JP2001252100A - 核酸の分別手段 - Google Patents
核酸の分別手段Info
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- nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸を含有する試料から煩雑な操作をすること
なく、短時間で核酸を分別する手段を提供すること。 【解決手段】ポリアニオン性物質の存在下で、各種の担
体に核酸を効率良く吸着させ、かつ低濃度の緩衝液を用
いて吸着した核酸を溶出することにより、短時間で簡便
な核酸の分別を可能とした。
なく、短時間で核酸を分別する手段を提供すること。 【解決手段】ポリアニオン性物質の存在下で、各種の担
体に核酸を効率良く吸着させ、かつ低濃度の緩衝液を用
いて吸着した核酸を溶出することにより、短時間で簡便
な核酸の分別を可能とした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の精製および
測定に使用しうる核酸の分別手段に関する。さらに詳し
くは、核酸を含有する試料から、ポリアニオン性物質の
存在下で核酸結合能を有する固相担体を用い、煩雑な操
作をすることなく、短時間で核酸を分別する手段および
該手段を用いる核酸の精製方法、核酸の測定方法、およ
び核酸の測定用キットに関する。該測定用キットは自動
核酸抽出装置にも応用しうる。
測定に使用しうる核酸の分別手段に関する。さらに詳し
くは、核酸を含有する試料から、ポリアニオン性物質の
存在下で核酸結合能を有する固相担体を用い、煩雑な操
作をすることなく、短時間で核酸を分別する手段および
該手段を用いる核酸の精製方法、核酸の測定方法、およ
び核酸の測定用キットに関する。該測定用キットは自動
核酸抽出装置にも応用しうる。
【０００２】
【従来の技術】核酸を含有する試料から核酸を抽出精製
する方法は、遺伝子工学や臨床診断の分野において不可
欠である。例えば、ある核酸を解析するにあたっては、
核酸を含有する生物試料からＤＮＡもしくはＲＮＡを抽
出精製する必要がある。また、感染症の診断において
も、細菌やウイルスからＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出し
た後、検出することが一般的である。
する方法は、遺伝子工学や臨床診断の分野において不可
欠である。例えば、ある核酸を解析するにあたっては、
核酸を含有する生物試料からＤＮＡもしくはＲＮＡを抽
出精製する必要がある。また、感染症の診断において
も、細菌やウイルスからＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出し
た後、検出することが一般的である。
【０００３】生物試料においては一般的に、ＤＮＡやＲ
ＮＡといった核酸は、蛋白質、脂質、糖から構成される
細胞膜や細胞壁などの殻の中に存在しており、また核酸
は遊離した状態で存在しているのではなく、蛋白質と複
合体を形成している。このため核酸を含有する生物試料
から核酸を抽出精製する場合には、プロテアーゼによる
酵素処理や界面活性剤などを用いた変性処理、また、超
音波処理や熱処理により核酸を遊離させた後、フェノー
ルやクロロホルムといった有機溶媒による抽出操作や塩
化セシウムを用いた超遠心分離等により核酸を精製する
必要があり、これらの手法は、遺伝子工学や臨床診断の
分野において、用いる核酸の用途によって組み合わさ
れ、至適化されているのが現状である。
ＮＡといった核酸は、蛋白質、脂質、糖から構成される
細胞膜や細胞壁などの殻の中に存在しており、また核酸
は遊離した状態で存在しているのではなく、蛋白質と複
合体を形成している。このため核酸を含有する生物試料
から核酸を抽出精製する場合には、プロテアーゼによる
酵素処理や界面活性剤などを用いた変性処理、また、超
音波処理や熱処理により核酸を遊離させた後、フェノー
ルやクロロホルムといった有機溶媒による抽出操作や塩
化セシウムを用いた超遠心分離等により核酸を精製する
必要があり、これらの手法は、遺伝子工学や臨床診断の
分野において、用いる核酸の用途によって組み合わさ
れ、至適化されているのが現状である。
【０００４】上記有機溶媒による抽出操作は、時間を要
し煩雑な遠心操作を必要とし、また塩化セシウムを用い
た超遠心操作も同様に時間を要し、脱塩も必要であり、
コストがかかるという問題がある。
し煩雑な遠心操作を必要とし、また塩化セシウムを用い
た超遠心操作も同様に時間を要し、脱塩も必要であり、
コストがかかるという問題がある。
【０００５】一方、簡便な核酸抽出精製方法として、超
常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子を用いる方法が
ある（特開平９−１９２９２号公報）。この方法は核酸
を含有する生物試料から遠心操作を行わずに非特異的に
核酸を吸着させ、水またはＴＥバッファーなど低濃度の
緩衝液を用いて磁性シリカ粒子から吸着した核酸を溶出
後直ちに解析できるといった利点を持つ。しかし、カオ
