JP2001204471A - 細胞増殖促進方法 - Google Patents
細胞増殖促進方法Info
- Publication number
- JP2001204471A JP2001204471A JP2000011458A JP2000011458A JP2001204471A JP 2001204471 A JP2001204471 A JP 2001204471A JP 2000011458 A JP2000011458 A JP 2000011458A JP 2000011458 A JP2000011458 A JP 2000011458A JP 2001204471 A JP2001204471 A JP 2001204471A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- dna
- gln
- cell
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】煩雑な培養操作を必要とせず、コスト面でも有
利で、かつ、種々の細胞に広く適用可能な細胞増殖促進
方法を提供すること。 【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれる１
以上の蛋白質を細胞に産生させることを特徴とする細胞
増殖促進方法。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白
質。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、細胞増殖促進作用を有
する蛋白質。
利で、かつ、種々の細胞に広く適用可能な細胞増殖促進
方法を提供すること。 【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれる１
以上の蛋白質を細胞に産生させることを特徴とする細胞
増殖促進方法。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白
質。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、細胞増殖促進作用を有
する蛋白質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞増殖促進方法
に関する。
に関する。
【０００２】
【従来の技術】物質生産等を目的として細胞を培養する
際には、目的物質の生産効率等を上げるために、細胞の
増殖を促し培養効率を高めることが一般に望まれる。従
来、細胞の増殖を促進させるための方法として、細胞増
殖促進作用を有する物質を培地に添加する方法が知られ
ている。しかしながら、このような方法では、増殖促進
効果を維持するために細胞増殖促進作用を有する物質を
常に培地に添加し続ける必要があり、培養操作が煩雑に
なるうえ、特に細胞を大量に培養して物質生産を行なわ
せる際にはコスト面で不利となる。また、細胞増殖促進
作用の発現に受容体やシグナル伝達系等の特定の機構が
必要である場合には、培養する細胞がそのような機構を
有することが必須となり、適用可能な細胞の種類が限定
される。
際には、目的物質の生産効率等を上げるために、細胞の
増殖を促し培養効率を高めることが一般に望まれる。従
来、細胞の増殖を促進させるための方法として、細胞増
殖促進作用を有する物質を培地に添加する方法が知られ
ている。しかしながら、このような方法では、増殖促進
効果を維持するために細胞増殖促進作用を有する物質を
常に培地に添加し続ける必要があり、培養操作が煩雑に
なるうえ、特に細胞を大量に培養して物質生産を行なわ
せる際にはコスト面で不利となる。また、細胞増殖促進
作用の発現に受容体やシグナル伝達系等の特定の機構が
必要である場合には、培養する細胞がそのような機構を
有することが必須となり、適用可能な細胞の種類が限定
される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、煩雑な培養操
作を必要とせず、コスト面でも有利で、かつ、種々の細
胞に広く適用可能な細胞増殖促進方法の開発が切望され
ていた。
作を必要とせず、コスト面でも有利で、かつ、種々の細
胞に広く適用可能な細胞増殖促進方法の開発が切望され
ていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討した結果、細胞にある種の蛋白質を産
生させることにより、その細胞の増殖が促進されること
を見出し、本発明に至った。すなわち本発明は、 １）以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれる１以上の蛋
白質を細胞に産生させることを特徴とする細胞増殖促進
方法（以下、本発明方法と記す。）、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白
質。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、細胞増殖促進作用を有
する蛋白質。 ２）（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列
を有する１以上のＤＮＡが導入されてなる細胞を培養す
る工程を含む前項１）記載の方法、 ３）細胞が、動物細胞である前項１）または２）のいず
れかに記載の方法を提供するものである。
明者らは鋭意検討した結果、細胞にある種の蛋白質を産
生させることにより、その細胞の増殖が促進されること
を見出し、本発明に至った。すなわち本発明は、 １）以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれる１以上の蛋
白質を細胞に産生させることを特徴とする細胞増殖促進
方法（以下、本発明方法と記す。）、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白
質。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、細胞増殖促進作用を有
する蛋白質。 ２）（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列
を有する１以上のＤＮＡが導入されてなる細胞を培養す
る工程を含む前項１）記載の方法、 ３）細胞が、動物細胞である前項１）または２）のいず
れかに記載の方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、更に詳細に本発明を説明す
る。本発明方法において使用される蛋白質は、（ａ）配
列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、また
は、（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において
１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしく
は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、一括
して本蛋白質と記す。）から選ばれる蛋白質である。こ
こで、数個とは、２個〜約５０個程度、好ましくは、２
個〜約２０個程度、さらに好ましくは２個から約１０個
程度である。本蛋白質を細胞に産生させるには、例え
ば、本蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを細
胞に導入し、得られた細胞を培養するとよい。本蛋白質
をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２で
示される塩基配列をあげることができる。本蛋白質をコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本ＤＮＡと記
す。）は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis
著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Clo
ning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、
１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準じて調製す
ることができる。具体的には例えば、まず、ヒト等の動
物由来の組織や培養細胞のＲＮＡを調製する。ヒト等の
動物由来の組織や培養細胞を塩酸グアニジンやグアニジ
ンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中
で破砕し、さらに該破砕物にフェノール、クロロホルム
等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質
を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分か
ら塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール
法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法に
より全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づい
た市販のキットとしては、例えばISOGEN（ニッポンジー
ン製）がある。得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄ
ＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆
転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤ
ＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮ
Ａ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲ
ＮＡをプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成する。更に該ｃＤＮＡ
の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化す
る。得られたｃＤＮＡはフェノール、クロロホルム抽
出、エタノール沈殿等の通常の方法(Gubler,U., B.J.Ho
ffman, Gene, 25, 263(1983)、Okayama,H., P.Berg, Mo
l.Cell.Biol, 2, 161(1982)等に記載されている）によ
り精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販
のキットとしては、例えばｃＤＮＡ合成システムプラス
（アマシャム社製）がある。つぎに、得られたｃＤＮＡ
を例えば、プラスミドpUC118やファージλgt11などのベ
クターにリガーゼを用いて結合させることによりｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡライブラリー
としては、ヒト等の動物組織由来の市販のｃＤＮＡライ
ブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用いることも可
能である。このようなｃＤＮＡライブラリーから、例え
ば、配列番号２で示される塩基配列の一部を有するＤＮ
Ａをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法
や、前記ＤＮＡをプライマーとして用いるポリメラーゼ
チェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）により本ＤＮＡ
を調製することができる。得られたＤＮＡの塩基配列
は、Maxam Gilbert法(例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977等に記載され
る。)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson,J.M
ol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and
A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 19
77等に記載される。）等により確認することができる。
また本ＤＮＡは、例えばホスファイト・トリエステル法
（Hunkapiller,M. et al., Nature, 310, 105, 1984）
などの核酸の通常の化学合成方法に準じて調製すること
もできる。
る。本発明方法において使用される蛋白質は、（ａ）配
列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、また
は、（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において
１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしく
は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、一括
して本蛋白質と記す。）から選ばれる蛋白質である。こ
こで、数個とは、２個〜約５０個程度、好ましくは、２
個〜約２０個程度、さらに好ましくは２個から約１０個
程度である。本蛋白質を細胞に産生させるには、例え
ば、本蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを細
胞に導入し、得られた細胞を培養するとよい。本蛋白質
をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２で
示される塩基配列をあげることができる。本蛋白質をコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本ＤＮＡと記
す。）は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis
著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Clo
ning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、
１９８９年等に記載の遺伝子工学的方法に準じて調製す
ることができる。具体的には例えば、まず、ヒト等の動
物由来の組織や培養細胞のＲＮＡを調製する。ヒト等の
動物由来の組織や培養細胞を塩酸グアニジンやグアニジ
ンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中
で破砕し、さらに該破砕物にフェノール、クロロホルム
等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質
を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分か
ら塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール
法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法に
より全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づい
た市販のキットとしては、例えばISOGEN（ニッポンジー
ン製）がある。得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄ
ＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆
転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤ
ＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮ
Ａ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲ
ＮＡをプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成する。更に該ｃＤＮＡ
の両末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化す
る。得られたｃＤＮＡはフェノール、クロロホルム抽
出、エタノール沈殿等の通常の方法(Gubler,U., B.J.Ho
ffman, Gene, 25, 263(1983)、Okayama,H., P.Berg, Mo
l.Cell.Biol, 2, 161(1982)等に記載されている）によ
り精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販
のキットとしては、例えばｃＤＮＡ合成システムプラス
（アマシャム社製）がある。つぎに、得られたｃＤＮＡ
を例えば、プラスミドpUC118やファージλgt11などのベ
クターにリガーゼを用いて結合させることによりｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡライブラリー
としては、ヒト等の動物組織由来の市販のｃＤＮＡライ
ブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用いることも可
能である。このようなｃＤＮＡライブラリーから、例え
ば、配列番号２で示される塩基配列の一部を有するＤＮ
Ａをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法
や、前記ＤＮＡをプライマーとして用いるポリメラーゼ
チェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）により本ＤＮＡ
を調製することができる。得られたＤＮＡの塩基配列
は、Maxam Gilbert法(例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977等に記載され
る。)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson,J.M
ol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and
A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 19
77等に記載される。）等により確認することができる。
また本ＤＮＡは、例えばホスファイト・トリエステル法
（Hunkapiller,M. et al., Nature, 310, 105, 1984）
などの核酸の通常の化学合成方法に準じて調製すること
もできる。
【０００６】このようにして調製された本ＤＮＡを、例
えば、本ＤＮＡを導入する細胞において用いられるベク
ターに通常の遺伝子工学的手法に準じて挿入し、得られ
たベクターのＤＮＡを細胞に導入するとよい。このよう
にして使用可能なベクターとしては、大腸菌等の遺伝子
工学的技術に適した微生物内で機能可能な複製起点、お
よび、薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカー遺伝子などを有
するプラスミド等のベクターがあげられる。さらに、細
胞に本蛋白質をより効率よく産生させるには、本ＤＮＡ
を、例えば、発現可能な形でプロモーターと接続される
ようにベクターに挿入し、得られたベクターのＤＮＡを
細胞に導入するとよい。プロモーターとしては、導入さ
れる細胞で機能可能な、即ち転写開始能を有するプロモ
ーターであって、例えば、当該細胞が酵母細胞である場
合には、酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター
（ADHプロモーター）、酵母gal1遺伝子プロモーター、n
