JP2001270899A - 発光量標準物質 - Google Patents
発光量標準物質Info
- Publication number
- JP2001270899A JP2001270899A JP2000084416A JP2000084416A JP2001270899A JP 2001270899 A JP2001270899 A JP 2001270899A JP 2000084416 A JP2000084416 A JP 2000084416A JP 2000084416 A JP2000084416 A JP 2000084416A JP 2001270899 A JP2001270899 A JP 2001270899A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aequorin
- luminescence
- photoprotein
- standard
- light emission
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
の検定に用いることができ、生体系に影響を与えず、安
定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質を提供す
る。 【解決手段】 カルシウムイオン結合によりフォトンを
誘発する、イクオリン、クライチン、オベリン、マイト
ロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群か
ら選択される天然由来または組換え蛋白質を発光量標準
物質として用いる。
Description
ることを特徴とする発光量標準物質に関する。詳細に
は、発光測定装置検定において発光量標準物質として発
光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関
する。
装置の検定および測定値フォトンの絶対量の決定を行う
場合、そのフォトン量の絶対標準物質として半減期が5
730年の放射性同位元素14C溶液が使用されてきた。
しかし、14Cは、使用場所が法令上放射線同位元素の使
用が許可されている場所に限定されるばかりか、取扱者
がその放射線に曝されるという問題があった。
野において分析や検査の目的で重要な役目を担うように
なり、発光測定装置の設置および使用は放射線管理区域
外で行われるようになっている。しかし、放射線管理区
域外では発光量標準物質として14Cを使用することがで
きず、測定に際しては相対値(relative light unit)
を用いているため、測定バッチ間および/または他の測
定装置との間でデータを統一的に評価、管理することが
できないという問題が指摘されていた。
光由来の酵素反応系、例えばルシフェラーゼによって生
成される発光を発光量標準に用いることが考案されてき
たが、これらの反応系は反応条件、例えば温度、pH、
溶存酸素濃度等の影響を比較的受けやすく、発光標準物
質としては不適切であるとして、汎用法としては普及し
ていない。
光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質
が求められている。そのような発光量標準物質を用いて
発光測定装置の検定を行うことができれば、各分析・検
査において絶対量を決定することができ、各バッチ間で
のデータおよび/または種々の発光測定装置にて得られ
るデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一
的に評価管理することが可能になる。
射性同位元素14Cの代わりに発光測定装置の検定に用い
ることができ、非放射性物質からなり、生体系に影響を
与えず、安定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質
を提供することを目的とする。発光量標準物質として
は、発光反応が反応条件による影響を受けにくく発光量
が安定していること、さらに取扱いが容易であることが
必要である。
トン量標準物質として使用する場合と同様に、その標準
物質を測定装置にセットすることにより簡単に検定する
方法を開発するべく検討を行った結果、カルシウムイオ
ン結合によりフォトンを誘発するイクオリンを代表とす
る発光蛋白質が発光量標準物質として使用可能であるこ
とを明らかにした。即ち、発光測定装置検定において発
光量標準物質として前記発光蛋白質を用いる。
とを特徴とする発光量標準物質に関する。
合型発光蛋白質である発光量標準物質に関する。
ン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプ
シンおよびベルボインからなる群から選択される天然由
来または組換え蛋白質である、発光量標準物質に関す
る。本発明において、前記発光蛋白質のアミノ酸配列に
おいて、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付
加されているものも包含される。
(b)(a)のアミノ酸配列において、1もしくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を有する蛋白質である発光量標準物質に関する。前記
発光蛋白質には、その145位、152位および180
位のシステイン残基の少なくとも1つがセリンに置換さ
れている発光蛋白質も包含される。
て、発光蛋白質として使用されるイクオリンは、シアト
ル近郊に生育する発光オワンクラゲ(Aequorea aequor
ea)の発光器から単離される蛋白質であり、蛋白質部分
であるアポイクオリン(アポタンパク)と発光基質に相
当するセレンテラジン、分子状酸素が複合体を形成した
状態で存在している。そして、イクオリン分子にカルシ
ウムイオンが結合すると、青色(λmax=465nm)の
瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレン
テラミド、二酸化炭素を生成する。イクオリンは、プレ
チャージ型蛋白質と称されるように、発光のエネルギー
を分子内に蓄積しており、カルシウム溶液を添加するこ
とのみで、瞬間光(=フォトン)が発生する。
に対する感受性の高さから微量カルシウムイオンの検
出、定量(検出限界10nM)や細胞内カルシウムの動的
変化のイメージプローブ(カルシウムセンサー)として
用いられてきた。クライチン、オベリン、マイトロコミ
ン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質も同様な
目的で使用されてきた。
し、イクオリンの正確な濃度を決定することによって発
光量を規定することができるため、イクオリンを発光量
標準物質として使用することができる。即ち、本発明
は、14Cに代わる発光量標準物質として使用という、イ
クオリンの全く新しい使用方法を開示する。
リン遺伝子を単離し(特開昭61−135586号公
報)、その後イクオリン変異体を用いてその発光機構を
明らかにした(特開昭63−291593号公報、特開
昭63−291586号公報、特開昭64−04737
9号公報)。さらに、大腸菌系を用いるイクオリンの製
造法を確立し、高純度イクオリンを製造した(特開平1
