JP2001270899A - 発光量標準物質 - Google Patents
発光量標準物質Info
- Publication number
- JP2001270899A JP2001270899A JP2000084416A JP2000084416A JP2001270899A JP 2001270899 A JP2001270899 A JP 2001270899A JP 2000084416 A JP2000084416 A JP 2000084416A JP 2000084416 A JP2000084416 A JP 2000084416A JP 2001270899 A JP2001270899 A JP 2001270899A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aequorin
- luminescence
- photoprotein
- standard
- light emission
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置
の検定に用いることができ、生体系に影響を与えず、安
定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質を提供す
る。 【解決手段】 カルシウムイオン結合によりフォトンを
誘発する、イクオリン、クライチン、オベリン、マイト
ロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群か
ら選択される天然由来または組換え蛋白質を発光量標準
物質として用いる。
の検定に用いることができ、生体系に影響を与えず、安
定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質を提供す
る。 【解決手段】 カルシウムイオン結合によりフォトンを
誘発する、イクオリン、クライチン、オベリン、マイト
ロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群か
ら選択される天然由来または組換え蛋白質を発光量標準
物質として用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発光蛋白質を用い
ることを特徴とする発光量標準物質に関する。詳細に
は、発光測定装置検定において発光量標準物質として発
光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関
する。
ることを特徴とする発光量標準物質に関する。詳細に
は、発光測定装置検定において発光量標準物質として発
光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関
する。
【０００２】
【従来の技術】一般的に学術研究の分野では、発光測定
装置の検定および測定値フォトンの絶対量の決定を行う
場合、そのフォトン量の絶対標準物質として半減期が５
７３０年の放射性同位元素14Ｃ溶液が使用されてきた。
しかし、14Ｃは、使用場所が法令上放射線同位元素の使
用が許可されている場所に限定されるばかりか、取扱者
がその放射線に曝されるという問題があった。
装置の検定および測定値フォトンの絶対量の決定を行う
場合、そのフォトン量の絶対標準物質として半減期が５
７３０年の放射性同位元素14Ｃ溶液が使用されてきた。
しかし、14Ｃは、使用場所が法令上放射線同位元素の使
用が許可されている場所に限定されるばかりか、取扱者
がその放射線に曝されるという問題があった。
【０００３】一方、発光測定検査は特に医薬や食品の分
野において分析や検査の目的で重要な役目を担うように
なり、発光測定装置の設置および使用は放射線管理区域
外で行われるようになっている。しかし、放射線管理区
域外では発光量標準物質として14Ｃを使用することがで
きず、測定に際しては相対値（relative light unit）
を用いているため、測定バッチ間および／または他の測
定装置との間でデータを統一的に評価、管理することが
できないという問題が指摘されていた。
野において分析や検査の目的で重要な役目を担うように
なり、発光測定装置の設置および使用は放射線管理区域
外で行われるようになっている。しかし、放射線管理区
域外では発光量標準物質として14Ｃを使用することがで
きず、測定に際しては相対値（relative light unit）
を用いているため、測定バッチ間および／または他の測
定装置との間でデータを統一的に評価、管理することが
できないという問題が指摘されていた。
【０００４】このため、化学発光反応系あるいは生物発
光由来の酵素反応系、例えばルシフェラーゼによって生
成される発光を発光量標準に用いることが考案されてき
たが、これらの反応系は反応条件、例えば温度、ｐＨ、
溶存酸素濃度等の影響を比較的受けやすく、発光標準物
質としては不適切であるとして、汎用法としては普及し
ていない。
光由来の酵素反応系、例えばルシフェラーゼによって生
成される発光を発光量標準に用いることが考案されてき
たが、これらの反応系は反応条件、例えば温度、ｐＨ、
溶存酸素濃度等の影響を比較的受けやすく、発光標準物
質としては不適切であるとして、汎用法としては普及し
ていない。
【０００５】そこで、放射性同位元素14Ｃの代わりに発
光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質
が求められている。そのような発光量標準物質を用いて
発光測定装置の検定を行うことができれば、各分析・検
査において絶対量を決定することができ、各バッチ間で
のデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られ
るデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一
的に評価管理することが可能になる。
光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質
が求められている。そのような発光量標準物質を用いて
発光測定装置の検定を行うことができれば、各分析・検
査において絶対量を決定することができ、各バッチ間で
のデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られ
るデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一
的に評価管理することが可能になる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、放
射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用い
ることができ、非放射性物質からなり、生体系に影響を
与えず、安定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質
を提供することを目的とする。発光量標準物質として
は、発光反応が反応条件による影響を受けにくく発光量
が安定していること、さらに取扱いが容易であることが
必要である。
射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用い
ることができ、非放射性物質からなり、生体系に影響を
与えず、安定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質
を提供することを目的とする。発光量標準物質として
は、発光反応が反応条件による影響を受けにくく発光量
が安定していること、さらに取扱いが容易であることが
必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、14Ｃをフォ
トン量標準物質として使用する場合と同様に、その標準
物質を測定装置にセットすることにより簡単に検定する
方法を開発するべく検討を行った結果、カルシウムイオ
ン結合によりフォトンを誘発するイクオリンを代表とす
る発光蛋白質が発光量標準物質として使用可能であるこ
