JP2001503748A

JP2001503748A - 分子薬の光活性における選択性改善と検出のための方法

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Publication number: JP2001503748A
Application number: JP52060498A
Authority: JP
Inventors: エー．ワクターエリック; ジー．フィッシャーウォルター; ディースエイッチ．クライ
Original assignee: フォトゲンインク．
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-27
Publication date: 2001-03-21
Also published as: WO1998018398A1; CA2252782A1; BR9713979A; NZ334191A; CN1226147A; EP1032321A1; IL128356A0; NO991493D0; NO991493L; EP1032321A4; IN185849B; US7346387B1; IS5007A; AU5425498A; US5832931A; IL128356A; KR20000035894A; AU716504B2

Abstract

(57)【要約】光活性における改善された選択性および分子診断用薬の検出のための方法。特定量の植物または動物組織を撮像するための方法であって、前記植物または動物組織は少なくとも１つの光活性分子薬を含む。この方法は特定量の植物または動物組織に含まれる光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で植物または動物組織を処置するステップと、特定量の植物または動物組織における少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つを光活性し、少なくとも１つの光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、少なくとも１つの光活性分子薬により放出されるエネルギーを検出するステップと、特定量の植物または動物組織の特徴を示す検出されるエネルギー信号を生成するステップと、を含む。本発明は特定量の物質を撮像するための方法であって、前記物質は少なくとも１つの光活性分子薬を含む方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】分子薬の光活性における選択性改善と検出のための方法本発明は、米国エネルギー省によりロッキード・マーチン・エネルギー・システム社に与えられた契約番号ＤＥ−ＡＣ０５−８４ＯＲ２１４００の下に米国政府の援助によりなされた。ロッキード・マーチン・エネルギー・システム社およびオークリッジ提携大学は発明人に対する本発明の権利を放棄している。米国政府は、米国エネルギー省により与えられた契約番号ＤＥ−ＡＣ０５−８４ＯＲ２１４００に従って本発明における権利を有する。発明の背景：発明の分野：本発明は、１種類以上の分子薬の空間的に選択的な光活性を遠隔的に達成するとともに、それにより得られる診断的信号の検出を改善するための方法および装置に関する。光活性を達成するために開示された方法では、高度の空間的および分子特異性を持って、１つの分子エネルギーレベルから別のレベルへ試薬を促進するための非線形光学励起の特性を利用する。この方法の特徴は各種内因性および外因性の造影剤の活性化に適用可能であり、特にヒトや動物における疾患の診断において明確な利点を提供する。特に、非線形励起法の使用により、現在使用されている方法や放射よりも吸収や分散の程度が少ない近赤外ないし赤外放射を用いた深部組織における診断薬の調節された活性化が促進される。これらの非線形励起法を先進的な信号コード化方法および処理方法に結合することにより、診断信号の検出における感度を著しく増加させることができる。従来技術の説明：多くの分野において、特に医療診断分野において、活性化過程からの副作用をできるだけ発生させずに各種分子薬の遠隔活性化を選択的に調節することが可能である方法が緊急に必要とされている。活性化における望ましい改善には、活性化の位置や深さにわたる空間的または時間的な調節の強化、他の配置された、または近位の分子薬または構造物の望ましくない活性化の軽減、および望ましくない分子薬の活性化よりも望ましい分子薬の活性化の増大が含まれる。種々の線形および非線形の光学的方法が開発され、一部の分子薬について非常に特殊な条件下で改善が得られているものもある。しかし、一般に従来のこうした方法の性能や応用性はあまり望ましいものではない。特に、各種の分子診断薬を選択的に光活性化すると同時にこの光活性化の適用の調節における性能の改善を提供するために用いられる光活性化法の改善が必要とされている。分子プローブを遠隔的に活性化するための手段として、光放射の適用が何年も前から知られている。特に、分子診断薬の半選択的活性を達成するための手段として、線形光励起法が広範囲にわたって研究されている。線形光励起は、分子診断薬など標的薬が、単一光子によって供給されるエネルギーの吸収時に蛍光放出など特異的な光化学的または光物理的過程を受けると生じる。これらの過程は多くの場合にきわめて有効であり、このような過程の使用は多くの適用に魅力的である。残念ながら、これらの線形方法の性能はつねに望んだほどの成功を収めているわけではない。例えば、一部の分子プローブを励起するために使用される紫外線は、他の望ましくない副作用とともに皮膚癌の誘発などヒトや動物における疾患を誘発することがある。さらに、望ましい浸透深度が小さいために、主に分子薬の線形吸収帯近くの波長での入射プローブ放射の線形光散乱および吸収の効果の結果として、分子薬の線形光励起に最大の努力が払われている。一例として、ＷａｃｈｔｅｒとＦｉｓｃｈｅｒ（Ｅ．Ａ．ＷａｃｈｔｅｒとＷ．Ｇ．Ｆｉｓｈｅｒ、「ポリマーマトリック組成物における構造的弱点を評価するための方法と装置」、米国特許第５，４８３，３３８号）では、プローブ分子薬における化学的形質転換を選択的に撮像することが可能な迅速な光学的方法が開示されているが、入射プローブ放射の散乱および吸収により、この方法は局所的分析にしか適さない。Ｖｏ−Ｄｉｎｈら（Ｔ．Ｖｏ−Ｄｉｎｈ，Ｍ．Ｐａｎｊｅｈｐｏｕｒ，Ｂ．Ｆ．Ｏｖｅｒｈｏｌｔ、Ｃ．Ｆａｒｒｉｓ、Ｆ．Ｐ．ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲ．Ｓｎｅｅｄ，「鑑別標準化蛍光（Ｄｎｆ）指数を用いた食道癌のＩｎ−Ｖｉｖｏ診断」、ＬａｓｅｒｓｉｎＳｕｒｇｅｒｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，１６（１９９５）４１−４７；およびＭ．Ｐａｎｊｅｈｐｏｕｒ，Ｂ．Ｆ．Ｏｖｅｒｈｏｌｔ，Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｍｉｄｈａｍｍｅｒ，Ｃ．Ｆａｒｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．Ｂｕｃｋｌｅｙ，およびＴ．Ｖｏ−Ｄｉｎｈ、「食道癌の分光鏡診断：新しい分類モデル、測定システムの改善」、ＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＥｎｄｓｃｏｐｙ，４１（１９９５）５７７−５８１）では、ヒトの疾患組織を検出するための同様の線形プローブ法の使用が開示されているが、この方法の望ましい浸透深度が得られず、入射プローブ放射の散乱および吸収により表在病変の検出に限定されている。また、このような種類の励起は励起出力に線形に関係しており、このような方法では光路に沿ったプローブ励起の位置を限定するための有効な手段が得られない。実際に線形光励起を使用したほぼすべての例では、周囲マトリックス、プローブ分子種の励起における不十分な特異性、活性化の範囲および深度の正確な調節のための適切な物理的機構がないことによる入射光放射の望ましくない吸収および散乱が原因となる基本的な性能の制限に見舞われる。各種の非線形光励起法が、一部の適用においては光活性化の選択性における特異的な改善を達成しているが、線形励起法により生じる多くの制限も報告されている。実際に、分子による光の２光子の同時吸収からなり、これらの２光子の２倍のエネルギーを有する単一光子の吸収によるものと同等の励起を達成するための非線形過程が、マトリックスによる励起光子の吸収や散乱を減少し、励起部にわたる空間的調節を強化し、サンプルに対する光化学的および光物理的損傷の可能性を軽減するこの過程の特異的な利点としてきわめて周知である。単一モードの連続波（ＣＷ）レーザーからピーク出力が１ＧＷを超えるパルスＱスイッチレーザーまでの励起源がこれらの方法とともに用いられている。例えば、ＷｉｒｔｈとＬｙｔｌｅ（Ｍ．Ｊ．ＷｉｒｔｈとＦ．Ｅ．Ｌｙｔｌｅ，「光学的に稠密な媒体における２光子励起分子蛍光」、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１９７７）２０５４−２０５７）は、光学的に稠密な媒体に存在する標的分子を刺激するための手段として非線形光励起の使用を開示している。この方法は媒体そのものと探触子照射との望ましくない直接的相互作用を制限するうえで有効であることがわかっている。さらにＷｉｒｔｈ（Ｍ．Ｊ．ＷｉｒｔｈとＨ．Ｏ．Ｆａｔｕｍｂｉ，「２光子分光鏡におけるきわめて高い検出能」、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２（１９９０）９７３−９７６）により活性部の空間的調節の改善が開発されており、特にＷｉｒｔｈは顕微鏡による撮像システムを用いた標的分子薬の励起におけるきわめて高い空間的選択性を達成するための方法を開示している。さらに同様の調節は、細胞または細胞レベル下のスケールで種々の分子発蛍光団の光活性化における本質的に高い三次元調節を達成するための非線形レーザー励起を利用した特殊な共焦点レーザー走査顕微鏡を開示しているＤｅｎｋら（Ｗ．Ｄｅｎｋ，Ｊ．Ｐ．ＳｔｒｉｃｋｌｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｗｅｂｂ，「２光子レーザー顕微鏡」、米国特許第５，０３４，６１３号）により出願されている。しかし、Ｄｅｎｋは特にスライド上の試料を見るために用いられる顕微鏡について述べている。。この顕微鏡は、生体標本に添加される光学的に稠密な媒体を構成する分子発蛍光薬を励起するために用いられる。Ｄｅｎｋにおいては、レーザーからの光は鏡により反射される結果として下方の対象表面上に進む。次に蛍光は、対物レンズ、一連の鏡および最終的に光電子増倍管を通って同じ光路に沿って後ろへ進む。このため、レーザーからの光は単にスライドの対象表面に焦点が合わせられ、反射する。非線形２光子励起の特別な特性は、対物レンズの焦点で生じる共焦点部に実質的に励起を制限するために利用されることにより、焦点の深さを注意深く調節することにより三次元撮像の可能性が得られる。放出蛍光はエピ照射配置を用いた励起対物レンズにより集められる。細胞および細胞レベル下のレベルでの発光に基づく画像を生成するための光励起の調節はステージにマウントされた標的試料に示される。さらにＤｅｎｋは、焦点面に位置した細胞の光誘発性壊死の軽減が、近赤外照射による紫外線励起照射の置換に基づくこの顕微鏡法の主な利点であると開示している。Ｄｅｎｋらの最近の研究（Ｗ．Ｄｅｎｋ，Ｄ．Ｗ．ＰｉｓｔｏｎおよびＷ．Ｗ．Ｗｅｂｂ，「レーザー操作顕微鏡における２光子分子励起」、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，第２版、Ｊ．Ｂ．Ｐａｗｌｅｙ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ニューヨーク、ｐｐ．４４５−４５８）において、２光子励起蛍光標識から得られる顕微鏡画像データの収集のために、外部全域検出法が開示されている。著者らが「未試験」と述べているこの方法では、エピ照射を用いた後方散乱を収集する必要がない（ｐ．４５２参照）。Ｄｅｎｋは、顕微鏡の対物レンズが放出蛍光波長を伝送しない場合はこの方法が有効であるが、「周囲室内光からの汚染を受けやすい」と指摘している。この研究および以前のＤｅｎｋの特許（５，０３４，６１３）において、周囲光または散乱励起光からの背景干渉を軽減するための明らかな方法は用いられておらず、予測もされていない。実際に、２光子励起法の公知の低い効率が、蛍光放出に対する散乱未吸収励起光のきわめて高い比に書き換えられているにすぎない。散乱励起光、ならびに周囲光および他の環境や機械的背景源からの干渉を軽減するための各種変形法には多数の先例がある。２光子励起蛍光の分野においては、Ｌｙｔｌｅら（Ｒ．Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＦ．Ｅ．Ｌｙｔｌｅ，「正弦的に変調された２光子励起蛍光の第二高調波検出」、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２（１９９０）２２１６−２２１９；およびＷ．Ｇ．ＦｉｓｈｅｒおよびＦ．Ｅ．Ｌｙｔｌｅ，「空間的に濾過された２光子励起蛍光の第二高調波検出」、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５（１９９３）６３１−６３５）が、第二高調波検出法の使用により、散乱レーザー励起光を拒絶するための高度な方法を開示している。すなわち、励起光の正弦変調が１つの周波数で実施され、２光子励起蛍光の検出がその周波数の２倍（励起変調周波数の第二高調波）で実施されると、散乱光からの干渉がほぼ削減される。さらに電子的および他のノイズ周波数を回避するための変調周波数の適切な選択により、機械的および環境的干渉の拒絶がきわめて高くなる。このため、蛍光の２光子励起を実験室条件下で用いて、線形単一光子励起で用いられる約２倍の波長で光を用いて分子発蛍光団を励起し、それにより達成される励起が励起の位置にわたる三次元的空間の調節を改善し、光学的に稠密な媒体における励起の吸収および散乱からの干渉を削減し、顕微鏡検査を受けた生細胞サンプルへの励起路に沿った副損傷を削減できることが公知である。しかし、以上の引例により実施される先行技術の実体により、画像診断や他のｉｎｖｉｖｏ顕微鏡的撮像用途に適用可能である各種光活性化法の多くの魅力的な特徴が明らかに示されているが、医療診断産業の異なった必要を満たすことが可能である高度な空間的調節を有する１種類以上の分子薬を選択的に光活性化するための一般的な方法はこれまでに開示されていない。特に、医療診断用途に重要である規模でこのような調節を達成するための実際的な方法はこれまでに開示されていない。したがって、本発明の目的は、高度の空間的調節を持った、１種類以上の分子薬の選択的光活性化を達成するための方法を提供することである。本発明の別の目的は、医療診断産業の種々の必要を満たすことが可能であるような方法を提供することである。本発明の別の目的は、医療診断用途のために重要である規模でこのような調節を達成するための実際的な方法を提供することである。発明の開示：上記および他の目的や利点を考慮すると、本発明は一般に特定量の植物または動物組織を撮像するための方法において、植物または動物組織は少なくとも１つの光活性分子薬を含む。この方法は、特定量の植物または動物組織に保持される光活性分子薬の同時２光子励起を促進するのに十分な光で、特定量の植物または動物組織を処理し、特定量の植物または動物組織内の少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つを光活性化し、少なくとも１つの光活性分子薬を作り出す工程において、少なくとも１つの光活性分子薬がエネルギーを発し、このエネルギーを検出し、特定量の植物または動物組織の特性を示す検出エネルギー信号を発生させる。本発明は、また、少なくとも１つの光活性分子薬を含む特定量の物質を撮像する方法を提供する。また、本発明の好ましい実施例において、光活性分子薬の同時２光子励起を促進するのに十分な光はパルスレーザー光である。本発明の別の好ましい実施例において、光活性分子薬の同時２光子励起を促進するのに十分な光は焦点をあわせた光ビームであり、さらに好ましくは焦点を合わせたレーザー光である。本発明の別の好ましい実施例では、物質、植物組織または動物組織を少なくとも１つの光活性分子薬で処理するステップを含み、特定量の物質、植物組織または動物組織は少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも一部を有している。