JP2001501206A

JP2001501206A - 非天然性リポタンパク質粒子

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Publication number: JP2001501206A
Application number: JP10515401A
Authority: JP
Inventors: ギャビンウィリアムハルバート; モイラドリーンオーエンス; ジョージベイリー
Original assignee: University of Strathclyde
Current assignee: University of Strathclyde
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2001-01-30
Also published as: CA2267650A1; US20020147304A1; GB9620153D0; WO1998013385A2; CA2267650C; EP0956303B1; AU4466797A; WO1998013385A3; US6670452B2; DE69733088D1; EP0956303A2; DE69733088T2

Abstract

(57)【要約】少なくとも１のペプチド成分から成る非天然性のレセプター受容性ＬＤＬ粒子であって、前記ペプチド成分は少なくとも１のＡｐｏＢタンパク質レセプター用の結合部位及び少なくとも１の親脂質性の置換基を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】非天然性リポタンパク質粒子発明の背景本発明はリポタンパク質粒子、該粒子の製造方法及びその使用法に関する。本発明は特に、非天然性の低密度リポタンパク質粒子、その製造方法及びその使用法に関する。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、コレステロールエステルの形態をしたコレステロールの体内への輸送に関わっている血漿の天然成分である。天然由来のＬＤＬはほぼ球形の粒子（直径２０−２２ｎｍ）として生ずることが知られており、この粒子は少量のトリグリセリド（ＴＧ）を含む約１５００のコレステロールエステルから成る内核を包含している。内核は一般的に約８００のリン脂質分子から成る可溶性単層と少量の遊離コレステロール（約５００分子）によって取り巻かれている。単層中に存在するのは、大型のリセプタータンパク質、およそ５００，０００ダルトンのアポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）であり、これはＬＤＬ重量の約２０％を占めている。天然由来のＬＤＬは他分野での利用が見出されており、例えばアテローム性動脈硬化や脂質代謝研究における利用がある。ＬＤＬはまた癌治療における薬物標的ベクターとしての利用も見出されている。ある種の癌細胞は、正常細胞より高率のリセプター介在のＬＤＬ取り込みを示しており、ＬＤＬはまた抗ガン剤の標的ベクターとしての利用も見出されている。現在、天然ＬＤＬは新鮮な血漿サンプルから分離することが必要である。この分離方法は冗長であり（例えば４８時間に及ぶ）、ドナーの血漿ＬＤＬレベルに依存しており、ＬＤＬの収量は健康な人の血漿の場合で約１００ｍｇ（ＡｐｏＢ）／１００ｍｌ（血漿）以下の量である。このように収量は通常低いものである。分離された天然ＬＤＬは不安定であることが知られている。天然ＬＤＬに類似したサイズ及び脂質組成の概してマイクロエマルジョン形態をしたＬＤＬ様粒子を製造する試みが行われているが、このような粒子にはレセプター受容能が欠けている。ＡｐｏＢは前記マイクロエマルジョン粒子上に移植させることができるが、その移植方法には、なお、新鮮な血漿から得られるある種のタンパク質が必要とされる。ＡｐｏＢは形が大きく、その両親媒性ゆえに凝集する傾向をもつため、これをマイクロエマルジョン上に部分的に移植するのは容易ではない。上記のように、マイクロエマルジョン粒子上へのＡｐｏＢの移植は、とりわけ移植方法に関連した生来的問題とＡｐｏＢ成分の不安定性ゆえに満足できるものではない。実質的に全ＡｐｏＢあるいは実質的にその全類縁体の使用を未だ必要とせず、ＬＤＬリセプター受容能をもつ、非天然性ＬＤＬを製造し得ることが現在見い出されている。さらに、ＬＤＬ由来の血漿及び／又はＡｐｏＢ由来の血漿の使用を必要としない非天然性ＬＤＬの製造方法が開発されている。発明の開示本発明の目的は、ＡｐｏＢレセプター受容能をもつ非天然性ＬＤＬを提供することである。本発明の他の目的は、非天然性ＬＤＬ粒子の製造方法を提供することである。本発明の上記の及び他の目的については以下の説明及び実施例によって明らかになろう。本発明の第一の目的によって、少なくとも１のペプチド成分から成る非天然性のレセプター受容性ＬＤＬ粒子が与えられ、前記ペプチド成分は少なくとも１のＡｐｏＢタンパク質レセプター用の結合部位及び少なくとも１の親脂質性の置換基を含んでいる。非天然性ＬＤＬ粒子は生体内で自然に生ずるとは認められないものである。非天然的に生成されるＬＤＬはレセプター受容性であり、つまりＡｐｏＢレセプターへ結合でき及び／又は結合時及び／又は結合後にＡｐｏＢタンパク質様の生理的効果を引き出すことができるものである。それゆえ、非天然性ＬＤＬ粒子は少なくともＡｐｏＢとの結合能をもつタンパク質、ポリペプチド、ペプチド等のアミノ酸の配列から成るものであり、そのポリペプチドはＡｐｏＢ結合部位（例えばＡｐｏＢ１００結合部位あるいは生理的機能のあるそのペプチド類縁体）のアミノ酸配列とその結合部分に関して同一であっても同一でなくてもよい。当然、当業者は、ＡｐｏＢレセプターを発現する癌細胞等の標的細胞においてＡｐｏＢレセプターと結合できるポリペプチドは、結合時及び／又は結合後にＡｐｏＢタンパク質様の生理的効果を引き出すこと、すなわち受容性であることが可能なことを認識している。ＬＤ１粒子は、少なくとも二成分、脂質成分（Ｌ成分）及びペプチド成分（Ｐ成分）から成る。Ｌ成分は通常核状のコレステロールエステル類、例えばオレイン酸コレステリル、リノレン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール等の核状の親脂質性分子を含む脂質エマルジョンから成っている。他の適当な親脂質性核分子としては、トリグリセロイド類、例えばトリオレイン、大豆油等の植物油、さらに親脂質性薬物、例えばエストラムスティン、プレドニムスティン、及び既知医薬を親脂質性へと修飾した抗ガン剤、例えばメソトレキゼートのコレステリル・エステル等を含むものが挙げられる。Ｌ成分の核は通常荷電状態の基あるいは親水性基を含む両親媒性の脂質等の脂質によって可溶性になっている。このような両親媒性の脂質には、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質のみならず、エステル化されていないコレステロール、適当な非イオン性サーファクタントも含まれる。好ましい場合、コレステロールエステルは単層のリン脂質によって可溶性とされる。Ｌ成分の調製法は当業者には既知であり、本明細書中に引用文献として記載しているＧｉｎｓｂｕｒｇ，Ｇ．Ｓ．ｅｔａｌ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１４）ｐｐ８２１６−８２２７；ＯｗｅｎｓＭ．Ｄ．及びＨａｌｂｅｒｔＧ．Ｗ．（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５（Ｓｕｐｐｌ．）ｐ６８Ｐ：ＯｗｅｎｓＭ．Ｄ．及びＨａｌｂｅｒｔＧ．Ｗ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ４１（２）ｐｐ１２０−１２６等の論文中に記載された多数の方法を用いて実施することが可能である。前記Ｌ成分は少なくとも二つの生物学的に許容される成分から構成されることが好ましい。第一の成分はリン脂質等の生物学的に許容される飽和あるいは不飽和の鎖長の長い荷電極性成分とすることができる。適当な荷電極性成分の例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴミエリン及びエステル化されていないコレステロール等が含まれる。第二の成分は生物学的に許容できるコレステロールエステル、例えばオレイン酸コレステリル等の親脂質性成分とすることができる。生物学的に許容できる成分とは、試験管内あるいは生体内で細胞へ投与できるものであり、実質的に細胞の生存に有害な影響のないものである。Ｌ成分は一定比、例えばモル比にある３成分あるいはそれ以上の成分、例えばリン脂質：トリオレイン：コレステリルエステル（Ｐ：Ｔ：Ｃ）から成るものであってもよい。モル比は、その成分が本発明の非天然性ＬＤＬ粒子の調製において使用に適するＬ成分を生成するのに適するものであればどのようなモル比でもよい。リン脂質（ＰＬ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びエステル化されていないコレステロール（ＵＣ）等の外核可溶性脂質のコレステリルエステル（ＣＥ）、トリオレイン（ＴＯ）、オレイン酸コレステリル（ＣＯ）あるいは親脂質性薬物等の核脂質に対するモル比は、約０．７：１から５：１、デザインによっては、好ましくは１：１から３：１までの範囲内であるのが望ましい。ＰＬ：ＣＥの好ましい比率は約２：１である。第三のＬ成分が用いられない場合、ＰＬ：ＣＥの比率は約１：１から約２：１の範囲内であればよい。ホスファチジルコリン：トリオレイン：オレイン酸コレステリル等の３成分系に適当なモル比は、３：２：１である。３つの外核脂質と２つの核脂質から成る５成分系に適するモル比は、０．７− ６５：０−２：０−１（外核脂質）：０−５：０−２．５(核脂質)の範囲内であろう。好ましくは、前記モル比は２．５−４．５：１−２：０．５−１（外核脂質）、２−４．５：１−２．５（核脂質）の範囲内にあるのがよい。さらに好ましくは、前記モル比は４−４．５：１．５−２：０．７−０．９（外核脂質）：４−４．