mtプロモーターなどがあげられ、当該細胞が昆虫類動物
細胞である場合には、核多角体ウイルスプロモーターな
どがあげられ、当該細胞が哺乳類動物細胞である場合に
は、SV40ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス
プロモーター（CMVプロモーター）、Raus Sarcoma Viru
sプロモーター(RSVプロモーター)、bアクチン遺伝子プ
ロモーターなどがあげられる。また、このようなプロモ
ーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベ
クターを利用することもできる。
えば、本ＤＮＡを導入する細胞において用いられるベク
ターに通常の遺伝子工学的手法に準じて挿入し、得られ
たベクターのＤＮＡを細胞に導入するとよい。このよう
にして使用可能なベクターとしては、大腸菌等の遺伝子
工学的技術に適した微生物内で機能可能な複製起点、お
よび、薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカー遺伝子などを有
するプラスミド等のベクターがあげられる。さらに、細
胞に本蛋白質をより効率よく産生させるには、本ＤＮＡ
を、例えば、発現可能な形でプロモーターと接続される
ようにベクターに挿入し、得られたベクターのＤＮＡを
細胞に導入するとよい。プロモーターとしては、導入さ
れる細胞で機能可能な、即ち転写開始能を有するプロモ
ーターであって、例えば、当該細胞が酵母細胞である場
合には、酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター
（ADHプロモーター）、酵母gal1遺伝子プロモーター、n
mtプロモーターなどがあげられ、当該細胞が昆虫類動物
細胞である場合には、核多角体ウイルスプロモーターな
どがあげられ、当該細胞が哺乳類動物細胞である場合に
は、SV40ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス
プロモーター（CMVプロモーター）、Raus Sarcoma Viru
sプロモーター(RSVプロモーター)、bアクチン遺伝子プ
ロモーターなどがあげられる。また、このようなプロモ
ーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベ
クターを利用することもできる。
【０００７】前記のようにして調製された本ＤＮＡを含
有するベクターのＤＮＡを細胞へ導入する。細胞へのＤ
ＮＡ導入法としては、細胞に応じた通常の導入方法を適
用することができ、例えば哺乳類動物細胞、昆虫類動物
細胞などの動物細胞には、リン酸カルシウム法、電気導
入法、DEAEデキストラン法、ミセル形成法等を適用する
ことができる。具体的には例えば、リン酸カルシウム法
としては、Grimm,S.,Stanger, B., Z., and Leder, P.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp10923-10927等に
記載の方法をあげることができ、電気導入法およびDEAE
デキストラン法としては、Ting, A., T., Pimentel-Mui
nos, F., X., and Seed, B., EMBO J,15, no.22, pp618
9-6196等に記載の方法をあげることができ、ミセル形成
法としては、Hawkins, C., J., Uren, A., G., Hacker,
G., Medcalf, R., L., andVau, D., L., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, pp13786-13790等に記載の方法を
あげることができる。本ＤＮＡを含有するベクターのＤ
ＮＡの導入処理を施した細胞を、例えば、当該ベクター
に含まれる選抜マーカー遺伝子に対応する選抜条件の培
地で培養することにより、前記ＤＮＡが導入されてなる
細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本
ＤＮＡが染色体に導入されてなる安定形質転換体を取得
してもよい。導入された本ＤＮＡが細胞内の染色体上に
組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤ
ＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、導入さ
れた本ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマ
ーとして用いるＰＣＲや、導入された本ＤＮＡの部分塩
基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハ
イブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮ
Ａ中の本ＤＮＡの存在を検出すればよい。
有するベクターのＤＮＡを細胞へ導入する。細胞へのＤ
ＮＡ導入法としては、細胞に応じた通常の導入方法を適
用することができ、例えば哺乳類動物細胞、昆虫類動物
細胞などの動物細胞には、リン酸カルシウム法、電気導
入法、DEAEデキストラン法、ミセル形成法等を適用する
ことができる。具体的には例えば、リン酸カルシウム法
としては、Grimm,S.,Stanger, B., Z., and Leder, P.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp10923-10927等に
記載の方法をあげることができ、電気導入法およびDEAE
デキストラン法としては、Ting, A., T., Pimentel-Mui
nos, F., X., and Seed, B., EMBO J,15, no.22, pp618
9-6196等に記載の方法をあげることができ、ミセル形成
法としては、Hawkins, C., J., Uren, A., G., Hacker,
G., Medcalf, R., L., andVau, D., L., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, pp13786-13790等に記載の方法を
あげることができる。本ＤＮＡを含有するベクターのＤ
ＮＡの導入処理を施した細胞を、例えば、当該ベクター
に含まれる選抜マーカー遺伝子に対応する選抜条件の培
地で培養することにより、前記ＤＮＡが導入されてなる
細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本
ＤＮＡが染色体に導入されてなる安定形質転換体を取得
してもよい。導入された本ＤＮＡが細胞内の染色体上に
組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤ
ＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、導入さ
れた本ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマ
ーとして用いるＰＣＲや、導入された本ＤＮＡの部分塩
基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハ
イブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮ
Ａ中の本ＤＮＡの存在を検出すればよい。
【０００８】本ＤＮＡが導入されてなる細胞における本
蛋白質の産生は、例えば、前記細胞から蛋白質液を抽出
し、得られた蛋白質液を試料として本蛋白質に対する抗
体を用いたウエスタンブロッティング等の免疫化学的分
析を行なうことにより確認することができる。ウエスタ
ンブロッティングは、例えばJ.Sambrook、E.F.Fritsc
h、T.Maniatis著：モレキュラー・クローニング第２
版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)等
に記載されている方法に準じて行なうことができる。ま
た、本蛋白質に対する抗体を調製するには、例えば、本
蛋白質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをペ
プチド合成機等により化学合成して精製した後、得られ
たペプチドを担体蛋白質（通常、ウシ血清アルブミン、
卵白アルブミン等が用いられる。）に共有結合させ、こ
れを免疫原とする。また、ペプチドを枝分かれ状に共有
結合させたポリペプチドを免疫原とするMultiple-antig
en peptide(MAP)法を利用することもできる。免疫原と
するペプチドの設計方法などは、例えば「新生化学実験
講座１−タンパク質IV」（東京化学同人）等に記載され
た方法に準じて行なえばよい。調製された免疫原をウサ
ギ、ヤギ、モルモットなどの動物に接種し、数週間後か
ら血清中の抗体価の検定を開始する。抗体価が上昇した
動物から抗体を含んだ血清（抗血清）を回収することに
より、本蛋白質に対する抗体を得ることができる。さら
に、抗体産生動物から抗体産生細胞を抽出し株化するこ
とにより、更に高い特異性をもつモノクローナル抗体を
得ることも可能である。
蛋白質の産生は、例えば、前記細胞から蛋白質液を抽出
し、得られた蛋白質液を試料として本蛋白質に対する抗
体を用いたウエスタンブロッティング等の免疫化学的分
析を行なうことにより確認することができる。ウエスタ
ンブロッティングは、例えばJ.Sambrook、E.F.Fritsc
h、T.Maniatis著：モレキュラー・クローニング第２
版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)等
に記載されている方法に準じて行なうことができる。ま
た、本蛋白質に対する抗体を調製するには、例えば、本
蛋白質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをペ
プチド合成機等により化学合成して精製した後、得られ
たペプチドを担体蛋白質（通常、ウシ血清アルブミン、
卵白アルブミン等が用いられる。）に共有結合させ、こ
れを免疫原とする。また、ペプチドを枝分かれ状に共有
結合させたポリペプチドを免疫原とするMultiple-antig
en peptide(MAP)法を利用することもできる。免疫原と
するペプチドの設計方法などは、例えば「新生化学実験
講座１−タンパク質IV」（東京化学同人）等に記載され
た方法に準じて行なえばよい。調製された免疫原をウサ
ギ、ヤギ、モルモットなどの動物に接種し、数週間後か
ら血清中の抗体価の検定を開始する。抗体価が上昇した
動物から抗体を含んだ血清（抗血清）を回収することに
より、本蛋白質に対する抗体を得ることができる。さら
に、抗体産生動物から抗体産生細胞を抽出し株化するこ
とにより、更に高い特異性をもつモノクローナル抗体を
得ることも可能である。
【０００９】上述のようにして本ＤＮＡが導入された細
胞を培養し、例えば細胞数を一定時間後に観察すること
により、増殖促進効果を確認することができる。哺乳
類、昆虫類等の動物由来の細胞は、一般に、培養細胞に
おける通常の培養に使用される培地を用いて培養するこ
とができる。選抜マーカー遺伝子に対応する選抜薬剤を
利用して本ＤＮＡが導入された細胞を取得した場合は、
該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。具体的に
は例えば、哺乳類動物由来の細胞は、例えば終濃度が10
%となるようFBSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）
などを用いて37℃、5％CO2存在下等の条件で数日ごとに
新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコ
ンフルエントになるまで増殖したら、例えば0.25w/v%程
度のトリプシンPBS溶液を加えて個々の細胞に分散さ
せ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続け
る。昆虫類動物由来の細胞の場合も同様に、例えばGrac
e's medium +10v/v%FBS+2w/v%Yeastlate等の昆虫細胞用
培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよ
い。本発明方法を、例えば、物質生産等を目的として培
養される細胞に適用することにより、煩雑な培養操作を
必要とせず、かつ、コスト面でも有利に細胞培養を行う
ことが可能となる。本発明方法を利用するには、例え
ば、目的物質の生産能を有する細胞に、本ＤＮＡを導入
して本蛋白質を産生させてもよいし、本ＤＮＡが導入さ
れてなり本蛋白質を産生する細胞に、目的物質の生産能
を付与してもよい。
胞を培養し、例えば細胞数を一定時間後に観察すること
により、増殖促進効果を確認することができる。哺乳
類、昆虫類等の動物由来の細胞は、一般に、培養細胞に
おける通常の培養に使用される培地を用いて培養するこ
とができる。選抜マーカー遺伝子に対応する選抜薬剤を
利用して本ＤＮＡが導入された細胞を取得した場合は、
該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。具体的に
は例えば、哺乳類動物由来の細胞は、例えば終濃度が10
%となるようFBSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）
などを用いて37℃、5％CO2存在下等の条件で数日ごとに
新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコ
ンフルエントになるまで増殖したら、例えば0.25w/v%程
度のトリプシンPBS溶液を加えて個々の細胞に分散さ
せ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続け
る。昆虫類動物由来の細胞の場合も同様に、例えばGrac
e's medium +10v/v%FBS+2w/v%Yeastlate等の昆虫細胞用
培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよ
い。本発明方法を、例えば、物質生産等を目的として培
養される細胞に適用することにより、煩雑な培養操作を
必要とせず、かつ、コスト面でも有利に細胞培養を行う
ことが可能となる。本発明方法を利用するには、例え
ば、目的物質の生産能を有する細胞に、本ＤＮＡを導入
して本蛋白質を産生させてもよいし、本ＤＮＡが導入さ
れてなり本蛋白質を産生する細胞に、目的物質の生産能
を付与してもよい。
【００１０】
【実施例】 本発明を更に以下の実施例および参考例で説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 参考例１（本ＤＮＡの取得） HeLa細胞（ヒト子宮頚癌細胞由来）を75cm2底面フラス
コ（岩城硝子製）10本で培養し、得られた計1×108個の
細胞を回収した。回収された細胞をPBS平衡緩衝液（0.2
mg/ml KCl、0.2mg/ml KH2PO4、8.0mg/ml NaCl、2.16mg/ml
Na2HPO4）で２回洗浄後、Fast Track mRNA Isolationキ
ット（Invitrogen社製）に含まれる溶解緩衝液15mlで溶
解し、ホモジナイザーで10-12ストローク処理すること
により細胞を破砕した。破砕液を更にシリンジに3回通
し、攪拌しながら45℃で60分間インキュベートした。塩
化ナトリウムを0.5Mとなるように加えて攪拌した後、更
にシリンジに3回通した。これにFast Track mRNA Isola
tionキット（Invitrogen社製）に含まれるオリゴdT錠を
加え、錠剤溶解後60分間ゆっくり振盪した。振盪後の液
をスピンカラムに吸着させ、該カラムを、洗浄液のOD26
0が0.05以下になるまで緩衝液で洗浄した。洗浄後のカ
ラムに溶出バッファーを供してpolyA+ RNAを溶出させ、
溶出液中のRNAをエタノール沈殿により回収した。この
ようにして得られたpolyA+ RNA：23μgのうち5μgにつ
いてSTRATAGENE社製ZAP cDNA合成キットを用いて逆転写
反応を行い、一本鎖DNAを取得した。すなわち、RNA:5μ
gに対し、10×1st Strand Buffer: 5.0μl、dNTP混合
液:0.6mM、配列番号３で示される塩基配列からなるプラ
イマー:2.8μg、RNase Block II:2.0μl、M-MuLV Rtase:
2.5μl/50μlを加え、37℃で1時間保温した。保温後の
反応液について、10μg/ml RNaseA(和光純薬)を数μl添
加した後、フェノール・クロロホルム抽出、酢酸アンモ
ニウムによるエタノール沈殿を行い、一本鎖DNAを回収
した。次に、この一本鎖DNA5μgに、dATP:10nmol、ddAT
P:0.33nmol、MgCl2:0.4mM、Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase（宝酒造）:1.0μl、5×Buffer（前記酵素
に添付のバッファー）:8.0μlを加えて全量を40μlと
し、37℃、1時間保温した。保温した液について、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行って一
本鎖DNAを回収した。次いで、回収された一本鎖DNA5μg
に対し、LA Taq(Long and Accurate PCR Taq、宝酒
造）:0.5μl、10×LA buffer:5μl、dNTP混合液:0.4m
M、ポリ(dT)20プライマー:20pmol、配列番号４で示され
る塩基配列からなるプライマーまたは配列番号５で示さ
れる塩基配列からなるプライマー:20pmolを加えて全量
を50μlとし、アステック社製PROGRAM TEMP CONTROL SY
STEM PC-700を用いてＰＣＲを行った。PCRの条件として
は、94℃か55℃まで温度を低下させながら10分間保温し
た後、72℃に2分間保ち、その後94℃:30秒間次いで55
℃:30秒間さらに72℃:2分間の保温を1サイクルとしてこ
れを40サイクル行った。次に、前記PCRによって目的と
するＤＮＡが増幅されているかを確認する目的で、配列
番号２で示される塩基配列の部分配列からなるプローブ
を用いてPCR産物のサザンハイブリダイゼーションを行
なった。すなわち、ＰＣＲ産物の一部（50μl中15μl）
を1%アガロースゲルで電気泳動し、0.4規定水酸化ナト
リウムを用いて、ゲルからナイロンメンブレン（ナイロ
ンメンブレン、Positively Charged;ベーリンガーマン
ハイム社製）に一晩アルカリトランスファーを行った。
ブロッティング後のメンブレンを洗浄後、UVクロスリン
ク（バイオラッド社製、GSGENE LINKER）によってメン
ブレン上のDNAをメンブレンに共有結合させ、これをハ
イブリダイゼーションに供した。サザンハイブリダイゼ
ーションについては、ベーリンガーマンハイム社製のDI
Gシステムを用い、プロトコール記載の方法に従って行
なった。まずメンブレンをDIG Easy Hyb（ベーリンガー
マンハイム社製）約5mlと共に包埋材にシールし、42℃
で1時間以上保温し、次にハイブリダイゼーション液に
替えて42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。
プローブは、ジゴキシゲニンラベルされたdUTPを基質と
したPCRを行って調製した。すなわち、まず、上記の一
本鎖DNAを鋳型にして、配列番号２で示される塩基配列
の塩基番号278〜300で表される塩基配列を有するプライ
マー、および、配列番号２で示される塩基配列の塩基番
号940〜960で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有
するプライマーを用いて上記と同様にPCRを行うことに
よって、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号278-