より好ましくは、少なくとも１つの光活性分子薬は、ソラレン、５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、４，５’，８−トリメチルソラレン（ＴＭＰ）、４’−アミノメチル−４，５’，８ −トリメチルソラレン（ＡＭＴ）、５−クロロメチル−８−メトキシソラレン（ＨＭＴ）、アンゲルシン（イソソラレン）、５−メチルアンゲルシン（５−ＭＩＰ）、および３−カルボキシソラレン、ポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、フォトフリンＩＩ、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）、フォトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、色素ヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、ポリヘマトポルフィリンエステル（ＰＨＥ）、プロトポルフィリンの１３，１７−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−ジメチルエチルエタンアミンエステル（ＰＨ１００８）、テトラ（３−ヒドロキシフェニル）−ポルフィリン（３−ＴＨＰＰ）、モノスルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ１）、ニスルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ２ａ）、ジヘマトポルフィリンエーテル、メソテトラフェニルポルフィリン、メソテトラ（４Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭｐｙＰ）、オクター（４−第三−ブチルフェニル）テトラピラジノポルフィラジン（ＯＰＴＰ）、フタロシアニン、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアニン（ｔ₄−ＰｃＨ₂）、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアン酸マグネシウム（ｔ₄−ＰｃＭＧ）、スルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）、テトラスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＴＳ）、モノスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ２Ｐｃ）、トリスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ３Ｐｃ）、テトラスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ４Ｐｃ）、シリコーンフタロシアニン（ＳｉＰｃＩＶ）、亜鉛IIフタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ビス（ジイソブチルオクタデシルシロキシ）シリコーン２，３−ナフタロシアニン（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）、ゲルマニウムＩＶオクタブトキシフタロシアニン（ＧｅＰｃ）、ローダミン１０１（Ｒｈ−１０１）、ローダミン１１０（Ｒｈ−１１０）、ローダミン１２３（Ｒｈ−１２３）、ローダミン１９（Ｒｈ−１９）、ローダミン５６０（Ｒｈ−５６０）、ローダミン５７５（Ｒｈ−５７５）、ローダミン５９０（Ｒｈ− ５９０）、ローダミン６１０（Ｒｈ−６１０）、ローダミン６４０（Ｒｈ−６４０）、ローダミン６Ｇ（Ｒｈ−６Ｇ）、ローダミン７００（Ｒｈ−７００）、ローダミン８００（Ｒｈ−８００）、ローダミンＢ（Ｒｈ−Ｂ）、スルホローダミン１０１、スルホローダミン６４０、スルホローダミンＢ、クマリン１、クマリン２、クマリン４、クマリン６、クマリン６Ｈ、クマリン７、クマリン３０、クマリン４７、クマリン１０２、クマリン１０６、クマリン１２０、クマリン１５１、クマリン１５２、クマリン１５２Ａ、クマリン１５３、クマリン３１１、クマリン３０７、クマリン３１４、クマリン３３４、クマリン３３７、クマリン３４３、クマリン４４０、クマリン４５０、クマリン４５６、クマリン４６０、クマリン４６１、クマリン４６６、クマリン４７８、クマリン４８０、クマリン４８１、クマリン４８５、クマリン４９０、クマリン５００、クマリン５０３、クマリン５０４、クマリン５１０、クマリン５１５、クマリン５１９、クマリン５２１、クマリン５２２、クマリン５２３、クマリン５３５、クマリン５４０、クマリン５４０Ａ、クマリン５４８、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＡ）、５−エチル−アミノ−９−ジエチル−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＳ）、５−エチルアミノ −９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノセレナジニウム（ＥｔＮＢＳｅ）、クロロプロマジン、クロロプロマジン誘導体、クロロフィール誘導体、バクテリオクロロフィール誘導体、メタル−リガンド複合体、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（ＲｕＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ロジウム（ＩＩ）（ＲｈＢＰＹ）、および二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）白金（ＩＩ）（ＰｔＢＰＹ）、フェオフォルバイドａ、メロシイアミン５４０、ビタミンＤ、５−アミノ−レブリック酸、フォトサン、クロリンｅ６、クロリンｅ６エチレン−ジアミド、モノ−Ｌ−アスパチャールクロリンｅ６、フェノキサジンナイルブルー誘導体、スチルベン、スチルベン誘導体、および４−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル）−アミノフェニル）−４’−（６−ヒドロキシヘキシルスルフォニル）スチルベン（ＡＰＳＳ）からなる群から選択されることが好ましい。さらに少なくとも１つの光活性分子薬は、特定量の材料、植物組織または動物組織内の特定量の材料または組織に対して特異的である少なくとも１つの生体光活性分子薬であり、少なくとも１つの生体薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンド、ハプテン、炭水化物受容体または複合物質、脂質受容体または複合物質、タンパク質受容体または複合物質、キレート剤、および被包担体からなる群から選択される部分を含み、さらに少なくとも１つの生体光活性分子薬は同時２光子励起を促進するのに十分な光に当てた時に光活性化される部分を含むことが好ましい。本発明のさらに別の好ましい実施例において、特定量の材料、植物または動物組織を特定量の材料、植物組織または動物組織に含まれる少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を促進するのに十分な光で処置するステップは、特定種類の変調で光源から光を変調し変調光を得るステップと、特定量の材料、植物組織または動物組織を特定量の材料、植物組織または動物組織に含まれる少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を促進するのに十分な変調光で処置するステップとを含む。また、本発明はさらに検出された特定種類の変調を持ったエネルギー信号を復調し、特定量の材料、植物組織または動物組織の特徴を示す復調エネルギー信号を得るステップを含むことが好ましい。さらに、検出された特定種類の変調を持ったエネルギー信号を復調するステップは、特定種類の変調の２倍の周波数で検出されたエネルギー信号を復調し、特定種類の変調の第２高調波を検出することを含むことが好ましい。また、特定量の材料、植物組織または動物組織の特徴を示す復調されたエネルギー信号は、特定量の材料、植物組織または動物組織に存在する少なくとも１つの光活性分子薬の寿命の変化を示すことがさらに好ましい。図面の簡単な説明：本発明の利点の上記および他の特徴は、図面とともに本発明の好ましい実施例の以下の詳細な説明からさらに明らかとなる：図１は線形および非線形光学励起のエネルギーレベル図を例示する図である。図２は単一光子および２光子の入射力と励起効果との間の関係を示す図である。図３は紫外から近赤外までのスペクトル域をカバーする動物組織の吸収スペクトルを例示する図である。図４は紫外から近赤外までのスペクトル域をカバーする動物組織の散乱スペクトルを示す図である。図５は短波長および長波長光の動物組織の光学吸収特性における一般的な傾向を示す図である。図６は単一光子および２光子励起法を用いたときの組織における光誘発性損傷を比較した図である。図７は溶液中の診断薬の線形励起の典型的な特性を示す図である。図８は溶液中の診断薬の非線形励起の典型的な特性を示す図である。図９は組織影像全体にわたって一様に分配された染料分子クマリン４８０の２光子励起蛍光の写真を示す図である。図１０は腫瘍試料全体にわたって一様に分配された染料分子クマリン４８０の２光子励起蛍光の写真を示す図である。図１１は内因性および外因性の画像診断薬を撮像するための本発明の特に好ましい実施例を示す図である。図１２は変調を用いて撮像性能を改善する内因性および外因性の画像診断薬を撮像するための本発明の特に好ましい代替の実施例を示す図である。図１３は表在部をビデオグラフィック撮像するための本発明の第２の代替の好ましい実施例を示す図である。発明の詳細な説明：本発明では分子薬の非線形光励起の独特な物理的特性を利用し、分子薬の光活性についての改善された空間的調節を達成する。また、非線形光励起はさらに、副励起および励起路に沿った損傷の減少、有害な光波長への曝露の減少、励起薬周囲の環境から発する吸収や散乱過程からの干渉の減少、および薬の励起における増強分子特異性を含む治療薬および他の薬の光活性時の利点を示すことが明らかにされている。この説明において開示される本発明の基本的な趣旨は、高度な空間的調節および改善された浸透の深度により１種類以上の診断薬を遠隔的に光活性するための非線形光励起過程を用いることにある。これらの分子薬は検査下にシステムに添加される外因性薬であっても、またはシステムの内因性成分であってもよい。外因性診断薬の例には各種ソラレン誘導体があり、内因性薬の例には芳香族アミノ酸および核酸がある。２光子励起は対応する単一吸収帯の約２倍の波長で実施される。光放射のビームを検査下の試料に焦点をあわせることにより、診断薬を焦点が合ったビームの共焦点部に実質的に限定される位置で励起することができる。共焦点部Ｚ_cは２πω₀ ²／λの距離を延びる区域と規定され、ω₀は最小ビームウエストの直径であり、λは光放射の波長である。これに対して、線形励起を行うと、励起は実質的に光路全体にわたって起こり、励起の空間位置を相当に不明確なものとする。このため、２光子励起法を使用すると光路に沿って励起の解像度が大幅に増大する。さらに、励起は対応する線形励起法に対する長い波長で実施されるため、励起エネルギーの散乱および吸収が大幅に減少する。ヒトの組織など厚く光学的に稠密なサンプルでは、これは２光子励起が線形励起法を用いて可能であるよりもはるかに超える深度で可能であることを意味する。診断薬から放出される光は散乱なしに直接的に検出され撮像される必要はない。これは放出光の元に関する空間的情報が、励起焦点によりコード化され、励起焦点に相関するためである。試料に対するこの焦点の位置を移動することにより、放出光の二次元または三次元の画像を得ることができる。また、励起光を変調し、検出装置で適切な復調法を用いることにより、散乱励起光の拒絶または他の干渉を大幅に改善することができる。本発明は、疾患やヒトの胸部癌など他の組織の特徴をｉｎｖｉｖｏ検出および撮像するのが主な目的である。しかし、本発明が完全に開示されれば、開示された方法や装置にはさらに多くの用途があり、これらの方法や装置が、Ｄｅｎｋらにより開示されたような２光子レーザー走査顕微鏡の分野に適用され、このような器具に特徴的な性能における実質的な改善を達成することは明らかである。線形と非線形の励起の比較−エネルギーレベル図の形成：図１は数種の線形および非線形励起法の典型的な分子エネルギーレベル図を示す。簡略ヤブロンスキー図であるこの図において、垂直方向はエネルギーの変化に対応し、水平方向は事象の順序を示し、左から右へ進行する。水平実線は量子力学的に許容される分子エネルギーレベルを示し、水平破線は許容されない仮想エネルギーレベルを示す。量子力学的に許容される分子エネルギーレベルは比較的長く生き、エネルギー吸収時の分子の励起の確率は、適切なエネルギーの光子の吸収により得られる確率のように高い。仮想エネルギーレベルは各種励起法により達することができるが、許容分子遷移とは対照的に、寿命がきわめて短く（ハイゼンベルク不確実性原理により、約１０^-15秒と予測される）、特別な励起条件下においてのみ有意となる。ヤブロンスキー図におけるまっすぐな矢印は放射性エネルギー転移過程を示し、上向きの矢印はエネルギーの吸収を示すのに対して、下向きの矢印は光子の蛍光または燐光放出など放射性放出を示す。波型の矢印は振動緩和など非放射性エネルギー転移過程を示す。まっすぐな矢印または波型の矢印の縦方向の長さは上記の過程において吸収または放出されるエネルギーに比例する。図１は数種類の線形および非線形光励起過程の典型的な分子エネルギーレベル図を示す。図１に示した第１のヤブロンスキー図において、許容エネルギーレベル２への単一光子励起は、第１の許容電子エネルギーレベル６（一般に最も低い電子エネルギーレベル、または基底レベル、Ｓ₀と呼ばれる）から全体的に高いエネルギーレベルを示す第２の許容電子エネルギーレベル８（ここではＳ₁ 状態で表される）まで分子を直接励起するのに十分なエネルギーを有する光子４の吸収時に起こる。注意すべきは、励起が起こり得る多数の高い許容電子エネルギーが存在することであり、これらは典型的にエネルギーが増大するに従ってＳ₁ 、Ｓ₂等で示される。用語Ｓ₁は、全電子のスピンが一対であり、これらに対の電子スピンが別のスピンに対向するパウリの禁則原理に合致する一重電子エネルギーレベルを示す。一種類以上の三重励起状態１０も一部の分子系で可能となり、ここでの例はＴ₁で示される。全電子のスピンが２を除き一対であるという点で、三重状態は一重状態と区別される。これらはこうして、それぞれの許容電子エネルギーはさらに別個の振動レベル１２の集団に分類することができ、こうした別個の振動レベル１２のそれぞれはさらに別個の回転エネルギーレベルの集団に分類することができる。このため、それぞれの許容電子エネルギーレベル、Ｓ₀ 、Ｓ₁、Ｔ₁等は、許容エネルギーレベルの複合帯を構成し、多数の振動及び回転状態を可能とする。光子４からのエネルギーの吸収時に、分子は特定の固有の電子および振動レベル１４に励起され、これは場合によりバイブロニックエネルギーと呼ばれる。次に、この励起状態から、分子は急速な内部転換１６を受け、例えば第３の許容電子エネルギーレベル１０における最も低い許容励起バイブロニックエネルギーレベル１８になり、これはＳ₁で表わされる。この内部転換１６は典型的にきわめて急速であり、約１０^-12〜１０^-15秒の時間スケールで起こる。最後に、励起分子はさらに衝突による非活性化２０などによる緩和を受け、初期の第１のエネルギーレベル６に戻る。別の緩和過程には、Ｓ₁からＳ₀に直接的に生じる光子２１の蛍光放射、および一重状態から三重状態１０へのシステム間交叉２２後に発生する燐光がある。注意すべきは、パウリの禁則原理に従って量子力学的に許容される遷移を構成するＳ₁→Ｓ₀で示されるような一重から一重への電子遷移である。これに対して、Ｓ₁→Ｔ₁など一重から三重状態１０の遷移は、電子スピンが一対ではなくなるため量子力学的に禁止される。しかし、内部変換の確率は、これらのシステムのシステム間交叉速度定数に比べてＳ₁状態の比較的長い寿命の結果として一部の分子系ではゼロよりも大きい。Ｔ₁→Ｓ₀など三重状態１０から一重状態にもどる遷移が、光子２４のりん光放出として知られる放射過程を介して生じることがある。りん光は一般に許可されない過程の性質による蛍光に比べて比較的長い放射寿命により特徴づけられる。許容エネルギーレベル２への単一光子励起の例は、４００ｎｍでの単一光子４の吸収後、内部変換１６および４８０ｎｍでの光子２１のその後の蛍光放出による染料分子クマリンの基底電子状態から励起電子状態への励起である。この例における励起の確率は入射光放射のパワーと線形関係であり、許容エネルギーレベル２への単一光子励起は線形励起過程と呼ばれる。図１に示した第２のヤブロンスキー図において、仮想エネルギーレベル３０への単一光子励起は、分子を許容電子エネルギーレベル８に直接励起するのには不十分なエネルギーを有する光子２８の吸収時に起こる。その代わりとして、分子は寿命がきわめて短いエネルギーレベル３０に励起される。この仮想エネルギーレベル３０の寿命は典型的に約１０^-15秒台となる。この仮想レベル３０からの吸収光子２８のほぼ瞬間的な再放出３２は典型的には弾性散乱などの過程を介して起こる。この過程の重要な例は、８００ｎｍでの光による励起時のクマリンからの８００ｎｍでのレイリー散乱である。別の例はラーマン散乱であり、これは分子が基底状態と関連した種々の振動レベルに戻るときに起こる。こうした過程の例における励起の確率は入射光放射のパワーと線形関係であり、仮想エネルギーレベル３０への単一光子励起は線形励起過程と呼ばれる。図１に示した最後のヤブロンスキー図において、許容エネルギー３４への同時２光子励起は２光子の第１の光子３６および２光子の第２の光子３８の同時吸収時に起こる。この場合、２光子の第１の光子３６と２光子の第２の光子３８の結合エネルギーは第１の許容エネルギーレベル６から第２の許容エネルギーレベル８まで分子を励起するのに十分である。典型的に、２光子の第１の光子３６および２光子の第２の光子３８の個々のエネルギーは、これや別の許容電子遷移を直接励起するにはいずれも不十分である。その代わりとして、２光子の第１の光子３６はきわめて短命の仮想エネルギーレベル３０に分子を励起する。これは第２のヤブロンスキー図に示したものと同じ仮想エネルギーレベルである。仮想エネルギーレベル３０から再放出３２が起こる前に、２光子の第２の光子３８は直ちに分子を第２の許容電子エネルギーレベル８にする。その結果は許容エネルギーレベル２への線形単一光子励起を用いて達成されるものと同等である励起である。注意すべきは、２光子の第１の光子３６および２光子の第２の光子３８のエネルギーは同等の場合も同等でない場合もある。また、入射励起光の瞬間放射照度、すなわちＷ^m-2はきわめて高く、仮想エネルギーレベル３０が緩和３２を受けて最初の第１の許容電子エネルギーレベル６に戻る前に２光子の第２の光子３８の有意な効果を得る必要がある。事実、仮想エネルギーレベル３０の寿命は約１０^-15秒であるため、きわめて高いピーク出力を有するパルス励起源を一般的に用いてこれらの過程を効果的に刺激する。パルス励起源は仮想エネルギーレベル３０の短い寿命の間に励起分子に対して多数の光子を供給する能力があるため多くの場合に好ましい。分子が第２の許容電子エネルギーレベル８に励起されると、急速内部変換を受けた後、衝突非活性化２０、光子２１の蛍光放出、または三重状態１０へのシステム間交叉２２などによりさらに緩和を受ける。最後の場合、三重状態１０から一重基底状態１０に戻る遷移が光子２４のりん光放出を介して生じる。注目すべきは、同時２光子励起が仮想エネルギーレベル３０への許容エネルギーレベル２と単一光子励起への両方の単一光子励起の特徴を配分し、特に仮想レベル３０が基底状態から励起状態への分子の励起で重要な役割を果たし、励起エネルギーに励起されると分子は単一光子励起から許容エネルギーレベル２によるものと同一である光化学的過程および光物理的過程を受けることがある。同時２光子励起法の例が、８００ｎｍでの２光子の同時吸収の後、４８０ｎｍでの蛍光光子の放出による基底電子状態から励起電子状態への染料分子クマリンの励起である。瞬間光子照射への周知の量子力学的依存性により、許容エネルギーレベル５０への同時２光子励起も非線形励起過程と呼ばれる。線形励起過程と非線形励起過程との間の有意差は次の節において確認される。注意すべきは、図１に示した例としてのエネルギーレベル図のほかに、分子系の特徴、その環境、および時間的・空間的相関関係とともに、エネルギーの吸収形式や放出形式の特定エネルギーを含む多数の因子により、そのほか多くの遷移およびエネルギーレベルの状態が考えられる。