トロピック物質によりイオン強度を高められた状態で核
酸を吸着しうる磁性粒子は磁性シリカ粒子のみであり、
市販されている一般的な磁性粒子、例えば、カルボキシ
ル基やカルボキシル基にシラノール基が導入された官能
基を持つ磁性粒子はカオトロピック物質によりイオン強
度を高めた状態では核酸を吸着させることはできない。
常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子を用いる方法が
ある（特開平９−１９２９２号公報）。この方法は核酸
を含有する生物試料から遠心操作を行わずに非特異的に
核酸を吸着させ、水またはＴＥバッファーなど低濃度の
緩衝液を用いて磁性シリカ粒子から吸着した核酸を溶出
後直ちに解析できるといった利点を持つ。しかし、カオ
トロピック物質によりイオン強度を高められた状態で核
酸を吸着しうる磁性粒子は磁性シリカ粒子のみであり、
市販されている一般的な磁性粒子、例えば、カルボキシ
ル基やカルボキシル基にシラノール基が導入された官能
基を持つ磁性粒子はカオトロピック物質によりイオン強
度を高めた状態では核酸を吸着させることはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従前
の技術が有する上記問題点を解決することであり、核酸
を含有する試料から煩雑な操作をすることなく、短時間
で核酸を分別する手段を提供することである。
の技術が有する上記問題点を解決することであり、核酸
を含有する試料から煩雑な操作をすることなく、短時間
で核酸を分別する手段を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に鋭意検討した結果、適当なポリアニオン性物質を用い
ることにより、上記のようにシリカでコーティングされ
たもののみでなく、例えばカルボキシル基やカルボキシ
ル基にシラノール基が導入された担体にも核酸が効率良
く吸着し、ＴＥバッファーなど低濃度の緩衝液を用いて
吸着した核酸を溶出できることを見出し本発明を完成さ
せた。
に鋭意検討した結果、適当なポリアニオン性物質を用い
ることにより、上記のようにシリカでコーティングされ
たもののみでなく、例えばカルボキシル基やカルボキシ
ル基にシラノール基が導入された担体にも核酸が効率良
く吸着し、ＴＥバッファーなど低濃度の緩衝液を用いて
吸着した核酸を溶出できることを見出し本発明を完成さ
せた。
【０００８】すなわち、本発明は、核酸を含有する試料
から、核酸結合能を有する固相担体を使用することによ
って、核酸を分別するに際して、ポリアニオン性物質を
液相に存在させることを特徴とする核酸の分別手段であ
る。別の本発明は、この分別手段を利用した核酸の精製
方法であり、核酸の測定方法である。さらに別の本発明
は、これら手段に使用される試薬を含む、核酸の測定用
キットである。
から、核酸結合能を有する固相担体を使用することによ
って、核酸を分別するに際して、ポリアニオン性物質を
液相に存在させることを特徴とする核酸の分別手段であ
る。別の本発明は、この分別手段を利用した核酸の精製
方法であり、核酸の測定方法である。さらに別の本発明
は、これら手段に使用される試薬を含む、核酸の測定用
キットである。
【０００９】本発明の分別手段は、下記のような工程か
らなる； （ａ）核酸を含有する試料に、ポリアニオン性物質溶液
および核酸結合能を有する固相担体を添加混合し、核酸
を核酸結合能を有する固相担体上に結合させる、（ｂ）
（ａ）工程における核酸−固相担体の複合体を洗浄液に
より洗浄する、（ｃ）（ｂ）工程にて洗浄した核酸−固
相担体複合体から用途に応じて、核酸を溶出させる。
らなる； （ａ）核酸を含有する試料に、ポリアニオン性物質溶液
および核酸結合能を有する固相担体を添加混合し、核酸
を核酸結合能を有する固相担体上に結合させる、（ｂ）
（ａ）工程における核酸−固相担体の複合体を洗浄液に
より洗浄する、（ｃ）（ｂ）工程にて洗浄した核酸−固
相担体複合体から用途に応じて、核酸を溶出させる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において核酸とは、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡを含みプラスミドＤＮＡであってもよい。そ
の長さは格別限定されないが、塩基配列として、好まし
くは８個以上のものが適当である。
Ａ、ＲＮＡを含みプラスミドＤＮＡであってもよい。そ
の長さは格別限定されないが、塩基配列として、好まし
くは８個以上のものが適当である。
【００１１】また、本発明に用いられる核酸を含有する
試料としては、核酸を含有するものであれば特に限定さ
れないが、ＰＣＲ産物、生物試料を例示することができ
る。生物試料とは生物に由来する試料を意味し、全血、
血漿、血清、骨髄、バッフィーコート、尿、体液、唾
液、鼻汁、涙液、糞便由来物、細胞培養物、細胞溶解
物、培養培地等のような核酸を含有する可能性ある生物
試料を例示することができる。
試料としては、核酸を含有するものであれば特に限定さ
れないが、ＰＣＲ産物、生物試料を例示することができ
