JP2000053700A - New protein and its dna - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、肥満などに関連す
る新規タンパク質およびそのＤＮＡに関する。[0001] The present invention relates to a novel protein related to obesity and the like and its DNA.
【０００２】[0002]
【従来の技術】最近、マウス肥満遺伝子tubが単離さ
れ、その遺伝子のparaventricular(PVN)やventromedial
(VMH)における発現が体重調整または食欲に関連してお
り、例えば、ＰＶＮの損傷が食物取り込みや体重の増加
をもたらし、ＶＭＨ内損傷が肥満に関連していることが
示唆されている（Patrick W. Kleynら、セル（Cell）,
第85巻，281-290頁, April 19, 1996年））。また、マ
ウスおよびヒト肥満遺伝子tubby（TUB, TULP1, TULP2）
が単離され、該遺伝子の変異が肥満、網膜退化に導くこ
とが示唆されている（プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アケデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）,第9
4巻,3128-3133頁,1997年）。2. Description of the Related Art Recently, a mouse obesity gene tub has been isolated and its gene, paraventricular (PVN) and ventromedial
(VMH) is associated with weight adjustment or appetite, for example, suggesting that damage to PVN results in increased food intake and weight, and that damage in VMH is associated with obesity (Patrick W.). Kleyn et al., Cell,
85, 281-290, April 19, 1996)). In addition, mouse and human obesity genes tubby (TUB, TULP1, TULP2)
It has been suggested that mutations in the gene lead to obesity and retinal degeneration (Procedures of the National Academy of Sciences of Science)
The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 9th
4, 3128-3133, 1997).
【０００３】[0003]
【本発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な肥
満関連遺伝子をクローニングし、肥満などの予防・治療
剤の開発を行うことを課題とする。An object of the present invention is to clone a novel obesity-related gene and to develop an agent for preventing or treating obesity.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マウス７．
５日胚由来ｃＤＮＡライブラリーから、新規な塩基配列
を有するｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、そ
れにコードされるタンパク質が肥満や視力低下などに関
連することを見いだした。本発明者らは、これらの知見
に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成す
るに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, the mouse 7.
From the 5 day embryo-derived cDNA library, we succeeded in cloning a cDNA having a novel nucleotide sequence, and found that the protein encoded by the cDNA was related to obesity and visual acuity. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）第（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドまた
はその塩、（３）第（１）項記載のタンパク質をコード
する塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４）
配列番号：２で表わされる塩基配列またはそれとハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を有する第（３）項記載のＤＮＡ、（５）第（２）項記
載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ、（６）第（３）項記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター、（７）第（６）項記載の組換えベクターを保持
する形質転換体、（８）第（７）項記載の形質転換体を
培養し、第（１）項記載のタンパク質を生成、蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする第（１）項記載の
タンパク質またはその塩の製造方法、That is, the present invention relates to (1) SEQ ID NO: 1.
A protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by
(2) a partial peptide of the protein described in (1) or a salt thereof; (3) a DNA containing a DNA having a base sequence encoding the protein described in (1); (4)
(3) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence hybridizable therewith under high stringent conditions, (5) DNA encoding the partial peptide according to (2) Containing DN
A, (6) a recombinant vector containing the DNA of (3), (7) a transformant carrying the recombinant vector of (6), (8) a transformant of (7) A method for producing a protein or a salt thereof according to (1), which comprises culturing the transformant, producing and accumulating the protein according to (1), and collecting the protein;
【０００６】（９）第（１）項記載のタンパク質または
その塩を含有してなる医薬、（１０）第（３）項記載の
ＤＮＡを含有してなる医薬、（１１）肥満、視力障害ま
たは聴力障害の予防・治療剤である第（９）項または第
（１０）項記載の医薬、（１２）第（３）項記載のＤＮ
Ａまたは第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる肥満、
視力障害または聴力障害の診断薬、（１３）第（１）項
記載のタンパク質、第（２）項記載の部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体、（１４）第（１）項記載のタン
パク質、第（２）項記載の部分ペプチドまたはその塩を
用いることを特徴とする第（１）項記載のタンパク質ま
たはその塩の作用または発現を活性化もしくは増強する
化合物またはその塩のスクリーニング方法、（１５）第
（１）項記載のタンパク質、第（２）項記載の部分ペプ
チドまたはその塩を含有してなる第（１）項記載のタン
パク質またはその塩の作用または発現を活性化もしくは
増強する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ
ト、（１６）第（１４）項記載のスクリーニング方法ま
たは第（１５）項記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる、第（１）項記載のタンパク質またはその塩
の作用または発現を活性化もしくは増強する化合物また
はその塩、（１７）第（１４）項記載のスクリーニング
方法または第（１５）項記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質または
その塩の作用または発現を活性化もしくは増強する化合
物またはその塩を含有してなる、肥満、視力障害または
聴力障害の予防・治療剤を提供する。(9) A medicine containing the protein or a salt thereof according to (1), (10) a medicine containing the DNA according to (3), (11) obesity, visual impairment or The medicament according to (9) or (10), which is a prophylactic / therapeutic agent for hearing impairment, and (12) the DN according to (3).
Obesity comprising the DNA according to A or (5),
A diagnostic agent for visual impairment or hearing impairment, (13) an antibody against the protein according to item (1), an antibody against the partial peptide according to item (2) or a salt thereof, (14) a protein according to item (1), (2) a method for screening a compound or a salt thereof that activates or enhances the action or expression of the protein or a salt thereof according to the item (1), wherein the partial peptide or a salt thereof according to the item (2) is used; A compound or salt thereof for activating or enhancing the action or expression of the protein or salt thereof according to item (1), comprising the protein according to item (1), the partial peptide according to item (2) or a salt thereof. (16) the screening method described in (14) or the (1) obtained using the screening kit described in (15). (17) A compound or a salt thereof that activates or enhances the action or expression of the protein or salt thereof according to (17), which is obtained using the screening method according to (14) or the screening kit according to (15). , A compound for activating or enhancing the action or expression of the protein or salt thereof according to item (1) or a salt thereof, for preventing or treating obesity, visual impairment or hearing impairment.
【０００７】さらに、本発明は、（１８）（ｉ）第
（１）項記載のタンパク質、第（２）項記載の部分ペプ
チドまたはその塩を含有する前駆体細胞を培養した場合
と、（ii）第（１）項記載のタンパク質、第（２）項記
載の部分ペプチドまたはその塩を含有する前駆体細胞を
試験化合物の存在下で培養した場合における、前駆体細
胞の分化を観察し、比較することを特徴とする第（１
４）項記載のスクリーニング方法、（１９）第（１４）
項または第（１８）項記載のスクリーニング方法または
第（１５）項記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる、第（１）項記載のタンパク質またはその塩の作
用または発現を活性化もしくは増強する化合物またはそ
の塩を含有してなる医薬、（２０）第（１３）項記載の
抗体と、被検液および標識化された第（１）項記載のタ
ンパク質、第（２）項記載の部分ペプチドまたはその塩
とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された
第（１）項記載のタンパク質、第（２）項記載の部分ペ
プチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする
被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（２）項記
載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、および（２
１）被検液と担体上に不溶化した第（１３）項記載の抗
体および標識化された第（１３）項記載の抗体とを同時
あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の第
（１）項記載のタンパク質、第（２）項記載の部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量法、（２２）外来性の第
（３）項記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非
ヒト哺乳動物、（２３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物で
ある第（２２)記載の非ヒト哺乳動物、（２４）ゲッ歯動
物がマウスである第（２３）記載の非ヒト哺乳動物、
（２５）外来性の第（３）項記載のＤＮＡまたはその変
異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換え
ベクター（２６）第（３）項記載のＤＮＡが不活性化さ
れた非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（２７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化された第（２
２）項記載の胚幹細胞、（２８）ネオマイシン耐性であ
る第（２２）項記載の胚幹細胞、（２９）非ヒト哺乳動
物がゲッ歯動物である第（２２）項記載の胚幹細胞、
（３０）ゲッ歯動物がマウスである第（２９）項記載の
胚幹細胞、（３１）第（３）項記載のＤＮＡが不活性化
された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（３２）該Ｄ
ＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化さ
れ、該レポーター遺伝子が第（３）項記載のＤＮＡに対
するプロモーターの制御下で発現しうる第（３１）項記
載のヒト哺乳動物、（３３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動
物である第（３１）項記載のヒト哺乳動物、（３４）ゲ
ッ歯動物がマウスである第（３３）項記載のヒト哺乳動
物、および（３５）第（３２）項記載の非ヒト哺乳動物
に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検
出することを特徴とする第（３）項記載のＤＮＡに対す
るプロモーター活性を促進または阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法を提供する。Further, the present invention relates to (18) (i) culturing precursor cells containing the protein described in (1), the partial peptide described in (2) or a salt thereof, and (ii) ) Observing the differentiation of precursor cells when precursor cells containing the protein described in (1), the partial peptide described in (2) or a salt thereof are cultured in the presence of a test compound, and comparing (1)
4) The screening method according to the above, (19) No. (14)
A compound that activates or enhances the action or expression of the protein or salt thereof according to item (1), obtained by using the screening method according to item or item (18) or the screening kit according to item (15). Or (20) the antibody described in (13), a test solution and a labeled protein described in (1), a partial peptide described in (2), or a salt thereof. Characterized in that the ratio of the labeled protein (1), the partial peptide (2) or a salt thereof bound to the antibody is measured by allowing the salt to react with the salt competitively. A method for quantifying the protein described in (1), the partial peptide described in (2) or a salt thereof in a test solution, and (2)
1) After reacting the test solution with the antibody described in (13) insolubilized on the carrier and the labeled antibody described in (13) simultaneously or continuously, the labeling agent on the insolubilized carrier is obtained. (2) a method for quantifying the protein according to item (1), the partial peptide according to item (2), or a salt thereof in a test solution; And (23) the non-human mammal according to (22), wherein the non-human mammal is a rodent; and (24) the mouse is a rodent. The non-human mammal according to (23),
(25) A recombinant vector containing an exogenous DNA of (3) or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal (26) A non-human in which the DNA of (3) has been inactivated Mammalian embryonic stem cells, (27) the second (2) wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
(2) the embryonic stem cell according to (22), the embryonic stem cell according to (22) which is neomycin resistant, (29) the embryonic stem cell according to (22), wherein the non-human mammal is a rodent;
(30) an embryonic stem cell according to (29), wherein the rodent is a mouse; (31) a non-human mammal deficient in expression of the DNA according to (3), wherein the DNA is inactivated; D
NA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA described in (3). (33) The human mammal according to (31), wherein the non-human mammal is a rodent, and (34) the human mammal according to (33), wherein the rodent is a mouse. Administering a test compound to an animal and (35) the non-human mammal according to (32), and detecting the expression of a reporter gene, thereby promoting the promoter activity against the DNA according to (3). Alternatively, the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the compound.
【０００８】[0008]
【発明の実施の形態】本発明の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と
称する）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラ
ット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経
細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウ
ム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内
皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免
疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュ
ラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン
細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組
織〔例、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底
球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、
脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状
腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関
節、骨格筋など〕または血球系の細胞もしくはその培養
細胞株などに由来するタンパク質であってもよく、合成
タンパク質であってもよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention (hereinafter, referred to as the protein of the present invention) is a human or a warm-blooded animal ( For example, cells of guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc. (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells) , Epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils , Eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or of these cells Derived cells, stem cells or cancer cells, etc. or any tissue in which those cells are present [eg, brain, each part of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata) ,cerebellum),
Spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland , Peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc.) or a blood cell or a cultured cell line thereof, or may be a synthetic protein. .
【０００９】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約
７０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好まし
くは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが
挙げられ、より具体的には、タンパク質の構成アミノ酸
配列として配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含
有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約５０
％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約９
０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列などが好ましい。本発明の配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列を含有するタンパク質と実質的に同質の作用を有す
るタンパク質などが好ましい。実質的に同質の作用とし
ては、例えば、前駆体脂肪細胞の分化抑制作用、前駆体
神経細胞の分化誘導作用などが挙げられる。実質的に同
質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示
す。したがって、前駆体脂肪細胞の分化抑制作用などの
活性が同等（例、約０．１〜２０倍、好ましくは約０．
５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程
度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていて
もよい。例えば、前駆体脂肪細胞の分化抑制作用の活性
の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる
が、例えば、後述するスクリーニング方法に従って測定
することができる。The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 90% or more as compared with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, and most preferably about 95% or more homology. More specifically, the amino acid sequence contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a constituent amino acid sequence of the protein; The amino acid sequence represented by 1 and about 50
% Or more, preferably about 70% or more, more preferably about 9%.
Amino acid sequences having 0% or more, most preferably about 95% or more homology are preferred. SEQ ID NO: 1 of the present invention
As a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1; Proteins having an action substantially the same as that of the protein containing the represented amino acid sequence are preferred. Substantially the same action includes, for example, an action of suppressing differentiation of precursor adipocytes, an action of inducing differentiation of precursor neurons, and the like. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as the differentiation inhibitory effect of the precursor adipocytes are equivalent (eg, about 0.1 to 20 times, preferably about 0.1 to 20 times).
(5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different. For example, the measurement of the activity of inhibiting the differentiation of precursor adipocytes can be performed according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
【００１０】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸
が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個
程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が他のアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合
わせアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆる
ムテインも含まれる。本明細書におけるタンパク質は、
ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末
端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク
質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ
2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。こ
こでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル
などのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シ
クロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、
フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例え
ば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アル
キル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル
−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、
経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチ
ルエステルなどが用いられる。The protein of the present invention may be, for example, one or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 or more) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is an amino acid sequence in which several amino acids have been deleted, and one or more (preferably 1 to 3)
About 0, preferably about 1 to 10, more preferably several, amino acids added, and one or more (preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Preferably about 1 to 10, more preferably several) amino acids in which amino acids are substituted with other amino acids, or so-called muteins such as proteins containing amino acid sequences in combination. The proteins herein are:
The left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling. The proteins of the present invention, including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, usually have a carboxyl group (—COOH) or carboxylate (—COO − ) at the C-terminus, but have an amide at the C-terminus. (-CONH
2 ) or an ester (—COOR). Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example,
Phenyl, C 6-12 aryl group such as α- naphthyl, for example, C 7 of benzyl, α- naphthyl -C 1-2 alkyl group such as a phenyl -C 1-2 alkyl or α- naphthylmethyl such phenethyl -14 In addition to an aralkyl group,
Pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, is used.
