JP2001505995A - 肝細胞成長因子アンタゴニスト - Google Patents

肝細胞成長因子アンタゴニスト

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Abstract

(57)【要約】 慢性腎疾患を有するヒトを治療する方法であって、該ヒトに肝細胞成長因子アンタゴニストを投与することを含む方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 肝細胞成長因子アンタゴニスト 発明の分野 本発明の分野は、慢性腎疾患の治療である。 発明の背景 肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、特異的プロテアーゼによってタンパク質分解処 理されて、成熟ＨＧＦを形成する７２８個のアミノ酸のプレプロ前駆体タンパク 質由来のヘテロ二量体分子である（Miyazawaら、1993，J．Biol．Chem．268:100 24-1028)。 ＨＧＦは、チロシンキナーゼ受容体ｃ−ｍｅｔによって細胞に結合する。ＨＧ Ｆのｃ−ｍｅｔへの結合は、腎上皮細胞の成長が刺激され；細胞の運動性が高め られ；腎臓の細管形成が誘導されるという効果を有する(Santosら、1993，Dev． Biol．159:535-548；Cantleyら、1994，Am．J．Physiol．２６７：F27l-F280)。 従って、ＨＧＦは、各々、マイトジェン、モトゲン（motogen）およびモルホゲ ンとして特徴付けられ、腎臓発達において役割を果たすと考えられる。 さらに、ＨＧＦは、腎摘出または虚血後の腎臓におけるＨＧＦおよびその受容 体ｃ−ｍｅｔレベルの増加によってもたらされるような損傷後の腎臓リモデリン グに関係する(Joannidisら、1994，Am．J．Physiol．267:F231-F236)。さらに、 ＨＧＦは、塩化水銀攻撃または虚血後の腎機能における改善をもたらすことが観 察された(Kawaidaら、1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:4357-4361；Mille rら、1994，Am．J．Physiol．266:Fl29-F134)。糸球体肥大は、多くの慢性腎疾 患において腎臓リモデリングの間に起こる。該事象は、糸球体基底膜膨張、糸球 体間質および上皮細胞の増殖、ならびにコラーゲンおよびフィブロネクチンの蓄 積と関連する。糸球体細胞該マトリックス膨張におけるＨＧＦの役割は、知られ ていない。 慢性腎機能不全は、代償的な成長およびリモデリングを伴う機能的腎臓量の進 行性の喪失である。慢性腎機能不全の間に起こる分子および細胞の事象は、成長 因子の放出、糸球体間質細胞の増殖および細胞外マトリックスの膨張を包含する (Klahrら、1988，New Engl．J．Med．318:1657-1666；Strikerら、1989，In:Kla hr,(Ed.)Seminars in Nephrology，pp．318，Philadelphia，W.B．Saunders)；E biharaら、1993，J．Am．Soc．Nephrol．3:1387-1397)。慢性腎機能不全の間に 変化する細胞外マトリックスの構成要素は、コラーゲン、フィブロネクチンおよ びラミニンを包含する(Ebiharaら、前掲；Tarsioら、1988，Diabetes 37:532-53 9；Yoshiokaら、1989，Kidney Int．35:1203-1211)。慢性腎機能不全が確立され る場合、腎臓切除モデルにおいて、フィブロネクチンおよびコラーゲンａ１免疫 細胞化学染色は、腎臓量の５／６の腎摘出後２および６週で、糸球体の細胞性増 加領域において向上する(Foelgeら、1992，Lab．Invest．66:485-497)。 いくつかのタンパク質因子は、慢性腎機能不全の間の糸球体間質細胞の有糸分 裂誘発または細胞外マトリックス生産の刺激に関係している。これらは、トロン ビン(Xuら、1995，Am．J．Pathol．146:101-110;Sraerら、1993，Ren．Fail．15 :343-348；Albrightsonら、1992，J．Pharmacol．Exp．Ther．2563:404-412)、 上皮細胞成長因子(Byynyら、1972，Endocrinology 90:1261-1266;Ki1lionら、19 93，J．Urol．150:1551-1556)、インスリン様成長因子１(Stilesら、1985，Endo crinology 117:2397-2401;Faginら、1987，Endocrinology 120:718-724)、およ び形質転換成長因子ｂ１（Coimbraら、1991，Am．J．Pathol．138:223-234;Okud aら、1990，J．Clin．Invest．86:453-462）を包含する。 腎機能不全および死または透析への依存を導く疾患を減少または除去するため に役立つ慢性腎疾患の治療のための組成物に対する要望が残存する。 発明の概要 本発明は、肝細胞成長因子アンタゴニストをヒトに投与することからなる慢性 腎疾患を有するヒトの治療法に関する。図面の簡単な説明 図１は、マイクロ生理機能測定法によって測定した形質転換マウス糸球体間質 細胞（ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞）(パネルＡ−Ｃ)、または正常なヒト糸球体間質細 胞（パネルＤ）の細胞外酸性化率を示す一連のグラフである。パネルＡ：ＭＭＣ −ＳＶ４０細胞を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または０．５％胎児ウ シ血清（ＦＢＳ）の存在下または不存在下、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１０ 分間処理した。パネルＢ：ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞をＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ） で２、５、１０および１５分間処理した。パネルＣ：ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞を４ 種類の濃度のＨＧＦで処理した。パネルＤ：正常なヒト糸球体間質細胞を１００ ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで処理した；２つの形跡を示す。 図２は、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＭＭＣ−ＳＶ４０細胞の細胞外 酸性化率を示すグラフである。細胞を対照培地または異なる濃度のBirchallら、 1994，J．Pharmacol．Exp．Ther．268:922-929によって記載されたプロテインキ ンアーゼ阻害剤ＲＯ−３２−０４３２を含有する培地で潅流した。 図３は、異なる濃度のＨＧＦで２４時間処理した正常なヒト糸球体間質細胞( ＨＭＣ)、ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞またはコラーゲンａ１（ＩＶ）プロモーターに よって制御されたルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクトされ たマウス糸球体間質細胞（ＭＭＣ−ＣＯＬ細胞）のトリチウム化チミジン取り込 みを示すグラフである。 図４は、異なる濃度のＨＧＦに対する応答において、ＭＭＣ−ＣＯＬ細胞にお けるコラーゲンａ１（ＩＶ）プロモーター活性を示すグラフである。データは、 ４回の平均±ＳＤである。 図５は、ビヒクルまたはＨＧＦのいずれかの注入後２１日目に測定した脂肪な しおよび肥満（糖尿病）マウスにおけるクレアチニンクリアランスを示すグラフ である。ＨＧＦは、肥満（糖尿病）マウスにおいてクレアチニンレベルを有意に 減少させた(*＜０．０５；ｎ＝５−６)。ＬＶ−脂肪なしビヒクル；ＬＨ−脂肪 なしＨＧＦ；ＯＶ−肥満ビヒクル；ＯＨ−肥満ＨＧＦ処理マウス。発明の詳細な記載 本発明によると、ＨＧＦの長期間の投与の結果、慢性腎疾患を生じることが見 出された。従って、ＨＧＦは急性腎疾患の治療に有用であり得るが、該化合物を 噛乳動物に長期間投与する場合、腎機能が衰える。また、ＨＧＦで細胞を処理す ると、フィブロネクチンｍＲＮＡ、ならびに糸球体間質および上皮細胞における 転写の増加を生じることが見出された。従って、本発明は、フィブロネクチンお よびコラーゲン合成を活性化し、それにより、糸球体硬化症を引き起こすことに よって、ＨＧＦが腎疾患に部分的に寄与するという発見に基づく。 本発明は、浦乳動物にＨＧＦのアンタゴニストを投与することからなる哺乳動 物における慢性腎疾患の治療法に関する。 本明細書中で使用される「慢性腎疾患」なる語によって、糸球体ろ過率によっ て測定した腎機能の進行性の喪失を意味する。 ＨＧＦのアンタゴニストは、限定はされないが、小型非−ペプチド分子、ＨＧ Ｆの特異的部分を含んでなるペプチド、抗−ＨＧＦ活性を有するペプチド部分(p eptidometic)、ＨＧＦに対して向けられた抗体、ＨＧＦをコードする核酸の全て または一部に相補的な配列を有する核酸およびＨＧＦ−特異的プロテアーゼを阻 害する小型化学化合物を包含する。 本明細書で使用される「ＨＧＦアンタゴニスト活性」なる語によって、例えば 、本明細書に記載されるアッセイのいずれか１つまたはそれ以上において測定さ れるようなＨＧＦの正常な活性を阻害する化合物を意味する。例として、マウス 糸球体間質細胞のＨＧＦでの処理は、これらの細胞の酸性化率を増加させる。従 って、ＨＧＦアンタゴニスト活性を有する化合物は、マウス糸球体間質細胞にお けるＨＧＦに誘導された増加を阻害する化合物として定義付けられる。 ＨＧＦのアンタゴニストを同定するために、試験化合物をＨＧＦアンタゴニス ト活性に関して、本明細書の実施例の部分に記載される１以上のアッセイにおい て、またはＨＧＦ機能の測定のための他のアッセイにおいて評価した。好ましく は、最初、イン・ビトロ試験を用いて、ＨＧＦアンタゴニスト活性を有する化合 物を同定する。かかるイン・ビトロ試験は、限定はされないが、ＨＧＦに対して 応答することが知られている細胞の細胞膜へのＨＧＦ結合、糸球体間質細胞のＨ ＧＦに誘導された酸性化率に対する試験化合物の影響を評価する試験、およびＨ ＧＦに誘導された細胞外マトリックス遺伝子発現に対する試験化合物の影響を評 価する試験を包含する。 試験化合物のＨＧＦ結合に対する効果を評価するために、[125Ｉ]−標識ＨＧ Ｆを、試験化合物と共にまたは無しで、シンチレーションビーズに結合したＡ４ ９８細胞から由来の細胞膜と一緒にインキュベーションする。該化合物がＨＧＦ の膜への結合を阻害するならば、[125Ｉ]−標識ＨＧＦはシンチレーションビー ズの付近にはなく、シグナルの減少が得られるであろう。以下に使用する第２の アッセイは、この化合物がアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決 定するものである。 試験化合物の細胞酸性化率に対する効果を評価するために、メサンギウム細胞 を、試験化合物と共にまたは無しで、ＨＧＦの存在下または不在下でインキュベ ーションする。細胞の酸性化率を本明細書に記載するようにマイクロ生理機能測 定法（microphysiometry）で測定し、試験化合物のＨＧＦ−誘発細胞酸性化に対 する効果を決定する。ＨＧＦ単独で処理した細胞の酸性化率と比較して、ＨＧＦ および試験化合物で処理した細胞の酸性化速度が減少することは、試験化合物が ＨＧＦアンタゴニスト活性を有することを意味する。 試験化合物の細胞外マトリックス遺伝子発現に対する効果を評価するために、 本明細書中、実験例に記載されている条件下、試験化合物と共にまたは無しで、 ＨＧＦの存在下または不在下で細胞をインキュベーションする。細胞外マトリッ クス遺伝子（例えば、コラゲナール（ＩＶ）およびフィブロネクチン）と関連す るｍＲＮＡの発現を測定し、種々の細胞との間で比較する。ＨＧＦ単独で処理し た細胞の細胞外マトリックスｍＲＮＡ発現と比較して、ＨＧＦおよび試験化合物 で処理した細胞の細胞外マトリックスｍＲＮＡ発現が減少することは、さらに、 試験化合物がＨＧＦアンタゴニスト活性を有することを意味する。 試験化合物をまた、インビボ検定にてＨＧＦアンタゴニスト活性について試験 してもよい。実験例に示されるデータから明らかなように、マウスのＨＧＦでの 長期間処理は腎不全を誘発する。このように、試験化合物のＨＧＦアンタゴニス ト活性を評価する別の具体的方法は、少なくとも２１日の期間にわたって、ＨＧ Ｆを単独で、試験化合物を添加したＨＧＦをマウスに投与することからなる。さ らなる対照として、適当なプラヤボ化合物を投与したマウスが挙げられる。腎機 能の基準として、各セットのマウスにてクレアチンクリアランスを評価する。Ｈ ＧＦを単独で投与したマウスのクレアチンクリアランスと比較して、ＨＧＦを試 験化合物と一緒に投与したマウスのクレアチンクリアランスが増加することは、 試験化合物がさらにＨＧＦアンタゴニスト活性を有することを意味する。 ＨＧＦの特異的な部分を有するペプチドを有してなるＨＧＦアンタゴニストは 、限定されるものではないが、ＨＧＦのＮ−末端付近に第１のクリンクル(krink le)領域を含むものを包含する。そのようなペプチドの一例が、末端切断された ＨＧＦペプチドＮＫ２である(Chanら、１９９１、Science２５４：１３８２−１ ３８５)。 実質的に純粋なＨＧＦ部を有してなるペプチドの調製物を得るために、ＨＧＦ の所望の部分をコードするＨＧＦＤＮＡをクローンし、発現することにより該ペ プチドを生成することができる。ＨＧＦＤＮＡおよびアミノ酸配列が、Miyazawa ら、１９９１、Eur.J.Biochem．１９７：１５−２２（配列番号１および２）に 記載されている。ＨＧＦの所望の部分をコードする単離されたＤＮＡを発現ベク ター中にクローンし、それからタンパク質を発現させる。ペプチドのクローン化 および発現の操作は当該分野にて周知であり、例えば、Sambrookら（１９８９、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York）に 記載されている。そうして発現したペプチドを当該分野にて周知の一般的ペプチ ド精製手段を用いて得ることができる。 本明細書で用いる場合、「実質的に純粋な」なる語は、天然に化合物を伴う成 分から単離されるもの、例えば、タンパク質またはポリペプチドをいう。典型的 には、試料中の物質全体の少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０ ％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、 さら に好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ま しくは少なくとも９８％が目的とする化合物である場合は、化合物は、実質的に 純粋である。純度は、例えば、ポリペプチドの場合には、カラムクロマトグラフ ィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により、いずれか適当な方法で測定する ことができる。化合物、例えば、タンパク質は、本質的に天然に結合した成分が ない場合またはその天然状態でその物を含む天然の汚染物を分離した場合も、実 質的に精製されている。 本発明はまた、本発明の方法に従って得られるペプチドのアナログを包含する 。アナログは、保存アミノ酸配列の違いで、または配列に影響を及ぼさない修飾 で、あるいはその両方で天然に存在するペプチドと区別することができる。 例えば、ペプチドの一次配列を変えるが、通常は、その機能を変えない保存ア ミノ酸変形を行ってもよい。保存アミノ酸配列は、典型的には、以下の群の置換 を包含する： グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、トレオニン； リジン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン。 修飾（通常、一次配列を変形しない）は、インビボ、またはインビトロにおけ るペプチドの化学的誘導化、例えば、アセチル化、またはカルボキシ化を包含す る。さらには、グリコシル化の修飾、例えば、ペプチドの合成の間にそのグリコ シル化のパターンを修飾し、プロセシングするか、またはさらなるプロセシング 工程にて、例えば、ペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば、哺乳 動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素に曝すことによりなされる変形も包 含される。リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまた はホスホトレオニンを有する配列も包含される。 さらに、そのタンパク質分解特性に対する耐性を改良するために、または溶解 性特性を最適化するために、通常の生物学的技法を用いて修飾されたペプチドも 包含される。かかるペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の 残基、例えば、Ｄ−アミノ酸、あるいは天然に存在しない合成アミノ酸を含むも のを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に挙げられる例示としての生成物 に限定されない。 かくして、本発明はまたＨＧＦアンタゴニスト活性を有するＨＧＦの活性フラ グメントに関する。本明細書に記載されるように、特定のポリペプチドがＨＧＦ の作用を阻害する場合、そのポリペプチドはＨＧＦアンタゴニスト活性を有する と考えられる。 本明細書で用いる場合、ＨＧＦペプチドに適用される「フラグメント」なる語 は、その長さが、一般には少なくとも約１０個の連続アミノ酸、典型的には少な くとも約２０個の連続アミノ酸、さらに典型的には少なくとも約５０個の連続ア ミノ酸、通常、少なくとも約７８個の連続アミノ酸のものをいう。 ＨＧＦに相補的な核酸配列は、Nakamuraら（前掲）に記載のＨＧＦの配列を用 いて得ることができる。現在、アンチセンスオリゴヌクレオチドの哺乳動物への 投与は当該分野において一般的なものであり、本明細書に記載のいずれの投与方 法を用いて行うこともできる。ＨＧＦのヌクレオチド７８−９５０（配列番号１ ）またはその一部に相補的な核酸は、ＲＮＡがアンチセンス配向（すなわち、相 補的に）にてそこからＨＧＦ ｍＲＮＡに発現するように、ＨＧＦＤＮＡまたは その一部を発現ベクターにクローンすることで得ることができる。 本明細書で用いる場合、「単離されたＤＮＡ」は、天然に存在する状態にてそ の側面にある配列から精製されているＤＮＡ配列、セグメントまたはフラグメン ト、例えば、通常、そのフラグメントに隣接する配列、例えば天然に存在するゲ ノムにてフラグメントに隣接する配列から分離したＤＮＡフラグメントをいう。 該用語はまた、天然状態でそのＤＮＡを伴う他の成分、例えば、細胞中にそれを 伴うＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されたＤＮＡに用いる。 本明細書にて用いる場合、「相補的」なる語は、２つの核酸、例えば、２つの Ｄ ＮＡまたはＲＮＡ分子の間のサブユニット配列相補性をいう。両方の分子のヌク レオチド位置が相互に塩基対を形成することのできるヌクレオチドで占められて いる場合、その時、その核酸は該位置で相互に相補的であると考えられる。すな わち、各々の分子の対応する位置の実質的な数（少なくとも５０％）が、相互に 正常な塩基対（例えば、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）を形成する場合、 ２つの核酸は相互に相補的である。 本発明は、ＨＧＦ ＤＮＡまたはその一部と実質的に相同であるＤＮＡを含む と解されるべきであり、該ＤＮＡは、ＨＧＦ相補核酸の産生、または、ＨＧＦペ プチドの産生に有用である。好ましくは、実質的に相同であるＤＮＡは、本発明 の方法を用いて得られたＤＮＡと約５０％相同であり、好ましくは、約７０％相 同であり、より好ましくは、約８０％相同であり、最も好ましくは、約９０％相 同である。 本明細書で用いる場合、「相同」とは、２つの高分子の間、例えば、２つのＤ ＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子の間のサブユニット配列 類似性を表す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同一の単量体サブ ユニットにより占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子がアデニンにより占 められる場合、それらは、その位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、 適合または相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの化合物配列におけ る位置の半分（例えば、サブユニット１０個の長さのポリマーにおける５つの位 置）が相同である場合、２つの配列は、５０％相同であり、位置の９０％、例え ば、１０個のうち９個が適合または相同である場合、２つの配列は、９０％相同 性を共有する。例えば、ＤＮＡ配列3'ATTGCC5'と3'TATGCG5'とは、５０％相同性 を共有する。 抗ＨＧＦ抗体は、本明細書で同定したＨＧＦペプチドで哺乳動物を免疫化する ことにより容易に得られる。公知のペプチドに対する抗体（モノクローナル抗体 またはポリクローナル抗体のいずれか）を得るためのプロトコールは、Harlow e t al．（1988，In:Antibodies，A Labpratory Manual，Cold Spring Harbor，NY ）に記載されており、該プロトコールは、当業者が容易に行うことができる。Ｈ Ｇ Ｆに対するポリクローナル抗体は、マウスまたはウサギなどのいずれの適当な哺 乳動物においても生じる。モノクローナル抗ＨＧＦ抗体は、ＨＧＦペプチドによ るマウスの免疫化、次いで、抗ＨＧＦ抗体分泌能を有するハイブリドーマ細胞の 産生により得られる。バクテリオファージにより発現される抗体などのモノクロ ーナル抗体を産生する他の手段は、現在、当該技術分野でよく知られており、例 えば、Marks et al．(1991，J．Mol．Biol．222:581-597)、Barbas（1995，Natu re Medicine 1:837-839)、de Kruif et al．(1995，J．Mol．Biol．248:97-105) およびSternberg et al．(1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:1609-1613)に 記載されている。 ＨＧＦ−アンタゴニスト様活性を有するペプチドメティク（peptidometic）も また、本発明に従って設計され使用される。ペプチドメティクの投与を記載して いるさらなる情報は、PCT出願PCT/US93/01201および米国特許第5,334,702号にお いて与えられる(引用して本明細書の記載とする)。これらの２つの文献のいずれ かに記載されている技術のいずれかをペプチドメティクの投与のために本発明に おいて用いてもよい。 ＨＧＦアンタゴニストとしては、また、ペプチドまたは核酸分子ではない、本 明細書で定義したＨＧＦアンタゴニスト活性を有する小分子が挙げられる。 本発明の方法において有用なＨＧＦアンタゴニストの例としては、限定されな いが、Faletto et al．(PCT出願WO94/06909)、Roosetal．(PCT出願WO94/06456) 、日本特許出願公開5-208998号、および、Aaronsonetal．(PCT出願WO92/05184) に記載されているものが挙げられる。 本発明の方法を用いて治療可能な腎臓病としては、限定されないが、多嚢胞病 、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、高血圧誘発性腎症、副腎腫などが挙 げられる。 ＨＧＦのアンタゴニストの投与を含む慢性腎症を有する哺乳動物の治療用プロ トコールは、当業者に明らかであり、疾患のタイプならびに哺乳動物のタイプお よび年齢により変化する。意図される治療計画としては、単回投与または１時間 に１回、日に１回、週１回、月１回、または、年１回投与される投薬が挙げられ る。投薬は、体重１kg当たりアンタゴニスト１−１０００mgで変化してもよく、 化合物のデリバリーに適している形態である。投与の経路は、また、治療される べき障害により変化する。 本発明は、慢性腎症を軽減または除去するためのヒトに対するＨＧＦアンタゴ ニストの投与を意図する。ヒトへのＨＧＦの投与について以下に記載するプロト コールは、ヒトにＨＧＦを投与する方法の例として挙げられる。このプロトコー ルは、用いうる唯一のプロトコールであると解されるべきではなく、むしろ、単 にその一例として解されるべきである。他のプロトコールは、本発明を所有して いる場合に当業者に明らかになるであろう。実質的には、ヒトへの投与のため、 ＨＧＦアンタゴニストは、生理食塩水約１mlに溶解され、体重１kg当たり１−１ ０００mgの用量は、１日１回〜数回、経口または静脈内投与される。腎機能を、 投与期間じゅうモニターする。 ＨＧＦのアンタゴニストは、生理食塩水、塩溶液またはかかる投与において当 者に明らかな他の製剤などの医薬上許容される担体中で懸濁または溶解させるこ とにより投与のために調製される。本発明の組成物は、噛乳動物に、生分解性生 適合性ポリマーを用いる持続放出型製剤で、または、ミセル、ゲルおよびリポソ ームを用いるオンーサイト・デリバリーにより、慣用的な方法の１つで（例えば 、経口的、非経口的、経皮的または経粘膜的に）投与されるか、または、直腸投 与（例えば、坐剤または浣腸による）または鼻投与（例えば、鼻スプレーによる ）される。かくして、ＨＧＦアンタゴニストは、その効果を及ぼす場合にそれが 結局は哺乳動物における標的エリア、すなわち、腎臓に達するために、いずれか の経路により哺乳動物に投与される。適切な医薬上許容される担体は、当業者に 明らかであり、投与経路に左右される。 ＨＧＦアンタゴニスト活性を有する化合物としては、また、細胞の特異的な型 を標的とするように製剤化される化合物が挙げられる。例えば、それらが細胞上 の特異的な受容体に指向されるように化合物を被包化または製剤化することが当 該技術分野で知られている。かかる製剤としては、抗体標識製剤、受容体リガン ド結合製剤などが挙げられる。 本発明は、さらに、以下の実施例の記載により詳述される。これらの実施例は 、単に説明のためだけであり、特記しない限り、限定するものではない。かくし て、本発明は、如何なる場合も以下の実施例に限定されると解されるべきではな く、むしろ、本明細書に記載した教示の結果として明らかになる全ての変更を含 むと解されるべきである。 本明細書に記載のデータによるとＨＧＦでのイン・ビトロでの細胞の処置が慢 性腎症に関係する化合物の産生における合成を生じるので、本明細書に記載の実 施例は、ＨＧＦのアンタゴニストが慢性腎症の治療に有用であることを確立する 方法および結果を提供している。同様に、ＨＧＦでのイン・ビボでの動物の長期 治療は、腎機能の低下を生じる。 実施例 細胞培養 ８〜１０週齢のＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２B）マウスの腎臓から得られた糸球体から マウス・メサンギウム細胞培養物を確立させた(Wolfetal.，1992，Am．J．Pathol ．140:95-107)。２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１８０mg／dlグルコースを含有し ており、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／mlペニシリン／ストレプマイシンで補足 されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ2中、３７℃で 細胞を増殖させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２０ｍＭ ＥＤ ＴＡで補足された０.０５％トリプシンと一緒にインキュベートすることにより 、細胞を継代培養した。 永久細胞系を確立するために非キャプシド形成ＳＶ４０ウイルスで形質転換さ れたマウス・メサンギウム細胞（Wolfetal.，上掲）をＭＭＣ−ＳＶ４０細胞と 称する。これらの細胞は、分化メサンギウム細胞の多くの特徴を示す(Wo1fetal. ，上掲)。安定なトランスフェクションは、ネズミＣＯＬ４Ａ１遺伝子の５’フ ランキングおよび第１イントロン領域からなる「ミニ遺伝子」により駆動される ルシフェラーゼを発現するリポーター構築物ＨＢ３５を用いてＭＭＣ−ＳＶ４０ 細胞に対して行われた(Fumo et al.，1994，Am．J．Physiol．267:F632-F638)。 安定な形質転換体をＭＭＣ−ＣＯＬ細胞と称する。これらの細胞は、ＭＭＣ−Ｓ Ｖ４ ０細胞と同様の上昇したグルコース濃度に応答する増殖およびタンパク質合成の パターンを示した(Fumoetal.，上掲)。 凍結保存したヒト・メサンギウム細胞（継代３）を、クロネティクス・コーポ レーション（Clonetics Corp.）(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入し、 ５％ＦＢＳ、５０mg／mlゲンタマイシン（Gentamicin）および５０ng／mlアンホ テリシン（Amphotericin）−Ｂで補足したクロネティクス・メサンギウム細胞増 殖培地（Clonetics Mesangial Cell Growth Medium）(MsGM)中で増殖させた。ク ロネティクス・コーポレーションにより提供された方法に従ってヒト・メサンギ ウム細胞を増殖させ、継代６−８の間、これらの実験で用いた。 マイクロ生理機能測定法 細胞センサー（cytosensor）マイクロ生理機能測定器は、細胞が固定されてい る微容量フローチャンバーの一部であるｐＨ感受性シリコンセンサーに基づくも のである(McConnel et al.，1992，Science 257:1906-1912)。マウス・メサンギ ウム細胞（mesangial cell）を１５０ｃｍ2フラスコからトリプシンを用いて、 ３ｍｍポアサイズのポリカーボネート膜を有するカプセルキャップ中(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，CA）に、３００,０００細胞／キャップの密度で継 代した。各セルタイプに特異的な培地中、２４時間付着させた。カプセルキャッ プ中に、スペーサー・リングおよびインサート・キャップを嵌めた後、この組み 立てたユニットをセンサーチャンバーに移し、マイクロ生理機能測定器中で、重 炭酸塩フリーＲＰＭＩ１６４０培地（Molecu1ar Devices，Inc.）で１００ｍｌ ／分にて灌流した。酸性化率をｐＨオーバータイムの変化で測定し、これはボン プを２分間隔で３０秒間停止させた時に測定した。 有糸***誘発アッセイ マウス・メサンギウム細胞でのＨＧＦの有糸***的作用を、新たに合成したＤ ＮＡに取り込まれた［3Ｈ］チミジンの量として測定した。細胞を、２４ウエル ・ディシュに継代し(２．５×１０3細胞／ウエル)、増殖培地で７２時間インキ ュ ベートした。２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含 有し、さらに３％ＦＢＳ、１００／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌスト レプトマイシンを補足したＤＭＥＭ培地に４８時間入れて、合した培養を静止さ せた。ＨＧＦを非補足ＤＭＥＭ培地で希釈し、ウエルに３連で２４時間加えた。 この２４時間培養の最後の４時間、細胞に［3Ｈ］チミジンを適用した。細胞を ＰＢＳで洗浄し、５％トリクロロ酢酸を加え、タンパク質および核酸を沈澱させ 、取り込まれなかった［3Ｈ］チミジンを除去した。ついで、０．５Ｎ ＮａＯ Ｈを添加して沈澱を溶解し、その４００ｍｌをシンチレーション液に添加し、ト ウラス（Taurus）液体シンチレーション・カウンターで計数した(ICN Biomedica ls，Inc.，Huntsville，AL)。 ルシフェラーゼ・アッセイ ＭＭＣ−ＣＯＬ細胞を、増殖培地中、２４ウエルプレートで、２５,０００細 胞／ウエルで４８時間培養した。ついで、増殖アッセイにおいて細胞を静止させ るのに使用したのと同じ培地中で、細胞をインキュベートし、ＨＧＦ添加前に、 さらに４８時間インキュベートした。表示した時間に、０．１ｍＭリン酸カリウ ムおよび１ｍＭジチオスレイトール、１％トリトンＸ−１００を含有するｐＨ７ ．２の緩衝液を用いて細胞を溶解するか（ルシフェラーゼ活性）、またはトリプ シン処理した(細胞数)。溶解細胞を遠心分離し、上澄液１００ｍｌを９６ウエル マイクロタイタープレートのウエルに２連で入れた。Microlumat LB96Pルミノメ ーター（Wallac Inc.，Gaithersburg，MD）を用いて発光を室温で直接測定し、 ルシフェリン反応混合物１００ｍｌを自動的に注入後、２０秒間にわたって積分 した。この混合物は、０．１ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１ｍＭジチオスレイトールのストック緩衝液（ｐＨ７．２） と、新たに添加した０．８ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（Boehringer Mannhei m，Indianapolis，IN）を含有していた。ルシフェリン活性は、ウエル中で同様 に処理し、トリプシン処理し、計数（Coulter Electronic LTD，Luton，Beds，E ngland）した細胞培養から測定された細胞数当りの相対光単位（ＲＬＵ）で表し た。 ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞を１５０ｃｍ2フラスコ中で培養し、上記増殖培地中で ３〜４日間インキュベートした。ＨＧＦ添加４８時間前、培地を２ｍＭ Ｌ−グ ルタミンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有し、３％ＦＢＳ、１００Ｕ／ ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ 培地に変えた。細胞を、ＨＧＦと共に、２、６および１６時間インキュベートし た。全ＲＮＡをマウス細胞から、チオシアン酸グアニジウム変性およびフェノー ル−クロロホルム抽出により抽出した(Chomczynski et al.，1987，Anal．Bioch em．162:156-159)。全ＲＮＡ（１０ｍｇ／レーン）を、０．２Ｍホルムアルデヒ ド−１％アガロースゲル上で分画し、４×ＳＳＣ中のナイロン膜（Nylon-1;Beth esda Research Laboratories，Bethesda，MD）に移した。等価物のロードおよび 移行をメチレンブルー染色で確認した。７．６ｋｂのｍＲＮＡを認識するランダ ムプライムした［32Ｐ］ＤＮＡプローブをフィブロネクチンについて作製した。 フィブロネクチンはＡＴＣＣから購入した。ハイブリダイゼーションは、５０％ ホルムアミド、２２５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％ドライミルク、１００ｍｇ・ ｍｌ酵母、全ＲＮＡおよびサケＤＮＡ中で、ラベルしたＤＮＡ１０6ｃｐｍ／ｍ ｌを用い、４２℃で１６時間行なった。ブロットを、０．２×ＳＳＣの最終スト リンジェンシー、０．２％ドデシル硫酸ナトリウムで、６５℃にて洗浄した。膜 をホスホル・イメージング・プレート（phosphor imaging plate）に暴露し、バ ンドをImageQuantソフトウエアー（Molecular Dynamics，Inc.）で定量した。 動物実験 Alzetミニオスモティックポンプ（Alza，Palo Alto，CA）に、１４．６ｎｇ／ ｍｌＨＧＦまたはビヒクル（３５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７． ３、６２５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン）を充填した。劣性ｄｂ変異を有する Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ系の細身および肥満マウスJackson Laboratory（Bar Harbor， ME）から購入した。マウスにKetalarの下、腹腔内移植し(６０ｍｇ／ｋｇ)、２ １日後に殺した。殺す日に、代謝ケージ内で２４時間尿試料を採集した。殺すと きに、血液を採集した。Synchron Clinical System AS8（Beckman;Columbia，MD ）で、尿および血清クレアチニン・レベルを測定した。クレアチニン・クリアラ ンスを計算して腎機能を測定した。 ＨＧＦ媒介酸性化率 ＦＢＳまたはＢＳＡのＨＧＦ媒介酸性化率に対する影響を評価するため、ＭＭ Ｃ−ＳＶ４０細胞を、０．１％ＢＳＡ、０．５％ＦＢＳまたは両方で３０分間前 処理した。この実験は、R&D Systems，Minneapolis，MNから得た組換ＨＧＦが、 酵素活性化の必要な一本鎖前駆体形で生じるので行なった。血清中のプロテアー ゼまたは細胞によって分泌されるプロテアーゼがＨＧＦを活性化でき、またはＦ ＢＳに含まれるプロテアーゼが必要となりうる。さらに、他の成長因子と同様に 、ＨＧＦは、プラスチックチューブに付着しやすく、ＨＧＦの細胞へのデリバリ ーに担体分子が必要となりうる。予備インキュベーションの後、０．１％ＢＳＡ または０．５％ＦＢＳの存在下、または不存在下に、細胞を１００ｍｇ／ｍｌＨ ＧＦに１０分間暴露した。 ＦＢＳの存在下、ベースライン応答がＨＧＦ投与前より３０％高くセットされ たが、ＨＧＦ誘発酸性化の弱まりが観察された。ＢＳＡは、ＦＢＳの存在下また は不存在下でＨＧＦのピーク応答を劇的に弱めた(図１、パネルＡ)。したがって 、残りの実験においては、ＨＧＦはランニング培地中、ＦＢＳまたはＢＳＡ不存 在下で投与した。 細胞をＨＧＦに暴露する時間の長さの酸性化率に対する影響を、ＭＭＣ−ＳＶ ４０細胞を１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで２、５、１０および１５分間処理して評 価した。細胞をＨＧＦの存在下、５、１０および１５分間のインキュベーション は、各々、同様な酸性化率のピークを生じたが、さらなる実験には、この処理後 の細胞の迅速な回収のために５分の暴露時間を選択した(図１、パネルＢ)。 ＨＧＦ用量応答を、３、１０、３０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦでＭＭＣ −ＳＶ４０細胞を処理して評価した。３０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ濃度が酸性化率の 最大増加を示し、１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦではさらなる増加は見られなかった (図１、パネルＣ)。 非形質転換メサンギウム細胞もＨＧＦに応答するかを測定するため、一次ヒト メサンギウム細胞を第７継代で処理した。１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦは、ヒトネ メサンギウム細胞の酸性化率増加を誘発した（図１、パネルＤ）。 メサンギウムのＨＧＦに対する応答におけるＰＫＣ媒介第二メッセンジャー系 の関与を、ＰＫＣ阻害剤ＲＯ−３２−０４３２を用いて評価した。形質転換マウ ス・メサンギウム細胞を１、３または５ｍＭ ＲＯ−３２−０４３２で３０分間 前処理し、前処理培地の存在下に５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＨＧＦを５分間加えた 。ＲＯ−３２−０４３２は、ＨＧＦ誘発酸性化率を濃度依存的に部分的にブロッ クした（図２）。 有糸***誘発に対するＨＧＦの影響 正常ヒト細胞および固定化マウス・メサンギウム細胞の増殖を、トリチウム化 チミジンの取り込みにより評価した。ヒト腎糸球体メサンギウム細胞を４８時間 血清欠乏させた。マウス・メサンギウム細胞を３％血清で増殖させた。各セット の細胞を１００ｎｇ／ｍｌまで増加する用量のＨＧＦで２４時間処理した。ＨＧ Ｆは、正常ヒト細胞および固定化マウス・メサンギウム細胞の両方において、テ ストしたいずれの用量においても、トリチウム化チミジンの取り込みに影響しな かった（図３）。 ＨＧＦの細胞外マトリックス遺伝子発現に対する影響 ＨＧＦの細胞外遺伝子発現に対する影響を、ＭＭＣ−ＣＯＬ細胞におけるルシ フェラーゼ・レポーター遺伝子のコラーゲンａ１（ＩＶ）プロモーター活性化の 査定およびＭＭＣ−ＳＶ４０細胞におけるコラーゲンａ１（ＩＶ）とフィブロネ クチンｍＲＮＡのノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション分析によって評 価した。 マウス・メサンギウム細胞におけるコラーゲンプロモーターのＨＧＦ誘発活性 化は、用量依存的であった。３０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ存在下、コラーゲンプロモ ーターの活性は、非処理細胞と比較して２倍であった(図４)。 ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞を、１ｍＭ ５−アミノ−２−（４−アミノアニリノ） ベンセンスルホン酸(ICN Biomedicals，Inc.，Costa Mesa，CA)、プロテインキ ナーゼＣ阻害剤、の存在下または不存在下、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで処理した 。ノーザン・ブロットは、ＨＧＦによりマウス・メサンギウム細胞においてコラ ーゲンａ１（ＩＶ）ｍＲＮＡレベルが増加し、該阻害剤がＨＧＦ誘発増加をブロ ックしたことを示した(データは示していない)。 また、ＭＭＣ−ＳＶ４０細胞を、３％血清の存在下で２、６および１６時間、 ５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで処理した。ノーザン・ブロットは、ＨＧＦが、ＨＧＦ 投与後、６および１６時間でフィブロネクチンｍＲＮＡレベルの増加を誘発した ことを示した(データは示していない)。 腎機能におけるＨＧＦの作用 腎機能におけるＨＧＦの作用を、正常および糖尿病マウスにおいて２１日間の ＨＧＦの長期投与後に、クレアチニンクリアランスを評価することにより決定し た。正常および糖尿病ビヒクル移植されたマウスにおけるクレアチニンクリアラ ンスは、それぞれ、４００および４５４ｍｌ／分／１００ｇであった。ＨＧＦは 、両方の群においてクレアチニンクリアランスを、それぞれ、２８３および２８ ７*ｍｌ／分／１００ｇ（ビヒクル群に対して*ｐ＜０．０５；ｎ＝５〜６マウス ；図５）に減少させた。 本明細書に示すデータは、糸球体間質細胞が、酸性化率および細胞外マトリッ クス遺伝子発現においてＨＧＦが示す変化に応答することを確証する。糸球体間 質細胞におけるＨＧＦの作用は、プロテインキナーゼＣセカンドメッセンジャー システムにより部分的に媒介される。 内皮細胞におけるＨＧＦの細胞***促進性の活性と対照的に、ＨＧＦはマウス またはヒトの糸球体間質細胞の増殖において何ら作用しない。ＨＧＦは、慢性腎 機能不全の間、糸球体間質細胞において異なる作用を有する。さらには、腎機能 不全に作用することが知られる他のタンパク質に加えて、本発明のデータ−は、 ＨＧＦもまた糸球体間質細胞におけるマトリックス産生に寄与し、それゆえ慢性 腎障害に寄与することを示す。 要約すると、ＨＧＦは糸球体間質細胞の細胞外酸性化率を促進し、糸球体間質 細胞においてフィブロネクチンおよびコラーゲンａ１（ＩＶ）の遺伝子発現を増 加する。それゆえ、ＨＧＦは、糸球体問質細胞を活性化して細胞外マトリックス 沈着を増加させることにより糸球体硬化症に寄与する。さらに、ＨＧＦで２１日 間動物を処置すると(長期間処置)、クレアチニンクリアランスが減少し、このこ とは、腎機能の減少を示唆する。それゆえ、多くの慢性腎疾患において観察され るＨＧＦが慢性的に高いことは、糸球体における細胞外マトリックスの拡大を引 き起こすことにより腎機能の減少に寄与するらしい。 本明細書に引用した特許、特許出願および出版物の各々およびすべての開示は 、そのすべてを出典明示により本明細書の一部とする。本発明を特定の具体例を 参照して開示するが、本発明の他の具体例および変形が、本発明の真の精神およ び範囲から逸脱することなく、当業者により案出されることは明らかであろう。 添付する請求の範囲は、すべてのかかる具体例および等価な変形を含むように構 築されることを意図する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＧＦ活性のアンタゴニストを同定する方法であって： 試験化合物の存在下または非存在下で細胞をＨＧＦで処理し； 細胞におけるフィブロネクチンｍＲＮＡのレベルを比較する、ここで、試験化 合物の非存在下でのフィブロネクチンｍＲＮＡのレベルと比較して、試験化合物 の存在下でのフィブロネクチンｍＲＮＡのより低いレベルは、試験化合物がＨＧ Ｆアンタゴニストであることを示す、 ことを含む方法。 ２． ＨＧＦ活性のアンタゴニストを同定する方法であって： 試験化合物の存在下または非存在下で細胞をＨＧＦで処理し； 細胞における酸性化率を比較する、ここで、試験化合物の非存在下での酸性化 率と比較して、試験化合物の存在下でのより低い酸性化率は、試験化合物がＨＧ Ｆアンタゴニストであることを示す、 ことを含む方法。 ３． ＨＧＦ活性のアンタゴニストを同定する方法であって： 試験化合物の存在下または非存在下でＨＧＦをマウスに投与し； マウスにおけるクレアチンクリアランス速度を比較する、ここで、ＨＧＦを単 独で投与したマウスにおけるクレアチンクリアランスの速度と比較して、ＨＧＦ および試験化合物を投与したマウスにおけるクレアチンクリアランスの速度が増 加することは、試験化合物がＨＧＦアンタゴニストであることを示す、 ことを含む方法。 ４． 請求項１、２または３のいずれかに記載の方法により同定されたＨＧＦア ンタゴニスト。 ５． 慢性腎疾患のヒトを治療する方法であって、ＨＧＦアンタゴニストを該ヒ トに投与することを含む方法。 ６． 抗−ＨＧＦ抗体、ペプチドメチックおよびＨＧＦのポリペプチドフラグメ ントからなる群より選択されるＨＧＦ抗体。
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