る。生物試料とは生物に由来する試料を意味し、全血、
血漿、血清、骨髄、バッフィーコート、尿、体液、唾
液、鼻汁、涙液、糞便由来物、細胞培養物、細胞溶解
物、培養培地等のような核酸を含有する可能性ある生物
試料を例示することができる。
【００１２】また必要に応じて例えば生物試料をあらか
じめ溶解し核酸を抽出してもよい。生体試料からの核酸
の溶出・抽出方法としては、溶解液を加え、細胞を溶解
させ、有機溶媒を加えて核酸を抽出させる方法が例示さ
れる。
じめ溶解し核酸を抽出してもよい。生体試料からの核酸
の溶出・抽出方法としては、溶解液を加え、細胞を溶解
させ、有機溶媒を加えて核酸を抽出させる方法が例示さ
れる。
【００１３】生体試料からの核酸の溶出に用いられる溶
解液は、プロテアーゼが含まれることが好ましく、プロ
テアーゼとしては細胞膜の破壊や生物試料中に含まれる
蛋白質を分解するものであれば特に限定されない。具体
的には、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ等が挙げられ、
これらのうち、プロテイナーゼＫが好ましく用いられ
る。その使用濃度としては、０．１〜１０００Ｕ／ｍＬ
の範囲で使用するのが好ましい。また緩衝液を溶解液に
含有させることも可能で、ｐＨ６〜１２の範囲が好適で
ある。この緩衝剤としては、一般に使用されているもの
であれば特に限定されるものではないが、ｐＨ６〜１２
の範囲のいずれかのｐＨにおいて緩衝能を持つものが望
ましく、例えば、１，３ビス［トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミノ］プロパン、トリス［ヒドロキシメチ
ル］アミノメタン等が挙げられ、その使用濃度として
は、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨは６〜１２の範囲が
好ましい。
解液は、プロテアーゼが含まれることが好ましく、プロ
テアーゼとしては細胞膜の破壊や生物試料中に含まれる
蛋白質を分解するものであれば特に限定されない。具体
的には、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ等が挙げられ、
これらのうち、プロテイナーゼＫが好ましく用いられ
る。その使用濃度としては、０．１〜１０００Ｕ／ｍＬ
の範囲で使用するのが好ましい。また緩衝液を溶解液に
含有させることも可能で、ｐＨ６〜１２の範囲が好適で
ある。この緩衝剤としては、一般に使用されているもの
であれば特に限定されるものではないが、ｐＨ６〜１２
の範囲のいずれかのｐＨにおいて緩衝能を持つものが望
ましく、例えば、１，３ビス［トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミノ］プロパン、トリス［ヒドロキシメチ
ル］アミノメタン等が挙げられ、その使用濃度として
は、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨは６〜１２の範囲が
好ましい。
【００１４】さらに本発明に用いられる有機溶媒は、核
酸の核酸結合能を有する固相担体への結合を妨げるもの
でなければ特に限定されない。本発明に用いられる有機
溶媒の具体例としては、水飽和フェノール、緩衝液飽和
フェノール、クロロホルム等が挙げられる。これらのう
ち、水飽和フェノールまたは緩衝液飽和フェノール、あ
るいはこれらの飽和フェノールとクロロホルムを適当な
割合で混合したものが好ましい。
酸の核酸結合能を有する固相担体への結合を妨げるもの
でなければ特に限定されない。本発明に用いられる有機
溶媒の具体例としては、水飽和フェノール、緩衝液飽和
フェノール、クロロホルム等が挙げられる。これらのう
ち、水飽和フェノールまたは緩衝液飽和フェノール、あ
るいはこれらの飽和フェノールとクロロホルムを適当な
割合で混合したものが好ましい。
【００１５】また、核酸の溶解・抽出操作時に塩化ナト
リウム、ＳＤＳ、グリコーゲン等を適宜用いてもよい。
リウム、ＳＤＳ、グリコーゲン等を適宜用いてもよい。
【００１６】本発明は、上記核酸を含有する試料から、
核酸結合能を有する固相担体を使用することによって、
核酸を分別するに際し、ポリアニオン性物質を液相に存
在させることを特徴とする核酸の分別手段である。本発
明による核酸の分別手段は、（ａ）吸着工程、（ｂ）洗
浄工程、（ｃ）溶出工程の３段階に大きく分けられる。
核酸結合能を有する固相担体を使用することによって、
核酸を分別するに際し、ポリアニオン性物質を液相に存
在させることを特徴とする核酸の分別手段である。本発
明による核酸の分別手段は、（ａ）吸着工程、（ｂ）洗
浄工程、（ｃ）溶出工程の３段階に大きく分けられる。
【００１７】（ａ）吸着工程 この工程では、核酸を含有する試料に、ポリアニオン性
物質溶液および核酸結合能を有する固相担体を添加、混
合し、核酸を核酸結合能を有する固相担体に吸着させ
る。
物質溶液および核酸結合能を有する固相担体を添加、混
合し、核酸を核酸結合能を有する固相担体に吸着させ
る。
【００１８】本発明に用いられるポリアニオン性物質
は、核酸と固相担体との親和性を高めるポリアニオン性
物質が含まれる。ポリアニオン性物質は、核酸の核酸結
合能を有する固相担体への吸着を促進するものと推察さ
れる。ポリアニオン性物質としては、多価陰イオン性の
物質であって核酸と固相担体との親和性を高めるもので
あれば特に限定されないが、その具体例としてデキスト
ラン硫酸、リンタングステン酸マグネシウム、ヘパリ
ン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫
酸などが挙げられる。これらのうち、デキストラン硫酸
が好ましく用いられ、その分子量は５００〜５００，０
００、その使用濃度としては０．５〜３０％の範囲が好
ましい。
は、核酸と固相担体との親和性を高めるポリアニオン性
物質が含まれる。ポリアニオン性物質は、核酸の核酸結
合能を有する固相担体への吸着を促進するものと推察さ
れる。ポリアニオン性物質としては、多価陰イオン性の
物質であって核酸と固相担体との親和性を高めるもので
あれば特に限定されないが、その具体例としてデキスト
ラン硫酸、リンタングステン酸マグネシウム、ヘパリ
ン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫
酸などが挙げられる。これらのうち、デキストラン硫酸
が好ましく用いられ、その分子量は５００〜５００，０
００、その使用濃度としては０．５〜３０％の範囲が好
ましい。
【００１９】本発明に用いられるポリアニオン性物質溶
液には、イオン強度を上げるために塩を添加しており、
ポリアニオン性物質の作用を促進するものと推察され
る。用いられる塩の具体例としては、塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられるが、
イオン強度を上げるものであれば特に限定されない。こ
れらのうち、塩化ナトリウムが好ましく用いられ、その
使用濃度としては、０．０１〜３ｍｏｌ／Ｌの範囲が好
ましい。
液には、イオン強度を上げるために塩を添加しており、
ポリアニオン性物質の作用を促進するものと推察され
る。用いられる塩の具体例としては、塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられるが、
イオン強度を上げるものであれば特に限定されない。こ
れらのうち、塩化ナトリウムが好ましく用いられ、その
使用濃度としては、０．０１〜３ｍｏｌ／Ｌの範囲が好
ましい。
【００２０】本発明において用いられる核酸結合能を有
する固相担体としては、ポリアニオン性物質の存在下で
核酸を吸着保持しうる固体であれば、特に限定されな
い。具体的には、二酸化ケイ素、すなわちシリカが好ま
しく用いられる。また、シリカから構成される担体であ
るガラス、ケイソウ土、あるいはこれらを化学的修飾に
より表面処理を施したものや、さらに超常磁性金属酸化
物等の他の物質との複合体も含まれる。さらにカルボキ
シル基やシラノール基およびこれらの組み合わせからな
る官能基で表面を修飾したものや、さらに超常磁性金属
酸化物等の他の物質との複合体も含まれる。これらのう
ち、吸着と溶出の効率を考えると、固相担体は粒子であ
ることが好ましく、その大きさとしては０．０５〜１０
μｍの範囲が好ましい。
する固相担体としては、ポリアニオン性物質の存在下で
核酸を吸着保持しうる固体であれば、特に限定されな
い。具体的には、二酸化ケイ素、すなわちシリカが好ま
しく用いられる。また、シリカから構成される担体であ
るガラス、ケイソウ土、あるいはこれらを化学的修飾に
より表面処理を施したものや、さらに超常磁性金属酸化
物等の他の物質との複合体も含まれる。さらにカルボキ
シル基やシラノール基およびこれらの組み合わせからな
る官能基で表面を修飾したものや、さらに超常磁性金属
酸化物等の他の物質との複合体も含まれる。これらのう
ち、吸着と溶出の効率を考えると、固相担体は粒子であ
ることが好ましく、その大きさとしては０．０５〜１０
μｍの範囲が好ましい。
【００２１】本発明においては、上記溶解液以外の、有
機溶媒からなる抽出液、ポリアニオン性物質溶液、核酸
結合能を有する固相担体を別々に添加しても、あるいは
同時に添加してもよい。
機溶媒からなる抽出液、ポリアニオン性物質溶液、核酸
結合能を有する固相担体を別々に添加しても、あるいは
同時に添加してもよい。
【００２２】（ｂ）洗浄工程 この工程は、溶解液、有機溶媒、および核酸結合能を有
する固相担体の混合物から、核酸が吸着した核酸結合能
を有する固相担体のみを分離・洗浄する工程である。こ
の時、洗浄液を使用して１〜３回程度、繰り返し洗浄す
るのが好ましい。
する固相担体の混合物から、核酸が吸着した核酸結合能
を有する固相担体のみを分離・洗浄する工程である。こ
の時、洗浄液を使用して１〜３回程度、繰り返し洗浄す
るのが好ましい。
【００２３】本発明における核酸結合能を有する固相担
体の分離のための具体的な手段は、使用する固相担体の
形態により異なり、例えば核酸結合能を有する固相担体
の場合には、遠心分離、ろ過等が好ましく、超常磁性金
属酸化物を含ませておいたものを固相担体として使用す
る場合には、磁石等を用いて簡便な磁力による分離が可
能となり、より好ましい。
体の分離のための具体的な手段は、使用する固相担体の
形態により異なり、例えば核酸結合能を有する固相担体
の場合には、遠心分離、ろ過等が好ましく、超常磁性金
属酸化物を含ませておいたものを固相担体として使用す
る場合には、磁石等を用いて簡便な磁力による分離が可
能となり、より好ましい。
【００２４】本発明において用いられる洗浄液として
は、固相担体に保持された核酸の遊離を妨げるものや蛋
白質の固相担体への吸着を妨げるものであれば、特に限
定されない。具体的には、０．５〜２．５ｍｏｌ／Ｌ塩
化ナトリウム溶液あるいは４０〜１００％エタノールで
洗浄することが好ましい。
は、固相担体に保持された核酸の遊離を妨げるものや蛋
白質の固相担体への吸着を妨げるものであれば、特に限
定されない。具体的には、０．５〜２．５ｍｏｌ／Ｌ塩
化ナトリウム溶液あるいは４０〜１００％エタノールで
洗浄することが好ましい。
【００２５】（ｃ）溶出工程 この工程は核酸が吸着した核酸結合能を有する固相担体
から核酸を溶出させる工程であり、本発明に用いられる
溶出液としては固相からの核酸の溶出を促進するもので
あれば、特に限定されない。具体的には、水あるいはＴ
Ｅバッファー［１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液、１
ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］が好ましい。こ
の時回収した核酸は透析やエタノール沈殿等の脱塩、濃
縮操作を施すことなく、制限酵素や核酸ポリメラーゼ等
を使用した酵素反応に直接使用することができる。
から核酸を溶出させる工程であり、本発明に用いられる
溶出液としては固相からの核酸の溶出を促進するもので
あれば、特に限定されない。具体的には、水あるいはＴ
Ｅバッファー［１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液、１
ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］が好ましい。こ
の時回収した核酸は透析やエタノール沈殿等の脱塩、濃
縮操作を施すことなく、制限酵素や核酸ポリメラーゼ等
を使用した酵素反応に直接使用することができる。
【００２６】上記のように、本発明による核酸の分別手
段は、単純な工程から構成されるため、核酸抽出精製キ
ットならびに固相担体の分離操作や試薬分注操作を自動
化した核酸抽出装置へ、容易に応用しうることは明らか
である。
段は、単純な工程から構成されるため、核酸抽出精製キ
ットならびに固相担体の分離操作や試薬分注操作を自動
化した核酸抽出装置へ、容易に応用しうることは明らか
である。
【００２７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００２８】実施例１ 血清に添加したＤＮＡの回収 （１）ＤＮＡ抽出材料の調製 λ−ＤＮＡ（宝酒造 社製）１μｇを秤取し、血清に加
え、１μｇ／２００μＬとなるように調製し、ＤＮＡ抽
出材料とした。
え、１μｇ／２００μＬとなるように調製し、ＤＮＡ抽
出材料とした。
【００２９】（２）λ−ＤＮＡの抽出精製 上記（１）にて調製した２００μＬのＤＮＡ抽出材料を
３本の２ｍＬのマイクロチューブに取り、それぞれに２
００μＬの溶解液［５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス（ヒドロキ
シル）アミノメタン−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍｍｏｌ
／Ｌ ＥＤＴＡ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％
ＳＤＳ、２０μｇ／ｍＬグリコーゲン、１２０Ｕ／ｍＬ
プロテイナーゼＫ］を加え、ボルテックスミキサーで混
合し、５６℃で３０分間加温した。加温後、４００μＬ
のＴＥバッファー飽和フェノール／クロロホルムをそれ
ぞれのチューブに加え、激しく攪拌した。
３本の２ｍＬのマイクロチューブに取り、それぞれに２
００μＬの溶解液［５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス（ヒドロキ
シル）アミノメタン−塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍｍｏｌ
／Ｌ ＥＤＴＡ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％
ＳＤＳ、２０μｇ／ｍＬグリコーゲン、１２０Ｕ／ｍＬ
プロテイナーゼＫ］を加え、ボルテックスミキサーで混
合し、５６℃で３０分間加温した。加温後、４００μＬ
のＴＥバッファー飽和フェノール／クロロホルムをそれ
ぞれのチューブに加え、激しく攪拌した。
【００３０】これらに８００μＬのポリアニオン性物質
溶液［２０％デキストラン硫酸（平均分子量５０００、
シグマ社製）、２．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ］を加えて
混合し、４０μＬの異なる種類の０．１ｇ／ｍＬ磁性粒
子［（平均粒径３μｍ、四三酸化鉄１５％含有、比表面
積０．１７ｍ２／ｇ、官能基 Ｃ３ＣＯＯＨ；ＳｉＯ ２
…ＳｉＯＨ：ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製 ｍｉｃｒｏｍｅｒ
−Ｍ）、（平均粒径６．１７μｍ、四三酸化鉄粒子４３
％含有、比表面積１５９ｍ２／ｇ、細孔容積２７９ｍｍ
３／ｇ、表面細孔直径３．２ｎｍ：他磁性粒子１・
２）］をチューブに加え、室温で１０分間混合した。
溶液［２０％デキストラン硫酸（平均分子量５０００、
シグマ社製）、２．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ］を加えて
混合し、４０μＬの異なる種類の０．１ｇ／ｍＬ磁性粒
子［（平均粒径３μｍ、四三酸化鉄１５％含有、比表面
積０．１７ｍ２／ｇ、官能基 Ｃ３ＣＯＯＨ；ＳｉＯ ２
…ＳｉＯＨ：ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製 ｍｉｃｒｏｍｅｒ
−Ｍ）、（平均粒径６．１７μｍ、四三酸化鉄粒子４３
％含有、比表面積１５９ｍ２／ｇ、細孔容積２７９ｍｍ
３／ｇ、表面細孔直径３．２ｎｍ：他磁性粒子１・
２）］をチューブに加え、室温で１０分間混合した。
【００３１】次にチューブを磁気スタンドに設置して、
磁性粒子をチューブ壁に集め、上清を除いた。磁気スタ
ンドからチューブを外した後、さらに１ｍＬの洗浄液
［７０％エタノール］を加えて、ボルテックスミキサー
を用い、十分に混和した。同様に磁気スタンドにチュー
ブを置き、上清を除き、この洗浄操作を２回繰り返し
た。上清を除いた後、マイクロチューブを５６℃にセッ
トしたヒートブロックに置き、１０分間放置することに
よりチューブ内のエタノールを蒸発させ、取り除き、粒
子を乾燥させた。これに５０μＬの滅菌水を添加し、５
６℃で１０分間混合した後、磁気スタンドに置いて磁性
粒子を集め、上清を回収した。
磁性粒子をチューブ壁に集め、上清を除いた。磁気スタ
ンドからチューブを外した後、さらに１ｍＬの洗浄液
［７０％エタノール］を加えて、ボルテックスミキサー
を用い、十分に混和した。同様に磁気スタンドにチュー
ブを置き、上清を除き、この洗浄操作を２回繰り返し
た。上清を除いた後、マイクロチューブを５６℃にセッ
トしたヒートブロックに置き、１０分間放置することに
よりチューブ内のエタノールを蒸発させ、取り除き、粒
子を乾燥させた。これに５０μＬの滅菌水を添加し、５
６℃で１０分間混合した後、磁気スタンドに置いて磁性
粒子を集め、上清を回収した。
【００３２】３種の磁性粒子を用いた回収液のうち、そ
れぞれ５μＬを１．０％アガロースゲルにアプライし、
１００Ｖ、４０分間電気泳動を行った後、エチジウムブ
ロマイド染色し、蛍光バイオイメージアナライザー［Ｆ
ＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩＭｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ：宝酒
造社製］で検出した結果を図１に示す。
れぞれ５μＬを１．０％アガロースゲルにアプライし、
１００Ｖ、４０分間電気泳動を行った後、エチジウムブ
ロマイド染色し、蛍光バイオイメージアナライザー［Ｆ
ＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩＭｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ：宝酒
造社製］で検出した結果を図１に示す。
【００３３】（３）回収したλ−ＤＮＡの制限酵素消化 上記（２）λ−ＤＮＡの抽出精製において得られた回収
液のうち１０μＬを取り、３μＬの１０×Ｍバッファー
［１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１
００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ
ｌ］、１μＬの１５Ｕ／μＬのＨｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒
造社製）ならびに滅菌水を加え全量を３０μＬとし、３
７℃で１６時間放置した結果、本発明による分別手段に
て抽出精製されたλ−ＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩによって完全に切断されており、直ちに、制限酵素
消化に使用できることが確認できた。
液のうち１０μＬを取り、３μＬの１０×Ｍバッファー
［１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１
００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ
ｌ］、１μＬの１５Ｕ／μＬのＨｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒
造社製）ならびに滅菌水を加え全量を３０μＬとし、３
７℃で１６時間放置した結果、本発明による分別手段に
て抽出精製されたλ−ＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩによって完全に切断されており、直ちに、制限酵素
消化に使用できることが確認できた。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、ポリアニオン性物質存
在下で核酸結合能を有する固相担体を使用することによ
り、核酸を含有する試料から核酸を吸着させ、さらに適
当な溶出液を使用することにより、煩雑な操作をするこ
となく、短時間で核酸を分別することができる。
在下で核酸結合能を有する固相担体を使用することによ
り、核酸を含有する試料から核酸を吸着させ、さらに適
当な溶出液を使用することにより、煩雑な操作をするこ
となく、短時間で核酸を分別することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 λ−ＤＮＡを添加した血清から、ポリアニオ
ン性物質存在下で磁性粒子によりλ−ＤＮＡが回収され
たことを示す図である（実施例１）。図中、レーン１：
λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩマーカー、レーン２：磁性粒子ｍ
ｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ（３μｍ）による回収１、レーン
３：磁性粒子ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ（３μｍ）による回
収２、レーン４：他磁性粒子１による回収１、レーン
５：他磁性粒子１による回収２、レーン６：他磁性粒子
２による回収１、レーン７：他磁性粒子２による回収
２。回収１、２は、各磁性粒子について、同様のλ−Ｄ
ＮＡ回収実験を２回行い、それぞれの結果を示してい
る。
ン性物質存在下で磁性粒子によりλ−ＤＮＡが回収され
たことを示す図である（実施例１）。図中、レーン１：
λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩマーカー、レーン２：磁性粒子ｍ
ｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ（３μｍ）による回収１、レーン
３：磁性粒子ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ（３μｍ）による回
収２、レーン４：他磁性粒子１による回収１、レーン
５：他磁性粒子１による回収２、レーン６：他磁性粒子
２による回収１、レーン７：他磁性粒子２による回収
２。回収１、２は、各磁性粒子について、同様のλ−Ｄ
ＮＡ回収実験を２回行い、それぞれの結果を示してい
る。
Claims (11)
- 【請求項１】 核酸を含有する試料から、核酸結合能を
有する固相担体を使用することによって、核酸を分別す
るに際して、ポリアニオン性物質を液相に存在させるこ
とを特徴とする核酸の分別手段。 - 【請求項２】 ポリアニオン性物質が、核酸と固相担体
との親和性を高める機能を有する請求項１記載の核酸の
分別手段。 - 【請求項３】 ポリアニオン性物質が、デキストラン硫
酸、リンタングステン酸マグネシウム、ヘパリン、コン
ドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸から選
択される少なくとも１の化合物を含むことを特徴とする
請求項２記載の核酸の分別手段。 - 【請求項４】 核酸結合能を有する固相担体が、ポリア
ニオン性物質の存在下で核酸を吸着しうる機能を持つ固
相担体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核
酸の分別手段。 - 【請求項５】 核酸結合能を有する固相担体が、シリカ
を含む担体又は、表面にカルボキシル基、シラノール基
もしくはその組み合わせからなる官能基を修飾した担体
である請求項４記載の核酸の分別手段。 - 【請求項６】 核酸結合能を有する固相担体が、超常磁
性金属酸化物を含む請求項４又は５に記載の核酸の分別
手段。 - 【請求項７】 磁力を利用することにより核酸結合能を
有する固相担体と液相を分離する工程を含む請求項６記
載の核酸の分別手段。 - 【請求項８】 核酸結合能を有する固相担体が、粒子で
ある請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸の分別手
段。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の手
段が、核酸の精製において利用される核酸の精製方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
手段が、核酸の測定において利用される核酸の測定方
