CN103608035A - 用于治疗和/或预防高血压的免疫调节方法和*** - Google Patents

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Abstract

用于治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的免疫调节剂、T细胞、组合物、方法和***。

Description

用于治疗和/或预防高血压的免疫调节方法和***
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年11月12日提交的题目为“ImmunomodulatoryMethods and Systems for Treatment and/or Prevention of Hypertension”、案卷号为P694-USP的美国临时申请S/N 61/413,375的优先权，该申请全文通过引用并入本文。本申请还涉及于2002年4月5日提交的PCT申请WO 02/080954，于2011年11月11日提交的题目为“ImmunomodulatoryMethods and Systems for Treatment and/or Prevention of Aneurysms”、案卷号为P686-PCT的PCT申请S/N________，并涉及于2011年11月11日提交的题目为“Immunomodulatory Compositions，Methods And SystemsComprising Immunogenic Fragments Of Apob 100”、案卷号为P686-PCT的PCT申请S/N________，每一篇全文通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及尤其适于治疗或预防高血压和/或其关联病况的免疫调节方法、***、组合物和疫苗。
发明背景
高血压及其并发症影响越来越大的人群比例。
高血压的治疗一般通过生活方式改变和通过施用各种药物来进行。但是，生活方式改变和/或高血压药物对于实现令人满意的血压控制而言可能不是足够的。许多患有高血压的患者需要2至3种不同种类的抗高血压药物，以使得患者对药物的依从性较差。另外，一些个体患有不能用当前药物充分治疗的抗性高血压。
提供对高血压的有效的治疗和/或预防目前仍是有挑战性的。
发明内容
本文提供了允许在若干种实施方式中治疗和/或预防个体的高血压的方法和***，所述方法和***是单独的或与包括各种药物的其他治疗组合。
根据第一方面，描述了治疗和/或预防高血压和/或其关联病况的方法。方法包括给个体施用ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分。
根据第二方面，描述了治疗和/或预防高血压和/或其关联病况的方法。方法包括给个体施用对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T。
根据第三方面，描述了治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的***。所述***包含下述的至少两种：一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞，和一种或多种CD8(+)T细胞增强剂。特别地，在若干种实施方式中，一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞和一种或多种CD8(+)T细胞增强剂包括在用于在本文所述方法中同时的、组合的或相继的使用的***中。
根据第四方面，描述了治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的***。所述***包含ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分和CD8(+)T细胞；和一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段特异性的CD8(+)T细胞。特别地，在若干种实施方式中，ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分和CD8(+)T细胞，和一种或多种CD8(+)T细胞包括在用于在本文所述方法中同时的、组合的或相继的使用的***中。
本文所述的片段、细胞、组合物、方法和***可与下述应用联系使用，所述应用中期望个体中的高血压降低和/或对高血压的治疗或预防作用。
本发明的一种或多种实施方式的细节在下文的附图和说明书中阐明。其他特征、目标和优势由说明书和附图和权利要求阐明。
附图简述
并入本说明书并构成其一部分的附图阐释了本发明的一种或多种实施方式，并与详细的说明书和实施例一起用来解释本发明的原理和实施。
图1显示了根据本文所述的实施方式，多组小鼠中p210免疫对平均血压的作用。
图2A和2B显示了根据本文所述的实施方式，多组小鼠中p210免疫对心率的作用。
图3显示了p210免疫赋予了动脉粥样硬化防护性作用。(A)较之PBS和cBSA/明矾组，用天然p210免疫导致主动脉动脉粥样硬化显著减少(每组n＝9-10，示出了来自每组的代表性图片)。(B)在主动脉窦斑块中，分别通过MOMA-2(每组n＝9-10)和CD11c(每组n＝7-12)免疫反应性评价，P210免疫显著减少了巨噬细胞渗入和DC出现。
图4显示了p210免疫对DC的作用。初次免疫后一周，较之cBSA/明矾组，p210/cBSA/明矾组中，免疫部位处的(A)CD11c(+)细胞或(B)CD11c(+)CD86(+)细胞显著减少。每组n＝10。(C)第三次免疫后一周，较之cBSA/明矾组，p210免疫的小鼠***中具有减少的CD11c(+)CD86(+)细胞(每组中n＝5；ANOVA后进行多个组比较)。
图5显示了p210免疫之前和之后对p210的IgM或IgG滴度(titer)。(A)免疫之前，p210 IgG滴度是低的并且安乐死时在PBS组中依然是低的；但在cBSA/明矾和p210/cBSA/明矾组中显著增加，在cBSA/明矾组中具有最高的滴度。(B)在免疫之前p210IgM滴度是低的并在安乐死时显著增加，在小鼠的3个组之间没有差异。6-7周时间点n＝5，25周时间点n＝9。
图6显示了体内免疫之后活化的淋巴细胞群。(A)较之PBS或cBSA/明矾组，p210/cBSA/明矾组中，***中的CD8(+)CD25(+)T-细胞群显著较高；(B)在三个组之间，***中的CD4(+)CD25(+)T-细胞没有差异。(C)在3个组之间，p210/cBSA/明矾组中有显著更大的脾脏CD8(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群；(D)脾脏CD8(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在3个组之间没有差异。(E)cBSA/明矾组中，脾脏CD4(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群显著增加，但被p210/cBSA/明矾免疫显著减弱；(F)脾脏CD4(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在3个组之间没有差异。(A)和(B)的每组中n＝9-10；(C)、(D)、(E)和(F)的每组中n＝5。
图7显示了来自p210免疫的供体的CD8(+)T-细胞的过继转移重演(recapitulate)了p210免疫的动脉粥样硬化防护性作用，而B-细胞或CD4(+)CD25(+)T-细胞的转移则没有。(A)较之来自其他2个组的CD8(+)T-细胞的受者小鼠，来自p210/cBSA/明矾免疫的供体的CD8(+)T-细胞的受者小鼠发展了显著更小的动脉粥样硬化病灶(每组的n＝9-10)。(B)较之来自PBS或cBSA/明矾组的B-细胞的受者小鼠，来自p210/cBSA/明矾供体的B-细胞的过继转移未减少动脉粥样硬化(每组n＝9)。2种不同剂量(C.1×105细胞/小鼠或D.3×105细胞/小鼠)的CD4(+)CD25(+)T-细胞的受者小鼠(每组n＝9-13)未再现p210免疫的动脉粥样硬化减少作用。
图8显示了来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T细胞提高的针对树突细胞的体外细胞溶解活性。较之来自PBS或BSA/明矾组的那些，来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞显著具有更高的针对树突状细胞的细胞溶解活性。重复实验4次，每次使用从每组的5只小鼠合并得到的CD8(+)T-细胞。每次都一式两份或一式三份进行，每组中总计共11个数据点。
图9显示了，较之来自PBS或cBSA/明矾组的那些，来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞含有更高水平的粒酶B；而穿孔素水平没有差异。
图10显示了p210免疫后针对KLH或TNP的IgG滴度。较之接受PBS或cBSA/明矾的小鼠，如通过IgG抗体滴度评价的，用p210的在先免疫不会影响随后的(A)T-细胞依赖型(KLH，每组n＝3-6)或(B)T-细胞非依赖型(TNP，每组n＝4-5)免疫的效力。
图11显示了用或不用根据本文所述的一种实施方式的p210免疫的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。
图12显示了根据本文所述的一种实施方式，apoE-/-小鼠中抗体对p210的应答。
图13显示了通过CD25+细胞耗尽消除了p210-免疫CD8+T细胞的细胞溶解活性。检验培养基中缺失血脂也消除了特异性针对p210的溶解活性。
图14显示了根据本文所述的一种实施方式，DC对FITC-标记的p210的内吞作用。
图15显示了根据本文所述的一种实施方式，如增加的活化的CD25+细胞所示，DC将肽p210体外呈递至CD8+CD25-T细胞。
图16显示了根据本文所述的一种实施方式，在FITC+细胞上门控的CD8+溶解活性。来自用下述DC进行p210-接种的小鼠的CD8+T细胞的p210-特异性溶解活性，所述DC载有用FITC-标记的p210。
发明详述
本文描述了允许在若干种实施方式中治疗和/或预防高血压和/或其关联病况的方法和***。
本文中使用的术语“高血压”是指高的血压。特别地，高血压(HTN)或高的血压是其中全身动脉血压被提高的慢性医学病况。高血压与低血压相反。高血压分为原发性(本质性)或继发性的。约90-95％的案例被称为“原发性高血压”，是指无法找到医学原因的高的血压。剩下的5-10％的案例(继发性高血压)由影响肾、动脉、心脏或内分泌***的其他病况引起。
本文中使用的术语“治疗”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为，所述行为是医药上或手术上对病况的医疗护理的一部分，或在医药上或手术上对病况进行处理。本文中使用的术语“预防”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为，所述行为减少个体中的来自病况的死亡率或发病率负担。这在一级、二级和三级预防水平下发生，其中：a)一级预防避免疾病发展；b)二级预防行为的目标在于早期疾病治疗，从而增加干预机会，以预防疾病进展和症状出现；和c)三级预防，通过恢复功能并减少疾病相关的并发症来减少已确定的疾病的负面影响。
本文中使用的术语“病况”(condition)表示与完整的身体、精神和可能的社会健康状态(well-being)关联的与个体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)不一致的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)。本文描述的病况包括但不限于病症(disorder)和疾病(disease)，其中术语“病症”表示与身体或任何其部分的功能异常关联的活个体的病况，术语“疾病”表示活个体的下述病况，所述病况损害身体或任何其部分的正常功能，并典型地通过有区别的体征和症状被表征。示例性的病况包括但不限于损伤、失能、病症(包括精神和身体病症)、综合征、感染、个体的反常行为和个体身体或其部分的结构和功能的非典型性变化。
本文中关于两个项目使用的的措辞“与…关联的”表示两个项目之间的下述关系：第一个项目的发生伴随着第二个项目的发生，其包括但不限于因果关系和体征/症状-疾病关系。与高血压关联的示例性病况是高的血压、异常的心率、动脉瘤、动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞和肾衰竭。额外的，与HTN关联的病况包括左室肥厚、与高血压关联的充血性心力衰竭(例如左室舒张功能不全)。已鉴定出参与与高血压关联的病况的许多免疫组件，并提示靶向这些组件的免疫-调节疗法可降低患高血压的可能性。
在一些实施方式中，通过给个体施用有效量的ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分，可提供高血压的治疗和/或预防。
本文中使用的术语“施用(administer)”或“施用(administering)”或“施用(administration)”表示以任何方式给个体提供物质的任何方法，所述方式包括但不限于本文讨论的那些。
本文中使用的术语“个体”(单数或复数形式)表示单个生物体，比如高等动物和尤其是脊椎动物(比如哺乳动物)，更尤其是人类。
本文中使用的术语“免疫原性片段”或“抗原片段”表示能产生免疫应答的任何长度的多肽的一部分，比如抗原。抗原是被免疫***识别的分子。ApoB100的抗原片段因此是呈现抗原性质(例如，特异性的体液或细胞应答)的apoB-100的一部分。
在本发明的意义上，术语“ApoB100的片段”不仅包括来自ApoB100的任何长度的片段，还包括通过遗传重组或化学合成产生的包含来自ApoB100的序列的肽。在本发明的意义上，术语“免疫原性片段”还包括任何片段的衍生物，比如突变片段(包括具有替代的、添加的或缺失的残基的片段)、氧化衍生物和/或用MDA或铜处理的肽，其保持了原片段的可检测的抗原性质。
本文中使用的关于第一肽(例如，免疫原性片段)的术语“衍生物”，表示结构上与第一肽相关并通过下述修饰源自第一肽同时保留第一肽功能性质的第二肽，所述修饰引入不在第一肽中存在的特性。因此，通过对与原肽或其部分不具有的其他功能可能关联或不关联的氨基酸序列进行修饰，免疫原性片段或其任何部分(例如其表位)的衍生多肽通常与原免疫原性片段或其部分不同。但是免疫原性片段或其任何部分的衍生肽保留了本文描述的与免疫原性片段或其部分有关的一种或多种免疫原性活性。使用比如已针对免疫原性片段描述的那些方法和***和对技术人员而言可鉴定的其他方法和***，可检验抗原性质。典型地，免疫原性片段的衍生物包含免疫原性片段的至少一种表位。
在本发明的意义上术语“免疫原性活性部分”表示可引起特异性免疫应答的参照抗原的任何部分。示例性的免疫原性活性部分是典型地包含在免疫原性片段内的5个或更多个残基形成的表位。在一些实施方式中，一个或多个片段内的表位可重叠。
可通过重组技术(比如与亲和标记物或表位标记物的融合)、游离的或与载体蛋白轭合的寡肽的化学合成、或本领域已知表达ApoB-100肽的任何其他方法，来表达免疫原性片段。
ApoB100的示例性的片段是下述肽，每一种肽包含如在实施例部分中更详细描述的在序列表中作为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：302列出的序列之一。适于鉴定在本发明的意义上的免疫原性片段的方法和***描述在WO 02/080954中，这里通过引用并入该文献。其他方法在实施例部分中示出(见，例如实施例1)。
本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”表示由两种或多种氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物(包括全长的蛋白质或肽)，以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的肽也被称为寡肽。本文中使用的术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指二十种氨基酸之任何，包括具有非天然侧链的合成氨基酸并包括D和L两种光学异构体。术语“氨基酸类似物”是指其中一个或多个个别原子已用不同的原子、同位素或不同的功能基团替代的氨基酸，但所述氨基酸在其他方面与其天然氨基酸类似物是等同的。
在一种实施方式中，适于治疗高血压的ApoB100的一种或多种免疫原性片段与动脉粥样硬化减少相关联。
鉴定与动脉粥样硬化减少关联的分子的方法可被技术人员鉴定，并且所述包括描述于WO 02/080954(其全文通过引用并入本文)中的示例性程序。特别地，可使用可被技术人员鉴定的程序，在以合适量施用分子后的动物模型中测试分子减少动脉粥样硬化的能力。例如，如在实施例部分中阐释的，皮下施用本文所述的分子之后，可在小鼠中测试分子影响动脉粥样硬化的能力。阅读本发明后，技术人员将能鉴定其他程序、施用时间表和剂量。
因此，在示例性实施方式中，可如下鉴定出与动脉粥样硬化减少关联的免疫原性分子：鉴定能在感兴趣的个体中提供细胞和/或体液应答的候选免疫原性分子；并测试能减少动脉粥样硬化的候选免疫原性分子，以选择与动脉粥样硬化减少相关联的候选免疫原性分子。
特别地，在一些实施方式中，ApoB100的免疫原性片段是产生与个体中的或动物模型中的动脉粥样硬化减少相关联的免疫应答的免疫原性片段。在这些实施方式中的一些中，动脉粥样硬化减少的百分比为至少约20％或至少约30％，从约40％至约60％或从约50％至约80％。
参考实施例部分，其中示例了与约11％的高血压减少相关联的免疫原性片段p210有关的本发明的实施方式(见，实施例2)。特别预期与动脉粥样硬化减少相关联的其他片段在高血压的治疗和/或预防中是有效的(见实施例部分)。
在一些实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的免疫原性片段包含下述肽的至少一种，所述每一种肽包含p1(SEQ ID NO：1)、p2(SEQ ID NO：2)、p11(SEQ ID NO：11)、p25(SEQ IDNO：25)、p45(SEQ ID NO：45)、p74(SEQ ID NO：74)、p99(SEQ IDNO：99)、p100(SEQ ID NO：100)、p102(SEQ ID NO：102)、p103(SEQ IDNO：103)、p105(SEQ ID NO：105)、p129(SEQ ID NO：129)、p143(SEQ IDNO：143)、p148(SEQ ID NO：148)、p210(SEQ ID NO：210)或p301(SEQ IDNO：301)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含p2(SEQ ID NO：2)、p11(SEQ ID NO：11)、p45(SEQ ID NO：45)、p74(SEQ ID NO：74)、p102(SEQ ID NO：102)、p148(SEQ ID NO：148)或p210(SEQ ID NO：210)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含两种肽，其中每一种肽包含p143(SEQ ID NO：143)或p210(SEQ ID NO：210)。在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联的一种或多种免疫原性片段包含三种肽，其中每一种肽包含p11(SEQ ID NO：11)、p25(SEQ ID NO：25)或p74(SEQ ID NO：74)之一。在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联的一种或多种免疫原性片段包含五种肽，其中每一种肽包含p99(SEQ ID NO：99)、p100(SEQ ID NO：100)、p102(SEQ ID NO：102)、p103(SEQ ID NO：103)和p105(SEQ ID NO：105)之一。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含p2(SEQ ID NO：2)、p45(SEQ ID NO：45)、p74(SEQ ID NO：74)、p102(SEQ ID NO：102)或p210(SEQ ID NO：210)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸16-35(p2；SEQ ID NO：2)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸661-680(p45；SEQ ID NO：45)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸3136-3155(P210；SEQ ID NO：210)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸4502-4521(P301；SEQ ID NO：301)。
在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联并适用于治疗和/或预防高血压的一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类apoB-100的氨基酸1-20(P1；SEQ ID NO：1)。
显示上述肽与动脉粥样硬化减少相关联的示例性数据在本发明的实施例3和国际申请WO 02/080954中示出，该文献全文通过引用并入(特别见表1、表2、表A和表B)。特别地，对于这些肽中的一些或其组合而言，已检测到64.6％(p143和p210)、59.6％(p11、p25和p74)、56.8％(p129、p148和p167)，p67.7(p2)、57.9％(p210)、55.2％(p301)、47.4％(p45)、31％(p1)的减少百分比(见通过引用全文并入本文的WO/02080954，特别见表B)。
技术人员可使用电子(in silico)和/或体外方法，鉴定包含本文所述序列之任一的免疫原性肽或这些肽的免疫原性活性部分。例如，电子方法可用来鉴定基于本文所述序列任一的所述表位或免疫原性肽之任一。参考例如文献[44]至[51]，其每一篇全文通过引用并入本文。
这些文献描述了各种算法，比如Tepitope(Radrizzani等2000)、Adept(Maksuytov等1993)、抗原指数(antigenic index)(Jameson等1988)和其他可用来鉴定包含所述序列或任何有关表位的免疫原性分子的算法。
可被技术人员用来证实电子数据和/或鉴定包含本文所述序列之任一或这些序列的免疫原性活性部分的免疫活性分子的、适于单独使用或连同电子鉴定一起使用的其他体外和/或体内测试和实验室程序(例如ELISA)是可以被技术人员鉴定的。
因此，在示例性实施方式中，可通过对本文所述的序列之任一进行电子分析来鉴定候选肽、候选活性部分和/或候选衍生物，和通过对候选肽、候选活性部分和/或候选衍生物进行体外和/或体内测试来鉴定免疫原性肽、免疫原性活性部分和/或衍生物，来鉴定本文所述的免疫原性肽、其免疫原性活性部分以及其衍生物。特别地，可用适于鉴定分子或其部分的免疫原性的算法，通过分析候选序列，进行电子分析。类似地，体外和/或体内测试包括直接鉴定候选肽、候选活性部分和/或衍生物的免疫原性以及这些分子对动脉瘤的作用(特别是关于形成或衰退)的方法。阅读本发明后，技术人员可鉴定合适的方法和技术。
在若干种实施方式中，预期免疫原性肽、其活性部分及其衍生物包括至少约5个氨基酸的序列，和如WO 02/080954中所示的表位的典型长度一致，所述文献其全文通过引用并入本文。
在一种实施方式中，用一种或多种本文所述的免疫原性分子进行的免疫减少血压的发生率(例如实施例2)。
当与对照测量值相比较时，免疫后预期血压降低至少约10％，特别地，预期从约10％降至由医师基于病况和待免疫的个体而测定的量。
本文中使用的术语“有效量”意欲描述诱导抗原特异性免疫应答的抗原(例如P210)的量。
本文所述的治疗和/或预防高血压的免疫原性片段和一种或多种免疫原性分子的有效量取决于其中进行活化的个体，并且可被技术人员鉴定。例如在一种实施方式中，可用从约100μg到少于约1000μg的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分，进行T细胞活化。在一种实施方式中，可用从约1至约100mg的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分进行高血压治疗和/或预防。考虑到其中进行活化的个体和期望的活化，技术人员可确定其他有效量。
在一种实施方式中，用于治疗或预防的有效量可为约100μg或更多。在一些实施方式中，治疗和/或预防可用1mg或更多，例如高至100mg的量来进行。
取决于如在本发明中阐释的期望的作用，在一些实施方式中可使用更大的浓度。例如，在其中期望治疗严重高血压的实施方式中，预期用250μg或更多，特别地用约500μg的有效量进行治疗。在其中高血压较不严重的另一实施方式中，较之用于治疗的量(例如从100至250μg)，预期治疗高血压的有效量为更低的量，即使在一些案例中，在250μg或500μg或更高范围内的量也预期是有效的，这也取决于影响个体中分子的药理学活性的其他因素。
特别地，也预期有效量取决于下述因素而变化：针对每种具体疫苗利用的肽的数目和组合，和被治疗的个体的病况和具体特征(例如免疫***膳食和总体健康和可被技术人员鉴定的其他因素)。更特别地，取决于多种因素，比如个体的重量、年龄、性别以及可被技术人员鉴定的其他因素，预期在所定义的范围内的更低或更高的量对个体是有效的。
在一些实施方式中，本文所述的免疫原性肽或相关的免疫原性活性部分可与适于影响并特别地提高肽或其活性部分的免疫原性的佐剂或其他载体组合施用。特别地，在一些实施方式中，根据对技术人员而言可鉴定的程序，免疫原性肽或其活性部分可与佐剂或载体轭合。合适的载体包括BSA，特别是阳离子化的BSA，铝盐，比如磷酸铝和氢氧化铝和其他可被技术人员鉴定的载体。
在一些实施方式中，本文所述的免疫原性分子可以以如下的免疫原性分子∶载体∶铝的重量与重量比率施用：约1∶2∶35、1∶2∶20.6、1∶2∶7.7、1∶2∶3.3、1∶1∶13.8。特别地，在一些实施方式中，可提供这样的比率，其中肽的数目与每一载体分子轭合，同时最小化铝(佐剂)的量。特别地在一种实施方式中，可提供导致高至2.7mg轭合物/mL的浓度的比率。
在一种实施方式中，根据下述施用时间表进行施用，所述施用时间表考虑期望的作用来确定。特别地，预期按照下述剂量和时间表进行施用，所述剂量和时间表基于将被治疗的个体的病况和期望的作用而被确定。例如可基于个体病况，通过进行单次施用或以一定的间隔多次施用(例如3次施用或更多次，特别地高至6次施用)本文所述的免疫原性片段或其免疫原性活性部分来进行施用，以获得期望的免疫。
在一些实施方式中，可根据考虑到个体的适应性免疫***所需的时间量而设计的施用时间表，来施用本文所述的免疫原性分子，以发动对免疫原的第一次暴露的应答。典型地，应答被预期在暴露后2-3周达到平台期(plateau)。随后的暴露通常引起更为快速的应答。在各种实施方式中，随后的时间表和施用方式可遵循：(1)单次施用，(2)间隔2-3周的两次施用，(3)三次每周一次的施用，(4)以每3周1次的时间表进行高至6次施用。通过下述方式施用疫苗：(1)皮下注射；(2)腹膜内注射；(3)鼻腔装置；(4)皮下输注。
免疫途径可取决于本文描述的免疫目的而改变。小鼠中成功的高血压预防和治疗通过皮下渗透泵注射来进行(见实施例2)。触发的免疫应答类型很大程度上是由免疫途径决定的。可使用各种途径，包括皮下的、肠胃外的和全身性的，以及其他。特别地，气管和肠的粘膜衬里含有淋巴组织，所述淋巴组织当暴露于抗原时，引起抗炎性的、免疫抑制的应答。当通过鼻腔或口腔途径进行抗原暴露时，呼吸和肠粘膜的不同的免疫特性导致部分不同的防护性免疫类型。
在一种实施方式中，施用一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分可通过肌肉或粘膜(例如鼻腔、口腔和/或***)进行。
在一些实施方式中，提供了预防个体的高血压和/或其关联病况的方法，所述方法包括给个体施用有效量的对ApoB-100的免疫原性片段特异性的CD8(+)T细胞。
在一些实施方式中，提供了预防个体的高血压和/或其关联病况的方法，所述方法包括增加个体中的对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的活化的CD8(+)T细胞。
本文中使用的术语“T细胞”表示T淋巴细胞，属于称为淋巴细胞的白细胞的一个组，并参与体液或细胞-介导的免疫。通过其细胞表面上特殊标记物比如T细胞受体(TCR)的存在，T细胞可与其他淋巴细胞类型比如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开。鉴定T细胞的其他标记物包括CD1a、CD3、CD4、CD8和被技术人员所知道的可能与T细胞状态和/或功能关联的其他标记物。
术语“CD8(+)T细胞”表示在其表面上表达CD8糖蛋白的T细胞，其中CD8(分化簇8)糖蛋白是跨膜糖蛋白，其作为T细胞受体(TCR)的辅助受体发挥作用。类似于TCR，CD8与主要的组织相容性复合体(MHC)分子结合，但对I类MHC蛋白是特异性的。示例性的CD8T细胞包括细胞毒性记忆CD8 T细胞、调控CD8 T细胞、细胞毒性效应器(effector)CD8 T-细胞和技术人员可鉴定的其他细胞。蛋白质存在两种同种型——α和β，每一种由不同的基因所编码。在人类中，两种基因都位于染色体2上的2p12位置。
本文中使用的术语“活化的”和“活化”表示下述过程，通过所述过程，在导致T细胞在免疫***内具有预先指定的免疫作用(例如细胞毒性)的条件下，T细胞与呈递特异性抗原的抗原呈递细胞相互作用一段时间。术语“抗原-呈递细胞”(antigen-presenting cell，APC)表示在其表面上显示(display)具有主要组织相容性复合体(MHC)的抗原复合物的细胞。T-细胞使用其T-细胞受体(TCR)识别该复合物。示例性的APC包括树突细胞(DC)，所述树突细胞已知在联系先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用，见参考文献(3，4)，且这两种免疫应答都参与动脉粥样硬化形成，见参考文献(5)，(6)。
T细胞，特别是CD8(+)T细胞的检测，可通过单独的标记物(比如CD8)或与TCRCD3和可由技术人员鉴定的其他标记物组合的标记物(比如CD8)的检测来进行。可使用适于检测表面标记物的方法和技术，通过检测T细胞标记物，特别是比如CD25、CD44、CD62的标记物，和可由技术人员鉴定的其他标记物，进行活化的CD8(+)T细胞的检测。
本文中使用的术语“检测”(动词形式或名词形式)表示测定有限部分的空间(包括但不限于样品、反应混合物、分子复合物和底物)中分子或细胞的存在、出现或事实。本文中使用的“检测”(动词形式或名词形式)可包括对目标物的化学和/或生物性质的测定，所述性质包括但不限于与其他化合物相互作用特别是结合的能力、活化另一化合物的能力和阅读本发明后可由技术人员鉴定的其他性质。检测可以是定量的或定性的。当检测表示、涉及或包括对目标物或信号的数量或量进行测量时，检测是“定量的”(也称为定量分析)，其包括但不限于被设计为测定目标物或信号的量或比例的任何分析。当检测表示、涉及或包括按照对另一目标物或信号的相对丰度对目标物或信号的品质或种类进行鉴定时，检测是“定性的”，其不是被量化的。
适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物，以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在一种示例性方法中，如在实施例部分中描述的，通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物，以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在一种示例性方法中，如在实施例部分中所述，通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。在本文描述的T细胞、组合物、方法和***的一些实施方式中，可使用ApoB100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分活化CD8(+)T细胞。
特别地，通过在活化CD8(+)T细胞的条件下，使CD8(+)T细胞与选自由p1(SEQ ID NO：1)、p2(SEQ ID NO：2)、p11(SEQ ID NO：11)、p25(SEQ ID NO：25)、p45(SEQ ID NO：45)、p74(SEQ ID NO：74)、p99(SEQ IDNO：99)、p100(SEQ ID NO：100)、p102(SEQ ID NO：102)、p103(SEQ IDNO：103)、p105(SEQ ID NO：105)、p129(SEQ ID NO：129)、p143(SEQ IDNO：143)、p148(SEQ ID NO：148)、p210(SEQ ID NO：210)或p301(SEQ IDNO：301)组成的组的一种或多种肽或其免疫原性活性部分接触一段时间，可获得对ApoB100的免疫原性片段特异性的活化的CD8(+)T细胞，其中所述活化的CD8(+)T细胞对一种或多种肽或其免疫原性活性部分是特异性的。
根据本发明的活化的CD8(+)T细胞是用ApoB100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活化部分活化的，并且其典型地是对用于活化的免疫原性片段或其免疫原性活化部分是特异性的。
本文中使用的关于免疫原性应答的措辞“特异性的”、“特异性地”或“特异性”是指免疫制剂指导针对抗原的免疫活性、同时不指导或显著更少地指导对可能存在的其他抗原的免疫活性的能力。因此，本文中的CD8(+)T细胞对用来活化它们的免疫原性片段或活性部分而不是其他抗原是特异地有活性的。
可用来鉴定对免疫原性片段特异性的CD8T细胞的示例性的抗原性质包括可以使用如实施例部分中示例的那些方法和技术以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术来检测的体液和/或细胞应答。在本发明的意义上用于检测抗原性质的示例性的方法和***包含ELISA，特别是血清ELISA和在实施例部分中示例的其他方法。适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的适当分子的抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物或合适的单克隆或多克隆抗体以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在示例性方法中，如在实施例部分中所述，通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。
在一种实施方式中，活化的CD8(+)T细胞对与治疗或预防动脉粥样硬化相关联的在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：302之间任何一种或多种肽或其免疫原性活性部分而言是特异性的。在一些实施方式中，免疫原性片段包括肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：210的一种或多种或其免疫原性活性部分。在一些实施方式中，免疫原性片段包括肽SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：102、SEQ IDNO：210的一种或多种或其免疫原性活性部分。甚至更特别地，在一些实施方式中，免疫原性片段包括人类apoB-100的氨基酸3136-3155(P210；SEQ ID NO：210)或其免疫原性活性部分。一般而言，证明或预期与个体的高血压治疗和/或预防相关联的免疫原性片段的相同组合还被预期能够活化将要用于个体的高血压治疗和/或预防的CD8(+)T细胞。特别地，可使用以适于治疗或预防动脉瘤的量、体内施用的本文所述的分子的任何一种，进行T细胞活化(见例如实施例部分)。还可使用比如参考文献[52]描述的方法和程序以及可被技术人员鉴定的其他程序，体外进行T细胞活化。
在一种实施方式中，可通过给个体施用有效量的活化的CD8(+)T细胞，进行个体中的CD8(+)T增加，以治疗和/或预防高血压。
在一种实施方式中，有效量被预期包含在约500,000个至约2,000,000个之间的细胞。在实施方式中，有效量被预期包含在约750,000个至约1,500,000个之间的细胞。在一种实施方式中，有效量被预期为约1,000,000个细胞。
特别地，在一种实施方式中，预期施用约1,000,000个细胞会导致动脉粥样硬化的治疗和预防二者，并因此预期对高血压的治疗和预防也是有效的。施用被预期按照下述剂量和时间表进行，所述剂量和时间表基于将被治疗的个体的病况和期望的作用而被确定。例如在用于预防的施用中，可以基于个体病况，通过单次施用或有间隔的多次施用(例如3次或更多次施用，特别地高至6次施用)本文描述的活化的CD8(+)T细胞，来进行有效量的活化的CD8(+)T细胞的施用，从而获得期望的免疫。特别地，无论什么时候期望延长免疫作用，均可进行多次施用。
在一些实施方式中，根据施用时间表，本文所述的活化的CD8+T细胞被预期是有效的，其中每日(高至21天)施用所述细胞和按照每10天的时间表(0、10、20天)施用所述细胞。预期有效的其他时间表可由技术人员基于其他病况(比如HIV和/或癌症)的细胞治疗来确定。
按照对技术人员而言可鉴定的使个体免疫的方法，进行本文描述的CD8(+)T细胞的施用。在一种实施方式中，可通过胃肠外施用进行施用。胃肠外施用是通过消化道之外的途径给予物质的全身性施用途径，其包括但不限于静脉注射施用、动脉内施用、肌肉注射施用、皮下施用、真皮内施用、腹膜内施用和膀胱内输注。特别地，在一种实施方式中，可通过静脉注射施用进行施用。
在一种实施方式中，可通过施用活化的CD8(+)T细胞(典型地通过静脉内途径)一次进行施用，施用一次或多次，这取决于免疫作用的期望的持续时间。
在其中提供了治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的方法的一些实施方式中，有效量的对ApoB100的免疫原性片段特异性的CD8(+)T细胞可单独施用或与有效量的本文所述的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分组合施用。特别地，可与CD8(+)T细胞一起施用一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分，其浓度与用来治疗和/或预防高血压的免疫原性片段的有效量所需的浓度相同或更小。
在其中提供了治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的方法的一些实施方式中，活化的CD8(+)T细胞和/或ApoB100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分的有效量有所变化，免疫途径也有所变化，所述免疫途径可取决于本文描述的免疫目的而改变。可使用各种途径，包括皮下的、肠胃外的和全身的以及其他。特别地，气管和肠的粘膜衬里含有淋巴组织，当所述淋巴组织暴露于细胞时，引起抗炎性的、免疫抑制的应答。
在一些实施方式中，可与CD8(+)T细胞活化的增强剂组合进行免疫原性片段和/或CD8(+)T细胞的施用。
当涉及有关CD8 T细胞的分子时，术语“增强剂”和“增强”是指分子通过促进免疫***的细胞的活化而改进免疫应答的能力。选择合适的增强剂可允许控制免疫应答的活化。示例性的增强剂包括细胞因子，比如IL-10、IL-2、IL-12、IL-4、IL-16。本文中使用的术语“细胞因子”是指细胞信号转导的分子，其起免疫调节剂的作用，并且包括蛋白质如对技术人员而言可被鉴定的白细胞介素和干扰素。选择合适的细胞因子可在合适的条件下导致优先诱导体液或细胞的免疫应答。
在一种实施方式中，增强剂可以是白细胞介素2(IL2)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素15(IL-15)、TGF-β(TGF-β)、IL2-抗IL-2抗体复合物和/或阅读本发明后可由技术人员鉴定的其他增强剂。参考参考文献Mitchell等2010(38)、Perret等2008(39)和Kamimura等2007(40)，所述文献描述了有关T细胞活化的增强剂的示例性用途，每一篇文献全文都通过引用并入。
特别地，在一些实施方式中，通过减少个体中的树突细胞对CD86的表达和/或IL12的分泌，进行所述增强。
在一些实施方式中，还用提供的用于治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的方法，与有效量的对ApoB100免疫原性片段特异性的CD8(+)T细胞和可能的增强剂一起施用ApoB-100的免疫原性片段。
如本文所公开的，可提供本文所述的免疫原性片段或其免疫原性活性部分、CD8(+)T细胞和增强剂作为治疗和/或预防高血压或其关联病况的***的一部分。
在一种实施方式中，***包含以下的至少两种：一种或多种活化的CD8(+)T细胞和能增强活化的CD8(+)T细胞的一种或多种细胞因子。
在一种实施方式中，***包含以下的至少两种：ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分和一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段特异性的活化的CD8(+)T细胞。
在一种实施方式中，***包含以下的至少两种：本文所述的ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分和活化的CD8(+)T细胞，并且还包含一种或多种CD8(+)T细胞增强剂。
***可以多部件试剂盒的形式提供。在多部件试剂盒中，本文描述的CD8(+)T细胞、免疫原性片段和用于进行本文描述的方法的其他试剂可以独立地包含在试剂盒中。本文描述的CD8(+)T细胞可包含在一种或多种组合物中，并且每一种本文描述的CD8(+)T细胞可连同合适的载剂存在于组合物中。
其他组件可包括，能检测本文描述的CD8(+)T细胞的增强剂分子，比如标记的分子，特别是标记的抗体、标记、微流控芯片、参照标准物和阅读本公发明后技术人员可确定的其他组件。本文中使用的作为复合物部件或分子的术语“标记”和“标记的分子”是指能检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶、配体(比如生物素、抗生素蛋白、抗生蛋白链菌素或半抗原)等等。术语“荧光团”是指能在可检测的图像中显示荧光的物质或其部分。因此，本文中使用的措辞“标记信号”表示从允许标记检测的标记发射的信号，包括但不限于放射性、荧光、化学发光、在酶反应结果中产生化合物等等。
在一些实施方式中，本文描述的CD8(+)T细胞或免疫原性片段的检测也可通过基于荧光的读出器进行，其中标记的抗体用荧光团标记，所述荧光团包括(但并非穷尽性地)，小分子染料、蛋白质发色团、量子点和金纳米颗粒。阅读本公开后其他技术可由技术人员鉴定并将不会进一步详细地讨论。
特别地，为了进行本文描述的方法，可提供具有合适的说明书和其他必要试剂的试剂盒的组件。试剂盒通常含有在单独的容器中的组合物。在试剂盒中通常包括用于进行检验的在纸上或电子支持物(比如磁带或CD-ROM)上的说明书，例如书面说明书或音频说明书。取决于使用的具体方法，试剂盒还可含有其他包装的试剂和材料(例如洗涤缓冲液等等)。
在一些实施方式中，本文描述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂可与合适的载体一起包括在组合物中。
本文中使用的术语“载体”表示下述各种介质中的任何，所述介质对包含在组合物中作为活性成分的T细胞而言通常作为溶剂、载体、粘合剂或稀释剂发挥作用。
在其中组合物被施用给个体的一些实施方式中，组合物可以是医药抗炎症性组合物，并包含T细胞和医药上可接受的载剂。
特别地，在一些实施方式中，本文公开了医药组合物，其含有与一种或多种相容的医药上可接受的载剂组合的，特别是与医药上可接受的稀释剂或赋形剂组合的，本文描述的至少一种免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂。在这些医药组合物中，本文描述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂可作为活性成分被施用，用于治疗或预防个体的病况。
本文中使用的术语“赋形剂”表示用作药物活性成分的载体的非活性物质。本文公开的用于医药组合物的合适的赋形剂包括增强个体身体吸收本文描述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂的能力的任何物质。合适的赋形剂还包括可用来增大含有本文所述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂的配方量以允许便利和准确的剂量的任何物质。除了它们在单剂量数量中的用途以外，赋形剂可在制造过程中使用，以帮助处理本文描述的免疫原性片段、其活性部分、CD8(+)T细胞和/或增强剂。取决于施用的途径和药物形式，可使用不同的赋形剂。示例性的赋形剂包括但不限于抗粘着剂、粘合剂、涂覆崩解剂、填充剂、香料(比如甜味剂)和颜料、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸着剂。
本文中使用的术语“稀释剂”表示用于稀释或携带组合物的活性成分的稀释试剂。合适的稀释剂包括可降低药物制剂的粘性的任何物质。
在一种实施方式中，本文描述的组合物还可包含佐剂。本文中使用的术语“佐剂”表示可刺激免疫***并增加对疫苗的应答，而其本身不具有任何特异性抗原作用的试剂。措辞“佐剂”来自拉丁文adjuvare，其意思是帮忙或帮助。典型地，免疫学佐剂被定义为当与特异性疫苗抗原组合使用时起加速、延长或增强抗原-特异性免疫应答作用的任何物质。
在一些实施方式中，医药组合物可包括(1)单独施用的本文描述的肽或其他免疫原性分子；(2)本文所述的肽或其他免疫原性分子+(一种或多种)载体；(3)本文所述的肽或其他免疫原性分子+佐剂；(4)本文所述的肽或其他免疫原性分子+载体+佐剂。特别地，用于示例性组合物(1)至(4)的每一种的载体可分别包括：(1)cBSA、(2)rHSA、(3)KLH、(4)霍乱毒素B亚基，其每一种可以是基于矿物质盐的。本领域技术人员知道的其他载体被预期是合适的，并将被技术人员鉴定出。这些佐剂的例子包括具有Th2作用的佐剂、具有佐剂性质的载体，例如，白喉类毒素，和能作为载体起作用的佐剂，例如，水包油乳液。在一些实施方式中，对医药组合物而言必要的、和在某些情况下充分的组件是免疫原性肽。如技术人员所已知的，可选择组合物的其他组件来调控本文所述的肽或其他免疫原性分子的免疫效果。
下文的详细公开将使本发明的其他优势和和特征更加明了，所述公开仅以阐述的方式涉及实验部分。
实施例
本文描述的方法和***在下述实施例中进一步阐释，所述方法和***通过阐释的方式提供并且并非意图限制。本领域技术人员会意识到详细描述的特性的适用性。
特别地，下述实施例阐释了示例性的免疫原性片段，以及用于对个体免疫以治疗或预防高血压的方法，特别是使用片段p210的方法。
本领域技术人员会意识到使本部分详细描述的特征适合于其他免疫原性片段的可行性和必要的改进，所述免疫原性片段按照本发明的实施方式皮下施用或使用其他施用途径体内或体外施用。
除非另外指出，下文报告的实施例中遵循下述材料和方法。
用于免疫的肽的选择及其制备 已报道了人类apoB-100肽的确定和筛选(8)。基于申请人的初步试验和先前报道(9)、(10)，申请人选择了肽210(p210，KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH-SEQ ID NO：210)作为候选免疫原。使用先前描述的方法(3)、(4)，使天然p210肽(Euro-DiagnosticaAB，瑞典)与用作载体的阳离子牛血清白蛋白(cBSA)轭合。明矾被用作佐剂，并与肽/cBSA轭合物用体积比1∶1的比率混合。肽轭合物以及与明矾的混合物在每次免疫之前新鲜制备。
免疫方案 雄性apoE-/-)小鼠(Jackson实验室)饲养在由美国实验室动物管理认证协会(American Association of Accreditation of LaboratoryAnimal Care)认可的动物设施中，并进行无限制得到水和食物的12-小时日/夜周期的喂养。Cedars-Sinai医学中心的实验动物护理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of Cedars-Sinai MedicalCenter)批准了实验方案。在初步实验中，较之25或50μg剂量，使用100μg剂量的p210免疫赋予了最佳的动脉粥样硬化-减少。因此，100μg剂量用于所有随后的实验。以正常食物膳食饲养的小鼠，在6-7周龄时在肩胛骨之间的脊背区域接受皮下的初次免疫，随后在9和12周龄时加强剂量。最后一次加强剂量后一周，膳食被转变为高胆固醇食物(TD88137，Harlan-Teklad)，并持续至在25周龄时安乐死。在相同的免疫时间点下接受PBS或cBSA/明矾的单独小鼠组作为对照。一些小鼠在8或13周龄时被处死以评价对p210的免疫应答。
组织收获和制备安乐死时，收获心脏并包埋进OCT化合物(Tissue-Tek)中用于冷冻切片。全部的主动脉被清洁、处理并用油红O染色，从而用计算机辅助的组织形态测量技术前位分析(en face)来评价动脉粥样硬化程度(3)、(4)。
免疫组织化学和组织形态测量 使用标准方案，将来自主动脉窦的切片用MOMA-2(Serotec)或CD 11c(eBioscience)抗体染色，以免疫组织化学地鉴定巨噬细胞或树突细胞。使用标准方案进行针对斑块尺寸的油红O染色。如前文所述进行计算机辅助的形态测量分析来评价组织形态，(3)、(4)。
血清ELISA 使用标准方案，将平底96-孔聚苯乙烯平板(MaxiSorp，德国)分别用100μl(2μg/ml)p210、KLH、TNP-KLH(BiosearchTechnologies T-5060)或BSA(针对IgG为2μg/ml或针对IgM为10μg/ml)预先涂覆，在4℃孵育过夜，以评价抗体水平。初步实验中最佳化涂覆浓度。出羊抗-小鼠HRP-IgG(Pierce 31437)或IgM(Southern Biotech)用作检测抗体，并通过在作为底物的ABTS(Southern Biotech)中显影检测结合抗体，并在405nm下记录光密度值。
流式细胞计量分析 使用标准方案用下文表1中列出的抗体和FACScan(Becton Dickinson)或CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter)进行流式细胞计量分析。对于细胞内的细胞因子染色，将Brefeldin A(3μg/ml)添加至培养过的细胞2小时，之后细胞经受染色程序。可渗透化处理细胞膜，用于染色细胞内的分子。
表1
Figure BDA00003505481200241
过继转移实验 如前面段落中描述的，常规饮食的雄性apoE(-/-)小鼠接受皮下免疫并在13周龄时被处死作为供体。将来自相同处理组的脾细胞合并，之后进行细胞分离。根据制造商的方案，使用DynabeadsFlowComp(Invitrogen)，将供体CD8(+)T-细胞、CD4(+)CD25(+)T-细胞或B-细胞分离。CD4(+)T-细胞被从脾细胞中阴性选择出，随后阳性选择CD4(+)CD25(+)细胞。阴性分离B细胞，而CD8(+)T-细胞首先被阳性分离并从珠粒中释放出。合并的CD8(+)T-细胞、CD4(+)CD25(+)T-细胞和B-细胞的纯度分别为90％、80％和70％。接着将分离的CD8(+)T-细胞(1×106细胞/小鼠)、CD4(+)CD25(+)T-细胞(1×105或3×105细胞/小鼠)或B-细胞(2×107细胞/小鼠)通过尾部静脉注射过继转移至6-7周龄的未经实验的雄性apoE(-/-)受者小鼠。在公开的血管生物学文献中，过继转移的淋巴细胞数目大大不同。对于B-细胞转移，基于两个先前报道(11)、(12)，选择2×107个细胞/小鼠的数量。对于CD4(+)CD25(+)T-细胞转移，在公开的文献(13)、(14)、(15)中，转移的细胞数目范围从5×104细胞/小鼠至1×106细胞/小鼠。因此申请人选择了2个中间剂量用于我们的实验。对CD8(+)T-细胞而言，基于自身免疫性疾病领域的报道(16)，选择了1×106个细胞。申请人未过继转移CD4(+)T-细胞，因为未经实验的或初次与抗原接触的(antigen-primed)CD4(+)T-细胞已知是致动脉粥样硬化的，(17)、(18)。受者小鼠被正常食物喂养，直到13周龄时，将食物转变为高胆固醇膳食，直到25周龄时安乐死。收获主动脉来评价动脉粥样硬化的程度。
KLH或三硝基苯基-脂多糖(TNP-LPS)免疫 申请人还测试了p210免疫是否影响随后用其他抗原进行免疫的效力。选择KLH作为原型T-细胞依赖型抗原，TNP作为T-细胞非依赖型抗原。如针对apoE-/-)小鼠的前面段落中描述的，常规饮食的雄性C57/BL6小鼠接受用p210轭合物或佐剂对照的皮下免疫。在13和15周龄时，用100μg KLH(用明矾作为佐剂)在远离p210部位的注射部位使小鼠皮下免疫，或用100μg TNP-LPS(Sigma)腹膜内注射。在单独的小鼠组中进行KLH或TNP免疫。在安乐死(16周龄时)时通过眼球后穿刺收集血液。
BM-来源的树突细胞(BMDC)的体外产生 从先前的出版物(19)通过改变改造得到用GM-CSF产生BMDC的方法。简而言之，将来自雄性apoE-/-小鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞涂布在带有含10ng/ml GM-CSF(R&DSystems)和10ng/ml IL-4(Invitrogen)的20ml完全RPMI-1640的10cm培养平板(Falcon)上。在第3天和第5天时，通过去除旧的培养基，随后用具有GM-CSF和IL-4的新鲜培养基再补充，来洗涤并喂养细胞。第8天，在显微镜下未成熟的DC作为非粘附细胞出现，通过强力吸打(pipetting)被收获，并在1.5ml培养基中有2×105DC的新培养平板中再次培养。
体外CD8+T-细胞分离和与树突细胞共培养 根据前面段落中描述的时间表，用PBS、cBSA/明矾或cBSA/明矾/P210使CD8(+)T-细胞的供体小鼠[雄性apoE-/-)小鼠]免疫并在13周龄时收获脾细胞。使用CD8选择Dynabeads试剂盒(Invitrogen)，按制造商方案，阴性分离CD8(+)T-细胞。接着将选择的CD8(+)T-细胞与DC以3∶1的CD8∶DC比率共培养。已进行了一系列的初步研究以确定用于该检验的最佳CD8∶DC比率。共培养4小时后，收集并处理细胞，用于通过LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)进行CD 11c和7-AAD的流式细胞计量测定，并且用Summit V4.3软件分析数据。在共培养中没有CD8(+)T-细胞的树突细胞死亡被用作基线，并使用前述的方法，计算细胞特异性溶解的百分比，(20)。
统计学 数据以均值±Std表示。每个组的动物数目在正文或图说明中列出。通过ANOVA，随后通过Newman-Keuls多组间比较或适当的时候通过t-检验分析数据。认为P＜0.05是统计学上显著的，每个图中的水平条表示组间在统计学上显著差异。
实施例1：ApoB-100的免疫原性片段
通过关注LDL中出现的单个蛋白——载脂蛋白B-100(apo B)，表征了特异性免疫原性表位。产生了由长度为20个氨基酸残基的302个肽组成的肽文库，其覆盖人类Apo B-100的全部的4563个氨基酸序列。产生的肽具有5个氨基酸重叠，以覆盖断点处所有的序列。如下文表2中所示的，从apo B的N-末端开始，肽编号为1-302。
表2
肽 序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P1： EEEML ENVSL VCPKD ATRFK aa 1-20 SEQ ID NO：1
P2： ATRFK HLRKY TYNYE AESSS aa 16-35 SEQ ID NO：2
P3： AESSS GVPGT ADSRS ATRIN aa 31-50 SEQ ID NO：3
P4： ATRIN CKVEL EVPQL CSFIL aa 46-65 SEQ ID NO：4
P5： CSFIL KTSQC TLKEV YGFNP aa 61-80 SEQ ID NO：5
P6： YGFNP EGKAL LKKTK NSEEF aa 76-95 SEQ ID NO：6
P7： NSEEF AAAMS RYELK LAIPE aa 91-110 SEQ ID NO：7
P8： LAIPE GKQVF LYPEK DEPTY aa 106-125 SEQ ID NO：8
P9： DEPTY ILNIK RGIIS ALLVP aa 121-140 SEQ ID NO：9
P10： ALLVP PETEE AKQVL FLDTV aa 136-155 SEQ ID NO：10
P11： FLDTV YGNCS THFTV KTRKG aa 151-170 SEQ ID NO：11
P12： KTRKG NVATE ISTER DLGQC aa 166-185 SEQ ID NO：12
P13： DLGQC DRFKP IRTGI SPLAL aa 181-200 SEQ ID NO：13
表2
肽 序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P14： SPLAL IKGMT RPLST LISSS aa 196-215 SEQ ID NO：14
P15： LISSS QSCQY TLDAK RKHVA aa 211-230 SEQ ID NO：15
P16： RKHVA EAICK EQHLF LPFSY aa 226-245 SEQ ID NO：16
P17： LPFSY NNKYG MVAQV TQTLK aa 241-260 SEQ ID NO：17
P18： TQTLK LEDTP KINSR FFGEG aa 256-275 SEQ ID NO：18
P19： FFGEG TKKMG LAFES TKSTS aa 271-290 SEQ ID NO：19
P20： TKSTS PPKQA EAVLK TLQEL aa 286-305 SEQ ID NO：20
P21： TLQEL KKLTI SEQNI QRANL aa 301-320 SEQ ID NO：21
P22： QRANL FNKLV TELRG LSDEA aa 316-335 SEQ ID NO：22
P23： LSDEA VTSLL PQLIE VSSPI aa 331-350 SEQ ID NO：23
P24： VSSPI TLQAL VQCGQ PQCST aa 346-365 SEQ ID NO：24
P25： PQCST HILQW LKRVH ANPLL aa 361-380 SEQ ID NO：25
P26： ANPLL IDVVT YLVAL IPEPS aa 376-395 SEQ ID NO：26
P27： IPEPS AQQLR EIFNM ARDQR aa 391-410 SEQ ID NO：27
P28： ARDQR SRATL YALSH AVNNY aa 406-425 SEQ ID NO：28
P29： AVNNY HKTNP TGTQE LLDIA aa 421-440 SEQ ID NO：29
P30： LLDIA NYLME QIQDD CTGDE aa 436-455 SEQ ID NO：30
P31： CTGDE DYTYL ILRVI GNMGQ aa 451-470 SEQ ID NO：31
P32： GNMGQ TMEQL TPELK SSILK aa 466-485 SEQ ID NO：32
P33： SSILK CVQST KPSLM IQKAA aa 481-500 SEQ ID NO：33
P34： IQKAA IQALR KMEPK DKDQE aa 496-515 SEQ ID NO：34
P35： DKDQE VLLQT FLDDA SPGDK aa 511-530 SEQ ID NO：35
P36： SPGDK RLAAY LMLMR SPSQA aa 526-545 SEQ ID NO：36
P37： SPSQA DINKI VQILP WEQNE aa 541-560 SEQ ID NO：37
P38： WEQNE QVKNF VASHI ANILN aa 556-575 SEQ ID NO：38
P39： ANILN SEELD IQDLK KLVKE aa 571-590 SEQ ID NO：39
P40： KLVKE ALKES QLPTV MDFRK aa 586-605 SEQ ID NO：40
P41： MDFRK FSRNY QLYKS VSLPS aa 601-620 SEQ ID NO：41
P42： VSLPS LDPAS AKIEG NLIFD aa 616-635 SEQ ID NO：42
P43： NLIFD PNNYL PKESM LKTTL aa 631-650 SEQ ID NO：43
P44： LKTTL TAFGF ASADL IEIGL aa 646-665 SEQ ID NO：44
P45： IEIGL EGKGF EPTLE ALFGK aa 661-680 SEQ ID NO：45
P46： ALFGK QGFFP DSVNK ALYWV aa 676-695 SEQ ID NO：46
表2
Figure BDA00003505481200281
表2
肽 序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P79： SDYPK SLHMY ANRLL DHRVP aa 1171-1190 SEQ ID NO：79
P80： DHRVP ETDMT FRHVG SKLIV aa 1186-1205 SEQ ID NO：80
P81： SKLIV AMSSW LQKAS GSLPY aa 1201-1220 SEQ ID NO：81
P82： GSLPY TQTLQ DHLNS LKEFN aa 1216-1235 SEQ ID NO：82
P83： LKEFN LQNMG LPDFH IPENL aa 1231-1250 SEQ ID NO：83
P84： IPENL FLKSD GRVKY TLNKN aa 1246-1260 SEQ ID NO：84
P85： TLNKN SLKIE IPLPF GGKSS aa 1261-1280 SEQ ID NO：85
P86： GGKSS RDLKM LETVR TPALH aa 1276-1295 SEQ ID NO：86
P87： TPALH FKSVG FHLPS REFQV aa 1291-1310 SEQ ID NO：87
P88： REFQV PTFTI PKLYQ LQVPL aa 1306-1325 SEQ ID NO：88
P89： LQVPL LGVLD LSTNV YSNLY aa 1321-1340 SEQ ID NO：89
P90： YSNLY NWSAS YSGGN TSTDH aa 1336-1355 SEQ ID NO：90
P91： TSTDH FSLRA RYHMK ADSVV aa 1351-1370 SEQ ID NO：91
P92： ADSVV DLLSY NVQGS GETTY aa 1366-1385 SEQ ID NO：92
P93： GETTY DHKNT FTLSC DGSLR aa 1381-1400 SEQ ID NO：93
P94： DGSLR HKFLD SNIKF SHVEK aa 1396-1415 SEQ ID NO：94
P95： SHVEK LGNNP VSKGL LIFDA aa 1411-1430 SEQ ID NO：95
P96： LIFDA SSSWG PQMSA SVHLD aa 1426-1445 SEQ ID NO：96
P97： SVHLD SKKKQ HLFVK EVKID aa 1441-1460 SEQ ID NO：97
P98： EVKID GQFRV SSFYA KGTYG aa 1456-1475 SEQ ID NO：98
P99： KGTYG LSCQR DPNTG RLNGE aa 1471-1490 SEQ ID NO：99
P100： RLNGE SNLRF NSSYL QGTNQ aa 1486-1505 SEQ ID NO：100
P101： QGTNQ ITGRY EDGTL SLTST aa 1501-1520 SEQ ID NO：101
P102： SLTST SDLQS GIIKN TASLK aa 1516-1535 SEQ ID NO：102
P103： TASLK YENYE LTLKS DTNGK aa 1531-1550 SEQ ID NO：103
P104： DTNGK YKNFA TSNKM DMTFS aa 1546-1565 SEQ ID NO：104
P105： DMTFS KQNAL LRSEY QADYE aa 1561-1580 SEQ ID NO：105
P106： QADYE SLRFF SLLSG SLNSH aa 1576-1595 SEQ ID NO：106
P107： SLNSH GLELN ADILG TDKIN aa 1591-1610 SEQ ID NO：107
P108： TDKIN SGAHK ATLRI GQDGI aa 1606-1625 SEQ ID NO：108
P109： GQDGI STSAT TNLKC SLLVL aa 1621-1640 SEQ ID NO：109
P110： SLLVL ENELN AELGL SGASM aa 1636-1655 SEQ ID NO：110
P111： SGASM KLTTN GRFRE HNAKF aa 1651-1670 SEQ ID NO：111
表2
Figure BDA00003505481200301
表2
肽 序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P145： SYDLH DLKIA IANII DEIIE aa 2161-2180 SEQ ID NO：145
P146： DEIIE KLKSL DEHYH IRVNL aa 2176-2195 SEQ ID NO：146
P147： IRVNL VKTIH DLHLF IENID aa 2191-2210 SEQ ID NO：147
P148： IENID FNKSG SSTAS WIQNV aa 2206-2225 SEQ ID NO：148
P149： WIQNV DTKYQ IRIQI QEKLQ aa 2221-2240 SEQ ID NO：149
P150： QEKLQ QLKRH IQNID IQHLA aa 2236-2255 SEQ ID NO：150
P151： IQHLA GKLKQ HIEAI DVRVL aa 2251-2270 SEQ ID NO：151
P152： DVRVL LDQLG TTISF ERIND aa 2266-2285 SEQ ID NO：152
P153： ERIND VLEHV KHFVI NLIGD aa 2281-2300 SEQ ID NO：153
P154： NLIGD FEVAE KINAF RAKVH aa 2296-2315 SEQ ID NO：154
P155： RAKVH ELIER YEVDQ QIQVL aa 2311-2330 SEQ ID NO：155
P156： QIQVL MDKLV ELTHQ YKLKE aa 2326-2345 SEQ ID NO：156
P157： YKLKE TIQKL SNVLQ QVKIK aa 2341-2360 SEQ ID NO：157
P158： QVKIK DYFEK LVGFI DDAVK aa 2356-2375 SEQ IDNO：158
P159： DDAVK KLNEL SFKTF IEDVN aa 2371-2390 SEQ ID NO：159
P160： IEDVN KFLDM LIKKL KSFDY aa 2386-2405 SEQ ID NO：160
P161： KSFDY HQFVD ETNDK IREVT aa 2401-2420 SEQ ID NO：161
P162： IREVT QRLNG EIQAL ELPQK aa 2416-2435 SEQ ID NO：162
P163： ELPQK AEALK LFLEE TKATV aa 2431-2450 SEQ ID NO：163
P164： TKATV AVYLE SLQDT KITLI aa 2446-2465 SEQ ID NO：164
P165： KITLI INWLQ EALSS ASLAH aa 2461-2480 SEQ ID NO：165
P166： ASLAH MKAKF RETLE DTRDR aa 2476-2495 SEQ ID NO：166
P167： DTRDR MYQMD IQQEL QRYLS aa 2491-2510 SEQ ID NO：167
P168： QRYLS LVGQV YSTLV TYISD aa 2506-2515 SEQ ID NO：168
P169： TYISD WWTLA AKNLT DFAEQ aa 2521-2540 SEQ ID NO：169
P170： DFAEQ YSIQD WAKRM KALVE aa 2536-2555 SEQ ID NO：170
P171： KALVE QGFTV PEIKT ILGTM aa 2551-2570 SEQ ID NO：171
P172： ILGTM PAFEV SLQAL QKATF aa 2566-2585 SEQ ID NO：172
P173： QKATF QTPDF IVPLT DLRIP aa 2581-2600 SEQ ID NO：173
P174： DLRIP SVQIN FKDLK NIKIP aa 2596-2615 SEQ ID NO：174
P175： NIKIP SRFST PEFTI LNTFH aa 2611-2630 SEQ ID NO：175
P176： LNTFH IPSFT IDFVE MKVKI aa 2626-2645 SEQ ID NO：176
P177： MKVKI IRTID QMQNS ELQWP aa 2641-2660 SEQ ID NO：177
表2
肽 序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P178： ELQWP VPDIY LRDLK VEDIP aa 2656-2675 SEQ ID NO：178
P179： VEDIP LARIT LPDFR LPEIA aa 2671-2690 SEQ ID NO：179
P180： LPEIA IPEFI IPTLN LNDFQ aa 2686-2705 SEQ ID NO：180
P181： LNDFQ VPDLH IPEFQ LPHIS aa 2701-2720 SEQ ID NO：181
P182： LPHIS HTIEV PTFGK LYSIL aa 2716-2735 SEQ ID NO：182
P183： LYSIL KIQSP LFTLD ANADI aa 2731-2750 SEQ ID NO：183
P184： ANADI GNGTT SANEA GIAAS aa 2746-2765 SEQ ID NO：184
P185： GIAAS ITAKG ESKLE VLNFD aa 2761-2780 SEQ ID NO：185
P186： VLNFD FQANA QLSNP KINPL aa 2776-2795 SEQ ID NO：186
P187： KINPL ALKES VKFSS KYLRT aa 2791-2810 SEQ ID NO：187
P188： KYLRT EHGSE MLFFG NAIEG aa 2806-2825 SEQ ID NO：188
P189： NAIEG KSNTV ASLHT EKNTL aa 2821-2840 SEQ ID NO：189
P190： EKNTL ELSNG VIVKI NNQLT aa 2836-2855 SEQ ID NO：190
P191： NNQLT LDSNT KYFHK LNIPK aa 2851-2870 SEQ ID NO：191
P192： LNIPK LDFSS QADLR NEIKT aa 2866-2885 SEQ ID NO：192
P193： NEIKT LLKAG HIAWT SSGKG aa 2881-2900 SEQ ID NO：193
P194： SSGKG SWKWA CPRFS DEGTH aa 2896-2915 SEQ ID NO：194
P195： DEGTH ESQIS FTIEG PLTSF aa 2911-2930 SEQ ID NO：195
P196： PLTSF GLSNK INSKH LRVNQ aa 2926-2945 SEQ ID NO：196
P197： LRVNQ NLVYE SGSLN FSKLE aa 2941-2960 SEQ ID NO：197
P198： FSKLE IQSQV DSQHV GHSVL aa 2956-2975 SEQ ID NO：198
P199： GHSVL TAKGM ALFGE GKAEF aa 2971-2990 SEQ ID NO：199
P200： GKAEF TGRHD AHLNG KVIGT aa 2986-3005 SEQ ID NO：200
P201： KVIGT LKNSL FFSAQ PFEIT aa 3001-3020 SEQ ID NO：201
P202： PFEIT ASTNN EGNLK VRFPL aa 3016-3035 SEQ ID NO：202
P203： VRFPL RLTGK IDFLN NYALF aa 3031-3050 SEQ ID NO：203
P204： NYALF LSPSA QQASW QVSAR aa 3046-3065 SEQ ID NO：204
P205： QVSAR FNQYK YNQNF SAGNN aa 3061-3080 SEQ ID NO：205
P206： SAGNN ENIME AHVGI NGEAN aa 3076-3095 SEQ ID NO：206
P207： NGEAN LDFLN IPLTI PEMRL aa 3091-3110 SEQ ID NO：207
P208： PEMRL PYTII TTPPL KDFSL aa 3106-3125 SEQ ID NO：208
P209： KDFSL WEKTG LKEFL KTTKQ aa 3121-3140 SEQ ID NO：209
P210： KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH aa 3136-3155 SEQ ID NO：210
表2
肽 序列 载脂蛋白B aa SEQ ID NO
P211： KKNKH RHSIT NPLAV LCEFI aa 3151-3170 SEQ ID NO：211
P212： LCEFI SQSIK SFDRH FEKNR aa 3166-3185 SEQ ID NO：212
P213： FEKNR NNALD FVTKS YNETK aa 3181-3200 SEQ ID NO：213
P214： YNETK IKFDK YKAEK SHDEL aa 3196-3215 SEQ ID NO：214
P215： SHDEL PRTFQ IPGYT VPVVN aa 3211-3230 SEQ ID NO：215
P216： VPVVN VEVSP FTIEM SAFGY aa 3226-3245 SEQ ID NO：216
P217： SAFGY VFPKA VSMPS FSILG aa 3241-3260 SEQ ID NO：217
P218： FSILG SDVRV PSYTL ILPSL aa 3256-3275 SEQ ID NO：218
P219： ILPSL ELPVL HVPRN LKLSL aa 3271-3290 SEQ ID NO：219
P220： LKLSL PHFKE LCTIS HIFIP aa 3286-3305 SEQ ID NO：220
P221： HIFIP AMGNI TYDFS FKSSV aa 3301-3320 SEQ ID NO：221
P222： FKSSV ITLNT NAELF NQSDI aa 3316-3335 SEQ ID NO：222
P223： NQSDI VAHLL SSSSS VIDAL aa 3331-3350 SEQ ID NO：223
P224： VIDAL QYKLE GTTRL TRKRG aa 3346-3365 SEQ ID NO：224
P225： TRKRG LKLAT ALSLS NKFVE aa 3361-3380 SEQ ID NO：225
P226： NKFVE GSHNS TVSLT TKNME aa 3376-3395 SEQ ID NO：226
P227： TKNME VSVAK TTKAE IPILR aa 3391-3410 SEQ ID NO：227
P228： IPILR MNFKQ ELNGN TKSKP aa 3406-3425 SEQ ID NO：228
P229： TKSKP TVSSS MEFKY DFNSS aa 3421-3440 SEQ ID NO：229
P230： DFNSS MLYST AKGAV DHKLS aa 3436-3455 SEQ ID NO：230
P231： DHKLS LESLT SYFSI ESSTK aa 3451-3470 SEQ ID NO：231
P232： ESSTK GDVKG SVLSR EYSGT aa 3466-3485 SEQ ID NO：232
P233： EYSGT IASEA NTYLN SKSTR aa 3481-3500 SEQ ID NO：233
P234： SKSTR SSVKL QGTSK IDDIW aa 3496-3515 SEQ ID NO：234
P235： IDDIW NLEVK ENFAG EATLQ aa 3511-3530 SEQ ID NO：235
P236： EATLQ RIYSL WEHST KNHLQ aa 3526-3545 SEQ ID NO：236
P237： KNHLQ LEGLF FTNGE HTSKA aa 3541-3560 SEQ ID NO：237
P238： HTSKA TLELS PWQMS ALVQV aa 3556-3575 SEQ ID NO：238
P239： ALVQV HASQP SSFHD FPDLG aa 3571-3590 SEQ ID NO：239
P240： FPDLG QEVAL NANTK NQKIR aa 3586-3605 SEQ ID NO：240
P241： NQKIR WKNEV RIHSG SFQSQ aa 3601-3620 SEQ ID NO：241
P242： SFQSQ VELSN DQEKA HLDIA aa 3616-3635 SEQ ID NO：242
P243： HLDIA GSLEG HLRFL KNIIL aa 3631-3650 SEQ ID NO：243
表2
表2
Figure BDA00003505481200351
ApoB100的全长序列可在各种出版物，比如参考文献(43)中找到(特别见图1)，其全文通过引用并入本文。
实施例2：ApoB-100相关的肽P210免疫降低由血管紧缩素诱导的血压
用100μg的以下任一在7、10和12周龄时对雄性apoE KO小鼠皮下免疫：第1组：使用明矾作为佐剂的P210/cBSA轭合物(P210)；第2组：对照-100μg的cBSA/明矾(cBSA)；第3组：对照PBS(PBS)。检查14P210、17cBSA、16PBS和8盐水注射的小鼠。
在10周龄时通过植入的皮下渗透泵递送AngII(1000ng/Kg/min)4周，以引起所有三个组的血压升高。将盐水递送给对照组。将小鼠在14周龄时处死。实验持续期间，对小鼠喂养正常饮食。
图1显示了，泵植入后4周，P210接种的小鼠的血压降低大约11％，泵植入后4周P210接种的小鼠伴随着心率改变大约7％(图2A)。图2B显示了整个实验持续期间平均血压改变的时间进程。在7、10和12周龄时，小鼠接受处理(PBS、cBSA/明矾或p210/cBSA/明矾)。由植入的渗透泵进行的血管紧缩素II输注在10周龄时开始。在14周龄时，使小鼠安乐死。整个实验持续期间测量血压。血管紧缩素II输注开始后，平均血压逐渐升高。13周龄时，较之其他2个组的血压，用p210/cBSA/明矾免疫的小鼠具有显著更低的平均血压。
根据上述数据，期望p210疫苗可预防HTN。
本文提供的仅用于指导目的并且不意图限制的可能的行为机制是：p210免疫降低了BP；并且p210免疫的作用通过CD8介导至与在随后的例子中阐释的针对动脉粥样硬化减少而检测到的相同或可比较的程度。因此，引起T细胞应答的能力是对p210特异性的(抗原特异性)，并且其他apoB-100肽预期显示类似的抗原-特异性的CD8作用。
本文提供的仅用于指导目的并且不意图限制的其他可能的行为机制是：还通过调控血管紧缩素表达发挥p210作用。基于公布的抗-HTN疫苗的文献，抗-血管紧缩素疫苗可治疗HTN。因此，基于抗-血管紧缩素疫苗，在某些病况中和对某些个体类型而言，可期望多次施用。
实施例3：p210免疫的动脉粥样硬化-防护性作用
疫苗制剂由使用前面3；4所述的方法与作为载剂的阳离子牛血清白蛋白(cBSA)轭合的p210肽(Euro-Diagnostica AB，瑞典)组成。明矾用作佐剂，并与轭合的肽/cBSA以1∶1体积比率混合。在免疫那天进行肽轭合，并在每次免疫之前与明矾新鲜混合。正常饮食膳食饲养的小鼠在6-7周龄时在肩胛骨之间的脊背区域接受皮下的初次免疫，随后在10和12周龄时加强剂量。最后一次加强剂量后一周，膳食转变为高胆固醇饮食(TD 88137，Harlan-Teklad)，并继续直到25周龄时安乐死。
较之PBS和cBSA/明矾组，用p210的免疫分别减少57％和50％的主动脉动脉粥样硬化(图3A)，而不影响循环胆固醇水平或体重(表3)。
表3PBS、cBSA/明矾和p210/cBSA/明矾组的小鼠的循环胆固醇水平和体重
Figure BDA00003505481200371
来自p210/cBSA/明矾组的主动脉窦斑块含有分别通过MOMA-2和CD11c免疫-染色评价的显著减少的巨噬细胞和DC免疫反应性(图3B)，动脉粥样硬化硬化病灶没有差异(PBS组0.40±0.13mm2，n＝10；cBSA/明矾组0.42±0.09mm2，n＝10；p210/cBSA/明矾组0.40±0.08mm2，n＝9)。
实施例4：p210-免疫引起的免疫应答的表征
鉴于DC是细胞免疫应答和体液免疫应答二者上游的主要细胞类型，申请人测定了这些细胞是否受免疫策略影响。初次免疫后一周，分离来自皮下免疫部位的细胞用于流式细胞计量分析。PBS组不包括在该分析中，因为接受PBS注射的小鼠在注射部位未出现肿胀或细胞累积。
较之cBSA/明矾组，p210/cBSA/明矾组在免疫部位有显著更少的CD11c(+)和CD11c(+)CD86(+)细胞(图4A和4B)。第三次免疫后1周对LN细胞进行流式细胞计量时，与cBSA/明矾组相比较，CD11c(+)CD86(+)细胞也显著减少(图4C)。
申请人接下来评价了抗体应答以定义对p210的体液免疫应答。免疫之前，所有3组小鼠对p210具有低水平的IgG滴度。安乐死时，对p210的IgG滴度在PBS组中仍然是低的，但在cBSA/明矾组中显著提高。用p210/cBSA/明矾的免疫与PBS组相比较导致p210IgG滴度提高，但与cBSA/明矾组相比较显著降低(图5A)。与p210 IgG应答相反，在所有组中p210 IgM滴度显著提高(图5B)，表明了对p210的内源性免疫应答。
IL-2Rα(CD25)是定义明确的淋巴细胞活化标记物。申请人因此分析了CD25在来自初次免疫一周后的小鼠浅颈***和腋窝***(LN)的CD4(+)T细胞或CD8(+)T细胞上的表达，以评估T细胞免疫应答。当与PBS或cBSA/明矾组相比较时，p210/cBSA/明矾组的***中的CD8(+)CD25(+)T-细胞群显著较高(图6A)，而***中的CD4(+)CD25(+)T-细胞在3个组之间没有差异(图6B)。
当与PBS或cBSA/明矾组相比较时，在p210/cBSA/明矾组中有显著更大的脾脏CD8(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群(图6C)，脾脏CD8(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在3个组间没有差异(图6D)。cBSA/明矾组中的脾脏CD4(+)CD25(+)IL-10(+)T-细胞群显著增加。但是，该增加的应答通过p210/cBSA/明矾免疫显著衰减(图6E)；而脾脏CD4(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在三个组之间没有差异(图6F)。
实施例5：来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞过继转移至未经实验的受者重演p210免疫的动脉粥样硬化防护性作用
用相同的分组，即：PBS或cBSA/明矾或p210/cBSA/明矾，使供体apoE(-/-)小鼠经受相同的免疫方案。在6-7周龄时，用供体细胞注射未经试验的受者雄性apoE(-/-)小鼠，并喂养正常饮食直到13周龄，将饮食转变为高胆固醇膳食，直到25周龄时安乐死。
安乐死时，较之用来自PBS或cBSA/明矾组的CD8(+)T-细胞注射的受者小鼠，用来自p210/cBSA/明矾组的CD8(+)T-细胞注射的受者小鼠发展了显著更少的动脉粥样硬化病灶，这强烈暗示了由疫苗诱导的效应器T细胞是CD8+并且在机制上是参与的(图7A)。
该主动脉病灶减少与降低的脾脏CD11c(+)DC(PBS组：4.3±1.7％；cBSA/明矾组：3.4±0.3％；p210/cBSA/明矾组：1.5±0.3％；每组n＝5，p＜0.05p210/cBSA/明矾组对PBS或cBSA/明矾组，通过ANOVA分析)相关，在3个组之间总胆固醇循环水平没有差异(PBS组：1083±296mg/dl；cBSA/明矾组：975±401mg/dl；p210/cBSA/明矾组：1098±379mg/dl)。
较之接受来自其他供体的B细胞的小鼠，分离自p210免疫的供体小鼠的脾的B细胞的过继转移不影响受者小鼠的动脉粥样硬化(图7B)。这些观察结果排除了B细胞作为p210免疫的动脉粥样硬化-防护性作用的介体。
为了排除CD4(+)CD25(+)T-细胞作为通过皮下p210免疫诱导的可能的动脉粥样硬化防护性介体，申请人以1×105细胞/小鼠的剂量将CD4(+)CD25(+)T-细胞过继转移进未经实验的受者apoE-/-小鼠中。3个CD4(+)CD25(+)T-细胞受者组之间的病灶尺寸没有差异。来自CD8+细胞池的CD25+细胞的耗尽消除了在p210/cBSA/明矾受者小鼠中观察到的动脉粥样硬化的减少，这进一步支持这样的观点，CD8+CD25+T细胞在机制上参与针对动脉粥样硬化的疫苗的防护性作用(图7C)。以3×105细胞/小鼠的较高数目的CD4(+)CD25(+)T-细胞的转移没有减少所有3个受者组中的病灶尺寸(图7D)。
实施例6：来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T细胞针对树突细胞的的增加的体外细胞溶解活性
鉴于观察到p210免疫减少了免疫部位中的DC和动脉粥样硬化斑块，并且来自p210免疫的供体的CD8(+)T-细胞的过继转移使得受者中的脾脏DC减少，申请人推测DC是CD8(+)T-细胞的可能的靶标。
为测试这一点，申请人共培养得自骨髓的DC和来自各种免疫组的CD8(+)T-细胞。来自p210免疫的小鼠的CD8(+)T-细胞较之来自PBS或BSA/明矾组的那些显著增加了DC死亡的百分比(图8)。该CD8(+)T-细胞增加的细胞溶解功能与增加的粒酶B表达而非穿孔素相关(图9)。
实施例7：用p210的免疫不会影响对其他T-细胞依赖型或非依赖型抗原的适应性免疫应答
鉴于观察到p210免疫减少了CD11c(+)DC并减少了对p210的适应性IgG应答，申请人接下来测试p210免疫对DC的此类调控是否会改变对其他抗原的宿主免疫应答。
申请人首先如前面部分中描述的用p210使小鼠免疫，随后两次单独的皮下KLH免疫或腹膜内注射TNP-LPS。使用KLH-或TNP-IgG滴度作为个体免疫效力的代替，申请人发现在p210免疫的小鼠的KLH-或TNP-IgG滴度和来自PBS或cBSA/明矾组的小鼠的滴度之间没有差异(图10)。
实施例8：用apoB-100免疫原性片免疫降低血管紧缩素II-诱导的主动脉动脉瘤的死亡率和高血压
在7、10和12周龄时，用p210/cBSA/明矾(p210；100μg)使ApoE(-/-)小鼠免疫。接受PBS或cBSA/明矾(cBSA)的小鼠作为对照。10周龄时，对小鼠皮下植入释放AngII(1mg/Kg/min)的渗透泵，并在4周后进行安乐死。收获主动脉、脾和***(LN)。较之对照，由于AA破裂，p210疫苗显著降低了死亡率(见图11)。
对LN和脾中的树突状细胞(DCs)的流式细胞分析显示了p210组中的细胞内IFN-γ表达被上调。在p210组中，通过原位二氢乙啶方法测量的主动脉过氧化物产生和通过Western印迹测量的主动脉AT1受体(AT1R)表达显著减小。在13周龄时，p210疫苗显著减小了平均动脉BP(见表4)。
p210疫苗显著降低了AngII诱导的AA破裂造成的死亡率。该保护性作用与DC中IFN-γ表达的上调和主动脉中的降低的动脉BP、AT1R表达和过氧化物生产相关联。疫苗可能是用于AA的有希望的新的非侵入性治疗。
表4树突状细胞(DCs)的细胞内IFN-γ表达的流式细胞分析
Figure BDA00003505481200401
Figure BDA00003505481200411
实施例9：来自apoB-100免疫原性片段免疫的小鼠的CD8(+)T细胞的提高的细胞溶解活性对脂质关联的抗原是特异性的
申请人已显示，用apoB-100相关的-肽p210免疫显著减少了apoE-/-小鼠中的动脉粥样硬化，并减少了apoE-/-小鼠中的斑块内CD11c+树突状细胞(DCs)。过继转移实验显示了，动脉粥样硬化-保护是通过CD8+T细胞介导的。因为apoB-100存在于血脂的LDL组分上，申请人评估了对通过DC呈递的脂质关联的抗原特异性的p210免疫的小鼠的CD8+T细胞的细胞溶解活性。
用p210/cBSA/明矾、cBSA/明矾或PBS，在7、9和12周龄时免疫ApoE-/-小鼠。第三次免疫后一周，使小鼠安乐死，以收集脾CD8+T细胞。得自骨髓的DC与未经实验的apoE-/-小鼠是分化的，并被用作靶细胞。在有10％FBS的培养基中，使用3∶1的CD8比DC比率，进行四小时溶解检验。接着收集细胞并对CD11c染色以鉴定DC和7-AAD，来使用流式细胞术评估细胞溶解。较之cBSA/明矾和pBS，来自p210/cBSA/明矾免疫的小鼠的CD8+T细胞有显著更大的溶解活性(表)。在有脱脂的FBS的培养基中进行检验时，消除了特异性针对来自p210/cBSA/明矾免疫的小鼠的CD8+T细胞的溶解活性(表5)，这暗示了培养基中的FBS脂质级分提供了抗原来源。溶解检验之前用FITC-标记的p210对DC进行负载24小时，表明了来自p210/cBSA/明矾免疫的小鼠的CD8+T细胞的溶解活性的特异性和抗原摄取(见表5)。
这些结果显示了，靶向DC的CD8+T细胞的细胞溶解功能对与脂质相关联的抗原，特别是apoB-100的p210片段是特异性的，并且这可成为p210免疫的保护性作用的基础。
表5CD8(+)T细胞的细胞溶解活性的流式细胞分析。
Figure BDA00003505481200421
实施例10：对p210疫苗的抗体应答
在免疫之前，对p210的抗体滴度是低的。在25周龄安乐死时，在所有组中的p210IgM滴度显著增加(图12)，这暗示了对自身肽p210的内源性免疫应答。较之PBS组，在cBSA/明矾组和p210/cBSA/明矾组二者中p210IgG滴度均显著增加，但令人吃惊地，在2个对应组之间，在cBSA/明矾中滴度更高。在cBSA/明矾组和p210/cBSA/明矾组中存在作为佐剂的明矾可能导致对IgG应答的IgM种类转变，所述转变在PBS组中没有出现。
实施例11：CD4(+)T细胞和CD8(+)T细胞对p210疫苗的应答
初次免疫后一周，收集来自小鼠的颈浅和腋窝***(LN)的T细胞周，来评估T细胞免疫应答。***中的CD4+CD25+T细胞在3个组中没有差异(表1)。cBSA/明矾组中脾脏CD4+CD25+IL-10+T细胞群显著增加。但是，这种增加的应答被p210/cBSA/明矾免疫显著削弱(表6)。令人感兴趣地，cBSA/明矾组中的脾脏CD4+CD62L+T细胞(表1)群更低。
初次免疫后一周，较之PBS或cBSA/明矾组，p210/cBSA/明矾组中，***中的CD8+CD25+T细胞群显著更高(表2)。较之PBS或cBSA/明矾组，p210/cBSA/明矾组中的脾脏CD8+CD25+IL-10+T细胞群显著更大(表2)。较之PBS或cBSA/明矾组的脾脏CD8+CD62L+T细胞群，p210/cBSA/明矾组中的脾脏CD8+CD62L+T细胞群显著更高(表6)。其他时间点下的T细胞谱图在组之间没有显著不同。
表6对p210疫苗的CD4(+)和CD8(+)T细胞应答
Figure BDA00003505481200441
实施例12：CD8+CD25+T细胞的效应器作用涉及细胞毒性功能
疫苗减少了p210/cBSA/明矾受者小鼠脾中和斑块中(图3)的DC的存在，这暗示了免疫后CD8+T细胞的效应器作用被证实为减少斑块中的DC。申请人因此评价了疫苗对于针对得自同源骨髓的DC的CD8+T细胞的细胞毒性活的影响。使用CD8选择Dynabeads试剂盒(Invitrogen)阴性分离来自免疫组的CD8+T细胞，随后在补充有10％FBS的RPMI中以CD8∶DC为3∶1的比率与DCs共培养。收集细胞并处理，用于4小时后CD11c+和7-AAD的流式细胞测定20。在共培养中没有CD8+T细胞的树突状细胞死亡被用作基线，并且使用前面描述的方法计算细胞的特异性溶解百分比20。
较之来自PBS或cBSA/明矾组的那些，来自p210免疫的小鼠的CD8+T细胞显著增加了DC溶解的百分比(图13，A组)。CD8+T细胞这种增加的细胞溶解功能与增加的粒酶B表达而非穿孔素相关联。CD25+细胞的耗尽消除了特异性针对来自p210免疫的小鼠的CD8+T细胞的增加的细胞溶解活性(图13，B组)，这表示CD8+CD25+T细胞是效应器群。使用补充有脱脂血清的培养基时，对来自p210免疫的小鼠的CD8+T细胞特异性的增加的细胞溶解功能也丢失了(图13，C组)，这表示在通过CTL识别的靶DC上的抗原得自培养基中的含有apoB-100的血清LDL。
实施例13：p210肽被DC体外内吞。
使用用FITC(来自Pierce的FITC轭合试剂盒)标记的p210，限定在BMDC上负载的肽。树突状细胞中FITC荧光的存在表示通过树突状细胞摄取p210。特别参见图14，其显示了FITC-标记的p210被DC内吞，这表示抗原摄取。
实施例14：p210肽通过DC呈递至CD8+T细胞。
p210肽含有apoB-100分子的蛋白聚糖结合位点。这种肽是细胞-穿膜肽，其能有效地递送抗原，用于交叉呈递至细胞毒性CD8+T细胞53。申请人因此评估了与用p210负载并用LPS成熟化的DC共培养的CD8+CD25-T细胞的活化。较之未处理的或仅用LPS处理的共培养物，与用LPS处理的用p210-负载的DC共培养后48小时，CD8+CD25+T细胞显著增加(图15)。结果暗示了p210抗原通过DC呈递给CD8+T细胞。
实施例15：p210-负载的DC被免疫CD8+T细胞特异性靶向。
上述实施例14中所示结果支持这样的观点，p210通过DC呈递至CD8+T细胞。针对DC的溶解活性是否特异性针对p210抗原仍旧不清楚。申请人因此使用FITC-标记的p210负载的BMDC作为靶标重复了溶解检验。来自p210/cBSA/明矾小鼠的CD8+T细胞中，针对FITC+DC的溶解活性显著增加(图16)，这暗示了抗原特异性的溶解活性。
总之，在若干个实施方式中，本文描述了免疫调节试剂、T细胞、组合物、方法和***，用于在个体中治疗和/或预防高血压和/或其关联的病况。
提供了上文阐明的实施例，以给予本领域的普通技术人员对于怎样制造和使用本发明的分子、组合物、***和方法的实施方式的一个完整的公开和说明，并且不意图限制发明人认定为他们发明的范围。本申请中的所有的专利和出版物表示本发明所属领域技术人员的技术水平。
在发明背景、发明内容、发明详述和实施例中引用的每一篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、实验室手册、书籍或其他公开)的全部公开内容据此通过引用被并入本文。在本申请中引用的所有参考文献在相同程度上被并入，好像每一篇参考文献以其整体通过引用被单独地并入。但是，如果引用的参考文献和本发明之间有任何矛盾之处，本发明有优先权。另外，本文于2011年11月11日创建的txt文档“P694-PCT-2011-11-11-序列表_ST25”中提交的的序列表形成了本申请不可或缺的部分，并且其全部内容通过引用并入本文。
已在本文中使用的术语和表达用作说明书的术语并且不是限制性的，并且没有意图在这种术语和表达的使用中排除所示和所述的特性或其部分的任何等同物，而是应当意识到，在本发明的范围内各种改变是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已被优选的实施方式、示例性实施方式和任选的特征具体公开，但是本领域技术人员可采用本文公开的概念的修饰和变型，并且这种修饰和变型被认为在由附加的权利要求限定的本发明的范围内。
应当理解，本文中使用的术语仅意图描述具体实施方式，并且不意图是限制性的。如在该说明书和附加的权利要求中使用时，除非内容清楚地指出，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数指示物。除非内容清楚地指出，术语“多数”包括两种或多种指示物。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科技术语具有本发明涉及的本领域技术人员所通常理解的相同的含义。
当本文中使用马库什组或其他分组时，组的所有单独的成员和组的所有组合和可能的亚组合意图单独地被包括在本发明中。除非另外指出，本文描述的或示例性的组分或材料的每一种组合可用来实施本发明。本领域技术人员将意识到，除了具体示例的那些之外的方法、设备元件和材料可用在本发明的实施中，而不用借助过度实验。任何这种方法、设备元件和材料的所有本领域已知的功能等同物意图包括在本发明中。无论何时在说明书中给出一个范围，例如温度范围、频率范围、时间范围或组合范围，在范围内包括的所有中间范围和亚范围，以及所有单独的值意图包括在本发明中。本文公开的范围或组的任何一个或更多单独的成员可从本发明的权利要求中排除。本文中例证性描述的本发明可合适地在缺失本文没有特别公开的任何元件或多个元件、限制或多个限制的情况下实施。
本文已描述了本发明的大量实施方式。本文提供的具体实施方式是本发明有用的实施方式的例子，并且本领域技术人员明白可使用本发明中阐释的设备、设备组件、方法步骤的大量变型实施本发明。如对本领域技术人员而言显而易见的，用于本方法的方法和设备可包括处理元件和步骤的大量任选的组合。
特别地，应当理解在不会背离本发明的精神和范围的情况下可做出各种修饰。因此，其他实施方式在所附权利要求的范围内。
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Claims (26)

1.治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的方法，所述方法包括：
给个体施用有效量的ApoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分，其中所述一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分与动脉粥样硬化减少关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，所述每一种肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：148、SEQ IDNO：210和SEQ ID NO：301之一。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，所述每一种肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQID NO：45、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：148和SEQ IDNO：210之一。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：143的肽和具有SEQ ID NO：210的肽。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：11的肽、具有SEQ ID NO：25的肽和具有SEQ ID NO：74的肽。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：2的肽。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：45的肽。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：210的肽。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述个体是人类并且浓度在约100μg和约小于1mg之间。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中通过1到3次施用至少约100μg的剂量，进行所述施用。
11.治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的方法，所述方法包括：
给个体施用有效量的对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的活化的CD8(+)T细胞，其中所述一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分与动脉粥样硬化减少关联。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，所述每一种肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：148、SEQ IDNO：210和SEQ ID NO：301之一。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，所述每一种肽包含SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：102、SEQ IDNO：148、SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：210之一。
14.根据权利要求11至13任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：143的肽和具有SEQ ID NO：210的肽。
15.根据权利要求11至14任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：11的肽、具有SEQ ID NO：25的肽和具有SEQ ID NO：74的肽。
16.根据权利要求11至15任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：2的肽。
17.根据权利要求11至16任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：45的肽。
18.根据权利要求11至17任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO：210的肽。
19.根据权利要求11至18任一项所述的方法，其中所述有效量在约500,000个和约2,000,000个CD8(+)T细胞之间。
20.根据权利要求11至19任一项所述的方法，其中通过给个体施用约1,000,000个细胞来进行所述施用。
21.根据权利要求11至20任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用有效量的一种或多种CD8(+)T细胞增强剂。
22.根据权利要求11至21任一项所述的方法，所述方法还包括施用apoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分。
23.根据权利要求11至22任一项所述的方法，其中如下获得对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的活化的CD8(+)T细胞：
在使CD8(+)T细胞活化的条件下，使CD8(+)T细胞与选自由SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：302组成的组的一种或多种肽或其免疫原性活性部分接触一段时间，所述活化的CD8(+)T细胞对所述一种或多种肽或其免疫原性活性部分是特异性的。
24.治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的***，所述***包含以下至少两种：
一种或多种对ApoB-100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞；和
一种或多种CD8(+)T细胞增强剂。
25.治疗和/或预防个体的高血压和/或其关联病况的***，所述***包含以下至少两种：
apoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分和CD8(+)T细胞；和
一种或多种对Apo-B100的免疫原性片段或其免疫原性活性部分特异性的CD8(+)T细胞。
26.根据权利要求25所述的***，其还包含一种或多种CD8(+)T细胞增强剂。
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XIAONING ZHAO等: "Athero-protective Effects of Immunization With apoB-100 Related Peptide Vaccine in apoE–/– Mice is Associated With Enhanced CD8 Regulatory T Cell Response", 《CIRCULATION》, vol. 120, no. 1812, 3 November 2009 (2009-11-03), pages 1018 *
曹伟健等: "脂蛋白、载脂蛋白与原发性高血压的关系", 《蚌埠医学院学报》, vol. 27, no. 2, 31 March 2002 (2002-03-31), pages 123 - 125 *

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