960で表される塩基配列を含むDNAを増幅し、増幅された
ＤＮＡをプラスミドpGAD-GH（CLONTECH社製）のクロー
ニング部位に挿入する。次いで、配列番号２で示される
塩基配列の塩基番号278-960で表される塩基配列からな
るＤＮＡがプラスミドpGAD-GH（CLONTECH社製）のクロ
ーニング部位に挿入されたプラスミド10pgを鋳型にし
て、10×DIG mix:5μl、10×buffer:5μl、MgCl2:2mM、
配列番号３で示される塩基配列からなるプライマー:30p
mol、pGADプラスミド塩基配列決定用プライマー（MATCH
MAKER 5` Insert-screening Amplimer、CLONTECH社製）:
30pmol、Taqポリメラーゼ（宝酒造）:0.4μlを加えて全
量を50μlとし、アステック社製PROGRAM TEMP CONTROL
SYSTEM PC-700を用いてＰＣＲを行った。PCRの条件とし
ては、94℃か55℃まで温度を低下させながら10分間保温
した後、72℃に2分間保ち、その後94℃:30秒間次いで55
℃:30秒間さらに72℃:2分間の保温を1サイクルとしてこ
れを55サイクル行った。次いで、該ＰＣＲの反応液から
フェノール抽出、エタノール沈殿によってプローブを回
収して30μlの水に溶解させ、そのうちの10μlとり、10
0℃で2分間保温した後急冷し、これをDIG Easy Hyb液5m
lに加え、上記のハイブリダイゼーションに用いた。ハ
イブリダイゼーション後のメンブレンを、SSC（3M塩化
ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）の10倍
希釈液に0.1%となるようSDSを添加した液で、室温にて5
分間、2回洗浄し、さらに、SSCの200倍希釈液＋0.1% SD
S液で、68℃、20分間の洗浄を2回行なった。洗浄後のメ
ンブレンの発色反応（ジゴキシゲニン抗体−アルカリホ
スファターゼによる化学発光）は全てベーリンガーマン
ハイム社のDIGシステムのプロトコールに従って行なっ
た。このサザンハイブリダイゼーションの結果、前記プ
ローブと強くハイブリダイズするバンドが3本観察され
たので、前記ハイブリダイゼーションに用いたのと同じ
PCRサンプルを電気泳動し、この3本のバンドに相当する
付近のゲルをUV照射下で切り出した。この切り出したゲ
ルからDNAを回収し、回収されたDNAをpUC118（宝酒造）
にサブクローニングした。得られた59クローンについて
前記プローブを用いたドットブロットサザンハイブリダ
イゼーションを行った。すなわち、各クローンの保有するプ
ラスミド各6-8μgをナイロンメンブレンに固定し、上記
サザンハイブリダーゼーションと同様の方法でドットブ
ロットサザンハイブリダイゼーションを行なった。その
結果、59クローンのプラスミドのうち13クローンのプラスミドに
ついてシグナルが検出されたため、この13プラスミドに
ついて挿入DNA長および制限酵素切断部位の確認を行な
った。配列番号２で示される塩基配列の塩基番号278-96
0で表される塩基配列から予想される制限酵素切断部位
を持ち、かつ数100塩基以上の挿入DNAを持つプラスミド
7種類について塩基配列を決定した。その結果、配列番
号２で示される塩基配列からなる本ＤＮＡを保有するプ
ラスミドが確認された。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 参考例１（本ＤＮＡの取得） HeLa細胞（ヒト子宮頚癌細胞由来）を75cm2底面フラス
コ（岩城硝子製）10本で培養し、得られた計1×108個の
細胞を回収した。回収された細胞をPBS平衡緩衝液（0.2
mg/ml KCl、0.2mg/ml KH2PO4、8.0mg/ml NaCl、2.16mg/ml
Na2HPO4）で２回洗浄後、Fast Track mRNA Isolationキ
ット（Invitrogen社製）に含まれる溶解緩衝液15mlで溶
解し、ホモジナイザーで10-12ストローク処理すること
により細胞を破砕した。破砕液を更にシリンジに3回通
し、攪拌しながら45℃で60分間インキュベートした。塩
化ナトリウムを0.5Mとなるように加えて攪拌した後、更
にシリンジに3回通した。これにFast Track mRNA Isola
tionキット（Invitrogen社製）に含まれるオリゴdT錠を
加え、錠剤溶解後60分間ゆっくり振盪した。振盪後の液
をスピンカラムに吸着させ、該カラムを、洗浄液のOD26
0が0.05以下になるまで緩衝液で洗浄した。洗浄後のカ
ラムに溶出バッファーを供してpolyA+ RNAを溶出させ、
溶出液中のRNAをエタノール沈殿により回収した。この
ようにして得られたpolyA+ RNA：23μgのうち5μgにつ
いてSTRATAGENE社製ZAP cDNA合成キットを用いて逆転写
反応を行い、一本鎖DNAを取得した。すなわち、RNA:5μ
gに対し、10×1st Strand Buffer: 5.0μl、dNTP混合
液:0.6mM、配列番号３で示される塩基配列からなるプラ
イマー:2.8μg、RNase Block II:2.0μl、M-MuLV Rtase:
2.5μl/50μlを加え、37℃で1時間保温した。保温後の
反応液について、10μg/ml RNaseA(和光純薬)を数μl添
加した後、フェノール・クロロホルム抽出、酢酸アンモ
ニウムによるエタノール沈殿を行い、一本鎖DNAを回収
した。次に、この一本鎖DNA5μgに、dATP:10nmol、ddAT
P:0.33nmol、MgCl2:0.4mM、Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase（宝酒造）:1.0μl、5×Buffer（前記酵素
に添付のバッファー）:8.0μlを加えて全量を40μlと
し、37℃、1時間保温した。保温した液について、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行って一
本鎖DNAを回収した。次いで、回収された一本鎖DNA5μg
に対し、LA Taq(Long and Accurate PCR Taq、宝酒
造）:0.5μl、10×LA buffer:5μl、dNTP混合液:0.4m
M、ポリ(dT)20プライマー:20pmol、配列番号４で示され
る塩基配列からなるプライマーまたは配列番号５で示さ
れる塩基配列からなるプライマー:20pmolを加えて全量
を50μlとし、アステック社製PROGRAM TEMP CONTROL SY
STEM PC-700を用いてＰＣＲを行った。PCRの条件として
は、94℃か55℃まで温度を低下させながら10分間保温し
た後、72℃に2分間保ち、その後94℃:30秒間次いで55
℃:30秒間さらに72℃:2分間の保温を1サイクルとしてこ
れを40サイクル行った。次に、前記PCRによって目的と
するＤＮＡが増幅されているかを確認する目的で、配列
番号２で示される塩基配列の部分配列からなるプローブ
を用いてPCR産物のサザンハイブリダイゼーションを行
なった。すなわち、ＰＣＲ産物の一部（50μl中15μl）
を1%アガロースゲルで電気泳動し、0.4規定水酸化ナト
リウムを用いて、ゲルからナイロンメンブレン（ナイロ
ンメンブレン、Positively Charged;ベーリンガーマン
ハイム社製）に一晩アルカリトランスファーを行った。
ブロッティング後のメンブレンを洗浄後、UVクロスリン
ク（バイオラッド社製、GSGENE LINKER）によってメン
ブレン上のDNAをメンブレンに共有結合させ、これをハ
イブリダイゼーションに供した。サザンハイブリダイゼ
ーションについては、ベーリンガーマンハイム社製のDI
Gシステムを用い、プロトコール記載の方法に従って行
なった。まずメンブレンをDIG Easy Hyb（ベーリンガー
マンハイム社製）約5mlと共に包埋材にシールし、42℃
で1時間以上保温し、次にハイブリダイゼーション液に
替えて42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。
プローブは、ジゴキシゲニンラベルされたdUTPを基質と
したPCRを行って調製した。すなわち、まず、上記の一
本鎖DNAを鋳型にして、配列番号２で示される塩基配列
の塩基番号278〜300で表される塩基配列を有するプライ
マー、および、配列番号２で示される塩基配列の塩基番
号940〜960で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有
するプライマーを用いて上記と同様にPCRを行うことに
よって、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号278-
960で表される塩基配列を含むDNAを増幅し、増幅された
ＤＮＡをプラスミドpGAD-GH（CLONTECH社製）のクロー
ニング部位に挿入する。次いで、配列番号２で示される
塩基配列の塩基番号278-960で表される塩基配列からな
るＤＮＡがプラスミドpGAD-GH（CLONTECH社製）のクロ
ーニング部位に挿入されたプラスミド10pgを鋳型にし
て、10×DIG mix:5μl、10×buffer:5μl、MgCl2:2mM、
配列番号３で示される塩基配列からなるプライマー:30p
mol、pGADプラスミド塩基配列決定用プライマー（MATCH
MAKER 5` Insert-screening Amplimer、CLONTECH社製）:
30pmol、Taqポリメラーゼ（宝酒造）:0.4μlを加えて全
量を50μlとし、アステック社製PROGRAM TEMP CONTROL
SYSTEM PC-700を用いてＰＣＲを行った。PCRの条件とし
ては、94℃か55℃まで温度を低下させながら10分間保温
した後、72℃に2分間保ち、その後94℃:30秒間次いで55
℃:30秒間さらに72℃:2分間の保温を1サイクルとしてこ
れを55サイクル行った。次いで、該ＰＣＲの反応液から
フェノール抽出、エタノール沈殿によってプローブを回
収して30μlの水に溶解させ、そのうちの10μlとり、10
0℃で2分間保温した後急冷し、これをDIG Easy Hyb液5m
lに加え、上記のハイブリダイゼーションに用いた。ハ
イブリダイゼーション後のメンブレンを、SSC（3M塩化
ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）の10倍
希釈液に0.1%となるようSDSを添加した液で、室温にて5
分間、2回洗浄し、さらに、SSCの200倍希釈液＋0.1% SD
S液で、68℃、20分間の洗浄を2回行なった。洗浄後のメ
ンブレンの発色反応（ジゴキシゲニン抗体−アルカリホ
スファターゼによる化学発光）は全てベーリンガーマン
ハイム社のDIGシステムのプロトコールに従って行なっ
た。このサザンハイブリダイゼーションの結果、前記プ
ローブと強くハイブリダイズするバンドが3本観察され
たので、前記ハイブリダイゼーションに用いたのと同じ
PCRサンプルを電気泳動し、この3本のバンドに相当する
付近のゲルをUV照射下で切り出した。この切り出したゲ
ルからDNAを回収し、回収されたDNAをpUC118（宝酒造）
にサブクローニングした。得られた59クローンについて
前記プローブを用いたドットブロットサザンハイブリダ
イゼーションを行った。すなわち、各クローンの保有するプ
ラスミド各6-8μgをナイロンメンブレンに固定し、上記
サザンハイブリダーゼーションと同様の方法でドットブ
ロットサザンハイブリダイゼーションを行なった。その
結果、59クローンのプラスミドのうち13クローンのプラスミドに
ついてシグナルが検出されたため、この13プラスミドに
ついて挿入DNA長および制限酵素切断部位の確認を行な
った。配列番号２で示される塩基配列の塩基番号278-96
0で表される塩基配列から予想される制限酵素切断部位
を持ち、かつ数100塩基以上の挿入DNAを持つプラスミド
7種類について塩基配列を決定した。その結果、配列番
号２で示される塩基配列からなる本ＤＮＡを保有するプ
ラスミドが確認された。
【００１１】参考例２（本蛋白質に対する抗体の作製） 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる本蛋白質を
認識する抗体を作製した。すなわち、Ｎ末端のシステイ
ンに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第207番目
のアスパラギンから219番目のセリンまでのアミノ酸配
列が接続されたアミノ酸配列からなる合計14残基のアミ
ノ酸で構成されるペプチドを化学合成した。合成された
ペプチドをコンジュゲーション法によって担体蛋白質(K
LH)に共有結合させた後、これをウサギ2羽に接種し、抗
血清を取得した。
認識する抗体を作製した。すなわち、Ｎ末端のシステイ
ンに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第207番目
のアスパラギンから219番目のセリンまでのアミノ酸配
列が接続されたアミノ酸配列からなる合計14残基のアミ
ノ酸で構成されるペプチドを化学合成した。合成された
ペプチドをコンジュゲーション法によって担体蛋白質(K
LH)に共有結合させた後、これをウサギ2羽に接種し、抗
血清を取得した。
【００１２】実施例１（本ＤＮＡの哺乳動物細胞への導
入による細胞増殖の促進） 参考例１で取得された本ＤＮＡを培養細胞に導入して本
蛋白質を産生させ、その細胞増殖促進効果を確認した。
すなわち、参考例１で得られた配列番号２で示される塩
基配列からなる本ＤＮＡを保有するプラスミドを制限酵
素Sca IとEco RIで消化し、配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを、アデノウイルスのSV40
プロモーターとHTLV1のLTRの一部をもつ発現ベクターpc
DL-SRa296（Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Ho
y, P., Yokota, K., Arai, K., Yoshida, M., and Ara
i, N., Mol. Cell. Biol., Jan. 1988, p466-472）のマ
ルチクローニング部位に挿入し、図２に示される構造を
有する発現プラスミドを得た（以下、該発現プラスミド
をpcDL-K45と記す。）。このようにして得られた発現プ
ラスミドpcDL-K45を大量調製した。プラスミドの大量調
製には、QIAGEN社製のQIAGEN-tipを用い、発現プラスミ
ドpcDL-K45が導入された大腸菌の培養液300mlから約100
μgの閉環状プラスミドDNAを得た。得られたＤＮＡを、
次いで、リポフェクトアミン（GIBCO社製）をDNA担体と
して用いる方法により細胞へ導入した。ＤＮＡが導入さ
れる細胞としては、HeLa細胞（子宮頚癌由来、上皮様、
入手先:American Type Culture Collection）およびCOS
-1細胞（アフリカミドリザル腎臓由来、線維芽細胞様、
入手先:American Type Culture Collection）を用い、6
穴プレートで70-80%密度となるまで、37℃、5%CO2下で
培養し、Opti-MEM培地で2回洗浄した。精製プラスミドD
NA4μgとリポフェクトアミン液（GIBCO社製）5μlを、
それぞれOpti-MEM培地（GIBCO社製）100μlに懸濁後、
両懸濁液を混合し、室温で30分放置した。次いで、前記
混合液に800μlのOpti-MEM培地を添加して穏やかに混合
し、前記の細胞に添加した。添加後8時間37℃で培養
し、8時間後に20%の血清を含むD-MEM培地を等量添加し
た。この状態で48-72時間培養し、培養後の細胞をトリ
プシン処理により器壁より剥離して回収した。回収した
細胞をトリパンブルー染色液(GIBCO BRL社製)によって
染色し、生細胞数の計数を行なった。結果を図１に示
す。発現プラスミドpcDL-K45の導入量に比例して細胞数
の増加が観察された。計数後の細胞を細胞溶解液（大日
本製薬製、ピッカジーンキット）で溶解し、得られた細
胞粗抽出液をレーンあたり1×105細胞を含むように電気
泳動によって分離した。ゲルは第一化学社製のグラジエ
ントゲル(15-25%)を用いた。泳動後のゲルをメンブレン
（ECL用ニトロセルロースフィルター、アマシャム社
製）にブロッティング（緩衝液＝25mMトリス、192mMグ
リシン、20%メタノール、80V, 1.5時間）した後、TTBS
（20mMトリス塩酸-pH7.6、150mM塩化ナトリウム、0.05%
ナトリウムアジド、0.05% Tween20）で15分間洗浄し
た。次に、フィルターを3%ゼラチンを含むTTBSで1時間
以上ブロッキングした後、一次抗体液(本蛋白質に対す
る抗血清を、1% ゼラチンを含むTTBS液に1/1000量加え
た液)中で37℃、30分間振盪し、次いでTTBSで5分、3回
洗った。これを2次抗体液（アルカリホスファターゼ標
識ヤギ抗ウサギIgGを、1% ゼラチンを含むTTBS液に1/20
00量加えた液）中で37℃、30分保温した後、TTBSで5
分、3回洗浄した。このフィルターをECL用基質-反応液
（アマシャム社製）で1分間処理した後、そのままラッ
プに包んでオートラジオグラフィーに供し、HeLa細胞及
びCOS-1細胞での本蛋白質の産生を確認した。その結
果、発現プラスミドpcDL-K45の導入量に比例して本蛋白
質の産生量の増加が観察された。
入による細胞増殖の促進） 参考例１で取得された本ＤＮＡを培養細胞に導入して本
蛋白質を産生させ、その細胞増殖促進効果を確認した。
すなわち、参考例１で得られた配列番号２で示される塩
基配列からなる本ＤＮＡを保有するプラスミドを制限酵
素Sca IとEco RIで消化し、配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを、アデノウイルスのSV40
プロモーターとHTLV1のLTRの一部をもつ発現ベクターpc
DL-SRa296（Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Ho
y, P., Yokota, K., Arai, K., Yoshida, M., and Ara
i, N., Mol. Cell. Biol., Jan. 1988, p466-472）のマ
ルチクローニング部位に挿入し、図２に示される構造を
有する発現プラスミドを得た（以下、該発現プラスミド
をpcDL-K45と記す。）。このようにして得られた発現プ
ラスミドpcDL-K45を大量調製した。プラスミドの大量調
製には、QIAGEN社製のQIAGEN-tipを用い、発現プラスミ
ドpcDL-K45が導入された大腸菌の培養液300mlから約100
μgの閉環状プラスミドDNAを得た。得られたＤＮＡを、
次いで、リポフェクトアミン（GIBCO社製）をDNA担体と
して用いる方法により細胞へ導入した。ＤＮＡが導入さ
れる細胞としては、HeLa細胞（子宮頚癌由来、上皮様、
入手先:American Type Culture Collection）およびCOS
-1細胞（アフリカミドリザル腎臓由来、線維芽細胞様、
入手先:American Type Culture Collection）を用い、6
穴プレートで70-80%密度となるまで、37℃、5%CO2下で
培養し、Opti-MEM培地で2回洗浄した。精製プラスミドD
NA4μgとリポフェクトアミン液（GIBCO社製）5μlを、
それぞれOpti-MEM培地（GIBCO社製）100μlに懸濁後、
両懸濁液を混合し、室温で30分放置した。次いで、前記
混合液に800μlのOpti-MEM培地を添加して穏やかに混合
し、前記の細胞に添加した。添加後8時間37℃で培養
し、8時間後に20%の血清を含むD-MEM培地を等量添加し
た。この状態で48-72時間培養し、培養後の細胞をトリ
プシン処理により器壁より剥離して回収した。回収した
細胞をトリパンブルー染色液(GIBCO BRL社製)によって
染色し、生細胞数の計数を行なった。結果を図１に示
