１＋ICE＋ペプチドＢ（0.25μＭ）、 レーン10：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ(2.5μＭ)及び レーン11：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ（0.25μＭ）である。 図５：研究下の高濃度のペプチドによるICE活性の阻害を示す。pIL−１β（５ ng）をペプチド（40または400μＭ）の存在または不存在でICEとインキュベート し、図２に記載したように、前駆体または成熟IL−１βの存在を証明した。特に 、 レーン１：pIL−１＋ペプチドＡ、 レーン２：pIL−１＋ペプチドＢ、 レーン３：pIL−１＋ペプチドＣ、 レーン４：pIL−１−ペプチドＸ、 レーン５：pIL−１、 レーン６：pIL−１＋ICE、 レーン７：pIL−１＋ICE＋ペプチドＡ(400μＭ)、 レーン８：pIL−１＋ICE＋ペプチドＢ(400μＭ)、 レーン９：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ(400μＭ)、 レーン10：pIL−１＋ICE＋ペプチドＸ(400μＭ)、 レーン11：pIL−１＋ICE＋ペプチドＡ（40μＭ）、 レーン12：pIL−１＋ICE＋ペプチドＢ（40μＭ）、 レーン13：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ（40μＭ）及び レーン14：pIL−１＋ICE＋ペプチドＸ（40μＭ）である。 図６：ペプチドＣ及びＳによるICE活性の阻害を示す。pIL−１β（５ng）をペ プチド（100，300または1,000μＭ）の存在または不存在でICEとインキュベート し、図２に記載したように、前駆体及び成熟IL−１βの存在を証明した。特に、 レーン１：pIL−１、 レーン２：pIL−１＋ペプチドＣ、 レーン３：pIL−１＋ペプチドＳ、 レーン４：pIL−１＋ペプチドＢ、 レーン５：pIL−１＋ICE、 レーン６：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ(0.1mM)、 レーン７：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ(0.3mM)、 レーン８：pIL−１＋ICE＋ペプチドＣ（１mM）、 レーン９：pIL−１＋ICE＋ペプチドＳ(0.1mM)、 レーン10：pIL−１＋ICE＋ペプチドＳ(0.3mM)、 レーン11：pIL−１＋ICE＋ペプチドＳ（１mM）及び レーン12：pIL−１＋ICE＋ペプチドＢ（１mM）である。 例 材料及び方法 試薬 次の市販の試薬を細胞の培養及び分離に用いた。 Ficoll(Seramed、独国、ベルリン)、Percoll（Pharmacia、スェーデン、ウプ サラ）、RPMI 1640（Seramed、独国、ベルリン）、FCS（HycloneLaboratories， UK、ローガン）、グルタミン(Seramed、独国、ベルリン)及びHepes(Merk、独国 、ダーマシュタット)。 細胞 単核細胞はFicollグラジエント遠心分離によりヒトの健康なドナーの末梢血液 から得た。精製された単球を室温で30分間の2,000rpm でのPercollグラジエント遠心分離により分離した（10）。COS−７細胞（米国、 メリーランド州、ロックビルのATCCから購入した）及び単球をRPMI 1640培地＋1 0％ FCS−2mMグルタミン＋20mM Hepes中で培養した。ヒト組換えIL−１β前駆体 を米国、ニュージャージー州、パインブルームのCistron Biotechnologyから得 た。成熟及び前駆体IL−１βの両方と反応性のポリクローナル抗体をこの研究室 で生じさせた。 PCR ICE cDNAを公表された配列（８ａ）に基づいて、RT−PCRによって得た。RT−P CRを記載されているように（16）、95℃で１分30秒、55℃で１分30秒及び72℃で １分30秒を30サイクル行なった。オリゴヌクレオチドをDuotech（イタリア国、 ミラン）から得た。選択的にICEを増幅するのに用いられたオリゴの配列は次の とおりであった。 結果 COS細胞における組換えICEの発現 ヒトICEをコードするcDNAをPCRにより増幅した。配列を確認し、cDNAをpSG５ 発現ベクター中にサブクローン化した。COS細胞を空のベクター（mock）またはI CE cDNAを含有するベクターでトランスフェクトし、48時間後、ICE特異的mRNAに ついて細胞を分析した。図３に示されているように、ICE cDNAでトランスフェク トされたCOS細胞は高レベルのICE mRNAを発現した。 前に記載した（11）ように製造された単球溶解物もpIL−１βを成熟形（図２ ）に変換することができた。したがって、組換えICEまたは新しく単離された単 球をさらなる実験のためのICE酵素活性 源として用いた。 ICE活性の阻害 ICE活性源を製造し、そのpIL−１βを開裂する能力を反応を37℃で１時間、イ ンキュベートすることにより試験した。次に混合物をSDS−PAGE上で動かし、ウ エスタンブロットによりpIL−１βまたは成熟形の存在を証明した。 ４つの異なるペプチドを設計し、合成し、それらのICE活性を阻害する能力に ついて試験した。これらのペプチドは図３に示されており、Applied Biosystems （カリフォルニア州、フォスターシティー）からの固相合成機により得た。これ らのペプチドの純度は高圧液体クロマトグラフィーにより確かめた。 公知のICE阻害剤（１ａ）である、図３に報告されたテトラペプチドＢ（Bache m）スイス国ブンデンドルフ）を陽性の対照として用いた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月２０日（１９９８．１０．２０） 【補正内容】 請求の範囲 1. インターロイキン−１β−変換酵素(ICE)に結合可能なペプチドであって 、配列番号１のアミノ酸配列からなり、そこで、XaaはAsp及びAlaの間で選択さ れるペプチド。 2. 配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のペプチド。 3. 配列番号３のアミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド。 4. Ｎ末端及び／またはＣ末端にさらに１以上のアミノ酸を含有し、したがっ て、20〜40アミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド。 5. 配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項４に記載のペプチド。 6. 本質的に配列番号５のアミノ酸配列からなる請求項４に記載のペプチド。 7. 医学用途に用いるための請求項１に記載の使用。 8. ICE阻害を必要とする病状に活性な医薬組成物の製造のための請求項１に 記載のペプチドの使用。 9. 前記病状が自己免疫疾患の群から選択されるという事実を特徴とする請求 項７に記載の使用。 10．前記病状が致死の細菌感染及びウイルス感染からなる群から選択されると いう事実を特徴とする請求項７に記載の使用。 11．前記病状が炎症性疾患からなる群から選択されるという事実を特徴とする 請求項７に記載の使用。 12．ICE阻害を必要とする病状の予防、治療または診断に用いるための、請求 項１または４に記載のペプチドといっしょに１以上の医薬として許容し得る担体 及び／または賦形剤を含有する医薬組成 物。 13．前記病状が自己免疫疾患から選択される請求項12に記載の医薬組成物。 14．前記病状が致死の細菌感染及びウイルス感染からなる群から選択される請 求項12に記載の医薬組成物。 15．前記病状が炎症性疾患からなる群から選択される請求項12に記載の医薬組 成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 37/04 37/04 37/06 37/06 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 マントバーニ，アルベルト イタリア国，イ―20146 ミラノ，４，ラ ルゴ ブラシリア

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ICE及び／またはICEファミリーの酵素に結合可能なペプチドであって、任 意にＮ末端及び／またはＣ末端に１以上のアミノ酸を含有する、本質的に配列番 号１のアミノ酸配列からなり、そこで、XaaはAsp及びAlaの間で選択される、ペ プチド。 2. 本質的に配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のペプチド。 3. 本質的に配列番号３のアミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド。 4. 本質的に配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のペプチド。 5. 本質的に配列番号５のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のペプチド。 6. 医学用途に用いるための請求項１に記載の使用。 7. ICE阻害及び／またはICEファミリーの酵素の阻害を必要とする病状に活性 な医薬組成物の製造のための請求項１に記載のペプチドの使用。 8. 前記病状が自己免疫疾患の群から選択されるという事実を特徴とする請求 項７に記載の使用。 9. 前記病状が致死の細菌感染及びウイルス感染からなる群から選択されると いう事実を特徴とする請求項７に記載の使用。 10．前記病状が炎症性疾患からなる群から選択されるという事実を特徴とする 請求項７に記載の使用。