JP2001157591A - Body weight modulator, correspondent nucleic acid or protein and their diagnostic or therapeutic use - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a nucleic acid capable of hybridizing to a DNA molecule encoding a body weight modulator which permits the control of fat accumulation and fat content in mammals. SOLUTION: The nucleic acid and an antisense nucleic acid molecule which are capable of hybridizing to the DNA molecule encoding an obesity(OB) polypeptide and are detectable when being labelled, a nucleic acid capable of hybridizing to a noncode domain of an OB nucleic acid and an oligonucleotide primer for amplifying a human genomic DNA encoding the OB polypeptide are obtained.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、哺乳動物
（動物およびヒトを包含する）の体重の制御に関する。
そしてより詳細には、本発明は、体重のモジュレーター
として本明細書中に同定された物質、およびこのような
モジュレーターが適用され得る診断および治療用途に関
する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to controlling the weight of mammals (including animals and humans).
And more particularly, the present invention relates to the substances identified herein as modulators of body weight, and diagnostic and therapeutic applications to which such modulators may be applied.

【０００２】[0002]

【従来の技術】肥満症（痩身体重に対する体脂肪過剰と
定義される）は、重要な心理的および医学的な病的状態
に関連している。後者は、高血圧、血中脂肪の上昇、お
よびII型または非インスリン依存性真性糖尿病(NIDDM)
を包含する。米国では600万から1000万人がNIDDMにかか
っており、この中には65歳齢群の18％を含む［Harris
ら,Int. J. Obes., 11:275-283(1987)]。NIDDMにかかっ
ている男性の約45％および女性の約70％が肥満症であ
り、そして彼らの糖尿病は、体重を減少させることによ
り実質的に改善されるか、または取り除かれる［Harri
s, Diabetes Care, 14(3):639-648(1991)]。以下に記載
されるように、肥満症およびNIDDMは両方とも遺伝性が
強いが、素因となる遺伝子は未だ同定されていない。こ
れらの代謝関連障害の分子遺伝学的基礎は、重要である
があまり理解されていない問題である。BACKGROUND OF THE INVENTION Obesity (defined as excess body fat relative to lean body weight) is associated with important psychological and medical morbidity. The latter include hypertension, elevated blood fat, and type II or non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM)
Is included. NIDDM affects 6 to 10 million people in the United States, including 18% of 65-year-olds [Harris
Et al., Int. J. Obes., 11: 275-283 (1987)]. About 45% of men and 70% of women with NIDDM are obese, and their diabetes is substantially improved or eliminated by losing weight [Harri
s, Diabetes Care, 14 (3): 639-648 (1991)]. As described below, obesity and NIDDM are both highly hereditary, but the predisposing genes have not yet been identified. The molecular genetic basis of these metabolic-related disorders is an important but poorly understood issue.

【０００３】栄養エネルギーの同化、蓄積、および利用
は、後生動物の生存の中心にある複雑な恒常性系を構成
している。陸上生活哺乳動物の間では、トリグリセリド
としての大量の代謝燃料の脂肪組織中の蓄積が、食物が
涸渇したときの生存期間にとってきわめて重要である。
生物体の大きさおよび形状に連続的な変化を生じさせる
ことなく固定レベルのエネルギー貯蔵を維持しようとす
る要求には、エネルギー摂取および消費間の平衡の達成
が必要とされる。しかし、エネルギー平衡を調節する分
子機構はまだ解明されていない。栄養情報を変換してエ
ネルギー平衡の制御を行う分子の単離が、健康および疾
患状態の体重の調節の理解にとって重要である。[0003] The assimilation, accumulation and utilization of nutrient energy constitute a complex homeostatic system at the heart of metazoan survival. Among terrestrial mammals, the accumulation of large amounts of metabolic fuel in the adipose tissue as triglycerides is crucial for survival when food is depleted.
The need to maintain a fixed level of energy storage without causing a continuous change in the size and shape of the organism requires achieving a balance between energy intake and expenditure. However, the molecular mechanism that regulates energy balance has not yet been elucidated. The isolation of molecules that convert nutritional information and control energy balance is important for understanding the regulation of body weight in health and disease states.

【０００４】脂肪蓄積の個体レベルは、大部分は遺伝的
に決定される。一卵性および二卵性の双生児または養子
とその生物学的親との間の体重および脂肪蓄積の一致率
の試験は、肥満症の遺伝性（0.4〜0.8）が、実質的遺伝
成分を有すると一般に考えられている特性（例えば、精
神***症、アルコール依存症、およびアテローム性動脈
硬化症）の遺伝性より高いことを示唆した［Stunkard
ら、N. Engl. J. Med.,322:1483-1487(1990)］。エネル
ギー消費率の家族制の類似もまた報告されている［Boga
rdusら、Diabetes, 35:1-5(1986)］。地理的に限定した
集団内の遺伝学的解析は比較的少数の遺伝子が身体組成
の変動の30〜50％の原因となり得ることを示唆する［Mo
llら, Am. J. Hum. Genet., 49:1243-1255(1991)]。し
かし、一般集団における肥満症の原因となる遺伝子はひ
とつも明確な染色体上の位置に対して遺伝学的にマッピ
ングされていない。[0004] The individual level of fat accumulation is largely determined genetically. Testing for the identity of body weight and fat accumulation between monozygotic and dizygotic twins or adoptives and their biological parents indicates that obesity heritability (0.4-0.8) has a substantial genetic component. This suggests that hereditary traits are higher than the heritable nature of commonly thought characteristics (eg, schizophrenia, alcoholism, and atherosclerosis) [Stunkard
N. Engl. J. Med., 322: 1483-1487 (1990)]. Similarities in the family system of energy consumption rates have also been reported [Boga
rdus et al., Diabetes, 35: 1-5 (1986)]. Genetic analysis within a geographically limited population suggests that relatively few genes can contribute 30 to 50% of body composition variability [Mo
ll et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 1243-1255 (1991)]. However, none of the genes responsible for obesity in the general population have been genetically mapped to distinct chromosomal locations.

【０００５】肥満症の齧歯類モデルは７つの見かけ上単
一遺伝子の変異を包含する。最も集中的に研究されてい
るマウス肥満症変異はob（肥満）遺伝子およびdb（糖尿
病）遺伝子である。同一の遺伝系統背景上に存在する場
合、obおよびdbは識別し得ない代謝および行動表現型を
生じ、このことは、これらの遺伝子が同一の生理学的経
路において機能し得ることを示唆する［Colemanら, Dia
betologia, 14:141-148(1978)]。いずれかの変異に対し
て同型接合性のマウスは過食および代謝低下性であり、
１カ月齢で顕著である肥満表現型となる。これらの動物
の体重は60〜70ｇで安定する傾向にある（比較してコン
トロールマウスでは30〜35ｇである）。obおよびdb動物
は非常に多くの他のホルモンおよび代謝の変化を発現
し、これにより変異に寄与し得る一次欠損を同定するこ
とが困難になる［Brayら, Am. J. Clin. Nutr., 50:891
-902(1989)]。[0005] The rodent model of obesity involves seven apparently single gene mutations. The most intensively studied mouse obesity variants are the ob (obesity) gene and the db (diabetes) gene. When present on the same genetic lineage background, ob and db give rise to indistinguishable metabolic and behavioral phenotypes, suggesting that these genes may function in the same physiological pathway [Coleman Et Dia
betologia, 14: 141-148 (1978)]. Mice homozygous for either mutation are hyperphagic and hypometabolic,
The obese phenotype becomes prominent at one month of age. The weight of these animals tends to stabilize at 60-70 g (compared to 30-35 g for control mice). Ob and db animals express numerous other hormonal and metabolic changes, which make it difficult to identify primary defects that can contribute to the mutation [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50: 891
-902 (1989)].

【０００６】各齧歯類肥満症モデルには、ヒトのII型糖
尿病に類似する炭水化物代謝の変化が伴う。ある場合で
は、糖尿病の重篤度は背景マウス系統に部分的に依存す
る［Leiter, Endocrinology, 124:912-922(1989)]。ob
およびdbの両方に対して、類遺伝子性（congenic）C57B
L/Kマウスは、極度のβ細胞壊死および小島萎縮を有す
る重度の糖尿病を発症し、相対的インスリン不足（rela
tive insulinopenia）を生じる。逆に、類遺伝子性C57B
L/6J obおよびdbマウスは、β細胞肥大により最終的に
補償される一時的インスリン抵抗性糖尿病を発症し、こ
れはヒトII型糖尿病に類似する。[0006] Each rodent obesity model is accompanied by alterations in carbohydrate metabolism similar to human type II diabetes. In some cases, the severity of diabetes is partly dependent on the background mouse strain [Leiter, Endocrinology, 124: 912-922 (1989)]. ob
Congenic C57B for both and db
L / K mice develop severe diabetes with extreme β-cell necrosis and islet atrophy and a relative insulin deficiency (rela
tive insulin openia). Conversely, congenic C57B
L / 6J ob and db mice develop transient insulin-resistant diabetes ultimately compensated by β-cell hypertrophy, similar to human type II diabetes.

【０００７】obおよびdbマウスの表現型は、糖尿病の進
行以外の点でヒト肥満症に類似する−−変異マウスは、
痩身型コントロールより食餌量が多くエネルギー消費量
が少ない（肥満者と同様）。この表現型はまた視床下部
腹内側部の病巣を有する動物で見られる表現型とかなり
類似しており、このことは、両変異が適切に中枢神経系
内で栄養情報を統合するかまたはこれに応答する能力を
妨害し得ることを示唆する。この仮説の支持は並体癒合
実験の結果から生じる［Colemanら, Diabetologia, 9:2
94-298(1973)]。この実験結果は、obマウスは循環飽食
因子が欠損しており、そしてdbマウスはob因子の影響に
対して抵抗性である（おそらくobレセプター欠損のため
と思われる）ことを示唆する。これらの実験は、これら
の変異マウスの肥満症が、身体組成を制御する仮定のフ
ィードバック機構の輸入ループ（afferent loop）およ
び／または統合中枢における異なる欠陥から生じ得ると
いう結論を導いた。[0007] The phenotype of ob and db mice resembles human obesity except for the development of diabetes--mutant mice
More food and less energy consumption than lean controls (similar to obese). This phenotype is also quite similar to that seen in animals with focal ventromedial hypothalamus, which indicates that both mutations properly integrate nutritional information within the central nervous system or Suggests that it may interfere with the ability to respond. Support for this hypothesis arises from the results of parallel fusion experiments [Coleman et al., Diabetologia, 9: 2
94-298 (1973)]. The experimental results suggest that ob mice are deficient in circulating satiety factors and db mice are resistant to the effects of ob factors (perhaps due to ob receptor deficiency). These experiments have led to the conclusion that obesity in these mutant mice can result from different defects in the afferent loop and / or the integration center of the hypothetical feedback mechanism controlling body composition.

【０００８】分子マーカーおよび従来の遺伝子マーカー
を用いて、ob遺伝子およびdb遺伝子はそれぞれ、近位の
第６染色体および第４染色体中央部にマッピングされた
［Baharyら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:8642-864
6(1990)；Friedmanら, Genomics，11:1054-1062(199
1)]。両場合とも、変異は、ヒトとシンテニー（synteni
c）であるマウスゲノム領域にマッピングされるので、
これにより、obおよびdbのヒトホモログが存在すれば、
それらはそれぞれ、ヒト染色体7qおよび1pにマッピング
されると思われることが示唆される。db遺伝子の欠損に
より、他の哺乳動物種で肥満症が生じ得る：Zucker fa/
faラットおよびBrown Norway ＋／＋ラット間の遺伝子
交雑において、fa変異（ラット第５染色体）はマウスの
dbに隣接する同じ遺伝子座により隣接される［Truett
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809(199
1)]。Using molecular and conventional genetic markers, the ob and db genes have been mapped to proximal chromosomes 6 and 4 respectively [Bahary et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 8642-864
6 (1990); Friedman et al., Genomics, 11: 1054-1062 (199
1)]. In both cases, the mutations are human and synteny (synteni)
c) is mapped to the mouse genomic region
Thus, if there are human homologs of ob and db,
It is suggested that they appear to map to human chromosomes 7q and 1p, respectively. Defects in the db gene can cause obesity in other mammalian species: Zucker fa /
In the genetic cross between the fa rat and the Brown Norway + / + rat, the fa mutation (rat chromosome 5) was
flanked by the same locus flanking the db [Truett
Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806-7809 (199
1)].

【０００９】体重に影響を及ぼすと思われる非常に多く
の因子のために、どの因子が、そしてより詳細にはどの
恒常性機構が体重の主要な決定因子となるのか推定する
ことができなかった。従って、本発明の基となる主要な
問題は、哺乳動物の脂肪蓄積および脂肪含量の制御を可
能にする体重のモジュレーターを提供することである。Because of the large number of factors that appear to affect weight, it was not possible to estimate which factors, and more particularly, which homeostasis mechanisms would be the main determinants of weight. . Accordingly, a major problem underlying the present invention is to provide a modulator of body weight that allows for control of fat accumulation and fat content in mammals.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の基と
なる主要な問題は、哺乳動物の脂肪蓄積および脂肪含量
の制御を可能にする体重のモジュレーターをコードする
DNA分子にハイブリダイズし得る検出可能な標識をされ
た核酸分子およびアンチセンス核酸分子、非コード領域
にハイブリダイズし得る核酸、ならびにコードするヒト
ゲノムDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライ
マーを提供することである。Accordingly, a major problem underlying the present invention is that it encodes a modulator of body weight that allows the control of fat accumulation and fat content in mammals.
By providing detectably labeled and antisense nucleic acid molecules capable of hybridizing to DNA molecules, nucleic acids capable of hybridizing to non-coding regions, and oligonucleotide primers for amplifying the encoding human genomic DNA. is there.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】本発明は、一般に、哺乳
動物（動物およびヒトを包含する）の体重の制御に関す
る。そしてより詳細には、本発明は、体重のモジュレー
ターとして本明細書中に同定された物質、およびこのよ
うなモジュレーターが適用され得る診断および治療用途
に関する。その最も広い局面では、本発明は、ヌクレオ
チド配列の解明および発見、およびこのようなヌクレオ
チドまたはそれらの変質性変異体により発現されると推
定されるタンパク質に関し、それらは哺乳動物の体重の
制御に関与する能力を示す。目的のヌクレオチド配列
は、マウスおよびヒトのOB遺伝子に相当する遺伝子を表
し、これが体重および脂肪蓄積の調節に重要な役割を果
たすと仮定されている。本明細書中に示した予備的なデ
ータは、目的の遺伝子のポリペプチド産物がホルモンと
して機能することを示唆している。本発明はさらに、分
子プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅の
プライマーとして有用な核酸分子、すなわち合成または
天然のオリゴヌクレオチドを提供する。さらなる局面で
は、本発明は、本発明の核酸を含むクローニングベクタ
ー；および本発明の核酸を、発現制御配列と作動可能に
関連させて含む細菌発現ベクター、昆虫発現ベクター、
または哺乳動物発現ベクターを提供する。従って、本発
明はさらに、適切な発現ベクターでトランスフェクトま
たはトランスフォームされた細菌細胞または哺乳動物細
胞、および対応して本発明のモジュレーターの調製にお
ける上記構築物の使用に関する。OBポリペプチドに対す
る抗体もまた提供される。さらに、哺乳動物の体重を調
整する方法が提供される。特定の実施例では、マウスお
よびヒトのOBポリペプチドの２つのイソ型をコードする
遺伝子が提供される。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention generally relates to controlling the weight of mammals (including animals and humans). And more particularly, the present invention relates to the substances identified herein as modulators of body weight, and diagnostic and therapeutic applications to which such modulators may be applied. In its broadest aspect, the present invention relates to the elucidation and discovery of nucleotide sequences, and the proteins putatively expressed by such nucleotides or their degenerate variants, which are involved in controlling the weight of mammals Show your ability to The nucleotide sequence of interest represents a gene that corresponds to the mouse and human OB genes, which have been postulated to play an important role in regulating body weight and fat accumulation. Preliminary data presented herein suggest that the polypeptide product of the gene of interest functions as a hormone. The invention further provides nucleic acid molecules, ie, synthetic or natural oligonucleotides, useful as molecular probes or primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification. In a further aspect, the invention provides a cloning vector comprising a nucleic acid of the invention; and a bacterial expression vector, an insect expression vector comprising a nucleic acid of the invention operably associated with an expression control sequence,
Alternatively, a mammalian expression vector is provided. Accordingly, the present invention further relates to bacterial or mammalian cells transfected or transformed with a suitable expression vector, and correspondingly the use of the above constructs in the preparation of a modulator of the present invention. Antibodies to the OB polypeptide are also provided. Further, a method for adjusting the weight of a mammal is provided. In certain embodiments, genes encoding two isoforms of the mouse and human OB polypeptides are provided.

【００１２】本発明によれば、動物において体重を調整
し得る、約145〜約167アミノ酸を有する肥満症（OB）ポ
リペプチド、あるいはフラグメントを包含する、同じ生
物学的活性を有するそれらの対立遺伝子変異体またはア
ナログが提供される。According to the present invention, alleles having the same biological activity, including obesity (OB) polypeptides or fragments having about 145 to about 167 amino acids, which are capable of regulating body weight in animals, are provided. Variants or analogs are provided.

【００１３】１つの実施態様によれば、前記OBポリペプ
チド、あるいはフラグメントを包含する、それらの対立
遺伝子変異体またはアナログは、配列番号２、４、５、
または６のアミノ酸配列を含む。According to one embodiment, said allelic variants or analogs, including said OB polypeptides or fragments, are those of SEQ ID NOs: 2, 4, 5,
Or 6 amino acid sequences.

【００１４】本発明によれば、前記OBポリペプチドの免
疫原性フラグメントが提供される。According to the present invention there is provided an immunogenic fragment of the OB polypeptide.

【００１５】本発明によれば、以下の配列からなる群よ
り選択されるOBポリペプチドの免疫原性フラグメントが
提供される： Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Le
u-Ile-Lys-Thr（配列番号１８）； Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Th
r-Leu-Ala（配列番号１９）； Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gl
n-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp（配列番号２０）；および Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gl
n-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys（配列番号２１）。According to the present invention there is provided an immunogenic fragment of an OB polypeptide selected from the group consisting of: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp- Thr-Lys-Thr-Le
u-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Th
r-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gl
n-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20); and Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gl
n-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21).

【００１６】１つの実施態様によれば、前記ヒトOBポリ
ペプチドアナログはアミノ酸53、56、71、85、89、92、
95、98、110、118、121、122、126、127、128、129、13
2、139、157、159、163、および166（配列番号４の番号
付けに従う）からなる群から選択される１つまたはより
多くのアミノ酸が別のアミノ酸と置換されている。According to one embodiment, the human OB polypeptide analog comprises amino acids 53, 56, 71, 85, 89, 92,
95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 13
One or more amino acids selected from the group consisting of 2, 139, 157, 159, 163, and 166 (according to the numbering of SEQ ID NO: 4) have been replaced with another amino acid.

【００１７】１つの実施態様によれば、前記ヒトOBポリ
ペプチドアナログは、前記置換が、配列番号２に記載の
マウスOBポリペプチドの分岐アミノ酸とで行われる。According to one embodiment, in said human OB polypeptide analog, said substitution is made with a branched amino acid of the mouse OB polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2.

【００１８】１つの実施態様によれば、前記ヒトOBポリ
ペプチドアナログは、前記置換が、アラニンとで行われ
る。According to one embodiment, in said human OB polypeptide analog, said substitution is made with alanine.

【００１９】１つの実施態様によれば、前記ヒトOBポリ
ペプチドアナログは以下のポリペプチドからなる群から
選択される： （ａ）５３位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリ
ン、システイン、メチオニン、またはトレオニンと置換
される； （ｂ）９８位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリ
ン、システイン、メチオニン、またはトレオニンと置換
される；および （ｃ）９２位のアルギニン残基がアスパラギン、リジ
ン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、セリン、トレオニン、メチオニン、またはシス
テインと置換される。According to one embodiment, said human OB polypeptide analog is selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) the serine residue at position 53 is glycine, alanine, valine, cysteine, methionine; Or (b) replacing the serine residue at position 98 with glycine, alanine, valine, cysteine, methionine, or threonine; and (c) replacing the arginine residue at position 92 with asparagine, lysine, or histidine. , Glutamine, glutamic acid, aspartic acid, serine, threonine, methionine, or cysteine.

【００２０】１つの実施態様によれば、前記OBポリペプ
チドアナログは、配列番号２、４、５、または６に記載
のヒトOBポリペプチドアミノ酸配列と、83％以上のアミ
ノ酸配列相同性を有する。According to one embodiment, the OB polypeptide analog has at least 83% amino acid sequence homology with the human OB polypeptide amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 5, or 6.

【００２１】１つの実施態様によれば、前記ヒトOBポリ
ペプチドアナログは、以下のポリペプチドからなる群か
ら選択される： （ａ）１つまたはより多くのアスパラギン酸残基がグル
タミン酸と置換される； （ｂ）１つまたはより多くのイソロイシン残基がロイシ
ンと置換される； （ｃ）１つまたはより多くのグリシンまたはバリン残基
がアラニンと置換される； （ｄ）１つまたはより多くのアルギニン残基がヒスチジ
ンと置換される； （ｅ）１つまたはより多くのチロシンまたはフェニルア
ラニン残基がトリプトファンと置換される； （ｆ）121位から128位（配列番号４の番号付けに従う）
の１つまたはより多くの残基がグリシンまたはアラニン
と置換される；および （ｇ）54位から60位または118位から166位（配列番号４
の番号付けに従う）の１つまたはより多くの残基がリジ
ン、グルタミン酸、システイン、またはプロリンと置換
される。According to one embodiment, said human OB polypeptide analog is selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) one or more aspartic acid residues are replaced with glutamic acid (B) one or more isoleucine residues are replaced with leucine; (c) one or more glycine or valine residues are replaced with alanine; (d) one or more Arginine residues are replaced with histidine; (e) one or more tyrosine or phenylalanine residues are replaced with tryptophan; (f) positions 121 to 128 (according to the numbering of SEQ ID NO: 4)
One or more residues is replaced with glycine or alanine; and (g) positions 54-60 or 118-166 (SEQ ID NO: 4)
One or more residues are replaced with lysine, glutamic acid, cysteine, or proline.

【００２２】１つの実施態様によれば、前記OBポリペプ
チドは、以下のポリペプチドからなる群から選択され
る： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている；および
（ｂ）21位でメチオニン、または18位から21位でグリシ
ン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号３
８）、または１位から21位でメチオニン−グリシン−セ
リン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン
−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン
−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配
列番号９８）を有するサブパート（ａ）のポリペプチ
ド。According to one embodiment, said OB polypeptide is selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) residues 1 to 21 are deleted; and (b) ) A methionine at position 21 or a glycine-serine-histidine-methionine sequence at positions 18 to 21 (SEQ ID NO: 3)
8) or methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine- at positions 1 to 21
The polypeptide of subpart (a) having the histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98).

【００２３】１つの実施態様によれば、前記OBポリペプ
チドは、以下のポリペプチドからなる群から選択され
る： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている；および
（ｂ）14位から21位でロイシン−グルタミン酸−リジン
−アルギニン−グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸
−アラニン配列（配列番号２６）、または18位から21位
でグルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配
列（配列番号２７）、または18位から21位でロイシン−
グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（配列番号２
８）、または２位から21位でメチオニン−グリシン−セ
リン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン
−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン
−グリシン−セリン−プロリン配列（配列番号９９）、
または18位から21位でグリシン−セリン−プロリン配列
を有するサブパート（ａ）のポリペプチド。According to one embodiment, said OB polypeptide is selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) residues 1 to 21 are deleted; and (b) A) a leucine-glutamic acid-lysine-arginine-glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence at positions 14 to 21 (SEQ ID NO: 26), or a glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence at positions 18 to 21 (SEQ ID NO: 27); Or leucine at positions 18-21
Glutamic acid-lysine-arginine sequence (SEQ ID NO: 2
8) or methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine- at positions 2 to 21
A histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99);
Or the polypeptide of subpart (a) having a glycine-serine-proline sequence at positions 18-21.

【００２４】１つの実施態様によれば、前記OBポリペプ
チドは、以下のポリペプチドからなる群から選択され
る： （ａ）１位から21位の残基が欠失されている；および
（ｂ）21位でメチオニン、または18位から21位でグリシ
ン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列番号３
８）、または１位から21位でメチオニン−グリシン−セ
リン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン
−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン
−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配
列番号９８）、または14位から21位でロイシン−グルタ
ミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニン
−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、また
は18位から21位でグルタミン酸−アラニン−グルタミン
酸−アラニン配列（配列番号２７）、または18位から21
位でロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列
（配列番号２８）、または２位から21位でメチオニン−
グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セ
リン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン
−アルギニン−グリシン−セリン−プロリン配列（配列
番号９９）、または18位から21位でグリシン−セリン−
プロリン配列を有するサブパート（ａ）のポリペプチ
ド。According to one embodiment, said OB polypeptide is selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) residues 1 to 21 are deleted; and (b) ) A methionine at position 21 or a glycine-serine-histidine-methionine sequence at positions 18 to 21 (SEQ ID NO: 3)
8) or methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine- at positions 1 to 21
Histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98), or leucine-glutamic acid-lysine-arginine-glutamic acid at positions 14-21. An alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 26), or a glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence at positions 18 to 21 (SEQ ID NO: 27), or 18 to 21
A leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence at position (SEQ ID NO: 28), or a methionine at positions 2 to 21;
Glycine-serine-serine-histidine-histidine-
Histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99), or glycine-serine at positions 18-21.
The polypeptide of subpart (a) having a proline sequence.

【００２５】１つの実施態様によれば、前記ヒトOBポリ
ペプチド短縮型アナログは、以下のポリペプチドからな
る群（配列番号４の番号付けに従う）から選択される： （ａ）121位から128位の１つまたはより多くの残基が欠
失される； （ｂ）１〜116位の残基が欠失される； （ｃ）１〜21位および54〜167位の残基が欠失される； （ｄ）１〜60位および117〜167位の残基が欠失される； （ｅ）１〜60位の残基が欠失される； （ｆ）１〜53位の残基が欠失される； （ｇ）１〜21位の残基が欠失されるサブパート（ａ）の
アナログ；および （ｈ）以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸ま
たはアミノ酸配列を有するサブパート（ａ）から（ｇ）
のアナログ： （１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒスチジ
ン−メチオニン配列（配列番号３８）、（３）メチオニ
ン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン
−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロ
リン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メ
チオニン配列（配列番号９８）、（４）ロイシン−グル
タミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニ
ン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、
（５）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニ
ン配列（配列番号２７）、（６）ロイシン−グルタミン
酸−リジン−アルギニン配列（配列番号２８）、（７）
メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒ
スチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリ
ン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−プロリ
ン配列（配列番号９９）、および（８）グリシン−セリ
ン−プロリン配列。According to one embodiment, said truncated analog of human OB polypeptide is selected from the group consisting of the following polypeptides (according to the numbering of SEQ ID NO: 4): (a) positions 121 to 128 (B) residues 1 to 116 are deleted; (c) residues 1 to 21 and 54 to 167 are deleted (D) residues at positions 1-60 and 117-167 are deleted; (e) residues at positions 1-60 are deleted; (f) residues at positions 1-53 are deleted. (G) an analog of subpart (a) in which residues 1-21 are deleted; and (h) a subpart (a) having an N-terminal amino acid or amino acid sequence selected from the group consisting of: ) To (g)
Analogs of (1) methionine, (2) glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 38), (3) methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine- Serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98), (4) leucine-glutamic acid-lysine-arginine-glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 26) ,
(5) glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 27), (6) leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence (SEQ ID NO: 28), (7)
Methionine-glycine-serine-serine-histidine-
Histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99), and (8) glycine-serine-proline sequence.

【００２６】本発明によれば、組換えOBポリペプチドが
提供される。According to the present invention, there is provided a recombinant OB polypeptide.

【００２７】本発明によれば、化学合成OBポリペプチド
が提供される。According to the present invention, there is provided a chemically synthesized OB polypeptide.

【００２８】本発明によれば、１つまたはそれより多く
の化学部分が結合している、前記OBポリペプチドの誘導
体が提供される。According to the present invention there is provided a derivative of said OB polypeptide, wherein one or more chemical moieties are attached.

【００２９】１つの実施態様によれば、前記化学部分は
水溶性ポリマーである。According to one embodiment, said chemical moiety is a water-soluble polymer.

【００３０】１つの実施態様によれば、前記水溶性ポリ
マーはポリエチレングリコールである。According to one embodiment, the water-soluble polymer is polyethylene glycol.

【００３１】１つの実施態様によれば、前記誘導体は、
モノPEG化、ジPEG化、トリPEG化、またはテトラPEG化さ
れている。According to one embodiment, the derivative is
It is mono-, di-, tri-, or tetra-PEGylated.

【００３２】１つの実施態様によれば、前記誘導体は、
Ｎ末端がモノPEG化されている。According to one embodiment, the derivative is
The N-terminus is monoPEGylated.

【００３３】１つの実施態様によれば、前記誘導体は、
配列番号４の22位から167位のアミノ酸残基または配列
番号６の22位から166位の残基を含むOBポリペプチドで
ある。According to one embodiment, the derivative is
An OB polypeptide comprising the amino acid residues from positions 22 to 167 of SEQ ID NO: 4 or the residues from positions 22 to 166 of SEQ ID NO: 6.

【００３４】１つの実施態様によれば、前記誘導体は、
配列番号４の22位から167位のアミノ酸残基または配列
番号６の22位から166位の残基を含み、そして21位にメ
チオニンを有するOBポリペプチドである。According to one embodiment, the derivative is
OB polypeptide comprising an amino acid residue from position 22 to position 167 of SEQ ID NO: 4 or a residue from position 22 to position 166 of SEQ ID NO: 6 and having methionine at position 21.

【００３５】本発明によれば、前記のOBポリペプチドを
コードする単離された核酸分子が提供される。According to the present invention, there is provided an isolated nucleic acid molecule encoding the above-mentioned OB polypeptide.