とを明らかにした。即ち、発光測定装置検定において発
光量標準物質として前記発光蛋白質を用いる。
トン量標準物質として使用する場合と同様に、その標準
物質を測定装置にセットすることにより簡単に検定する
方法を開発するべく検討を行った結果、カルシウムイオ
ン結合によりフォトンを誘発するイクオリンを代表とす
る発光蛋白質が発光量標準物質として使用可能であるこ
とを明らかにした。即ち、発光測定装置検定において発
光量標準物質として前記発光蛋白質を用いる。
【０００８】従って、本発明は、発光蛋白質を用いるこ
とを特徴とする発光量標準物質に関する。
とを特徴とする発光量標準物質に関する。
【０００９】本発明はまた、発光蛋白質がカルシウム結
合型発光蛋白質である発光量標準物質に関する。
合型発光蛋白質である発光量標準物質に関する。
【００１０】本発明はまた、発光蛋白質が、イクオリ
ン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプ
シンおよびベルボインからなる群から選択される天然由
来または組換え蛋白質である、発光量標準物質に関す
る。本発明において、前記発光蛋白質のアミノ酸配列に
おいて、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付
加されているものも包含される。
ン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプ
シンおよびベルボインからなる群から選択される天然由
来または組換え蛋白質である、発光量標準物質に関す
る。本発明において、前記発光蛋白質のアミノ酸配列に
おいて、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付
加されているものも包含される。
【００１１】本発明はまた、発光蛋白質が、 （ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を有する蛋白質である発光量標準物質に関する。前記
発光蛋白質には、その１４５位、１５２位および１８０
位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換さ
れている発光蛋白質も包含される。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を有する蛋白質である発光量標準物質に関する。前記
発光蛋白質には、その１４５位、１５２位および１８０
位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換さ
れている発光蛋白質も包含される。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明の発光量標準物質におい
て、発光蛋白質として使用されるイクオリンは、シアト
ル近郊に生育する発光オワンクラゲ（Aequorea aequor
ea）の発光器から単離される蛋白質であり、蛋白質部分
であるアポイクオリン（アポタンパク）と発光基質に相
当するセレンテラジン、分子状酸素が複合体を形成した
状態で存在している。そして、イクオリン分子にカルシ
ウムイオンが結合すると、青色（λmax＝４６５nm）の
瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレン
テラミド、二酸化炭素を生成する。イクオリンは、プレ
チャージ型蛋白質と称されるように、発光のエネルギー
を分子内に蓄積しており、カルシウム溶液を添加するこ
とのみで、瞬間光（＝フォトン）が発生する。
て、発光蛋白質として使用されるイクオリンは、シアト
ル近郊に生育する発光オワンクラゲ（Aequorea aequor
ea）の発光器から単離される蛋白質であり、蛋白質部分
であるアポイクオリン（アポタンパク）と発光基質に相
当するセレンテラジン、分子状酸素が複合体を形成した
状態で存在している。そして、イクオリン分子にカルシ
ウムイオンが結合すると、青色（λmax＝４６５nm）の
瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレン
テラミド、二酸化炭素を生成する。イクオリンは、プレ
チャージ型蛋白質と称されるように、発光のエネルギー
を分子内に蓄積しており、カルシウム溶液を添加するこ
とのみで、瞬間光（＝フォトン）が発生する。
【００１３】イクオリンまたは、そのカルシウムイオン
に対する感受性の高さから微量カルシウムイオンの検
出、定量（検出限界１０nM）や細胞内カルシウムの動的
変化のイメージプローブ（カルシウムセンサー）として
用いられてきた。クライチン、オベリン、マイトロコミ
ン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質も同様な
目的で使用されてきた。
に対する感受性の高さから微量カルシウムイオンの検
出、定量（検出限界１０nM）や細胞内カルシウムの動的
変化のイメージプローブ（カルシウムセンサー）として
用いられてきた。クライチン、オベリン、マイトロコミ
ン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質も同様な
目的で使用されてきた。
【００１４】イクオリンの発光量は蛋白質濃度に比例
し、イクオリンの正確な濃度を決定することによって発
光量を規定することができるため、イクオリンを発光量
標準物質として使用することができる。即ち、本発明
は、14Ｃに代わる発光量標準物質として使用という、イ
クオリンの全く新しい使用方法を開示する。
し、イクオリンの正確な濃度を決定することによって発
光量を規定することができるため、イクオリンを発光量
標準物質として使用することができる。即ち、本発明
は、14Ｃに代わる発光量標準物質として使用という、イ
クオリンの全く新しい使用方法を開示する。
【００１５】本発明者は、発光オワンクラゲからイクオ
リン遺伝子を単離し（特開昭６１−１３５５８６号公
報）、その後イクオリン変異体を用いてその発光機構を
明らかにした（特開昭６３−２９１５９３号公報、特開
昭６３−２９１５８６号公報、特開昭６４−０４７３７
９号公報）。さらに、大腸菌系を用いるイクオリンの製
造法を確立し、高純度イクオリンを製造した（特開平１
−１３２３９７号公報）。
リン遺伝子を単離し（特開昭６１−１３５５８６号公
報）、その後イクオリン変異体を用いてその発光機構を
明らかにした（特開昭６３−２９１５９３号公報、特開
昭６３−２９１５８６号公報、特開昭６４−０４７３７
９号公報）。さらに、大腸菌系を用いるイクオリンの製
造法を確立し、高純度イクオリンを製造した（特開平１
−１３２３９７号公報）。
【００１６】本発明において、発光量標準物質として使
用するイクオリンは、天然由来または組換え体の何れで
もよいが、正確な濃度を決定するという観点から均一で
高純度のものが好ましく、上述の高純度組換えイクオリ
ンがさらに好ましい。
用するイクオリンは、天然由来または組換え体の何れで
もよいが、正確な濃度を決定するという観点から均一で
高純度のものが好ましく、上述の高純度組換えイクオリ
ンがさらに好ましい。
【００１７】また、天然型イクオリンの発光は高濃度カ
ルシウムイオン（最終濃度が０.１mM以上）添加により
数秒間で完了する高速発光反応であり、測定装置におい
て発光をより正確に検出するためには、カルシウムイオ
ンが高濃度であってもゆっくり反応が起きる変異型イク
オリンがより好ましい。そのような変異型イクオリン
は、本出願人の特開昭６３−２９１５９３号公報に記載
されており、天然型イクオリンのアミノ酸配列におい
て、１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残
基の少なくとも１つがセリンに置換されているイクオリ
ン変異体が特に好ましい。
ルシウムイオン（最終濃度が０.１mM以上）添加により
数秒間で完了する高速発光反応であり、測定装置におい
て発光をより正確に検出するためには、カルシウムイオ
ンが高濃度であってもゆっくり反応が起きる変異型イク
オリンがより好ましい。そのような変異型イクオリン
