【発明の詳細な説明】
ヒトケモカインβ-13
発明の分野
本発明は、ケモカインファミリーに属するポリペプチドをコードする新規ヒト
遺伝子に関する。より詳しく述べると、ヒトケモカインβ-13と呼ばれるヒトポ
リペプチド、以降「CKβ-13」と呼ぶポリペプチドをコードする単離された核酸
分子を提供する。ポリペプチドはまた、同ポリペプチドを産生するためのベクタ
ー、宿主細胞および組換え法と共に提供する。同様に、免疫系に関連した疾患を
検出する診断法、およびそのような疾患を治療する治療法も提供する。本発明は
さらに、CKβ-13活性のアゴニストおよびアンタゴニストを特定するスクリーニ
ング法に関する。
発明の背景
ケモカインは、また、インタークリンサイトカインといわれ、構造的および機
能的に関連するサイトカインのサブファミリーである。これらの分子は、８〜10
kdの大きさである。一般に、ケモカインは、アミノ酸レベルで20％〜75％の相同
性を示し、そして２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存されたシステイ
ン残基によって特徴づけられる。最初の２つのシステイン残基の配列に基づいて
、ケモカインは２つのサブファミリー、αおよびβに分類される。αサブファミ
リーにおいては、最初の２つのシステインは１つのアミノ酸によって、分離され
、それゆえ「C-X-C」サブファミリーといわれる。βサブファミリーにおいては
、２つのシステインは隣接した位置にあり、それゆえ、「C-C」サブファミリー
といわれる。これまでに、少なくともこのファミリーの９つの異なるメンバーが
、ヒトにおいて同定されている。
インタークリンサイトカインは、広範な種類の機能を示す。顕著な特性は、単
球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞を含む、異なる細胞型の
走化性遊走を誘発する能力である。多くのケモカインは、前炎症性活性を有し、
そして炎症反応の間の多くの段階に含まれる。これらの活性として、ヒスタミン
放出の刺激、リソソームの酵素およびロイコトリエンの放出、標的免疫細胞の内
皮細胞への接着の増強、補体タンパク質の結合の増強、顆粒球接着分子および補
体レセプターの発現の誘導、ならびに呼吸バーストが挙げられる。炎症における
それらの関係に加えて、特定のケモカインは他の活性をあらわすことが示されて
いる。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１（MIP-1）は造血幹細胞の増
殖を抑制し得、血小板因子-４（PF-4）は内皮細胞増殖の強力なインヒビターで
あり、インターロイキン-８（IL-8）はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてG
ROはメラノーマ細胞についてのオートクリン成長因子である。
多様な生物学的活性に照らせば、ケモカインが、リンパ球の走行、創傷治癒、
造血調節、ならびにアレルギー、喘息、および関節炎のような免疫学的障害を含
む多くの生理学的条件および疾患条件において密接に関連している事は、驚くべ
き事ではない。
「C-C」分岐のメンバーは、以下の細胞においてそれらの効果を発揮する：寄
生虫を破壊して寄生虫性感染を減少させ、そして呼吸器系の気道における慢性炎
症の原因となる好酸球；脊椎動物における腫瘍の形成を抑制する単球およびマク
ロファージ；Ｔ細胞を誘引するＴリンパ球、およびアレルギー性炎症において役
割を果たすヒスタミンを放出する好塩基球。
C-C分岐のメンバーが単核の細胞で優勢に作用し、そしてC-X-C分岐のメンバー
が好中球で優勢に作用する一方で、別の化学誘因特性は、この指標に基づくケモ
カインに対して指定され得ない。一方のファミリー由来のいくつかのケモカイン
は、他方の特徴を示す。
本発明のポリペプチドは、保存されたシステイン「C-C」領域を有し、そして
公知のケモカインと相同なアミノ酸配列を有する。
発明の概要
本発明は、配列番号：２に示す完全なアミノ酸配列、または1995年４月28日に
ATCC寄託番号第97113号として細菌宿主において寄託されているcDNAクローンに
よってコードされる完全なアミノ酸配列、を有するCKβ-13ポリペプチドの少な
くとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する
。図１（配列番号：１）に示す、寄託されたCKβ-13クローンのシークエンシン
グによって決定されるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１〜３位でN末端メチ
オニンをコードする開始コドンを含む、アミノ酸残基93個の完全なポリペプチド
をコード
するオープンリーディングフレームを含む。
本発明のポリペプチドは、配列番号：２においてアミノ末端からの最初のシス
テインで始まるケモカインのβサブファミリーの特徴である保存されたシステイ
ンパターンを含む、既知のケモカインとのアミノ酸配列相同性を有する。
コードされるポリペプチドは、アミノ酸24個および28個の認められた２つのリ
ーダー配列を有する；および認められた成熟CKβ-13蛋白質のアミノ酸配列もま
た、図１（配列番号：２）にアミノ酸残基25〜93位およびアミノ酸残基29〜93位
として示す。
このように、本発明の１つの局面は、（a）配列番号：２の完全なアミノ酸配
列を有するCKβ-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（b）配列番号
：２の25〜93位のアミノ酸配列を有する認められた成熟CKβ-13ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；（c）配列番号：２の29〜93位のアミノ酸配列を
有する認められた成熟CKβ-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（d
）ATCC寄託番号第97113号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全な
アミノ酸配列を有するCKβ-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（e
）ATCC寄託番号第97113号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ
酸配列を有する成熟したCKβ-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
および（f）上記の（a）、（b）、（c）、（d）または（e）のヌクレオチド配列
のいずれかと相補的であるヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
本発明のこの局面のさらなる態様は、上記の（a）、（b）、（c）、（d）また
は（e）に記述されたアミノ酸配列を有するCKβ-13ポリペプチドのエピトープ含
有部分のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のCK
β-13ポリペプチドのエピトープ含有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまた
はポリペプチドは、少なくとも６または７個、好ましくは少なくとも９個、およ
びより好ましくは少なくとも約30個〜約50個のアミノ酸を有するそのようなポリ
ぺプチドの一部を含むが、上記の本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までの
長さで、かつ全アミノ酸配列を含む、如何なる長さのエピトープ含有ポリペプチ
ドも本発明に含まれる。
もう一つの態様において、本発明は、上記（a）、（b）、（c）、（d）または
（e）に記述のアミノ酸配列を有するCKβ-13ポリペプチドに特異的に結合する単
離された抗体を提供する。本発明はさらに、本明細書に記述のアミノ酸配列を有
するCKβ-13ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離する方法を提供する。
そのような抗体は下記のように診断的または治療的に有用である。
本発明はまた、例えば、固形癌、慢性感染症、白血病、T細胞媒介自己免疫疾
患、寄生虫感染症、乾癖の治療に、造血の制御に、増殖因子活性の刺激に、繊維
性疾患の治療に、血管新生の阻害に、および創傷治癒の促進に用いてもよい、CK
β-13ポリペプチド、特にヒトCKβ-13ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供す
る。CKβ-13はまた、敗血症の治療に用いてもよく、免疫の増強または抑制、骨
髄保護、ならびに急性および慢性炎症の調節に有用である。
CKβ-13ポリペプチドを必要とする個体を治療する方法もまた提供する。
本発明はさらに、インビトロで細胞に、エクスビボで細胞に、およびインビボ
で細胞に、または多細胞器官に投与することを目的とした、CKβ-13ポリヌクレ
オチドまたはCKβ-13ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面
の特定の特に好ましい態様において、組成物は宿主生体において疾患の治療のた
めにCKβ-13ポリペプチドを発現させるためのCKβ-13ポリヌクレオチドを含む。
この点において特に好ましいのは、CKβ-13の異常な内因性活性に関連した機能
障害の治療のためにヒト患者に発現させることである。
もう一つの局面において、候補化合物がCKβ-13のCKβ-13受容体に対する結合
に及ぼす効果を決定することを含む、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリ
ーニングアッセイを提供する。特に本方法は、CKβ-13受容体をCKβ-13ポリペプ
チドおよび候補化合物と接触させる段階、およびCKβ-13に対するCKβ-13ポリペ
プチドの結合が候補化合物の存在により増加するか減少するかを決定する段階を
含む。このアッセイ法において、CKβ-13の結合が基準となる結合より増加すれ
ば候補化合物はCKβ-13結合活性のアゴニストであり、基準と比較してCKβ-13結
合が減少すれば、化合物はCKβ-13結合活性のアンタゴニストであることを示す
。
CKβ-13は、単球のみならず、活性化樹状細胞にも発現されていることが見出
された。これらの組織または細胞、特に免疫系に関する多くの疾患では、そのよ
う
な疾患を有する個体から採取した特定の組織（例えば、癌および損傷組織）また
は体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、もしくは脳脊髄液）から、「標準的な
」CKβ-13遺伝子発現レベル、すなわち免疫系の疾患を有しない個体からの健常
な組織でのCKβ-13発現レベルと比較して、CKβ-13遺伝子発現が有意に高い、ま
たは低いレベルであるかが検出される可能性がある。このように、本発明は、（
a）個体の細胞または体液中のCKβ-13遺伝子発現レベルを解析する段階；（b）
それによって、解析したCKβ-13遺伝子発現レベルが標準的な発現レベルと比較
して増加または減少すれば免疫疾患の指標となる、CKβ-13遺伝子発現レベルを
標準的なCKβ-13遺伝子発現レベルと比較する段階を含む、そのような疾患の診
断の際に有用な診断法を提供する。
本発明のさらなる局面は、本発明の単離CKβ-13ポリペプチドまたはそのアゴ
ニストの治療的有効量を含む組成物を、そのような個体に投与することを含む、
体内でCKβ-13活性レベルの増加を必要とする個体の治療法に関する。
本発明のなおさらなる局面は、そのような個体にCKβ-13アンタゴニストの治
療的有効量を含む組成物を投与する段階を含む、体内においてCKβ-13活性レベ
ルの減少を必要とする個体の治療法に関する。本発明において用いられる好まし
いアンタゴニストはCKβ-13特異的抗体である。
図面の簡単な説明
図１は、CKβ-13のヌクレオチド配列（配列番号：１）および推定アミノ酸配
列（配列番号：２）を示す。
図２は、コンピュータープログラムベストフィット（Bestfit）ウィスコンシ
ン配列解析パッケージ、ユニックス用バージョン８、遺伝子コンピューターグル
ープ、University Research Park，575 Science Drive，Madison WI53711）によ
って、デフォルトパラメータを用いて決定した、CKβ-13蛋白質のアミノ酸配列
と、単球化学走化性蛋白質-1α（MIP-1α）のヒトmRNAの翻訳産物（下の列）（
配列番号：３）との同一領域を示す。
図３は、CKβ-13アミノ酸配列の解析を示す。α、β、折り返し、およびコイ
ル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可変領域；抗原性指数および表面
確率を示す。「抗原性指数−ジェームソン・ウルフ（Jamesen-Wolf）」グラフで
は
、CKβ-13蛋白質の高度抗原性領域の指標位置、すなわちそこから本発明のエピ
トープ含有ペプチドが得られる領域を示す。
図４は、実施例５に記述のように、ドナー３人から採取した活性化T-リンパ球
に及ぼすCKβ-13の化学走化性活性を示す。
詳細な説明
本発明は、クローニングしたcDNAのシークエンシングによって決定された配列
番号：２に示すアミノ酸配列を有するCKβ-13ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１に示すヌクレオチド配列
（配列番号：１）は、12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852にあ
るアメリカンタイプカルチャーコレクションに1995年４月12日に寄託し、寄託番
号ATCC第97113号を与えられたHMSDB49クローンのシークエンシングによって得た
。寄託されたクローンはpBluescriptSK(-)プラスミド（ストラタジーン社、ラホ
ヤ、カリフォルニア州）に含まれている。
本発明のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ末端からの最初のシステイン
で始まるケモカインのβサブファミリーの特徴である保存されたシステインパタ
ーンを含む、既知のケモカインとのアミノ酸配列相同性を有する。
核酸分子
特に明示していなければ、本明細書に記述のDNA分子のシークエンシングによ
って決定されるヌクレオチド配列は全て、自動DNAシークエンサー（カリフォル
ニア州、フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ、インクのモデル37
3のようなシークエンサー）を用いて決定し、本明細書で決定されたDNA分子によ
ってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は全て、上記のように決定したDN
A配列の翻訳によって推定した。したがって、この自動化アプローチによって決
定されるいかなるDNA配列に関しても当技術分野で知られているように、本明細
書で決定されたいかなるヌクレオチド配列も何らかの誤差を含む可能性がある。
自動決定したヌクレオチド配列は、シークエンシングしたDNA分子の実際のヌク
レオチド配列と典型的に少なくとも約90％、より典型的には少なくとも約95％〜
少なくとも約99.9％同一である。実際の配列は、当技術分野で周知の手動による
DNAシークエンシング法を含むその他のアプローチによってより正確に決定する
ことができる。
当技術分野で公知のように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列
に１つでも挿入または欠失があれば、決定されたヌクレオチド配列によってコー
ドされる推定アミノ酸配列は、そのような挿入または欠失の時点を起点として、
シークエンシングされたDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは
完全に異なったものになるような、ヌクレオチド配列の翻訳にフレームシフトを
生じると考えられる。
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、DNA分子また
はポリヌクレオチドにおいてはデオキシリボヌクレオチド配列、RNA分子または
ポリヌクレオチドにおいては、特定のデオキシリボヌクレオチド配列における各
チミジンデオキシリボヌクレオチド(T)がリボヌクレオチドウリジン(U)で置換さ
れている、対応するリボヌクレオチド配列（A、G、C、およびU）を意味する。
図１に示すヌクレオチド配列（配列番号：１）のような、本明細書に提供した
情報を用いて、CKβ-13ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、開始材
料としてmRNAを用いたcDNAのクローニング法のような、標準的なクローニングお
よびスクリーニング法を用いて得てもよい。本発明に示す図、図１に記載の核酸
分子（配列番号：１）は、ヒト単球に由来するcDNAライブラリにおいて見出され
た。
同じ遺伝子のさらなるクローンもまた、活性化樹状細胞からのcDNAライブラリ
において同定された。
図１のCKβ-13 cDNAの決定されたヌクレオチド配列（配列番号：１）は、図１
のヌクレオチド配列（配列番号：１）のヌクレオチド１〜３位で開始コドンを含
む、アミノ酸93残基の蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む
。配列番号：２に示すCKβ-13蛋白質のアミノ酸配列は、MIP-1αのヒトmRNAと約
33％同一から53％類似である。
当業者は、上記のシークエンシング誤差の確率のため、寄託されたcDNAによっ
てコードされ、アミノ酸約93個を含む、実際の完全なCKβ-13ポリペプチドがい
くぶん長くなる、または短くなることを認識すると思われる。より一般的には、
実際のオープンリーディングフレームは、図１（配列番号：１）に示すＮ末端か
らの最初のメチオニンコドンから推定される、実際のオープンリーディングフレ
ーム
の、アミノ酸±20個の範囲内にあると考えられ、アミノ酸±10個の範囲内にある
可能性がより高い。
リーダーおよび成熟配列
完全なCKβ-13蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示し、これには下記の
ようにリーダー配列および成熟蛋白質が含まれる。より詳しく述べると、本発明
は、CKβ-13蛋白質の成熟型をコードする核酸分子を提供する。このように、シ
グナル仮説によれば、粗面小胞体を横切って伸長しつつある蛋白鎖の輸送が一度
開始されれば、哺乳類細胞によって分泌される蛋白質はシグナルまたは分泌性リ
ーダー配列を有して、これが完全なポリペプチドから開裂して分泌される「成熟
型」蛋白質を生じる。ほとんどの哺乳類細胞および昆虫細胞でさえも同じ特異性
によって、分泌蛋白質を開裂する。しかし、場合によっては分泌された蛋白質の
開裂は完全に均一ではなく、その結果２種類以上の成熟蛋白質を生じることがあ
る。さらに、分泌蛋白質の開裂特異性は、完全な蛋白質の一次構造によって最終
的に決定される、すなわち、ポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることは以