【００３６】本発明によれば、哺乳動物の体重を調整す
る生物学的活性を有するOBポリペプチドの発現を得るた
めに用いられるDNA分子であって、以下からなる群から
選択される、DNA分子： （ａ）配列番号１および３に記載のDNA分子またはそれ
らのフラグメント； （ｂ）（ａ）に定義したDNA分子とハイブリダイズするD
NA分子またはそれらのハイブリダイズし得るフラグメン
ト；および （ｃ）該DNA分子のいずれかによりコードされるアミノ
酸配列の発現をコードするDNA分子、が提供される。According to the present invention, there is provided a DNA molecule used for obtaining expression of an OB polypeptide having a biological activity that regulates the weight of a mammal, wherein the DNA molecule is selected from the group consisting of: : (A) a DNA molecule as set forth in SEQ ID NOs: 1 and 3 or a fragment thereof; (b) a D that hybridizes with the DNA molecule as defined in (a)
NA molecules or hybridizable fragments thereof; and (c) DNA molecules encoding expression of the amino acid sequence encoded by any of the DNA molecules.

【００３７】１つの実施態様によれば、前記DNA分子
は、配列番号２２および２４のヒトゲノムDNA分子であ
る。According to one embodiment, said DNA molecule is the human genomic DNA molecule of SEQ ID NOS: 22 and 24.

【００３８】１つの実施態様によれば、前記DNA分子は
以下に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする： （ａ）配列番号２； （ｂ）配列番号２の22位から167位のアミノ酸； （ｃ）配列番号４； （ｄ）配列番号４の22位から167位のアミノ酸； （ｅ）配列番号５； （ｆ）配列番号５の22位から166位のアミノ酸； （ｇ）配列番号６； （ｈ）配列番号６の22位から166位のアミノ酸； （ｉ）以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸ま
たはアミノ酸配列を有するサブパート（ｂ）、（ｄ）、
（ｆ）、または（ｈ）のアミノ酸配列： （１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒスチジ
ン−メチオニン配列（配列番号３８）、（３）メチオニ
ン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン
−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロ
リン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メ
チオニン配列（配列番号９８）。According to one embodiment, said DNA molecule encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences: (a) SEQ ID NO: 2; (b) sequence (C) SEQ ID NO: 4; (d) amino acid from position 22 to position 167 of SEQ ID NO: 4; (e) SEQ ID NO: 5; (f) amino acid from position 22 of SEQ ID NO: 5 (G) SEQ ID NO: 6; (h) amino acid at positions 22 to 166 of SEQ ID NO: 6; (i) a subpart having an N-terminal amino acid or amino acid sequence selected from the group consisting of: , (D),
Amino acid sequence of (f) or (h): (1) methionine, (2) glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 38), (3) methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine -Histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98).

【００３９】１つの実施態様によれば、前記DNA分子
は、以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸配列
を有する（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、または（ｈ）のアミ
ノ酸配列をコードする： （１）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−
グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列
（配列番号２６）、（２）グルタミン酸−アラニン−グ
ルタミン酸−アラニン配列（配列番号２７）、（３）ロ
イシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（配列
番号２８）、（４）メチオニン−グリシン−セリン−セ
リン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシ
ン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシ
ン−セリン−プロリン配列（配列番号９９）、および
（５）グリシン−セリン−プロリン配列。According to one embodiment, the DNA molecule has the amino acid sequence of (b), (d), (f) or (h) having an N-terminal amino acid sequence selected from the group consisting of: Encode: (1) leucine-glutamic acid-lysine-arginine-
Glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 26), (2) glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 27), (3) leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence (SEQ ID NO: 28), (4) )) Methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99), and (5) ) Glycine-serine-proline sequence.

【００４０】１つの実施態様によれば、前記DNA分子
は、配列番号３のタンパク質コード配列として記載され
る配列を含む。According to one embodiment, said DNA molecule comprises the sequence described as the protein coding sequence of SEQ ID NO: 3.

【００４１】１つの実施態様によれば、前記DNA分子
は、配列番号３の22位から167位のアミノ酸をコードす
る配列として記載される配列を含む。According to one embodiment, said DNA molecule comprises the sequence described as a sequence encoding amino acids 22 to 167 of SEQ ID NO: 3.

【００４２】本発明によれば、前記のDNA分子にハイブ
リダイズし得る検出可能な標識をされた核酸分子が提供
される。According to the present invention, there is provided a detectably labeled nucleic acid molecule capable of hybridizing to the above-mentioned DNA molecule.

【００４３】本発明によれば、OB核酸の非コード領域に
ハイブリダイズし得る核酸であって、該非コード領域が
イントロン、５’非コード領域、および３’非コード領
域からなる群から選択される、核酸が提供される。According to the present invention, a nucleic acid capable of hybridizing to a non-coding region of an OB nucleic acid, wherein the non-coding region is selected from the group consisting of an intron, a 5 ′ non-coding region, and a 3 ′ non-coding region. , A nucleic acid is provided.

【００４４】本発明によれば、OBポリペプチドをコード
するヒトゲノムDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチ
ドプライマーが提供される。According to the present invention, there is provided an oligonucleotide primer for amplifying human genomic DNA encoding an OB polypeptide.

【００４５】１つの実施態様によれば、前記オリゴヌク
レオチドは、以下からなる群から選択される： HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3'（配列番号29） ; HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3'（配列番号30）; HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3'（配列番号31）；
および HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3'（配列番号32） 本発明によれば、前記のDNA分子を含むベクターが提供
される。According to one embodiment, said oligonucleotide is selected from the group consisting of: HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3 '(SEQ ID NO: 29); HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' ( SEQ ID NO: 30); HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3 '(SEQ ID NO: 31);
And HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3 '(SEQ ID NO: 32) According to the present invention, there is provided a vector comprising the above DNA molecule.

【００４６】本発明によれば、発現制御配列と作動可能
に関連された、前記のDNA分子を含む発現ベクターが提
供される。According to the present invention, there is provided an expression vector comprising the above-mentioned DNA molecule operably associated with an expression control sequence.

【００４７】本発明によれば、前記のDNA分子または発
現ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクト
された単細胞宿主が提供される。According to the present invention there is provided a unicellular host transformed or transfected with a DNA molecule or expression vector as described above.

【００４８】１つの実施態様によれば、前記単細胞宿主
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、お
よび組織培養におけるヒト細胞からなる群から選択され
る。According to one embodiment, said single-cell host is selected from the group consisting of bacteria, yeast, mammalian cells, plant cells, insect cells, and human cells in tissue culture.

【００４９】１つの実施態様によれば、前記単細胞宿主
は、E. coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、
酵母、CHO、R1.1、B-W、LM、COS1、COS7、BSC1、BSC4
0、BMT10、およびSf9細胞からなる群から選択される。According to one embodiment, said single cell host is E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces,
Yeast, CHO, R1.1, BW, LM, COS1, COS7, BSC1, BSC4
0, BMT10, and Sf9 cells.

【００５０】１つの実施態様によれば、前記単細胞宿主
は、Saccharomyces、Pichia、Candida、Hansenula、お
よびTorulopsisからなる群から選択される酵母宿主であ
る。According to one embodiment, said unicellular host is a yeast host selected from the group consisting of Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, and Torulopsis.

【００５１】本発明によれば、OBポリペプチドをコード
するDNA配列を含み、そしてこのOBポリペプチドをコー
ドする配列に対して機能的に近接した位置に発現調節配
列を挿入することからなる相同的組換え事象によって、
OBポリペプチドの高発現を可能にするようにインビトロ
で改変された、哺乳動物細胞が提供される。According to the present invention, there is provided a homology comprising a DNA sequence encoding an OB polypeptide and inserting an expression control sequence in a position functionally adjacent to the sequence encoding the OB polypeptide. By recombination event,
Mammalian cells are provided that have been modified in vitro to allow for high expression of an OB polypeptide.

【００５２】１つの実施態様によれば、前記細胞におい
ては、前記発現調節配列がOBポリペプチド発現調節配列
であり、そして前記相同的組換え事象が変異OBポリペプ
チド発現制御配列を置き換える。According to one embodiment, in said cell, said expression control sequence is an OB polypeptide expression control sequence, and said homologous recombination event replaces the mutant OB polypeptide expression control sequence.

【００５３】１つの実施態様によれば、前記細胞におい
ては、前記発現制御配列挿入部がOBポリペプチド制御配
列ではない。According to one embodiment, in said cell, said expression control sequence insert is not an OB polypeptide control sequence.

【００５４】本発明によれば、以下の工程を包含する、
OBポリペプチドを調製する方法が提供される： （ａ）前記の細胞をOBポリペプチドの発現を提供する条
件下で培養する工程；および （ｂ）この発現されたOBポリペプチドを回収する工程。According to the present invention, the following steps are included:
Provided are methods of preparing an OB polypeptide: (a) culturing the cells under conditions that provide for expression of the OB polypeptide; and (b) recovering the expressed OB polypeptide.

【００５５】１つの実施態様によれば、前記方法におい
ては、前記細胞が細菌または酵母である。According to one embodiment, in the method, the cells are bacteria or yeast.

【００５６】１つの実施態様によれば、前記方法は、以
下の工程をさらに包含する： （ｃ）前記OBポリペプチドをNiキレートカラムでのクロ
マトグラフィーにかける工程；および （ｄ）前記OBポリペプチドをゲル濾過により精製する工
程。According to one embodiment, the method further comprises the steps of: (c) chromatography of the OB polypeptide on a Ni-chelate column; and (d) the OB polypeptide. Is purified by gel filtration.

【００５７】１つの実施態様によれば、前記方法は、工
程（ｃ）後かつ工程（ｄ）前に、前記OBポリペプチドを
強陽イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかける
工程をさらに包含する。According to one embodiment, the method further comprises, after step (c) and before step (d), chromatography of the OB polypeptide on a strong cation exchange column.

【００５８】本発明によれば、前記のOBポリペプチドま
たは前記の方法により生産されるOBポリペプチドに対し
て特異的な抗体が提供される。According to the present invention, there is provided an antibody specific to the above-mentioned OB polypeptide or the OB polypeptide produced by the above-mentioned method.

【００５９】１つの実施態様によれば、前記抗体は、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。According to one embodiment, said antibodies are monoclonal or polyclonal antibodies.

【００６０】１つの実施態様によれば、前記抗体は、検
出可能な標識で標識されている。According to one embodiment, said antibodies are labeled with a detectable label.

【００６１】本発明によれば、前記のモノクローナル抗
体を生産する不死化細胞系が提供される。According to the present invention, there is provided an immortalized cell line which produces the above-mentioned monoclonal antibody.

【００６２】本発明によれば、以下の工程を包含する、
OBポリペプチドに対して特異的な抗体を調製する方法が
提供される： （ａ）前記のOBポリペプチドまたは前記の方法により生
産されたOBポリペプチドを、キャリアタンパク質に複合
体化させる工程； （ｂ）アジュバントと混合させた工程（ａ）のOBポリペ
プチドフラグメント−キャリアタンパク質複合体で宿主
動物を免疫する工程；および （ｃ）この免疫宿主動物から抗体を得る工程。According to the present invention, the following steps are included:
Provided are methods for preparing an antibody specific for an OB polypeptide: (a) complexing the OB polypeptide or the OB polypeptide produced by the method with a carrier protein; b) immunizing a host animal with the OB polypeptide fragment-carrier protein complex of step (a) mixed with an adjuvant; and (c) obtaining antibodies from the immunized host animal.

【００６３】本発明によれば、以下の工程を包含する、
試料においてOBポリペプチドの存在を測定する方法が提
供される： （ａ）OBポリペプチドを含有すると思われる試料を、該
OBポリペプチドに特異的に結合する抗体と、この抗体お
よびこのOBポリペプチドを含む反応複合体の形成を可能
にする条件下で接触させる工程；および（ｂ）この抗体
およびこの試料中のOBポリペプチドを含む反応複合体の
形成を検出する工程であって、ここでこの反応複合体の
形成の検出がこの試料におけるOBポリペプチドの存在を
示す、工程。According to the present invention, the following steps are included:
Provided are methods for determining the presence of an OB polypeptide in a sample: (a) providing a sample suspected of containing an OB polypeptide;
Contacting an antibody that specifically binds to the OB polypeptide under conditions that allow for the formation of a reaction complex comprising the antibody and the OB polypeptide; and (b) contacting the antibody and the OB polypeptide in the sample. Detecting the formation of a reaction complex comprising the peptide, wherein detecting the formation of the reaction complex indicates the presence of the OB polypeptide in the sample.

【００６４】１つの実施態様によれば、前記方法におい
て、方法前記抗体が固相支持体に結合される。[0064] According to one embodiment, in the above method, the method comprises binding the antibody to a solid support.

【００６５】本発明によれば、以下の工程を包含する、
生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルを評価する
インビトロ方法が提供される： （ａ）前記の方法に従って、生物学的試料における反応
複合体の形成を検出する工程；および（ｂ）形成された
反応複合体の量を評価する工程であって、ここでこの反
応複合体の量は、この生物学的試料におけるOBポリペプ
チドレベルに対応する、工程。According to the present invention, the following steps are included:
An in vitro method for assessing OB polypeptide levels in a biological sample is provided: (a) detecting the formation of a reaction complex in the biological sample according to the method described above; and (b) the reaction formed Assessing the amount of the complex, wherein the amount of the reaction complex corresponds to the OB polypeptide level in the biological sample.

【００６６】本発明によれば、以下の工程を包含する、
哺乳動物被験体におけるOBポリペプチドレベルの上昇ま
たは低下に関連した疾患の存在を検出または診断するイ
ンビトロ方法が提供される： （ａ）前記の哺乳動物被験体由来の生物学的試料におけ
るOBポリペプチドレベルを評価する工程；および（ｂ）
工程（ａ）において検出されたレベルと、正常被験体ま
たは初期の被験体に存在するOBポリペプチドレベルとを
比較する工程であって、ここで、正常レベルに比較した
このOBポリペプチドレベルの上昇はOBポリペプチドレベ
ルの上昇に関連した疾患を示し、そして正常レベルに比
較したこのOBポリペプチドレベルの低下はOBポリペプチ
ドレベルの低下に関連した疾患を示す、工程。According to the present invention, the following steps are included:
Provided are in vitro methods for detecting or diagnosing the presence of a disease associated with increasing or decreasing OB polypeptide levels in a mammalian subject: (a) OB polypeptide in a biological sample from said mammalian subject Assessing the level; and (b)
Comparing the level detected in step (a) with the level of the OB polypeptide present in a normal or early subject, wherein the level of the OB polypeptide is increased relative to the normal level Indicates a disease associated with elevated OB polypeptide levels, and wherein this decrease in OB polypeptide levels relative to normal levels indicates a disease associated with decreased OB polypeptide levels.

【００６７】本発明によれば、哺乳動物被験体における
OBポリペプチドのレベルの上昇または低下と関連した疾
患の治療処置をモニターするインビトロ方法であって、
前記の方法に従って、OBポリペプチドレベルの上昇また
は低下に関連した疾患について治療処置を受ける哺乳動
物被験体から異なる時点で得られた一連の生物学的試料
におけるOBポリペプチドレベルを評価する工程を包含す
る、方法が提供される。According to the present invention, in a mammalian subject
An in vitro method for monitoring therapeutic treatment of a disease associated with increasing or decreasing levels of an OB polypeptide, comprising:
Assessing OB polypeptide levels in a series of biological samples obtained at different times from a mammalian subject undergoing therapeutic treatment for a disease associated with elevated or decreased OB polypeptide levels, according to the method described above. A method is provided.

【００６８】本発明によれば、前記のOBポリペプチドま
たは前記の方法により生産されたOBポリペプチドと、薬
学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物が提供
される。According to the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the above-mentioned OB polypeptide or the OB polypeptide produced by the above-mentioned method, and a pharmaceutically acceptable carrier.

【００６９】１つの実施態様によれば、前記薬学的組成
物は、動物の体重を減少させるためのものである。According to one embodiment, the pharmaceutical composition is for reducing the weight of an animal.

【００７０】本発明によれば、前記のOBポリペプチドま
たは前記の方法により生産されるOBポリペプチドのアン
タゴニストと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、
動物の体重を増大させるための薬学的組成物が提供され
る。According to the present invention, there is provided an OB polypeptide or an OB polypeptide antagonist produced by the above method, and a pharmaceutically acceptable carrier.
Pharmaceutical compositions for increasing the weight of an animal are provided.

【００７１】１つの実施態様によれば、前記薬学的組成
物において、前記アンタゴニストが、前記OBポリペプチ
ドに結合しそしてその活性を中和する抗体、このOBポリ
ペプチドのレセプターに結合するがこれを活性化しない
このOBポリペプチドのフラグメント、およびこのOBポリ
ペプチドの小分子アンタゴニストからなる群から選択さ
れる。According to one embodiment, in the pharmaceutical composition, the antagonist binds to the OB polypeptide and neutralizes its activity, an antibody that binds to a receptor for the OB polypeptide but does not bind to the receptor. It is selected from the group consisting of fragments of the OB polypeptide that do not activate, and small molecule antagonists of the OB polypeptide.

【００７２】本発明によれば、前記のOBポリペプチドま
たは前記の方法により生産されたOBポリペプチドと、薬
学的に受容可能なキャリアとを含む、個体の体重を減少
させるための体型改善美容組成物が提供される。According to the present invention, a cosmetic composition for improving a body weight for reducing the weight of an individual, comprising the OB polypeptide or the OB polypeptide produced by the method, and a pharmaceutically acceptable carrier. Things are provided.

【００７３】本発明によれば、前記のOBポリペプチドま
たは前記の方法により生産されたOBポリペプチドのアン
タゴニストと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、
個体の体重を増大させるための体型改善美容組成物が提
供される。According to the present invention, there is provided an OB polypeptide as described above or an antagonist of the OB polypeptide produced by the above method, and a pharmaceutically acceptable carrier.
Provided is a body improving cosmetic composition for increasing the weight of an individual.

【００７４】１つの実施態様によれば、前記美容組成物
において、前記アンタゴニストは、前記OBポリペプチド
に結合しそしてその活性を中和する抗体、このOBポリペ
プチドのレセプターに結合するがこれを活性化しないこ
のOBポリペプチドのフラグメント、およびこのOBポリペ
プチドの小分子アンタゴニストからなる群から選択され
る。According to one embodiment, in the cosmetic composition, the antagonist binds to the OB polypeptide and neutralizes its activity, an antibody that binds to the OB polypeptide receptor but activates it. Selected from the group consisting of fragments of the OB polypeptide that do not become oxidized, and small molecule antagonists of the OB polypeptide.

【００７５】本発明によれば、個体の体型を改善するた
めの美容方法であって、前記の美容組成物が、個体に、
この個体の体重を所望のレベルに調整するに十分な用量
で投与される、方法が提供される。According to the present invention, there is provided a cosmetic method for improving the body shape of an individual, wherein the cosmetic composition is used for:
A method is provided wherein the individual is administered at a dose sufficient to adjust the body weight to the desired level.

【００７６】本発明によれば、哺乳動物の体重を調整す
るための医薬品の製造のための、前記のOBポリペプチド
をコードする核酸にハイブリダイズし得るアンチセンス
核酸分子の使用が提供される。According to the present invention there is provided the use of an antisense nucleic acid molecule capable of hybridizing to a nucleic acid encoding an OB polypeptide as described above for the manufacture of a medicament for adjusting the weight of a mammal.

【００７７】本発明によれば、動物の体重を改変するた
めの遺伝子治療医薬品の製造のための、前記のOBポリペ
プチドまたは前記の方法により生産されたOBポリペプチ
ドをコードする核酸分子の使用が提供される。According to the present invention, there is provided the use of a nucleic acid molecule encoding an OB polypeptide as described above or an OB polypeptide produced by the above method for the manufacture of a gene therapy medicament for modifying the weight of an animal. Provided.

【００７８】本発明によれば、動物の体重を改変するた
めの医薬品の製造のための、前記のOBポリペプチドまた
は前記の方法により生産されたOBポリペプチドの使用が
提供される。According to the present invention there is provided the use of an OB polypeptide as described above or an OB polypeptide produced by the above method for the manufacture of a medicament for altering the weight of an animal.

【００７９】本発明によれば、糖尿病、高血圧、および
高コレステロール症からなる群から選択される障害の処
置における哺乳動物の体重を調整するための医薬品の製
造のための、前記のOBポリペプチドまたは前記の方法に
より生産されたOBポリペプチドの使用が提供される。According to the present invention there is provided an OB polypeptide or a OB polypeptide as described above for the manufacture of a medicament for adjusting the weight of a mammal in the treatment of a disorder selected from the group consisting of diabetes, hypertension and hypercholesterolemia. Provided is the use of an OB polypeptide produced by the above method.

【００８０】本発明によれば、糖尿病、高血圧、および
高コレステロール症の処置のための医薬品と組み合わせ
て用いられる哺乳動物の体重を調整するための医薬品の
製造のための、前記のOBポリペプチドまたは前記の方法
により生産されたOBポリペプチドの使用が提供される。According to the present invention, there is provided an OB polypeptide or a OB polypeptide as described above for the manufacture of a medicament for adjusting the body weight of a mammal used in combination with a medicament for the treatment of diabetes, hypertension and hypercholesterolemia. Provided is the use of an OB polypeptide produced by the above method.

【００８１】本発明によれば、動物の体重を増大させる
ための医薬品の製造のための、前記のOBポリペプチドま
たは前記の方法により生産されたOBポリペプチドのアン
タゴニストの使用が提供される。According to the present invention there is provided the use of an OB polypeptide as described above or an antagonist of an OB polypeptide produced by the above method for the manufacture of a medicament for increasing the weight of an animal.

【００８２】１つの実施態様において、前記使用におい
て、前記アンタゴニストが、前記OBポリペプチドに結合
しそしてその活性を中和する抗体、このOBレセプターに
結合するがこれを活性化しないこのOBポリペプチドのフ
ラグメント、およびこのOBポリペプチドの小分子アンタ
ゴニストからなる群から選択される。[0082] In one embodiment, in the above uses, the antagonist binds to the OB polypeptide and neutralizes its activity, wherein the antibody binds to the OB receptor but does not activate it. Fragments, and small molecule antagonists of the OB polypeptide.

【００８３】１つの実施態様において、前記使用は、静
脈内送達、動脈内送達、腹腔内送達、筋内送達、皮下送
達、鼻内送達、経口送達、または肺送達のための医薬品
の製造のためのものである。In one embodiment, the use is for the manufacture of a medicament for intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, oral, or pulmonary delivery. belongs to.

【００８４】本発明に従えば、動物、特に哺乳動物の脂
肪蓄積および脂肪含量の制御の問題は、本明細書中に開
示されている肥満症（OB）ポリペプチドおよびこれらの
ポリペプチドをコードする核酸分子の提供を通して解決
された。本発明は、初めて、体重および脂肪蓄積の調整
（すなわち制御および調節）に有用な単離されたポリペ
プチド、ならびにOBポリペプチドの組換え生産を可能に
するだけでなくそれ自身体重の調整に有用である、この
ようなポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。In accordance with the present invention, the problem of controlling fat accumulation and fat content in animals, particularly mammals, is related to the obesity (OB) polypeptides disclosed herein and to those polypeptides. Solved through the provision of nucleic acid molecules. The present invention is, for the first time, an isolated polypeptide useful for regulating body weight and fat accumulation (ie, control and regulation), as well as enabling recombinant production of OB polypeptides, as well as itself useful for regulating body weight. A nucleic acid sequence encoding such a polypeptide is provided.

【００８５】本発明の肥満症（OB）ポリペプチドは、約
145〜約167アミノ酸を有し、動物（特に哺乳動物）にお
いて体重を調整し得、そして同じ生物学的活性を有する
それらの対立遺伝子変異体またはアナログ（フラグメン
トを包含する）を包含する。このポリペプチドは、組換
え方法または化学合成方法によって調製され得る。本発
明の好ましいOBポリペプチドは、配列番号２、４、５、
または６のアミノ酸配列を有するOBポリペプチド、ある
いはそれらの対立遺伝子変異体またはアナログ（フラグ
メントを包含する）を包含する。The obesity (OB) polypeptide of the present invention comprises
Includes allelic variants or analogs thereof (including fragments) having from 145 to about 167 amino acids, capable of adjusting body weight in animals, particularly mammals, and having the same biological activity. The polypeptide can be prepared by recombinant or chemical synthesis methods. Preferred OB polypeptides of the present invention are SEQ ID NOs: 2, 4, 5,
Or an OB polypeptide having an amino acid sequence of 6, or an allelic variant or analog (including fragments) thereof.

【００８６】本発明のOBポリペプチドの免疫原性フラグ
メントは、以下を包含する：Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-
Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr（配列番号
１８）；Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-As
p-Gln-Thr-Leu-Ala（配列番号１９）；Ser-Lys-Ser-Cys
-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-S
er-Leu-Asp（配列番号２０）；およびSer-Arg-Leu-Gln-
Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Se
r-Pro-Glu-Cys（配列番号２１）。[0086] Immunogenic fragments of the OB polypeptides of the present invention include: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-.
Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-As
p-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys
-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-S
er-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20); and Ser-Arg-Leu-Gln-
Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Se
r-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21).

【００８７】ヒトOBポリペプチドアナログは、配列番号
４および６のヒトアミノ酸配列を有するOBポリペプチド
アナログを含み、ここでアミノ酸53、56、71、85、89、
92、95、98、110、118、121、122、126、127、128、12
9、132、139、157、159、163、および166（配列番号４
の番号付けに従う）からなる群から選択される１つまた
はより多くのアミノ酸が別のアミノ酸、例えば、配列番
号２に記載のマウスOBポリペプチドの分岐（divergen
t）アミノ酸またはアラニンと置換されている。このよ
うなアナログはまた、以下のようなアナログを包含す
る：（ａ）５３位のセリン残基がグリシン、アラニン、
バリン、システイン、メチオニン、またはトレオニンと
置換される；（ｂ）９８位のセリン残基がグリシン、ア
ラニン、バリン、システイン、メチオニン、またはトレ
オニンと置換される；および（ｃ）９２位のアルギニン
残基がアスパラギン、リジン、ヒスチジン、グルタミ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニ
ン、メチオニン、またはシステインと置換される。本発
明のOBポリペプチドアナログは、好ましくは、配列番号
２、４、５、または６に記載のヒトOBポリペプチドアミ
ノ酸配列と、83％以上のアミノ酸配列相同性を有する。Human OB polypeptide analogs include OB polypeptide analogs having the human amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 and 6, wherein amino acids 53, 56, 71, 85, 89,
92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 12
9, 132, 139, 157, 159, 163 and 166 (SEQ ID NO: 4
One or more amino acids selected from the group consisting of: divergen of the mouse OB polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2.
t) is replaced with an amino acid or alanine. Such analogs also include the following: (a) wherein the serine residue at position 53 is glycine, alanine,
(B) replacing the serine residue at position 98 with glycine, alanine, valine, cysteine, methionine, or threonine; and (c) an arginine residue at position 92 Is replaced with asparagine, lysine, histidine, glutamine, glutamic acid, aspartic acid, serine, threonine, methionine, or cysteine. The OB polypeptide analog of the present invention preferably has 83% or more amino acid sequence homology with the human OB polypeptide amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 5, or 6.

【００８８】本発明の別のヒトOBポリペプチドアナログ
は、配列番号４および６のアミノ酸配列を有し、そして
以下を有する：（ａ）１つまたはより多くのアスパラギ
ン酸残基がグルタミン酸と置換される；（ｂ）１つまた
はより多くのイソロイシン残基がロイシンと置換され
る；（ｃ）１つまたはより多くのグリシンまたはバリン
残基がアラニンと置換される；（ｄ）１つまたはより多
くのアルギニン残基がヒスチジンと置換される；（ｅ）
１つまたはより多くのチロシンまたはフェニルアラニン
残基がトリプトファンと置換される；（ｆ）121位から1
28位（配列番号４の番号付けに従う）の１つまたはより
多くの残基がグリシンまたはアラニンと置換される；お
よび（ｇ）54位から60位または118位から166位（配列番
号４の番号付けに従う）の１つまたはより多くの残基が
リジン、グルタミン酸、システイン、またはプロリンと
置換される。Another human OB polypeptide analog of the invention has the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 4 and 6, and has the following: (a) one or more aspartic acid residues are replaced with glutamic acid (B) one or more isoleucine residues are replaced with leucine; (c) one or more glycine or valine residues are replaced with alanine; (d) one or more Arginine residue is replaced with histidine; (e)
One or more tyrosine or phenylalanine residues are replaced with tryptophan; (f) positions 121 to 1
One or more residues at position 28 (according to the numbering of SEQ ID NO: 4) are replaced with glycine or alanine; and (g) positions 54 to 60 or 118 to 166 (SEQ ID NO: 4 One or more residues are replaced with lysine, glutamic acid, cysteine, or proline.

【００８９】本発明の好ましいヒトOBポリペプチド短縮
型（truncated）アナログは、以下であることを包含す
る（配列番号４の番号付けに従う）：（ａ）121位から1
28位の１つまたはより多くの残基が欠失される；（ｂ）
１〜116位の残基が欠失される；（ｃ）１〜21位および5
4〜167位の残基が欠失される；（ｄ）１〜60位および11
7〜167位の残基が欠失される；（ｅ）１〜60位の残基が
欠失される；（ｆ）１〜53位の残基が欠失される；およ
び（ｇ）１〜21位の残基が欠失されるサブパート（subp
art）（ａ）のアナログ。21アミノ酸「シグナル」配列
（例えば配列番号４の１〜21位のアミノ酸）を欠く本発
明のOBポリペプチドおよびOBポリペプチドアナログは、
以下のようなＮ末端アミノ酸またはアミノ酸配列を有す
る：（１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒス
チジン−メチオニン配列（配列番号３８）、（３）メチ
オニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒス
チジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチ
ジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−
プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン
−メチオニン配列（配列番号９８）、（４）ロイシン−
グルタミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−ア
ラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２
６）、（５）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−
アラニン配列（配列番号２７）、（６）ロイシン−グル
タミン酸−リジン−アルギニン配列（配列番号２８）、
（７）メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチ
ジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン
−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−
プロリン配列（配列番号９９）、および（８）グリシン
−セリン−プロリン配列。Preferred human OB polypeptide truncated analogs of the present invention include (according to the numbering of SEQ ID NO: 4):
One or more residues at position 28 are deleted; (b)
Residues at positions 1-116 are deleted; (c) positions 1-21 and 5
Residues 4 to 167 are deleted; (d) positions 1 to 60 and 11
(E) residues 1-60 are deleted; (f) residues 1-53 are deleted; and (g) 1 The subpart where the residues at positions 21 to 21 are deleted (subp
art) An analog of (a). OB polypeptides and OB polypeptide analogs of the invention lacking a 21 amino acid "signal" sequence (e.g., amino acids 1-21 of SEQ ID NO: 4)
It has the following N-terminal amino acid or amino acid sequence: (1) methionine, (2) glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 38), (3) methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine- Histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-
Proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98), (4) leucine-
Glutamic acid-lysine-arginine-glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 2
6), (5) glutamic acid-alanine-glutamic acid-
An alanine sequence (SEQ ID NO: 27), (6) a leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence (SEQ ID NO: 28),
(7) Methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-
Proline sequence (SEQ ID NO: 99), and (8) Glycine-serine-proline sequence.

