JP2001299346A - Solid phase pcr method using immobilized primer - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリメラーゼ連鎖
反応を利用する核酸複製技術に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid replication technique utilizing a polymerase chain reaction.
【０００２】[0002]
【従来の技術】これまでのＤＮＡポリメラーゼによるＤ
ＮＡ合成の連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉ
ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下「ＰＣＲ」と呼ぶ）は、液
相において、複製増幅しようともくろむ１つの遺伝子の
核酸塩基配列に相補的な１組の合成オリゴヌクレオチド
より開始されるため、１反応容器において１種類の遺伝
子断片しか、複製増幅させることができなかった。その
ため、複数の遺伝子や複数の遺伝子領域を複製増幅させ
たい場合、もしくはそのＰＣＲ反応の成否を判定したい
場合、対応する数の反応液と反応容器を個別に準備する
必要があった。2. Description of the Related Art D by conventional DNA polymerase
Chain Reaction of NA Synthesis (Polymerase Chai)
n Reaction (hereinafter referred to as “PCR”) is initiated in the liquid phase from a set of synthetic oligonucleotides complementary to the nucleobase sequence of one gene that is intended to replicate and amplify. Was able to replicate and amplify. Therefore, when it is desired to replicate and amplify a plurality of genes or a plurality of gene regions, or to determine the success or failure of the PCR reaction, it is necessary to separately prepare a corresponding number of reaction solutions and reaction vessels.
【０００３】また、このＰＣＲ反応の原理とその増幅効
率の良さを利用して、ＰＣＲ反応により細胞の遺伝子産
物であるＲＮＡの微量濃度を比較する、もしくは測定す
ることも一般に行われている。この場合も１種類の遺伝
子に由来するＲＮＡ濃度を測定するために、１つの反応
液と反応容器を必要とした。そのため、多数の遺伝子産
物のＲＮＡ濃度の測定には対応する数の反応液と反応容
器を個別に準備し、また、反応産物も個々に定量する必
要があり、手間がかかった。[0003] Further, by utilizing the principle of this PCR reaction and the good amplification efficiency, it is also common to compare or measure the trace concentration of RNA which is a gene product of a cell by the PCR reaction. Also in this case, one reaction solution and one reaction vessel were required to measure the concentration of RNA derived from one type of gene. Therefore, measurement of the RNA concentration of many gene products requires preparing a corresponding number of reaction solutions and reaction vessels individually, and quantifying the reaction products individually, which is troublesome.
【０００４】現在、細胞や組織資料に由来する多数の遺
伝子産物たるＲＮＡの測定には、選択的な核酸のハイブ
リダイゼーション法と多数の核酸固定化技術を組み合わ
せたＤＮＡマイクロアレイや、ＤＮＡチップとよばれる
測定方法が存在するが、これらは相同性の高い遺伝子配
列も合算して定量してしまうことがあり、現状では、At present, in order to measure RNA, which is a large number of gene products derived from cell and tissue data, a DNA microarray or a DNA chip, which combines a selective nucleic acid hybridization method and a large number of nucleic acid immobilization techniques, is called. Although there are measurement methods, these methods may add together highly homologous gene sequences and quantify them.
【０００３】に記した定量的ＰＣＲ法に比べ、その特異
性に問題を残している。[0003] Compared with the quantitative PCR method described above, there remains a problem in its specificity.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、同時に複数
個の遺伝子を増幅することができる固相ＰＣＲ法の原理
と、その実施方法と、その反応効率の測定の技術を提供
することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a principle of a solid phase PCR method capable of simultaneously amplifying a plurality of genes, a method for carrying out the method, and a technique for measuring the reaction efficiency. And
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明は、複数組からなるオリゴヌクレオチドプラ
イマー組のおのおのを、固相の異なった部分に合成させ
る、もしくは固相の異なった部分に結合させる工程と、
核酸を鋳型として、固相上の各固定化プライマー組から
ＰＣＲ反応を同時に実施させる工程と、固相の複数の部
位で産生されたＰＣＲ反応産物たるＤＮＡを定量する工
程と、を具備する方法よりなる。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method of synthesizing each of a plurality of sets of oligonucleotide primers on different portions of a solid phase or different portions of a solid phase. Binding to
Using a nucleic acid as a template, simultaneously performing a PCR reaction from each set of immobilized primers on a solid phase, and quantifying DNA as a PCR reaction product produced at a plurality of sites on the solid phase. Become.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】ＰＣＲ反応によりある核酸断片を
増幅させる、もしくは特定の遺伝子の発現量（ＲＮＡ）
を定量するためには、まず、生物試料等から「核酸含有
する試料」を採取する。核酸を抽出後、さらに、ＤＮＡ
もしくはＲＮＡに純化精製する。本明細書において、
「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び／又
は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えば
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲ
ＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノ
シン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデ
ノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、
紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオ
チドも含まれる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A nucleic acid fragment is amplified by a PCR reaction or the expression level (RNA) of a specific gene
In order to quantify, first, a "sample containing nucleic acids" is collected from a biological sample or the like. After nucleic acid extraction, DNA
Alternatively, it is purified and purified into RNA. In this specification,
The term “nucleic acid” includes polynucleotides consisting of any simple and / or modified nucleotides, such as genomic DNA, cDNA, mRNA, total RNA, hnR
NA, etc. are included. "Modified nucleotides" include inosine, acetylcytidine, methylcytidine, methyladenosine, phosphate esters including methylguanosine,
Also included are nucleotides that can be acquired acquired by the action of ultraviolet light or chemical substances.