は、本出願人の特開昭６３−２９１５９３号公報に記載
されており、天然型イクオリンのアミノ酸配列におい
て、１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残
基の少なくとも１つがセリンに置換されているイクオリ
ン変異体が特に好ましい。
【００１８】本発明において使用し得る変異型イクオリ
ンは、特に限定しないが公知の遺伝子組換え技術、例え
ば特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の方法によっ
て製造することができる。このようにして得られるイク
オリンの組換え変異体は、天然型イクオリンと同様に発
光量標準物質として使用することができる。
ンは、特に限定しないが公知の遺伝子組換え技術、例え
ば特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の方法によっ
て製造することができる。このようにして得られるイク
オリンの組換え変異体は、天然型イクオリンと同様に発
光量標準物質として使用することができる。
【００１９】また、イクオリンは天然型または変異体と
もに、発光反応後にＥＤＴＡ等のキレート剤で処理する
ことによりアポイクオリンからカルシウムを除去し、還
元剤、セレンテラジン、酸素とともに低温でインキュベ
ーションすることによって再生させて再利用することが
可能である。
もに、発光反応後にＥＤＴＡ等のキレート剤で処理する
ことによりアポイクオリンからカルシウムを除去し、還
元剤、セレンテラジン、酸素とともに低温でインキュベ
ーションすることによって再生させて再利用することが
可能である。
【００２０】本発明において、発光量標準物質としてイ
クオリンを使用するためには、その活性を長期間安定的
に保持させることが重要である。従って、本発明はま
た、イクオリンの安定保存法に関する。高純度イクオリ
ンの活性を維持するためには、使用目的あるいは使用場
所にあわせて以下のような保存方法を採用することが好
ましい。 １．濃度０.１mMのＥＤＴＡを含む１.０Ｍ以上の濃度の
硫酸アンモニウム水溶液中１０℃以下で保存する。この
保存方法の場合、最低２ヶ月は活性の低下が認められな
い。 ２．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム溶液を液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法
の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。 ３．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム水溶液が飽和硫酸アンモニウム水溶液になるように
硫酸アンモニウムを添加することにより高純度イクオリ
ンを塩析沈澱させ、液体チッソ等で凍結させ保存する。
この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められな
い。 ４．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム水溶液に硫酸アンモニウムを徐々に加え、母液が薄
く濁りはじめたら１０℃以下に保持して結晶を析出さ
せ、結晶化したイクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウ
ム水溶液を１０℃以下で保存する。この方法の場合、最
低１ヵ年は活性の低下が認められない。
クオリンを使用するためには、その活性を長期間安定的
に保持させることが重要である。従って、本発明はま
た、イクオリンの安定保存法に関する。高純度イクオリ
ンの活性を維持するためには、使用目的あるいは使用場
所にあわせて以下のような保存方法を採用することが好
ましい。 １．濃度０.１mMのＥＤＴＡを含む１.０Ｍ以上の濃度の
硫酸アンモニウム水溶液中１０℃以下で保存する。この
保存方法の場合、最低２ヶ月は活性の低下が認められな
い。 ２．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム溶液を液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法
の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。 ３．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム水溶液が飽和硫酸アンモニウム水溶液になるように
硫酸アンモニウムを添加することにより高純度イクオリ
ンを塩析沈澱させ、液体チッソ等で凍結させ保存する。
この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められな
い。 ４．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニ
ウム水溶液に硫酸アンモニウムを徐々に加え、母液が薄
く濁りはじめたら１０℃以下に保持して結晶を析出さ
せ、結晶化したイクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウ
ム水溶液を１０℃以下で保存する。この方法の場合、最
低１ヵ年は活性の低下が認められない。
【００２１】イクオリンについて得られた上述の知見か
ら、イクオリンと同様に微量カルシウムイオンの検出等
に使用されているクライチン、オベリン、マイトロコミ
ン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質について
も、発光量標準物質として使用することができる。
ら、イクオリンと同様に微量カルシウムイオンの検出等
に使用されているクライチン、オベリン、マイトロコミ
ン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質について
も、発光量標準物質として使用することができる。
【００２２】イクオリンを発光蛋白質の代表例とし、実
施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に
限定されるものではない。
施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に
限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】実施例１高純度イクオリンの製造 １）組換えアポイクオリンの大腸菌での発現 大腸菌においてアポイクオリンを発現させるために、イ
クオリン遺伝子を包含するｐＡＱ４４０（特開昭６１−
１３５５８６号公報）から構築した、アポイクオリン遺
伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９
７号公報）を用いた。宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を
使用し、常法によりｐｉＰ−ＨＥで該菌株を形質転換し
た。得られた形質転換株を３０℃で一晩培養後、アンピ
シリン（５０μg／ml）を含有する５０mlのＬＢ液体培
地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イ
ーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ
７.２）に植菌し、さらに３０℃で８時間培養した。次
いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２Ｌに添加し、
３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、菌体と
培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離し
た。菌体および培養液はともに発現したアポイクオリン
を含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料
とした。
クオリン遺伝子を包含するｐＡＱ４４０（特開昭６１−