【００１１】本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボ
キシル基（またはカルボキシレート）を有している場
合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて
いるものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合の
エステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルな
どが用いられる。さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ
末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホ
ルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保
護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端
のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、
ＮＨ2、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護され
ているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパ
ク質などの複合タンパク質なども含まれる。本発明のタ
ンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有するマウス７．５日胚由来
のタンパク質などが用いられる〔図１〜図３〕。When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used. Further, the protein of the present invention includes N
Those in which the amino group of the terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a formyl group or an acetyl group); Is pyroglutaminated, on the side chain of an amino acid in the molecule, such as OH,
Those in which NH 2 , SH, etc. are protected with an appropriate protecting group (eg, a C 1-6 acyl group such as a formyl group, an acetyl group, etc.), and complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bonded are also included. included. Specific examples of the protein of the present invention include, for example, a mouse 7.5-day embryo-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 to 3).
【００１２】本発明のタンパク質の部分ペプチドとして
は、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであっ
て、本発明のタンパク質が有する作用、例えば、前駆体
脂肪細胞の分化抑制作用、前駆体神経細胞の分化誘導作
用などの作用を有するものであればいずれのものでもよ
い。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列の
うち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さ
らに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以
上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有
し、脂肪細胞分化誘導作用などを有するペプチドなどが
用いられる。また、本発明の部分ペプチドは、そのアミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失し、
または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好まし
くは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程
度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が付加し、また
は、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらい好ま
しくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されていてもよい。また、本発明の部分ペプチドはＣ末
端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキ
シレート（−ＣＯＯ-）であるが、前記した本発明のタ
ンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ＝）ま
たはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、
本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク
質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護
基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生
成したグルタミル基がピログルタミン化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基（例、チ
オール基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が
結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども
含まれる。The partial peptide of the protein of the present invention is a partial peptide of the above-mentioned protein of the present invention, and has the action of the protein of the present invention, for example, the action of inhibiting the differentiation of precursor adipocytes, and the action of precursor neurons. Any substance may be used as long as it has an action such as a differentiation induction action. For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably 200 or more amino acid sequences of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention, A peptide having an adipocyte differentiation-inducing action or the like is used. The partial peptide of the present invention may have one or more (preferably 1 to 10)
Amino acids, more preferably several amino acids)
Alternatively, one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several) amino acids are added to the amino acid sequence, or 1 or more amino acids in the amino acid sequence are added. Alternatively, two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids may be substituted with another amino acid. The partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO − ) at the C-terminus. (-COOR). further,
Similar to the protein of the present invention described above, the partial peptide of the present invention includes one in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and a glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo. Pyroglutamate, a compound in which a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group (eg, a thiol group), or a complex peptide such as a so-called glycopeptide having a sugar chain bound thereto Is also included.
【００１３】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のタン
パク質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞
または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によっ
て製造することもできるし、後述するタンパク質をコー
ドするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
っても製造することができる。また、後述のペプチド合
成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の
組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組
織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行
ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合
わせることにより精製単離することができる。The salt of the protein of the present invention or its partial peptide is preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid),
Alternatively, organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid,
Fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid,
For example, salts with malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid) are used. The protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cell or tissue by a protein purification method known per se, or a transformant containing a DNA encoding the protein described below can be prepared. It can also be produced by culturing. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later. When producing from human or mammalian tissues or cells, the homogenized human or mammalian tissues or cells are extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
【００１４】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはその塩またはそれらのアミド体の合成には、通常
市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そ
のような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒ
ドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミ
ノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール
樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹
脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミド
メチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジ
メトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹
脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチ
ル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このよ
うな樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保
護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通り
に、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させ
る。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時
に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジ
スルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合
成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる
が、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類
としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、
N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイ
ミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ
化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミ
ノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物また
はHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじ
め保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加する
ことができる。For the synthesis of the protein of the present invention, its partial peptide or its salt, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution, and the target protein,
Obtain the partial peptides or their amides.
For the condensation of the protected amino acids described above, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As carbodiimides, DCC, N, N'-diisopropylcarbodiimide,
N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For these activations, the protected amino acid was directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added later to the resin.
【００１５】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol,
Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; and an appropriate mixture thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond forming reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
【００１６】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、
トリチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2
-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチル
などが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基
としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチ
ルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、B
um、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, tert-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, Trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used. Carboxyl groups can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl,
Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc., aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester) 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide,
It can be protected by trityl hydrazide or the like. The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for the esterification, for example, a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group, and the like are used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group. Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include, for example, Bzl, Cl 2
-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tert-butyl and the like are used. Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, B
um, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
【００１７】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ-炭素
などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、ま
た、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロ
メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの
混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミ
ン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに
よる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる
還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、
一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処
理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオ
アニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチ
ルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチ
オールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効であ
る。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用い
られる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理に
より除去され、トリプトファンのインドール保護基とし
て用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used. As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethane Acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is as follows:
Generally, the reaction is carried out at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethane Addition of a cation scavenger such as dithiol is effective. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
【００１８】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質またはその部分ペプチ
ドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、
カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド
化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク
質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ
末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質
（部分ペプチド）とＣ末端のカルボキシル基の保護基の
みを除去したタンパク質（部分ペプチド）とを製造し、
この両タンパク質（部分ペプチド）を上記したような混
合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記
と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精
製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所
望の粗タンパク質（部分ペプチド）を得ることができ
る。この粗タンパク質（部分ペプチド）は既知の各種精
製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥すること
で所望のタンパク質（部分ペプチド）のアミド体を得る
ことができる。タンパク質またはその部分ペプチドのエ
ステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しア
ミノ酸エステルとした後、タンパク質（部分ペプチド）
のアミド体と同様にして、所望のタンパク質（部分ペプ
チド）のエステル体を得ることができる。The protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means. . As another method for obtaining an amide form of a protein or its partial peptide, for example, first,
After amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired length on the amino group side.
A protein (partial peptide) in which only the protecting group of the terminal α-amino group is removed and a protein (partial peptide) in which only the protecting group of the C-terminal carboxyl group is removed,
Both proteins (partial peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein (partial peptide) can be obtained. The crude protein (partial peptide) is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein (partial peptide). In order to obtain an ester of a protein or its partial peptide, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the protein (partial peptide)
In the same manner as in the amide form, an ester form of the desired protein (partial peptide) can be obtained.
【００１９】本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩
は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本
発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断すること
によって製造することができる。ペプチドの合成法とし
ては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっ
ても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る
部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。The partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in (1) to (4) below. M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptide,
Academic Press, New York (1965) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten The partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
【００２０】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より
totalＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを
用いて、直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって
増幅することもできる。本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされ
る塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で
表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の作
用、例えば、前駆体脂肪細胞の分化抑制作用、前駆体神
経細胞の分化誘導作用などの活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。The DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Genomic DNA, genomic DNA library,
Any of the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, from the cells and tissues described above,
Reverse Transcriptase Polymerase Chain directly using the prepared total RNA fraction or mRNA fraction
It can also be amplified by Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method). As the DNA encoding the protein of the present invention, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence hybridizing under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 And a DNA encoding a protein having an activity equivalent to that of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, such as an activity of inhibiting the differentiation of precursor adipocytes and an activity of inducing differentiation of precursor neurons. Any one may be used.
【００２１】配列番号：２で表わされる塩基配列とハイ
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配
列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法ある
いはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロー
ニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook eta
l., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリ
ウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０
ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６
５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ
で温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的に
は、配列番号：１のアミノ酸配列を含有するタンパク質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされ
る塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる〔図１〜図
３〕。DN capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions
As A, for example, a nucleotide sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. And the like containing DNA. Hybridization is performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook eta).
l., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions. High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM.
In mM, the temperature is about 50-70 ° C, preferably about 60-6
The condition at 5 ° C. is shown. In particular, when the sodium concentration is about 19 mM
Most preferably, the temperature is about 65 ° C. More specifically, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used (FIGS. 1 to 3).
【００２２】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡの何れ
でもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡの部分塩基配列、または配列番号：２
で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の作
用を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配
列を有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼー
ションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記
と同様のものが用いられる。DNA encoding the partial peptide of the present invention
May be any as long as it contains the nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used. Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include a partial nucleotide sequence of a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 2
Has a base sequence that hybridizes under high stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. DNA or the like is used. The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.
【００２３】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ド（以下、本発明のタンパク質と略記する）を完全にコ
ードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明
のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライ
マーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当
なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の
一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合
成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシ
ョンによって選別することができる。ハイブリダイゼー
ションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Col
d Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など
に従って行なうことができる。また、市販のライブラリ
ーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従
って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、
公知のキット、例えば、MutantTM-G（宝酒造（株））、
MutantTM-K（宝酒造（株））などを用いて、Gupped dup
lex法やKunkel法などの自体公知の方法あるいはそれら
に準じる方法に従って行なうことができる。クローン化
されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりその
まま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカ
ーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡは
その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有
し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡ
Ａ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの
翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡ
アダプターを用いて付加することもできる。本発明のタ
ンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタ
ンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片
を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター
中のプロモーターの下流に連結することにより製造する
ことができる。As a means for cloning DNA which completely encodes the protein of the present invention or its partial peptide (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention), a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the protein of the present invention is used. Or by hybridizing the DNA incorporated into an appropriate vector with a DNA fragment coding for a part or all of the protein of the present invention or using a synthetic DNA. it can. Hybridization methods are described, for example, in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Col.
d Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Conversion of the base sequence of DNA
Known kits, for example, Mutant ™ -G (Takara Shuzo),
Gupped dup using Mutant TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.)
It can be carried out according to a method known per se such as the lex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto. The DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA has ATG at the 5 'end as a translation initiation codon and TA at the 3' end as a translation stop codon.
A, TGA or TAG. These translation initiation codons and translation stop codons are appropriately synthesized DNA
It can also be added using an adapter. The expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
【００２４】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好
ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐ
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
など、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場
合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター
などが好ましい。As a vector, a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12,
UC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB11)
0, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as λ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
A1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RS
V, pcDNAI / Neo, etc. are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as hosts, the SRα promoter, SV40 promoter, L
TR promoter, CMV promoter, HSV-TK
Promoters and the like. Of these, CMV
It is preferable to use a promoter, SRα promoter or the like. When the host is Escherichia, trp
Promoter, lac promoter, recA promoter, λP L promoter, lpp promoter, etc., when the host is Bacillus sp., SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc .; , GAP promoter, ADH
Promoters and the like are preferred. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
【００２５】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用
いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場
合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選
択することができる。また、必要に応じて、宿主に合っ
たシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付
加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ
・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主が
バチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル
配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母
である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグ
ナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシ
ュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナ
ル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用で
きる。このようにして構築された本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転
換体を製造することができる。[0025] In addition to the above, an expression vector optionally containing an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like may be used. Can be used. As a selection marker, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter, dhfr)
Gene (sometimes abbreviated as “methotrexate (M
TX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter referred to as Amp
r ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes Neo, G418 resistance)
And the like. In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using CHO (dhfr − ) cells, the target gene can be selected also by using a thymidine-free medium. If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is Escherichia, PhoA
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, or the like is used. When the host is a yeast, the MFα signal sequence, SUC2. When the host is an animal cell, such as a signal sequence, an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc. can be used. A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
【００２６】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccaromyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，
ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾ
サッカロマイセス ポンベ（Schizosaccaromyces pomb
e）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、サッカロマ
イセス ピキア パストリス（Saccaromyces picjia pa
storis）などが用いられる。As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used. Specific examples of Escherichia bacteria include
Escherichia coli K12 DH
1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160]
(1968)], JM103 [Nukuilec Acids
Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309
(1981)], JA221 [Journal of Molecular Biolog
y)], 120, 517 (1978)], HB101
[Journal of Molecular Biology, 4
1, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like. Examples of Bacillus bacteria include, for example, Bacillus
Bacillus subtilis MI114 [Gene,
24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemis
try), 95, 87 (1984)].
Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − ,
NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccaromyces pomb
e) NCYC1913, NCYC2036, Saccharomyces pichia pastoris (Saccaromyces picjia pa
storis) is used.
【００２７】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（in V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。As insect cells, for example, virus is A
In the case of cNPV, a cell line derived from night larvae of moth (Spodop
tera frugiperda cell (Sf cell), Trichoplusia ni
MG1 cells from the midgut, H from the eggs of Trichoplusia ni
igh Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or
Estigmena acrea-derived cells and the like are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mor
iN cells; BmN cells) and the like. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf9
21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo)
ivo), 13, 213-217, (1977)). As insects, for example, silkworm larvae and the like are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (198).
5)]. As animal cells, for example, monkey cells COS-
7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO (dhf)
r − ) cells), mouse L cells, mouse AtT-2
0, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like. In order to transform Escherichia, for example, Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69
Vol. 2110 (1972) and Gene, Vol. 17, 1
07 (1982).
【００２８】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細
胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新
細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９
５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２
巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうこと
ができる。このようにして、タンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換
体を得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチ
ルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用さ
れる培地としては液体培地が適当であり、その中には該
形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その
他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキ
ス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物
質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸
二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられ
る。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。In order to transform Bacillus sp., For example, Molecular & General Genetics, Vol.
111 (1979). To transform yeast, for example, methods in Enzymolog (Methods in Enzymolog)
y), 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Na)
Acad. Sci. USA), 75, 1929 (197).
8) and the like. In order to transform insect cells or insects, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988))
And the like. To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8 New
Cell engineering experiment protocol. 263-267 (199
5) (Published by Shujunsha), Virology, 52
Vol., 456 (1973). In this way, the D encoding the protein
A transformant transformed with the expression vector containing NA can be obtained. When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.As a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
【００２９】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通
常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により
通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バーク
ホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、
必要に応じて通気や撹拌を加える。As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa)
l of Experiments in Molecular Genetics), 431-
433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1
972] is preferred. Here, in order to make the promoter work efficiently if necessary, for example, 3β-indolyl
An agent such as acrylic acid can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Of the National Academy of Sciences of the USA, 77, 45.
05 (1980)] or SD containing 0.5% casamino acid.
Medium [Bitter, GA, et al., "The Prossings of
The National Academy of Sciences
Of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours,
Vent or agitate as needed.
【００３０】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Jounal of the American Medical
Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９
培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of
the Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞膜に本発明の
タンパク質を生成せしめることができる。When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the medium used is Grace's Insect Mediu.
m (Grace, TCC, Nature, 195,788 (196
Those to which an additive such as 10% bovine serum immobilized in 2)) is appropriately added are used. The pH of the medium is about 6.2-6.