【００９０】本発明のOBポリペプチドの誘導体は、そこ
に結合している１つまたはそれより多くの化学部分を有
し、この化学部分は、水溶性ポリマー（例えばポリエチ
レングリコール）を包含する。ポリエチレングリコール
誘導体は、モノPEG化、ジPEG化、トリPEG化、またはテ
トラPEG化であり得、例えばＮ末端モノPEG化であり得
る。本発明のOBポリペプチドの好ましいＮ末端モノPEG
化誘導体は、配列番号４の22位から167位のアミノ酸残
基または配列番号６の22位から166位の残基を含み、必
要に応じて21位に（PEG化）メチオニンを有するOBポリ
ペプチドである。The derivatives of the OB polypeptides of the present invention have one or more chemical moieties attached thereto, including a water-soluble polymer (eg, polyethylene glycol). The polyethylene glycol derivative can be mono-, di-, tri-, or tetra-PEGylated, for example, N-terminal mono-PEGylated. Preferred N-Terminal Mono PEG of the OB Polypeptide of the Invention
An OB polypeptide comprising an amino acid residue from position 22 to position 167 of SEQ ID NO: 4 or a residue from position 22 to position 166 of SEQ ID NO: 6, and optionally having (PEGylated) methionine at position 21 It is.

【００９１】本発明により提供される単離された核酸分
子は、上記のようなOBポリペプチド、対立遺伝子変異
体、またはアナログ（それらのフラグメントを包含す
る）をコードする。哺乳動物の体重を調整する生物学的
活性を有するOBポリペプチドの発現を得るために用いら
れるDNA分子であって、以下からなる群から選択され
る、DNA分子が特に提供される：（ａ）配列番号１およ
び３に記載のDNA分子またはそれらのフラグメント；
（ｂ）（ａ）に定義したDNA分子とハイブリダイズするD
NA分子またはそれらのハイブリダイズし得るフラグメン
ト；および（ｃ）該DNA分子のいずれかによりコードさ
れるアミノ酸配列の発現をコードするDNA分子。このよ
うな分子の例示は、配列番号２２および２４のヒトゲノ
ムDNA分子である。[0091] The isolated nucleic acid molecules provided by the present invention encode OB polypeptides, allelic variants, or analogs (including fragments thereof) as described above. Particularly provided is a DNA molecule used to obtain expression of a biologically active OB polypeptide that modulates the weight of a mammal, wherein the DNA molecule is selected from the group consisting of: (a) DNA molecules as set forth in SEQ ID NOs: 1 and 3, or fragments thereof;
(B) D that hybridizes with the DNA molecule defined in (a)
NA molecules or hybridizable fragments thereof; and (c) a DNA molecule that encodes the expression of an amino acid sequence encoded by any of the DNA molecules. An example of such a molecule is the human genomic DNA molecule of SEQ ID NOS: 22 and 24.

【００９２】本発明の好ましいDNA分子は、以下に記載
されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードする：（ａ）配列番
号２；（ｂ）配列番号２の22位から167位のアミノ酸；
（ｃ）配列番号４；（ｄ）配列番号４の22位から167位
のアミノ酸；（ｅ）配列番号５；（ｆ）配列番号５の22
位から166位のアミノ酸；および（ｇ）配列番号６；お
よび（ｈ）配列番号６の22位から166位のアミノ酸、な
らびに既に記載したようなＮ末端アミノ酸またはアミノ
酸配列を有するポリペプチド。例示的には、好ましいDN
A分子は、配列番号３のタンパク質コード配列として記
載される配列、および特に配列番号３の22位から167位
のアミノ酸をコードする配列として記載される配列を有
する。A preferred DNA molecule of the present invention encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences: (a) SEQ ID NO: 2; (b) SEQ ID NO: 22 The amino acid at position 167 to position 167;
(C) SEQ ID NO: 4; (d) amino acids from position 22 to position 167 of SEQ ID NO: 4; (e) SEQ ID NO: 5; (f) 22 of SEQ ID NO: 5
And (g) SEQ ID NO: 6; and (h) an amino acid at positions 22 to 166 of SEQ ID NO: 6, and a polypeptide having an N-terminal amino acid or amino acid sequence as described above. Illustratively, the preferred DN
The A molecule has the sequence described as the protein coding sequence of SEQ ID NO: 3, and particularly the sequence described as the sequence encoding amino acids 22 to 167 of SEQ ID NO: 3.

【００９３】本発明のDNA分子にハイブリダイズし得る
検出可能な標識をされた核酸分子もまた提供され、そし
てOB核酸の非コード領域にハイブリダイズし得る核酸分
子（非コード領域はイントロン、５’非コード領域、お
よび３’非コード領域からなる群から選択される）を包
含する。本発明はまた、OBポリペプチドをコードするヒ
トゲノムDNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを提供し、このようなオリゴヌクレオチドは、配
列番号２９から３２に記載される。A detectably labeled nucleic acid molecule capable of hybridizing to a DNA molecule of the present invention is also provided, and a nucleic acid molecule capable of hybridizing to a non-coding region of an OB nucleic acid (where the non-coding region is an intron, 5 ′ Non-coding region, and 3 'non-coding region). The present invention also provides oligonucleotide primers for amplifying human genomic DNA encoding an OB polypeptide, such oligonucleotides are set forth in SEQ ID NOs: 29-32.

【００９４】本発明により提供されるベクターは、上記
の本発明のDNA分子を含み、そして好ましくは、発現制
御配列と作動可能に関連されたDNA分子を含む発現ベク
ターの形態を有する。本発明の単細胞宿主細胞は、本発
明のDNA分子または上記のベクターでトランスフォーム
またはトランスフェクトされる。好ましい宿主細胞は、
細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、およ
び組織培養におけるヒト細胞を包含する。例示的には、
このような宿主細胞は、E. coli、Pseudomonas、Bacill
us、Streptomyces、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS
1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、およびSf9細胞からなる
群から選択される。本発明に好ましい酵母細胞は、Sacc
haromyces、Pichia、Candida、Hansenula、およびTorul
opsisを包含する。OBポリペプチドをコードするDNA配列
を含み、そして該OBポリペプチドをコードする配列に対
して機能的に近接した位置に発現調節配列を挿入するこ
とからなる相同組換え事象によって、OBポリペプチドの
高発現を可能にするようにインビトロで改変された哺乳
動物細胞もまた提供される。この発現調節配列は、OBポ
リペプチド発現調節配列またはそれ以外であり得、そし
て細胞内で変異OBポリペプチド制御配列と置き換え得
る。The vector provided by the present invention comprises the above-described DNA molecule of the present invention, and preferably has the form of an expression vector containing a DNA molecule operably linked to an expression control sequence. A single cell host cell of the invention is transformed or transfected with a DNA molecule of the invention or a vector as described above. Preferred host cells are
Includes bacteria, yeast, mammalian cells, plant cells, insect cells, and human cells in tissue culture. Illustratively,
Such host cells include E. coli, Pseudomonas, Bacill
us, Streptomyces, yeast, CHO, R1.1, BW, LM, COS
1, selected from the group consisting of COS7, BSC1, BSC40, BMT10, and Sf9 cells. Preferred yeast cells for the present invention are Sacc
haromyces, Pichia, Candida, Hansenula, and Torul
opsis. A homologous recombination event comprising a DNA sequence encoding an OB polypeptide and inserting an expression control sequence in a position functionally adjacent to the sequence encoding the OB polypeptide results in a high level of the OB polypeptide. Mammalian cells that have been modified in vitro to allow expression are also provided. The expression control sequence can be an OB polypeptide expression control sequence or otherwise, and can replace a mutant OB polypeptide control sequence in a cell.

【００９５】本発明は、以下の工程を包含するOBポリペ
プチドを調製する方法を提供する： （ａ）上記の細胞をOBポリペプチドの発現を提供する条
件下で培養する工程；および（ｂ）発現されたOBポリペ
プチドを回収する工程。この手順はまた、以下による工
程を伴い得る：（ｃ）上記ポリペプチドをNiキレートカ
ラムでのクロマトグラフィーにかける工程；および
（ｄ）上記ポリペプチドをゲル濾過により精製する工
程。好ましい実施態様では、工程（ｃ）後かつ工程
（ｄ）前に、この方法は、OBポリペプチドを強陽イオン
交換カラムでのクロマトグラフィーにかける工程を包含
する。The present invention provides a method for preparing an OB polypeptide comprising the steps of: (a) culturing the above-described cells under conditions that provide for expression of the OB polypeptide; and (b) Recovering the expressed OB polypeptide. This procedure may also involve the following steps: (c) chromatography of the polypeptide on a Ni-chelate column; and (d) purifying the polypeptide by gel filtration. In a preferred embodiment, after step (c) and before step (d), the method comprises chromatography of the OB polypeptide on a strong cation exchange column.

【００９６】本発明はまた、本発明のOBポリペプチドに
特異的な標識および非標識モノクローナルおよびポリク
ローナル抗体ならびに本発明のモノクローナル抗体を生
産する不死化細胞系を提供する。本発明の抗体調製は、
以下の工程を包含する：（ａ）OBポリペプチドをキャリ
アタンパク質に複合体化（conjugate）させる工程；
（ｂ）アジュバントと混合させた工程（ａ）のOBポリペ
プチドフラグメント−キャリアタンパク質複合体で宿主
動物を免疫する工程；および（ｃ）免疫された宿主動物
から抗体を得る工程。The present invention also provides labeled and unlabeled monoclonal and polyclonal antibodies specific for the OB polypeptides of the present invention and immortalized cell lines which produce the monoclonal antibodies of the present invention. The antibody preparation of the present invention comprises:
Including: (a) conjugating the OB polypeptide to the carrier protein;
(B) immunizing a host animal with the OB polypeptide fragment-carrier protein complex of step (a) mixed with an adjuvant; and (c) obtaining antibodies from the immunized host animal.

【００９７】本発明はまた、以下の工程を包含する、試
料においてOBポリペプチドの存在を測定する方法を提供
する：（ａ）OBポリペプチドを含有すると思われる試料
を、該OBポリペプチドに特異的に結合する抗体と、抗体
およびOBポリペプチドを含む反応複合体の形成を可能に
する条件下で接触させる工程；および（ｂ）抗体および
試料中のOBポリペプチドを含む反応複合体の形成を検出
する工程（ここで該反応複合体の形成の検出が該試料に
おけるOBポリペプチドの存在を示す）。以下の工程を包
含する、生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルを
評価するインビトロ方法が、対応して提供される：
（ａ）上記の方法に従って、生物学的試料における反応
複合体の形成を検出する工程；および（ｂ）形成された
反応複合体の量を評価する工程（ここで反応複合体の量
は、生物学的試料におけるOBポリペプチドレベルに対応
する）。本発明によりOBポリペプチドの上昇または低下
に関連した疾患の存在を検出または診断する場合、上記
の評価が行われ、そして検出されたレベルが、正常被験
体または初期の被験体に存在するOBポリペプチドレベル
と比較される。正常または以前のレベルに比較したOBポ
リペプチドレベルの上昇はOBポリペプチドレベルの上昇
に関連した疾患を示し、そして正常レベルに比較したOB
ポリペプチドレベルの低下はOBポリペプチドレベルの低
下に関連した疾患を示す。哺乳動物被験体におけるOBポ
リペプチドのレベルの上昇または低下と関連した疾患の
治療処置をモニターするインビトロ方法が対応して提供
され、これは、上記のようにしてOBポリペプチドの上昇
または低下に関連した疾患について治療処置を受ける哺
乳動物被験体から異なる時点で得られた一連の生物学的
試料におけるOBポリペプチドレベルを評価する工程を包
含する。The present invention also provides a method for determining the presence of an OB polypeptide in a sample, comprising the steps of: (a) providing a sample suspected of containing the OB polypeptide to a sample specific for the OB polypeptide; Contacting the antibody that specifically binds with the antibody and OB polypeptide under conditions that allow for the formation of a reaction complex; and (b) forming the reaction complex that includes the antibody and the OB polypeptide in the sample. Detecting (where detection of the formation of the reaction complex indicates the presence of the OB polypeptide in the sample). An in vitro method for assessing OB polypeptide levels in a biological sample, comprising the following steps, is correspondingly provided:
(A) detecting the formation of a reaction complex in a biological sample according to the method described above; and (b) evaluating the amount of the reaction complex formed (where the amount of the reaction complex is Corresponding to the OB polypeptide level in the biological sample). When detecting or diagnosing the presence of a disease associated with an increase or decrease in an OB polypeptide according to the present invention, the above evaluations are performed and the level detected is the OB polypeptide present in a normal or early subject. Compared to the peptide level. Elevated OB polypeptide levels compared to normal or previous levels indicate a disease associated with elevated OB polypeptide levels, and OB compared to normal levels
Decreased polypeptide levels are indicative of a disease associated with decreased OB polypeptide levels. Correspondingly provided in vitro methods for monitoring therapeutic treatment of a disease associated with elevated or decreased levels of an OB polypeptide in a mammalian subject, wherein the method is associated with elevated or decreased OB polypeptides as described above. Assessing OB polypeptide levels in a series of biological samples obtained at different times from a mammalian subject undergoing therapeutic treatment for the indicated disease.

【００９８】本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可
能なキャリアと共に上記のOBポリペプチドを含み、動物
の体重を減少させるための治療方法において有用であ
る。動物の体重を増大させるための治療方法において有
用な本発明の別の薬学的組成物は、OBポリペプチドのア
ンタゴニストを包含し、このアンタゴニストは、好まし
くはOBポリペプチドに結合しそしてその活性を中和する
抗体、該OBポリペプチドのレセプターに結合するがこれ
を活性化しないOBポリペプチドのフラグメント、および
該OBポリペプチドの小分子アンタゴニストからなる群か
ら選択される。本発明はまた、個体の体重を減少または
増大させるための、対応する体型改善美容組成物を提供
し、これは、個体の体型を改善するための美容方法にお
いて有用である。このような美容組成物は、個体に、個
体の体重を所望のレベルに調整するに十分な用量で投与
される。The pharmaceutical compositions of the present invention comprise an OB polypeptide as described above together with a pharmaceutically acceptable carrier, and are useful in a method of treatment for reducing body weight of an animal. Another pharmaceutical composition of the invention useful in a method of treatment for increasing the weight of an animal includes an antagonist of the OB polypeptide, which antagonist preferably binds to the OB polypeptide and mediates its activity. Selected from the group consisting of an antibody that binds, a fragment of the OB polypeptide that binds to but does not activate the receptor for the OB polypeptide, and a small molecule antagonist of the OB polypeptide. The present invention also provides a corresponding body-building cosmetic composition for reducing or increasing the weight of an individual, which is useful in a cosmetic method for improving the body of an individual. Such cosmetic compositions are administered to an individual at a dose sufficient to adjust the weight of the individual to a desired level.

【００９９】動物の体重調整（例えば遺伝子治療）のた
めの医薬品の製造のための、本発明の核酸分子ならびに
本発明OBポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイ
ズし得るアンチセンス核酸分子の使用についても、本発
明によって述べられている。動物の体重を改変するため
の医薬品の製造のための本発明のOBポリペプチドまたは
アンタゴニストの使用もまた提供される。そのように開
発された医薬品は、糖尿病、高血圧、および高コレステ
ロール症からなる群から選択される障害の処置におけ
る、およびこのような障害の処置のための医薬品との組
み合わせ療法の一部としての、哺乳動物の体重を改変す
るための医薬品の製造のために用いられ得る。このよう
な医薬品は、静脈内送達系、動脈内送達系、腹腔内送達
系、筋内送達系、皮下送達系、鼻内送達系、経口送達
系、または肺送達系において用いられ得る。The use of a nucleic acid molecule of the present invention as well as an antisense nucleic acid molecule capable of hybridizing to a nucleic acid encoding an OB polypeptide of the present invention for the manufacture of a medicament for adjusting the weight of an animal (eg, gene therapy) is also described. , Described by the present invention. Also provided is the use of an OB polypeptide or antagonist of the invention for the manufacture of a medicament for modifying the weight of an animal. Pharmaceuticals so developed are used in the treatment of disorders selected from the group consisting of diabetes, hypertension, and hypercholesterolemia, and as part of combination therapy with pharmaceuticals for the treatment of such disorders. It can be used for the manufacture of a medicament for modifying the weight of a mammal. Such medicaments can be used in intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, oral, or pulmonary delivery systems.

【０１００】本明細書で示したデータは、本発明のOBポ
リペプチドはそれら自身の形態で主として哺乳動物脂肪
細胞（adipocyte）から分泌され、そしてこのポリペプ
チドはホルモンとして機能することを示す。The data presented herein show that the OB polypeptides of the present invention are secreted in their own form primarily from mammalian adipocytes, and that the polypeptide functions as a hormone.

【０１０１】本明細書中の実施例は、OBポリペプチド
（あるいは本明細書中で「レプチン(leptin)」と呼ばれ
る）がマウス、ラット、およびヒトの血漿中を循環する
ことを示している。レプチンはob/obマウス由来の血漿
には存在せず、db/dbマウス由来の血漿では10倍高い濃
度で存在し、そしてfa/faラットでは20倍高い濃度で存
在する。最も重要なことには、組換えレプチンの毎日の
注射により、ob/obマウスの体重は劇的に減少し、野生
型マウスの体重は大きな影響を及ぼされ、そしてdb/db
マウスは全く影響を受けない。The examples herein show that OB polypeptides (also referred to herein as "leptins") circulate in mouse, rat, and human plasma. Leptin is not present in plasma from ob / ob mice, is present at a 10-fold higher concentration in plasma from db / db mice, and at a 20-fold higher concentration in fa / fa rats. Most importantly, daily injection of recombinant leptin dramatically reduced the weight of ob / ob mice, significantly affected the weight of wild-type mice, and
Mice are not affected at all.

【０１０２】さらなる局面では、１つの種に由来するOB
ポリペプチドが他の種において生物学的に活性である。
特に、ヒトOBポリペプチドはマウスにおいて活性であ
る。In a further aspect, OBs from one species
The polypeptide is biologically active in another species.
In particular, the human OB polypeptide is active in mice.

【０１０３】第１の場合では、本発明のモジュレーター
は、本明細書中で定義されたようにそれ自身が体重制御
のモジュレーターとして働くポリペプチド（このポリペ
プチドは、図１Ａ〜Ｅ（配列番号２）、図３（配列番号
４）、図５（配列番号５）、および図６（配列番号６）
に記載されるようなアミノ酸配列を有する）、またはそ
れらの保存的変異体またはフラグメント、特にシグナル
ペプチドを欠くフラグメント（あるいは本明細書中で成
熟OBポリペプチドと呼ばれる）をコードする核酸分子を
含む。この核酸分子は、組換えDNA分子（例えばcDNA、
またはcDNAまたは単離されたゲノムDNAを含有するベク
ター）またはクローン化遺伝子（すなわち単離されたゲ
ノムDNA）、あるいはそれらの変質性（degenerate）変
異体を包含する。特定の実施態様では、マウスおよびヒ
トのOBポリペプチドの２つの変異体に対するアミノ酸配
列が提供される。両ポリペプチドは、49位のグルタミン
が欠失した形態で見出される。これは、mRNAスプライシ
ングの例外から生じ得る。種々の種に由来するOBポリペ
プチドは高度に相同性であり得る；図４に示されるよう
に、マウスおよびヒトのOBポリペプチドは、80％以上相
同である。In the first case, the modulator of the invention is a polypeptide which itself acts as a modulator of body weight control as defined herein (this polypeptide is shown in FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 2). ), FIG. 3 (SEQ ID NO: 4), FIG. 5 (SEQ ID NO: 5), and FIG.
Or nucleic acid molecules encoding conservative variants or fragments thereof, particularly fragments lacking a signal peptide (or alternatively referred to herein as a mature OB polypeptide). The nucleic acid molecule is a recombinant DNA molecule (eg, a cDNA,
Or a vector containing cDNA or isolated genomic DNA) or cloned genes (ie, isolated genomic DNA), or degenerate variants thereof. In certain embodiments, amino acid sequences are provided for two variants of the mouse and human OB polypeptides. Both polypeptides are found in a form lacking glutamine at position 49. This can result from an exception in mRNA splicing. OB polypeptides from various species can be highly homologous; as shown in FIG. 4, the mouse and human OB polypeptides are more than 80% homologous.

【０１０４】この核酸分子（組換えDNA分子またはクロ
ーン化遺伝子）は、図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）および図
２ＡおよびＢ（配列番号３）に示されるヌクレオチド配
列を有し得るか、DNAコード配列に相補的であり得る。
特に、このようなDNA分子は、cDNAまたは染色体から単
離されたゲノムDNAであり得る。本発明の核酸分子はま
た、DNAの５’および３’フランキング配列ならびにイ
ントロンDNA配列に相当し得る。従って、本発明はま
た、本願において図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）および図２
ＡおよびＢ（配列番号３）に示される配列、および変質
性変異体、対立遺伝子変異、ならびに同様の同族分子か
ら選択されるヌクレオチド配列を有する核酸の同定に関
する。The nucleic acid molecule (recombinant DNA molecule or cloned gene) may have the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1) and FIGS. It can be complementary to a sequence.
In particular, such a DNA molecule can be cDNA or genomic DNA isolated from a chromosome. The nucleic acid molecules of the present invention can also correspond to the 5 'and 3' flanking sequences of DNA and intron DNA sequences. Accordingly, the present invention also relates to FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1) and FIG.
A and B (SEQ ID NO: 3) and the identification of nucleic acids having nucleotide sequences selected from degenerate variants, allelic variants, and similar cognate molecules.

【０１０５】本発明の核酸分子は、DNAまたはRNAであり
得、これはリン酸結合またはリン酸アナログ（例えばチ
オリン酸）結合を有する合成変異体を包含する。一本鎖
および二本鎖の両配列が、本明細書中で意図される。The nucleic acid molecules of the present invention can be DNA or RNA, including synthetic variants having a phosphate linkage or a phosphate analog (eg, thiophosphate) linkage. Both single-stranded and double-stranded sequences are contemplated herein.

【０１０６】本発明はさらに、分子プローブまたはポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のプライマーとして用い
られる核酸分子、すなわち図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）、
図２ＡおよびＢ（配列番号３）、および図２０Ａ〜Ｃ
（配列番号２２および２４）に示される配列；またはコ
ード配列の５’および３’フランキング配列；またはゲ
ノムDNAのイントロン配列の一部分に相当する配列を有
する合成または天然のオリゴヌクレオチド、を提供す
る。特に、本発明は、少なくとも約10ヌクレオチドを有
する核酸分子を意図し、ここでこの核酸分子の配列は、
図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）、図２ＡおよびＢ（配列番号
３）、および図２０Ａ〜Ｃ（配列番号２２）のヌクレオ
チド配列中の同じヌクレオチド数のヌクレオチド配列、
またはそれに相補的な配列に相当する。より好ましく
は、この分子の核酸配列は少なくとも15ヌクレオチドを
有する。最も好ましくは、この核酸配列は少なくとも20
ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドがプローブ
である本発明の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、
例えば放射性核種（例えば³²P）または酵素で検出可能
に標識される。The present invention further provides nucleic acid molecules used as molecular probes or primers for polymerase chain reaction (PCR) amplification, ie, FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1),
2A and B (SEQ ID NO: 3) and FIGS.
(SEQ ID NOS: 22 and 24); or the 5 'and 3' flanking sequences of the coding sequence; or a synthetic or natural oligonucleotide having a sequence corresponding to a portion of an intron sequence of genomic DNA. In particular, the invention contemplates a nucleic acid molecule having at least about 10 nucleotides, wherein the sequence of the nucleic acid molecule is
A nucleotide sequence of the same number of nucleotides in the nucleotide sequences of FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1), FIGS. 2A and B (SEQ ID NO: 3), and FIGS. 20A-C (SEQ ID NO: 22);
Or a sequence complementary thereto. More preferably, the nucleic acid sequence of the molecule has at least 15 nucleotides. Most preferably, the nucleic acid sequence has at least 20
With nucleotides. In embodiments of the invention where the oligonucleotide is a probe, the oligonucleotide is
For example, it is detectably labeled with a radionuclide (eg, ³² P) or an enzyme.

【０１０７】さらなる局面では、本発明は、クローニン
グベクター（OBポリペプチドをコードする本発明の核酸
を含む）；および細菌発現ベクター、昆虫発現ベクタ
ー、または哺乳動物発現ベクター（発現制御配列と作動
可能に関連させて、OBポリペプチドをコードする本発明
の核酸分子を含む）を提供する。従って、本発明はさら
に、適切な発現ベクターでトランスフェクトまたはトラ
ンスフォームされた宿主細胞（例えば細菌細胞、酵母細
胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）、および対応し
て、本発明のモジュレーターの調製における上記構築物
の使用に関する。In a further aspect, the present invention provides a cloning vector (including a nucleic acid of the invention encoding an OB polypeptide); and a bacterial, insect, or mammalian expression vector (operable with an expression control sequence). In a related context, comprising a nucleic acid molecule of the invention that encodes an OB polypeptide). Accordingly, the present invention further provides a host cell (eg, a bacterial, yeast, insect, or mammalian cell) transfected or transformed with a suitable expression vector, and correspondingly, in the preparation of a modulator of the present invention. It relates to the use of the above construct.

【０１０８】なおさらなる局面では、本発明は、OBポリ
ペプチドに結合する抗体に関する。このような抗体は、
完全長ポリペプチドまたはそれらの抗原性フラグメント
に対して生成され得る。１つの局面では、このような抗
体は、OBポリペプチドの機能的（すなわち体重および脂
肪組成を調整する）活性を阻害する。別の局面では、抗
体は、血漿または血清中の循環OBポリペプチドレベルを
決定するために用いられ得る。なおさらなる局面では、
領域特異的抗体（特にモノクローナル抗体）が、OBポリ
ペプチド構造のプローブとして用いられ得る。[0108] In yet a further aspect, the present invention relates to antibodies that bind to an OB polypeptide. Such antibodies are
It can be generated against full-length polypeptides or antigenic fragments thereof. In one aspect, such antibodies inhibit the functional (ie, regulate body weight and fat composition) activity of the OB polypeptide. In another aspect, antibodies can be used to determine circulating OB polypeptide levels in plasma or serum. In a still further aspect,
Region-specific antibodies, particularly monoclonal antibodies, can be used as probes of the OB polypeptide structure.

【０１０９】前述の全ての物質が、体重および脂肪組成
のモジュレーターとして考慮されるべきであり、そして
このような物質は種々の背景で用いられ得る。詳細に
は、本発明は、診断および治療の両適用、ならびに特定
の農業適用、本明細書で定義されるモジュレーター（核
酸分子およびペプチドを包含する）の使用の可能性のあ
る全てを意図する。さらに、体重の調整は特定の治療含
意および利益を有する。それは、肥満症または逆に悪液
質が望ましくない身体状態を示すような状態が、本発明
の１つまたはそれより多くのモジュレーターの投与によ
り治療され得る状態においてである。All the substances mentioned above are to be considered as modulators of body weight and fat composition, and such substances can be used in various contexts. In particular, the present invention contemplates both diagnostic and therapeutic applications, as well as all possible agricultural applications, the use of modulators as defined herein, including nucleic acid molecules and peptides. Further, weight adjustment has particular therapeutic implications and benefits. That is, in conditions where obesity or, conversely, cachexia indicates an undesirable physical condition, can be treated by administration of one or more modulators of the present invention.

【０１１０】従って、哺乳動物の体重を調整する方法が
提案されており、これは、図１Ａ〜Ｅ（配列番号１）の
配列、図２ＡおよびＢ（配列番号３）の配列およびそれ
らの変質性変異体および対立遺伝子変異体から選択され
るヌクレオチド配列を有する核酸によりコードされるタ
ンパク質の発現を制御する工程を包含する。このような
制御は、遺伝子治療により目的のヌクレオチドを患者ま
たは宿主の脂肪細胞中に導入し、肥満症を制御または低
減させることによりもたらされ得る。逆に、ヌクレオチ
ドに対するアンタゴニスト（例えばアンチセンス分子）
の調製および投与は、過度の体重損失を包含する状態
（例えば神経性食欲不振、癌、またはAIDS）が存在しそ
してその治療下にある場合においてその必要が示され、
続行される。このような構築物は、ヌクレオチドの場合
と同様に直接脂肪細胞に導入されて、このような変化を
生じさせ得る。Accordingly, methods for adjusting the weight of mammals have been proposed, including the sequences of FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1), the sequences of FIGS. 2A and B (SEQ ID NO: 3) and their alterations. Controlling the expression of a protein encoded by a nucleic acid having a nucleotide sequence selected from variants and allelic variants. Such control may be provided by introducing the nucleotide of interest into adipocytes of the patient or host by gene therapy to control or reduce obesity. Conversely, antagonists to nucleotides (eg, antisense molecules)
The preparation and administration of is indicated to be necessary when conditions involving excessive weight loss (eg, anorexia nervosa, cancer, or AIDS) are present and under treatment.
Continued. Such constructs can be introduced directly into adipocytes, as in the case of nucleotides, to effect such changes.