−132397号公報)。
用するイクオリンは、天然由来または組換え体の何れで
もよいが、正確な濃度を決定するという観点から均一で
高純度のものが好ましく、上述の高純度組換えイクオリ
ンがさらに好ましい。
ルシウムイオン(最終濃度が0.1mM以上)添加により
数秒間で完了する高速発光反応であり、測定装置におい
て発光をより正確に検出するためには、カルシウムイオ
ンが高濃度であってもゆっくり反応が起きる変異型イク
オリンがより好ましい。そのような変異型イクオリン
は、本出願人の特開昭63−291593号公報に記載
されており、天然型イクオリンのアミノ酸配列におい
て、145位、152位および180位のシステイン残
基の少なくとも1つがセリンに置換されているイクオリ
ン変異体が特に好ましい。
ンは、特に限定しないが公知の遺伝子組換え技術、例え
ば特開昭63−291586号公報に記載の方法によっ
て製造することができる。このようにして得られるイク
オリンの組換え変異体は、天然型イクオリンと同様に発
光量標準物質として使用することができる。
もに、発光反応後にEDTA等のキレート剤で処理する
ことによりアポイクオリンからカルシウムを除去し、還
元剤、セレンテラジン、酸素とともに低温でインキュベ
ーションすることによって再生させて再利用することが
可能である。
クオリンを使用するためには、その活性を長期間安定的
に保持させることが重要である。従って、本発明はま
た、イクオリンの安定保存法に関する。高純度イクオリ
ンの活性を維持するためには、使用目的あるいは使用場
所にあわせて以下のような保存方法を採用することが好
ましい。 1.濃度0.1mMのEDTAを含む1.0M以上の濃度の
硫酸アンモニウム水溶液中10℃以下で保存する。この
保存方法の場合、最低2ヶ月は活性の低下が認められな
い。 2.前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム溶液を液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法
の場合、最低1ヵ年は活性の低下が認められない。 3.前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム水溶液が飽和硫酸アンモニウム水溶液になるように
硫酸アンモニウムを添加することにより高純度イクオリ
ンを塩析沈澱させ、液体チッソ等で凍結させ保存する。
この方法の場合、最低1ヵ年は活性の低下が認められな
い。 4.前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム水溶液に硫酸アンモニウムを徐々に加え、母液が薄
く濁りはじめたら10℃以下に保持して結晶を析出さ
せ、結晶化したイクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウ
ム水溶液を10℃以下で保存する。この方法の場合、最
低1ヵ年は活性の低下が認められない。
ら、イクオリンと同様に微量カルシウムイオンの検出等
に使用されているクライチン、オベリン、マイトロコミ
ン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質について
も、発光量標準物質として使用することができる。
施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に
限定されるものではない。
クオリン遺伝子を包含するpAQ440(特開昭61−
135586号公報)から構築した、アポイクオリン遺
伝子発現ベクターpiP−HE(特開平1−13239
7号公報)を用いた。宿主として大腸菌WA802株を
使用し、常法によりpiP−HEで該菌株を形質転換し
た。得られた形質転換株を30℃で一晩培養後、アンピ
シリン(50μg/ml)を含有する50mlのLB液体培
地(水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イ
ーストイクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH
7.2)に植菌し、さらに30℃で8時間培養した。次
いで、その培養物を新たなLB液体培地2Lに添加し、
37℃で一昼夜(18時間)培養した。培養後、菌体と
培養液を低速遠心分離(5000×g)によって分離し
た。菌体および培養液はともに発現したアポイクオリン
を含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料
とした。
光純薬社製)200mgを含む400mlの50mM Tri
s−HCl,10mM EDTA,pH7.6の緩衝液中に
懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で2分間処理
して菌体を破砕し、12000×gで20分間遠心後、
上澄み液を集めた。得られた上澄み液に化学合成したセ
レンテラジンを産生アポイクオリンの1.2倍のモル濃
度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、4℃で
5時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、20mM
Tris−HCl,10mM EDTA,pH7.6の緩衝
液で平衡化したQ−セファロースカラム(ファルマシア
製、直径2cm×10cm)に添加してイクオリンを吸着さ
せ、カラムから溶液の280nmでの吸光度が0.05以
下になるまで20mM Tris−HCl,10mM EDT
A,0.1M NaCl,pH7.6でカラムを洗浄し
た。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオ
リン画分を0.1M−NaCl〜0.4M−NaClの直
線濃度勾配で溶出させた。
との分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセ
ファロース4ファーストフローゲルを用いて行った。即
ち、Q−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液
を、硫酸アンモニウムの最終濃度が2Mになるように調
整した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、
その上澄み液を、2M−硫酸アンモニウムを含有する2
0mM Tris−HCl,10mM EDTA,pH7.6
で平衡化したブチルセファロース4ファーストフローカ
ラム(ファルマシア社、カラムサイズ:直径2cm×8c
m)に通し、硫酸アンモニウム濃度1Mまで直線濃度勾
配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イ
クオリン画分を収集した。
Tris−HCl,10mM EDTA,pH7.6での
み溶出された。再生イクオリン画分について、還元状態
で12%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PA
GEによる分析を行った。その結果、精製画分について