１３５５８６号公報）から構築した、アポイクオリン遺
伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９
７号公報）を用いた。宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を
使用し、常法によりｐｉＰ−ＨＥで該菌株を形質転換し
た。得られた形質転換株を３０℃で一晩培養後、アンピ
シリン（５０μg／ml）を含有する５０mlのＬＢ液体培
地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イ
ーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ
７.２）に植菌し、さらに３０℃で８時間培養した。次
いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２Ｌに添加し、
３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、菌体と
培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離し
た。菌体および培養液はともに発現したアポイクオリン
を含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料
とした。
【００２４】２）菌体からのイクオリンの精製 集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（和
光純薬社製）２００mgを含む４００mlの５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液中に
懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理
して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、
上澄み液を集めた。得られた上澄み液に化学合成したセ
レンテラジンを産生アポイクオリンの１.２倍のモル濃
度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、４℃で
５時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝
液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア
製、直径２cm×１０cm）に添加してイクオリンを吸着さ
せ、カラムから溶液の２８０nmでの吸光度が０.０５以
下になるまで２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴ
Ａ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.６でカラムを洗浄し
た。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオ
リン画分を０.１Ｍ−ＮａＣｌ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直
線濃度勾配で溶出させた。
光純薬社製）２００mgを含む４００mlの５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液中に
懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理
して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、
上澄み液を集めた。得られた上澄み液に化学合成したセ
レンテラジンを産生アポイクオリンの１.２倍のモル濃
度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、４℃で
５時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝
液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア
製、直径２cm×１０cm）に添加してイクオリンを吸着さ
せ、カラムから溶液の２８０nmでの吸光度が０.０５以
下になるまで２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴ
Ａ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.６でカラムを洗浄し
た。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオ
リン画分を０.１Ｍ−ＮａＣｌ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直
線濃度勾配で溶出させた。
【００２５】再生イクオリンと未再生のアポイクオリン
との分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセ
ファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即
ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液
を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２Ｍになるように調
整した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、
その上澄み液を、２Ｍ−硫酸アンモニウムを含有する２
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６
で平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカ
ラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８c
m）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾
配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イ
クオリン画分を収集した。
との分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセ
ファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即
ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液
を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２Ｍになるように調
整した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、
その上澄み液を、２Ｍ−硫酸アンモニウムを含有する２
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６
で平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカ
ラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８c
m）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾
配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イ
クオリン画分を収集した。
【００２６】一方、未再生のアポイクオリンは、２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６での
み溶出された。再生イクオリン画分について、還元状態
で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる分析を行った。その結果、精製画分について