【０１１１】対応して、図１Ａ〜Ｅ、３、５、および６
（配列番号１、配列番号４、配列番号５、および配列番
号６）により定義されるタンパク質、それらの保存的変
異体、活性フラグメント、および同族小分子は、治療目
的のために、直接投与用に処方され、過度の体脂質また
は体重増加の減少または制御をもたらし得る。対応し
て、上述のタンパク質物質（例えばそれらのフラグメン
ト）に対する抗体および他のアンタゴニストが調製さ
れ、そして同様に投与されて、逆の効果を達成し得る。
従って、本発明は、好都合に、薬学的に受容可能なキャ
リアまたは賦形剤と混合して、本発明のOBポリペプチ
ド、または別の場合はそのアンタゴニストを含む薬学的
組成物に関する。Correspondingly, FIGS. 1A-E, 3, 5, and 6
(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6), their conservative variants, active fragments, and cognate small molecules are useful for therapeutic purposes, for direct administration. May be prescribed and result in the reduction or control of excessive body lipids or weight gain. Correspondingly, antibodies and other antagonists to the above-described protein substances (eg, fragments thereof) can be prepared and similarly administered to achieve the opposite effect.
Accordingly, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an OB polypeptide of the invention, or otherwise an antagonist thereof, advantageously in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

【０１１２】さらに、本発明のOBポリペプチドは、その
美容効果、例えば脂肪蓄積を減少させることによる体型
改善のために投与され得る。OBポリペプチドは、その美
容効果のために、独立にまたは他の美容戦略（例えば手
術）と併用して用いられ得る。Further, the OB polypeptide of the present invention can be administered for its cosmetic effect, for example, for improving body shape by reducing fat accumulation. The OB polypeptide can be used alone or in combination with other cosmetic strategies (eg, surgery) for its cosmetic effect.

【０１１３】本発明のヌクレオチドおよび対応ペプチド
の診断用途は、診断および治療の両適用に有用な活性ヌ
クレオチド物質のレパートリーを開発するために、その
対立遺伝子変異体のさらなる変異を同定するためのその
核酸の使用に及ぶ。特に、目的のヌクレオチドの同型接
合変異および異型接合変異が同定され、それにより患者
の状態をより正確に定量化すると仮定され、肥満症に対
する個体の危険状態潜在性を決定し得る。詳細には、異
型接合変異は現在、軽度から中度の肥満症に関連してい
るとみなされ、一方、同型接合変異はより顕著な重度の
肥満状態に関連し得る。対応するDNA試験が、次いで上
述の確定された物質を水準基標として用いて行われ、特
定の体質に対する的確な長期予後を容易にし、食事習慣
または他の個人的習慣の変更、あるいは直接治療介入を
規定し得、このような状態を避け得る。The diagnostic uses of the nucleotides and corresponding peptides of the present invention include their nucleic acids for identifying additional mutations of their allelic variants in order to develop a repertoire of active nucleotide substances useful in both diagnostic and therapeutic applications. Range of use. In particular, it is hypothesized that homozygous and heterozygous mutations of the nucleotide of interest are identified, thereby quantifying the patient's condition more accurately, and may determine the individual's risk status potential for obesity. In particular, heterozygous mutations are currently considered to be associated with mild to moderate obesity, while homozygous mutations may be associated with a more pronounced severe obesity condition. Corresponding DNA tests are then performed using the above-identified substances as a baseline, facilitating an accurate long-term prognosis for a particular constitution, altering dietary or other personal habits, or direct therapeutic intervention And such a situation can be avoided.

【０１１４】本発明の診断利用は、試験被験体から採取
した細胞試料または生物学的抽出物（または試料）にお
ける本発明のモジュレーターの存在および量を測定する
方法に及び、そこでこのような試験試料における核酸
（ゲノムDNAまたはmRNA）および／またはタンパク質レ
ベルが確定され得る。ヌクレオチドの活性増大およびそ
の結果生じるタンパク質の存在が被験体の肥満症阻害能
を反映するとした場合、肥満性被験体においてこのよう
な結果を観察する医師は、本発明のヌクレオチドの存在
および活性に関する機能不全以外の要因が肥満状態の原
因であると決定し得る。逆に、ヌクレオチドおよび／ま
たは発現タンパク質のレベルの低下は、このような肥満
状態を治療するためにはこのようなレベルが増大しなけ
ればならないことを示唆し、次いで適切な治療養生法が
行われ得る。The diagnostic uses of the present invention extend to methods for determining the presence and amount of a modulator of the present invention in a cell sample or biological extract (or sample) taken from a test subject, wherein such test samples The nucleic acid (genomic DNA or mRNA) and / or protein level in can be determined. Given that increased activity of the nucleotides and the resulting presence of the protein would reflect the subject's ability to inhibit obesity, a physician observing such results in an obese subject will have a function as to the presence and activity of the nucleotides of the invention. Factors other than insufficiency may be determined to be responsible for the obesity condition. Conversely, a decrease in the level of nucleotides and / or expressed proteins suggests that such a level must be increased to treat such an obesity condition, and then an appropriate therapeutic regimen is taken. obtain.

【０１１５】さらに、見出されそして図１Ａ〜Ｅおよび
２ＡおよびＢにおいて示されたヌクレオチドは、上記で
簡単に述べたように、対応するRNAの測定に有用であるc
DNAを表す。同様に、図１Ａ〜Ｅおよび３のポリペプチ
ドに相当する組換えタンパク質物質が調製され、そし
て、例えばOBタンパク質の脂肪および／または血漿レベ
ルの測定、または組織（例えば視床下部）上のOBに対す
るレセプターの存在およびレベルの検出のための、例え
ばラジオイムノアッセイにおける使用のために適切に標
識され得る。In addition, the nucleotides found and shown in FIGS. 1A-E and 2A and B are useful for measuring the corresponding RNAs, as briefly described above.
Represents DNA. Similarly, recombinant proteinaceous materials corresponding to the polypeptides of FIGS. 1A-E and 3 were prepared and measured, for example, for fat and / or plasma levels of OB protein, or receptors for OB on tissue (eg, hypothalamus) Can be suitably labeled for detection of the presence and level of, for example, in a radioimmunoassay.

【０１１６】さらに、本発明は、本明細書中に示された
ヌクレオチドおよび対応するタンパク質の同定だけでな
く、このような物質に対するレセプターの明示もまた意
図する。このような背景において、図１Ａ〜Ｅ、３、
５、および／または６のポリペプチドが調製され得、適
切な発現ライブラリーをスクリーニングして活性なレセ
プターを単離するために利用され得る。このレセプター
はその後クローン化され得、そしてその後レセプター単
独で、またはリガンドと併用して、本明細書中のモジュ
レーターと同様の活性を有し得る小分子をスクリーニン
グするのに用いられ得る。In addition, the present invention contemplates not only the identification of the nucleotides and corresponding proteins set forth herein, but also the identification of the receptors for such substances. In such a background, FIGS.
Five and / or six polypeptides can be prepared and used to screen an appropriate expression library to isolate active receptors. This receptor can then be cloned and then used alone or in combination with a ligand to screen for small molecules that can have similar activity as the modulators herein.

【０１１７】さらに、本発明は、本明細書において特定
のモジュレーター、好ましくはそのような治療が適切で
ある種々の投与様式の製剤形態において調製された、そ
の配列が配列番号２、配列番号４、配列番号５、および
配列番号６に示されるポリペプチド、それらの抗体、そ
れらの対応する小分子アゴニストまたはアンタゴニス
ト、または活性フラグメントを含む薬学的組成物に関す
る。このような製剤形態は、薬学的に受容可能なキャリ
ア、または必要に応じて他のアジュバントを含み、そし
て各場合において臨床医または医師により決定される有
効用量範囲で調製され得る。Furthermore, the present invention relates to a method for preparing a particular modulator herein, preferably of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, prepared in the form of various modes of administration for which such treatment is appropriate. Pharmaceutical compositions comprising the polypeptides shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, their antibodies, their corresponding small molecule agonists or antagonists, or active fragments. Such dosage forms contain pharmaceutically acceptable carriers, or other adjuvants as appropriate, and may be prepared in each case at an effective dose range determined by the clinician or physician.

【０１１８】従って、本発明の主要な目的は、本明細書
中で定義されるような精製形態の体重モジュレーターを
提供することであり、このモジュレーターは、哺乳動物
の脂肪蓄積および脂肪含量の制御および変動に関連した
特定の特徴および活性を示す。Accordingly, a primary object of the present invention is to provide a purified form of a weight modulator as defined herein, which modulator regulates fat accumulation and fat content in mammals. Shows certain characteristics and activities associated with the variability.

【０１１９】本発明のさらなる目的は、このようなモジ
ュレーターのレベルの変動が特徴的な性質であるかまた
はあり得る病理学的状態の有効な診断およびモニタリン
グの手段として、本明細書中に記載したような体重制御
のモジュレーターの検出および測定方法を提供すること
である。A further object of the present invention is to provide a method for the effective diagnosis and monitoring of pathological conditions in which fluctuations in the level of such modulators are of a characteristic nature or possible, as described herein. It is an object of the present invention to provide a method for detecting and measuring such a modulator of weight control.

【０１２０】本発明の別のさらなる目的は、哺乳動物に
おいて本発明のモジュレーターの活性を模倣または阻害
するに潜在的に有効な物質（例えば、薬剤、因子など）
のスクリーニングのための方法および関連アッセイシス
テムを提供することである。Another further object of the present invention is to provide substances (eg, drugs, factors, etc.) that are potentially effective in mimicking or inhibiting the activity of the modulators of the present invention in mammals.
And a related assay system.

【０１２１】本発明の別のさらなる目的は、哺乳動物に
おいて体重および脂肪含量を制御し、そして／または体
重の異常低下または異常上昇が特徴的な性質である特定
の病理学的状態を治療するための哺乳動物の処置方法を
提供することである。Another further object of the present invention is to control body weight and fat content in mammals and / or to treat certain pathological conditions in which abnormal loss or increase in weight is a characteristic feature. Is to provide a method for treating mammals.

【０１２２】本発明のさらなる目的は、遺伝子治療プロ
トコルにおいて用いられる遺伝子構築物、および／また
は１つまたはそれより多くのモジュレーター、結合パー
トナー、またはそれらの生産を制御し得るか、またはそ
れらの活性を模倣または拮抗し得る因子を含むか、また
はこれに基づく、同等の治療方法のための薬学的組成物
を調製することである。It is a further object of the present invention that the gene constructs used in gene therapy protocols and / or one or more modulators, binding partners or their production can be controlled or mimic their activity Or to prepare a pharmaceutical composition for an equivalent method of treatment that contains or is based on an agent that can be antagonized.

【０１２３】他の目的および利点は、以下の例示の図面
に関連して進行する続く記載を検討することにより、当
業者には明らかである。Other objects and advantages will be apparent to those skilled in the art from a consideration of the ensuing description, taken in conjunction with the following illustrative drawings.

【０１２４】[0124]

【発明の実施の形態】本発明は、本明細書においてobポ
リペプチドまたはレプチン(1eptin)と呼ばれるタンパク
質、本タンパク質をコードする核酸(例えば、特定の発
現系における発現のための最適コドンを取り込み、ここ
でタンパク質が哺乳動物の体重の制御に関与する能力を
示す、その核酸の縮重変異体を含む)の解明および発見
に関する。対象となる核酸は、マウスおよびヒトOBポリ
ペプチドに対応するコード配列を示し、体重および脂肪
蓄積の調節に重要な役割を果たすとされている。本明細
書に示されたデータは、本発明の核酸のポリペプチド産
物は、それを発現する細胞によって分泌されることを示
し、そしてそのポリペプチドがホルモンとして機能する
ことを示す。別の実験データは、OBポリペプチドが、ob
遺伝子の変異を有するマウスの肥満症の治療において非
常に有効であることを示す。さらに、OBポリペプチドの
高用量の一回投与または中程度の継続用量は、正常(野
生型)マウスの重量滅少を起こす。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a protein referred to herein as an ob polypeptide or leptin, a nucleic acid encoding the protein (e.g., incorporating optimal codons for expression in a particular expression system; The present invention relates to the elucidation and discovery of proteins (including degenerate variants of their nucleic acids, which show the ability of proteins to participate in the control of mammal weight). The nucleic acids of interest exhibit coding sequences corresponding to mouse and human OB polypeptides and are believed to play an important role in regulating body weight and fat accumulation. The data presented herein indicate that the polypeptide products of the nucleic acids of the invention are secreted by the cells that express them, and that the polypeptides function as hormones. Another experimental data shows that the OB polypeptide
It shows that it is very effective in treating obesity in mice having a genetic mutation. In addition, a single dose or a moderate continuous dose of a high dose of OB polypeptide causes weight loss in normal (wild-type) mice.

【０１２５】さらに、本明細書の実施例は、OBポリペプ
チド(あるいは本明細書において「レプチン」と呼ばれる)
が、マウス、ラットおよびヒト血漿内を循環することを
示す。レプチンはob/obマウス由来の血漿中には存在せ
ず、db/dbマウス由来の血漿中には10倍高い濃度で存在
し、そしてfa/faラット中には20倍高い濃度で存在し
た。最も有意に、組換えレプチンの連日注入は劇的にob
/obマウスの体重を滅少し、野生型マウスの体重に有意
に影響し、そしてdb/dbマウスには影響を及ぼさない。[0125] Further, the examples herein refer to OB polypeptides (or alternatively referred to herein as "leptins").
Circulates in mouse, rat and human plasma. Leptin was absent in plasma from ob / ob mice, at a 10-fold higher concentration in plasma from db / db mice, and at a 20-fold higher concentration in fa / fa rats. Most significantly, daily injections of recombinant leptin dramatically ob
Decreases body weight of / ob mice, significantly affects body weight of wild-type mice, and has no effect on db / db mice.

【０１２６】さらなる局面において、1つの種由来のOB
ポリペプチドは、別の種においても生物学的に活性であ
る。特に、ヒトOBポリペプチドは、マウスにおいて活性
である。In a further aspect, an OB from one species
Polypeptides are also biologically active in other species. In particular, a human OB polypeptide is active in the mouse.

【０１２７】その主な局面において、本発明は、哺乳動
物の体重のモジュレーターとして機能する物質の同定に
関する。詳細には、本発明は、マウスおよびヒト両者に
おけるOB遺伝子およびそのコード領域に対応する特定の
核酸ならびにこれらの核酸によって発現される対応ポリ
ベプチドの単離、精製、および配列決定に関する。従っ
て、本発明は、図11A-E(配列番号１)ならびに図2Aおよ
びB(配列番号３)に記載のヌクレオチド配列を有する核
酸、ならびに縮重変異体、対立遺伝子およびそのフラグ
メントの発見を含み、そのすべては体重および脂肪蓄積
を調製する活性を有する。本核酸のOB遺伝子への対応
は、肥満症ならびに体重の異常が寄与因子となっている
他の疾病および機能不全のような状態に重要な影響を与
えることを予告する。本発明は、本発明の核酸によって
発現されるタンパク質、詳細には図１A-E(配列番号
２)、図３(配列番号４)、図５(配列番号５)、および図
６(配列番号６)ならびに保存された変異体、活性フラグ
メント、および同族の小分子にまで拡張する。In its main aspect, the present invention relates to the identification of substances that function as modulators of mammalian body weight. In particular, the present invention relates to the isolation, purification, and sequencing of specific nucleic acids corresponding to the OB gene and its coding region in both mouse and human, and the corresponding polypeptides expressed by these nucleic acids. Accordingly, the present invention includes the discovery of nucleic acids having the nucleotide sequences set forth in FIGS. 11A-E (SEQ ID NO: 1) and FIGS. 2A and B (SEQ ID NO: 3), as well as degenerate variants, alleles and fragments thereof, All have the activity of regulating body weight and fat accumulation. The correspondence of the nucleic acid to the OB gene predicts that it will have important effects on conditions such as obesity and other diseases and abnormalities in which abnormal body weight is a contributing factor. The present invention relates to proteins expressed by the nucleic acids of the invention, in particular FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 2), FIG. 3 (SEQ ID NO: 4), FIG. 5 (SEQ ID NO: 5) and FIG. ) And conserved variants, active fragments, and cognate small molecules.

【０１２８】前に記載の通り、重量制御モジュレーター
ペプチド、またはそれらの結合パートナー、あるいはそ
れらに対する模倣または拮抗あるいはそれらの生産の制
御のいずれかを示す他のリガンドまたは薬剤は、適切な
キャリアと共に、そして、体重の異常変動または脂肪蓄
積(単独、またはガンまたはAIDSのような有害な医学的
状態の一部として)を患う患者に対する種々の手段によ
る投与に対して有効な強度で、その治療のために、薬学
的組成物中に調製され得る。種々の投与技術が利用され
得、それらの中には、経口投与、鼻および経粘膜投与の
他の形態、皮下、静脈内注射および腹腔内注射のような
非経口技術、ならびにカテーテル注入などがある。認識
因子またはそれらのサブユニットの平均量は変化し得、
とくに資格を有する医師または獣医の推奨または処方に
基づくべきである。As previously described, the weight controlling modulator peptides, or their binding partners, or other ligands or agents that either mimic or antagonize them or control their production, are combined with a suitable carrier and For its treatment with effective intensity for administration by various means to patients suffering from abnormal body weight fluctuations or fat accumulation (alone or as part of a deleterious medical condition such as cancer or AIDS). Can be prepared in a pharmaceutical composition. A variety of administration techniques may be utilized, including oral administration, other forms of nasal and transmucosal administration, parenteral techniques such as subcutaneous, intravenous and intraperitoneal injection, and catheter infusion. . The average amount of recognition factors or their subunits can vary,
It should be based on the recommendation or prescription of a qualified physician or veterinarian.

【０１２９】上記に従って、体重モジュレーターの活性
を模倣または拮抗するのに有効な潜在的薬物をスクリー
ニングするためのアッセイシステムを調製し得る。重量
モジュレーターは、試験システムに導入され得、そして
候補薬物も得られた細胞培養物に導入され得、培養物は
細胞の活性における任意の変化を観察するためにその後
に試験され、それは候補薬物単独の添加、または既知重
量モジュレーターの添加量の効果による。In accordance with the above, an assay system can be prepared for screening potential drugs effective to mimic or antagonize the activity of a weight modulator. The weight modulator can be introduced into the test system, and the candidate drug can also be introduced into the resulting cell culture, and the culture is subsequently tested to observe any changes in the activity of the cells, where the candidate drug alone is , Or the effect of the amount of known weight modulator added.

【０１３０】上述の通り、本明細書に記載のOB遺伝子の
分子クローニングにより、哺乳動物の体重を調整するた
めに分子レベルで機能する物質のクラスの同定が行われ
た。本発明のモジュレーターの発見は、栄養疾患の診断
および治療について重要な意味を有し、このような疾患
には肥満症、ガン関連の重量の消失、および高血圧、心
臓病、およびII型糖尿病のような肥満症に関連する疾患
の治療が含まれるがこれらには限定されない。さらに、
家畜の体重を調整しようとする場合の、その遺伝子産物
に対する潜在的な農業上の用途がある。最後に、本発明
の1つまたはそれ以上のモジュレーターが分泌された分
子である限りは、それらのモジュレーターは、生物学的
に使用され、発現クローニングの技術を用いてそれらの
レセプターを単離し得る。特にOB遺伝子について以下に
行われる考察には、本発明の一部を含有するモジュレー
ターのクラスヘの一般的適応性が含まれ、従って解釈の
程度および範囲などと一致される。As described above, the molecular cloning of the OB gene described herein has led to the identification of a class of substances that function at the molecular level to regulate the weight of mammals. The discovery of modulators of the present invention has important implications for the diagnosis and treatment of nutritional disorders, such as obesity, cancer-related weight loss, and hypertension, heart disease, and type II diabetes. Including, but not limited to, the treatment of diseases associated with obesity. further,
There are potential agricultural uses for the gene product when trying to regulate livestock weight. Finally, as long as one or more modulators of the invention are secreted molecules, those modulators can be used biologically to isolate their receptors using the techniques of expression cloning. In particular, the discussion made below regarding the OB gene includes the general applicability of the modulators containing a portion of the present invention to the class, and is therefore consistent with the degree and scope of interpretation.

【０１３１】上記の通り、OBペプチドの機能的活性は、
トランスジェニックで評価され得る。この点に関して、
トランスジェニックマウスモデルが使用され得る。ob遺
伝子は、トランスジェニックマウスを用いる相補試験に
おいて使用され得る。候補遺伝子の野生型位置に対応す
るウイルスベクターまたはコスミドクローン(またはフ
ァージクローン)を含むトランスジェニックベクター
は、単離されたob遺伝子を用いて構築され得る。コスミ
ドは、公表されている手順[Jaenish,Science, 240:1468
‐1474(1988)]を用いてトランスジェニックマウスに導
入され得る。構築物を、C57BL/6J ob/ob×DBA交雑のFl
子孫間の交雑から誘導された受精卵に導入する。これら
の交雑は、Fl動物を作製するためのC57BL/6J ob/ob卵巣
移植体の使用を要する。DBA/2Jマウスは、対比株(count
erstrain)として使用する。何故なら、このマウスは、
卵巣移植体を用いる際に重要な非アグーティ(nonagout
i)外皮色を有するからである。コスミドトランスジェニ
ックマウス動物のob位置での遺伝子型は、緊密に連鎖し
たRFLPまたは変異の側面に位置し、そして先祖株間で多
型であるマイクロサテライトで動物を分類することによ
って、決定される。相補性は、特定の構築物が遺伝的に
肥満性型のF2動物(RFLP分析により評価されたものとし
て)を痩身型および非糖尿的にする場合に示される。こ
のような環境下では、相補性を決定的に証明するため
に、トランスジーンを有するob/obまたはdb/db動物を、
ob/obまたはdb/db卵巣移植体と交配させる必要がある。
この交配において、トランスジーンを有しないすべての
N2動物は肥満型およびインスリン耐性/糖尿病性になる
が、トランスジーンを有する動物は痩身型となり、そし
て正常なグルコースおよびインスリン血漿中濃度を有す
る。遺伝的意義においては、トランスジーンは抑制変異
として作用する。As noted above, the functional activity of the OB peptide is
It can be evaluated transgenic. In this regard,
A transgenic mouse model can be used. The ob gene can be used in a complementation test using transgenic mice. A transgenic vector containing a viral vector or cosmid clone (or phage clone) corresponding to the wild-type position of the candidate gene can be constructed using the isolated ob gene. Cosmids were prepared according to published procedures [Jaenish, Science, 240: 1468.
-1474 (1988)] into transgenic mice. The construct was used for C57BL / 6J ob / ob x DBA cross Fl
Introduce into fertilized eggs derived from crosses between progeny. These crosses require the use of C57BL / 6J ob / ob ovarian transplants to generate Fl animals. DBA / 2J mice were
erstrain). Because this mouse is
Important nonagouty (nonagout) in using ovarian transplants
i) It has a skin color. The genotype at the ob position of cosmid transgenic mouse animals is determined by classifying the animals with microsatellite flanking tightly linked RFLPs or mutations and polymorphism among ancestral strains. Complementation is indicated when a particular construct renders genetically obese F2 animals (as assessed by RFLP analysis) lean and non-diabetic. In such an environment, ob / ob or db / db animals with the transgene were used to conclusively demonstrate complementation.
Must be crossed with ob / ob or db / db ovarian transplants.
In this cross, all transgene-free
N2 animals become obese and insulin resistant / diabetic, whereas animals with the transgene become lean and have normal glucose and insulin plasma levels. In a genetic sense, the transgene acts as a suppressor mutation.

【０１３２】あるいは、野生型動物においてアンチセン
スの方向で発現される場合の表現型の効果を調べること
によって、OB遺伝子を試験し得る。このアプローチにお
いて、野生型対立遺伝子の発現は抑制され、変異の表現
型が生じる。RNA‐RNAの二本鎖形成(アンチセンス‐セ
ンス)は、mRNAの正常な取り扱いを妨げ、野生型遺伝子
の効果の部分的または完全な消失を引き起こす。この技
術を用いて、組織培養におけるTK合成の阻害ならびにDr
osophilaのKruppel変異およびマウスのShiverer変異の
表現型が生じさせられているIzantら、Cell, 36, 1007-
1015(1984);Greenら、Annu.Rev.Biochem., 55:569-597
(1986);Katsukiら、Science, 241:593‐595(1988)。こ
のアプローチの重要な利点は、同種mRNA全体の発現の効
果的な阻害のために、遺伝子の小さい部分の発現しか必
要としないことである。アンチセンストランスジーン
を、それ自身のプロモーターまたは適切な細胞のタイプ
で発現される別のプロモーターの制御下に置き、かつSV
40のポリA部位の上流に置く。このトランスジーンを用
いてトランスジェニックマウスを作成する。トランスジ
ェニックマウスはまた、卵巣移植体と接合させて、obヘ
テロ接合体が、アンチセンス構築物の効果に対してより
感受性であるかどうかについて試験する。Alternatively, the OB gene can be tested by examining the phenotypic effect when expressed in the antisense orientation in wild-type animals. In this approach, the expression of the wild-type allele is suppressed, resulting in a mutant phenotype. RNA-RNA duplex formation (antisense-sense) interferes with the normal handling of mRNA, causing a partial or complete loss of the effect of the wild-type gene. Using this technique, inhibition of TK synthesis in tissue culture and Dr
Izant et al., Cell, 36, 1007-, in which phenotypes of the osophila Kruppel mutation and the mouse Shiverer mutation have been generated.
1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55: 569-597.
(1986); Katsuki et al., Science, 241: 593-595 (1988). An important advantage of this approach is that only a small portion of the gene needs to be expressed for effective inhibition of the expression of the entire cognate mRNA. Placing the antisense transgene under the control of its own promoter or another promoter expressed in the appropriate cell type, and
Place upstream of 40 poly A sites. A transgenic mouse is prepared using this transgene. Transgenic mice are also conjugated to ovarian transplants to test whether ob heterozygotes are more sensitive to the effects of the antisense construct.

【０１３３】長期的には、OB遺伝子産物(OBポリペプチ
ドまたはOBタンパク質)の生化学的機能を解明すること
が、その活性に影響する小分子のアゴニストおよびアン
タゴニストを同定するのに有用である。In the long term, elucidating the biochemical function of an OB gene product (OB polypeptide or OB protein) is useful for identifying small molecule agonists and antagonists that affect its activity.

【０１３４】本明細書を通して用いられる種々の用語
は、例えば以下の本明細書で設定させる定義を有する。Various terms used throughout this specification have, for example, the definitions set out below in this specification.

【０１３５】用語「体重モジュレーター」、「モジュレー
ター(単数)」、「モジュレーター(複数)」、および具体的
に列挙されていないいずれの変異体も、本明細書におい
て相互に入れ換えて用いられ得、そして本出願および請
求の範囲で用いられる通り、一つの例でヌクレオチドお
よびタンパク質性物質を意味し、後者は単一または多数
のタンパク質を包含する。さらに具体的には、前記用語
は、ヌクレオチドならびに本明細書に記載の配列および
図1A-E(配列番号1)ならびに図2AおよびB(配列番号３)に
示される配列を有するDNAにまで及ぶ。同様に、本明細
書に記載のアミノ酸配列データならびに図1A〜E(配列番
号２)および図３(配列番号４)に示されるアミノ酸配列
データを有するタンパク質ならびに、本明細書中および
請求の範囲の両方における全ての物質について記載され
ている活性のプロフィールも同様に考慮される。従っ
て、実質的に等価なもしくは変化した活性を示すヌクレ
オチドについても同様に考慮され、これは実質的に相同
なアナログおよび対立遺伝子の変異体を包含する。同様
に、実質的に等価なもしくは変化した活性を示すタンパ
ク質で、例えば部位特異的変異によって意図的に改変さ
れたタンパク質、またはモジュレーターを生産する宿主
における偶発的な変異によるタンパク質を包含するタン
パク質についても同様に考慮される。The terms “weight modulator”, “modulator (s)”, “modulator (s)”, and any variants not specifically listed may be used interchangeably herein. As used in the present application and claims, in one example is meant nucleotide and proteinaceous material, the latter encompassing a single or multiple proteins. More specifically, the term extends to nucleotides and DNA having the sequences set forth herein and the sequences set forth in FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1) and FIGS. 2A and B (SEQ ID NO: 3). Similarly, proteins having the amino acid sequence data set forth herein and the amino acid sequence data set forth in FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 2) and FIG. 3 (SEQ ID NO: 4), and The activity profiles described for all substances in both cases are likewise considered. Accordingly, nucleotides that exhibit substantially equivalent or altered activity are likewise considered, including substantially homologous analogs and allelic variants. Similarly, proteins that exhibit substantially equivalent or altered activity, including, for example, proteins that have been intentionally altered by site-directed mutagenesis, or proteins that have been accidentally mutated in a host producing the modulator. Considered similarly.

【０１３６】「A」(但し、「A」は、単一のタンパク質、DNA
分子、ベクター、組換え宿主細胞など)を有する組成物
には、実質的に「B」(但し、「B」は、Aのラセミ体を除く１
つまたはそれ以上の混入タンパク質、DNA分子、ベクタ
ーなどを含む)が存在せず、この場合、組成物におい
て、重量で少なくとも約75%のタンパク質、DNA、ベクタ
ー(これらは、AおよびBが属する種のカテゴリーに依存
する)が、「A」である。好ましくは、「A」は、組成物にお
いてA+B種の重量で少なくとも約90%を含み、最も好まし
くは、重量で少なくとも約99%を含む。また好ましく
は、実質的に混入物が存在しない組成物は、目的の種の
活性または特徴を有する単一の分子量種のみを含有す
る。"A" (where "A" is a single protein, DNA
Compositions comprising molecules, vectors, recombinant host cells, etc., include substantially “B” (where “B” is 1 other than the racemic form of A).
One or more contaminating proteins, DNA molecules, vectors, etc., in which case at least about 75% by weight of the protein, DNA, vector (including the species to which A and B belong) in the composition Is "A". Preferably, "A" comprises at least about 90% by weight of the A + B species in the composition, and most preferably comprises at least about 99% by weight. Also preferably, compositions that are substantially free of contaminants contain only a single molecular weight species having the activity or characteristics of the species of interest.