分子量25kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出さ
れ、その純度はデンシトメーターでの測定では98%以
上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約80%
で、80mgの高純度イクオリンを得た。
−132397号公報に記載の方法に従って実施した。
即ち、培養液を酸性化処理してpH5以下にし、4℃で
放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離
によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶
解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同
様にQ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファ
ロース4ファーストフローカラムクロマト法を用いて、
純度98%以上のイクオリンを取得した。得られた精製
イクオリンについて、還元状態で12%ポリアクリルア
ミドゲルを用いたSDS−PAGEによる分析を行った
結果、分子量25kDa蛋白質に相当する単一バンドが検
出され、その純度はデンシトメーターでの測定では98
%以上であった。得られた高純度アポイクオリン50mg
から高純度イクオリン45mgを得た。
開昭61−135586号公報に記載のpAQ440の
代わりに特開昭63−291586号公報に記載の変異
型イクオリン遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、上
述のpiP−HEと同様に大腸菌においてイクオリン変
異体(本実施例においては代表例として、145位、1
52位および180位のシステイン残基が全てセリンに
置換された変異体)を発現させた。次いで、実施例1と
同様に精製した。精製したイクオリン変異体は、SDS
−PAGEにおいて単一バンドを示し、その純度は98
%以上であった。
定装置の評価 実施例1および2で取得した98%以上の純度をもつ組
換えイクオリン0.001μgに高濃度のカルシウム溶液
を添加し、その全発光量を14Cの標準溶液により補正さ
れた発光測定装置にて測定し、蛋白質1mgあたりの絶対
発光量を算出した。その結果、得られた絶対発光量は、
実施例1の天然型イクオリン、実施例2の変異体ともに
蛋白質1mgあたり4.8×1015フォトンであった。ま
た、組換えイクオリン濃度を吸光度法にて測定した結
果、吸収スペクトル280nmにおける0.01%(w/
v)イクオリンの吸光度は0.30であった。
2pg、60pg、120pg、600pgまたは1200pg)
に高濃度カルシウム溶液を添加し、上述の発光測定装置
を用いて、その全発光量を実測値として相対発光量(rl
u)を測定した。また、各々の量の組換えイクオリンに
ついて、絶対発光量を蛋白質1mgあたりの絶対発光量
4.8×1015フォトンから求めた。そして、下記の式
により、1相対発光量の絶対量を算出した。 1相対発光量の絶対量=絶対発光量(フォトン)/相対
発光量(rlu) その結果を下記の表に示す。
と発光量は直線性を示し、絶対発光量から算出した1相
対発光量の絶対量もほぼ一定であった。このようにイク
オリンを用いて相対発光量を絶対発光量に変換すれば、
他のバッチおよび/または他の測定装置で得られた測定
値(相対値)を絶対発光量として評価することができ
る。
ァロース4ファーストフローカラムクロマト法で得られ
た高純度イクオリン画分について保存試験を行った結果
を下記に示す。 (1)EDTA0.1mMを含む濃度1.0M以上の硫酸ア
ンモニウム水溶液である実施例1で得られた高純度イク
オリン画分を4℃で保存したところ、2ヶ月を超えても
活性の低下は認められなかった。 (2)前記の高濃度硫酸アンモニウム溶液を含む高純度
イクオリン画分を液体チッソを用い−80℃で凍結保存
したところ、保存期間1ヵ年を超えても活性の低下が認
められなかった。 (3)前記の高純度イクオリン画分に対し硫酸アンモニ
ウム濃度が飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し
て高純度イクオリンを塩析沈殿させ、−80℃で凍結さ
せて保存したところ、保存期間1ヵ年を超えても活性の
低下が認められなかった。 (4)前記の高純度イクオリン画分を結晶化のための母
液として、それに硫酸アンモニウムを徐々に加え母液が
薄く濁りはじめたところで温度を下げ5℃に維持して結
晶を析出させた。この結晶化したイクオリンを含む硫酸
アンモニウム水溶液をそのまま5℃で保存したところ、
保存期間1ヵ年を超えても活性の低下が認められなかっ
た。
代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光
量標準物質が提供される。本発明の発光量標準物質を用
いて発光測定装置の検定を実施すれば、各分析・検査に
おいて絶対発光量を決定することができ、各バッチ間で
のデータおよび/または種々の発光測定装置にて得られ
るデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一
的に評価管理することが可能である。
Claims (7)
- 【請求項1】 発光蛋白質を用いることを特徴とする発
光量標準物質。 - 【請求項2】 発光蛋白質がカルシウム結合型発光蛋白
質である、請求項1に記載の発光量標準物質。 - 【請求項3】 発光蛋白質が、イクオリン、クライチ
ン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベ
ルボインからなる群から選択される天然由来または組換
え蛋白質である、請求項2に記載の発光量標準物質。 - 【請求項4】 発光蛋白質が、そのアミノ酸配列におい
て、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ
れている、請求項3に記載の発光量標準物質。 - 【請求項5】 発光蛋白質が、 (a)配列番号:1に示されるアミノ酸配列、または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1もしくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を有する蛋白質である、請求項1に記載の発光量標準
物質。 - 【請求項6】 前記発光蛋白質が、その145位、15
2位および180位のシステイン残基の少なくとも1つ
がセリンに置換されていることを特徴とする、請求項5
に記載の発光量標準物質。 - 【請求項7】 発光蛋白質を発光量標準物質として用い
る、発光蛋白質の使用方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000084416A JP4501211B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 発光量標準物質 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000084416A JP4501211B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 発光量標準物質 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001270899A true JP2001270899A (ja) | 2001-10-02 |