分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出さ
れ、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以
上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％
で、８０mgの高純度イクオリンを得た。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６での
み溶出された。再生イクオリン画分について、還元状態
で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる分析を行った。その結果、精製画分について
分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出さ
れ、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以
上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％
で、８０mgの高純度イクオリンを得た。
【００２７】３）培養液からのイクオリンの精製 培養液からの高純度アポイクオリンの精製は、特開平１
−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。
即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で
放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離
によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶
解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同
様にＱ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファ
ロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、
純度９８％以上のイクオリンを取得した。得られた精製
イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルア
ミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った
結果、分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検
出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８
％以上であった。得られた高純度アポイクオリン５０mg
から高純度イクオリン４５mgを得た。
−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。
即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で
放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離
によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶
解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同
様にＱ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファ
ロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、
純度９８％以上のイクオリンを取得した。得られた精製
イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルア
ミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った
結果、分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検
出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８
％以上であった。得られた高純度アポイクオリン５０mg
から高純度イクオリン４５mgを得た。
【００２８】実施例２イクオリン変異体の製造 大腸菌においてイクオリン変異体を製造するために、特
開昭６１−１３５５８６号公報に記載のｐＡＱ４４０の
代わりに特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の変異
型イクオリン遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、上
述のｐｉＰ−ＨＥと同様に大腸菌においてイクオリン変
異体（本実施例においては代表例として、１４５位、１
５２位および１８０位のシステイン残基が全てセリンに
置換された変異体）を発現させた。次いで、実施例１と
同様に精製した。精製したイクオリン変異体は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示し、その純度は９８
％以上であった。
開昭６１−１３５５８６号公報に記載のｐＡＱ４４０の
代わりに特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の変異
型イクオリン遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、上
述のｐｉＰ−ＨＥと同様に大腸菌においてイクオリン変
異体（本実施例においては代表例として、１４５位、１
５２位および１８０位のシステイン残基が全てセリンに
置換された変異体）を発現させた。次いで、実施例１と
同様に精製した。精製したイクオリン変異体は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示し、その純度は９８
％以上であった。
【００２９】実施例３イクオリンの純度検定およびイクオリンを用いた発光測
定装置の評価 実施例１および２で取得した９８％以上の純度をもつ組
換えイクオリン０.００１μgに高濃度のカルシウム溶液
を添加し、その全発光量を14Ｃの標準溶液により補正さ
れた発光測定装置にて測定し、蛋白質１mgあたりの絶対
発光量を算出した。その結果、得られた絶対発光量は、
実施例１の天然型イクオリン、実施例２の変異体ともに
蛋白質１mgあたり４.８×１０15フォトンであった。ま
た、組換えイクオリン濃度を吸光度法にて測定した結
果、吸収スペクトル２８０nmにおける０.０１％（ｗ／
ｖ）イクオリンの吸光度は０.３０であった。
定装置の評価 実施例１および２で取得した９８％以上の純度をもつ組
換えイクオリン０.００１μgに高濃度のカルシウム溶液
を添加し、その全発光量を14Ｃの標準溶液により補正さ
れた発光測定装置にて測定し、蛋白質１mgあたりの絶対
発光量を算出した。その結果、得られた絶対発光量は、
実施例１の天然型イクオリン、実施例２の変異体ともに
蛋白質１mgあたり４.８×１０15フォトンであった。ま
た、組換えイクオリン濃度を吸光度法にて測定した結
果、吸収スペクトル２８０nmにおける０.０１％（ｗ／
ｖ）イクオリンの吸光度は０.３０であった。
【００３０】次いで、実施例１の組換えイクオリン（１
２pg、６０pg、１２０pg、６００pgまたは１２００pg）
に高濃度カルシウム溶液を添加し、上述の発光測定装置
を用いて、その全発光量を実測値として相対発光量（rl
u）を測定した。また、各々の量の組換えイクオリンに
ついて、絶対発光量を蛋白質１mgあたりの絶対発光量
４.８×１０15フォトンから求めた。そして、下記の式
により、１相対発光量の絶対量を算出した。 １相対発光量の絶対量＝絶対発光量（フォトン）／相対
発光量（rlu） その結果を下記の表に示す。
２pg、６０pg、１２０pg、６００pgまたは１２００pg）
