JP2001299362A - New polypeptide and dna encoding the same - Google Patents

New polypeptide and dna encoding the same

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JP2001299362A
JP2001299362A JP2000382474A JP2000382474A JP2001299362A JP 2001299362 A JP2001299362 A JP 2001299362A JP 2000382474 A JP2000382474 A JP 2000382474A JP 2000382474 A JP2000382474 A JP 2000382474A JP 2001299362 A JP2001299362 A JP 2001299362A
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ester
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JP2000382474A
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Japanese (ja)
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Kuniji Hinuma
州司 日沼
Masashi Fukuzumi
昌司 福住
Akira Fujii
亮 藤井
Masaki Hosoya
昌樹 細谷
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new polypeptide usable as a therapeutic agent for diseases including hypertension, autoimmune diseases and cardiac insufficiency because of having physiological activity associated with e.g. anterior pituitary hormone, and useful as a reagent for screening compounds promoting or inhibiting the activity of this new peptide and therefore hopeful of serving as prophylactic/therapeutic agents for diseases including hypertension, autoimmune diseases and cardiac insufficiency, furthermore e.g. quantifiable when contained in liquid test specimens by the use of an antibody thereto because the antibody can specifically recognize this new polypeptide. SOLUTION: This new polypeptide has a physiological activity associated with anterior pituitary hormone. The 2nd objective DNA encoding this new polypeptide, and the other objective method for screening compounds promoting or inhibiting the activity of this new polypeptide are provided respectively.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は下垂体由来の新規ポ
リペプチド、その部分ペプチドおよびそれらをコードす
るＤＮＡなどに関する。特にそれ単独で活性を有する、
あるいはサブユニット構造をとることにより活性を有す
ることを特徴とする全く新規のポリペプチドに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel pituitary-derived polypeptide, a partial peptide thereof, a DNA encoding the same, and the like. In particular, it has activity alone,
Alternatively, the present invention relates to a completely novel polypeptide characterized by having an activity by taking a subunit structure.

【０００２】[0002]

【従来の技術】下垂体は脳の直下に存在する内分泌器官
であり、さまざまな生理活性物質やホルモンを分泌し、
内分泌系の中心的な役割を担っている。下垂体はその構
造上前葉、中葉、後葉に分けられ各々が特異的なホルモ
ンを分泌し、代謝、成長、生殖、恒常性維持、精神活
動、生態防御など生体の機能を調節している。これらの
ホルモンの分泌は視床下部より放出されるホルモンなど
多様な因子により調節を受けている。下垂体から分泌さ
れるホルモンは種々の組織の細胞膜上の特異的な受容体
に結合することによりその情報を細胞に伝えている。こ
れまでこのようなホルモンの多くは、その生理活性に基
づいて組織抽出物等から単離されその構造が決定されて
きた。また最近では受容体を利用して組織抽出物等から
さまざまな生理活性物質やホルモンを単離することもな
されるようになってきた。一方、最近のゲノムやcDNAの
配列解析の急速な進展により、膨大なDNA情報が入手可
能になった。これらのDNAの中にはこれまで未知であっ
た生理活性物質をコードする配列が含まれていることが
推定される。しかしゲノムDNA配列やExpressed Sequenc
e Tag（EST）から、ホルモンのような生理活性を有する
未知のポリペプチドを探そうとしても、既知の生理活性
ポリペプチドに類似した配列は、しばしばまったく無関
係な蛋白の遺伝子や非翻訳領域のDNA配列にも見出さ
れ、さらには偽遺伝子の存在の可能性もあるため、それ
らの中からどれが本当の生理活性ポリペプチドであるか
どうかを確定することは困難であった。下垂体前葉ホル
モンとしては現在までに、プロラクチン(PRL)、成長ホ
ルモン（GH）、副腎皮質ホルモン(ACTH)、甲状腺刺激ホ
ルモン(TSH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモ
ン(LH)が知られている。特にこれらのうちTSH、FSH、LH
はアルファ、ベータのサブユニット構造をとる糖蛋白質
ホルモンである。アルファ鎖はこれらのホルモンに共通
であるが、ベーター鎖は構造上の変異が大きくそれぞれ
のホルモンの特異的な生物活性はベーター鎖に由来して
いる。また、活性の発現には通常アルファ、ベータから
なるサブユニット構造が必須である。アルファ鎖は5個
のS-S結合と2個の糖結合部位を、ベーター鎖も６個のS-
S結合と一個所の糖結合部位を有している。また糖鎖も
活性の発現に重要な役割を果たしているものと考えられ
ている。（A.J.Lapthornら、Nature（1994）369、455-4
61）一方これらの下垂体前葉ホルモンの生理活性に関し
てはさまざまな報告がある。 FSHとLHは哺乳類の性腺の
増殖と分化に関して必須の因子である。FSHは精巣にお
いて***形成を促進し、卵巣では濾胞の発達を促進す
る。LHは精巣からのアンドロゲンの分泌を促進し、卵巣
では***を促進する。TSHは甲状腺の機能調節に関して
必須のホルモンである。以上のように下垂体由来の糖蛋
白質ホルモンに関しては多くの非常に重要な生理作用が
報告されている。しかしTSH、FSH、LH以外に哺乳動物で
知られている下垂体由来の糖蛋白質ホルモンはまったく
知られていなかった。2. Description of the Related Art The pituitary gland is an endocrine organ located immediately below the brain, and secretes various physiologically active substances and hormones.
It plays a central role in the endocrine system. The pituitary is structurally divided into the anterior lobe, middle lobe, and posterior lobe, each of which secretes specific hormones, and regulates biological functions such as metabolism, growth, reproduction, homeostasis, mental activity, and ecological defense. Secretion of these hormones is regulated by various factors such as hormones released from the hypothalamus. Hormones secreted from the pituitary gland transmit information to cells by binding to specific receptors on the cell membranes of various tissues. Hitherto, many of such hormones have been isolated from tissue extracts and the like based on their physiological activities, and their structures have been determined. Recently, various physiologically active substances and hormones have also been isolated from tissue extracts and the like using receptors. On the other hand, recent rapid progress in genomic and cDNA sequence analysis has made vast amounts of DNA information available. It is presumed that these DNAs contain a sequence encoding a previously unknown physiologically active substance. However, genomic DNA sequences and Expressed Sequenc
Even if you try to search for unknown polypeptides with physiological activities such as hormones from eTag (EST), sequences similar to known biologically active polypeptides often contain genes of unrelated proteins or DNA in untranslated regions. It was difficult to determine which of them were the true bioactive polypeptides, as they were also found in the sequence and could also be the presence of pseudogenes. To date, prolactin (PRL), growth hormone (GH), adrenocortical hormone (ACTH), thyroid stimulating hormone (TSH), follicle stimulating hormone (FSH), and luteinizing hormone (LH) are known as anterior pituitary hormones. Have been. Of these, TSH, FSH, LH
Is a glycoprotein hormone with an alpha and beta subunit structure. Although the alpha chain is common to these hormones, the beta chain has large structural variations and the specific biological activity of each hormone is derived from the beta chain. In addition, the expression of the activity usually requires a subunit structure consisting of alpha and beta. The alpha chain has 5 SS bonds and 2 sugar binding sites, and the beta chain has 6 S-
It has an S bond and one sugar binding site. Sugar chains are also considered to play an important role in the expression of activity. (AJ Lapthorn et al., Nature (1994) 369, 455-4
61) On the other hand, there are various reports on the physiological activities of these anterior pituitary hormones. FSH and LH are essential factors for mammalian gonad proliferation and differentiation. FSH promotes spermatogenesis in the testes and promotes follicular development in the ovaries. LH promotes androgen secretion from the testis, and promotes ovulation in the ovaries. TSH is an essential hormone for regulating thyroid function. As described above, many very important physiological actions have been reported for pituitary-derived glycoprotein hormones. However, other than TSH, FSH, and LH, no pituitary-derived glycoprotein hormone known in mammals was known at all.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】そこで、未知の下垂体
由来のポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子を見
出し、それを直接利用した、あるいはアゴニスト、アン
タゴニトを用いた疾患の予防、治療薬の開発が望まれて
いた。Therefore, it is necessary to find a polypeptide derived from an unknown pituitary gland and a gene encoding the same, and to develop a drug for preventing and treating diseases using the peptide directly or using an agonist or antagonite. Was wanted.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者たちは上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プライマー
を作製し、ヒト下垂体poly(A)+RNAを鋳型とするRT-PCR
により、新規な塩基配列を有するcDNAをクローニングす
ることに成功した。そして、本発明者らは、得られたcD
NAにコードされているポリペプチドが有用な新規下垂体
糖蛋白質ホルモンであることを見出し、これらの知見に
基づいて、さらに検討を重ねた結果本発明を完成するに
いたった。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, prepared primers and used RT-PCR using human pituitary poly (A) + RNA as a template.
As a result, a cDNA having a novel nucleotide sequence was successfully cloned. We then obtained the obtained cD
The present inventors have found that a polypeptide encoded by NA is a useful novel pituitary glycoprotein hormone, and based on these findings, have conducted further studies to complete the present invention.

【０００５】すなわち、本発明は、 （１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴
とするポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエ
ステルまたはその塩、 （２）実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：１１で
表されるアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩、 （３）実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：５で表
されるアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチ
ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
塩、 （４）実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：１３で
表されるアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩、 （５）上記（１）記載のポリペプチドの部分ペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 （６）上記（１）記載のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含有するＤＮＡ、 （７）配列番号：２、配列番号：６、配列番号：１２ま
たは配列番号：１４で表される塩基配列を有する上記
（６）記載のＤＮＡ、 （８）上記（５）記載の部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａを含有するＤＮＡ、 （９）上記（６）または（８）記載のＤＮＡを含有する
組換えベクター、 （１０）上記（９）記載の組換えベクターで形質転換さ
れた形質転換体、 （１１）上記（１０）記載の形質転換体を培養し、上記
（１）記載のポリペプチドまたは上記（５）記載の部分
ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記
（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩、または上記（５）記載の部
分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
たはその塩の製造法、 （１２）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（５）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩に対する抗体、 （１３）上記（１２）記載の抗体を用いることを特徴と
する上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩、または上記（５）
記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエ
ステルまたはその塩の定量方法、 （１４）上記（６）もしくは（８）記載のＤＮＡまたは
上記（１２）記載の抗体を含有してなる診断薬、 （１５）上記（６）または（８）記載のＤＮＡの塩基配
列に相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその
一部分を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有す
るアンチセンスＤＮＡ、 （１６）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（５）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を含有してなる剤、 （１７）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（５）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、 （１８）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（５）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上
記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしく
はそのエステルまたはその塩、または上記（５）記載の
部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
またはその塩の活性を促進または阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、 （１９）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（５）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を含有してなる上記（１）記
載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩、または上記（５）記載の部分ペプチ
ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング用キット、 （２０）上記（１８）記載のスクリーニング方法または
上記（１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、上記（５）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また
はその塩、 （２１）上記（１８）記載のスクリーニング方法または
上記（１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（５）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する
化合物またはその塩を含有してなる医薬などに関する。That is, the present invention relates to (1) a polypeptide characterized by containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its amide or its ester, or its polypeptide; (2) the polypeptide according to (1) above, wherein the substantially identical amino acid sequence is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or an amide or ester thereof, or a salt thereof, (3) a substantially identical amino acid sequence Wherein the amino acid sequence of (1) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or the amide or ester or salt thereof, or (4) the substantially identical amino acid sequence is SEQ ID NO: 13. The polypeptide according to the above (1), which is an amino acid sequence represented, or an amide or ester thereof, or a polypeptide thereof (5) a partial peptide of the polypeptide according to the above (1) or an amide or an ester thereof or a salt thereof; (6) a DN encoding the polypeptide according to the above (1)
DNA containing A, (7) DNA according to the above (6) having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, (8) the above (5) A) a DN encoding the partial peptide
DNA containing A, (9) a recombinant vector containing the DNA of (6) or (8), (10) a transformant transformed with the recombinant vector of (9), (11) ) The polypeptide according to (1) or (1), wherein the transformant according to (10) is cultured to produce and accumulate the polypeptide according to (1) or the partial peptide according to (5). A method for producing the amide or ester or salt thereof, or the partial peptide or amide or ester or salt thereof according to the above (5); (12) the polypeptide or the amide or ester thereof or the amide or salt thereof according to the above (1) An antibody against a salt, or the partial peptide according to the above (5), an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof; (12) polypeptide or its amide as described in (1) above, which comprises using the antibody described or its ester or a salt thereof, or above, (5)
(14) a diagnostic agent comprising the DNA according to (6) or (8) or the antibody according to (12); (15) Antisense DNA having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA according to the above (6) or (8) or a part thereof, and having an action of suppressing expression of the DNA; ) An agent comprising the polypeptide according to the above (1) or an amide or an ester thereof or a salt thereof, or an agent comprising the partial peptide according to the above (5) or an amide or an ester thereof or a salt thereof; The polypeptide or the amide or the ester or the salt thereof, or the partial peptide or the partial peptide according to the above (5). Is a pharmaceutical comprising an amide or an ester or a salt thereof, (18) the polypeptide of the above (1), an amide or an ester thereof or a salt thereof, or a partial peptide of the above (5) or an amide or Activity of the polypeptide according to the above (1) or its amide or its ester or its salt, or the partial peptide as described in the above (5) or its amide or its ester or its salt, characterized by using its ester or its salt. (19) The polypeptide according to the above (1) or its amide or its ester or its salt, or the partial peptide according to the above (5) or its amide or its ester or The salt A compound or a compound thereof which promotes or inhibits the activity of the polypeptide or amide or ester thereof or salt thereof described in (1) above, or the partial peptide or amide or ester thereof or salt thereof described in (5) above A salt screening kit, (20) the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof, or a salt thereof, obtained by using the screening method according to (18) or the screening kit according to (19). A compound or salt thereof that promotes or inhibits the activity of the partial peptide or amide or ester thereof or salt thereof according to (5); (21) the screening method according to (18) or the screening kit according to (19) Obtained using the above It comprises the polypeptide described in 1) or its amide or its ester or its salt, or the compound or its salt that promotes or inhibits the activity of the partial peptide or its amide or its ester or its salt described in (5) above. It relates to medicine and the like.

【０００６】さらには、本発明は、 （２２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、よ
り好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％
以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記（１）記
載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩、および （２３）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列中の１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さ
らに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）
のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１
５個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１
〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列に１〜２０個（好ましく
は１〜１５個、さらに好ましくは１〜５個、より好まし
くは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配
列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜２
０個（好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜５
個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み
合わせたアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩などを提供する。Further, the present invention relates to (22) an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably about 70% or more, Is about 80% or more, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95%
The polypeptide according to the above (1), which is an amino acid sequence having the above homology, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof; and (23) an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
1 to 20 (preferably 1 to 1)
5, more preferably 1 to 5, more preferably 1
1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: ) Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
0 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5
(More preferably 1 to 3) amino acids in which the amino acid is replaced by another amino acid, or the amino acid sequence obtained by combining the amino acids, or the amide or ester thereof or the salt thereof. And so on.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】本発明の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチ
ドと称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、
モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細
胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細
胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細
胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維
細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファー
ジ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細
胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、
視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、
胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨
髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小
腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立
腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、
または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、Ｍ
ＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，
ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯ
ＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳ
Ｂ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵ
Ｔ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，Ｊ
Ｋ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に
由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチ
ドであってもよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter, sometimes referred to as the polypeptide of the present invention) is a human. And warm-blooded animals (for example,
Cells of guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc. (eg, retinal cells, hepatocytes, splenocytes, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans) Cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils) Spheres, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells, stem cells or Cancer cells) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus,
Hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum), spinal cord, pituitary,
Stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate , Testicles, ovaries, placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscle, etc.
Or cells of blood cell lineage or cultured cells thereof (for example, M
EL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3,
HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MO
LT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-
CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HS
B-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HU
T-102, H9, U937, THP-1, HEL, J
K-1, CMK, KO-812, MEG-01) or a synthetic polypeptide.

【０００８】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約
８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ま
しくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列など
があげられる。特に、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記の
アミノ酸配列の他、 (i) 配列番号：１または配列番号：１１で表されるアミ
ノ酸配列中の１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さら
に好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (ii) 配列番号：１または配列番号：１１で表されるア
ミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さら
に好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (iii) 配列番号：１または配列番号：１１で表されるア
ミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さら
に好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）の
アミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 (iv) 配列番号：１または配列番号：１１で表されるア
ミノ酸配列中の１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さ
らに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）
のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 (v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列、 (vi) 配列番号：１のＮ末端から３６番目、５０番目、
６０番目、６４番目、８４番目、９９番目、１１５番
目、１１７番目、１２０番目、１２７番目のＣｙｓおよ
び８７番目のＡｓｎ以外のアミノ酸（残基）が他のアミ
ノ酸（残基）で置換された、または配列番号：１１のＮ
末端から３５番目、４９番目、５９番目、６３番目、８
３番目、９８番目、１１４番目、１１６番目、１１９番
目、１２６番目のＣｙｓおよび８６番目のＡｓｎ以外の
アミノ酸（残基）が他のアミノ酸（残基）で置換された
アミノ酸配列、 (vii) 配列番号：１のＮ末端から３６番目、５０番目、
６０番目、６４番目、８４番目、９９番目、１１５番
目、１１７番目、１２０番目、１２７番目のＣｙｓおよ
び８７番目のＡｓｎ以外のアミノ酸（残基）中、１〜２
０個（好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜５
個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸（残基）が
他のアミノ酸（残基）で置換された、または配列番号：
１１のＮ末端から３５番目、４９番目、５９番目、６３
番目、８３番目、９８番目、１１４番目、１１６番目、
１１９番目、１２６番目のＣｙｓおよび８６番目のＡｓ
ｎ以外のアミノ酸（残基）中、１〜２０個（好ましくは
１〜１５個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましく
は、１〜３個）のアミノ酸（残基）が他のアミノ酸（残
基）で置換されたアミノ酸配列、 (viii) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末
端から１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：
１１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番
の部分アミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、 (ix) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端
から１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番の
部分アミノ酸配列が欠失し、さらに残りのアミノ酸配列
の１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さらに好ましく
は１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が
欠失したアミノ酸配列、 (x) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端か
ら１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：１１
で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番の部
分アミノ酸配列が欠失し、さらに残りのアミノ酸配列に
１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは
１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付
加したアミノ酸配列、 (xi) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端
から１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番の
部分アミノ酸配列が欠失し、さらに残りのアミノ酸配列
の１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さらに好ましく
は１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が
挿入されたアミノ酸配列、 (xii) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端
から１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番の
部分アミノ酸配列が欠失し、さらに残りのアミノ酸配列
の１〜２０個（好ましくは１〜１５個、さらに好ましく
は１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 (xiii) 上記(viii)〜(xi)を組み合わせたアミノ酸配
列、 (xiv) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端
から１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番の
部分アミノ酸配列が欠失し、配列番号：１のＮ末端から
３６番目、５０番目、６０番目、６４番目、８４番目、
９９番目、１１５番目、１１７番目、１２０番目、１２
７番目のＣｙｓおよび８７番目のＡｓｎ以外のアミノ酸
（残基）が他のアミノ酸（残基）で置換された、または
配列番号：１１のＮ末端から３５番目、４９番目、５９
番目、６３番目、８３番目、９８番目、１１４番目、１
１６番目、１１９番目、１２６番目のＣｙｓおよび８６
番目のＡｓｎ以外のアミノ酸（残基）が他のアミノ酸
（残基）で置換されたアミノ酸配列、 (xv) 配列番号：１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端
から１〜２４番の部分アミノ酸配列または配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から１〜２３番の
部分アミノ酸配列が欠失し、配列番号：１または配列番
号：１１のＮ末端から３６番目、５０番目、６０番目、
６４番目、８４番目、９９番目、１１５番目、１１７番
目、１２０番目、１２７番目のＣｙｓおよび８７番目の
Ａｓｎ以外のアミノ酸（残基）中、１〜２０個（好まし
くは１〜１５個、さらに好ましくは１〜５個、より好ま
しくは、１〜３個）のアミノ酸（残基）が他のアミノ酸
（残基）で置換された、または配列番号：１１のＮ末端
から３５番目、４９番目、５９番目、６３番目、８３番
目、９８番目、１１４番目、１１６番目、１１９番目、
１２６番目のＣｙｓおよび８６番目のＡｓｎ以外のアミ
ノ酸（残基）中、１〜２０個（好ましくは１〜１５個、
さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３
個）のアミノ酸（残基）が他のアミノ酸（残基）で置換
されたアミノ酸配列、 (xvi) 配列番号：１のＮ末端から２５〜３６番の部分ア
ミノ酸配列または配列番号：１１のＮ末端から２４〜３
５番目の部分アミノ酸配列の１〜５個、好ましくは、１
〜３個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (xvii) 配列番号：１のＮ末端から２５〜３６番の部分
アミノ酸配列または配列番号：１１のＮ末端から２４〜
３５番目の部分アミノ酸配列に１〜５個、好ましくは、
１〜３個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (xviii) 配列番号：１のＮ末端から２５〜３６番の部分
アミノ酸配列または配列番号：１１のＮ末端から２４〜
３５番目の部分アミノ酸配列に１〜５個、好ましくは、
１〜３個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 (xix) 配列番号：１のＮ末端から２５〜３６番の部分ア
ミノ酸配列または配列番号：１１のＮ末端から２４〜３
５番目の部分アミノ酸配列の１〜５個、好ましくは、１
〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列、 (xx) 上記(xv)〜(xviii)を組み合わせたアミノ酸配列な
どがあげられる。[0008] The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, more preferably about 95% or more homology. In particular, the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, in addition to the above amino acid sequence, (i) one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11 An amino acid sequence in which ２０20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids have been deleted; (ii) SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11 An amino acid sequence in which 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids are added to the amino acid sequence represented, (iii) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence in which 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids have been inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, (iv) SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 20 amino acid sequence shown by 11 (preferably 1-15, more preferably 1-5, more preferably, 1 to 3)
(V) an amino acid sequence obtained by combining the above (i) to (iv), (vi) 36th and 50th amino acids from the N-terminal of SEQ ID NO: 1,
Amino acids (residues) other than Cys at positions 60, 64, 84, 99, 115, 117, 120, 127 and Asn at position 87 were substituted with other amino acids (residues); Or N of SEQ ID NO: 11
35th, 49th, 59th, 63rd, 8 from end
An amino acid sequence in which amino acids (residues) other than Cys at positions 3, 98, 114, 116, 119, and 126 and Asn at position 86 have been replaced with other amino acids (residues); 36th and 50th from the N-terminal of No. 1
In amino acids (residues) other than Cys at positions 60, 64, 84, 99, 115, 117, 120, 127 and Asn at position 87, 1-2
0 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5
, More preferably 1 to 3) amino acids (residues) have been replaced by other amino acids (residues), or SEQ ID NO:
35th, 49th, 59th, 63 from N-terminal of 11
, 83rd, 98th, 114th, 116th,
119th, 126th Cys and 86th As
In amino acids (residues) other than n, 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids (residues) are replaced with other amino acids (residues) (Viii) a partial amino acid sequence from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 24, or SEQ ID NO:
An amino acid sequence obtained by deleting the partial amino acid sequence of Nos. 1 to 23 from the N-terminus in the amino acid sequence represented by No. 11, (ix) an amino acid sequence of Nos. 1 to 24 from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Partial amino acid sequence or SEQ ID NO: 1
1 to 23 partial amino acid sequences from the N-terminal in the amino acid sequence represented by 1 are deleted, and 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5) (X) a partial amino acid sequence of 1 to 24 from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11
In the amino acid sequence represented by the amino acid sequence, the partial amino acid sequence of Nos. 1 to 23 from the N-terminus is deleted, and the remaining amino acid sequence has 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, More preferably, an amino acid sequence to which 1 to 3 amino acids have been added; (xi) a partial amino acid sequence of 1 to 24 from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1
1 to 23 partial amino acid sequences from the N-terminal in the amino acid sequence represented by 1 are deleted, and 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5) (Xii) an amino acid sequence having 1 to 24 amino acids from the N-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 1
1 to 23 partial amino acid sequences from the N-terminal in the amino acid sequence represented by 1 are deleted, and 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5) (More preferably, 1 to 3) amino acids are substituted with other amino acids; (xiii) an amino acid sequence obtained by combining the above (viii) to (xi); (xiv) SEQ ID NO: 1. No. 1 to 24 from the N-terminus in the amino acid sequence
1 to 23 partial amino acid sequence from the N-terminus in the amino acid sequence represented by 1, is deleted, 36th, 50th, 60th, 64th, 84th,
99th, 115th, 117th, 120th, 12th
Amino acids (residues) other than Cys at position 7 and Asn at position 87 have been substituted with other amino acids (residues), or 35, 49, and 59 from the N-terminal of SEQ ID NO: 11.
Th, 63rd, 83rd, 98th, 114th, 1st
16th, 119th, 126th Cys and 86
An amino acid sequence in which an amino acid (residue) other than the nth Asn is replaced with another amino acid (residue); (xv) a partial amino acid from the N-terminus to the 24th amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Sequence or SEQ ID NO: 1
1 to 23 partial amino acid sequences from the N-terminus in the amino acid sequence represented by 1 are deleted, and SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11, 36, 50, 60,
Of amino acids (residues) other than Cys at position 64, 84, 99, 115, 117, 120, and 127 and Asn at position 87, 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 15) Has 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids (residues) substituted with other amino acids (residues), or the 35th, 49th, and 59th amino acids from SEQ ID NO: 11 Th, 63rd, 83rd, 98th, 114th, 116th, 119th,
Of amino acids (residues) other than Cys at position 126 and Asn at position 86, 1 to 20 (preferably 1 to 15,
Still more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3
Amino acids (residues) are substituted with other amino acids (residues), (xvi) a partial amino acid sequence from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 to position 25 to 36, or an N-terminus of SEQ ID NO: 11 From 24 to 3
1 to 5, preferably 1 of the fifth partial amino acid sequence
(Xvii) a partial amino acid sequence at positions 25 to 36 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 or 24- to
1 to 5, preferably 35 amino acids in the partial amino acid sequence,
(Xviii) a partial amino acid sequence of Nos. 25 to 36 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 or 24-amino acids from the N-terminus of SEQ ID NO: 11
1 to 5, preferably 35 amino acids in the partial amino acid sequence,
(Xix) a partial amino acid sequence at positions 25 to 36 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 or 24-3 from the N-terminus of SEQ ID NO: 11
1 to 5, preferably 1 of the fifth partial amino acid sequence
And (xx) an amino acid sequence obtained by combining the above (xv) to (xviii), and the like.