す。発現プラスミドpcDL-K45の導入量に比例して細胞数
の増加が観察された。計数後の細胞を細胞溶解液（大日
本製薬製、ピッカジーンキット）で溶解し、得られた細
胞粗抽出液をレーンあたり1×105細胞を含むように電気
泳動によって分離した。ゲルは第一化学社製のグラジエ
ントゲル(15-25%)を用いた。泳動後のゲルをメンブレン
（ECL用ニトロセルロースフィルター、アマシャム社
製）にブロッティング（緩衝液＝25mMトリス、192mMグ
リシン、20%メタノール、80V, 1.5時間）した後、TTBS
（20mMトリス塩酸-pH7.6、150mM塩化ナトリウム、0.05%
ナトリウムアジド、0.05% Tween20）で15分間洗浄し
た。次に、フィルターを3%ゼラチンを含むTTBSで1時間
以上ブロッキングした後、一次抗体液(本蛋白質に対す
る抗血清を、1% ゼラチンを含むTTBS液に1/1000量加え
た液)中で37℃、30分間振盪し、次いでTTBSで5分、3回
洗った。これを2次抗体液（アルカリホスファターゼ標
識ヤギ抗ウサギIgGを、1% ゼラチンを含むTTBS液に1/20
00量加えた液）中で37℃、30分保温した後、TTBSで5
分、3回洗浄した。このフィルターをECL用基質-反応液
（アマシャム社製）で1分間処理した後、そのままラッ
プに包んでオートラジオグラフィーに供し、HeLa細胞及
びCOS-1細胞での本蛋白質の産生を確認した。その結
果、発現プラスミドpcDL-K45の導入量に比例して本蛋白
質の産生量の増加が観察された。
【００１３】
【発明の効果】本発明により、煩雑な培養操作を必要と
せず、コスト面でも有利で、かつ、種々の細胞に広く適
用可能な細胞増殖促進方法が提供可能となる。
せず、コスト面でも有利で、かつ、種々の細胞に広く適
用可能な細胞増殖促進方法が提供可能となる。
【００１４】[配列表フリーテキスト] 配列番号３ 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチド
プライマー 配列番号４ 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチド
プライマー 配列番号５ 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチド
プライマー
プライマー 配列番号４ 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチド
プライマー 配列番号５ 遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチド
プライマー
【００１５】
【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Co.Ltd. <120> Methods for promotion of growth of cells <130> P150985 <160> 5 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Asn Thr Pro Gly Met Gln Ser Leu Leu Gln Gln Ile Thr Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gln Leu Met Gln Asn Met Leu Ser Ala Pro Tyr Met Arg Ser 20 25 30 Met Met Gln Ser Leu Ser Gln Asn Pro Asp Leu Ala Ala Gln Met Met 35 40 45 Leu Asn Asn Pro Leu Phe Ala Gly Asn Pro Gln Leu Gln Glu Gln Met 50 55 60 Arg Gln Gln Leu Pro Thr Phe Leu Gln Gln Met Gln Asn Pro Asp Thr 65 70 75 80 Leu Ser Ala Met Ser Asn Pro Arg Ala Met Gln Ala Leu Leu Gln Ile 85 90 95 Gln Gln Gly Leu Gln Thr Leu Ala Thr Glu Ala Pro Gly Leu Ile Pro 100 105 110 Gly Phe Thr Pro Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ser Thr Gly Gly Ser Ser 115 120 125 Gly Thr Asn Gly Ser Asn Ala Thr Pro Ser Glu Asn Thr Ser Pro Thr 130 135 140 Ala Gly Thr Thr Glu Pro Gly His Gln Gln Phe Ile Gln Gln Met Leu 145 150 155 160 Gln Ala Leu Ala Gly Val Asn Pro Gln Leu Gln Asn Pro Glu Val Arg 165 170 175 Phe Gln Gln Gln Leu Glu Gln Leu Ser Ala Met Gly Phe Leu Asn Arg 180 185 190 Glu Ala Asn Leu Gln Ala Leu Ile Ala Thr Gly Gly Asp Ile Asn Ala 195 200 205 Ala Ile Glu Arg Leu Leu Gly Ser Gln Pro Ser 210 215 219 <210> 2 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (69)...(728) <400> 2 agtactccag tggcacttct gggcagagta ctactgcgcc aaatttggtg cctggagtag 60 gagctagt atg ttc aac aca cca gga atg cag agc ttg ttg caa caa ata 110 Met Phe Asn Thr Pro Gly Met Gln Ser Leu Leu Gln Gln Ile 1 5 10 act gaa aac cca caa ctg atg caa aac atg ttg tct gcc ccc tac atg 158 Thr Glu Asn Pro Gln Leu Met Gln Asn Met Leu Ser Ala Pro Tyr Met 15 20 25 30 aga agc atg atg cag tca cta agc cag aat cct gac ctt gct gca cag 206 Arg Ser Met Met Gln Ser Leu Ser Gln Asn Pro Asp Leu Ala Ala Gln 35 40 45 atg atg ctg aat aat ccc cta ttt gct gga aat cct cag ctt caa gaa 254 Met Met Leu Asn Asn Pro Leu Phe Ala Gly Asn Pro Gln Leu Gln Glu 50 55 60 caa atg aga caa cag ctc cca act ttc ctc caa caa atg cag aat cct 302 Gln Met Arg Gln Gln Leu Pro Thr Phe Leu Gln Gln Met Gln Asn Pro 65 70 75 gat aca cta tca gca atg tca aac cct aga gca atg cag gcc ttg tta 350 Asp Thr Leu Ser Ala Met Ser Asn Pro Arg Ala Met Gln Ala Leu Leu 80 85 90 cag att cag cag ggt tta cag aca tta gca acg gaa gcc ccg ggc ctc 398 Gln Ile Gln Gln Gly Leu Gln Thr Leu Ala Thr Glu Ala Pro Gly Leu 95 100 105 110 atc cca ggg ttt act cct ggc ttg ggg gca tta gga agc act gga ggc 446 Ile Pro Gly Phe Thr Pro Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ser Thr Gly Gly 115 120 125 tct tcg gga act aat gga tct aac gcc aca cct agt gaa aac aca agt 494 Ser Ser Gly Thr Asn Gly Ser Asn Ala Thr Pro Ser Glu Asn Thr Ser 130 135 140 ccc aca gca gga acc act gaa cct gga cat cag cag ttt att cag cag 542 Pro Thr Ala Gly Thr Thr Glu Pro Gly His Gln Gln Phe Ile Gln Gln 145 150 155 atg ctg cag gct ctt gct gga gta aat cct cag cta cag aat cca gaa 590 Met Leu Gln Ala Leu Ala Gly Val Asn Pro Gln Leu Gln Asn Pro Glu 160 165 170 gtc aga ttt cag caa caa ctg gaa caa ctc agt gca atg gga ttt ttg 638 Val Arg Phe Gln Gln Gln Leu Glu Gln Leu Ser Ala Met Gly Phe Leu 175 180 185 190 aac cgt gaa gca aac ttg caa gct cta ata gca aca gga ggt gat atc 686 Asn Arg Glu Ala Asn Leu Gln Ala Leu Ile Ala Thr Gly Gly Asp Ile 195 200 205 aat gca gct att gaa agg tta ctg ggc tcc cag cca tca tag cag cat 734 Asn Ala Ala Ile Glu Arg Leu Leu Gly Ser Gln Pro Ser 210 215 219 ttctgtatct tgaaaaaatg taatttattt ttgataacgg ctcttaaact ttaaaatacc 794 tgctttattt cattgtgact cttggaattc tgtgctgtta taaacaaacc caatatgatg 854 cattttaagg tggagtacag taagatgtgt gggtttctct gtatttntct tttctggaac 914 agtgggaatt aaggctactg catgcatcac ttctgcattt attgta 960 <210> 3 <211> 17 <212> Artificial Sequence <220> <223> Designated oligonucleotide primer to amplify gene <400> 3 CCTCCTGTGG GACTTGT 17 <210> 4 <211> 17 <212> Artificial Sequence <220> <223> Designated oligonucleotide primer to amplify gene <400> 4 GCCCCCAAGC CAGGAGT 17 <210> 5 <211> 17 <212> Artificial Sequence <220> <223> Designated oligonucleotide primer to amplify gene <400> 5 CCCGAAGAGC CTCCAGT 17
【図１】HeLa細胞及びCOS-1細胞を用いて、本蛋白質の
増殖促進効果を確認した結果を示す図である。Ａ〜Ｃの
各グラフの上に、使用した細胞の種類を示す。各試験区
のデータはそれぞれ2連の平均値を示す。[vec]欄の数字
は、ベクターpcDL-SRa296の導入量をμg単位で示し、[K
45]欄の数字は、発現プラスミドpcDL-K45の導入量をμg
単位で示す。最下段は、プラスミド導入から細胞数測定
までの培養時間を示す。
増殖促進効果を確認した結果を示す図である。Ａ〜Ｃの
各グラフの上に、使用した細胞の種類を示す。各試験区
のデータはそれぞれ2連の平均値を示す。[vec]欄の数字
は、ベクターpcDL-SRa296の導入量をμg単位で示し、[K
45]欄の数字は、発現プラスミドpcDL-K45の導入量をμg
単位で示す。最下段は、プラスミド導入から細胞数測定
までの培養時間を示す。
【図２】発現プラスミドpcDL-K45の構造を示す図であ
る。Amprは、アンピシリン耐性遺伝子を示す。
る。Amprは、アンピシリン耐性遺伝子を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA07 AA20 BA01 CA03 DA02 DA03 EA04 GA11 GA18 HA01 4B064 AG13 CA10 CA19 CC24 DA01 DA10 DA11 4B065 AA90X AA93X AA93Y CA24 CA41 CA44 CA47 CA60 4H045 AA10 AA20 BA10 CA41 DA30 EA60 FA72 FA74
Claims (3)
- 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれる１
以上の蛋白質を細胞に産生させることを特徴とする細胞
増殖促進方法。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白
質。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１
もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、細胞増殖促進作用を有
する蛋白質。 - 【請求項２】（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコードする
塩基配列を有する１以上のＤＮＡが導入されてなる細胞
を培養する工程を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】細胞が、動物細胞である請求項１または２
のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000011458A JP2001204471A (ja) | 2000-01-20 | 2000-01-20 | 細胞増殖促進方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000011458A JP2001204471A (ja) | 2000-01-20 | 2000-01-20 | 細胞増殖促進方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001204471A true JP2001204471A (ja) | 2001-07-31 |
Family
ID=18539316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000011458A Pending JP2001204471A (ja) | 2000-01-20 | 2000-01-20 | 細胞増殖促進方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001204471A (ja) |
-
2000
- 2000-01-20 JP JP2000011458A patent/JP2001204471A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Palladino et al. | dADAR, a Drosophila double-stranded RNA-specific adenosine deaminase is highly developmentally regulated and is itself a target for RNA editing | |
| US6300110B1 (en) | Peptides related to TPC2 and TPC3, two proteins that are coexpressed with telomerase activity | |
| JPH08503128A (ja) | 転写因子ｄｐ−１ | |
| JP2012065671A (ja) | Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＰ−糖タンパク質およびその使用 | |
| WO2000012525A1 (en) | Sequences characteristic of hypoxia-regulated gene transcription | |
| JP2005519584A5 (ja) | ||
| US5686598A (en) | Genes associated with retinal dystrophies | |
| US20020160451A1 (en) | Novel orphan receptors | |
| JP2002519027A (ja) | 網膜芽腫結合タンパク質（ｒｂｐ−７）をコードする核酸および前記核酸に関連する多型マーカー | |
| US7045316B2 (en) | Transporter genes OATP-B,C,D, and E | |
| JP2006517181A (ja) | Ｂｂｂ−特異的タンパク質およびその断片を同定する方法 | |
| AU710551B2 (en) | Nucleic acid encoding a nervous tissue sodium channel | |
| WO2001057189A9 (en) | Fas pathway genes | |
| JP2001204471A (ja) | 細胞増殖促進方法 | |
| Nuell et al. | Approach to the isolation of antiproliferative genes | |
| JP2002112777A (ja) | 新規精巣特異的遺伝子 | |
| EP1220911B1 (en) | P-glycoproteins and uses thereof | |
| US5231009A (en) | Cdnas coding for members of the carcinoembryonic antigen family | |
| Qi et al. | Isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and characterizations of two novel full-length genes | |
| US6855812B2 (en) | P-glycoproteins and uses thereof | |
| WO2001018037A2 (en) | A p53-induced protein with a death domain that can promote apoptosis | |
| JP4723133B2 (ja) | 新規ヒトｂｍｃｃ１遺伝子 | |
| US20020182694A1 (en) | Novel gene and polypeptide which opposes the Fas pathway | |
| Wen et al. | Structural and functional analysis of the porcine secretory carrier membrane protein 1 gene (SCAMP1) | |
| JP2003259871A (ja) | 脳特異的発現を示す分泌タンパク質ｃｒｅｇ２とその利用 |