分子が励起状態に励起されていると、光子のルミネセンス放出、異性化や酸化など光化学的変換、または光イオン化を含む種々の物理的または化学的過程が起こる。重大なのは、これは分子の最終的運命を決定する励起状態およびその環境の基本的特性であるということである。励起されると、分子を励起状態に励起する原因となる機構は、励起過程それ自体が励起分子またはその環境のその後の特性に直接影響を及ぼすことがないため、この運命に重要な影響はない。このため、単一光子励起条件下で十分に作用する分子診断薬は、２光子励起条件下に同様の挙動を示すことが予想される。線形と非線形励起の比較−出力依存性および空間的影響：光が分子系と相互作用すると、応用電界の程度により増幅される線形感受性に比例する分極が誘発される。この電界がきわめて強いと、分子系は簡単に説明することができず、高位の相互作用の用語を誘発分極の説明に記載する必要がある。同時２光子励起は２光子からの電磁場がこれらの高位の用語を介して結合し、特に第３位の感受性の仮想位置、χ⁽³⁾、電子遷移を誘発するため、非線形過程と呼ばれる。これは同時２光子吸収の非線形性を述べる別の方法である。すなわち、分子系は強い電磁場に対して非線形的に反応しているのである。これに対して、単一励起過程は線形感受性で説明され、励起出力と線形である。注意すべきは、同時２光子の断面が典型的に同等の単一光子励起過程のものに比べて１００万分の１小さいということである。これは２光子がきわめて短い仮想エネルギーレベルの寿命の間に分子と同時に相互作用する確率が低いことによるものである。しかし、モードロック型レーザーなどきわめて高いピーク出力を供給する能力がある光励起源の利用可能性は、瞬間入射力を増大するとともに、同時２光子励起の有効な効率を劇的に増大することによりこの低い効率の影響を実質的に改善することができる。例えば、連続波励起を用いると、特定分子系の２光子励起の効率は単一光子励起で達成される効率の１０⁵小さくなる。しかし、きわめて短いパルスの列の形で同じ平均光出力が放出された場合は、ピークおよび平均出力の生成における転位がこの比率を変化させ、単一に近くなることがある。同時２光子励起の非線形性を利用して、同時２光子励起と線形励起の空間的励起特性における重要な違いを達成することができる。例えば、図２は、レーザービーム４６が材料５０中に焦点が合う４８と、単一光子励起効率プロフィール４０と同時２光子励起効率プロフィール４２が、ビーム強度プロフィール４４の関数として劇的に差ができることを示している。この材料５０はキュベット５２の壁の間に保持されるレーザー染料液であってもよい。この材料５０の別の例はヒトの組織真下の皮膚でもある。レンズ５４によるレーザービーム４６の焦点合わせ４８により、試料５０を介した距離の関数として変化するビーム強度プロフィール４４が生じ、これは伝統的なガウス光学理論で予測される焦点５６の中心で最大レベルに達する。単一光子過程では、ビーム強度（入射力）と励起効率との間の線形関係により、ビーム強度プロフィール４４に線形的に従う単一光子励起効率プロフィール４０となる。これに対して、同時２光子励起過程では、ビーム強度（入射力）と励起効率との間の非線形関係により、ビーム強度プロフィール４４の二乗に従う同時２光子励起効率プロフィール４２となる。このため、レーザービーム４６の焦点合わせ４８を用いて、同時２光子励起を行うときに励起の程度を小さな焦点域または共焦点部に実質的に限定することができる。これに対して、線形励起を行うと、励起は実質的に光路全体にわたって起こり、励起の空間位置を相当に不明確なものとする。線形と非線形の励起の比較一吸収および散乱の影響：同時２光子励起の断面は単一光子励起で確認されるよりも相当に低いが、同時２光子法の使用は長い波長の光放射の基質吸収および光散乱が低いという点で多くの条件下で単一光子励起には有利とみられる。例えば、図３は、ヒトの皮膚など動物組織の紫外（ＵＶ）から近赤外（ＮＩＲ）までのスペクトル域をカバーする吸収スペクトル５８を示す。図４は、同様の条件下でのヒトの皮膚など動物組織の散乱スペクトル６６を示す。特に、図３は、診断薬の線形励起に使用されるような高エネルギー光子６０が、診断薬の非線形励起に使用されるような低エネルギー光子６２よりも相当に大きな組織吸収を経験することを示している。例えば、ヒトの皮膚は４００ｎｍで高エネルギー光子６０を強く吸収するが、８００ｎｍで低エネルギー光子６２に対して比較的透明である。これは皮膚の他の天然成分の中でも色素、タンパク質、遺伝物質による紫外線または可視波長を有する高エネルギー光子６０の比較的高い自然吸収の結果である。診断薬の励起エネルギーと放出波長６４との間の関係も注意すべきである。薬を励起するために高エネルギー光子６０または低エネルギー光子６２を使用するか否かに関係なく、放出波長６４は、薬に適用される励起法ではなく、薬により決定されるエネルギーで生じる。図４はさらに高エネルギー光子６８が低エネルギー光子７０よりも相当に大きな組織散乱を経験することを示している。ヒトの皮膚など光学的に稠密な媒体はいずれも例えば４００ｎｍで強く高エネルギー光子を散乱するが、例えば８００ｎｍのＮＩＲまたは近赤外（ＩＲ）での低エネルギー光子７０でははるかに低い散乱を示す。注意すべきは、前に図３に示したように、図４は診断薬の放出波長７２が典型的に高エネルギー光子６０と低エネルギー光子６２の波長との間の範囲にあることを示す。光特性のこうした違いは２つの重要な結果を示す。第一に、組織による短波長の高エネルギー光子６０はＵＶまたは他の高エネルギー光への曝露時に望ましくない組織の損傷の原因となる。これに対して、ＮＩＲ光など低エネルギー光子６２による照射下では、ＮＩＲ光の光力がＵＶ放射の光力よりも何倍も高い場合でも、ごくわずかな影響を受けることがある。第二に、組織による高エネルギー光子６８の内在的に高い吸収および散乱により、組織浸透深度はきわめて浅くなるが、低エネルギー光子７０は一般にはるかに大きな浸透深度を示す。散乱高エネルギー光子６０はそれらの散乱路に沿って診断薬から放出を誘発するため、組織に浸透させる高エネルギー光子６０は励起路に垂直に延びる拡散放出域を生む傾向があるが、２光子励起に対する二次依然性により、低エネルギー光子６２による照射が、散乱低エネルギー光子６２の存在により大きくぶれないさらに鮮鋭に規定された励起パターンを生む。このため、表面下部の照射およびその後の検出は、ＵＶまたは可視スペクトル部におけるなど高エネルギー光子６８を用いたときには困難または不可能となる。これに対して、ＮＩＲまたはＩＲスペクトル部など低エネルギー光子を用いると表面下部の照射およびその後の検出がはるかに容易となる。診断薬からの放出光が検査下に組織や他の光学的に稠密な媒体により大きく吸収され、散乱することにも注意すべきである。しかし、放出光を十分に検出するためには、この光の小断片を検出器に方向づけるだけでよい。この放出光が散乱する大きな範囲は、散乱光や他の光学または機械によるノイズ源からの励起薬により生じる放出光を区別するために必要である高性能な手段を意味する。この最後の考察は次の節の話題である。高エネルギーおよび低エネルギー光の吸収および浸透深度の特性におけるこうした重要な違いを、図５に示す。例えば４００ｎｍでのＵＶまたは可視光７４がヒトの組織７６を照射すると、大半の光エネルギーは、表皮や皮膚など最も外側の層８２に直ちに吸収７８および散乱８０する。吸収７８は、細胞核における生体物質を含むものなどこの組織７６の細胞内の一部の分子の励起により起こることがあり、この吸収７８部位でこれらの細胞の各種の副光化学的変化を開始させることもある。これらの副光化学的変化には非可逆性生体損傷や癌の誘発がある。このため、光浸透深度は低く、副損傷を誘発する可能性は、診断薬の線形励起に使用される従来使用されるようなＵＶまたは可視光７４での励起について高い。これに対して、例えば８００ｎｍでのＮＩＲまたはＩＲ光８４は組織７６によりはるかに低い吸収および散乱８０を受ける。浸透の全体的深度はさらに大きくなり、細胞に対する副損傷の範囲は実質的に低くなる。このため、高エネルギーの単一光子励起に変えて、２光子励起法において長波長励起光を用いれば、比較的非損傷性で高浸透深度の波長を用いて、深い組織内にある特異的診断薬を光活性することが可能である。さらに、図２に示した非線形励起の顕著な特性には、ＮＩＲ光の固有の非損傷的性質や低い吸収と結合したときに別の意義がある。例えば、図６は皮下腫瘍９０に存在する造影剤の単一光子励起８６および同時２光子ＮＩＲ励起８８で予想される浸透深度特性および空間的局在特性を比較したものである。単一光子励起８６は実質的に光路全体に沿って延在し、有意な生体特異性を示さない励起域９２を誘発する。注意すべきは、単一光子励起８６の効率は吸収および散乱により光路に沿って変化し、光放射の誘導点近くで最も高く９４、光路に沿って急速に減退９６することである。また、副光損傷を誘導する可能性がこれと同じ傾向に従うことにも注意すべきである。このため、単一光子励起により、特に深部組織において限定された量に有効に限定することができない拡大した励起域９２が生じる。また、周囲組織９８、特に表面組織１００の全体にわたって有意な副損傷が生じることがある。単一光子励起８６が焦点を合わせられた場合は、励起域９２は焦点１０２でわずかに強化される。しかし注意すべきは、この励起域９２は、単一光子励起８６に用いられるＵＶまたは可視光が腫瘍９０に達する前に大きく吸収または散乱する場合は、腫瘍９０内に延在しないということである。これに対して、ＮＩＲ同時２光子励起８８は、この励起法の非線形特性の結果として実質的に焦点１０６に位置決めされるはっきりと限定された遠隔の励起域１０４が生じる。さらに、ＮＩＲ光の吸収が減少するため、周囲組織９８および特に表面組織１００に対する副損傷は最小限となる。そしてＮＩＲ光の吸収および散乱がともに低い結果として、ＵＶまたは可視波長を用いて可能であるよりもはるかに深い位置を有効に検査することが可能である。典型的な画像診断薬の線形および非線形励起の例：溶液中診断薬の線形励起を図７に示す。この例においては、４４２ｎｍでのレーザー放射を用いてメタノール中染料分子ＦＩＴＣの希釈液を励起した。連続波ヘリウム−カドミウムレーザーから放出されるレーザービームは２０ｘ顕微鏡の対物レンズから染料を含むキュベットに焦点を合わせ、染料中の分散し延びた放出パターンを刺激する。この例では、放出が光路全体に沿って起こり、散乱レーザーによる染料の刺激の原因となる分散ハローが主要な励起路を取り囲むことを明らかに示している。これに対して、図８は同時２光子励起を用いた診断薬のきわめて局限された遠隔光活性を示している。この例においては、７３０ｎｍでのレーザー放出を用いてメタノール中染料分子クマリン４８０の希釈液を励起した。特に、７３０ｎｍ波長の連続列、口径約１ｍｍのビームにおける７８ＭＨｚパルス繰返し周波数での光の＜２００ｆｓのパルスを放出するモードロック型チタン：サファイアレーザーのＮＩＲ出力を同じ２０ｘ顕微鏡の対物レンズから染料を含むキュベットに焦点を合わせた。図８は染料分子からの蛍光反応がＮＩＲビームの焦点に限定されることを明らかに示す。２光子励起と瞬間レーザー出力との間の二次関係により、焦点前後の励起路に沿った位置での刺激はきわめて小さい。また、ハローは確認されないが、この写真の放出周囲には写真フィルムの露光過度による小さなアーチファクトが認められる。光学的に稠密な媒体全体にわたって存在する診断薬のきわめて局限された遠隔の光活性が図９に示されている。これはアガロースゼラチンのブロック全体にわたって一様に分布した染料分子クマリン４８０の２光子励起蛍光の写真を示す。７３０ｎｍ波長の連続列を放出したモードロック型チタン：サファイアレーザーのＮＩＲ出力、口径約１ｍｍのビームにおける７８ＭＨｚパルス繰返し周波数での光の＜２００ｆｓパルスは拡大し、ビーム拡大テレスコープを用いて口径約５０ｍｍの平行ビームを生成した。次にこの拡大ビームを１００ｍｍの焦点距離の５０ｍｍ径両凸単一ガラスレンズを用いてゼラチンブロックに焦点を合わせた。さらにゼラチンブロックは１００−ｍｍｆ．ｌ．の焦点がブロックに位置４０ｍｍで合うように位置決めした。図９は、クマリン４８０からの蛍光がＮＩＲビームの焦点でのみ刺激されることを明らかに示している。２光子励起と瞬間レーザー出力との間の二次関係により、焦点前後のビーム路に沿った位置での分子刺激はごくわずかである。したがって、焦点部の外側では副光活性はほとんどまたはまったく起こらない。注意すべきは、焦点の鋭さがガウスの光特性により決定されることである。このため、焦点部の外側では損傷の励起または副光活性はほとんどまたはまったく認められない。また、ＮＩＲ励起光はゼラチンでほんのわずかしか散乱しないため、ブロックの深い浸透深部で鮮鋭な焦点が維持される。注意すべきは、焦点の鮮鋭度がガウス光特性により決定され、このため、共焦点部の長さがビームの拡大やその後の再焦点合わせに用いられる光学パラメータを変化させることで容易に調節されることである。図１０に示すように、標識腫瘍試料に同等の励起法を適用した場合は、同様の結果が得られる。これはマウス癌組織のブロック全体にわたって一様に配分された染料分子クマリン４８０の２光子励起蛍光の写真を示す。図９におけるように、きわめて高い光学密度を有するこのサンプルであっても、活性化の狭く局限された部位が示されている。画像診断薬の２光子励起のための励起源：同等の単一光子励起法のものよりも典型的に約１００万分の１小さい同時２光子励起の比較的小さい断面は、特殊な光学励起源が診断薬を有効に励起するために典型的に用いる必要があることを意味する。高い最高出力を供給する光源を用いて、最新の平均出力レベルを維持しながら瞬間入射出力を増大することでこの低い効率の影響を実質的に改善することができる。実際に、モデルロック型チタン：サファイヤレーザーなど準連続波モデルロック型レーザーは、生体組織など光学的に稠密な試料における分子診断薬を励起するために理想的である。特に、このようなレーザーは１０ｋＷを超えるＮＩＲ最高出力を送出することが可能であるが、きわめて高い繰返し速度（＞２５ＭＨｚパルス繰返し速度）、超短（〜２００ｆｓパルス幅）、低エネルギー（〜ＩｎＪ／パルス）パルスの形であり、平均レーザー出力（約１０ｍＷ〜２Ｗ）を超短パルスの高周波数列に配分することにより、同時２光子励起発光にきわめて有効であるが生体材料に対して基本的に無害である励起ビームが得られる。モードロック型または他の高繰返し速度レーザーの準連続出力も、特にレーザーのパルス繰返し周波数よりも大幅に低い周波数で変調を実施する場合に、各種変調法と互換性が高い。これは源のパルス特性がその後の復調過程において無視できるためである。モデルロック型チタン：サファイヤレーザーの特異的例は、約６９０ｎｍから１０８０ｎｍまで延びる波長帯にわたって継続的に調整可能であり、これは生体試料の最小の散乱および吸収の部分に十分に対応する。この帯における２光子吸収も、可能な多くの画像診断薬で３４５ｎｍから５４０ｎｍまでの重要な単一吸収部に対応するが、２光子選択規則は場合により対応する単一光子選択規則とまったく異なり、単一光子法での強い吸収が、単一光子波長の約２倍の波長で有意な２光子吸収を示すことがある。モデルロック型チタン：サファイヤレーザーのほかに、他の各種光源が画像診断薬の励起に適用可能であることが明らかである。特に、ダイオードレーザー、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーおよびＮｄ：ＹＬＦレーザー、光学パラメータオシレータ、増幅器および発生器である。パルスダイオードレーザーは、きわめて高い操作効率の結果として魅力的な性能を提供し、ＮＩＲの各種波長で利用可能である。モデルロック型Ｎｄ：ＹＡＧレーザーおよびＮｄ：ＹＬＦレーザーはそれぞれ、１０６４ｎｍおよび１０４７または１０５３ｎｍでＮＩＲ励起光を発生させるために有効で信頼できる手段を提供する。モードロック型光学パラメータオシレータ、増幅器および発生器は約５００ｎｍから３０００ｎｍを超えるまでの帯をカバーする光放射を生成することが可能であり、１０００ｎｍから１８００ｎｍまでの波長の利用可能性により、特に低い組織散乱および吸収の帯における光を用いた診断薬を励起するための実際的な手段が得られ、特にＮＩＲ診断薬（すなわち、５００ｎｍを超える波長での単一光子吸収帯を有する）の活性化に有効である。また、他の各種パルスまたはモデルロック型レーザーが適用可能であり、それらには、アルゴンイオンレーザー、クリプトンイオンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、ヘリウムカドミウムレーザー、ルビーレーザー、Ｎｄ：ＹＡＰレーザー、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザー、Ｎｄ：Ｇｌａｓｓレーザー、Ｎｄ：ＣｒＧｓＧＧレーザー、再生的に増幅されるレーザー、Ｃｒ：ＬｉＳＦレーザー、Ｅｒ：ＹＡＧレーザー、Ｆ−ｃｅｎｔｅｒレーザー、Ｈｏ：ＹＡＦレーザー、ＨｏＹＬＦレーザー、銅蒸気レーザーがある。各種連続波レーザーも用いることができるが、パルスレーザーを用いて達成されるよりも効率が相当に低くなる。画像診断薬からの２光子励起放出の検出：２光子励起画像診断薬からの放出光源に関する情報は、励起焦点によりコード化されるとともに、励起焦点に関連づけることができる。これは、励起路全体に沿って発生する放出光および散乱励起光により生じる放出から画像診断信号を注意深く脱回旋する必要がある光子移動に基づくものを含む単一光励起造影法と大きく異なる。このため、散乱なしに直接的に検出または造影すべき２光子励起診断薬から放出される光は不要である。実際に必要なのは、この放出光の断片を収集し、収集および検出過程が検出信号と放出源点との間の相関を歪めることのないようにして検出することのみである。信号検出と２光子励起放出原点との関係の重要性を理解するために、放出の瞬間直後に放出光に何が起きているかを考えることが有効である。生体組織など光学的に稠密な試料における造影時には、２光子励起画像診断薬からの光が基本的に等方的に放出される。この放出光の一部の断片は放出点から遠隔的に取付けられた検出装置に直接進むが、他の位置の断片は放出と検出との間で発生する１種類以上の散乱事象の結果として検出装置への遠回りの経路を進む。生体試料の深さ１０ｃｍでの造影を試みた場合は、未散乱、または衝撃放出光の遷移時間（すなわち、放出の瞬間から試料の表面から出るまでの全遷移時間）は約０．３ｎｓとなり、大きく散乱した放出光子では、この遷移時間は３〜１０ｎｓほどの大きさになるとみられる。このため、この例における最大効率のためには、衝撃光子および大きく散乱した光子のほとんどまたはすべてを捕捉するために十分な時間で放出光のすべてを統合することが望ましい。