JP4501211B2 JP4501211B2 (ja) | 2010-07-14 |
Family
ID=18600895
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000084416A Expired - Lifetime JP4501211B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 発光量標準物質 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4501211B2 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2827292A1 (fr) * | 2001-07-12 | 2003-01-17 | Centre Nat Rech Scient | Photoproteines mutees et leurs applications |
WO2005014633A1 (ja) * | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Chisso Corporation | 蛍光蛋白質 |
JP2006308501A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Chisso Corp | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
JP2008048607A (ja) | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | Fc結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
US7396655B2 (en) | 2005-03-30 | 2008-07-08 | Chisso Corporation | Method for enhancing activity of luciferase with fluorescence activity |
JP2008283944A (ja) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Chisso Corp | Fc結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
JP2015091873A (ja) * | 2015-01-30 | 2015-05-14 | Jnc株式会社 | Fc結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
-
2000
- 2000-03-24 JP JP2000084416A patent/JP4501211B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6009043593, 蛋白質 核酸 酵素,Vol.33,No.12(1988)p.1985−1993 * |
JPN6009043595, ファルマシア,Vol.32,No.3(1996)p.276−280 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2827292A1 (fr) * | 2001-07-12 | 2003-01-17 | Centre Nat Rech Scient | Photoproteines mutees et leurs applications |
WO2003006497A3 (fr) * | 2001-07-12 | 2004-01-22 | Centre Nat Rech Scient | Photoprotéines mutees et leurs applications |
WO2005014633A1 (ja) * | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Chisso Corporation | 蛍光蛋白質 |
JP4770462B2 (ja) * | 2003-08-12 | 2011-09-14 | Jnc株式会社 | 蛍光蛋白質 |
US8710195B2 (en) | 2003-08-12 | 2014-04-29 | Jnc Corporation | Fluorescent proteins |
US7396655B2 (en) | 2005-03-30 | 2008-07-08 | Chisso Corporation | Method for enhancing activity of luciferase with fluorescence activity |
JP2006308501A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Chisso Corp | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
JP4609177B2 (ja) * | 2005-04-28 | 2011-01-12 | チッソ株式会社 | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
US9678067B2 (en) | 2005-04-28 | 2017-06-13 | Jnc Corporation | Method for extending light-emitting time of calcium-binding photoprotein solution |
JP2008048607A (ja) | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | Fc結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
JP2008283944A (ja) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Chisso Corp | Fc結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
JP2015091873A (ja) * | 2015-01-30 | 2015-05-14 | Jnc株式会社 | Fc結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4501211B2 (ja) | 2010-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Weber et al. | High level expression in Escherichia coli and characterization of the EF-hand calcium-binding protein caltractin. | |
Fisher et al. | The 1.5-Å resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions | |
Mohr et al. | Binding of small acid-soluble spore proteins from Bacillus subtilis changes the conformation of DNA from B to A. | |
Kendall et al. | Engineering the Ca2+-activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium | |
Arechaga et al. | Cysteine residues are not essential for uncoupling protein function | |
US9678067B2 (en) | Method for extending light-emitting time of calcium-binding photoprotein solution | |
JP2001270899A (ja) | 発光量標準物質 | |
Barth et al. | Magnetic circular dichroism studies. XVII. Magnetic circular dichroism spectra of proteins. New method for the quantitative determination of tryptophan | |
Borisova et al. | Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay | |
Hromić-Jahjefendić et al. | A novel Porphyromonas gingivalis enzyme: An atypical dipeptidyl peptidase III with an ARM repeat domain | |
Parsons et al. | A comparison of the L-arabinose-and D-galactose-binding proteins of Escherichia coli B/r | |
Beddoe et al. | The production, purification and crystallization of a pocilloporin pigment from a reef-forming coral | |
JP2013231037A (ja) | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 | |
DeGrazia et al. | Investigation of the cAMP receptor protein secondary structure by Raman spectroscopy | |
Highsmith et al. | High-affinity and low-affinity vanadate binding to sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase labeled with fluorescein isothiocyanate | |
Inouye et al. | High-level expression and purification of apoaequorin | |
Sayers et al. | Cloning and expression of Saccharomyces cerevisiae copper‐metallothionein gene in Escherichia coli and characterization of the recombinant protein | |
Sakato-Antoku et al. | Outer-arm dynein light chain LC1 is required for normal motor assembly kinetics, ciliary stability, and motility | |
JPWO2020071229A1 (ja) | エンドトキシン測定剤の感度の増強方法 | |
Devedjiev et al. | X-ray structure at 1.76 Å resolution of a polypeptide phospholipase A2 inhibitor | |
Tonan et al. | Conformations of isolated fragments of pancreatic polypeptide | |
US7241864B2 (en) | Recombinant photoproteins and their conjugates | |
JP4039722B2 (ja) | 複合因子測定試薬 | |
Skelly et al. | Conformational effects of nucleotide exchange in ras p21 proteins as studied by fluorescence spectroscopy | |
JP7397343B2 (ja) | エンドトキシンの測定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061025 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090901 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091028 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20091028 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091124 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100224 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100308 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100330 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100412 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4501211 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140430 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |