JP2001500251A - Ｈｋ２ポリペプチドを検出するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 前立腺抗原phK２又はhK２と結合し、前立腺特異的抗原hK３と大きな反応性のない抗体を用いる診断方法を供する。hK２複合体形成を検出するための方法も供する。その方法は、前立腺癌の診断に役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】 HK２ポリペプチドを検出するための方法 発明の背景 腺性カリクレインは、それらの生物的に活性な形態への特定のポリペプチド前 駆体の翻訳後プロセッシングに関連するセリンプロテアーゼのサブグループであ る。ヒトにおいて、このファミリーの３つのメンバーが同定されており、それら の特性のいくつかがキャラクタライズされている(Clements，Endoc ．Rev，10，3 43(1989)；Clements，Mol．Cell Endo.，99，1（1994）；Jonesら、Acta Endoc ，127 ，481(1992))。hKLK１遺伝子は組織カリクレインタンパク質hK１をコード し、hKLK２遺伝子は前立腺特異的腺性カリクレインタンパク質hK２をコードし、 そしてhKLK３遺伝子は前立腺特異的抗原タンパク質hK３(PSA)をコードする。mRN Aのノーザンブロット分析は、hK２及びPSAの両方が主にヒト前立腺において発現 され、他方hK１の発現は膵臓、顎下腺、腎臓、及び他の非前立腺組織において見 い出される(Chapdelaineら、FEBS Lett ，236，205（1988）；Youngら、Biochem ．31 ，818(1992))。 hKLK２及びhKLK３のエキソンの間のヌクレオチド配列相同性は80％であるが、 hKLK２及びhKLK１のエキソンの間のヌクレオチド配列相同性は65％である。PSA に対するhK２の予想されるアミノ酸配列相同性は78％であるが、hK１に対するhK ２の予想されるアミノ酸配列相同性は57％である。更に、hK２の予想されるアミ ノ酸配列は、hK２がトリプシン様プロテアーゼであり得、PSAがキモトリプシン 様プロテアーゼであることを示唆する。 前立腺癌の予後の指示体としてPSAレベルが広く用いられる。し かしながら、血清中のPSAの濃度は、前立腺癌(PCa)又は良性前立腺過形成(BPH) の患者において上昇するので、PSAのレベルの上昇の検出は、これらの病気を区 別しない。 更に、PSAに対するhK２の相同性の高さは、PSAのレベルを検出するのに現在用 いられる抗体の特異性に関していくつかの問題を生じさせる。循環するhK２のレ ベルがpCa又はBPHに関係しないなら、hK２で汚染されたPSAの調製物に対して、 又はhK２と相同なPSAの領域に対して生じた抗体は誤った陽性の結果を引きおこ し得る。しかしながら、血清中のhK２のレベルの決定、及びpCa又はBPHの患者に おけるこれらのレベルの相関は達成されていない。 これにより、pCa，BPH又は関連する状態の診断のための改良された方法及び試 薬についての必要性がある。 発明の概要 本発明は、phK２又はhK２に特異的に結合する所定量の精製された抗体を、ヒ トから得られた生理的流体のサンプルに接触させることを含む診断方法を供する 。その生理的流体はhK２又はphK２を含む。その抗体は、該抗体の一部分とphK２ 又はhK２の一部分との間の２成分複合体の形成を許容するのに十分な時間、サン プルに接触させられ、ここで前記抗体はhK３と大きな反応をしない。次に前記サ ンプル中の前記複合体の一方又は両方の存在が検出され、そしてその量は前立腺 癌の存在又は欠如と相関される。前記複合体の一方又は両方の量は、例えば前立 腺癌の危険のない又はそれを患っていないヒトからの同じ流体の対照サンプル中 の一方又は両方の複合体の量で代表される標準的な量と比較することができる。 同様に、その量は、その上又は下の値で前立腺癌についての更なる評価が行われ 、そしてその上又は下の各々で、ヒトは癌でない可能性が高いカ ットオフを示す標準的量と比較することができる。このアッセイは、phK２が前 立腺癌細胞系の上清において検出され、hK２が前立腺癌患者からのヒト生理的流 体中に存在するという発見に基づく。これにより、この方法は前立腺癌の治療及 び／又は進行をモニターするため、又は前立腺癌の早期検出のために役立つ。 本明細書に用いる場合、前立腺癌の“危険性”のあるヒトは、良性の前立腺過 形成(BPH)又は高い段階の前立腺上皮内腫瘍形成を有する男性、又は男性の家族 のメンバーが良性前立腺過形成、高い段階の前立腺の上皮内腫瘍形成もしくは前 立腺癌(PCa)を有する男性である。 PSA(hK３)は、ヒト血清中の抗キモトリプシン(ACT)及びα２−マクログロブリ ン（MG）と共有結合した複合体を形成する（Leinonenら、Clin ．Chem.，34，209 8(1993)）。血清中での異なるPSAの形態（複合体化したもの対複合体化していな いもの）は、BPHとpCaとの間を区別するのに役立つ(Christenssonら、J ．Urol. ，150 ，100(1993))。 以下に示される結果は、hK２ポリペプチドがACT及びMGとの複合体も形成する ことを示す。hK２のACTとの複合体形成は、hK２がトリプシン様プロテアーゼで ありACTが典型的な、キモトリプシン様プロテアーゼのインヒビターであるので 予想されないことであった。しかしながら、それはhK２がインヒビターとのその 反応性を命令するPSA(hK３)とのコンホメーション／構造の類似性を有する。こ れにより、遊離した（結合していない）hK２と共に、ACT及びMGと複合化したhK ２は、ヒト血清中の主な免疫学的に検出又は測定可能なhK２の構成物を供すると 予想される。以下に供される結果は、hK２複合体が、前立腺癌患者の血清中で検 出することができることも示す。それゆえ、hK２複合体の存在及び／又は量につ いてモニター することは、PCaとBPHとの間を区別するのにも重要であり得る。 これにより、本発明は、ヒトの生理的流体のサンプルからの血漿タンパク質に 結合したhK２ポリペプチドの量を決定し、該結合したhK２ポリペプチドの量を、 前記ヒトにおける前立腺癌の存在又は欠如と相関することを含む診断方法も供す る。本発明の好ましい実施形態は、前立腺癌の危険性のない又はそれを患ってい ないヒトにおいて結合したhK２の前記量の代表的な値に対して、結合したhK２ポ リペプチドの量を決定する診断方法である。本発明の他の好ましい方法は、結合 したhK２ポリペプチドの量を決定する前に、血漿タンパク質に結合しないhK２ポ リペプチドから、血漿タンパク質に結合したヒトの生理的流体hK２ポリペプチド をサンプルから分離することを含む診断方法である。異なる分子量及び／又はコ ンホメーションのタンパク質の分離のための方法は当該技術で公知である。 血漿タンパク質とのhK２複合体形成を検出するための方法を更に供する。その 方法は、血漿タンパク質に結合しないhK２ポリペプチドの量に対する血漿タンパ ク質に結合したhK２ポリペプチドの量を検出することを含む。あるいは、全ての hK２ポリペプチド（結合したもの＋結合していないもの）に対する血漿タンパク 質に結合したhK２ポリペプチドの量が検出される。 本発明は、hK２を含むヒトの生理的流体のサンプル中の結合していないhK２ポ リペプチドを検出し又は決定するための方法を更に供する。その方法は、前記抗 体の少くとも一部分と前記hK２の一部分との間の二成分複合体の形成を許容する のに十分な時間、所定量のhK２に特異的に結合する精製された抗体をテストされ るべきサンプルに接触させることを含む。その抗体は、hK３と大きく反応せず、 血漿タンパク質に結合したhK２と大きな反応性はない。本発明の好ましい実施形 態は、抗体をテストされるべきサンプルに接触させる 前に、前記抗体を固相に結合させることを含む。 hK２ポリペプチドに特異的に結合し、hK３に結合しない精製された抗体であっ て、血漿タンパク質に結合したhK２にも結合する抗体も供する。 本発明は、更に、phK２又はhK２を検出し又は決定するための診断キットを供 する。そのキットは、包装、容器、別個に包装された（ａ）捕獲抗体に結合した 固相；及び（ｂ）周知の量の検出抗体であってphK２又はhK２に特異的に結合し 、hK３に結合しない抗体を含む。 本発明の他の実施形態は、phK２を検出し又は決定するための診断キットであ る。そのキットは、包装、容器、別個に包装された（ａ）捕獲抗体に結合する固 相；及び（ｂ）周知の量の検出抗体であって、hK２のプロ形態に特異的に結合す るが、hK３又はhK２に結合しない抗体を含む。 本発明のなお更なる実施形態は、phK２又はhK２を検出し又は決定するための キットである。そのキットは、包装、容器、別個に包装された（ａ）捕獲抗体に 結合した固相；及び（ｂ）周知の量の捕獲抗体であって、phK２又はhK２に特異 的に結合するがhK３に結合しない抗体を含む。 試験管内でhK２を検出する方法も供する。その方法は、所定量のhK２ポリペプ チドを含むサンプル、例えば流体サンプルを、所定量のペプチド基質に、hK２ポ リペプチドによるペプチド基質の開裂がそのペプチドのサブユニットを作り出す のに十分な時間、接触させるステップであって、前記ペプチド基質がhK２ポリペ プチドが結合する部位を形成する連結するアミノ酸残基を含むことを特徴とする ステップを含む。次に、そのペプチド基質のサブユニットの存在又は量が決定さ れる。好ましくは、ペプチド基質は合成ペプチドであ る。 図面の簡単な記載 図１は、野生型成熟hK２（配列番号：１）及びhK３（配列番号：７）のアミノ 酸配列を示す。 図２は、野生型pphK２（及び配列番号：５及び配列番号：６）、phK２（配列 番号：３及び配列番号：４）及びhK２（配列番号：１及び配列番号：２）のアミ ノ酸配列及び対応する核酸配列を示す。コドン217（GCT，Ala）をボールド及び 下線で示す。 図３は、pGT発現ベクターpGThK２及びpGThK２^V217の概略図である。 図４は、phK２^V217の精製からのクロマトグラフィープロフィールを示す。（ Ａ）pphK２^V217をコードするベクターをトランスフェクトしたAV12からの７日を 経た培地のDEAEクロマトグラム。消費された培地のサンプルを、重炭酸緩衝液、 pH８に適用し、塩勾配で溶出した。Ａ₂₈₀溶出プロフィールを連続線で示す。点 線は、マイクロタイタープレート上に乾燥させ、ウサギ抗pphK２抗体で展開した 個々のカラム画分の一部分のELISAアッセイの結果を示す。（Ｂ）プールしたDEA E画分の疎水性相互作用プロフィール。（Ａ）のDEAEクロマトグラフィー溶出液 からの画分24〜30をプールし、濃縮し、そして1.2Ｍ硫酸ナトリウム中のHIC(疎 水性相互作用カラム)に適用し、塩勾配を減少させて溶出した。その溶出プロフ ィール（Ａ₂₈₀）を連続線で示す。点線は、マイクロタイタープレート上に乾燥 させてウサギ抗hK２抗体で展開した個々のカラム画分の一部分のELISAアッセイ の結果を示す。（Ｃ）（Ｂ）からの22分のピークからのhK２含有画分を濃縮し、 Pharmacia Ｓ12サイズ排除カラムに適用した。画分を収集し、SDS／PAGEにより 分析した。19.4分のピーク はSDS−PAGEにより均一であった。 図５は、精製されたhK２及びPSA(7)SDS／PAGE分析を示す。精製したphK２^V217 又はPSAの1.5mgサンプルを、１％β−メルカプトエタノールを含む（Ｒ）又は含 まない（Ｎ）サンプル緩衝液中で煮沸した。サンプルを４〜20％ゲルでのSDS／P AGEにかけた。そのタンパク質バンドを、そのゲルを銀で染色することにより視 覚化した。 図６は、phK２^V217のコンコナバリンＡ染色を示す。phK２の予想される位置を 矢印で示す。ZCE(抗CEAmAb)及びBSAを、グリコシル化及び非グリコシル化タンパ ク質の例として各々含めた。phK２レーンにおける予想される位置におけるバン ドの存在はこのタンパク質がグリコシル化されていることを示す。 図７は、トリプシン開裂によるプロの成熟hK２^V217〜の変換を示す。トリプシ ン（１％ｗ／ｗ）を、100mMホウ酸緩衝液pH８中37℃で10分、phK２^V217とインキ ュベートし、次にHIC−HPLCにかけた。点線は、トリプシンとのインキュベーシ ョンの前の、phK２^V217のプロフィールを示す。連続線は、トリプシン消化後のp hK２のプロフィールを示す。それらのプロフィールを比較のため重ね合わせた。 ２つの形態の同一性はタンパク質のＮ末端配列決定により確認した。 図８は、モノクローナル抗体(mAb)hK1G586.1を用いるサンプル流体のウェスタ ンブロット分析を示す。処理した***流体をPBS中１：１に希釈し、20分、10,00 0×ｇで遠心した。その上清をPhast System(Pharmacia)を用いる８〜25％ゲルで のSDS／PAGEにかけた。タンパク質をニトロセルロースに移し、タンパク質−Ｇ で精製したHK1G586.１（１μｇ／ml）と、次にヤギ抗マウスIgG−HRP（１：1000 ）とインキュベートした。そのブロットをECL検出システム（ Amersham）を用いて展開した。 図９は、AV12細胞におけるhK２発現の時間経過研究を示す。AV12−hK２クロー ン＃27を約60〜70％コンフルエンシーまで増殖させ、次に細胞をHBSSで洗い、そ して無血清HH４培地を加えた。消費された培地を各々の日にとり、濃縮し、そし て12％ゲルでのSDS／PAGEにかけた。タンパク質をエレクトロブロットし、phK２ 及びhK２（１：1000）の両方を検出するモノクローナル抗体HK1D106.4又はphK２ （１：1000）を検出するHK1G464.3で、次にヤギ抗マウスIgG−HRP(１：500)でプ ロービングした。そのブロットを、製造元の説明に従ってECL(Amersham)で展開 した。精製されたphK２^V217及びhK２^V217を対照として用いた。hK２の位置を、 矢印で示す。 図10は、トランスフェクトされたAV12細胞内でのhK２の変異形態の発現の時間 経過研究を示す。約60〜70％マンフルエンシーのAV12−hK２^V217細胞をHBSSで洗 い、無血清HH４培地を加えた。消費された培地を各々の目に取り出し、濃縮し、 そして12％ゲルでのSDS／PAGEにかけた。タンパク質をエレクトロブロットし、 モノクローナル抗体HK1D106.4及びHK1G464.3でプロービングした。ヤギ抗マウス IgG−HRP(１：500)を二次抗体として用い、製造元の説明に従って、ECL(Amersha m)で展開した。