これは１０ｃｍ以下の深さで造影するには、約１０ｎｓの統合時間が適切であることを意味する。試料に対する励起焦点の位置を移動または走査することで画像を得るべき場合は、前述の分析は励起点を１０ｎｓごとに１回よりも頻繁に移動するベきではないことを意味する。事実、最小ドウェル時間および変調法の可能な追加使用に関する信号雑音議論と併せて走査の過程および機構の実際の制限は、１μｓを超えるドウェル時間を用いて走査を実施しなければならない。このため、１μｓを超えるドウェル時間および１ＭＨｚ以下の可能な変調周波数による強度に基づく造影では、検出器が衝撃および散乱放出光の重要な部分を収集できるような状態で位置決めされている限り差はほとんど生じない（放出源点に対する検出器の位置の選択、従って光学的遅延により誘導される時間の長さは、他の測定パラメータに対する遷移時間が短いためにその源と検出信号を相関させる能力に対する影響はほとんどないか皆無である）。したがって、検出器は励起ビームとエピ照射配置を構成するように位置決めできること、または励起ビームに対して外部から位置決めできることが明らかとなる。注意すべきは、エピ照射配置（または他の可能な共線形励起および検出配置）は表面または表面近くの対象物の検出の潜在的な視差損失を最小限にするが、このような配置は弾性に散乱または反射される励起光からの干渉に対してさらに感受性である。視差損失は検出システムが励起点と一貫した記録を維持するようにこれを積極的に方向づけること、試料内の異なる区域からの放出光を採集するために個別に最適化されている多重検出アセンブリを用いること、または視差損失が最小であるように試料から十分に離して検出システムを位置決めすることにより、外部検出配置について最小限にすることができる。２光子励起画像診断薬からの放出光の検出に関する考察は、試料全体にわたって多重励起点の励起位置と放出の検出強度を相関させることで画像を構成することができる強度に基づく方法のこの点に中心が向けられている。しかし、強度に基づく方法は多数の複雑な因子に対して感受性であるため、つねに最適というわけではない。これらの因子には以下が含まれる。・試料における不均質性による励起光の散乱および吸収のばらつきであって、例えば異常な光学密度の部分など、励起源と励起目的点との間に位置する不均質性であって、励起目的点での有効な励起レベルにおける予想外の差に転換される。この現象により生じるアーチファクトは、この不均質性により種々の程度に影響されるいくつかの励起路に沿ったデータを捕捉した後、得られた一連の多重データのその後の脱回旋により改善できるが、一部の試料では困難または不可能な場合がある。・試料における不均質性による励起光の散乱および吸収のばらつきであって、例えば異常な光学密度の部分など、励起点と検出システムとの間に位置する不均質性であって、励起点から放出される光の収集効率における予想外の差に変換される。この現象により生じるアーチファクトは、この不均質性により種々の程度に影響されるいくつかの励起路に沿ったデータを捕捉した後、得られた一連の多重データのその後の脱回旋により改善できるが、一部の試料では困難または不可能な場合がある。・形式または機能と直接的には相関しない画像診断薬の濃度または局所環境のばらつきであって、強度に基づく造影において、試料全体にわたる放出レベルの変化が試料の構造的または生理学的構成と相関することがあると考えられる。しかし、画像診断薬が試料全体にわたって適切に配分されていない場合、または試料内の局所環境における不均質性など他の因子が、形式または機能と相関しないように画像診断薬の放出に影響を及ぼす場合は、試料から有意義なデータを得ることが困難となる。この現象により生じるアーチファクトは、このような因子に対して感受性ではない画像診断薬を用いたりデザインすることにより改善できるが、一部の試料では困難または不可能な場合がある。試料の光学的不均質性に対して感受性でない検出方法は、放出強度ではなく励起状態の寿命の変化の測定に基づくことができる。励起状態の寿命は分子薬とその直接の環境の励起状態に固有の特性であり、幸運にも寿命の正確な測定は励起レベルおよび収集効率における最大のばらつき以外のすべてに対して感受性ではない。励起状態の寿命を測定するための便利な手段では位相測光法を用いて、変調励起源と得られた放出信号との間の位相シフトを寿命に関係づける。特に、光子遷移時間に関する先の議論は、位相測光法が光学的に稠密な媒体における造影、特に１〜１０ｎｓを超える寿命の薬に適用可能であることを意味する。このため、酸素または構造内の造影剤の濃度の存在下に造影剤の蛍光の消光など試料内の形式または機能と相関する放出寿命を有する画像診断薬を用いた場合は、放出強度ではなく寿命の変化に基づく造影が実際的となる。このような寿命に基づく方法は、レーザー走査顕微鏡や、ヒト被験者の腫瘍など分散対象物の遠隔造影に同等の適用性を示すであろう。強度または位相に基づく放出データを導入するための適切な収集装置には、光電子増倍管、マイクロチャンネルプレート装置、フォトダイオード、電子なだれフォトダイオード、電荷結合装置および電荷結合装置アレイ、電荷注入装置および電荷注入装置アレイ、およびフォトグラフィックフィルムがあるが、これらに限定されるものではない。画像診断薬からの２光子励起放出を回復ための雑音低下法−変調及び第２高調波検出：２光子励起過程の本来的に低い効率は、２光子励起蛍光放出に対する散乱した未吸収励起光のきわめて高い比に変換することができる。さらに、このきわめて高い励起レベルの原因となると考えられる他の線形干渉の重要性は、検査下に試料中に存在する薬または他の種の単一光子励起蛍光、ラーマン散乱、および他の現象を含め、周囲光や他の光学的または電子的雑音源からの干渉を削減する必要とともに、すべては検出信号の適切な復調と結合した変調励起法により分析信号の干渉や回復の増強に対する最適な区別が得られることを示す。実際に、Ｄｅｎｋら（米国特許第５，０３４，６１３号）により報告された背景からの干渉は、レーザーのパルス繰返し周波数での復調を含めて、適切な変調法および復調法を使用した場合には大きく回避されるとみられ、このような方法の使用により、それらの顕微鏡の信号対雑音（ＳＮＲ）性能が劇的に改善される。一般に、変調では以下の１種類以上によるほぼすべての測定の検出性能を改善することができる：（１）連続背景または雑音源の拒絶−Ｄｅｎｋの２光子レーザー走査顕微鏡の例において、ロックイン増幅器（ＬＩＡ）またはヘテロダイン復調器などの装置を用いた検出器信号のその後の復調による励起源の変調により、変調周波数に密接に関係した周波数帯に対する検出システム反応が制限される。この復調の位相感度を調節することにより、変調パターンと結合されない、または密接に適合される信号に対して追加の区別が達成される。このため、変調周波数および復調位相の適切な選択により、特殊な周波数での室内光や電子的雑音など雑音源からの干渉、例えば近くの電気モータからの干渉を大幅に拒絶することができる。この方法は同様にヒト被験者における腫瘍など分散した対象物の遠隔造影にも有効である。（２）広帯域または「ピンクノイズ」源の拒絶−測定に使用される電子機器および他の装置とともに、測定環境は測定の多くの場合にピンクノイズと呼ばれる広帯域雑音の原因となる。この固有雑音の影響は帯域幅制限検出法により大きく削減することができる。特に、与えられた光学的測定値について、確認される信号電圧Ｖ_SIGNALは検出器入力電流ｉ_INPUTと関係づけられ、検出器と相互作用する光子により生じ、入力インピーダンスＺ_INPUTおよび検出システムの利得Ｇを掛け、以下の式に従って得られる：Ｖ_SIGNAL＝ｉ_INPUT・Ｚ_INPUT・Ｇ（１）一方、確認される雑音電圧Ｖ_NOISEは、雑音電流ｉ_NOISE、入力インピーダンス、検出システムの電子的または光学的帯域幅Ｂの平方根、および利得の積により、以下の式に従って近似値が得られる：Ｖ_NOISE＝ｉ_NOISE・Ｚ_INPUT・Ｂ^1/2・Ｇ（２）このため、ＳＮＲは以上の２つの電圧の比（Ｖ_SIGNAL／Ｖ_NOISE）から推計することができる。光倍増管（ＰＭＴ）など典型的な光学検出を用いて変調されていない蛍光信号を検出すると、この検出器により雑音電流に沿った一定の信号レベルが得られる。ＨａｍａｍａｔｓｕＲ９２８（７．４ｘ１０⁵Ａ／Ｗ放射陽極感度）などＰＭＴの例では、レベルが１０ｐＷでの光入力により７．４μＡｉ_SIGNAL が得られる。この信号電流を利得１００、入力インピーダンス５０Ω、入力雑音レベル５ｎＶ／√Ｈｚ、帯域幅１ＭＨｚを有する低雑音増幅器の電圧に変換した場合には、以下の信号が得られる：Ｖ_SIGNAL＝７．４μＡ・５０Ω、・１００＝３７ｍＶＶ_NOISE＝５ｎＶ／√Ｈｚ・（１０⁷Ｈｚ）^1/2 ・１００＝１．６ｍＶ注意すべきは、オームの法則Ｖ＝ｉ・Ｒは式２に示した雑音電流およびインピーダンスに替えられている。このため、この帯域幅の例では、ＳＮＲ＝２３である。この励起エネルギーを、例えば正弦的に１００％の変調深度により１ＭＨｚで変調した場合には、Ｖ_SIGNALの値は約１８．５ｍＶに低下する（この変調は、最高励起出力を変更することなく平均出力の５０％の全体的損失をきたす周期減衰または他の損失に基づく変調法を仮定）。しかし検出システムで１ｋＨｚの帯域幅を有する１ＭＨｚで帯域幅制限復調を使用した場合には、最高雑音は以下の信号よりも迅速に低下し、Ｖ_NOISE＝５ｎＶ／√Ｈｚ・（１０³Ｈｚ）^1/2・１００＝１６μＶ全体的なＳＮＲは約１２００に増大する。このため、多くの形式の変調を用いると一部の信号強さが失われるが、それ以上にＳＮＲの全体的な増大によりこの損失が補償される。さらに、例えば検出器に漏れる周囲光から検出器反応に線形干渉が認められる場合には、帯域幅検出スキーマはこれを追加の雑音源として検出するが、変調された帯域幅制限スキーマはこの干渉を拒絶する。周囲漏れにより、ＰＭＴでは１μＡの背景信号が生じ、これが５ｍＶの背景信号に変換される。変調されていない場合は、この背景Ｂからの光学ショット雑音が検出される総光子の平方根に等しくなり、ＳＮＲ＝Ｓ／（Ｓ＋Ｂ）^1/2であり、これにより約５．７の推定ＳＮＲが得られる。注目すべきは、変調された場合のＳＮＲが基本的に無変化であることである。この分析は同様にレーザー走査顕微鏡およびヒト被験者の腫瘍など分散対象物の遠隔造影に適用可能である。（３）変調周波数での線形干渉の拒絶−２光子励起の固有の低い効率の結果として、２光子励起蛍光放出に対する散乱した未吸収励起光の比は一般的にきわめて高い。これには弾性および非弾性散乱ならびに単一光子励起蛍光から生じる変調周波数での線形干渉がある。２光子放出をこれらの光学背景現象とスペクトル的に区別するために光学的濾過が多用される。残念ながら、これらの干渉は、スペクトル手段のみを用いて削減することはきわめて困難または不可能である。こうした残留性干渉源を拒絶するための代替として、純粋な２光子信号を回復するための一般的な方法では、励起出力レベルに対するいくつかの励起出力レベルでの検出信号の回帰を利用し、二次２光子励起蛍光成分を線形干渉から数学的に抽出することができ、これにより総蛍光反応Ｉ_rのモデルとして次式が使用される：Ｉ_r＝αＩ_L＋βＩ² _L （３）式中、Ｉ_Lは瞬間励起強度、αは各種線形影響の比例定数、βは２光子励起蛍光の比例定数を示す。この回帰に基づく方法は時間の単位当たりの必要な測定数が少ない実験室での応用に適切であるが、多重点光学造影の場合など、総データ捕捉時間を最小限にする必要がある場合には時間がかかりすぎ、複雑すぎて実用的ではない。いくつかの出力レベルでの多重測定の実行の必要性がなくなる第二高調波検出など、時間的拒絶法によりはるかに迅速な結果を得ることができる。Ｆｒｅｅｍａｎら（Ｒ．Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＦ．Ｅ．Ｌｙｔｌｅ，「正弦的に変調された２光子励起蛍光の第二高調波検出」、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２（１９９０）２２１６− ２２１９）は、励起源の正弦変調を用いて２光子励起蛍光のみに関係した変調周波数の２倍での信号を発生する、化学的サンプルの分析に有効な第二高調波を開示している。変調周波数に関連したロックイン増幅器を用いて、変調周波数の第二高調波で純粋な２光子信号を回復する。第二高調波蛍光信号は生じる全２光子蛍光の約１２％にすぎないが、それ以上に改善された線形干渉の拒絶により絶対信号レベルの損失が補償され、全体的なＳＮＲの増大が得られる。このため、第二高調波検出法は、散乱およびその潜在的な高いデータ帯域幅の拒絶におけるその固有の効率の結果として、レーザー走査顕微鏡およびヒト被験者の腫瘍など分散対象物の遠隔造影に理想的に適用可能である。こうした利点は、第二高調波を用いた造影システムにより、各点で最小のドウェル時間、および各点での各測定に最大の励起出力を使用して、純粋の２光子励起放出信号を確実に得ることができる。２光子励起画像診断における変調法の使用での先に列挙した利点は、データが放出強度または励起状態の寿命の測定に基づき捕捉されるかどうかに関係なく同じく十分に適用される。実際に、寿命の測定値は、変調波形と検出信号との間の位相シフトの決定に基づく位相測光法を用いて最も容易に感度よく測定される。このため、第二高調波検出に基づくものを含む変調法は、周囲や機械の雑音源ならびに散乱および検査を受けている試料内で発生する他の現象からの干渉が削減される、２光子励起蛍光の有効な検出における重要な利用性を有することは明らかである。ヒトの組織など光学的に稠密な媒体では、２光子励起蛍光放出に対する散乱した未吸収励起光のきわめて高い比により、このような方法の使用がきわめて重要となる。このため、臨床的画像適用または２光子レーザー走査顕微鏡では、本願で述べた変調法の使用がつねに有利となる。２光子励起造影における造影剤−内因性薬および外因性薬：前述の考察により、非線形２光子励起を用いて、光学的に稠密な媒体に存在する光学的に励起可能な分子薬の浸透の特異性および深度における重要な改善を達成することができ、検出性能がそれぞれの励起過程および検出過程でコード化およびコード解読を行うことで改善できることがわかる。２光子励起法を用いた場合に可能な励起の例外的な空間的局在化を利用し、励起点におけるコントラストを大幅に改善することができる。この局在励起が達成されると、これにより放出される分析光は種々の検出法を用いて検出することができる。この励起点を、例えば試料に対して焦点の位置を走査することや焦点にたいして試料の位置を走査することにより、検査下に試料に対して移動させた場合は、励起点の局在化とそれにより生じる放出光との間を相関させることで、二次元または三次元画像を生成することができる。しかし、この画像における有効なコントラストも分子薬または放出の原因となる薬の濃度または局所環境における差の存在に左右される。これらの薬は試料に対して内因性または外因性でもあり、造影は最終的に試料内の構造または機能における不均質性に関係づけられる薬の局在放出におけるコントラストに基づく。このため、非線形画像診断におけるこれらの造影剤の役割を注意深く考察することが重要である。種々の内因性の発色団薬が、特に疾患組織の画像診断用に有効であると考えられる。疾患組織と非疾患組織、種々の内部構造物と高等動物、または異なる範囲の健常組織または健常に近い組織、それぞれの間の構造的または生理学的な差により、芳香族アミノ酸、タンパク質、核酸、細胞エネルギー交換蓄積物（アデノシン三リン酸など）、酵素、ホルモン、または他の薬など天然発色団薬の濃度または局所環境は、構造的または機能的の不均質性を検査するために有効であるという点で変動する。このため、不均質性のこうした内因性指示薬は２光子励起を用いて非侵襲的に検査することができる。残念ながら、多くの場合において、このような薬で可能な特異性は有意義な画像診断を達成するには不十分であり、そこで外因性薬を試料に添加する必要がある。伝統的な外因性薬は、投与後の試料の特異的組織、臓器、または他の構造単位に準選択的に配分される。これらの薬の投与経路は典型的に局所適用または全身投与による。理想的な条件下で、これらの薬は関連構造物に配分され、もしくは凝縮し、またはこれらの構造物から優先的に排除されることもある。この凝縮は表在構造物への直接的な分離した局所適用の結果、または構造物への薬の配分をもたらす構造物の物理的または化学的な特性の内因性の差によるとみられる。それにより、高濃度と低濃度の部分間のコントラストを構造的または生理学的な不均質性を検査するための基礎として用いることができる。または、外因性薬は試料全体にわたって浸透し、染色シフト、消光、または寿命など外因性薬の放出特性が生理学的不均質性に対して感受性である場合は、これらの造影剤のパラメータは造影におけるコントラストの基礎として用いることができる。分子薬の放出特性は励起状態とその環境の基本的な特性により決定されるため、薬を励起状態に促進する原因となる機構は励起状態の放出特性に対して有意な影響を示さない。このため、単一光子励起条件下に十分に作用する分子診断または造影剤は、２光子励起条件下に同様の挙動を示すと予想される。一般に、単一光子励起に有効である造影剤はいずれも２光子励起と用いることができ、励起の部位にわたる調節の強化により画像の解像度が改善される。適切な造影剤には、生体染料または着色剤に用いられる多くの分子薬、および光力学的療法（ＰＤＴ）に用いられる多くの分子薬がある。標準ＰＤＴ薬は、一般に薬と、癌病変など組織の化学的および物理的な特性の結合に基づく組織特異性を有する。これらの薬は光学エネルギーの有効な吸収体であり、多くの場合にルミネセンスである。例えば、・ソラレンおよびその誘導体（５−メトキシソラレン〔または５−ＭＯＰ〕；８−メトキシソラレン〔８−ＭＯＰ〕；４，５’，８−トリメチルソラレン〔ＴＭＰ〕；４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン〔ＡＭＴ〕；５−クロロメチル−８−メトキシソラレン〔ＨＭＴ〕；アンゲルシン〔イソソラレン〕；５−メチルアンゲルシン〔５−ＭＩＰ〕；および３−カルボキシソラレンソラレンを含む）；・各種ポリフィリン誘導体およびヘマトポルフィリン誘導体（ヘマトポルフィリン〔ＨＰＤ〕；フォトフリンＩＩ；ベンゾポルフィリン誘導体〔ＢＰＤ〕；フォトポルフィリンＩＸ〔ＰｐＩＸ〕；色素ヘマトポルフィリンエーテル〔ＤＨＥ〕；ポリヘマトポルフィリンエステル〔ＰＨＥ〕；プロトポルフィリンの１３，１７−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−ジメチルエチルエタンアミンエステル〔ＰＨ１００８〕；テトラ（３−ヒドロキシフェニル）−ポルフィリン〔３−ＴＨＰＰ〕；モノスルホン酸テトラフェニルポルフィリン〔ＴＰＰＳ１〕；ニスルホン酸テトラフェニルポルフィリン〔ＴＰＰＳ２ａ〕；ジヘマトポルフィリンエーテル、メソテトラフェニルポルフィリン；および各種テトラアザポルフィリン（オクタ−（４−第三−ブチルフェニル）−テトラピラジノポルフィラジン〔ＯＰＴＰ〕；テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアニン〔ｔ₄−ＰｃＨ₂〕；およびテトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアン酸マグネシウム〔ｔ₄ −ＰｃＭＧ〕を含む）とともにメソテトラ（４Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン〔Ｔ４ＭｐｙＰ〕を含む）；・各種フタロシアニン誘導体（スルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン〔ＣＡＳＰｃ〕；テトラスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン〔ＡｌＰｃＴＳ〕；１−、２−、３−、４−スルホン酸アルミニウムフタロシアニン〔ＡｌＳＰｃ、ＡｌＳ２Ｐｃ、ＡｌＳ３Ｐｃ、ＡｌＳ４Ｐｃを含む〕；シリコーンフタロシアニン〔ＳｉＰｃＩＶ〕；亜鉛IIフタロシアニン〔ＺｎＰｃ〕；ビス（ジイソブチルオクタデシルシロキシ）シリコーン２，３−ナフタロシアニン〔ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ〕；およびゲルマニウムＩＶオクタブトキシフタロシアニン〔ＧｅＰｃ〕・各種ローダミン誘導体（ローダミン１０１〔Ｒｈ−１００；ローダミン１１０〔Ｒｈ−１１０〕；ローダミン１２３〔Ｒｈ−１２３〕；ローダミン１９〔Ｒｈ−１９〕；ローダミン５６０〔Ｒｈ−５６０〕；ローダミン５７５〔Ｒｈ−５７５〕；ローダミン５９０〔Ｒｈ−５９０〕；ローダミン６１０〔Ｒｈ−６１０〕、ローダミン６４０〔Ｒｈ−６４０〕、ローダミン６Ｇ〔Ｒｈ−６Ｇ〕；ローダミン７００〔Ｒｈ−７００〕；ローダミン８００〔Ｒｈ−８００〕；ローダミンＢ〔Ｒｈ−Ｂ〕；スルホローダミン６４０または１０１；およびスルホローダミンＢを含む）；・各種クマリン誘導体（１、２、４、６、６Ｈ、７、３０、４７、１０２、１０６、１２０、１５１、１５２、１５２Ａ、１５３、３１１、３０７、３１４、３３４、３３７、３４３、４４０、４５０、４５６、４６０、４６１、４６６、４７８、４８０、４８１、４８５、４９０、５００、５０３、５０４、５１０、５１９、５２１、５２２、５２３、５３５、５４０、５４０Ａ、５４８を含む）；・各種ベンゾフェノキサジン誘導体（５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム〔ＥｔＮＢＡ〕；５−エチル−アミノ−９−ジエチル−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム〔ＥｔＮＢＳ〕；および５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノセレナジニウム〔ＥｔＮＢＳｅ〕を含む）；・クロロプロマジンおよびその誘導体；・各種クロロフィール誘導体およびバクテリオクロロフィール誘導体（バクテリオクロリン〔ＢＣＡ〕）；・二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（ＲｕＢＰＹ）など各種メタルーリガンド複合体；・フェオフォルバイドａ〔Ｐｈｅｏａ〕；メロシイアミン５４０〔ＭＣ５４０〕；ビタミンＤ；５−アミノ−レブリン酸〔ＡＬＡ〕；フォトサン；クロリンｅ６、クロリンｅ６エチレン−ジアミド、モノ−Ｌ−アスパチャールクロリンｅ６；フェノフォルバイド−ａ〔Ｐｈ−ａ〕；フェノキサジンナイルブルー誘導体（各種フェノキサジン色素を含む）；・スチルベン、スチルベン誘導体、および４−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル）−アミノフェニル）−４’−（６−ヒドロキシヘキシルスルフォニル）スチルベン（ＡＰＳＳ）など各種電荷移動薬およびrediative移動薬；および・その他多数の光活性または光感受性薬、は一般に適用の点もしくは点の近く、または半選択的にＰＤＴ薬の組織への分割につながる組織の物理的または化学的特性による特殊組織内のいずれかで蓄積され、いったん蓄積されると、このような薬は２光子励起に対して感受性となり、それらの発光または他の放出特性を用いて画像データを得ることができる。光を吸収し、１種類以上の他の薬にその後のエネルギーの変換可能な他の光活性薬を用いることができ、この光活性薬は単独またはこの転換エネルギーを受け入れたり、これを放射放出に変化することが可能な１種類以上の反応性薬と併用して用いることができる。２光子励起造影における生体造影剤：理想的な条件下において、標準造影剤は特異的組織に対する化学的または物理的な結合活性に基づく標的特異性を誘導する。このようにして、造影剤の分配またはその他の場合は関連組織に凝縮する。残念ながら、この標的特異性は通常は完全ではない。実際に、薬剤用途の目的における特異性を増大するための改善された方法を得ることが望ましい。このような特異性における改善を達成するための手段は、構造、機能、または疾患の特異的生物的特徴の利用に基づくものである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド薬を、ＦＩＴＣなど１種類以上の光活性分子に結合することにより、相補性の遺伝子コード化を含む癌細胞など特異的細胞のみを選択的に標識することが可能である新しい生物造影剤が生成される。さらに、基本的な方法は、生物プローブに使用されるオリゴマーコードを変更することにより多数の遺伝子に基づく疾患または他の障害に容易に拡大される。同時２光子活性の使用により、同時２光子光活性過程に固有の生物プローブと高い空間的位置決めの結合生物特異性を用いて適用されるこの強力な方法が可能となる。このため、コントラストがきわめて高く、解像度がきわめて高い造影が、特定の臓器、組織、または病変に対してきわめて特異的に目標として設定される薬剤を用いた遺伝子レベルで可能となる。生体プローブのための最適なデザインでは、生体薬と標的部位とのあいだの複合化時に変化する放出特性を有する１種類以上の光活性分子を利用する。特に、複合化時の放出波長または寿命を利用して一般的な方法の感受性を増大することができるが、これはこのような変化により複合剤を含む部分と未複合剤を含む部分との間のコントラストが増大されるためである。その一例が、発生放出が急冷されなくなる複合化が発生するまでに急冷される光活性分子に基づく薬剤である。別の例が、アンチセンス生体配列につながれるソラレンなど介在性光活性分子に基づく薬剤であり、アンチセンス配列とその標的配列との間の複合化時には、光活性分子の介在が可能となる、光活性分子の放出特性において有色シフトされる。前述の考察により、単なる遺伝子手段ではなく免疫学的手段など別の生体特異的手段に基づく標的設定方法も本発明の態様範囲内であることが明らかである。特に、抗体プローブが光活性群に結合されている抗原−抗体法に基づく薬剤特異性により、疾患および感染の診断のための強力な新しい手段が得られる。薬剤標的設定における生体特異性を達成するための追加の手段として、リガンド、ハプテン、糖質、脂質、タンパク受容体または複合薬、キレート薬、およびリポソーム、フラーレン、クラウンエーテル、シクロデキストリンなど被包性賦形剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の第１の実施例：したがって、本発明の特に好ましい実施例は、ＮＩＲ源の出力を用いて、従来の単一光子光活性に必要な約２倍の波長での光を用いることにより試料中に存在する内因性または外因性の画像診断剤の同時２光子光活性を誘発することである。この好ましい実施例を図１１に示す。ＮＩＲ源１０８はＮＩＲ放射の一連の急速な最高出力パルスからなるＮＩＲ放射１１０のビームを発生させる。例えば、標準の市販モードロック型チタン：サファイアレーザーは持続時間＜２００ｆｓのモードロック型パルスおよび７５ＭＨｚを超えるパルス繰返し周波数で約２０ｎＪのパルスエネルギーの出力が可能であり、この源は約６９０〜１０８０ｎｍからのＮＩＲ波長帯にわたって連続的に調節可能である、比較的低い平均出力（数ワットまで）であるが、最高出力（約１００ｋＷ）を有する光の準連続ビームを発生させる。ＮＩＲ源１０８により放出されるパルス列は、反射または屈折レンズ１１２など標準光学手段を用いて容易に焦点が合わせられるＮＩＲ放射１１０のビームを構成する。そして焦点の合ったＮＩＲビーム１１４は造影すべき試料１１６に方向づけられる。画像診断剤の同時２光子光活性は、焦点にのみ存在する高い同時照射レベルにより焦点ビーム１１４の共焦点部１１８に実質的に限定されることになる。試料１１６中の散乱する励起光１２０は共焦点部１１８の外側部分に存在する画像診断剤の有意な励起のための十分な同時照射レベルを示さない。共焦点部１１８に存在する画像診断剤分子により放出される光１２２は実質的に等方的に共焦点部１１８を出る。放出光１２４の部分は、試料１１６の内側または外側の位置に取付けられた光倍数管など検出手段１２６により捕捉される。この検出手段１２６は、光バンドパスフィルタなど波長選択手段１２８と適合され、光バンドフィルタにより、波長または原則的に診断剤からの放出の特徴を示すものに対応する各波長での光の主要な断片を通過する間に弾性に散乱される光の主要な断片を選択手段１２８が拒否するように放出光１２４の捕捉部分が前処理される。こうして検出手段１２６から放出される信号１３０は、その主な目的が共焦点部１１８の位置の関数としての画像診断剤からの放出反応記録をすることであるプロセッサ手段１３２により捕捉される。試料１１６の容量全体にわたって走査させることにより、共焦点部１１８の位置の関数としてプロセッサ手段１３２の内容を検査することで試料１１６の完全な画像を得ることができる。この画像を用いて皮下腫瘍または他の疾患部など関連区域１３４を同定することができる。本発明の第２の実施例：この好ましい実施例の代替として、変調手段を図１１に示した一般的な実施例に組み込むことができ、環境または機械による雑音源の拒絶を改善したり、第２高調波で純粋な２光子励起放出の回復を可能にしたり、位相測光法を用いて放出光の検出を促進したりするなど、造影システムの全体的な性能を改善することができる。特に、図１２はＮＩＲ源１０８により放出されるＮＩＲ放射１１０のビームと相互作用するように位置決めされた電子光学または音響光学変調器、チョッパ、または他の手段など変調手段１３６を用いて、駆動信号１４０を変調手段１３６に供給する変調ドライバ１３８の出力に規則される変調パターンによりＮＩＲ放射１１０のビームをコード化することができる。これにより得られるＮＩＲ放射１４２の変調ビームは図１１について前述した試料１１６に方向づけられる。これにより得られる２光子励起放出光１４４は基本的に等方的に共焦点部１１８を出ることになる。しかし、図１１について前述した同様の放出光１２２とは対照的に、この放出光１４４はＮＩＲ放射１４２の変調ビームの変調と基本的に同期し、次に変調ドライバ１３８により放出される駆動信号１４０と同期する変調を示す。変調放出光１４４の一部は、試料１１６の内側または外側の部分に取付けられる光倍数管など検出手段１２６により捕捉される。この検出手段１２６は、光バンドパスフィルタなど波長選択手段１２８と適合され、光バンドフィルタにより、波長または原則的に診断剤からの放出の特徴を示すものに対応する各波長での光の主要な断片を通過する間に弾性に散乱される光の主要な断片を選択手段１２８が拒否するように変調放出光１４６の捕捉部分が処理される。こうして検出手段１２６から放出される信号１４８はプロセッサ手段１５０により捕捉される。プロセッサ手段１５０は２つの主要な目的に使用され、第一に変調ドライバ１３８により放出される変調基準出力１５２を用いて検出手段１２６から放出される変調信号１４８を復調し、第二に共焦点部１１８の位置の関数として画像診断剤からの復調放出反応を記録する。このため、試料１１６の容量全体にわたって走査させることにより、共焦点部１１８の位置の関数としてプロセッサ手段１５０の内容を検査することで試料１１６の完全な画像を得ることができる。この画像を用いて皮下腫瘍または他の疾患部など関連区域１３４を同定することができる。本発明の第３の実施例：この好ましい実施例の第２の代替として、ＮＩＲ放射の焦点が合っていないビームを用いて試料の表在部を照射し、検出の直接的な造影手段を提供することができる。これは図１３に示されている。特に、モデルロック型チタン：サファイヤレーザーなどＮＩＲ源の出力を用いて、従来の単一光子光活性のために必要な約２倍の波長での光を用いた試料の表面上またはその近くに存在する内因性または外因性の画像診断剤の同時２光子光活性を誘発することができる。ＮＩＲ源１０８により、ＮＩＲ放射の迅速な一連の高い最高出力パルスからなるＮＩＲ放射１１０のビームが得られる。このビームはＮＩＲ源１０８により放出されるＮＩＲ放射１１０のビームと相互作用するように位置決めされた変調手段１３６を用いて変調される。この変調手段１３６は駆動信号１４０を変調手段１３６に供給する変調ドライバ１３８の出力に記録される変調パターンによりＮＩＲ放射１１０のビームをコード化する。これにより得られるＮＩＲ放射１４２の変調ビームは反射または屈折光学レンズ１５４など標準光学手段を用いて焦点がぼかされ、造影されるべき試料１１６に方向づけられる発散励起ビーム１５６を発生する。試料１１６の表面上またはその近くに存在する画像診断剤の同時２光子光活性により、ＮＩＲ放射１４２の変調ビームの変調と基本的に同期し、次に変調ドライバ１３８により放出される駆動信号１４０と同期する変調を有する変調２光子励起放出光１４４が得られる。変調放出光１４６の一部分は、試料１１６の外側の部分に取付けられる電荷結合装置アレイなど画像検出手段１５８により捕捉される。この画像検出手段１５８は、光バンドパスフィルタなど波長選択手段１２８と適合され、光バンドフィルタにより、波長または原則的に診断剤からの放出の特徴を示すものに対応する各波長での光の主要な断片を通過する間に弾性に散乱される光の主要な断片を選択手段１２８が拒否するように変調放出光１４６の捕捉部分が処理される。画像検出手段１５８からこうして放出される変調信号１６０はプロセッサ手段１６２により捕捉される。プロセッサ手段１６２は２つの主要な目的に使用され、第一に変調ドライバ１３８により放出される変調基準出力１５２を用いて画像検出手段１５８から放出される変調信号１６０を復調し、第二に放出位置の関数として画像診断剤からの復調放出反応を記録する。このため、この代替実施例により、試料１１６の照射表面上の２光子励起放出における空間的差に基づいて実施されるべき皮膚癌病変など表面部１６４の直接的なビデオグラフィック造影が可能となる。上述した要素のそれぞれ、または２種類以上は、上述した種類と異なる構成または適用の別の種類における有効な適用が見いだされると理解される。本発明は分子診断的造影剤の光活性における選択性を改善するための一般的な方法において実施されるものとして図示され説明されているが、示された詳細に限定することを意図されていない。これは図示した方法の形態や詳細およびその操作における種々の省略、修正、変換および変更が、本発明の精神からいかなる方法においても離れることなく、当業者により行うことができるためである。例えば、第３の実施例において、変調および復調の詳細はさらに簡単な造影装置を得るために省略することができるが、この変形例により造影性能の全体的な低下が生じるとみられる。さらに分析を行うことなく、前記は、現在の知識を適用することにより、先行技術の立場から、本発明の包括的または特殊な態様の本質的な特徴を正しく構成する特徴を省略することなく各種適用のために容易にこれを適用することができる本発明の要旨を完全に示すものである。新規性があり特許証により保護されるべき望ましい請求の範囲を添付クレームに記載する。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１１月４日（１９９９．１１．４）【補正内容】請求の範囲１．特定量の植物または動物組織を撮像するための方法において、前記植物または動物組織は少なくとも１つの光活性分子薬を含む方法であって、（ａ）植物または動物組織の特定量を植物または動物組織の特定量に含まれる前記光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で処置するステップと、（ｂ）前記特定量の植物または動物組織における前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つを光活性することにより、少なくとも１つの光活性分子薬を生成するステップであって、該少なくとも１つの光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、（ｃ）前記少なくとも１つの光活性分子薬により放出されるエネルギーを方向づけるステップと、（ｄ）特定量の植物または動物組織の特徴を示す検出されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。２．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光はレーザー光であることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。３．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光は焦点をあわせた光ビームであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。４．前記焦点を合わせた光は焦点を合わせたレーザ一光であることを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。５．前記植物または動物組織を少なくとも１つの光活性分子薬で処置する第１のステップをさらに含み、前記特定量の植物または動物組織は前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも一部を保持することを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。６．前記少なくとも１つの光活性分子薬は、ソラレン、５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、４，５’，８−トリメチルソラレン（ＴＭＰ）、４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ＡＭＴ）、５−クロロメチル−８−メトキシソラレン（ＨＭＴ）、アンゲルシン（イソソラレン）、５−メチルアンゲルシン（５−ＭＩＰ）、３−カルボキシソラレン、ポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、フォトフリンＩＩ、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）、フォトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、色素ヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、ポリヘマトポルフィリンエステル（ＰＨＥ）、プロトポルフィリンの１３，１７−Ｎ，Ｎ，Ｎ，− ジメチルエチルエタンアミンエステル（ＰＨ１００８）、テトラ（３−ヒドロキシフェニル）−ポルフィリン（３−ＴＨＰＰ）、モノスルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ１）、二スルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ２ａ）、ジヘマトポルフィリンエーテル、メソテトラフェニルポルフィリン、メソテトラ（４Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭｐｙＰ）、オクタ −（４−第三−ブチルフェニル）テトラピラジノポルフィラジン（ＯＰＴＰ）、フタロシアニン、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアニン（ｔ₄−ＰＣＨ₂ ）、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアン酸マグネシウム（ｔ₄−ＰｃＭＧ）、スルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）、テトラスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＴＳ）、モノスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ２Ｐｃ）、トリスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ３Ｐｃ）、テトラスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ４Ｐｃ）、シリコーンフタロシアニン（ＳｉＰｃＩＶ）、亜鉛IIフタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ビス（ジイソブチルオクタデシルシロキシ）シリコーン２，３−ナフタロシアニン（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）、ゲルマニウムＩＶオクタブトキシフタロシアニン（ＧｅＰｃ）、ローダミン１０１（Ｒｈ−１０１）、ローダミン１１０（Ｒｈ −１１０）、ローダミン１２３（Ｒｈ−１２３）、ローダミン１９（Ｒｈ−１９）、ローダミン５６０（Ｒｈ−５６０）、ローダミン５７５（Ｒｈ−５７５）、ローダミン５９０（Ｒｈ−５９０）、ローダミン６１０（Ｒｈ−６１０）、ローダミン６４０（Ｒｈ−６４０）、ローダミン６Ｇ（Ｒｈ−６Ｇ）、ローダミン７００（Ｒｈ −７００）、ローダミン８００（Ｒｈ−８００）、ローダミンＢ（Ｒｈ−Ｂ）、スルホローダミン１０１、スルホローダミン６４０、スルホローダミンＢ、クマリン１、クマリン２、クマリン４、クマリン６、クマリン６Ｈ、クマリン７、クマリン３０、クマリン４７、クマリン１０２、クマリン１０６、クマリン１２０、クマリン１５１、クマリン１５２、クマリン１５２Ａ、クマリン１５３、クマリン３１１、クマリン３０７、クマリン３１４、クマリン３３４、クマリン３３７、クマリン３４３、クマリン４４０、クマリン４５０、クマリン４５６、クマリン４６０、クマリン４６１、クマリン４６６、クマリン４７８、クマリン４８０、クマリン４８１、クマリン４８５、クマリン４９０、クマリン５００、クマリン５０３、クマリン５０４、クマリン５１０、クマリン５１５、クマリン５１９、クマリン５２１、クマリン５２２、クマリン５２３、クマリン５３５、クマリン５４０、クマリン５４０Ａ、クマリン５４８、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＡ）、５−エチル−アミノ−９−ジエチル−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＳ）、５ −エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノセレナジニウム（ＥｔＮＢＳｅ）、クロロプロマジン、クロロプロマジン誘導体、クロロフィール誘導体、バクテリオクロロフィール誘導体、メタル−リガンド複合体、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（ＲｕＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ロジウム（ＩＩ）（ＲｈＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）白金（ＩＩ）（ＰｔＢＰＹ）、フェオフォルバイドａ、メロシイアミン５４０、ビタミンＤ、５−アミノーレブリック酸、フォトサン、クロリンｅ６、クロリンｅ６エチレン−ジアミド、モノ−Ｌ−アスパチャールクロリンｅ６、フェノキサジンナイルブルー誘導体、スチルベン、スチルベン誘導体、４−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル）−アミノフェニル）−４’ −（６−ヒドロキシヘキシルスルフォニル）スチルベン（ＡＰＳＳ）、および標準生物学的着色剤や染料を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。７．前記少なくとも１つの光活性分子薬は特定量の植物または動物組織内の特定組織に対して特異的である少なくとも１つの生体光活性分子薬であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。８．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンド、ハプテン、炭水化物受容体または複合物質、脂質受容体または複合物質、タンパク質受容体または複合物質、キレート剤、および被包担体を含む群から選択される部分を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。９．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬はさらに同時２光子励起を励起するのに十分な光を当てた時に光活性である部分を含むことを特徴とする請求の範囲８に記載の方法。１０．前記特定量の植物または動物組織に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で前記特定量の植物または動物組織を処置するステップは、（ａ１）特殊な変調を有する光源からの光を変調し、変調光を生成するステップと、（ａ２）前記特定量の植物または動物組織に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な前記変調光で前記特定量の植物または動物組織を処置するステップと、を含み、さらに、（ｅ）前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップと、（ｆ）前記特定量の植物または動物組織の特徴を示す変調されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。１１．前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップは、前記特殊な変調の２倍の周波数で検出されたエネルギー信号を変調することにより、前記特殊な変調の第２高調波を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲１０に記載の方法。１２．前記特定量の植物または動物組織の特徴を示す変調されたエネルギー信号は、前記特定量の植物または動物組織に存在する少なくとも１つの光活性分子薬の寿命の変化を表すことを特徴とする請求の範囲１０に記載の方法。１３．特定量の材料を撮像するための方法において、該材料は少なくとも１つの光活性分子薬を含む方法であって、（ａ）前記特定量の材料に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つの同時２光子励起を励起するのに十分な光で前記特定量の材料を処置するステップと、（ｂ）前記特定量の材料における前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つを光活性化することにより、少なくとも１つの光活性分子薬を生成するステップであって、該少なくとも１つの光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、（ｃ）前記少なくとも１つの光活性分子薬により放出されるエネルギーを方向づけるステップと、（ｄ）前記特定量の材料の特徴を示す検出されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。１４．前記材料は植物組織および動物組織を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１５．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光はレーザー光であることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１６．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光は焦点を合わせた光ビームであることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１７．前記焦点を合わせた光ビームは焦点を合わせたレーザー光であることを特徴とする請求の範囲１６に記載の方法。１８．前記材料を少なくとも１つの光活性分子薬で処置する第１のステップをさらに含み、前記特定量の材料は前記少なくとも１つの光活性分子薬の一部を保持することを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１９．前記少なくとも１つの光活性分子薬は、ソラレン、５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、４，５’，８−トリメチルソラレン（ＴＭＰ）、４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ＡＭＴ）、５−クロロメチル−８−メトキシソラレン（ＨＭＴ）、アンゲルシン（イソソラレン）、５−メチルアンゲルシン（５−ＭＩＰ）、３−カルボキシソラレン、ポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、フォトフリンＩＩ、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）、フォトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、色素ヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、ポリヘマトポルフィリンエステル（ＰＨＥ）、プロトポルフィリンの１３，１７−Ｎ，Ｎ，Ｎ，− ジメチルエチルエタンアミンエステル（ＰＨ１００８）、テトラ（３−ヒドロキシフェニル）−ポルフィリン（３−ＴＨＰＰ）、モノスルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ１）、二スルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ２ａ）、ジヘマトポルフィリンエーテル、メソテトラフェニルポルフィリン、メソテトラ（４Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭｐｙＰ）、オクタ −（４−第三−ブチルフェニル）テトラピラジノポルフィラジン（ＯＰＴＰ）、フタロシアニン、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアニン（ｔ₄−ＰＣＨ₂ ）、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアン酸マグネシウム（ｔ₄−ＰｃＭＧ）、スルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）、テトラスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＴＳ）、モノスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ２Ｐｃ）、トリスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ３Ｐｃ）、テトラスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ４Ｐｃ）、シリコーンフタロシアニン（ＳｉＰｃＩＶ）、亜鉛IIフタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ビス（ジイソブチルオクタデシルシロキシ）シリコーン２，３−ナフタロシアニン（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）、ゲルマニウムＩＶオクタブトキシフタロシアニン（ＧｅＰｃ）、ローダミン１０１（Ｒｈ−１０１）、ローダミン１１０（Ｒｈ−１１０）、ローダミン１２３（Ｒｈ−１２３）、ローダミン１９（Ｒｈ−１９）、ローダミン５６０（Ｒｈ−５６０）、ローダミン５７５（Ｒｈ−５７５）、ローダミン５９０（Ｒｈ−５９０）、ローダミン６１０（Ｒｈ−６１０）、ローダミン６４０（Ｒｈ−６４０）、ローダミン６Ｇ（Ｒｈ−６Ｇ）、ローダミン７００（Ｒｈ−７００）、ローダミン８００（Ｒｈ−８００）、ローダミンＢ（Ｒｈ−Ｂ）、スルホローダミン１０１、スルホローダミン６４０、スルホローダミンＢ、クマリン１、クマリン２、クマリン４、クマリン６、クマリン６Ｈ、クマリン７、クマリン３０、クマリン４７、クマリン１０２、クマリン１０６、クマリン１２０、クマリン１５１、クマリン１５２、クマリン１５２Ａ、クマリン１５３、クマリン３１１、クマリン３０７、クマリン３１４、クマリン３３４、クマリン３３７、クマリン３４３、クマリン４４０、クマリン４５０、クマリン４５６、クマリン４６０、クマリン４６１、クマリン４６６、クマリン４７８、クマリン４８０、クマリン４８１、クマリン４８５、クマリン４９０、クマリン５００、クマリン５０３、クマリン５０４、クマリン５１０、クマリン５１５、クマリン５１９、クマリン５２１、クマリン５２２、クマリン５２３、クマリン５３５、クマリン５４０、クマリン５４０Ａ、クマリン５４８、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＡ）、５−エチル−アミノ−９ −ジエチルーアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＳ）、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノセレナジニウム（ＥｔＮＢＳｅ）、クロロプロマジン、クロロプロマジン誘導体、クロロフィール誘導体、バクテリオクロロフィール誘導体、メタル−リガンド複合体、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（ＲｕＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２ ’−ビピリジン）ロジウム（ＩＩ）（ＲｈＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’− ビピリジン）白金（ＩＩ）（ＰｔＢＰＹ）、フェノフォルバイドａ、メロシイアミン５４０、ビタミンＤ、５−アミノ−レブリン酸、フォトサン、クロリンｅ６、クロリンｅ６エチレン−ジアミド、モノ−Ｌ−アスパチャールクロリンｅ６、フェノキサジンナイルブルー誘導体、スチルベン、スチルベン誘導体、４−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル）−アミノフェニル）−４’−（６−ヒドロキシヘキシルスルフォニル）スチルベン（ＡＰＳＳ）、および標準生物学的着色剤または染料を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲１８に記載の方法。２０．前記少なくとも１つの光活性分子薬は特定量の材料内の特定物質に対して特異的である少なくとも１つの生体光活性分子薬であることを特徴とする請求の範囲１８に記載の方法。２１．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンド、ハプテン、炭水化物受容体または複合物質、脂質受容体または複合物質、タンパク質受容体または複合物質、キレート剤、および被包担体を含む群から選択される部分を含むことを特徴とする請求の範囲２０に記載の方法。２２．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬はさらに同時２光子励起を励起するのに十分な光を当てた時に光活性である部分を含むことを特徴とする請求の範囲２１に記載の方法。２３．前記特定量の材料に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で前記特定量の材料を処置するステップは、（ａ１）特殊な変調を有する光源からの光を変調し、変調光を生成するステップと、（ａ２）前記特定量の材料に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な前記変調光で前記特定量の材料を処置するステップと、を含み、さらに、（ｅ）前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップと、（ｆ）前記特定量の材料の特徴を示す変調されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。