５：１．８−２．２（核脂質）の範囲内にあるのがよい。適する外核脂質はＰＣ，ＳＭ，ＵＣ及びＰＬから選択されよう。適する核脂質はＴＯ，ＣＥ及びＣＯから選択することができる。当業者は他の適当な外核脂質及び核脂質も本発明において使用可能なことを認識するに至るであろう。５成分系の例としては、ＰＣ：ＳＭ：ＵＣ（外核脂質）：ＴＯ：ＣＯ（核脂質）が挙げられる。このような５成分系の成分は前記したモル比で存在するものと考えられる。一般的に、本発明の非天然性リポタンパク質中に使用される脂質マイクロエマルジョンの滴径は生体内、生体外、あるいは試験管内でリポタンパク質として機能できなければならないものである。非天然性ＬＤＬ粒子の粒径はほぼ５０ｎｍ以下であり、調製方法及び／又はＰＬ：ＣＥモル比等の使用したモル比に依存して、約１０ｎｍから約３５ｎｍの範囲内であることが好ましい。本発明のＬＤＬ粒子の生成に使用するペプチド成分は、Ｌ成分へペプチドを固定するための「アンカー」として働くことができる少なくとも１の親脂質性置換基あるいは部分を含むものである。親脂質性部分あるいは置換基は、生物学的に親和性のコレステロール、レチノイン酸、ステアリン酸(Ｃ₁₈)のようなＣ₁₀−Ｃ₂₂ 脂肪酸、その他の親脂質性化合物から得られよう。親脂質性の部分／置換基は、当業分野で既知の共有結合あるいはイオン結合等の化学的手段を介してペプチドのアミノ基末端及び／又はカルボキシル基末端と接触させて配置させることができる。当業者は、本発明のペブチドがＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法の標準Ｆｍｏｃプロトコルを用いて組み立てられることを認識するであろう。レチノイン酸等の親脂質性置換基を活性化し、標準的なペプチドカプリング・サイクルを用いてペプチドＮ−末端へ付加することが可能である。まず最初に、3-メトキシ−４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸等の不安定な結合の酸が樹脂サポートへ付加され、標的ペプチドの最初のアミノ酸（Ｃ−末端）へエステル結合される。ペプチドの構成が完了したら、結合部へ繋がったエステルを加水分解し、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて（例として１％ＴＦＡ）、後に留出可能なジクロロメタン中で完全に保護されたペプチドを取り除くことが可能である。かかるステージにおいて、有効な官能基はペプチドカルボキシルであり、これは、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて活性化させ、コレステロール（１０当量）等の親脂質性分子へカプリングさせてエステルを生成することができる。溶媒の蒸発及びＴＦＡ(例えば９５％ＴＦＡ)による処理は、アミノ酸側鎖の保護を解除して合成を完了させる。完全なペプチドを次いで濃縮し、例えばジエチルエーテルを用いて沈殿させて固体を得、これを必要に応じて水洗して残存する保護基断片及び過剰のコレステロールを除去する。レチノイン酸等のＮ−末端修飾体及び第一級アミンを標的としたステアリン酸付加は、当業者に既知の技法を用いて本発明の変形ペプチド合成に用いることができる。好ましい場合、本発明において使用することができるペプチドは、性質上両親媒性、即ち親脂質性基及び親水性基をもつものである。適当な親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基が含まれる。ペプチドが性質上両親媒性である場合、適当な側鎖を介して疎水基と親水基をペプチド上の適当な位置に配置することが可能である。疎水基と親水基はペプチドのアミノ基末端とカルボキシル基末端にそれぞれ、あるいはその逆の組み合わせで配置されることが好ましい。本発明の目的の１つにより、ペプチドから構成される非天然性ＬＤＬ粒子が提供されているが、前記ぺプチドの結合部位のアミノ酸配列は、塩基性の側鎖を有するアミノ酸、脂肪酸側鎖を有するアミノ酸、及び脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸から成るグループから選ばれるものである。本発明のこの観点において、本発明の非天然性ＬＤＬのペプチドは、実質的に殆どあろいは全くＡｐｏＢ結合部分のアミノ酸配列と類似性及び／又は同一性を示すものではないかもしれない。しかし、本発明のペプチドは、ＡｐｏＢ結合部分のアミノ酸配列と実質的な類似性あるいは同一性を示すことが好ましい。本発明のＬＤＬの脂質成分上に移植できるペプチドを形成しているアミノ酸配列は、リジン、アルギニン及びヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン等の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、セリン及びスレオニン等の脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸、及びそれらの類縁体から成るグループから選ぶことが出来る。結合部分のアミノ酸配列が、そこへ組み込まれているアミノ酸の順序に関し実質的にＡｐｏＢの結合部位配列と類似しない場合、アミノ酸配列の結合部分へ包含するために選ぶアミノ酸は、ＡｐｏＢ結合部分配列を構成するものと実質的に同一のアミノ酸から選ぶことが可能である。当然、当業者はここで述べる伝統的な置換及び／又は代用がこのような結合部分にも適用できることを理解するであろう。本発明は、ＡｐｏＢレセプターと相互作用が可能なＡｐｏＢ結合部分を含む少なくとも１のアミノ酸配列から成る非天然性ＬＤＬ粒子を提供するものである。当然、当業者は、本発明での使用に適する機能的ペプチドあるいはポリペプチドを構成するかかるアミノ酸配列が、本文中で定義するレセプター受容性でなければならないことを理解するであろう。このように、ＡｐｏＢレセプターへ結合可能な合成あるいは半合成ペプチド及び／又はポリペプチド及びその類縁体が本発明に包含される。本発明において、好ましくは、前記アミノ酸配列は、同一ペプチド中、あるいは二量体中、又は異なるペプチド中の下記に描かれたＡｐｏＢ結合部位配列のいずれか又は双方が；（１） Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Asn Lys His Arg His; 又は（２） Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys; 及びＡｐｏＢ１００レセプター部位に結合できるそれらの類縁体を含むことが可能である。アミノ酸配列は、ここに記載された移植条件の下で脂質成分上に移植されるのであれば、いかなる長さであってもよい。アミノ酸配列は、上記配列（１）及び／又は（２）を含む約５００のアミノ酸残基までの配列を包含することができる。配列（１）及び（２）は、ＫｎｏｔｔＴ.Ｊ.ら，Nature Vol．323，October 1986 P 735に記載されたヒトＡｐｏ−１００タンパク質から同定されたＡｐｏＢ結合部位配列として知られている。例えば、アミノ酸配列には、図１の、ｐ７３５（Ｋｎｏｔｔら，前出）のアミノ酸３０７９から約３３８０位置までの配列を含ませることができる。アミノ酸配列は、少なくとも単一のＡｐｏＢ結合部位配列を含むことができ、また長さで約８−２００からのアミノ酸残基であってもよく、あるいは長さで約８−５０からのアミノ酸残基が短い配列であってもいいが、長さで約９−３０からのアミノ酸残基であることが好ましい。適当なペプチド配列の例には本文図７に記載のものも含まれる。レセプターへ結合するアミノ酸配列の能力やペプチド配列を合成する能力等を実際に考慮した場合、一般的に短い配列が好ましいことは当業者が当然に認識するところである。アミノ酸の置換、欠失及び／又は交換を含むアミノ酸配列における天然の変形も本発明に包含されることは専門家の認識するところである。さらに、アミノ酸の置換、欠失及び／又は交換は、かかる変形が結合部位へ結合して生理的反応を引き出すアミノ酸配列の能力を実質的に妨げない限りアミノ酸配列に対して行い得るものであることも当業者は同様に理解するであろう。例えば、伝統的交換は、ペプチドの生理的機能が実質的に損なわれない限り、おそらく以下のグループ中のアミノ酸間で行われ得る：（ｉ）リジンとアルギニン（ｉｉ）アラニン、セリンとスレオニン（ｉｉｉ）グルタミンとアスパラギン（ｉｖ）スレオニン、フェニルアラニンとトリプトファン（ｖ）ロイシン、イソロイシン、バリンとメチオニン本発明には、本発明ペプチドに実質的に類似の活性／機能を有し、光学的に並べた場合に上記ペプチド（１）及び／又は（２）の配列に少なくとも７０％の類似性、つまり同一なアミノ酸配列を有する実質的に分離されたタンパク質がさらに含まれろ。かかる程度の類似性つまり同一性は、少なくとも８０％であることが好ましいが、９０％あるいはそれ以上であることがより好ましい。本発明の脈絡において、相互に少なくとも７０％の類似性を有する二つのアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等の当業者に周知のコンピューター・プログラムを用いて光学的に並べた場合、好ましい位置の少なくとも７０％が同一であるか、あるいは伝統的に交換されているかのアミノ酸残基を有するものである。本発明のさらなる目的は、薬物標的ベクターとしての非天然性ＬＤＬ粒子の使用を提供することである。かかる薬物標的ベクターはガン細胞等の治療に使用することができる。本発明の他の目的において、（ｉ）親脂質性分子と両親媒性脂質分子から脂質成分を生成し、及び（ｉｉ）少なくとも１のタンパク質を、少なくとも１のペプチドが少なくとも親脂質性の置換基と少なくともアポタンパク質Ｂレセプターと相互作用できる結合部分から構成されている（ｉ）において生成した脂質成分と接触させることから構成される、ＡｐｏＢレセプター受容性を有する非天然性のレセプター受容性ＬＤＬ粒子の製造方法が提供されている。本発明のさらなる目的において、ｎＬＤＬ粒子の薬物標的ベクターとしての使用、特に患者体内のＡｐｏＢタンパク質レセプターを含むガン細胞治療における使用を提供するものである。さらに本発明の他の目的において、病気、特にガン治療用の医薬の製造におけるｎＬＤＬ粒子の使用を提供するものである。従って、ＡｐｏＢタンパク質レセプターを含むガン細胞の治療用のベクター中に医薬を包含する薬物標的ベクターの製造におけるｎＬＤＬ粒子の使用を提供するものである。本発明に係る非天然性レセプター受容性ＬＤＬ粒子は、医薬品で一般的に用いられている慣用の賦形剤又はキャリア、水・生理学的に許容できる塩溶液・バッファー等の水疱物とともに患者へ投与できるものであることを、当業者は理解するであろう。本発明のさらなる目的において、非天然性レセプター受容性ＬＤＬと医薬的に許容できるキャリアから成る医薬製剤を提供するものである。医薬的に許容できるキャリアは、当業者において通常使用されている慣用的キャリアから選ぶことが出来る。さらに、臨床的有効量の抗癌性薬物を含む非天然性ＬＤＬ粒子を癌患者へ投与すろことから成る癌患者の冶療方法を提供するものである。この脂質成分は上記したものと同様なタイプの使用可能なペプチドである。以下の図は本発明について説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。図１：異なる脂質源で補充されたＲＰＭＩ中のＵ９３７細胞の増殖。脚注：平均値±標準偏差（ｎ＝３）。ＲＰＭＩ２５ｍｌを含む７５ｃｍ²のフラスコ中へ細胞を１×１０⁵の濃度で植え付け、□血漿１０％(v/v)、■脂質を除いた子牛血清５％(v/v)、▲無添加、◆ＬＤＬ、●対称マイクロエマルジョン、をそれぞれ補充している。ＬＤＬ及び対称マイクロエマルジョンは、当量のコレステロール濃度（０．０８ｍｍｏｌ／ｌ）で子牛血漿へ添加した。２４時間間隔で０．５ｍｌの細胞懸濁液を除去し計測した。図２：異なる脂質源によって誘起されたＵ９３７の増殖。脚注：平均値±標準偏差（ｎ＝３）。結果は無添加の対称区培地の平均値に対する７２時間後の細胞数の増加で表した。無ペプチドのマイクロエマルジョン（ＭＥ）。コレステロール濃度０．０８ｍｍｏｌ／ｌ、ペプチド濃度０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌ（オレイン酸コレステロール）。本実験ではＤＦＣＳは使用しなかった。。＋：有意差なし。ｐ＞０．０５。＃：有意差ｐ＜０．０５。図３：ｎＬＤＬで補充されたＵ９３７細胞の成長に対するコレステロール濃度及び脂質を除いた血清の影響。脚注：平均値（ｎ＝２）。結果は無添加の対称区培地の平均値に対する７２時間後の細胞数の増加で表した。開いた記号はＤＦＣＳ無添加｛ペプチドＤ｝ｎＬＤＬ、詰まった記号はＤＦＣＳ５％(v/v)を補充した｛ペプチドＤ｝ｎＬＤＬ。ペプチド濃度は０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌ（オレイン酸コレステロール）。図４ａ：異なるｎＬＤＬ標品で誘起されたＵ９３７細胞の成長。脚注：図４ａ。平均値±標準偏差（ｎ＝８）。結果は無添加の対称区培地の平均値に対する７２時間後の細胞数の増加で表した。ペプチド濃度は０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌ（オレイン酸コレステロール）。□マイクロエマルジョン無処理；◇ ｛ペ｛ペプチドＤ｝ｎＬＤＬ；★｛ペプチドＥ｝ｎＬＤＬ；●ＬＤＬ。すべて５％(v /v)ＤＦＣＳで補充した。図４ｂ：図４ａに関して標準偏差をプロットしなかったものである。図５：異なるｎＬＤＬ標品によって誘起したＵ９３７細胞の成長に対する抗ＬＤＬレセプター抗体の影響。脚注：平均値±標準偏差（ｎ＝４）。結果は無添加の対称区培地の平均値に対する７２時間後の細胞数の増加で表した。すべて５％(v/v)ＤＦＣＳで補充した。コレステロール濃度は０．０２６ｍｍｏｌ／ｌ、ペプチド濃度は０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌ（オレイン酸コレステロール）。＃：抗体無処理より有意に少ない（ｐ<０．０５）。図６：｛ペプチドＢ｝ｎＬＤＬによって誘起されたＵ９３７細胞の成長に対する抗ＬＤＬレセプター抗体の濃度増加の影響。脚注：平均値±標準偏差（ｎ＝４）。結果は無添加の対称区培地の平均値に対する７２時間後の細胞数の増加で表した。すべて５％(v/v)ＤＦＣＳで補充した。コレステロールは濃度０．０３３ｍｍｏｌ／ｌ、ペプチド濃度は０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌ（オレイン酸コレステロール）。＃：有意差（ｐ<０．０５）。図７：Ａｐｏ−Ｂ１００の合成ペプチド類縁体結合部位（ぺプチドＡ〜Ｅを含む）。図８(ａ)及び８(ｂ)：種々のｎＬＤＬ標品の平均径数及びゼータ電位に対するペプチド濃度増加の効果。脚注：図８(ａ)及び８(ｂ)。開いた記号は平均径数、閉じた記号はゼータ電位。□｛ペプチドＡ｝−ｎＬＤＬ（PC：TO：CO，３：２：１）；○｛ペプチドＢ｝ −ｎＬＤＬ（ＰＣ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，６．２：１：４．２：２．１）；△｛ペプチドＣ｝−ｎＬＤＬ(ＰＣ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，６．２：１：４．２：２．１) 。平均値±標準偏差（ｎ＝１０）。図９（ａ）：種々の｛ペプチドＡ｝−ｎＬＤＬ標品のゼータ電位測定値に対するｐＨの効果。脚注：図９（ａ）。すべての標品ＰＣ：ＴＯ：ＣＯ，３：２：１。■ＤＭＳＯ処理の対称；□０．０２ｍｏｌペプチドＡ／ｍｏｌＣＯ；◇０．０３９ｍｏｌペプチドＡ／ｍｏｌＣＯ；○０．１０６ｍｏｌペプチド／ｍｏｌＣＯ；△０．５３２ｍｏｌペプチドＡ／ｍｏｌＣＯ。平均値±標準偏差（ｎ＝１０）。図９（ｂ）：種々のｎＬＤＬ標品のゼータ電位測定値に対するｐＨの影響。脚注：図９（ｂ）。すべての標品ＰＣ：ＴＯ：ＣＯ，３：２：１。■ＤＭＳＯ処理の対称；□｛ペプチドＡ｝−ｎＬＤＬ０．１１９ｍｏｌ／ｍｏｌＣＯ；◇ ｛ペプチドＢ｝−ｎＬＤＬ０．１１２ｍｏｌ／ｍｏｌＣＯ；○｛ペプチドＣ｝ −ｎＬＤＬ０．１１１ｍｏｌ／ｍｏｌＣＯ。平均値±標準偏差（ｎ＝１０）。図１０（ａ）：｛ペプチドＡ｝−ｎＬＤＬ標品の平均径数及びゼータ電位測定値に対するマイクロエマルジョン製剤の影響。脚注：図１０（ａ）。開いた記号は平均径数、閉じた記号はゼータ電位。□ＰＣ：ＴＯ：ＣＯ，３：２：１；○ＰＣ：ＳＭ：ＴＯ：ＣＯ，２．５：１：２．４：１．２；△ＰＣ：ＳＭ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，４．４：１．８：１：４．２：２．１。平均値±標準偏差，ｎ＝１０。図１０（ｂ）：｛ペプチドＢ｝−ｎＬＤＬ標品の平均径数及びゼータ電位測定値に対するマイクロエマルジョン製剤の影響。脚注：図１０（ｂ）。開いた記号は平均径数、閉じた記号はゼータ電位。□ＰＣ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，６．２：１：４．２：１；○ＰＣ：ＳＭ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，４．４：１．８：１：４．２：２．１。平均値±標準偏差，ｎ＝１０。図１０（ｃ）：｛ペプチドＣ｝−ｎＬＤＬ標品の平均径数及びゼータ電位測定値に対するマイクロエマルジョン製剤の影響。脚注：図１０（ｃ）。開いた記号は平均径数、閉じた記号はゼータ電位。□ＰＣ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，６．２：１：４．２：１；○ＰＣ：ＳＭ：ＵＣ：ＴＯ：ＣＯ，４．４：１．８：１：４．２：２．１。平均値±標準偏差，ｎ＝１０。図１１：試験管内４℃でのＢ１６細胞への種々１４Ｃ−ｎＬＤＬ標品の全結合曲線。脚注：図１１。細胞を一晩血清飢餓状態に置き、ＤＦＣＳを補充したｎＬＤＬ標品をコレステロール濃度として０．０８ｍｍｏｌ／ｌ含む培地（４℃に冷却したもの）へ添加する前に４℃で冷却した。すべてのペプチド濃度は０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌコレステロール。□［ＮＰ］−ｎＬＤＬ；◇［ペプチドＡ］−ｎＬＤＬ；○ ｎＬＤＬ；＋［ペプチドＥ］−ｎＬＤＬ。図１２(ａ)及び１２(ｂ)：試験管内４℃でのＢ１６細胞への種々１２Ｃ−ｎＬＤＬ標品の非特異的（１２ａ）及び特異的（１２ｂ）結合曲線。脚注：図１２(ａ)及び１２(ｂ)。細胞を一晩血清飢餓状態に置き、ＤＦＣＳを補充したｎＬＤＬ標品をコレステロール濃度として０．０８ｍｍｏｌ／ｌ含む培地（４℃に冷却したもの）へ添加する前に４℃に冷却した。すべてのペプチド濃度は０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌ（コレステロール）であった。非特異的結合に関する値は、過剰のラベル化なしのｎＬＤＬを用いて測定し、特異的結合値は全結合から特異的結合を減じて算出した。□［ＮＰ］−ｎＬＤＬ；◇［ペプチドＡ］ −ｎＬＤＬ；〇ｎＬＤＬ；＋［ペプチドＥ］−ｎＬＤＬ。図１３：試験管内４℃でのＢ１６細胞への種々１４Ｃ−ｎＬＤＬ標品の全結合データの二重相互プロット。脚注：図１３。実験条件は図１２(ａ)及び１２(ｂ)に同じ。直線は一次回帰によって決定し、数値は表１に示されたデータから算出した。□［ＮＰ］−ｎＬＤＬ；◇［ペプチドＡ］−ｎＬＤＬ；○［ペプチドＢ］−ｎＬＤＬ；△［ペプチドＣ］− 図１４：ウシ血清アルブミンで培養後のＤｉｏラベル化ｎＬＤＬのクロマトグラフイー。脚注：図１４。■Ｄｉｏ；○ウシ血清アルブミン，セファクリルｓ−３００カラム（ベッド容積９．１ｍｌ）。Ｄｉｏラベル化を行ったｎＬＤＬをＰＢＳ／ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、ＰＢＳで予め平衡に至らしめたカラムヘ加える前に３７℃で培養した。溶出した分各画について方法中に記載されたＤｉｏ及びタンパク質含量を分析した。数値は各分画の単一回測定値である。図１５：Ｂ１６細胞へ結合するＤｉｏラベル化ｎＬＤＬの薬量反応脚注：図１５．細胞を４℃で３時間培養した（ｎ＝５、観察結果は１６％以下で変動した）。非特異的結合は考慮しなかった。■対称マイクロエマルジョン； ●｛ペプチドＡ｝−ｎＬＤＬ；▲｛ペプチドＣ｝−ｎＬＤＬ。図１６：４℃でのＢ１６細胞へのＤｉｏラベル化マイクロエマルジョン及びｎＬＤＬの結合特性。脚注：図１６。細胞を４℃で３時間培養した（ｎ＝５、観察結果は１６％以下で変動した）。特異的高親和性結合は、全結合から非特異的結合（１００倍過剰の無ラベルリガンドを用いて測定した）を減じて測定した。■マイクロエマルジョン全合；●｛ペプチドＡ｝ｎＬＤＬ全結合；○｛ペプチドＡ｝ｎＬＤＬ非特異的結合；図１７：３７℃でのＢ１６細胞へのＤｉｏラベル化マイクロエマルジョン及びｎＬＤＬの結合及びインターナリゼーション。脚注：図１７。細胞を３７℃で３時間培養した。平均（ｎ＝５，観察結果は１６％以下で変動した）。特異的高親和性結合は、全結合から非特異的結合（１００倍過剰の無ラベルリガンドを用いて測定した）を減じて測定した。■マイクロエマルジョン全結合；△マイクロエマルジョンインターナリゼーション；●｛ペプチドＡ｝ｎＬＤＬ全結合；▲｛ペプチドＡ｝ｎＬＤＬインターナリゼーション。図１８（ａ）及び１８（ｂ）：４℃でのＢ１６細胞へのＤｉｏラベル化マイクロエマルジョン及びｎＬＤＬ結合のスキャッチャード及び二重交互プロット。脚注：図１８（ａ）。４℃、３時間後の全結合のスキャッチャード分析、平均（ｎ＝５）。■マイクロエマルジョン；●｛ペプチドＡ｝ｎＬＤＬ：▲｛ペプチドＣ｝ｎＬＤＬ。脚注：図１８（ｂ）。４℃、３時間後の全結合の二重交互分析、平均（ｎ＝５）。記号は図１８（ａ）と同じ。図１９：［ペプチド］ｎＬＤＬＵ９３７細胞増殖に対するエチニルエストラジオールの影響。脚注：図１９。平均値±標準偏差ｎ＝４。結果は無添加の対称区培地の平均値に対する７２時間後の細胞数の増加で表した。開いた記号はエチニルエストラジオール無添加、閉じた記号はエチニルエストラジオール添加(２μｇ／ｍｌ)。□ ［ペプチドＡ］ｎＬＤＬ；○［ペプチドＢ］ｎＬＤＬ。コレステロール濃度は０．０８ｍｍｏｌ／ｌ。ここで、本発明につき以下の非限定の実施例を用いて説明する。実施例１材料及び方法（材料）卵黄ホスファチジルコリンを英国ＳｕｒｒｅｙのＬｉｐｉｄＰｒｏｄｕｃｔｓから購入し、精製せずに使用した（純度＞９９％）。トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミン（トリス）、塩酸（ＨＣｌ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）及びｔ−ブタノール（すべてアナラー・グレード）は英国ＧｌａｓｇｏｗのＭｅｒｃｋＬｔｄから入手した。トリオレイン（純度９９％、ＴＯ）、オレイン酸コレステリル（純度９８％，ＣＯ）、リン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）の錠剤及びコレステロール試験用に用いる試薬は、英国ＤｏｒｓｅｔのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙから購入した。押し出し行程で使用したポリカーボネート・フィルターは、英国ＢｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅのＣｏｓｔａｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。フィルター殺菌に使用した殺菌済・使い捨て用の０．２μｍポリスルホン・フィルターは、英国ＭａｉｄｓｔｏｎｅのＷｈａｔｍａｎＬｔｄから購入した。欧州薬局方の注射モノグラフ用の水に適合した殺菌蒸留水は、英国ＲｕｎｃｏｒｎのＳｔｅｒｉｐａｋＬｔｄから購入した。すべての合成ポリペプチドは、グラスゴー大学生化学学部にあるＴｈｉｓｔｌｅＰｅｐｔｉｄｅＳｅｒｖｉｃｅｓ（従前のＢｉｏＭａｃ）で合成した。ペプチド構造は図７に図示した通りであり、材料は純度９０％以上で供給され、受け取ると同時に使用した。すべての組織培養用の材料（培地、血清、培養フラスコ、ピペット、多壁プレート）は、英国ＰａｉｓｌｅｙのＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄから入手した。Ｕ９３７細胞は、英国ＳａｌｉｓｂｕｒｙのＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓから入手した。ＤＦＣＳはＲｏｔｈｂｌａｔら⁶の方法によりＦＣＳから調製した。モノクロナール抗ＬＤＬレセプター抗体（クローンＣ７，コード番号ＲＰＮ．５３７）はＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入し、使用直前に殺菌水で元に戻して使用した。（方法）ｎＬＤＬ粒子の調製ホスファチジルコリン：トリオレイン：オレイン酸コレステリル（ＰＣ：ＴＯ：ＣＯ）の３：２：１モル混合物をクロロホルム／メタノール溶液（２：１v/v ）中に溶解し、窒素を通しながら溶媒を除去した。次いで脂質を再溶解し、２４時間かけてｔ−ブタノールから凍結乾燥し（ＥＦ４，ＭｏｄｕｌｙｏＦｒｅｅｚｅＤｒｙｅｒ，ＥｄｗａｒｄｓＨｉｇｈＶａｃｕｕｍ，Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｕ．Ｋ．）、次いで０．０１Ｍのトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁して押し出し用に最終濃度を７−８％(w/v)とした。窒素を流しながら２５０Ｗのソニケーターを用いて脂質分散液に超音波処理を行い、１０，０００ｒｐｍで６０分遠心分離し（ＭＳＥＳｕｐｅｒｓｐｅｅｄ７５超遠心分離機，ＭＳＥＬｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．を使用）、次いで常時５０−５５℃に維持された押し出し機(ＬｉｐｅｘＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓＩｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ)の容器へ分散液を移した。脂質混合物を二つの組み合わせフィルターを用いて孔のサイズが０．１と０．０５μｍのポリカーボネート・フィルターを通して連続的に押し出し、窒素源（^N）によって与えられた６０ｐｓｉｇの圧力下で少なくとも４回押し出しを行った。脂質マイクロエマルジョンのサンプルをトリス−ＨＣｌ緩衝液を用いて希釈し、コレステロール濃度をおよそ1ｍｍｏｌ／ｌとし、攪拌水浴中で５５℃に加熱した。ＤＭＳＯ中に溶解したペプチドの等分を攪拌下にあるマイクロエマルジョンの表面下へ加え、対称区の試験はＤＭＳＯのみを用いて行った。各場合において加えるＤＭＳＯの容量はマイクロエマルジョン混合液として２０μｌ／ｍｌ以下とした。ペプチド−マイクロエマルジョン混合物を５５℃で１５分間恒温器中に保ち、次いで一晩５リットルのＰＢＳに対して透析した。生じた非天然性ＬＤＬ（ｎＬＤＬ）をフィルター（０．２μｍ）を用いて除菌し、使用するまでＮ₂ガス下に４℃で貯蔵した。コレステロール含量分析マイクロエマルジョンを分析し、コレステリルエステル含量をＡｌｌａｉｎら [⁹]の方法によって測定した。コレステロール試薬（コレステロール・オキシダーゼ、コレステロール・エステラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸塩及び緩衝液）を水浴中で３０℃に温めた。本試薬１．０ｍｌに０．０１ｍｌのサンプル、ブランク（蒸留水）あるいは標準液（コレステロール・キャリブレーター，２００ｍｇ/１００ｍｌ）を加えた。試薬−サンプル混合物を３０℃で１０分間保温した。各サンプルの吸光度を分光光度計を用いて５００ｎｍで測定した（ＣｅｃｉｌＣＥ２７２紫外線分光光度計を使用）。保温終了から３０分以内にすべてについて吸光度を読み取った。標準品コレステロールをリファレンスとしてオレイン酸コレステリル含量を算出した。細胞培養Ｕ９３７ストックカルチャーをグルタミン（１０ｍＭ）、ジェンタマイシン（５０μｇ/ｍｌ）、フンギゾン（０．５μｇ/ｍｌ）及び１０％（v/v）牛血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中３７℃で生育させた。細胞は加湿した５％ＣＯ₂大気中、１−８×１０⁵ｃｅｌｌ/ｍｌの濃度範囲内で培養維持し、週２回植え継いだ。生長解析すべての生長解析は、特に記載がない限り、２４−ウェル・プレート中で７２時間以上に渡って行われた。各生長試験の１日前に、セルを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、脱脂質された５％(v/v)子牛血清（ＤＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ培地中に再懸濁してコレステロール飢餓状態を開始させ、またＬＤＬレセプターの調節を行った。細胞を遠心分離により集め、ウェル当たり１×１０⁵個植え付けた。濾過（フィルター０．２μｍ）後、コレステロールの適当量（ＬＤＬ、マイクロエマルジョンあるいはｎＬＤＬのいずれか）を加え、５％（v/v）ＤＦＣＳを含むＲＰＭＩを用いてウェル容量を１ｍｌとした。７２時間後に各ウェルの等分をＰＢＳを用いて希釈し、存在する細胞数をクルター・カウンターを用いて３反復測定した。実験によっては、異なる濃度について４回あるいは８回反復した。均一な細胞密度が得られているかを確認するため、保温開始前に実験ごとに３個のウェルを無作為にチェックした。このチェックが分析結果の再現性に寄与する要因となることは先に示されている通りである[⁷]。すべての場合において、対称区のウェルの平均開始細胞密度は０．９５と１．０５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲内であった。結果及び考察図１に示された結果は、Ｕ９３７の生長はＦＣＳ含有培地及び程度はやや少ないがＬＤＬにより支えられているが、脱脂質されたＦＣＳあるいはＬＤＬに類似の脂質組成をもつマイクロエマルジョンによっては支えられないことを明らかにしている。この結果は、Ｕ９３７にはコレステロールの合成能力はなく、レセプターを介したＬＤＬ取り込みによりこの能力の欠陥を克服していることを証明する公表の研究報告と一致している[³]。非天然性ＬＤＬ（ｎＬＤＬ）が細胞生長を支えられるかどうかを調べるため、Ｕ９３７細胞を｛Ａ｝ｎＬＤＬとともに最大細胞生長を起こす最適ＬＤＬ濃度に匹敵するコレステロール濃度（０．０８ｍｍｏｌ／ｌ）において保温した。図２に示した結果は、｛Ａ｝ｎＬＤＬがＵ９３７細胞の試験管内での増殖を支えていることを示すものである。この生長増加は、マイクロエマルジョンだけによってひき起こされた生長よりも有意に大きいものであったが（ｐ<０．０５）、ＬＤＬにより支えられた結果と統計上相違するものではなかった（ｐ>０．０５）。これはＬＤＬに類似した形かつ細胞増殖を許容するＵ９３７のｎＬＤＬ取り込みを強く示すものである。この結果は、対称のマイクロエマルジョンがこのような性質を示していないので、粒子上のレセプター・ペプチドの存在によるものである。ＬＤＬによって誘起されたＵ９３７の増殖は、薬量依存型かつ飽和し得るものであり[³]、この事実がＬＤＬについても正しいかどうかを調べるために実験を行った。図３では、ｎＬＤＬコレステロール濃度の増加とＤＦＣＳの培地への添加の両影響を示すものである。これによれば、最適コレステロール濃度があること、及びＤＦＣＳがＵ９３７細胞による｛ペプチドＤ｝ｎＬＤＬの増殖を増大させていることが明らかである。ＤＦＣＳが誘起さた細胞数の最大増加数は、血清を含まない培地の細胞数の３倍であった。ＤＦＣＳ（０．０３２ｍｍｏｌ/ｌ）を含む培地中での｛ペプチドＤ｝ｎＬＤＬの最適コレステロール濃度は、ＬＤＬ（０．０２６ｍｍｏｌ/ｌ）で成長したＵ９３７細胞のそれに匹敵するものである[⁵]。しかし、ＬＤＬを用いた初期の知見に従えば、高濃度のｎＬＤＬは無処理と比較して細胞数の減少を生じている。最適ｎＬＤＬコレステロール濃度（最大の増殖を起こした濃度）がＤＦＣＳによって４倍増大したこと（０．００８ｍｍｏｌ/ｌから０．０３２ｍｍｏｌ／ｌ）は、血清がｎＬＤＬの取り込みをより効率的に促進したことを示している。Ｕ９３７のｎＬＤＬ取り込みに対するペプチド配列の影響を判定するため、５つのｎＬＤＬ系を使用して増殖検定試験を行った。各ペプチドの詳細については図７を参照。すべてのｎＬＤＬ系が、マイクロエマルジョン単独と比較した場合、試験した範囲のコレステロール濃度に渡って明らかな増殖をもたらしていた（Ｕ９３７細胞のｐ<０．０５）（図４）。高濃度のポリペプチドを含まないマイクロエマルジョンによる支持が認められた若干の増殖は、非特異的な食細胞活性によるものと思われる[¹⁰]。しかし、５種の異なるｎＬＤＬ系（ペプチドＡ−Ｅ）によって支えられた細胞数の増加は、粒子上へのレセプター・ペプチドの包摂が取り込みを増大させたことを強く示唆している。ペプチドＢ，Ｃ及びＤ系は増殖で最大の増加を示しており、これらにはＣ−末端脂質アンカー（ペプチドＢ及びＤ）も２２のアミノ酸残基鎖中に埋め込まれたＡｐｏＢの結合部分も含まれていない。系間の相違は、ペプチド配列及びＣ−末端の親脂質性アンカーの存在が増殖の程度を調節していることを示すものである。最も効果の低い系であるペプチドＡ及びＥは、Ｃ及びＮ−末端脂質アンカー（ペプチドＡ）の双方を持つ最も鎖長の短いものか、あるいは非ＡｐｏＢ結合部分アミノ酸配列（ペプチドＥ）のいずれかを含むものである。ＬＤＬはペプチドＡ，Ｄ及びＥを含むｎＬＤＬ標品に類似する増加を支えたが、それは｛ペプチドＢ｝及び｛ペプチドＣ｝ｎＬＤＬよりも３倍小さいものであった（図４参照）。これはおそらく商業的に入手できるＬＤＬの生存力に起因するものであろう。測定された増加は、Ｆｒｏｓｔａｇａｒｄらによってコレステロール濃度０．０３ｍｍｏｌ/ｌで行った報告[³]、２０μｇ/mlのＬＤＬコレステロールを用いたＳｃｈｅｗｅらの報告[⁴]及び培養基中に１０μｇ/mlを含ませたＳｅｌｌｓとＢａｒａｋａｔの報告[⁵]よりも１０倍小さいものであった。この結果は、試験管内あるいは生体内試験用に新鮮なＬＤＬを分離する現状の必要性にわる間題点を例証するものである。ｎＬＤＬが誘起したＵ９３７細胞増殖は、レセプターを介在する取り込みのためであることをさらに明らかにするため、細胞を種々のｎＬＤＬ標品（コレステロール濃度０．０２６ｍｍｏｌ/ｌ）及び商業的に入手したヒト抗ＬＤＬレセプター抗体とともに保温した。先にＬＤＬ（０．１５０ｍｍｏｌ/ｌ）が支えたＵ９３７の成長を殆どゼロまで減少させたことがあるため、抗体濃度は10μｇ/ｍｌとした[³]。抗体とともに保温した場合、ｎＬＤＬ標品及びマイクロエマルジョンのそれぞれを含む培地中でのＵ９３７細胞の成長は少し減少した（図５参照）。｛ペプチドＡ｝ｎＬＤＬ，［ペプチドＣ］ｎＬＤＬについての減少は統計上有意であったが、細胞数は対称のマイクロエマルジョンのレベルまでは減少しなかった。Ｕ９３７のｎＬＤＬ取り込みに対する抗ＬＤＬレセプター抗体の効果についてさらに研究するため、一定範囲の抗体濃度について［ペプチドＢ］ｎＬＤＬ（０．０３３ｍｍｏｌ/ｌ）を含む培地中で７２時間をかけて試験を行った。［ペプチドＢ］ｎＬＤＬがＵ９３７の成長促進に関して最も効果的なｎＬＤＬであるという事実は、最も効果の高いレセプター相互作用を示すものである（図４参照）。低濃度（５μｇ／ｍｌ）の抗体は増殖に影響はないが（図６参照）、高濃度は薬量依存性で飽和点のある阻害効果を生み出す。抗体飽和状態（１５μｇ/ｍｌ）でさえ、細胞増殖は脂質なしの対称区ウェルより明らかに多い（ｐ<０．０５）。本研究で観察された抗体飽和状態（１５μｇ/ｍｌ）での細胞成長の大きな阻害（７４％、ｐ<０．０５）は、ｎＬＤＬが誘起する細胞増殖はＬＤＬレセプターによる取り込みを介したものであるという推測をさらに強化するものである。本研究で示されたｎＬＤＬ粒子は濃度依存性であり、また試験管内でＵ９３７細胞の細胞増殖を誘起する飽和能を有することが示された。この効果は培地中にＤＦＣＳが存在すれば刺激され、また抗ＬＤＬレセプター抗体によって阻害される。これらの結果は、ｎＬＤＬがＵ９３７細胞増殖検定試験において天然のＬＤＬの効果をまねるものであることを示しており、またｎＬＤＬがレセプター受容性であることを明らかにしている。ｎＬＤＬ系での比較により、ペプチド配列の変更によって、また脂質アンカーの数と位置を変えることによって、レセプター相互作用の調節が可能であることも明らかにされている。実施例２材料及び方法材料、ｎＬＤＬ粒子の適当な標品及びコレステロール含量の分析については、上記実施例１の概要に準ずる。光量子相関分光法粒子サイズの分析を光量子相関分光機（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ，Ｍｏｄｅｌ４，ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕ．Ｋ．）を用いて実施した。分析前に、サンプルはトリス・ＨＣｌ緩衝液（０．０１Ｍ）を用いて希釈し、濾過（０．２μｍフィルターを使用）した。サイズ測定は入射ビームに対して９０° の固定角度で行った。より正確なサイズ分布測定を可能とするため、コリレーターを並行的に作動させた。散乱光の強度に従って重量測定したサンプルの平均サイズ（ｚ−平均粒径）をキュムランツ分析法によって算出した。この粒径は大形粒子に偏って測定されるため、レイリー理論によって強度分布を数分布に変換した[¹²]。このサイズ計算には、純水の粘度及び屈折率を使用した。引用されたすべての結果は、少なくとも１０回の測定値の平均及び標準偏差である。ゼータ電位測定サンプルを０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５に対して１の割合で希釈し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４(ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)を用いて２５℃でゼータ電位を測定した。各場合とも与えた電圧は１５０Ｖであり、細胞電流を２０ｍＡに制限するため反復使用を行った。引用されたすべての結果は少なくとも１０回の測定値の平均及び標準偏差である。結果及び考察粒径及びゼータ電位双方に対するペプチド濃度増加の影響について図８に示した。すへてのペプチドは測定されたゼータ電位を負値から正値へと変えようとするが、粒径に対しては著しく異なる影響を与える。０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ以下では、ＣＯペプチドＡはサイズには何ら影響を与えないが、濃度にともなってゼータ電位の直線的増加を引き起こす。高濃度においては、サイズの増大を生ずるが、ゼータ電位は＋１７ｍＶ付近でプラトーとなる。低濃度のペプチドＢは、大きさには何ら変化はないが−１５ｍＶから＋１５ｍＶへのゼータ電位の急激な反転を起こす。濃度をさらに増加しても、ゼータ電位を増大させず、＋１５ｍＶの一定値に留まらせ、電位の大きさも一定に維持される。０．１ｍｏｌ/ｍｏｌＣＯ付近のペプチドＣも、測定された粒径に影響せずにゼータ電位の反転を起こすが、一方では、より高濃度では粒径がほぼ倍となり、またゼータ電位は正値のままだが減少する。ゼータ電位は表面電荷の計測法であり、観察された結果によれば、ペプチドは自発的にマイクロエマルジョンの小滴表面に位置を取ることが示される。粒径が変化しない留まるペプチドの低濃度（０．２ｍｏｌ／ｍｏｌＣＯ以下）においては、ペプチドＡ及びＢによってひき起こされるゼータ電位の増加は大まかには等しく、他方ペプチドＣの場合はその効果を倍に高める。両アンカー（ペプチドＡ及びＣ）を含むペプチドは低濃度（それぞれ０．５及び０．２ｍｏｌ/ｍｏｌＣＯ）で粒径の増大を生じる一方、１アンカーのみ持つペプチドＢはいずれの濃度においても影響がない。類似の影響は天然ＬＤＬで知られており、その場合、サーファクタントが誘起したサイズの増加は親脂質性部分の分子サイズとの相関がある[¹³]。コレステロール・アンカーの欠失は、ペプチドＡ及びＢについて得られたゼータ電位が類似していることから、粒子へのペプチド挿入を妨げるとは思われない。ペプチドＣ中の増大されたペプチド鎖の長さも小滴の径に影響があるようであり、ペプチドＡよりも低い濃度で増大を起こす。結果によれば、脂質アンカーはマイクロエマルジョン小滴の外側にあるリン脂質層中に埋もれる一方、比較的親水性のペプチドは外側表面上に留まったままである。図９（ａ）には、種々の［ペプチドＡ］−ｎＬＤＬ系について測定されたゼータ電位に対するｐＨ変化の影響が示されている。すべての場合、ｐＨの増加につれて負値への移行を示している。［ＮＰ］−ｎＬＤＬ（ペプチドなし）も同様に、このような傾向を示しており（３つのｐＨユニットに渡って１０ｍＶ）、この傾向は水酸化ナトリウムでのｐＨ調整による緩衝液のイオン強度の変化に相関している。０．５３２ｍｏｌペプチドＡ／ｍｏｌ COの濃度におけるゼータ電位変化は−２０ｍＶであり、また０．１０６ｍｏｌペプチドＡ/ｍｏｌCOでは−１６ｍＶであり、双方とも対称区の電位変化より大きかった。試験を行った極端にアルカリ性のｐＨでは、最も高いペプチド濃度の例外を除き、すべての系で同等なゼータ電位が認められた。このことは、ペプチドのイオン化が抑制され、測定された値はマイクロエマルジョンの電位であることを示している。この結果は、ペプチドが粒子表面上に晒されていることを示すものである。類似のペプチド濃度での３種の異なるｎＬＤＬ標品が図９（ｂ）中に示されているが、すべて図９（ａ）中において示された傾向を表している。図９（ｂ）は種々のｎＬＤＬ標品について測定されたゼータ電位に対するｐＨの影響を示している。マイクロエマルジョンの表面脂質成分の変更による測定された平均径数及びゼータ電位の変化に関する結果が図１０に示されている。使用された両親媒性脂質混合物は、天然のＬＤＬ中に見出されたそれら混合物に比例していた[¹¹]。ペプチドＡ及びＢの双方とも、径の多少の変化を伴なったゼータ電位の反転を示した一方、ペプチドＣは両パラメーターについて大きな変化を引き起こした。異なるｎＬＤＬ系の中で、混合前にはすべてが同様な値を示していたが、ペプチドＡだけが脂質製剤間でのゼータ電位の有意な相違を示した。ここに示された結果は、Ａｐｏ−Ｂ１００からのレセプター結合配列を含んだＬＤＬの完全合成類似体が製造可能なことを説明するものである。この用いられた合成ペプチドは濃度に依存する形で脂質マイクロエマルジョンの表面へ混ぜ込まれた。生成した粒子は天然ＬＤＬに相当する物理化学性を有し、粒径は少し大きいが調節可能なゼータ電位を持つものである。実施例３材料及び方法Ｂ１６細胞をＷｅｓｔｅｒｎＩｎｆｉｒｍａｒｙ，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｕ．Ｋ．の皮膚科部より入手した。他の材料、ｎＬＤＬ粒子の調製及びコレステロール含量分析については前記実施例１及び２における概略に準ずる。１４Ｃ−オレイン酸コレステリルの混合必要量の１４Ｃ−オレイン酸コレステリル（０．５μＣｉ/ｍｍｏｌ CO，トルエン溶液で供給）を必要な場合１０倍量のＤＭＳＯと混合し、次いで水浴中５５ ℃で加熱攪拌しておいたｎＬＤＬ中へ加えた。５時間保温状態に置いた後、混合液をセファデックスＧ−２５Ｍゲル押し出しクロマトグラフィーカラム（ベッド容量１０ｍｌ）へＰＢＳを溶出液として用いて通過させた。分液（１ｍｌ）を採取し、その吸光度（３００ｎｍ）及び１４Ｃ−オレイン酸コレステリル活性を測定した。ラベル化した標品をフィルター（０．２μｍ）除菌し、使用までＮ₂ガス下４℃に保管した。組織培養Ｂ１６細胞は、１０％(v/v)ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、５％炭酸ガスを大気に加えて３７℃に維持した。集密培養はトリプシン処理を行い、採取し、新鮮な培地２０部に対し１部の割合で再度植え付けを行った。細胞結合検定Ｂ１６細胞を対数成育期に採取し、遠心分離して洗浄し、１０(v/v)ＤＦＣＳを含んだ培地を入れた２４ウェル・プレート中に１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で再植え付けした。一晩保温した後、細胞を４℃で１時間冷却し、培地を吸引し、１０％(v/v)ＤＦＣＳを含み、コレステロール濃度０．０８ｍｍｏｌ／ｌで１４Ｃ−ｎＬＤＬを補充した氷冷培地と置き換えた。各濃度についてウェルは４反復使用した。次いで細胞を４℃で時々揺らして４時間保温し、培地を吸引して細胞を３回氷冷したＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液(ＰＢＳｍｌ当たりＢＳＡ２ｍｇ)を用いて洗浄し、次いで氷冷したＰＢＳ／ＢＳＡによって１０分間２回保温した。その後で、最終的に氷冷したＰＢＳを用いて３回洗浄を行った。１４Ｃ−オレイン酸コレステリルをヘキサン／イソプロパノール溶液で室温下３０分間抽出し、吸引し、計数前にシンチレーション用液３ｍｌと混合した。抽出後ウェル中に残った細胞タンパク質についてローリー法のピーターソンによる変法を用いて検定を行った[¹⁴]。デオキシコール酸ナトリウム（１．５ｍｇ/ｍｌ）を加えてタンパク質を可溶化し、トリクロロ酢酸（７２％ｗ/ｖ）を加えてこのタンパク質を沈殿させ、遠心分離（５，０００ｒｐｍ，１０分間）してペレット化し、上清を捨て、前記ペレットをローリー試薬中に室温で２０分掛けて可溶化した。ＦｏｌｉｎＣｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を加え、溶液を混合し、その色をプレート・リーダーを用いて６９０ｎｍで吸光度を測定する前に３０分間発色させた。ＢＳＡ標品の２０〜２００μｇ/ｍｌの濃度範囲に渡って校正曲線をプロットした。結果及び考察ｎＬＤＬがレセプターに依存した形で結合するかどうかを確認するため、増量した放射性物質でラベルした［ペプチドＸ｝ｎＬＤＬを試験管内でＢ１６へ加え、その結果を図１１に示した。［ペプチドＸ｝ｎＬＤＬ粒子（ペプチドＢ，Ｃ，Ｄ及びＥ）の４つについて、レセプター・リガンド相互作用の典型である全結合中の可飽和増加分の値を得た。［ＮＰ］ｎＬＤＬ（ペプチドを含まないｎＬＤＬ（ＮＰ））も可飽和結合を示した一方、［ペプチドＡ］ｎＬＤＬは試験を行った濃度で直線的反応を与えた。［ペプチドＤ］ｎＬＤＬはレセプターの飽和状態で［ペプチドＣ］ｎＬＤＬのほぼ２倍の結合性をもつため、ｎＬＤＬ中に混合されるペプチドの選択はＢ１６細胞との相互作用に大きな影響をもつことは明らかである。明らかに、結果は[ペプチドＸ]ｎＬＤＬ及びＢ１６細胞間に相互作用が起こっていること、及び組み込まれたペプチドによってこの相互作用が和らげられていることを示すものである。ＬＤＬレセプター結合は二つの構成要素、高親和性特異的結合及び非特異的結合（過剰の非ラベル化リガンドの存在下でのリガンド結合として定義される）から成るものである[¹⁶]。前者は親和性定数の計算に通常使用され、全結合から非特異的結合を減じて測定される。種々の［ペプチドＸ］ｎＬＤＬ標品について測定した非特異的及び特異的結合は図１２（ａ）及び１２（ｂ）に示されている。これらの結果は、試験されたすべての濃庶について、「ペプチドＢ］，「ペプチドＤ］及び［ペプチドＥ］ｎＬＤＬの特異的結合は、［ＮＰ］又は［ペプチドＣ］ｎＬＤＬのいずれかについて得られた結合より高かったことを説明するものである。さらに、［ペプチドＢ］，［ペプチドＤ］及び［ペプチドＥ］ｎＬＤＬは非特異的結合よりもより特異的であることを示している。二重交互プロットは図１３に、また計算された定数は表１に示した。すべての標品についての直線回帰分析により、統計的に有意な相関計数が得られた（表１参照）。残りの［ペプチドＸ］ｎＬＤＬ標品には結合定数の等級があり、［ペプチドＥ］＞［ペプチドＢ］＞［ペプチドＤ］となっている。［ＮＰ］ｎＬＤＬは飽和結合曲線を与えているので、それは［ペプチドＤ］ｎＬＤＬに非常に類似した値の結合定数をも与えている。これらの結果は、ｎＬＤＬがＢ１６細胞と試験管内４℃で、混合されたペプチドの構造によって決まる限度で飽和結合速度論を提示することを明らかにしている。二つの脂質アンカーをもつ１１のアミノ酸ペプチドは［ペプチドＡ］との結合を生ずるが、Ｃ−末端のコレステロールの除去は著しく［ペプチドＢ］の機能性を向上させる。２２のアミノ酸から成るペプチドは、［ペプチドＣ］の結合をさらに強め、コレステロールアンカーの同様な除去は［ペプチドＤ］の結合受容性をさらに増大させている。このような性能の改善は、従前のペプチド中に存在するアミノ酸に基づく［ペプチドＥ］のランダム配列を用いて調整することができる。このことは、測定された結合が、単純な物理的影響よりもむしろペプチドとその構造（長さ、脂質アンカー及び配列）に関わっていることを強く示唆するものである。表１：全結合の二重交互プロットから測定した[ペプチドｘ]ｎＬＤＬの結合定数計算値は一次回帰式によって算出した。すべての直線が統計的に有意であった(p <０．０５)。＊切片が正値であるため計算できなかった。実質例４材料及び方法材料、マイクロエマルジョン及びｎＬＤＬ粒子の調製、コレステロール含量の分析はし９３７細胞に変えＢ１６細胞を用いたことを例外とする他は実施例１に準ずる。マイクロエマルジョン、nLDLの蛍光ラベル化ＬＤＬ、ｎＬＤＬ及びマイクロエマルジョンを、(以下に記載するが)Stephan とYuracheck[¹⁸]の方法の変法によってラベル化した。蛍光プローブ保存液（3ｍｇ／5ｍｌDMSO）を濃度300μｇ／ｍｇ(ＬＤＬタンパク質)でＬＤＬ溶液中、あるいは同一容量かつ同等のコレステロール濃度(1mmol／ｌ)を含有するマイクロエマルジョンあるいはｎＬＤＬ懸濁液中へ加えた。脂質Ｄｉｏ混合物を暗黒下３７ ℃で５時間保温し、PBSを溶出液に用いてセファデックスG-25Mカラム(ベッド容量９．１ｍｌ)中へ通過させた。生じたラベル化されたｎＬＤＬをフィルター(０．２μｍ)で除菌し、使用まで窒素ガス下4℃で保管した。マイクロエマルジョンのＤｉｏ濃縮液を、４８４ｎｍ及び５８７ｎｍの励起及び放射波長のぞれぞれについて蛍光分光光度計(Perkin Elmer 203，Xenon Model 150 Lamp)を用いて測定した。Ｄｉｏでラベル化された材料(２００μｌ)をメタノール(３ml)中へ加え、蛍光度を測定し、濃度を標準曲線と照合して算出した。細胞培養対数成長期のB16細胞をトリプシン処理し、１０％ｖ／ｖＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０(1ｍｌ)を含む24-ウェル・プレート中へ５×１０⁴cells／ウェルの濃度で接種して保温した。細胞を24時間そのまま生育させ、次いでさらに２４時間５％（ｖ／ｖ）ＤＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で血清飢餓状態に置いた。Ｄｉｏでラベルしたマイクロエマルジョン及びｎＬＤＬをフィルター (０．２μｍ)へ通し、既知の濃度でウェル中へ加えた。プレートを、結合を測定するためなら４℃、細胞に結合したＤｉｏ濃度を測定すろためなら３７℃に３時間保温した。脂質を加える前に、４℃に保温したプレートを３０分間冷却した。保温後、残存培地を吸引し、解離を防ぐため細胞を注意深く洗浄し、次いで各ウェルへメタノール(1ml)を加え、静かに攪拌しながら３０分間室温で保温した。メタノール抽出液を５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸引し、メタノール (２ml)中へ加え、次いで前記した蛍光定量法でＤｉｏ濃度を測定した。保温したＤｉｏ-無ラベル化細胞についても自然蛍光発色を考慮してメタノール抽出を行った。プレート当り３ウェルについて、２ＭＮａＯＨを加え、Lowry法[¹⁵]のPeterson変法[¹⁴]を用いてルーチン的にタンパク質濃度を分析した。Ｂ１６細胞は接触を阻止され、実験期間中はほぼ融合状態であり、この測定で得た平均値を用いた。特異的に結合及び会合したＤｉｏは、各濃度測定について、２ウェル中に無ラベル化リガンドの１００倍過剰量を含ませて測定した。特異的結合は、全結合(過剰分なし)から非特異的結合(過剰分含む)を減じて計算した。データはスキャチャード及び二重交互分析を用いて処理し結合定数を算出した。結果レセプター結合研究においてｎＬＤＬがラベル化可能か否かを調べるため、サンプルをセファデックスG-25Ｍカラム（ＰＤ−１０）を用いてクロマトグラフィーにかけた。分画についてＤｉｏ及びコレステロール濃度をモニターし、結果を表２に示した。Ｄｉｏが確実にｎＬＤＬに結合しているか否かを確認するため、サンプルを子牛血清アルブミン(ＢＳＡ，2mg／ml)を含有する同一量のPBSとともに３７℃で３０分間保温し、次いでセファクリルS-３００カラムを用いてクロマトグラフィーを行った。蛍光の８０％以上が粒子に結合し(図１４参照)、少量のみがタンパク質とともに溶出された。Ｄｉｏ等のカルボシアニン色素は、特にコレステロールが同時に存在する場合、リン脂質層へ挿入された後殆ど移動しないことが知られている。データによれば、ｎＬＤＬ懸濁液はＬＤＬのため先に案出された方法の変法を用いてＤｉｏでラベルすることが可能である[¹⁷と¹⁸]。Ｂ１６細胞へのＤｉｏ-ラベル化ｎＬＤＬの結合に関する最初の研究は過剰の無ラベル化リガンドなしに行われている。最初に製造されたｎＬＤＬは少量の培養ウェルへ加えるのに十分な過剰量(ラベル化されたｎＬＤＬの１００倍量)を得るのに十分なほど濃縮されていなかった。[ペプチドＡ]ｎＬＤＬ及びマイクロエマルジョンは類似の結合態様を示したが(図１５参照)、[ペプチドＣ]ｎＬＤＬは添加されたリガンドのより高いレベルで飽和した。Ｄｉｏ-ラベル化ｎＬＤＬの４℃でのＢ１６細胞への全結合曲線が薬量依存的であり飽和するようであることは、レセプター介在の相互作用を示唆するものである。図１６はコレステロール濃度増加の、ラベル化された[ペプチドＡ]ｎＬＤＬ及びマイクロエマルジョンのＢ１６細胞への4℃下での結合(特異的結合、非特異的結合及び全結合)に対する影響を示している。両者は類似の全結合曲線をもつが、マイクロエマルジョンは[ペプチドＡ]ｎＬＤＬと比べた場合、非特異的成分を示し増加させる。[ペプチドA]ｎＬＤＬの非特異的結合は加えた量に直線的に比例するが、計算による特異的結合より大きいものであった。[ペプチドA]ｎＬＤＬの特異的結合は、濃度依存的と見られるが、試験を行った濃度では飽和に至るものではなかった。３７℃で３時間で内面化されたｎＬＤＬの量は結合された全細胞から全結合を減じて算出することができる(図１７参照)。[ペプチドA]ｎＬＤＬは３パラメーターのすべてについて０〜２５μｍｏｌ／ｌのコレステロール範囲に渡って直線的薬量反応を与えるが、このことは最高濃度であっても[ペプチドA]ｎＬＤＬのレセプター依存的取り込みを飽和状態にまで至らしめなかったことを示唆するものである。これらの結果は[ペプチドA]ｎＬＤＬが直ちにＬＤＬレセプターへ結合できることを示している。レセプター結合定数は、スキャチャード及び二重交互プロット(図１８（ａ）及び１８（ｂ）)から算出され表３に示されている。これら両タイプの分析法は、マイクロエマルジョンと比べた場合、[ペプチドA]ｎＬＤＬ及び[ペプチドC]ｎＬＤＬに関してはずっと高い会合定数を生ずる。これら結果は、ペプチドを伴うか伴わないかでの相違、あるいはペプチド間の相違を強調するものである。特異的結合はペプチドの存在によって与えられ、結合の程度はペプチドの構造によっている。この結果は、ＡｐｏＢレセプター配列を含む両親媒性のペプチドｎＬＤＬ粒子上への包摂が細胞表面レセプターへ高い親和性結合を与えること、及び結合親和性はペプチドの長さによって影響されることを示している。ペプチドの長さを１１から２２のアミノ酸へと倍にすれば測定される親和性もほぼ倍になる。実施例１に示されたデータと連関しているこの結果は、[ペプチドX]ｎＬＤＬ粒子がＢ１６細胞上の低密度リポタンパク質レセプターと相互作用していることを示している。この相互作用は、両親媒性ペプチドの全長及び親脂質性アンカーによって調整されており、二つのアンカーは単一アンカーの場合より低い結合力を与える。表２：ＬＤＬ及びｎＬＤＬのＰＤ−１０溶出液からのコレステロール及びＤｉｏの回収表３：スキャチャード及び二重交互分析から測定されたレセプター結合定数実施例５材料、ｎＬＤＬ粒子の調製方法、コレステロール含量の分析、細胞培養及び細胞成長あるいは増殖検定は実施例１の記載に準ずる。光量子相関分光法及びゼータ電位測定は実施例２の記載に準ずる。結果いくつかの研究において、エストロゲンはＬＤＬレセプター数の上方制御と後続して増加する血漿ＬＤＬクリアランスを介して次亜脂質様効果を働かせることが示唆されている[¹⁹]。もしｎＬＤＬが誘起したＵ９３７の増殖がＬＤＬレセプターを介して起こるのであれば、エストロゲンの培地への添加はこの効果を強める筈である。増殖誘起に対するエストロゲン処理の結果は図１９に示している。エストロゲンはペプチドがない場合、対称区の系には何ら影響はないが、同様なペプチド濃度において[ペプチドA]ｎＬＤＬ及び[ペプチドB]ｎＬＤＬに関して増殖の劇的な増加を生ずる。高濃度のペプチドにおけるエストロゲンにより刺激される[ペプチドB]ｎＬＤＬの増殖は少なく、試験された最高濃度では完全に消失した。Ｕ９３７の増殖の有意な増加が達成されたことは、これらの系がＬＤＬレセプター経路を利用していることを示唆するものである。[ＮＰ]ｎＬＤＬに対してはエストロゲン刺激を与えていないので、その影響を食作用の増大あるいは類似する他の非特異的メカニズムのせいにできないことは明らかである。増殖へのエストロゲン刺激はさらに、ＬＤＬの取り込みがＬＤＬレセプター経路を介するものであることを示すものである。ｎＬＤＬ系は、薬物を標的とする仕事への応用で調節可能なＬＤＬ代替物として有用であることが示される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月１２日（１９９８．９．１２）【補正内容】補正後の請求の範囲１２．前記少なくとも１のペブチド成分が、（１）Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Asn Lys His Arg His又はその二量体、及び（２）Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys又はその二量体、から選ばれるいずれかの結合配列を含むことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の粒子。１３．前記ペプチド成分が、図７に示されるペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣ、ペプチドＤ及びペプチドＥから成るグルーブから選ばれることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の粒子。１４．配列(１)又は(２)あるいはそれらの二量体から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位と少なくとも７０％のアミノ酸同一性があるＡｐｏＢタンパク質結合配列を含有することを特徴とする合成ペプチド。１５．配列(１)又は(２)あるいはそれらの二量体から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位と少なくとも８０％のアミノ酸同一性があるＡｐｏＢタンパク質結合配列を含有することを特徴とする請求項１４に記載の合成ペプチド。１６．配列(１)又は(２)あるいはそれらの二量体から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位と少なくとも９０％のアミノ酸同一性があるＡｐｏＢタンパク質結合配列を含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載の合成ペプチド。１７．