前から知られていた。従って、本発明はATCC寄託番号第97113号として同定され
る宿主に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟
CKβ-1３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ATCC寄託番
号第97113号のcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟CK
β-13ポリペプチド」とは、寄託された宿主においてベクター内に含まれるクロ
ーンのヒトDNA配列によってコードされる完全なオープンリーディングフレーム
の哺乳類細胞（例えば、下記のようにCOS細胞）での発現によって生じたCKβ-13
蛋白質の成熟型を意味する。
本発明の場合、寄託されたcDNAは、本明細書において後述の昆虫細胞中のバキ
ュロウイルスベクターにおいて発現されており、分泌された２種類のアミノ末端
のアミノ酸シークエンシングにより、成熟CKβ-13蛋白質が配列番号：２のアミ
ノ酸25〜93位および29〜93位を含むことが示された。このように、配列番号：２
のアミノ酸配列におけるCKβ-13蛋白質のリーダー配列はそれぞれ、アミノ酸24
個および28個である。
さらに、蛋白質が分泌性のリーダー配列と共にそのリーダー配列の開裂点を有
するか否かを推定する方法が利用できる。例えば、マツクゲオック(McGeoch、Vj
rus Res．3:271〜286（1985））の方法は、短いN末端荷電領域およびその後の完
全な（非開裂の）蛋白質の非荷電領域からの情報を利用している。フォン・ハイ
ンエ（von Heinje、Nucleic Acids Res．14：4683〜4690（1986））は、開裂部
位を取り巻く残基、典型的に-13〜+2位からの情報を利用しており、この場合1+
が成熟蛋白質のアミノ末端を示す。これらの方法のそれぞれについて既知の哺乳
類分泌蛋白質の開裂点を予測する精度は、75〜80％の範囲である（フォン・ハイ
ンエ（von Heinje）、前記）。しかし、２つの方法は所定の蛋白質に関して必ず
しも同じ推定開裂点を生じない。
当業者は、上記の考察から、異なる既知の蛋白質における開裂部位の変動と共
にシークエンシングの誤差の確率のため、寄託されたcDNAによってコードされる
２種類の成熟CKβ-13ポリペプチドは、アミノ酸約65個および69個からなると予
想されるが、アミノ酸約58〜73個の範囲の如何なる数のアミノ酸からなる可能性
もあり；そしてこの蛋白質の実際のリーダー配列はアミノ酸24および28個である
と予想されるが、アミノ酸20〜35個の範囲の如何なる数のアミノ酸からなる可能
性もあることを認識すると思われる。
示したように、本発明の核酸分子は、mRNAのようなRNAの形で、または例えば
クローニングによってもしくは合成的に生成されたcDNAおよびゲノムDNAを含むD
NAの形であってもよい。DNAは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖D
NAまたはRNAは、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、またはア
ンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。
「単離された」核酸分子とは、その本来の環境から移動した核酸分子、DNAま
たはRNAを意味する。例えば、ベクターに含まれる組換え型DNA分子は、本発明の
目的のために単離されたと見なされる。単離されたDNA分子のさらなる例には、
異種宿主細胞においてまたは溶液中で精製された（部分的または実質的に）DNA
分子の形で維持される組換え型DNA分子が含まれる。単離されたRNA分子には、イ
ンビボまたはインビトロで本発明のDNA分子のRNA転写物が含まれる。本発明の単
離された核酸分子にはさらに、合成的に生成されたそのような分子が含まれる。
本発明の単離された核酸分子には、図１に示すヌクレオチド配列（配列番号：
１）の１〜３位で開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ORF）を
含むDNA分子が含まれる。
同様に、認められた成熟CKβ-13蛋白質のコード配列を含むDNA分子も含まれる
。
さらに、本発明の単離された核酸分子には、遺伝子コードの縮重のため上記配
列とは実質的に異なる配列を有するが、なおCKβ-13蛋白質をコードするDNA分子
が含まれる。当然のこととして、遺伝子コードおよび種特異的コドン選択性は当
技術分野で周知である。このように、例えば特定の宿主にとってコドン発現を最
適にするために上記の縮重変異体を産生することは当業者にとって定常的なこと
である（例えば、ヒトmRNAにおけるコドンを大腸菌のような細菌宿主によって好
まれるコドンに変化させる）。
もう一つの局面において、本発明は、1995年４月28日にATCC寄託番号第97113
号として寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされる
アミノ酸配列を有するCKβ-31ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を
提供する。好ましくはこの核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによって
コードされる成熟ポリペプチドをコードする。
本発明はさらに、図１に示すヌクレオチド配列（配列番号：１）もしくは上記
の寄託クローンに含まれるCKβ-13cDNAのヌクレオチド配列を有する単離された
核酸分子、または上記配列の１つと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。
そのような単離された分子、特にDNA分子は、染色体とのインサイチューハイブ
リダイゼーションによる遺伝子マッピングのためのプローブとして、および例え
ばノザンブロット分析によるヒト組織でのCKβ-13遺伝子発現の検出のためのプ
ローブとして有用である。
本発明は、さらに、本明細書に記述のヌクレオチド配列の一部をコードする核
酸分子と共に、本明細書に記述の単離された核酸分子の断片を目的とする。特に
、本発明は1〜279位を含む配列番号：１の一部を表すヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチドを提供する。
より一般的に述べると、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１に示す
ヌクレオチド配列（配列番号：１）を有する単離された核酸分子の断片とは、本
明細書で述べた診断プローブおよびプライマーとして有用である、長さが少なく
とも約15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド、さらによ
り好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド、およびより一層好ましくは少なくと
も約40ヌクレオチドの断片を意味する。当然のこととして、長さが50〜300ヌク
レオチドの大きい断片もまた、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１に
示すヌクレオチド配列（配列番号：１）の全てではないがほとんどに対応する断
片と同様に、本発明によれば有用である。例えば長さが少なくとも20ヌクレオチ
ドの断片とは、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１に示すヌクレオチ
ド配列（配列番号：１）からの近接塩基20個以上を含む断片を意味する。本発明
の好ましい核酸断片には、図３において同定され、後により詳しく記述するCKβ
-13ポリペプチドのエピトープ含有部分をコードする核酸分子が含まれる。
もう一つの局面において、本発明は、上記本発明の核酸分子、例えばATCC寄託
番号第97113号に含まれるcDNAクローンにおけるポリヌクレオチドの一部とスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件」とは、50％ホルムアミド、５×SSC（150mM NaCl、15mMク
エン酸三ナトリウム）、50mM燐酸ナトリウム（pH7.6）、５×デンハード溶液、1
0％硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ***DNAを含む溶液中で42℃
で一晩インキュベートし、その後0.1×SSCで約65℃でフィルターを洗浄すること
を意味する。
ポリヌクレオチドの「一部」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、基
準ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド、およびより好ましくは少な
くとも約20ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド、
およびなお一層好ましくは少なくとも約30〜70（例えば、50）ヌクレオチドとハ
イブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはRNAのいずれか）を意味する。こ
れらは上記の、および後により詳しく述べる診断プローブおよびプライマーとし
て有用である。
「長さが少なくとも20ヌクレオチド」のポリヌクレオチドの一部とは、例えば
参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNAまたは図１
に示すヌクレオチド配列（配列番号：１））からの20個以上の近接ヌクレオチド
を意味する。当然のこととして、ポリＡ配列（図１（配列番号：１）に示すCKβ
-13 cDNAの3'末端ポリ(A)部分のような配列）またはT（またはU残基）の相補的
伸長鎖のみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオ
チドがポリ(A)伸長部またはその相補鎖（例えば、実際に何らかの二本鎖cDNAク
ローン）を含む任意の核酸分子とハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部
とハイブリダイズさせるために用いられる本発明のポリヌクレオチドには含まれ
ない。
示したように、CKβ-13ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子には、成
熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子そのもの；成熟ポリペプチ
ドのコード配列およびプレ、プロ、もしくはプレプロ蛋白質配列のようなアミノ
酸約20〜35個のリーダー配列または分泌配列をコードする配列のようなさらなる
配列；および前記のさらなるコード配列を伴う、または伴わない成熟ポリペプチ
ドのコード配列が含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。
同様に、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含むmRNAプロ
セシングにおいて、例えばmRNAのリボゾーム結合および安定性のような何らかの
役割を果たす、転写されるが翻訳されない配列のようなイントロンおよび非コー
ド5'および3'配列を含むがこれらに限定しないさらなる非コード配列；ならびに
さらなる機能を提供するアミノ酸のような、さらなるアミノ酸をコードするさら
なるコード配列と共に、上記の蛋白質配列が本発明の核酸によってコードされる
。
このように、ポリペプチドをコードする配列は、融合したポリペプチドの精製
を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列と融合してもよい
。本発明のこの局面の特定の好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、
その多くが市販されており、とりわけpQEベクター（キアゲン、インク、9259 Et
on Avenue，Chatsworth，CA，91311）において提供されるタグのようなヘキサヒ
スチジンペプチドである。ゲンツら（Gentz）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86
：821〜824（1989）によって記述されるように、例えば、ヘキサヒスチジンによ
って融合蛋白質は簡単に精製される。「HA」タグは、ウィルソンら（Wilson）、
Cell 37：767（1984）によって記述されている、インフルエンザヘマグルチニン
蛋白質に由来するエピトープに対応する精製に有用なもう一つのペプチドである
。下記のように、その他のそのような融合蛋白質にはN末端またはC末端でFcと融
合するCKβ-13が含まれる。
変種および変異ポリヌクレオチド
本発明はさらに、CKβ-13蛋白質の一部、類似体または誘導体をコードする本
発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように
天然に生じるものでもよい。「対立遺伝子変異体」とは、有機体の染色体の所定
の座を占める遺伝子のいくつかの互換型の１つを意味する。「遺伝子II（Genes
II）」レビン（Lewin，B）編、ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク（1985）
。非天然型の変異体は、当技術分野で公知の変異誘発技法を用いて産生してもよ
い。
そのような変異体には、ヌクレオチド置換、欠失、または付加によって生じた
変異体が含まれる。置換、欠失または付加は１つ以上のヌクレオチドを含んでも
よい。変異体はコード領域、非コード領域またはその双方において変化してもよ
い。コード領域の変化によって、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、ま
たは付加を生じてもよい。これらの中で特に好ましいのは、CKβ-13蛋白質また
はその一部の特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失で
ある。保存的置換も同様にこの点において特に好ましい。
最も好ましいのは、上記のアミノ酸配列または寄託されたcDNAクローンによっ
てコードされる成熟CKβ-13アミノ酸配列を有する成熟蛋白質をコードする核酸
分子である。
さらなる態様には、（a）配列番号：２に示す完全なアミノ酸配列を有するCK
β-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（b）配列番号：２の25〜93
位のアミノ酸配列を有する認められた成熟CKβ-13ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（c）配列番号：２の29〜93位のアミノ酸配列を有する認めら
れた成熟CKβ-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（d）ATCC寄託番
号第97113号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列
を有するCKβ-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（e）ATCC寄託番
号第9711
3号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟CK
β-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（f）上記（a）、（b
）、（c）、（d）、もしくは（e）のヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌ
クレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％
同一、より好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、もしくは99%同一で
あるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含
まれる。
本発明のさらなる態様には、上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）もしく
は（f）のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも90％同一、より好ましくは
少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチド、または上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）もし
くは（f）におけるポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含む単離された核酸分子
が含まれる。このハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下でA残基のみまたはT残基のみからなるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。本発明のさらなる
核酸の態様は、上記（a）、（b）、（c）、（d）または（e）のアミノ酸配列を
有するCKβ-13ポリペプチドのエピトープ含有部分のアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子が含まれる組換えベクター、およ
び該組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細
胞の製造法、それらを組換え技法によるCKβ-13ポリペプチドまたはペプチドの
製造に用いる方法に関する。
CKβ-13ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と例えば、少なくと
も95％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌ
クレオチド配列がCKβ-13ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各1
00ヌクレオチド毎に５個までの点突然変異を含んでもよいことを除いては、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味する。言い
換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列
を
有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの５％
までが欠失しているもしくは別のヌクレオチドに置換されていてもよく、または
参照配列の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入され
てもよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末
端部分で起こってもよく、またはそれらの末端部分の間のどこかで、参照配列ま
たは参照配列内の１つ以上の近接基内におけるヌクレオチドに個々に点在して起
こってもよい。
実際的な問題として、特定の核酸分子が例えば、図１に示すヌクレオチド配列
または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列と少なくとも90％、95％、96
％、97％、98％または99％同一であるか否かは、ベストフィット（Bestfit）プ
ログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、ユニックス用バージョン８、遺
伝子コンピューターグループ、University Research Park，575 Science Drive
，Madison WI 53711）のような既知のコンピュータープログラムを用いて慣例的
に決定することができる。ベストフィットは、２つの配列間の相同性の最善の部
分を検出するために、スミス＆ウォーターマン（Smith and Waterman、Adcances
in Applied Mathematics 2：482〜489（1981））の局所相同アルゴリズムを用
いている。ベストフィットまたはその他の任意の配列配置プログラムを用いて特
定の配列が、例えば本発明の参照配列と95％同一であるか否かを決定する場合に
は、当然、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の全長に対して計算され、参照
配列におけるヌクレオチド総数の５％までに相同性の空白部分が得られるように
、パラメータを設定する。
本出願は、図１に示す核酸配列（配列番号：１）、または寄託されたcDNAの核
酸配列がCKβ-13活性を有するポリペプチドをコードするか否かによらず、それ
らと少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である核酸分子を
目的とする。これは、たとえ特定の核酸分子がCKβ-13活性を有するポリペプチ
ドをコードしていなくとも、当業者はなお、例えばハイブリダイゼーションプロ
ーブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーとして核酸分子を使用する
方法を知っていると思われるためである。CKβ-13活性を有するポリペプチドを
コードしない本発明の核酸分子の用途には、とりわけ、（1）cDNAライブラリに
おけるCKβ
-13遺伝子またはその対立遺伝子変異体の単離；（2）ベルマら（Verma）「ヒト
染色体：基本的技術のマニュアル（Human Chromosomes：A Manual of Basic Tec
hniques）」、Pergamon Press、New York（1988）に記述のように、CKβ-13遺伝
子の正確な染色体上の位置を提供するために***中期の染色体伸長体とのインサ
イチューハイブリダイゼーション（例えば「FISH」）；および特定の組織でのCK
β-13 mRNA発現を検出するノザンブロット分析、が含まれる。
しかし、CKβ-13蛋白質活性を有するポリペプチドを実際にコードする、図１
に示す核酸配列（配列番号：１）または寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも
90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である配列を有する核酸分子が好
ましい。「CKβ-13活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物アッセイにお
いて測定した場合に本発明の成熟蛋白質の活性と同程度の、しかし必ずしも同一
ではない活性を示すポリペプチドを意味する。例えば、本発明のCKβ-13蛋白質
は、実施例５に記述するアッセイにおいて活性化T-リンパ球を化学遊走させる。
CKβ-13蛋白質は上記アッセイにおいて活性化Tリンパ球に対して用量依存的に
化学遊走させる。このように、「CKβ-13蛋白質活性を有するポリペプチド」に
は、上記アッセイにおいて用量依存的に同じ活性を示すポリペプチドが含まれる
。用量依存的活性の程度はCKβ-13蛋白質のものと同一である必要はないが、好
ましくは、「CKβ-13蛋白質活性を有するポリペプチド」は、所定の活性におい
てCKβ-13蛋白質と比較して実質的に同程度の用量依存性を示す（すなわち、候
補ポリペプチドは、参照CKβ-13蛋白質と比較して、より大きい活性または、最
少で25分の１の低い活性、好ましくは最少で10分の１の低い活性を示すと思われ
る）
その他のCCケモカインと同様に、CKβ-13は、IL-2の存在下でCD3受容体とのク
ロスリンクによって活性化されるT-リンパ球に対して強い活性を示すと共に、白
血球に対して活性を示す。この理由から、CKβ-13は、これらの細胞タイプの増
殖、分化、および遊走を引き起こす上で活性がある。そのような活性は免疫増強
または抑制、骨髄保護、幹細胞動貞、急性および慢性炎症の調節ならびに白血病
の治療にとって有用である。しかし、他の既知のCCケモカインとは異なり、CKβ
-13は活性化単球および樹状細胞cDNAライブラリに限って発現されることが示さ
れている。これらの２つの細胞タイプを合わせると抗原提示細胞（APC）の大部
分を占
める。樹状細胞（DC）および単球は、宿主の適切な応答にとって重要で、初期抗
原特異的免疫応答を担当する専門的APCである。APCは、例えば、抗原の捕獲およ
び処理、ウイルスの捕獲、濾過および処理を含む免疫応答を開始させるために、
T-リンパ球およびB-リンパ球の双方に対する抗原の提示に重要な役割を果たして
いる。APCは通常、リンパ節、脾臓、胸腺、皮膚、および全身循環中に認められ
る。皮膚に認められる場合、DCはランゲルハンス細胞と呼ばれる。濾胞樹状細胞
はリンパ節の胚中心に常在する。CKβ-13は、これらの細胞によって産生される
ため、CKβ-13は単球および樹状細胞と共に、これらのAPCが相互作用する細胞の
活性を制御する活性を示す。さらに、CKβ-13は、APCが通常、皮膚、胸腺、脾臓
、およびリンパ節のような組織に常在する局所常在細胞に影響を及ぼす。
CKβ-13はDCの増殖および成熟を制御し、ピータースら（Peters）、（1996）
、Immun．Today 17：273が総説で述べ、ヤングら（Young）、（1995）、J．Exp
．Med．182：1111）；コークスら（Caux）、（1992）、Nature 360：258）；お
よびサンティゴ・シュワルツら（Santigo-Schwartz）、（1995）、Adv．Exp．Me
d．Biol．378：7）が記述したような増殖／分化アッセイにおいてモニターされ
る。
代表的な細胞株もそのようなアッセイにおいて用いることができる。CKβ-13は
また、DCおよび単球のイフェクター機能に影響を及ぼす。すなわち、CKβ-13はD
Cおよび単球がウイルス、細菌、またはその他の異物を取り込み、それらを処理
して免疫応答を担当するリンパ球に提示する能力を増強する。CKβ-13はまた、D
Cおよび単球とT-リンパ球およびB-リンパ球との相互作用を制御する。例えば、C
Kβ-13は、抗原提示の際に、応答する細胞を生存、増殖、分化、さらなるサイト
カインもしくは可溶性メディエーターを分泌させ、またはアポトーシスもしくは
その他の細胞死のメカニズムを誘導することによって応答細胞を選択的に除去さ
せる共刺激シグナルを提供する。DCおよび単球はHIVのCD4+T-リンパ球への移入
を容易にすることが示されているため、CKβ-13はまた、この能力に影響を及ぼ
し、HIVまたは単球もしくはDCを介した他のウイルスによるリンパ球の感染を防
止する。このことは、そのようなウイルスによる単球およびDCの初期感染の場合
にも当てはまる。
当然のこととして、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNA
の核酸配列または図１（配列番号：１）に示す核酸配列と少なくとも90％、95％
、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「
CKβ-13蛋白質活性を有する」ポリペプチドをコードするであろうことを直ちに
認識すると思われる。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全て同
じポリペプチドをコードするため、これは上記の比較アッセイを行わなくとも当
業者には明らかであると思われる。縮重変異体でないそのような核酸分子の場合
でも、妥当な数の核酸分子がCKβ-13蛋白質活性を有するポリペプチドをコード
することは当技術分野においてさらに認識されるであろう。これは、後にさらに
詳しく説明するように、蛋白質機能に有意な影響を及ぼす可能性が低い、または
可能性がないアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミ
ノ酸に置換する）を当業者が十分に承知しているためである。
ベクターと宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター
によって遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技法によるCKβ-13ポリペプ
チドまたはその断片の製造に関する。ベクターは例えば、ファージ、プラスミド
、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベク
ターは複製可能または複製不能であってもよい。後者の場合ウイルスの増殖は一
般に、これを補足するような宿主細胞に限って起こる。
ポリヌクレオチドは、宿主での増殖のために選択可能なマーカーを含むベクタ
ーと結合させてもよい。一般にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物
のような沈殿物において、または電荷脂質との複合体において導入される。ベク
ターがウイルスである場合、適当なパッケージング細胞株を用いてインビトロで
パッケージングし、その後宿主細胞に形質導入してもよい。
DNAインサートは、いくつか例を挙げると、ファージラムダPLプロモーター、
大腸菌lac、trp、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモータ
ーならびにレトロウイルスLTRのプロモーターのような適当なプロモーターに機
能的に結合すべきである。他の適したプロモーターも当業者に既知である。発現
構築物はさらに、転写開始、終了および転写領域において翻訳のためのリボソー
ム結合部位を含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、翻訳すべ
きポリ
ペプチドの最初に翻訳開始コドンを、および末尾に適切に位置する停止コドン（
UAA、UGA、またはUAG）を含むことが好ましい。
示したように、発現ベクターは好ましくは、少なくとも１つの選択可能マーカ
ーを含む。そのようなマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダク
ターゼ、G418またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびに大腸菌およびその他の細
菌の培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺
伝子が含まれる。適当な宿主の代表的な例には、大腸菌、放線菌（Streptomyces
）、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）細胞のような細菌細胞；
酵母細胞のような真菌細胞、ショウジョウバエ（Drosophila）S2およびスポドプ
テラSf9（Spodoptera）細胞のような昆虫細胞；CHO、COS、293およびBowes黒色
腫細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞が含まれるがこれらに限定しない。
上記宿主細胞に対して適当な培養培地および条件は当技術分野で既知である。
細菌において用いることが好ましいベクターには、前記のキアゲン社（QIAGEN
Inc.）から入手できるpQE70、pQE60およびpQE-9；ストラタジーン社から入手
できるpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16
a、pNH18A、pNH46A；およびファルマシア社から入手できるptrc99a、pKK223-3、
pKK233-3、pDR540、pRIT5が含まれる。好ましい真核ベクターは、ストラタジー
ン社から入手できるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG；ならびにファル
マシア社から入手できるpSVK3、PBPV、PMSG、およびpSVLである。他の適したベ
クターは当業者に容易に明らかとなるであろう。
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクショ
ン、電気穿孔、形質導入、インフェクションまたはその他の方法によって行うこ
とができる。そのような方法は、デービスら（Davis）の「分子生物学の基本的
方法（Basic Method in Molecular Biology）」（1986）のような多くの標準実
験マニュアルに記述されている。
ポリペプチドは、融合蛋白質のような改変型において発現されてもよく、分泌
シグナルのみならず、さらなる異種機能領域を含んでもよい。例えば、精製、ま
たはその後の取り扱いおよび保存の際に、宿主細胞における安定性および持続性
を改善するために、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸をポリペプチド
のN末端に加えてもよい。同様に、精製を容易にするためにペプチド部分をポリ
ペプチドに加えてもよい。そのような領域はポリペプチドの最終調製の前に除去
してもよい。分泌または排出させるために、安定性を改善するためおよびとりわ
け精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチドに加えることは一般的
で、当技術分野で定常的な技術である。好ましい融合蛋白質は、蛋白質の安定化
および精製に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、EP-A-O 464
533（カナダの対応特許第2045869号）は、別のヒト蛋白質またはその一部と共
に免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を含む融合蛋白質を開示している
。多くの場合、融合蛋白質のFc部分は治療および診断での使用に非常に有用で、
このように例えば薬物動態特性の改善が得られる（EP-A 0232262）。一方で、用
途によっては、融合蛋白質を記述の有利な方法で発現、検出および精製した後に
Fc部分を欠失することができれば望ましいと考えられる。これは、例えば、融合
蛋白質を免疫のための抗原として用いる場合に、Fc部分が治療および診断に用い
る際に妨害となることが証明された場合に当てはまる。例えば、医薬品の発見に
おいて、hIL-5のアンタゴニストを特定するための高処理量スクリーニングアッ
セイの目的で、hIL-5のようなヒト蛋白質をFc部分と融合している。ベネットら
（D.Bennett）、J．Molecular Recognition 8：52〜58（1995）およびヨハンソ
ンら（K.Johanson）、J．Biol．Chem．270：9459〜9471（1995）を参照のこと。
CKβ-13蛋白質は、硫酸アンモニウム、またはエタノール沈殿法、酸抽出、陰
イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、フォスフォセルロースクロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを含む周知の方法によって、組換え培養細胞から回収および精製すること
ができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を精製に
用いる。本発明のポリペプチドには、直接単離または培養したものであれ、体液
、組織および細胞を含む天然の試料源から精製した物質；化学合成技法の産物；
ならびに例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む原核また
は真核宿主から組換え技法によって生成した産物が含まれる。組換え産生技法に
お
いて用いられる宿主に依り、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていても
グリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、場
合によっては、宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変メチオニン残基を含
んでもよい。
ポリペプチドおよび断片
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列もしくは
配列番号：２のアミノ酸配列を有する単離されたCKβ-13ポリペプチド、または
上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。
変種および変異ポリペプチド
CKβ-13ポリペプチドの特徴を改善または変化させるため、蛋白質操作法を用
いてもよい。当技術分野で既知の組換えDNA技術を用いて、新規変異蛋白質、ま
たは１つまたは多数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合蛋白質を含む突然変
異蛋白質を作製することができる。そのような改変ポリペプチドは例えば、活性
の増強または安定性の増強を示すことができる。さらに、それらはより高い収率
で精製され、少なくとも特定の精製および保存条件下で対応する天然のポリペプ
チドより良好な溶解性を示す可能性がある。
N末端およびC末端欠失変異体
例えば、膜関連蛋白質の細胞外ドメインまたは分泌蛋白質の成熟型を含む多く
の蛋白質について、生物機能が実質的に失われることなく、１つ以上のアミノ酸
がN末端またはC末端から欠失する可能性があることは当技術分野で既知である。
例えば、ロンら（Ron）、J．Bjol．Chem．268：2984〜2988（1993）は、3、8ま
たは27位のアミノ末端アミノ酸残基が欠失していてもヘパリン結合活性を有する
改変KGF蛋白質を報告した。この場合、本発明の蛋白質はケモカインポリペプチ
ドファミリーに属するため、配列番号：２の36位のシステインまでのN末端アミ
ノ酸が欠失しても、受容体結合または標的細胞活性の制御のようなケモカインに
とってのいくつかの生物活性は保持されうる。配列番号：２におけるCys-36残基
を含むさらなるN末端欠失を有するポリペプチドは、ケモカイン関連ポリペプチ
ドにおけるこの残基が、受容体結合およびシグナル伝達において必要な構造的安
定性を提供するジスルフィド架橋の形成に必要であるということがわかっている
ため、そ
のような生物活性を保持しないと予想される。
しかし、蛋白質のN末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失によって、蛋白質の
１つ以上の生物機能が失われるという改変が生じても、その他の生物活性はなお
保持されると考えられる。このように、短くなった蛋白質が蛋白質の完全または
成熟型を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、完全または成熟蛋
白質のN末端から除去される残基が大部分より少なければ一般に保持されると考
えられる。完全な蛋白質のN末端残基を欠損する特定のポリペプチドがそのよう
な免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記述の定常的な方法によって、
およびそうでなければ当技術分野で既知の方法によって容易に決定することがで
きる。
したがって、本発明はさらに、配列番号：２に示されるCKβ-13のアミノ酸配
列のアミノ末端からCys-36残基までの間で１個以上の残基が欠失したポリペプチ
ド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
特に、本発明は、nが１〜35までの範囲の整数で、Cys-36が、CKβ-13蛋白質の受
容体結合活性に必要と思われる完全なCKβ-13ポリペプチド（配列番号：２に示
す）のN末端からの最初の残基の位置である、配列番号：２の残基n-93位のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
より詳しく述べると、本発明は配列番号：２の残基１〜93、2〜93、3〜93、4
〜93、5〜93、6〜93、7〜93、8〜93、9〜93、10〜93、11〜93、12〜93、13〜93
、14〜93、15〜93、16〜93、17〜93、18〜93、19〜93、20〜93、21〜93、22〜93
、23〜93、24〜93、25〜93、26〜93、27〜93、28〜93、29〜93、30〜93、31〜93
、32〜93、33〜93、34〜93、および35〜93位のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供
する。
同様に、生物学的に機能的なC末端欠失変異蛋白質についても多くの例が知ら
れている。例えば、インターフェロンγは、蛋白質のカルボキシ末端から８〜10
個のアミノ酸残基を欠失することによって最大で10倍高い活性を示す（デベリら
（
質はケモカインポリペプチドファミリーに属するため、配列番号：２の76位のCy
sまでのC末端アミノ酸が欠失しても、受容体結合または標的細胞活性の制御のよ
うなケモカインにとってのいくつかの生物活性は保持される可能性がある。さら
に配列番号：２のCys-76を含むC末端欠失を有するポリペプチドは、ケモカイン
関連ポリペプチドにおけるこの残基が、受容体結合およびシグナル伝達にとって
必要とされる構造的安定性を提供するジスルフィド架橋の形成に必要であるため
に、そのような生物活性を保持しないと予想される。
しかし、蛋白質のC末端から１個以上のアミノ酸が欠失したために蛋白質の１
つ以上の生物機能が失われる改変が起こっても、その他の生物活性はなお保持さ
れるうる。このように、短くなった蛋白質が、蛋白質の完全型または成熟型を認
識する抗体を誘導および／または結合する能力は、C末端から除去される残基が
完全または成熟蛋白質の過半数より少なければ、保持されると考えられる。完全
な蛋白質のC末端残基を欠損する特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性
を保持するか否かは、本明細書に記述の定常的な方法によって、およびそうでな
ければ当技術分野で既知の方法によって容易に決定することができる。
従って、本発明は、配列番号：２に示すCKβ-13のアミノ酸配列のカルボキシ
末端から配列番号：２のCys-76までの１個以上の残基を有するポリペプチド、お
よびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
特に、本発明は、mが77〜93までの範囲の任意の整数で、76は、CKβ-13蛋白質の
受容体結合または標的細胞活性の制御に必要と思われる完全CKβ-13ポリペプチ
ド（配列番号：２に示す）のC末端Cys残基の位置である、配列番号：２のアミノ
酸配列の残基１〜m位のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
より詳しく述べると、本発明は、nが配列番号：２の１〜35までの整数で、mが
77〜93までの整数である、残基n〜m位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドも提供する。
ATCC寄託番号第97113号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なC
Kβ-13アミノ酸配列の一部を含み、この部分がATCC寄託番号第97113号に含まれ
るcDNAクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端の１〜約
35個のアミノ酸、もしくはカルボキシ末端の１〜約17個のアミノ酸を欠失し、ま
たはATCC寄託番号第97113号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全
なア
ミノ酸配列の上記アミノ末端およびカルボキシ末端欠失の何らかの組合せを有す
る、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。上記欠失変異ポリ
ペプチドの全ての型をコードするポリヌクレオチドもまた提供する。
その他の変異体
上記の蛋白質の末端欠失型の他に、蛋白質の構造または機能に有意な影響を及
ぼすことなく、CKβ-13ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列を変化させるこ
とができることも当業者によって認識されると思われる。そのような配列の差を
考慮する場合、蛋白質には活性を決定する重要な領域があることを覚えておくべ
きである。
このように、本発明にはさらに、実質的なCKβ-13ポリペプチド活性を示す、
または下記の蛋白質部分のようなCKβ-13蛋白質の領域を含むCKβ-13ポリペプチ
ドの変異体が含まれる。そのような変異体には、活性にほとんど影響を及ぼさな
いような当技術分野で一般的な規則に従って選択された欠失、挿入、逆位、反復
、およびタイプ置換が含まれる。例えば、表現型の上ではサイレントなアミノ酸
置換を作成する方法に関する手引き書は、ボウイら（Bowie，J.U.、「蛋白質配
列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換に対する抵抗性（Deciphering the
Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acids Substitutions）」
、Science 247：1306〜1310（1990））によって提供され、ここで著者らはアミ
ノ酸配列の変化に対する抵抗性を調べる２つの主なアプローチがあることを示し
ている。最初の方法は、その中で変異が自然の選択によって受容される、または
拒絶される進化の過程に依存する。第二のアプローチは、機能性を維持する配列
を同定するために、クローニングした遺伝子の特定の位置でのアミノ酸変化を導
入する遺伝子操作、選択、またはスクリーニングを用いる。
著者らが述べているように、これらの試験は、蛋白質がアミノ酸置換に驚くほ
ど抵抗性であることを明らかにした。著者らはさらに、アミノ酸変化が蛋白質の
特定の位置で許容される可能性があることを示している。例えば、最も埋もれた
（buried）アミノ酸残基には非極性の側鎖が必要であるが、表面側鎖の特徴は一
般的にほとんど保存されない。その他のそのような表現型上のサイレント置換は
、前記のボウイら（Bowie，J.U.）およびそこに引用されている参考文献に記述
さ
れている。典型的に保存的置換として認められるのは、脂肪族アミノ酸、Ala、V
al、LeuおよびIle内での置換；ヒドロキシル残基SerとThrとの交換、酸性残基As
pとGluとの交換、アミド残基AsnとGlnとの置換、塩基性残基LysとArgとの交換お
よび芳香族残基Phe、Tyrの間の置換である。
このように、配列番号：２のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによってコー
ドされるポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、(i)その中で１つ以上の
アミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸
残基）によって置換され、そのような置換アミノ酸残基が遺伝子コードによって
コードされたものであっても、コードされないものであってもよいもの、または
(ii)１つ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）ポリペプ
チドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）のように、
成熟ポリペプチドがもう一つの化合物と融合しているもの、または(iv)さらなる
アミノ酸が、IgG Fc融合領域ペプチド、リーダー配列、分泌配列、もしくはポリ
ペプチドの上記型もしくはプロ蛋白質配列の精製に用いられる配列のような、ポ
リペプチドの上記の型と融合しているもの、であってもよい。そのような断片、
誘導体および類似体は、本明細書の開示から当業者の技術範囲内であると考えら
れる。
このように、本発明のCKβ-13には、自然の変異または人為的操作のいずれか
によって、１個以上のアミノ酸置換、欠失または付加が含まれてもよい。示され
るように、変化は、蛋白質の折り畳みまたは活性に有意な影響を及ぼさない保存
的アミノ酸置換のような軽微な性質であることが好ましい（表１参照）。
表１．保存的アミノ酸置換
本発明のCKβ-13蛋白質において、機能にとって必須であるアミノ酸は、部位
特異的変異誘発、またはアラニンスキャン変異誘発のような当技術分野で既知の
方法によって同定することができる。（カニンガム＆ウェルズ（Cunningham and
Wells）、Science 244：1081〜1085（1989））。後者の技法は、分子のあらゆ
る残基で単一のアラニン変異を導入する。次に得られた変異分子を受容体結合ま
たはインビトロもしくはインビボ増殖活性のような生物活性に関して試験する。
荷電アミノ酸と他の荷電または中性アミノ酸との置換は特に重要で、これによ
って凝集がより少ないといった非常に望ましい改善された特徴を有する蛋白質を
生じる可能性がある。凝集は免疫原性となり得るため（ピンカードら（Pinckard
）、Clin．Exp．Immunol．2：331〜340（1967））；ロビンスら（Robbins）、Di
abetes 36：838〜845（1987）；クレランドら（Cleland）、Crit．Rev．Therape
utic Drug Carrier Systems 10：307〜377（1993））、凝集は活性を低下させる
のみならず、薬学的組成物の調製の際に問題となる可能性がある。
また、アミノ酸の置換により、リガンドと細胞表面受容体との結合の選択性を
変化させることができる。例えば、オスタデら（Ostade）、Nature 361：266〜2
68（1993）は、既知の２つのタイプのTNF受容体の１つのみとTNF−αとの選択的
結合が得られた特定の変異について記述している。リガンド・受容体結合にとっ
て重要な部位もまた、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識のような構造分析
によって決定することができる（スミスら（Smith）、J．Mol．Biol．224：899
〜904（1992）およびドフォスら（de Vos）、Science 255：306〜312（1992））
。
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形で、および好ましくは実質
的に精製された形で提供される。組換えにより産生されたCKβ-13ポリペプチド
は、スミス＆ジョンソン（Smith and Johnson）、Gene 67：31〜40（1988）に記
述された１ステップ法によって実質的に精製することができる。本発明のポリペ
プチドもまた、蛋白質精製の技術分野で周知である方法において、本発明の抗-C
Kβ-13抗体を用いて天然または組換え型試料源から精製することができる。
本発明のさらなるポリペプチドには、上記のポリペプチドと少なくとも90％類
似である、より好ましくは少なくとも95％類似である、そしてさらにより好まし
くは少なくとも96％、97％、98％または99％類似であるポリペプチドが含まれる
。本発明のポリペプチドはまた、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプ
チドまたは配列番号：２のポリペプチドと少なくとも80％同一、より好ましくは
少なくとも90％、または95％同一、さらにより好ましくは少なくとも96％、97％
、98％または99％同一であるポリペプチドを含み、また少なくともアミノ酸30個
およびより好ましくは少なくとも50個を有するそのようなポリペプチドの一部が
含まれる。
２つのポリペプチドの「％類似性」とは、ベストフィットプログラム(Bestfi
ｔ、ウィスコンシン配列解析パッケージ、ユニックス用バージョン８、遺伝子コ
ンピューターグループ、University Research Park，575 Science Drive，Madis
onWI 53711）および類似性決定のためのデフォルト設定を用いて、２つのポリペ
プチドのアミノ酸配列を比較することによって生じた類似性スコアを意味する。
ベ
ストフィットは、２つの配列の類似性の最善の部分を検出するために、スミス＆
ウォーターマンの局所相同性アルゴリズム（Advances in Applied Mathematics
2：482〜489、1981）を用いている。
CKβ-13ポリペプチドの参照アミノ酸配列と少なくとも例えば95％「同一な」
アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、CKβ-13ポリペプチドの参照アミノ酸
のアミノ酸100個毎に５個までのアミノ酸変異を含んでもよい。言い換えれば、
参照アミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失もしくは他のア
ミノ酸と置換されてもよく、または参照配列における総アミノ酸残基の５％まで
の数のアミノ酸が参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変化は
、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部分で起こってもよく
、またはそれらの末端部分の間のどこかに、参照配列の残基または参照配列内の
１つ以上の近接基内に個々に散在してもよい。
実際的な問題として、特定のポリペプチドが、例えば配列番号：２に示すアミ
ノ酸配列または寄託されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列と少
なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるか否かは、ベス
トフィットプログラム（Bestfit、ウィスコンシン配列解析パッケージ、ユニッ
クス用バージョン８、遺伝子コンピューターグループ、University Research Pa
rk，575 Science Drive，Madison WI 53711）のような既知のコンピュータープ
ログラムを用いて慣例的に決定することができる。特定の配列が例えば、本発明
の参照配列と95％同一であるか否かを決定するためにベストフィットまたはその
他の配列配置プログラムを用いる場合、当然、同一性の割合が参照アミノ酸配列
の全長に対して計算され、参照配列におけるアミノ酸残基の総数の５％までの相
同性の空白部分が得られるように、パラメータを設定する。
本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEゲルまたは当業者に周知の方法を用いた分
子ふるいゲル濾過カラム上での分子量マーカーとして用いることができる。
下記に示すように、本発明のポリペプチドを用いて、下記のようにCKβ-13蛋
白質発現を検出するアッセイにおいて、またはCKβ-13蛋白質機能を増強もしく
は阻害することができるアゴニストおよびアンタゴニストとして有用であるポリ
クロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体を作製することができる。さらに、そのよ
うなポリペプチドは、酵母の２ハイブリッドシステムにおいて本発明のアゴニス
トおよびアンタゴニストの候補でもあるCKβ-13蛋白結合蛋白質を「捕獲する」
ために用いることができる。酵母２ハイブリッドシステムは、フィールズ＆ソン
グ（Fields and Song）、Nature 340:245〜246（1989）に記述されている。
エピトープ含有部分
もう一つの局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ含有
部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエ
ピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。
「免疫原性エピトープ」とは、蛋白全体が免疫原物質である場合、抗体反応を誘
発する蛋白質の一部として定義される。一方で、抗体が結合することができる蛋
白質分子の領域は「抗原性エピトープ」として定義される。蛋白質の免疫原性エ
ピトープの数は一般に、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、ゲイセンら
（Geysen）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：3998〜4002（1983）を参照のこ
と。
抗原性エピトープを有する（すなわち、抗体が結合することができる蛋白質分
子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、蛋白質配列の一
部を模倣した比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣された蛋白質と反応する
抗血清を定常的な方法により誘発することができることは当技術分野で周知であ
る。例えば、サトクリッフェ（Sutcliffe，J.G.）、シニック（Shinnick，T.M.
）、グリーン（Green，N.）およびラーナー（Learner，R.A.）（1983）の「蛋白
質上の既定の部位と反応する抗体（Antibodies that react with predetermined
sites on proteins）」、Science 219：660〜666を参照のこと。蛋白質反応性
血清を誘発することができるペプチドは、蛋白質の一次配列においてしばしば示
され、一連の単純な化学的法則によって特徴分析を行うことができ、完全蛋白質
の免疫優性領域（すなわち免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボ
キシ末端にも制限されない。本発明の抗原性エピトープ含有ペプチドおよびポリ
ペプチドは、したがって、本発明のポリペプチドと特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を含む抗体の作製に有用である。例えば、ウィルソンら（Wilson）、Ce
ll 3
7：767〜778（1984）の777頁を参照のこと。
本発明の抗原性エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは本
発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７個の配列を含み、
より好ましくは少なくとも９個および最も好ましくは約15個〜約30個のアミノ酸
の配列を含む。CKβ-13特異的抗体を産生するために用いることができる抗原性
ポリペプチドまたはペプチドの非制限的な例として、ほぼThr-22〜ほぼGly-28；
Asn-30〜ほぼLeu-47；Thr-56〜ほぼVal-65；およびPhe-70〜ほぼTrp-83までのア
ミノ酸残基を含むポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチド断片は、上記
の図３に示すようにジェームソン・ウルフ（Jameson-Wolf）抗原性指数の分析に
よってCKβ-13蛋白質の抗原性エピトープを有することが決定されている。
本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、如何なる従来の手段
を用いて産生してもよい。例えば、ハフテンら（Houghten，R.A.）（1985）「多
数のペプチドの迅速な固相合成に関する一般法：個々のアミノ酸のレベルでの抗
原抗体相互作用の特異性（General method for the rapid solid-phasesynthesi
s of large numbers of pepitides：specificity of antigen-antibody interac
tion at the level of individual aminoacids）」、Proc．Natl．Acad．Scid．
USA 82：5131〜5135；この「同時多ペプチド合成（Simultaneous Multiple Pept
ide Synthesis：SMPS）」プロセスはさらに、ハフテンら（Houghten）に対する
米国特許第4,631,211号において記述されている。
本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、当技術分野で周知の
方法に従って抗体を誘導するために用いられる。例えば、サトクリッフェら（Su
tcliffe）、前記；ウィルソンら（Wilson）、前記；チョウら（Chow，M.）、Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA 82：910〜914；およびビットルら（Bittle，F.J.）、
J．Gen．Virol．66：2347〜2354（1985）を参照のこと。本発明の免疫原性エピ
トープ含有ペプチド、すなわち蛋白質全体が免疫原物質である場合に抗体反応を
誘発する蛋白質の一部は、当技術分野で既知の方法に従って同定される。例えば
、ゲイセンら（Geysen）、前記を参照のこと。さらに、なおゲイセン（Geysen）
（1990）に対する米国特許第5,194,392号は、関係する抗体の特定のパラトープ
（抗原結合部位）と相補的なエピトープ（すなわち「ミモトープ」）の位相同形
であ
るモノマー（アミノ酸またはその他の化合物）の配列を検出または決定するため
の一般的な方法を記述している。より一般的にゲイセンら（Geysen）（1989）に
対する米国特許第4,433,092号は、関係する特定の受容体のリガンド結合部位に
相補的なリガンドの位相同形であるモノマーの配列を検出または決定する方法を
記述している。同様に、ペルアルキル化オリゴペプチド混合物に関するハフテン
ら（Houghten，R.A.）（1996）に対する米国特許第5,480,971号は、直鎖状のC1-
C7アルキルペルアルキル化オリゴペプチド、ならびにそのようなペプチドのセッ
トおよびライブラリと共に、関係するアクセプター分子と選択的に結合するペル
アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、そのようなオリゴペプチド
セットおよびライブラリを用いる方法を開示する。このように、本発明のエピト
ープ含有ペプチドの非ペプチド性類似体もまた、これらの方法によって定常的な
方法により作製することができる。
融合蛋白質
当業者は、上記の本発明のCKβ-13ポリペプチドおよびそのエピトープ含有断
片は、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの一部と組み合わせることができ
、その結果、キメラポリペプチドが得られることを認識していると思われる。こ
れらの融合蛋白質は精製を容易にし、インビボでの半減期の増加を示す。これは
例えば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳類免疫グロブ
リンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインを含むキメラ蛋白質について
示されている（EP A 394,827；トラウネッカーら（Traunecker）、Nature 331：
84〜86（1988））。IgG部分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合
蛋白質はまた、モノマーCKβ-13蛋白質または蛋白質断片単独以外の分子を結合
および中和するためにより有効となりうる（フォウントウラキスら（Fountoulak
is）、J．Biochem．270：3958〜3964（1995））。
抗体
本発明において用いられるCKβ-13蛋白質特異的抗体は、アルブミンのような
担体蛋白質と共に、または十分長ければ（アミノ酸少なくとも約25個）担体がな
くとも動物系（ウサギ、またはマウス）に投与することができる、完全なCKβ-1
3蛋白質またはその抗原性ポリペプチド断片に対して作製してもよい。
本明細書で用いるように、「抗体（Ab）」、または「モノクローナル抗体（Ma
b）」という用語には、CKβ-13蛋白質に特異的に結合することができる完全な分
子と共に抗体断片（例えば、FabおよびF(ab')2断片）が含まれることを意味する
。FabおよびF(ab')2断片は完全な抗体のFc断片を欠損し、循環中からより急速に
***され、完全抗体の非特異的組織結合は低い可能性がある（ワールら（Wahl）
、J．Nucl．Med．24：316〜325（1983））。このように、これらの断片が好まし
い。
本発明の抗体は、様々な方法によって調製してもよい。例えば、ポリクローナ
ル抗体を含む血清の産生を誘起するために、CKβ-13蛋白質またはその抗原性断
片を発現する細胞を動物に投与することができる。好ましい方法において、CKβ
-13蛋白質の調製物は、天然の混入物を実質的に含まないように調製および精製
される。次に、より比活性の大きいポリクローナル抗血清を作製するために、そ
のような調製物を動物に注入する。
最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはその
CKβ-13蛋白質結合断片）である。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリ
ドmerling）、「モノクローナル抗体とT-細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibo
dies and T-Cell Hybridmas）」、Elsevier，N.Y．（1981）、563〜681頁）。一
般に、そのような技法は、CKβ-13蛋白質抗原、またはより好ましくはCKβ-13蛋
白質発現細胞によって動物（好ましくはマウス）を免疫することを含む。適した
細胞は、それらが抗CKβ-13蛋白質抗体に結合するか否かによって認識すること
ができる。そのような細胞は、適した組織培養培地中で培養してもよいが、10％
ウシ胎児血清（約56℃で不活化）、ならびに約10g/lの非必須アミノ酸、約1000U
/mlぺニシリン、および約100μg/mlストレプトマイシンを加えたアール（Earle
）の改変イーグル（Eagle）培地において細胞を培養することが好ましい。その
ようなマウスの脾細胞を採取して、適した骨髄腫細胞株と融合させる。本発明に
従っていかなる適した骨髄腫細胞株を用いてもよいが、メリーランド州ロックビ
ル
にあるアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる親骨髄腫細胞株
（SP20）を用いることが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をHAT
培地で選択的に維持し、ワンズら（Wands、Gastroenterology 80：225〜232（19
81））が記述した限界希釈によってクローニングする。次にそのような選択によ
って得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、CKβ-13蛋白質抗原と結合す
ることができる抗体を分泌するクローンを特定する。
または、抗イディオタイプ抗体を用いることによって、CKβ-13蛋白質抗原と
結合することができるさらなる抗体を２段階法によって産生してもよい。そのよ
うな方法は、抗体がそれ自身抗原であって、したがって第二抗体と結合する抗体
を得ることが可能であるという事実を利用している。この方法に従って、CKβ-1
3蛋白質特異的抗体を用いて動物、好ましくはマウスを免疫する。次に、そのよ
うな動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を産生し、ハイブリドーマ細胞を
スクリーニングして、CKβ-13蛋白質特異的抗体との結合能をCKβ-13蛋白質抗原
によって遮断することができる抗体を産生するクローンを特定する。そのような
抗体は、CKβ-13蛋白質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、さら
なるCKβ-13蛋白質特異的抗体の形成を誘導するために動物の免疫に用いること
ができる。
本発明の抗体のFabおよびF(ab')2ならびにその他の断片は、本明細書に開示の
方法に従って用いられることが認識されると思われる。そのような断片は典型的
に、パパイン（Fab断片を生じる）またはペプシン(F(ab')2断片を生じる）のよ
うな酵素を用いて、蛋白質分解性の開裂によって得られる。またはCKβ-13蛋白
質結合断片は、組換えDNA技法の応用または合成化学によって産生することがで
きる。
ヒトにおける抗CKβ-13のインビボでの使用に関しては、「ヒト化させた」キ
メラモノクローナル抗体を用いることが好ましい可能性がある。そのような抗体
は上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構
築物を用いて産生することができる。キメラ抗体の製造法は当技術分野で既知で
ある。参考までに、モリソン（Morrison）、Science 229：1202（1985）；オイ
ら（Oi）、BioTechnniques 4：214（1986）；キャビリーら（Cabilly）、米国特
許第
4,816,567号；タニグチら（Taniguchi）、欧州特許第171496号；モリソンら（No
.rrison）、欧州特許第173494号；ニューバーガーら（Neuberger）、国際公開公
報第8601533号；ロビンソンら（Robinson）、国際公開公報第8702671号；ブーリ
アンヌら（Boulianne）、Nature 312：643（1984）；ニューバーガーら（Neuber
ger）、Nature 314：268（1985）を参照のこと。
免疫系関連障害
診断
本発明者らは、CKβ-13が不活性化単球およびエクスビボで増殖させた樹状細
胞に発現されることを見出した。多くの免疫系関連障害にとって、実質的に変化
した（増加または減少）レベルのCKβ-13遺伝子発現は、そのような障害を有す
る個体から採取した免疫系の組織、その他の細胞もしくは体液（例えば、血清、
血漿、尿、滑液、または脳脊髄液）において、「標準的な」CKβ-13遺伝子発現
レベル、すなわち免疫系の障害を有しない個体から採取した免疫系組織もしくは
体液中のCKβ-13発現レベルと比較して、検出することができる。このように、
本発明は、個体から採取した免疫系組織、その他の細胞もしくは体液中のCKβ-1
3蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する段階、および測定した遺伝
子発現レベルを標準的なCKβ-13遺伝子発現レベルと比較する段階を含み、それ
によって標準と比較して遺伝子発現レベルが増加または減少すれば免疫系障害が
存在することが示される、免疫系障害の診断の際に有用な診断法を提供する。
特に、免疫系の癌を有する哺乳類における特定の組織が、対応する「標準的な
」レベルと比較して、有意に変化した（すなわち増強または減少）レベルのCKβ
-13蛋白質およびCKβ-13蛋白質をコードするmRNAを発現すると思われる。さらに
、そのような癌を有する哺乳類からの特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、お
よび脳脊髄液）では、癌を有しない同種の哺乳類からの血清と比較して、変化し
たレベルのCKβ-13蛋白質を検出することができると思われる。
このように、本発明は、個体から採取した免疫系の組織、その他の細胞もしく
は体液中のCKβ-13蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する段階、お
よび測定された遺伝子発現レベルを標準的なCKβ-13遺伝子発現レベルと比較す
る段階を含み、それによって標準と比較して遺伝子発現レベルが有意に増加また
は減
少すれば、免疫系の障害が存在することが示される、免疫系の癌を含む免疫系障
害の診断の際に有用な診断法を提供する。
腫瘍の診断を含む免疫系の障害の診断が従来の方法によって既になされている
場合には、CKβ-13遺伝子発現が有意に変化している患者は、標準レベルに近い
遺伝子発現レベルを示す患者と比較してより悪い臨床転帰をたどると考えられる
ため、本発明は予後の指標として有用である。
「CKβ-13蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを解析する」とは、第一の
生物試料中のCKβ-13蛋白質のレベルまたはCKβ-13蛋白質をコードするmRNAのレ
ベルを、直接（例えば、蛋白質の絶対レベルまたはmRNAレベルを決定または推定
することによって）、または相対的（例えば、第二の生物試料中のCKβ-13蛋白
質レベルまたはmRNAレベルと比較することによって）に、定性的または定量的に
測定または推定することを意味する。好ましくは、第一の生物試料中のCKβ-13
蛋白質レベルまたはmRNAレベルを測定または推定して、疾患を有しない個体から
採取された第二の生物試料から得られた値、または免疫系の疾患を有しない個体
の集団からの平均レベルによって決定した値である、標準的なCKβ-13蛋白質レ
ベルまたはmRNAレベルと比較する。当技術分野で認識されるように、標準的なCK
β-13蛋白質レベルまたはmRNAレベルがわかれば、これを比較のための標準とし
て繰り返し用いることができる。
「生物試料」とは、CKβ-13蛋白質またはmRNAを含む個体、体液、細胞株、組
織培養またはその他の試料源から得られる任意の生物試料を意味する。示したよ
うに、生物試料には、遊離のCKβ-13蛋白質、免疫系の組織および完全または成
熟CKβ-13またはCKβ-13受容体を発現することがわかっているその他の組織源を
含む体液（血清、血漿、尿、滑液および脳脊髄液）が含まれる。哺乳類から組織
生検および体液を得る方法は当技術分野で周知である。生物試料にmRNAを含める
場合、組織生検が好ましい試料源である。
本発明は、哺乳類、好ましくはヒトにおける免疫細胞機能の脱制御を含む、様
々な免疫系関連障害の診断または治療に有用である。そのような障害には、白血
病、リンパ腫、自己免疫疾患、関節炎、免疫抑制、ヒスタミンおよびIgE媒介ア
レルギー反応、敗血症、プロスタグランジン非依存的発熱、骨髄不全、創傷治癒
、
珪肺症、類肉腫症、急性および慢性感染症、細胞性免疫、液性免疫、炎症性腸疾
患、骨髄抑制、および好酸球増加症候群等が含まれるがこれらに限定しない、腫
瘍、癌、間質性肺疾患（ランゲルハンス細胞肉芽腫症など）、および免疫細胞機
能の脱制御が含まれる。
総細胞RNAは、チョメジンスキー＆サッチ（Chomezynski and Sacchi、Anal．B
iochem．162：156〜159（1987））に記述のように、１段階グアニジニウム・チ
オシアネート・フェノール・クロロホルム法のような如何なる適した技法も用い
て生物試料から単離することができる。次に、CKβ-13蛋白質をコードするmRNA
レベルを適当な方法を用いてアッセイする。これらの中には、ノザンブロット分
析、S1ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリメラーゼ
連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT-PCR）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わ
せた逆転写（RT-LCR）が含まれる。
生物試料中のCKβ-13蛋白質レベルのアッセイは、抗体に基づく技法を用いて
行うことができる。例えば、組織でのCKβ-13蛋白質発現は、古典的な免疫組織
学的方法を用いて調べることができる（ヤルカネンら（Jalkanen，M.）、J．Cel
l．Biol．101：976〜985（1985）；ヤルカネンら（Jalkanen，M.）、J．Cell．B
jol.105：3087〜3096（1987））。CKβ-13蛋白質遺伝子発現を検出するために有
用なその他の抗体に基づく方法には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELIS
A）およびラジオイムノアッセイ（RIA）のようなイムノアッセイが含まれる。適
した抗体アッセイ標識は当技術分野で既知で、これにはグルコースオキシダーゼ
のような酵素標識、およびヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）
、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、およびテクネチウム（99mTc）のよ
うな放射性同位元素、およびフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識
、ならびにビオチンが含まれる。
個体から得られた生物試料中のCKβ-13蛋白質レベルの解析法の他に、CKβ-13
蛋白質はまた画像によってインビボで検出することもできる。CKβ-13蛋白質を
インビボで画像化するための抗体標識またはマーカーには、X-線造影、NMR、ま
たはESRによって検出可能なものが含まれる。X線撮影の場合、適した標識には、
バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が含まれ、これらは検出可能な
放射
線を放出するが、被験者には明らかに有害でない。NMRおよびESRにとって適した
マーカーには、重水素のように検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれ
、これらは関連するハイブリドーマのための栄養素の標識によって抗体に取り込
んでもよい。
放射性同位元素（例えば、131I、112In、99mTc）、放射線不透過物質、または
核磁気共鳴によって検出可能な材料のような適当な検出可能な画像部分で標識し
たCKβ-13蛋白質特異的抗体または抗体断片を、免疫系障害のために検査すべき
哺乳類に注入（例えば、非経口、皮下または腹腔内）する。被験者の体格および
用いる造影システムにより、診断画像を得るために必要な造影部分の量が決定さ
れることは当技術分野において認識されていると思われる。放射性同位元素の部
分の場合、ヒト被験者に注入する放射活性量は99mTcの通常約５〜20ミリキュリ
ーの範囲である。次に、標識された抗体または抗体断片はCKβ-13蛋白質を含む
細胞部位に選択的に蓄積する。インビボ腫瘍造影はブルキエルら（S.W．Burchie
l）の「放射性標識抗体とその断片の免疫薬物動態（Immunopharmacokinetics of
Radiolabeled Antibodies and TheirFragments）」（第13章、「腫瘍の造影：
癌の放射化学検出（Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer）
」、ブルキエル＆ローズ編（S．W．Burchiel and B.A．Rhodes）、Masson Publi
shing Inc．（1982））に記述されている。
治療
上記のように、CKβ-13ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、CKβ-13活性
の異常に高いまたは低い発現を含む状態の診断に有用である。その活性と共にCK
β-13が発現されている細胞および組織がCKβ-13によって制御されているとすれ
ば、個体におけるCKβ-13の発現レベルが標準または「正常な」レベルと比較し
て実質的に変化（増加または減少）していることにより、CKβ-13が発現および
／または活性である体系に関連した病的状態を生じることは容易に明らかとなる
。
本発明のCKβ-13蛋白質は、ケモカインβファミリーに属するため、蛋白質の
成熟型は、蛋白質溶解性の開裂によってCKβ-13を発現する細胞から可溶性の形
で放出される可能性があることも当業者は認識するであろう。したがって、成熟
CKβ-13を細胞外から個体の細胞、組織または体に加えると、蛋白質はその個体
の標的
細胞に対して生理活性を発揮すると考えられる。
したがって、個体におけるCKβ-13活性の標準または正常なレベルの減少によ
って生じた状態、特に免疫系の障害は、CKβ-13ポリペプチド（成熟型蛋白質）
の投与によって治療できることが認識される。したがって、本発明はまた、CKβ
-13活性のレベルを増加させることが必要な個体を治療する方法であって、本発
明のCKβ-13単離ポリペプチド、特に、該個体においてCKβ-13活性レベルを増加
させるのに有効な成熟型CKβ-13のある量を含む薬学的組成物を、該個体に投与
することを含む方法を提供する。
本発明のポリペプチドは、癌化学療法の際の補助的な保護治療として骨髄幹細
胞コロニー形成を阻害するために用いてもよい。CKβ-13ポリペプチドは、骨髄
幹細胞のような造血細胞の増殖および分化を阻害する可能性がある。白血病細胞
の増殖を治療的に阻害するために、前駆細胞の集団（例えば、顆粒球、およびマ
クロファージ／単球）に及ぼす阻害剤効果を利用してもよい。
本発明のポリペプチドはまた、皮膚のランゲルハンス細胞がケモカインを産生
することがわかっているため、ケラチノサイトの過増殖を特徴とする乾癬を治療
する目的で表皮ケラチノサイトの増殖阻害に用いてもよい。
CKβ-13は、固形腫瘍；例えば、細胞障害性T-細胞およびマクロファージのよ
うな宿主防御細胞の浸潤および活性化を刺激することによって、および腫瘍の血
管新生を阻害することによってカポジ肉腫を治療するための抗血管新生剤として
用いてもよい。当業者は、血管増殖が望ましくないその他の癌以外の適応症を認
識していると考えられる。
CKβ-13ポリペプチドは、殺菌性の白血球の誘引および活性化を通じて、慢性
および急性の耐性菌感染症、例えばマイコバクテリア感染症に対する宿主防御を
増強するために用いてもよい。
CKβ-13はまた、T細胞媒介自己免疫疾患およびリンパ球性白血病の治療を目的
として、IL-2生合成の阻害によってT-細胞増殖を阻害するために用いてもよい。
CKβ-13はまた、壊死組織片除去および結合組織促進炎症細胞の動員を通じて
、ならびに過度のTGF媒介繊維症の調節を通じて、創傷治癒を刺激し、治癒の際
の瘢痕を防止するために用いてもよい。このようにして、CKβ-13はまた、肝硬
変、変
形性関節炎、および肺繊維症を含むその他の繊維性疾患の治療に用いてもよい。
CKβ-13はまた、住血吸虫症、旋毛虫症、回虫症のような、組織に侵入する寄
生虫の幼虫を殺す明確な機能を有する好酸球の存在量を増加させる。CKβ-13は
また、当業者に周知のように、ナチュラルキラー（NK）細胞が存在することが有
用である様々な疾患の治療に有用となるNK細胞の存在量を増加させ、かつNK細胞
を活性化する。
様々な造血前駆細胞の活性化および分化を制御することによって、例えば、化
学療法後の骨髄から成熟白血球を放出するために、すなわち幹細胞動員において
造血を制御するために、CKβ-13を用いてもよい。
CKβ-13はまた、敗血症の治療に用いてもよく、免疫増強または抑制、骨髄保
護、ならびに急性および慢性炎症の調節に有用である。
それらはまた、様々な造血前駆細胞の活性化および分化を制御することによっ
て造血を制御するために、例えば化学療法後に骨髄からの成熟白血球を放出する
ために用いてもよい。
本発明のポリペプチドはまた、癌治療の場合のように、望まない細胞をアポト
ーシスの標的にするために用いてもよい。
ポリペプチドはまた、幹細胞が容易に単離できるようになる、骨髄幹細胞の末
梢血への動目のために用いてもよい。幹細胞の単離は大量化学療法後の骨髄コロ
ニー形成のために用いてもよい。
製剤
CKβ-13ポリペプチド組成物は製剤化して、個々の患者の臨床状態（特にCKβ-
13ポリペプチド単独による治療の副作用）、CKβ-13ポリペプチド組成物の輸送
部位、投与法、投与スケジュール、および医師に既知のその他の要因を考慮に入
れて、医療基準（good medical practice）に従って投与される。このように、
本明細書の目的のためのCKβ-13ポリペプチドの「有効量」は、そのような検討
によって決定される。
一般的な案として、非経口投与の場合のCKβ-13ポリペプチドの１用量あたり
の薬学的有効総量は、患者の体重あたり約１μg/kg/day〜10mg/kg/dayであるが
、これは前述のように治療の裁量に委ねられる。より好ましくは、この用量は少
な
くとも0.01mg/kg/day、最も好ましくはヒトに関してホルモンとして投与する場
合約0.01〜1mg/kg/dayである。連続的に表すと、CKβ-13ポリペプチドは典型的
に約１μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の投与速度で、１日１〜４回注射または例
えばミニポンプを用いた持続的皮下注入によって投与される。静注用バッグ溶液
もまた用いてもよい。変化を観察するために必要な治療期間および反応が起こる
までの治療後の期間は、望ましい作用に依存して変化するように思われる。
本発明のCKβ-13を含む薬学的組成物は、経口、直腸内、非経口、大槽内、膣
内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチ）、頬内、または経
口もしくは点鼻スプレーによって投与してもよい。「薬学的に許容される担体」
とは、非毒性の固体、半固体、または液体賦形剤、希釈剤、被包化材料、または
如何なるタイプの処方補助物質をも意味する。本明細書で用いられる「非経口」
という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、大槽内、皮下および関節内注射ならび
に注入を含む投与様式を指す。
CKβ-13ポリペプチドはまた、徐放性システムによって投与することも適して
いる。徐放性組成物の適した例には、成型された商晶の形としての半透過性ポリ
マーマトリクス、例えば薄膜、マイクロカプセルが含まれる。徐放性マトリクス
には、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、欧州特許第58,481号）、L-グル
タミン酸とγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー（シドマンら（Sidman，U.）
、Biopolymers 22：547〜556（1983））、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレ
ート)（ランガーら（R．Langer）、J．Biomed．Mater．Res．15：167〜277（198
1））、およびランガー（R．Langer）、Chem．Tech．12：98〜105（1982））、
酢酸エチレンビニル（ランガーら（R．Langer）、Id）、またはポリ-D-(-)-3-ヒ
ドロキシブチル酸（欧州特許第133,988号）が含まれる。徐放性CKβ-13ポリペプ
チド組成物はまた、リポソームにくるんだCKβ-13ポリペプチドが含まれる。CK
β-13を含むリポソームは、それ自体既知の方法によって調製される:DE第3,218,
121号；エプスタインら（Epstein）、Pro．Natl．Acad．Sci．(USA)82：3688〜3
692（1985）；ワンら（Hwang）、Pro．Natl．Acad．Sci．(USA)77：4030〜4034
（1980）欧州特許第52,322号；欧州特許第36,676号；欧州特許第88,046号；欧州
特許第143,939号；欧州特許第142,641号；日本特許出願第83-118008号；米国特
許第4,4
85,045号および第4,544,545号；ならびに欧州特許第102,324号。通常、リポソー
ムは小さい（約200〜800オングストローム）単層タイプであり、その中の脂質含
量は約30モル百分率コレステロール以上で、選択された比率は最適なCKβ-13ポ
リペプチド療法のために調節される。
非経口投与の場合、一つの態様において、CKβ-13ポリペプチドは一般に、所
望の程度の純度でそれを混合することによって、単位投与注射可能剤形（溶液、
懸濁液、または乳液）で、薬学的に許容される担体、すなわち用いられる用量お
よび濃度でレシピエントに対して毒性でなく、製剤の他の成分と融和しうる担体
と共に製剤化する。例えば、製剤は好ましくは、酸化剤およびポリペプチドにと
って有害であることが知られているその他の化合物を含まない。
一般に、製剤はCKβ-13ポリペプチドを、液体担体もしくは細粉固体担体また
はその双方と均一かつ密接に接触させることによって調製する。必要であれば、
産物を所望の製剤へと成型する。好ましくは担体は非経口担体であり、より好ま
しくはレシピエントの血液と等張である液体である。そのような担体溶媒の例に
は、水、生理食塩液、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれる。固定
油およびオレイン酸エチルのような非水性溶媒もまた、リポソームと共に本明細
書において有用である。
担体は等張性および科学的安定性を増強する物質のような少量の添加剤を含む
ことが適している。そのような材料は、用いる用量および濃度でレシピエントに
対して毒性を示さず、燐酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸およびその他の有
機酸、またはその塩のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子
量（約10残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド
；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニ
ルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン
酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコ
ース、マンノース（manose）、またはデキストリンのような単糖類、二糖類、お
よびその他の糖質；EDTAのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトール
のような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソル
ベート、ポロキサマー（poloxamer）、またはPEGのような非イオン性界面活性剤
が
含まれる。
CKβ-13ポリペプチドは典型的に、約0.1mｇ/ml〜100mｇ/mlの濃度で、好まし
くは1〜10mｇ/mlでpHは約３〜８でそのような溶媒に製剤化される。前記の特定
の添加剤、担体または安定化剤を用いた結果、CKβ-13ポリペプチド塩が形成さ
れることは理解されると思われる。
治療的投与に用いられるCKβ-13ポリペプチドは、無菌的でなければならない
。無菌性は、滅菌濾過メンブレン（例えば0.2ミクロンのメンブレン）に通して
濾過することによって容易に得られる。治療的CKβ-13ポリペプチド組成物は一
般に、無菌的な注入口を有する容器、例えば、静注溶液バッグ、または皮下注射
針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
CKβ-13ポリペプチドは通常、単位または多用量容器、例えば、密封アンプル
またはバイアルの中で、水溶液または溶解用凍結乾燥製剤として保存される。凍
結乾燥製剤の実例として、10mlバイアルに濾過滅菌１％（w/v）CKβ-13ポリペプ
チド水溶液５mlを満たし、得られた混合液を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌的
注射用水を用いて凍結乾燥したCKβ-13ポリペプチドを溶解することによって調
製する。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の
容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。そのような容器については、
製薬企業、医薬品または生物学的製品の使用または販売を規制する政府当局によ
って規定された書式で、ヒトへの投与に対して製造、使用、または販売の当局に
よる承認を記した説明書を含むことができる。さらに、本発明のポリペプチドは
、その他の治療用化合物と併用して用いてもよい。
アゴニストとアンタゴニスト−解析および分子
本発明はまた、受容体分子のようなCKβ-13結合分子との相互作用のような、C
Kβ-13の細胞に及ぼす作用を増強または阻害する化合物を特定するための化合物
のスクリーニング法を提供する。アゴニストは、CKβ-13の本来の生物機能を増
加させる化合物、またはCKβ-13と同様に機能する化合物であるのに対し、アン
タゴニストはそのような機能を減少または消失させる。
この態様のもう一つの局面において、本発明はCKβ-13ポリペプチドに特異的
に
結合する受容体蛋白質またはその他のリガンド結合蛋白質を同定する方法を提供
する。例えば、膜またはその組織標本のような細胞成分は、CKβ-13と結合する
分子を発現する細胞から調製してもよい。組織標本は標識CKβ-13と共にインキ
ュベートし、受容体またはその他の結合蛋白質に結合したCKβ-13複合体を単離
して当技術分野で定常的な方法に従って特徴分析を行った。または、CKβ-13ポ
リペプチドは、細胞から可溶化された結合分子をカラムに結合させ、その後溶出
して定常的な方法に従って特徴分析を行うために、固相支持体に結合してもよい
。
アゴニストまたはアンタゴニストに関する本発明の解析法において、膜または
その組織標本のような細胞成分は、CKβ-13によって制御されるシグナル伝達ま
たは制御経路の分子のような、CKβ-13と結合する分子を発現する細胞から調製
してもよい。組織標本を、CKβ-13アゴニストまたはアンタゴニストである可能
性がある候補分子の非存在下または存在下において、標識したCKβ-13と共にイ
ンキュベートする。候補分子の結合分子との結合能は標識リガンドの結合の減少
によって表される。無意味に結合する分子、すなわちCKβ-13結合分子の結合に
及ぼすCKβ-13の作用を誘導することなく結合する分子が、よいアンタゴニスト
である可能性が最も高い。結合が良好でCKβ-13と同じまたは密接に関連した作
用を誘発する分子はアゴニストである。
可能性があるアゴニストおよびアンタゴニストのCKβ-13様作用は、例えば、
候補分子と細胞または適当な細胞標本との相互作用後のセカンドメツセンジャー
システムの活性を測定し、その作用をCKβ-13またはCKβ-13と同じ作用を誘発す
る分子の作用と比較することによって測定してもよい。この点において有用と考
えられるセカンドメッセンジャーシステムには、AMPグアニル酸シクラーゼ、イ
オンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解セカンドメッセンジャーシス
テムが含まれるが、これらに限定されない。
CKβ-13アンタゴニストの解析に関するもう一つの例は、競合阻害解析にとっ
て適当な条件下で、膜結合型CKβ-13受容体分子または組換え型CKβ-13受容体分
子と、CKβ-13および可能性があるアンタゴニストとを結合させる競合解析であ
る。CKβ-13は、受容体分子に結合したCKβ-13分子の数が、可能性があるアンタ
ゴニストの有効性を正確に評価するために決定することができるように、放射活
性の
ような方法によって標識することができる。
考えられるアンタゴニストには、本発明のポリペプチドと結合し、それによっ
てその活性を阻害または無効にする様な、小さい有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドおよび抗体が含まれる。考えられるアンタゴニストはまた、CKβ-13誘発活
性を誘導させることなく、それによってCKβ-13が結合できないようにすること
によってCKβ-13の作用を防止する、受容体分子のような結合分子上の同じ部位
と結合する、小さい有機分子、ペプチド、密接に関連する蛋白質のようなポリペ
プチド、または抗体でありうる。
その他の考えられるアンタゴニストにはアンチセンス分子が含まれる。アンチ
センス技術は、アンチセンスDNAもしくはRNAを通じて、または三重ヘリックス形
成を通じて、遺伝子発現を調節するために用いることができる。アンチセンス技
術は例えば、オカノ（Okano）、J．Neurochem．56：560（1991）；「遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド（Oligodeoxynucleo
tides as Antisense Inhibitors of Gene Expression）」、CRC Press，Boca Ra
ton，FL（1988）において議論されている。三重ヘリックス形成は例えば、リー
ら（Lee）、Nucleic Acids Research 6：3073（1979）；クーネイら（Cooney）
、Science 241：456（1988）；およびダーバンら（Dervan）、Science 251：136
0（1991）において議論されている。方法は、相補的DNAまたはRNAに対するポリ
ヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドの5'コード部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNA
オリゴヌクレオチドをデザインするために用いてもよい。DNAオリゴヌクレオチ
ドは、それによってCKβ-13の転写および産生が防止されるような、転写に関係
する遺伝子の領域と相補的となるようデザインされる。アンチセンスRNAオリゴ
ヌクレオチドはインビボでmRNAとハイブリダイズし、mRNA分子のCKβ-13ポリペ
プチドへの翻訳を遮断する。上記のオリゴヌクレオチドはまた、インビボでCKβ
-13蛋白質の産生を阻害するようにアンチセンスRNAまたはDNAを発現してもよい
ように細胞に輸送することができる。
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記の薬学的に許容される担体
と共に組成物において用いてもよい。
アンタゴニストを使用して、特定の自己免疫疾患および慢性炎症性疾患、なら
びに感染性疾患において、例えばマクロファージおよびその前駆体、ならびに好
中球、好塩基球、Ｂリンパ球、およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活
性化Ｔ細胞およびCD8細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー細胞）の走
化性および活性化を阻害し得る。自己免疫疾患の例として、多発性硬化症、およ
びインシュリン依存性糖尿病が挙げられる。
またアンタゴニストは、単核食細胞の補充および活性化を妨げることにより、
珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症を含む感染性疾患を処置するために使用され
得る。それらはまた、好酸球の生成および遊走を阻害することによって、特発性
好酸球増多症症候群を処置するために使用され得る。内毒素性ショックもまた、
マクロファージの遊走およびそれらの本発明のヒトケモカインポリペプチドの産
生を阻害するアンタゴニストにより処置され得る。
アンタゴニストはまた、単球の動脈壁への浸潤を妨げることによって、アテロ
ーム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導性の肥満細胞および好塩基球の脱顆粒
およびヒスタミンの放出を阻害することにより、ヒスタミン媒介アレルギー反応
および免疫学的障害（後期アレルギー反応、慢性尋麻疹、およびアトピー性皮膚
炎を含む）を処置するために使用され得る。アレルギー性喘息、鼻炎、および湿
疹のようなIgE媒介アレルギー反応もまた、処置され得る。
このアンタゴニストはまた、単球の創傷領域への誘因を妨げることにより、慢
性および急性炎症を処置するために使用され得る。これらはまた、慢性および急
性炎症性肺疾患が肺における単核食細胞の滞留（sequestration）に関連してい
るため、正常な肺のマクロファージ集団を調節するために使用され得る。
アンタゴニストはまた、患者の関節における単球の滑液への誘因を妨げること
により、慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。単球の流入および活
性化は、退行性関節症および炎症性関節症の両方の病因において重要な役割を果
たしている。
アンタゴニストは、IL-1およびTNFに主に帰する有害カスケードを阻止するた
めに使用され得、それは他の炎症性サイトカインの生合成を阻止する。このよう
に
してアンタゴニストは、炎症を妨げるために使用され得る。このアンタゴニスト
はまた、ケモカインに誘導されるプロスタグランジン非依存性発熱を阻害するた
めに用いられ得る。
アンタゴニストはまた、例えば再生不良性貧血および骨髄形成異常症候群のよ
うな、骨髄不全の症例を処置するために使用され得る。
アンタゴニストはまた、肺における好酸球の蓄積を妨げることにより喘息およ
びアレルギーを処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、喘息の肺
の顕著な特徴である上皮下基底膜の線維症を処置するために使用され得る。
CKβ-13に対する抗体は、損傷後の肺への好中球の浸潤を防止することによっ
て例えばARDSを治療するためにCKβ-13に結合してその活性を阻害するために用
いてもよい。
上記のアンタゴニストの如何なるものも、例えば本明細書に記述のように、薬
学的に許容される担体と共に組成物において用いてもよい。
本発明の配列はまた、染色体の同定のために有用である。この配列は、個々の
ヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてこれとハイブリダイズ
され得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の
配列データ（反復多型）に基づく染色体マーキング試薬は、現在、染色***置を
マーキングするためにはほとんど利用されていない。本発明の染色体に対するDN
Aのマッピングは、これらの配列の疾患に関連する遺伝子への関連づけにおける
重要な第１段階である。
この点において特定の好ましい態様において、本明細書に開示のcDNAは、CKβ
-13蛋白質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために用いられる。これは、多
様な周知の技術および一般に市販されているライブラリを用いて達成することが
できる。次にゲノムDNAを、この目的のために周知の技法を用いてインサイチュ
ー染色体マッピングのために用いる。
また、いくつかの場合において、配列は、cDNA由来のPCRプライマー（好まし
くは15〜25塩基対）の調製により、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’
非翻訳領域のコンピューター分析は、ゲノムDNAにおいて１より多いエクソンに
及ばず、従って増幅工程を複雑にしているプライマーを迅速に選択する。次いで
、こ
れらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリ
ーニングのために使用される。cDNAクローンの***中期染色体の広がりに対する
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）が、一段階で正確な染色体
の位置づけを提供するために使用され得る。この技術は、50または60塩基対の短
いcDNAプローブを用いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら、
「ヒト染色体：基本的技術のマニュアル（Human Chromosomes：A Manual of Bas
ic Techniques）」（Pergamon Press，New York(1988)）を参照のこと。
一旦配列が正確な染色***置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的
位置は、遺伝的マップデータに相関され得る。このようなデータは、例えば、Jo
hns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンライン入手可能である
V.McKusick、「ヒトにおけるメンデル遺伝（Mendelian Inheritance in Man）」
に見出される。次いで、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との
関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
次に、疾患にかかった個体とかかっていない個体との間のcDNAまたはゲノム配
列における差異を決定する必要がある。変異が、疾患にかかった個体のいくつか
または全てで認められるが、どの正常な個体においても認められないならば、そ
の変異がその疾患の原因となると考えられる。
本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、さら
に容易に理解されると思われる。以下の実施例は、例示を目的とするものであり
、制限を意図するものではない。
実施例
実施例1(a)：大腸菌におけるCKβ-13の発現および精製
この実施例では細菌発現ベクターpQE60を細菌の発現に用いた（キアゲン・イ
ンク、9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）。pQE60は、アンピシリン抗
生物質耐性（「Ampr」）をコードし、細菌の複製起点（「ori」）、IPTG誘導可
能プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）、前記のキアゲン・インクが
販売しているニッケル・ニトリロトリ酢酸（「Ni-NTA」）親和性樹脂を用いたア
フィニテイ精製が可能となるヒスチジン残基をコードする６個のコドン、および
適した単一の制限酵素開裂部位を含む。これらのエレメントは、ポリペプチドを
コード
するDNA断片がそのポリペプチドのカルボキシ末端に６個のヒスチジン残基（す
なわち「６×Hisタグ」）が共有結合したポリペプチドを産生するような様式で
挿入されるように配置する。しかし、本実施例では、ポリペプチドコード配列は
６個のHisコドンが翻訳されないように挿入され、従って、６×Hisタグを有しな
いポリペプチドが産生されるように挿入される。
CKβ-13アミノ酸配列のGly-25で始まる成熟型を含むCKβ-13蛋白質の望ましい
部分をコードするDNA配列は、CKβ-13蛋白質の望ましい部分のアミノ末端配列お
よびcDNAコード配列の3'に存在する寄託された構築物の配列とアニーリングする
PCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託されたcDNAクローンから増幅
した。pQE60ベクターにおけるクローニングを容易にするため、制限部位を含む
さらなるヌクレオチドをそれぞれ、5'および3'配列に加えた。
Gly-25で始まるCKβ-13蛋白質の成熟型のクローニングに関しては、5'プライ
マーは、下線を引いたNcoI制限部位（太字）を含む配列5'AAACCATGGGTCCGTACGGT
GCAAACATGGAAGACAGCG3’(配列番号：４)を有する。両プライマーにおいて特定の
コドンの「ゆらぎ（wobble）」部位における特定のヌクレオチドは、大腸菌の選
択性に基づいて変化している。当業者は、当然のことながら、蛋白質コード配列
において5'プライマーが始まる時点が、成熟型より短いまたは長い完全な蛋白質
の望ましい部分を増幅するために変化しうることを認識していると思われる。3'
プライマーは、下線で示したHindIII制限部位を含む配列5'AAAAAGCTTCTGACCCTTC
CCTGGAAGGTA3'（配列番号：５）を有する。
増幅したCKβ-13DNA断片およびベクターpQE60を、NcoIおよびHindIIIで消化し
、次に消化したDNAを共にライゲーションした。制限pQE60ベクターへのCKβ-13D
NAの挿入は、IPTG誘導可能プロモーターから下流で、かつ開始AUGとインフレー
ムでその関連する停止コドンを含む、CKβ-13蛋白質コード領域で起こる。関連
する停止コドンは、挿入点の下流の６個のヒスチジンコドンの翻訳を防止する。
ライゲーション混合物を、サムブルックら（Sambrook）、「分子クローニング
：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、第二版、Co
ld Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor、ニューヨーク（198
9）に記述されているように標準的な技法を用いて、コンピテント大腸菌細胞に
形
質転換した。lacリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（「Kanr」）を付与
するプラスミドpREP4の多数のコピーを含む大腸菌株M15/rep4は、本明細書に記
述の説明的な実施例を実施する際に用いる。この株はCKβ-13蛋白質の発現に適
した多くの株の唯一つで、前記のキアゲン・インクから市販されている。形質転
換株は、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下におけるLBプレート上での増
殖能によって決定した。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、クローニン
グしたDNAの同一性を制限分析、PCRおよびDNAシークエンシングによって確認し
た。
望ましい構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）およびカナマ
イシン（25μg/ml）の双方を加えたLB培地の液体培地で一晩（「O/N」）増殖さ
せた。O/N培養液を約１：25〜１：250の希釈で用いて、より大きい培養物に接種
した。600nm（「OD600」）で吸光度が0.4〜0.6となるように、細胞を増殖させた
。次にイソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を最終濃度が１m
Mとなるように加えて、lacIリプレッサーを不活化することによって、lacリプレ
ッサー感受性プロモーターからの転写を誘導した。その後細胞をさらに３〜４時
間インキュベートした。次に細胞を遠心によって回収した。
CKβ-13ポリペプチドを精製するため、次に細胞を４℃で６Mグアニジン塩酸、
pH８で３〜４時間攪拌した。細胞の破片を遠心によって除去し、CKβ-13を含む
上清を、200mM塩化ナトリウムを加えた50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH６に対し
て透析した。または、蛋白質は、500mM NaCl、20％グリセロール、プロテアーゼ
阻害剤を含む25mMトリス／塩酸、pH7.4に対して透析することによってうまく再
生することができる。再生後、蛋白質をイオン交換、疎水性相互作用およびサイ
ズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。または、抗体カラム
のようなアフィニティクロマトグラフィー段階を用いて、純粋なCKβ-13蛋白質
を得ることができる。精製蛋白質は４℃で保存または-80℃で凍結する。
大腸菌において発現されたCKβ-13が封入体の形で存在する場合には、以下の
代用法を用いてこれを精製してもよい。特に明記していなければ、以下の段階は
全て４〜10℃で実施する。
大腸菌発酵の産生相の完了後、細胞培養を４〜10℃に冷却し、15,000rpm（ヘ
ラエウス・セパテック社）での連続遠心によって細胞を回収する。細胞ペースト
の単位重量あたりの蛋白質の予想される収率および必要とされる精製蛋白質量に
基づき、細胞ペーストの適当量を重量で100mMトリス、50mM EDTA、pH7.4を含む
緩衝液に懸濁する。細胞を高剪断ミキサーを用いて均一な懸濁液に分散させる。
次に細胞を、微量流動体化装置（マイクロフルディクス社、またはAPV Gaulin
Inc.）に4000〜6000psiで２回溶液を通過させることによって溶解した。次にホ
モジネートをNaCl溶液と混合して、最終濃度0.5M NaClとし、その後7000×gで15
分遠心する。得られたペレットを0.5M NaCl、100mMトリス、50mM EDTA、pH7.4を
用いて再度洗浄する。
得られた洗浄した封入体を1.5Mグアニジン塩酸（GuHCl）で２〜４時間可溶化
する。7000×gで15分遠心した後、ペレットを捨て、CKβ-13ポリペプチド含有上
清を４℃で一晩インキュベートし、さらにGuHCl抽出を行う。
超遠心（30,000×g）を行って不溶性粒子を除去した後、GuHCl抽出物と、50mM
ナトリウム、pH4.5、150mM NaCl、２mM EDTAを含む緩衝液20容量を速やかに混合
し、激しく攪拌することによってGuHCl可溶化蛋白質を再生する。再生した希釈
蛋白質溶液を、さらなる精製段階を行う前に４℃で12時間混合せずに保存する。
再生したCKβ-13ポリペプチド溶液を清澄させるため、40mM酢酸ナトリウム、p
H6.0で平衡にして適当な表面積を有する0.16μmメンブレンフィルター（例えば
、フィルトロン（Filtron））を備えた、予め調製した接線濾過装置を用いる。
濾過した試料を陽イオン交換樹脂（例えば、ポロスHS-50、Perseptive Biosyste
ms）に載せる。カラムを40mM酢酸ナトリウム、pH6.0で洗浄し、段階的に同じ緩
衝液中の250mM、500mM、1000mMおよび1500mM NaClで溶出する。溶出液の280nmで
の吸光度を連続的にモニターする。分画を回収してSDS-PAGEでさらに分析する。
次に、CKβ-13ポリペプチドを含む分画をプールして水４容量と混合する。次
に、希釈した試料を、予め調製した強陰イオン（ポロスHQ-50、パーセプティブ
・バイオシステムズ）および弱陰イオン（ポロスCM-20、パーセプティブ・バイ
オシステムズ）交換樹脂のタンデムカラムセットに載せる。カラムを40mM酢酸ナ
トリウ
ム、pH6.0で平衡にする。両カラムを40mM酢酸ナトリウム、pH6.0、200mM NaClで
洗浄する。次に、0.2M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.0から1.0M NaCl、50mM
酢酸ナトリウム、pH6.5までの10カラム容量直線勾配を用いて、CM-20カラムを溶
出する。溶出液のA280を常にモニターしながら分画を回収する。次に、CKβ-13
ポリペプチドを含む分画（例えば、16％SDS-PAGEによって決定）をプールする。
得られたCKβ-13ポリペプチドは、上記再生および精製段階後に95％以上の純
度を示す。精製蛋白質５μgを載せた場合、クーマシーブルー染色を施した16％S
DS-PAGEゲルからは主要な混入バンドが認められない。精製蛋白質また、エンド
トキシン／LPS混入についても試験し、典型的にLPS含量はLALアッセイによれば0
.1ng/ml末満である。
実施例２：バキュロウイルス発現系におけるCKβ-13蛋白質のクローニングおよ
び発現
本実施例では、サマーズら（Summers）、「バキュロウイルスベクターと昆虫
細胞培養法マニュアル（A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and In
sect Cell Culture Procedures）」、テキサス農業試験所公報第1555号（1987）
に記述の標準的な方法を用いて、プラスミドシャトルベクターpA2を用いて、そ
の天然に関連する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全な蛋白質をコード
するクローニングしたDNAを、成熟CKβ-13蛋白質を発現するバキュロウイルスに
挿入した。この発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa
californica）核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強いポリヘドリンプロモーター
を含み、その後にBamHI、XbaIおよびAsp718のような簡便な制限部位が続く。有
効なポリアデニル化を行うために、シミアンウイルス40（「SV40」）のポリアデ
ニル化部位を用いる。組換え型ウイルスを容易に選択するため、プラスミドは同
じ方向に、弱いショウジョウバエのプロモーターの調節下で大腸菌からのβガラ
クトシダーゼ遺伝子を含み、その後にポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグ
ナルを含む。挿入された遺伝子は、クローニングしたポリヌクレオチドを発現す
る生存ウイルスを産生するために、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介相同組換え
のためのウイルス配列をその両側に隣接させる。
当業者は容易に認識できるように、構築物が、シグナルペプチドおよびインフ
レームAUGを必要に応じて含む、転写、翻訳、分泌等の適切に位置するシグナル
を提供する限り、上記ベクターの場所にはpAc373、pVL941、およびpAcIM1のよう
なその他の多くのバキュロウイルスベクターを用いることができる。そのような
ベクターは、例えば、ルッコウら（Luckow）、Virology 170：31〜39（1989）に
記述されている。
配列番号：２に示すAUG開始コドンおよび天然に関連するリーダー配列を含む
寄託されたクローンにおいて、全長のCKβ-13蛋白質をコードするcDNA配列は、
遺伝子の5'および3'配列に相当するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅した。5'プライマーは、BamHI制限酵素部位（太字）、およびコザック（Koz
ak，M．）、J．Mol．Biol．196：947〜950（1987）に記述される真核細胞におけ
る翻訳開始のための効率的なシグナルを含む、配列5'AAAGGATCCGCCACCATGGCTCGC
CTACAGACT3'（配列番号：６）を有する。3'プライマーは、Asp718制限酵素部位
（太字）を含む配列5’AAAGGTACCTCATTGGCTCAGCTTATT 3’(配列番号：７)を有す
る。
増幅された断片は、市販のキット（「ジェネクリーン」、バイオ101インク、
ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて１％アガロースゲルから単離した。次に断
片をBamHIおよびAsp718で消化し、１％アガロースゲル上で再度精製する。
プラスミドは、制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、選択的に当業者に既知
の定常的な方法を用いて仔ウシ腸フォスファターゼを用いて脱燐酸化することが
できる。次に市販のキット（「ジェネクリーン」、バイオ101インク、ラホヤ、
カリフォルニア州）を用いてDNAを１％アガロースゲルから単離した。
断片および脱燐酸化プラスミドをT4 DNAリガーゼと共にライゲーションした。
大腸菌HB101またはXL-1 Blue細胞のような（ストラタジーン・クローニング・シ
ステムズ、ラホヤ、カリフォルニア州）その他の適した大腸菌宿主をライゲーシ
ョン混合物で形質転換して、培養プレート上で増殖させた。個々のクローンから
のDNAをBamHIおよびAsp718を用いて消化し、次にゲル電気泳動によって消化産物
を分析することによってヒトCKβ-13遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同
定した。クローニングした断片の配列をDNAシークエンシングによって確認した
。このプラスミドを本明細書においてpA2CKβ-13と呼ぶ。
５μgのプラスミドpA2CKβ-13を、リポフェクション法（Felgnerら、Proc．Na
tl．Acad．Sci．USA，84：7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販の線状化し
たバキュロウイルスDNA（「BaculoGold（登録商標）baculovirus DNA」，Pharmi
ngen，San Diego，CA）とともにコトランスフェクトした。
１μgのBaculoGold（登録商標）ウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpA2CKβ
-13を、50μlの血清非含有グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersbu
rg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、
10μlリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加、混合し、そして室温に
て15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血
清非含有グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆
虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下して加えた。次いでプレートを、27℃で５時間
インキュベートした。トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして
10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加した。27℃で４日間
、培養を続けた。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載により
プラークアッセイを行った。「BlueGal」（Life Technologies Inc.，Gaithersb
urg）を有するアガロースゲルを用いることにより、青く染まったプラークを形
成するgal発現クローンの容易な同定および単離が可能となった。（このタイプ
の「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Life Technologies Inc.、Gaithe
rsburgにより配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイ
ド、９〜10頁においても見出され得る）。適切なインキュベーション後、青く染
色されたプラークをマイクロピペッター（例えばエッペンドルフ）のチップで拾
った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含む微量
遠心用チューブに再懸濁し、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、
35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させた。４日後、これらの培養ディ
ッシユの上清を回収し、次いで４℃で保存した。この組換えウイルスをV-CKβ-1
3と呼ぶ。
CKβ-13遺伝子の発現を確かめるため、Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充し
たグレース培地中で増殖させた。細胞を、感染多重度（MOI）約２で、組換えバ
キュ
ロウイルスV-CKβ-13で感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチ
オニンおよびシステインを除いたSF900 Ii培地（Life Technologies Inc.，Rock
ville，MDにより入手可能）に置き換える。42時間後、５μCiの35S-メチオニン
および５μCiの35Sシステイン（Amershamより入手可能）を添加した。細胞をさ
らに16時間インキュベートし、その後遠心分離により採集した。上清のタンパク
質および細胞内タンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分
析した（放射性標識の場合）。
精製したタンパク質アミノ末端の、アミノ酸配列の微量配列決定により、上記
した成熟CKβ-13タンパク質、ならびにこうして、リーダーフォームおよび成熟
フオームのアミノ末端配列が決定された。
実施例３：COS細胞における組換えCKβ-13の発現
プラスミドCKβ-13HAの発現を、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen
）から誘導する：1)SV40複製起点、2)アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複製起
点、4)ポリリンカー領域、SV40イントロンそしてポリアデニル化部位が続くCMV
プロモーター。完全なCKβ-13前駆体、およびその３’末端にフレームをあわせ
て融合されたHAタグをコードするDNA断片を、ベクターのポリリンカー領域にク
ローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下で指示さ
れる。HAタグは、先に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質
由来のエピトープに対応する（I.Wilsonら、1984，Cell 37,767）。標的タンパ
ク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタン
パク質の容易な検出が可能になる。
プラスミド構築戦略を以下に記述する：
CKβ-13をコードするDNA配列（ATCC寄託番号第97113号）を、２つのプライマ
ーを用いたPCRにより構築する：５’プライマー
５’AAAAAGCTTAACATAGGCTCGCCTACAGACT３’（配列番号：８）は、HindIII部位、
それに続く開始コドンに対してマイナス３位から始まるCKβ-13コード配列の18
ヌクレオチドを含む；３’プライマー
５’CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTGGCTCAGCTTATTGAGAAT３’（配
列番号：９）は、XbaI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびCKβ-13コード配
列
の最後の21ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それ
ゆえ、PCR産物は、HindIII部位、フレームをあわせて融合したHAタグが続くCKβ
-13コード配列、HAタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびXbaI部位を含む
。PCR増幅DNA断片およびベクター（pcDNA3/Amp）を、HindIIIおよびXbaI制限酵
素により消化し、そしてライゲーションする。ライゲーション混合物を、E.coli
SURE株（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）に形質転換し、形質転
換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐性コロニーを選択する。プラ
スミドDNAを形質転換体より単離し、そして正しい断片の存在を制限分析で試験
する。組換えCKβ-13ポリペプチドの発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法に
より発現ベクターでトランスフェクトする（J.SaJnbrookら、「分子クローニン
グ：実験マニュアル（Molecular Clonjng；A Laboratory Manual」、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press，(1989)）。CKβ-13HAタンパク質の発現を、放射性
標識および免疫沈降法により検出する（E.Harlowら、「抗体：実験マニュアル（
Antibodies：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press
，(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、35S−システインで８時
間標識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液（
150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、0.5％ DOC、50mM Tris、pH7.5）で溶解す
る（Wilson,I.ら、同上37:767(1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、H
A特異的モノクローナル抗体により沈降させる。沈降したタンパク質をSDS-PAGE
によって分析する。
実施例４：遺伝子治療を介する発現
線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得られた組織を組織培養培
地中に入れ、そして小さい切片に分けた。組織の小さな塊を、組織培養フラスコ
の湿った表面上に置き、各フラスコ中に約10切片を入れる。フラスコを上下に回
転させ、しっかりと密閉し、室温に一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを
逆転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定したまま維持し、そして新鮮な培
地、例えば、10％ FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むハムF12
培地を添加する。次いで、これを37℃で約１週間インキュベートする。このとき
、新鮮な培地を添加し、そしてその後数日ごとに交換する。さらに２週間の培養
後
、線維芽細胞の単層が生じる。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きな
フラスコにスケール（scale）する。
モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するpMV-7（Kirschmeier,P
.T.ら、DNA，７：219-25(1988)）をEcoRIおよびHindIIIを用いて消化し、続いて
仔ウシ腸アルカリフォスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲ
ル上で分離し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ５’および３’末端配列
に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、EcoRI部位を含
み、そして３’プライマーは、HindIII部位をさらに含む。等量のモロニーマウ
ス肉腫ウイルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたEcoRIおよびHindIII断片を、T4
DNAリガーゼの存在下でともに加える。得られた混合物を、２つの断片のライゲ
ーションに適切な条件下に維持する。ライゲーション混合物を使用して、細菌HB
101を形質転換し、次いで、これを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子
を有することを確認するために、カナマイシン含有寒天プレート上に播種する。
両栄養性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清（CS）、
ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM
）における組織培養中で、集密的密度に増殖させる。次いで、遺伝子を含むMSV
ベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する
。
この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を包含する感染性ウイルス粒子を産生
する（この時点でパッケージング細胞は、プロデユーサー細胞と呼ばれる）。
新鮮な培地を形質導入プロデューサー細胞に添加し、その後、集密したプロデ
ューサー細胞の10cmプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む消
費された培地を、ミリポア（millipore）フィルターで濾過し、剥離したプロデ
ューサー細胞を除去し、そして次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる
。培地を、線維芽細胞の半集密的プレートから除去し、そして迅速にプロデュー
サー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き
換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そし
て選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー、例えばneo、ま
たはhisを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。
次いで、操作された線維芽細胞は、単独、あるいはサイトデックス３マイクロ
キャリアービーズ上で集密的に増殖させた後のいずれかで、宿主に注入される。
その後、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生するようになる。
実施例５：活性化T-リンパ球に及ぼすCKβ-13の化学走化性作用
末梢血単核球をドナーのロイコパック（赤十字社）から、リンパ球分離培地（
LSM；密度1.077g/ml；オルガノンテクニカ社）上で遠心し、界面の帯を回収する
ことによって精製した。T細胞に富むカラム（R&Dシステムズ）を用いてT-リンパ
球をPBMCから精製した。T-リンパ球の活性化に関しては、細胞を、化学走化性ア
ッセイの前にIL-2（10U/ml）の存在下で16時間CD3受容体とクロスリンクさせる
ことによって剌激した。アッセイに用いる細胞をHBSS/0.1％BSAで３回洗浄し、
標識のために＠２×106/mlで再懸濁した。カルセイン-AM（モレキュラー・プロ
ーブ社）を最終濃度１mMとなるように加え、細胞を37℃で30分インキュベートし
た。このインキュベーションの後、細胞をHBSS/0.1％BSAで３回洗浄した。標識
した細胞を４〜８×106個/mlで再懸濁し、25ml（１〜２×105細胞）を、プレー
トの下の化学走化性剤と細胞懸濁液とを仕切るポリカーボネートフィルター（孔
サイズ３〜５mm；PVP不含；NeuroProbe Inc.）の上部に加えた。細胞を45〜90分
遊走させ、遊走細胞数（フィルターに接着した細胞ならびに底のプレートに存在
する細胞の数）を、サイトフルオ（Cytofluor）II蛍光プレートリーダー（パー
セプティブ・バイオシステムズ社）を用いて定量した。
異なるドナー３人から得た活性化T-リンパ球を上記の化学走化性解析に用いた
。図４では、MCP-1（○）およびCkBeta-13(▲）のデータを、化学走化性指数（
ケモカインの存在下で遊走した細胞数と緩衝液対照の存在下で遊走した細胞数の
比）として表記する。
本発明は、前記の説明および実施例に特に記載されている方法以外の方法で実
践できることは明らかであろう。上記の開示を鑑みて、本発明の多くの改変およ
び変更が可能であり、したがって、それらは添付の請求の範囲内に含まれる。
本明細書において引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌の記事、実験
マニュアル、本、またはその他の文書を含む）に関する全ての開示は、本明細書
に引用として組み入れられる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21
5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 45/00
// Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 7/00
45/00 17/02
Ａ６１Ｐ 7/00 17/06
17/02 33/00
17/06 35/00
33/00 35/02
35/00 37/04
35/02 37/06
37/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
37/06 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ
，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，
ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 リ ハオドン
アメリカ合衆国 メリーランド州 ゲイザ
ーズバーグ リュトレッジ ドライブ
11033
(72)発明者 セイベル ジョージ
アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 セン
ト デイビッズ コーンウォール サーク
ル 11