に高濃度カルシウム溶液を添加し、上述の発光測定装置
を用いて、その全発光量を実測値として相対発光量（rl
u）を測定した。また、各々の量の組換えイクオリンに
ついて、絶対発光量を蛋白質１mgあたりの絶対発光量
４.８×１０15フォトンから求めた。そして、下記の式
により、１相対発光量の絶対量を算出した。 １相対発光量の絶対量＝絶対発光量（フォトン）／相対
発光量（rlu） その結果を下記の表に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１の結果から、組換えイクオリンの濃度
と発光量は直線性を示し、絶対発光量から算出した１相
対発光量の絶対量もほぼ一定であった。このようにイク
オリンを用いて相対発光量を絶対発光量に変換すれば、
他のバッチおよび／または他の測定装置で得られた測定
値（相対値）を絶対発光量として評価することができ
る。
と発光量は直線性を示し、絶対発光量から算出した１相
対発光量の絶対量もほぼ一定であった。このようにイク
オリンを用いて相対発光量を絶対発光量に変換すれば、
他のバッチおよび／または他の測定装置で得られた測定
値（相対値）を絶対発光量として評価することができ
る。
【００３３】実施例４ ＜高純度イクオリンの保存試験＞実施例１のブチルセフ
ァロース４ファーストフローカラムクロマト法で得られ
た高純度イクオリン画分について保存試験を行った結果
を下記に示す。 （１）ＥＤＴＡ０.１mMを含む濃度１.０Ｍ以上の硫酸ア
ンモニウム水溶液である実施例１で得られた高純度イク
オリン画分を４℃で保存したところ、２ヶ月を超えても
活性の低下は認められなかった。 （２）前記の高濃度硫酸アンモニウム溶液を含む高純度
イクオリン画分を液体チッソを用い−８０℃で凍結保存
したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認
められなかった。 （３）前記の高純度イクオリン画分に対し硫酸アンモニ
ウム濃度が飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し
て高純度イクオリンを塩析沈殿させ、−８０℃で凍結さ
せて保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の
低下が認められなかった。 （４）前記の高純度イクオリン画分を結晶化のための母
液として、それに硫酸アンモニウムを徐々に加え母液が
薄く濁りはじめたところで温度を下げ５℃に維持して結
晶を析出させた。この結晶化したイクオリンを含む硫酸
アンモニウム水溶液をそのまま５℃で保存したところ、
保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかっ
た。
ァロース４ファーストフローカラムクロマト法で得られ
た高純度イクオリン画分について保存試験を行った結果
を下記に示す。 （１）ＥＤＴＡ０.１mMを含む濃度１.０Ｍ以上の硫酸ア
ンモニウム水溶液である実施例１で得られた高純度イク
オリン画分を４℃で保存したところ、２ヶ月を超えても
活性の低下は認められなかった。 （２）前記の高濃度硫酸アンモニウム溶液を含む高純度
イクオリン画分を液体チッソを用い−８０℃で凍結保存
したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認
められなかった。 （３）前記の高純度イクオリン画分に対し硫酸アンモニ
ウム濃度が飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し
て高純度イクオリンを塩析沈殿させ、−８０℃で凍結さ
せて保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の
低下が認められなかった。 （４）前記の高純度イクオリン画分を結晶化のための母
液として、それに硫酸アンモニウムを徐々に加え母液が
薄く濁りはじめたところで温度を下げ５℃に維持して結
晶を析出させた。この結晶化したイクオリンを含む硫酸
アンモニウム水溶液をそのまま５℃で保存したところ、
保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかっ
た。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、放射性同位元素14Ｃの
代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光
量標準物質が提供される。本発明の発光量標準物質を用
いて発光測定装置の検定を実施すれば、各分析・検査に
おいて絶対発光量を決定することができ、各バッチ間で
のデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られ
るデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一
的に評価管理することが可能である。
代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光
量標準物質が提供される。本発明の発光量標準物質を用
いて発光測定装置の検定を実施すれば、各分析・検査に
おいて絶対発光量を決定することができ、各バッチ間で
のデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られ
るデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一
的に評価管理することが可能である。
【００３５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> チッソ株式会社（CHISSO CORPORATION） <120> 発光量標準物質 <130> DOJ-5403 <160> 1 <210> 1 <211> 189 <212> PRT <213> Aequorea aequorea <400> 1 Val Lys Leu Thr Ser Asp Phe Asp Asn Pro Arg Trp Ile Gly Arg His 16 Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val Asn His Asn Gly Lys Ile Ser 32 Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu 48 Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg His Lys Asp Ala Val Glu Ala 64 Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr Gly Val Glu Thr Asp Trp Pro 80 Ala Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Lys Leu Ala Thr Asp Glu Leu Glu Lys 96 Tyr Ala Lys Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Ile Trp Gly Asp Ala Leu 112 Phe Asp Ile Val Asp Lys Asp Gln Asn Gly Ala Ile Thr Leu Asp Glu 128 Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp 144 Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu 160 Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met 176 Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly Gly Ala Val Pro 189