２４．前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップは、前記特殊な変調の２倍の周波数で検出されたエネルギー信号を変調することにより、前記特殊な変調の第２高調波を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２３に記載の方法。２５．前記特定量の材料の特徴を示す変調されたエネルギー信号は、前記特定量の材料に存在する少なくとも１つの光活性分子薬の寿命の変化を表すことを特徴とする請求の範囲２３に記載の方法。２６．前記処置するステップは、焦点距離の範囲にわたって光ビームの焦点を合わせ、光ビームの焦点面が組織の表面と実質的に組織表面を超える点との間の位置に延びするようにするステップであって、前記処置するステップは組織内の深部に浸透するように延びることができることを特徴とする請求の範囲１に記載の撮像法。２７．光ビームが現存する間に、組織内の焦点距離の位置を変化させ、前記光活性するステップ、検出するステップ、および検出されたエネルギー信号を生成するステップは、前記組織表面と実質的に前記組織表面を超えて位置決めされた位置との間の位置に沿って生じることにより、前記撮像は三次元であることを特徴とする請求の範囲２６に記載の撮像法。２８．前記処置するステップはレーザーを操作し、約７５メガヘルツを超えるパルス繰返し周波数及びサブナノ秒パルス幅を有するパルス出力を生成することを特徴とする請求の範囲２７に記載の方法。２９．前記レーザーを操作し、近赤外光を生成するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２８に記載の方法。３０．前記レーザーは約２０ナノジュールのパルスエネルギーを生成することを特徴とする請求の範囲２９に記載の方法。３１．前記光活性するステップは前記少なくとも光活性分子薬の同時２光子励起を実施するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２９に記載の方法。３２．前記検出するステップは前記レーザーからの入射光の光路を後戻りすることがない放射光を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。３３．前記処置するステップはさらに前記レーザービームを変調するステップを含むとともに、前記検出するステップおよび前記生成するステップのうち選択された１つが波長選択ステップを含むことを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。３４．前記処置するステップおよび光活性化するステップは組織中の分子薬からのものであり、基本的に前記レーザー光の変調と同時性である放射光を生成するように配置されることを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。３５．少なくとも１つの光活性分子薬を含む特定量の植物または動物組織を撮像するための撮像装置において、平行光源であって、前記平行光は実質的に組織に浸透するのに効果的な周波数を有し、前記平行光は組織内に含まれる分子薬の同時２光子励起（ＴＰＥ）を励起するために適応される平行光源と、前記組織の表面から実質的に前記表面を超える深さまで延びる焦点距離の範囲にわたって前記平行光の焦点を合わせるための焦点を台わせる装置であって、焦点または焦点面が前記光源に対して調節可能であり、前記光源および焦点を合わせる装置は協働して前記分子薬のＴＰＥを励起する装置と、前記組織の最も近くに配置されるとともに位置決めされ、前記分子薬により放出され、前記組織上の光入射の光路を後戻りすることがない路に沿って進む前記光を検出する検出器であって、前記光源が焦点を合わせられている特定量の特徴を示す検出される信号を生成するように構成された前記検出器と、を含むことを特徴とする撮像装置。３６．前記光源は約７５メガヘルツを超えるパルス繰返し周波数及びサブナノ秒パルス幅を有するパルス出力を生成することを特徴とする請求の範囲３５に記載の装置。３７．前記光源は近赤外光を生成することを特徴とする請求の範囲３６に記載の装置。３８．前記光源は約２０ナノジュールのパルスエネルギーを生成することを特徴とする請求の範囲３７に記載の装置。３９．前記光源はレーザーを含むことを特徴とする請求の範囲３７に記載の装置。４０．前記検出器に結合されたプロセッサをさらに含むことを特徴とする請求の範囲３５に記載の装置。４１．前記光源と結合した変調システムをさらに含み、前記プロッセは前記変調システムに結合されていることを特徴とする請求の範囲４０に記載の装置。４２．医用画像診断のための方法において、光活性分子薬を組織に導入するステップであって、前記薬は関連組織の特異性で選択され、前記薬は２光子励起が可能であるステップと、前記薬を関連の特異的組織に蓄積させるステップと、実質的に組織表面より下の部分を含む組織内の関連の特異的部分に光を方向づけるステップであって、前記光は組織を浸透するとともに実質的に共焦点部のみでＴＰＥを促進する周波数およびエネルギーで選択されるステップと、前記組織の深さの範囲にわたって共焦点部の位置を調節するステップと、ＴＰＥを用い、前記組織内の深さの範囲にわたって前記薬を光活性することにより、共焦点部で光活性物質を生成し、前記光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、放出工ネルギーを検出するステップと、共焦点部で組織の特徴を示す検出されるエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。４３．前記光を検出するステップは、短パルス幅および高パルス繰返しレートで操作するパルスレーザーを用いて近赤外光を生成するステップと、前記レーザーを前記組織に焦点を合わせるステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。４４．前記位置を調節するステップは検査下の組織に対して共焦点部の位置を変化させるステップ、または固定共焦点部に対して検査下の組織の位置を変化させるステップを含むことを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。４５．前記方法はさらに組織上に入射する前の光を変調するステップと、放射光の検出からの信号を復調するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。４６．医用画像診断のための装置において、撮像すべき深部組織に拘束光を方向づけるための光源手段であって、前記光は組織表面より下に浸透し、実質的に共焦点部でのみＴＰＥを励起する周波数およびエネルギーで選択される光源と、撮像すべき組織の深さの範囲内で光の共焦点部の位置を変化させ、組織内の分子薬が２光子励起（ＴＰＥ）を用いて光活性となるための手段と、光活性分子薬が２光子励起を用いて励起された後に組織内の前記物質により放出される等方放射線を受け取るとともに検出するように位置決めされた検出手段と、を含むことを特徴とする装置。４７．前記光源手段は平行光ビームを生成するための手段を含むとともに、前記光源は組織表面より下の点で組織により位置決めされる共焦点部に平行光ビームの焦点をあわせるための焦点を合わせる手段を含むことを特徴とする請求の範囲４６に記載の装置。４８．平行光ビームを生成するための手段は近赤外スペクトルで操作するパルスレーザーを含むことを特徴とする請求の範囲４７に記載の装置。４９．特定量の繊維を変調された光で処理するステップに顕微鏡が使用されることを特徴とする請求の範囲９又は２３に記載されている方法。５０．特定量の繊維を変調された光で処理して、検出されたエネルギー信号を復調するステップに顕微鏡が使用されることを特徴とする請求の範囲９又は２３に記載される方法。５１．光を撮像される物質の方向に又は材料の中に導き、その光が材料の内部又は表面下に浸透して、撮像される領域のみで２光子励磁を実質的に促進するために周波数とエネルギーで選択されるための光源と、前記光をある変調タイプで変調して、それにより変調光を発生するための変調手段と、光活性分子薬が２光子励磁を使用して励磁された後に、材料の内部で光活性分子薬により放出される放射光を受け取り、検出するために配置される検出手段と、特定の光活性分子薬の特徴である復調エネルギー信号を発生するための復調手段と、前記復調エネルギー信号を収集して、処理するための処理手段とを具備することを特徴とする顕微鏡撮像装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者エイッチ．クライディースアメリカ合衆国テネシー州 37923 ノックスビルノースセダーブルフロード 790 サンチェイスアパートメント 1805

Claims

【特許請求の範囲】１．特定量の植物または動物組織を撮像するための方法において、前記植物または動物組織は少なくとも１つの光活性分子薬を含む方法であって、（ａ）植物または動物組織の特定量を植物または動物組織の特定量に含まれる前記光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で処置するステップと、（ｂ）前記特定量の植物または動物組織における前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つを光活性することにより、少なくとも１つの光活性分子薬を生成するステップであって、該少なくとも１つの光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、（ｃ）前記少なくとも１つの光活性分子薬により放出されるエネルギーを方向づけるステップと、（ｄ）特定量の植物または動物組織の特徴を示す検出されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。２．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光はレーザー光であることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。３．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光は焦点をあわせた光ビームであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。４．前記焦点を合わせた光は焦点を合わせたレーザー光であることを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。５．前記植物または動物組織を少なくとも１つの光活性分子薬で処置する第１のステップをさらに含み、前記特定量の植物または動物組織は前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも一部を保持することを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。６．前記少なくとも１つの光活性分子薬は、ソラレン、５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、４，５’，８−トリメチルソラレン（ＴＭＰ）、４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ＡＭＴ）、５−クロロメチル−８−メトキシソラレン（ＨＭＴ）、アンゲルシン（イソソラレン）、５−メチルアンゲルシン（５−ＭＩＰ）、３−カルボキシソラレン、ポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、フォトフリンＩＩ、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）、フォトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、色素ヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、ポリヘマトポルフィリンエステル（ＰＨＥ）、プロトポルフィリンの１３，１７−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−ジメチルエチルエタンアミンエステル（ＰＨ１００８）、テトラ（３−ヒドロキシフェニル）−ポルフィリン（３−ＴＨＰＰ）、モノスルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ１）、二スルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ２ａ）、ジヘマトポルフィリンエーテル、メソテトラフェニルポルフィリン、メソテトラ（４Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭｐｙＰ）、オクタ− （４−第三−ブチルフェニル）テトラピラジノポルフィラジン（ＯＰＴＰ）、フタロシアニン、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアニン（ｔ₄−ＰｃＨ₂）、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアン酸マグネシウム（ｔ₄−ＰｃＭＧ）、スルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）、テトラスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＴＳ）、モノスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ２Ｐｃ）、トリスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ３Ｐｃ）、テトラスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ４Ｐｃ）、シリコーンフタロシアニン（ＳｉＰｃＩＶ）、亜鉛IIフタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ビス（ジイソブチルオクタデシルシロキシ）シリコーン２，３−ナフタロシアニン（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）、ゲルマニウムＩＶオクタブトキシフタロシアニン（ＧｅＰｃ）、ローダミン１０１（Ｒｈ−１０１）、ローダミン１１０（Ｒｈ−１１０）、ローダミン１２３（Ｒｈ−１２３）、ローダミン１９（Ｒｈ−１９）、ローダミン５６０（Ｒｈ−５６０）、ローダミン５７５（Ｒｈ−５７５）、ローダミン５９０（Ｒｈ−５９０）、ローダミン６１０（Ｒｈ−６１０）、ローダミン６４０（Ｒｈ−６４０）、ローダミン６Ｇ（Ｒｈ−６Ｇ）、ローダミン７００（Ｒｈ−７００）、ローダミン８００（Ｒｈ−８００）、ローダミンＢ（Ｒｈ−Ｂ）、スルホローダミン１０１、スルホローダミン６４０、スルホローダミンＢ、クマリン１、クマリン２、クマリン４、クマリン６、クマリン６Ｈ、クマリン７、クマリン３０、クマリン４７、クマリン１０２、クマリン１０６、クマリン１２０、クマリン１５１、クマリン１５２、クマリン１５２Ａ、クマリン１５３、クマリン３１１、クマリン３０７、クマリン３１４、クマリン３３４、クマリン３３７、クマリン３４３、クマリン４４０、クマリン４５０、クマリン４５６、クマリン４６０、クマリン４６１、クマリン４６６、クマリン４７８、クマリン４８０、クマリン４８１、クマリン４８５、クマリン４９０、クマリン５００、クマリン５０３、クマリン５０４、クマリン５１０、クマリン５１５、クマリン５１９、クマリン５２１、クマリン５２２、クマリン５２３、クマリン５３５、クマリン５４０、クマリン５４０Ａ、クマリン５４８、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＡ）、５−エチル−アミノ−９−ジエチル−アミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＳ）、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノセレナジニウム（ＥｔＮＢＳｅ）、クロロプロマジン、クロロプロマジン誘導体、クロロフィール誘導体、バクテリオクロロフィール誘導体、メタル−リガンド複合体、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（ＲｕＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ロジウム（ＩＩ）（ＲｈＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）白金（ＩＩ）（ＰｔＢＰＹ）、フェオフォルバイドａ、メロシイアミン５４０、ビタミンＤ、５ −アミノ−レブリック酸、フォトサン、クロリンｅ６、クロリンｅ６エチレン−ジアミド、モノ−Ｌ−アスパチャールクロリンｅ６、フェノキサジンナイルブルー誘導体、スチルベン、スチルベン誘導体、４−（Ｎ− （２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル）−アミノフェニル）−４’−（６−ヒドロキシヘキシルスルフォニル）スチルベン（ＡＰＳＳ）、および標準生物学的着色剤や染料を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。７．前記少なくとも１つの光活性分子薬は特定量の植物または動物組織内の特定組織に対して特異的である少なくとも１つの生体光活性分子薬であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。８．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンド、ハプテン、炭水化物受容体または複合物質、脂質受容体または複合物質、タンパク質受容体または複合物質、キレート剤、および被包担体を含む群から選択される部分を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。９．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬はさらに同時２光子励起を励起するのに十分な光を当てた時に光活性である部分を含むことを特徴とする請求の範囲８に記載の方法。１０．前記特定量の植物または動物組織に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で前記特定量の植物または動物組織を処置するステップは、（ａ１）特殊な変調を有する光源からの光を変調し、変調光を生成するステップと、（ａ２）前記特定量の植物または動物組織に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な前記変調光で前記特定量の植物または動物組織を処置するステップと、を含み、さらに、（ｅ）前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップと、（ｆ）前記特定量の植物または動物組織の特徴を示す変調されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。１１．前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップは、前記特殊な変調の２倍の周波数で検出されたエネルギー信号を変調することにより、前記特殊な変調の第２高調波を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲１０に記載の方法。１２．前記特定量の植物または動物組織の特徴を示す変調されたエネルギー信号は、前記特定量の植物または動物組織に存在する少なくとも１つの光活性分子薬の寿命の変化を表すことを特徴とする請求の範囲１０に記載の方法。１３．特定量の材料を撮像するための方法において、該材料は少なくとも１つの光活性分子薬を含む方法であって、（ａ）前記特定量の材料に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つの同時２光子励起を励起するのに十分な光で前記特定量の材料を処置するステップと、（ｂ）前記特定量の材料における前記少なくとも１つの光活性分子薬の少なくとも１つを光活性化することにより、少なくとも１つの光活性分子薬を生成するステップであって、該少なくとも１つの光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、（ｃ）前記少なくとも１つの光活性分子薬により放出されるエネルギーを方向づけるステップと、（ｄ）前記特定量の材料の特徴を示す検出されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。１４．前記材料は植物組織および動物組織を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１５．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光はレーザー光であることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１６．前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光は焦点を合わせた光ビームであることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１７．前記焦点を合わせた光ビームは焦点を合わせたレーザー光であることを特徴とする請求の範囲１６に記載の方法。１８．前記材料を少なくとも１つの光活性分子薬で処置する第１のステップをさらに含み、前記特定量の材料は前記少なくとも１つの光活性分子薬の一部を保持することを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。１９．前記少なくとも１つの光活性分子薬は、ソラレン、５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、４，５’，８−トリメチルソラレン（ＴＭＰ）、４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ＡＭＴ）、５−クロロメチル−８−メトキシソラレン（ＨＭＴ）、アンゲルシン（イソソラレン）、５−メチルアンゲルシン（５−ＭＩＰ）、３−カルボキシソラレン、ポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、フォトフリンＩＩ、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）、フォトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、色素ヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、ポリヘマトポルフィリンエステル（ＰＨＥ）、プロトポルフィリンの１３，１７−Ｎ，Ｎ，Ｎ，− ジメチルエチルエタンアミンエステル（ＰＨ１００８）、テトラ（３−ヒドロキシフェニル）−ポルフィリン（３−ＴＨＰＰ）、モノスルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ１）、二スルホン酸テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰＳ２ａ）、ジヘマトポルフィリンエーテル、メソテトラフェニルポルフィリン、メソテトラ（４Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭｐｙＰ）、オクタ −（４−第三−ブチルフェニル）テトラピラジノポルフィラジン（ＯＰＴＰ）、フタロシアニン、テトラ−（４−第三−ブチル）フタロシアニン（ｔ₄−ＰｃＨ₂）、テトラ− （４−第三−ブチル）フタロシアン酸マグネシウム（ｔ₄−ＰｃＭＧ）、スルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）、テトラスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（ＡｌＰｃＴＳ）、モノスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、ジスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ２Ｐｃ）、トリスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ３Ｐｃ）、テトラスルホン酸アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳ４Ｐｃ）、シリコーンフタロシアニン（ＳｉＰｃＩＶ）、亜鉛IIフタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ビス（ジイソブチルオクタデシルシロキシ）シリコーン２，３−ナフタロシアニン（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）、ゲルマニウムＩＶオクタブトキシフタロシアニン（ＧｅＰｃ）、ローダミン１０１（Ｒｈ−１０１）、ローダミン１１０（Ｒｈ−１１０）、ローダミン１２３（Ｒｈ−１２３）、ローダミン１９（Ｒｈ−１９）、ローダミン５６０（Ｒｈ−５６０）、ローダミン５７５（Ｒｈ−５７５）、ローダミン５９０（Ｒｈ−５９０）、ローダミン６１０（Ｒｈ−６１０）、ローダミン６４０（Ｒｈ−６４０）、ローダミン６Ｇ（Ｒｈ−６Ｇ）、ローダミン７００（Ｒｈ− ７００）、ローダミン８００（Ｒｈ−８００）、ローダミンＢ（Ｒｈ−Ｂ）、スルホローダミン１０１、スルホローダミン６４０、スルホローダミンＢ、クマリン１、クマリン２、クマリン４、クマリン６、クマリン６Ｈ、クマリン７、クマリン３０、クマリン４７、クマリン１０２、クマリン１０６、クマリン１２０、クマリン１５１、クマリン１５２、クマリン１５２Ａ、クマリン１５３、クマリン３１１、クマリン３０７、クマリン３１４、クマリン３３４、クマリン３３７、クマリン３４３、クマリン４４０、クマリン４５０、クマリン４５６、クマリン４６０、クマリン４６１、クマリン４６６、クマリン４７８、クマリン４８０、クマリン４８１、クマリン４８５、クマリン４９０、クマリン５００、クマリン５０３、クマリン５０４、クマリン５１０、クマリン５１５、クマリン５１９、クマリン５２１、クマリン５２２、クマリン５２３、クマリン５３５、クマリン５４０、クマリン５４０Ａ、クマリン５４８、５ −エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＡ）、５−エチル−アミノ−９−ジエチルーアミノベンゾ［ａ］フェノキサジニウム（ＥｔＮＢＳ）、５−エチルアミノ−９−ジエチルアミノベンゾ［ａ］フェノセレナジニウム（ＥｔＮＢＳｅ）、クロロプロマジン、クロロプロマジン誘導体、クロロフィール誘導体、バクテリオクロロフィール誘導体、メタル−リガンド複合体、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（ＲｕＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）ロジウム（ＩＩ）（ＲｈＢＰＹ）、二塩化トリス（２，２’−ビピリジン）白金（ＩＩ）（ｐｔＢＰＹ）、フェノフォルバイドａ、メロシイアミン５４０、ビタミンＤ、５−アミノ−レブリン酸、フォトサン、クロリンｅ６、クロリンｅ６エチレン−ジアミド、モノ−Ｌ −アスパチャールクロリンｅ６、フェノキサジンナイルブルー誘導体、スチルベン、スチルベン誘導体、４−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル）− アミノフェニル）−４’−（６−ヒドロキシヘキシルスルフォニル）スチルベン（ＡＰＳＳ）、および標準生物学的着色剤または染料を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲１８に記載の方法。２０．前記少なくとも１つの光活性分子薬は特定量の材料内の特定物質に対して特異的である少なくとも１つの生体光活性分子薬であることを特徴とする請求の範囲１８に記載の方法。２１．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、タンパク質、抗体、リガンド、ハプテン、炭水化物受容体または複合物質、脂質受容体または複合物質、タンパク質受容体または複合物質、キレート剤、および被包担体を含む群から選択される部分を含むことを特徴とする請求の範囲２０に記載の方法。２２．前記少なくとも１つの生体光活性分子薬はさらに同時２光子励起を励起するのに十分な光を当てた時に光活性である部分を含むことを特徴とする請求の範囲２１に記載の方法。２３．前記特定量の材料に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な光で前記特定量の材料を処置するステップは、（ａ１）特殊な変調を有する光源からの光を変調し、変調光を生成するステップと、（ａ２）前記特定量の材料に含まれる前記少なくとも１つの光活性分子薬の同時２光子励起を励起するのに十分な前記変調光で前記特定量の材料を処置するステップと、を含み、さらに、（ｅ）前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップと、（ｆ）前記特定量の材料の特徴を示す変調されたエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。２４．前記特殊な変調で検出されたエネルギー信号を変調するステップは、前記特殊な変調の２倍の周波数で検出されたエネルギー信号を変調することにより、前記特殊な変調の第２高調波を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２３に記載の方法。２５．前記特定量の材料の特徴を示す変調されたエネルギー信号は、前記特定量の材料に存在する少なくとも１つの光活性分子薬の寿命の変化を表すことを特徴とする請求の範囲２３に記載の方法。２６．前記処置するステップは、焦点距離の範囲にわたって光ビームの焦点を合わせ、光ビームの焦点面が組織の表面と実質的に組織表面を超える点との間の位置に延びするようにするステップであって、前記処置するステップは組織内の深部に浸透するように延びることができることを特徴とする請求の範囲１に記載の撮像法。２７．光ビームが現存する間に、組織内の焦点距離の位置を変化させ、前記光活性するステップ、検出するステップ、および検出されたエネルギー信号を生成するステップは、前記組織表面と実質的に前記組織表面を超えて位置決めされた位置との間の位置に沿って生じることにより、前記撮像は三次元であることを特徴とする請求の範囲２６に記載の撮像法。２８．前記処置するステップはレーザーを操作し、約７５メガヘルツを超えるパルス繰返し周波数及びサブナノ秒パルス幅を有するパルス出力を生成することを特徴とする請求の範囲２７に記載の方法。２９．前記レーザーを操作し、近赤外光を生成するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２８に記載の方法。３０．前記レーザーは約２０ナノジュールのパルスエネルギーを生成することを特徴とする請求の範囲２９に記載の方法。３１．前記光活性するステップは前記少なくとも光活性分子薬の同時２光子励起を実施するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２９に記載の方法。３２．前記検出するステップは前記レーザーからの入射光の光路を後戻りすることがない放射光を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。３３．前記処置するステップはさらに前記レーザービームを変調するステップを含むとともに、前記検出するステップおよび前記生成するステップのうち選択された１つが波長選択ステップを含むことを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。３４．前記処置するステップおよび光活性化するステップは組織中の分子薬からのものであり、基本的に前記レーザー光の変調と同時性である放射光を生成するように配置されることを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。３５．少なくとも１つの光活性分子薬を含む特定量の植物または動物組織を撮像するための撮像装置において、平行光源であって、前記平行光は実質的に組織に浸透するのに効果的な周波数を有し、前記平行光は組織内に含まれる分子薬の同時２光子励起（ＴＰＥ）を励起するために適応される平行光源と、前記組織の表面から実質的に前記表面を超える深さまで延びる焦点距離の範囲にわたって前記平行光の焦点を合わせるための焦点を合わせる装置であって、焦点または焦点面が前記光源に対して調節可能であり、前記光源および焦点を合わせる装置は協働して前記分子薬のＴＰＥを励起する装置と、前記組織の最も近くに配置されるとともに位置決めされ、前記分子薬により放出され、前記組織上の光入射の光路を後戻りすることがない路に沿って進む前記光を検出する検出器であって、前記光源が焦点を合わせられている特定量の特徴を示す検出される信号を生成するように構成された前記検出器と、を含むことを特徴とする撮像装置。３６．前記光源は約７５メガヘルツを超えるパルス繰返し周波数及びサブナノ秒パルス幅を有するパルス出力を生成することを特徴とする請求の範囲３５に記載の装置。３７．前記光源は近赤外光を生成することを特徴とする請求の範囲３６に記載の装置。３８．前記光源は約２０ナノジュールのパルスエネルギーを生成することを特徴とする請求の範囲３７に記載の装置。３９．前記光源はレーザーを含むことを特徴とする請求の範囲３７に記載の装置。４０．前記検出器に結合されたプロセッサをさらに含むことを特徴とする請求の範囲３５に記載の装置。４１．前記光源と結合した変調システムをさらに含み、前記プロッセは前記変調システムに結合されていることを特徴とする請求の範囲４０に記載の装置。４２．医用画像診断のための方法において、光活性分子薬を組織に導入するステップであって、前記薬は関連組織の特異性で選択され、前記薬は２光子励起が可能であるステップと、前記薬を関連の特異的組織に蓄積させるステップと、実質的に組織表面より下の部分を含む組織内の関連の特異的部分に光を方向づけるステップであって、前記光は組織を浸透するとともに実質的に共焦点部のみでＴＰＥを促進する周波数およびエネルギーで選択されるステップと、前記組織の深さの範囲にわたって共焦点部の位置を調節するステップと、ＴＰＥを用い、前記組織内の深さの範囲にわたって前記薬を光活性することにより、共焦点部で光活性物質を生成し、前記光活性分子薬はエネルギーを放出するステップと、放出エネルギーを検出するステップと、共焦点部で組織の特徴を示す検出されるエネルギー信号を生成するステップと、を含むことを特徴とする方法。４３．前記光を検出するステップは、短パルス幅および高パルス繰返しレートで操作するパルスレーザーを用いて近赤外光を生成するステップと、前記レーザーを前記組織に焦点を合わせるステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。４４．前記位置を調節するステップは検査下の組織に対して共焦点部の位置を変化させるステップ、または固定共焦点部に対して検査下の組織の位置を変化させるステップを含むことを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。４５．前記方法はさらに組織上に入射する前の光を変調するステップと、放射光の検出からの信号を復調するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲４２に記載の方法。４６．医用画像診断のための装置において、撮像すべき深部組織に拘束光を方向づけるための光源手段であって、前記光は組織表面より下に浸透し、実質的に共焦点部でのみＴＰＥを励起する周波数およびエネルギーで選択される光源と、撮像すべき組織の深さの範囲内で光の共焦点部の位置を変化させ、組織内の分子薬が２光子励起（ＴＰＥ）を用いて光活性となるための手段と、光活性分子薬が２光子励起を用いて励起された後に組織内の前記物質により放出される等方放射線を受け取るとともに検出するように位置決めされた検出手段と、を含むことを特徴とする装置。４７．前記光源手段は平行光ビームを生成するための手段を含むとともに、前記光源は組織表面より下の点で組織により位置決めされる共焦点部に平行光ビームの焦点をあわせるための焦点を合わせる手段を含むことを特徴とする請求の範囲４６に記載の装置。４８．平行光ビームを生成するための手段は近赤外スペクトルで操作するパルスレーザーを含むことを特徴とする請求の範囲４７に記載の装置。