【０００８】核酸中の特定の遺伝子断片、もしくは遺伝
子領域をＰＣＲ法で分析、もしくは定量する場合、試料
を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作
を行う。生体成分から核酸を抽出する方法としては、例
えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出
方法を使用し得る。ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリ
ゴｄＴカラムにかけてもよい。[0008] When a specific gene fragment or gene region in a nucleic acid is analyzed or quantified by the PCR method, after a sample is collected, usually, an operation of extracting the nucleic acid from the sample is performed. As a method for extracting a nucleic acid from a biological component, for example, phenol extraction, ethanol precipitation, or any other extraction method can be used. When extracting mRNA, it may be applied to an oligo dT column.
【０００９】通常、プライマーとなるオリゴヌクレオチ
ドの塩基配列は、ＰＣＲ反応でＤＮＡ増幅させたい遺伝
子領域の３’端の各ＤＮＡストランドに対し相補的にな
るように５０ヌクレオチドまでの長さで設定しておく必
要かある。つまり、増幅させる遺伝子領域１つに対し、
通常２種もしくはそれ以上（１組）のプライマーを必要
とするので、本発明を実施するためには、この１組を固
相の同じ領域に固定化されていることが必要である。１
組のプライマーの固定化される領域の大きさは、小さい
ほど、より多くのプライマー組が固相上に結合させうる
ので好ましく、通常、４ミリメーター平方以下の大きさ
である。Usually, the nucleotide sequence of an oligonucleotide serving as a primer is set to a length of up to 50 nucleotides so as to be complementary to each DNA strand at the 3 'end of the gene region to be amplified in a PCR reaction. It is necessary to keep. In other words, for one gene region to be amplified,
Usually, two or more (one set) of primers are required, and in order to carry out the present invention, this one set needs to be immobilized on the same region of the solid phase. 1
The size of the region to which the primers of the set are immobilized is preferably as small as possible because more primer sets can be bound on the solid phase, and usually has a size of 4 mm 2 or less.
【００１０】このＰＣＲ反応のためのプライマーの固定
化（固相への結合）を行う方法は、大きく次の２通りに
分けられる。そのひとつは、プライマーとなる各オリゴ
ヌクレオチドを化学合成する時に、その５’末端側にア
ミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有
する分子を共有結合させておく方法である（文献１、文
献２）。これを２種類以上のプライマー（１組）（３）
（４）ごとに混合し、表面をシランカップリング剤等
（６）で活性化させたガラスやシリカや耐熱性プラスチ
ック等より成るの固相に、スペサーやクロスリンカー
（５）を介して共有結合させる。このプライマー組を固
相上に１回スポットした後、また、異なるプライマー組
を違う固相表面にスポットし、固定化する。このプライ
マー組の高密度のスッポト作製は、ＤＮＡチップ作製装
置（ＤＮＡアレイヤー）等を使ってできる。これを繰り
返すことで、多種類のプライマーの組を固相上の異なる
部位に固定することができる（２）。The method of immobilizing primers (binding to a solid phase) for the PCR reaction is roughly classified into the following two methods. One of them is a method in which a molecule having an active functional group such as an amino group, an aldehyde group, or a thiol group is covalently bonded to the 5 ′ terminal side when each oligonucleotide to be a primer is chemically synthesized (Reference 1). Reference 2). Apply this to two or more primers (one set) (3)
(4) is mixed and covalently bonded to a solid phase made of glass, silica, heat-resistant plastic, or the like, activated with a silane coupling agent or the like (6) via a spacer or a crosslinker (5). Let it. After spotting this primer set once on the solid phase, different primer sets are spotted on different solid phase surfaces and immobilized. The high-density production of this primer set can be performed using a DNA chip production apparatus (DNA arrayer) or the like. By repeating this, a set of various types of primers can be immobilized at different sites on the solid phase (2).