精製したphK２^V217及びhK２^V217を対照として用いた。hK２の位 置を矢印で示す。 図11は、時間の経過に伴うhK２発現及び細胞生存能のブロットである。AV12− hK２クローン＃27を60〜70％のコンフルエンシーまで増殖させ、HBSSで洗い、無 血清HH４培地を加えた。消費された培地を各々の日にとり、hK２濃度を一次抗体 としてHK1D106.4又はHKIG464.3、及び二次抗体としてヤギ抗マウスIgG−HRPを用 いてELISAにより測定した。その反応をOPD(Sigma，St．Louis，MO)で展開した。 生存細胞数を、トリパンブルー染料排除を用いて毎日計数し た。 図12は、PC３及びDU145細胞におけるhK２の発現を示す。pGThK２を移入した。 PC３及びDU145細胞を約60〜70％コンフルエンシーまで増殖させ、洗浄し、無血 清HH４培地に再度懸濁した。pGThK２を移入したDU145細胞の消費された培地を再 度の懸濁の後３日に収集し、pGThK２を移入したPC３細胞の消費した培地を再度 の懸濁後５日に収集した。消費された培地を濃縮し、12％ゲルでのSDS／PAGEに かけた。タンパク質をエレクトロブロットし、上述の通りHKID106.4又はHK1G464 .3でプロービングした。精製したphK２^V217及びphK２^V217を対照として用いた。 hK２の位置を矢印で示す。 図13は、選択されたhK２含有AV12クローンによるhK２の発現を示す。AV12クロ ーン番号10，27，31及び32を含むhK２からの細胞を、約60〜70％コンフルエンシ ーまで増殖させ、HBSSで洗い、次に無血清HH４培地を加えた。消費された培地を 、無血清培地を加えた後７日目にとり、濃縮し、12％ゲルでのSDS／PAGEにかけ た。タンパク質をエレクトロブロットし、HK1D106.4又はHK1G464.3でプロービン グした。ヤギ抗マウスIgG−HRP(１：500)を二次抗体として用い、そのブロット を製造元の説明に従ってECL(Amersham)で展開した。精製されたphK２^V217及びph K２^V217を対照として用いた。hK２の位置を矢印で示す。 図14は、選択されたAV12−hK２^V217クローン中でのphK２^V217の発現を示す。A V12クローン番号２，３，４，45及び48からの細胞を約60〜70％マンフルエンシ ーまで増殖させ、HBSSで洗い、無血清HH４培地を加えた。消費された培地を、無 血清培地の添加後７日目にとり、濃縮し、そして12％ゲルでのSDS／PAGEにかけ た。タンパク質をエレクトロブロットし、HK1D106.4及びHK1G464.3でプロービン グした。ヤギ抗マウスIgG−HRP(１：500)を二次抗体として用い 、そのブロットを製造元の説明に従って、ECL(Amersham)で展開した。精製され たphK２^V217及びhK２^V217を対照として用いた。hK２の位置を矢印で示す。 図15は、hK２の残基210〜236についてのhK２^V217，hK２、及びPSAのアミド分 解特異性を示す。合成ペプチド（0.63mM）を１μｇ／ml hK２，40μｇ／ml hK ２^V217又は100μｇ／ml PSAで37℃で一晩消化し、その消化産物をRP−HPLCによ り分離した。開裂の定性的観点を比較するためにピークを標準化した。 図16は、異なるペプチド基質についてのhK２及びPSAの特異性を示す。白ぬき 矢印は、PSAにより開裂されたペプチドバンドを示し、黒ぬり矢印はhK２により 開裂されたバンドを示す。ペプチド＃１（配列番号：16）はhK２のアミノ酸残基 210〜236を示す。ペプチド＃２（配列番号：18）はアンジオテンシノゲン、即ち レニン基質のテトラデカペプチドのアミノ酸残基１〜14を示す。ペプチド＃３（ 配列番号：19）は、phK２のアミノ酸残基−７〜＋７を示す。ペプチド＃４（配 列番号：20）は、hK２のアミノ酸残基41〜56を示す。ペプチド＃５（配列番号： 21）は、インスリンの酸化されたβ鎖のアミノ酸配列を示す。ペプチド＃６（配 列番号：22）は、PMSAのアミノ酸残基196〜213を示す。 図17は、hK２^V217でなくhK２によりphK２^V217の活性化を示す。phK２^V217は、 hK２^V217中に存在しない配列であるプロリーダーペプチド配列VPLIQSR(配列番号 ：12)を含む。パネルＡは１％ｗ／ｗ hK２とインキュベートしたphK２^V217を示 す。パネルＢはphK２^V217と６時間インキュベートした40％ｗ／ｗ hK２^V217の 対照である。 図18は、プロテアーゼインヒビターとインキュベートしたhK２のウェスタンブ ロット分析を示す。各々のサンプルを８〜25％勾配S DS−PAGEで分離し、ブロットし、HK1G586.1でプロービングした。hK２を４時間 、37℃で、次のインヒビター：レーン１、アンチキモトリプシン(ACT)；レーン ２，α２−アンチプラスミン；レーン３、アンチトロンビンIII；レーン４，α １−プロテアーゼインヒビター（アンチトリプシン）；レーン５，α２−マクロ グロブリンとインキュベートした。レーン１及び２は予想Mr 90〜100kDの共有 結合複合体を示す。セルピンインヒビターを20μＭで、マクログロブリンを2.8 μＭで、そしてhK２を0.175μＭで用いた。レーン５は、α２−マクログロブリ ンとのhK２の共有結合複合体形成を示すより高いMrの複合体を示す。 図19は、ヒト血清中のhK２の複合体形成を示す。hK２及びPSAのウェスタンブ ロットをヒト血清とインキュベートした。hK２サンプルをHK1G586.1でプロービ ングし、PSAサンプルをPSM773抗PSA mAbでプロービングした。レーン１〜６はhK ２サンプルを含み、レーン７及び８はPSAサンプルである。レーン１はhK２対照 を示す。レーン２は４時間、ACTとインキュベートしたhK２を含む。レーン３は プロテアーゼを加えていない血清対照を示す。レーン４は、血清と15分、インキ ュベートしたhK２を含む。レーン５は、４時間、血清とインキュベートしたhK２ を含む。レーン６は、４時間、精製されたα−２−マクログロブリンとインキュ ベートしたhK２を含む。レーン７は、４時間、血清とインキュベートしたPSAを 含む。レーン８は、４時間、精製されたα−２−マクログロブリンとインキュベ ートしたPSAを含む。 についての投与量応答曲線を示す。 図21は、時間経過に伴うミボレロンで刺激したLNCaP細胞の培地 中のhK２又はphK２の濃度のグラフを示す。phK２及びhK２レベル、又はphK２レ ベルを各々測定するためにモノクローナル抗体HKIG586−□−又はHK1G464−◇− を用いた。挿入されたグラフは、ミボレロンで刺激したLNCaP細胞の上清中のhK ２酵素活性を示す。 図22は、モノクローナル抗体HK1G464でのLNCaP細胞からの上清のウェスタンブ ロット分析を示す。レーン１は75mgの精製されたhK２を含む。レーン２は75mgの 精製されたphK２を含む。レーン３は***流体から単離された精製されたPSA 200 mgを含む。レーン４は５μｇのpphK２を含む。レーン５は５μｇのppPSAを含む 。レーン６〜９はミボレロン刺激後１〜４日からのLNCaP細胞の消費された培地 を含む。 図23は、モノクローナル抗体HK1G586でのLNCaP細胞からの上清のウェスタンブ ロット分析を示す。レーン１は、75mgの精製されたhK２を含む。レーン２は75mg の精製されたphK２を含む。レーン３は***流体から単離された精製されたPSA 2 00mgを含む。レーン４は５mgのpphK２を含む。レーン５は５μｇのppPSAを含む 。レーン６〜９はミボレロン刺激後１〜４日からのLNCaP細胞の消費された培地 を含む。 図24は、前立腺癌血清のパネル中のhK２の検出を示す。10人の患者からの血清 サンプルを、４〜20％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース にブロットした。各々のレーンは、前立腺癌患者からのhK２が富化されたヒト血 清10μｇを含む。レーンに抗hK２mab，HK1G587.1、レーン２：抗hK２mab HK1B10 4.1、レーン３：抗PSAmab，PSM 773、レーン４：陰性対照mab。 図25は、モノクローナル抗体HK1G586.1による前立腺癌患者からの血清中のhK ２−ACT複合体の検出を示す。レーン：mab HK1G586.1、レーン２：陰性対照mab 、レーン３：抗ACTmab，AC1A086、レ ーン４：分子量マーカー。 発明の詳細な記載 PSAに対するhK２のアミノ酸配列相同性の高さ、及びhK２及びPSAの両方の発現 が本質的に前立腺に限られるという事実は、両方のタンパク質の血清濃度を測定 することが、前立腺癌(pCa)の診断及びモニターにおいて役立ち得ることを示唆 する。現在、pphK２は細菌において発現されている(Saediら、Mol ．Cell．Endoc ，109 ，237(1995))。細菌から得られたpphK２は、hK２上の非コンホメーション 依存性エピトープに対する抗体を作り出すのに用いることができる。しかしなが ら、hK２の生合成に関連するステップを識別するため及びhK２の十分にプロセッ シングされ、分泌された形態に特異的な抗体を得るために、哺乳動物細胞におけ るhK２の発現が必要である。 本明細書に用いる場合、用語“hK２ポリペプチド”は、組換えプレプロ、プロ 及び成熟hK２ポリペプチドを含む。図１に示すアミノ酸配列（配列番号：１）を 有する成熟hK２ポリペプチド、及びhK３と実質的に相同である領域、即ち図１で 棒で示されない領域において配列番号：１と少くとも90％の相同性を有する“変 異体”ポリペプチドも含まれる。これらのhK２ポリペプチドは、該ポリペプチド がそれに特異的に結合するがhK３（又はhK１）と交差反応しない抗体によっても 規定することができる点で、図１の成熟hK２分子と共通した抗原機能も有する。 好ましくは、前記抗体は図１の成熟hK２分子上にも存在する抗原性部位又はエピ トープと反応性がある。共通の抗原性機能を規定するのに役立つ抗体は、通し番 号08/096,946に詳細に記載され、即ち、ポリクローナル抗血清は、hK２サブユニ ット41〜56に対して生体内で調製される。 “単離されたhK２核酸”は、ネイティブhK２ポリペプチドRNAもしくはDNAの非 コーディング鎖に相補的であるか、又は前記RNAもしくはDNAとハイブリダイズし てストリンジェント条件下で安定に結合し続ける生物学的に活性なhK２ポリペプ チド又はその変異体フラグメントをコードする15超、好ましくは20又はそれ超の 連続するヌクレオチド塩基を含むRNA又はDNAである。これにより、RNA又はDNAは 、核酸の天然のソースに通常関連する少くとも１の汚染する核酸を含まず、好ま しくはいずれの他の哺乳動物RNA又はDNAも実質的に含まない点で単離される。句 “通常関連する少くとも１の汚染するソース核酸を含まない”とは、その核酸が ソース又は天然細胞内に再導入されるが異なる染色***置にあるか、又はソース の細胞中では通常見い出されない核酸配列に隣接している場合を含む。単離され たhK２核酸の例は、上述の通り、図１のhK２ペプチドのhK３相同性領域と少くと も90％の配列同一性を有する生物学的に活性なhK２ポリペプチドをコードするRN A又はDNAである。hK２ポリペプチドに関して用いられる用語“単離された実質的 に相同な”とは、以下に議論される方法において定義される。 本明細書に用いる場合、用語“組換え核酸”、即ち“組換えDNADNA”は、核酸 、即ち後に試験管内で化学的に変えることができ、後に標的宿主細胞、例えば動 物、植物、昆虫、イースト、真菌又は細菌源由来の細胞に導入することができる 適切な組織源から得られ、又は単離されたDNAという。ソースから“得られた” 組換えDNAの例は、hK２又はそのフラグメントもしくは変異体をコードする有用 なフラグメントとして同定され、後に本質的に純粋な形態で化学的に合成される DNA配列であろう。ソースから“単離”されたDNAの例は、それを更に、遺伝子操 作の方法により、操作し、例えば本発明に用いるために増幅できるように、化学 的手段により、例えば 制限エンドヌクレアーゼの使用により、前記ソースから切除し又は除去される有 用なDNA配列であろう。 それゆえ、“組換えDNA”は、完全な合成DNA配列、半合成DNA配列、生物ソー スから単離されたDNA配列、及び導入されたRNA由来のDNA配列、並びにそれらの 混合物を含む。一般に、組換えDNA配列は、DNAの受容体である宿主標的細胞のゲ ノム内にもとは存在しないか、又はゲノム内に存在するが発現されないもしくは 多くは発現されない。 本明細書に用いる場合、“キメラ”とは、ベクターが少くとも２つの異なる種 からのDNAを含むか、又はその種の“ネイティブ”もしくは野生型において発生 しない様式で連結しもしくは関連している同じ種からのDNAを含む。 本明細書で形質転換のために用いられる組換えDNA配列は、環状又は連鎖状の 二本鎖又は一本鎖のものであり得る。一般に、DNA配列は結果として生ずる細胞 系中に存在する組換えDNAの発現を促進する調節配列に隣接したコーディング領 域も含み得るキメラDNAの形態、例えばプラスミドDNAである。例えば、組換えDN Aは、それ自体、哺乳動物細胞内で活性であるプロモーターを含み得、又はその 形質転換標的であるゲノム内に既に存在するプロモーターを利用し得る。このよ うなプロモーターは、CMVプロモーター、並びにSV40後期プロモーター及びレト ロウィルスLTR(長い末端反復要素)を含む。hK２又はその一部のための転写ユニ ットとして機能する組換えDNA配列と別に、組換えDNAの一部は転写されず、調節 又は構造的機能を供し得る。 “調節配列”は、特定の宿主生物における作用可能に連結されたコーディング 配列の発現のために必要なDNA配列を意味するとして定義される。原核細胞に適 した調節配列は、例えば、プロモーター 、並びに任意に、オペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知ら れている。 “作用可能に連結”とは、核酸が他の核酸配列と機能的関係におかれることを 意味するとして定義される。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのDNAは 、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるなら、ポリペ プチドのためのDNAに作用可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、 配列の転写に影響を与えるなら、コーディング配列に作用可能に連結され；又は リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするよう位置するなら、コーディング配列 に作用可能に連結される。一般に、“作用可能に連結”とは、連結されるDNA配 列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的にリーディングフェーズにある ことを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結 は、便利な制御部位における連結により行われる。これらの部位が存在しないな ら、慣用的な実施に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが 用いられる。 hK２又はその一部のための転写ユニットとして機能する組換えDNA配列とは別 に、組換えDNAの一部は翻訳されず、調節又は構造的機能を供し得る。 細胞内に導入されるべき組換えDNAは、形質転換されたことが見つけられる細 胞の集団からの形質転換された細胞の同定及び選択を容易にするために、選択マ ーカー遺伝子もしくはリポーター遺伝子のいずれか又は両方を一般に含むであろ う。あるいは、選択マーカーは、DNAの別個の断片上にあってもよく、同時形質 転換手順に用いることができる。選択マーカー及びリポーター遺伝子の両方は、 宿主細胞中での発現を可能にするために適切な調節配列に隣接させ ることができる。有用な選択マーカーは当該技術で公知であり、例えば抗生物質 及び除草剤耐性遺伝子、例えばneo，hpt，dhfr，bar，araA，dapA等を含む。 リポーター遺伝子は、形質転換された可能性のある細胞を同定するため及び調 節配列の機能性を評価するために用いられる。簡単にアッセイできるタンパク質 をコードするリポーター遺伝子は当該技術で公知である。一般に、リポーター遺 伝子は、受容体生物又は組織中に存在せず、又は発現されず、その発現が特定の 容易に検出できる特性、例えば酵素活性により顕在化されるタンパク質をコード する遺伝子である。好ましい遺伝子は、大腸菌のTn９からのクロランフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)、大腸菌のuidA座のβ−グルクロニ ダーゼ遺伝子(gus)、及びホタルホチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）から のルシフェラーゼ遺伝子を含む。リポーター遺伝子の発現は、DNAを受容細胞内 に導入した後に適切な時間、アッセイされる。 宿主細胞内で機能的な他の要素、例えばイントロン、エンハンサー、ポリアデ ニル化配列等も組換えDNAの一部であり得る。これらの要素は、DNAの機能のため に必要であってもそうでなくてもよいが、転写に影響を与えることによるDNAの 発現、mRNAの安定性等を改善し得る。これらの要素は細胞内の形質転換するDNA の最適な能力を得るために要求されるDNAに含まれ得る。 標的細胞を形質転換することができる組換えDNAを作製するための一般的な方 法は、当業者に公知であり、同じ組成物及び作製の方法は、本明細書で役立つDN Aを作るのに利用することができる。例えば、J．Sambrookら(Molecular Cloning ：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2d ed.，1989) )は、適切な作製の方法を供する。 組換えDNAは、hK２をコードするcDNAを含む発現ベクターでのトランスフェク ションにより、例えば(Chenら(Mol ．Cell．Biol.)，7，2745(1987))の改良型リ ン酸カルシウム沈殿法により、標的細胞に直ちに導入することができる。トラン スフェクションは、例えばBRLにより供される。市販のキットを用いて、リポフ ェクチンによっても行うことができる。 hK２ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物から得られる 。これらの宿主細胞は、プロセッシング及びグリコシル化活性をあわせ持つこと ができる。原則として、脊椎動物又は非脊椎動物細胞培養のいずれかからの高等 真核細胞を本発明の実施に用いることができる。非脊椎動物細胞の例は、植物及 び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウィルス株及び変異体並びに宿主、例えばス ポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)（毛虫）、アエデス・アエ ジプチ(Aedes aesypti)（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（Aedes albopictu s ）（ハエ）、ドロソフィラ・メラノガステル(Drosophila melanogaster)（ショ ウジョウバエ）、及びボンビクス・モリ(Bombyx mori)からの対応する複製を許 容する昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、Luckowら、（Bio/Technology，6 ，47（1988）；Millerら（Genetic Engineering，J．K．Setlow et al.，eds. ，Vol．8(Plenum Publishing，1986)，pp．277-279）；及びMaedaら、（Nature ，315 ，592(1985)）を参照のこと。トランスフェクションのための種々のウィル ス株、例えばオートグラファ・カリホルニア（Autographa california）NPVのＬ −１変異体及びボンビクス・モリ NPVのBm−５株が公共的に利用でき、これらの ウィルスが、例えばスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションの ために用いることができる。 制限消化物からのDNAの所定のフラグメントの回収又は単離は、 電気泳動によりポリアクリルアミド又はアガロースゲルでの消化物の分離、周知 の分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度に対する移動度の比較による関心 のフラグメントの同定：要求されるフラグメントを含むゲルセクションの除去、 及びDNAからのゲルの分離を用いることができる。例えば、Lawら(Nucleic Acids Res ．9 ，6103(1981))及びGoeddelら(Nucleic Acids Res.，8 4057(1980))を参 照のこと。 “サザン分析”又は“サザンブロッティング”は、DNA又はDNA含有組成物の制 限エンドヌクレアーゼ消化におけるDNA配列の存在が周知の標識化されたオリゴ ヌクレオチド又はDNAフラグメントへのハイブリダイゼーションにより確認され る方法である。サザン分析は、典型的には、アガロースゲルでのDNA消化物の電 気泳動での分離、電気泳動分離後のDNAの変性、及びSambrookら（前掲）のセク ション9.37〜9.52に記載される放射能標識された、ビオチニル化された、又は酵 素標識されたプローブでの分析のためのニトロセルロース、ナイロン又は他の適 切な膜支持体へのDNAの移動を含む。 “ノーザン分析”又は“ノーザンブロッティング”は、周知のプローブ、例え ばオリゴヌクレオチド、DNAフラグメント、cDNAもしくはそのフラグメント、又 はRNAフラグメントにハイブリダイズするRNA配列を同定するのに用いられる方法 である。プローブは、ビオチニル化により³²Ｐのようなラジオアイソトープで、 又は酵素で標識される。分析されるべきRNAは、通常、アガロース又はポリアク リルアミドゲルで電気泳動で分離され、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の 適切な膜に移され、そして当該技術で公知の標準的技術、例えばSambrookら（前 掲）のセクション7.39〜7.52に記載される方法を用いてプローブとハイブリダイ ズされ得る。 “ポリメラーゼ鎖反応”又は“PCR”は、所定量の予め選択され た核酸のフラグメント、RNA及び／又はDNAが米国特許第4,683,195号に記載され るように増幅される手順又は技術をいう。一般に、関心の領域の端又はそれ以上 からの配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインするのに用いられ る。これらのプライマーは、増幅されるべきテンプレートの反対側の鎖と同一又 は類似の配列であろう。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定のDNA配 列、及び全細胞RNAが転写されたcDNA、バクテリオファージ又はプラスミド配列 等を増幅するのに用いることができる。一般に、Mullisら（Cold Spring Harbor Symp ．Quant．Biol.，51 ，263（1987）Erltched.，PCR Technology(Stockton P ress，NY，1989)）を参照のこと。 “ストリンジェント条件”は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温、例 えば0.015Ｍ NaCl／0.0015Ｍクエン酸ナトリウム（SSC）；0.1％ラウリル硫酸 ナトリウム(SDS)を50℃で用いるか、又は（２）ハイブリダイゼーションの間に 変性剤、例えばホルムアミド、例えば0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％ Ficoll ／0.1％ポリビニルピロリドンを含む50％ホルムアミド／750mM NaCl，75mMクエ ン酸ナトリウムを含むpH6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液を42℃で用いる条件 である。他の例は、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％ピロリン酸ナトリウ ム、５×Denhardt's溶液、高波処理したサケ***DNA(50μｇ／ml)、0.1％ SDS、 及び10％デキストランスルフェート（42℃）及び0.2×SSC及び0.1％ SDSでの42 ℃での洗浄の使用である。 hK２ポリペプチドがヒト源のもの以外の組換え細胞内で発現される場合、hK２ ポリペプチドはヒト源のタンパク質又はポリペプチドを全く含まない。しかしな がら、hK２ポリペプチドについて実質的に均一である調製物を得るために、組換 え細胞タンパク質又はポリ ペプチドからhK２ポリペプチドを精製することが必要である。例えば、培養培地 又はライゼートは、特定の細胞デブリスを除去するために遠心することができる 。次に膜及び可溶性タンパク質画分が分離される。次にhK２ポリペプチドは可溶 性タンパク質画分から精製され、そして必要なら、培養ライゼートの膜画分から 精製することができる。次に、hK２ポリペプチドは、イムノアフィニティーもし くはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカもしくはア ニオン交換樹脂、例えばDEAEでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング ；SDS−PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばSephadex Ｇ−75を用いるゲルろ過 ；又は液体アフィニティークロマトグラフィーにより、汚染する可溶性タンパク 質及びポリペプチドから精製することができる。 生じたトランスジェニック宿主細胞から単離した後、hK２ポリペプチドの誘導 体及び変異体は直ちに調製することができる。例えば、本発明のhK２ポリペプチ ドのアミドは、カルボン酸基又は前駆体をアミドに転化するために当該技術で公 知の技術によっても調製することができる。（末端カルボキシル基におけるアミ ド形成のための好ましい方法は、ポリペプチドを固体支持体から適切なアミンで 開裂すること、又はアルコールの存在下で開裂させてエステルを作り、次に要求 されるアミンでアミノ分解を行うことである。 hK２ポリペプチドのカルボキシル基の塩は、１又は複数の等価の要求される塩 基、例えば水酸化金属塩、例えば水酸化ナトリウム；炭酸又は重炭酸金属塩、例 えば炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム；又はアミン塩基、例えばトリエチル アミン、トリエタノールアミン等に、ペプチドを接触させることにより、通常、 調製することができる。 本ポリペプチドのアミノ基のＮ−アシル誘導体は、最終的な縮合 のためのＮ−アシル保護されたアミノ酸を利用することにより、又は保護された もしくは保護されていないペプチドをアシル化することにより調製することがで きる。Ｏ−アシル誘導体は、例えば、遊離ヒドロキシペプチド又はペプチド樹脂 のアシル化により調製することができる。いずれのアシル化も、標準的なアシル 化試薬、例えばアシハハライド、無水物、アシルイミダゾール等を用いて行うこ とができる。Ｎ−及びＯ−アシル化の両方を必要なら行うことができる。更に、 図１の内部hK２アミノ酸配列は、Ｌ形態よりＤ形態を利用する置換を含む、特定 の位置を、１又は２の保存性アミノ酸置換基に置換することにより改変すること ができる。本発明は、hK２ポリペプチドの変異体又は改変形態にも関する。この ポリペプチドの１又は複数の残基は、抗原機能が保持される限り、変えることが できる。保存性アミノ酸置換、即ち、例えば酸性アミノ酸としてのアスパラギン −グルタミン酸；塩基性アミノ酸としてのリシン／アルギニン／ヒスチジン；疎 水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン、メチオニンノバリン、アラニン ノバリン；親水性アミノ酸としてのセリン／グリシン／アラニン／トレオニンが 好ましい。 ポリペプチドの酸付加塩は、そのポリペプチドを、１又は複数の等価の要求さ れる無機又は有機酸、例えば塩酸に接触させることにより調製することができる 。ポリペプチドのカルボキシル基のエステルは、当該技術で周知の通常の方法の いずれかによっても調製することができる。 単離した後、hK２ポリペプチド及びその抗原的に活性な変異体、誘導体及びフ ラグメントは、通し番号08/096,946に詳細に開示されるように、hK２又は抗hK２ 抗体を含むと予想される生物材料由来のサンプルにおけるhK２についてのアッセ イに用いることができる。例えば、hK２ポリペプチドは、検出可能.な標識で、 例えば１又は複 数の放射能標識ペプチジル残基により、標識することができ、抗hK２抗体への結 合について内因性hK２と競合するのに、即ち生理的流体のサンプル中の抗hK２抗 体に結合する“捕獲抗原”として用いることができ、固定化することができる抗 hK２抗体を用いるhK２についての種々の競合イムノアッセイ形態は、 （ａ）固体表面に結合することができる所定量の抗hK２抗体を供し； （ｂ）hK２を含む生理学的流体のサンプルを、検出可能な標識を含む周知の量 のhK２ポリペプチドと混合して混合したサンプルを作り、 （ｃ）前記抗体を、前記混合したサンプルに、該抗体と前記hK2との間に免疫 学的反応がおこり抗体−hK２複合体を形成し前記抗体と前記標識されたペプチド との間に免疫学的反応がおこり抗体−標識化ポリペプチド複合体を形成するのに 十分な時間、接触させ、 （ｄ）前記混合されたサンプルから、hK２に結合した抗体と前記標識されたポ リペプチドに結合した抗体とを分離し、 （ｅ）前記固体表面上に結合した又は前記混合されたサンプル中に残っている 標識されたポリペプチドの存在又は量を検出又は決定し、 （ｆ）前記サンプル中の前記hK２の存在又は量を、ステップ（ｅ）の結果から 決定すること により行われる。 競合阻害イムノアッセイによりサンプル中の内因性hK２を検出することができ る他の形態において、内因性hK２の未知の量を含むサンプルに周知の量の抗hK２ 抗体が添加される。その周知の量は存在すると予想されるhK２の全てと複合体形 成するのに必要とされる量より少いように選択され、例えば前立腺癌であると知 られている患 者から得られた生理的流体と同じ量のサンプル中に存在するであろう量である。 次に、検出可能な標識を含む本発明の周知の量のhK２ポリペプチド又はそのサブ ユニットが添加される。サンプル中に内因性hK２が存在するなら、標識されたhK ２ポリペプチドに結合するのにより少い抗体が利用できるであろうし、それは溶 液中で遊離しているであろう。内因性hK２が存在しないなら、添加された標識化 ポリペプチドは、添加された抗hK２抗体と複合体形成して二成分複合体を形成す るであろう。次に、その二成分抗体−抗原複合体は、抗哺乳動物IgG抗体（ヒツ ジ、ヤギ、マウス等）により沈殿する。その沈殿（三成分複合体）中の放射能又 は他の標識の量は、サンプル中に存在する内因性hK２の量に逆比例し、例えば減 少した量の放射能を含むペレットは内因性hK２の存在を示す。 研究室及び飼育動物中のポリクローナル抗体又は抗血清を調製するための慣用 的な技術のかわりに、周知のハイブリドーマ細胞培養技術を用いてhK２ポリペプ チドに対するモノクローナル抗体を調製することができる。一般に、この方法は 、例えば、ミエローマ細胞の適合する連続性の系と融合した一次牌臓細胞の、抗 体生産性融合細胞系を調製し、そして大量培養又は用いたミエローマ細胞系が得 られたもしくは適合する動物種のいずれかにおいて、その融合した細胞を増殖さ せることを含む。これらの抗体は、それらが高度に特異的かつセンシティブであ り、比較的“純粋”に免疫化学的であるので、動物の接種により生産されたもの と比較して多くの利点を与える。本抗体の免疫学的に活性なフラグメント、例え ば部分的にヒトに適応させたモノクローナル抗体であるｆ（ab）フラグメントも 本発明の範囲内である。 本発明は、以下の詳細な実施例を引用することにより更に記載されよう。実施例１ 材料及び方法 哺乳動物hK２発現ベクターの作製 図２に示す（pphK２転写物の開始部位に対してヌクレオチド＃40〜＃858の） 全プレプロhK２（pphK２）をコードするcDNA（約820bp長）を、一対のhK２特異 的オリゴヌクレオチドプライマーと共に逆転写ポリメラーゼ鎖反応(Ｒ１−PCR)を用いてヒトBPH組織のRNAから合 成した。このcDNAを（pphK２センス配列に関する）５’及び３’端が各々BamHＩ 及びPstＩ配列で夾叉されるように作った。次に、アガロースゲル電気泳動によ りcDNAを精製し、BamHＩ及びPstＩ制限酵素で消化した。その制限されたcDNAをB amHＩ−PstＩで消化したpVL139３プラスミドベクターに連結し、大腸菌HB101株 に形質転換した。pphK２cDNA／pVL1393プラスミドを有する大腸菌を選択した。 挿入物を含むpphK２を配列決定した。プラスミドpphK２cDNA／pVLl393を大腸菌 内で大量生産し、CsCl勾配超遠心により精製した。 大腸菌HB101中のプラスミドpphK２／pVL1393は、ブダペスト条約の規定におい て、America Type Culture Collection，Rockville，MD，USAに1994年５月２日 に寄託し、受託番号ATCC69614が割り当てられた。 全体のpphK２コーディング配列を示す0.8kbフラグメント（図２）を、テンプ レートとしてプライマー 並びにpphK２を含むプライマーpVLl393（Dr．Young，Mayo Clinic から得た）を用いてPCRにより作った。PCR産物をTA−クローニングベクター(Inv itrogen Corp.，San Diego，CA)に挿入して、全体の挿入物のDNAを配列決定した 。 哺乳動物hK２発現ベクターを得るために、対応するTAクローンからhK２含有挿 入物を単離し、GBMTプロモーターの制御下でプラスミドpGT−ｄ(Bergら、Nucl ． Acids Res．20 ，54-85(1992))のBcll部位に挿入した。哺乳動物発現ベクターPLN S−hK２及びPLNC−hK２を、対応するTAベクターからの0.8kb野生型hK２挿入物を プラスミドpLNSX及びpLNCX（Millerら、Biotech ，9，980(1989)）に各々クロー ニングすることにより得た。全ての哺乳動物発現ベクター内での挿入物の方向を 、DNA配列決定により確認した。 組換えクローンの形成 ゴールデンハムスターにおけるアデノウィルス誘導性腫瘍由来の細胞系である AV12−664(ATCC CRL−9595)及びDU145を、10％胎児ウシ血清(D20F)を補給したDu lbecco's改良Eagle'ｓ培地（高グルコース）内で培養した。PC３細胞を、10％胎 児ウシ血清を含む最小イーグル培地で培養した。AV12細胞に、リン酸カルシウム 法(Maniatisら、前掲(1989))を用いてhK２発現ベクターを移入した。トランスフ ェクション後３日に、細胞をD10F÷200mMメトトレキセート（MTX）に再度懸濁し た。２〜３週間後に薬剤耐性クローン細胞を単離し、それらの消費した培地をウ ェスタンブロットにより分析した。PC３及びDU145細胞に、リポフェクタミン(Gi bco−BRL，Gaithersburg，MD)を用いてhK２哺乳動物発現ベクターを移入し、ク ローン(PC３−hK２及びDU145−hK２）を、400μｇ／mlのＧ418を含む培地中で選 択した。 タンパク質の精製及び配列決定 AV12−hK２クローンを、D10F＋200mM MTX内で増殖させた。約60 ％のマンフルエンシーにおいて細胞をハンクス刺激塩溶液で洗い、無血清HH４培 地に再度懸濁した。消費された培地を、無血清消費培地の添加後７日に収集し、 −20℃で保存した。タンパク質を精製するために、その無血清消費培地を濃縮し 、50mM重炭酸ナトリウムpH８に対象した。サンプルを0.2μフィルターでろ過し 、次に５ml／分の流速で21mm×150mmのTSK DEAE−５PW HPLCカラムに直接、ポン プした。緩衝液Ａは50mM重炭酸ナトリウム／pH7.9を含んでおり、緩衝液Ｂは50m M重炭酸ナトリウム＋0.5Ｍ NaCl pH7.6を含んでいた。その溶出プロフィールを 、35分の０〜50％の緩衝液Ｂ；35〜40分の50〜100％のＢの勾配、及び５分の100 ％のＢでのアイソクラティック溶出で展開し、緩衝液Ａで再平衡化した。その流 速は全体を通して５mL／分であった。先の手順において、ホウ酸緩衝液は、重炭 酸緩衝液を顕著な差のないものに置換することができよう。 DEAE画分を、ウサギ抗pphK２（Saediら、Mol ．Cell．Endoc.，109，237(1995) ）を用いてドライド・ダウンELISA法（以下を参照のこと）によりhK２の存在に ついてアッセイした。hK２活性を有する画分をプールし、膜（10kDカットオフ） での限外ろ過により約５〜８mLに濃縮した。次に、固体の硫酸アンモニウムを1. 2Ｍの最終濃度まで加えた。次にこのサンプルを、PolyLC、ポリプロピルアスパ ルタミドカラム、1000Å孔径、4.6mm×200mmに注として疎水性相互作用クロマト グラフィー(HIC)によりタンパク質を分けた。緩衝液Ａは、20mMリン酸ナトリウ ム、1.2Ｍ硫酸ナトリウムpH6.3であり、緩衝液Ｂは50mMリン酸ナトリウム、５％ ２−プロパノール、pH7.4であった。その溶出勾配は、５分の０〜20％；５〜2 0分の20〜55％のＢの勾配、20〜23分の55％のＢでのアイソクラティック、23〜2 5分の55〜100％のＢの勾配、２分の100％のＢでのアイソクラティックであり、 次に緩衝液Ａで再度平衡化した。流速は１mL ／分であった。約50％のＢで溶出したhK２を含むHICピークを、Centricon−10（ Amicon）10Ｋ MWカットオフ超遠心でのくり返しの濃縮により50mMホウ酸緩衝液p H８に交換した。純度を、SDS−PAGE及びウェスタンブロット分析の両方により評 価した。hK２^V217濃度を評価するのに用いた吸光係数は1.84のＡ₂₈₉＝１mg／ml であった。 特定の場合において、hK２を含むHICピークを、10／30 Pharmacia Ｓ12カラ ムでのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により更に精製した。この場合、hK ２を含むHICピークを、上述のような限外ろ過により１mL未満に濃度し、次に100 mM酢酸アンモニウムpH７又はホウ酸ナトリウムpH８で平衡化したサイズ排除カラ ムに適用した。流速は0.7mL／分であった。次にhK２ピークを限外ろ過により濃 縮した。酢酸アンモニウムでのSECから収集したピークを凍結乾燥して緩衝液を 除去し、次に水で再構成した。このサンプルのアリコートを、112℃で20時間、 気体の６Ｎ HClで加水分解し、次に0.1Ｎ HCl中で再構成して、第１級アミンの ためのOPA及び第２級アミンのためのFMOCでのアミノ酸のカラム前誘導化を利用 して、Hewlett Packand Aminoquantアミノ酸アナライザーで分析した。 アフィニティークロマトグラフィーによりhK２を精製するためにHKIG 586.1ア フィニティー樹脂を用いた。HK1G586.1モノクローナル抗体(mAb)を、Schneider （J ．Biol．Chem．257，10766(1982)）に従ってPharmacia Gamma Bind plus Sep harose（cat no．17-0886）に結合させた。要約すると、HK1G586.1mAb及び樹脂 を回転させながら４℃で一晩、インキュベートした。樹脂を遠心し(500×ｇで５ 分、４℃）、0.2ＭトリエタノールアミンpH8.２で２回洗った。アミン基を室温 （22℃）で45分、新しい架橋溶液(0.2Ｍトリエタノールアミン、pH8.2中25mMの ジメチルピメリミデートジヒドロクロ ライド)中で架橋した。その樹脂を室温で５分、20mMのエタノールアミンpH8.2で 反応を止め、次に１Ｍ NaCl，0.1Ｍ PO₄，pH7.0で２回洗った。その樹脂を更に ２回PBSで洗い、使用するまで0.05％NaN₃と共に４℃で保存した。 Applied Biosystems Model 477ａパルスト液相シーケンサーを用いてタンパク 質及びペプチドを配列決定した。Model 477ａは、Ｎ末端からアミノ酸を連続的 に遊離し、次にPTH誘導化、そして逆相HPLCによるクロマトグラフィーを行うた めに自動化エドマン分解化学を用いる。そのペプチドサンプルをバイオブレン処 理したガラス繊維フィルター支持体でシーケンサーに適用し、全てのタンパク質 をバイオブレン処理したフィルターに又は予め活性化したPortonフィルター（Be ckman，Fullerton，CA）のいずれかに適用した。ブロットから配列させたサンプ ルを、最初にNovexシステム（Novex，San Diego，CA）上のミニゲルとして走ら せ、次に、Problot PVDF膜に移し、クーマシーブルーで視覚化、適切なバンドを 切り出し、そしてPVDF膜から直接配列決定した。 モノクローナル抗体生産 Ａ／Ｊマウスに１日目に完全フロイントアジュバント(CFA)中50mlのphK２を、 14日目に不完全フロイントアジュバント(IFA)中25mgのphK２を、そして28日目に PBS中25μｇのphK２を復腔内に注入した。融合前３日に、マウスをPBS中10μｇ nphK２の静脈内注入でブーストした。マウスを殺し、単一細胞懸濁液を脾臓か ら調製した。免疫Ｂ細胞を、当該技術で公知の技術を用いてＰ3．653ミエローマ 細胞に融合した。ELISAによりクローンをスクリーニングし、hK２^V217及びphK２^V217 へのその上清の反応性並びにPSAとの最小の反応性に基づいて選択した。こ れらの基準により選択した２つのクローンHK1G464及びHK1G586をFACStarプラス 細胞ソーター を用いてサブクローニングして、単一細胞をマウス脾臓フィーダー層に与えた。 サブクローンHK1G464.3及びHK1G586．１を、更なる研究のために用いた。 免疫原をhK２とし、CFA及びIFAのかわりにミョウバンを用い、BALB／ｃマウス をＡ／Ｊマウスのかわりに用いたことを除いて上述と同じプロトコルを用いる融 合によりクローンHK1H247を作った。 ELISA アッセイ クローンの無血清消費培地において及びhK２精製の間に収集した画分において hK２を測定するのにドライド・ダウンELISAを用いた。マイクロタイタープレー ト（Becton Dsckinson Labware，NJ）を50μｌの消費培地又はカラム画分で、37 ℃で一晩、コートした。そのウェルをPBS＋0.1％ Tween 20(PBST)で洗い、50μ ｌの一次抗体と共に１時間、インキュベートした。そのウェルをPBS＋Ｔで再び 洗い、37℃で１時間、50μｌの、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（１:500，Ja ckson Immunosearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA）と結合したヤギ抗 マウス−IgG又はヤギ抗ウサギ−IgGFc抗体と、一時間、インキュベートした。ウ ェルをPBSTで洗い、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（OPD，Sigma， MO）と５分、インキュベートし、ELISAリーダー(Biotek Instruments，Inc.，モ デルEL310，VT)でＡ₄₉₀において比色反応を測定した。全てのサンプルを重複し てアッセイした。ベクターのみを移入したAV12細胞からの無血清消費培地を陰性 対照として用いた。 抗体を、ビオチニル化phK２^V217，hK２^V217、及びPSAを用いて溶液ベースのEL ISAでテストした。PSAは、Sensabaugh及びBlake(J ．Urology，144，1523(1990)) の方法により精製した50μｌの緩衝液Ａ(8.82mMクエン酸、82.1mMリン酸ナトリ ウム（二塩基）、10％ BSA，0.1％マンニトール、0.1％ Nonidet Ｐ−40，pH7 .0)に 希釈したビオチニル化hK２^V217又はphK２^V21720mg又はPBS中10 ％のウマ血清（ HS）に希釈したビオチニル化PSA 0.25mgを、50μｌのハイブリドーマ上清、陰性 対照上清(即ち、phK２^V217“及びhK２^V217について無関係なハイブリドーマ上清 、又はPSAのためのHS中の20μｇ／mlの無関係な精製されたmAb)、又は陽性対照 上清（即ちPSAのためのHS中の20μｇ／mlの精製されたPSM 773(抗PSA）mAb、又 はphK２^V217及びhK２^V217についてのHK1D104(抗“hK２”)ハイブリドーマ上清と インキュベートした。hCGに対するmAbであるHCO514をPSAアッセイにおける陰性 対照として用い、tquに対するmAbであるZTG085をhK２アッセイにおける陰性対照 として用いた。 これらの抗体と抗原との混合物を、ストレプトアビジンでコートしたマイクロ タイタープレート（Labsystems，Helsinki，Finland）中で振とうしながら１時 間、インキュベートさせた。そのプレートを300μｌのPBS，0.1％ Tween−20（P BST）で３回洗い、１時間、振とうしながら、HS中に１：10,000に希釈した100m1 のγ特異的ヤギ抗マウス IgG−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート （Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.，Westgrove，PA）とインキュ ベートした。２回目のPBSで洗浄の後、50mMリン酸−クン酸緩衝液、0.03％過ホ ウ酸ナトリウムpH5.0（Sigma Chemical，St．Louis，MO）中１mg／mlのｏ−フェ ニレンジアミン100μｌを加えた後、振とうしながら30分、色を展開させた。そ の反応を、50mlの４Ｎ H₂SO₄を加えることにより止めた。その色の強度を、マイ クロタイタープレートリーダーを用いて490nm及び540nmの吸光度を測定すること により決定した。490nmにおける2.6を超える吸光度を540nmの読みで補正した。 サンプル値は３回重複の平均±標準偏差である。対照値は２回重複の平均である 。 ウェスタンブロットアッセイ 標準的な手順を用いてウェスタンブロット分析を行った。無血清消費培地をCe ntricon 10(Amicon，Inc.，Beverly，MA)を用いて10倍に濃縮し、12％ゲル（Bio -Rad，Inc，Melville，NY）を用いるSDS／PAGEにかけた。分析のため、８〜25％ 勾配ゲルを用いてPharmacia Phast SystemでSDS／PAGEを行った。電気泳動の後 、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、PBS中で２％の脱脂粉乳と共に４℃ で一晩、ブロックした。ブロットをそそぎ、次に22℃で１時間、一次抗体（腹水 の１：1000希釈、又は精製したmAbもしくはポリクローナルAbsの１μｇ／ml）と インキュベートした。次にブロットを洗い、45分、二次抗体（ヤギ抗マウスHRP 又はヤギ抗ウサギHRP，１：500，Jackson Immurosearch Laboratories，Inc.，W est Grove，PA）とインキュベートした。免疫反応性のバンドを、DAB(Sigma，St ．Louis，Mo)＋H₂O₂を用いてブロットを展開することにより、又は製造元の説明 に従ってECL(Amersham，Buckinghamshire，England)を用いることにより検出し た。 共有結合複合体形成 共有結合複合体形成についてテストするため、0.175μＭのhK２を100mMホウ酸 緩衝液中pH８で、20μＭのインヒビターとインキュベートした。テストしたイン ヒビターは、１−アンチキモトリプシン(ACT)、１−アンチトリプシン、１−ア ンチプラスミン、アンチトロンビン及び２−マクログロブリン（MG）であった。 ５μｌのhK２（10μｇ／ml）に、100mMホウ酸緩衝液中に調製した計算したμｇ のインヒビターを加え、必要に応じて、サンプルを全量10μｌにした。サンプル を37℃で３時間、インキュベートし、それに基づいて、35％の２−メルカプトエ タノールを含む、1.5μｌの７×Phast System SDSサンプル緩衝液を加え、その サンプルを水浴中で３分、煮沸した。サンプルをSDSサンプル緩衝液中１／４に 希釈した後 、SDS／PAGE及びウェスタン分析に適用した。 ペプチド基質のタンパク質分解 hk２がペプチド基質を開裂する能力を決定するために、ペプチドを10mg／mlで DMSOに溶かし、次に１：10で、PSA，hK２又はトリプシンを含む100mMホウ酸緩衝 液に希釈した。典型的な実験を次の通りに行った：１μｌのペプチドを７μｌの 100mMホウ酸緩衝液に加え、次に２μｌのhK２（10μｇ／ml）、PSA(500μｇ／ml )又はトリプシン(0.5μｇ／ml)を加えた。一般に、サンプルは37℃で16時間、イ ンキュベートした。サンプルを100μｌの0.2％ TFA／水で反応を止め、そのサン プルをAS100オートサンプラー、デュアル1350ポンプ及びBiodimension走査性UV −VISディテクターを備えたBioRad Model 800HPLCに取り付けたVydac Ｃ−18逆 相カラムに直接、適用した。溶媒Ａは0.1％ TFA／水であり、溶媒Ｂは0.1％ TFA を含むアセトニトリルであった。サンプルを90％の溶媒Ａ及び10分の60％の溶媒 Ｂに向かう勾配に適用した。220nm及び280nmにおいて同時に吸光度をモニターし た。HPLCから収集されたピークを真空遠心又は凍結乾燥により濃縮し、次にアミ ノ酸シーケンサーに適用して個々のフラグメントを同定した。特定の場合、10μ ｌの反応を止めたサンプル混合物を配列決定膜に直接適用し、その配列は知られ ているので、その開裂部位を各々のサイクルに存在するアミノ酸の分布から決定 した。 色原基質を用いるプロテアーゼアッセイ パラニトロアニリド誘導化基質の加水分解を測定するためのアッセイを、プロ グラム可能なサーモスタット７−ポジションセルホルダーを備えたHP8452A UV− VISスペクトロホトメーターを用いて行った。アッセイは37℃でインキュベート した100mMホウ酸ナトリウムpH８で行い、405nmにおける吸光度の増加をモニター した。その アッセイにおいて、メトキシスクシニル−Arg−Pro−Tyr−パラニトロアニリド （Meo−Suc−Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA）及びＨ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−パラニトロアニリ ド（Ｐ−Ｆ−Ｒ−pNA）は１mMであった。 標準的FastMoc化学を用いるABIモデル431Aペプチドシンセナイザーを、Sigma から得た＃２、アンジオテンシノゲン及び＃５、インスリンの酸化β鎖を除き、 図16に列記される全てのペプチドを合成するのに用いた。各々の合成したペプチ ドの量はES／MSを用いる質量分析(University of Michigan，Core Facility)に より確認した。上述のABIモデル477ａシーケンサーを、ペプチド配列を確認する のに用いた。 phK2^V217 のhK2^V217への変換 50mMのホウ酸ナトリウム中100〜400μｇ／mlのphK2^V217のサンプルを37℃で１ ％ｗ／ｗのトリプシン又はhK２とインキュベートした。プロから成熟への変換を 、１〜２μｇのhK2^V217出発材料の１00ml HIC緩衝液Ａへの希釈及び上述のHIC− HPLCによる２つの形態の分離によりモニターした。hK2^V217のphK2^V217とのイン キュベーションを、２つの形態の相当する量を、図７Ｂのように一緒にインキュ ベートしたことを除いて、同様に行った。実施例２ 哺乳動物細胞におけるhK2^V217の発現及び精製 哺乳動物細胞系においてhK２を発現させるために、hK２（pphK２）の全体のコ ーディング配列をコードする0.8kbフラグメント（図２）を、PCRを用いて増幅し 、ベクターPCRII（TA）にサブクローニングし、そしていくつかのクローンを単 離した。これらのクローンのいくつかにおける全体のpphK２挿入物のヌクレオチ ド配列を決定し、PCR増幅によって引きおこされ得るいずれかの変異を検出し た。２つのクローン、即ち、野生型hK２挿入物TA−hK２を有するものと変異hK２ 挿入物TA−hK2^V217を有するものとを更なる分析のために選択した。TA−hK2^V217 （配列番号：14）はhK２のコドン650においてＣのＴへの置換を含んでおり、hK ２のアミノ酸残基217におけるアラニン(GCT)のバリン(GTT)への保存性の置換を 生ずる。 哺乳動物発現ベクターを得るために、TA−hK２及びTA−hK2^V217のpphK２挿入物 をGBMTプロモーターの制御下のプラスミドPGT−ｄにサブクローニングして、プ ラスミドpGThK２及びpGThK２^V217（図３）を作った。GBMTプロモーターは、いく つかの調節配列から構成され、アデノウィルスElaタンパク質により活性化され る（Bergら、前掲（1992））。 pphK２^V217遺伝子の産物が哺乳動物細胞中で発現されるか否かを決定するため に、プラスミドpGThK２^V217をAV12−664細胞に移入した。この細胞系は、ゴール デンハムスターにおいてアデノウィルス12型により誘導された腫瘍から得られ、 Elaタンパク質を発現する。Elaタンパク質は、このプロモーターの制御下で遺伝 子産物を発現させるGBMTプロモーターを活性化する。２〜３週間後、MTX耐性の クローン細胞を単離し、それらの消費培地を、ウェスタンブロットにより分析し た。その培地内に抗pphK２抗血清に対して免疫反応するポリペプチドを分泌する いくつかのクローンを同定した。更なるキャラクタリゼーション及びタンパク質 精製のために１つのクローン（AVl2−pGThK２^V217＃２）を選択した。 hK２ポリペプチドを精製するために、AV12−pGThK２^V217クローン＃２からの 無血清消費培地を７日後に収集し、濃縮してアニオン交換クロマトグラフィーに かけた（図４Ａ）。hK２活性のピークは、ELISAアッセイにより決定して、約0.2 ＭのNaClで溶出された（点線）。ELISAアッセイは、同じ画分におけるSDS／PAGE により見 られるタンパク質の約34kDのバンドの出現と十分に相関した。アニオン交換カラ ムからのhK２−陽性画分を収集し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIL)に かけた（図４Ｂ）。Ａ₂₈₀の主要な部分はHILカラム上に保持されなかった。主な ピークはHIL上に保持され、それは22分で溶出し、ELISAアッセイにより最も高い ピークの活性を示した（点線、図４Ｃ）。約34kDの主なタンパク質バンドはSDS −PAGEによっても観察された。HILからの22分のピークを、SECで分離し、典型的 にタンパク質のＡ₂₈₀の約80〜90％が19.4分に溶出し、約34kDのタンパク質であ るのと一致した保持時間であった（図４Ｃ）。先の精製ステップにおいて約70KD タンパク質に相当する16.7画分に溶出するSECでの唯一の他のタンパク質ピーク が観察された。 精製されたタンパク質を更に、同定するために、約2.5μｇのタンパク質を自 動化Ｎ末端分析にかけて、次の配列：Val-Pro-Leu-Ileu-Gln-Ser-Arg-Heu-Val-G ly-Gly-Trp-Glu-（配列番号：15）を作り出した。エドマン分析法により連続的 に遊離されたアミノ酸のプロフィールから明らかな競合する配列はなかった。PS Aとの類似性により、このタンパク質はphK２^V217である。なぜなら、（***から 単離された）成熟PSAの周知の配列はIleu-Val-Gly-で始まり、pPSA及びphK２は そのＮ末端において更に７つのアミノ酸を有すると仮定されるからである（図２ ）。このタンパク質のアミノ酸分析は、phK２^V217の予想される配列と一致した アミノ酸組成を示した。このphK２ポリペプチドをmg量で精製した。実施例３ phK ２^V217のキャラクタリゼーション及びhK２^V217の形成 実施例２に用いた精製スキームの効率を検査するために、1.5μｇの精製したp hK２^V217を、β−トルカプトエタノール(BME)の存 在又は欠如下でのSDS／PAGEにかけ、そのゲルを銀で染色した。結果は、サンプ ル中のphK２^V217が約95％の純度であることを示した（図５）。phK２^V217はBME の欠如下で約30kDまで移動し、BMEの存在下で約34kDまで移動したことも示した 。このパターンは***から精製されたPSAについて観察されたものと似ている。 cDNA配列から予想されるhK２のアミノ酸配列は、残基78における１つの可能性 あるＮ結合グリコシル化部位の存在を示す（Ｎ−Ｍ−Ｓ）。この部位がグリコシ ル化されているか否かを決定するために、phK２^V217をSDS／PAGEにかけ、ニトロ セルロース紙に移し、ジゴキシゲニン(DIG)に結合したレクチンと、次にセイヨ ウワサビペルオキシダーゼ標識化抗DIGと反応させた。 図６（レーン１）において、２μｇのphK２がコンカナバリンＡ（ConA）で染 色されたことは、そのタンパク質中に２つの非置換化又は２−ｏ−置換化α−マ ンノシル残基の存在を示唆する。レーン２は、陽性対照グリコプロテインZCEO25 mABのConA染色を示す。このmAbの重鎖（50kD）及び軽鎖（25kD）はマンノースコ アと共にＮ結合オリゴサッカライドを含むことが知られている。レーン３は、非 グリコシル化タンパク質(BSA)がConAレクチンと反応しないことを示す。phK２^{V2 17} はPLA（Galbl−４−G1cNAc特異性）及びAAA(α（１−６）結合フコース特異性 ）とも反応した。このレクチン反応性のパターンは、複合体Ｎ結合オリゴサッカ ライドの存在と一致した。phK２^V217上のオリゴサッカライドは、シアル酸も含 んでいる。なぜならガラクトースに対するSNA(ガラクトースにα（２−６）結合 したシアル酸)及びMAA(ガラクトースにα（２−６）結合したシアル酸)の両方が phK２^V217と反応したからである。 hK２のプロ領域の配列はVP LIQSR（配列番号：12）である。このプロ配列のア ルギニンのカルボキシ末端における酵素開裂は、phK ２をhK２に変換するであろう。弱いトリプシン消化はこの位置の精製されたphK ２^V217のペプチド結合を加水分解するように開発した。phK２^V217を１％トリプ シンとインキュベートし、HPLCによりその変換をモニターした（図７）。この手 順は、phK２^V217を完全にhK２^V217に変換した。ピークで示されるhK２^V217をＮ 末端配列決定し、hK２からの成熟体についてのＮ末端である配列IVGGWEで始まる ことが示された。上述以外の配列が検出されなかったことは、この弱いトリプシ ン処理がいずれの大きなレベルの非特異的開裂を作らないことを示す。トリプシ ンで処理したサンプルのSDS／PAGEは小さいが識別できる移動度の増加を示し、 これはプロペプチドの量である826ダルトンの量の小さな減少と一致した。実施例４ hK ２特異的Absの形成 phK２^V217及びhK２^V217をhK２に対するモノクローナル抗体（mabs）を作るた めの免疫原として用いた。ハイブリドーマを、hK２^V217又はphK２^V217との高い 反応性及びPSAとの最小の反応性に基づいてスクリーニングした。ハイブリドー マから得られたmAbの例を表１に示す。phK２^V217での免疫化によりmAb HK1G586. 1及びHK1G464.3を作った。HK1G586.1はそれがphK２^V217及びhK２^V217を認識する がPSAを認識しないので、hK２特異的であった。他方、HK1G464は、それがphK２^{V 217} のみを認識し、hK２^V217又はPSAを認識しないのでphK２特異的であった。 表１ hK２^V217及びphK２^V217に対して生じた種々のmAbの特異性 Ａ． phK２^V217に対して生じたmAb Ｂ．hK２^V217に対して生じたmAb hK２^V217での免疫化によりmAb HK1H247を作った。このmAbは、hK２^V217のみを 認識し、phK２^V217又はPSAを認識しないのでhK２特異的であった。これらの結果 は、phK２^V217及びhK２^V217が異なる形態のhK２に特異的なmAbを作り出すことに おいて免疫原として役立つことを示す。 HK1G586が***中のhK２を認識するか否かを検査するためにウェスタンブロッ ト分析を用いた（図８）。約22kD、約33kD、及び約85kDのhK２免疫反応性バンド がこのmAbにより認識された。***中での同様のhK２免疫反応パターンがDeperth eら（Biochem．Biophy．Acta ．1245，311（1995））によっても現在、報告され ている。この結果は、hK２^V217に対して生じたmAbが***中のネイティブhK２を 認識することを示す。hK２^V217又はphK２^V217に対して生じた全ての抗体がhK２ 及びphK２の対応する形態も認識したことは、hK２及びphK２は、各々hK２^V217及 びphK２^V217と同様な免疫原性であることを示す（以下を参照のこと）。実施例５ 哺乳動物細胞におけるhK２の発現 哺乳動物細胞内で野生型hK２（hK２）を発現させるために、pGT hK２（図３） をAV12細胞に移入した。hK２ポリペプチドを発現するいくつかのクローンを、HK 1D106.4(hK２のアミノ酸残基17−71に相当するポリペプチドに対して生じたhK２ 特異的mAb)を用いてウェスタン分析により同定した。そのより高いhK２発現レベ ルに基づく更なる分析のために、クローンAV12−hK２＃27（AV12−hK２）を選択 した。ベクターのみを移入したクローン（pGTD）は、HK1D106.4との反応性を示 さなかった。 HK1D106.4mAbを用いるELISAは、７日目におけるAV12−hK２の無血清消費培地 中のhK２ポリペプチドの約0.5〜１μｇ／mlの存在を示した。AV12−hK２^V217か らのphK２^V217の精製に用いたのと同じ方法を用いてAV12−hK２の７日目の消費 培地からhK２ポリペプチドを精製した。これは、精製手順に対して極めて不安定 である低い収量の精製されたhK２ポリペプチドを生じ、これにより免疫原として の使用のためには実用的でなかった。 hK２ポリペプチドを上述の方法を用いて部分精製し、SDS／PAGEにかけ、エレ クトロブロットし、そしてＮ末端アミノ酸配列決定にかけた。この分析は、７日 目におけるAV12−hK２の消費培地中のhK２ポリペプチドがＮ末端に配列IVGGWELE K（配列番号：17）を有することを示した。エドマン分解法により連続的に遊離 されたアミノ酸のプロフィールから明らかになった競合配列はなかった。PSAと の比較により、この配列は成熟hK２（hK２）に相当する。このタンパク質のアミ ノ酸分析はhK２のそれとも一致した。 この発見は興味をそそる。なぜならそれは、AV12−hK２^V217の無血清培地中に 支配的なphK２^V217が７日目に存在する一方、AV12−hK２の無血清消費培地中に 支配的なhK２が７日目に存在することを示したからである。１日目においてAV12 −hK２の無血清培地中に存在するhK２の形態を検査するために、この材料を、HK 1G586.１mAbsを用いるアフィニティー精製により部分精製した。約34kDのタンパ ク質をPVDFに移し、Ｎ末端分析にかけ、配列VPLIQSRIVGGを示した。エドマン分 解法により連続的に遊離されたアミノ酸のプロフィールから明らかな競合する配 列はなかった。PSAと比べて、この配列はphK２に相当する。これは、hK２ポリペ プチドがAV12−hK２及びAV12−hK２^V217細胞の両方によりプロ形態として分泌さ れることを示唆する。しかしながら、phK２^V217は安定でありhK２^V217に転化さ れないので、phK２は不安定であり、容易に細胞外でhK２に転化される。実施例６ hK ２の生合成 哺乳動物細胞におけるhK２の生合成を更に研究するために、AV12−hK２クロー ン＃27からの無血清消費培地を８日の連続期間の各々の日に収集し、濃縮し、そ してSDS／PAGEにかける時間経過研究を行った。そのタンパク質をニトロセルロ ース膜に移し、HK1D106.4又はHK1G464.３mAbsのいずれかでプロービングした。 また、図９に示すように、HK1D106.4はphK２及びhK２の両方を認識するが、HK1G 464.3はhK２の−７〜＋７領域にそのエピトープがあるので、phK２のみを認識す る。hK２ポリペプチド（約34kD）の発現は３日目までピークであり、その後、HK 1D106.4mAbsにより検出して安定期 に入る。約70kD及び約90kDに移動する２つの他の免疫反応性バンドも４日目から 検出された。 他方、同じサンプルをブロットし、HK1G464.3でプロービングし、hK２のレベ ルの逐次的減少を４日目までに検出した。８日目に、消費培地において極めて低 レベルのhK２が見い出された。この結果は、phK２がAV12−hK２細胞により培地 に分泌され、次第にhK２を細胞外で転化することを示す。興味あることに、HK1G 464.3で約70kD及び約90kDのバンドは観察されず、このことは、これらのバンド がhK２のホモオリゴマーであるか、又はまだ知られていないタンパク質と共有結 合複合体形成したhK２であることを示す。これらのバンドの同一性はこの時知ら れていないが、それらは消費培地中のhK２の存在についてのマーカーとして機能 する。図９において、精製されたphK２^V217及びhK２^V217タンパク質を対照とし て用いた。 AV12細胞におけるhK２^V217の生合成を研究するため、同様の時間経過研究をAV 12−hK２^V217クローン＃２で行った。図10に示すように、hK２^V217の発現は３日 目までピークであり、HK1D106.4mAbsにより検出して４日目以降からあまり多く なかった。同様の結果は、そのブロットをHK1G464.3mAbsでプロービングした時 に得られた（図10）。これは、AV12−pGThK２^V217クローン＃２細胞が１日目以 降からphK２^V217を発現しており、少くとも８日目以降に、このタンパク質は成 熟形態に転化されることを示した。これらの結果は、８日間、培地中においたな らhK２に転化されるphK２のそれと対照的であり、このことは、phK２^V217が８日 間、37℃で培地中で安定であることを示す。 phK２のhK２への細胞外変換が培養においてAV12-hK２クローン＃27の生存能と 相関するか否かを研究するために、＃27細胞をトリパンブルー排除を用いて計数 した。消費培地中でのhK２の発現を、 HK1D106.4及びHK1G464.3mAbの両方を用いてELISAにより測定した。図11に示すよ うに、生存する細胞の数は３日目まで培養において3500万のピークであり、その 後次第に減少した。８日目までに、生存細胞の数は1000万未満にまで減少した（ HK1G464.3により測定した）phK２の発現も３日目までピークになり、その後次第 に減少した。 他方、（HK1D106.4により測定した）hK２の発現は３日までにピークになった が、その後安定した。この結果は、phK２はAV12−hK２細胞により分泌され、そ の画分は４日目までに次第に細胞外に転化されることを示す。更に、それは、ph K２のhK２への転化が細胞生存能の減少と明らかに相関していることを示し、こ のことは死んでいる細胞により遊離される細胞外プロテアーゼがこの転化の原因 である要因の１つであり得ることを示す。hK２の発現は、細胞が最も生存能のあ る点において最も高い。hK２の減少が細胞生存能の減少と平行していることは、 hK２が、細胞死及び溶解の後に遊離されるのと反対に、これらの細胞により分泌 されることを示唆する。また、hK２の上昇がphK２の低下に対応したことは、hK ２のプロ形態が時間の経過とともに成熟形態に自動的に転化することを示す。 前立腺癌細胞におけるhK２の生合成を検査するため、hK２をDU14５及びPC３細 胞系において発現させた。pphK２を各々CMV及びSV40プロモーターの制御下で、 プラスミドpLNCX及びpLNSX(Miller及びRosman，Bio Techniques ，7，980(1989)) にクローン化した。生じたプラスミドpLNC−hK２及びpLNS−hK２各々を各々PC３ 及びDU145細胞に移入し、そしてＧ418を含む培地中でクローンを選択した。高レ ベルのhK２を発現するクローンを、ELISA及びウェスタンブロットにより選択し た（PC３−hK２及びDU145−hK２）。 培地中でのhK２及びphK２のレベルを評価するために、CP３−hK ２及びDU145-hK２細胞の無血清培地を、HK1D106.4(hK２特異的)及びHK1G464.3（ phK２特異的）mAbsを用いるウェスタンブロットにかけた（図12）。結果は、phK ２がDU145−hK２及びPC３−hK２の両方の消費培地中に存在することを示した。 これは、前立腺癌細胞がphK２として分泌され、細胞外で成熟形態に転化される ことを示す。この発見は、AV12細胞で先に得られた結果を確認する。７日後でさ えPC３−hK２細胞の消費培地中に支配的なphK２が検出されたが、１日目から始 まるDU145−hK２の無血清培地中に支配的なhK２が存在した。これはおそらく、D U145消費培地における細胞外プロテアーゼの豊富さのためである。 上述の結果がちょうど１つのクローンに限られるか否かを検査するために、AV 12−hK２の３つの他の独立して単離されたクローン及びAV12−hK２^V217の４つの 他の独立して単離されたクローンを、hK２ポリペプチドの発現についてテストし た。クローンの無血清培地を７日目に収集し、HK1D106.4(hK２特異的)及びHK1G4 64（phK２特異的）mAbsを用いてウェスタンブロットによりhK２の発現について テストした（図13及び14）。全てのAV12−hK２クローンにおいて、HK1D106.4mAb は主要な約34kDバンド（“hK２”）ばかりでなく、hK２の存在を示す約70kD及び 約90kDのバンドも示した（図13）。HK1G464.3は、全てのAV12−hK２クローン中 で極めて低レベルのphK２を検出した（図14）。この結果は、主要なhK２が全て のAV12−hK２クローンの消費培地中に存在し、このことは、AV12−hK２＃27クロ ーンについて確立された生合成メカニズムを確かにする。同じ分析をAV12−hK２^V217 クローンで用いた（図14）。結果は、７日目にこれらのクローンの消費培地 中にphK２^V217のみが存在したことを示し、このことはAV12−hK２^V217クローン での我々の発見を確認する。 上述の結果は、要約すると、hK２が哺乳動物細胞中のプロ形態として発現され 、まだ知られていないプロテアーゼにより細胞外で成熟形態に変換されることを 示唆する。これらの結果は、phK２が生物流体中に存在し、それゆえpCa及びBPH のための有用な診断マーカーであり得ることも示唆する。実施例７ hK ２及びhK２^V217の酵素活性及び特異性 少量のhK２を、その酵素活性及び基質特異性を確立するのに十分な純度まで精 製した。hK２の一般的な活性を、ペプチドのｐ−ニトロアニリド誘導体でクロマ トグラフィーでそのアミド分解活性を決定することにより測定した（表２）。こ れらの基質のタンパク質分解消化により遊離されたｐ−ニトロアニリドを吸光度 Ａ₄₀₅において測定した。基質メトキシスクシニル−Arg−Pro−Tyr−パラ−ニト ロアニリド(MeO−Suc−Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA)を、フェニルアラニンにおいて開裂す るキモトリプシン様プロテアーゼを測定するのに用いる。この基質は、以前に、 PSAの活性を測定するのに用いられている（Chrtstenssonら、Eur ．J．Biochem. ，194 ，755(1990)）。基質Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−パラ−ニトロアニリド(Ｐ− Ｆ−Ｒ−pNA)はアルギニンを開裂するトリプシン様プロテアーゼに特異的である 。 hK２はＰ−Ｆ−Ｒ−pNA上のhK２^V217より10倍高い全体の活性を有することが 見い出され、キモトリプシン基質であるMeO−Suc−Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNAを加水分解 する能力を示すタンパク質はなかった。開裂（リシン、アルギニン）のためのト リプシン様部位を含む他の相当する基質もテストし、hK２は最も高い比率で基質 Ｐ−Ｆ−Ｒ−pNAを加水分解することが見い出された。これらの発見は、hK２が トリプシン様活性を有することを示す。 表２ 色原基質へのアミド分解活性 表２：色原基質へのhK２，hK２^V217，PSA及びトリプシンのアミド分解活性 hK２及びhK２^V217の特異性を、ペプチド結合が加水分解されていることを決定 するためのＮ末端アミノ酸配列分析と一緒にペプチド基質を用いることによりよ り詳細に検査した。図15は潜在的なトリプシン及びキモトリプシン開裂部位を有 するポリペプチド：へのアミド分解活性を示す。hK２^V217は、キモトリプシン様開裂に優る２：１の 比でトリプシン様開裂と共に、トリプシン（Ｒ−Ｋ）及びキモトリプシン（Ｙ− Ｒ）部位を開裂した。これらの実験における対照として、phK２^V217をこのペプ チドともインキュベートし、アミド分解活性がないことを示した。hK２は、この ペプチド基質に対してhK２^V217と異なる特異性を示した。この基質でのキモトリ プシン様特異性はhK２については見られず、その活性はトリプシン様部位（Ｒ− Ｋ）について排他的であった。このポリペプチド中で加水分解された他のリシン （Ｋ）残基はなく、このことは、hK２の特異性がアルギニン（Ｒ）残基について 排他的であることを示す。 対照として、この基質でトリプシンも研究した。トリプシンは、 トリプシン開裂に適する部位でないことが知られているＫ−Ｐ結合を除いて全て のリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）部位を開裂した。トリプシンは、hK２より 約４倍、hK２^V217より約4000倍速い速度で210〜236基質（ペプチド＃１、図16） のRK部位を開裂した。キモトリプシン様適合はトリプシンにより開裂されなかっ た。PSAは主にＹ−Ｒ結合を開裂した。PSAについてＲ−Ｋ結合に対する少いトリ プシン様活性も見られた（図15）。これは、色原基質でのPSAについて以前に見 られた小さなトリプシン様活性と一致した（表２）。 いくつかの他のペプチド基質もhK２及びPSAとインキュベートした（図16）。 テストした全てのペプチドにおいて、hK２は選択されたアルギニンについてのみ 特異性を示し、PSAは主に選択されたチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ） 及びロイシン（Ｌ）残基についてであった。図16のペプチド＃１のみが、図15の クロマトグラムに示すようにhK２^V217により開裂された。実施例８ hK ２によるphK２^V217の活性化 図16のペプチド＃３の配列はphK２のアミノ酸残基−７〜＋７に相当する。こ の領域はphK２^V217のＮ末端リーダーペプチドとして見い出されたプロペプチドV PLIQSRを含む。上述の通り、hK２はプロペプチド領域を遊離するこのペプチドを 開裂することができるがhK２^V217はそうでない。hK２がネイティブ基質上でこの プロ配列を開裂することができるか否かを決めるために、そのphK２^V217をhK２^{V 217} へ変換する能力をモニターした。phK２^V217を１％hK２とインキュベートし、 その変換を、HIC−HPLC法によりモニターした（図17Ａ）。結果は、hK２がphK２^V217 をhK２^V217に変換することができることを示した。但し、トリプシンより約 30倍遅い速度であっ た。phK２^V217を40％hK２^V217とインキュベートした場合、２つのhK２形態の比 率の差は６時間後においてでさえ検出されなかった（図17Ｂ）。これは、そのペ プチド基質での先の観察結果を確認し、ネイティブ基質でさえ、hK２^V217でなく hK２のみがhK２のプロ領域を開裂した。 これらの結果は、要約すると、更なるインキュベーションに基づくphK２^V217 及びhK２^V217の安定性を示す。hK２^V217と比較した場合、hK２はより高いタンパ ク質分解活性、より高い特異性を有すること、特に図15のプロペプチドでの活性 により及び図17に示されるphK２^V217に対する活性により示されるように、hK２ のプロ形態についての特異性を有することを示した。 これらの結果は、hK２とhK２^V217との間の酵素活性の大きな差を示し、phK２^{V 217} の収率と比べて、培地からhK２を精製する試みの後に得られた低い収率を説 明する助けとなり得る。hK２の高純度の調製物は、他の活性なプロテアーゼに見 られるように、自己分解のため安定でない。これらの結果は、免疫学的テストに 加えて、hK２特異的基質への酵素活性を決定するためのテストを、体液中のhK2 のレベルをモニターするのに用いることができるであろうことを示唆する。実施例９ hK ２とのインヒビター複合体の形成 PSAはα２マクログロブリン（MG）及びセリンプロテアーゼインヒビターアン チキモトリプシン(ACT)と複合体を形成することが示されている。その複合体形 成を研究するために、hK２をヒト血漿中に存在する一連の一般的なプロテアーゼ （ACT，α２−アンチプラスミン、アンチトロンビンIII、及びα１−アンチトリ プシン）とインキュベートし(Travis及びSalveseen，Ann ，Rev．Biochem.，52， 655(1983))、その混合物をウェスタンブロットにより分析した（図18）。これら のセルピンとのhK２のいずれかの共有結合複合体が還元条件下でSDS／PAGE上で 約80〜100kDのバンドを作るはずである。 ACT及びα２−アンチプラスミンは、hK２との複合体を形成した（図18、レー ン１及び２）。アンチトロンビンIII（レーン３）及びα１−アンチトリプシン （α１プロテアーゼインヒビター、レーン４）は、hK２との検出可能な複合体を 検出しなかった。血漿の主な成分であるMGも直ちにhK２と複合体形成した（レー ン５）。この複合体は、PSAを精製されたMGとインキュベートした時にも形成さ れた約200kD及び120kDのMrに相当する（図18、レーン８、以下参照）。hK２が、 このタンパク質が広範囲のトリプシン様プロテアーゼを阻害するのにもかかわら ず、α１−アンチトリプシンと複合体を形成しなかったことは特に興味がある(L oebermannら、J ．Mol．Biol，177，531（1984）；Carell及びTravis，TIB ，10， 20(1985))。 hK２がα２−アンチプラスミンと複合体を形成したことは驚かなった。なぜな らこのタンパク質はそのインヒビター活性部位にアルギニン残基を有するからで ある(Hunt及びDayhoff，Biochem ．Biophy．Res．Comm.，95，864（1980）；Chan draら、Biochemistry ，22，5055（1983）；Potempaら、Science ，241，699（198 5）；Shiethら、J ．Biol．Chem.，264，13420（1989）；Mastら、Biochemistry ，30 ，1723(1991))。hK２がACTと複合体を形成するであろうことは予想しなかっ た。なぜならACTはそのインヒビター活性部位にロイシンを有するからである。 明らかに、PSAとhK２との間の構造類似性は、それらのタンパク質分解特異性が 図16及び表２に示されるように全体的に異なるが、共通のインヒビターとの複合 体形成 に影響を与える。 ヒト女性の血清に与えた場合、ウェスタンブロットで検出されるように、hK２ は迅速にMGとの複合体を形成した（図18）。レーン１及びレーン３は各々hK２及 び血清のみの対照である。レーン２はACTとインキュベートしたhK２であり、90k D hK２−ACT複合体及び残存hK２を示す。レーン４及び５は各々15分及び１時間 、血清中にスパイクしたhK２である。レーン６は４時間、精製されたMGとインキ ュベートしたhK２である。レーン７は、15分、血清中にスパイクしたPSAであり 、レーン８は４時間、精製されたMGとインキュベートしたPSAである。 これらの結果は、MGが、生体内実験においてhK２又はPSAをヒトにスパイクし た場合に主要な複合体を形成することを示す。ACTとのPSA複合体は、前立腺の病 気の患者の血清中でおこることが知られているので、血清中に存在するhK２は特 定レベルのACTとの複合体も形成するようである。 議論 PSA又はhK２についての生体内タンパク質プロセッシング及び分泌メカニズム は未知である。本明細書に供される結果は、phK２がAV12−hK２，DU145−hK２及 びPC３−hK２細胞により分泌されることを示し、hK２は通常、phK２として分泌 され、そのプロペプチドは細胞外で開裂されることを示す。これは、phK２が生 物流体中に存在し、これによりpCa又はBPHのための有用な診断マーカーであり得 ることを示唆する。 hK２の変異形態（hK２^V217）及びhK２の野生型形態の両方をAV12細胞から精製 した。hK２は、他のプロテアーゼで見い出されるように、用いる精製手順に対し て極めて不安定であり、これは、その自己触媒特性のためであり得、免疫原及び キャリブレーターとして用 いるのに十分な量でhK２又はphK２を精製するのを極めて困難にする。対照的に 、phK２^V217は高度に安定であり、トリプシン消化により安定なhK２^V217に変換 される。精製されたphK２^V217及びhK２^V217は、hK２及びphK２に特異的なmAbを 作るための免疫原を供した。実施例10 前立腺癌細胞系上清内のhK２ポリペプチドの検出 PSAは前立腺癌(PCa)のための診断マーカーとして広く用いられるが、PSAの検 出はPCaと良性前立腺過形成とを区別することができない。phK２が前立腺癌細胞 の上清において検出することができるか否かを決定するために、hK２及びPSAの 両方を天然で分泌するLNCaP細胞からの上清を、hK２特異的抗血清とインキュベ ートした。 ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを用いる連続サンドイッチアッ セイを、phK２を測定するのに用いた。プロhK２特異的mab HK1G464をビオチン化 し、捕獲試薬として用いた。phK２及びhK２の両方を検出するMAb HK1H449を、ユ ーロピウム標識し、ディテクター試薬として用いた。時間分割した免疫蛍光をDe lfia分光計を用いて測定した。アッセイの較正は、精製されたphK２^V217を希釈 して０〜100mg／mlにレベルを変えることにより行った（図20）。***から精製 されたPSAを用いてPSAとの交差反応性についてアッセイをテストした。10μｇ／ mlのPSAは、0.1％の交差反応性であった。更に、捕獲試薬としてビオチニル化ma b HK1G586を用いて、同様に、phK２及びhK２の両方を検出するアッセイを確立し た。このアッセイについてのPSA交差反応性は0.3％であった。 LNCaP細胞を、RPMI＋10％胎児ウシ血清中80％コンフルエンスまで培養した。 その増殖培地を吸引し、そのプレートを１×PBSで洗 った。HH４＋10nMミボレロンを加え、消費培地を４日間、収集した。生存細胞を トリパンブルー染色により計数した。サンプルを４倍 phK２（HK1G464捕獲）及びphK２＋hK２（HK1G586捕獲）についてアッセイした。 更に、hK２酵素活性を、hK２特異的色原基質を用いて測定した（図21）。そのア ッセイの結果は、phK２及びhK２の両方が前立腺癌細胞により発現されることを 示した。phK２及びhK２レベルは、２日までに最大に達し、PSAレベルは増加し続 けた。hK２酵素活性が時間経過全体を通して増加したことは、phK２が時間とと もにhK２に変換されることを示唆する。 HK1G586 hK２免疫反応性に標準化したLNCaPサンプルのアリコート、並びに対 照としてのhK２，phK２，PSA，pphK２、及びppPSAサンプルを、４〜20％ Novex Tris／Gly SDS PAGEにかけ、次にニトロセルロースにエレクトロブロットした 。そのブロットを、HK1G464120μｇ／ml）又はHK1G586(2μｇ／ml)のいずれかを 一次抗体として用いてプロービングした。室温での一次抗体との２時間のインキ ュベーション後、そのブロットを洗い、ヤギ抗マウスHRP２次抗体でプロービン グした。２次抗体との室温での１時間のインキュベーション後、ECLでの展開の 前にそのブロットを洗った。その結果は、HK1G464もHK1G586もPSA又はppPSAを認 識しないことを示した（各々図22及び23、レーン３及び５）。更に、HK1G464は 、phK２のみを認識し（図22、レーン２）、hK２を認識しなかった（図22、レー ン１）ので、phK２特異的であり、HK1G586はphK２及びhK２の両方を認識した（ 各々図23、レーン１及び２）。更に、図22（レーン６〜９）は、HK1G464が全て のLNCaPサンプル中のphK2（33kDバンド）を検出したことを示し、このことはphK ２がLNCaP細胞から選択されることを示す。図22及び23におけるレーン６〜９ の各々のレーンにおいて約15ngのHK1G586免疫反応性があった。 これらの結果は、前立腺癌細胞において、hK２はphK２として分泌されること を示す。その結果は、phK２が生物流体中に存在し得、これによりPCa又はBPHの ための有用な診断マーカーであり得ることも示す。実施例11 前立腺癌患者血清におけるhK２複合体の検出 hK２ポリペプチドが生物流体中に存在するか否かを決定するために、前立腺癌 患者からの10の血清サンプルを、抗hK２mab，HK1G586.1でのウェスタンブロット により評価した。その血清標品の各々におけるPSAレベルをイムノラジオメトリ ーアッセイにより決定した（Tandem−Ｒ PSA，Hybritech，San Diego，Californ ia）。各々の血清を、抗hK２（HK1G586.1）イムノアフィニティーカラムからの 吸収及び溶出によりhK２について富化した。 豊化した血清を、200μｌの血清を、製造元の説明に従って、抗hK２ mab，HK1 G586.1と先に結合させた75μｌのAmino Link Gel（Pierce，Rockford，IL）とイ ンキュベートすることにより調製した。シェーカー上で、室温で4.5時間、イン キュベーションを行った。ビーズを、0.1％ Tween 20を含む、５mlのリン酸緩衝 塩類溶液で４回、洗った。0.5Ｍ Tris-HCl，pH8.0中2.0％のSDSの最少量でのイ ンキュベーションにより、ビーズからhK２を溶出した。 還元し、変性したタンパク質を４〜20％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し 、ニトロセルロースにブロットした。その移動の成功は、Ponceau Ｓタンパク質 染色でブロットを染色することによりチェックした。ブロットをPBS中５％の脱 脂粉乳でブロックし、次に４℃で一晩、抗体（10μｇ／ml）とインキュベートし た。洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗 体（１：2000倍希釈）を１時間、そのブロットとインキュベートし、次にPBSで 洗った。抗体反応を、PBS中10mg／mlジアミノベンジジン、0.1％過酸化水素を加 えることにより、又はECLシステム(Amersham，Arlington Heights，Illinois)を 用いて検出した。ECL検出を用いた実験において、ブロットを室温で１時間、抗 体とインキュベートし、典型的には30秒間、Ｘ線フィルムに露出した。 富化された血清サンプルの大部分（7110）は、抗hK２ mab，HK1G586.1での検 出の後に、33kDの種及び90kDの種を含んでいた（図24、レーン１）。HK1G586.1 と反応しなかった３つの血清は低レベルのPSAを含んでいた（表３）。正常な女 性の血清及び正常な男性の血清のプールは、HK1G586.1でのウェスタンブロット でも陰性であった。このデータは、血清中でのhK２のレベルがPSAのレベルと相 関するようであることを示唆する。 遊離した及び複合化したhK２を、抗hK２ mab，HK1G586.1での前立腺癌血清の ウェスタンブロット分析により検出した。前立腺癌血清を抗hK２(HK1G586.1)イ ムノアフィニティーカラムからの吸光度及び溶出によりhK２について富化した。 その溶出された材料を、抗hK２ mab，HK1G586.1でのウェスタンブロットで検査 した（図25）。レーン１において、HK1G586.1は約33kDで遊離hK２と反応した。 約90kDの高分子種もHK1G586.1で検出した。この90kD種を、抗ACTmab，AC1A086で も検出した（レーン３）。特定の抗hK２ mab及び抗ACT mAbによる免疫精製され たhK２における同じバンドの検出は、hK２−ACTとして90kD種を同定した。 抗PCI(プロテインＣインヒビター)ポリクローナル抗体での同様のブロットの プロービングはいずれのシグナルも作り出さず、このことは、hK２−PCI複合体 が、前立腺癌血清の富化された調製物中で検出することができないことを示す。 ブロットを横切って一貫し て見られる50kDのバンドは、溶出の間にイムノアフィニティー樹脂から遊離され 、次にウェスタンブロットにおいて二次抗体ヤギ抗マウスHRPにより溶出される イムノグロブリンの検出を供する。抗ACT mAbでのみ検出される約66kDの大きな バンドは遊離ACTを示す。 これにより、hK２ポリペプチドは前立腺癌患者の生物流体中に存在する。それ ゆえ、これらのポリペプチドの検出は、PCa又はBPHのための有用な診断マーカー であり得よう。 表３ HK1G586.１でのウェスタンブロット分析により前立腺癌患者におけるhK２の検出 全ての出版物及び特許は、個々に引用により組み込まれるように、本明細書に 引用により組み込まれる。本発明は示され、記載される正確な詳細に限られず、 請求の範囲に規定される本発明の精神及び範囲内にある多くのバリエーション及 び改良を行うことができる ことが理解されるはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 サエディ，モハマッド，サエイード アメリカ合衆国，カリフォルニア 92126, サン ディエゴ，ヘンドリックス ドライ ブ 7898 (72)発明者 ミコライチク，スティーブン，ディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92117, サン ディエゴ，コンラッド アベニュー 4052 (72)発明者 グローアー，ラナ アメリカ合衆国，カリフォルニア 92130, サン ディエゴ，グレンクリフ ウェイ 13686 (72)発明者 ティンドール，ドナルド，ジェイ. アメリカ合衆国，ミネソタ 55901，ロチ ェスター，テレマーク レーン 2304 (72)発明者 ヤング，チャールズ，ワイ．エフ. アメリカ合衆国，ミネソタ 55901，ロチ ェスター，メリー ドライブ ストリート エヌ．ダブリュ．5100 (72)発明者 クリー，ジョージ，ジィー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55902，ロチ ェスター，イレブンス アベニュー エ ス．ダブリュ．5949

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）phK２又はhK２に特異的に結合しhK３と大きな反応性のない所定量 の精製された抗体を、phK２又はhK２を含むヒトから得られた生理的流体のサン プルに、前記抗体の少くとも一部分と前記phK２又はhK２の一部分との間の二成 分複合体の形成を許容するのに十分な時間、接触させるステップと、 （ｂ）前記サンプル中の前記複合体の一方又は両方の量を決定し、該複合体の 一方又は両方の量を、前記ヒトにおける前立腺癌の存在又は欠如と相関させるス テップと、 を含む診断方法。 ２．前記複合体の一方又は両方の相対的な量を、前立腺癌の危険性のない又は それを患っていないヒトからの前記複合体の一方又は両方の量を代表する値と比 較することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．前記ヒトにおける前立腺癌の進行をモニターするために、所定の間隔で、 ステップ（ａ）及び（ｂ）をくり返すことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．ステップ（ａ）において、前記抗体がphK２に特異的に結合し、hK３又はh K２に結合しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．ステップ（ａ）において、前記抗体がphK２及びhK２に特異的に結合する が、hK３に結合しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ６．前記ステップ（ｂ）において、前記複合体が、phK２又はhK２に特異的に 結合が、hK３に結合しない所定量の抗体と反応し、該抗体が、検出可能な標識を 含むか又は検出可能な標識に結合して検 出可能な三成分複合体を形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．ヒトの生理的流体のサンプルからの血漿タンパク質に結合したhK２ポリペ プチドの量を決定するステップと、該結合したポリペプチドの量を、前記ヒトに おける前立腺癌の存在又は欠如に相関させるステップと、を含む診断方法。 ８．前記結合したhK２ポリペプチドの相対的な量を、前立腺癌の危険性のない 又はそれを患っていないヒトからの結合したhK２の量を代表する値と比較するこ とを特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．結合したhK２ポリペプチドの量を決定する前に、前記結合したhK２ポリペ プチドを結合していないhK２ポリペプチドから分離することを特徴とする請求項 ７に記載の方法。 10．サンプル中で、hK２ポリペプチドの全量に対する、血漿タンパク質に結合 したhK２ポリペプチドの量を決定することを含む、血漿タンパク質とのhK２複合 体形成を検出するための方法。 11．サンプル中で、血漿タンパク質に結合していないhK２ポリペプチドの量に 対する、血漿タンパク質に結合したhK２ポリペプチドの量を決定することを含む 、血漿タンパク質とのhK２複合体形成を検出するための方法。 12．結合したhK２ポリペプチドの量を決定する前に、前記結合したhK２ポリペ プチドを、結合していないhK２ポリペプチドから分離することを特徴とする請求 項10又は11に記載の方法。 13．前記結合したhK２ポリペプチドを、hK２ポリペプチドと特異的に結合する が、hK３ポリペプチドに結合しない所定量の抗体と反応させることを特徴とする 請求項７，10又は11に記載の方法。 14．前記サンプルを、hK２ポリペプチドに特異的に結合するが、hK３ポリペプ チドに結合しない所定量の抗体と反応させることを特 徴とする請求項７，10又は11に記載の方法。 15．前記抗体が、検出可能な標識を含むか、又は検出可能な標識に結合して検 出可能な三成分複合体を形成することを特徴とする請求項13に記載の方法。 16．前記抗体が、検出可能な標識を含むか、又は検出可能な標識に結合して検 出可能な三成分複合体を形成することを特徴とする請求項14に記載の方法。 17．前記血漿タンパク質がアンチキモトリプシンであることを特徴とする請求 項７，10又は11に記載の方法。 18．前記血漿タンパク質がα２−マクログロブリンであることを特徴とする請 求項７，10又は11に記載の方法。 19．前記サンプルを、アンチキモトリプシンに結合したhK２に特異的に結合す る所定量の精製された抗体と反応させることを特徴とする請求項７，10又は11に 記載の方法。 20．前記抗体が、検出可能な標識を含むか、又は検出可能な標識に結合して検 出可能な三成分複合体を形成することを特徴とする請求項19に記載の方法。 21．前記サンプルを、アンチキモトリプシンに特異的に結合する所定量の精製 された抗体と反応させることを特徴とする請求項７，10又は11に記載の方法。 22．前記抗体が、検出可能な標識を含むか、又は検出可能な標識に結合して検 出可能な三成分複合体を形成することを特徴とする請求項21に記載の方法。 23．hK２ポリペプチドに特異的に結合し、hK３に結合しない精製された抗体で あって、血漿タンパク質に結合したhK２にも結合することを特徴とする抗体。 24．前記血漿タンパク質がアンチキモトリプシンであることを特 徴とする請求項23に記載の方法。 25．別個に包装された、 （ａ）捕獲抗体に結合する固相と、 （ｂ）周知の量の検出抗体であって、phK２又はhK２に特異的に結合するがhK ３には結合しない検出抗体と、 を含む包装を含む、phK２又はhK２を検出又は測定するための診断キット。 26．別個に包装された、 （ａ）捕獲抗体に結合する固相と、 （ｂ）周知の量の検出抗体であって、hK２のプロ形態に特異的に結合するが、 hK３又はhK２には結合しない検出抗体と、 を含む包装を含むphK２を検出又は測定するための診断キット。 27．別個に包装された、 （ａ）捕獲抗体に結合する固相と、 （ｂ）周知の量の前記捕獲抗体であって、phK２又はhK２に特異的に結合する がhK３に結合しない捕獲抗体と、 を含む包装を含むphK２又はhK２を検出又は測定するための診断キット。 28．周知の量の捕獲抗体であって、少くともhK２のプロ形態に特異的に結合す るが、hK３には結合しない捕獲抗体を更に含む請求項25又は26に記載のキット。 29．前記検出抗体が、検出可能に標識されるか、又は検出可能な標識に結合す ることを特徴とする請求項25又は26に記載のキット。 30．検出可能に標識され、又は検出可能な標識に結合した検出抗体を更に含む 請求項27に記載のキット。 31．試験管内でhK２を検出する方法であって、 （ａ）所定量のhK２ポリペプチドを含むサンプルを、所定量のhK ２のためのペプチド基質と、前記hK２ポリペプチドによる前記ペプチド基質の開 裂を許容し前記ペプチド基質のサブユニットを作り出すのに十分な時間、接触さ せるステップであって、前記ペプチド基質が、前記hK２ポリペプチドが結合する 部位を形成する連続的アミノ酸残基を含むステップと、 （ｂ）前記ペプチド基質のサブユニットの存在又は量を検出又は測定するステ ップと、 を含む方法。 32．前記ペプチド基質が合成ペプチド基質であることを特徴とする請求項31に 記載の方法。 33．hK２を含むヒトの生理的流体のサンプルにおいて、血漿タンパク質に結合 していないhK２を検出又は測定するための方法であって、 （ａ）hK２に特異的に結合する所定量の精製された抗体を、テストするサンプ ルに、前記抗体の少くとも一部分と前記hK２の一部分との間の二成分複合体の形 成を許容するのに十分な時間、接触させるステップであって、前記抗体がhK３と 大きな反応性を有さず、前記抗体が、血漿タンパク質に結合したhK２と大きな反 応性を有さないステップと、 （ｂ）前記抗体と複合体形成したhK２の存在又は量を検出又は測定するステッ プと、 を含む方法。 34．ステップ（ｂ）において、前記hK２複合体を、hK２に特異的に結合しhK３ に結合しない所定量の抗体と反応させ、ここで前記抗体が、検出可能な標識を含 むか、又は検出可能な標識に結合して検出可能な三成分複合体を形成することを 特徴とする請求項33に記載の方法。 35．前記抗体が、サンプルと接触させる前に、固体表面に結合していることを 特徴とする請求項33に記載の方法。 36．前記血漿タンパク質がアンチキモトリプシンであることを特徴とする請求 項33に記載の方法。