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 DB07 FB13 GC15 2G054 CA10 CE02 EA02 4B024 AA01 AA05 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 BJ12 CA02 CA19 CC24 CE09 CE11 DA01 DA10 DA13 4H045 AA10 AA30 BA10 BA70 DA89 EA50 FA74 GA23 GA25 GA40 GA45
Claims (7)
- 【請求項１】 発光蛋白質を用いることを特徴とする発
光量標準物質。 - 【請求項２】 発光蛋白質がカルシウム結合型発光蛋白
質である、請求項１に記載の発光量標準物質。 - 【請求項３】 発光蛋白質が、イクオリン、クライチ
ン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベ
ルボインからなる群から選択される天然由来または組換
え蛋白質である、請求項２に記載の発光量標準物質。 - 【請求項４】 発光蛋白質が、そのアミノ酸配列におい
て、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ
れている、請求項３に記載の発光量標準物質。 - 【請求項５】 発光蛋白質が、 （ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を有する蛋白質である、請求項１に記載の発光量標準
物質。 - 【請求項６】 前記発光蛋白質が、その１４５位、１５
２位および１８０位のシステイン残基の少なくとも１つ
がセリンに置換されていることを特徴とする、請求項５
に記載の発光量標準物質。 - 【請求項７】 発光蛋白質を発光量標準物質として用い
る、発光蛋白質の使用方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000084416A JP4501211B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 発光量標準物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000084416A JP4501211B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 発光量標準物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001270899A true JP2001270899A (ja) | 2001-10-02 |
| JP4501211B2 JP4501211B2 (ja) | 2010-07-14 |
Family
ID=18600895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000084416A Expired - Lifetime JP4501211B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 発光量標準物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4501211B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2827292A1 (fr) * | 2001-07-12 | 2003-01-17 | Centre Nat Rech Scient | Photoproteines mutees et leurs applications |
| WO2005014633A1 (ja) * | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Chisso Corporation | 蛍光蛋白質 |
| JP2006308501A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Chisso Corp | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
| JP2008048607A (ja) | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| US7396655B2 (en) | 2005-03-30 | 2008-07-08 | Chisso Corporation | Method for enhancing activity of luciferase with fluorescence activity |
| JP2008283944A (ja) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2015091873A (ja) * | 2015-01-30 | 2015-05-14 | Jnc株式会社 | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
-
2000
- 2000-03-24 JP JP2000084416A patent/JP4501211B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6009043593, 蛋白質 核酸 酵素，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１２（１９８８）ｐ．１９８５−１９９３ * |
| JPN6009043595, ファルマシア，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．３（１９９６）ｐ．２７６−２８０ * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2827292A1 (fr) * | 2001-07-12 | 2003-01-17 | Centre Nat Rech Scient | Photoproteines mutees et leurs applications |
| WO2003006497A3 (fr) * | 2001-07-12 | 2004-01-22 | Centre Nat Rech Scient | Photoprotéines mutees et leurs applications |
| WO2005014633A1 (ja) * | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Chisso Corporation | 蛍光蛋白質 |
| JP4770462B2 (ja) * | 2003-08-12 | 2011-09-14 | Ｊｎｃ株式会社 | 蛍光蛋白質 |
| US8710195B2 (en) | 2003-08-12 | 2014-04-29 | Jnc Corporation | Fluorescent proteins |
| US7396655B2 (en) | 2005-03-30 | 2008-07-08 | Chisso Corporation | Method for enhancing activity of luciferase with fluorescence activity |
| JP2006308501A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Chisso Corp | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
| JP4609177B2 (ja) * | 2005-04-28 | 2011-01-12 | チッソ株式会社 | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
| US9678067B2 (en) | 2005-04-28 | 2017-06-13 | Jnc Corporation | Method for extending light-emitting time of calcium-binding photoprotein solution |