【０００９】本発明の配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドとしては、例えば、前記の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなど
が好ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、本
発明のポリペプチドの有する活性（例えば、後述の疾患
の予防・治療活性、受容体との結合活性、受容体発現細
胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性等）など
があげられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質
的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であ
ることを示す。本発明のポリペプチドに対する受容体と
しては、種々の受容体のうち、本発明のポリペプチドと
結合活性を有し、本発明のポリプチドにより該受容体発
現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ 2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ
生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ
の活性化、ｐＨの低下などを促進する活性等）が観察さ
れるものなどがあげられる。具体的には、 LGR4（AOMF05）（Molecular Endocrinology(1998)1
2、1830-1845； WO 99/15545号）、 LGR5（HG38）（Molecular Endocrinology(1998)12,
1830-1845；BBRC（1998）247、266-270； WO 99/15660
号）、 LGR7（WO 99/48921号） ＦＳＨ受容体、 ＬＨ受容体、 ＴＳＨ受容体 などがあげられる。 配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列としてより
具体的には、例えば配列番号：５で表されるアミノ酸配
列（すなわち、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から１〜２４番の部分アミノ酸配列が欠失したア
ミノ酸配列）、配列番号：１１で表されるアミノ酸配
列、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列（すなわ
ち、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１〜２３番目の部分アミノ酸配列が欠失したアミノ酸
配列）などがあげられる。The amino acid represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention
Polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the acid sequence
The tide is represented, for example, by the aforementioned SEQ ID NO: 1.
Having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence
Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
Polypeptides having substantially the same activity as the peptide
Is preferred. Examples of substantially equivalent activities include, for example,
The activity possessed by the polypeptide of the invention (for example, the diseases described below)
Prevention / treatment activity, receptor binding activity, receptor expression
Cell stimulating activity on vesicles (eg, arachidonic acid release,
Acetylcholine release, intracellular Ca2+Free, intracellular cAM
P production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production
Raw, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, cf
activity to promote os activation, pH reduction, etc.)
Is raised. Substantially the same quality means that their activity is
(Eg, physiochemically or pharmacologically) homogeneous
Indicates that A receptor for the polypeptide of the present invention;
Thus, among various receptors, the polypeptide of the present invention
It has a binding activity and the receptor of the present invention is expressed by the polypeptide of the present invention.
Cell stimulating activity of the current cell (eg, arachidonic acid release,
Cetylcholine release, intracellular Ca 2+Free, intracellular cAMP
Production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production,
Cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos
Activation, activity to promote pH reduction, etc.)
And the like. Specifically, LGR4 (AOMF05) (Molecular Endocrinology (1998) 1
2, 1830-1845; WO 99/15545), LGR5 (HG38) (Molecular Endocrinology (1998) 12,
1830-1845; BBRC (1998) 247, 266-270; WO 99/15660
No.), LGR7 (WO 99/48921), FSH receptor, LH receptor, TSH receptor and the like. As an amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1
Specifically, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
Sequence (ie, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1)
An amino acid sequence in which the partial amino acid sequence of positions 1 to 24 has been deleted from the N-terminus
Amino acid sequence), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
Column, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 (i.e.,
The N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
Amino acids in which the partial amino acid sequence of amino acids 1 to 23 is deleted
Sequence).

【００１０】本明細書におけるポリペプチドは、ペプチ
ド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右
端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをは
じめとする、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端が通常カ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート
(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮ
Ｈ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチ
ルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、
シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例え
ば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、
例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2
アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフ
チル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほ
か、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシ
メチル基などが用いられる。本発明のポリペプチドがＣ
末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）
を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエ
ステル化されているものも本発明のポリペプチドに含ま
れる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ
末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のポ
リペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニ
ン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、ア
セチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基
など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成
するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化した
もの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−Ｏ
Ｈ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール
基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホル
ミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などの
Ｃ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは
糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパ
ク質なども含まれる。本発明のポリペプチド中、糖鎖が
結合（付加）する部位は、糖鎖が結合しうる部位であれ
ば特に限定はされないが、例えば配列番号：１のＮ末端
から８７番目または配列番号：１１のＮ末端から８６番
目のＡｓｎなどがあげられる。糖鎖を構成する糖として
は、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｌ−フコース、シアル酸などがあげられ
る。糖鎖との結合様式は、Ｎ−グリコシド結合（Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンとＡｓｎ間の結合）、Ｏ−グ
リコシド結合（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＳ
ｅｒまたはＴｈｒ間の結合、Ｄ−ガラクトースとヒドロ
キシリシン間の結合）などがあげられるが、本発明のポ
リペプチドの結合様式はＮ−グリコシド結合（Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンとＡｓｎ間の結合）であること
が好ましい。またそのＮ−グリコシド結合のＡｓｎ糖鎖
構造としては、高マンノース型、複合型および混合型が
あげられる。[0010] In the present specification, the polypeptide has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling. SEQ ID NO: 1
The polypeptide of the present invention, including the polypeptide containing the amino acid sequence represented by the following formula, usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate at the C-terminus.
(—COO − ), but the C-terminal is an amide (—CON
H 2 ) or an ester (—COOR).
Here, as R in the ester, for example, methyl,
A C 1-6 alkyl group such as ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example cyclopentyl,
C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclohexyl, for example, C 6-12 aryl groups such as phenyl, α-naphthyl,
For example, phenyl-C 1-2 such as benzyl and phenethyl
In addition to an alkyl group or a C 7-14 aralkyl group such as an α-naphthyl-C 1-2 alkyl group such as α-naphthylmethyl, a pivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester and the like are used. The polypeptide of the present invention may comprise C
Carboxyl group (or carboxylate) other than at the end
When the carboxyl group is amidated or esterified, it is also included in the polypeptide of the present invention. Examples of the ester in this case include the above-mentioned C
A terminal ester or the like is used. Further, the polypeptides of the present invention, amino acid residues (eg, methionine residue) of the N-terminal amino group protecting group (e.g., formyl group, such as C 1-6 alkanoyl such as acetyl group C 1-6 Acyl-group-protected), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine-oxidized, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, -O
H, -SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc. are suitable protecting groups (for example, C 1-6 acyl groups such as C 1-6 alkanoyl groups such as formyl group and acetyl group). Protected proteins and complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound are also included. In the polypeptide of the present invention, the site to which the sugar chain is bonded (added) is not particularly limited as long as it is a site to which the sugar chain can be bonded. And the 86th Asn from the N-terminus. Examples of the sugar constituting the sugar chain include N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, D-mannose, D-galactose, L-fucose, sialic acid, and the like. The manner of bonding to the sugar chain is as follows: N-glycoside bond (bond between N-acetyl-D-glucosamine and Asn), O-glycoside bond (N-acetyl-D-galactosamine and S
er or Thr, a bond between D-galactose and hydroxylysine) and the like, and the binding mode of the polypeptide of the present invention is an N-glycoside bond (a bond between N-acetyl-D-glucosamine and Asn). It is preferable that Examples of the N-glycoside-linked Asn sugar chain structure include a high mannose type, a complex type and a mixed type.

【００１１】本発明のポリペプチドの具体例としては、
例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、配列番号：１１で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド、配列番号：５で表わされるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１３で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげら
れる。本発明のポリペプチドの部分ペプチドとしては、
前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドであれば
いかなるものでもよい。本発明のポリペプチドの部分ペ
プチドとして具体的には、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列のＮ末端から２５〜３５番目の部分アミノ酸配
列からなるペプチド、１２１〜１３０番目の部分アミノ
酸配列からなるペプチドまたは配列番号：１１で表され
るアミノ酸配列のＮ末端から２４〜３４番目の部分アミ
ノ酸配列からなるペプチド、１２０〜１２９番目の部分
アミノ酸配列からなるペプチドなどがあげられる。ま
た、本発明の部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１
〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失し、
または、そのアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは、１
〜３個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配
列に１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿
入され、または、そのアミノ酸配列中の１〜５個（好ま
しくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列を含有していてもよく、それらを組み
合わせたアミノ酸配列を含有していてもよい。また、本
発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−
ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ―）であ
るが、前記した本発明のポリペプチドのごとく、Ｃ末端
がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯ
Ｒ）（Ｒは上記と同意義を示す）であってもよい。さら
に、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のポリ
ペプチドと同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオ
ニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、
Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピ
ログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上
の置換基が適当な保護基で保護されているものなども含
まれる。また、本発明の部分ペプチドは抗体作成のため
の抗原として用いることができるので、必ずしも本発明
のポリペプチドの有する活性を有する必要はない。[0011] Specific examples of the polypeptide of the present invention include:
For example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 Examples include polypeptides having the amino acid sequence represented. As the partial peptide of the polypeptide of the present invention,
Any peptide may be used as long as it is a partial peptide of the polypeptide of the present invention. Specifically, the partial peptide of the polypeptide of the present invention is a peptide consisting of the partial amino acid sequence at positions 25 to 35 from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and consisting of the partial amino acid sequence at positions 121 to 130. Peptides or peptides consisting of the partial amino acid sequence at positions 24 to 34 from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, peptides comprising the partial amino acid sequence at positions 120 to 129, and the like. In addition, the partial peptide of the present invention has 1 amino acid in its amino acid sequence.
~ 5 (preferably 1-3) amino acids are deleted,
Alternatively, 1 to 5 (preferably 1 to 5)
~ 3) amino acids are added, or 1-5 (preferably 1-3) amino acids are inserted into the amino acid sequence, or 1-5 (preferably, (1-3) amino acids may contain an amino acid sequence substituted with another amino acid, or may contain an amino acid sequence obtained by combining them. In the partial peptide of the present invention, the C-terminus usually has a carboxyl group (-
COOH) or carboxylate (—COO − ), but the C-terminal is amide (—CONH 2 ) or ester (—COO − ) as in the aforementioned polypeptide of the present invention.
R) (R is as defined above). Furthermore, the partial peptide of the present invention has an N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) in which the amino group is protected with a protecting group, similarly to the polypeptide of the present invention described above.
Glutamine residues generated by cleavage of the N-terminal side in vivo are pyroglutamine-oxidized, and those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group are also included. Further, since the partial peptide of the present invention can be used as an antigen for preparing an antibody, it is not necessary to have the activity of the polypeptide of the present invention.

【００１２】本発明のポリペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその部分ペプチドもしくは
そのアミドもしくはそのエステルの塩としては、生理学
的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、
アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理
学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩と
しては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、
メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが
用いられる。本発明のポリペプチドまたはその塩は、前
述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知の
ポリペプチドの精製方法によって製造することもできる
し、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転
換された形質転換体を培養することによっても製造する
ことができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製
造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞
から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞を
ホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液
を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることによ
り精製単離することができる。The salts of the polypeptide or amide or ester thereof or partial peptide or amide or ester thereof of the present invention include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids and organic acids) and bases (eg,
For example, a salt with an alkali metal salt) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid,
For example, salts with methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid) are used. The polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced from a human or warm-blooded animal cell or tissue by a known method for purifying a polypeptide, or can be transformed with a DNA encoding the polypeptide described below. Can also be produced by culturing the transformed transformant. Further, it can also be produced according to the peptide synthesis method described later. When producing from human or mammalian tissues or cells, the homogenized human or mammalian tissues or cells are extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.

【００１３】本発明のポリペプチド、部分ペプチド、も
しくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成に
は、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることが
できる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４
−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フ
ェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmoc
アミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチド
の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上
で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切
り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液
中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の
ポリペプチド、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を
取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポ
リペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いるこ
とができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボ
ジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボ
ジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）
カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化
にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)ととも
に保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸
無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとし
てあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂
に添加することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂
との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合
反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択
されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドン
などの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどの
ハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどの
アルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシ
ド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなど
のエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなど
のニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル
類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反
応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ること
が知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃
〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミ
ノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニン
ヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場
合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返
すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を
繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢
酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸
をアセチル化することによって、後の反応に影響を与え
ないようにすることができる。For the synthesis of the polypeptide, partial peptide, salt thereof, or amide thereof of the present invention, a commercially available resin for polypeptide synthesis can be generally used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4
-(2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc
Aminoethyl) phenoxy resin and the like. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target polypeptide according to various condensation methods known per se. At the end of the reaction, the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target polypeptide, a partial peptide, or an amide thereof. . For the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for polypeptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. Carbodiimides include DCC, N, N'-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl)
Carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid was added directly to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added later to the resin. The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin may be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide condensation reaction. For example, N, N-dimethylformamide,
Acid amides such as N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethylsulfoxide, pyridine, dioxane, tetrahydrofuran and the like Ethers, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from the range that can be used for the polypeptide bond formation reaction, and is usually about -20 ° C.
The temperature is appropriately selected from the range of ~ 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole to prevent the subsequent reaction from being affected.

【００１４】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボ
ルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、
例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、
シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２
−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アル
キルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベ
ンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メ
トキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステ
ル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル
化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブト
キシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化な
どによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル
基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などが用いられる。また、エーテル化に適する
基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニ
ル基、t-ブチル基などである。チロシンのフェノール性
水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−
ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニ
ル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmoc
などが用いられる。Examples of the amino-protecting group for the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, Trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2
-Nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used. The carboxyl group is
For example, alkyl esterification (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl,
Cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2
Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as adamantyl), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification) , Phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like. The hydroxyl group of serine is
For example, it can be protected by esterification or etherification. Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group. Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include, for example, Bzl, Cl 2 -Bzl,
Nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As a protecting group for imidazole of histidine, for example,
Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc
Are used.

【００１５】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ-炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。原料の
反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、
およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性
化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しう
る。Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used. As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon,
Also, acid treatment with anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia Also used. The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C,
In the acid treatment, for example, anisole, phenol,
It is effective to add a cation scavenger such as thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like. Protection of functional groups that should not participate in the reaction of the raw materials, as well as protecting groups,
The elimination of the protecting group and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.

【００１６】本発明のポリペプチドもしくは部分ペプチ
ドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、
カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド
化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチ
ド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ
末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチド
とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリ
ペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したよ
うな混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細について
は上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプ
チドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除
去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この
粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製
し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド
もしくは部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチドもしくは部分ペプチドのエステル
体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−
カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸
エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にし
て、所望のポリペプチドもしくは部分ペプチドのエステ
ル体を得ることができる。As another method for obtaining an amide of the polypeptide or partial peptide of the present invention, for example,
After amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (polypeptide) chain is extended to a desired chain length on the amino group side.
A polypeptide from which only the terminal α-amino group protecting group has been removed and a polypeptide from which only the C-terminal carboxyl group protecting group has been removed are produced, and both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. . Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude polypeptide. This crude polypeptide is purified by various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired polypeptide or partial peptide.
To obtain an ester of the polypeptide or partial peptide of the present invention, for example, α-
After condensing the carboxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired polypeptide or partial peptide can be obtained in the same manner as the amide of the polypeptide.

【００１７】本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自
体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の
ポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによ
って製造することができる。ペプチドの合成法として
は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによって
も良い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る
部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法があげられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって適当な塩に変換することができる
し、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明のポリペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを
用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain R
eaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増
幅することもできる。The partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in (1) to (4) below. M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Thereafter, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained as a salt, a known method or analogous method It can be converted into a free form or another salt by a method. DNA encoding the polypeptide of the present invention
May be any as long as it contains a base sequence encoding the polypeptide of the present invention described above. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Also, Reverse Transcriptase Polymerase Chain R is directly used by using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
It can also be amplified by eaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method).

【００１８】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２または配列番号：１２
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番
号：２または配列番号：１２で表わされる塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどであれ
ば何れのものでもよい。配列番号：２または配列番号：
１２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条
件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、
それぞれ配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％
以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブ
リダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準
じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Mole
cular Cloning）２nd（J. Sambrook etal., Cold Sprin
g Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従っ
て行なうことができる。また、市販のライブラリーを使
用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行
なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェ
ントな条件に従って行なうことができる。ハイストリン
ジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９
〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約
５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示
す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５
℃の場合が最も好ましい。DNA encoding the polypeptide of the present invention
For example, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12
Or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12, and substantially differs from the polypeptide of the present invention. Any DNA may be used as long as it encodes a polypeptide having the same activity. SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO:
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by 12 under high stringent conditions include, for example,
Each of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and about 70%
Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90%
% Or more, more preferably about 95% or more. Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, molecular cloning (Mole
cular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Sprin)
g Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions. High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19
４０40 mM, preferably about 19-20 mM, and a temperature of about 50-70 ° C., preferably about 60-65 ° C. In particular, a sodium concentration of about 19 mM and a temperature of about 65
C is most preferred.

【００１９】本発明のポリペプチドと実質的に同質の活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、
例えば配列番号：６または配列番号：１４で表される塩
基配列を有するＤＮＡなどがあげられる。より具体的に
は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：
２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れる。また、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を
含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を
含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられる。さらに、配列番号：１３で表されるアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと
しては、配列番号：１４で表される塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが用いられる。本発明の部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチド
をコードする塩基配列を含有するものであればいかなる
ものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成
ＤＮＡのいずれでもよい。DNA encoding a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide of the present invention includes:
For example, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 14 is exemplified. More specifically, the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes SEQ ID NO:
DNA containing the base sequence represented by 2 or the like is used. As the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the like are used. As the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the like is used. Furthermore, as the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or the like is used. The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. In addition, genomic DNA, genomic DN
A library, cDNA derived from the cells and tissues described above,
Any of the cell / tissue-derived cDNA library and synthetic DNA described above may be used.

【００２０】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２または配列番号：１２
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を
有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：１
２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリ
ペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：２または配列番号：１２で表わ
される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記
と同意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法および
ハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用い
られる。配列番号：２または配列番号：１２で表わされ
る塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡでコードされ
るポリペプチドは後述の本発明のポリペプチドの製造法
と同様にして製造することができ、該ポリペプチドのア
ミド、エステル、塩は上述の本発明のポリペプチドのア
ミド、エステル、塩と同様のものなどがあげられる。DNA encoding the partial peptide of the present invention
For example, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12
DNA having a partial base sequence of the DNA having the base sequence represented by: or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 1
DNA having a base sequence that hybridizes under high stringent conditions to the base sequence represented by 2, and having a partial base sequence of DNA encoding a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide of the present invention. Are used. DNAs capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12 have the same significance as described above. The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used. The polypeptide encoded by the DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 12 can be produced in the same manner as the method for producing the polypeptide of the present invention described below. Examples of the amide, ester, and salt include those similar to the above-mentioned amide, ester, and salt of the polypeptide of the present invention.

【００２１】また、本発明の部分ペプチドをコードする
ＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：１で表される
アミノ酸配列のＮ末端から２５〜３５番目の部分アミノ
酸配列もしくは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から２４〜３４番目の部分アミノ酸配列からな
るペプチドまたは配列番号：１で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から１２１〜１３０番目の部分アミノ酸配列も
しくは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列のＮ末端
から１２１〜１３０番目の部分アミノ酸配列からなるペ
プチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、またはこれらとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを含有す
るＤＮＡなどがあげられる。More specifically, the DNA encoding the partial peptide of the present invention is more specifically represented by the partial amino acid sequence at the 25th to 35th positions from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11. A peptide consisting of the partial amino acid sequence at positions 24-34 from the N-terminus of the amino acid sequence or the partial amino acid sequence at positions 121-130 from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11 DNA containing a nucleotide sequence encoding a peptide consisting of a partial amino acid sequence at positions 121 to 130 from the N-terminus of the amino acid sequence, or a DNA having a nucleotide sequence that hybridizes with these under high stringency conditions. Contained DNA and the like.

【００２２】本発明のポリペプチドもしくはその部分ペ
プチドまたは本発明のポリペプチドもしくはその部分ペ
プチドをコードするＤＮＡは、自体公知の方法で標識化
されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化さ
れたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセイ
ンなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは
酵素標識されたものなどがあげられる。本発明のポリペ
プチドまたは部分ペプチド（以下、これらポリペプチド
等をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明
においては、これらポリペプチド等を単に本発明のポリ
ペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤ
ＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプ
チドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用
いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適
当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチ
ドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしく
は合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼ
ーションによって選別することができる。ハイブリダイ
ゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法
などに従って行なうことができる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行なうことができる。The polypeptide of the present invention or its partial peptide or the DNA encoding the polypeptide of the present invention or its partial peptide may be labeled by a method known per se, and specifically, isotope-labeled. , Fluorescently labeled (eg, fluorescent labeling with fluorescein), biotinylated or enzyme-labeled. The polypeptide or the partial peptide of the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of DNAs encoding these polypeptides and the like, these polypeptides and the like may be simply abbreviated to the polypeptide of the present invention) may be completely encoded. D
As a means for cloning NA, amplification by a PCR method known per se using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the polypeptide of the present invention, or DNA incorporated into an appropriate vector, Selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the region or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods are described, for example, in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.

【００２３】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、MutanTM-superExpress Km（宝酒造
（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA
-LAPCR法やGapped duplex法やKunkel法等の自体公知の
方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことが
できる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素
で消化したり、リンカーを付加したりして使用すること
ができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドン
としてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コ
ドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していて
もよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、
適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもで
きる。The DNA base sequence can be converted by ODA using PCR or a known kit such as Mutan ™ -superExpress Km (Takara Shuzo) or Mutan ™ -K (Takara Shuzo).
-The method can be carried out according to a method known per se, such as the LAPCR method, the gapped duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto. D encoding the cloned polypeptide
NA can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation start codon and translation stop codon
It can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.

【００２４】本発明のポリペプチドの発現ベクターは、
例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮ
Ａ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に
連結することにより製造することができる。ベクターと
しては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，
ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来
のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１
５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、
ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、
ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが
あげられる。これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイ
ルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いる
のが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプ
ロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモータ
ー、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌であ
る場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクター
には、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライ
シングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、
ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称す
る場合がある）などを含有しているものを用いることが
できる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸
還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝
子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン
耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、
ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場
合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈ
ｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄ
ｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的
遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択でき
る。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主
がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配
列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シ
グナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗
体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。この
ようにして構築された本発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製
造することができる。宿主としては、例えば、エシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物
細胞などが用いられる。The expression vector of the polypeptide of the present invention comprises
For example, (a) DN encoding the polypeptide of the present invention
A, a DNA fragment of interest is cut out from (A) and the DN
It can be produced by ligating the A fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. As a vector, a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322,
pBR325, pUC12, pUC13) and plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC19)
4), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH1
5), bacteriophages such as λ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., as well as pA1-11, pXT1, pR
c / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, etc. are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, the SRα promoter,
SV40 promoter, HIV / LTR promoter,
CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter, or the like. When the host is a genus Escherichia,
trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., when the host is Bacillus sp., SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc .; , PGK promoter, GA
P promoters and ADH promoters are preferred.
When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable. In addition to the above, the expression vector may optionally include an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker,
Those containing SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) or the like can be used. As the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r),
Neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r, G418 resistance) and the like. In particular, dh
Using fr gene-deficient Chinese hamster cells
When the hfr gene is used as a selection marker, the target gene can also be selected using a thymidine-free medium. Further, if necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention. When the host is a genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, etc., and when the host is a Bacillus genus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc., and the host is yeast. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used. Using the vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention thus constructed, a transformant can be produced. As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.

【００２５】エシェリヒア属菌の具体例としては、例え
ば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・
ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１
６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッ
ズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３
０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Bio
logy）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bioch
emistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられ
る。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが
用いられる。Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12.
DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 1
60 (1968)], JM103 [Nukuilec Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 3
09 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Bio
logy)], 120, 517 (1978)], HB101
[Journal of Molecular Biology, 4
1, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like. Examples of Bacillus bacteria include, for example, Bacillus
Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry
emistry), Vol. 95, 87 (1984)]. Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22
R -, NA87-11A, DKD-5D , 20B-1
2. Schizosaccharomy
ces pombe) NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 and the like.

【００２６】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、
ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズ
ハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細
胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウ
スミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが
用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載
の方法に従って行なうことができる。As insect cells, for example, virus is A
In the case of cNPV, a cell line derived from night larvae of moth (Spodop
tera frugiperda cell (Sf cell), Trichoplusia ni
MG1 cells from the midgut, H from the eggs of Trichoplusia ni
igh Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or
Estigmena acrea-derived cells and the like are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mor
iN cells; BmN cells) and the like. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf9
21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo
ivo), 13, 213-217, (1977)). As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (198).
5)]. As animal cells, for example, monkey cells COS-
7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter referred to as
CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr − ) cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like. Transformation of the genus Escherichia can be performed, for example, by the procedure of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 69, 21.
10 (1972) and Gene, 17, 107 (1)
982). In order to transform Bacillus sp., For example, Molecular and General Genetics (Mole
cular & General Genetics), 168, 111 (19
79) and the like.
To transform yeast, see, for example, Methods in Enzymology, 194.
Vol. 182-187 (1991).
Proc. Natl. Acad. Sc of the National Academy of Sciences of the USA
USA), Vol. 75, 1929 (1978).

【００２７】昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、
例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology, 6, 4
7-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことがで
きる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学
別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７
（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なうことができる。このようにして、ポリペプチドを
コードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換さ
れた形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリヒ
ア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、
培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、
その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素
源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな
どがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長
促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８
が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。To transform an insect cell or insect,
For example, Bio / Technology, 6, 4
7-55 (1988)). To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267
(1995) (published by Shujunsha), virology (Virolog)
y), Vol. 52, 456 (1973). Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the polypeptide can be obtained. When culturing a transformant whose host is Escherichia or Bacillus,
A liquid medium is suitable as a medium used for culture,
It contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances and the like necessary for the growth of the transformant. As the carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch,
As a nitrogen source such as sucrose, for example, inorganic or organic substances such as ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and inorganic substances such as calcium chloride , Sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is about
Is desirable. As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa)
l of Experiments in Molecular Genetics), 431-
433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1
972] is preferred. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.

【００２８】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要によ
り、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス
属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時
間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地と
しては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小
培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザ
ミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８
４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整する
のが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜
７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化
した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが
用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整する
のが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行な
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞
である形質転換体を培養する際、培地としては、例え
ば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイ
エンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，
ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９
６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル
・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーショ
ン（The Journal of the American Medical Associatio
n）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロ
シージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バ
イオロジカル・メディスン（Proceeding ofthe Society
for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のよ
うにして、形質転換体の細胞膜などに本発明のポリペプ
チドを生成せしめることができる。上記培養物から本発
明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の
方法により行なうことができる。When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Processings of
The National Academy of Sciences
Of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA), vol. 77, 4505 (1980)] or SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processings of the National Academy of Sciences of the USA]. (Proc. Na
Acad. Sci. USA), 81, 5330 (198).
4)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. Culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to
Run for 72 hours, adding aeration and agitation as needed. When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, Grace's Insect Medium (Grace, T .;
CC, Nature, 195, 788 (1962)) to which an immobilized additive such as 10% bovine serum is appropriately added. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or stirring are added. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)],
DMEM medium [Virology, 8, 39
6 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association]
n) Volume 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine (Proceeding of the Society)]
for the Biological Medicine), 73, 1 (195
0)]. Preferably, the pH is between about 6-8. The cultivation is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration or stirring is added. As described above, the polypeptide of the present invention can be produced on the cell membrane or the like of the transformant. The polypeptide of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.

【００２９】本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは
細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌
体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、
超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによっ
て菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過に
よりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い
られる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白
質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌さ
れる場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体
あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このよ
うにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれ
るポリペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適
宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およ
びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主
として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する
方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差
を利用する方法などが用いられる。かくして得られるポ
リペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換すること
ができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法ある
いはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変
換することができる。なお、組換え体が産生するポリペ
プチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を
作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペ
プチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素
としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アル
ギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリ
コシダーゼなどが用いられる。When the polypeptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culture, and suspended in an appropriate buffer.
After disrupting the cells or cells by ultrasonication, lysozyme and / or freeze-thawing, a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the polypeptide is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected. Purification of the polypeptide contained in the culture supernatant or the extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the like. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used. When the polypeptide thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide is obtained as a salt, a method known per se or analogous thereto Depending on the method, it can be converted into a free form or other salts. The polypeptide produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.

【００３０】本発明のポリペプチド、部分ペプチドまた
はそれらのエステルもしくはそれらのアミドまたはそれ
らの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド、部分ペ
プチドまたはそれらのエステルもしくはそれらのアミド
またはそれらの塩に対する抗体を認識し得る抗体であれ
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れで
あってもよい。本発明のポリペプチド、部分ペプチドま
たはそれらのエステルもしくはそれらのアミドまたはそ
れらの塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に
本発明のポリペプチドと略記する場合がある）に対する
抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、自体
公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造すること
ができる。Antibodies against the polypeptide, partial peptide or their esters or amides or their salts of the present invention are antibodies against the polypeptide, partial peptide or their esters or their amides or their salts of the present invention. Any polyclonal antibody or monoclonal antibody may be used as long as it can be recognized. Antibodies against the polypeptide, partial peptide or their esters or their amides or their salts of the present invention (hereinafter, these may be simply abbreviated to the polypeptide of the present invention in the description of the antibodies) are the same as those of the present invention. Can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using the polypeptide as an antigen.

【００３１】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のポリペプチドは、温血動物に対して投与により
抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤
とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高める
ため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイント
アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎
に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温
血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげ
られるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で
免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種
または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製すること
ができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の
標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体
に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうこ
とができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラー
とミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、49
5 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤と
しては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や
センダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥ
Ｇが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−
１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の
骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
には種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド
（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた
固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上
清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免
疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウス
の場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）ま
たはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナ
ル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプ
ロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清
を添加し、放射性物質や酵素などで標識したポリペプチ
ドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出す
る方法などがあげられる。モノクローナル抗体の選別
は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう
ことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なう
ことができる。選別および育種用培地としては、ハイブ
リドーマが生育できるものならばどのような培地を用い
ても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０
％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１
０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業
（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体
価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。[Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody Producing Cell The polypeptide of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier and a diluent at a site where the antibody can be produced by administration. Is done. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained therein. By fusing the antibody-producing cells to the same or different species of myeloma cells.
A hybridoma producing a monoclonal antibody can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled polypeptide described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 49
5 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
G is used. As myeloma cells, for example, NS-
1, myeloma cells of warm-blooded animals such as P3U1, SP2 / 0, and AP-1 are mentioned, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG600) is used.
0) is added at a concentration of about 10 to 80%,
C., preferably 30 to 37.degree. C., for 1 to 10 minutes to efficiently perform cell fusion. Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a polypeptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier. Anti-immunoglobulin antibodies (anti-mouse immunoglobulin antibodies are used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, and monoclonal antibodies bound to the solid phase are detected. Method, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a polypeptide labeled with a radioactive substance or an enzyme, and detecting a monoclonal antibody bound to the solid phase. can give. The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as hybridomas can grow. For example, 1-20%, preferably 10-20
% RPMI 1640 medium containing fetal calf serum, 1-1
GIT medium containing 0% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free medium for hybridoma culture (S
FM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 3 ° C.
7 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.

【００３２】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。(B) Purification of Monoclonal Antibody Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a method known per se, for example, a separation and purification method of immunoglobulin [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis Method, adsorption / desorption method using an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active antibody such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate the bond. Specific Purification Method for Obtaining Antibody].

【００３３】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリア
ー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗
体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動
物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、
キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体
が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架
橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシ
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合
でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いること
ができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マ
レイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基
を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成
物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ
自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に
際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュ
バントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取することができる。抗血清中のポリクロー
ナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と
同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製
は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫
グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補
的な塩基配列またはその一部分を有するアンチセンスＤ
ＮＡ（以下、アンチセンスＤＮＡの説明においては、こ
れらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する）としては、
本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に
相補的な塩基配列またはその一部分を有し、該ＤＮＡの
発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれの
アンチセンスＤＮＡであってもよい。[Preparation of Polyclonal Antibody] The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (polypeptide antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance and separating and purifying the antibody. Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio between the carrier and the hapten are:
Any antibody may be efficiently cross-linked to the hapten immunized by cross-linking with a carrier.However, any antibody may be cross-linked at any ratio. A method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 with respect to 1 is used. Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used. The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 1
It is performed about 0 times. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method. The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The polyclonal antibody can be separated and purified according to the same method for separating and purifying immunoglobulins as in the above-described method for separating and purifying a monoclonal antibody.
Antisense D having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof or a part thereof
NA (hereinafter, in the description of antisense DNA, these DNAs are abbreviated as DNA of the present invention) include:
Any antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA of the present invention or a portion thereof and having an action capable of suppressing the expression of the DNA can be used. There may be.

【００３４】本発明のＤＮＡの塩基配列に実質的に相補
的な塩基配列またはその一部分の塩基配列とは、例え
ば、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列（す
なわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるい
は部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。
特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発
明のポリペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基
配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補
鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ま
しくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相
同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これら
のアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを
用いて製造することができる。以下に、本発明のポリ
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル、ま
たはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはその
エステルまたはそれらの塩（以下、本発明のポリペプチ
ドと略記する場合がある）、本発明のポリペプチドも
しくはその部分ペプチドまたは本発明のレセプター蛋白
質もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以
下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明
のポリペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略
記する場合がある）、およびアンチセンスＤＮＡの用
途を説明する。The base sequence substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a partial base sequence thereof is, for example, a base sequence complementary to the base sequence of the DNA of the present invention (ie, the base sequence of the DNA of the present invention). About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more.
Base sequences having 5% or more homology are exemplified.
In particular, of the total nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, about 70% or more of the complementary strand of the nucleotide sequence encoding the N-terminal site of the polypeptide of the present invention (for example, the nucleotide sequence near the start codon). An antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like. Hereinafter, the polypeptide of the present invention or its amide or its ester, or its partial peptide or its amide or its ester or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the polypeptide of the present invention), the polypeptide of the present invention Alternatively, a partial peptide thereof, a DNA encoding the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, may be abbreviated as the DNA of the present invention), an antibody against the polypeptide of the present invention (hereinafter, abbreviated as the antibody of the present invention) In some cases), and the use of antisense DNA.

【００３５】（１）本発明のポリペプチドが関与する各
種疾病の治療・予防剤 本発明のポリペプチドは後述の実施例１および図３に示
すとおり、既知のＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨのベータサブユ
ニットと高い相同性を示し、他のサブユニット（例えば
アルファサブユニット、具体的には配列番号：７で表さ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するポリペプチドなど。「実質的に同一」と
は上記の本発明のポリペプチドと同様に、アルファサブ
ユニットの有する活性またはアルファサブユニットと本
発明のポリペプチドが会合することにより発現される活
性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）
同質であることを意味する。）と会合することにより生
理活性が発現される。また、既知のＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳ
Ｈ等と同様に、配列番号：１の３６番目（Ｃｙｓ）−８
４番目（Ｃｙｓ）間、５０番目（Ｃｙｓ）−９９番目
（Ｃｙｓ）間、６０番目（Ｃｙｓ）−１１５番目（Ｃｙ
ｓ）間、６４番目（Ｃｙｓ）−１１７番目（Ｃｙｓ）
間、１２０番目（Ｃｙｓ）−１２７番目（Ｃｙｓ）間、
配列番号：１１の３５番目（Ｃｙｓ）−８３番目（Ｃｙ
ｓ）間、４９番目（Ｃｙｓ）−９８番目（Ｃｙｓ）間、
５９番目（Ｃｙｓ）−１１４番目（Ｃｙｓ）間、６３番
目（Ｃｙｓ）−１１６番目（Ｃｙｓ）間、１１９番目
（Ｃｙｓ）−１２６番目（Ｃｙｓ）間でそれぞれＳ−Ｓ
結合を有すると考えられる。後述の実施例１に記載のと
おり、本発明のポリペプチドは既知のＬＨ、ＦＳＨ、Ｔ
ＳＨ等において、アルファサブユニットとの会合に必要
な因子の一つであるＳ−Ｓ結合をとりうるＣｙｓが欠落
しているため、他のサブユニットと会合せずに、本発明
のポリペプチド単独でも生理活性が発現される。従って
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに異常があっ
たり、欠損している場合、または本発明のポリペプチド
のレセプター蛋白質をコードするＤＮＡに異常があった
り、欠損している場合には、例えば、高血圧、自己免疫
疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜
炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人
呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー
病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺
炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治
癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白
血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸が
ん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎
症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコ
バクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝
炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水
痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染
症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血
症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血
症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存
性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒
色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎
炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿
病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨
軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェッ
ト病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性
食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神***症，敗血
症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺
がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一
過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴
呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不
全、瀕尿、***、または神経変成疾患等の種々の疾病
が発症する可能性が高い。従って、本発明のポリペプチ
ド、本発明のＤＮＡは、例えば、上記の種々の疾病の治
療・予防剤などの医薬として使用することができる。(1) Therapeutic / prophylactic agent for various diseases associated with the polypeptide of the present invention The polypeptide of the present invention is a known beta subunit of LH, FSH and TSH as shown in Example 1 and FIG. And high homology to other subunits (for example, an alpha subunit, specifically a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, etc. The term “substantially the same” means that the activity of the alpha subunit or the activity expressed by the association of the alpha subunit with the polypeptide of the present invention is qualitatively (eg, physiological Chemically or pharmacologically)
It means that they are the same. ), The physiological activity is expressed. In addition, known LH, FSH, TS
H, etc., the 36th (Cys) -8 of SEQ ID NO: 1
4th (Cys), 50th (Cys) -99th (Cys), 60th (Cys) -115th (Cy)
s), 64th (Cys) -117th (Cys)
Interval, 120th (Cys)-127th (Cys) interval,
35th (Cys) to 83rd (Cy) of SEQ ID NO: 11
s), 49th (Cys)-98th (Cys),
SS between 59th (Cys) -114th (Cys), 63rd (Cys) -116th (Cys), 119th (Cys) -126th (Cys)
It is thought to have a bond. As described in Example 1 below, the polypeptides of the present invention are known LH, FSH, T
In SH and the like, Cys, which can take the SS bond, which is one of the factors required for association with the alpha subunit, is lacking, so that the polypeptide of the present invention alone does not associate with other subunits. However, physiological activity is expressed. Therefore, when the DNA encoding the polypeptide of the present invention is abnormal or defective, or when the DNA encoding the receptor protein of the polypeptide of the present invention is abnormal or defective, for example, , Hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, atherosclerosis, atopic skin Inflammation, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (col / Rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, helicobacter pylori sensation Disease, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, high Cholesterol, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma , Allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Petchet disease , Peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small Cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion failure, dysuria, There is a high possibility that various diseases such as uremia or neurodegenerative disease will develop. Therefore, the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, as a medicament such as an agent for treating or preventing the above-mentioned various diseases.

【００３６】本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮ
Ａは、例えば、生体内において本発明のポリペプチドが
減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本
発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のポリ
ペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発
明のＤＮＡを挿入し、本発明のポリペプチドを発現させ
た後に、該細胞を患者に移植することによって、または
（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与することな
どによって、該患者における本発明のポリペプチドの役
割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場
合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエ
ーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入
した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与
することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あ
るいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認めら
れる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカ
テーテルのようなカテーテルによって投与できる。本発
明のポリペプチドを上記の治療・予防剤として使用する
場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、よ
り好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上
に精製されたものを使用するのが好ましい。本発明のポ
リペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明
のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、
賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などととも
に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態
で混和することによって製造することができる。これら
製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量
が得られるようにするものである。The polypeptide of the present invention and the DN of the present invention
A: For example, when there is a patient in a living body in which the polypeptide of the present invention is reduced or deficient, (A) administering the DNA of the present invention to the patient and expressing the polypeptide of the present invention in the living body (B) inserting the DNA of the present invention into cells, expressing the polypeptide of the present invention, and then transplanting the cells into a patient, or (c) introducing the polypeptide of the present invention into the patient. In this case, the role of the polypeptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted.
When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, the DNA is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be administered to humans or warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. When the polypeptide of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it should be at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. Is preferred. The polypeptide of the present invention can be, for example, sterilized with tablets or capsules, elixirs, microcapsules, or the like, optionally coated with sugar, or with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as aqueous solutions or suspensions. For example, the polypeptide of the present invention physiologically acceptable carrier, flavoring agent,
It can be prepared by mixing with excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in the unit dosage form generally required for the practice of formulations. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a proper dosage in the specified range can be obtained.

【００３７】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが
挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、
非経口的に使用される。このようにして得られる製剤
は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血
動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、
トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、
など）に対して投与することができる。Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid. Use may be made of bulking agents such as, for example, magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. Examples of aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. , For example, alcohols (eg, ethanol, etc.),
It may be used in combination with a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), a nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 ™ , HCO-50, etc.). As the oily liquid, for example, sesame oil,
Soybean oil and the like, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with a preservative (for example, benzyl alcohol, phenol, etc.), an antioxidant, etc. The prepared injection is
Usually, it is filled into a suitable ampoule. The vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above.
Used parenterally. The preparations obtained in this way are safe and of low toxicity, such as, for example, humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits,
Birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys,
Etc.).

【００３８】本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、神経疾患の治療目的で本発明のポリペプチドを経
口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）にお
いては、一日につき該ポリペプチドを約０.１ｍｇ〜１
００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好まし
くは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する
場合は、該ポリペプチドの１回投与量は投与対象、対象
疾患などによっても異なるが、例えば、神経疾患の治療
目的で本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人（体重
６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ポリペ
プチドを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ
程度を患部に注射することにより投与するのが好都合で
ある。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量
を投与することができる。The dosage of the polypeptide of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. In an adult (as 60 kg), about 0.1 mg to 1 mg of the polypeptide per day is used.
00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the polypeptide varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the polypeptide of the present invention may be administered in the form of an injection to an adult ( (As a body weight of 60 kg), the polypeptide is about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 30 mg per day.
About 1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg
It is convenient to administer the degree by injecting it into the affected area. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.

【００３９】（２）疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング 本発明のポリペプチドは下垂体前葉ホルモン（ＬＨ、Ｆ
ＳＨ、ＴＳＨなど）に関連する生理活性などを有するた
め、本発明のポリペプチドの機能（例、下垂体前葉ホル
モン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨなど）に関連する生理活性
など）を促進または阻害する化合物またはその塩は、例
えば、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内
障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，
急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性
肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性
皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過
食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性
白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸が
ん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合
併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜
症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ
型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイ
ルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン
病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高
カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド
血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，イン
シュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感
染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギ
ー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン
非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，
骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，
骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺
がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分
裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染
症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマ
トーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性
／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホ
ルモン分泌不全、瀕尿、***、または神経変成疾患等
の疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。該
スクリーニングは、本発明のポリペプチドを用いるか、
または組換え型本発明のポリペプチドの発現系を構築
し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用い
ることによって、本発明のポリペプチドとその受容体と
の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの
活性を促進または阻害する化合物）（例えば、ペプチ
ド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物など）またはその塩をスクリーニングすることがで
きる。このような化合物には、本発明のポリペプチドの
受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−
ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性など）
を有する化合物（即ち本発明のポリペプチドの受容体ア
ゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ち本
発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト）などが含
まれる。「本発明のポリペプチドとの結合性を変化させ
る」とは、本発明のポリペプチドとの結合を阻害する場
合と本発明のポリペプチドとの結合を促進する場合の両
方を包含するものである。(2) Screening of drug candidate compounds for diseases The polypeptide of the present invention comprises anterior pituitary hormone (LH, F
A compound that has a physiological activity related to SH, TSH, etc., and thus promotes or inhibits the function of the polypeptide of the present invention (eg, a physiological activity related to anterior pituitary hormone (LH, FSH, TSH, etc.)). Or salts thereof, for example, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis,
Acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervix Cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colorectal cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetes Retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, A
Hepatitis B, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceride , Hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis , Non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation,
Osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer,
Bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, Gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion insufficiency, micturition, uremia, or neurodegeneration It can be used as a medicament such as a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as diseases. The screening uses the polypeptide of the present invention,
Alternatively, by constructing a recombinant expression system of the polypeptide of the present invention and using a receptor binding assay system using the expression system, a compound that alters the binding between the polypeptide of the present invention and its receptor (this compound Compounds that promote or inhibit the activity of the polypeptide of the invention (eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be screened. Such compounds have cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c) via the receptor of the polypeptide of the present invention.
AMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-
activation of fos, activity to promote pH reduction, etc.)
(Ie, a receptor agonist of the polypeptide of the present invention) and a compound having no cell stimulating activity (ie, a receptor antagonist of the polypeptide of the present invention). “Altering the binding to the polypeptide of the present invention” includes both the case of inhibiting the binding to the polypeptide of the present invention and the case of promoting the binding to the polypeptide of the present invention. .

【００４０】すなわち、本発明は、本発明のポリペプチ
ドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活
性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、具体的には、（ｉ）本発明のポリペプチド
の受容体もしくはその塩または該本発明のポリペプチド
の受容体の部分ペプチドもしくはその塩に、本発明のポ
リペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の
ポリペプチドの受容体もしくはその塩または該本発明の
ポリペプチドの受容体の部分ペプチドもしくはその塩
に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させ
た場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリ
ペプチドと本発明のポリペプチドの受容体の結合性を変
化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進ま
たは阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方
法を提供する。本発明のスクリーニング方法において
は、（ｉ）上記した本発明のポリペプチドの受容体また
は該本発明のポリペプチドの受容体の部分ペプチドに、
本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記し
た本発明のポリペプチドの受容体または該本発明のポリ
ペプチドの受容体の部分ペプチドに、本発明のポリペプ
チドおよび試験化合物を接触させた場合における、例え
ば該本発明のポリペプチドの受容体または該本発明のポ
リペプチドの受容体の部分ペプチドに対する本発明のポ
リペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比
較する。That is, the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention, which comprises using the polypeptide of the present invention. (B) contacting the polypeptide of the present invention with the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof, or a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof; A polypeptide of the present invention, which is compared with a case where a polypeptide of the present invention and a test compound are contacted with a receptor or a salt thereof or a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof. Compounds that alter the binding between the peptide and the receptor of the polypeptide of the present invention (compounds that promote or inhibit the activity of the polypeptide of the present invention) Or to provide a screening method of a salt thereof. In the screening method of the present invention, (i) the receptor of the polypeptide of the present invention or a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention
And (ii) contacting the polypeptide of the present invention and a test compound with the above-described receptor of the polypeptide of the present invention or a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention. In this case, for example, the amount of the polypeptide of the present invention bound to the receptor of the polypeptide of the present invention or a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention, the cell stimulating activity and the like are measured and compared.

【００４１】本発明のスクリーニング方法は具体的に
は、 標識した本発明のポリペプチドを、上記した本発明の
ポリペプチドの受容体もしくはその塩または本発明のポ
リペプチドの受容体の部分ペプチドまたはその塩に接触
させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試
験化合物を本発明のポリペプチドの受容体もしくはその
塩または本発明のポリペプチドの受容体の部分ペプチド
もしくはその塩に接触させた場合における、標識した本
発明のポリペプチドの該本発明のポリペプチドの受容体
もしくはその塩、または該部分ペプチドもしくはその塩
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本
発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドの受容体と
の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの
活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスク
リーニング方法、 標識した本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプ
チドの受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接
触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび
試験化合物を本発明のポリペプチドの受容体を含有する
細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、
標識した本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本
発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドの受容体と
の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの
活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスク
リーニング方法、 標識した本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプ
チドの受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体
を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のポ
リペプチドの受容体に接触させた場合と、標識した本発
明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明のポリペプ
チドの受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体
を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のポ
リペプチドの受容体に接触させた場合における、標識し
た本発明のポリペプチドの本発明のポリペプチドの受容
体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドの受容体
との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチド
の活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のス
クリーニング方法、In the screening method of the present invention, specifically, the labeled polypeptide of the present invention is prepared by converting the above-mentioned receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention or a peptide thereof. When contacted with a salt, and when the labeled polypeptide of the present invention and a test compound are contacted with a receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof And measuring the amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof, and comparing the measured amount with the polypeptide of the present invention. A compound that alters the binding of the polypeptide of the present invention to a receptor (promotes the activity of the polypeptide of the present invention or A method of screening a compound of the present invention or a salt thereof, the method comprising the steps of: contacting a labeled polypeptide of the present invention with a cell containing a receptor of the polypeptide of the present invention or a membrane fraction of the cell; When the polypeptide of the present invention and a test compound are contacted with a cell containing the receptor of the polypeptide of the present invention or a membrane fraction of the cell,
The amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the cell or the membrane fraction is measured and compared, and the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the polypeptide of the present invention is changed. Method for screening compound (compound that promotes or inhibits the activity of polypeptide of the present invention) or a salt thereof, Transformant containing labeled polypeptide of the present invention and DNA encoding receptor of polypeptide of the present invention And the test compound containing a labeled polypeptide of the present invention and a test compound containing a DNA encoding the receptor of the polypeptide of the present invention. When a transformant to be cultured was cultured and contacted with a receptor for the polypeptide of the present invention expressed on the cell membrane, A compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the polypeptide of the present invention, wherein the amount of the polypeptide of the present invention binding to the receptor of the polypeptide of the present invention is measured and compared. (A compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof,

【００４２】本発明のポリペプチドの受容体を活性化
する化合物（例えば、本発明のポリペプチド）を本発明
のポリペプチドの受容体を含有する細胞に接触させた場
合と、本発明のポリペプチドの受容体を活性化する化合
物および試験化合物を本発明のポリペプチドの受容体を
含有する細胞に接触させた場合における、本発明のポリ
ペプチドの受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を測定し、比較するこ
とを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のポリペ
プチドの受容体との結合性を変化させる化合物（本発明
のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）ま
たはその塩のスクリーニング方法、および 本発明のポリペプチドの受容体を活性化する化合物
（例えば、本発明のポリペプチドなど）を本発明のポリ
ペプチドの受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明
のポリペプチドの受容体に接触させた場合と、本発明の
ポリペプチドの受容体を活性化する化合物および試験化
合物を、本発明のポリペプチドの受容体をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞
膜上に発現した本発明のポリペプチドの受容体に接触さ
せた場合における、本発明のポリペプチドの受容体を介
する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明
のポリペプチドと本発明のポリペプチドの受容体との結
合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性
を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリー
ニング方法などである。A compound that activates the receptor of the polypeptide of the present invention (eg, the polypeptide of the present invention) is contacted with a cell containing the receptor of the polypeptide of the present invention, When a compound that activates the receptor of the present invention and a test compound are brought into contact with cells containing the receptor of the polypeptide of the present invention, cell stimulating activity of the polypeptide of the present invention via the receptor (for example, arachidonic acid Release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Activity of promoting or inhibiting) and measuring and comparing the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the polypeptide of the present invention. A method for screening a compound that alters sex (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof, and a compound that activates a receptor of the polypeptide of the present invention (for example, the polypeptide of the present invention, etc.) Is contacted with a receptor of the polypeptide of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the receptor of the polypeptide of the present invention; A compound that activates the receptor of the present invention and a test compound are identified as D-encoding the receptor of the polypeptide of the present invention.
When the transformant containing NA is brought into contact with the receptor of the polypeptide of the present invention expressed on the cell membrane by culturing, the cell stimulating activity of the polypeptide of the present invention through the receptor (for example, arachidonic acid Release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. A compound that alters the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the polypeptide of the present invention, which is characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing the activity of the polypeptide of the present invention. Or a salt thereof.

【００４３】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いる本発明のポリペプチドの受容体としては、本発明
のポリペプチドをリガンドとして認識するものであれば
何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の
膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器
は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用い
られるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた
本発明のポリペプチドの受容体などが適している。本発
明のポリペプチドの受容体を製造するには、前述の本発
明のポリペプチドの製造方法などが用いられる。本発明
のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチド
の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用
いる場合、後述の調製法に従えばよい。本発明のポリペ
プチドの受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞を
グルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよ
い。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うこと
ができる。本発明のポリペプチドの受容体を含有する細
胞としては、本発明のポリペプチドの受容体を発現した
宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられ
る。また、本発明のポリペプチドの受容体を発現した宿
主細胞は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現
ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様
の方法などがあげられる。膜画分としては、細胞を破砕
した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含
まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Po
tter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方
法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社
製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスな
どで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させること
による破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画
遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分
画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速
（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約
１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００
ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心
し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発
現した本発明のポリペプチドの受容体と細胞由来のリン
脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該本発明
のポリペプチドの受容体を含有する細胞や膜画分中の本
発明のポリペプチドの受容体の量は、１細胞当たり１０
3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子で
あるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当
たりの本発明のポリペプチド結合活性（比活性）が高く
なり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるば
かりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるよう
になる。The specific description of the screening method of the present invention is as follows. First, the receptor of the polypeptide of the present invention used in the screening method of the present invention may be any receptor that recognizes the polypeptide of the present invention as a ligand. A membrane fraction of an organ is suitable. However, since it is particularly difficult to obtain human-derived organs, a receptor for the polypeptide of the present invention which is expressed in large amounts by using a recombinant is suitable for screening. In order to produce the receptor of the polypeptide of the present invention, the above-described method for producing the polypeptide of the present invention and the like are used. In the screening method of the present invention, when a cell containing the receptor of the polypeptide of the present invention or a cell membrane fraction thereof is used, the preparation method described later may be followed. When cells containing the receptor of the polypeptide of the present invention are used, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. The cell containing the receptor of the polypeptide of the present invention refers to a host cell expressing the receptor of the polypeptide of the present invention. Examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, Animal cells and the like. Examples of the host cell that has expressed the receptor of the polypeptide of the present invention include the same method as the above-described method for producing a transformant transformed with the expression vector containing the polypeptide of the present invention. The membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. As a method for disrupting cells, Po
Examples of the method include crushing cells with a tter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, and the like. . For the fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically, about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15,000 rpm).
(rpm to 30,000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed receptor of the polypeptide of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The amount of the receptor of the polypeptide of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the polypeptide of the present invention is 10 per cell.
It is preferably 3 to 10 8 molecules, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules. The higher the expression level, the higher the polypeptide binding activity (specific activity) of the present invention per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. become able to.

【００４４】本発明のポリペプチドと本発明のポリペプ
チドの受容体との結合性を変化させる化合物（本発明の
ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をス
クリーニングする前記の〜を実施するためには、適
当な本発明のポリペプチドの受容体画分と、標識した本
発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明のポリペ
プチドの受容体画分としては、天然型の本発明のポリペ
プチドの受容体画分か、またはそれと同等の活性を有す
る組換え型本発明のポリペプチドの受容体画分などが望
ましい。ここで、同等の活性とは、同等の本発明のポリ
ペプチド結合活性などを示す。標識した本発明のポリペ
プチドとしては、標識した本発明のポリペプチド、標識
した本発明のポリペプチドアナログ化合物などが用いら
れる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕
などで標識された本発明のポリペプチドなどを利用する
ことができる。具体的には、本発明のポリペプチドと本
発明のポリペプチドの受容体との結合性を変化させる化
合物のスクリーニングを行うには、まず本発明のポリペ
プチドの受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、
スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによ
りレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４
〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、
トリス−塩酸バッファーなどの本発明のポリペプチドと
レセプターとの結合を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的
で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテア
ーゼによるレセプターや本発明のポリペプチドの分解を
抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプ
チド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該
レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００
００ｃｐｍ）の標識した本発明のポリペプチドを添加
し、同時に１０-10〜１０-7Ｍの試験化合物を共存させ
る。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未
標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用
意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３
７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時
間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同
バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放
射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カ
ウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウン
ト(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウン
ト（Ｂ 0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量
（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を
拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ
る。The polypeptide of the present invention and the polypep of the present invention
Compounds that alter the binding of tide to the receptor (of the present invention)
Compounds that promote or inhibit the activity of the polypeptide)
In order to carry out the above-mentioned ~
The relevant receptor fraction of the polypeptide of the present invention and a labeled book
The polypeptide of the invention and the like are used. Polype of the present invention
As the peptide receptor fraction, the natural polypeptide of the present invention is used.
Receptor fraction of peptide or has equivalent activity
The receptor fraction of the recombinant polypeptide of the present invention
Good. Here, the equivalent activity refers to the equivalent polymorph of the present invention.
Shows peptide binding activity and the like. Labeled polypeptide of the invention
As the peptide, a labeled polypeptide of the present invention, a label
Using the polypeptide analog compound of the present invention
It is. For example, [ThreeH], [125I], [14C], [35S]
Utilize the polypeptide of the present invention labeled with
be able to. Specifically, the polypeptide of the present invention and the present
Changes in the binding of the polypeptide of the invention to the receptor
To screen a compound, first, the polypeptide of the present invention is used.
A cell or a membrane fraction of the cell containing the peptide receptor,
Suspend in a buffer suitable for screening.
Prepare a receptor sample. PH 4 buffer
Phosphate buffer of 10 to 10 (preferably pH 6 to 8),
A polypeptide of the present invention such as Tris-HCl buffer
Any buffer that does not inhibit receptor binding
It may be shifted. Also, to reduce non-specific binding
In, CHAPS, Tween-80TM(Kao-Atlas
Surfactants, such as digitonin, deoxycholate, etc.
Can be added to the buffer. In addition, Protea
Degradation of the receptor or polypeptide of the present invention by
PMSF, leupeptin, E-64 (Pep
Protease inhibition such as pepstatin
Agents can also be added. 0.01 ml to 10 ml of the
A certain amount (5,000 cpm-5000) is added to the receptor solution.
00 cpm) of the labeled polypeptide of the present invention
And at the same time 10-Ten-10-7M test compounds
You. In order to know the amount of non-specific binding (NSB),
Also use a reaction tube containing the labeled polypeptide of the present invention.
I mean. The reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably at 4 ° C to 3 ° C.
20 minutes to 24 hours at 7 ° C, preferably 30 minutes to 3:00
Do it for a while. After the reaction, filter with a glass fiber filter paper, etc.
After washing with buffer, the residual
Radioactivity in a liquid scintillation counter or γ-
Measure with Unter. Counsel when there is no antagonist
To (B0) Minus the amount of non-specific binding (NSB)
G (B 0-NSB) as 100%, specific binding amount
A test compound having (B-NSB) of, for example, 50% or less
Can be selected as a candidate substance with competitive inhibition ability
You.

【００４５】本発明のポリペプチドと本発明のポリペプ
チドの受容体との結合性を変化させる化合物（本発明の
ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をス
クリーニングする前記の〜の方法を実施するために
は、本発明のポリペプチドの受容体を介する細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低
下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知
の方法または市販の測定用キットを用いて測定すること
ができる。具体的には、まず、本発明のポリペプチドの
受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養
する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮
な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファー
に交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュ
ベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、
生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞
刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸な
ど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困
難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッ
セイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの
活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産
生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用とし
て検出することができる。細胞刺激活性を測定してスク
リーニングを行なうには、適当な本発明のポリペプチド
の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の本発明
のポリペプチドの受容体を発現した細胞としては、前述
の本発明のポリペプチドの受容体発現細胞株などが望ま
しい。試験化合物としては、例えばペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ
る。The above-mentioned methods (1) to (4) for screening a compound that alters the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the polypeptide of the present invention (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) are carried out. To do so, the cell stimulating activity of the polypeptide of the present invention via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release,
Intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGM
P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.) by a known method or a commercially available measurement kit. Can be measured. Specifically, first, cells containing the polypeptide receptor of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells in advance, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells or collect the supernatant,
The products produced are quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid or the like) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like. In order to carry out screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing an appropriate receptor for the polypeptide of the present invention are required. As the cells expressing the receptor of the polypeptide of the present invention of the present invention, the above-mentioned cell lines expressing the receptor of the polypeptide of the present invention are preferable. Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.

【００４６】本発明のポリペプチドまたはその前駆体タ
ンパク質と本発明のポリペプチドの受容体との結合性を
変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進
または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング
用キットは、本発明のポリペプチドの受容体またはその
塩、本発明のポリペプチドの受容体の部分ペプチドまた
はその塩、本発明のポリペプチドの受容体を含有する細
胞、あるいは本発明のポリペプチドの受容体を含有する
細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有する
ものである。本発明のスクリーニング用キットの例とし
ては、次のものが挙げられる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 本発明のポリペプチドの受容体標品 本発明のポリペプチドの受容体を発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識された本発明のポリペプチド 〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識し
た本発明のポリペプチド 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは
−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに
希釈する。 本発明のポリペプチド標準液 本発明のポリペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン
（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解
し、−２０℃で保存する。Screening for a compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof that changes the binding between the polypeptide of the present invention or its precursor protein and the receptor of the polypeptide of the present invention. The kit for use is a receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof, a cell containing the receptor of the polypeptide of the present invention, or the polypeptide of the present invention. And a membrane fraction of a cell containing the receptor of the present invention, and the polypeptide of the present invention. Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Screening reagent Measurement buffer and washing buffer Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco)
One containing 05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma). Sterilized by filtration through a 0.45 μm filter, 4 ° C
Or may be prepared at the time of use. Receptor preparation of polypeptide of the present invention CHO cells expressing the receptor of the polypeptide of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 × 10 5 cells / well.
Cultured at 5 ° C., 5% CO 2 and 95% air for 2 days. Polypeptide of the labeled present invention [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] 4 ° C. or those dissolved in a polypeptide suitable solvent or buffer of the present invention labeled with a Store at -20 ° C and dilute to 1 μM with measurement buffer before use. Polypeptide standard solution of the present invention The polypeptide of the present invention is dissolved to a concentration of 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.

【００４７】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のポリ
ペプチドの受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１
ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各
穴に加える。 １０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて
１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験
化合物のかわりに１０-3Ｍの本発明のポリペプチドを５
μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識された本発明のポリペプチドを
０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液
体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。 〔数１〕 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量2. Measuring method Cells expressing the polypeptide receptor of the present invention cultured on a 12-well tissue culture plate were mixed with a measuring buffer 1
After washing twice with ml, 490 μl of measurement buffer is added to each well. After adding 5 μl of a 10 −3 to 10 −10 M test compound solution, 5 μl of the labeled peptide of the present invention is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 -3 M of the polypeptide of the present invention was used in place of the test compound.
Add μl. Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled polypeptide of the present invention bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Liquid scintillation counter (Beckman)
Radioactivity was measured using Percent Maximum Binding
(PMB) is obtained by the following equation (Equation 1). [Equation 1] PMB = [(B−NSB) / (B 0 −NSB)] × 10
0 PMB: Percent Maximum Binding B: Value when a sample is added NSB: Non-specific Binding (Non-specific binding amount) B 0 : Maximum binding amount

【００４８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドの受
容体との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進す
る）化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または
阻害する化合物）であり、具体的には本発明のポリペプ
チドの受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物また
はその塩（いわゆる本発明のポリペプチドの受容体アゴ
ニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわ
ゆる本発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト）で
ある。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプ
チド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。上記本発明のポリペプチド
の受容体アゴニストであるかアンタゴニストであるかの
具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えば
よい。 （ｉ）前記〜のスクリーニング方法で示されるバイ
ンディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと
本発明のポリペプチドの受容体との結合性を変化させる
（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が
上記した本発明のポリペプチドの受容体を介する細胞刺
激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を
有する化合物またはその塩は本発明のポリペプチドの受
容体アゴニストであり、該活性を有しない化合物または
その塩は本発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト
である。 （ii）(a)試験化合物を本発明のポリペプチドの受容体
を含有する細胞に接触させ、上記本発明のポリペプチド
の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活
性を有する化合物またはその塩は本発明のポリペプチド
の受容体アゴニストである。 (b) 本発明のポリペプチドの受容体を活性化する化合物
（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペ
プチドの受容体アゴニストなど）を本発明のポリペプチ
ドの受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明
のポリペプチドの受容体を活性化する化合物および試験
化合物を本発明のポリペプチドの受容体を含有する細胞
に接触させた場合における、本発明のポリペプチドの受
容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明
のポリペプチドの受容体を活性化する化合物による細胞
刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の
ポリペプチドの受容体アンタゴニストである。該本発明
のポリペプチドの受容体アゴニストは、本発明のポリペ
プチドの受容体に対する本発明のポリペプチドが有する
生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリ
ペプチドと同様に安全で低毒性な医薬として有用であ
る。逆に、本発明のポリペプチドの受容体アンタゴニス
トは、本発明のポリペプチドの受容体に対する本発明の
ポリペプチドが有する生理活性を抑制することができる
ので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬
として有用である。The compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention alters the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the polypeptide of the present invention (inhibits or promotes the binding). ) A compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention), specifically, a compound having a cell stimulating activity via a receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof (the so-called poly (polyester of the present invention)). A peptide receptor agonist) or a compound having no stimulating activity (a so-called receptor antagonist of the polypeptide of the present invention). Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds. A specific method for evaluating whether the polypeptide of the present invention is a receptor agonist or antagonist may be according to the following (i) or (ii). (I) The binding assay shown in the above screening method (1) was performed to obtain a compound that alters (particularly, inhibits the binding) the binding of the polypeptide of the present invention to the receptor of the polypeptide of the present invention. Thereafter, it is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity through the receptor of the above-mentioned polypeptide of the present invention. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a receptor agonist of the polypeptide of the present invention, and a compound or a salt thereof having no such activity is a receptor antagonist of the polypeptide of the present invention. (Ii) (a) The test compound is brought into contact with cells containing the receptor of the polypeptide of the present invention, and the cell stimulating activity of the polypeptide of the present invention via the receptor is measured. The compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a receptor agonist of the polypeptide of the present invention. (b) A compound that activates the receptor of the polypeptide of the present invention (for example, the polypeptide of the present invention or a receptor agonist of the polypeptide of the present invention) is added to a cell containing the receptor of the polypeptide of the present invention. The receptor of the polypeptide of the present invention when contacted, and when the compound that activates the receptor for the polypeptide of the present invention and the test compound are contacted with cells containing the receptor for the polypeptide of the present invention. Are measured and compared. A compound capable of reducing the cell stimulating activity of the compound of the present invention that activates the receptor of the polypeptide of the present invention or a salt thereof is a receptor antagonist of the polypeptide of the present invention. Since the receptor agonist of the polypeptide of the present invention has the same activity as the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the receptor of the polypeptide of the present invention, it is as safe as the polypeptide of the present invention. And is useful as a low-toxicity drug. Conversely, since the receptor antagonist of the polypeptide of the present invention can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the receptor of the polypeptide of the present invention, it is safe and low toxic to suppress the receptor activity. It is useful as a novel medicine.

【００４９】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出
液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であ
り、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する
化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明
のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animals. A compound selected from a tissue extract, plasma, or the like, which promotes or inhibits the function of the polypeptide of the present invention. As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the polypeptide of the present invention are used.

【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施す
ることができる。例えば、前記した本発明のポリペプチ
ド等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、
エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁
液剤などとすることができる。このようにして得られる
製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温
血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジ
ーなど）に対して投与することができる。該化合物また
はその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、
投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、神経性疾
患治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する
化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１
〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好
ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与
する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾
患などによっても異なるが、例えば、神経性疾患治療の
目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物を
注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場
合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。 （３）本発明のポリペプチドの定量 本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）は、本発明のポリペプチドを
特異的に認識することができるので、被検液中の本発明
のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法に
よる定量などに使用することができる。When a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, in the same manner as the drug containing the polypeptide of the present invention and the like, tablets, capsules,
An elixir, microcapsule, sterile solution, suspension or the like can be used. The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered. The dose of the compound or a salt thereof depends on its action, target disease, subject to be administered,
Although there are differences depending on the administration route and the like, for example, when a compound that promotes the function of the polypeptide of the present invention is orally administered for the purpose of treating a neurological disease, generally, an adult (body weight 60 k
g), the compound is added at about 0.1 per day.
-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, a compound that promotes the function of the polypeptide of the present invention for the purpose of treating a neurological disease is injected. When administered to a normal adult (as 60 kg) in the form of a drug, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg per day,
It is convenient to administer preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg. (3) Quantification of the polypeptide of the present invention An antibody against the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the polypeptide of the present invention. It can be used for quantification of the polypeptide of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay.

【００５１】すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の抗体
と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドと
を競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本
発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする
被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および（i
i）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標
識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に
反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定す
ることを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの
定量法を提供する。上記（ii）の定量法においては、一
方の抗体が本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗
体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反
応する抗体であることが望ましい。また、本発明のポリ
ペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明の
ポリペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色
等による検出を行なうこともできる。これらの目的に
は、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子
のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いて
もよい。本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの
定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定
液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗
体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または
物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標
準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ
れば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロ
メトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイ
ッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後
述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。That is, the present invention provides (i) a method of competitively reacting an antibody of the present invention with a test solution and a labeled polypeptide of the present invention, and binding the labeled present invention to the antibody. A method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution, wherein the method comprises the steps of:
i) measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier after simultaneously or continuously reacting the test solution with the antibody of the present invention insoluble on the carrier and another labeled antibody of the present invention on the carrier; The present invention provides a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution, characterized in that: In the quantification method (ii), one antibody may be an antibody that recognizes the N-terminal of the polypeptide of the present invention, and the other antibody may be an antibody that reacts with the C-terminal of the polypeptide of the present invention. desirable. In addition, the polypeptide of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the polypeptide of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, and in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.

【００５２】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素として
は、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、
〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクト
シダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用
いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。抗原あるいは
抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、ま
た通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化す
るのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体
としては、アガロース、デキストラン、セルロースなど
の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、
シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられ
る。サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノ
クローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さら
に標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応さ
せ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量
を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順
序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をず
らして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は
前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッ
チ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標
識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要
はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の
抗体の混合物を用いてもよい。As a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H],
[ 14 C] and the like are used. As the above-mentioned enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent. For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a polypeptide or an enzyme may be used. As the carrier, agarose, dextran, insoluble polysaccharides such as cellulose, polystyrene, polyacrylamide,
Synthetic resin such as silicon, glass, or the like can be used. In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the polypeptide of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.

【００５３】本発明のサンドイッチ法による本発明のポ
リペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に
用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポ
リペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用
いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いら
れる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本
発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応
で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ
端部を認識する抗体が用いられる。本発明のモノクロー
ナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例え
ば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリ
ーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の
抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの
ち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗
原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの
標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応
法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポ
リエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体など
を用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を
用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第
２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられ
る。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化
抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後
固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と
過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加
え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と
液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し
被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーで
は、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた
不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅
かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザ
ーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適
に用いられる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の
定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等
の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常
の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本
発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これら
の一般的な技術手段の詳細については、総説、成書など
を参照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオ
イムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江
寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、
昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」
（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら
編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２
年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunoch
emical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunoch
emical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunoch
emical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunoch
emical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mon
oclonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量
することができる。In the method for measuring the polypeptide of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having different sites to which the polypeptide of the present invention binds. Is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably used, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention. Is other than the C end, for example, N
Antibodies that recognize the ends are used. The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like. In the competitive method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody, or A solid-phase method using a soluble antibody as the first antibody and using a solid-phased antibody as the second antibody is used. In the immunometric method, an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Is reacted with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution. In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephelometry utilizing laser scattering is preferably used. In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. What is necessary is just to construct the measuring system of the polypeptide of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like. For example, Hiro Irie edited by "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Irie
Kan-edo “Radio immunoassay” (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme immunoassay” (Medical Shoin,
Published in 1983), edited by Eiji Ishikawa et al. “Enzyme immunoassay”
(Second Edition) (Medical Shoin, published in 1982), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (Third Edition) (Medical Shoin, Showa 62)
Years), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunoch
emical Techniques (Part A)), ibid.Vol. 73 (Immunoch
emical Techniques (Part B)), ibid.Vol. 74 (Immunoch
emical Techniques (Part C)), ibid.Vol. 84 (Immunoch
emical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)),
Ibid. Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Mon
oclonal Antibodies and General Immunoassay Method
s)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part
I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s)) (above, published by Academic Press). As described above, the polypeptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.

【００５４】さらには、本発明の抗体を用いて本発明の
ポリペプチドの濃度を定量することによって、本発明の
ポリペプチドの濃度の減少または増加が検出された場
合、例えば、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、
緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵
炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコー
ル性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピ
ー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳が
ん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リ
ンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，
大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿
病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病
性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不
全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペ
スウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジ
キン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染
症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリ
セリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染
症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ
状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，
アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，イン
シュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓
器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵
巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾
患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節
炎，精神***症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性
真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性
エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜
症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節
炎、下垂体ホルモン分泌不全、瀕尿、***、または神
経変成疾患等の疾病である、または将来罹患する可能性
が高いと診断することができる。また、本発明の抗体
は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリ
ペプチドを検出するために使用することができる。ま
た、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗
体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプ
チドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド
の挙動の分析などのために使用することができる。Furthermore, when a decrease or increase in the concentration of the polypeptide of the present invention is detected by quantifying the concentration of the polypeptide of the present invention using the antibody of the present invention, for example, hypertension, autoimmune disease , Heart failure, cataract,
Glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, Breast cancer, bulimia, binge eating, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis,
Colorectal cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A , Hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia , Hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma,
Allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Petchet disease, Peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic Diseases such as lupus erythematosus, transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion dysfunction, dysuria, uremia, or neurodegenerative disease Or are more likely to be affected in the future. Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide of the present invention, detection of the polypeptide of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the polypeptide of the present invention in test cells, etc. Can be used for

【００５５】（４）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺
伝子異常）を検出することができるので、例えば、該Ｄ
ＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下
や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多な
どの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを
用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザ
ンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノ
ミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１
９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエス
エー（Proceedings ofthe National Academy of Scienc
es of the United States of America），第８６巻，２
７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施す
ることができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンにより発現低下または過多が検出された場合は、
例えば、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内
障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，
急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性
肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性
皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過
食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性
白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸が
ん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合
併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜
症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ
型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイ
ルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン
病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高
カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド
血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，イン
シュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感
染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギ
ー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン
非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，
骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，
骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺
がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分
裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染
症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマ
トーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性
／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホ
ルモン分泌不全、瀕尿、***、または神経変成疾患等
である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと
診断することができる。(4) Gene Diagnostic Agent The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow,
(DNA, mRNA, etc.) encoding the polypeptide of the present invention in horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
It is useful as a gene diagnostic agent for damage, mutation or decreased expression of NA or mRNA, and increased or overexpressed DNA or mRNA. The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1)
989), Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America), Vol. 86, 2
766 to 2770 (1989)). For example, when expression reduction or excess is detected by Northern hybridization,
For example, hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis,
Acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn healing, cervix Cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colorectal cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetes Retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, A
Hepatitis B, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceride , Hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis , Non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation,
Osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer,
Bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, Gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion insufficiency, micturition, uremia, or neurodegeneration It can be diagnosed that there is a high possibility of being a disease or the like, or a high possibility of getting a disease in the future.

【００５６】（５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、高
血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バ
クテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイル
ス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アル
ツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バ
クテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食
症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢
性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／
直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿
病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，
ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ
型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染
症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ
感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム
血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂
血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依
存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性
黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，
腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖
尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，
骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェ
ット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流
性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神***症，敗血
症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺
がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一
過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴
呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不
全、瀕尿、***、または神経変成疾患等の疾病の治療
・予防剤として使用することができる。(5) Pharmaceuticals Containing Antisense DNA Antisense DNA that can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA includes, for example, hypertension, autoimmune diseases, heart failure, cataracts , Glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture , Breast cancer, bulimia bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colon cancer (colon /
Rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis,
Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, B
Hepatitis C, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, high Lipemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis,
Nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis,
Osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Petchet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, Severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, lower It can be used as a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as pituitary hormone secretion deficiency, micturition, uremia, or neurodegenerative disease.

【００５７】例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場
合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス
アソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクタ
ーに挿入した後、常套手段に従って実施することができ
る。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂
取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体
とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル
のようなカテーテルによって投与できる。さらに、該ア
ンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮ
Ａの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌ
クレオチドプローブとして使用することもできる。For example, when the antisense DNA is used, the antisense DNA may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by conventional means. Can be. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and then administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Furthermore, the antisense DNA can be used as the DN of the present invention in tissues and cells.
It can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of A and its expression status.

【００５８】（６）本発明の抗体を含有する医薬 本発明のポリペプチドを中和する作用を有する本発明の
抗体は、例えば、 高血圧、自己免疫疾患、心不全、白
内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，
急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，ア
ルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，
アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，
乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢
性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬
変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，
糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖
尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，
肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘ
ルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，
ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感
染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グ
リセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染
症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ
状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，
アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，イン
シュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓
器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵
巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾
患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節
炎，精神***症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性
真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性
エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜
症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節
炎、下垂体ホルモン分泌不全、瀕尿、***、または神
経変成疾患等の疾病の治療・予防剤などの医薬として使
用することができる。(6) Pharmaceuticals Containing Antibody of the Present Invention Antibodies of the present invention which have a neutralizing effect on the polypeptide of the present invention include, for example, hypertension, autoimmune diseases, heart failure, cataract, glaucoma, acute bacterial meninges Inflammation, acute myocardial infarction,
Acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis,
Atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture,
Breast cancer, bulimia, binge eating, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colorectal cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia,
Diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection,
Liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection,
Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive Staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma,
Allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Petchet disease, Peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic Diseases such as lupus erythematosus, transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion dysfunction, dysuria, uremia, or neurodegenerative disease It can be used as a medicament such as a therapeutic / prophylactic agent.

【００５９】本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・
予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医
薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に
対して経口的または非経口的に投与することができる。
投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなど
によっても異なるが、例えば、成人の神経疾患患者の治
療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１
回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、
好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好
ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５
回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により
投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口
投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。
症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量しても
よい。本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成
物として投与することができる。上記投与に用いられる
医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され
得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。
かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形と
して提供される。すなわち、例えば、経口投与のための
組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠
剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、
顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含
む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。か
かる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分
野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤
を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤
としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネ
シウムなどが用いられる。Treatment of the above diseases containing the antibody of the present invention
The prophylactic agent can be administered to humans or mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) orally or non-permanently as a solution as it is or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form. It can be administered orally.
The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.
The dose is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight,
Preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, 1 to 5 days a day
It is convenient to administer by intravenous injection about once, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered.
If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms. The antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration. That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills,
Examples include granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.

【００６０】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射
剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方
法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射
剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁
または乳化することによって調製する。注射用の水性液
としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補
助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、
例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコー
ル（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、
ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of
hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通
常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられ
る坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に
混合することによって調製される。上記の経口用または
非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよ
うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。
かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル
剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞ
れの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ
注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２
５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ま
しくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有し
てもよい。As compositions for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections and the like. In the dosage form. Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections. As an aqueous liquid for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and a suitable solubilizing agent,
For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant [eg, polysorbate 80,
HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of
hydrogenated castor oil)].
As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule. Suppositories to be used for rectal administration are prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base. The above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a unit dosage form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient.
Examples of such dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like. 10-2 for other dosage forms
Preferably, it contains 50 mg of the above antibody.
Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.

【００６１】（７）ＤＮＡ転移動物 本発明は、外来性の本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）また
はその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記す
る場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。す
なわち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト
哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、（３）
ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の
動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変
異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換え
ベクターを提供するものである。本発明の外来性ＤＮＡ
またはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、
本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受
精卵、***およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対
して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発
生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞
の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウ
ム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マ
イクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転
移することによって作出することができる。また、該Ｄ
ＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞な
どに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培
養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これ
ら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により
融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出す
ることもできる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウ
シ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモ
ット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。
なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生お
よび生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲ
ッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５
７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ
６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動
物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動
物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが
あげられる。(7) DNA-Transferred Animal The present invention relates to a DNA encoding the exogenous polypeptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (the exogenous mutant DNA of the present invention) Which may be abbreviated as such). That is, the present invention provides (1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof, (2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent, (3)
(2) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or a rat; and (4) a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. . Exogenous DNA of the present invention
Or a non-human mammal having the mutant DNA thereof (hereinafter, referred to as
The DNA-transferred animal of the present invention is preferably used for unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, etc., preferably at the stage of embryo development in non-human mammal development (more preferably Is a single cell or fertilized egg cell stage and generally before the 8-cell stage), calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DE
It can be produced by transferring the target DNA by the AE-dextran method or the like. In addition, the D
By the NA transfer method, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing cells with a cell fusion method known per se. As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used.
Above all, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, particularly mice (for example, C5
As a hybrid line such as 7BL / 6 line and DBA2 line, B
6C3F 1 system, BDF 1 system, B6D2F 1 system, BA
LB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) are preferred. "Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.

【００６２】本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペ
プチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本
発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発
現させるＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮ
Ａは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺
乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対
象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞
で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコ
ンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例え
ば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同
性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例え
ば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラ
ット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プ
ロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤ
ＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動
物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェ
クションすることによって本発明のＤＮＡを高発現する
ＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention,
Specifically, DNA in which addition or deletion of a base, substitution with another base, or the like has occurred is used, and abnormal DNA is also included. The abnormal DNA refers to a DNA that expresses an abnormal polypeptide of the present invention, and for example, a DNA that expresses a polypeptide that suppresses the function of the normal polypeptide of the present invention is used. Exogenous DN of the present invention
A may be derived from a mammal of the same species or a different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, DNAs derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto are expressed. Downstream of various promoters that can be made to bind to the human DNA of the present invention.
A DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced by microinjecting an NA construct (eg, a vector, etc.) into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.

【００６３】本発明のポリペプチドの発現ベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、
ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の
プロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、
ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、
エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸
性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、
血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ
１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭ
Ｐ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロ
フィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房
ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナー
ゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウム
アデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−
１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシ
ン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロ
ブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（Ｖ
ＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用
いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサ
イトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖
延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよ
びニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とす
るメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各
ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミア
ンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。Examples of the expression vector of the polypeptide of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as λ phage, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses such as are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used. The above DN
Examples of promoters that regulate A expression include, for example,
Promoters of DNAs derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), various mammals (human, rabbit, dog, cat,
Guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II,
Uroplakin II, elastase, erythropoietin,
Endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase,
Platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K
14. Collagen type I and type II, cyclic AM
P-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPas)
e), neurofilament light chain, metallothionein I
And IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1α (EF-
1α), β actin, α and β myosin heavy chains, myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (V
NP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, preproenkephalin A, vasopressin and other promoters. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a promoter of human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), and human and chicken β-actin promoters are preferable.
The above-mentioned vector preferably has a sequence that terminates transcription of a messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally called a terminator). A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.

【００６４】その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに
高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナ
ル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部
などをプロモーター領域の５´上流、プロモーター領域
と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３´下流 に連結する
ことも目的により可能である。正常な本発明のポリペプ
チドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、
ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラッ
ト、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維
芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブ
ラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、ま
たは肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡよ
り公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として
取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、
上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチド
の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域
を作製することができる。該翻訳領域は転移動物におい
て発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロ
モーターの下流および所望により転写終結部位の上流に
連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製すること
ができる。受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮ
Ａの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のす
べてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出
動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在
することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞お
よび体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持する
ことを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこ
の種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべて
に本発明の外来性ＤＮＡを有する。本発明の外来性正常
ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来
性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保
有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来
る。受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転
移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過
剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動
物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存
在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞およ
び体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する
ことを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこ
の種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに
本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。In addition, in order to further express the desired foreign DNA, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of eukaryotic DNA, and the like are placed 5 'upstream of the promoter region, and between the promoter region and the translation region. Alternatively, it can be linked to the 3 'downstream of the translation region depending on the purpose. The normal translation region of the polypeptide of the present invention may be human or various mammals (for example,
Rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) derived liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA and all or part of genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or liver, Complementary DNA prepared by known methods from RNA derived from kidney, thyroid cells, and fibroblasts can be obtained as a raw material. In addition, foreign abnormal DNA is
A translation region obtained by mutating the translation region of a normal polypeptide obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method can be prepared. The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site. Exogenous DN of the invention at the fertilized egg cell stage
Metastasis of A is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. . Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all the offspring
Breeding passages can be made to have excess NA.

【００６５】本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内
在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に
本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあ
り、その病態モデル動物として利用することができる。
例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明
のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチド
が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の
治療方法の検討を行なうことが可能である。また、本発
明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離し
た本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、
本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬の
スクリーニング試験にも利用可能である。一方、本発明
の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配に
より外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該Ｄ
ＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育すること
が出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラ
スミドに組み込んで原科として用いることができる。プ
ロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ
工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞
段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動
物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保
される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本
発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が
全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常Ｄ
ＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを
受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および
体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮ
Ａを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫
が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and finally promotes the function of the endogenous normal DNA to thereby finally convert the polypeptide of the present invention. It may develop hyperfunction and can be used as a model animal for the disease.
For example, using the normal DNA transgenic animal of the present invention, elucidation of the hyperfunction of the polypeptide of the present invention and the pathological mechanism of a disease associated with the polypeptide of the present invention, and examination of a method for treating these diseases. It is possible. Further, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention,
The present invention can also be used for screening tests for therapeutic drugs for diseases related to the polypeptide of the present invention. On the other hand, the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention was confirmed to stably maintain the foreign DNA by mating, and
It can be reared in a normal breeding environment as an NA-bearing animal. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-described plasmid and used as a source material. The DNA construct with the promoter is a normal DNA
It can be produced by engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all of the offspring of the produced animal have the abnormal D of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
It means having NA. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. Introduction DN
A homozygous animal having A in both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed and passage so that all offspring have the DNA.

【００６６】本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内
在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に
本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となること
があり、その病態モデル動物として利用することができ
る。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本
発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の
解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可
能である。また、具体的な利用可能性としては、本発明
の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機
能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドに
よる正常ポリペプチドの機能阻害（dominant negative
作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異
常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポ
リペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリ
ペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬ス
クリーニング試験にも利用可能である。また、上記２種
類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性とし
て、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された
ポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリ
ペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペ
プチドとの関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体
作製などが考えられる。 さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポ
リペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明の
ポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることが
でき、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデ
ルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、
新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的
疾患の研究および治療に貢献することができる。また、
本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切
後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離
したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細
胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明
のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化
あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナ
ル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどがで
き、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための
有効な研究材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動
物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応
症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療
薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法な
どを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニン
グ法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮ
Ａ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを
用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ
治療法を検討、開発することが可能である。The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level. It may be functionally inactive refractory, and can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the polypeptide of the present invention and to examine a method for treating this disease. In addition, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of a normal polypeptide by the abnormal polypeptide of the present invention (dominant negative) in the inactive refractory type of the polypeptide of the present invention.
Action). In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention, it is used in a therapeutic drug screening test for the polypeptide of the present invention or a functionally inactive refractory disease. Is also available. Other possible uses of the above two DNA-transferred animals of the present invention include, for example, use as a cell source for tissue culture, and DNA or R in the tissues of the DNA-transferred animal of the present invention.
Analysis of the relevance to polypeptides specifically expressed or activated by the polypeptide of the present invention by directly analyzing NA or analyzing polypeptide tissue expressed by DNA; Tissue having DNA The cells are cultured by standard tissue culture techniques and used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture, screening for agents that enhance cell function by using the cells described above, and Isolation and purification of the mutant polypeptide of the present invention and production of its antibody can be considered. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease associated with the polypeptide of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention, and the like. More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the polypeptide of
It can contribute to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the diseases. Also,
Each organ is taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells by using a protease such as trypsin. Furthermore, it is possible to examine the specificity of the polypeptide-producing cell of the present invention, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the mechanism of signal transduction in them, and to investigate their abnormalities. It is an effective research material for elucidation. Furthermore, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the polypeptide of the present invention, including the inactive refractory type of the polypeptide of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using the method and the quantitative method. In addition, the DN of the present invention
A transgenic animal or DNA of a disease associated with the polypeptide of the present invention using the exogenous DNA expression vector of the present invention.
It is possible to study and develop treatments.

【００６７】（８）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本
発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為
的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制す
るか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリ
ペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮ
Ａが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない
（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがあ
る）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記
する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前記と同様の
ものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的に変異を加
える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該
ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入また
は置換させることによって行なうことができる。これら
の変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらした
り、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊するこ
とにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよ
い。(8) Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention. That is, the present invention provides (1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
(2) the embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli); (4) The embryonic stem cell according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent, (5) the embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse, 6) a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated; (7) the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli); The non-human mammal according to (6), wherein the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention,
(8) The non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is a rodent, (9) the non-human mammal according to (8), wherein the rodent is a mouse, and (10) D) administering the test compound to the animal described in (7) and detecting the expression of the reporter gene;
A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits a promoter activity for NA is provided. A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, or By substantially eliminating the activity of the polypeptide of the present invention encoded by the DNA, DN
A refers to embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells) of a non-human mammal that does not substantially have the ability to express the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). As the non-human mammal, the same one as described above is used. The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. The knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.

【００６８】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能
を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲ
ＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子
を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖
（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例
えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得ら
れたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近
傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ
ーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤ
ＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本
発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマー
としたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥ
Ｓ細胞を選別することにより得ることができる。また、
相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元
のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立さ
れたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方
法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウ
スのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ
細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりして
いないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景
が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ
５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさ
をＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス
（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立
したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採
卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加え
て、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用
いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したと
き、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでそ
の遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可
能である点で有利に用い得る。また、ＥＳ細胞を樹立す
る場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用する
が、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して
用いることにより効率よく多数の初期胚を取得すること
ができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよい
が、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出する
のに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するた
めにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望まし
い。Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by the target non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloram). A DNA sequence that disrupts exon functions by inserting a reporter gene or the like typified by the phenicol acetyltransferase gene) or terminates transcription of the gene in an intron between exons (eg, polyA
Additional messenger R)
By disabling the synthesis of NA, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination. The obtained ES cells were analyzed by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or D on a targeting vector.
The NA sequence and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector were analyzed by PCR using primers, and the knockout E of the present invention was analyzed.
It can be obtained by selecting S cells. Also,
As the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or a new ES cell may be newly established according to the known Evans and Kaufma method. May be done. For example, in the case of mouse ES cells, at present, generally, 129-line ES cells
Although cells have been used, the immunological background is not clear. For example, C-cells may be used to obtain ES cells having a purely immunologically clear genetic background instead of pure cells.
C57BL / 6 mice and C57BL / 6 egg number of lack of such even better ones were established using (F 1 of C57BL / 6 and DBA / 2) BDF 1 mice improved by crossing with DBA / 2 Can be used. BDF 1 mice are often egg number, and, in addition to the advantage that the egg is tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when the ES cells obtained therefrom, which were generated pathological model mice , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing. In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. In addition, a large number of blastocysts can be obtained efficiently by collecting 8-cell stage embryos and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained. Either male or female ES cells may be used, but generally male ES cells are more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.

【００６９】ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例え
ば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を
増幅、検出する方法が、その１例としてあげることがで
きる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするの
に約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロ
ニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初
期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別
で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能
にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バン
ディング法による染色体数の確認等により行うことがで
きる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％
が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な
場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常
細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である
細胞）に再びクローニングすることが望ましい。このよ
うにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変
良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深
く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維
芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−
１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましく
は、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭
酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法
で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ
溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５
ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意した
フィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。この
ような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細
胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場
合はその培養細胞は放棄することが望まれる。ＥＳ細胞
は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養する
か、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することに
より、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞
に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H.
Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981
年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1
981年；T. C. Doetschmanら、ジャーナル・オブ・エン
ブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォ
ロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を
分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、イ
ンビトロにおける本発明のポリペプチドまたは本発明の
レセプター蛋白質の細胞生物学的検討において有用であ
る。As a method of determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned. By using this method, the number of ES cells of about 1 colony (about 50 cells) is sufficient, whereas the conventional method required about 10 6 cells for karyotype analysis. The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be greatly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is 100% of the normal number
However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, etc., the gene of the ES cell is knocked out and then cloned again into a normal cell (for example, a mouse having 2n = 40 chromosomes). It is desirable. The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenetic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, LIF (1-
Culturing at about 37 ° C. in a carbon dioxide incubator (preferably, 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air) in the presence of 10,000 U / ml) At the time of passage, for example, trypsin / EDTA
Solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5
mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / 1m
(M EDTA) treatment, and seeding on a newly prepared feeder cell. Such passage is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells. ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscles, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH
Kaufman, Nature, 292, 154, 1981.
Year; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1
981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], insufficiency of expression of the DNA of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention. Cells are useful in in vitro cell biological studies of the polypeptides of the invention or the receptor proteins of the invention.

【００７０】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間
接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区
別することが可能である。該非ヒト哺乳動物としては、
前記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製し
たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマ
ウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベク
ターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺
伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵
細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換
えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウト
させることができる。本発明のＤＮＡがノックアウトさ
れた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ
配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解
析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、
ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発
明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマー
としたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非
ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換
えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をク
ローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞
期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製した
キメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植
する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ
細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と
の両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物
の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場
合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することに
より得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を
加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体
を、例えば、コートカラーの判定等により選別すること
により得られる。このようにして得られた個体は、通
常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であ
り、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋
白質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔
から本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋
白質のホモ発現不全個体を得ることができる。The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. is there. As the non-human mammal,
The same as described above is used. The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination. Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out are those on or near the DNA of the present invention.
A DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the sequence as a probe,
The determination can be made by analysis by PCR using a DNA sequence in a nearby region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as the targeting vector as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of a non-human mammalian stem cell. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color. The individual thus obtained is usually an individual with a heterozygous expression deficiency of the polypeptide of the present invention, and mated with an individual with a heterozygous expression of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention. Thus, an individual deficient in homoexpression of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention can be obtained.

【００７１】卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞
核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入
することによりターゲッティングベクターを染色体内に
導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ること
ができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に
比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変
異のあるものを選択することにより得られる。このよう
にして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体
は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックア
ウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継
代を行なうことができる。さらに、生殖系列の取得およ
び保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活
化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、
該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴー
ト動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、
母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数に
なるような状態で飼育することにより効率的に得ること
ができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配すること
により、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよび
ヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡ
が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明の
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に
有用である。また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプタ
ー蛋白質により誘導され得る種々の生物活性を欠失する
ため、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター
蛋白質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデル
となり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の
検討に有用である。When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg cell by a microinjection method. Compared to a non-human mammal, it can be obtained by selecting a DNA locus of the present invention having a mutation by homologous recombination. In this way, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating. Furthermore, the acquisition and maintenance of the germ line may be performed according to a conventional method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA,
A homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal is
It can be obtained efficiently by rearing mother animals in such a manner that one normal individual and one or more homozygote are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged. DNA of the present invention
The non-human mammalian embryonic stem cells in which is inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention. In addition, since the non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention It can be used as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.

【００７２】（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予
防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を
観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠
損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を
有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。該スクリーニング方法において用いられる本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものがあげられる。試験化合物としては、例えば、ペ
プチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、
発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出
液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物
であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具体
的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試
験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物
の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試
験化合物の治療・予防効果を試験することができる。試
験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、
経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、
試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することがで
きる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化
合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。(8a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage according to the present invention.
It can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by NA deficiency or damage. That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against a disease. Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above. Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds,
Examples include fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. These compounds may be novel compounds or known compounds. Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / preventive effects of the compounds can be tested. As a method of treating a test animal with a test compound, for example,
Oral administration, intravenous injection, etc. are used,
It can be appropriately selected according to the properties of the test compound. In addition, the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, properties of the test compound, and the like.

【００７３】例えば、高血圧、自己免疫疾患、心不全、
白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗
塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候
群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈
硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，
骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部が
ん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵
炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン
病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神
経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロ
リ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝
炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイル
ス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマ
ウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール
血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフル
エンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵
襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発
性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リン
パ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞
肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨
粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末
梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウ
マチ関節炎，精神***症，敗血症，敗血症ショック，重
症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃が
ん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結
核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠
症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全、瀕尿、***、
または神経変成疾患等に対して治療・予防効果を有する
化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現
不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置
前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値
および体重変化などを経時的に測定する。For example, hypertension, autoimmune diseases, heart failure,
Cataract, glaucoma, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer,
Fracture, breast cancer, bulimia bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colorectal cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia , Diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection Disease, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin dependence Diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin Diabetics (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer, bone Petchet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux Esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient ischemic attack, tuberculosis, heart Valvular disease, vascular / multiple infarct dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion deficiency, micturition, uremia,
Or, when screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on neurodegenerative disease, etc., perform glucose tolerance treatment on a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, and administer a test compound before or after glucose tolerance treatment, The blood glucose level and weight change of the animal are measured over time.

【００７４】該スクリーニング方法において、試験動物
に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約
１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは
約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患
に対して治療・予防効果を有する化合物として選択する
ことができる。該スクリーニング方法を用いて得られる
化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であ
り、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引
き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するの
で、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの
医薬として使用することができる。さらに、上記スクリ
ーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様
に用いることができる。該スクリーニング方法で得られ
た化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩とし
ては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸な
ど）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは
有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸など）との塩などが用いられる。該スクリーニン
グ方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬
は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同
様にして製造することができる。このようにして得られ
る製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまた
は哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウ
サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する
場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）において
は、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合
物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異
なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６
０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を
約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０
ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静
脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場
合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することがで
きる。In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, if the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test The compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases. The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the polypeptide of the present invention. It can be used as a medicament such as a safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agent against Further, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner. The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like are used. A medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the polypeptide of the present invention. The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered. The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the dose per day The compound is used in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 1.0 mg.
Administer 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
0 mg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg of the compound per day.
It is convenient to administer about mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.

【００７５】（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニン
グ方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものがあげられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。本発明
のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本
発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在する
ので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ
ースすることにより、プロモーターの活性を検出するこ
とができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発
明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプ
チドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従っ
て、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−
ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色するこ
とにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内に
おける発現状態を観察することができる。具体的には、
本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片を
グルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩
液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室
温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させ
た後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄
することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止さ
せ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃ
ＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。上記スクリ
ーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、
上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明
のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害す
る化合物である。該スクリーニング方法で得られた化合
物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、
生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基
（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生
理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩と
しては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、
酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コ
ハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香
酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との
塩などが用いられる。(8b) Method for Screening Compound Promoting or Inhibiting the Activity of Promoter for DNA of the Present Invention The present invention relates to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound and detecting the expression of a reporter gene. In the above-mentioned screening method, the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used. Examples of the test compound include the same compounds as described above. As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable. The DN of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene
In a non-human mammal deficient in A expression, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the activity of the promoter can be detected by tracing the expression of a substance encoded by the reporter gene. For example, when a part of the DNA region encoding the polypeptide of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the tissue expressing the polypeptide of the present invention originally should Β-galactosidase is expressed instead of the peptide. Thus, for example, β-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal)
By staining with a reagent serving as a substrate for galactosidase, the expression state of the polypeptide of the present invention in an animal body can be easily observed. In particular,
The polypeptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with a phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal-containing staining solution at room temperature or around 37 ° C. for about 30 minutes. After reacting for 1 minute to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Also, according to the usual method, lac
The mRNA encoding Z may be detected. A compound or a salt thereof obtained by using the above screening method,
A compound selected from the test compounds described above, which promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention. The compound obtained by the screening method may form a salt, as a salt of the compound,
Salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, etc.) and bases (eg, organic acids, etc.) are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg,
Examples thereof include salts with acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.

【００７６】本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性
を促進または阻害する化合物またはその塩は、本発明の
ポリペプチドの発現を促進または阻害し、該ポリペプチ
ドの機能を促進または阻害することができるので、例え
ば、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、
急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性
ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝
炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮
膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食
症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白
血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん
（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併
症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜
症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ
型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイ
ルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン
病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高
カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド
血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，イン
シュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感
染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギ
ー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン
非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，
骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，
骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺
がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分
裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染
症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマ
トーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性
／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホ
ルモン分泌不全、瀕尿、***、または神経変成疾患等
の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬
として有用である。さらに、上記スクリーニングで得ら
れた化合物から誘導される化合物も同様に用いることが
できる。Compounds or salts thereof that promote or inhibit the promoter activity of the DNA of the present invention can promote or inhibit the expression of the polypeptide of the present invention and promote or inhibit the function of the polypeptide. , Hypertension, autoimmune disease, heart failure, cataract, glaucoma,
Acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bladder cancer, fracture, breast cancer, Bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic pancreatitis, cirrhosis, colorectal cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications Disease, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, gastritis, Helicobacter pylori infection, liver failure, A
Hepatitis B, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, Hodgkin's disease, AIDS infection, human papillomavirus infection, hypercalcemia, hypercholesterolemia, hyperglyceride , Hyperlipidemia, infection, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), invasive staphylococcal infection, malignant melanoma, cancer metastasis, multiple myeloma, allergic rhinitis, nephritis , Non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, organ transplantation,
Osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer,
Bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, prostate cancer, reflux esophagitis, renal failure, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, severe systemic fungal infection, small cell lung cancer, spinal cord injury, Gastric cancer, systemic lupus erythematosus, transient cerebral ischemic attack, tuberculosis, valvular heart disease, vascular / multiple infarction dementia, wound healing, insomnia, arthritis, pituitary hormone secretion insufficiency, micturition, uremia, or neurodegeneration It is useful as a drug such as a safe and low toxic therapeutic / prophylactic agent for diseases such as diseases. Further, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.

【００７７】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペ
プチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造す
ることができる。このようにして得られる製剤は、安全
で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例
えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、
ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異は
あるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成
人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化
合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。
非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投
与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本
発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合
物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与す
る場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。一方、例えば、本
発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合
物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇと
して）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１
００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好まし
くは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する
場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患な
どによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対す
るプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通
常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき
該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与
することができる。このように、本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩を
スクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤ
ＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防
・治療薬の開発に大きく貢献することができる。また、
本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤ
ＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする
遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆ
るトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成す
れば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体
での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロ
モーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これ
が発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペ
プチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もし
くは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使
用できる。A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the polypeptide of the present invention or a salt thereof. The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep,
Pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like. For example, when the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is orally administered, it is generally used in adults (body weight). 60 kg), from about 0.1 to 100 mg, preferably from about 1.0 to 5 mg of the compound per day.
0 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, a compound that promotes the promoter activity for DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult ( 60 kg), the compound is administered by intravenous injection at a rate of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg. On the other hand, for example, when the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is orally administered, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 1 per day.
00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that inhibits the promoter activity against DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( 60 mg), about 0.01 to 30 mg of the compound per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day.
Conveniently, about mg is administered by intravenous injection.
In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg. As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter of the DNA of the present invention.
It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by the insufficiency of NA expression or the development of preventive / therapeutic agents. Also,
D containing the promoter region of the polypeptide of the present invention
By using NA, genes encoding various proteins are ligated downstream and injected into the egg cells of an animal to create a so-called transgenic animal (transgenic animal). Then, it becomes possible to examine the action in the living body. Furthermore, by binding an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed, a low molecule having the action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the polypeptide of the present invention itself. It can be used as a compound search system.

【００７８】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｉ ：イノシン Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ） Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ） Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ） Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ） Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基 ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル ＤＣＭ ：ジクロロメタン ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン ＣＨＯ ：ホルミル Ｃl2Ｂzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸In the present specification and drawings, when bases, amino acids and the like are represented by abbreviations, IUPAC-IUB
Abbreviations from the Commission on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field,
An example is given below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine I: inosine R: adenine (A) or guanine (G) Y: thymine (T) or cytosine (C) M: adenine (A) or cytosine (C) K: guanine (G) or thymine (T) S: guanine (G) or cytosine (C) W: adenine (A) or thymine (T) B: guanine (G), guanine ( G) or thymine (T) D: adenine (A), guanine (G) or thymine (T) V: adenine (A), guanine (G) or cytosine (C) N: adenine (A), guanine (G) , Cytosine (C) or thymine (T) or unknown or other base RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid d TP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid SDS: sodium dodecyl sulfate BHA: benzhydrylamine pMBHA : P-methylbenzhydrylamine Tos: p-toluenesulfonyl Bzl: benzyl Bom: benzyloxymethyl Boc: t-butyloxycarbonyl DCM: dichloromethane HOBt: 1-hydroxybenztriazole DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide TFA: tri trifluoroacetic acid DIEA: diisopropylethylamine CHO: formyl Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Z: Benjiruo Cicarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl DNP: dinitrophenol Trt: trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOOBt: 3, 4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile : Isoleucine Ser: Serine Thr: Threonine Cys: Cysteine Met: Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyrosine Syn Trp: Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine pGlu: Pyroglutamic acid

【００７９】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕後述の実施例１で得られた本発明のポ
リペプチド（ヒト型）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕後述の実施例１で用いられるプライマ
ーＬＦ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕後述の実施例１で用いられるプライマ
ーＬＲ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕後述の実施例１で得られた本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列中、シグナル配列と予想され
るＮ末端から１〜２４番の部分アミノ酸配列が欠失した
アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６〕 配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕ヒト型アルファサブユニットのアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：８〕 配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：９〕後述の実施例２で用いられるプライマ
ーｒ２５Ｆ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕後述の実施例１で用いられるプライ
マーｒ２５Ｒ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：１１〕後述の実施例２で得られた本発明の
ポリペプチド（ラット型）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１２〕 配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を有する本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１３〕後述の実施例２で得られた本発明の
ポリペプチドのアミノ酸配列中、シグナル配列と予想さ
れるＮ末端から１〜２３番の部分アミノ酸配列が欠失し
たアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４〕 配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を有する本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１５〕後述の実施例３で用いられるプライ
マーVHFX1の塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕後述の実施例３で用いられるプライ
マーVHRN1の塩基配列を示す。The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of the polypeptide (human type) of the present invention obtained in Example 1 described later. [SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. [SEQ ID NO: 3] This shows the base sequence of primer LF2 used in EXAMPLE 1, which will be described later. [SEQ ID NO: 4] This shows the base sequence of primer LR1 used in EXAMPLE 1, which will be described later. [SEQ ID NO: 5] This shows the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention obtained in Example 1 described later in which the partial amino acid sequence of positions 1 to 24 from the N-terminal, which is predicted to be a signal sequence, has been deleted. . [SEQ ID NO: 6] This shows the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5. [SEQ ID NO: 7] This shows the amino acid sequence of human alpha subunit. [SEQ ID NO: 8] This shows the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. [SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of primer r25F2 used in EXAMPLE 2, which will be described later. [SEQ ID NO: 10] This shows the base sequence of primer r25R1 used in EXAMPLE 1, which will be described later. [SEQ ID NO: 11] This shows the amino acid sequence of the polypeptide (rat type) of the present invention obtained in Example 2 described later. [SEQ ID NO: 12] This shows the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. [SEQ ID NO: 13] This shows the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention obtained in Example 2 described later in which the partial amino acid sequence of positions 1 to 23 from the N-terminal, which is predicted to be a signal sequence, has been deleted. . [SEQ ID NO: 14] This shows the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13. [SEQ ID NO: 15] This shows the base sequence of primer VHFX1 used in EXAMPLE 3, which will be described later. [SEQ ID NO: 16] This shows the base sequence of primer VHRN1 used in EXAMPLE 3, which will be described later.

【００８０】[0080]

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。実施例１で得られたプラスミドpT
AhGTHL6を保持するEscherichia coli JM109/pTAhGTHL6
は２０００年１１月９日に日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）の通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にＦＥ
ＲＭ ＢＰ−７３５６として寄託され、また２０００年
１０月２４日に日本国大阪市淀川区十三本町２丁目１７
番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ１６４８９として寄託されて
いる。実施例２で得られたプラスミドｐｒＧＯＮ７を保
持するEscherichia coli JM109/prGON7は２０００年１
１月９日にＮＩＢＨにＦＥＲＭ ＢＰ−７３５４として
寄託され、また２０００年１０月２４日にＩＦＯにＩＦ
Ｏ１６４８７として寄託されている。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but it should not be construed that the invention is limited thereto. In addition, the genetic manipulation method using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning. Plasmid pT obtained in Example 1
Escherichia coli JM109 / pTAhGTHL6 carrying AhGTHL6
FE was sent to NIBH on November 9, 2000 at 1-3-1 Higashi (Tsukuba 305-8566), Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan.
Deposited as RM BP-7356, and on October 24, 2000 2--17 Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Japan
No. 85 (Zip code 532-8686) and deposited at the Institute of Fermentation (IFO) as IFO16489. Escherichia coli JM109 / prGON7 carrying the plasmid prGON7 obtained in Example 2 was
Deposited on January 9 at NIBH as FERM BP-7354 and on October 24, 2000 at IFO
It has been deposited as O16487.

【００８１】実施例１ ヒト下垂体poly(A)+RNA画分か
らのcDNA合成とRT-PCR法による新規ホルモンVH098489の
cDNAの取得 クローンテック社より購入したヒト下垂体poly(A)+RNA
画分1μgにプライマーとしてOligo (dT)プライマー（Gi
bcoBRL社）を加え、モロニイマウス白血病ウイルスの逆
転写酵素（GibcoBRL社）により、添付バッファーを用い
てcDNAを合成した。反応産物はエタノール沈殿を行った
後、100μlのTEに溶解した。調製したcDNA 0.1μlを鋳
型として、以下の２種類の合成DNAを用いて、PCRによる
増幅を行った。 LF2:5’-CGGAAGAGCAGCATGAAGCTGGCATTC-3’（配列番号：３） LR1:5’-CATGTGCTGCTCACACAGGTGGGTCTG-3’（配列番号：４） PCRの反応液はcDNA溶液0.1μl（ 1 ng poly(A)+RNA由
来）、0.5μl LF2（10μM）、0. 5μl LR1（10 μM）、
2.5μl添付の10 x反応液、2.5 μldNTP（10mM）、0.25
μl Ex Taq（タカラ）、18.65 μl蒸留水を加えて合計2
5μlにした。反応液をThermalCycler9600を用いてPCR反
応にかけた。PCRの条件は95 ℃・2 分の変性の後、98
℃・10 秒、65 ℃・10 秒、72 ℃・20秒のサイクルを35
回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気泳動で約450
bpのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物をQuiagen P
CR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を
行ったところ図１で示す配列がえられた。図１のDNA配
列から予測されるアミノ酸配列は図２に示すものであっ
た。予測されるアミノ酸配列のN末端領域には疎水性の
高い典型的なシグナル配列が存在し、この蛋白質が２４
番目のGlyと２５番目のAlaの周辺で切断されて分泌され
ることが予想された。また87番目のAsnが糖鎖の付加を
受ける可能性のあることが配列から予想された。さらに
S-S結合は他のホルモンとの比較より、36-84、50-99、6
0-115、64-117、120-127番目のシステイン残基の間でで
きていることが予想された。特に興味深いことはLH、FS
H、TSH等に置いてアルファサブユニットとの会合に必須
と考えられているS-S結合をとりうるシステインが欠落
しておりこの新規ホルモンVH098489がサブユニット構造
を取らずに単独でも作用しうることが示唆された。得ら
れた配列の相同性を調べたところ既知の下垂体由来のホ
ルモン、特にLH、FSH、TSHなどのベーターサブユニット
と高い相同性を示した(図３)。また、約450bpのPCR産物
をTA cloning kit (Invitrogen社)のマニュアルに従
い、クローニングベクターpCR2.1Topoへ挿入し、大腸菌
JM109に導入して形質転換体E. coli JM109/pTAhGTHL6を
得た。Example 1 Synthesis of cDNA from human pituitary poly (A) + RNA fraction and synthesis of novel hormone VH098489 by RT-PCR
Obtaining cDNA Human pituitary poly (A) + RNA purchased from Clonetech
Oligo (dT) primer (Gi
bcoBRL), and cDNA was synthesized using Moroni murine leukemia virus reverse transcriptase (GibcoBRL) using the attached buffer. After ethanol precipitation, the reaction product was dissolved in 100 μl of TE. Amplification by PCR was performed using 0.1 μl of the prepared cDNA as a template and the following two types of synthetic DNAs. LF2: 5'-CGGAAGAGCAGCATGAAGCTGGCATTC-3 '(SEQ ID NO: 3) LR1: 5'-CATGTGCTGCTCACACAGGTGGGTCTG-3' (SEQ ID NO: 4) 0.1 μl of the PCR reaction solution (derived from 1 ng poly (A) + RNA) , 0.5 μl LF2 (10 μM), 0.5 μl LR1 (10 μM),
2.5 μl attached 10 x reaction solution, 2.5 μldNTP (10 mM), 0.25
μl Ex Taq (Takara), add 18.65 μl distilled water for a total of 2
Made up to 5 μl. The reaction solution was subjected to a PCR reaction using a ThermalCycler 9600. PCR conditions were denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by 98
Cycle for 10 seconds at 65 ° C for 10 seconds and 20 seconds at 72 ° C for 35 seconds.
Repeated times. Approximately 450 by electrophoresis using a part of the PCR product
After confirming the amplification of the bp PCR product, the PCR product was
Purification using the CR purification Kit and direct sequencing revealed the sequence shown in FIG. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence shown in FIG. 1 is shown in FIG. A typical signal sequence having high hydrophobicity is present in the N-terminal region of the predicted amino acid sequence.
It was expected to be cleaved and secreted around the Gly and the Ala at the 25th. It was also predicted from the sequence that Asn at position 87 could undergo sugar chain addition. further
SS binding is 36-84, 50-99, 6
It was expected that it was formed between cysteine residues 0-115, 64-117 and 120-127. Of particular interest is LH, FS
The lack of cysteine that can take the SS bond, which is considered essential for the association with the alpha subunit in H, TSH, etc., is lacking, and this new hormone VH098489 can act alone without taking the subunit structure It was suggested. When the homology of the obtained sequence was examined, it showed high homology with known pituitary hormones, particularly with beta subunits such as LH, FSH and TSH (FIG. 3). In addition, the PCR product of about 450 bp was inserted into the cloning vector pCR2.1Topo according to the manual of TA cloning kit (Invitrogen), and E. coli
The transformant was introduced into JM109 to obtain a transformant E. coli JM109 / pTAhGTHL6.

【００８２】実施例２ ラット胸腺からの新規ホルモン
VH098489のラット型cDNAの取得 ラット胸腺poly(A)+RNAから合成したｃDNAを鋳型とし
て、ラット型の新規ホルモンVH098489cDNAをPCR法にて
取得した。開始コドンの上流域と終始コドンの下流域に
それぞれ1本のプライマー r25F2: 5’-AGGCAGCCTGATAACAGAAGGGAGAG-3’ (配列番号:９) r25R1: 5’-CTTGGGCCACCAGCCATGACTGTGCT-3’ (配列番号:１０) を合成した。ラット胸腺poly(A)+RNAよりSuperScriptII
reverse transcriptase(GIBCO BRL社) とrandom 7 mer
(GIBCO BRL社) を用いて合成したcDNAを鋳型としてPCR
を行った。PCR反応液はAdvantage 2 polymerase (Clont
ech社)をDNA polymeraseとして用い、これに添付のバッ
ファー2.5μｌ、各プライマー 200pMと各0.1mM dNTPを
混ぜて総反応液量25μｌとして調製し、98℃ 10秒、68
℃ 45秒のサイクルを３４サイクル繰り返した。PCR反応
産物を2%アガロース電気泳動に付し、バンドをエチジウ
ムブロミド染色によって検出した。その結果得られた約
540bpのバンドをQIA quick Gel Extraction Kit（Quiag
en）を用いて精製し、TA cloning kit (Invitrogen社)
のマニュアルに従い、クローニングベクターpCR2.1 TOP
Oへ挿入、大腸菌JM109に導入して形質転換体E.coli JM1
09 / prGON7を得た。このプラスミドprGON7に挿入され
ている配列（配列番号：１２）を決定し、該塩基配列お
よびそれにコードされるラット型の新規ホルモンVH0984
89の予測されるアミノ酸配列（配列番号：１１）を図４
に示した。また実施例１に示したヒト型配列との比較を
図５に示した。Example 2 Novel Hormone from Rat Thymus
Acquisition of rat-type cDNA of VH098489 Using a cDNA synthesized from rat thymus poly (A) + RNA as a template, a rat-type novel hormone VH098489 cDNA was obtained by PCR. One primer r25F2: 5'-AGGCAGCCTGATAACAGAAGGGAGAG-3 '(SEQ ID NO: 9) was synthesized in each of the upstream region of the start codon and the downstream region of the stop codon. R25R1: 5'-CTTGGGCCACCAGCCATGACTGTGCT-3' (SEQ ID NO: 10) was synthesized. . Superscript II from rat thymus poly (A) + RNA
reverse transcriptase (GIBCO BRL) and random 7 mer
PCR using cDNA synthesized using (GIBCO BRL) as a template
Was done. PCR reaction solution is Advantage 2 polymerase (Clont
ech) as a DNA polymerase, 2.5 μl of the attached buffer, 200 pM of each primer and 0.1 mM dNTP were mixed to prepare a total reaction volume of 25 μl.
A cycle of 45 ° C. was repeated 34 times. The PCR reaction product was subjected to 2% agarose electrophoresis, and the band was detected by ethidium bromide staining. The resulting approx.
The 540 bp band was analyzed using the QIA quick Gel Extraction Kit (Quiag
en) and purified using TA cloning kit (Invitrogen)
Cloning vector pCR2.1 TOP
O, introduced into E. coli JM109 and transformed into E. coli JM1.
09 / prGON7 was obtained. The sequence (SEQ ID NO: 12) inserted into this plasmid prGON7 was determined, and the nucleotide sequence and the rat-type novel hormone VH0984 encoded thereby were determined.
Figure 4 shows the 89 predicted amino acid sequences (SEQ ID NO: 11).
It was shown to. FIG. 5 shows a comparison with the human sequence shown in Example 1.

【００８３】実施例３ ヒト型新規ホルモンVH098489発
現CHO細胞の作成 ヒト型新規ホルモンVH098489発現CHO細胞の作製は以下
のように行った。GTHLの配列に基づき以下の２種類の合
成DNAを合成した。 VHFX1:5’-CTCGAGAGCAGCATGAAGCTGGCATTCCTCT-3’ （配列番号：１５） VHRN1:5’-GCTAGCGGCCTCAGATGGTCTCACACTCCGT-3’’ （配列番号：１６） これらの合成DNAを用いて実施例１で作製した寄託菌Esc
herichia coli JM109/pTAhGTHL6の保持するプラスミドp
TAhGTHL6を鋳型としてPCRを行った。PCRの反応液はプラ
スミド溶液1 μl（1 ng）、１ μl VHFX1（10 micro
M）、1 μl VHRN1（10 microM）、5 μl添付の10 x反応
液、5 μl dNTP（10 mM）、1 μl Ex Taq（タカラ）、3
6 μl蒸留水を加えて合計50 μlにした。反応液をTherm
alCycler9600を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95
℃2 分の変性の後、98 ℃10 秒、65℃10 秒、７２℃30
秒のサイクルを20回繰り返した。PCR産物の一部を用い
て電気泳動で約0.5 kbのPCR産物の増幅を確認した後、
ゲルから回収したPCR産物をTAクローニングキット（Inv
itrogen社）を用いて大腸菌にサブクローニングした。
サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドをプ
ラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断
片の塩基配列を決定し、その配列が実施例１と同じヒト
型新規ホルモンVH098489 cDNAであることを確認した。
次にそのプラスミドから制限酵素XhoＩおよびNheＩによ
って消化後約0,5 kbのヒト型新規ホルモンVH098489 cDN
A断片を得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであ
るpAKKO-111Hはマルチクローニングサイト部分の制限酵
素サイトSalＩおよびNheＩによって消化後、電気泳動を
行い、ベクター部分を回収した。以上の操作によって調
製したヒト型新規ホルモンVH098489cDNA断片および発現
ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌JM10
9を形質転換してE.coli JM109/pAKKOGTHLを得た。形質
転換体E.coli JM109/pAKKOGTHLを培養し、プラスミドpA
KKOGTHLのDNAを大量に調製した。そのプラスミドDNAの
うちの２０μgを１mlの生理的食塩水（PBS）に溶解後、
ジーントランスファー（和光純薬）のバイアルに注入
し、ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌してDNA
を含有するリポソームを形成させた。CHOdhfr-細胞１な
いし２×１０6個を直径３５mmの細胞培養用シャーレに
播種し、２０時間培養した後に培養液を新鮮なものに交
換した。各シャーレに対して０.５μgのDNAに相当する
量（２５μｌ）のリポソーム液を滴下し、１６時間イン
キュベーションを行ってプラスミドDNAの導入を行っ
た。さらに新鮮な培地に交換して１日間培養した後、選
択培地に交換して３日間培養を続け、最後にトリプシン
消化を行って分散させた細胞を低密度で選択培地（deox
yribonucleosidesおよびribonucleosidesを含有しないm
inimum essential medium，alpha mediumに１０％透析
ウシ血清を加えたもの）中に播種し、形質転換体の選択
を行った。形質転換体のみが選択培地中で増殖すること
が可能であり、継代を繰り返すことによって選択を重
ね、CHO-GTHL細胞を樹立した。ヒト型新規ホルモンVH09
8489を高発現するクローンの選択は、細胞のクローン化
と、メトトレキセート（シグマ社）濃度の段階的な増加
を交互に繰り返すことで行なった。各段階における産生
量の測定と高産生クローンの選択は、後述のEIAによっ
て行なった。Example 3 Preparation of CHO Cells Expressing Novel Human Hormone VH098489 The CHO cells expressing the novel human hormone VH098489 were prepared as follows. The following two types of synthetic DNAs were synthesized based on the GTHL sequence. VHFX1: 5'-CTCGAGAGCAGCATGAAGCTGGCATTCCTCT-3 '(SEQ ID NO: 15) VHRN1: 5'-GCTAGCGGCCTCAGATGGTCTCACACTCCGT-3''(SEQ ID NO: 16) Deposited bacteria Esc prepared in Example 1 using these synthetic DNAs
plasmid p carried by herichia coli JM109 / pTAhGTHL6
PCR was performed using TAhGTHL6 as a template. PCR reaction solution was 1 μl (1 ng) of plasmid solution and 1 μl of VHFX1 (10 microliters).
M), 1 µl VHRN1 (10 microM), 5 µl 10x reaction solution, 5 µl dNTP (10 mM), 1 µl Ex Taq (Takara), 3
6 μl distilled water was added to make a total of 50 μl. Reaction solution
PCR reaction was performed using alCycler9600. PCR conditions are 95
After 2 minutes denaturation at 98 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 30 seconds.
The second cycle was repeated 20 times. After confirming the amplification of the PCR product of about 0.5 kb by electrophoresis using a part of the PCR product,
The PCR product recovered from the gel is transferred to a TA cloning kit (Inv
It was subcloned into E. coli using itrogen.
A plasmid was extracted from the E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), and the base sequence of the inserted fragment was determined. It was confirmed that the sequence was the same human type novel hormone VH098489 cDNA as in Example 1. did.
Next, after digestion with the restriction enzymes XhoI and NheI from the plasmid, about 0.5 kb of the novel human hormone VH098489 cDN was obtained.
A fragment was obtained. Furthermore, pAKKO-111H, which is an expression vector for animal cells, was digested with restriction enzyme sites SalI and NheI at the multiple cloning site and electrophoresed to recover the vector. The novel human hormone VH098489 cDNA fragment and the expression vector prepared by the above operation were ligated by ligation, and E. coli JM10
9 was transformed to obtain E. coli JM109 / pAKKOGTHL. The transformant E. coli JM109 / pAKKOGTHL was cultured and the plasmid pA
KKOGTHL DNA was prepared in large quantities. After dissolving 20 μg of the plasmid DNA in 1 ml of physiological saline (PBS),
Inject into a vial of Gene Transfer (Wako Pure Chemical Industries) and vortex vigorously to mix DNA
A liposome containing was formed. 1 to 2 × 10 6 CHOdhfr - cells were inoculated in a 35 mm diameter cell culture dish and cultured for 20 hours, and the culture solution was replaced with fresh one. A liposome solution in an amount (25 μl) corresponding to 0.5 μg of DNA was added dropwise to each petri dish, and the mixture was incubated for 16 hours to introduce plasmid DNA. Further, after replacing the medium with a fresh medium and culturing for 1 day, culturing is continued for 3 days after replacing the medium with a selection medium. Finally, cells dispersed by trypsin digestion are dispersed at a low density in the selection medium (deox medium).
m without yribonucleosides and ribonucleosides
The cells were seeded in an inimum essential medium, an alpha medium and 10% dialyzed bovine serum), and a transformant was selected. Only the transformant was able to grow in the selection medium, and the selection was repeated by repeating the subculture to establish CHO-GTHL cells. Novel human hormone VH09
Selection of clones that highly express 8489 was performed by alternately repeating cloning of cells and stepwise increase of methotrexate (Sigma) concentration. Measurement of the amount of production at each stage and selection of high-producing clones were performed by EIA described later.

【００８４】実施例４ 新規ホルモンVH098489に対する
抗血清の取得 新規ホルモンVH098489に対する抗体の作製は次のように
行った。新規ホルモンVH098489の分泌シグナル配列直後
の、N末端部の配列ASSGNLRTFVGにシステインを付加した
ASSGNLRTFVGC（GTN1）を抗原として用いた。GTN1をKLH
とコンジュゲートしてウサギに定法に従って免疫し、GT
N1に対する抗血清を取得した。抗体価の上昇の検討は、
GTN1をOVAに結合させたものをコーティングしたプレー
トと、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗
体を用いた定法による固相法EIAにて行ない、免疫前の
血清と比較して図６のような抗体価を示す抗血清を取得
した。Example 4 Preparation of Antiserum Against New Hormone VH098489 An antibody against the novel hormone VH098489 was prepared as follows. Cysteine was added to the N-terminal sequence ASSGNLRTFVG immediately after the secretory signal sequence of the new hormone VH098489.
ASSGNLRTFVGC (GTN1) was used as the antigen. GTN1 to KLH
And immunize rabbits according to the standard method.
Antiserum against N1 was obtained. Examination of increase in antibody titer
The plate was coated with GTN1 bound to OVA and subjected to a conventional solid phase EIA method using horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody. Was obtained.

【００８５】実施例５ ヒト型新規ホルモンVH098489の
発現の検出 上記のCHO-GTHL細胞を無血清培養し、上清を回収、限外
ろ過法にて濃縮を行なった。濃縮した上清はSDS-PAGE用
のサンプルバッファーに溶解し、加熱変性後、１６％ゲ
ルを用いたSDS-PAGEにて電気泳動を行なった。電気泳動
によって分離した蛋白質はニトロセルロース膜に電気的
に転写した。非特異的な結合を予防するためにブロック
エース（大日本製薬）で膜を処理した後、ブロックエー
スを１０％、Tween-20（シグマ社）を0.1%含むPBSで適
宜希釈した上述の抗血清とインキュベートした。その
後、ニトロセルロース膜を良く洗浄し、西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体とさらにインキュベ
ート、未結合の標識抗体を充分に洗浄した。メンブレン
に転写されたヒト型新規ホルモンVH098489は西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの発色反応によって検出した（図
７）。Example 5 Detection of Expression of Novel Human Hormone VH098489 The above-mentioned CHO-GTHL cells were cultured without serum, the supernatant was recovered and concentrated by ultrafiltration. The concentrated supernatant was dissolved in a sample buffer for SDS-PAGE, denatured by heating, and then electrophoresed by SDS-PAGE using a 16% gel. The proteins separated by electrophoresis were electrically transferred to a nitrocellulose membrane. After treating the membrane with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) to prevent non-specific binding, the above antiserum was appropriately diluted with PBS containing 10% Block Ace and 0.1% Tween-20 (Sigma). And incubated. Thereafter, the nitrocellulose membrane was thoroughly washed, further incubated with horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody, and the unbound labeled antibody was sufficiently washed. The novel human hormone VH098489 transcribed on the membrane was detected by a horseradish peroxidase color reaction (FIG. 7).

【００８６】実施例６ 新規ホルモンVH098489のEIA測
定系の構築 上述の抗GTN1抗血清を５０％濃度の硫酸アンモニウムに
よって処理し、沈殿した画分をPBSに再溶解した。GTN1
ペプチドを市販のカラム（HiTrap NHS-activated、ファ
ルマシア社）に結合させて作成した抗原カラムを用い、
付属のマニュアルに従って抗原精製を行なった。GTN1ペ
プチドを定法に従ってマレイミド法で西洋ワサビペルオ
キシダーゼに結合させ、未結合のペプチドをゲルろ過で
分離した後、GTN1標識体を得た。EIA用の９６ウェルプ
レートに抗ウサギIgFcを結合させ、その後、２５％のブ
ロックエースを含有するPBSとインキュベートして非特
異結合を防止する処理を行なった。まず、精製抗体とス
タンダード（GTN1ペプチド）あるいはサンプルと４℃で
一晩インキュベーションし、その後GTN1標識体を添加し
て室温でさらにインキュベーションを行なった。アッセ
イバッファーは１０％のブロックエース、0.1％のTween
-20を含有するPBSを使用した。反応後に充分に洗浄を行
ない、プレートに結合した標識体をペルオキシダーゼの
発色反応によって検出した。標識体のプレートへの結合
量（B/B0）をもとに検量線（図８）を作成し、サンプル
中に含まれる新規ホルモンVH098489の濃度を算出した。Example 6 Construction of EIA Assay System for New Hormone VH098489 The above-mentioned anti-GTN1 antiserum was treated with 50% ammonium sulfate, and the precipitated fraction was redissolved in PBS. GTN1
Using an antigen column created by binding the peptide to a commercially available column (HiTrap NHS-activated, Pharmacia),
The antigen was purified according to the attached manual. The GTN1 peptide was bound to horseradish peroxidase by the maleimide method according to a standard method, and the unbound peptide was separated by gel filtration to obtain a GTN1-labeled product. Anti-rabbit IgFc was bound to a 96-well plate for EIA, and then incubated with PBS containing 25% Block Ace to prevent non-specific binding. First, a purified antibody and a standard (GTN1 peptide) or a sample were incubated overnight at 4 ° C., and then a GTN1 label was added, followed by further incubation at room temperature. Assay buffer is 10% Block Ace, 0.1% Tween
PBS containing -20 was used. After the reaction, the plate was sufficiently washed, and the label bound to the plate was detected by a peroxidase color reaction. A calibration curve (FIG. 8) was prepared based on the binding amount of the label to the plate (B / B0), and the concentration of the novel hormone VH098489 contained in the sample was calculated.

【００８７】[0087]

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、例えば、下垂
体前葉ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨなど）に関連す
る生理活性などを有するため、高血圧、自己免疫疾患、
心不全などの治療薬として使用することができる。ま
た、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの
活性を促進もしくは阻害する化合物またはその塩のスク
リーニングのための試薬として有用であり、スクリーニ
ングによって得られる化合物は高血圧、自己免疫疾患、
心不全などの予防・治療剤として期待される。さらに、
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペ
プチドを特異的に認識することができるので、被検液中
の本発明のポリペプチドの定量などに使用することがで
きる。The polypeptide of the present invention has, for example, physiological activities related to anterior pituitary hormones (LH, FSH, TSH, etc.), and thus has high blood pressure, autoimmune diseases,
It can be used as a therapeutic agent for heart failure and the like. Further, the polypeptide of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention, and the compound obtained by the screening is hypertension, an autoimmune disease,
It is expected as a prophylactic / therapeutic agent for heart failure and the like. further,
Since an antibody against the polypeptide of the present invention can specifically recognize the polypeptide of the present invention, it can be used for quantification of the polypeptide of the present invention in a test solution.

【００８８】[0088]

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Polypeptide and its DNA <130> B00368 <150> JP 11-358707 <151> 1999-12-17 <150> JP 2000-46825 <151> 2000-02-18 <160> 16 <210> 1 <211> 130 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Lys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Leu 5 10 15 Ala Gly Tyr Gly Cys Val Leu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr 20 25 30 Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro 35 40 45 Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala His 65 70 75 80 His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Val Lys Leu 85 90 95 Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Val Ala 100 105 110 Ile Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu 115 120 125 Thr Ile 130 <210> 2 <211> 390 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGAAGCTGG CATTCCTCTT CCTTGGCCCC ATGGCCCTCC TCCTTCTGGC TGGCTATGGC 60 TGTGTCCTCG GTGCCTCCAG TGGGAACCTG CGCACCTTTG TGGGCTGTGC CGTGAGGGAG 120 TTTACTTTCC TGGCCAAGAA GCCAGGCTGC AGGGGCCTTC GGATCACCAC GGATGCCTGC 180 TGGGGTCGCT GTGAGACCTG GGAGAAACCC ATTCTGGAAC CCCCCTATAT TGAAGCCCAT 240 CATCGAGTCT GTACCTACAA CGAGACCAAA CAGGTGACTG TCAAGCTGCC CAACTGTGCC 300 CCGGGAGTCG ACCCCTTCTA CACCTATCCC GTGGCCATCC GCTGTGACTG CGGAGCCTGC 360 TCCACTGCCA CCACGGAGTG TGAGACCATC 390 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 CGGAAGAGCA GCATGAAGCT GGCATTC 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 CATGTGCTGC TCACACAGGT GGGTCTG 27 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Human <400> 5 Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr 20 25 30 Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu 35 40 45 Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala His His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu 50 55 60 Thr Lys Gln Val Thr Val Lys Leu Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp 65 70 75 80 Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Ile Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys 85 90 95 Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu Thr Ile 100 105 <210> 6 <211> 378 <212> DNA <213> Human <400> 6 GCCTCCAGTG GGAACCTGCG CACCTTTGTG GGCTGTGCCG TGAGGGAGTT TACTTTCCTG 60 GCCAAGAAGC CAGGCTGCAG GGGCCTTCGG ATCACCACGG ATGCCTGCTG GGGTCGCTGT 120 GAGACCTGGG AGAAACCCAT TCTGGAACCC CCCTATATTG AAGCCCATCA TCGAGTCTGT 240 ACCTACAACG AGACCAAACA GGTGACTGTC AAGCTGCCCA ACTGTGCCCC GGGAGTCGAC 300 CCCTTCTACA CCTATCCCGT GGCCATCCGC TGTGACTGCG GAGCCTGCTC CACTGCCACC 360 ACGGAGTGTG AGACCATC 378 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Human <400> 7 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 8 <211> 348 <212> DNA <213> Human <400> 8 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT 60 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA 120 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA 180 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG 240 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG 300 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCT 348 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 AGGCAGCCTG ATAACAGAAG GGAGAG 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 CTTGGGCCAC CAGCCATGAC TGTGCT 26 <210> 11 <211> 129 <212> PRT <213> Rat <400> 11 Met Lys Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ser Asp Ser Val Leu Ser Ser Ser Ser Gly Asn Leu His Thr Phe 20 25 30 Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Val Ala Lys Lys Pro Gly 35 40 45 Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys Glu 50 55 60 Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala Tyr His 65 70 75 80 Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu Thr Arg Arg Val Thr Val Lys Leu Pro 85 90 95 Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Met Ala Val 100 105 110 Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu Thr 115 120 125 Ile <210> 12 <211> 387 <212> DNA <213> Rat <400> 12 ATGAAGCTGG TATACCTTGT CCTTGGTACT GCGGCCCTCC TTCTGGGTGG CTCTGACTCT 60 GTCCTCAGCA GCTCCAGCGG GAACCTACAC ACTTTTGTGG GATGTGCTGT GAGGGAATTC 120 ACTTTTGTGG CCAAGAAGCC AGGCTGCAGG GGACTTCGGA TCACCACAGA TGCCTGCTGG 180 GGTCGCTGTG AGACCTGGGA GAAACCCATT CTGGAGCCTC CCTACATAGA AGCCTATCAT 240 CGAGTGTGTA CCTACAATGA GACCAGACGG GTGACGGTGA AGCTGCCTAA CTGTGCCCCT 300 GGAGTCGACC CCTTCTACAC CTACCCTATG GCTGTCCGAT GTGACTGCGG GGCATGTTCC 360 ACTGCCACCA CTGAGTGTGA GACCATC 387 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Rat <400> 13 Ser Ser Ser Gly Asn Leu His Thr Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 Phe Thr Phe Val Ala Lys Lys Pro Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr 20 25 30 Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu 35 40 45 Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala Tyr His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu 50 55 60 Thr Arg Arg Val Thr Val Lys Leu Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp 65 70 75 80 Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Met Ala Val Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys 85 90 95 Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu Thr Ile 100 105 <210> 14 <211> 318 <212> DNA <213> Rat <400> 14 AGCTCCAGCG GGAACCTACA CACTTTTGTG GGATGTGCTG TGAGGGAATT CACTTTTGTG 60 GCCAAGAAGC CAGGCTGCAG GGGACTTCGG ATCACCACAG ATGCCTGCTG GGGTCGCTGT 120 GAGACCTGGG AGAAACCCAT TCTGGAGCCT CCCTACATAG AAGCCTATCA TCGAGTGTGT 180 ACCTACAATG AGACCAGACG GGTGACGGTG AAGCTGCCTA ACTGTGCCCC TGGAGTCGAC 240 CCCTTCTACA CCTACCCTAT GGCTGTCCGA TGTGACTGCG GGGCATGTTC CACTGCCACC 300 ACTGAGTGTG AGACCATC 318 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 CTCGAGAGCA GCATGAAGCT GGCATTCCTC T 31 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 GCTAGCGGCC TCAGATGGTC TCACACTCCG T 31[Sequence Listing] [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Polypeptide and its DNA <130> B00368 <150> JP 11-358707 <151> 1999-12-17 <150> JP 2000- 46825 <151> 2000-02-18 <160> 16 <210> 1 <211> 130 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Lys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Leu 5 10 15 Ala Gly Tyr Gly Cys Val Leu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr 20 25 30 Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro 35 40 45 Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala His 65 70 75 80 His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Val Lys Leu 85 90 95 Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Val Ala 100 105 110 Ile Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu 115 120 125 Thr Ile 130 <210> 2 <211> 390 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGAAGCTGG CATTCCTCTT CCTTGGCCCC ATGGCCCTCC TCCTTCTGGC TGGCTATGGC 60 TGTGTCCTCG GTGCCTCCAG TGGG AACCTG CGCACCTTTG TGGGCTGTGC CGTGAGGGAG 120 TTTACTTTCC TGGCCAAGAA GCCAGGCTGC AGGGGCCTTC GGATCACCAC GGATGCCTGC 180 TGGGGTCGCT GTGAGACCTG GGAGAAACCC ATTCTGGAAC CCCCCTATAT TGAAGCCCAT 240 CATCGAGTCT GTACCTACAA CGAGACCAAA CAGGTGACTG TCAAGCTGCC CAACTGTGCC 300 CCGGGAGTCG ACCCCTTCTA CACCTATCCC GTGGCCATCC GCTGTGACTG CGGAGCCTGC 360 TCCACTGCCA CCACGGAGTG TGAGACCATC 390 <210> 3 <211> 27 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 CGGAAGAGCA GCATGAAGCT GGCATTC 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 CATGTGCTGC TCACACAGGT GGGTCTG 27 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Human <400> 5 Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr 20 25 30 Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu 35 40 45 Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala His His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu 50 55 60 Thr Lys Gln Val Thr Val Lys Leu Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp 65 70 75 80 Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Ile Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys 85 90 95 Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu Thr Ile 100 105 <210> 6 <211> 378 <212> DNA <213> Human <400> 6 GCCTCCAGTG GGAACCTGCG CACCTTTGTG GGCTGTGCCG TGAGGGAGTT TACTTTCCTG 60 GCCAAGAAGC CAGGCTGCAG GGGCCTTCGG ATCACCACGG ATGCCTGCTG GGGTCGCTGT 120 GAGACCTGGG AGAAACCCAT TCTGGAACCC CCCTATATTG AAGCCCATCA TCGAGTCTGT 240 ACCTACAACG AGACCAAACA GGTGACTGTC AAGCTGCCCA ACTGTGCCCC GGGAGTCGAC 300 CCCTTCTACA CCTATCCCGT GGCCATCCGC TGTGACTGCG GAGCCTGCTC CACTGCCACC 360 ACGGAGTGTG AGACCATC 378 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Human <400> 7 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Va l Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 8 <211> 348 <212> DNA <213> Human <400 > 8 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT 60 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA 120 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA 180 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG 240 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG 300 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCT 348 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 AGGCAGCCTG ATAACAGAAG GGAGAG 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer < 400> 10 CTTGGGCCAC CAGCCATGAC TGTGCT 26 <210> 11 <211> 129 <212> PRT <213> Rat <400> 11 Met Lys Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ser Asp Ser Val Leu Ser Ser Ser Ser Gly Asn Leu His Thr Phe 20 25 30 Va l Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Val Ala Lys Lys Pro Gly 35 40 45 Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys Glu 50 55 60 Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala Tyr His 65 70 75 80 Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu Thr Arg Arg Val Thr Val Lys Leu Pro 85 90 95 Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Met Ala Val 100 105 110 Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu Thr 115 120 125 Ile <210> 12 <211> 387 <212> DNA <213> Rat <400> 12 ATGAAGCTGG TATACCTTGT CCTTGGTACT GCGGCCCTCC TTCTGGGTGG CTCTGACTCT 60 GTCCTCAGCA GCTCCAGCGG GAACCTACACTTGTGGA ACTTTTGTGG CCAAGAAGCC AGGCTGCAGG GGACTTCGGA TCACCACAGA TGCCTGCTGG 180 GGTCGCTGTG AGACCTGGGA GAAACCCATT CTGGAGCCTC CCTACATAGA AGCCTATCAT 240 CGAGTGTGTA CCTACAATGA GACCAGACGG GTGACGGTGA AGCTGCCTAA CTGTGCCCCT 300 GGAGTCGACC CCTTCTACAC CTACCCTATG GCTGTCCGAT GTGACTGCGG GGCATGTTCC 360 ACTGCCACCA CTGAGTGTGA GACCATC 387 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Rat <400 > 13 Se r Ser Ser Gly Asn Leu His Thr Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 Phe Thr Phe Val Ala Lys Lys Pro Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr 20 25 30 Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu 35 40 45 Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala Tyr His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu 50 55 60 Thr Arg Arg Val Thr Val Lys Leu Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp 65 70 75 80 Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Met Ala Val Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys 85 90 95 Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu Thr Ile 100 105 <210> 14 <211> 318 <212> DNA <213> Rat <400> 14 AGCTCCAGCG GGAACCTACA CACTTTTGTG GGATGTGCTG TGAGGGAATT CACTTTTGTG 60 GCCAAGAAGC CAGGCTGCAG GGGACTTCGG ATCACCACAG ATGCCTGCTG GGGTCGCTGT 120 GAGACCTGGG AGAAACCCAT TCTGGAGCCT CCCTACATAG AAGCCTATCA TCGAGTGTGT 180 ACCTACAATG AGACCAGACG GGTGACGGTG AAGCTGCCTA ACTGTGCCCC TGGAGTCGAC 240 CCCTTCTACA CCTACCCTAT GGCTGTCCGA TGTGACTGCG GGGCATGTTC CACTGCCACC 300 ACTGAGTGTG AGACCATC 318 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 CTCGAGAG CA GCATGAAGCT GGCATTCCTC T 31 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 GCTAGCGGCC TCAGATGGTC TCACACTCCG T 31

【００８９】[0089]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例１で得られた本発明のポリペプチド(ヒ
ト型)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide (human type) of the present invention obtained in Example 1.

【図２】本発明のポリペプチド（ヒト型）のアミノ酸配
列を示す。FIG. 2 shows the amino acid sequence of the polypeptide (human type) of the present invention.

【図３】本発明のポリペプチドと既知のLH、FHS、TSHの
ベータサブユニットとのアミノ酸配列の比較を示す。FIG. 3 shows a comparison of the amino acid sequences of a polypeptide of the present invention with known LH, FHS, TSH beta subunits.

【図４】実施例２で得られた本発明のポリペプチド（ラ
ット型）をコードするＤＮＡの塩基配列および対応する
アミノ酸配列を示す。FIG. 4 shows the nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of the DNA encoding the polypeptide (rat type) of the present invention obtained in Example 2.

【図５】配列番号：１で表される本発明のポリペプチド
（ヒト型）と配列番号：１１で表される本発明のポリペ
プチド（ラット型）との配列比較を示す。FIG. 5 shows a sequence comparison between the polypeptide of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 (human type) and the polypeptide of the present invention represented by SEQ ID NO: 11 (rat type).

【図６】VH098489に対する抗血清の抗体価の測定結果を
示す。免疫前（Preimmune Serum）および免疫後（Antis
erum）のGTN1に対する抗体価を希釈法によって比較し
た。FIG. 6 shows the results of measuring antibody titers of antisera to VH098489. Pre-immune (Preimmune Serum) and post-immune (Antis
erum) for GTN1 were compared by a dilution method.

【図７】VH098499のEIA測定系の標準曲線を示す。横軸
はスタンダード（GTN1ペプチド）の濃度、縦軸は標識体
の結合量（B/B0）を示す。FIG. 7 shows a standard curve of an EIA measurement system of VH098499. The horizontal axis shows the concentration of the standard (GTN1 peptide), and the vertical axis shows the binding amount of the label (B / B0).

【図８】VH098499発現CHO細胞（CHO-GTHL）およびコン
トロール細胞（mock）のウエスタンブロットによる解析
結果を示す。培養上清（sup）および細胞(cell)のそれ
ぞれについて抗GTN1抗体を用いたウエスタンブロットを
実施した。図の左側には分子量マーカーの位置を示す。FIG. 8 shows the results of Western blot analysis of VH098499-expressing CHO cells (CHO-GTHL) and control cells (mock). A Western blot using an anti-GTN1 antibody was performed on each of the culture supernatant (sup) and cells (cell). The position of the molecular weight marker is shown on the left side of the figure.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８６ 1/04 1/18 ４Ｈ０４５ 1/16 3/04 1/18 3/06 3/04 3/10 3/06 3/14 3/10 7/00 3/14 9/00 7/00 9/04 9/00 9/10 9/04 9/12 9/10 11/00 9/12 11/06 11/00 13/02 11/06 13/12 13/02 17/00 13/12 17/02 17/00 19/00 17/02 19/02 19/00 19/10 19/02 25/00 19/10 25/18 25/00 25/20 25/18 25/28 25/20 27/06 25/28 27/12 27/06 29/00 １０１ 27/12 31/04 29/00 １０１ 31/10 31/04 31/16 31/10 31/18 31/16 31/20 31/18 31/22 31/20 35/00 31/22 35/02 35/00 35/04 35/02 37/02 35/04 37/08 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/575 37/08 16/26 Ｃ０７Ｋ 14/575 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/26 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 藤井 亮 茨城県つくば市春日１丁目７番地９ 武田 春日ハイツ303号 (72)発明者 細谷 昌樹 茨城県土浦市板谷１丁目711番地83 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB26 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 FB08 4B024 AA01 AA11 BA01 BA41 CA04 CA12 DA02 EA04 GA03 GA11 HA01 4B064 AG15 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA91X AB01 AB04 BA05 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA22 CA53 CA56 CA59 NA14 ZA332 ZA362 ZA512 ZA662 ZA752 ZA812 ZA962 ZB072 ZB132 ZB262 ZB332 ZC332 ZC352 ZC782 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 NA14 ZA33 ZA36 ZA51 ZA66 ZA81 ZA96 ZB07 ZB13 ZB26 ZB33 ZC33 ZC35 ZC78 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA30 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 1/00 A61P 1/16 4C086 1/04 1/18 4H045 1/16 3/04 1/18 3 / 06 3/04 3/10 3/06 3/14 3/10 7/00 3/14 9/00 7/00 9/04 9/00 9/10 9/04 9/12 9/10 11/00 9 / 12 11/06 11/00 13/02 11/06 13/12 13/02 17/00 13/12 17/02 17/00 19/00 17/02 19/02 19/00 19/10 19/02 25/00 19/10 25/18 25/00 25/20 25/18 25/28 25/20 27/06 25/28 27/12 27/06 29/00 101 27/12 31/04 29/00 101 31/10 31/04 31/16 31/10 31/18 31/16 31/20 31/18 31/22 31/20 35/00 31/22 35/02 35/00 35/04 35/02 37 / 02 35/04 37/08 37/02 C07K 14/575 37/08 16/26 C07K 14/575 C12N 1/15 16/26 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1 / 21 21/08 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z 21/08 C12R 1:91) 01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02 // (C12N 5/10 C12N 5/00 A C12R 1:91) C12R 1:91) (72) Inventor Ryo Fujii Kasuga, Tsukuba, Ibaraki 1-7-9 Takeda Kasuga Heights 303 No. 303 (72) Inventor Masaki Hosoya 1-711-83 Itaya, Tsuchiura-shi, Ibaraki Pref. GA03 GA11 HA01 4B064 AG15 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA91X AB01 AB04 BA05 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA22 CA53 CA56 CA59 NA14 ZA332 ZA362 ZA2 ZA362 ZA2 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA2 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 ZA3 AA01 AA03 AA04 EA16 NA14 ZA33 ZA36 ZA51 ZA66 ZA81 ZA96 ZB07 ZB13 ZB26 ZB33 ZC33 ZC35 ZC78 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA30 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有すること
を特徴とするポリペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩。1. A polypeptide comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide or ester thereof or a salt thereof. 【請求項２】実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：
１１で表されるアミノ酸配列である請求項１記載のポリ
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩。2. The substantially identical amino acid sequence is represented by SEQ ID NO:
2. The polypeptide according to claim 1, which is an amino acid sequence represented by 11, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof. 【請求項３】実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：
５で表されるアミノ酸配列である請求項１記載のポリペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩。3. The method of claim 1, wherein the substantially identical amino acid sequence is SEQ ID NO:
2. The polypeptide according to claim 1, which is an amino acid sequence represented by 5, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof. 【請求項４】実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：
１３で表されるアミノ酸配列である請求項１記載のポリ
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩。4. The method of claim 1, wherein the substantially identical amino acid sequence is SEQ ID NO:
The polypeptide according to claim 1, which is an amino acid sequence represented by 13, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof. 【請求項５】請求項１記載のポリペプチドの部分ペプチ
ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
塩。5. A partial peptide of the polypeptide according to claim 1, or an amide or ester thereof or a salt thereof. 【請求項６】請求項１記載のポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ。6. A DNA containing a DNA encoding the polypeptide according to claim 1. 【請求項７】配列番号：２、配列番号：６、配列番号：
１２または配列番号：１４で表される塩基配列を有する
請求項６記載のＤＮＡ。7. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
The DNA according to claim 6, which has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14. 【請求項８】請求項５記載の部分ペプチドをコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ。8. A DNA containing a DNA encoding the partial peptide according to claim 5. 【請求項９】請求項６または請求項８記載のＤＮＡを含
有する組換えベクター。9. A recombinant vector containing the DNA according to claim 6 or 8. 【請求項１０】請求項９記載の組換えベクターで形質転
換された形質転換体。[10] A transformant transformed with the recombinant vector according to [9]. 【請求項１１】請求項１０記載の形質転換体を培養し、
請求項１記載のポリペプチドまたは請求項５記載の部分
ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする請求項
１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその
エステルまたはその塩、または請求項５記載の部分ペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩の製造法。(11) culturing the transformant according to (10),
The polypeptide according to claim 1, or the partial peptide according to claim 5, which is produced or accumulated, the polypeptide according to claim 1, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof, or the partial peptide according to claim 5. Alternatively, a method for producing an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof. 【請求項１２】請求項１記載のポリペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、または請
求項５記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩に対する抗体。12. An antibody against the polypeptide according to claim 1 or an amide or ester thereof or a salt thereof, or an antibody against the partial peptide according to claim 5 or an amide or ester thereof or a salt thereof. 【請求項１３】請求項１２記載の抗体を用いることを特
徴とする請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、または請求項５
記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエ
ステルまたはその塩の定量方法。13. The polypeptide according to claim 1, wherein the antibody according to claim 12 is used, an amide or ester thereof, or a salt thereof.
A method for quantifying the partial peptide or amide or ester or salt thereof as described above. 【請求項１４】請求項６もしくは請求項８記載のＤＮＡ
または請求項１２記載の抗体を含有してなる診断薬。(14) the DNA according to the above (6) or (8),
Or a diagnostic agent comprising the antibody according to claim 12. 【請求項１５】請求項６または請求項８記載のＤＮＡの
塩基配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列また
はその一部分を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用
を有するアンチセンスＤＮＡ。15. An antisense having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA according to claim 6 or 8, and having an action capable of suppressing the expression of the DNA. DNA. 【請求項１６】請求項１記載のポリペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、または請
求項５記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を含有してなる剤。16. An agent comprising the polypeptide according to claim 1 or an amide or ester thereof or a salt thereof, or an agent comprising the partial peptide according to claim 5 or an amide or ester thereof or a salt thereof. 【請求項１７】請求項１記載のポリペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、または請
求項５記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。[17] A pharmaceutical comprising the polypeptide according to [1] or its amide or its ester or its salt, or the partial peptide according to [5] or its amide or its ester or its salt. 【請求項１８】請求項１記載のポリペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、または請
求項５記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする請
求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩、または請求項５記載の部分
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング方法。18. The method according to claim 1, wherein the polypeptide according to claim 1 or an amide or ester thereof or a salt thereof, or the partial peptide according to claim 5 or an amide or ester thereof or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the polypeptide or its amide or its ester or its salt, or the partial peptide or its amide or its ester or its salt according to claim 5. 【請求項１９】請求項１記載のポリペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、または請
求項５記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩を含有してなる請求項１記載
のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩、または請求項５記載の部分ペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の
活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キット。(19) the polypeptide according to (1), which comprises the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof or a salt thereof, or the partial peptide according to (5) or an amide or ester thereof or a salt thereof; A kit for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the peptide or its amide or its ester or its salt, or the partial peptide or its amide or its ester or its salt according to claim 5. 【請求項２０】請求項１８記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１９記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項５記載の
部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
またはその塩の活性を促進または阻害する化合物または
その塩。20. The polypeptide according to claim 1, obtained by using the screening method according to claim 18 or the screening kit according to claim 19, an amide or ester thereof, or a partial peptide according to claim 5. Or a compound or salt thereof which promotes or inhibits the activity of the amide or ester or salt thereof. 【請求項２１】請求項１８記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１９記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、または請求項５
記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエ
ステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物
またはその塩を含有してなる医薬。21. The polypeptide according to claim 1, which is obtained by using the screening method according to claim 18, or the screening kit according to claim 19, or an amide or ester thereof, or a salt thereof.
A medicament comprising the compound or salt thereof for promoting or inhibiting the activity of the partial peptide or amide or ester thereof or salt thereof described above.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005515974A (en) * 2001-10-22 2005-06-02 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ Gonadodropin for follicle formation

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