（１）Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Asn Lys His Arg His又はその二量体、及び（２）Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys又はその二量体、から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位を含有することを特徴とする合成ペプチド。１８．８〜５００個長のアミノ酸残基を有する請求項１４〜１７のいずれかに記載の合成ペプチド。１９．８〜２００個長のアミノ酸残基を有する請求項１４〜１８のいずれかに記載の合成ペプチド。２０．８〜５０個長のアミノ酸残基を有する請求項１４〜１９のいずれかに記載の合成ペプチド。２１．図７に示されるペプチドＡ、ペブチドＢ、ペブチドＣ、ペプチドＤ及びペプチドＥから成るグループから選ばれる合成ペプチド。２２．患者におけるＡｐｏＢタンパク質レセプター含有癌細胞の治療に使用する薬物標的ベクターとしての請求項１〜１３のいずれかに記栽の非天然性レセプター受容性ＬＤＬ粒子。２３．癌細胞の治療において使用する薬物標的ベクターの製造に用いる、請求項１〜１３のいずれかに記載の非天然性レセプター受容性ＬＤＬ粒子。２４．抗癌剤を含有する請求項１〜１３のいずれかに記載の非天然性ＬＤＬ粒子の臨床的有効量を患者へ投薬することから構成される癌患者の治療方法。２５．i) 親脂質性分子及び両親媒性脂質分子から脂質成分を生成し、 ii) 少なくとも１の親脂質性置換基と少なくとも１のＡｐｏＢタンパク質レセプターと相互作用可能な結合部分とを含有する少なくとも１のペプチドを前記生成された脂質と接触させることから構成される請求項１〜１３のいずれかに記載のＡｐｏＢレセプター受容性を有する非天然性レセプター受容性ＬＤＬ粒子の製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ベイリージョージイギリス国ケイエー４８ジェイイーキルマーノックガルストンブレア・ストリート 15

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１のＡｐｏＢタンパク質レセプターとの結合部位と少なくとも１の親脂質性置換基とを含む少なくとも１のペプチド成分を含有することを特徴とする非天然性レセプター受容性ＬＤＬ粒子。２．前記少なくとも１のペプチド成分が、リジン、アラニン、グルタミン、チロシン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、ロイシン、グリシン及びその類縁体から成るグループから選ばれるアミノ酸残基から成る少なくとも１のＡｐｏＢタンパク質レセプター結合部位を含むことを特徴とする請求項１に記載の粒子。３．前記少なくとも１のペプチド成分が８〜５００個長のアミノ酸残基がら成ることを特徴とする請求項１又は２に記載の粒子。４．前記ペプチド成分が８〜２００個長のアミノ酸残基から成ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の粒子。５．前記ペプチド成分が８〜５０個長のアミノ酸残基から成ることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の粒子。６．前記ペプチド成分が９〜３０個長のアミノ酸残基から成ることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の粒子。７．前記ペプチド成分の親脂質性置換基が、コレステロール、レチノイック酸及びＣ₁₀−Ｃ₂₂の脂肪酸から成るグループから選ばれるいずれかであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の粒子。８．前記ペプチド成分がさらに水酸基、カルボキシル基及びアミノ基から成るグループから選ばれるいずれかの親水性置換基を含むことを特徴とする請求項７に記載の粒子。９．前記ペプチド成分の結合配列がＡｐｏＢタンパク質の結合配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有することを特徴とする請求項７に記載の粒子。１０．前記ペプチド成分の結合配列がＡｐｏＢタンパク質の結合配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有することを特徴とする請求項９に記載の粒子。１１．前記ペプチド成分の結合配列がＡｐｏＢタンパク質の結合配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有することを特徴とする請求項９又は１０に記載の粒子。１２．前記少なくとも１のペプチド成分が、（１）Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Asn Lys His Arg His又はその二量体、及び（２）Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys又はその二量体、から選ばれるいずれかの結合配列を含むことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の粒子。１３．前記ペプチド成分が、ペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣ、ペプチドＤ及びペプチドＥから成るグループから選ばれることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の粒子。１４．配列（１）又は（２）あるいはそれらの二量体から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位と少なくとも７０％のアミノ酸同一性があるＡｐｏＢタンパク質結合配列を含有することを特徴とするペプチド。１５．配列（１）又は（２）あるいはそれらの二量体から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位と少なくとも８０％のアミノ酸同一性があるＡｐｏＢタンパク質結合配列を含有することを特徴とする請求項１４に記載のペプチド。１６．配列（１）又は（２）あるいはそれらの二量体から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位と少なくとも９０％のアミノ酸同一性があるＡｐｏＢタンパク質結合配列を含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のペプチド。１７．（１）Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Asn Lys His Arg His又はその二量体、及び（２）Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys又はその二量体、から選ばれるいずれかのＡｐｏＢタンパク質結合部位を含有することを特徴とするペプチド。１８．８〜５００個長のアミノ酸残基を有する請求項１４〜１７のいずれかに記載のペプチド。１９．８〜２００個長のアミノ酸残基を有する請求項１４〜１８のいずれかに記載のペプチド。２０．８〜５０個長のアミノ酸残基を有する請求項１４〜１９のいずれかに記載のペプチド。２１．ペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣ、ペプチドＤ及びペプチドＥから成るグループから選ばれるペプチド。２２．患者におけるＡｐｏＢタンパク質レセプター含有癌細胞の治療に薬物標的ベクターとしての請求項１〜１３のいずれかに記載のｎＬＤＬ粒子の使用。２３．ＡｐｏＢタンパク質レセプター含有癌細胞の治療用に内包する薬剤を特徴とする薬物標的ベクターの製造に用いるｎＬＤＬ粒子の使用。２４．抗癌剤を含有する請求項１〜１３のいずれかに記載の非天然性ＬＤＬ粒子の臨床的有効量を患者へ投薬することから構成される癌患者の治療方法。２５． i) 親脂質性分子及び両親媒性脂質分子から脂質成分を生成し、 ii) 少なくとも１の親脂質性置換基と少なくとも１のＡｐｏＢタンパク質レセプターと相互作用可能な結合部分とを含有する少なくとも１のペプチドを前記生成された脂質と接触させることから構成されるＡｐｏＢレセプター受容性を有する非天然性レセプター受容性ＬＤＬ粒子の製造方法。２６．外核性可溶性脂質及び核脂質から前記脂質成分を生成する方法であって、外核性可溶性脂質及び核脂質の相対比が０．７：１〜５：１の範囲内にあることを含む請求項２５に記載の製造方法。２７．前記相対比が１：１〜３：１の範囲内であることを特徴とする請求項２５又は２６に記載の製造方法。２８．前記相対比が１：１〜２：１の範囲内であることを特徴とする請求項２５又は２６に記載の製造方法。２９．外核性可溶性脂質と２種の核脂質の相対比が３（外核請求項脂質）：２（核脂質１）：１（核脂質2）である外核性可溶性脂質及び核脂質から前記脂質成分を生成することを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。３０．３種の外核性脂質及び２種の核脂質の相対モル比が０．７〜６．５：０〜２：０〜１（外核性脂質）：０〜５：０〜２〜５（核脂質）の範囲内にある外核性可溶性脂質及び核脂質から前記脂質成分を生成することを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。３１．前記モル比が２．５〜４．５：１〜２：０．５〜１（外核性脂質）：２〜４．５：１〜２．５（核脂質）である請求項３０に記載の製造方法。３２．前記モル比が４〜４．５：１．５〜２：０．７〜０．９（外核性脂質）：４〜４．５：１．８〜２．２（核脂質）である請求項３０又は３１に記載の製造方法。３３．請求項１〜１３のいずれかに記載の非天然性レセプター受容性ｌｄｌと医薬的に許容可能なキャリアとを含んで成る医薬組成物。３４．細胞培養培地中への請求項１〜１３のいずれかに記載の非天然性レセプター受容性ＬＤＬの使用。３５．前記粒子を細胞成長のための補充要素として使用することを特徴とする請求項３４に記載の使用方法。