法。 - 【請求項１１】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
手段に使用される試薬を含む、核酸の測定用キット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000065486A JP4519247B2 (ja) | 2000-03-09 | 2000-03-09 | 核酸の抽出精製用試薬 |
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| JP2000065486A JP4519247B2 (ja) | 2000-03-09 | 2000-03-09 | 核酸の抽出精製用試薬 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001252100A true JP2001252100A (ja) | 2001-09-18 |
| JP2001252100A5 JP2001252100A5 (ja) | 2007-04-19 |
| JP4519247B2 JP4519247B2 (ja) | 2010-08-04 |
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| JP (1) | JP4519247B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007529229A (ja) * | 2004-03-18 | 2007-10-25 | アンビオン インコーポレーティッド | 核酸精製のための固相支持体として修飾された表面 |
| JP2011524360A (ja) * | 2008-06-13 | 2011-09-01 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | Ｒｎａ単離のための細胞溶解試薬 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01502319A (ja) * | 1987-03-02 | 1989-08-17 | ジエン―プローブ・インコーポレイテツド | 核酸精製、分離及びハイブリダイゼーション用ポリカチオン性支持体 |
| JPH10506991A (ja) * | 1994-09-30 | 1998-07-07 | アボツト・ラボラトリーズ | 構造体アレイを利用して分析物を捕捉する装置および方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2965131B2 (ja) * | 1995-07-07 | 1999-10-18 | 東洋紡績株式会社 | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 |
| JPH11236506A (ja) * | 1998-02-23 | 1999-08-31 | Jsr Corp | 磁性粒子、磁性粒子の製造方法および非特異性核酸結合担体 |
-
2000
- 2000-03-09 JP JP2000065486A patent/JP4519247B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH10506991A (ja) * | 1994-09-30 | 1998-07-07 | アボツト・ラボラトリーズ | 構造体アレイを利用して分析物を捕捉する装置および方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007529229A (ja) * | 2004-03-18 | 2007-10-25 | アンビオン インコーポレーティッド | 核酸精製のための固相支持体として修飾された表面 |
| US8426126B2 (en) | 2004-03-18 | 2013-04-23 | Applied Biosystems, Llc | Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification |
| US9464315B2 (en) | 2004-03-18 | 2016-10-11 | Applied Biosystems, Llc | Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification |
| JP2011524360A (ja) * | 2008-06-13 | 2011-09-01 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | Ｒｎａ単離のための細胞溶解試薬 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4519247B2 (ja) | 2010-08-04 |
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