【００１１】もう一つの方法は、ガラスやシリコン基盤
上に直接、プライマーとなる１組のオリゴヌクレオチド
を化学合成させる方法である。通常、１種類のオリゴヌ
クレオチドを固相上に合成するには、Ｆｏｄｏｒら（文
献３）の、光照射により選択的に除去されるフォトリソ
グラフィー技術と固相ヌクレオチド合成技術の組み合わ
せにより実現されるか、Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（文献４）
のメニスカスシールによる微小反応槽を固相の一部に作
ることで実現される。本発明における固相の同領域に２
種以上（１組）のオリゴヌクレオチドを化学合成させる
方法は、これらの技術を以下のように改変することで実
現できると考えられる。つまりいずれの方法でも、ガラ
スやシリコン等からなる固相上に導入されたアミノ基等
（６）の反応活性基の一部を、化学物質により可逆的に
離脱しうる分子で保護、ブロックしておくことで、もし
くは全部の官能基を保護したあと部分的に脱保護するこ
とで可能となる。つまり、現存する固相上の反応活性基
から１種のオリゴヌクレオチドを化学合成させたあと、
残存する保護された反応活性基の一部もしくは全部離脱
させ、活性化したあと、それを足場に異なる塩基配列に
対して、オリゴヌクレオチドの合成手順を繰り返すこと
で、複数種のオリゴヌクレオチドを同じ固相部位に化学
合成させることができる。Another method is to chemically synthesize a set of oligonucleotides as primers directly on a glass or silicon substrate. In general, is it possible to synthesize one kind of oligonucleotide on a solid phase by a combination of a solid-phase nucleotide synthesis technique and a photolithography technique selectively removed by light irradiation as described by Fodor et al. (Reference 3)? , Southern et al. (Reference 4).
This is realized by forming a micro-reactor with a meniscus seal as a part of the solid phase. In the same region of the solid phase in the present invention, 2
It is considered that a method of chemically synthesizing one or more (one set) of oligonucleotides can be realized by modifying these techniques as follows. That is, in either method, a part of the reactive group such as an amino group (6) introduced on a solid phase made of glass, silicon, or the like is protected and blocked by a molecule that can be reversibly released by a chemical substance. Or by partially deprotecting after protecting all functional groups. In other words, after chemically synthesizing one type of oligonucleotide from existing reactive groups on the solid phase,
After leaving some or all of the remaining protected reactive groups and activating them, the oligonucleotides can be used as scaffolds to repeat oligonucleotide synthesis procedures for different base sequences, thereby allowing multiple types of oligonucleotides to be fixed to the same base. It can be chemically synthesized at the phase site.
【００１２】実際のＰＣＲの反応は、複数のプライマー
組を複数のスポットとして有する固相（１）を、ＤＮＡ
ポリメラーゼ（８）と鋳型のなる核酸（７）、基質とな
るデオキシヌクレオチド３燐酸等をふくむ反応液（液
相）と接触させ、あらかじめ最適化された各温度で、変
性、アニーリング、複製の３段階を繰り返すことによ
り、図１にあるようにプライマーが固定化された部位
に、複製されたＤＮＡ断片（９）が蓄積する。本発明で
の固相ＰＣＲ法でも、通常のＰＣＲ法と同様、耐熱性細
菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ，ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ，ＰｆｕＤＮＡ
ポリメラーゼ等が使用しうる。このようにプライマーを
固定化することで、各プライマーの塩基配列で特定化さ
れて増幅産生されるＤＮＡ断片は、その固定化部位のみ
に結合しているので、その部位でのＤＮＡ量、もしくは
標識ヌクレオチド３燐酸の取り込み量を測定すること
で、定量的ＰＣＲ法として、目的とするＰＣＲ反応の成
否、収率を判定することができる。In an actual PCR reaction, a solid phase (1) having a plurality of primer sets as a plurality of spots is placed on a DNA
A polymerase (8) is brought into contact with a reaction solution (liquid phase) containing a template nucleic acid (7), a substrate deoxynucleotide triphosphate, and the like, and denatured, annealed, and replicated at each temperature optimized in advance. Is repeated, the replicated DNA fragment (9) accumulates at the site where the primer is immobilized as shown in FIG. In the solid-phase PCR method of the present invention, as in the ordinary PCR method, Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, and Pfu DNA which are DNA polymerases derived from thermostable bacteria are used.
A polymerase or the like can be used. By immobilizing the primers in this manner, the DNA fragment specified and amplified and produced by the base sequence of each primer binds only to the immobilized site. By measuring the amount of incorporation of nucleotide triphosphate, the success or failure and the yield of the target PCR reaction can be determined as a quantitative PCR method.
【００１３】ＰＣＲ産物である増幅ＤＮＡ断片は、典型
的には、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ社）等の２本鎖ＤＮＡに特異的に結合す
るインターカレート蛍光色素を用いて、定量、検出する
ことができる。生ずる蛍光の強度は、ＰＣＲ産物である
ＤＮＡ量に比例していて、これを固相のプライマー組が
結合させてあった各部位ごとに，ＣＣＤカメラやフルオ
ロイメージングアナライザー（ＦＬＡ；富士写真フィル
ム）等の操作によって、定量化することが可能である。
定量的ＰＣＲとしてその他には、放射性物質、例えば３
２Ｐでラベルされたヌクレオチド３燐酸を用いて増幅産
物を内部標識する方法を使用し得る。標識された増幅産
物は、固相を洗浄することで遊離の放射性ヌクレオチド
又はプライマーと分離することができる。次に、その固
相を、オートラジオグラフィー、バイオイメージングア
ナライザー（ＢＡＳ；富士写真フィルム）等の操作によ
って、固相上にある複数の増幅産物量を放射活性として
定量することができる。放射性物質の代わりに、蛍光物
質や発光物質を標識基質としてＰＣＲ反応で使用し、フ
ルオロイメージングアナライザー、ＣＣＤカメラを用い
て増幅産物を定量してもよい。また、望ましくは現在、
多用されつつあるＰＣＲ反応随時定量装置（Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置）（ＧｅｎｅＡｍｐ５７００；Ｐ
Ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）等を用いて、固相のプライ
マー組が結合させてあった各部位ごとに、ＰＣＲ反応の
サイクル経過を追って反応産物量を経時的にモニターす
ることで、より信頼性の高い核酸の定量ができる。The amplified DNA fragment, which is a PCR product, is typically prepared from PicoGreen ™ (Molecular).
Probes) and the like can be quantified and detected using an intercalating fluorescent dye that specifically binds to double-stranded DNA. The intensity of the generated fluorescence is proportional to the amount of DNA that is a PCR product. For each site to which the solid phase primer set was bound, a CCD camera, a fluoro imaging analyzer (FLA; Fuji Photo Film), etc. It is possible to quantify by the operation of
Others such as quantitative PCR include radioactive substances such as 3
A method of internally labeling the amplification product with 2P-labeled nucleotide triphosphates may be used. The labeled amplification product can be separated from free radionucleotides or primers by washing the solid phase. Next, the amount of a plurality of amplification products on the solid phase can be quantified as radioactivity by an operation such as autoradiography or a bioimaging analyzer (BAS; Fuji Photo Film). Instead of a radioactive substance, a fluorescent substance or a luminescent substance may be used as a labeling substrate in a PCR reaction, and the amplification product may be quantified using a fluoroimaging analyzer or a CCD camera. Also, preferably now,
Quantitative equipment for real-time PCR reaction (Real
Time PCR device) (GeneAmp5700; P
E Biosystem) and the like, by monitoring the amount of the reaction product over time for each site to which the solid-phase primer set was bound, following the progress of the PCR reaction, to obtain a more reliable nucleic acid. Can be determined.
【００１４】（文献１）Ｌａｍｔｕｒｅ，ＪＢ ｅｔ
ａｌ．：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１２
１−２１２５（１９９４） （文献２）Ｇｕｏ，Ｚ ｅｔ ａｌ．：Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９
４） （文献３）Ｆｏｄｏｒ，ＳＰＡ ｅｔ ａｌ．：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３（１９９１） （文献４）Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，ＥＭ：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６７
９−１６８４（１９９２）(Reference 1) Lamture, JB et
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n, EM: Nucl. Acid Res. 20: 167
9-1684 (1992)
【００１５】[0015]
【発明の効果】本発明の原理と方法によれば、同じ核酸
を鋳型として行う複数種のＰＣＲ反応を１つの反応容器
で実施することが可能となり、これを応用することで、
極く微量のゲノムＤＮＡや細胞由来ＲＮＡを鋳型に、多
数の遺伝子断片を一挙に増幅する、その増幅可能性の判
定する、もしくは、多数の遺伝子量を正確に定量するこ
とを可能とせしめる。According to the principle and method of the present invention, it is possible to carry out a plurality of types of PCR reactions using the same nucleic acid as a template in a single reaction vessel.
Using a very small amount of genomic DNA or cell-derived RNA as a template, it is possible to amplify a large number of gene fragments at once, determine the possibility of amplification, or accurately quantify the amount of a large number of genes.
【図１】固定化プライマーによるＰＣＲ法の一連の反応
の説明図 Ａ；複数のプライマー組が共有結合で複数個スポットさ
れたスライドガラス等の固相、Ｂ；１組（２種）のプラ
イマーが固定化されたスポットの拡大図、Ｃ；酵素と基
質を含む液相をＡの固相と接触させ、鋳型の１本鎖核酸
を片方のプライマーＡとアニーリングさせた後、そのプ
ライマーからＤＮＡ複製が開始した様子、Ｄ；ＤＮＡ複
製が修了後、熱変性により鋳型の核酸を除去された後、
プライマーＡから最初に合成されたＤＮＡが１本鎖にな
っている様子、Ｅ；プライマーＡから合成されたＤＮＡ
が、プライマーＢとアニーリングした後、再度、プライ
マーＢからＤＮＡ複製が開始した様子、Ｆ；ＤＮＡ複製
が修了後、熱変性により鋳型のＤＮＡから解離し、全て
の合成されたＤＮＡが１本鎖になっている様子、Ｇ；Ｅ
とＦのステップの繰り返しにより、残存するプライマー
から多量の２本鎖ＤＮＡが固相上スポットに合成され蓄
積し、２本鎖ＤＮＡ蛍光色素が結合した様子。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram illustrating a series of reactions in a PCR method using immobilized primers A: a solid phase such as a slide glass on which a plurality of primer sets are spotted by covalent bonds, and B: one set (two kinds) of primers Enlarged view of the immobilized spot, C: contacting the liquid phase containing the enzyme and the substrate with the solid phase of A, annealing the single-stranded nucleic acid of the template with one primer A, and then replicating DNA from the primer. After starting, D; after completion of DNA replication, after removal of template nucleic acid by heat denaturation,
DNA synthesized first from primer A is single-stranded, E: DNA synthesized from primer A
However, after annealing with the primer B, the DNA replication started again from the primer B. F: After the DNA replication was completed, the DNA was dissociated from the template DNA by heat denaturation, and all the synthesized DNA was converted into a single strand. G, E
A large amount of double-stranded DNA is synthesized and accumulated on the solid phase spot from the remaining primer by repeating steps F and F, and the double-stranded DNA fluorescent dye is bound.
（１）固相、（２）プライマー組の固相への結合領域、
（３）プライマーＢ、（４）プライマーＡ、（５）クロ
スリンカー、（６）活性官能基、（７）鋳型の１本鎖核
酸、（８）ＤＮＡポリメラーゼ、（９）複製されたＤＮ
Ａ、（１０）複製後に熱変性させられた１本鎖ＤＮＡ、
（１１）蛍光色素。(1) a solid phase, (2) a binding region of the primer set to the solid phase,
(3) Primer B, (4) Primer A, (5) Crosslinker, (6) Active functional group, (7) Single-stranded nucleic acid of template, (8) DNA polymerase, (9) Replicated DN
A, (10) heat-denatured single-stranded DNA after replication,
(11) fluorescent dye.
Claims (3)
種以上よりなるプライマー組から、核酸を鋳型として、
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａ
ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を固相上で実施させ
る方法。1. An oligonucleotide 2 bound on a solid phase
From a primer set consisting of more than one species, using nucleic acid as a template,
Polymerase Chain Reaction (Polymerase Cha)
in Reaction (PCR) on a solid phase.
のオリゴヌクレオチドを固相上の同一微小領域に合成さ
せた固相部分、もしくは結合させた固相部分を、単数個
もしくは複数個有する固相を作製する方法。2. The method according to claim 1, wherein one or more solid-phase parts in which two or more kinds of oligonucleotides are synthesized in the same microregion on the solid-phase, or a solid-phase part in which two or more oligonucleotides are bound are combined. A method for producing a solid phase having the same.
認するために、固相上の単数個もしくは複数個の部位で
産生されたＰＣＲ反応産物たるＤＮＡ量を効率良く定量
する方法。3. A method for efficiently quantifying the amount of DNA as a PCR reaction product produced at one or more sites on a solid phase to confirm the reaction efficiency of the solid phase PCR method according to claim 1.
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