Adjustment to 4 is preferred. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3
５5 days, with aeration and / or agitation as needed. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, MEM containing about 5 to 20% fetal bovine serum.
Medium [Seience, Vol. 122, 501 (19)
52)], DMEM medium [Virology,
8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association (The Jounal of the American Medical Association)
Association) Volume 199, 519 (1967)], 199
Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine (Proceeding of the
the Society for the Biological Medicine), 73
Vol., 1 (1950)]. pH is about 6-8
It is preferred that The cultivation is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration or stirring is added. As described above, the protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
【００３１】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるい
は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにし
て得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタン
パク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み
合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精
製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用す
る方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として
分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用
する方法などが用いられる。The protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method. When the protein of the present invention is extracted from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme, and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected. Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SD.
A method utilizing mainly a difference in molecular weight such as S-polyacrylamide gel electrophoresis, a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography, a method utilizing specific novelty such as affinity chromatography,
A method using a difference in hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography, a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
【００３２】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られ
た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
より、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の存在は、標識したリガンドとの結合実験および特異
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定
することができる。When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or another salt by a method analogous thereto. The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used. The presence of the thus-produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
【００３３】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体で
あれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何
れであってもよい。本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原と
して用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。The antibody against the protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof can be used as the antibody of the present invention.
Any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody may be used as long as the antibody can recognize the partial peptide or a salt thereof. An antibody against the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention) is produced by using the protein of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se. Can be. [Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier and a diluent at a site where the antibody can be produced by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
【００３４】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、例えばマウスから抗
体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に
脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産
生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合し
た標識剤の活性を測定することにより行なうことができ
る。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス
などが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ
Ｐ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好
ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２
０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００
〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加さ
れ、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０
分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を
実施できる。In preparing monoclonal antibody-producing cells, an individual having an antibody titer is selected from a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is performed by known methods, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (197
5)]. As a fusion promoter, for example,
Polyethylene glycol (PEG), Sendai virus and the like can be mentioned, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, S
P2 / 0, AP-1 and the like can be mentioned, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is 1: 1 to 2
0: 1, and PEG (preferably PEG1000
-PEG6000) is added at a concentration of about 10-80%, and at 20-40 ° C, preferably 30-37 ° C, 1-10
Cell incubation can be carried out efficiently by incubating for minutes.
【００３５】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着さ
せた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培
養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した
抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマ
ウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタン
パク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検
出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選
別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行な
うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行な
うことができる。選別および育種用培地としては、ハイ
ブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用
いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２
０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜
１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業
（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体
価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then, A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. . Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as hybridomas can grow. For example, 1-20%, preferably 10-2
RPMI 1640 medium containing 0% fetal calf serum,
GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% fetal calf serum or serum-free medium for hybridoma culture (S
FM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 3 ° C.
7 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
【００３６】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。(B) Purification of Monoclonal Antibody Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis). Method, adsorption / desorption method using an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active antibody such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate the bond. Specific Purification Method for Obtaining Antibody].
【００３７】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体を
つくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温
血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパ
ク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を
行なうことにより製造できる。温血動物を免疫するため
に用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に
関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプ
テンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハ
プテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なもの
をどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血
清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等
を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好まし
くは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。[Preparation of Polyclonal Antibody] The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (protein antigen) and a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as in the above-described monoclonal antibody production method, and an antibody-containing substance against the protein of the present invention is collected from the immunized animal. Then, the antibody can be produced by separating and purifying the antibody. With respect to the complex of the immunizing antigen and the carrier protein used for immunizing a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are such that the antibody is efficiently cross-linked to the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 20, relative to hapten 1. A method of coupling at a rate of ５5 is used.
【００３８】また、ハプテンとキャリアーのカプリング
には、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタル
アルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステ
ル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エス
テル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対
して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約
２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれ
る。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温
血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取する
ことができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノク
ローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離
精製法に従って行なうことができる。For coupling the hapten and the carrier, various condensing agents can be used. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used. Condensation product is itself or a carrier at a site where antibody production is possible for a warm-blooded animal,
Administered with diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method. The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The polyclonal antibody can be separated and purified according to the same method for separating and purifying immunoglobulins as in the above-described method for separating and purifying a monoclonal antibody.
【００３９】本発明のタンパク質または部分ペプチドを
コードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩
基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明の
タンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまた
はｍＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に実質
的に相補的な塩基配列を有し、該タンパク質または部分
ペプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレ
オチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセン
スＤＮＡであってもよい。該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに実
質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、該ＤＮＡまた
はｍＲＮＡの相補鎖）の全塩基配列または部分塩基配列
と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好まし
くは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相
同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明
のＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本
発明のタンパク質等のＮ末端部位をコードする部分の塩
基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相
補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好
ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上
の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。こ
れらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置な
どを用いて製造することができる。以下に、本発明のタ
ンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、
本発明のタンパク質等と略記する場合がある）、本発明
のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本
発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体
と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡの用
途を説明する。The antisense DNA having a nucleotide sequence substantially complementary to the DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention includes the nucleotide sequence or DNA of the DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention. Any antisense DNA having an nucleotide sequence substantially complementary to a part of the nucleotide sequence and an oligonucleotide or a derivative thereof having an action capable of suppressing the expression of the protein or partial peptide may be used. Is also good. The nucleotide sequence substantially complementary to the DNA or mRNA is, for example, about 70% of the total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA or mRNA (that is, the complementary strand of the DNA or mRNA). %, Preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, still more preferably about 95% or more. In particular, of the entire nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA or mRNA of the present invention, the complementary strand of the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, the nucleotide sequence near the start codon) is about 70%. % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like. Hereinafter, the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (hereinafter, referred to as
Abbreviated as the protein of the present invention, etc.), and
A (hereinafter sometimes abbreviated to the DNA of the present invention), antibodies to the protein and the like of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated to the antibody of the present invention), and uses of antisense DNA will be described.
【００４０】（１）本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の予防・治療剤 本発明のタンパク質等またはＤＮＡに異常があったり、
欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、
生体内において正常な機能を発揮できないために、例え
ば、肥満、視力障害、聴覚障害、網膜退化、糖尿病、動
脈硬化症などの原因となる。したがって、本発明のタン
パク質等およびＤＮＡは、例えば、本発明のタンパク質
等またはＤＮＡの欠損・損傷・発現減少などに起因する
種々の疾病（例、肥満、視力障害、聴覚障害、網膜退
化、糖尿病、動脈硬化症など）の予防・治療剤、体重調
整剤、食欲調整剤などの医薬として使用することができ
る。例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少
あるいは欠損しているために、本発明のタンパク質の機
能が十分に、あるいは正常に行なわれない患者がいる場
合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内
で本発明のタンパク質等を発現させることによって、
（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパ
ク質等を発現させた後に、該細胞を患者に移植すること
によって、または（ハ）本発明のタンパク質等を該患者
に注入することなどによって、該患者における本発明の
タンパク質等の役割を十分に、あるいは正常に発揮させ
ることができる。本発明のＤＮＡを上記の予防・治療剤
として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロ
ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウ
イルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な
ベクターに挿入した後、常套手段に従って実施すること
ができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂
取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲ
ルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。(1) Agent for preventing or treating various diseases related to the protein of the present invention.
If it is deficient or the expression level is reduced,
Inability to perform normal functions in a living body causes, for example, obesity, visual impairment, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, and arteriosclerosis. Therefore, the protein or the like and the DNA of the present invention include, for example, various diseases (eg, obesity, visual impairment, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, etc.) caused by deficiency, damage or reduced expression of the protein or the like or the DNA of the present invention. It can be used as a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent for arteriosclerosis, a weight adjusting agent, an appetite adjusting agent and the like. For example, when the function of the protein of the present invention is insufficient or normal in some patients because the protein of the present invention is reduced or deficient in a living body, (a) the DNA of the present invention By administering to a patient and expressing the protein or the like of the present invention in vivo,
(B) inserting the DNA of the present invention into cells and expressing the protein or the like of the present invention, and then transplanting the cells into a patient; or (c) injecting the protein or the like of the present invention into the patient. Thus, the role of the protein of the present invention or the like in the patient can be sufficiently or normally exerted. When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by conventional means. can do. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
【００４１】本発明のタンパク質等を上記の予防・治療
剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましく
は９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ま
しくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ま
しい。本発明のタンパク質等またはＤＮＡは、例えば、
必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシ
ル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるい
は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌
性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に
使用できる。例えば、本発明のタンパク質等またはＤＮ
Ａを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒ
クル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認め
られた製剤実施に要求される単位用量形態で混和するこ
とによって製造することができる。これら製剤における
有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ
うにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和する
ことができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コー
ンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合
剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスター
チ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステア
リン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖また
はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ
油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調
剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材
料にさらに油脂のような液状担体を含有することができ
る。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒク
ル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出
植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実
施に従って処方することができる。When the protein or the like of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it must be purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferred to use. The protein or DNA of the present invention, for example,
Sugar-coated tablets, capsules, elixirs, microcapsules, and the like, as necessary, orally, or sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions, etc. It can be used parenterally in the form of injections. For example, the protein of the present invention or DN
A can be produced by mixing A with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in the unit dosage form generally required for the practice of formulations. it can. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained. Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
【００４２】注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤
は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血
動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、
トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、
チンパンジーなど）に対して投与することができる。該
タンパク質等またはＤＮＡの投与量は、症状などにより
差異はあるが、例えば、肥満治療を目的として経口投与
する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは
約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍ
ｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量
は投与対象、対象組織、症状、投与方法などによっても
異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（６０ｋｇ
として）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ
程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好まし
くは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。Examples of aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). In combination with a solubilizing agent, for example, an alcohol (eg, ethanol or the like), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol or the like), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™ , HCO-50, or the like) Is also good. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), Preservatives (for example,
Benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule. The preparations obtained in this way are safe and of low toxicity, such as, for example, humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits,
Birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys,
Chimpanzees). The dose of the protein or DNA may vary depending on the symptoms and the like. For example, when administered orally for the purpose of treating obesity, generally, for an adult (60 kg), about 0.1 mg to 100 mg per day is used. , Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 m
g. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target tissue, symptoms, administration method and the like.
)), About 0.01 to 30 mg per day
It is convenient to administer the drug by intravenous injection, preferably of the order of about 0.1 to 20 mg, more preferably of the order of about 0.1 to 10 mg. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
【００４３】（２）各種疾病に対する医薬候補化合物の
スクリーニング 本発明のタンパク質等は、例えば、前駆脂肪細胞の分化
抑制作用、前駆神経細胞の分化誘導作用などの活性を有
するため、本発明のタンパク質の作用を活性化もしくは
増強する化合物またはその塩は、肥満、視力障害、聴覚
障害、網膜退化、糖尿病、動脈硬化症などの各種疾病の
予防・治療剤、体重調整剤、食欲調整剤などの医薬とし
て使用できる。一方、本発明のタンパク質の作用を阻害
もしくは減弱する化合物またはその塩は、本発明のタン
パク質の過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤などの
医薬として使用できる。したがって、本発明のタンパク
質等は、本発明のタンパク質等の作用を活性化もしくは
増強する化合物、本発明のタンパク質の作用を阻害もし
くは減弱する化合物またはその塩のスクリーニングのた
めの試薬として有用である。すなわち、本発明は、
（１）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の作用（例、前
駆脂肪細胞の分化抑制作用、前駆神経細胞の分化誘導作
用など）または発現を活性化または増強する化合物（以
下、活性化剤と略記する場合がある）または該作用を阻
害もしくは減弱する化合物（以下、阻害剤と略記する場
合がある）のスクリーニング方法を提供する。具体的に
は、例えば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質、その部
分ペプチドまたはその塩を含有する前駆細胞を培養した
場合と、（ii）本発明のタンパク質、その部分ペプチド
またはその塩を含有する前駆細胞を試験化合物の存在下
で培養した場合における、前駆細胞の分化を観察し、比
較することを特徴とする該活性化剤または阻害剤のスク
リーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリー
ニング方法（２）において、例えば、（ｉ）と（ii）の
場合における、前駆細胞の分化過程を観察して、比較す
ることを特徴とするものである。(2) Screening of Candidate Drug Compounds for Various Diseases Since the protein of the present invention has, for example, an activity of inhibiting the differentiation of preadipocytes and an activity of inducing the differentiation of progenitor nerve cells, the protein of the present invention is Compounds or salts thereof that activate or enhance the action can be used as drugs for preventing or treating various diseases such as obesity, visual impairment, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, arteriosclerosis, weight regulators, appetite regulators, etc. Can be used. On the other hand, a compound or a salt thereof that inhibits or attenuates the action of the protein of the present invention can be used as a medicament such as an agent for preventing or treating a disease caused by overexpression of the protein of the present invention. Therefore, the protein or the like of the present invention is useful as a reagent for screening a compound that activates or enhances the action of the protein or the like of the present invention, a compound that inhibits or attenuates the action of the protein of the present invention, or a salt thereof. That is, the present invention
(1) Action of the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof using the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (eg, the inhibitory action on the differentiation of preadipocytes, progenitor nerve cell Of a compound that activates or enhances expression (hereinafter sometimes abbreviated as an activating agent) or a compound that inhibits or attenuates the effect (hereinafter sometimes abbreviated as an inhibitor). A screening method is provided. Specifically, for example, (2) (i) the case where a precursor cell containing the protein of the present invention, its partial peptide or its salt is cultured, and (ii) the protein of the present invention, its partial peptide or its salt, It is intended to provide a method for screening for the activator or the inhibitor, which comprises observing and comparing the differentiation of the precursor cells when the containing precursor cells are cultured in the presence of a test compound. Specifically, in the screening method (2), for example, the differentiation process of the precursor cells in the cases (i) and (ii) is observed and compared.
【００４４】本発明のタンパク質等としては、前記した
ものと同様のものが用いられる。本発明のタンパク質等
を含有する前駆細胞としては、前駆脂肪細胞、前駆神経
細胞の他、本発明のＤＮＡを導入せしめた株化細胞など
が用いられる。前駆脂肪細胞としては、例えば、３Ｔ３
−Ｌ１（セル（Cell）3, 127-133(1974)）、３Ｔ３−Ｆ
４４２Ａ（セル（Cell）7, 105-113(1976)）、Ｏｂ１７
７１（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. S
ci. USA）,75, 6054-6058(1978)）、ＳＴ１３（インヴ
ィトロ（In Vitro）,16, 658-693(1980)）などの公知の
細胞が用いられる。本発明のＤＮＡを導入せしめた株化
細胞は自体公知の方法を用いて製造することができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非
ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。前駆脂肪細胞から脂肪細胞へ分化さ
せる手法としては、自体公知の方法、例えば、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジーカル・ケミストリー（Journal
of Biological Chemistry）266, 4722-4731(1992)など
に記載の方法などを用いることができる。As the protein and the like of the present invention, those similar to those described above are used. As the precursor cells containing the protein or the like of the present invention, cell lines into which the DNA of the present invention has been introduced, as well as preadipocytes and progenitor nerve cells, are used. Examples of preadipocytes include 3T3
-L1 (Cell 3, 127-133 (1974)), 3T3-F
442A (Cell 7, 105-113 (1976)), Ob17
71 (Proceding of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. S)
ci. USA), 75, 6054-6058 (1978)) and ST13 (In Vitro, 16, 658-693 (1980)). The cell line into which the DNA of the present invention has been introduced can be produced by a method known per se.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound. As a method for differentiating preadipocytes into adipocytes, a method known per se, for example, Journal of Biological Chemistry (Journal
of Biological Chemistry) 266, 4722-4731 (1992) and the like.
【００４５】本発明のタンパク質等の作用としては、例
えば、前駆脂肪細胞の分化抑制作用、前駆神経細胞の分
化誘導作用などが挙げられる。また、本発明のタンパク
質等をコードするｍＲＮＡの発現量、本発明のタンパク
質等の発現量などを指標とすることができる。本発明の
タンパク質等の前駆脂肪細胞の分化抑制作用は、自体公
知の方法を用いて測定することができるが、例えば、前
駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の過程において産生さ
れる中性脂肪の量を指標として測定することができる。
具体的には、セル（Cell）,5, 19-27(1975)などに記載
の中性脂肪染色法に従って測定することができる。本発
明のタンパク質等をコードするｍＲＮＡの発現量は、例
えば、ノーザンハイブリダイゼーションなどによって測
定することができる。本発明のタンパク質等の発現量
は、後述する本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質
等の定量法に従って測定することができる。試験化合物
を添加することにより本発明のタンパク質等の作用
（例、前駆脂肪細胞の分化抑制作用など）、本発明のタ
ンパク質等をコードするｍＲＮＡの発現量または本発明
のタンパク質等の発現量が約１０％以上、好ましくは約
２０％以上、より好ましくは約３０％以上、最も好まし
くは約５０％以上増加した場合、該試験化合物は本発明
のタンパク質等の作用または発現を活性化もしくは増強
する化合物として選択することができる。一方、試験化
合物を添加することにより本発明のタンパク質等の作
用、本発明のタンパク質等をコードするｍＲＮＡの発現
量または本発明のタンパク質等の発現量が約１０％以
上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％
以上、最も好ましくは約５０％以上減少した場合、該試
験化合物は本発明のタンパク質等の作用または発現を阻
害もしくは減弱する化合物として選択することができ
る。The action of the protein or the like of the present invention includes, for example, an action of inhibiting differentiation of preadipocytes, an action of inducing differentiation of precursor neurons, and the like. In addition, the expression level of mRNA encoding the protein or the like of the present invention, the expression level of the protein or the like of the present invention, or the like can be used as an index. The effect of inhibiting the differentiation of preadipocytes such as the protein of the present invention can be measured using a method known per se. The amount can be measured as an index.
Specifically, it can be measured according to the neutral fat staining method described in Cell, 5, 19-27 (1975) and the like. The expression level of mRNA encoding the protein or the like of the present invention can be measured, for example, by Northern hybridization. The expression level of the protein or the like of the present invention can be measured according to the method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention described later. By adding the test compound, the action of the protein or the like of the present invention (eg, the effect of inhibiting the differentiation of preadipocytes), the expression level of mRNA encoding the protein or the like of the present invention, or the expression level of the protein or the like of the present invention can be reduced. When increased by 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and most preferably about 50% or more, the test compound activates or enhances the action or expression of the protein or the like of the present invention. Can be selected as On the other hand, by adding a test compound, the action of the protein or the like of the present invention, the expression level of mRNA encoding the protein or the like of the present invention, or the expression level of the protein or the like of the present invention is about 10% or more, preferably about 20% or more. , More preferably about 30%
As described above, when the decrease is most preferably about 50% or more, the test compound can be selected as a compound that inhibits or attenuates the action or expression of the protein or the like of the present invention.
【００４６】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有
するものであってもよく、あるいは、前駆脂肪細胞また
は本発明のＤＮＡを導入せしめた細胞を含有するもので
あってもよい。本発明のスクリーニング用キットの例と
しては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 前駆脂肪細胞 ３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞１０4セル／ウェルを、１０
％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（ｐＨ
７．２）を用いて９６穴プレートで５％炭酸ガス下、３
７℃で培養したもの。 分化誘導用培地 １０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地
（ｐＨ７．２）にインスリン １０ｍｇ／ｍｌ、デキサ
メタゾン １０μＭ、イソブチルメチルキサンチン０．
５ｍＭを添加したもの。 検出 イソプロパノール溶液（Oil Red O）による中性脂肪の
染色The screening kit of the present invention may contain the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or may contain a preadipocyte or a cell into which the DNA of the present invention has been introduced. It may be something. Examples of the screening kit of the present invention include the following. [Screening Reagent] Preadipocytes 3T3-L1 preadipocytes 10 4 cells / well
% Fetal bovine serum containing Dulbecco's modified Eagle medium (pH
7.2) in a 96-well plate under 5% CO 2
Cultured at 7 ° C. Differentiation-inducing medium Dulbecco's modified Eagle's medium (pH 7.2) containing 10% fetal bovine serum, insulin 10 mg / ml, dexamethasone 10 μM, isobutylmethylxanthine 0.
5 mM added. Detection Neutral fat staining with isopropanol solution (Oil Red O)
【００４７】〔測定法〕前駆脂肪細胞をリン酸緩衝液で
２回洗浄した後、１０％ホルマリン／リン酸緩衝液に室
温で１時間浸すことにより固定する。固定された細胞を
０．５％（W/V）のOil Red Oで染色する。染色後、この
細胞を６０％イソプロパノールで２回洗浄することによ
り、中性脂肪のみが染色された細胞標本を得ることがで
きる。さらに、Oil Red Oを１００％イソプロパノール
で中性脂肪から溶出し、５１０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより中性脂肪の含有量を定量する。試験化合物を
添加することにより、中性脂肪の染色度が約１０％以
上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％
以上、最も好ましくは約５０％以上阻害された場合、該
試験化合物を本発明のタンパク質等の前駆脂肪細胞の分
化抑制作用を活性化もしくは増強する化合物として選択
する。一方、試験化合物を添加することにより、中性脂
肪の染色度が約１０％以上、好ましくは約２０％以上、
より好ましくは約３０％以上、最も好ましくは約５０％
以上増加した場合、該試験化合物を本発明のタンパク質
等の前駆脂肪細胞の分化抑制作用を阻害もしくは減弱す
る化合物として選択する。[Measurement Method] Preadipocytes are washed twice with a phosphate buffer, and then fixed by immersion in a 10% formalin / phosphate buffer at room temperature for 1 hour. The fixed cells are stained with 0.5% (W / V) Oil Red O. After staining, the cells are washed twice with 60% isopropanol to obtain a cell specimen in which only neutral fat is stained. Further, Oil Red O is eluted from neutral fat with 100% isopropanol, and the content of neutral fat is quantified by measuring the absorbance at 510 nm. By adding the test compound, the degree of staining of neutral fat is about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30%.
As described above, when the inhibition is most preferably about 50% or more, the test compound is selected as a compound that activates or enhances the action of inhibiting the differentiation of preadipocytes such as the protein of the present invention. On the other hand, by adding the test compound, the degree of staining of neutral fat is about 10% or more, preferably about 20% or more,
More preferably about 30% or more, most preferably about 50%
In the case of the increase, the test compound is selected as a compound that inhibits or attenuates the action of suppressing the differentiation of preadipocytes such as the protein of the present invention.
【００４８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本
発明のタンパク質等の作用または発現を活性化もしくは
増強する化合物、または該作用を阻害もしくは増強する
化合物である。該化合物は、本発明のタンパク質等の作
用を直接に活性化もしくは増強、または阻害もしくは減
弱するものであってもよいし、あるいは本発明のタンパ
ク質等の転写レベルでの発現を活性化もしくは増強、ま
たは阻害もしくは減弱することによって間接的に本発明
のタンパク質等の作用を活性化もしくは増強、または阻
害もしくは減弱するものであってもよい。該化合物の塩
としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のも
のが用いられる。本発明のタンパク質等の作用または発
現を活性化または増強する化合物は、例えば、肥満、視
力障害、聴覚障害、網膜退化、糖尿病、動脈硬化症など
の各種疾病に対する予防・治療剤、体重調整剤、食欲調
整剤などの医薬として有用である。一方、タンパク質等
の作用または発現を阻害もしくは減弱する化合物は、例
えば、本発明のタンパク質の過剰発現などに起因する疾
病に対する予防・治療剤などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キ
ットを用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤とし
て使用する場合、常套手段に従って実施することができ
る。例えば、前記した本発明のタンパク質等またはＤＮ
Ａを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液
剤などとすることができる。得られる製剤は安全で低毒
性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、
マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、
トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して
投与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、症状などにより差異はあるが、例えば、肥満の治療
のために経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常
成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、該化合物またはその塩の投与量は、症状などによ
り差異はあるが、例えば、本発明のタンパク質の過剰発
現に起因する疾病の治療目的で経口投与する場合、一般
的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につ
き約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口
的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえ
ば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。The compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and activates or enhances the action or expression of the protein or the like of the present invention. A compound, or a compound that inhibits or enhances the action. The compound may directly activate or enhance, or inhibit or attenuate the action of the protein or the like of the present invention, or activate or enhance the expression of the protein or the like at the transcription level, Alternatively, the action of the protein or the like of the present invention may be indirectly activated or enhanced, or inhibited or attenuated by inhibiting or attenuating the action. As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used. Compounds that activate or enhance the action or expression of the protein or the like of the present invention include, for example, agents for preventing and treating various diseases such as obesity, visual impairment, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, and arteriosclerosis, weight adjusting agents, It is useful as a drug such as an appetite regulator. On the other hand, a compound that inhibits or attenuates the action or expression of a protein or the like is useful as a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent for a disease caused by overexpression of the protein of the present invention.
When a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be carried out according to conventional means. For example, the above-described protein of the present invention or DN
Tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the preparation containing A. The resulting formulations are safe and low toxic, such as, for example, humans or warm-blooded animals (eg,
Mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse,
Birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.). The dose of the compound or a salt thereof varies depending on symptoms and the like. For example, when administered orally for the treatment of obesity, it is generally used for adults (body weight 60 k
g) about 0.1 to 100 m per day
g, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. If administered parenterally,
The single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. For example, in the case of an injection, usually in an adult (as 60 kg), about 0.1 mg per day is used.
It is convenient to administer about 01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. For other animals,
The amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, the dose of the compound or a salt thereof varies depending on symptoms and the like. For example, when the compound is orally administered for the purpose of treating a disease caused by overexpression of the protein of the present invention, it is generally used for adults (with a body weight of 60 kg). )), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg per day.
g, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method and the like. About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg
It is convenient to administer about 0 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
【００４９】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を特異的に認識
することができるので、被検液中の本発明のタンパク質
等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量など
に使用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）
本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタ
ンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化された本発明のタンパク質等の割合を測定すること
を特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは
連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパ
ク質等の定量法を提供する。上記（ii）の定量法におい
ては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ
端部に反応する抗体であることが望ましい。(3) Quantification of the protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof The antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention and the like. It can be used for quantification of proteins and the like, particularly for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention provides (i)
An antibody of the present invention is allowed to react competitively with a test solution and a labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured. And (ii) reacting the test solution with the antibody of the present invention and the labeled antibody of the present invention insolubilized on a carrier simultaneously or continuously. Thereafter, there is provided a method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test liquid, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier. In the quantification method (ii), one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention, and the other antibody is a C-protein such as the protein of the present invention.
Desirably, the antibody reacts at the end.
【００５０】また、本発明のタンパク質等に対するモノ
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定
量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこと
もできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用い
てもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あ
るいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用い
る本発明のタンパク質等の定量法は、 特に制限される
べきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タン
パク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複
合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これ
を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線
より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いて
もよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメト
リック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、
感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いる
のが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられ
る標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍
光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素と
しては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔
14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比
活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用い
られる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。In addition to quantification of the protein of the present invention using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like is also possible. Can also. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of an antigen (eg, the amount of a protein) in a test solution. Any method may be used as long as it is a method for detecting the amount of by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used,
In terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later. As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [
14 C]. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
【００５１】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不
溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液
中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１
次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に
行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識
化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることが
できる。また、サンドイッチ法による免疫測定法におい
て、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は
必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させ
る等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよ
い。本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質
等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられ
る本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質
等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられ
る。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗
体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の
タンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用い
られる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を
認識する抗体が用いられる。For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass. In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined. 1
The next reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may. In the method for measuring the protein or the like of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein or the like of the present invention. Can be That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably used, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein or the like of the present invention. Is an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
【００５２】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降
物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレ
ーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephelometry and the like. In the competition method, an antigen in a test solution and a labeled antigen are allowed to react competitively with an antibody, and then the unreacted labeled antigen is reacted with the antigen.
(F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (B
/ F separation), the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody was used as an antibody, B / F separation was performed using polyethylene glycol,
A liquid phase method using a second antibody or the like to the antibody, and using an immobilized antibody as the first antibody, or
A solid-phase method using a soluble antibody as the first antibody and using a solid-phased antibody as the second antibody is used. In the immunometric method, an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Is reacted with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution. In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
【００５３】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛
編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明のタンパク質
抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感
度良く定量することができる。さらには、本発明のタン
パク質抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量
することによって、例えば、本発明のタンパク質等が関
与する疾病の診断を行なうことができる。具体的には、
本発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、
本発明のタンパク質等の濃度の減少が見られた場合は、
例えば、肥満、視力障害、聴覚障害、網膜退化、糖尿
病、動脈硬化症などの疾病であると診断することができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明のタンパク質等を検出するために使用
することができる。また、本発明のタンパク質等を精製
するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画
中の本発明のタンパク質等の検出、被検細胞内における
本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用する
ことができる。In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. What is necessary is just to construct the measuring system of the protein etc. of the present invention by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like. For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd Ed. Published in 1962, "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochem
ical Techniques (Part A)), ibid.Vol. 73 (Immunochem
ical Techniques (Part B)), ibid.Vol. 74 (Immunochem
ical Techniques (Part C)), ibid.Vol. 84 (Immunochem
ical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)),
Ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part
I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s)) (above, published by Academic Press). As described above, the protein and the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the protein antibody of the present invention. Furthermore, by quantifying the concentration of the protein or the like of the present invention using the protein antibody of the present invention, for example, a disease associated with the protein or the like of the present invention can be diagnosed. In particular,
By quantifying the concentration of the protein or the like of the present invention,
If the concentration of the protein of the present invention is reduced,
For example, it can be diagnosed as a disease such as obesity, visual impairment, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, and arteriosclerosis. Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, and the like Can be used for
【００５４】（４）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s ofthe Natinal Academy of Sciences of the United
States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０
頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより、本発
明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡの減少が検出された場合は、肥満、
視力障害、聴覚障害、網膜退化、糖尿病、動脈硬化症で
ある可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと
診断することができる。(4) Gene Diagnostic Agent The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, bovine,
DNA or mRNA abnormalities (genetic abnormalities) encoding the protein of the present invention or its partial peptide in horses, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) can be detected.
It is useful as an agent for genetic diagnosis such as damage, mutation or decreased expression of DNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA. The above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics (Genomics)).
s), 5, 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of USA (Proceeding)
s ofthe Natinal Academy of Sciences of the United
States of America), Vol. 86, 2766-2770
(1989)).
For example, by Northern hybridization, D encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof is
If a decrease in NA or mRNA is detected, obesity,
A diagnosis can be made that the eyesight, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, arteriosclerosis are likely, or are likely to be affected in the future.
【００５５】（５）アンチセンスＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ 本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａに相補的に結合し、該ＤＮＡもしくはｍＲＮＡや本発
明のタンパク質等の発現を抑制することができるアンチ
センスＤＮＡは、本発明のタンパク質等またはそれらを
コードするＤＮＡの異常発現を抑制することができる。
したがって、該アンチセンスＤＮＡは、例えば、本発明
のタンパク質等またはそれらをコードするＤＮＡの異常
発現に起因する疾病の予防・治療剤として使用すること
ができる。該アンチセンスＤＮＡを上記の治療・予防剤
として使用する場合、前記した本発明のＤＮＡを含有す
る医薬と同様にして製造することができる。例えば、該
アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与
することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのまま
で、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に
認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ
ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞にお
ける本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるため
の診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用するこ
ともできる。(5) DN containing antisense DNA
A DNA or mRN encoding the protein or the like of the present invention
A antisense DNA that can complementarily bind to A and suppress the expression of the DNA or mRNA or the protein of the present invention can suppress abnormal expression of the protein or the like of the present invention or the DNA encoding them. it can.
Therefore, the antisense DNA can be used, for example, as an agent for preventing or treating a disease caused by abnormal expression of the protein or the like of the present invention or the DNA encoding the same. When the antisense DNA is used as the above therapeutic / prophylactic agent, it can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the DNA of the present invention. For example, the antisense DNA can be administered alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector or the like, and then administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and then administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
【００５６】（６）ＤＮＡ転移動物の作製 本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）または
その変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する
場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すな
わち、本発明は、（ｉ）本発明の外来性ＤＮＡまたはそ
の変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（ii）非ヒト哺
乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ)記載の非ヒト哺乳動
物、 （iii）ゲッ歯動物がマウスである第（ii）記載の非ヒ
ト哺乳動物、および（iv）本発明の外来性ＤＮＡまたは
その変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる
組換えベクターを提供するものである。(6) Preparation of DNA-Transferred Animal The present invention relates to D-encoding an exogenous protein of the present invention.
Provided is a non-human mammal having NA (hereinafter abbreviated as an exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as an exogenous mutant DNA of the present invention). That is, the present invention provides (i) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof, (ii) the non-human mammal according to (i), wherein the non-human mammal is a rodent, (Iii) a non-human mammal according to (ii), wherein the rodent is a mouse; and (iv) a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. Is what you do.
【００５７】本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮ
Ａを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移
動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、***およびそ
の始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、
非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好
ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に
８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス
法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェク
ション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによっ
て作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法によ
り、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本
発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養など
に利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚
芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることに
より本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツ
ジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスタ
ー、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体
動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイク
ルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とり
わけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系
統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系
統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系
統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔ
ａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動物において発
現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」として
は、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられ
る。The foreign DNA of the present invention or its mutant DN
A non-human mammal having A (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) is preferably used for unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
At the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably, at the stage of a single cell or a fertilized egg cell and generally before the 8-cell stage), a calcium phosphate method, an electric pulse method, a lipofection method, an agglutination method, a microinjection method, a particle It can be produced by transferring a target DNA by a cancer method, a DEAE-dextran method, or the like. Further, by the DNA transfer method, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Above all, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, particularly mice (for example, crosses such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) As a strain, B6C3F 1 strain, BDF 1 strain, B6D2F 1 strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wist
ar, SD, etc.). "Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
【００５８】本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ
るＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、
対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物
に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現
させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンスト
ラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本
発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高
い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモータ
ーの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコン
ストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精
卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転
移哺乳動物を作出することができる。The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention,
Specifically, DNA in which addition or deletion of a base, substitution with another base, or the like has occurred is used, and abnormal DNA is also included. The abnormal DNA refers to a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used. The exogenous DNA of the present invention comprises:
It may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, DNAs derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto are expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
【００５９】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、ウ
ィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィル
ス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィ
ルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モ
ルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のも
のとしては、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキ
ンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリ
ン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク
質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来
成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラ
ーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タン
パク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒
石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム
利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般に
Ｔｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン
３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロ
フィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、
メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラ
スＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミ
ンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰ
Ｏ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、β
アクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１お
よび２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔ
ｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血
清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポ
ニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリン
Ａ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる
が、好ましくは全身で高発現することが可能なサイトメ
ガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因
子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワ
トリβアクチンプロモーターなどを用いることができ
る。Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as phage λ, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses and the like are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used. The above DN
Examples of the promoter that controls A expression include promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), and various mammals (human, rabbit) , Dogs, cats, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice and the like) include albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelets Derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline solution Phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA,
Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TP
O), polypeptide elongation factor 1α (EF-1α), β
Actin, α and β myosin heavy chains, myosin light chains 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, T
hy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, preproenkephalin A, vasopressin, and other promoters, and the like, preferably high expression in the whole body For example, a cytomegalovirus promoter, a human polypeptide elongation factor 1α (EF-1α) promoter, a human and chicken β-actin promoter, and the like can be used.
【００６０】上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物にお
いて目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各
ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミア
ンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮ
Ａのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核
ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の
５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳
領域の３'下流に連結することも目的により可能であ
る。正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、各種哺乳
動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハム
スター、ラット、マウス、ヒトなど）由来の肝臓、腎
臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各
種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあ
るいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線
維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相
補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外
来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られ
た正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法によ
り変異した翻訳領域を作製することができる。該翻訳領
域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクト
として、前記のプロモーターの下流および所望により転
写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法
により作製することができる。受精卵細胞段階における
本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細
胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。
ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の
外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべ
て、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来
性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性Ｄ
ＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞お
よび体細胞のすべてに本発明のＤＮＡを有する。The vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the target mRNA in a DNA-transferred mammal (generally called a terminator). A sequence can be used, and preferably, SV40 terminator of simian virus or the like is used.
In addition, each DN is used to further express the target DNA.
It is also possible to link the splicing signal of A, the enhancer region, a part of an intron of eukaryotic DNA, etc. 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region. The normal translation region of the protein of the present invention can be obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA, and commercially available DNA from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, humans, etc.). From the various genomic DNA libraries described above, or as a starting material, a complementary DNA prepared by a known method from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal protein obtained from the above-described cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA. The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site. Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. means. Exogenous D of the present invention
The progeny of such animals that have inherited NA have the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
【００６１】本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非
ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持するこ
とを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境
で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階における
本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細
胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保され
る。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明
の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子
孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外
来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外
来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽
細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰
に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザ
イゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配すること
によりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁
殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させら
れており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することに
より最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症す
ることがあり、その病態モデル動物として利用すること
ができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタン
パク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの
疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。ま
た、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物
は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有するこ
とから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治
療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the non-human mammal stably retains the DNA by mating. I can do it. Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess. The non-human mammal having the normal DNA of the present invention, in which the normal DNA of the present invention is highly expressed, promotes the function of the endogenous normal DNA, and eventually causes hyperactivity of the protein of the present invention. It may develop and can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible. In addition, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for screening tests for therapeutic drugs for diseases related to the protein of the present invention. is there.
【００６２】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保
持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とす
る外来性ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科と
して用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコン
ストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製す
ることができる。受精卵細胞段階における本発明の異常
ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞
の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作
出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在す
ることは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚
芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有す
る。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴー
ト動物を取得し、この雌雄の動物を交配することにより
すべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代するこ
とができる。本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内
在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に
本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることが
あり、その病態モデル動物として利用することができ
る。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本
発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解
明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能
である。また、具体的な利用可能性としては、本発明の
異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不
活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正
常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を
解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡ
を転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質
の増加症状を有することから、本発明のタンパク質の機
能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験に
も利用可能である。On the other hand, the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably maintained by mating. Can be done. Further, the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of this type of animal that has inherited the DNA has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all offspring have the DNA. The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of the endogenous normal DNA, and finally, a functionally inactive form of the protein of the present invention. It may become refractory and can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease. Further, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can inhibit the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. A model to elucidate. In addition, the foreign abnormal DNA of the present invention
Since the transferred mammal has an increased symptom of the free protein of the present invention, it can be used for a therapeutic drug screening test for inactive refractory function of the protein of the present invention.
【００６３】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動
物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ転移哺乳動物の組織中のＤＮＡもしく
はＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現さ
れたタンパク質組織を分析することによる、本発明のタ
ンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパ
ク質との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。 さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパ
ク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、ま
た、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器
におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療
方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究
および治療に貢献することができる。また、本発明のＤ
ＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシ
ンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転
移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を
行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質
産生細胞の特定化、分化あるいは増殖との関連性、また
はそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異
常を調べることなどができ、本発明のタンパク質および
その作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、
本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質
の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関
連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査
法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療
薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。ま
た、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮ
Ａ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連す
る疾患の遺伝子治療法を検討、開発することが可能であ
る。Other possible uses of the above two DNA-transferred animals of the present invention include, for example, use as a cell source for tissue culture, and DNA or RNA in tissues of the DNA-transferred mammal of the present invention. Analysis of the relationship with proteins specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or by analyzing protein tissues expressed by DNA. The cells are cultured by tissue culture techniques and used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture, to screen for drugs that enhance the function of cells by using the cells described above, and to mutate the present invention. Isolation and purification of the protein and production of its antibody are considered. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. A more detailed pathological finding in each organ of a related disease model can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the study and treatment of a secondary disease caused by the disease. The D of the present invention
After removing each organ from the NA-transferred animal and cutting it into small pieces, it is possible to obtain released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells with a protease such as trypsin. Furthermore, it is possible to examine the specificity of the protein-producing cell of the present invention, its relation to differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and to investigate their abnormalities. It is an effective research material. further,
In order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including the inactive refractory type of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, the above-described test method and quantification method, etc. Can be used to provide an effective and rapid method for screening for a therapeutic drug for the disease. The DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DN of the present invention
Using the A expression vector, it is possible to examine and develop a gene therapy method for a disease associated with the protein of the present invention.
【００６４】（７）ノックアウト動物の作製 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（i
i）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活
性化された第（ｉ）項記載の胚幹細胞、（iii）ネオマ
イシン耐性である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、（iv）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ）項記載の胚幹
細胞、（ｖ）ゲッ歯動物がマウスである第（iv）項記載
の胚幹細胞、（vi）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（vii）該ＤＮＡがレ
ポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポ
ーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの
制御下で発現しうる第（vi）項記載のヒト哺乳動物、
（viii）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi）項
記載のヒト哺乳動物、（ix）ゲッ歯動物がマウスである
第（viii）項記載のヒト哺乳動物、および（ｘ）第（vi
i）項記載の非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、
レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本
発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻
害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。(7) Preparation of Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention. That is, the present invention relates to (i) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated;
i) The DNA is a reporter gene (eg, β from E. coli)
-(Galactosidase gene), (iii) the embryonic stem cell according to (i), which is resistant to neomycin, and (iv) the non-human mammal is inactivated. (V) embryonic stem cells according to (iv), wherein the rodent is a mouse; and (vi) expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated. Deficient non-human mammal, (vii) the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention. A human mammal according to item (vi),
(Viii) the human mammal according to (vi), wherein the non-human mammal is a rodent, (ix) the human mammal according to (viii), wherein the rodent is a mouse, and (x) (Vi
i) administering a test compound to the non-human mammal according to the above,
A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention, which comprises detecting the expression of a reporter gene, is provided.
【００６５】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの
発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしてい
る本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させること
により、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能
を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称す
ることがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ
細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前
記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手
法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡ
を挿入または置換させることによって行なうことができ
る。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠
をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を
破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製
すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能
を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成で
きなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するよ
うに構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ター
ゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換
え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞
について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配
列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析
あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とタ
ーゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ
以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ
法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別
することにより得ることができる。A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is defined as a DNA obtained by artificially mutating the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the expression ability of the DNA. Alternatively, the DNA substantially does not have the ability to express the protein of the present invention by substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). Embryonic stem cells of non-human mammals (hereinafter sometimes referred to as ES)
(Abbreviated as cell). As the non-human mammal, the same one as described above is used. As a method for artificially mutating the DNA of the present invention, for example, deletion of a part or all of the DNA sequence by genetic engineering techniques,
Can be inserted or substituted. The knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations. Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A DNA sequence (eg, polyA) that disrupts the function of exons by inserting a reporter gene or the like represented by a transferase gene, or terminates transcription of the gene in an intron between exons.
An additional signal (eg, an additional signal) is inserted into the DNA sequence (hereinafter abbreviated as a targeting vector) having a DNA sequence constructed so that complete mRNA cannot be synthesized, resulting in the disruption of the gene. The resulting ES cells were used for Southern hybridization analysis using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe or for preparing a DNA sequence on a targeting vector and a targeting vector. DNA of the present invention
PCR using DNA sequence of the neighboring region other than
It can be obtained by analyzing by the method and selecting the knockout ES cells of the present invention.
【００６６】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させるために用いられる元のＥＳ細胞として
は、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いて
もよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく
樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場
合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されて
いるが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これ
に代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細
胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウ
スやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との
交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６と
ＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好
に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、
卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞
は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７
ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用
い得る。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精
後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞
期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率
よく多数の初期胚を取得することができる。また、雌雄
いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞
の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。ま
た、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早
く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄
の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体
上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その
１例として挙げることができる。この方法を使用すれ
ば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要
していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約
５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一
次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ
り、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初
期の手間は大幅に削減できる。The DN of the present invention can be prepared by the homologous recombination method or the like.
As the original ES cells used to inactivate A, for example, those already established as described above may be used, or newly established cells according to the known method of Evans and Kaufma may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 line ES cells are generally used. However, since the immunological background is not clear, a pure line instead of this is used as an immunological genetic background. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which C57BL / 6 is apparent, for example, C57BL / 6 mice or BDF1 mice in which the number of eggs collected by C57BL / 6 has been improved by hybridization with DBA / 2 (C57BL / 6 and DBA / 2 Those established using F1) can also be used favorably. BDF1 mice have a high number of eggs collected, and
In addition to the advantage that the eggs are robust, they have C57BL / 6 mice as their background, so that when the ES cells obtained using the cells are used to produce a disease model mouse, they can be cross-crossed with the C57BL / 6 mice. Genetic background C57
It can be used advantageously in that it can be replaced with a BL / 6 mouse. In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. In addition, a large number of blastocysts can be obtained efficiently by collecting 8-cell stage embryos and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained. Either male or female ES cells may be used, but generally male ES cells are more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor. As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned. By using this method, the number of ES cells of about 1 colony (about 50 cells) is sufficient, whereas the conventional method required about 10 6 cells for karyotype analysis. The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be greatly reduced.
【００６７】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養
器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５
％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養
するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシ
ン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％ト
リプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、
新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが
とられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なう
が、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が
見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望ま
れる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るま
で単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊
培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々
のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J.
Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292
巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第7
8巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャーナ
ル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメン
タル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発
明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現
不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知
方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較するこ
とにより、正常動物と区別することが可能である。該非
ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられ
る。The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations or the like at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the cells can be knocked out of normal cells (for example, chromosome in mice). Number is 2n
= Cells). The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast, in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5%) in the presence of LIF (1-10000 U / ml).
% Oxygen, 5% carbon dioxide gas, 90% air) at about 37 ° C., and at the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.5%). 1-5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA) treatment to form a single cell,
A method of seeding on newly prepared feeder cells is used. Such passage is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells. ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscles, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ
Evans and MH Kaufman, Nature 292
Vol. 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) No. 7
8, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985], obtained by differentiating the ES cells of the present invention. The cells deficient in expressing the DNA of the present invention are useful in in vitro cell biological studies of the protein of the present invention. DNA of the present invention
An expression-defective non-human mammal can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
【００６８】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be prepared, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells,
By knocking out the DNA of the present invention, the DNA sequence in which NA has been inactivated is replaced with the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. it can. A cell in which the DNA of the present invention has been knocked out is a DNA sequence of the present invention derived from the mouse used in the targeting vector, the DNA sequence of the DNA of the present invention or a DNA sequence of the targeting vector, or a DNA sequence on or near the DNA of the present invention. The determination can be made by analysis by a PCR method using the DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of a non-human mammalian stem cell. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. D of the present invention added
It can be obtained by selecting individuals composed of cells having NA loci, for example, by judging coat color. The individual thus obtained is usually an individual heterozygously deficient in expression of the protein of the present invention, mated with an individual deficient in heteroexpression of the protein of the present invention, and homozygously expressing the protein of the present invention from their offspring. A failed individual can be obtained. When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method,
Compared to these transgenic non-human mammals,
It can be obtained by selecting a DNA locus of the present invention having a mutation by homologous recombination.
【００６９】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のタン
パク質発現不全マウスは、本発明のタンパク質により誘
導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタ
ンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデ
ルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法
の検討に有用である。In the individual knocked out of the DNA of the present invention in this manner, it is necessary to confirm that the DNA of the animal obtained by the crossing is also knocked out, and to carry out rearing in an ordinary rearing environment. Can be. further,
The germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal was compared to a normal animal 1,
It can be obtained efficiently by breeding in a state where a plurality of homozygotes are formed. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged. The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention. Further, since the mouse deficient in expression of the protein of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it can be a model for a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
【００７０】（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、前記した本
発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、肥
満、視力障害、聴覚障害、網膜退化、糖尿病、動脈硬化
症など）に対する治療・予防効果、体重調整効果または
食欲調整効果などを有する化合物のスクリーニングに用
いることができる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該非
ヒト哺動物の変化を観察・測定することを特徴とする、
本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対す
る治療・予防効果、体重調整効果または食欲調整効果な
どを有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を
提供する。該スクリーニング方法において用いられる本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と
同様のものが挙げられる。試験化合物としては、例え
ば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化
合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織
抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化
合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、
該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標と
して試験化合物の治療・予防効果を試験することができ
る。試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例
えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の
症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択するこ
とができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、
試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することがで
きる。例えば、糖尿病に対して治療・予防効果を有する
化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現
不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の体
重変化などを経時的に測定する。該スクリーニング方法
において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試
験動物の体重が約１０％以上、好ましくは約３０％以
上、より好ましくは約５０％以上減少した場合、該試験
化合物を肥満に対して治療・予防効果を有する化合物と
して選択することができる。(8a) Screening method for compounds having therapeutic / preventive effects on diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is the aforementioned DNA of the present invention Screening for compounds that have therapeutic and / or preventive effects, weight adjustment effects, or appetite adjustment effects on diseases caused by deficiency or damage of the body (eg, obesity, visual impairment, hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, arteriosclerosis, etc.) Can be used. That is, the present invention relates to the DN of the present invention.
A test compound is administered to a non-human mammal deficient in A expression, and a change in the non-human mammal is observed and measured,
The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect, a weight adjusting effect, an appetite adjusting effect, etc. for a disease caused by DNA deficiency or damage or the like. Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above. Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention is treated with a test compound, and compared with an untreated control animal,
The therapeutic / preventive effect of the test compound can be tested using changes in various organs, tissues, disease symptoms and the like of the animal as indices. As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. In addition, the dose of the test compound, the administration method,
It can be appropriately selected according to the properties of the test compound and the like. For example, when screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diabetes, a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, and changes in body weight and the like of the animal are measured over time. In the screening method, when the test compound is administered to the test animal, if the weight of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound becomes obese. On the other hand, it can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect.
【００７１】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物
であり、本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによっ
て引き起こされる疾患、例えば、肥満、視力障害、聴覚
障害、網膜退化、糖尿病、動脈硬化症などの疾患に対す
る治療・予防効果、体重調整効果または食欲調整効果な
どを有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・
予防剤、体重調整剤または食欲調整剤などの医薬として
使用することができる。さらに、上記スクリーニングで
得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いるこ
とができる。該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩
（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ
生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩
としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭
化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、
メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが
用いられる。該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する治療・予防剤は、前記した本発明
のタンパク質等を含有する医薬と同様にして製造するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、肥満治療の目的で該化合物を経口投与する場合、
一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日
につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回
投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、
例えば、肥満治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常
成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該
化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与する
ことができる。The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by deficiency or damage of the protein or the like of the present invention, for example, obesity, visual impairment, It has a therapeutic / preventive effect for diseases such as hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, and arteriosclerosis, a weight adjusting effect or an appetite adjusting effect, etc.
It can be used as a medicament such as a prophylactic agent, a weight adjusting agent or an appetite adjusting agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner. The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and salts (eg, alkali metals). And especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid,
For example, salts with methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid) are used. A therapeutic or prophylactic agent containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention. The dose of the compound or a salt thereof varies depending on a target disease, an administration subject, an administration route, and the like.For example, when the compound is orally administered for the purpose of treating obesity,
Generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
Administer. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
For example, when the compound is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection for the treatment of obesity, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 30 mg per day.
About 1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg
It is convenient to administer the degree by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
【００７２】（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニン
グ方法 本発明は、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化された本発明のＤＮＡ発現不全非
ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝
子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに
対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物
またはその塩のスクリーニング方法を提供する。試験化
合物としては、前記と同様のものが挙げられる。レポー
ター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で不活性化された本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター
遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下
に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の
発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を
検出することができる。(8b) Method for Screening for a Compound That Promotes or Inhibits the Activity of a Promoter for the DNA of the Present Invention The present invention provides a method for deficient expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention has been inactivated by introducing a reporter gene. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal and detecting the expression of a reporter gene. Examples of the test compound include the same compounds as described above. As the reporter gene, the same one as described above is used.
-The galactosidase gene (lacZ) is preferred.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by the reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, expression of the substance encoded by the reporter gene By tracing, the activity of the promoter can be detected.
【００７３】例えば、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部が大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子（ｌａｃＺ）で不活性化されている場合、本来、
本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパ
ク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従っ
て、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−
ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色するこ
とにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内にお
ける発現状態を観察することができる。具体的には、本
発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグル
タルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコリン酸緩衝生
理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液
で、室温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応
させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で
洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停
止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌ
ａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is inactivated by β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli,
In tissues expressing the protein of the present invention, β-galactosidase is expressed instead of the protein of the present invention. Thus, for example, β-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal)
By staining with a reagent serving as a substrate for galactosidase, the expression state of the protein of the present invention in an animal body can be easily observed. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or at 7 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour in the vicinity, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the coloration may be observed. Also, according to the usual method,
mRNA encoding acZ may be detected.
【００７４】上記スクリーニング方法を用いて得られる
化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進または阻害する化合物である。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）または塩（例、アルカリ金属）などと
の塩が好ましくは、とりわけ生理学的に許容される酸付
加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーター活性を促進する化合物またはそ
の塩は、本発明のタンパク質の発現を活性化または増強
し、該タンパク質の作用または発現を活性化または増強
することができるので、例えば、肥満、視力障害、聴覚
障害、網膜退化、糖尿病、動脈硬化症などの疾病に対す
る安全で低毒性な治療・予防剤、体重調整剤、食欲調整
剤などの医薬として有用である。一方、本発明のＤＮＡ
に対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその
塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク
質の作用を減少させることができるので、例えば、本発
明のタンパク質の過剰発現に起因する疾病に対する安全
で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導
される化合物も同様に用いることができる。The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention. The compound obtained by the screening method may form a salt,
Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg,
Salts with inorganic acids, organic acids) or salts (eg, alkali metals) are preferred, and especially physiologically acceptable acid addition salts. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid),
Alternatively, organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid,
Fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid,
For example, salts with malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid) are used. The DN of the present invention
A compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of A can activate or enhance the expression of the protein of the present invention and activate or enhance the action or expression of the protein, for example, obesity, visual impairment, It is useful as a medicament such as a safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agent, a weight adjusting agent, and an appetite adjusting agent for diseases such as hearing impairment, retinal degeneration, diabetes, and arteriosclerosis. On the other hand, the DNA of the present invention
A compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and reduce the action of the protein. It is useful as a medicament such as a low-toxic therapeutic or prophylactic agent.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
【００７５】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパ
ク質等を含有する医薬と同様にして製造し、ヒトまたは
哺乳動物に投与することができる。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することがで
きる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投
与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、
肥満治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成
人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化
合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。
非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投
与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥
満治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活
性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ
として）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のタンパク質の過剰発現に起因す
る疾病の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ー活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に
成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該
化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜
５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与す
る。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量
は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害す
る化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に
投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０
ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好
ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与
するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当
たりに換算した量を投与することができる。A drug containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the drug containing the protein of the present invention and administered to a human or mammal. Since the thus obtained preparation is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). . The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
When orally administering a compound of the present invention that promotes the promoter activity to DNA for the purpose of treating obesity, generally, in adults (with a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 100 mg per day. 1.0-5
0 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, for the purpose of treating obesity, a compound that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention may be used as an injection. Normal adult (60kg
)), The compound is administered at about 0.5 mg / day.
It is convenient to administer about 01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. For other animals,
The amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, for example, when a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention is orally administered for the purpose of treating a disease caused by overexpression of the protein of the present invention, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), it takes one day. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to
The dose is 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that inhibits the promoter activity against DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( 60 mg), the compound may be administered in an amount of about 0.01 to 30 per day.
It is convenient to administer about mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
【００７６】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウムIn the present specification and drawings, when bases, amino acids and the like are represented by abbreviations, IUPAC-IUB
Abbreviations based on Commision on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field,
An example is given below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate
【００７７】 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile: isoleucine Ser: serine Thr: threonine Cys: cysteine Met: methionine Glu: glutamic acid Asp: aspartic acid Lysine arginine arginine : Tyrosine Trp: Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine pGlu: Pyroglutamic acid Me: Methyl group Et: Ethyl group Bu: Butyl group Ph: Phenyl group TC: Thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
【００７８】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl2Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドThe substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols. Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyl Oxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitrophenol Trt: trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBT: 3,4-dihydro-3-hydroxy -4-oxo-1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
【００７９】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のマウス７．５日胚由来タンパ
ク質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のマウス７．５日胚由来タンパク質を
コードするＤＮＡの塩基配列を示す。後述の実施例１で
得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia
coli)ＪＭ１０９／ｐＴＵＢＫ２は、平成１０年７月３
０日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４２とし
て、平成１０年７月２１日から財団法人・醗酵研究所
（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６１９１として寄託さ
れている。The sequence numbers in the sequence listing in the present specification show the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of the mouse 7.5-day embryo-derived protein of the present invention. [SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence of the DNA encoding the mouse 7.5-day embryo-derived protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The transformant Escherichia coli (Escherichia coli) obtained in Example 1 described later is used.
coli) JM109 / pTUBK2 was obtained on July 3, 1998.
The deposit number FERM BP-6442 from the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) from July 0, and the deposit number IFO 16191 from the Fermentation Research Institute (IFO) from July 21, 1998. Has been deposited.
【００８０】[0080]
【実施例】以下に、参考例および実施例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定され
るものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）に記載されている方法に従った。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto. Genetic manipulation using Escherichia coli is based on molecular cloning (Molecular clonin).
g) was followed.
【００８１】[0081]
【実施例１】本発明のマウス７．５日胚由来のタンパク
質をコードするｃＤＮＡのクローニング （１）Ｐ１９テラトカルシノーマ細胞が神経細胞へ分化
する過程で発現誘導されるｍＲＮＡのサブトラクション
による濃縮 Ｐ１９細胞は１０％ウシ胎児血清（fotal bovinc ser
um；ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地
（Dulbecco'ｓ modified Eagle's medium；ＤＭＥ
Ｍ）で培養し、対数増殖期にあるＰ１９細胞を未分化な
前駆細胞のサンプルとした。一方、Ｐ１９細胞を、５×
１０2細胞／ｍｌの細胞密度で上記培地にレチノイン酸
（all-trnas retinoic acid、シグマ社製）を１μＭ
の濃度で添加した培地を用い、ペトリ培養皿にて２４時
間および４８時間浮遊培養し、集合体形成を行った細胞
を、神経へ分化する過程の細胞サンプルとした。両サン
プルとも、ファルマシア社製のｍＲＮＡ Purification
Kitを用いて、poly（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。これ
らのpoly（Ａ）＋ＲＮＡそれぞれ５μｇを出発材料とし
て、公知ノ方法（Ishino et.,１９９５）によりｃＤＮ
Ａ合成およびサブトラクションを行い、神経細胞分化過
程に特異的に発現しているｃＤＮＡ断片を収集した。得
られた神経分化過程に特異的に発現しているｃＤＮＡ断
片を、両端に附加してあるアダブター配列を元に合成し
たプライマを用いて、ＰＣＲにより32Ｐで標識した。こ
の標識されたｃＤＮＡ断片をプロープトとして用い、マ
ウス胚７．５日胚より作成したｃＤＮＡライブラリー
（λＺＡＰ II phage Vector）をプラーグハイブリ
ダイゼーションでスクリーニングすることによって、ｃ
ＤＮＡ断片を得た。このマウス胚ｃＤＮＡライブラリー
は、ストラータジン社製のｃＤＮＡ合成キットを用いて
作成したものである。クローニングされたｃＤＮＡ断片
のＤＮＡ塩基配列を解読し、明らかとなった塩基配列を
元に公のデータベースであるGenebank データベースを
用いてblastＮによるホモロジー検索を行った。その結
果、選られたクローンK-tubbyは新規なＤＮＡ塩基配列
を有していた。Example 1 Cloning of cDNA Encoding a Mouse 7.5-Day Embryo-Derived Protein of the Present Invention (1) Enrichment by Subtraction of mRNA Induced by Expression during P19 Teratocarcinoma Cell Differentiation into Nerve Cells P19 Cells Is 10% fetal bovine serum (fotal bovinc ser)
ul; FBS) added to the Dulbecco's modified Eagle's medium; DME
M), and P19 cells in the logarithmic growth phase were used as a sample of undifferentiated progenitor cells. On the other hand, P19 cells were
1 μM retinoic acid (all-trnas retinoic acid, Sigma) was added to the above medium at a cell density of 10 2 cells / ml.
Using a medium added at a concentration of 1%, the cells were subjected to suspension culture in a Petri culture dish for 24 hours and 48 hours, and the cells that had formed aggregates were used as cell samples in the process of differentiating into nerves. For both samples, Pharmacia mRNA Purification
Poly (A) + RNA was purified using the Kit. Using 5 μg of each of these poly (A) + RNAs as starting materials, cDN was obtained by a known method (Ishino et al., 1995).
A synthesis and subtraction were performed to collect cDNA fragments specifically expressed in the neural cell differentiation process. The obtained cDNA fragment specifically expressed in the neural differentiation process was labeled with 32 P by PCR using a primer synthesized based on an adapter sequence added to both ends. Using the labeled cDNA fragment as a prompt, a cDNA library (λZAP II phage Vector) prepared from a mouse embryo 7.5-day embryo was screened by plug hybridization to obtain c.
A DNA fragment was obtained. This mouse embryo cDNA library was prepared using a cDNA synthesis kit manufactured by Stratadine. The DNA base sequence of the cloned cDNA fragment was deciphered, and based on the revealed base sequence, homology search using blastN was performed using a public database, Genebank database. As a result, the selected clone K-tubby had a novel DNA base sequence.
【００８２】（２）K-tubbyｃＤＮＡ断片の完全長ｃＤ
ＮＡの単離 K-tubbyｃＤＮＡの塩基配列の全コード領域を含む完全
長ｃＤＮＡは、上記のスクリーニングで選られたｃＤＮ
Ａ断片をプローブとして用い、再びマウス７．５日胚ｃ
ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーショ
ンでスクリーニングすることによって得られた。得られ
た陽性ファージの１つを、ストラータジーン社の方法に
従い、ファージミッド（pＢluescript ＳＫ）（−）ベ
クター）に変換し、その塩基配列を決定した。K-tubby
の全長ｃＤＮＡは３３２５ｂｐで、配列番号：１で表わ
される４６０個のアミノ酸からなるポリペプチドをコー
ドしていた〔図１〜図３〕。この全長ｃＤＮＡをプラス
ミド（pＢluescript ＳＫ）（−）（ストラータジーン
社製）のＥcoＲＩ／ＸhoＩサイトに含んだプラスミドｐ
ＴＵＢＫ２を得た。このｐＴＵＢＫ２を大腸菌（Escher
ichia coli）ＪＭ１０９に導入して、形質転換体：大
腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＴＵＢＫ２
を得た。(2) Full-length cD of K-tubby cDNA fragment
Isolation of NA A full-length cDNA containing the entire coding region of the nucleotide sequence of K-tubby cDNA was obtained from the cDN selected in the above screening.
Using the A fragment as a probe, mouse 7.5 day embryo c
Obtained by screening plaque hybridization from a DNA library. One of the obtained positive phages was converted into a phage mid (pBluescript SK) (-) vector according to the method of Stratagene, and its nucleotide sequence was determined. K-tubby
Was 3,325 bp and encoded a polypeptide consisting of 460 amino acids represented by SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 to 3). Plasmid p containing this full-length cDNA in the EcoRI / XhoI site of plasmid (pBluescript SK) (-) (Stratagene)
TUBK2 was obtained. This pTUBK2 was transformed into Escherichia coli (Escher
(Escherichia coli) JM109 / pTUBK2
I got
【００８３】[0083]
【発明の効果】本発明のタンパク質等およびＤＮＡは、
本発明のタンパク質等の欠損・損傷などに起因する疾病
の治療・予防剤などの医薬として使用することができ
る。また、本発明のタンパク質等は、本発明のタンパク
質等の作用または発現を活性化または増強する化合物ま
たはその塩のスクリーニングのための試薬として有用で
ある。さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質等
を特異的に認識することができるので、被検液中の本発
明のタンパク質等の定量などに使用することができる。The protein and the like and the DNA of the present invention are
It can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing a disease caused by deficiency or damage of the protein or the like of the present invention. Further, the protein or the like of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that activates or enhances the action or expression of the protein or the like of the present invention. Further, since the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution.
【００８４】[0084]
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４６０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Ala Ala Arg Cys Ala Pro Gly Pro Arg Gly Asp Ser Ala Phe 1 5 10 15 Asp Asp Glu Thr Leu Arg Leu Arg Gln Leu Lys Leu Asp Asn Gln Arg 20 25 30 Ala Leu Leu Glu Lys Lys Gln Arg Lys Lys Arg Leu Glu Pro Leu Met 35 40 45 Val Gln Pro Asn Pro Glu Ala Arg Leu Arg Arg Leu Lys Pro Arg Gly 50 55 60 Ser Glu Glu His Thr Pro Leu Val Asp Pro Gln Met Pro Arg Ser Asp 65 70 75 80 Val Ile Leu His Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ala Phe Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Ala Gln Asp Leu Glu Ser Lys Pro Gln Val Leu Ser Val Gly Ser Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ala Asp Gly Glu Ser Pro Glu 115 120 125 Glu Thr Ala Pro Lys Pro Asp Leu Gln Glu Ile Leu Gln Lys His Gly 130 135 140 Ile Leu Ser Ser Val Asn Tyr Asp Glu Glu Pro Asp Lys Glu Glu Asp 145 150 155 160 Glu Gly Gly Asn Leu Ser Ser Pro Ser Ala Arg Ser Glu Glu Ser Ala 165 170 175 Ala Ala Ser Gln Lys Ala Ala Ser Glu Thr Gly Ala Ser Gly Val Thr 180 185 190 Ala Gln Gln Gly Asp Ala Gln Leu Gly Glu Val Glu Asn Leu Glu Asp 195 200 205 Phe Ala Tyr Ser Pro Ala Pro Arg Gly Val Thr Val Lys Cys Lys Val 210 215 220 Thr Arg Asp Lys Lys Gly Met Asp Arg Gly Leu Phe Pro Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 Met His Leu Glu Arg Glu Glu Asn Arg Lys Ile Phe Leu Leu Ala Gly 245 250 255 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Lys Thr Ser Asn Tyr Leu Val Ser Thr Asp 260 265 270 Pro Thr Asp Leu Ser Arg Glu Gly Glu Ser Tyr Ile Gly Lys Leu Arg 275 280 285 Ser Asn Leu Met Gly Thr Lys Phe Thr Val Tyr Asp His Gly Val Asn 290 295 300 Pro Val Lys Ala Gln Gly Leu Val Glu Lys Ala His Thr Arg Gln Glu 305 310 315 320 Leu Ala Ala Ile Cys Tyr Glu Thr Asn Val Leu Gly Phe Lys Gly Pro 325 330 335 Arg Lys Met Ser Val Ile Ile Pro Gly Met Asn Met Asn His Glu Arg 340 345 350 Ile Pro Phe Arg Pro Arg Asn Glu His Glu Ser Leu Leu Ser Lys Trp 355 360 365 Gln Asn Lys Ser Met Glu Asn Leu Ile Glu Leu His Asn Lys Ala Pro 370 375 380 Val Trp Asn Asp Asp Thr Gln Ser Tyr Val Leu Asn Phe His Gly Arg 385 390 395 400 Val Thr Gln Ala Ser Val Lys Asn Phe Gln Ile Val His Gly Asn Asp 405 410 415 Pro Asp Tyr Ile Val Met Gln Phe Gly Arg Val Ala Asp Asp Val Phe 420 425 430 Thr Leu Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Cys Ala Leu Gln Ala Phe Ala Ile 435 440 445 Gly Leu Ser Ser Phe Asp Ser Lys Leu Ala Cys Glu 450 455 460[Sequence list] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 460 Sequence type: amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein sequence Met Glu Ala Ala Arg Cys Ala Pro Gly Pro Arg Gly Asp Ser Ala Phe 1 5 10 15 Asp Asp Glu Thr Leu Arg Leu Arg Gln Leu Lys Leu Asp Asn Gln Arg 20 25 30 Ala Leu Leu Glu Lys Lys Gln Arg Lys Lys Arg Leu Glu Pro Leu Met 35 40 45 Val Gln Pro Asn Pro Glu Ala Arg Leu Arg Arg Leu Lys Pro Arg Gly 50 55 60 Ser Glu Glu His Thr Pro Leu Val Asp Pro Gln Met Pro Arg Ser Asp 65 70 75 80 Val Ile Leu His Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ala Phe Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Ala Gln Asp Leu Glu Ser Lys Pro Gln Val Leu Ser Val Gly Ser Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ala Asp Gly Glu Ser Pro Glu 115 120 125 Glu Thr Ala Pro Lys Pro Asp Leu Gln Glu Ile Leu Gln Lys His Gly 130 135 140 Ile Leu Ser Ser Val Asn Tyr Asp Glu Glu Pro Asp Lys Glu Glu Asp 145 150 155 160 Glu Gly Gly Asn Leu Ser Ser Pro Ser Ala Arg Ser Glu Glu Ser Ala 165 170 175 Ala Ala Ser Gl n Lys Ala Ala Ser Glu Thr Gly Ala Ser Gly Val Thr 180 185 190 Ala Gln Gln Gly Asp Ala Gln Leu Gly Glu Val Glu Asn Leu Glu Asp 195 200 205 Phe Ala Tyr Ser Pro Ala Pro Arg Gly Val Thr Val Lys Cys Lys Val 210 215 220 Thr Arg Asp Lys Lys Gly Met Asp Arg Gly Leu Phe Pro Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 Met His Leu Glu Arg Glu Glu Asn Arg Lys Ile Phe Leu Leu Ala Gly 245 250 255 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Lys Thr Ser Asn Tyr Leu Val Ser Thr Asp 260 265 270 Pro Thr Asp Leu Ser Arg Glu Gly Glu Ser Tyr Ile Gly Lys Leu Arg 275 280 285 Ser Asn Leu Met Gly Thr Lys Phe Thr Val Tyr Asp His Gly Val Asn 290 295 300 Pro Val Lys Ala Gln Gly Leu Val Glu Lys Ala His Thr Arg Gln Glu 305 310 315 320 Leu Ala Ala Ile Cys Tyr Glu Thr Asn Val Leu Gly Phe Lys Gly Pro 325 330 335 Arg Lys Met Ser Val Ile Ile Pro Gly Met Asn Met Asn His Glu Arg 340 345 350 Ile Pro Phe Arg Pro Arg Asn Glu His Glu Ser Leu Leu Ser Lys Trp 355 360 365 Gln Asn Lys Ser Met Glu Asn Leu Ile Glu Leu His Asn Lys Ala Pro 370 375 380 Val Trp Asn Asp As p Thr Gln Ser Tyr Val Leu Asn Phe His Gly Arg 385 390 395 400 Val Thr Gln Ala Ser Val Lys Asn Phe Gln Ile Val His Gly Asn Asp 405 410 415 Pro Asp Tyr Ile Val Met Gln Phe Gly Arg Val Ala Asp Asp Val Phe 420 425 430 Thr Leu Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Cys Ala Leu Gln Ala Phe Ala Ile 435 440 445 Gly Leu Ser Ser Phe Asp Ser Lys Leu Ala Cys Glu 450 455 460
【００８５】 配列番号：２ 配列の長さ：１３８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧ ＣＧＣＧＣＴＧＣＧＣ ＡＣＣＣＧＧＡＣＣＣ ＣＧＣ
ＧＧＧＧＡＣＡ ＧＴＧＣＣＴＴＴＧＡ ＣＧＡＴＧＡＧＡＣＣ ６０ ＣＴＧＡＧＧＣＴＴＣ ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＡ ＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴ ＣＡＧ
ＡＧＧＧＣＡＣ ＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡ ＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡ １２０ ＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣ ＴＴＧＡＧＣＣＡＣＴ ＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧ ＣＣＡ
ＡＡＣＣＣＡＧ ＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴ ＧＣＧＡＡＧＧＴＴＡ １８０ ＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧ ＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡ ＧＣＡＣＡＣＧＣＣＴ ＣＴＧ
ＧＴＧＧＡＣＣ ＣＴＣＡＧＡＴＧＣＣ ＴＣＧＣＡＧＣＧＡＣ ２４０ ＧＴＣＡＴＣＣＴＡＣ ＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡ ＣＧＧＴＣＣＡＧＣＴ ＧＣＴ
ＴＴＣＣＴＴＡ ＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣ ＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧ ３００ ＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣ ＣＴＣＡＧＧＴＴＣＴ ＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣ ＴＣＣ
ＣＣＴＧＣＣＣ ＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧ ＣＡＣＧＧＡＡＧＧＧ ３６０ ＡＧＴＧＣＡＧＡＴＧ ＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣ ＣＧＡＧＧＡＧＡＣＡ ＧＣＣ
ＣＣＣＡＡＧＣ ＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡ ＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣ ４２０ ＣＡＡＡＡＡＣＡＣＧ ＧＣＡＴＣＴＴＧＡＧ ＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣ ＴＡＴ
ＧＡＣＧＡＧＧ ＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡ ＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴ ４８０ ＧＡＧＧＧＧＧＧＡＡ ＡＣＣＴＣＡＧＣＴＣ ＣＣＣＧＴＣＧＧＣＴ ＣＧＣ
ＴＣＡＧＡＧＧ ＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣ ＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧ ５４０ ＡＡＡＧＣＡＧＣＣＴ ＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ ＡＧＣＴＴＣＣＧＧＴ ＧＴＧ
ＡＣＡＧＣＣＣ ＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡ ＣＧＣＣＣＡＧＣＴＴ ６００ ＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧ ＡＧＡＡＴＴＴＡＧＡ ＧＧＡＣＴＴＴＧＣＧ ＴＡＴ
ＡＧＣＣＣＴＧ ＣＣＣＣＴＣＧＧＧＧ ＴＧＴＣＡＣＧＧＴＧ ６６０ ＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧ ＴＡＡＣＣＡＧＧＧＡ ＴＡＡＧＡＡＡＧＧＣ ＡＴＧ
ＧＡＣＣＧＴＧ ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣ ＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴ ７２０ ＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧ ＡＡＣＧＧＧＡＧＧＡ ＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧ ＡＴＡ
ＴＴＴＣＴＴＣ ＴＡＧＣＣＧＧＴＡＧ ＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡ ７８０ ＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡ ＣＧＴＣＣＡＡＣＴＡ ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣ ＡＣＡ
ＧＡＣＣＣＧＡ ＣＡＧＡＴＴＴＧＴＣ ＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧ ８４０ ＧＡＡＡＧＴＴＡＣＡ ＴＴＧＧＣＡＡＡＣＴ ＣＡＧＡＴＣＣＡＡＴ ＣＴＣ
ＡＴＧＧＧＧＡ ＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣ ＡＧＴＧＴＡＴＧＡＣ ９００ ＣＡＴＧＧＴＧＴＣＡ ＡＣＣＣＡＧＴＣＡＡ ＧＧＣＣＣＡＧＧＧＴ ＣＴＧ
ＧＴＧＧＡＧＡ ＡＧＧＣＣＣＡＣＡＣ ＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧ ９６０ ＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡ ＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡ ＡＡＣＡＡＡＴＧＴＣ ＣＴＣ
ＧＧＴＴＴＣＡ ＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧ ＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴ １０２０ ＧＴＧＡＴＣＡＴＣＣ ＣＧＧＧＧＡＴＧＡＡ ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴ ＧＡＧ
ＣＧＣＡＴＣＣ ＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣ ＡＣＧＡＡＡＴＧＡＡ １０８０ ＣＡＣＧＡＧＡＧＣＴ ＴＧＣＴＴＴＣＡＡＡ ＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣ ＡＡＡ
ＴＣＣＡＴＧＧ ＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴ ＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣ １１４０ ＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣ ＣＧＧＴＧＴＧＧＡＡ ＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣ ＣＡＧ
ＴＣＣＴＡＣＧ ＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴ ＴＣＡＣＧＧＣＡＧＡ １２００ ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＧ ＣＡＴＣＣＧＴＧＡＡ ＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧ ＡＴＣ
ＧＴＣＣＡＣＧ ＧＧＡＡＴＧＡＣＣＣ ＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣ １２６０ ＧＴＣＡＴＧＣＡＧＴ ＴＴＧＧＡＣＧＣＧＴ ＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣ ＧＴＧ
ＴＴＣＡＣＡＣ ＴＧＧＡＣＴＡＴＡＡ ＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧ １３２０ ＴＧＣＧＣＡＣＴＴＣ ＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣ ＣＡＴＣＧＧＧＣＴＧ ＴＣＣ
ＡＧＣＴＴＴＧ ＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴ ＧＧＣＧＴＧＴＧＡＡ １３８０SEQ ID NO: 2 Sequence length: 1380 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA sequence ATGGAGGCGG CGCGCTGCGC ACCCGGACCC CGC
GGGGACA GTGCCTTTGA CGATGAGACC 60 CTGAGGCTTC GGCAGCTGAA GCTGGACAAT CAG
AGGGCAC TGCTGGAGAA GAAGCAGAGA 120 AAGAAGCGCC TTGAGCCACT CATGGTACAG CCA
AACCCAG AAGCCAGGCCT GCGAAGGTTA 180 AAGCCACGAG GCAGTGGAGA GACACAGCCT CTG
GTGGACC CTCAGATGCC TCGCAGCGAC 240 GTCATCCTAC ACGGCATCGA CGGTCCAGCT GCT
TTCCTTA AGCCAGAGGC TCAGGATTTG 300 GAAAGCAAGC CTCAGGTTCT CTCTGTGGGC TCC
CCTGCCCC CAGAAGAAGG CACGGAAGGG 360 AGTGCAGATG GGGAAAGCCC CGAGGAGACA GCC
CCCAAGC CAGACCTTCA GGAGATTCTC 420 CAAAAAACACG GCATCTTGAG TAGGTGTGAAC TAT
GACGAGG AGCCTGACAA GGAGGAAGAT 480 GAGGGGGGAA ACCTCAGCTCCCCGTCGGGCT CGC
TCAGAG AGAGTGCTGC AGCCAGCCAG 540 AAAGCAGCCT CGGAGACAGG AGCTTCCGGT GTG
ACAGCCC AGCAGGGTGGA CGCCCAGCTT 600 GGAGAAGTGG AGAATTTAGA GGACTTTGCG TAT
AGCCCTG CCCCTCGGGG TGTCACGGTG 660 AAGTGTAAAAG TAACCAGGGGA TAAGAAAGGC ATG
GACCGTG GCCTCTTCCC CACCTACTAT 720 ATGCACCTGG AACGGGAGGA GAACCGCAAG ATA
TTTCTTC TAGCCGGTAG AAACGCGGAAA 780 AAGAGCAAAAA CGTCCAAACTA CCTGGTCTCC ACA
GACCCCGA CAGATTTGTC TCGTGAAGGG 840 GAAAGTTACA TTGGCAAACT CAGATCCAAT CTC
ATGGGGA CCAAGTTCAC AGTGTATGAC 900 CATGGTGTCA ACCCAGTCAA GGCCCAGGGT CTG
GTGGAGA AGGCCCACAC CCGCCAGGAG 960 CTGGCTGCTA TCTGTTATGA AACAAATGTC CTC
GGTTTCA AAGGTCCCAG GAAAATGTCT 1020 GTGATCATCC CGGGGATGAACATGAACCAT GAG
CGCATCC CTTTCAGGCC ACGAAATGAA 1080 CACGAGAGCT TGCTTTCAAA ATGGCAAAAC AAA
TCCATGG AGAACCTGAT CGAGCTGCAC 1140 AACAAGGCCCC CGGTGTGGAA TGACGACACC CAG
TCCTACCG TGCTGAACTT TCACGGCAGA 1200 GTCACCCAGG CATCCGTGAA AAAACTTCCAG ATC
GTCCACG GGAATGACC TGACTACCATC 1260 GTCATGCAGTT TTGGACGCGT GGCTGATGAC GTG
TTCACAC TGGACTATAA CTACCCCACTG 1320 TGCGCACTTC AAGCCTTTCGC CATCGGGCTG TCC
AGCTTTTG ACAGCAAGCT GGCGTGTGAA 1380
【００８６】[0086]
【図１】本発明のマウス７．５日胚由来タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列とそれにコードされるアミ
ノ酸配列を示す。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding the mouse 7.5-day embryo-derived protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby.
【図２】本発明のマウス７．５日胚由来タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列とそれにコードされるアミ
ノ酸配列を示す。図１の続きである。FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding the mouse 7.5-day embryo-derived protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby. It is a continuation of FIG.
【図３】本発明のマウス７．５日胚由来タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列とそれにコードされるアミ
ノ酸配列を示す。図２の続きである。FIG. 3 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the mouse 7.5-day embryo-derived protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby. It is a continuation of FIG.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＮ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｃ０８４ 48/00 ＡＣＮ Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/21 33/50 Ｔ 5/10 33/53 Ｄ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＬ Ｃ１２Ｑ 1/02 ＡＢＭ Ｇ０１Ｎ 33/15 ＡＢＸ 33/50 ＡＤＮ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA28 AA34 AA35 CB01 DA13 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR66 QR77 QR80 QS05 QS12 QS36 QX01 4B064 AG02 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA91X AA91Y AA92X AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 BA24 BC01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 AA17 BA01 BA22 BA44 CA53 DA39 ZA332 ZA342 ZA702 4C086 AA01 AA02 EA16 ZA33 ZA34 ZA70 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA76 DA86 EA20 EA50 FA72 FA74 GA23 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 38/00 ADN C12P 21/02 C 4C084 48/00 ACN C12Q 1/02 4C086 C07K 16/18 G01N 33 / 15 Z 4H045 C12N 1/21 33/50 T 5/10 33/53 D 15/09 ZNA C12P 21/08 C12P 21/02 A61K 37/02 ABL C12Q 1/02 ABM G01N 33/15 ABX 33/50 ADN 33 / 53 C12N 5/00 B // C12P 21/08 15/00 ZNAA (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) F term (reference) 2G045 AA25 AA28 AA34 AA35 CB01 DA13 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR66 QR77 QR80 QS05 QS12 QS36 QX01 4B064 AG02 AG27 CA02 CA10 CA19 CC 24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA91X AA91Y AA92X AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 BA24 BC01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 AA17 BA01 BA22 BA44 CA53 DA39 ZA332 ZA342 ZA702 4C086 AA01AA20 A16A34 A34 EA50 FA72 FA74 GA23
Claims (17)
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質またはその塩。1. A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof.
またはその塩。2. A partial peptide of the protein according to claim 1, or a salt thereof.
基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。3. A DNA containing a DNA having a base sequence encoding the protein according to claim 1.
それとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する塩基配列を有する請求項３記載のＤＮＡ。4. The DNA according to claim 3, which has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence hybridizable therewith under high stringency conditions.
ＤＮＡを含有するＤＮＡ。5. A DNA containing a DNA encoding the partial peptide according to claim 2.
クター。6. A recombinant vector containing the DNA according to claim 3.
形質転換体。A transformant carrying the recombinant vector according to claim 6.
項１記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする請求項１記載のタンパク質または
その塩の製造方法。8. A method for producing a protein or a salt thereof according to claim 1, wherein the transformant according to claim 7 is cultured, the protein according to claim 1 is produced, accumulated, and collected. .
含有してなる医薬。[9] a pharmaceutical comprising the protein or a salt thereof according to [1];
薬。[10] A pharmaceutical comprising the DNA according to [3].
治療剤である請求項９または１０記載の医薬。11. Prevention of obesity, visual impairment or hearing impairment.
The medicament according to claim 9 or 10, which is a therapeutic agent.
載のＤＮＡを含有してなる肥満、視力障害または聴力障
害の診断薬。(12) A diagnostic agent for obesity, visual impairment or hearing impairment comprising the DNA according to (3) or the DNA according to (5).
載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。13. An antibody against the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 2, or a salt thereof.
載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす
る請求項１記載のタンパク質またはその塩の作用または
発現を活性化もしくは増強する化合物またはその塩のス
クリーニング方法。14. A compound which activates or enhances the action or expression of the protein or salt thereof according to claim 1, wherein the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 2 or a salt thereof is used. A method for screening the salt.
載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる請求項１
記載のタンパク質またはその塩の作用または発現を活性
化もしくは増強する化合物またはその塩のスクリーニン
グ用キット。(15) A protein comprising the protein of (1), the partial peptide of (2) or a salt thereof.
A screening kit for a compound or a salt thereof that activates or enhances the action or expression of the protein or a salt thereof described above.
たは請求項１５記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、請求項１記載のタンパク質またはその塩の作
用または発現を活性化もしくは増強する化合物またはそ
の塩。16. A compound or salt thereof that activates or enhances the action or expression of the protein or salt thereof according to claim 1, which is obtained by using the screening method according to claim 14 or the screening kit according to claim 15. .
たは請求項１５記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる、請求項１記載のタンパク質またはその塩の作
用または発現を活性化もしくは増強する化合物またはそ
の塩を含有してなる、肥満、視力障害または聴力障害の
予防・治療剤。17. A compound or salt thereof which activates or enhances the action or expression of the protein or salt thereof according to claim 1, which is obtained by using the screening method according to claim 14 or the screening kit according to claim 15. An agent for preventing or treating obesity, visual impairment or hearing impairment, comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10227063A JP2000053700A (en) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | New protein and its dna |
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| JP10227063A JP2000053700A (en) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | New protein and its dna |
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| JP10227063A Withdrawn JP2000053700A (en) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | New protein and its dna |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000053700A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008291042A (en) * | 2008-07-28 | 2008-12-04 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Specific antibody against endothelin-2/vic, method for manufacturing the same, and use thereof |
-
1998
- 1998-08-11 JP JP10227063A patent/JP2000053700A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008291042A (en) * | 2008-07-28 | 2008-12-04 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Specific antibody against endothelin-2/vic, method for manufacturing the same, and use thereof |
| JP4635265B2 (en) * | 2008-07-28 | 2011-02-23 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Specific antibody against endothelin-2 / VIC, production method and use thereof |
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