| JP2008048607A (ja) | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2008283944A (ja) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2015091873A (ja) * | 2015-01-30 | 2015-05-14 | Jnc株式会社 | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4501211B2 (ja) | 2010-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Weber et al. | High level expression in Escherichia coli and characterization of the EF-hand calcium-binding protein caltractin. | |
| Fisher et al. | The 1.5-Å resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions | |
| Mohr et al. | Binding of small acid-soluble spore proteins from Bacillus subtilis changes the conformation of DNA from B to A. | |
| Kendall et al. | Engineering the Ca2+-activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium | |
| Arechaga et al. | Cysteine residues are not essential for uncoupling protein function | |
| US9678067B2 (en) | Method for extending light-emitting time of calcium-binding photoprotein solution | |
| JP2001270899A (ja) | 発光量標準物質 | |
| Barth et al. | Magnetic circular dichroism studies. XVII. Magnetic circular dichroism spectra of proteins. New method for the quantitative determination of tryptophan | |
| Borisova et al. | Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay | |
| Hromić-Jahjefendić et al. | A novel Porphyromonas gingivalis enzyme: An atypical dipeptidyl peptidase III with an ARM repeat domain | |
| Parsons et al. | A comparison of the L-arabinose-and D-galactose-binding proteins of Escherichia coli B/r | |
| Beddoe et al. | The production, purification and crystallization of a pocilloporin pigment from a reef-forming coral | |
| JP2013231037A (ja) | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 | |
| DeGrazia et al. | Investigation of the cAMP receptor protein secondary structure by Raman spectroscopy | |
| Highsmith et al. | High-affinity and low-affinity vanadate binding to sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Inouye et al. | High-level expression and purification of apoaequorin | |
| Sayers et al. | Cloning and expression of Saccharomyces cerevisiae copper‐metallothionein gene in Escherichia coli and characterization of the recombinant protein | |
| Sakato-Antoku et al. | Outer-arm dynein light chain LC1 is required for normal motor assembly kinetics, ciliary stability, and motility | |
| JPWO2020071229A1 (ja) | エンドトキシン測定剤の感度の増強方法 | |
| Devedjiev et al. | X-ray structure at 1.76 Å resolution of a polypeptide phospholipase A2 inhibitor | |
| Tonan et al. | Conformations of isolated fragments of pancreatic polypeptide | |
| US7241864B2 (en) | Recombinant photoproteins and their conjugates | |
| JP4039722B2 (ja) | 複合因子測定試薬 | |
| Skelly et al. | Conformational effects of nucleotide exchange in ras p21 proteins as studied by fluorescence spectroscopy | |
| JP7397343B2 (ja) | エンドトキシンの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061025 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090901 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091028 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20091028 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091124 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100224 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100308 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100330 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100412 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4501211 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140430 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |