JP2001505426A - 線維芽細胞増殖因子13 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、繊維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーのメンバーであるFGF−13タンパク質に関する。とりわけ、ヒトFGF−13タンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。FGF−13ポリペプチドも、その製造用のベクター、宿主細胞および組換法と同様に提供する。さらに、本発明はFGF−13活性のアゴニストおよびアンタゴニスト同定用のスクリーニング法に関する。また、FGF−13関連障害検出用の診断方法およびFGF−13関連障害治療用の治療方法も提供する。ドーパミン作動性ニューロン生存延長方法を開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
線維芽細胞増殖因子13
発明の分野
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの使用、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産
に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、本明細書中以下で線維芽細
胞増殖因子13(以降、「FGF-13」)という、線維芽細胞増殖因子/ヘパリン結合
性増殖因子として推定的に同定されている。本発明はまた、そのようなポリペプ
チドの作用の阻害に関する。
発明の背景
線維芽細胞増殖因子は、ヘパリンへ結合する特徴を示すタンパク質のファミリ
ーであり、それゆえヘパリン結合性増殖因子(HBGF)とも呼ばれる。これらのタ
ンパク質の異なるメンバーの発現は、種々の組織において見出され、特定の時間
的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は、線維芽細胞、角膜および
血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、
水晶体上皮細胞、メラノサイト、角質細胞、稀突起膠細胞、星状細胞、骨芽細胞
、ならびに造血細胞を含む中胚葉、外胚葉および内胚葉起源の種々の細胞に対す
る強力なマイトジェンである。
各々のメンバーは、他のメンバーと重複する機能を有し、また特有の機能のス
ペクトルを有する。血管内皮細胞の増殖を刺激する能力に加えて、FGF-1およびF
GF-2の両方は内皮細胞に対して走化性であり、FGF-2は内皮細胞が基底膜に浸透
することを可能にすることが示されている。これらの特性と一致して、FGF-1お
よびFGF-2の両方は、脈管形成を刺激する能力を有する。これらの増殖因子の別
の重要な特徴は、創傷治癒を促進する能力である。FGFファミリーの多くの他の
メンバーは、
脈管形成および創傷治癒の促進のような、FGF-1およびFGF-2と類似の活性を共有
する。FGFファミリーのいくつかのメンバーは、中胚葉形成を誘発し、ニューロ
ン細胞、脂肪細胞および骨格筋細胞の分化を調節することが示されている。
正常組織におけるこれらの生物学的活性以外に、FGFタンパク質は、腫瘍血管
新生の促進により、そしてその発現が脱調節される場合トランスフォームタンパ
ク質として、ガン腫および肉腫における腫瘍形成の促進と関連している。
FGFファミリーは現在、以下の8つの構造的に関連したポリペプチドからなっ
ている:塩基性FGF、酸性FGF、int2、hst1/k-FGF、FGF-5、FGF-6、角質細胞増
殖因子、AIGF(FGF-8);近年、ヒト神経膠腫細胞株の培養上清から精製されたグ
リア活性化因子は、新規なヘパリン結合性増殖因子であることが示されている(
Miyamoto,M.ら,Mol.and Cell.Biol.,13(7):4251-4259(1993))。各々に対
する遺伝子はクローン化および配列決定されている。メンバーのうちの2つ、FG
F-1およびFGF-2は、多くの名称の下に、しかしほとんどそれぞれ酸性線維芽細胞
増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子として特徴付けられている。正常な遺
伝子産物は、大部分の中胚葉および神経外胚葉に由来する細胞の全般的な増殖能
力に影響する。それらは、インビボにおいて脈管形成を誘発し得、初期発生にお
ける重要な役割を担い得る(Burgess,W.H.およびMaciag,T.,Ann.Rev.Bioc
hem.,58:575-606(1989))。
FGFファミリーの上記のメンバーの多くはまた、同じ受容体に結合し、それら
の受容体への結合を介して第二メッセージを誘起する。
FGF-1の分泌形態をコードする真核生物発現ベクターが、遺伝子移入によって
ブタ動脈に導入されている。このモデルは、インビボにおいて動脈壁における遺
伝子機能を規定する。FGF-1の発現は、遺伝子移入の21日後にブタ動脈における
内膜厚化を誘発した(Nabel,E.G.ら,Nature,362:844-6(1993))。塩基性線
維芽細胞増殖因子が、腫瘍脈管形成におけるその役割とは別に神経膠腫の成長お
よび進行を調節し得ること、ならびに塩基性線維芽細胞増殖因子の放出または分
泌が、これらの作用に必要とされ得ることがさらに実証されている(Morrison,
R.S.ら,J.Neurosci.Res.34:502-509(1993))。
塩基性FGFのような線維芽細胞増殖因子はさらに、インビトロにおけるカポー
ジ肉腫細胞の増殖と関連している(Huang,Y.Q.ら,J.Clin.Invest.91:119
1-1197(1993))。また、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするcDNA配列は
、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによって認識される転写プロモーター
の下流にクローン化されている。そのようにして得られた塩基性線維芽細胞増殖
因子は、マイトジェン性、プラスミノーゲンアクチベーターの合成および脈管形
成アッセイにおいて、ヒト胎盤線維芽細胞増殖因子と区別し得ない生物学的活性
を有することが示されている(Squires,C.H.ら,J.Biol.Chem.263:16297-1
6302(1988))。
米国特許第5,155,214号は、実質的に純粋な哺乳動物塩基性線維芽細胞増殖因
子およびその生産を開示している。ウシおよびヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の
アミノ酸配列、ならびにウシ種のポリペプチドをコードするDNA配列が開示され
ている。
新たに発見されたFGF-9は、FGFファミリーの他のメンバーに対してほぼ30%の
配列類似性を有する。ファミリーメンバーにおける2つのシステイン残基および
その他のコンセンサス配列もまた、FGF-9において良好に保存されていた。FGF-9
は、酸性および塩基性FGFにおけるように、N末端における典型的なシグナルを
有しないことが見出された。しかしFGF-9は、典型的なシグナル配列の欠失にか
かわらず、合成後に細胞から分泌されることが見出された(Miyamoto,M.ら,M
ol.and Cell.Biol.,13(7):4251-4259(1993))。さらに、FGF-9は、稀突起膠
細胞2型星状細胞前駆細胞、BALB/c3T3およびPC-12細胞の細胞増殖を刺激するが
、ヒト臍静脈内皮細胞の細胞増殖は刺激しないことが見出された(Naruo,K.ら
,J.Biol.Chem.268:2857-2864(1993))。
塩基性FGFおよび酸性FGFは、細胞増殖、細胞運動性、分化、および生存の強力
な調節因子であり、外胚葉、中胚葉および内胚葉由来の細胞型に作用する。これ
ら2つのFGFは、KGFおよびAIGFとともに、タンパク質精製によって同定された。
しかし、他の4つのメンバーはオンコジーンとして単離され、その発現は胚形成
および特定の型のガンに制限されている。FGFファミリーのメンバーは腫瘍形成
能を有することが報告されている。FGF-9は、BALB/c3T3細胞中に形質転換された
場
合に、トランスフォーム能を示している(Miyamoto,M.ら,Mol.and Cell.Bi
ol.,13(7):4251-4259(1993))。
アンドロゲン誘導性増殖因子(AIGF)(FGF-8としても知られる)は、テスト
ステロンで刺激されたマウス乳ガン細胞(SC-3)の馴化培地から精製された。AI
GFは、推定のシグナルペプチドを有し、既知のFGFファミリーのメンバーと30〜4
0%の相同性を共有する、独特のFGF様増殖因子である。AIGFで形質転換された哺
乳動物細胞は、アンドロゲンの非存在下で、SC-3の増殖に対する顕著な刺激効果
を示す。それゆえAIGFは、SC-3細胞およびおそらくその他の細胞のアンドロゲン
誘導性増殖を媒介する。なぜなら、AIGFは腫瘍細胞自体によって分泌されるから
である。
発明の要旨
本発明のポリペプチドは、FGFファミリーの他のメンバーとのアミノ酸配列相
同性の結果として、FGFファミリーのメンバーとして推定的に同定された。
本発明の1つの態様によれば、新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に
活性であり、そして診断的または治療的に有用なそのフラグメント、アナログ、
および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源である。
本発明の別の態様によれば、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにそのアン
チセンスアナログおよび生物学的に活性であり、そして診断的または治療的に有
用なそのフラグメントを含む、本発明のポリペプチドをコードする単離された核
酸分子が提供される。
従って、本発明は、配列番号2に示す完全アミノ酸配列または細菌宿主中のプ
ラスミドDNAとしてATCC寄託番号97148として1995年5月12日に寄託されたcDNAク
ローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドの少
なくとも一部分をコードするポリペプチドを含む単離された核酸分子を提供する
。寄託されたFGF-13クローンを配列決定することによって決定されたヌクレオチ
ド配列(図1(配列番号1)に示す)は、ヌクレオチド1位〜3位のN末端メチ
オニンをコードする開始コドンを含めて、216アミノ酸残基の完全ポリペプチド
をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。本発明の核酸分子は、配列番号2
に示すN末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列;またはATCC寄託番号97148中の
cDNAクローンによってコードされるN末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を
コードする核酸分子を含み、この分子はまた、FGF-13アミノ酸配列のN末端に融
合されたさらなるアミノ酸をコードし得る。
従って、本発明の1つの態様は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する:(a)N末
端メチオニンを除く配列番号2における完全アミノ酸配列(すなわち、配列番号
2の-22位〜193位)を有するFGF-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
;(b)配列番号2のほぼ1位〜ほぼ193位のアミノ酸配列を有する推定の成熟FGF
-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(c)ATCC寄託番号97148中に含
まれるcDNAクローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するFGF-13ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列;(d)ATCC寄託番号97148中に含まれるcD
NAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟FGF-13ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列;および(e)上記(a)、(b)、(c)また
は(d)におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
本発明のさらなる実施態様は、上記(a)、(b)、(c)、(d)もしくは
(e)におけるヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも90%同一である、より
好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一であるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチド、または上記(a)、(b)、(c)、(d)
もしくは(e)におけるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。このハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドは、A残基のみまたはT残基のみからなるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドにはストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施態様は、上記(a)
、(b)、(c)または(d)におけるアミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチ
ドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸分子に関する。
本発明のなお別の態様によれば、本発明のポリペプチドの組換え生産における
試薬として有用なクローニングおよび発現プラスミドのような組換えベクター、
ならびに本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物およ
び/または真核生物宿主細胞の使用を介する、組換え技術によるそのようなポリ
ペプチドの生産用のプロセスが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、それに対するアゴニストおよびアンタゴニス
トについてスクリーニングするための、および治療目的(例えば、例えば熱傷お
よび潰瘍の結果としての創傷治癒の促進、発作に関連しニューロン障害に起因す
るニューロン損傷の防止およびニューロン成長の促進(例えば、パーキンソン病
のための)、皮膚老化および毛髪損失の防止、初期胚および肢再生における脈管
形成、中胚葉誘導の刺激)のための、そのようなポリペプチドまたはそのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供さ
れる。
本発明のなおさらなる態様によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体が
提供される。
本発明のなお別の態様によれば、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニ
スト、および例えば、瘢痕を軽減し、血管過多性疾患を処置するための細胞トラ
ンスフォーメーション(例えば、腫瘍)の処置における、そのようなポリペプチ
ドの作用を阻害するための使用のためのプロセスが提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに特異的にハイブリダイズするために十分な長さの核酸分子を含む核酸プロ
ーブが提供される。
別の実施態様において、本発明は、上記(a)、(b)、(c)または(d)
に記載のアミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドに特異的に結合する単離され
た抗体を提供する。本発明はさらに、本明細書中に記載のアミノ酸配列を有する
FGF-13ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。
そのような抗体は、下記のように診断的または治療的に有用である。
本発明のなお別の態様によれば、本発明の核酸配列における変異に関連する疾
患またはその疾患に対する罹患性の検出用の、およびそのような配列によってコ
ードされるポリペプチドの過剰発現または過少発現の検出用の診断アッセイが提
供される。
本発明の別の態様によれば、科学的研究、DNAの合成およびDNAベクターの製造
に関するインビトロ目的のために、そのようなポリペプチド、またはそのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供さ
れる。従って、本発明はまた、FGF-13ポリペプチド、特にヒトFGF-13ポリペプチ
ドを含む医薬組成物を提供する。FGF-13ポリペプチドを必要とする個体の処置方
法もまた提供される。本発明はさらに、インビトロにおける細胞への、エクスビ
ボにおける細胞へのおよびインビボにおける細胞への、または多細胞生物への投
与のための、FGF-13ポリヌクレオチドまたはFGF-13ポリペプチドを含む組成物を
提供する。本発明の特定の特に好ましい実施態様において、この組成物は、疾患
の処置のために宿主生物においてFGF-13ポリペプチドを発現させるためにFGF-13
ポリヌクレオチドを含む。これに関して特に好ましいのは、FGF-13遺伝子の異常
な内因性活性に関連する不全の処置のためのヒト患者における発現である。
図面の簡単な説明
以下の図面は、本発明の特定の実施態様の例示のみを意味し、いかにしても限
定を意味するものではない。
図1は、FGF-13をコードするヒトmRNAのヌクレオチド配列(配列番号1)およ
びFGF-13ポリペプチドの推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。約23アミノ酸
の推定のリーダー配列に下線を付す。図1におけるリーダー配列の開始のメチオ
ニン残基を位置番号(正)1で示し、一方、配列番号2の対応する配列における
リーダー位置を負の位置番号で示すことに留意のこと。従って、図1におけるリ
ーダー配列1位〜23位は、配列番号2における-23位〜-1位に対応する。
図2は、DNAStarプログラムの「Megalign」ルーチンによって決定した場合の
、ヒトFGF-13のアミノ酸配列および以下のヒトタンパク質のアミノ酸配列の間の
同一性の領域のアラインメントを示す:酸性FGF(配列番号3)、塩基性FGF(配
列
番号4)、Int-2(配列番号5)、FGF-4(配列番号6)、FGF-5(配列番号7)
、FGF-6(配列番号8)、角質細胞増殖因子(KGF)(配列番号9)、およびAIGF(FGF
-8)(配列番号10)。
図3は、FGF-13アミノ酸配列の解析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域
;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数および表面確率
を示す。「抗原性指数−Jameson-Wolf」グラフにおいて、FGF-13タンパク質の高
度に抗原性の領域、すなわち本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域
の位置が示される。
図4。FGF-13処理は、胚皮質培養物において細胞数を増加させる。妊娠17日目
の胚に由来する細胞を、ポリスチレン/ラミニンコートしたウェル中に354細胞/
mm2の密度でプレーティングした。培養物を無血清培地中で維持し、毎日表示の
濃度のFGFで処理した。7〜8日間の処理後、培養物をCalcein AMで標識し、530
nmにおける蛍光発光のレベルをモニターすることによって、細胞数を評価した。
データ点は、5〜6回の測定の平均±標準誤差を表す。(キー:○=FGF-13;●
=bFGF(rh))。
図5。FGF-13によって誘発される高親和性ニューロン特異的GABA取込みの増加
は、ヘパリンによって増強される。ポリスチレン/ラミニンコートしたウェル中
に1770細胞/mm2の密度でプレーティングした皮質培養物を、7〜8日間FGF-13で
ヘパリンの存在下または非存在下で処理した。ヘパリンおよびFGF-13を、培養物
への添加の前に約30分間プレインキュベートした。データ点は、4回の測定の平
均±標準誤差を表す。(キー:■=FGF-13;=FGF-13+10ng/mlヘパリン;▲=FG
F-13+100ng/mlヘパリン)。
図6。FGF-13処理は、皮質ニューロンの軸策成長を増強する。軸策成長実験用
に、培養物をポリリジンコートしたウェル上に212細胞/mm2の密度でプレーティ
ングした。次いで、培養物を固定し、68kDa神経フィラメントサブユニットの量
をELISAによって測定した。データ点は、5〜6回の測定の平均±標準誤差であ
る。(キー:○=FGF-13;●=bFGF(rh))。
図7。FGF-13は、ラット海馬星状細胞の増殖を誘発する。星状細胞を96ウェル
プレート中に15,000細胞/ウェルの密度で継代培養した。無血清培地中での18時
間のインキュベーションによって細胞をG1期において停止させ、次いでFGF-13で
ヘパリンの非存在下または存在下で24時間処理した。インキュベーション期間の
最後の4時間の間、培養物を[3H]チミジンで標識した。データ点は、4〜6回の
測定の平均±標準誤差を表す。(キー:○=FGF-13;●=FGF-13+10ng/mlヘパリ
ン;=FGF-13+100ng/mlヘパリン;■=FGF-13+1000ng/mlヘパリン)。
図8。FGF-13は、海馬星状細胞の単層培養物から[125I]FGF-1の結合を置換す
る。星状細胞を継代し、24ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖させた。
培養物を4℃で50pM[125I]FGF-1とともに表示の濃度の非標識FGFの非存在下また
は存在下でインキュベートした。データ点は、4回の測定の平均±標準誤差を表
す。(キー:●=FGF-10;=bFGF;■=FGF-13)。
図9。ヒト肺線維芽細胞の増殖に対するFGF-13の作用。(キー:■=bFGF;◆
=FGF-13)。
図10。ヒト皮膚内皮細胞の増殖に対するFGF-13の作用。(キー:■=bFGF;◆
=FGF-13)。
図11。ヒト肺線維芽細胞からのPGE2の放出に対するFGF-2およびFGF-13の作用
。(キー:6本の棒の各群において左から右に棒は以下を表す:培地単独;bFGF
(FGF-2)(100ng/ml);インドメタシン(100ng/ml);FGF-13(100ng/ml);FG
F-13(1000ng/ml);FGF-12(2500ng/ml))。
図12。ヒト肺線維芽細胞からのIL-6の放出に対するFGF-2およびFGF-13の作用
。(キー:6本の棒の各群において左から右に棒は以下を表す:培地単独;bFGF
(FGF-2)(100ng/ml);インドメタシン(100ng/ml);FGF-13(100ng/ml);F
GF-13(1000ng/ml);FGF-12(2500ng/ml))。
図13は、チミジン取込みによって測定したFGF受容体(FGFR)1c、2c、3cおよ
び4を発現するBaF3細胞に対するFGF13のマイトジェン活性を示す。FGF受容体を
発現するBaF3細胞を、62.5nMの濃度までのFGF-13とともにインキュベートした(
X軸)。同じ濃度範囲のaFGFを、ポジティブコントロールとして使用した。Y軸
は、FGF1刺激後に取り込まれた最大cpmの百分率としての、BaF3細胞のDNA中に取
り込まれ
た3Hチミジンの量を表す。丸:FGFR1c;四角:FGFR2c;菱形:FGFR3c;三角:FGFR4。
図14は、E14のWistarラット胚から切除し、トリプシンを用いて解離し、1平
方センチメートル当たり200,000細胞の密度で播種した中脳底由来の培養ドーパ
ミン作動性ニューロンに対するFGF13のチロシンヒドロキシラーゼ刺激活性を示
す。チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンは、FGF-13投与後に増加した。コ
ントロールは塩基性FGFであり、その他の線維芽細胞増殖因子はFGF-2、FGF-9、
およびFGF-10を含む。
詳細な説明
本発明は、クローン化されたcDNAを配列決定することによって決定された、配
列番号2に示すアミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む単離された核酸分子を提供する。配列番号1の11位〜1212位に示
すヌクレオチド配列は、HODAH63クローンを配列決定することによって得られた
。このHODAH63クローンは、1995年5月12日にAmerican Type Culture Collectio
n,12301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852に寄託され、受託番号A
TCC97148を受けた。寄託されたクローンはpBluescript SK(-)プラスミド(Strata
gene,La Jolla,CA)中に含まれている。配列番号1の1位〜10位に示すヌクレ
オチド配列は、ヒトcDNAの混合物を含むcDNAライブラリーのPCR増幅の産物を配
列決定することによって得られた。
本明細書において言及される寄託物は、特許手続のための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。この寄託物は、単に便宜上提
供されるのであって、寄託物が米国特許法第112条の下に要求されることの承認
ではない。寄託された材料中に含まれるポリヌクレオチドの配列ならびにそれに
よってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に参考として援用
され、本明細書中の配列の記載とのいかなる不一致の場合においても支配的であ
る。寄託された材料を作製、使用または販売するためには認可が要求され得、そ
のような認可は本明細書によっては与えられない。
FGF-13ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子ファミリーの全てのメンバーに構
造的に関連し、その最初の25アミノ酸が推定のリーダー配列を表し、その結果、
成熟ポリペプチドが193アミノ酸を含む、216アミノ酸(配列番号2)のポリペプ
チドをコードするオープンリーディングフレームを含む。最高適合(top match
)の中には以下が存在する:
1)185アミノ酸の範囲にわたるマウスAIGFに対する69%の同一性および81%の
類似性;2)82アミノ酸の領域におけるFGF-4に対する30%の同一性および56%の
類似性:3)78アミノ酸の範囲にわたるヒトKGF(配列番号9)に対する41%の
同一性および64%の類似性。FGF-13に比較したヒトホモログの中で、FGF-8(bFG
F)およびaFGFが最大の類似性を示す(それぞれ、56.7%および51.0%)。FGF-1
3アミノ酸配列の種々のヒトポリペプチドのアミノ酸配列とのアラインメントを
図2に示す。
FGF/HBGFファミリーの印(signature)であるGXLX(S、T、A、G)X6(D、E)CXFX
Eは、本発明のポリペプチドにおいて保存されている(Xはいずれかのアミノ酸残
基を意味する;(D,E)はD残基またはE残基のいずれかを意味する;X6はいずれかの
6つのアミノ酸残基を意味する)。
核酸分子
他に示さない限り、本明細書においてDNA分子を配列決定することによって決
定された全てのヌクレオチド配列は、自動DNAシーケンサー(Applied Biosystems
,Inc.,Foster City,CAのModel 373のような)を使用して決定され、そして本
明細書において決定されたDNA分子によってコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は、上記のように決定されたDNA配列の翻訳によって推定された。それゆ
え、この自動化されたアプローチによって決定されるいずれのDNA配列について
も当該分野において公知であるように、本明細書において決定されるいずれのヌ
クレオチド配列もいくらかのエラーを含み得る。自動装置によって決定されるヌ
クレオチド配列は、配列決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列と、代表
的には少なくとも約90%同一、より代表的には少なくとも約95%〜少なくとも約
99.9%同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定法
を含む他のアプローチ
によって、より正確に決定され得る。これもまた当該分野において公知であるよ
うに、実際の配列に比較しての決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入
または欠失は翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定される
ヌクレオチド配列によってコードされる推定のアミノ酸配列は、配列決定される
DNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる(これは、
そのような挿入または欠失の点で始まる)。
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、DNA分子
またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、RNA分
子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド(A、G、CおよびU)
の対応する配列が意図され、ここで、特定されるデオキシリボヌクレオチド配列
における各々のチミジンデオキシリボヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチド
ウリジン(U)によって置換される。
図1(配列番号1)におけるヌクレオチド配列のような本明細書中に提供する
情報を使用して、FGF-13ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的
なクローニングおよびスクリーニング手順(出発材料としてmRNAを使用してcDNA
をクローン化するための手順のような)を使用して取得され得る。本発明の実例
では、図1(配列番号1)に記載の核酸分子はヒト卵巣ガン組織に由来するcDNA
ライブラリー中に見出された。同じ遺伝子のさらなるクローンはまた、ヒト胎児
腎臓組織由来のcDNAライブラリーにおいて見出され、ヒト組織のノーザンブロッ
ティングによって、ヒト胎児腎臓およびヒト胎児脳のみにおいて弱いシグナル(1
.6kb)が検出された。それゆえ、本発明の核酸は、生物学的試料中に存在する組
織または細胞型の差次的同定(differential identification)用のハイブリダイ
ゼーションプローブとして有用である。同様に、ポリペプチドおよびそのポリペ
プチドに対する抗体は、組織または細胞型の差次的同定用の免疫学的プローブを
提供するために有用である。
図1(配列番号1)のFGF-13cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、図1(配
列番号1)におけるヌクレオチド配列のヌクレオチド1位〜3位の開始コドンを
有する216アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ム
を含む。寄託されたcDNAによってコードされるFGF-13ポリペプチドは、実際には
、配列番号2における配列のC末端の約212アミノ酸を含み、図1および配列番
号2における残りのN末端配列は、ファージベクター中のヒトcDNAライブラリー
由来のDNAをテンプレート用に使用し、cDNA挿入部位の5'側および3'側のベクタ
ー特異的プライマーによってプライムしたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)混合物
の産物を配列決定することによって決定された。当業者によって理解されるよう
に、以上で論じた配列決定エラーの可能性により、寄託されたcDNAによってコー
ドされる実際のFGF-13ポリペプチド(配列番号2における配列のC末端の約212ア
ミノ酸を含む)は、決定された配列より幾分長いかまたは短くあり得る。より一
般的には、実際のオープンリーディングフレームは、図1(配列番号1)に示す
N末端から推定されるオープンリーディングフレームの±20アミノ酸の範囲内、
おそらく±10アミノ酸の範囲内のいずれかであり得る。
リーダーおよび成熟配列
配列番号2に示すように、完全FGF-13タンパク質のアミノ酸は、リーダー配列
および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、成熟形態のFGF-13タン
パク質をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナル仮説によれば、一旦
、粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始すると、哺乳動物細胞
によって分泌タンパク質はシグナルまたはリーダー配列を有し、このリーダー配
列は完全ポリペプチドから切断されて、分泌「成熟」形態のタンパク質を生じる
。大部分の哺乳動物細胞および昆虫細胞さえも、同じ特異性で分泌タンパク質を
切断する。しかしいくつかの場合、分泌タンパク質の切断は完全に一様ではなく
、この結果、タンパク質の2つ以上の成熟種が生じる。さらに、分泌タンパク質
切断特異性は最終的には完全タンパク質の一次構造によって決定される、すなわ
ちポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長い間知られている。
それゆえ、本発明は、ATCC寄託番号97148として同定される宿主中に含まれるc
DNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟FGF-13ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ATCC寄託番号97148中のcDNAクロ
ーン
によってコードされるアミノ酸配列を有する成熟FGF-13ポリペプチド」によって
、寄託された宿主中のベクター中に含まれるクローンのヒトDNA配列によってコ
ードされる完全FGF-13コード配列をコードするDNAによる哺乳動物細胞(例えば、
下記のCOS細胞)における発現によって産生される成熟形態のFGF-13タンパク質が
意味される。ここで、そのヒトDNA配列は、開始コドンを含めたFGF-13コード配
列の翻訳のために適切な調節配列に作動可能に連結される。
本発明の場合、完全FGF-13ポリペプチドの推定アミノ酸配列を、ヒトFGF-8の
既知のアミノ酸配列とのアラインメントによって解析し、それによって配列番号
2に示す完全アミノ酸配列内の相同な位置(残基-1と+1との間)に分泌リーダ
ー切断部位が推定された。
示したように、本発明の核酸分子は、mRNAのようなRNAの形態であり得るか、
またはDNAの形態(例えば、クローニングによって得られるかまたは合成で生成
されたcDNAおよびゲノムDNAを含む)であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であ
り得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)であり
得るか、または非コード鎖(アンチセンス鎖ともいう)であり得る。
「単離された核酸分子」によって、その天然環境から取り出されている核酸分
子(DNAまたはRNA)が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分
子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたDNA分子
のさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えDNA分子または溶液
中の精製された(部分的にまたは実質的に)DNA分子が挙げられる。単離されたR
NA分子としては、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロRNA転写物が挙げ
られる。本発明による単離された核酸分子としてはさらに、合成で生成されたそ
のような分子が挙げられる。
本発明の単離された核酸分子としては、図1(配列番号1)に示すヌクレオチ
ド配列の1位〜3位の開始コドンを有するかまたは有しないオープンリーディン
グフレーム(ORF)を含むDNA分子が挙げられる。配列番号2の1位〜193位に示
す推定の成熟FGF-13タンパク質のコード配列を含むDNA分子もまた挙げられる。
さらに、本発明の単離された核酸分子としては、上記の配列とは実質的に異な
る配列を含むが、それでもなお遺伝暗号の縮重によりFGF-13タンパク質をコード
するDNA分子が挙げられる。もちろん、遺伝暗号および種特異的コドン優先は当
該分野において周知である。従って、上記の縮重改変体を生成して、例えば特定
の宿主用にコドン発現を最適化する(例えば、ヒトmRNA中のコドンをE.coliの
ような細菌宿主によって優先されるコドンに変更する)ことは、当業者にとって
慣習的である。
別の態様において、本発明は、ATCC寄託番号97148として1995年5月12日に寄
託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配
列を有するFGF-13ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好
ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによってコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする。
本発明はさらに、図1に示すヌクレオチド配列もしくは上記の寄託されたクロ
ーン中に含まれるFGF-13cDNAのヌクレオチドを有する単離された核酸分子、また
は上記の配列の1つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単
離された核酸分子(特に、DNA分子)は、遺伝子マッピング用(染色体とのイン
サイチュハイブリダイゼーションによる)およびヒト組織におけるFGF-13遺伝子
の発現の検出(例えば、ノーザンブロット分析による)用のプローブとして有用
である。
本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核
酸分子ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する
。特に、本発明は、配列番号1の1位〜648位からなる配列番号1の部分を表す
ヌクレオチド配列を有するポリペプチドを提供する。
従って、本発明は、配列番号1残基1〜残基648の少なくとも約30ヌクレオチ
ド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチドのいずれかの部分を含むポリヌクレ
オチドを含む。より一般的には、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図1
(配列番号1)に示すヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメ
ントによって、本明細書において論じるような診断プローブおよびプライマーと
して有用である、長さ少なくとも約15nt、より好ましくは少なくとも約20nt、な
お
より好ましくは少なくとも約30nt、さらにより好ましくは少なくとも約40ntのフ
ラグメントが意図される。もちろん、長さ50〜300ntのより長いフラグメントも
また、寄託されたcDNAのまたは図1(配列番号1)に示すヌクレオチド配列の大
部分(全てではないにしても)に対応するフラグメントがそうであるように、本
発明に従って有用である。例えば、長さ少なくとも20ntのフラグメントによって
、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図1(配列番号1)に示すヌクレオ
チド配列由来の20以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。本発明
の好ましい核酸フラグメントとしては、図3に示し、以下でより詳細に記載する
FGF-13のエピトープ保有部分をコードする核酸分子が挙げられる。
別の態様において、本発明は、上記の本発明の核酸分子(例えば、ATCC寄託番
号97148中に含まれるcDNAクローン)中のポリペプチドの部分にストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む
単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件」によって、50%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mMクエン酸3ナ
トリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10%硫酸デキ
ストランおよび20μg/ml変性剪断サケ***DNAを含有する溶液中での42℃でのイ
ンキュベーション、続く0.1×SSC中での約65℃でのフィルターの洗浄が意図され
る。
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、より好ましくは
少なくとも約20nt、なおより好ましくは少なくとも約30nt、さらにより好ましく
は約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド(DNAまたはRNAのいずれか)
が意図される。これらは、以上でそしてより詳細に以下で論じるように診断プロ
ーブおよびプライマーとして有用である。
例えば、「長さ少なくとも20nt」のポリヌクレオチドの部分によって、参照ポ
リヌクレオチド(例えば、寄託されたcDNAまたは図1(配列番号1)に示すヌク
レオチド配列)のヌクレオチド配列由来の20以上の連続するヌクレオチドが意図
される。もちろん、ポリA配列(図1(配列番号1)に示すFGF-13cDNAの3'末端
ポリ(A)領域のような)、またはT(もしくはU)残基の相補的伸長にのみハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の部分にハイブリダイズさせ
るために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら、その
ようなポリヌクレオチドはポリ(A)伸長またはその相補物を含むいずれの核酸分
子にも(例えば、事実上いずれの二本鎖cDNAクローンにも)ハイブリダイズする
からである。
示したように、FGF-13ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子としては、
限定するものではないが、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分
子自体;ならびに、プレ、またはプロ、またはプレプロタンパク質配列のような
、成熟ポリペプチドおよびさらなる配列のコード配列(約25アミノ酸のリーダー
または分泌配列をコードする配列のような);上記のさらなるコード配列を有す
るかまたは有しない成熟ポリペプチドのコード配列が挙げられる。
さらなる非コード配列(例えば、限定するものではないが、転写、mRNAプロセ
シング(スプライシングおよびポリアデニル化を含む)における役割(例えば、
リボソーム結合およびmRNAの安定性)を担う、転写され、翻訳されない配列のよ
うなイントロンならびに非コード5'および3'配列を含む);さらなる機能性を提
供するアミノ酸のようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列と一
緒に、上記のタンパク質配列はまた本発明の核酸によってコードされる。
従って、ポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリペプチドの精製を
容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合され得る。本
発明のこの態様の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、
とりわけ、pQEベクター(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91
311)中に提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは
市販されている。例えば、Gentzら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(
1989)に記載のように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提
供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピ
トープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、Wilsonら,Cell 37:
767(1984)に記載されている。以下で論じるように、その他のそのような融合
タンパク質と
しては、N末端またはC末端でFcに融合されたFGF-13が挙げられる。
改変体および変異体ポリヌクレオチド
本発明はさらに、FGF-13タンパク質の部分、アナログまたは誘導体をコードす
る本発明の核酸分子の改変体に関する。天然の対立遺伝子改変体のように、改変
体は天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の
遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの変形の1つが意図される。Genes II,Le
win,B.,編,John Wiley & Sons,New York(1985)。非天然の改変体は、当該分
野で公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。
そのような改変体としては、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって生
成される改変体が挙げられる。置換、欠失または付加には、1つ以上のヌクレオ
チドが関与し得る。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方にお
いて変化され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的なアミノ
酸の置換、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、FGF-13
タンパク質またはその部分の特性および活性を変化させないサイレントな置換、
付加および欠失である。保存的置換もまたこの点で特に好ましい。
最高に好ましいのは、配列番号2に示すアミノ酸配列または寄託されたcDNAク
ローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟タンパク質をコードする
核酸分子である。
さらなる実施態様には、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少
なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%または99
%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸
が含まれる:(a)配列番号2における完全アミノ酸配列を有するFGF-13ポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列;(b)配列番号2の1位〜193位のアミ
ノ酸配列を有する推定の成熟FGF-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
;(c)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全ア
ミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(d)
ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配
列を有す
る成熟FGF-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および(e)上記(a)
、(b)、(c)または(d)におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的な
ヌクレオチド配列。
FGF-13ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば
、95%「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポ
リヌクレオチド配列がFGF-13ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の
各100ヌクレオチド当たり5つまでの点変異を含み得る以外、ポリヌクレオチド
のヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。換言すると、参
照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの5%までが欠失され
得るかもしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列中の全ヌク
レオチドの5%までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列
のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'末端位置もしくは3'末端位置、ま
たはそれらの末端位置の間のどこかで、参照配列中のヌクレオチド間で独立して
かまたは参照配列内の1つ以上の連続する群でかのいずれかで散在して生じ得る
。
実際問題とし、いずれかの特定の核酸分子が図1に示すヌクレオチド配列また
は寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも90%、95
%、96%、97%、98%または99%同一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wi
sconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer
Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)
のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。
Bestfitは、2つの配列間の相同性の最良セグメントを見出すために、Smithおよ
びWaterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)の局所的相同
性アルゴリズムを使用する。特定の配列が本発明による参照配列と、例えば、95
%同一であるかどうかを決定するためにBestfitまたはいずれかのその他のアラ
インメントプログラムを使用する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の百
分率が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出され、参照配列中のヌクレオ
チドの総数の5%までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される
。
本願は、それらがFGF-13活性を有するポリペプチドをコードするかどうかにか
かわらず、図1(配列番号1)に示す核酸配列または寄託されたcDNAの核酸配列
と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である核酸分子に関
する。これは、たとえ特定の核酸分子がFGF-13活性を有するポリペプチドをコー
ドしない場合でさえ、当業者はいかにしてこの核酸分子を使用するかを知るから
である(例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)プライマーとして)。FGF-13活性を有するポリペプチドをコードしない
本発明の核酸分子の用途としては、とりわけ以下が挙げられる:(1)cDNAライ
ブラリーにおけるFGF-13遺伝子またはその対立遺伝子改変体の単離;(2)Verm
aら,Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New
York(1988)に記載のような、FGF-13遺伝子の正確な染色***置を提供するため
の中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション(例えば「FIS
H」);および、特定の組織におけるFGF-13mRNA発現の検出用のノーザンブロット
分析。
しかし、実際、FGF-13タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする、図
1(配列番号1)に示す核酸配列または寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも
90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を有する核酸分子が好
ましい。「FGF-13タンパク質活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物
学的アッセイにおいて測定した場合に、本発明の成熟FGF-13タンパク質の活性に
類似する(必ずしも同一ではないが)活性を示すポリペプチドが意図される。例
えば、本発明のFGF-13タンパク質は、以下にさらに記載するように、種々の哺乳
動物細胞、特に線維芽細胞の増殖を刺激する。
FGF-13タンパク質は、本明細書中以下に記載する種々の活性アッセイにおいて
、用量依存性様式で細胞増殖を刺激する。従って、「FGF-13タンパク質活性を有
するポリペプチド」としては、下記のアッセイにおいて用量依存性様式で同じ活
性のいずれかもまた示すポリペプチドが挙げられる。用量依存性活性の程度はFG
F-13タンパク質の程度と同一である必要はないが、「FGF-13タンパク質活性を有
するポリペプチド」は、FGF-13タンパク質に比較した場合、所定の活性において
実質的に類似の用量依存性を示す(すなわち、候補ポリペプチドは、参照FGF-13
タ
ンパク質に比較して、より高い活性、または25分の1以上、好ましくは約10分の
1以上の活性を示す。)。
もちろん、遺伝暗号の縮重により、寄託されたcDNAの核酸配列または図1(配
列番号1)に示す核酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99
%同一である配列を有する核酸分子の多くが「FGF-13タンパク質活性を有する」
ポリペプチドをコードすることを、当業者は直ちに認識する。実際、これらのヌ
クレオチド配列の縮重改変体の全ては同じポリペプチドをコードするので、たと
え上記の比較アッセイを実施しなくても、このことは当業者にとって明白である
。縮重改変体でないような核酸分子については、合理的な数がまたFGF-13タンパ
ク質活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野においてさらに認
識される。これは、以下にさらに記載するように、タンパク質機能にあまりまた
は全く有意には影響を及ぼしそうにないアミノ酸置換(例えば、1つの脂肪族ア
ミノ酸の第2の脂肪族アミノ酸での置換)を、当業者は完全に知っているからで
ある。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター
を用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるFGF-13ポリペプチ
ドまたはそのフラグメントの生産に関する。ベクターは、例えば、ファージ、プ
ラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルス
ベクターは、複製可能であるかまたは複製欠陥であり得る。後者の場合、ウイル
スの増殖は一般に相補性宿主細胞中でのみ生じる。
ポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のために、選択マーカーを含むベ
クターに連結され得る。一般にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿の
ような沈殿中で、または荷電脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイル
スである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロ
においでパッケージングされ、次いで宿主細胞中に形質導入され得る。
DNAインサートは、いくつか名前を挙げると、ファージλPLプロモーター、E.
coli
lac、trp,phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターなら
びにレトロウイルスLTRのプロモーターのような適切なプロモーターに作動可能
に連結されるべきである。その他の適切なプロモーターは当業者の知るところと
なる。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位、および、転写される
領域中に、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される
転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドンを、そして翻訳され
るべきポリペプチドの終わりに適切に配置された終止コドン(UAA、UGAまたはUA
G)を含む。
示したように、発現ベクターは好ましくは少なくとも1つの選択マーカーを含
む。そのようなマーカーとしては、真核生物細胞培養物用のジヒドロ葉酸レダク
ターゼ、G418またはネオマイシン耐性、ならびにE.coliおよびその他の細菌に
おける培養用のテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子
が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定するものではないが、E
.coliStreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞のような細菌細胞;酵母
細胞のような真菌細胞;Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞のような昆虫細
胞;CHO、COS、293およびBowesメラノーマ細胞のような動物細胞;ならびに植物細
胞が挙げられる。上記の宿主細胞のために適切な培養培地および条件は、当該分
野において公知である。
細菌における使用のために好ましいベクターの中には、QIAGEN,Inc.(前出
)から入手可能であるpQE70、pQE60およびpQE-9;Stratageneから入手可能であ
るPhagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A
;ならびにPharmaciaから入手可能であるptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540
、pRIT5が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、Stratageneから入手
可能であるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;ならびにPharmaciaから入
手可能であるpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLがある。その他の適切なベクターは
当業者に容易に明らかとなる。
宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DE
AEデキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフ
ェ
クション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によっ
てもたらされ得る。そのような方法は、Davisら,Basic Methods In Molecular
Biology(1986)のような多くの標準的な研究室マニュアルに記載されている。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、分泌
シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域も含み得る。例えば、さらなるア
ミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞中での、精製の間の、またはその
後の取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプ
チドのN末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするために
、ポリペプチドに付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終的な調
製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じさせるため、安定性を
改善するため、および精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の
付加は、当該分野において良く知られそして慣習的な技術である。好ましい融合
タンパク質は、タンパク質を安定化および精製するために有用である免疫グロブ
リン由来の異種領域を含む。例えば、EP-A-O 464 533(カナダ国対応出願204586
9)は、別のヒトタンパク質またはその部分と共に免疫グロブリン分子の定常領
域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質
中のFc部分は、治療および診断における使用のために十分に有利であり、従って
その結果、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じる(EP-A 0232 262)。他
方、いくつかの用途については、融合タンパク質が、記載した有利な様式で発現
、検出および精製された後に、Fc部分を欠失させ得ることが所望される。これは
、Fc部分が治療および診断における使用に対する妨害物であることが判明した場
合(例えば、融合タンパク質が免疫用の抗原として使用されるべきである場合)で
ある。薬物発見において、例えば、hIL-5のようなヒトタンパク質が、hIL-5のア
ンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニングアッセイの目的のために
、Fc部分と融合されている。D.Bennettら,J.Molecular Recognition 8:52-58
(1995)およびK.Johansonら,J.Biol.Chem.270:9459-9471(1995)を参照の
こと。
FGF-13タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニ
オンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む
周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ま
しくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)が精製用に用いられる。本発
明のポリペプチドには以下が含まれる:体液、組織および細胞を含む天然の供給
源から精製された産物(直接的に単離されるか培養されるかのいずれにしても);
化学合成手順の産物;ならびに、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺
乳動物細胞を含む原核生物または真核生物宿主から組換え技術によって生産され
た産物。組換え生産手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプ
チドは、グリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されなくてもよい。さ
らに本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介性プロセスの結果
として、開始修飾メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによって
コードされるN末端メチオニンが一般に全ての真核生物細胞における翻訳後にい
ずれのタンパク質からも高効率で除去されることは、当該分野においで周知であ
る。大部分の原核生物において大部分のタンパク質上のN末端メチオニンはまた
効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物の除去プ
ロセスは、N末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非
効率的である。
ポリペプチドおよびフラグメント
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列、もしく
は配列番号2におけるアミノ酸配列を含む単離されたFGF-13ポリペプチド、また
は上記のポリペプチドの部分を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。
改変体および変異体ポリペプチド
FGF-13ポリペプチドの特徴を改善または変化させるために、タンパク質工学が
用いられ得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、単一のまたは複数のアミノ酸
の置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規な変異体タンパク質または「
ム
テイン」を作製するために使用され得る。そのような改変されたポリペプチドは
、例えば、増強された活性または増大された安定性を示し得る。さらに、それら
は、少なくとも特定の精製および貯蔵条件下において、対応する天然のポリペプ
チドよりも高収率で精製され、良好な可溶性を示し得る。
N末端およびC末端欠失変異体
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態
を含む多くのタンパク質について、1つ以上のアミノ酸がN末端またはC末端か
ら生物学的機能の実質的な損失なしに欠失され得ることが、当該分野において公
知である。例えば、Ronら,J.Biol.Chem.,268:2984-2988(1993)は、たとえ3
、8または27のアミノ末端アミノ酸残基が失われてもヘパリン結合活性を有した
改変されたKGFタンパク質を報告した。本発明の場合、推定のリーダー切断点を
越えて約10までの(すなわち、配列番号2における10位のアスパラギンまでの)
さらなるN末端残基の欠失を有するポリペプチドが、細胞増殖刺激または受容体
結合活性のようないくらかの生物学的活性を保持し得る。
しかし、たとえタンパク質のN末端から1つ以上のアミノ酸の欠失の結果、タ
ンパク質の1つ以上の生物学的機能の損失の修飾が生じてもなお、その他の生物
学的活性は保持され得る。従って、短縮されたタンパク質が、タンパク質の完全
または成熟形態を認識する抗体を誘発するおよび/またはそれに結合する能力は
、完全または成熟タンパク質の大部分より少ない残基がN末端から除去される場
合、一般に保持される。完全タンパク質のN末端残基を欠く特定のポリペプチド
がそのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される、お
よびそうでなければ当該分野において公知の慣習的な方法によって容易に決定さ
れ得る。
従って、本発明はさらに、10位のアスパラギンまで、配列番号2に示すFGF-13
のアミノ酸配列のアミノ末端から1つ以上の残基が欠失されたポリペプチドを提
供する。特に、本発明は、配列番号の残基n〜残基193のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドを提供する。ここで、nは-23〜+10(0以外)の範囲の0以外の整数
で
ある。より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供する:配列番号2の-23〜193、-22〜193
、-21-193、-20〜193、-19〜193、-18〜193、-17〜193、-16〜193、-15〜193、-
14〜193、-13〜193、-12〜193、-11〜193、-10〜193、-9〜193、-8〜193、-7〜1
93、-6〜193、-5〜193、-4〜193、-3〜193、-2〜193、-1〜193、1〜193、2〜193
、3〜193、4〜193、5〜193、6〜193、7〜193、8〜193、9〜193および10〜193。
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
同様に、生物学的に機能的なC末端欠失ムテインの多くの例が知られている。
例えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から8〜10アミノ
Biotechnology 7:199-216(1988))。本発明の場合、本発明のタンパク質はヒトF
GF-8に相同であるので、配列番号2における154位のロイシンで始まる保存領域
までのC末端アミノ酸の欠失は、細胞増殖の刺激または受容体結合のようないく
つかの生物学的活性を保持し得る。
しかし、たとえタンパク質のC末端から1つ以上のアミノ酸の欠失の結果、タ
ンパク質の1つ以上の生物学的機能の損失の修飾が生じてもなお、その他の生物
学的活性は保持され得る。従って、短縮されたタンパク質が、タンパク質の完全
または成熟形態を認識する抗体を誘発するおよび/またはそれに結合する能力は
、完全または成熟タンパク質の大部分より少ない残基がC末端から除去される場
合、一般に保持される。完全タンパク質のC末端残基を欠く特定のポリペプチド
がそのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される、お
よびそうでなければ当該分野において公知の慣習的な方法によって容易に決定さ
れ得る。
従って、本発明はさらに、配列番号2の154位のロイシンまで、配列番号2に
示すFGF-13のアミノ酸配列のカルボキシ末端から1つ以上の残基が欠失されたポ
リペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供する。詳細には、本発明は、配列番号2におけるアミノ酸配列の残基-22〜残
基mのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。ここで、mは154〜192の
範囲
のいずれかの整数であり、残基154は、FGF-13とヒトFGF-8との間で高度に保存さ
れた領域を開始する、完全FGF-13ポリペプチドのC末端からの最初の残基の位置
である。
より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する:配列番号2の-22〜154、-22〜155、-22
〜156、-22〜157、-22〜158、-22〜159、-22〜160、-22〜161、-22〜162、-22〜
163、-22〜164、-22〜165、-22〜166、-22〜167、-22〜168、-22〜169、-22〜17
0、-22〜171、-22〜172、-22〜173、-22〜174、-22〜175、-22〜176、-22〜177
、-22〜178、-22〜179、-22〜180、-22〜181、-22〜182、-22〜183、-22〜184、
-22〜185、-22〜186、-22〜187、-22〜188、-22〜189、-22〜190および-22〜192
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から1つ以上のアミノ
酸が欠失されたポリペプチドを提供し、これは一般に配列番号2の残基n〜残基
mを有するとして記載され得る。ここでnおよびmは上記のような整数である。
ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全FGF-1
3アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もま
た含まれる。ここでこの部分は、ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローン
によってコードされる完全アミノ酸配列のアミノ末端からの1〜約33アミノ酸、
または、ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完
全アミノ酸配列の、カルボキシ末端からの1〜約39アミノ酸、または上記のアミ
ノ末端およびカルボキシ末端欠失のいずれかの組み合わせを除外する。上記の欠
失変異体ポリペプチド形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた提供され
る。
他の変異体
以上で論じたタンパク質の末端欠失形態に加えて、FGF-13ポリペプチドのいく
つかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能の有意な影響なしに変化さ
れ得ることもまた、当業者によって認識される。そのような配列の差異が意図さ
れる場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することを覚えてお
くべきである。
従って、本発明にはさらに、実質的なFGF-13ポリペプチド活性を示すかまたは
以下で論じるタンパク質の部分のようなFGF-13の領域を含むFGF-13の変形が含ま
れる。そのような変異体としては、活性に対してわずかしか影響を有しないよう
に当該分野において公知の一般的な規則に従って選択される欠失、挿入、反転、
反復、および型置換(type substitution)が挙げられる。例えば、いかにして
表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関しての指導は、Bowie,J
.U.ら,「タンパク質配列中のメッセージの解読:アミノ酸置換に対する寛容」,S
cience 247:13016-1310(1990)に提供され、ここで著者らは、アミノ酸配列の変
化に対する寛容を研究するためには2つの主なアプローチが存在することを示し
ている。第1の方法は進化の過程に依存している。進化において、変異は自然淘
汰によって許容されるかまたは拒絶されるかのいずれかである。第2のアプロー
チはクローン化された遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入するために遺伝
子操作を、そして機能性を維持する配列を同定するために選択またはスクリーニ
ングを使用する。
著者らが記述するように、これらの研究によって、タンパク質がアミノ酸置換
に驚異的に寛容であることが明らかとなった。著者らはさらに、どのアミノ酸変
化がタンパク質の個々の位置において許容されそうであるかを示している。例え
ば、大部分の埋没したアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、一方、表面側鎖の
特徴は概して少ししか保存されていない。その他のそのような表現型的にサイレ
ントな置換は、Bowie,J.U.ら(前出)およびその中で引用されている参考文
献に記載されている。代表的に保存的置換と見られているのは、脂肪族アミノ酸
Ala、Val、LeuおよびIleの間での互いの置換;ヒドロキシル残基SerおよびThrの
交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間の置換、塩基
性残基LysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyr間の置換である。
従って、配列番号2のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによってコードされ
るポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは(i)1つ以上のアミ
ノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置
換され、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされるア
ミノ酸残基であってもよくまたはそうでなくてもよいフラグメント、誘導体また
はアナログ、または(ii)1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むフラグメント
、誘導体またはアナログ、または(iii)成熟ポリペプチドがポリペプチドの半
減期を増大させる化合物のような別の化合物(例えば、ポリエチレングリコール
)に融合されているフラグメント、誘導体またはアナログ、または(iv)IgG Fc
融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列または上記の形態のポリペプ
チドもしくはプロタンパク質配列の精製用に用いられる配列のような、さらなる
アミノ酸が上記の形態のポリペプチドに融合されているフラグメント、誘導体ま
たはアナログであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、
本明細書中の教示から当業者の範囲内にあるとみなされる。
従って、本発明のFGF-13は、自然変異由来またはヒト操作由来のいずれかの、
1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。示したように、変化は
好ましくしは、タンパク質の折り畳みにも活性にも有意には影響しない保存的ア
ミノ酸置換のような微少な性質の変化である(表1を参照のこと)。
表1。保存的アミノ酸置換。 機能に必須である本発明のFGF-13タンバク質中のアミノ酸は、部位特異的変異
誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような当該分野において公知の方法
によって同定され得る(CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085(1989))
。後者の手順は、単一アラニン変異を分子中の全ての残基に導入する。次いで、
その結果生じる変異体分子は、受容体結合またはインビトロもしくはインビボ増
殖活性のような生物学的活性について試験される。
特に興味深いのは、より少ない凝集のような高度に所望される改善された特徴
を有するタンパク質をもたらし得る、荷電アミノ酸の他の荷電アミノ酸または中
性アミノ酸での置換である。凝集は活性を減少させるだけでなく、医学処方物を
調製する場合に問題となり得る。なぜなら凝集物は免疫原性であり得るからであ
る(Pirlckardら,Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbinsら,Diabete
s
36:838-845(1987);Clelandら,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems
10:307-377(1993))。
アミノ酸の置換はまた、リガンドの細胞表面受容体への結合の選択性を変化さ
せ得る。例えば、Ostadeら,Nature 361:266-268(1993)は、2つの既知の型のTN
F受容体のうちの一方のみへのTNF-αの選択的結合を生じる個々の変異を記載し
ている。リガンド−受容体結合のために重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴
または光親和性標識のような構造解析によって決定され得る(Smithら,J.Mol.
Biol.224:899-904(1992)およびde Vosら,Science 255:306-312(1992))。
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは
実質的に精製されている。組換え生産型のFGF-13ポリペプチドは、SmithおよびJ
ohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載の1工程法によって実質的に精製され得る
。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野において周知の方法にお
いて本発明の抗FGF-13抗体を使用して、天然供給源または組換え供給源から精製
され得る。
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離され
たFGF-13ポリペプチドを提供する:(a)N末端メチオニンを除く配列番号2に
示す完全FGF-13ポリペプチドのアミノ酸配列(すなわち、配列番号2の-22位〜19
3位);(b)配列番号2におけるほぼ1位〜ほぼ193位の推定の成熟FGF-13ポリ
ペプチドのアミノ酸配列;(c)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによ
ってコードされる完全アミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドのアミノ酸配列
;および(d)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされ
るアミノ酸配列を有する成熟FGF-13ポリペプチドのアミノ酸配列。
本発明のさらなるポリペプチドとしては、上記のポリペプチドに対する少なく
と90%の類似性、より好ましくは少なくとも95%の類似性、なおより好ましくは
少なくとも96%、97%、98%または99%の類似性を有するポリペプチドが挙げら
れる。本発明のポリペプチドにはまた、寄託されたcDNAによってコードされるポ
リペプチドまたは配列番号2のポリペプチドと少なくと80%同一、より好ましく
は少なくとも90%または95%同一、なおより好ましくは少なくとも96%、97%、
98%または99%同一であるポリペプチドが含まれ、少なくとも30アミノ酸、より
好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するそのようなポリペプチドの部分もまた
含まれる。
2つのポリペプチドについての「%類似性」によって、Bestfitプログラム(W
isconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Compute
r Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)
および類似性決定用の不履行設定(default setting)を使用して2つのポリペ
プチドのアミノ酸配列を比較することによってもたらされる類似性スコアが意図
される。Bestfitは、2つの配列間の相同性の最良セグメントを見出すために、S
mithおよびWaterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489,1981)の
局所的相同性アルゴリズムを使用する。
FGF-13ポリペプチドの参照アミノ酸配列と少なくとも、例えば、95%,「同一
」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、ポリペプチド配列がFGF-
13ポリペプチドの参照アミノ酸配列の100アミノ酸当たり5つまでのアミノ酸変
化を含み得る以外、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることが
意図される。換言すると、参照アミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ
酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の5%
までが欠失され得るかもしくは別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列
中の全アミノ酸残基の5%までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。参
照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキ
シ末端位置、またはそれらの末端位置の間のどこかで、参照配列中の残基間で独
立してかまたは参照配列内の1つ以上の連続する群でかのいずれかで散在して生
じ得る。
実際問題とし、いずれかの特定のポリペプチドが配列番号2に示すアミノ酸配
列または寄託されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列と、例えば
、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかどうかは、
Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Uni
x,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive
,Maldison,WI
53711)のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され
得る。特定の配列が本発明による参照配列と、例えば、95%同一であるかどうか
を決定するためにBestfitまたはいずれかのその他のアラインメントプログラム
を使用する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の百分率が参照アミノ酸配
列の全長にわたって算出され、参照配列中のアミノ酸残基の総数の5%までの相
同性におけるギャップが許容されるように設定される。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を使用するSDS-PAGEゲルまたは
分子ふるいゲル濾過カラムでの分子量マーカーとして使用され得る。
以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル
およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得、これらは下記のような
FGF-13タンパク質発現検出用アッセイにおいてまたはFGF-13タンパク質機能を増
強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さら
に、そのようなポリペプチドは、これもまた本発明による候補アゴニストおよび
アンタゴニストであるFGF-13タンパク質結合タンパク質を「捕獲」するために酵
母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母ツーハイブリッドシス
テムは、FieldsおよびSong,Nature 340:245-246(1989)に記載されている。
エピトープ保有部分
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を誘起する
タンパク質の部分として定義される。他方、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピト
ープの数は、一般に抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Geysenら,Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと。
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド(すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含むペプチドまたはポリペプチド)の選択に
関しては、タンパク質配列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドが、慣習的
に、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘起し得ることが、当該
分野において周知である。例えば、Sutcliffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green
,N.およびLearner,R.A.(1983)「タンパク質上の予め決定された部位と反応
する抗体」Science,219:660-666を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘起し
得るペプチドは、タンパク質の一次配列において頻繁に表され、一組の単純な化
学的規則によって特徴付けられ得、インタクトなタンパク質の免疫優勢領域(す
なわち、免疫原性エピトープ)にもアミノ末端もしくはカルボキシ末端にも制限
されない。それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチ
ドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体(モノクローナル抗体を含
む)を惹起するために有用である。例えば、Wilsonら,Cell 37:767-778(1984)
の777頁を参照のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも7つ、より好まし
くは少なくとも9つ、最も好ましくは約15と約30との間のアミノ酸の配列を含む
。FGF-13特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペ
プチドの非限定的な例としては以下が挙げられる:ほぼGln22〜ほぼAsn32、ほぼ
Asn34〜ほぼMet43、ほぼGln46〜ほぼTyr55、ほぼSer59〜ほぼVal66、ほぼVal68
〜ほぼPhe83、ほぼVa188〜ほぼGlu105、ほぼMet110〜ほぼVal128、ほぼPhe153〜
ほぼHis173、ほぼLeu178〜ほぼGln182、ほぼPhe185〜ほぼGln194、およびほぼVa
l198〜Gln213の配列番号2におけるアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらの
ポリペプチドフラグメントは、上記図3に示すように、Jameson-Wolf抗原性指数
の解析によってFGF-13タンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定され
ている。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、いずれかの従来の手
段によって産生され得る。例えば、Floughten,R.A.(1985)「多数のペプチドの
迅速な固相合成用の一般的な方法:個々のアミノ酸のレベルでの抗原−抗体相互
作用の特異性」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135を参照のこと;この
「同
時複数ペプチド合成(SMPS)」プロセスは、Houghtenらの米国特許第4,631,211
号(1986)にさらに記載されている。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野において周
知の方法に従って抗体を誘発するために使用される。例えば、Sutcliffeら(前出
);Wilsonら(前出);Chow,M.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914
;およびBittle,F.J.ら,J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)を参照のこと
。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド(すなわち、タンパク質全体が免疫
原である場合に抗体応答を誘起するタンパク質の部分)は、当該分野において公
知の方法に従って同定される。例えば、Geysenら(前出)を参照のこと。さらに
、Geysenの米国特許第5,194,392号(1990)は、目的の抗体の特定のパラトープ
(抗原結合部位)に相補性であるエピトープのトポロジー的等価物(すなわち、
「ミモトープ」)である単量体(アミノ酸またはその他の化合物)の配列の検出
または決定の一般的な方法を記載している。より一般的には、Geysenの米国特許
第4,433,092号(1989)は、目的の特定の受容体のリガンド結合部位に相補性で
あるリガンドの地勢的(topographical)等価物である単量体の配列の検出また
は決定の方法を記載する。同様に、過アルキル化オリゴペプチド混合物に関する
Houghten,R.A.らの米国特許第5,480,971号(1996)は、直鎖状C1〜C7アルキル
過アルキル化オリゴペプチドならびにそのようなペプチドの組およびライブラリ
ー、ならびに目的のアクセプター分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペ
プチドの配列を決定するためのそのようなオリゴペプチドの組およびライブラリ
ーの使用方法を開示している。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペ
プチドアナログもまた、これらの方法によって慣習的に作製され得る。
融合タンパク質
当業者によって理解されるように、本発明のFGF-13ポリペプチドおよび上記の
そのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの
部分と合せられ、その結果キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパ
ク質は精製を容易にし、増大したインビボにおける半減期を示す。これは、例え
ば、
ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの
重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について
示されている(EP A 394,827;Trauneckerら,Nature 331:84-86(1988))。IgG
部分に起因するジスルフィド結合された二量体構造を有する融合タンパク質はま
た、単量体FGF-13タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分
子の結合および中和においてより効率的であり得る(Fountoulakisら,J.Bioch
em.270:3958-3964(1995))。
抗体
本発明において使用するためのFGF-13タンパク質特異的抗体は、インタクトな
FGF-13タンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対しで惹起され
得、これはアルブミンのような担体タンパク質とともに動物系(ウサギまたはマ
ウスのような)に、または十分長い場合は(少なくとも約25アミノ酸)担体なし
で提示され得る。
本明細書中で使用する場合、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体
」(Mab)は、FGF-13タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子ならび
に抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab')2フラグメントのような)を含む
ように意味される。FabおよびF(ab')2フラグメントはインタクトな抗体のFcフラ
グメントを欠き、循環からより迅速に浄化され、インタクトな抗体の非特異的組
織結合をより少なく有し得る(Wahlら,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。従
って、これらのフラグメントは好ましい。
本発明の抗体は種々の方法のいずれかによって調製され得る。例えば、ポリク
ローナル抗体を含有する血清の産生を誘発するために、FGF-13タンパク質または
その抗原性フラグメントを発現する細胞が動物に投与され得る。好ましい方法に
おいて、FGF-13タンパク質の調製物は、天然の混入物を実質的に含まなくするよ
うに調製および精製される。次いで、そのような調製物は、より高い比活性のポ
リクローナル抗血清を産生するために、動物中に導入される。
最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体(またはその
FGF-13タンパク質結合フラグメント)である。そのようなモノクローナル抗体は
、
(1976);Hammerlingら:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevie
r,N.Y.,(1981)563-681頁)。一般に、そのような手順は、動物(好ましくは
マウス)をFGF-13タンパク質抗原で、またはより好ましくはFGF-13タンパク質発
現細胞で免疫する工程を包含する。適切な細胞は、抗FGF-13タンパク質抗体に結
合する能力によって認識され得る。そのような細胞は、いずれかの適切な組織培
養培地中で培養され得る;しかし、10%ウシ胎児血清(約56℃で不活化)を補充
し、約10g/lの非必須アミノ酸、約1,000U/mlのペニシリンおよび約100μg/mlの
ストレプトマイシンを補充したアール改変イーグル培地中で細胞を培養すること
が好ましい。そのようなマウスの脾細胞は抽出され、適切なミエローマ細胞株と
融合される。いずれかのミエローマ細胞株は本発明に従って用いられ得る;しか
し、American Type Culture Collection,Rockville,Marylandから入手可能で
ある親ミエローマ細胞株(SP20)を用いることが好ましい。Wandsら(Gastroent
erology 80:225-232(1981))によって記載されるように、融合後、得られるハイ
ブリドーマ細胞はHAT培地中で選択的に維持され、次いで限界希釈によってクロ
ーン化される。そのような選択を通して得られたハイブリドーマ細胞は、次いで
FGF-13タンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにア
ッセイされる。
あるいは、FGF-13タンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディオタ
イプ抗体の使用を介する2工程手順で産生され得る。そのような方法は、抗体は
それ自体が抗原であり、それゆえ第2の抗体に結合する抗体を得ることが可能で
あるという事実を利用する。この方法に従って、FGF-13タンパク質特異的抗体は
、動物、好ましくはマウスを免疫するために使用される。次いで、そのような動
物の脾細胞は、ハイブリドーマ細胞を生成するために使用され、ハイブリドーマ
細胞は、FGF-13タンパク質特異的抗体に結合するその能力がFGF-13タンパク質抗
原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリー
ニ
ングされる。そのような抗体としては、FGF-13タンパク質特異的抗体に対する抗
イディオタイプ抗体が挙げられ、動物を免疫してさらなるFGF-13タンパク質特異
的抗体を誘発するために使用され得る。
本発明の抗体のFabおよびF(ab')2およびその他のフラグメントが本明細書中に
開示する方法に従って使用され得ることは理解される。そのようなフラグメント
は、代表的には、パパイン(Fabフラグメントを生成するために)またはペプシ
ン(F(ab')2フラグメントを生成するために)のような酵素を使用して、タンパク
質分解的切断によって生成される。あるいは、FGF-13タンパク質結合フラグメン
トは、組換えDNA技術の適用または合成化学を通して生成され得る。
ヒトにおける抗FGF-13のインビボ使用については、「ヒト化」キメラモノクロー
ナル抗体を使用することが好ましくあり得る。そのような抗体は、上記のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用して
産生され得る。キメラ抗体の産生用の方法は当該分野において公知である。総説
については、Morrison,Science 229:1202(1985);Oiら,BioTechniques 4:21
4(1986);Cabilyら,米国特許第4,816,567号;Taniguchiら,EP 171496;Morri
sonら,EP 173494;Neubergerら,WO 8601533;Robinsonら,WO 8702671;Bouli
anneら,Nature 312:643(1984);Neubergerら,Nature 314:268(1985)を参照
のこと。
FGF-13関連障害
診断
本発明はまた、本発明の遺伝子の、本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列中の変異の存在に関連する疾患またはその疾患に対する罹患性の検出用の診断
アッセイの一部としての使用に関する。
本発明の遺伝子中に変異を有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検
出され得る。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料のよう
な患者の細胞から取得され得る。ゲノムDNAは、検出用に直接的に使用され得る
かまたは分析前にPCR(Saikiら,Nature,324:163-166(1986))を使用すること
によって酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的のために使用
され得る。
例として、本発明のポリペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーは
、変異を同定および解析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、
正常な遺伝子型に比較しての増幅産物の大きさの変化によって検出され得る。点
変異は、増幅されたDNAを放射能標識されたRNAあるいは放射能標識されたアンチ
センスDNA配列にハイブリダイズさせることによって同定され得る。完全にマッ
チした配列は、RNaseA消化によって、または融解温度の差異によって、ミスマッ
チした二重鎖から区別され得る。
DNA配列の差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル中
でのDNAフラグメントの電気泳動移動度の変化の検出によって達成され得る。小
さな配列の欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動によって可視化され得る。
異なる配列のDNAフラグメントは、異なるDNAフラグメントの移動度がそれらの特
異的な融解温度または部分融解温度に従って異なる位置でゲル中で遅延される変
性ホルムアミド勾配ゲル上で区別され得る(例えば、Myersら,Science,230:124
2(1985)を参照のこと)。
特定の位置での配列変化はまた、RNaseおよびS1保護のようなヌクレアーゼ保
護アッセイまたは化学的切断法によって明らかにされ得る(例えば、Cottonら,P
NAS,USA,85;:4397-4401(1985))。
従って、特異的DNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学
的切断、直接DNA配列決定または制限酵素の使用(例えば、制限断片長多型(RFLP)
)およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。
より従来的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまたインサイ
チュ分析によって検出され得る。
本発明はまた、種々の組織におけるFGF-13タンパク質のレベルの変化を検出す
るための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織試料に比較し
てのタンパク質の過剰発現は、異常な細胞増殖(例えば、腫瘍)の存在を検出し
得るからである。宿主に由来する試料中のタンパク質のレベルを検出するために
使用されるアッセイは当業者に周知であり、これにはラジオイムノアッセイ、競
合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイおよび「サンドイ
ッ
チ」アッセイが含まれる。ELISAアッセイ(Coliganら,Current Protocols in I
mmunology,1(2),第6章,(1991))は、最初に本発明のポリペプチドに対する
抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包含する
。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調製される。レポータ
ー抗体には、放射能、蛍光、またはこの例では西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素
のような検出可能な試薬が付着される。試料は宿主から取り出され、試料中のタ
ンパク質を結合する固体支持体(例えば、ポリスチレンディッシュ)上でインキ
ュベートされる。次いで、ディッシュ上のいずれもの遊離タンパク質結合部位は
、ウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質とともにインキュベートする
ことによって覆われる。次に、モノクローナル抗体はディッシュ中でインキユベ
ートされ、その間にモノクローナル抗体はポリスチレンディッシュに付着された
本発明のいずれものポリペプチドに付着する。全ての非結合モノクローナル抗体
は、緩衝液で洗い流される。ここで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された
レポーター抗体がディッシュに入れられ、その結果、目的のタンパク質に結合し
たいずれものモノクローナル抗体へのレポーターの結合が生じる。
次いで、付着していないレポーター抗体は洗い流される。次いで、ペルオキシ
ダーゼの基質がディッシュに添加され、所定の期間中の発色の量が、標準曲線に
比較した場合の所定の容量の患者試料中に存在する本発明のポリペプチドの量の
測定値である。
本発明のポリペプチドに特異的な抗体が固体支持体に付着され、標識されたFG
F-13および宿主に由来する試料が固体支持体上を通過させられ、例えば、液体シ
ンチレーションクロマトグラフィーによって検出される標識の量が、試料中の本
発明のポリペプチドの量に相関され得る競合アッセイが用いられ得る。
「サンドイッチ」アッセイはELISAアッセイに類似している。「サンドイッチ
」アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは固体支持体上を通過されられ、固
体支持体に付着された抗体に結合する。次いで、第2に抗体が目的のポリペプチ
ドに結合させられる。次いで、標識されそして第2の抗体に特異的な第3の抗体
が固体支持体上を通過させられ、第2の抗体に結合し、次いで、量が定量され得
る。
本発明者らは、FGF-13がガン性卵巣組織ならびに胎児腎臓および胎児脳組織に
おいて発現されることを見出した。従って、哺乳動物中のこれらの組織ならびに
その他のガン性組織のガンは、対応する「標準」レベルに比較した場合、有意に
増強されたレベルのFGF-13タンパク質およびFGF-13タンパク質をコードするmRNA
を発現し得る。さらに、増強されたレベルのFGF-13タンパク質は、ガンを有しな
い同じ種の哺乳動物由来の血清に比較した場合、そのようなガンを有する哺乳動
物由来の個々の体液(例えば、血清、血漿、尿および脊髄液)において検出され
得る。従って、本発明は、FGF-13発現が関与する障害(ガンを含む)の診断の間
に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の卵巣、腎臓もしくは神経系
組織またはその他の細胞もしくは体液におけるFGF-13タンパク質をコードする遺
伝子の発現レベルを測定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをその組
織、細胞または液体における標準的FGF-13遺伝子発現レベルと比較する工程を包
含し、それによれば、標準に比較しての遺伝子発現レベルの増大または減少はFG
F-13発現に関連する障害の指標である。
卵巣、腎臓または神経系における障害の診断(腫瘍の診断を含む)が従来法に
従って行われている場合、本発明は予後の指標として有用であり、それによれば
、増強または減少したFGF-13遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレ
ベルで遺伝子を発現する患者に比較してより悪い臨床的結果を経験する。
「FGF-13タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルのアッセイ」によって、
直接的(例えば、絶対タンパク質レベルまたはmRNAレベルを測定または評価する
ことによる)または間接的(例えば、第2の生物学的試料におけるFGF-13タンパ
ク質レベルまたはmRNAレベルに比較することによる)のいずれかで、第1の生物
学的試料におけるFGF-13タンパク質のレベルまたはFGF-13タンパク質をコードす
るmRNAのレベルを、定性的または定量的に測定または評価することが意図される
。好ましくは、第1の生物学的試料におけるFGF-13タンパク質レベルまたはmRNA
レベルは測定または評価され、標準的なFGF-13タンパク質レベルまたはmRNAレベ
ルに比較され、標準は、障害を有しない個体から得られた第2の生物学的試料か
ら取られるか、またはFGF-13発現に関連する障害を有しない個体の集団由来のレ
ベ
ルを平均することによって決定される。当該分野において理解されるように、一
旦、標準FGF-13タンパク質レベルまたはmRNAレベルが既知となれば、それは比較
のための標準として反復して使用され得る。
「生物学的試料」によって、FGF-13タンパク質またはmRNAを含む個体、体液、
細胞株、組織培養物またはその他の供給源から得られるいずれかの生物学的試料
が意図される。示したように、生物学的試料としては、遊離のFGF-13タンパク質
を含む体液(血清、血漿、尿、滑液および脊髄液のような)、卵巣または腎臓系
、および完全もしくは成熟FGF-13ポリペプチドまたはFGF-13受容体を発現するこ
とが見出されるその他の供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液
を得るための方法は当該分野において周知である。生物学的試料がmRNAを含むで
きである場合、組織生検が好ましい供給源である。
全細胞RNAは、ChomczynskiおよびSacchi,Anal.Biochem.162:156-159(1987
)に記載の1工程グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法
のようないずれかの適切な技術を使用して生物学的試料から単離され得る。次い
で、FGF-13タンパク質をコードするmRNAのレベルは、いずれかの適切な方法を使
用してアッセイされる。この方法としては、ノーザンブロット分析、S1ヌクレア
ーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリメラーゼ連鎖反応との組
み合わせの逆転写(RT-PCR)およびリガーゼ連鎖反応(RT-LCR)との組み合わせ
の逆転写が挙げられる。
生物学的サンプルにおけるFGF-13タンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づ
く技術を使用して行われ得る。例えば、組織におけるFGF-13タンパク質発現は、
従来の免疫組織学的方法を用いて研究され得る(Jalkanen,M,ら,J.Cell.Bi
ol.101:976-985(1985);Jalkanen,M,ら,J.Cell.Biol.105:3087-3096(198
7))。FGF-13タンパク質遺伝子発現を検出するために有用なその他の抗体に基づ
く方法としては、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)およ
びラジオイムノアッセイ(RIA)のようなイムノアッセイが挙げられる。適切な
抗体アッセイ標識は当該分野において公知であり、これにはグルコースオキシダ
ーゼのような酵素、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、イオウ(35S)、トリ
チウム(3H)、
インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc)のような放射性同位元素、フ
ルオロセインおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる
。
個体から得られた生物学的試料におけるFGF-13タンパク質レベルのアッセイに
加えて、FGF-13タンパク質はまた、イメージングによってインビボにおいて検出
され得る。FGF-13タンパク質のインビボイメージング用の抗体標識またはマーカ
ーとしては、X線撮影、NMRまたはESRによって検出されるものが挙げられる。X
線撮影については、適切な標識としては、バリウムまたはセシウムのような放射
性同位元素が挙げられ、これらは検出可能な放射を発するが、明白には対象に有
害ではない。NMRおよびESR用の適切なマーカーとしては、ジューテリウムのよう
な、検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられ、これは関連するハイブ
リドーマ用の栄養素の標識によって抗体中に取り込まれ得る。
放射性同位元素(例えば、131I、112In、99mTc)、放射線不透過性物質、また
は核磁気共鳴によって検出可能な材料のような適切な検出可能なイメージング部
分で標識されたFGF-13タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫系
障害について検査されるべき哺乳動物中に導入される(例えば、非経口、皮下ま
たは腹腔内で)。対象の大きさおよび使用されるイメージングシステムによって
診断画像をもたらすために必要とされるイメージング部分の量が決定されること
は当該分野において理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象について
は、注射される放射能の量は、通常約5〜20ミリキューリーの99mTcの範囲であ
る。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、FGF-13タンパク質を含
む細胞の位置で優先的に蓄積される。インビボ腫瘍イメージングは、S.W.Burc
hielら,「放射能標識された抗体およびそのフラグメントの免疫薬物動態学」(
第13章,Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.Burch
ielおよびB.A.Rhodes,編,Masson Publishing Inc.(1982))に記載されてい
る。
処置
本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、血
栓症、細動脈硬化症およびその他の心臓血管症状のような種々の疾患状態に起因
する虚血性組織の血管再生を刺激するための処置において用いられ得る。これら
のペプチドはまた、脈管形成および肢再生を刺激するために用いられ得る。
このポリペプチドはまた、損傷、熱傷、術後組織修復および潰瘍に起因する創
傷を処置するために用いられ得る。なぜなら、それらは線維芽細胞および平滑筋
細胞のような異なる起源の種々の細胞に対してマイトジェン性であり、それゆえ
損傷または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
本発明のポリペプチドはまた、ニューロン成長を刺激するために、ならびに発
作に関連し、アルツハイマー病、パーキンソン病およびAIDS関連症候群のような
特定のニューロン障害または神経変性症状において生じるニューロン損傷を処置
および予防するために用いられ得る。FGF-13はインビトロにおいて生存するドー
パミン作動性ニューロンの数を増加させ、このことはFGF-13がパーキンソン病患
者に利益を与え得ることを示す。FGF-13は、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し
、それゆえ骨および歯周の再生を増強し、組織移植物または骨移植片を補助する
ために用いられ得る。
本発明のポリペプチドはまた、角質細胞増殖を刺激することによって日焼けに
起因する皮膚老化を予防するために用いられ得る。
FGF-13ポリペプチドはまた毛髪損失の予防用に使用され得る。なぜなら、FGF
ファミリーメンバーは毛髪形成細胞を活性化し、メラノサイト増殖を促進するか
らである。同じ線に沿って、本発明のポリペプチドは、他のサイトカインと組み
合わせて使用される場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激する
ために用いられ得る。
FGF-13ポリペプチドはまた、移植前に器官を維持するために、または初代組織
の細胞培養物を支持するために用いられ得る。
本発明のポリペプチドはまた、初期胚において中胚葉の組織が分化するように
誘導するために用いられ得る。
本発明のなおさらなる態様によれば、そのようなポリペプチドまたはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合成、DNA
ベクターの製造に関するインビトロ目的のために、およびヒト疾患の処置用の診
断薬および治療薬を提供する目的のために利用するためのプロセスが提供される
。
本発明は、本発明のポリペプチドに対する受容体の同定のための方法を提供す
る。受容体をコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法、例えば、リガン
ドパンニングおよびFACSソーティング(Coliganら,Current Protocols in Immun
.,1(2),第5章,(1991))、によって同定され得る。好ましくは、発現クローニ
ングが用いられる。ここで、ポリアデニル化されたRNAはポリペプチドに応答性
の細胞(例えば、NIH3T3細胞(FGFファミリータンパク質に対する複数の受容体を
含むことが知られている)およびSC-3細胞)から調製され、このRNAから作製され
たcDNAライブラリーはプールに分割され、COS細胞またはこのポリペプチドに応
答性でないその他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラススラ
イド上で増殖させられるトランスフェクトされた細胞は、それらが標識された後
に本発明のポリペプチドに曝露される。ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特
異的タンパク質キナーゼの認識部位を含めることを含む種々の手段によって標識
され得る。
固定およびインキュベーションの後、スライドはオートラジオグラフィー分析
に供される。陽性プールが同定され、サブプールが調製され、再トランスフェク
トされ、反復するサブプール化および再スクリーニングプロセスを使用して、最
終的に推定の受容体をコードする単一クローンが得られる。
受容体同定のための別のアプローチとして、標識されたポリペプチドは、受容
体分子を発現する細胞の膜または抽出物の調製物と光親和性結合され得る。架橋
された材料はPAGE分析によって分離され、X線フィルムに曝露される。ポリペプ
チドの受容体を含む標識された複合体は、切り出され、ペプチドフラグメントに
分離され、タンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列決定から得られたア
ミノ酸配列は、cDNAライブラリーをスクリーニングして、推定の受容体をコード
する遺伝子を同定するための1組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する
ために使用される。
FGF-13を結合する既知のFGF特異的受容体の特定のクラスを同定するためのさ
らなるアプローチとして、組換えヒトFGF-13タンパク質を、個々のFGF受容体を
発現するように操作されたBaF3細胞株に対するマイトジェン活性についてアッセ
イし
た(Ornitzら,J.Biol.Chem.,271:15292-15297(1996))。これらの実験は、F
GF-13が優先的にFGF受容体3cおよび4を活性化し、FGF受容体1cおよび2cに対する
いくらかの活性を有することを実証する。図13を参照のこと。いずれのFGF受容
体の「b」スプライス改変体に対しても活性は検出されなかった。全体に、これ
はFGF-8の受容体特異性パターンに類似する受容体特異性パターンである。しか
し、組換えFGF-13の全体の活性はその他のFGFの活性よりかなり低く、このこと
は、試験したこの組換えタンパク質の特定の調製物が完全には活性ではなかった
ことを示唆する。
処方物
FGF-13ポリペプチド組成物はグッドメディカルプラクティスに一致した様式で
、個々の患者の臨床的状態(特にFGF-13ポリペプチド単独での処置の副作用)、FG
F-13ポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業
医に知られているその他の因子を考慮して、処方および投薬される。本明細書に
おける目的のためのFGF-13ポリペプチドの「有効量」はそのような考慮によって
このように決定される。
本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、非経口投与用の
医薬組成物を構成するために適切な医薬担体と組み合わせて用いられ得る。その
ような組成物は、治療有効量のポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
および医薬上許容される担体または賦形剤を含む。そのような担体としては、限
定するものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。処方物は投
与様式に適合するべきである。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の1つ以上の成分が充填された1つ以上の
容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製
造、使用または販売を規制する政府機関によって規定される書式の通知が、その
ような容器に付随し得、この通知はヒト投与用の製造、使用または販売の期間に
よる承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタ
ゴニストは、その他の治療的化合物とともに用いられ得る。
医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内または皮内
経路によるような便利な方法で投与され得る。医薬組成物は、特定の適応症の処
置および/または予防のために有効な量で投与される。一般に、医薬組成物は、
少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、大部分の場合1日当たり約8mg/Kg
体重を越えない量で投与される。大部分の場合、投薬量は、投与経路、症状など
を考慮1して、1日約10μg/kg〜約1mg/kg体重である。局所投与の特定の場合
には、投薬量は好ましくは、1cm2当たり約0.1μg〜約9mgで投与される。
本発明のポリペプチドならびにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴ
ニスト化合物はまた、本発明に従って、そのようなポリペプチドの発現によりイ
ンビボにおいて用いられ、これはしばしば「遺伝子治療」といわれる。
従って、例えば、細胞はエクスビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いて操作され得、次いで、操作された細胞はポリペプ
チドで処置されるべき患者に提供される。そのような方法は当該分野において主
知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレト
ロウイルス粒子の使用によって、当該分野において公知の手順により操作され得
る。
同様に、細胞は、例えば、当該分野において公知の手順によって、インビボに
おけるポリペプチドの発現のためにインビボにおいて操作され得る。当該分野に
おいて公知であるように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロ
ウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボにおける細胞の操作および
インビボにおけるポリペプチドの発現のために、患者に投与され得る。そのよう
な方法による本発明のポリペプチドの投与のためのこれらおよびその他の方法は
、本発明の教示から当業者にとって明らかとなるはずである。例えば、細胞を操
作するための発現ビヒクルは、適切な送達ビヒクルと合した後にインビボにおい
て細胞を操作するために使用され得るレトロウイルス粒子以外(例えば、アデノ
ウイルス)であり得る。
本明細書中で上記したレトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレト
ロウイルスとしては、限定するものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス
、
脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫
ウイルス、鳥類白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳ガンウイルスが挙げら
れる。1つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニ
ーマウス白血病ウイルスに由来する。
ベクターは1つ以上のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーター
としては、限定するものではないが、レトロウイルスLTR;SV40プロモーター;
およびMillerら,Biotechniques,第7巻,第9号,980-990(1989)に記載のヒト
サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、またはいずれかのその他のプロモー
ター(例えば、真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター(限定
するものではないが、ヒストン、pol IIIおよびβアクチンプロモーターを含む
))が挙げられる。用いられ得るその他のプロモーターとしては、限定するもの
ではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモータ
ーおよびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターの
選択は本明細書中に含まれる教示から当業者にとって明らかとなる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下
にある。用いられ得る適切なプロモーターとしては、限定するものではないが、
アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター;ま
たはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのような異種プロモーター;呼吸
シンシチウムウイノレス(RSV)プロモーター;MMTプロモーター、メタロチオネ
インプロモーターのような誘導性プロモーター;熱ショックプロモーター;アルブ
ミンプロモーター;ApoAIプロモーター;ヒトグロビンプロモーター;単純ヘルペス
チミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター
;レトロウイルスLTR(本明細書中で上記した改変レトロウイルスLTRを含む);βア
クチンプロモーター;およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。プロ
モーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモータ
ーであり得る。
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して
、
産生細胞株を形成するために用いられる。トランスフェクトされ得るパッケージ
ング細胞の例としては、限定するものではないが、Miller,Human Gene Therapy
,第1巻,5-14頁(1990)(その全体が本明細書に参考として援用される)に記載の
、PE501、PA317、-2、-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、CRE、CRIP、GP+E-86
、GP+envAm12およびDAN細胞株が挙げられる。ベクターは、当該分野において公
知のいずれかの手段を介してパッケージング細胞株を形質導入し得る。そのよう
な方法としては、限定するものではないが、エレクトロポレーション、リポソー
ムの使用およびCaPO4沈殿が挙げられる。1つの代替法において、レトロウイル
スプラスミドベクターはリポソーム中に被包されるかまたは脂質に結合され、次
いで宿主に投与され得る。
産生細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイル
スベクター粒子を生成する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子は
、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するために
用いられ得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸
配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、限定するものではな
いが、胚幹細胞、胚ガン腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、角質細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が挙げられる。
アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子
本発明は、化合物をスクリーニングして、本発明のポリペプチドの作用を調節
する化合物を同定する方法を提供する。そのようなアッセイの例は、哺乳動物線
維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合物および[3H]
チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合する工程を包含する
。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物の非存在下で実施
され、化合物の存在下での線維芽細胞増殖の量に比較されて、各々の場合におけ
る3[H]チミジンの取込みを測定することによって、化合物が増殖を刺激するかど
うかが決定され得る。線維芽細胞増殖の量は、3[H]チミジンの取込みを測定する
液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定される。アゴニスト化合
物
およびアンタゴニスト化合物の両方は、この手順によって同定され得る。
別の方法において、本発明のポリペプチドに対する受容体を発現する哺乳動物
細胞または膜調製物は(以上およびOrnitzら(前出)に記載)、化合物の存在下
で、標識された本発明のポリペプチドとともにインキュベートされる。次いで、
化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力が測定され得る。あるいは
、スクリーニングされるべき化合物とFGF-13受容体との相互作用の後の既知の第
二メッセンジャー系の応答が測定され、化合物が受容体に結合し第二メッセンジ
ャー応答を誘起する能力が測定されて、化合物が潜在的なアゴニストまたはアン
タゴニストであるかどうかが決定される。そのような第二メッセンジャー系とし
ては、限定するものではないが、cAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル
またはホスホイノシチド加水分解が挙げられる。
アンタゴニスト化合物の例としては、本発明のポリペプチドに対する受容体に
結合するが第二メッセンジャー応答を誘起しないかまたはFGF-13ポリペプチド自
体に結合する抗体、またはいくつかの場合において、オリゴヌクレオチドが挙げ
られる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、受容体に結合するが、しかし第
二メッセンジャー応答は誘起されず、それゆえポリペプチドの作用が有効にブロ
ックされる、ポリペプチドの変異体形態であり得る。
FGF-13遺伝子および遺伝子産物に対する別のアンタゴニスト化合物は、アンチ
センス技術を使用して調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術
は、三重鎖形成またはアンチセンスDNAもしくはRNA(両方の方法は、ポリヌクレ
オチドのDNAまたはRNAへの結合に基づいている)を通して遺伝子発現を制御する
ために使用され得る。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列の5'コード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴ
ヌクレオチドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に
関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され(三重鎖−Leeら、Nucl.A
cids Res.,6:3073(1979);Cooneyら、Science,241:456(1988);およびDervan
ら、Science,251:1360(1991)を参照のこと)、それによって本発明のポリペプ
チドの転写および産生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、イ
ンビボ
においてmRNAにハイブリダイズし、mRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロック
する(アンチセンス−Okano,J.Neurochem.,56:560(1991);Oligodeoxynucleoti
de as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL
(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAがイン
ビボにおいて発現されて、ポリペプチドの産生を阻害し得るように細胞に送達さ
れ得る。
潜在的なアンタゴニスト化合物としてはまた、受容体の結合部位に結合してこ
れを占有し、それによって、正常な生物学的活性が防止されるように受容体をそ
のポリペプチドに接近不能にする小分子が挙げられる。小分子の例としては、限
定するものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられる。
アンタゴニスト化合物は、新形成性細胞および組織に対する本発明のポリペプ
チドの細胞成長および増殖効果(すなわち、腫瘍の脈管形成の刺激)を阻害し、
それゆえ、例えば腫瘍の形成または増殖における異常な細胞の成長および増殖を
遅延または防止するために用いられ得る。
アンタゴニストはまた、血管過多性疾患を防止するために、そして関節包外白
内障手術後の上皮水晶体細胞の増殖を防止するために用いられ得る。本発明のポ
リペプチドのマイトジェン活性の防止はまた、バルーン血管形成術後の再狭窄の
ような場合において所望され得る。
アンタゴニストはまた、創傷治癒の間の瘢痕組織の成長を防止するために用い
られ得る。
染色体アッセイ
染色体マッピングに関する特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開
示するcDNAは、FGF-13遺伝子のゲノムDNAをクローン化するために使用される。
これは種々の周知の技術およびライブラリー(一般に、市販されている)を使用
して達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、インサイチュ染色体マッピング用に
、この目的のために周知の技術を使用して用いられる。それゆえ、本発明の核酸
分子はまた、染色体同定のために役立つ。配列は、個々のヒト染色体上の特定の
位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。さらに、染色
体上
の特定の部位を同定することの現在の必要性が存在する。実際の配列データ(反
復多型性)に基づく少しの染色体標識試薬(chromosome marking reagent)しか
、現在、染色***置の標識用に利用可能でない。本発明による、DNAの染色体へ
のマッピングは、これらの配列を、疾患に関連する遺伝子に相関させることにお
ける重要な最初の段階である。
簡潔には、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を調製す
ることによって、染色体にマップされ得る。3'非翻訳領域のコンピューター解析
が、ゲノムDNAにおいて1つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセ
スを複雑にしないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これ
らのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリー
ニング用に使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドの
みが、増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当て
るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに本発明
を使用して、詳細な局在化(sublocalization)が、特定の染色体由来のフラグメ
ントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて類似の方法で達成さ
れ得る。染色体へマップするために同様に使用され得るその他のマッピングスト
ラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フロー分取染色
体を用いる事前スクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによる事前選択が挙げられる。
cDNAクローンの中期染色体展開物に対する蛍光インサイチュハイブリダイゼー
ション(「FISH」)は、1工程で正確な染色***置を提供するために使用され得
る。この技術は、50または60塩基ほど短いcDNAとともに使用され得る。この技術
の総説については、Vermaら,Human Chromosomes:a Manual of Basic Technique
s,Pergamon Press,New York(1988)を参照のこと。
一旦、配列が正確な染色***置にマップされると、染色体上の配列の物理的位
置は、遺伝子地図データと相関され得る。(そのようなデータは、例えば、V.Mc
Kusick,Mendelian Inheritance In Man(Johns Hopkins University Welch Med
ical Library
を通じてオンラインで利用可能である)において見出される)。次いで、遺伝子
と、同じ染色体領域にマップされている疾患との間の関係は、連鎖解析(物理的
に隣接する遺伝子の同時遺伝)を通して同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列における差異を決
定することが必要である。変異が、いくらかのまたは全ての罹患個体においては
観察されるが、いずれの正常個体においても観察されない場合、変異は、疾患の
作因でありそうである。
物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関
連する染色体領域に正確に局在化されるcDNAは、50と500との間の潜在的な原因
遺伝子の1つであり得る。(これは、1メガベースのマッピング解像度および20
kb当たり1つの遺伝子を仮定している)。
上記の方法を使用して、本発明のFGF-13遺伝子は、蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーションによってヒト染色体8p21にマップされた。マウスにおける対応す
るマップ位置は、ds(組織崩壊−発達崩壊)およびwc(波状外被−ホモ接合型致
死性)を含むいくつかの疾患遺伝子座を含む。
本発明を一般的に記載したが、同じことは以下の実施例(例示のために提供さ
れ、限定としては意図されるものではない)を参照してより容易に理解される。
実施例
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される;しかし、本発明はその
ような実施例に限定されないことが理解されるべきである。明記しない限り、全
ての部または量は重量による。
以下の実施例の理解を容易にするために、個々の頻繁に出現する方法および/
または用語を説明する。
「プラスミド」は、小文字p、それに先行するおよび/または後に続く大文字
および/または数字によって命名される。本明細書における出発プラスミドは、
市販されているか、無制限に公に利用可能であるか、または利用可能なプラスミ
ドから公開されている手順に従って構築され得るかのいずれかである。さらに、
記載するプラスミドと等価なプラスミドは当該分野において公知であり、当業者
にとって明らかとなる。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列においてのみ作用する制限酵素でのDNA
の触媒的切断をいう。本明細書中で使用する種々の制限酵素は市販されており、
それらの反応条件、補因子およびその他の要求を、当業者に公知であるように使
用した。分析目的用には、代表的には1μgのプラスミドまたはDNAフラグメント
を、約20μlの緩衝溶液中で約2単位の酵素とともに使用する。プラスミド構築
用にDNAフラグメントを単離する目的のためには、代表的には5〜50μgのDNAを
、より多くの容量中で20〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素のために
適切な緩衝液および基質量は、製造者によって明記されている。37℃での約1時
間のインキュベーション時間を通常は使用するが、これは供給者の説明書に従っ
て変動し得る。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して、
所望のフラグメントを単離する。
切断したフラグメントのサイズ分離を、Goeddel,D.ら,Nucleic Acids Res.
,8:4057(1980)によって記載される8%ポリアクリルアミドゲルを使用して実施
する。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成し得る一本鎖ポリデオキシヌクレオ
チドまたは2つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸を有しておらず、従ってキナーゼの存在
下でATPを用いてリン酸を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結されな
い。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントに連結され
る。
「連結」は、2つの二本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形
成するプロセスをいう(Maniatis,T.ら,同上,146頁)。他に提供しない限り
、連結は公知の緩衝液および、ほぼ当モル量の連結されるべきDNAフラグメント0
.5μg当たり10単位のT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)の条件を使用して達成され
得る。
記述しない限り、形質転換をGraham,F.およびVan der Eb,A.,Virology,52
:426-457(1973)の方法によって記載されるように実施した。
実施例1(a):E.coliにおける「Hisタグ付き」FGF-13の発現および精製
FGF-13ATCC#97148をコードするDNA配列を、配列番号2の2位〜193位のアミノ
酸配列を有するポリペプチドの5'配列および遺伝子の3'側のベクター配列に対応
するFCRオリゴヌクレオチドを使用して最初に増幅した。遺伝子に対応するさら
なるヌクレオチドを、それぞれ5'および3'配列に付加した。5'オリゴヌクレオチ
ドプライマ-5'GCCAGACCATGGAGAATCACCCGTCTCCTAAT3'(配列番号11)はNco制限酵
素部位を含む。3'配列5'GATTTAAGATCTCGTGAGGGGCTGGGGCCG3'(配列番号12)はBglI
I部位に相補的な配列を含み、それにはFGF-13コード配列の18ヌクレオチドが続
く。
制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-60(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA9131
1)上の制限酵素部位に対応する。pQE-60は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌複製起
点(ori)、IPTG調節可能プロモーターオペレータ一(P/O)、リボソーム結合部位(R
BS)、6-Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-60をNcoIおよび
BglIIで消化した。増幅した配列をpQE-60中に連結し、ヒスチジンタグおよびリ
ボソーム結合部位(RBS)をコードする配列とインフレームで挿入した。次いで
、連結混合物を使用してE.coli M13/rep4株(Qiagen,Inc.)を、Sambrook,J.ら
,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,(1
989)に記載の手順によって形質転換した。M15/rep4は多コピーのプラスミドpREP
4を含み、これは1acIリプレッサーを発現し、またカナマイシン耐性(Kanr)を
与える。トランスフォーマントをLBプレート上で増殖する能力によって同定し、
アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離し
、制限分析によって確認した。
所望の構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の
両方を補充したLB培地中の液体培養で一晩(O/N)増殖させる。O/N培養物を使用し
て大量培養物を1:100〜1:250の比率で接種する。細胞を0.4と0.6との間の光学密
度600(O.D.600)まで増殖させる。次いで、IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガ
ラクトピラノシド」)を1mMの最終濃度に添加する。IPTGは1acIリプレッサーを
不活化し、P/Oを解除して、増大した遺伝子発現を導くことによって誘導する。
細胞
をさらに3〜4時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離によって収集する。細
胞ペレットをカオトロピック剤6MグアニジンHCl中で可溶化する。清澄化後、可
溶性FGF-13を、6-Hisタグを含むタンパク質による堅固な結合を可能にする条件
下でのニッケル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによってこの溶液か
ら精製する(Hochuli,E.ら,J.Chromatography 411:177-184(1984))。タン
パク質をカラムから6MグアニジンHCl(pH5.0)中で溶出し、再生の目的のために3M
グアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン(還元)および2mM
グルタチオン(酸化)に調整する。この溶液中での12時間のインキュベーション
の後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。
実施例1(b):E.coliにおけるFGF-13の発現および精製
細菌発現ベクターpQE70をこの実施例における細菌発現用に使用する(QIAGEN,I
nc.,9259 Eton Avenue,Chatworth,CA,91311)。pQE70は、アンピシリン抗生
物質耐性(Ampr)をコードし、細菌複製起点(「ori」)、IPTG誘導性プロモー
ター、リボソーム結合部位(「RBS」)、QIAGEN,Inc.(前出)によって販売さ
れるニッケル-ニトリロ-トリ-酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂を使用す
るアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする6つのコドン、
および適切な単一制限酵素切断部位を含む。これらの要素は、ポリペプチドをコ
ードするDNAフラグメントが、そのポリペプチドのカルボキシ末端に共有結合さ
れた6つのHis残基(すなわち、「6×Hisタグ」)を有するポリペプチドを生じ
るような方法で挿入され得るように配置されている。しかし、この実施例におい
て、ポリペプチドコード配列は、6つのHisコドンの翻訳が防止されるように挿
入され、それゆえポリペプチドは6×Hisタグを有しないで産生される。
FGF-13アミノ酸配列の推定の成熟形態を含むFGF-13タンパク質の所望の部分(
すなわち、配列番号2のアミノ酸1〜193)をコードするDNA配列を、FGF-13タンパ
ク質の所望の部分をコードするアミノ末端配列およびcDNAコード配列の3'側の寄
託した構築物中の配列にアニールするPCRオリゴヌクレオチドを使用して、寄託
したcDNAクローンから増幅した。pQE70ベクター中のクローニングを容易にする
ため
の制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ5'および3'配列に付加した
。
FGF-13タンパク質の成熟形態のクローン化のために、5'プライマーは、下線を
付したSphI制限部位を含む配列5'CTAGTCGCATGCAGGGGGAGAATCACCCGTCT3'(配列番
号13)を有し、これは開始コドンおよび、開始コドンの後に、21ヌクレオチドの
、配列番号2における成熟FGF-13配列のアミノ末端コード配列を含む。当業者は
、もちろん、成熟形態よりも短いかまたは長い完全タンパク質の所望の部分を増
幅するために、5'プライマーが開始するタンパク質コード配列中の点が変動し得
ることを理解する。3'プライマーは、下線を付したHindIII制限部位、それに続
く終止コドンおよび配列番号1におけるFGF-13DNA配列中のコード配列の3'末端
に相補的な18ヌクレオチドを含む配列5'GCTTGAAAGCTTCTACGTGAGGGGCTGGGGCCG3'
(配列番号14)を有した。
増幅したFGF-13DNAフラグメントおよびベクターpQE70をSphIおよびHindIIIで
消化し、次いで、消化したDNAを一緒に連結した。FGF-13DNAの制限したpQE70ベ
クター中への挿入は、その付随する終止コドンを含むFGF-13タンパク質を、IPTG
誘導性プロモーターの下流かつ5'プライマー中の開始AUGとインフレームに配置
する。付随する終止コドンは、挿入点の下流の6つのヒスチジンコドンの翻訳を
防止する。
連結混合物を、Sambrookら,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第2
版,;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)
に記載の手順のような標準的な手順を使用してコンピテントなE.coli細胞中に
形質転換した。1acリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(「Kan」)を与え
る多コピーのプラスミドpREP4を含むE.coliM15/rep4株を、本明細書中に記載の
例示的な実施例の実施において使用した。この株(FGF-13タンパク質の発現のた
めに適切である多くのうちの1つでしかない)は、QIAGEN,Inc.(前出)から
市販されている。トランスフォーマントをアンピシリンおよびカナマイシンの存
在下でLBプレート上で増殖する能力によって同定した。耐性コロニーからプラス
ミドDNAを単離し、クローン化DNAの同一性を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定
によって確認した。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイ
シン(25μg/ml)の両方を補充したLB培地中の液体培養で一晩(O/N)増殖させ
た。O/N培養物を使用して大量培養物を約1:25〜1:250の希釈で接種した。細胞を
0.4と0.6との間の600nmでの光学密度(「O.D.600」)まで増殖させる。次いで、
イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(「IPTG」)を1mMの最終濃度に添
加して、1acIリプレッサーを不活化することによって、1acリプレッサー感受性
プロモーターからの転写を誘導する。次いで、細胞をさらに3〜4時間インキュ
ベートし、次いで、細胞を遠心分離によって収集する。
FGF-13ポリペプチドを精製するために、細胞をマイクロフルイダイザー中で溶
解し、次いで3〜4時間4℃で2M、次いで6MグアニジンHCl、50mM tris-HCl(pH7
.5)、2mM EDTA中で撹拌した。FGF-13タンパク質は、2Mおよび6M両方のGuHCl抽
出物中に存在した。合したGuHCl抽出物を素早く30mM Tris(pH7.5)、5mM EDTA、2
00mM NaCl、20μg/ml Pefabloc SC、2μg/ml E-64(Boeringer Mannheim)を含
む緩衝液中に希釈した。再生したFGF-13を、pH7でporos 50 HS(PerSeptive Bio
system)カチオン交換カラムを通して精製した。HS精製したタンパク質を縦列ク
ロマトグラフィー様式のporos HQ 50/poros CM 20(PerSeptive Biosystem)ア
ニオン/カチオンカラムの組に付した。FGF-13をαカラムから、20容量の、24mM
NaCl中の0.2〜1.25M NaCl直線勾配を用いて溶出し、精製をS200 sephacryl HR(P
harmacia)サイズ排除カラムを用いて終了した。
GuHCl抽出したタンパク質は、SDS-PAGE上で出発材料と同じ大きさであるよう
に見え、60%より高く純粋であった。しかし、タンパク質の再生後に、SDS-PAGE
上で約2kD小さく見える3つのバンドを示し、このことは、タンパク質分解的分
解が再生の間に生じ得たことを示唆する。poros HS 50カラム上での強カチオン
交換によって捕獲された再生FGF-13は、1M NaClを用いて80%の純度で溶出され
た。縦列カラムの組から得られたタンパク質(CMカラムから600mM NaClを用いて
溶出された)は、SDS-PAGE上で以下の少なくとも3つの異なるバンドを示した:約
22kDの2つの上方バンドおよび約19kDの1つの下方バンド。上方バンドと下方バ
ンドとを分離する試みで、CM精製したFGF-13をS200 sepharcryl HRサイズ排除カ
ラム
に通した。主に上方バンドを含む画分を単離した。上方バンドおよび下方バンド
をN末端微量配列決定によって分析した。
精製FGF-13をProBlott膜(Applied Biosystems,Inc.(ABI))上にスロット
ブロットし、Ponceau S(3%酢酸中0.2%)で染色した。次いで、目的のバンド
を切り出し、「Blot Cartridge」に入れ、モデルABI-494シーケンサー(Perkin-
Elmer-Applied Biosystems,Inc.)およびGas-phase Blot cycleを使用するN末
端アミノ酸配列分析に供した。結果により、上方二重バンドのN末端アミノ酸配
列はN末端Metを含むQE70発現構築物について予想されたとおりであり(すなわち
、MQGEN...)、一方、下方鼎バンドは21アミノ酸短いN末端配列(すなわち、TDQL
S)を有することが示された。これらの末端配列は、もとの未分画調製物中の全て
のN末端のそれぞれ40%および50%を表した。線維芽細胞増殖アッセイにより、
上方および下方画分は匹敵し、両方の画分は実施例1(a)のベクターを使用し
て作製したHisタグ付きFGF-13より活性であることが示された。これらのアッセ
イにより、FGF-13が-80℃で凍結され得、その後活性の損失なしに融解され得る
ことも示された。次いで、上方および下方FGF-13画分を本明細書中に記載の全て
のさらなる生物学的活性試験用に合して、SDS-PAGE上でほぼ等しい強度、95%よ
り高い純度および2EU/mgの低い内毒素を有する3つのバンドからなる混合物を得
た。
実施例2:バキュロウイルス発現系におけるFGF-13タンパク質のクローニングお
よび発現
全長FGF-13タンパク質をコードするDNA配列(ATCC#97148)を、遺伝子の5'お
よび3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する:
FGF-13 5'プライマーは配列5'CTAGTGGATCCCGAGAATCACCCGTCTCCT3'(配列番号1
5)を有し、その部位でのクローニングがバキュロウイルスシグナル配列を推定
のFGF-13シグナルペプチド切断部位の下流のFGF-13遺伝子の18ヌクレオチドとイ
ンフレームに配置するようにBamHI制限酵素部位(太字)を有する。
3'プライマーは配列5'CGACTTCTAGAACCTCGGGGATCTGGCTCC3'(配列番号16)を有
し、制限エンドヌクレアーゼXbaIの切断部位および遺伝子の3'非翻訳配列に相補
的な18ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキツト(「Geneclean」,BIO
101 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して1%アガロースゲルから単離する。次いで
、このフラグメントをそれぞれのエンドヌクレアーゼで消化し、1%アガロース
ゲル上で再度精製する。このフラグメントをF2と命名する。
ベクターpA2gp(pVL941の改変、以下で論じる)を、バキュロウイルス発現系
を使用するタンパク質の発現用に使用する(総説については、Summers,M.D.お
よびSmith,G.E.1987,A manual of methods for baculovirus vectors and in
sect cell culture procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bu
lletin No.1555を参照のこと)。この発現ベクターは、Autographa californic
a核多角体形成ウイルス(AcMNPV)の強力な多角体プロモーター、それに続く制
限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミアンウイルス(S
V)40のポリアデニル部位が、効率的なポリアデニル化のために使用されている
。組換えウイルスの簡便な選択のために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺
伝子が、多角体プロモーターと同じ方向で挿入されており、多角対遺伝子のポリ
アデニル化シグナルがそれに続いている。多角体配列は、両端で、同時トランス
フェクトされる野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換え用のウイルス配列に
よって隣接されている。pRGl、pAc373、pVL941およびpAcIM1のような多数のその
他のバキュロウイルスベクターがpA2の代わりに使用され得る(Luckow,V.A.お
よびSummers,M.D.,Virology,170:31-39)。
プラスミドを制限酵素で消化し、当該分野において公知の手順によって仔ウシ
腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、DNAを市販のキット(「G
eneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して1%アガロースゲルから
単離する。このベクターDNAをV2と命名する。
フラグメントF2および脱リン酸化したプラスミドV2をT4DNAリガーゼで連結す
る。次いで、E.coliDH5細胞を形質転換し、プラスミド(pBacFGF-13)を含んで
いた細菌をそれぞれの制限酵素を使用して同定する。クローン化したフラグメン
トの配列をDNA配列決定によって確認する。
5μgのプラスミドpBacFGF-13を、1.0μgの市販の線状化バキュロウイルス
(「BaculoGoldTMバキュロウイルスDNA」,Pharmingen,San Diego,CA.)とと
もにリポフェクション法(Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7
417(1987))を使用して同時トランスフェクトする。
各々の場合において、1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラス
ミドを、50μlの無血清Grace培地(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD
)を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、10μlL
ipofectin+90μl Grace培地を添加し、混合し、15分間室温でインキュベートす
る。次いで、トランスフェクション混合物を、血清を含まないGrace培地1mlを
含む35mm組織培養プレート中に播種したSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴下す
る。プレートを前後に揺り動かして、新たに添加した溶液を混合する。次いで、
プレートを5時間27℃でインキュベートする。5時間後、トランスフェクション
溶液をプレートから除去し、10%ウシ胎児血清を補充したGrace昆虫培地1mlを
添加する。プレートをインキュベーターに戻し、培養を27℃で4日間継続する。
4日後、上清を採集し、SummersおよびSmith(前出)による記載と類似のプラ
ークアッセイを実施する。改変として、青色に染色されたプラークの簡便な単離
を可能にする「Blue Gal」(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)を含むア
ガロースゲルを使用する。(「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life T
echnologies Inc.,Gaithersburgによって配布される昆虫細胞培養およびバキュ
ロウイルス学についての使用者の手引き、9〜10頁に見出され得る)。
段階希釈の4日後、ウイルスを細胞に添加し、青色に染色されたプラークをEp
pendorfピペットのチップでひろう。次いで、組換えウイルスを含む寒天を200μ
lのGrace培地を含むEppendorfチューブ中に再懸濁する。寒天を手短な遠心分離
によって除去し、組換えウイルスを含む上清を使用して、35mmディッシュ中に播
種したSf9細胞を感染させた。4日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し
、次いで4℃で貯蔵する。
Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させる。細胞を組
換えバキュロウイルスV-FGF-13で感染多重度(MOI)2で感染させる。6時間後
、培地を除去し、SF900II培地−メチオニンおよびシステイン(Life Technologi
es Inc.,
Gaithersburg)で置換する。42時間後、5μCiの35Sメチオニンおよび5μCiの3
5Sシステイン(Amersham)を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、
その後遠心分離によって収集し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオート
ラジオグラフィーによって可視化する。
実施例3:哺乳動物細胞におけるFGF-13のクロ−ニングおよび発現
実施例3(a):COS細胞におけるクローニングおよび発現
推定の成熟FGF-13ポリペプチドの発現には、以下を含むベクターpcDNA3/Amp(
Invitrogen)に由来するプラスミドFGF-13-HAを使用する:1)SV40複製起点、
2)アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複製起点、4)CMVプロモーター、そ
れに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位。FGF-13
前駆体全体および3'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフ
ラグメントを、ベクターのポリリンカー領域中にクローン化する。それゆえ、組
換えタンパク質発現はCMVプロモーターの下に指向される。以前に記載されたよ
うに(I.Wilson,H.Niman,R.Heighten,A Cherenson,M.Connolly,および
R.Lerner,1984,Cell 37:767,(1984))、HAタグは、インフルエンザ赤血球凝
集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。HAタグの標的タンパク質への
導入は、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の簡便な検出を
可能にする。
PCR増幅したDNAフラグメントおよびベクターpcDNA3/Ampをそれぞれの制限酵素
で消化し、連結する。連結混合物をE.coli SURE株(Stratagene Cloning Syste
ms,La Jolla,CA)中に形質転換し、形質転換した培養物をアンピシリン培地プ
レート上にプレーティングし、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAをトラ
ンスフォーマントから単離し、正しいフラグメントの存在についての制限分析に
よって検査する。組換えFGF-13の発現用に、COS細胞を発現ベクターを用いてDEA
E-デキストラン法によってトランスフェクトする(J.Sambrook,E.Fritsch,T
.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pr
ess,(1989))。FGF-13-HAタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法に
よって検出する(E.Harlow,D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor
Laboratory Press,(1988))。トランスフェクションの2日後に細胞を8時間35
Sシステインで標識する。次いで、培養培地を採集し、細胞を界面活性剤で溶解
する(RIPA緩衝液(150mM NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、1%NP-40、0.5%DOC、
50mM Tris(pH7.5))(Wilson,I.ら,同上37:767(1984)))。細胞溶解物およ
び培養培地の両方をHA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させる。沈降され
たタンパク質を15%SDS-PAGEゲル上で分析する。
実施例3(b):CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC4をFGF-13ポリペプチドの発現用に使用する。プラスミドpC4は、プ
ラスミドpSV2-dhfr(ATCC受託番号37146)の誘導体である。可溶性、分泌形態の
ポリペプチドを産生するために、推定の成熟体をヒトIL-6遺伝子の分泌リーダー
に融合する。このプラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下のマウスDHFR遺
伝子を含む。これらのプラスミドによってトランスフェクトされるジヒドロ葉酸
活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞またはその他の細胞は、化学療法剤
であるメトトレキセートを補充した選択培地(α-MEM,Life Technologies)中
で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキセート(MTX)に耐
性の細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は十分に実証されている(例えば、Alt,F.
W.,Kellems,R.M.,Bertino,J.R.,およびSchimke,R.T.,1978,J.Biol
.Chem.253:1357-1370,Hamlin,J.L.およMa,C.1990,Biochem.et Biophys
.Acta,1097:107-143,Page,M.J.およびSydenham,M.A.1991,Biotechnolo
gy 9:64-68を参照のこと)。漸増濃度のMTX中で増殖させられる細胞は、DHFR遺
伝子の増幅の結果として、標的酵素であるDHFRを過剰生産することによって薬物
に対する耐性を発達させる。第2の遺伝子がDHFR遺伝子に連結されている場合、
その遺伝子は通常同時増幅および過剰発現される。このアプローチが1,000コピ
ーより多い増幅された遺伝子を有する細胞株を開発するために使用され得ること
は当該分野において公知である。次いで、メトトレキセートを抜くと、宿主細胞
の1つ以上の染色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含む細胞株が得られる
。
プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現用に、ラウス肉腫ウイルスの長末端反
復
(LTR)の強力なプロモーター(Cullenら,Molecular and Cellular Biology,
3月1985:438-447)+ヒトサイトメガロウイルス(CMV)の極初期プロモーター
のエンハンサーから単離されたフラグメント(Boshartら,Cell 41:521-530(1985
))を含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一
制限酵素切断部位が存在する:BamHI、XbaIおよびAsp718。これらのクローニング
部位の後に、このプラスミドはラットプレプロインスリン遺伝子の3'イントロン
およびポリアデニル下部位を含む。その他の高効率プロモーターもまた発現用に
使用され得る。例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プ
ロモーターまたはその他のレトロウイルス(例えば、HIVおよびHTLVI)由来の長
末端反復。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および類似の系は、哺
乳動物細胞において調節された方法でFGF-13ポリペプチドを発現させるために使
用され得る(Gossen,M.,およびBujard,H.1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89:5547-5551)。mRNAのポリアデニル化用に、他のシグナル(例えば、ヒト成
長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来)が同様に使用され得る。染色体に組み込
まれた目的の遺伝子を有する安定細胞株はまた、gtp、G418またはハイグロマイ
シンのような選択マーカーとの同時トランスフェクションに際して選択され得る
。最初に1つ以上の選択マーカーを使用することが有利である(例えば、G418+
メトトレキセート)。
プラスミドpC4を制限酵素BamHIおよびXbaIで消化し、次いで当該分野において
公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、
ベクターを1%アガロースゲルから単離する。
成熟FGF-13ポリペプチドをコードするDNA配列を、遺伝子の所望の部分の5'お
よび3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。K
ozak配列と重複する下線を付したBamHI部位、AUG開始コドン、ヒトIL-6遺伝子由
来の分泌リーダーペプチドをコードする配列、および成熟FGF-13ポリペプチドの
5'コード領域の21ヌクレオチドを含む5'プライマーは、以下の配列を有する
列番号17)。下線を付したXbaIおよび図1(配列番号1)に示す終止コドンの直
前の3'コード配列に相補的な18のヌクレオチドを含む3'プライマーは以下の配列
を有する:5'GCTTGATCTAGACGTGAGGGGCTGGGGCCG3'(配列番号18)。
増幅したフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIで消化し、次い
で1%アガロースゲル上で再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび
脱リン酸化したベクターをT4 DNAリガーゼを用いて連結する。次いで、E.coli
HB101またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、プラスミドpC4中に挿入されたフラグ
メントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を使用して同定する。
活性なDHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェクシ
ョン用に使用する。5μgの発現プラスミドpC4を、0.5μgのプラスミドpSVneoと
ともにリポフェクチンを使用して同時トランスフェクトする(Felgnerら、前出
)。プラスミドpSVneoは、優勢選択マーカーである、G418を含む一群の抗生物質
に対する耐性を与える酵素をコードする、Tn5由来のneo遺伝子を含む。細胞を1
mg/mlのG418を補充したα-MEM中に播種する。2日後、細胞をトリプシン処理し
、ハイブリドーマクローニングプレート(Greiner,Germany)中に、10、25または
50ng/mlのメトトレキセート+1mg/mlのG418を補充したα-MEM中で播種する。約
10〜14日後、単一クローンをトリプシン処理し、次いで6ウェルペトリ皿または
10mlフラスコ中に、異なる濃度のメトトレキセート(50nM、100nM、200nM、400n
M、800nM)を使用して播種する。次いで、最高濃度のメトトレキセートで増殖す
るクローンを、さらに高濃度のメトトレキセート(1μM、2μM、5μM、10mM
、20mM)を含む新たな6ウェルプレートに移す。100〜200μMの濃度で増殖する
クローンが得られるまで、同じ手順を繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例
えば、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって、または逆相HPLC分析によっ
て分析する。
実施例4:遺伝子治療を介する発現
線維芽細胞を対象から皮膚生検によって得る。得られる組織を組織培養培地中
に入れ、小片に分ける。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に置く。約
10片を各々のフラスコに入れる。フラスコを逆さにし、密封し、室温で一晩放置
する。室温での24時間後、フラスコを反転する。組織の塊はフラスコの底に固定
されたままである。これに新鮮な培地(例えば、10%FBS、ペニシリンおよびス
トレプトマイシンを含むHam'sF12培地)を添加する。次いで、これを37℃で約1
週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日毎に交
換する。培養物中でのさらなる2週間の後に、線維芽細胞の単層が出現する。こ
の単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコに拡大する。
モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復によって隣接されるpMV-7
(Kirschmeier,P.T.ら,DNA,7:219-25(1988))をEcoRIおよびHindIIIで消化
し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲ
ル上で分画し、ガラスビーズを使用して精製する。
本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ5'および3'末端配列に対
応するPCRプライマーを使用して増幅する。5'プライマーはEcoRI部位を含み、3'
プライマーはHindIII部位を含む。当量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨
格とEcoRIおよびHindIIIフラグメントとを、T4 DNAリガーゼの存在下で一緒に加
える。得られる混合物を2つのフラグメントの連結のために適切な条件下で維持
する。この連結混合物を使用して、細菌HB101を形質転換し、次いでこれを、ベ
クターが正しく挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、
カナマイシン含有寒天上にプレーティングする。
両向性(amphotropic)pA317またはGP+am12パッケージング細胞をコンフルエン
トな密度まで、10%仔ウシ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で組織培養物中で増殖させる。次い
で、遺伝子を含むMSVベクターを培地に添加し、パッケージング細胞をベクター
を用いて形質導入する。ここで、パッケージング細胞は遺伝子を含む感染性ウイ
ルス粒子を産生する(ここで、パッケージング細胞を産生細胞という)。
新鮮な培地を形質導入した産生細胞に添加し、次いで培地をコンフルエントな
産生細胞の10cmプレートから収集する。感染性ウイルス粒子を含む消費済みの培
地をmilliporeフィルターを通して濾過して、剥離した産生細胞を除去し、次い
で、
この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。培地を線維芽細胞のサブコンフ
ルエントなプレートから除去し、素早く産生細胞由来の培地で置換する。この培
地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高い場合は、実質的に全
ての線維芽細胞が感染され、選択は必要とされない。力価が非常に低い場合は、
neoまたはhisのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する
ことが必要である。
次いで、操作した線維芽細胞を、単独でまたはcytodex3マイクロキャリアビ
ーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後に宿主中に注射する。ここで、
線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
実施例5:FGF-13の生物学的作用
星状細胞およびニューロンアッセイ。上記のようにEscherichia coliにおいて
発現させ、精製した組換えFGF-13を、皮質ニューロン細胞の生存、軸策成長また
は表現型的分化の促進における活性について、およびグリア細胞繊維性酸性タン
パク質免疫陽性細胞である星状細胞の増殖の誘導について試験した。バイオアッ
セイ用の皮質細胞の選択は、皮質構造におけるFGF-1およびFGF-2の優勢な発現な
らびに以前に報告されたFGF-2処理の結果生じる皮質ニューロン生存の増強に基
づく。
calcein AMを用いて行った吸収測定に基づくと、FGF-13での処理は、皮質培養
物において細胞数の用量依存的増加をもたらした(図4)。FGF-13に対する半最
大(half-maximal)応答および飽和応答は、それぞれ約10ng/mlおよび50ng/mlで
観察され、これは以前に特徴付けられた皮質ニューロンの向性因子であるFGF-2
について観察された応答と、飽和において、ほぼ等価であった。
calcein AM吸収の変化は、グリアまたはニューロン細胞区画における増加の間
で区別されないので、FGF-13を、皮質培養物中に存在するニューロン集団の1つ
であるGABA作動性ニューロンの表現型的分化のレベルの変化を誘導するかどうか
について試験した。7日間の処理期間の後、高親和性GABA取込みのレベルは、FG
F-13の濃度の関数として増加した(図5)。GABA作動性ニューロン応答は、全般
的な
細胞生存応答よりもFGF-13に対して感受性であるようであった。なぜなら、GABA
取込みの最大誘導は、50ng/mlのFGF-13ではなく、10ng/mlで生じたからである。
インビトロにおける皮質または海馬ニューロンに対するFGF-2(塩基性FGF)の
生物学的作用を記載する以前の報告により、ニューロン生存および軸策成長の両
方の増加が実証されている(Walicke,P.ら,「線維芽細胞御増殖因子は解離海
馬ニューロンの生存を促進し軸策伸長を増強する」Proc.Natl.Acad.Sci.USA
83:3012-3016(1986))。しかし、PC-12細胞に対して行われた実験からの報告に
よれば、これら2つの応答は必ずしも同義ではなく、どのFGFが試験されるかの
みならず、どの受容体が標的細胞上で発現されているかにも依存し得ることが示
唆される。初代皮質ニューロン培養物の例を使用して、FGF-13が軸策成長を誘導
する能力を、FGF-2を用いて達成された応答に比較した(図6)。FGF-2およびTG
F-13に対する飽和応答は、それぞれ10および50ng/mlで達成された。
星状細胞は、皮質培養物中に存在する主な非ニューロン細胞型である。FGF-1
(酸性FGF)、FGF-2およびFGF-9は、星状細胞に対するマイトジェンである。図
7に示すように、FGF-1、FGF-2またはFGF-9は、[3H]チミジン取込みのレベルの
5〜10倍の増加をもたらした。一般に、最大応答は10〜50ng/mlの範囲で達成さ
れた。これと比較して、100ng/mlヘパリンの存在下でのFGF-13での処理は、150n
g/mlまでの[3H]チミジン取込みの濃度依存性増加をもたらした。ヘパリンの添加
は、用量応答曲線における左への明らかな変化を引き起こした。
異種リガンド競合結合研究を、成体ラット皮質から調製した膜に対して実施し
た。これらの研究において、FGF-13が[125I]-FGF-1を置換する能力をモニターし
、FGF-2を用いて達成された置換に比較した。図8は、FGF-2、FGF-10およびFGF-
13についての置換曲線を要約する。50%置換を達成するために必要とされるFGF-
2またはFGF-13の濃度は、それぞれ200および1000pMであった。
線維芽細胞および内皮細胞アッセイ。ヒト肺線維芽細胞をClonetics(San Dieg
o,CA)から入手し、Cloneticsからの増殖培地中で維持した。皮膚微小血管内皮
細胞をCell Applications(San Diego,CA)から入手した。増殖アッセイ用に、
ヒト
肺線維芽細胞および皮膚微小血管内皮細胞を、5,000細胞/ウェルで96ウェルプレ
ート中で1日間増殖培地中で培養した。次いで、細胞を1日間0.1%BSA基本培地
中でインキュベートした。培地を新鮮な0.1%BSA培地で置換した後、細胞を試験
タンパク質とともに3日間インキュベートした。Alamar Blue(Alamar Bioscienc
es,Sacramento,CA)を、各ウェルに最終濃度10%に添加した。細胞を4時間イ
ンキュベートした。細胞生存性を、CytoFluor蛍光リーダーにおける示度によっ
て測定した。PGE2アッセイ用に、ヒト肺線維芽細胞を、5,000細胞/ウェルで96ウ
ェルプレート中で1日間培養した。培地を0.1%BSA基本培地に変更した後、細胞
をFGF-2またはFGF-13とともにIL-1αの存在下または非存在下で24時間インキュ
ベートした。上清を採集し、EIAキット(Cayman,Ann Arbor,MI)によってPGE2
についてアッセイした。IL-6アッセイ用に、ヒト肺線維芽細胞を、5,000細胞/ウ
ェルで96ウェルプレート中で1日間培養した。培地を0.1%BSA基本培地に変更し
た後、細胞をFGF-2またはFGF-13とともにIL-1αの存在下または非存在下で24時
間インキュベートした。上清を採集し、EIAキット(Endogen,Cambridge,MA)
によってIL-6についてアッセイした。
ヒト肺線維芽細胞をFGF-2またはFGF-13とともに3日間基本培地中で培養した
後、Alamar Blueを添加して、線維芽細胞の増殖に対する作用を評価した。FGF-2
は10〜2500ng/mlで刺激を示し、一方、FGF-13は1000〜2500ng/mlで刺激を示した
(図9)。しかし、最大作用は類似していた。FGF-2とは対照的に、FGF-13は皮
膚内皮細胞に対しては刺激作用を有しなかった(図10)。
FGF-2およびFGF-13は、線維芽細胞からのPGE2およびIL-6の放出に対して作用
を有しなかった。IL-1αは、PGE2およびIL-6の刺激を示さなかった。FGF-2およ
びFGF-13の両方はIL-1αと共働的に作用して、PGE2(図11)およびIL-6(図12)
を放出させた。2,500ng/mlのFGF-13は、100ng/mlのFGF-2と同様の作用を与えた
。100ng/mlのインドメタシンは線維芽細胞からのPGE2の放出を阻害したが、IL-6
の放出は阻害しなかった。
脈管形成アッセイ。FGF-13のインビボ脈管形成アッセイは、既存の毛細血管網
がマウス細胞外マトリックス材料(Matrigel)の移植されたカプセルにおける新
たな血管を形成する能力を測定する。タンパク質を液体Matrigelと4℃で混合し
、次いで混合物をマウスに皮下注射し、ここで混合物は固化する。7日後、Matr
igelの固体「栓」を取り出し、新たな血管の存在について検査する。Matrigelを
Becton Dickinson Labware/Collaborative Biochemical Productsから購入した
。
4℃で融解する場合、Matrigel材料は液体である。MatrigelをFGF-13と150ng/
mlで4℃で混合し、冷3mlシリンジ中に引いた。約8週齢の雌性C57B1/6マウス
に、Matrigelおよび実験タンパク質の混合物を、腹部の中腹面の2つの部位で注
射した(0.5ml/部位)。7日後、マウスを頚部脱臼によって屠殺し、Matrigel栓
を取り出し、洗浄した(すなわち、全ての密着する膜および線維組織を除去する
)。折りたたんだ全体の栓を中性緩衝化10%ホルムアルデヒド中で固定し、パラ
フィン中に包埋し、Masson's Trichromeでの染色後の組織学的検査用切片を作製
するために使用した。各々の栓の3つの異なる領域からの横断切片を処理した。
選択した切片をvWFの存在について染色した。このアッセイ用のポジティブコン
トロールはウシ塩基性FGF(150ng/ml)であった。Matrigel単独を、脈管形成の
基底レベルを測定するために使用した。
FGF-13は、少数の細胞の浸潤がMatrigel栓の辺縁末端に観察されたという点で
、弱く陽性であった。vWFに対する抗体での免疫染色によっては、vWF陽性内皮細
胞は示されなかった。当該分野において公知である上記のようなプロトコルは、
一般に、栓の全細胞性を測定することのみによって脈管形成を定量し、この手順
はタンパク質の脈管形成活性の完全な評価を与えないかもしれない。
パーキンソンモデル
パーキンソン病において観察される運動機能の損失は、黒質線状体ドーパミン
作動性突出ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。十
分に特徴付けられているパーキンソンの動物モデルとしては、1-メチル-4フェニ
ル1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)の全身投与が挙げられる。CNSにおい
て、MPTPは星状細胞によって取り込まれ、モノアミンオキシダーゼBによって1-
メチ
ル-4-フェニルピリジン(MPP+)に異化され、放出される。次いでMPP+は、ドー
パミンの高親和性再取込み輸送体によってドーパミン作動性ニューロン中に活発
に蓄積される。次いでMPP+は、電気化学的勾配によってミトコンドリア中に濃縮
され、ニコチンアミドアデニンジホスフェート:ユビキノン酸化還元酵素(複合
体I)を選択的に阻害し、それによって電子伝達に干渉し、最終的に酸素ラジカ
ルを生成する。
FGF-2(塩基性FGF)が黒質ドーパミン作動性ニューロンに対する栄養活性を有
することが組織培養の例において実証されている(Ferrariら,Dev.Biol.1989
)。近年、Unsicker博士のグループは、線条中のゲルフォーム移植物でのFGF-2
の投与の結果、MPTP曝露に付随する毒性からの黒質ドーパミン作動性ニューロン
のほぼ完全な保護が生じることを実証している(OttoおよびUnsicker,J.Neuros
cience,1990)。
FGF-2についてのデータに基づいて、FGF-13がインビトロにおけるドーパミン
作動性ニューロン生存の増強におけるFGF-2の作用と類似の作用を有するかどう
かを決定するためにFGF-13を評価し、次いでFGF-13を、MPTP処理に付随する損傷
からの線条中のドーパミン作動性ニューロンの保護についてインビボにおいて試
験した。FGF-13の潜在的作用を、まずドーパミン作動性ニューロン細胞培養物の
例においてインビトロで検討した。培養物を、妊娠14日目のWistarラット胎児か
ら中脳底板を切除することによって調製した:組織をトリプシンを用いて解離し
、200,000細胞/cm2の密度でポリオルニチン−ラミニンコートしたカバーグラス
上に播種した。細胞を、ホルモン補充物(N1)を含むダルベッコ改変イーグル培
地およびF12培地中で維持した。インビトロにおける8日間の後に、培養物をパ
ラホルムアルデヒドで固定し、チロシンヒドロキシラーゼ(ドーパミン作動性ニ
ューロンに特異的なマーカー)免疫組織化学的染色用に処理した。図14。FGF-13
はチロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性ニューロンの数を増加させる。解離細胞培
養物を胎児ラットから調製した。培養培地を3日毎に交換し、因子もまたその時
に添加した。
パーキンソンの結論:ドーパミン作動性ニューロンを妊娠14日目(ドーパミン
作動性前駆細胞が増殖中である段階を過ぎた発生の時期)の動物から単離したの
で、チロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性ニューロン数の増加は、インビトロにお
いて生存しているドーパミン作動性ニューロン数の増加を表す。それゆえ、FGF-
13は、パーキンソン病において必要とされるドーパミン作動性ニューロンの生存
を延長するように作用する。
FGF-13の生物学的活性の結論。FGF-13は、妊娠16日目の胎児に由来する皮質培
養物において、細胞数、軸策成長、およびニューロン特異的高親和性GABA取込み
のレベルを増加させる。精製海馬星状細胞を使用する増殖アッセイからの結果に
より、FGF-13が、星状細胞培養物における[3H]チミジン取込みの量を増加させる
ことが実証される。非ニューロン細胞の増殖を阻害するために皮質細胞培養物を
無血清培地中で維持するが、星状細胞数の増加はFGF-2およびFGF-13での処理の
後に示された。従って、FGF-13処理後に観察された細胞数の増加の一部は、星状
細胞の増殖に起因する。しかし、ニューロンマーカー(GABA取込み)の強い増加
により、直接的なニューロン応答もまた生じていることが示唆される。
FGF-13は、FGF-2と同様にヒト肺線維芽細胞において増殖を刺激するように作
用した。どちらも線維芽細胞からのIL-6およびPGE2の放出に対する作用を有しな
かったが、両方ともIL-1αと共働的に作用した。しかしFGF-2とは対照的に、FGF
-13は、皮膚微小血管内皮細胞の増殖を刺激しなかった。ドーパミン作動性ニュ
ーロン生存はFGF-13投与によって増加され、このことはFGF-13がパーキンソン病
における治療的利益を有し得ることを示す。
実施例6:E.coliにおけるFGF-13の発現および精製
細菌発現ベクターpHE-4またはpHE-4-5をこの実施例における細菌発現用に使用
する。pHE-4は、カナマイシン抗生物質耐性(「Kan」)をコードし、細菌複製起
点(「ori」)、IPTG誘導性プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)およ
び適切な単一制限酵素切断部位を含む。これらの要素は、ポリペプチドをコード
するDNAフラグメントが、そのDNAフラグメントに対応するポリペプチドを産生す
るような方法で挿入され得るように配置されている。
新規なpHE4シリーズの細菌発現ベクター、特にpHE4-5ベクターは、この実施例
における細菌発現用に使用され得る。(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chat
sworth,CA,91311)。発現プラスミドpHE4-5/MPIFΔ23ベクタープラスミドDNA
は、別のORFをコードするインサートを含む。この構築物はAmerican Type Cultu
re Collection,12301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852に1997年
9月30日に寄託され、受託番号209311を受けた。無関係なMPIF ORFインサートに
隣接するNdeIおよびAsp718制限部位を使用して、当業者は、pHE4-5ベクター中の
無関係なORFを本発明のFGF-13 ORFで置換するために、現在の分子生物学的技術
を容易に使用し得る。
pHE4-5細菌発現ベクターは、選択用ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子、E.coli複製起点、T5ファージプロモーター配列、2つのlacオペレーター
配列、シャインーダルガーノ配列、およびラクトースオペロンリプレッサー遺伝
子(lacIq)を含む。これらの要素は、ポリペプチドをコードする挿入されたDNA
フラグメントが、そのポリペプチドのアミノ末端に共有結合された6つのHis残
基(すなわち、「6×Hisタグ」)を有するポリペプチドを発現するように配置
されている。pHE4-5ベクターのプロモーターおよびオペレーター配列は合成で作
製した。核酸配列の合成生成は当該分野において周知である(CLONETECH 95/96
カタログ,215-216頁,CLONETECH,1020 East Meadow Circle,Palo Alto,CA 9
4303)。
成熟FGF-13タンパク質の所望の部分(すなわち、配列番号2のアミノ酸20〜19
3)をコードするDNA配列を、寄託したcDNAクローンから、FGF-13タンパク質の所
望の部分をコードするアミノ末端配列およびcDNAコード配列の3'側の寄託した構
築物中の配列にアニールするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅
した。pHE-4ベクター中のクローニングを容易にするために制限部位を含むさら
なるヌクレオチドを、それぞれ5'および3'配列に付加した。
A.FGF-13タンパク質のΔ42形態のクローン化用に、5'プライマーは、下線を付
したNdeI制限部位を含む配列5'GGG AAT TCC ATA TGA CCG ACC AGC TGA GCA GG(
配列番号19)を有し、これは開始コドンおよび、開始コドンの後に、配列番号2
に
おけるFGF-13配列のアミノ末端コード配列の19ヌクレオチドを含む。当業者は、
もちろん、成熟形態よりも短いかまたは長い完全タンパク質の所望の部分を増幅
するために、5'プライマーが開始するタンパク質コード配列中の点が変動し得る
ことを理解する。3'プライマーは、下線を付したASP718制限部位、それに続く終
止コドンおよび配列番号1におけるFGF-13 DNA配列中のコード配列の3'末端に相
補的な18ヌクレオチドを含む配列GCCCGGGGTACCTTACGTGAGGGGCTGGGGCC(配列番号2
0)を有した。
B.FGF-13タンパク質の3"Δ9形態のクローン化用に、5'プライマーは、下線を
付したNdeI制限部位を含む配列5'GGGAATTCCATATGCAGGGGGAGAATCACCCGTCT3'(配
列番号21)を有し、これは開始コドンおよび、開始コドンの後に、配列番号2に
おけるFGF-13配列のアミノ末端コード配列の18ヌクレオチドを含む。当業者は、
もちろん、成熟形態よりも短いかまたは長い完全タンパク質の所望の部分を増幅
するために、5'プライマーが開始するタンパク質コード配列中の点が変動し得る
ことを理解する。3'プライマーは、下線を付したASP718制限部位、それに続く終
止コドンおよび配列番号1におけるFGF-13 DNA配列中のコード配列の3'末端に相
補的な18ヌクレオチドを含む配列GCCCGGGGTACCTTACTTGGTCCGACGGGTGGG(配列番号
22)を有した。
C.FGF-13の成熟形態中には、配列番号2に従うアミノ酸20位にメチオニンをコ
ードするコドンが存在する。このATGの上流には、E.coliにおけるリボソーム結
合を促進し得るヌクレオチド配列(シャイン−ダルガーノ配列)が存在する。E
.coliにおける別のATGの使用を防止するために、この配列を、下線を付したNde
I制限部位を含む配列
GGGAATTCCATATGCAGGGGGAGAATCACCCGTCTCCTAATTTTAACCAGTACGTGCGTGACCAGGGCGCCA
TG(配列番号23)の5'プライマー(開始コドンおよび、開始コドンの後に、配列
番号2におけるFGF-13配列のアミノ末端コード配列の60ヌクレオチドを含む)を
使用して変異させた。
増幅したFGF-13 DNAフラグメントおよびベクターpHE-4をNdeIおよびASP718で
消化し、次いで、消化したDNAを一緒に連結した。FGF-13 DNAの制限したpHE-4ベ
クター中への挿入は、その付随する終止コドンを含むFGF-13タンパク質コード領
域を、IPTG誘導性プロモーターの下流かつ5'プライマー中の開始AUGとインフレ
ームに配置する。
連結混合物を、Sambrookら,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第2
版,;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989
)に記載の手順のような標準的な手順を使用して、コンピテントなE.coli細胞
中に形質転換した。E.coli DH5α株を、本明細書中に記載の例示的な実施例の
実施において使用した。この株(FGF-13タンパク質の発現のために適切である多
数のうちの1つでしかない)は、Life Technologies,Inc.,Rockville,Maryla
ndから市販されている。トランスフォーマントをカナマイシンの存在下でLBプレ
ート上で増殖する能力によって同定した。耐性コロニーからプラスミドDNAを単
離し、クローン化DNAの同一性を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定によって確
認した。
所望の構築物を含むクローンを、カナマイシン(25μg/ml)を補充したLB培地
中の液体培養で一晩(「O/N」)増殖させた。O/N培養物を使用して大量培養物を
約1:25〜1:250の希釈で接種した。細胞を0.4と0.6との間の600nmでの光学密度(
「O.D.600」)まで増殖させる。次いで、イソプロピル-b-d-チオガラクトピラノ
シド(「IPTG」)を1mMの最終濃度に添加して、1acIリプレッサーを不活化する
ことによって、1acリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。次
いで、細胞をさらに3〜4時間インキュベートし、次いで、細胞を遠心分離によ
って収集した。
実施例7:FGF-13の末端欠失改変体
FGF-13のアミノ末端および/またはカルボキシ末端欠失改変体を、A〜Dに開
示するプライマーを使用して、下記の改変体を生成作製して調製し得る。作製さ
れる制限酵素部位を示す。これらの改変体を、実施例6に開示する発現系を使用
して産生し得る。
A.欠失改変体1(FGF13プライマーおよび構築物配列)
B.欠失改変体2(5'Δ42/3'完全)
C.欠失改変体3(5'Δ23/3'完全)
D.欠失改変体4(5'Δ23 SDG欠失/3'完全)
前記の説明および実施例に詳細に記載した以外で本発明が実施され得ることは
明らかとなる。本発明の多数の改変および変形は上記の教示に照らして可能であ
り、それゆえそれらは添付の請求の範囲の範囲内にある。本明細書中で引用する
全ての刊行物(特許、特許出願、雑誌論文、研究室マニュアル、書籍またはその
他の文書を含む)の全体の開示は本明細書に参考として援用される。 シンガポール
出願人はこれによって、微生物の試料の供給が専門家のみに利用可能にされる
ことを請求する。この効果に対する請求は、出願の国際公開のための技術的準備
の完了の前に国際事務局に出願人によって提出されなければならない。
ノルウェー
出願人はこれによって、出願が公共の検閲に公開されるか(ノルウェー国特許
庁によって)、または公共の検閲に公開されることなくノルウェー国特許庁によ
って最終的に審決されるまで、試料の供給が当該分野の専門家のみに遂行される
ことを請求する。この効果に対する請求は、出願がノルウェー国特許法の22条お
よび33(3)条の下に公共に利用可能にされる時点より前に、ノルウェー国特許庁
に出願人によって提出される。そのような請求が出願人によって提出されている
場合、試料の供給のために第三者によってなされるいずれの請求も使用されるべ
き専門家を示す。その専門家は、ノルウェー国特許庁によって作成される承認さ
れた専門家の一覧表上に掲載されたいずれかの人物または個々の事例においで出
願人によって承認されたいずれかの人物であり得る。
オーストラリア
出願人はこれによって、微生物の試料の供給が、特許の許可の前、または出願
の失効、拒絶または取り下げの前に、発明への関心を有しない熟練した受取人に
のみ遂行されるという通達をする(オーストラリア国特許規則の規則3.25(3))
。
フィンランド
出願人はこれによって、出願が公共の検閲に公開されるか(特許および登録の
国立局によって)、または公共の検閲に公開されることなく特許および登録の国
立局によって最終的に審決されるまで、試料の供給が当該分野の専門家のみに遂
行されることを請求する。
アイスランド
出願人はこれによって、出願が公共の検閲に公開されるか(アイスランド国特
許庁によって)、または公共の検閲に公開されることなくアイスランド国特許庁
によって最終的に審決されるまで、試料の供給が当該分野においてのみ遂行され
ることを請求する。
デンマーク
出願人はこれによって、出願が公共の検閲に公開されるか(デンマーク国特許
庁によって)、または公共の検閲に公開されることなくデンマーク国特許庁によ
って最終的に審決されるまで、試料の供給が当該分野の専門家のみに遂行される
ことを請求する。この効果に対する請求は、出願がデンマーク国特許法の22条お
よび33(3)条の下に公共に利用可能にされる時点より前に、デンマーク国特許庁
に出願人によって提出される。そのような請求が出願人によって提出されている
場合、試料の供給のために第三者によってなされるいずれの請求も使用されるべ
き専門家を示す。その専門家は、デンマーク国特許庁によって作成される承認さ
れた専門家の一覧表上に掲載されたいずれかの人物または個々の事例において出
願人によって承認されたいずれかの人物であり得る。
スウェーデン
出願人はこれによって、出願が公共の検閲に公開されるか(スウェーデン国特
許庁によって)、または公共の検閲に公開されることなくスウェーデン国特許庁
によって最終的に審決されるまで、試料の供給が当該分野の専門家のみに逐行さ
れることを請求する。この効果に対する請求は、優先日から16ヶ月の満了の前に
、国際事務局に出願人によって提出される(好ましくは、PCT出願人の手引きの
第I巻の補遺Zに複製される書式PUT/RO/134で)。そのような請求が出願人によ
って提出されている場合、試料の供給のために第三者によってなされるいずれの
請求も使用されるべき専門家を示す。その専門家は、スウェーデン国特許庁によ
って作成される承認された専門家の一覧表上に掲載されたいずれかの人物または
個々
の事例において出願人によって承認されたいずれかの人物であり得る。
イギリス
出願人はこれによって、微生物の試料の供給が専門家のみに利用可能にされる
ことを請求する。この効果に対する請求は、出願の国際公開のための技術的準備
の完了の前に国際事務局に出願人によって提出されなければならない。
オランダ
出願人はこれによって、オランダ国特許の許可の日まで、または出願が拒絶ま
たは取り下げまたは失効される日まで、微生物が特許規則の規則31F(1)において
提供されるように、専門家に対する試料の発行によってのみ利用可能にされるこ
とを請求する。この効果に対する請求は、オランダ王国の特許法の第22C条また
は第25条の下に公共に利用可能にされる日の前に(先に生じる2つの日付のどち
らか)、オランダ国工業所有権局に出願人によって提出されなければならない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C07K 16/22 C12N 1/15
C12N 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 5/00 A
5/10 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG
,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT
,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,
CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,F
I,GB,GE,GH,HU,ID,IL,IS,JP
,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,
LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,M
W,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD
,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,
TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW
(72)発明者 グルーバー,ヨアヒム・エア
アメリカ合衆国02131マサチューセッツ州
ボストン、ロズリンデイル・アベニュー
245番
(72)発明者 ローゼン,クレイグ・エイ
アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ
トンズビル、ローリング・ヒル・ロード
22400番
【要約の続き】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下からなる群より選択される配列に少なくとも95%同一であるヌクレオ チド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子: (a) 配列番号2の-22位〜193位のアミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチド をコードするヌクレオチド配列; (b) 配列番号2のほぼ1位〜ほぼ193位のアミノ酸配列を有する成熟FGF-13ポ リペプチドをコードするヌクレオチド配列; (c)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全 アミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列; (d)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミ ノ酸配列を有する成熟FGF-13ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;およ び (e) 上記(a)、(b)、(c)または(d)におけるヌクレオチド配列の いずれかに相補的なヌクレオチド配列。 2.ポリヌクレオチドが図1(配列番号1)における完全ヌクレオチド配列を 有する請求項1記載の核酸分子。 3.ポリヌクレオチドが配列番号2における完全アミノ酸配列を有するFGF-13 ポリペプチドをコードする図1(配列番号1)におけるヌクレオチド配列を有す る請求項1記載の核酸分子。 4.ポリヌクレオチドが配列番号2におけるほぼ1位〜ほぼ193位のアミノ酸配 列を有する成熟FGF-13ポリペプチドをコードする図1(配列番号1)におけるヌ クレオチド配列を有する請求項1記載の核酸分子。 5.以下からなる群より選択される配列に少なくとも95%同一であるヌクレオ チド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子: (a)配列番号2の残基n〜残基193のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー ドし、ここでnは-23〜+10の範囲の0以外の整数であるヌクレオチド配列; (b)配列番号2の残基-22〜残基-mのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー ドし、ここでmは154〜192の範囲の整数であるヌクレオチド配列; (c)配列番号2の残基n〜残基mからなるアミノ酸配列を有するポリペプチド をコードし、ここでnおよびmはそれぞれ上記(a)および(b)において定義 される整数であるヌクレオチド配列; (d)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全F GF-13アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードし、ここで該部分はATC C寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる該完全アミノ酸 配列のアミノ末端からの1〜約33アミノ酸を除外するヌクレオチド配列; (e)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全F GF-13アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードし、ここで該部分はATC C寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる該完全アミノ酸 配列のカルボキシ末端からの1〜約39アミノ酸を除外するヌクレオチド配列;お よび (f)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全F GF-13アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードし、ここで該部分は上 記(e)および(f)におけるアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失のいずれ かの組み合わせを含むヌクレオチド配列。 6.ポリヌクレオチドがATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンの完全ヌ クレオチド配列を有する請求項1記載の核酸分子。 7.ポリヌクレオチドがATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによって コードされる完全アミノ酸配列を有するFGF-13ポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列を有する請求項1記載の核酸分子。 8.ポリヌクレオチドがATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによって コードされるアミノ酸配列を有する成熟FGF-13ポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列を有する請求項1記載の核酸分子。 9.請求項1の(a)、(b)、(c)または(d)におけるヌクレオチド配 列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントなハ イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、こ こで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドがA残基のみまたはT残基のみから なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはストリンジェントなハイブ リダイゼーション条件下でハイブリダイズしない単離された核酸分子。 10.請求項1の(a)、(b)、(c)または(d)におけるアミノ酸配列 を有するFGF-13ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードする ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。 11.FGF-13ポリペプチドのエピトープ保有部分をコードし、ここで該部分の アミノ酸配列が以下からなる配列番号2における配列の群より選択される請求項 10記載の単離された核酸配列:ほぼGln22〜ほぼAsn32、ほぼAsn34〜ほぼMet43 、ほぼGln46〜ほぼTyr55、ほぼSer59〜ほぼVal66、ほぼVal68〜ほぼPhe83、ほぼ Val88〜ほぼGlu105、ほぼMet110〜ほぼVal128、ほぼPhe153〜ほぼHis173、ほぼL eu178〜ほぼGln182、ほぼPhe185〜ほぼGln194、およびほぼVal198〜Gln213。 12.請求項1記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入する工程を包含 することを特徴とする組換えベクターの作製方法。 13.請求項12記載の方法によって作製される組換えベクター。 14.請求項13記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する ことを特徴とする組換え宿主細胞の作製方法。 15.請求項14記載の方法によって作製される組換え宿主細胞。 16.請求項15記載の組換え宿主細胞をポリペプチドが発現されるような条 件下で培養する工程および該ポリペプチドを回収する工程を包含することを特徴 とするFGF-13ポリペプチドの生産用組換え方法。 17.以下からなる群より選択される配列と少なくとも95%同一であるアミノ 酸配列を含む単離されたFGF-13ポリペプチド: (a) 配列番号2の-22位〜193位のアミノ酸配列; (b) 配列番号2におけるほぼ1位〜ほぼ193位のアミノ酸配列; (c)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全 アミノ酸配列;および (d)ATCC寄託番号97148中に含まれるcDNAクローンによってコードされる成熟F GF-13アミノ酸配列。 18.FGF-13ポリペプチドのエピトープ保有部分を含み、ここで該部分のアミ ノ酸配列が以下からなる配列番号2における配列の群より選択される単離された ポリペプチド:ほぼGln22〜ほぼAsn32、ほぼAsn34〜ほぼMet43、ほぼGln46〜ほ ぼTyr55、ほぼSer59〜ほぼVal66、ほぼVal68〜ほぼPhe83、ほぼVal88〜ほぼGlu1 05、ほぼMet110〜ほぼVal128、ほぼPhe153〜ほぼHis173、ほぼLeu178〜ほぼGln1 82、ほぼPhe185〜ほぼGln194、およびほぼVal198〜Gln213。 19.請求項17記載のFGF-13ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗 体。 20.以下からなる群より選択される配列と少なくとも95%同一である配列を 有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子: (a)少なくとも50の連続するヌクレオチドを含む、図1(配列番号1)に示 す配列の部分のヌクレオチド配列; (b)上記(a)におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチ ド配列。 21.延命濃度のFGF-13をドーパミン作動性ニューロンと接触させる工程を包 含することを特徴とするドーパミン作動性ニューロンの生存の増加方法。 22.ドーパミン作動性ニューロンがパーキンソン病患者中に存在する請求項 22記載の方法。
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