【０１３７】OBポリペプチド 用語「タンパク質」（これは天然に存在するポリペプチ
ドを指す）および「ポリペプチド」は、ob遺伝子産物お
よびその変異体に関して、本明細書中で交換可能に用い
られる。用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプ
チド」は特に、シグナル配列（または融合タンパク質パ
ートナー）が除去されたOB遺伝子産物を指す。The OB polypeptide terms “protein” (which refers to a naturally occurring polypeptide) and “polypeptide” are used interchangeably herein with respect to the ob gene product and its variants. The term “mature protein” or “mature polypeptide” specifically refers to the OB gene product from which the signal sequence (or fusion protein partner) has been removed.

【０１３８】上述したように、特定の実施態様では、本
発明のobポリペプチドは、本明細書中に記載したアミノ
酸配列（例えば、配列番号２、４、５、６など）を有す
るポリペプチドを包含し、これは保存的アミノ酸置換で
改変されたobポリペプチド、ならびにそれらの生物学的
に活性なフラグメント、アナログ、および誘導体を包含
する。用語「生物学的に活性」は、ポリペプチドの特定
の効果を指すために本明細書中で用いられ、これは特異
的結合（例えばレセプター、抗体または他の認識分子に
対する）；分子レベルでのシグナル伝達経路の活性化；
および／またはインビボで天然obポリペプチドにより仲
介される生理的効果の誘導（またはアンタゴニストによ
る阻害）を包含するが、それらに限定されない。OBポリ
ペプチド（フラグメント、アナログ、および誘導体を包
含する）は、合成により、例えば、固相または液相ペプ
チド合成の周知の技術を用いて、調製され得る。好まし
くは、固相合成技術が用いられ得る。あるいは、本発明
のOBポリペプチドは、以下に記載されるような周知の遺
伝子工学技術を用いて調製され得る。さらに別の実施態
様では、OBポリペプチドは、例えば免疫アフィニティー
精製により、生体液から精製され得る。生体液は、例え
ば、血漿、血清、または尿であり、好ましくはヒトの血
漿、血清、または尿であり、そしてより好ましくはポリ
ペプチドを過剰発現している被験者、例えばOBレセプタ
ーにおいて変異を受けている肥満者または「脂肪性」に
対応する変異に関連した肥満症の肥満者に由来する血
漿、血清、または尿であるが、これらに限定されない。As mentioned above, in certain embodiments, the ob polypeptides of the present invention include polypeptides having the amino acid sequences described herein (eg, SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6, etc.). This includes ob polypeptides modified with conservative amino acid substitutions, as well as biologically active fragments, analogs, and derivatives thereof. The term “biologically active” is used herein to refer to a particular effect of a polypeptide, which is a specific binding (eg, to a receptor, antibody or other recognition molecule); Activation of signaling pathways;
And / or includes, but is not limited to, inducing a physiological effect (or inhibition by an antagonist) mediated by the native ob polypeptide in vivo. OB polypeptides (including fragments, analogs, and derivatives) can be prepared synthetically, for example, using well-known techniques of solid or liquid phase peptide synthesis. Preferably, solid phase synthesis techniques can be used. Alternatively, the OB polypeptide of the present invention can be prepared using well-known genetic engineering techniques as described below. In yet another embodiment, the OB polypeptide can be purified from the biological fluid, for example, by immunoaffinity purification. The biological fluid is, for example, plasma, serum, or urine, preferably human plasma, serum, or urine, and more preferably a subject overexpressing the polypeptide, e.g., mutated in an OB receptor. But not limited to, plasma, serum, or urine from an obese or obese obese person associated with a mutation corresponding to “fatty”.

【０１３９】OBポリペプチドのフラグメント 特定の実施態様では、本発明は、天然に存在するOBポリ
ペプチドのフラグメントが重要であり得ることを意図す
る。ペプチド配列は、しばしばタンパク質分解切断の標
的となる多くの部位（例えばアルギニン残基）を含む。
完全長ポリペプチドが１つまたはそれより多くの部位で
切断され得て、生物学的に活性なフラグメントを形成す
ることが可能である。このような生物学的に活性なフラ
グメントは、体重を低下させるOBポリペプチドの機能的
活性に対して作動的または拮抗的のいずれかに作用し得
る。Fragments of OB Polypeptides In certain embodiments, the present invention contemplates that fragments of naturally occurring OB polypeptides may be important. Peptide sequences often contain many sites (eg, arginine residues) that are targeted for proteolytic cleavage.
A full-length polypeptide can be cleaved at one or more sites to form a biologically active fragment. Such biologically active fragments can either agonize or antagonize the functional activity of the weight-reducing OB polypeptide.

【０１４０】OBポリペプチドのアナログ 本発明は、特定的には、OBペプチドのアナログの調製を
意図する。このアナログは、OBポリペプチドの生物学的
活性を保持し得る、例えばobペプチドの特異的結合パー
トナー（例えばOBレセプター）に結合し得ることにより
特徴づけられる。１つの実施態様では、アナログはOB活
性に作動的に作用し、すなわちそれはobペプチドと同様
に機能する。好ましくは、OBアゴニストは天然タンパク
質よりもより効果的である。例えば、OBアゴニストアナ
ログは、より高い親和性でOBレセプターに結合し得る
か、またはインビボでより長い半減期を示し得るか、ま
たはその両方であり得る。それにも関わらず、天然タン
パク質より有効性が低いOBペプチドアゴニストアナログ
もまた意図される。別の実施態様では、アナログはOB活
性に拮抗的に作用する。例えば、OBレセプターに結合す
るがシグナル伝達を誘導しないOBアナログは、天然OBの
レセプターへの結合を競合的に阻害し得、従ってインビ
ボでOB活性を低下させる。このようなOBアンタゴニスト
アナログはまた、obペプチドと異なる特性を示し得、例
えばインビボでのより長い（または短い）半減期、OBレ
セプターに対するより高い（または低い）結合親和性、
またはその両方を示し得る。OB Polypeptide Analogs The present invention specifically contemplates the preparation of OB peptide analogs. The analog is characterized by being able to retain the biological activity of the OB polypeptide, eg, bind to a specific binding partner of the ob peptide (eg, an OB receptor). In one embodiment, the analog operatively affects OB activity, ie, it functions similarly to the ob peptide. Preferably, OB agonists are more effective than native proteins. For example, an OB agonist analog may bind to the OB receptor with higher affinity, or exhibit a longer half-life in vivo, or both. Nevertheless, OB peptide agonist analogs that are less effective than the native protein are also contemplated. In another embodiment, the analog acts antagonistically on OB activity. For example, OB analogs that bind to the OB receptor but do not induce signal transduction can competitively inhibit the binding of native OB to the receptor, thus reducing OB activity in vivo. Such OB antagonist analogs may also exhibit different properties than ob peptides, such as longer (or shorter) half-life in vivo, higher (or lower) binding affinity for the OB receptor,
Or both.

【０１４１】１つの実施態様では、OBペプチドのアナロ
グは、ポリペプチドにおいて構造または機能に必須では
ない位置でのアミノ酸置換により改変されたOBペプチド
である。例えば、ヒトOBペプチドはマウスにおいて生物
学的に活性であるので、マウスアミノ酸配列に比較して
ヒト配列中の分岐アミノ酸残基を置換することにより、
OBペプチドの有用なアナログが得られると思われる。例
えば、ヒトの53位または98位、またはその両位置のセリ
ン残基（図４中に図示されるプロセスされていないペプ
チド配列）は、例えばグリシン、アラニン、バリン、シ
ステイン、メチオニン、またはスレオニンと置換され得
る。同様に、92位のアルギニン残基（図４）は、例え
ば、アスパラギン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、
グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、
メチオニン、またはシステインと置換され得る。図４を
さらに参照すると、置換可能であると考えられるヒトOB
ペプチドの他のアミノ酸は、118位のヒスチジン、121位
のトリプトファン、122位のアラニン、126位のグルタミ
ン酸、127位のスレオニン、128位のロイシン、132位の
グリシン、139位のグリシン、159位のトリプトファン、
および166位のグリシンである。別の実施態様では、121
位から128位（図４中に図示される）のうち１つ以上の
残基を、例えばグリシンまたはアラニンと置換するか、
または123位のセリンまたは125位のロイシンを除いて一
部の残基を置換することが可能であり得る。In one embodiment, an analog of the OB peptide is an OB peptide that has been modified by amino acid substitutions at positions that are not essential for structure or function in the polypeptide. For example, since the human OB peptide is biologically active in the mouse, by substituting a branched amino acid residue in the human sequence relative to the mouse amino acid sequence,
It is likely that useful analogs of the OB peptide will be obtained. For example, a human serine residue at position 53 or 98, or both, (an unprocessed peptide sequence illustrated in FIG. 4) may be replaced with, for example, glycine, alanine, valine, cysteine, methionine, or threonine. Can be done. Similarly, an arginine residue at position 92 (FIG. 4) can be, for example, asparagine, lysine, histidine, glutamine,
Glutamic acid, aspartic acid, serine, threonine,
It can be replaced with methionine, or cysteine. Still referring to FIG. 4, human OBs considered to be replaceable
Other amino acids in the peptide are histidine at position 118, tryptophan at position 121, alanine at position 122, glutamic acid at position 126, threonine at position 127, leucine at position 128, glycine at position 132, glycine at position 139, and glycine at position 159. Tryptophan,
And glycine at position 166. In another embodiment, 121
Replacing one or more residues from position 128 to position 128 (illustrated in FIG. 4) with, for example, glycine or alanine;
Or it may be possible to substitute some residues except for serine at position 123 or leucine at position 125.

【０１４２】別の実施態様では、OBポリペプチド（好ま
しくはヒトOBポリペプチド）のアナログはポリペプチド
の短縮型である。例えば、49位のグルタミンは必須では
なく、ペプチドから欠失され得ることが既に実証されて
いる。同様に、121位から128位の分岐アミノ酸残基の一
部または全てを欠失させることが可能であり得る。さら
に、本発明は、生物学的活性に必要な最少アミノ酸配列
を有するOBアナログの提供を意図する。これは、例え
ば、OBフラグメントの活性を、OB特異的抗体に結合す
る、天然OBポリペプチドの活性を阻害する、または天然
OBペプチドの活性に作動的に作用する能力について試験
することにより、容易に決定され得る。１つの実施態様
では、本発明は、117位および167位のシステイン残基
（図４中に図示される）間で形成するジスルフィド結合
により形成されたループ構造からなる短縮型OBポリペプ
チドを提供する。別の実施態様では、短縮型アナログ
は、22位（推定シグナルペプチド切断部位の後に続く）
から53位（限定タンパク質分解後のOBポリペプチドの質
量分析で検出される可動性ループ領域の直前のアミノ酸
残基；Cohenら、Protein Science, 4:1088(1995)を参照
のこと）のアミノ酸残基に相当する。別の実施態様で
は、短縮型アナログは、61位（OBポリペプチドの限定タ
ンパク質分解／質量分析で検出される可動性ループ領域
の直後の残基）から116位（最初のシステイン残基の直
前の残基）のアミノ酸に相当する。さらに別の実施態様
では、短縮型アナログは、61位から167位のアミノ酸に
相当する。In another embodiment, an analog of an OB polypeptide, preferably a human OB polypeptide, is a truncated form of the polypeptide. For example, it has already been demonstrated that glutamine at position 49 is not essential and can be deleted from the peptide. Similarly, it may be possible to delete some or all of the branched amino acid residues from positions 121 to 128. Further, the present invention contemplates providing OB analogs having the minimum amino acid sequence required for biological activity. This includes, for example, binding the activity of an OB fragment to an OB-specific antibody, inhibiting the activity of a native OB polypeptide, or
It can be readily determined by testing for the ability to operatively affect the activity of the OB peptide. In one embodiment, the present invention provides a truncated OB polypeptide consisting of a loop structure formed by disulfide bonds formed between cysteine residues at positions 117 and 167 (illustrated in FIG. 4). . In another embodiment, the truncated analog is at position 22 (following the putative signal peptide cleavage site).
To amino acid residues 53 to 53 (amino acid residues immediately before the mobile loop region detected by mass spectrometry of OB polypeptide after limited proteolysis; see Cohen et al., Protein Science, 4: 1088 (1995)) Group. In another embodiment, the truncated analog is from position 61 (residue immediately after the mobile loop region detected by limited proteolysis / mass spectrometry of the OB polypeptide) to position 116 (immediately before the first cysteine residue). Residue). In yet another embodiment, the truncated analog corresponds to amino acids 61-167.

【０１４３】さらに、54位から60位の推定可動性ループ
の１つ以上の残基が置換される。例えば、１つ以上の残
基が、架橋結合（例えばポリマーとの）のために、リジ
ン、グルタミン酸、またはシステイン（好ましくはリジ
ン）と置換され得る。これは、可動性ループ構造はタン
パク質の誘導体化に好ましい部位であるからである。あ
るいは、可動性ループ部分の残基が、タンパク質分解に
対してより耐性であるが可動性構造を保持するアミノ酸
残基、例えば１つ以上のプロリンと置換され得る。さら
に別の実施態様では、さらに誘導体化され得てそれらを
より分解（例えばタンパク質分解）に対し耐性にするア
ミノ酸残基での置換が意図される。In addition, one or more residues of the putative flexible loop at positions 54 to 60 are replaced. For example, one or more residues can be replaced with lysine, glutamic acid, or cysteine (preferably lysine) for cross-linking (eg, with a polymer). This is because the mobile loop structure is a preferred site for protein derivatization. Alternatively, residues in the mobile loop portion can be replaced with amino acid residues that are more resistant to proteolysis but retain the mobile structure, eg, one or more prolines. In yet another embodiment, substitutions with amino acid residues that can be further derivatized to make them more resistant to degradation (eg, proteolysis) are contemplated.

【０１４４】上記フラグメントサイズは概算であり、そ
してジスルフィド結合ループアナログにおいてシステイ
ン残基が維持されねばならないことを除いて、１個から
約５個のアミノ酸が、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ント、列挙された短縮型アナログの各末端または両末
端、あるいは内部に含められ得るかまたは欠失され得る
ことが、当業者により理解される。The fragment sizes above are approximations and, except that cysteine residues must be maintained in the disulfide-bonded loop analog, one to about five amino acids are the polypeptide or fragment thereof, the listed truncations. It will be appreciated by those skilled in the art that each or both termini of the type analog may be included or deleted internally.

【０１４５】マウスOBペプチドは50％のαヘリックス量
を含有し、そしてヒトOBポリペプチドは約60％のαヘリ
ックス量を含有することが判明している。これらは、生
理的条件に近い条件下における組換えペプチドの円偏光
二色性により検出される。従って、別の実施態様では、
アミノ酸残基が他の残基と置換され得て、OBポリペプチ
ドのアナログを形成し、このアナログは、より安定した
αヘリックス構造を形成する傾向の増加を示すかまたは
形成する。例えば、Glu、Ala、Leu、His、Trpが、天然O
Bポリペプチド中で見出されるアミノ酸残基に対する置
換基として導入される場合、αヘリックス構造をとりや
すい。好ましくは、保存的アミノ酸置換が用いられ、例
えば、29位、30位、44位、61位、76位、100位、および
／または106位のアスパラギン酸（図４中に図示され
る）のグルタミン酸（Glu）での置換；イソロイシンの
ロイシンでの置換；グリシンまたはバリンあるいは任意
の分岐アミノ酸のアラニンでの置換（例えばヒトOBポリ
ペプチドの53位のセリンのアラニンでの置換）；アルギ
ニンまたはリジンのヒスチジンでの置換；およびチロシ
ンおよび／またはフェニルアラニンのトリプトファンで
の置換が挙げられる。αヘリックス構造の程度、または
より重要なことに、αヘリックス構造の安定性を高める
と、より高い活性、増大された結合親和性、またはより
長い半減期を有するOBアナログが得られ得る。特定の実
施態様では、22位から53位のアミノ酸残基に相当するOB
ペプチド部分のヘリックス形成能力が増大される。別の
実施態様では、61位から116位のアミノ酸残基のヘリッ
クス形成能力または安定性が増大される。さらに別の実
施態様では、117位から167位のアミノ酸に相当するジス
ルフィドループ構造のヘリックス形成能力が増大され
る。また、上記ドメインの１つより多くにおいて増大さ
れたαヘリックス能力または安定性を含有するOBアナロ
グが意図される。さらなる実施態様では、短縮型OBポリ
ペプチドアナログは、構造形成性（例えばヘリックス形
成性）アミノ酸残基を取り込んで、ポリペプチドフラグ
メントが安定構造を欠如する傾向がより高いことを補う
ように生成される。It has been found that the mouse OB peptide contains 50% α-helix content and the human OB polypeptide contains about 60% α-helix content. These are detected by the circular dichroism of the recombinant peptide under conditions close to physiological conditions. Thus, in another embodiment,
Amino acid residues can be substituted for other residues to form analogs of the OB polypeptide, which analogs exhibit or form an increased tendency to form more stable α-helical structures. For example, Glu, Ala, Leu, His, Trp is a natural O
When introduced as a substituent for an amino acid residue found in a B polypeptide, it tends to adopt an α-helical structure. Preferably, conservative amino acid substitutions are used, for example, the glutamic acid of aspartic acid at position 29, 30, 44, 61, 76, 100, and / or 106 (shown in FIG. 4). (Glu); isoleucine for leucine; glycine or valine or any branched amino acid for alanine (eg, serine at position 53 of human OB polypeptide for alanine); arginine or lysine for histidine And substitution of tyrosine and / or phenylalanine with tryptophan. Increasing the degree of α-helix structure, or more importantly, the stability of the α-helix structure, may result in OB analogs with higher activity, increased binding affinity, or longer half-life. In certain embodiments, the OB corresponding to amino acid residues 22 through 53.
The helix-forming ability of the peptide moiety is increased. In another embodiment, the helix forming ability or stability of amino acid residues 61 to 116 is increased. In yet another embodiment, the helix forming ability of the disulfide loop structure corresponding to amino acids 117 to 167 is increased. Also contemplated are OB analogs that contain increased α-helical capacity or stability in more than one of the above domains. In a further embodiment, truncated OB polypeptide analogs are generated that incorporate structure-forming (eg, helix-forming) amino acid residues to compensate for the increased tendency of polypeptide fragments to lack stable structures. .

【０１４６】フラグメントのようなアナログは、例え
ば、体重モジュレーターペプチド物質のペプシン消化に
より生成され得る。ムテイン（mutein）のような他のア
ナログは、体重モジュレーターペプチドコード配列の標
準的な部位特異的変異誘発により生成され得る。プロモ
ーターまたはインヒビターのいずれとして機能するにせ
よ、小分子などのような「体重モジュレーター活性」を
示すアナログは、公知のインビボアッセイおよび／また
はインビトロアッセイにより同定され得る。[0146] Analogs such as fragments can be produced, for example, by pepsin digestion of the weight modulator peptide material. Other analogs, such as muteins, can be generated by standard site-directed mutagenesis of the weight modulator peptide coding sequence. Analogs that exhibit "weight modulator activity", such as small molecules, whether functioning as promoters or inhibitors, can be identified by known in vivo and / or in vitro assays.

【０１４７】OBポリペプチドの小分子アナログおよびペ
プチド模擬体(peptidomimetics)obポリペプチド（好ま
しくはヒトOBポリペプチド）の構造は、当該分野で公知
の種々の方法により分析され得る。タンパク質配列は親
水性分析［例えば、Hoppら、Proc．Natl. Acad. Sci. U
SA, 78:3824 (1981) ］により特徴づけられ得る。親水
性プロフィルは、OBポリペプチドの疎水性領域および親
水性領域を同定するのに用いられ得、フォールディング
されたポリペプチドの内部に埋まっている領域、および
ポリペプチドの外部で接近可能な領域を示し得る。さら
に、二次構造分析［例えば、Chouら、Biochem., 13:222
(1974) ］もまた行われ得、特定の二次構造をとるOBポ
リペプチドの領域を同定し得る。二次構造推定を包含す
る構造の推定または決定の操作は、当該分野で入手可能
なコンピューターソフトウェアプログラムを用いて行わ
れ得る。The structures of small molecule analogs of the OB polypeptide and peptidomimetics ob polypeptides, preferably human OB polypeptides, can be analyzed by various methods known in the art. Protein sequences were analyzed for hydrophilicity [see, for example, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 78: 3824 (1981)]. The hydrophilicity profile can be used to identify the hydrophobic and hydrophilic regions of the OB polypeptide, indicating regions that are buried inside the folded polypeptide and regions that are accessible outside the polypeptide obtain. In addition, secondary structure analysis [eg, Chou et al., Biochem., 13: 222
(1974)] can also be performed to identify regions of the OB polypeptide that adopt a particular secondary structure. The manipulation of structure estimation or determination, including secondary structure estimation, can be performed using computer software programs available in the art.

【０１４８】組換えOBポリペプチドの豊富な供給源を提
供することにより、本発明は、ポリペプチドの定量的構
造決定を可能にする。特に、核磁気共鳴（NMR）、赤外
（IR）、ラマン、および紫外（UV）、特に円偏光二色性
（CD）分光分析のために、十分な材料が提供される。特
に、NMRは、溶液中分子の非常に強力な構造分析を提供
し、分子の天然の環境により正確に近づく［Marionら,
Biochim. Biophys. Res. Comm. 113:967-974 (1983)；B
arら, J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985)；Kimura
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77：1681-1685 (198
0) ］。他の構造分析方法もまた用いられ得る。これら
は、Ｘ線結晶構造解析［Engstom、Biochem. Exp. Bio
l., 11:7-13 (1974)］を包含するが、これに限定されな
い。By providing a rich source of recombinant OB polypeptides, the present invention allows for quantitative structure determination of the polypeptide. In particular, sufficient materials are provided for nuclear magnetic resonance (NMR), infrared (IR), Raman, and ultraviolet (UV), especially circular dichroism (CD) spectroscopy. In particular, NMR provides very powerful structural analysis of molecules in solution, more closely approaching the natural environment of the molecule [Marion et al.,
Biochim. Biophys. Res. Comm. 113: 967-974 (1983); B
ar et al., J. Magn. Reson., 65: 355-360 (1985); Kimura.
Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1681-1685 (198
0)]. Other structural analysis methods can also be used. These are based on X-ray crystal structure analysis [Engstom, Biochem. Exp. Bio.
l., 11: 7-13 (1974)].

【０１４９】さらに別の実施態様では、OBポリペプチド
のアナログが、天然OBポリペプチドまたはそれらの特定
のフラグメントに対して特異的な抗体と交差反応するか
否かを決定するために試験され得る。交差反応度は、タ
ンパク質の構造相同性または類似性、あるいはフラグメ
ント特異的抗体を生成するために用いられるポリペプチ
ド部分に相当する領域の接近可能性についての情報を提
供する。In yet another embodiment, an analog of an OB polypeptide can be tested to determine whether it cross-reacts with an antibody specific for a native OB polypeptide or a particular fragment thereof. Cross-reactivity provides information about the structural homology or similarity of the proteins, or the accessibility of the region corresponding to the portion of the polypeptide used to generate fragment-specific antibodies.

【０１５０】OBアナログのスクリーニング ポリペプチドのアナログをスクリーニングするために、
種々のスクリーニング技術が当該分野で知られている。
化学物質の種々のライブラリーが利用可能である。従っ
て、本発明は、このようなライブラリー（例えば、何年
もの研究で生成された合成化合物のライブラリー、天然
化合物のライブラリー、および組合せのライブラリー、
以下でより詳細に記載する）を、OBポリペプチドのアナ
ログについてスクリーニングすることを意図する。１つ
の実施態様では、本発明は、このようなライブラリーを
抗OBポリペプチド抗体、好ましくは抗ヒトobポリペプチ
ド抗体に結合する化合物についてスクリーニングするこ
とを意図する。別の局面では、一旦OBレセプターが同定
されれば（以下を参照のこと）、当該分野で公知の任意
のスクリーニング技術がOBレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストについてスクリーニングするために用い
られ得る。本発明は、小分子リガンドまたはリガンドア
ナログおよび模倣物についてのスクリーニング、ならび
にインビボでOBレセプターに結合し、そしてその活性化
に作動的または拮抗的に作用する天然リガンドについて
のスクリーニングを意図する。Screening for OB Analogs To screen for analogs of a polypeptide,
Various screening techniques are known in the art.
Various libraries of chemicals are available. Accordingly, the present invention is directed to such libraries (eg, libraries of synthetic compounds, libraries of natural compounds, and libraries of combinations, generated in years of research,
(Described in more detail below) are intended to be screened for analogs of the OB polypeptide. In one embodiment, the invention contemplates screening such libraries for compounds that bind to an anti-OB polypeptide antibody, preferably an anti-human ob polypeptide antibody. In another aspect, once the OB receptor has been identified (see below), any screening technique known in the art can be used to screen for OB receptor agonists or antagonists. The present invention contemplates screening for small molecule ligands or ligand analogs and mimetics, as well as for natural ligands that bind to the OB receptor in vivo and agonize or antagonize its activation.

【０１５１】レセプターの一次配列およびその配列と機
能が公知であるタンパク質との類似性を認識することに
より、タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストに
関する端緒が提供され得る。アンタゴニストの同定およ
びスクリーニングは、タンパク質の構造特徴を、例え
ば、Ｘ線結晶構造解析、中性子回折、核磁気共鳴分光
法、および構造決定のための他の技術を用いて決定する
ことにより、さらに容易になる。これらの技術は、アゴ
ニストおよびアンタゴニストの合理的な設計または同定
を提供する。Recognition of the primary sequence of the receptor and its similarity to proteins of known sequence and function can provide clues to agonists or antagonists of the protein. Identification and screening of antagonists is made easier by determining the structural characteristics of the protein using, for example, X-ray crystallography, neutron diffraction, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and other techniques for structure determination. Become. These techniques provide for the rational design or identification of agonists and antagonists.

【０１５２】別のアプローチは、大きなライブラリーを
生成するために組換えバクテリオファージを用いる。
「ファージ法」［Scottら, Science, 249:386-390 (199
0)；Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-
6382 (1990)；Devlinら, Science, 249:404-406（199
0）］を用いて、非常に大きなライブラリーが構築され
得る（10⁶〜10⁸化学的実在(chemical entities)）。第
２の方法は、主に化学的方法を用いる。この方法として
は、Geysen法［Geysenら, Molecular Immunology,23:70
9-715 (1986)；Geysenら, J. Immunologic Method, 10
2:259-274 (1987）］およびFodorら、Science, 251:767
-773 (1991) による最新法が挙げられる。Furkaら 14t
h International Congress of Biochemistry, Volume
5, AbstractFR:013 (1988)；Furka, Int. J. Peptide P
rotein Res., 37:487-493 (1991) ］；Houghton（米国
特許第4,631,211号、1986年12月発行）；およびRutter
ら（米国特許第5,010,175号、1991年４月23日発行）
は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得
るペプチドの混合物を生成する方法を記載している。Another approach uses recombinant bacteriophage to generate large libraries.
"Phage method" [Scott et al., Science, 249: 386-390 (199
0); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-
6382 (1990); Devlin et al., Science, 249: 404-406 (199
0)], very large libraries can be constructed (10 ⁶ -10 ⁸ chemical entities). The second method mainly uses a chemical method. This method includes the Geysen method [Geysen et al., Molecular Immunology, 23:70.
9-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 10
2: 259-274 (1987)] and Fodor et al., Science, 251: 767.
-773 (1991). Furka et al. 14t
h International Congress of Biochemistry, Volume
5, AbstractFR: 013 (1988); Furka, Int. J. Peptide P
rotein Res., 37: 487-493 (1991)]; Houghton (US Pat. No. 4,631,211 issued December 1986); and Rutter.
(US Patent No. 5,010,175, issued April 23, 1991)
Describe a method of producing a mixture of peptides that can be tested as agonists or antagonists.

【０１５３】別の局面では、合成ライブラリー［Needel
sら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:10700-10704 (19
93)；Lamら, 国際特許公開第WO92/00252号、それぞれそ
の全体が本明細書中に参考として援用されている］など
が、本発明のOBレセプターリガンドについてスクリーニ
ングするために用いられ得る。このようなライブラリー
を用いれば、レセプターアンタゴニストは、実際にOBレ
セプターをクローニングしなくても、レセプターを発現
する細胞を用いて検出され得る。In another aspect, a synthetic library [Needel
Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700-10704 (19
93); Lam et al., International Patent Publication No. WO 92/00252, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety], and the like, can be used to screen for OB receptor ligands of the present invention. Using such a library, receptor antagonists can be detected using cells that express the receptor without actually cloning the OB receptor.

【０１５４】あるいは、組換え型のOBレセプターリガン
ド結合ドメインを発現する細胞への可溶性リガンドの結
合についてのアッセイが行われ得る。この可溶性リガン
ドは、組換えまたは合成OBポリペプチドとして容易に提
供され得る。Alternatively, assays can be performed for binding of soluble ligand to cells expressing the recombinant OB receptor ligand binding domain. The soluble ligand can be readily provided as a recombinant or synthetic OB polypeptide.

【０１５５】スクリーニングは、OBレセプターを発現す
る組換え細胞を用いて、あるいは精製レセプタータンパ
ク質（例えば、組換えにより生成された）を用いて、上
述のように行われ得る。例えば、分子のリガンド結合部
分を含む標識した可溶性または可溶化OBレセプターがリ
ガンドに結合する能力が、上述の参照において記載され
るように、ライブラリーのスクリーニングのために用い
られ得る。Screening can be performed as described above, using recombinant cells expressing the OB receptor, or using purified receptor proteins (eg, produced recombinantly). For example, the ability of a labeled soluble or solubilized OB receptor containing the ligand binding portion of the molecule to bind a ligand can be used for screening libraries, as described in the above references.

【０１５６】OBポリペプチドの誘導体 一般に、本発明のタンパク質（ここで用語「タンパク
質」は、他に指示されなければ「ポリペプチド」を包含
するように用いられる）は、タンパク質部分への１つ以
上の化学部分の結合により誘導体化され得る。化学修飾
誘導体は、さらに動脈内、腹腔内、筋内、皮下、静脈
内、経口、鼻内、直腸、経頬粘膜(bucal)、舌下、肺、
局所、経皮、または他の投与経路についてさらに処方さ
れ得る。生物学的に活性なタンパク質の化学修飾は、特
定の環境下で付加的な利点を提供することが見出されて
いる。この利点としては、例えば、治療タンパク質の安
定性および循環時間の増大および免疫原性の低下が挙げ
られる。例えば、米国特許第4,179,337号、Davisら、19
79年12月18日発行を参照のこと。概説については、Abuc
howskiら、「可溶性ポリマー−酵素付加物」、Enzyme a
s Drugs, 367〜383頁、HolcenbergおよびRoberts編、Wi
ley-Interscience, New York, NY, (1981)を参照のこ
と。タンパク質修飾および融合タンパク質について記載
の概説的文献は、Francis、Focus on Growth Factors,
3:4-10(1992)である。Derivatives of OB Polypeptides Generally, the proteins of the present invention (where the term "protein" is used to encompass "polypeptide" unless otherwise indicated) are used to attach one or more of the Can be derivatized by the attachment of a chemical moiety of Chemically modified derivatives can also be used in the arteries, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intravenous, oral, nasal, rectal, buccal (bucal), sublingual, lung,
It may be further formulated for topical, transdermal, or other routes of administration. Chemical modifications of biologically active proteins have been found to provide additional benefits under certain circumstances. Advantages include, for example, increased stability and circulation time of the therapeutic protein and reduced immunogenicity. See, for example, U.S. Pat.No. 4,179,337, Davis et al., 19
See issue on December 18, 1979. For an overview, see Abuc
Howski et al., "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", Enzyme a
s Drugs, pp. 367-383, edited by Holcenberg and Roberts, Wi.
See ley-Interscience, New York, NY, (1981). Review literature describing protein modifications and fusion proteins can be found in Francis, Focus on Growth Factors,
3: 4-10 (1992).

【０１５７】誘導体化のための化学部分 誘導体化に適切な化学部分は、水溶性ポリマーの中から
選択され得る。選択されるポリマーは、それに結合され
るタンパク質が生理的環境のような水性環境で沈澱しな
いように、水溶性でなければならない。好ましくは、最
終産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的
に受容可能である。当業者は、ポリマー／タンパク質複
合体が治療的に用いられるかどうかというような考慮、
そしてもし用いられる場合、所望の投与量、循環時間、
タンパク質分解に対する耐性、および他の考慮条件に基
づいて、所望のポリマーを選択し得る。本発明のタンパ
ク質およびペプチドについて、これらは本明細書中に提
供されるアッセイを用いて確かめられ得る。Chemical Moieties for Derivatization Chemical moieties suitable for derivatization can be selected from among water-soluble polymers. The polymer chosen must be water-soluble so that the proteins attached to it do not precipitate in aqueous environments, such as physiological environments. Preferably, for therapeutic use of the end product preparation, the polymer is pharmaceutically acceptable. One of skill in the art will consider whether the polymer / protein conjugate is used therapeutically,
And if used, the desired dose, circulation time,
The desired polymer can be selected based on its resistance to proteolysis and other considerations. For the proteins and peptides of the invention, these can be ascertained using the assays provided herein.

【０１５８】ポリマー分子 水溶性ポリマーは、例えばポリエチレングリコール、エ
チレングリコール／プロピレングリコールのコポリマ
ー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-
ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／
無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマ
ーまたはランダムコポリマーのいずれか）およびデキス
トランまたはポリ(n-ビニルピロリドン）ポリエチレン
グリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、
ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマ
ー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニル
アルコールからなる群から選択され得る。ポリエチレン
グリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定
性のために製造に利点を提供し得る。Polymer molecules The water-soluble polymers include, for example, polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly-1,3-
Dioxolan, poly-1,3,6-trioxane, ethylene /
Maleic anhydride copolymers, polyamino acids (either homopolymers or random copolymers) and dextran or poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer,
It may be selected from the group consisting of polypropylene oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols, and polyvinyl alcohol. Polyethylene glycol propionaldehyde may offer advantages in manufacturing due to its stability in water.

【０１５９】ポリマーは、任意の分子量であり得、そし
て分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコー
ルについて、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造に
容易であるためには約２kDaと約100kDaとの間である
（用語「約」はポリエチレングリコールの調製におい
て、いくらかの分子の分子量が記された分子量よりも高
く、いくらかは低いことを示す）。他のサイズは、所望
の治療プロフィル（例えば所望の徐放期間、（もしあれ
ば生物学的活性に対する）効果、取り扱いの容易さ、抗
原性の程度または欠如、および治療タンパク質またはア
ナログに対するポリエチレングリコールの他の既知の効
果依存して用いられ得る。The polymers can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. For polyethylene glycol, the preferred molecular weight is between about 2 kDa and about 100 kDa for ease of handling and manufacture (the term "about" refers to the molecular weight of some molecules in the preparation of polyethylene glycol, where the molecular weight of some molecules is noted). Higher and somewhat lower). Other sizes include the desired therapeutic profile (eg, desired sustained release time, effect (on biological activity, if any), ease of handling, degree or lack of antigenicity, and polyethylene glycol for therapeutic protein or analog). It can be used depending on other known effects.

【０１６０】ポリマー／タンパク質比 そのように結合されるポリマー分子数は変化し得、そし
て当業者は機能に対するその効果を確かめ得る。モノ誘
導体化され得るか、または同一のまたは異なる化学部分
（例えば、ポリマー（例えば異なる分子量のポリエチレ
ングリコール））とジ誘導体化、トリ誘導体化、テトラ
誘導体化、または誘導体化の組合せが提供され得る。タ
ンパク質（またはペプチド）分子に対するポリマー分子
の割合は、反応混合物におけるそれらの濃度の変化につ
れて変化する。一般に、最適比（過剰な非反応タンパク
質またはポリマーが存在しない反応効率に関する）は、
所望の誘導体化程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、
選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分枝であるか
非分枝であるか、および反応条件のような因子により決
定される。Polymer / Protein Ratio The number of polymer molecules so attached can vary, and one skilled in the art can ascertain its effect on function. It can be mono-derivatized, or provided with the same or different chemical moieties (eg, polymers (eg, polyethylene glycols of different molecular weight)) and di-, tri-, tetra-, or derivatization combinations. The ratio of polymer molecules to protein (or peptide) molecules changes as their concentration in the reaction mixture changes. Generally, the optimal ratio (for reaction efficiency in the absence of excess unreacted protein or polymer) is
Desired degree of derivatization (eg, mono, di, tri, etc.),
It is determined by factors such as the molecular weight of the polymer selected, whether the polymer is branched or unbranched, and the reaction conditions.

【０１６１】タンパク質への化学部分の結合 ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）
は、タンパク質の機能性または抗原性ドメインにおける
効果を考慮してタンパク質に結合されるべきである。当
業者に利用可能な多くの結合方法がある（例えば、本明
細書中に参考として援用されるEP 0 401 384（PEGのG-C
SFへのカップリング））。Malikら、Exp.Hematol., 20:
1028-1035 (1992)（塩化トレシルを用いるGM-CSFのPEG
化を報告）もまた参照のこと。例えば、ポリエチレング
リコールは、反応基（例えば遊離アミノまたはカルボキ
シル基）を介してアミノ酸残基に共有結合され得る。反
応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合され
得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、
リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み、遊離カル
ボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残
基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含
む。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール
分子を結合させるための反応基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例え
ば、Ｎ末端はまたはリジン基での結合である。レセプタ
ー結合に重要な残基での結合は、レセプター結合が所望
である場合避けられるべきである。Attachment of a chemical moiety to a protein Polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety)
Should be attached to the protein taking into account the effect on the functional or antigenic domain of the protein. There are many conjugation methods available to those of skill in the art (eg, EP 0 401 384 (GC of PEG, which is incorporated herein by reference).
Coupling to SF)). Malik et al., Exp.Hematol., 20:
1028-1035 (1992) (PEG of GM-CSF using tresyl chloride
Report). For example, polyethylene glycol can be covalently linked to an amino acid residue via a reactive group (eg, a free amino or carboxyl group). A reactive group is a group to which an activated polyethylene glycol molecule can be attached. The amino acid residue having a free amino group is
Amino acid residues having a free carboxyl group, including lysine residues and N-terminal amino acid residues, include aspartic acid residues, glutamic acid residues, and C-terminal amino acid residues. Sulfhydryl groups can also be used as reactive groups for attaching polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, for example at the N-terminus or at a lysine group. Binding at residues important for receptor binding should be avoided if receptor binding is desired.

【０１６２】Ｎ末端化学修飾タンパク質 特にＮ末端化学修飾タンパク質を所望し得る。本発明の
組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いる場
合、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝
などでの）、反応混合物中におけるタンパク質（または
ペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の
割合、実施されるPEG化反応のタイプ、および選択され
たＮ末端PEG化タンパク質を得る方法から選択され得
る。Ｎ末端PEG化調製物を得る（すなわち、必要であれ
ば他のモノPEG化部分からこの部分を分離する）方法
は、PEG化タンパク質分子の集団からＮ末端PEG化物質を
精製することにより行われ得る。選択的Ｎ末端化学修飾
は、還元アルキル化により行われ得、特定のタンパク質
における誘導体化に利用可能な異なるタイプのもとのア
ミノ基（Ｎ末端に対してリジン）の異なる反応性を用い
る。適切な反応条件下で、ポリマーを含むカルボニル基
によるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体
化が達成される。例えば、タンパク質のリジン残基のε
アミノ基とＮ末端残基のαアミノ基との間のpK_a差を利
用し得るpHで反応を行うことにより、タンパク質を選択
的にＮ末端でPEG化し得る。このような選択的誘導体化
により、水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御さ
れる：ポリマーとの複合体化は、タンパク質のＮ末端で
優勢的に生じ、そして他の反応基（例えばリジン側鎖ア
ミノ基）の有意な修飾は生じない。還元アルキル化を用
いる場合、水溶性ポリマーは上記のタイプであり得、そ
してタンパク質にカップリングするため１つの反応性ア
ルデヒドを有するべきである。ポリエチレングリコール
プロピオンアルデヒド（１つの反応性アルデヒドを含
む）は用いられ得る。N-Terminal Chemically Modified Proteins In particular, N-terminally chemically modified proteins may be desired. When using polyethylene glycol as an illustration of the composition of the present invention, various polyethylene glycol molecules (in terms of molecular weight, branching, etc.), the ratio of polyethylene glycol molecules to protein (or peptide) molecules in the reaction mixture, the PEG effected And the method by which the selected N-terminal PEGylated protein is obtained. A method of obtaining an N-terminal PEGylated preparation (ie, separating this portion from other mono-PEGylated moieties if necessary) is performed by purifying the N-terminal PEGylated material from a population of PEGylated protein molecules. obtain. Selective N-terminal chemical modification can be performed by reductive alkylation, using different reactivities of different types of original amino groups (lysine to N-terminal) available for derivatization in a particular protein. Under the appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with the carbonyl group containing polymer is achieved. For example, ε of lysine residue of protein
By carrying out the reaction at a pH which may utilize a pK _a differences between the α-amino group of the amino group and the N-terminal residues may turned into PEG to a protein selectively at the N-terminus. Such selective derivatization controls the binding of the water-soluble polymer to the protein: complexation with the polymer occurs predominantly at the N-terminus of the protein and other reactive groups such as lysine side chains No significant modification of the amino group) occurs. If reductive alkylation is used, the water-soluble polymer can be of the type described above and should have one reactive aldehyde for coupling to proteins. Polyethylene glycol propionaldehyde (including one reactive aldehyde) can be used.

【０１６３】OBポリペプチドに関連する核酸 上記のように、本発明はobポリペプチドをコードする核
酸、およびOB遺伝子関連ゲノムの5'、3'、およびイント
ロンの非コード配列に関する。それゆえ本発明に従っ
て、当該分野の技術範囲において従来の分子生物学、微
生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。このよ
うな技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Sa
mbrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、
第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York (1989);Glover編、DNA Cloni
ng: A Practical Approach、第Ｉ巻および第II巻、MRL
Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait編、Oligonuc
leotide Synthesis、OxfordUniversity Press (1984);
Hamesら編、Nucleic Acid Hybridization、Springer-Ve
rlag (1985); Hamesら編、Transcription And Translat
ion、Oxford University Press (1984); Freshney編、A
nimal Cell Culture、Oxford University Press (198
6); Immobilized Cells And Enzymes、IRL Press (198
6); Perbal、A Practical Guide To Molecular Clonin
g、Wiley, New York (1984)を参照のこと。本発明に特
に関連するのは、遺伝子または核酸の、周知のポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)技術に基づいた単離、クローニン
グ、配列決定、解析、および特徴付けのストラテジーで
ある。 Nucleic Acids Related to OB Polypeptides As described above, the invention relates to nucleic acids encoding ob polypeptides, and non-coding sequences of the 5 ', 3', and introns of the OB gene-related genome. Thus, according to the present invention, conventional molecular biology, microbiology, and recombinant DNA techniques may be used within the skill of the art. Such techniques are explained fully in the literature. For example, Sa
mbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York (1989); Glover, DNA Cloni
ng: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL
Press, Ltd., Oxford, UK (1985); Gait, Oligonuc
leotide Synthesis, Oxford University Press (1984);
Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Ve
rlag (1985); edited by Hames et al., Transcription And Translat
ion, Oxford University Press (1984); Ed. Freshney, A
nimal Cell Culture, Oxford University Press (198
6); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (198
6); Perbal, A Practical Guide To Molecular Clonin
g, see Wiley, New York (1984). Of particular relevance to the invention are strategies for isolating, cloning, sequencing, analyzing, and characterizing genes or nucleic acids based on the well-known polymerase chain reaction (PCR) technique.

【０１６４】「レプリコン」は、インビボにおけるDNA
複製の自律的なユニットとして機能する、すなわちそれ
自身の制御のもとに複製し得る任意の遺伝的要素(例え
ば、プラスミド、染色体、ウイルス)である。"Replicon" refers to DNA in vivo.
Any genetic element (eg, a plasmid, chromosome, virus) that can function as an autonomous unit of replication, ie, replicate under its own control.

【０１６５】「ベクター」は、プラスミド、ファージ、
またはコスミドのような、他のDNAセグメントを結合し
て、結合されたセグメントの複製をもたらし得るレプリ
コンである。"Vector" refers to a plasmid, phage,
Or a replicon that can bind other DNA segments, such as cosmids, resulting in replication of the linked segment.

【０１６６】「カセット」は、特定の制限部位でベクタ
ーに挿入し得るDNAのセグメントを意味する。DNAのセグ
メントは目的のポリペプチドをコードし、そしてカセッ
トおよび制限部位は、転写および翻訳のための適切な読
みとり枠(reading frame)でのカセットの挿入を確実に
するように設計される。"Cassette" refers to a segment of DNA that can be inserted into a vector at a particular restriction site. The segment of DNA encodes the polypeptide of interest, and the cassette and restriction sites are designed to ensure insertion of the cassette in the appropriate reading frame for transcription and translation.

【０１６７】「異種」DNAは、細胞内または細胞の染色
体部位に天然には位置しないDNAを意味する。好ましく
は、異種DNAは細胞にとって外来の遺伝子を包含する。“Heterologous” DNA refers to DNA that is not naturally located within a cell or at a chromosomal site in a cell. Preferably, the heterologous DNA includes a gene foreign to the cell.

【０１６８】細胞は外因性または異種DNAによりこのよ
うなDNAが細胞内に導入されるとき、「トランスフェク
ト」される。トランスフェクトされたDNAが表現型の変
化をもたらすとき、細胞は外因性または異種DNAにより
「トランスフォーム」される。好ましくはトランスフォ
ームDNAは染色体DNAに組み込まれて(共有結合で結合さ
れて)細胞のゲノムを構成するべきである。A cell is "transfected" when such DNA has been introduced into the cell by exogenous or heterologous DNA. A cell is "transformed" by exogenous or heterologous DNA when the transfected DNA effects a phenotypic change. Preferably, the transforming DNA should be integrated (covalently linked) into the chromosomal DNA to make up the genome of the cell.

【０１６９】「クローン」は単一の細胞または有糸***
による共通の祖先に由来する細胞の集団である。A "clone" is a population of cells derived from a single cell or a common mitotic ancestor.

【０１７０】「核酸分子」は一本鎖型または二本鎖ヘリ
ックスにおけるリン酸エステル重合形態のリボヌクレオ
シド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチ
ジン;「RNA分子」)またはデオキシリボヌクレオシド(デ
オキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミ
ジン、またはデオキシシチジン; 「DNA分子」)を意味す
る。二本鎖のDNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAヘリッ
クスが可能である。核酸分子という用語（詳細にはDNA
またはRNA分子）は、分子の１次および２次構造のみを
意味し、そしていずれの特定の３次または４次形態に限
定しない。それゆえ、この用語はとりわけ直鎖または環
状のDNA分子(例えば、制限フラグメント)、プラスミ
ド、および染色体に見出される二本鎖DNAを包含する。
特定の二本鎖DNA分子の構造について記載する場合、配
列は本明細書中で、DNAの非転写ストランド(すなわちmR
NAに相同な配列を有するストランド)に沿って5'から3'
の方向の配列のみを示す通常の慣例にしたがって記載さ
れ得る。「組換えDNA分子」は分子生物学的操作を経たD
NA分子である。A "nucleic acid molecule" is a ribonucleoside (adenosine, guanosine, uridine, or cytidine; a phosphate molecule) in a single-stranded or double-stranded helix; an "RNA molecule" or a deoxyribonucleoside (deoxyadenosine, deoxyguanosine). , Deoxythymidine, or deoxycytidine; "DNA molecule"). Double-stranded DNA-DNA, DNA-RNA, and RNA-RNA helices are possible. The term nucleic acid molecule (specifically DNA
Or RNA molecule) means only the primary and secondary structure of the molecule and is not limited to any particular tertiary or quaternary form. Thus, the term includes double-stranded DNA found, inter alia, in linear or circular DNA molecules (eg, restriction fragments), plasmids, and chromosomes.
When describing the structure of a particular double-stranded DNA molecule, the sequence is referred to herein as the non-transcribed strand of DNA (i.e., mR
5 'to 3' along the strand having a sequence homologous to NA)
Can be described according to the usual practice of showing only the arrangement in the direction of "Recombinant DNA molecule" is D after molecular biological manipulation
NA molecule.

【０１７１】核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA
のような他の核酸分子と、核酸分子の一本鎖形態が他の
核酸分子と適切な温度および溶液イオン強度の条件下で
アニールし得るときに「ハイブリダイズし得る」(Sambr
ookら、(1989)上記を参照のこと)。温度およびイオン強
度の条件はハイブリダイゼーションの「厳密性(stringe
ncy)」を決定する。相同な核酸のための予備スクリーニ
ングには、低い厳密性のハイブリダイゼーション条件
（55℃のＴ_mに相当）が使用され得る(例えば、５×SS
C、0.1% SDS、0.25%ミルク、およびホルムアミドなし;
または30%ホルムアミド、５×SSC、0.5% SDS)。中程度
の厳密性のハイブリダイゼーション条件はより高いＴ_m
値に相当する(例えば、40%ホルムアミド、５×または６
×SSC)。高い厳密性のハイブリダイゼーション条件は、
最も高いＴ_m値に相当する(例えば、50%ホルムアミド、
５×または６×SSC)。ハイブリダイゼーションには相補
的な配列を含有する２種の核酸が必要であるが、ハイブ
リダイゼーションの厳密性に依存して塩基間のミスマッ
チが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切
な厳密性は、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、
当該分野に周知の程度で変化をする。２種のヌクレオチ
ド配列の類似性または相同性が大きければ大きいほど、
それらの配列を有する核酸のハイブリッド形成のための
Ｔ_m値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相
対的安定性(より高いＴ_mに相当する)は以下の順序で減
少する: RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100ヌクレ
オチドを超えるハイブリッド形成にはＴ_m算出のための
方程式が導かれている(Sambrookら、(1989)上記、9.50-
0.51を参照のこと)。より短い核酸、すなわちオリゴヌ
クレオチド、とのハイブリダイゼーションにはミスマッ
チの位置がより重要となり、そしてオリゴヌクレオチド
の長さはその特異性を決定する(Sambrookら、(1989)上
記、11.7-11.8を参照のこと)。好ましくは、ハイブリダ
イズし得る核酸の最小の長さは少なくとも約10ヌクレオ
チドである; より好ましくは、少なくとも約15ヌクレオ
チドである; 最も好ましくは、長さが少なくとも約20ヌ
クレオチドである。Nucleic acid molecules can be cDNA, genomic DNA, or RNA.
`` Can hybridize '' to other nucleic acid molecules such as when a single-stranded form of the nucleic acid molecule can anneal to the other nucleic acid molecule under conditions of appropriate temperature and solution ionic strength (Sambr
ook et al. (1989) see above). Temperature and ionic strength conditions are stringent for hybridization.
ncy) ”. Phase A preliminary screening for the nucleic acids, can be used (corresponding to the T _m of 55 ° C.) low stringency hybridization conditions (e.g., 5 × SS
C, 0.1% SDS, 0.25% milk, and no formamide;
Or 30% formamide, 5 × SSC, 0.5% SDS). Moderate stringency hybridization conditions are higher T _m
Value (e.g., 40% formamide, 5x or 6
× SSC). High stringency hybridization conditions
Corresponds to the highest _Tm value (e.g., 50% formamide,
5 × or 6 × SSC). Hybridization requires two nucleic acids containing complementary sequences, but mismatches between bases are possible depending on the stringency of the hybridization. The appropriate stringency for hybridizing nucleic acids depends on the length of the nucleic acids and the degree of complementarity,
It will vary to the extent known in the art. The greater the similarity or homology between the two nucleotide sequences, the greater the
The _Tm value for hybridization of nucleic acids having those sequences is increased. Nucleic acid hybridization relative stability (corresponding to higher T _m) decreases in the following order: RNA: RNA, DNA: RNA , DNA: DNA. For hybridizations greater than 100 nucleotides in length, equations for calculating the _Tm have been derived (Sambrook et al., (1989) supra, 9.50-
0.51). The location of mismatches becomes more important for hybridization with shorter nucleic acids, i.e., oligonucleotides, and the length of the oligonucleotide determines its specificity (see Sambrook et al., (1989) supra, 11.7-11.8. thing). Preferably, the minimum length of a hybridizable nucleic acid is at least about 10 nucleotides; more preferably, it is at least about 15 nucleotides; most preferably, the length is at least about 20 nucleotides.

【０１７２】「相同的組換え」はベクター中の外来DNA
の染色体内への挿入を意味する。好ましくは、ベクター
は特異的な染色体の部位を相同的組換えの標的とする。
特異的な相同的組換えのために、ベクターは染色体の配
列に相同な十分に長い領域を含むことで、相補的結合お
よびベクターの染色体への取り込みを実現させる。相同
性の領域がより長く、そして配列類似性の程度がより大
きいと、相同的組換えの効率が増加し得る。"Homologous recombination" refers to foreign DNA in a vector.
Into the chromosome. Preferably, the vector targets specific chromosomal sites for homologous recombination.
For specific homologous recombination, the vector contains a sufficiently long region homologous to the sequence of the chromosome to achieve complementary binding and integration of the vector into the chromosome. Longer regions of homology and greater degrees of sequence similarity can increase the efficiency of homologous recombination.

【０１７３】DNA「コード配列」は、適切な調節配列の
制御下に置かれたときにインビトロまたはインビボにお
いて細胞内でポリペプチドに転写および翻訳される二本
鎖のDNA配列である。コード配列の境界は5'(アミノ)末
端の開始コドンおよび3'(カルボキシル)末端の翻訳終止
コドンによって決定される。コード配列は原核生物の配
列、真核生物のmRNA由来のcDNA、真核(例えば、哺乳類)
DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列をも、包
含し得るがこれらに限定されない。コード配列が真核細
胞内での発現を意図される場合は、ポリアデニル化シグ
ナルおよび転写終結配列がコード配列の3'側に通常位置
される。[0173] A DNA "coding sequence" is a double-stranded DNA sequence that is transcribed and translated into a polypeptide in a cell, in vitro or in vivo, when placed under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '(amino) terminus and a translation stop codon at the 3' (carboxyl) terminus. Coding sequences can be prokaryotic, cDNA from eukaryotic mRNA, eukaryotic (e.g., mammals).
Genomic DNA sequences from DNA and synthetic DNA sequences can also be included, but are not limited to these. If the coding sequence is intended for expression in a eukaryotic cell, a polyadenylation signal and transcription termination sequence are usually located 3 'to the coding sequence.

【０１７４】OBコード配列およびフランキング配列の単
離 本発明により意図される核酸は、記載の通り、本明細書
の図１Ａ〜Ｄ(配列番号２)、図３(配列番号４)、図５
(配列番号５)、および図６(配列番号６)に示すようなペ
プチドの発現をコードする他の核酸まで及ぶ。したがっ
て、ob遺伝子に関連して特異的なDNAが単離および配列
決定される一方、いずれの動物細胞も潜在的に本発明の
ペプチドをコードする遺伝子の分子クローニングの核酸
供給源として利用し得る。DNAはクローン化DNA(例え
ば、「DNAライブラリー」)から、化学合成により、cDNA
クローニングにより、もしくは所望の細胞より精製した
ゲノムDNA、またはそのフラグメントのクローニングに
より得られ得る(例えば、Sambrookら、(1989)、上記; G
lover、(1985)、上記を参照のこと)。ゲノムDNA由来の
クローンは調節およびイントロンのDNA領域、さらにコ
ード領域を含有し得る; cDNA由来のクローンはイントロ
ンの配列を含有しない。供給源が何であれ、遺伝子は、
その遺伝子の増幅のために適切なベクターに分子的にク
ローン化される。Isolation of OB coding and flanking sequences The nucleic acids contemplated by the present invention are described herein with reference to FIGS. 1A-D (SEQ ID NO: 2), FIG. 3 (SEQ ID NO: 4), FIG.
(SEQ ID NO: 5), and other nucleic acids encoding expression of the peptide as shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 6). Thus, while the specific DNA associated with the ob gene is isolated and sequenced, any animal cell can potentially be used as a nucleic acid source for molecular cloning of the gene encoding the peptide of the invention. DNA is obtained from cloned DNA (e.g., a "DNA library") by chemical synthesis,
Can be obtained by cloning or by cloning genomic DNA purified from the desired cells, or a fragment thereof (see, for example, Sambrook et al., (1989), supra;
lover, (1985), see above). Clones from genomic DNA may contain regulatory and intronic DNA regions, as well as coding regions; clones from cDNAs do not contain intron sequences. Whatever the source, the gene
It is molecularly cloned into a suitable vector for amplification of the gene.

【０１７５】ゲノムDNA由来の遺伝子の分子クローニン
グでは、ゲノムDNAはcDNA配列から選択されたプライマ
ーを使用して増幅され得る。あるいは、DNAフラグメン
トが作成され、そのいくつかが所望の遺伝子をコードす
る。DNAは特異的な部位で種々の制限酵素を使用して切
断され得る。DNAをフラグメント化するためにDNアーゼ
をマンガン存在下で使用し得、またはDNAは、例えば超
音波処理によって物理的に剪断され得る。直鎖DNAフラ
グメントはサイズに従って標準的な技術により分離され
得るこのような標準的な技術として、アガロースならび
にポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびカラムクロ
マトグラフィーが挙げられるがそれらに限定されない。For molecular cloning of a gene derived from genomic DNA, genomic DNA can be amplified using primers selected from a cDNA sequence. Alternatively, DNA fragments are created, some of which encode the desired gene. DNA can be cut at various sites using various restriction enzymes. DNase can be used in the presence of manganese to fragment the DNA, or the DNA can be physically sheared, for example, by sonication. Linear DNA fragments can be separated by standard techniques according to size. Such standard techniques include, but are not limited to, agarose and polyacrylamide gel electrophoresis, and column chromatography.

【０１７６】いったんDNAフラグメントが作成される
と、所望のobまたはob様遺伝子を含有する特異的なDNA
フラグメントの同定は多くの方法によって達成され得
る。例えば、一定量のobまたはob様遺伝子の部分または
その特異的RNA、あるいはそのフラグメントを入手し得
て精製および標識し得る場合は、生じたDNAフラグメン
トは標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーション
によりスクリーニングされ得る(Bentonら、Science, 19
6:180 (1977); Grunsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 72:3961 (1975))。本発明は、このような核酸プロ
ーブを提供し、これは本明細書中で開示される特異的な
配列から容易に調製され得る。例えば、図１Ａ〜Ｅ(配
列番号１)または図２ＡおよびＢ(配列番号３)に記載さ
れる配列の少なくとも10、好ましくは15ヌクレオチドフ
ラグメントに相当するヌクレオチド配列を有するハイブ
リダイズし得るプローブがある。好ましくは、フラグメ
ントは本発明のモジュレーターペプチドに高度に特有で
あるように選択される。プローブに対して実質的に相同
であるDNAフラグメントがハイブリダイズする。上記の
ように、相同性の程度が大きければ大きいほど、より厳
密なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。１つ
の実施態様において、低い厳密性のハイブリダイゼーシ
ョン条件が相同性のモジュレーターペプチドを同定する
ために使用される。しかし、好ましい局面において、お
よび本明細書中で実験的に示されるように、本発明のモ
ジュレーターペプチドをコードする核酸は、図１Ａ〜Ｅ
(配列番号１)または図２ＡおよびＢ(配列番号３)に記載
されるようなヌクレオチド配列を有する核酸、または中
程度に厳密な条件でハイブリダイズし得るそのフラグメ
ントにハイブリダイズする; より好ましくは、核酸は高
い厳密性の条件でハイブリダイズする。Once the DNA fragment has been generated, a specific DNA containing the desired ob or ob-like gene
Identification of fragments can be accomplished by a number of methods. For example, if a certain amount of an ob or ob-like gene portion or its specific RNA, or a fragment thereof, is available and can be purified and labeled, the resulting DNA fragment can be screened by nucleic acid hybridization to a labeled probe ( Benton et al., Science, 19
6: 180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 72: 3961 (1975)). The present invention provides such nucleic acid probes, which can be readily prepared from the specific sequences disclosed herein. For example, there are hybridizable probes having nucleotide sequences corresponding to at least 10, preferably 15 nucleotide fragments of the sequences set forth in FIGS. 1A-E (SEQ ID NO: 1) or FIGS. 2A and B (SEQ ID NO: 3). Preferably, the fragments are selected to be highly unique to a modulator peptide of the present invention. DNA fragments that are substantially homologous to the probe will hybridize. As noted above, the greater the degree of homology, the more stringent hybridization conditions can be used. In one embodiment, low stringency hybridization conditions are used to identify homologous modulator peptides. However, in a preferred aspect, and as shown experimentally herein, the nucleic acids encoding the modulator peptides of the invention are shown in FIGS.
(SEQ ID NO: 1) or a nucleic acid having a nucleotide sequence as set forth in FIGS. 2A and B (SEQ ID NO: 3), or a fragment thereof capable of hybridizing under moderately stringent conditions; more preferably, Nucleic acids hybridize under conditions of high stringency.

【０１７７】あるいは、遺伝子の存在は、それが発現さ
れる生産物の物理的、化学的、または免疫学的特性に基
づいたアッセイにより検出され得る。例えば、cDNAクロ
ーン、または適切なmRNAをハイブリッドで選択する（hy
brid-select）DNAクローンが選択され得、本発明のモジ
ュレーターペプチドについて既知の特性と類似または同
一の、電気泳動の移動度、等電点電気泳動上の挙動、プ
ロテアーゼ切断マップ、チロシンホスファターゼ活性、
または抗原特性を有するタンパク質を生産する。例え
ば、本発明の抗体は他の供給源に由来するモジュレータ
ーペプチドのホモログのスクリーニングに容易に利用さ
れ得る。Alternatively, the presence of a gene can be detected by assays based on the physical, chemical, or immunological properties of the product in which it is expressed. For example, a cDNA clone or an appropriate mRNA is selected by a hybrid (hy
brid-select) DNA clones can be selected and have electrophoretic mobilities, isoelectric focusing behavior, protease cleavage maps, tyrosine phosphatase activity, similar or identical to known properties for modulator peptides of the invention.
Alternatively, it produces a protein having antigenic properties. For example, the antibodies of the present invention can be readily utilized in screening for modulator peptide homologs from other sources.

【０１７８】本発明のモジュレーターペプチドをコード
する遺伝子はまた、mRNA選択、すなわち核酸ハイブリダ
イゼーションおよびそれに続くインビトロトランスレー
ション、により同定され得る。この手順において、フラ
グメントは、相補的mRNAをハイブリダイゼーションによ
って単離するために使用される。そのようなDNAフラグ
メントは入手可能な精製されたモジュレーターのDNAを
示し得る。単離されたmRNAの生産物のインビトロトラン
スレーション生産物の、免疫沈降分析または機能的アッ
セイ(例えば、チロシンホスファターゼ活性)によりmRNA
が同定され、それゆえ所望の配列を含有する相補的DNA
フラグメントが、同定される。さらに、特異的なmRNA
は、細胞から単離されたポリソームの、モジュレーター
ペプチドに対して特異的な固定化抗体への吸着により選
択され得る。The gene encoding the modulator peptide of the present invention can also be identified by mRNA selection, ie, nucleic acid hybridization followed by in vitro translation. In this procedure, the fragments are used to isolate complementary mRNA by hybridization. Such a DNA fragment may represent available purified modulator DNA. In vitro translation of the isolated mRNA product, immunoprecipitation analysis or functional assay (e.g., tyrosine phosphatase activity) of the mRNA
Complementary DNA containing the desired sequence
Fragments are identified. Furthermore, specific mRNA
Can be selected by adsorption of polysomes isolated from cells to immobilized antibodies specific for modulator peptides.

【０１７９】放射性標識されたモジュレーターペプチド
cDNAは、(吸着されたポリソームから)選択されたmRNAを
鋳型として使用して合成され得る。次に放射性標識され
たmRNAまたはcDNAは他のゲノムDNAフラグメントの中か
ら相同なモジュレーターペプチドDNAフラグメントを同
定するためのプローブとして使用され得る。Radiolabeled Modulator Peptides
cDNA can be synthesized using the selected mRNA (from the adsorbed polysomes) as a template. The radiolabeled mRNA or cDNA can then be used as a probe to identify homologous modulator peptide DNA fragments among other genomic DNA fragments.

【０１８０】上記のように、本明細書中で開示される体
重モジュレーターペプチドをコードするDNA配列は、ク
ローン化によらず合成で調製され得る。DNA配列は、体
重モジュレーターペプチドのアミノ酸配列に適切なコド
ンをもって設計され得る。一般に配列を発現に使用する
場合は、意図する宿主にとって好ましいコドンを選択す
る。標準的な方法で調製し、そして完全なコード配列に
組み合わせた重複するオリゴヌクレオチドから、完全な
配列を組み立てる。例えば、Edge, Nature, 292:756 (1
981); Nambairら、Science, 223:1299 (1984); Jayら、
J. Biol. Chem.,259:6311 (1984)を参照のこと。As noted above, the DNA sequences encoding the weight modulator peptides disclosed herein can be prepared synthetically rather than by cloning. The DNA sequence can be designed with the appropriate codons for the amino acid sequence of the weight modulator peptide. Generally, where the sequence is used for expression, one will select preferred codons for the intended host. The complete sequence is assembled from overlapping oligonucleotides prepared in a standard manner and combined with the complete coding sequence. For example, Edge, Nature, 292: 756 (1
981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al.,
See J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).

【０１８１】上記のように、合成DNA配列は体重モジュ
レーターのアナログを発現する遺伝子の簡便な構築を可
能にする。あるいは、アナログをコードするDNAは天然
のOB遺伝子またはcDNAの部位特異的突然変異によって作
製され得、そしてアナログは従来のポリペプチド合成を
使用して直接作製され得る。As noted above, synthetic DNA sequences allow for the convenient construction of genes that express analogs of weight modulators. Alternatively, the DNA encoding the analog can be made by site-directed mutagenesis of the native OB gene or cDNA, and the analog can be made directly using conventional polypeptide synthesis.

【０１８２】非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異
的組み込みのための一般的な方法はNorenら、Science,
244:182-188 (1989)に記載されている。本方法は非天然
アミノ酸をもつobポリペプチドのアナログの作製に使用
され得る。General methods for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins are described in Noren et al., Science,
244: 182-188 (1989). The method can be used to generate analogs of the ob polypeptide with unnatural amino acids.

【０１８３】非コード核酸 本発明は、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイム
の調製にまで及び、本発明を用いて体重モジュレーター
タンパク質の発現を翻訳レベルで妨げ得る。本アプロー
チでは、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用して
、特異的なmRNAの翻訳をブロックするが、これは、 mR
NAをアンチセンス核酸でマスクするかあるいはリボザイ
ムで切断することによる。Non-coding nucleic acids The present invention extends to the preparation of antisense nucleotides and ribozymes and can be used to prevent expression of a weight modulator protein at the translational level. This approach utilizes antisense nucleic acids and ribozymes to block the translation of specific mRNAs,
By masking NA with antisense nucleic acids or cutting with ribozymes.

【０１８４】アンチセンス核酸は、特異的なmRNA分子の
少なくとも一部に相補的なDNAまたはRNA分子である(Wei
ntraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura,
Anal. Biochem., 172:289-295 (1988)を参照のこと)。
細胞内においてアンチセンス核酸はmRNAにハイブリダイ
ズして二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖の形態
に複合体化されたmRNAを翻訳しない。それゆえ、アンチ
センス核酸はmRNAのタンパク質への発現を妨げる。約15
ヌクレオチドのオリゴマーおよびAUG開始コドンにハイ
ブリダイズする分子は特に効率的である。なぜならそれ
らは合成が容易であり、そして体重モジュレーターペプ
チド産生細胞に導入する際に生じる問題が、より大きな
分子の場合よりも少ないと思われるからである。アンチ
センス法は多くの遺伝子のインビトロにおける発現を阻
害するために使用されている(Marcus-Sekura、(1988)、
上記; Hamborら、J. Exp. Med., 168:1237-1245 (198
8))。Antisense nucleic acids are DNA or RNA molecules that are complementary to at least a portion of a specific mRNA molecule (Wei
ntraub, Sci. Am., 262: 40-46 (1990); Marcus-Sekura,
Anal. Biochem., 172: 289-295 (1988)).
In the cell, the antisense nucleic acid hybridizes to the mRNA to form a double-stranded molecule. Cells do not translate mRNA complexed in this double-stranded form. Therefore, antisense nucleic acids prevent expression of mRNA into protein. About 15
Oligonucleotides of nucleotides and molecules that hybridize to the AUG start codon are particularly efficient. Because they are easy to synthesize, and the problems that arise when introducing them into weight modulator peptide producing cells are likely to be less than with larger molecules. Antisense methods have been used to inhibit the expression of many genes in vitro (Marcus-Sekura, (1988),
Hambor et al., J. Exp.Med., 168: 1237-1245 (198
8)).

【０１８５】リボザイムは、他の一本鎖RNA分子をDNA制
限エンドヌクレアーゼにいくぶん類似する様式で特異的
に切断する能力を有するRNA分子である。リボザイム
は、ある種のmRNAがそれ自身のイントロンを削除する能
力を有するという観察から発見された。これらのRNAの
ヌクレオチド配列を改変することにより、研究者らはRN
A分子における特異的なヌクレオチド配列を認識し、そ
して切断する分子を設計し得る(Cech, J. Am. Med. Ass
oc., 260:3030-3034 (1988))。これらのリボザイムは配
列特異的であるので、特定の配列を有するmRNAのみが不
活化される。A ribozyme is an RNA molecule that has the ability to specifically cleave other single-stranded RNA molecules in a manner somewhat similar to DNA restriction endonucleases. Ribozymes were discovered from the observation that certain mRNAs have the ability to delete their own introns. By modifying the nucleotide sequences of these RNAs, researchers
A molecule can be designed that recognizes and cleaves specific nucleotide sequences in the A molecule (Cech, J. Am. Med. Ass.
oc., 260: 3030-3034 (1988)). Since these ribozymes are sequence-specific, only mRNAs having a particular sequence are inactivated.

【０１８６】研究者らは２タイプのリボザイム、Tetrah
ymenaタイプおよび「ハンマーヘッド」タイプ、を同定
した。Tetrahymenaタイプリボザイムは４塩基配列を認
識し、「ハンマーヘッド」タイプは11〜18塩基配列を認
識する。認識配列が長ければ長いほど、標的mRNA種によ
り限定されて起こり得る。それゆえ、ハンマーヘッドタ
イプリボザイムはTetrahymenaタイプリボザイムよりも
特異的なRNA種の不活化において好ましく、そして18塩
基認識配列はより短い認識配列よりも好ましい。Researchers have identified two types of ribozymes, Tetrah
The ymena type and the "hammerhead" type were identified. The Tetrahymena type ribozyme recognizes a 4-base sequence and the "hammerhead" type recognizes an 11-18 base sequence. The longer the recognition sequence, the more likely it will be, depending on the target mRNA species. Therefore, hammerhead type ribozymes are preferred in inactivating specific RNA species over Tetrahymena type ribozymes, and an 18 base recognition sequence is preferred over a shorter recognition sequence.

【０１８７】それゆえ、本明細書中に記載のDNA配列
は、体重モジュレータータンパク質およびそのリガンド
のmRNAに対するアンチセンス分子およびmRNAを切断する
リボザイムの調製に使用され得、それゆえob遺伝子の発
現を阻害し、そして体重増加および肥満に導く。Thus, the DNA sequences described herein can be used in the preparation of antisense molecules to the mRNA of the weight modulator protein and its ligand and ribozymes that cleave the mRNA, thus inhibiting the expression of the ob gene. And leads to weight gain and obesity.

【０１８８】他の実施態様において、OB核酸のコード鎖
および相補鎖、またはOB遺伝子の5'、3'、あるいはコー
ド領域の内部の(イントロンの) 非コード領域に相補的
な短いオリゴヌクレオチドが本発明により提供される。
そのような核酸は直接標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応のプライマーのい
ずれかとしてプローブに有用であり、ob遺伝子内の突然
変異の存在、またはOBmRNAの発現レベルの評価を目的と
する。好ましくは、本発明の非コード核酸はヒトOB遺伝
子由来である。In another embodiment, a short oligonucleotide complementary to the coding and complementary strands of the OB nucleic acid, or to the 5 ', 3' or non-coding (intronic) regions of the OB gene, is present. Provided by the invention.
Such nucleic acids are useful as probes, either as directly labeled oligonucleotide probes, or as primers in the polymerase chain reaction, for the purpose of assessing the presence of mutations in the ob gene, or OB mRNA expression levels. Preferably, the non-coding nucleic acids of the invention are from the human OB gene.

【０１８９】特定の実施態様において、非コード核酸
は、増幅し得る遺伝子および/または他の調節配列をOB
遺伝子の付近に組み込ませるための相同的組換えを目的
とし、例えばOBポリペプチドの高レベルの発現、または
OBポリペプチドの適切な発現レベルを妨げるob遺伝子調
節配列における変異の克服を目的とする(国際特許公報
第WO 91/06666号、1991年５月16日Skoultchiにより公
開、; 国際特許公報第WO 91/09955号、1991年７月11日C
happelにより公開、; また国際特許公報第WO 90/14092
号、1990年11月29日KucherlapatiおよびCampbellにより
公開、を参照のこと)。[0189] In certain embodiments, the non-coding nucleic acid comprises an amplifiable gene and / or other regulatory sequence.
For the purpose of homologous recombination for integration near the gene, e.g., high level expression of an OB polypeptide, or
Aiming at overcoming mutations in the ob gene regulatory sequences that prevent proper expression levels of the OB polypeptide (International Patent Publication No. WO 91/06666, published by Skoultchi on May 16, 1991; International Patent Publication WO 91 / 09955, July 11, 1991 C
published by happel; and International Patent Publication No.WO 90/14092
No., published by Kucherlapati and Campbell on November 29, 1990).

【０１９０】OBポリペプチドの生産: 発現および合成 転写および翻訳制御配列はプロモーター、エンハンサ
ー、ターミネーターなどのようなDNA調節配列であり、
宿主細胞におけるコード配列の発現を目的とする。真核
細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列で
ある。 Production of OB polypeptide: Expression and synthetic transcription and translation control sequences are DNA regulatory sequences such as promoters, enhancers, terminators, and the like.
For expression of the coding sequence in a host cell. In eukaryotic cells, polyadenylation signals are regulatory sequences.

【０１９１】RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転
写し、次いでこのmRNAがトランスRNAスプライシングを
受け、そしてコード配列によってコードされるタンパク
質に翻訳されるとき、コード配列は細胞内において転写
および翻訳制御配列の「制御下」にある。When RNA polymerase transcribes a coding sequence into mRNA, which is then subjected to transRNA splicing and translated into the protein encoded by the coding sequence, the coding sequence is transformed into transcription and translation control sequences in the cell. "Under control".

【０１９２】「シグナル配列」は細胞の表面に発現され
るタンパク質のコード配列の始めに含まれる。この配列
は成熟ポリペプチドのN-末端側にあるシグナルペプチド
をコードし、ポリペプチドの輸送を宿主細胞に指示す
る。用語「輸送シグナル配列」もまた本明細書中に用い
られ、この種類のシグナル配列を意味する。輸送シグナ
ル配列は各種の真核生物および原核生物由来のタンパク
質に関して見出され得、しばしば両方のタイプの生物に
おいて機能的である。A "signal sequence" is included at the beginning of the coding sequence for a protein expressed on the surface of a cell. This sequence encodes a signal peptide N-terminal to the mature polypeptide and directs host cell transport of the polypeptide. The term "transport signal sequence" is also used herein to refer to this type of signal sequence. Transport signal sequences can be found for various eukaryotic and prokaryotic proteins, and are often functional in both types of organisms.

【０１９３】DNA配列は発現制御配列に、発現制御配列
がDNA配列の転写および翻訳を制御および調節すると
き、「作動可能に連結される」。用語「作動可能に連結
される」とは、発現されるDNA配列の前に適切な開始シ
グナル(例えば、ATG)を有すること、および発現制御配
列の制御下でのDNA配列の発現およびDNA配列にコードさ
れる所望の生産物の生産をもたらすために正しい読みと
り枠を維持することを包含する。組換えDNA分子に挿入
しようとする遺伝子が適切な開始シグナルを含有しない
場合は、このような開始シグナルがその遺伝子の上流
(5')およびその遺伝子を有する読みとり枠内に挿入され
得る。A DNA sequence is "operably linked" to an expression control sequence when the expression control sequence controls and regulates the transcription and translation of the DNA sequence. The term `` operably linked '' refers to having the appropriate initiation signal (e.g., ATG) before the DNA sequence to be expressed, and expressing the DNA sequence under the control of expression control sequences and to the DNA sequence. This involves maintaining the correct reading frame to effectuate the production of the desired product to be encoded. If the gene to be inserted into the recombinant DNA molecule does not contain a suitable start signal, such a start signal will
(5 ') and its gene can be inserted in the reading frame.

【０１９４】「プロモーター配列」は細胞内でRNAポリ
メラーゼと結合して下流(3'方向)のコード配列の転写を
開始させ得るDNA調節領域である。本発明を明確にする
目的のためには、プロモーター配列はその3'末端で転写
開始部位により境界付けられ、そしてバックグラウンド
以上の検出し得るレベルの転写を開始するために必要な
最小数の塩基または要素を含有するように上流(5'方向)
に延長する。プロモーター配列の内部には、転写開始部
位(例えばS1ヌクレアーゼによるマッピングにより容易
に定義される)、およびRNAポリメラーゼの結合するタン
パク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見られる。A “promoter sequence” is a DNA regulatory region capable of binding RNA polymerase in a cell and initiating transcription of a downstream (3 ′ direction) coding sequence. For purposes of clarifying the invention, the promoter sequence is bounded at its 3 'end by a transcription initiation site, and the minimum number of bases required to initiate a detectable level of transcription above background. Or upstream to contain the element (5 'direction)
To be extended. Within the promoter sequence are found a transcription start site (e.g., easily defined by mapping with S1 nuclease), and a protein binding domain (consensus sequence) to which RNA polymerase binds.

【０１９５】本発明の別の特徴は、本明細書中で開示さ
れるDNA配列の発現である。当該分野において公知なよ
うに、DNA配列はそれを適切な発現ベクター内の発現制
御配列に作動可能に連結し、そして発現ベクターを適切
な単細胞宿主にトランスフォームするために使用するこ
とによって発現し得る。Another feature of the present invention is the expression of the DNA sequences disclosed herein. As is known in the art, a DNA sequence can be expressed by operably linking it to an expression control sequence in a suitable expression vector and using the expression vector to transform it into a suitable single-cell host. .

【０１９６】そのような発現制御配列への本発明のDNA
配列の作動可能な連結は、当然、必ずしもDNA配列の一
部でない場合でも、開始コドンであるATGの、 DNA配列
上流の正しい読みとり枠への提供を包含する。The DNA of the present invention for such an expression control sequence
Operable linking of the sequences will, of course, include providing the initiation codon, ATG, to the correct reading frame upstream of the DNA sequence, even if it is not necessarily part of the DNA sequence.

【０１９７】多種多様な宿主/発現ベクターの組み合わ
せが、本発明のDNA配列の発現に使用され得る。有用な
発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合
成DNA配列のセグメントからなり得る。適切なベクター
は、SV40の誘導体および公知の細菌プラスミド、例え
ば、大腸菌プラスミドcolE1、pCR1、pBR322、pMB9、pU
C、またはpUCプラスミド誘導体、例えば、pGEXベクタ
ー、pETベクター、pmal-c、pFLAGなど、およびそれらの
誘導体、RP4のようなプラスミド; ファージDNA、例え
ば、多数のλファージの誘導体、例えば、NM989、およ
び他のファージDNA、例えば、M13および線状一本鎖ファ
ージDNA; ２μプラスミドまたはその誘導体のような酵
母プラスミド; 昆虫または哺乳類細胞において有用なベ
クターのような真核細胞において有用なベクター; ファ
ージDNAまたは他の発現制御配列を使用するように改変
したプラスミドのような、プラスミドおよびファージDN
Aの組み合わせから誘導されるベクターなどを含有す
る。好ましい実施態様において、obの発現はメチロトロ
フ酵母、例えば、Pichia pastoris酵母において達成さ
れる(例えば、国際特許公報第WO 90/03431号、1990年４
月５日Brierleyらにより公開; 国際特許公報第WO 90/10
697号、1990年９月20日Siegelらにより公開、を参照の
こと)。下記の特定の実施態様において、発現ベクター
がα接合因子シグナル配列の制御下でのobの発現のため
に設計される。任意の多種多様な発現制御配列、作動可
能に連結されたDNA配列の発現を制御する配列、がこれ
らのベクターにおいて本発明のDNA配列を発現させるた
めに使用され得る。そのような有用な発現制御配列は、
例えばSV40の初期または後期プロモーター、CMV、ワク
シニア、ポリオーマまたはアデノウィルス、lacシステ
ム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、LTRシス
テム、λファージのメジャーオペレーターおよびプロモ
ーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホ
グリセリン酸キナーゼまたはその他の解糖系酵素のプロ
モーター、酸性ホスファターゼ(例えば、Pho5)のプロモ
ーター、メチロトロフ酵母のAOX1プロモーター、酵母α
-接合因子のプロモーター、および原核細胞または真核
細胞、あるいはそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御
することが公知である他の配列、およびそれらの種々の
組み合わせを包含する。A wide variety of host / expression vector combinations can be used for expressing the DNA sequences of the present invention. Useful expression vectors can consist of segments of, for example, chromosomes, non-chromosomes, and synthetic DNA sequences. Suitable vectors include derivatives of SV40 and known bacterial plasmids such as E. coli plasmids colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pU
C, or pUC plasmid derivatives, e.g., pGEX vector, pET vector, pmal-c, pFLAG, etc., and derivatives thereof, plasmids such as RP4; phage DNA, e.g., multiple λ phage derivatives, e.g., NM989, and Other phage DNA, for example, M13 and linear single-stranded phage DNA; yeast plasmids such as 2μ plasmid or derivative thereof; vectors useful in eukaryotic cells such as vectors useful in insect or mammalian cells; phage DNA or Plasmids and phage DNs, such as plasmids modified to use other expression control sequences
It contains a vector derived from the combination of A and the like. In a preferred embodiment, the expression of ob is achieved in a methylotrophic yeast, for example, a Pichia pastoris yeast (see, for example, International Patent Publication No. WO 90/03431, April 1990).
Published by Brierley et al .; International Patent Publication No. WO 90/10
No. 697, published September 20, 1990 by Siegel et al.). In certain embodiments described below, an expression vector is designed for expression of ob under the control of the alpha mating factor signal sequence. Any of a wide variety of expression control sequences, sequences that control the expression of operably linked DNA sequences, can be used to express the DNA sequences of the present invention in these vectors. Such useful expression control sequences include
For example, SV40 early or late promoter, CMV, vaccinia, polyoma or adenovirus, lac system, trp system, TAC system, TRC system, LTR system, major operator and promoter region of phage λ, control region of fd coat protein, 3-phospho Glycerate kinase or other glycolytic enzyme promoter, acid phosphatase (e.g., Pho5) promoter, methylotrophic yeast AOX1 promoter, yeast α
-Includes promoters of mating factors and other sequences known to control the expression of prokaryotic or eukaryotic cells or their viral genes, and various combinations thereof.

【０１９８】多種多様の単細胞宿主細胞もまた、本発明
のDNA配列の発現において有用である。これらの宿主
は、E. coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyce
s、; 酵母などの菌類(Saccharomyces、およびPichia、C
andida、Hansenula、およびTorulopsisのようなメチロ
トロフ酵母); および、CHO、R1.1、B-W、およびLM細
胞、アフリカミドリザル肝臓細胞(例えば、COS1、COS
7、BSC1、BSC40、およびBMT10)、昆虫細胞(例えば、Sf
9)、およびヒト細胞のような動物細胞、ならびに組織培
養の植物細胞のような周知の真核性および原核性宿主を
包含し得る。A wide variety of unicellular host cells are also useful in expressing the DNA sequences of the present invention. These hosts are E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyce
s ,; fungi such as yeast (Saccharomyces, and Pichia, C
and methylotrophic yeasts such as andida, Hansenula, and Torulopsis); and CHO, R1.1, BW, and LM cells, African green monkey liver cells (e.g., COS1, COS
7, BSC1, BSC40, and BMT10), insect cells (e.g., Sf
9), and well-known eukaryotic and prokaryotic hosts, such as animal cells, such as human cells, and plant cells in tissue culture.

【０１９９】すべてのベクター、発現制御配列、および
宿主が、本発明のDNA配列を発現するために同等に良好
に機能するわけではないと理解される。いずれの宿主も
同一の発現系に同等に良好に機能するわけではない。し
かし、当業者は適切なベクター、発現制御配列、および
宿主を、所望の発現を達成するために必要以上に実験を
したり、本発明の範囲を逸脱することなく選択し得る。
例えば、ベクターの選択において、宿主を考慮する必要
がある、なぜならベクターはその中で機能するはずであ
るからである。ベクターのコピー数、コピー数の制御
能、および抗生物質マーカーのようなベクターにコード
される他のいずれのタンパク質の発現も考慮され得る。It will be appreciated that not all vectors, expression control sequences, and hosts will function equally well to express the DNA sequences of the present invention. Not all hosts function equally well with the same expression system. However, one of skill in the art can select appropriate vectors, expression control sequences, and hosts without undue experimentation or achieving the desired expression without departing from the scope of the invention.
For example, in selecting a vector, the host must be considered because the vector should function therein. The copy number of the vector, the ability to control copy number, and the expression of any other protein encoded by the vector, such as an antibiotic marker, can also be considered.

【０２００】発現制御配列の選択において、種々の因子
が通常考慮される。これらは例えば、系の相対的な強
度、その制御能、および、特に取り得る２次構造に関し
て、その発現される特定のDNA配列または遺伝子との適
合性を包含する。適切な単細胞宿主は、例えば選択され
たベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正確に
フォールディングする能力、および発酵要求性、ならび
に発現されるDNA配列にコードされる生産物の宿主に対
する毒性、および発現生産物の精製の容易さを考慮する
ことによって選択される。In selecting an expression control sequence, various factors are usually considered. These include, for example, the compatibility of the system with the particular DNA sequence or gene being expressed, with respect to the relative strength of the system, its ability to control, and particularly its possible secondary structure. Suitable unicellular hosts include, for example, compatibility with the selected vector, secretory properties, ability to correctly fold the protein, and fermentation requirements, and toxicity of the product encoded by the expressed DNA sequence to the host, and The choice is made by considering the ease of purification of the expression product.

【０２０１】これらおよびその他の因子を考慮して当業
者は、本発明のDNA配列を発酵または大規模動物細胞培
養において発現する種々のベクター/発現制御配列/宿主
の組み合わせを構築し得る。In view of these and other factors, one of skill in the art can construct various vector / expression control sequence / host combinations that express the DNA sequences of the present invention in fermentation or large-scale animal cell culture.

【０２０２】特定の実施態様において、OB融合タンパク
質が発現され得る。OB融合タンパク質は、少なくとも機
能的に活性なOBポリペプチドの部分にペプチド結合によ
って結合された少なくとも機能的に活性な非OBタンパク
質の部分を包含する。非ob配列はOB配列のアミノまたは
カルボキシ末端であり得る。より好ましくは、タンパク
質分解的に不活性なOB融合タンパク質の安定な発現のた
めには、非OB融合タンパク質の部分はOBタンパク質のア
ミノ末端にペプチド結合によって結合される。このよう
な融合タンパク質をコードする組換えDNA分子は、OBコ
ード配列に読み取り枠内で結合された少なくとも機能的
に活性な非OBタンパク質の部分をコードする配列を含
み、好ましくは、特異的なプロテアーゼ例えば、トロン
ビンまたは第Xa因子に対する切断部位を、好ましくはOB
-非OB連結部でコードする。特定の実施態様において、
融合タンパク質はEscherichia coliまたはP. pastoris
において発現される。[0202] In certain embodiments, an OB fusion protein may be expressed. An OB fusion protein includes at least a functionally active non-OB protein portion linked by a peptide bond to at least a functionally active OB polypeptide portion. The non-ob sequence can be at the amino or carboxy terminus of the OB sequence. More preferably, for stable expression of a proteolytically inactive OB fusion protein, the portion of the non-OB fusion protein is attached to the amino terminus of the OB protein by a peptide bond. A recombinant DNA molecule encoding such a fusion protein comprises a sequence encoding at least a portion of a non-OB protein that is at least functionally active in reading frame with the OB coding sequence, and preferably comprises a specific protease. For example, a cleavage site for thrombin or factor Xa, preferably OB
-Code at non-OB connection. In certain embodiments,
The fusion protein is Escherichia coli or P. pastoris
Is expressed in

【０２０３】下記の特定の実施態様において、ベクター
はマウスおよびヒトob遺伝子を、gln-49のコドンを有し
ておよび有さないで、細菌発現系および酵母(Pichia)発
現系において融合タンパク質として発現するために調製
した。ob遺伝子は例えばPCRおよび新規なプライマーを
使用して、エンドヌクレアーゼ切断部位を有して調製さ
れる。PCRによって生じた配列を確認するのが望まし
い、なぜなら本技術に関しては点突然変異を含有する可
能性がより高いからである。ヒスチジンtag(His-Tag)お
よびプロテアーゼ切断部位を含有するプラスミドが使用
される。ヒスチジンの存在により組換えタンパク質のNi
-キレートカラムまたはアフィニティー精製により選択
的単離が可能になる。プロテアーゼ切断部位（下記の特
定の実施態様ではトロンビン切断部位）が設計されプロ
テアーゼ（例えばトロンビン）による処理で完全長の成
熟（すなわちシグナル配列を欠く）OBポリペプチドを放
出する。In a specific embodiment described below, the vector expresses the mouse and human ob genes as fusion proteins in bacterial and yeast (Pichia) expression systems, with and without the codon gln-49. Prepared for The ob gene is prepared having an endonuclease cleavage site using, for example, PCR and novel primers. It is desirable to confirm the sequence generated by PCR because it is more likely to contain point mutations for this technique. A plasmid containing a histidine tag (His-Tag) and a protease cleavage site is used. Recombinant protein Ni due to the presence of histidine
-Chelate columns or affinity purification allow for selective isolation. A protease cleavage site (thrombin cleavage site in certain embodiments described below) is designed to release a full-length mature (ie, lacking a signal sequence) OB polypeptide upon treatment with a protease (eg, thrombin).

【０２０４】他の局面において、pGEXベクター(Smith
ら、Gene 67:31-40 (1988))が使用され得る。本ベクタ
ーは住血吸虫(schistosoma japonicum)グルタチオンS-
トランスフェラーゼcDNAを目的の配列に融合する。細菌
のタンパク質を回収し、組換えタンパク質を還元型グル
タチオンアフィニティーカラムで迅速に精製し得る。GS
Tキャリアーは後に部位特異的プロテアーゼを用いた切
断によって融合タンパク質から切断され得る。切断の
後、キャリアーおよび切断されなかった融合タンパク質
はグルタチオンアガロースへの吸着によって除去され得
る。この系は、コードされるタンパク質が水溶液に不溶
性である場合、時おり問題が生じる。[0204] In another aspect, the pGEX vector (Smith
Gene 67: 31-40 (1988)). This vector is schistosome (schistosoma japonicum) glutathione S-
The transferase cDNA is fused to the sequence of interest. The bacterial protein can be recovered and the recombinant protein can be rapidly purified on a reduced glutathione affinity column. GS
The T carrier can later be cleaved from the fusion protein by cleavage with a site-specific protease. After cleavage, the carrier and uncleaved fusion protein can be removed by adsorption to glutathione agarose. This system sometimes poses a problem when the encoded protein is insoluble in aqueous solutions.

【０２０５】細菌系における組換えタンパク質の発現
は、発現タンパク質の不正確なフォールディングを生じ
得、再フォールディングが必要である。組換えタンパク
質を切断の前または後に再フォールディングし、機能的
に活性なOBポリペプチドを形成し得る。OBポリペプチ
ド、は以下の工程により再フォールディングされる：
(i)タンパク質の還元剤を含有する変成バッファー中で
インキュベートする工程、(ii)タンパク質を酸化剤、好
ましくはタンパク質安定化剤またはカオトロピック剤の
一方または両方もまた含有する緩衝液中でインキュベー
トする工程。適切な酸化還元（還元/酸化剤）の対は以
下を包含するがそれに限定されない、還元型グルタチオ
ン/グルタチオンジスルフィド、シスチン/システイン、
シスタミン（cystamine）/システアミン、および2-メル
カプトエタノール/2-ヒドロキシエチルジスルフィド。
特定の局面において、融合タンパク質は還元バッファー
に交換する前に尿素のような変成剤中で可溶化され得
る。好ましい実施態様においては、タンパク質は還元バ
ッファーに交換する前に例えば、イオン交換クロマトグ
ラフィーまたはNi-キレートクロマトグラフィーによっ
ても精製される。変成剤は尿素および塩酸グアニジンを
含有するがそれに限定されない。次に組換えタンパク質
を少なくとも約10倍以上に、より好ましくは約100倍
に、0.1MTris-HCl,pH 8.0、1mM EDTA、0.15M NaCl、0.3
M酸化型グルタチオンのような、しかし限定されない、
酸化剤を含有する酸化バッファーに希釈する。次に融合
タンパク質は約１から約24時間、好ましくは約２から約
16時間、室温で酸化バッファー中でインキュベートされ
る。酸化バッファーは、例えば糖、アルコール、または
硫酸アンモニウムのようなタンパク質安定化剤を含み得
る。酸化バッファーはさらにカオトロピック剤を低濃度
で含有して、不正確な分子間相互作用を不安定化し、そ
れゆえに適切なフォールディングを促進する。適切なカ
オトロピック剤としては、界面活性剤、ポリオール、L-
アルギニン、塩酸グアニジン、およびポリエチレングリ
コール(PEG)が挙げられるがそれに限定されない。十分
に低濃度のカオトロピック剤を使用してタンパク質の変
成を避けることが重要である。再フォールディングした
タンパク質は少なくとも約10倍以上に、より好ましくは
酸化バッファーに希釈されたもとの量に濃縮される。[0205] Expression of the recombinant protein in bacterial systems can result in incorrect folding of the expressed protein and requires refolding. The recombinant protein can be refolded before or after cleavage to form a functionally active OB polypeptide. The OB polypeptide is refolded by the following steps:
(i) incubating in a denaturing buffer containing a protein reducing agent, (ii) incubating the protein in a buffer also containing an oxidizing agent, preferably one or both of a protein stabilizer or a chaotropic agent. . Suitable redox (reducing / oxidizing) pairs include, but are not limited to, reduced glutathione / glutathione disulfide, cystine / cysteine,
Cystamine / cysteamine, and 2-mercaptoethanol / 2-hydroxyethyl disulfide.
In certain aspects, the fusion protein may be solubilized in a denaturing agent such as urea before exchanging for the reducing buffer. In a preferred embodiment, the proteins are also purified before exchange for the reducing buffer, for example by ion exchange chromatography or Ni-chelate chromatography. Denaturants include, but are not limited to, urea and guanidine hydrochloride. Then the recombinant protein is at least about 10-fold or more, more preferably about 100-fold, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.3 M
Like, but not limited to, M-oxidized glutathione
Dilute in oxidation buffer containing oxidizing agent. The fusion protein is then left for about 1 to about 24 hours, preferably about 2 to about 24 hours.
Incubate in oxidation buffer at room temperature for 16 hours. Oxidation buffers can include protein stabilizers, such as, for example, sugars, alcohols, or ammonium sulfate. Oxidation buffers also contain low concentrations of chaotropic agents to destabilize incorrect intermolecular interactions and therefore promote proper folding. Suitable chaotropic agents include surfactants, polyols, L-
Include, but are not limited to, arginine, guanidine hydrochloride, and polyethylene glycol (PEG). It is important to use sufficiently low concentrations of the chaotropic agent to avoid denaturation of the protein. The refolded protein is concentrated at least about 10-fold or more, more preferably to the original volume diluted in the oxidation buffer.

【０２０６】細菌発酵方法はまた、受容され得ないレベ
ルのエンドトキシンを含有するタンパク質調製物を生じ
させ得る。それゆえ、本発明は、例えばエンドトキシン
特異的抗体または他のエンドトキシン結合分子を使用し
たそのようなエンドトキシンの除去を意図する。エンド
トキシンの存在はE-TOXATE試薬(Sigma, St.Louis, Miss
ouri)の使用、またはバイオアッセイのような標準的な
技術によって決定され得る。The bacterial fermentation process can also result in protein preparations containing unacceptable levels of endotoxin. Thus, the present invention contemplates the removal of such endotoxins using, for example, endotoxin-specific antibodies or other endotoxin binding molecules. The presence of endotoxin was determined by the E-TOXATE reagent (Sigma, St. Louis, Miss.
ouri) or by standard techniques such as bioassays.

【０２０７】特定の実施例に加え、本発明者はバキュロ
ウィルス、哺乳類、および酵母発現系のobタンパク質の
発現への使用を意図する。例えば、バキュロウィルス発
現系において、pVL941 (BamHIクローニング部位; Summe
rs)、pVL1393 (BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaI
II、BglII、およびPstIクローニング部位; Invitroge
n)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、Xba
I、SmaI、およびBamH1クローニング部位; Summersおよ
びInvitrogen)、およびpBlueBacIII (BamH1、BglII、Ps
tI、NcoI、およびHindIIIクローニング部位、青色/白色
組換え体スクリーニング可能; Invitrogen)のような、
しかし限定されない非融合トランスファーベクター、お
よびpAc700 (BamHIおよびKpnIクローニング部位、BamHI
認識部位は開始コドンから始まる; Summers)、pAc701お
よびpAc702 (pAc700と同様、異なる読みとり枠を有す
る)、pAc360 (ポリヘドリン開始コドンの36塩基対下流
のBamHIクローニング部位; Invitrogen (195))、および
pBlueBacHisA、B、C (３種の異なる読みとり枠、BamH
I、BglII、PstI、NcoI、およびHindIIIクローニング部
位、ProBond精製のためのN-末端ペプチド、およびプラ
ークの青色/白色組換え体スクリーニング; Invitrogen
(220))のような、しかし限定されない融合トランスファ
ーベクターの両方が包含される。In addition to the specific examples, the inventors contemplate the use of baculovirus, mammalian, and yeast expression systems for expression of the ob protein. For example, in a baculovirus expression system, pVL941 (BamHI cloning site; Summe
rs), pVL1393 (BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, NotI, XmaI
II, BglII, and PstI cloning sites; Invitroge
n), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, Xba
I, SmaI, and BamH1 cloning sites; Summers and Invitrogen), and pBlueBacIII (BamH1, BglII, Ps
tI, NcoI, and HindIII cloning sites, blue / white recombinant screenable; like Invitrogen),
However, non-limiting non-fusion transfer vectors, and pAc700 (BamHI and KpnI cloning sites, BamHI
The recognition site begins at the start codon; Summers), pAc701 and pAc702 (similar to pAc700 with a different reading frame), pAc360 (a BamHI cloning site 36 base pairs downstream of the polyhedrin start codon; Invitrogen (195)), and
pBlueBacHisA, B, C (3 different reading frames, BamH
Blue / white recombinant screening of I, BglII, PstI, NcoI, and HindIII cloning sites, N-terminal peptide for ProBond purification, and plaques; Invitrogen
(220)), but not limited to.

【０２０８】本発明において使用を意図する哺乳類発現
ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)プロモータ
ーのような誘導性プロモーターを有するベクターを包含
する。それは例えば、DHFR発現ベクター、またはpED (P
stI、SalI、SbaI、SmaI、およびEcoRIクローニング部
位、クローン化遺伝子およびDHFRの両方を発現するベク
ター; Kaufmann, Current Protocols in Molecular Bio
logy、16.12 (1991)を参照のこと)のようなDHFR/メトト
レキセート共増幅ベクターの任意な発現ベクターであ
る。あるいは、pEE14 (HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、Ec
oRI、およびBclIクローニング部位、ベクターはグルタ
ミンシンターゼおよびクローン化遺伝子を発現; Cellte
ch)のようなグルタミンシンターゼ/メチオニンスルフォ
キシミン共増幅ベクター。その他の実施態様における、
pREP4 (BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、Nhe
I、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成的RSV-LT
Rプロモーター、ヒグロマイシン選択マーカー; Invitro
gen)、pCEP4 (BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindII
I、NheI、PvuII、およびKpnIクローニング部位、構成的
hCMV即時初期遺伝子、ヒグロマイシン選択マーカー; In
vitrogen)、pMEP4 (KpnI、PvuI、NheI、HindIII、Not
I、XhoI、SfiI、BamHIクローニング部位、誘導性メタロ
チオネインIIa遺伝子プロモーター、ヒグロマイシン選
択マーカー; Invitrogen)、pREP8 (BamHI、XhoI、Not
I、HindIII、NheI、およびKpnIクローニング部位、RSV-
LTRプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー; Invit
rogen)、pREP9 (KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、Sf
iI、およびBamHIクローニング部位、RSV-LTRプロモータ
ー、G418選択マーカー; Invitrogen)、およびpEBVHis
(RSV-LTRプロモーター、ヒグロマイシン選択マーカー、
ProBond樹脂で精製可能で、そしてエンテロキナーゼで
切断されるN-末端ペプチド; Invitrogen)などのような
エプスタイン-バーウィルス（Epstein Barr Virus）(EB
V)の制御下でのエピソーム発現に導くベクター。本発明
において使用される選択し得る哺乳類発現ベクターは、
pRc/CMV (HindIII、BstXI、NotI、SbaI、およびApaIク
ローニング部位、G418選択; Invitrogen)、pRc/RSV (Hi
ndIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaIクローニング部位、G4
18選択; Invitrogen)などを含む。本発明に従って使用
されるワクシニアウィルス哺乳類発現ベクター(Kaufma
n、(1991)、上記を参照のこと)は、pSC11 (SmaIクロー
ニング部位、TK-およびβ-gal選択)、pMJ601 (SalI、Sm
aI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、
KpnI、およびHindIIIクローニング部位; TK-およびβ-g
al選択)、およびpTKgptF1S (EcoRI、PstI、SalI、Acc
I、HindII、SbaI、BamHI、およびHpaクローニング部
位、TKまたはXPRT選択)などを含むがそれに限定されな
い。[0208] Mammalian expression vectors contemplated for use in the present invention include vectors having an inducible promoter, such as the dihydrofolate reductase (DHFR) promoter. It can be, for example, a DHFR expression vector, or pED (P
stI, SalI, SbaI, SmaI, and EcoRI cloning sites, vectors expressing both cloned genes and DHFR; Kaufmann, Current Protocols in Molecular Bio
DHFR / methotrexate co-amplification vector, such as S.logy, 16.12 (1991)). Alternatively, pEE14 (HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, Ec
oRI, and BclI cloning sites, vector expresses glutamine synthase and cloned gene;
glutamine synthase / methionine sulfoximine co-amplification vector such as ch). In other embodiments,
pREP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, Nhe
I, PvuII, and KpnI cloning sites, constitutive RSV-LT
R promoter, hygromycin selectable marker; Invitro
gen), pCEP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindII
I, NheI, PvuII, and KpnI cloning sites, constitutive
hCMV immediate early gene, hygromycin selectable marker; In
vitrogen), pMEP4 (KpnI, PvuI, NheI, HindIII, Not
I, XhoI, SfiI, BamHI cloning site, inducible metallothionein IIa gene promoter, hygromycin selectable marker; Invitrogen), pREP8 (BamHI, XhoI, Not
I, HindIII, NheI, and KpnI cloning sites, RSV-
LTR promoter, histidinol selectable marker; Invit
rogen), pREP9 (KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, Sf
iI and BamHI cloning sites, RSV-LTR promoter, G418 selectable marker; Invitrogen), and pEBVHis
(RSV-LTR promoter, hygromycin selectable marker,
N-terminal peptides that can be purified on ProBond resin and cleaved by enterokinase; Epstein Barr Virus (EB) such as Invitrogen)
Vectors leading to episomal expression under the control of V). Selectable mammalian expression vectors for use in the present invention include:
pRc / CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaI, and ApaI cloning sites, G418 selection; Invitrogen), pRc / RSV (Hi
ndIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI cloning site, G4
18 selections; Invitrogen). Vaccinia virus mammalian expression vector (Kaufma
n, (1991), see above), pSC11 (SmaI cloning site, TK- and β-gal selection), pMJ601 (SalI, Sm
aI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII,
KpnI and HindIII cloning sites; TK- and β-g
al selection), and pTKgptF1S (EcoRI, PstI, SalI, Acc
I, HindII, SbaI, BamHI, and Hpa cloning sites, TK or XPRT selection), and the like.

【０２０９】酵母発現系もまた本発明に従ってOBポリペ
プチドの発現に使用され得る。例えば、非融合pYES2ベ
クター (XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstX
I、BamH1、SacI、Kpn1、およびHindIIIクローニング部
位; Invitrogen)または融合pYESHisA、B、C (XbaI、Sph
I、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、お
よびHindIIIクローニング部位、 ProBond樹脂で精製さ
れ、エンテロキナーゼで切断されるN-末端ペプチド; In
vitrogen)の２例のみ挙げるが、本発明に従って使用さ
れ得る。[0209] Yeast expression systems can also be used for expressing OB polypeptides in accordance with the present invention. For example, a non-fused pYES2 vector (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstX
I, BamH1, SacI, Kpn1, and HindIII cloning sites; Invitrogen) or fusions pYESHisA, B, C (XbaI, Sph
I, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI, and HindIII cloning sites, N-terminal peptide purified on ProBond resin and cleaved with enterokinase; In
vitrogen), but can be used according to the invention.

【０２１０】体重モジュレーターペプチドアナログが、
本発明の範囲に由来するヌクレオチド配列から調製され
得ることがさらに意図される。The weight modulator peptide analog may comprise
It is further contemplated that they can be prepared from nucleotide sequences that fall within the scope of the invention.

【０２１１】OBポリペプチドの組換え発現に加え、本発
明は、OBポリペプチド、またはそのフラグメントの、周
知で高度に開発された固相ペプチド合成技術を用いて
の、調製を想定し完全に可能にする。本発明は一般的な
BocおよびFmocの両方、およびその他の保護基ストラテ
ジーのobポリペプチドまたはそのフラグメントの調製へ
の使用を意図する。再フォールディングおよびシステイ
ン側鎖の酸化をしてジスルフィド結合を形成する種々の
技術もまた当該分野に周知である。[0211] In addition to recombinant expression of OB polypeptides, the present invention is fully envisioned for the preparation of OB polypeptides, or fragments thereof, using well-known and highly developed solid phase peptide synthesis techniques. To The invention is general
Both Boc and Fmoc, and other protecting group strategies, are contemplated for use in preparing ob polypeptides or fragments thereof. Various techniques for refolding and oxidizing cysteine side chains to form disulfide bonds are also well known in the art.

【０２１２】OBポリペプチドに対する抗体 本発明に従い、組換えまたは化学合成で生産したOBポリ
ペプチド、およびそのフラグメントまたはその他の誘導
体あるいはアナログ（融合タンパク質を含む）は、OBポ
リペプチドを認識する抗体を生じさせるための免疫原と
して使用され得る。そのような抗体はポリクローナル、
モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、
およびFab発現ライブラリーを含むがそれに限定されな
い。 Antibodies to OB Polypeptides In accordance with the present invention, recombinantly or chemically synthesized OB polypeptides, and fragments or other derivatives or analogs thereof (including fusion proteins), generate antibodies that recognize OB polypeptides. Can be used as an immunogen for Such antibodies are polyclonal,
Monoclonal, chimeric, single-stranded, Fab fragment,
And Fab expression libraries.

【０２１３】分子は、免疫グロブリン(抗体)またはＴ細
胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識分子と特異
的に相互作用し得るときに「抗原性」である。抗原性の
ポリペプチドは少なくとも約５個、好ましくは少なくと
も約10個アミノ酸を含有する。分子の抗原性部分は、抗
体またはＴ細胞レセプター認識に免疫優先である部分で
あり得、または免疫感作のために抗原性部分をキャリア
ー分子にコンジュゲートすることにより分子に対する抗
体を生じさせるのに使用される部分であり得る。抗原性
の分子はそれ自身が免疫原性である、すなわちキャリア
ーなしで免疫応答を引き起こし得る、必要はない。A molecule is "antigenic" when it can interact specifically with an antigen-recognition molecule of the immune system, such as an immunoglobulin (antibody) or T-cell antigen receptor. Antigenic polypeptides contain at least about 5, preferably at least about 10 amino acids. The antigenic portion of the molecule may be a portion that is immunodominant for antibody or T cell receptor recognition, or may be used to raise antibodies to the molecule by conjugating the antigenic portion to a carrier molecule for immunization. Can be used part. An antigenic molecule need not be itself immunogenic, ie, capable of eliciting an immune response without a carrier.

【０２１４】「抗体」は特異的なエピトープに結合する
任意の免疫グロブリンであり、この免疫グロブリンには
抗体およびそのフラグメントが含まれる。この用語はポ
リクローナル、モノクローナル、キメラ抗体(米国特許
第4,816,397号および同第4,816,567号にさらに詳細に記
載)、ならびにFab、F(ab')₂、およびF(v) (一本鎖抗体
を含む)を含む抗体の抗原結合部分を含む。従って、語
句「抗体分子」は、本明細書中で用いられる種々の文法
的形態において、インタクトな（intact）免疫グロブリ
ン分子および抗体結合部位を含有する免疫グロブリン分
子の免疫的に活性な部分の両方を意図する。「抗体結合
部位」は抗原に特異的に結合するＨ鎖およびＬ鎖の可変
および超可変領域から構成され抗体分子の構造的部分で
ある。抗体分子の例としては、インタクトな免疫グロブ
リン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、
および当該分野においてFab、Fab'、F(ab')₂、およびF
(v)として公知の部分を含むパラトープを含有する免疫
グロブリンの部分が挙げられる。An “antibody” is any immunoglobulin that binds to a specific epitope, including antibodies and fragments thereof. The term includes polyclonal, monoclonal, chimeric antibodies (described in more detail in U.S. Pat.Nos. 4,816,397 and 4,816,567), and Fab, F (ab ') ₂ , and F (v) (including single chain antibodies). And an antigen-binding portion of an antibody comprising: Thus, the phrase “antibody molecule”, in various grammatical forms as used herein, refers to both an intact immunoglobulin molecule and an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule that contains an antibody binding site. Intended. An "antibody binding site" is a structural part of an antibody molecule that is composed of the variable and hypervariable regions of the heavy and light chains that specifically bind to an antigen. Examples of antibody molecules include intact immunoglobulin molecules, substantially intact immunoglobulin molecules,
And Fab, Fab ', F (ab') ₂ , and F in the art.
Examples of (v) a part of an immunoglobulin containing a paratope containing a known part.

【０２１５】抗体分子のFabおよびF(ab')₂部分はパパイ
ンおよびペプシンそれぞれのタンパク質分解反応により
調製され、実質的にインタクトな抗体分子については周
知の方法による。例えば、米国特許第4,342,566号、The
ofilopolousらを参照のこと。Fab'抗体分子部分もまた
周知であり、そしてF(ab')₂部分から、メルカプトエタ
ノールで二本のＨ鎖部分を連結しているジスルフィド結
合を還元し、続いて得られたタンパク質メルカプタンを
ヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化して生産
される。インタクトな抗体分子を含む抗体が本明細書中
において好ましい。The Fab and F (ab ') ₂ portions of the antibody molecule are prepared by proteolytic reactions of papain and pepsin, respectively, and substantially intact antibody molecules are well-known in the art. For example, U.S. Pat.No. 4,342,566, The
See ofilopolous et al. The Fab 'antibody molecule portion is also well known, and the disulfide bond linking the two heavy chain portions is reduced from the F (ab') ₂ portion with mercaptoethanol, and the resulting protein mercaptan is then iodinated. It is produced by alkylation with a reagent such as acetamide. Antibodies comprising intact antibody molecules are preferred herein.

【０２１６】語句「モノクローナル抗体」は種々の文法
的形態において、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合
部位を１種類のみ有する抗体を意味する。モノクローナ
ル抗体はそれゆえ、それが免疫反応する任意の抗原に対
して単一の結合親和性を典型的に提示する。従って、モ
ノクローナル抗体は、複数の、それぞれが異なる抗原に
免疫特異的な抗体結合部位を有する抗体分子、例えば２
特異性(キメラ)モノクローナル抗体、を含み得る。The phrase “monoclonal antibody” in various grammatical forms means an antibody that has only one type of antibody binding site capable of immunoreacting with a particular antigen. A monoclonal antibody therefore typically presents a single binding affinity for any antigen with which it immunoreacts. Thus, a monoclonal antibody is an antibody molecule having a plurality of antibody binding sites immunospecific for each different antigen, eg,
Specific (chimeric) monoclonal antibodies.

【０２１７】用語「アジュバント」は抗原に対する免疫
応答を増強する化合物または混合物を意味する。アジュ
バントは、徐々に抗原を放出する組織貯蔵所として、ま
た免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性因子とし
て作用し得る[Hoodら、Immunology、384頁、第２版、Be
njamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]。
しばしば、抗原のみによる、アジュバント非存在下の、
１次の免疫は、体液性または細胞性免疫応答を引き起こ
し得ない。アジュバントは完全フロイントアジュバン
ト、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化
アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのよ
うな表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニ
オン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、キー
ホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、
およびBCG(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebact
erium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバント
を包含するがそれに限定されない。好ましくは、アジュ
バントは薬学的に受容される。The term “adjuvant” refers to a compound or mixture that enhances the immune response to an antigen. Adjuvants can act as a tissue depot that slowly releases antigen and as a lymphoid activator that non-specifically enhances the immune response [Hood et al., Immunology, p. 384, second edition, Be.
njamin / Cummings, Menlo Park, California (1984)].
Often due to antigen alone, in the absence of adjuvant,
Primary immunity cannot elicit a humoral or cellular immune response. Adjuvants include complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, saponins, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil or hydrocarbon emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitro Phenol,
And BCG (bacille Calmette-Guerin) and Corynebact
Includes, but is not limited to, potentially useful human adjuvants such as erium parvum. Preferably, the adjuvant is pharmaceutically acceptable.

【０２１８】当該分野に公知の種々の工程が、OBポリペ
プチド、あるいはそのフラグメント、誘導体、またはア
ナログに対するポリクローナル抗体の生産に使用され得
る。抗体の生産のためには、ウサギ、マウス、ラット、
ヒツジ、ヤギなどを含むがそれに限定されない種々の宿
主動物が、OBポリペプチドまたはその誘導体(例えば、
フラグメントまたは融合タンパク質)の注入によって免
疫され得る。１つの実施態様において、OBポリペプチド
またはそのフラグメントは、例えばウシ血清アルブミン
(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)の
免疫原性キャリアーに結合され得る。種々のアジュバン
ト、フロイント(完全および不完全) 、水酸化アルミニ
ウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面
活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペ
プチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシ
アニン、ジニトロフェノール、およびBCG(bacille Calm
ette-Guerin)およびCorynebacterium parvumのような潜
在的に有用なヒトアジュバントを含むがそれに限定され
ない、が宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させる
ために使用され得る。[0219] Various procedures known in the art can be used for the production of polyclonal antibodies against the OB polypeptide, or a fragment, derivative, or analog thereof. For the production of antibodies, rabbits, mice, rats,
Various host animals, including but not limited to sheep, goats, and the like, can be OB polypeptides or derivatives thereof (e.g.,
(Fragments or fusion proteins). In one embodiment, the OB polypeptide or fragment thereof is, for example, bovine serum albumin.
(BSA) or keyhole limpet hemocyanin (KLH) immunogenic carrier. Various adjuvants, Freund (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and BCG (bacille Calm
ette-Guerin) and potentially useful human adjuvants such as Corynebacterium parvum, but can be used to increase the immunological response, depending on the host species.

【０２１９】OBポリペプチド、あるいはそのフラグメン
ト、アナログ、または誘導体に関するモノクローナル抗
体の調製のためには、培養中の連続的細胞株による抗体
分子の生産を提供する任意の技術が使用され得る。これ
らの技術は、Kohlerら(Nature, 256:495-497 (1975))に
よって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびに
ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術であるトリオーマ技術(K
ozbrら、ImmunologyToday, 4:72 (1983))、およびヒト
モノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブリドー
マ技術[Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Th
erapy、77-96頁, Alan R. Liss, Inc., (1985)]を包含
するがそれに限定されない。不死の抗体生産細胞株は、
Ｂリンパ吸の癌遺伝子DNAによる直接トランスフォーメ
ーション、またはエプスタイン-バーウィルスによるト
ランスフェクションなどの融合以外の技術により作製さ
れ得る(例えば、M. Schreierら、「Hybridoma Techniqu
es 」(1980); Hammerlingら、「Monoclonal Antibodies
And T-cell Hybridomas」 (1981); Kennettら、「Mono
clonal Antibodies」 (1980)を参照のこと; また米国特
許第4,341,761号; 同第4,399,121号; 同第4,427,783号;
同第4,444,887号; 同第4,451,570号; 同第4,466,917
号;同第4,472,500号; 同第4,491,632号; および同第4,4
93,890号を参照のこと)。For preparation of monoclonal antibodies for the OB polypeptide, or a fragment, analog, or derivative thereof, any technique which provides for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture can be used. These techniques are the hybridoma technology first developed by Kohler et al. (Nature, 256: 495-497 (1975)), as well as the trioma technology (KK), a human B-cell hybridoma technology.
ozbr et al., Immunology Today, 4:72 (1983)), and EBV-hybridoma technology for producing human monoclonal antibodies [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Th
erapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]. Immortal antibody-producing cell lines
B-lymphoid suckling can be made by techniques other than fusion, such as direct transformation with oncogene DNA or transfection with Epstein-Barr virus (see, eg, M. Schreier et al., "Hybridoma Techniqu
es ''(1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies
And T-cell Hybridomas ''(1981); Kennett et al., Mono
clonal Antibodies ''(1980); and U.S. Patent Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783;
No. 4,444,887; No. 4,451,570; No. 4,466,917
No. 4,472,500; No. 4,491,632; and No. 4,4
93,890).

【０２２０】本発明のさらなる実施態様において、モノ
クローナル抗体は近年の技術を利用して無菌動物におい
て生産され得る(PCT/US90/02545)。本発明に従って、ヒ
ト抗体は使用され得、そしてヒトハイブリドーマを使用
して[Coteら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2
030 (1983)]、またはヒトＢ細胞をEBVウィルスによりイ
ンビトロにおいてトランスフォームすることにより(Col
eら、1985、上記)、獲得され得る。実際、本発明に従
い、「キメラ抗体」[Morrisonら、J. Bacteriol., 159-
870 (1984); Neubergerら、Nature, 312:604-608 (198
4); Takedaら、Nature, 314:452-454 (1985)]の生産の
ために、obポリペプチドに特異的なマウス抗体分子から
の遺伝子と適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺
伝子とを組み継ぐことによって開発された技術が使用さ
れ得る; そのような抗体は本発明の範囲内である。この
ようなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾病また
は疾患の治療における使用(以下で記載)に好ましい、な
ぜならヒトまたはヒト化抗体は異種移植抗体よりもそれ
自身で免疫応答、特にアレルギー反応を引き起こす可能
性が非常に低いからである。In a further embodiment of the present invention, monoclonal antibodies may be produced in sterile animals using modern technology (PCT / US90 / 02545). In accordance with the invention, human antibodies can be used, and human hybridomas can be used [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2.
030 (1983)], or by transforming human B cells with EBV virus in vitro (Col.
e et al., 1985, supra). Indeed, according to the present invention, "chimeric antibodies" [Morrison et al., J. Bacteriol., 159-
870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (198
4); For the production of Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985)], a gene from a mouse antibody molecule specific for the ob polypeptide and a gene from a human antibody molecule of appropriate biological activity. Techniques developed by conjugation with E. can be used; such antibodies are within the scope of the present invention. Such human or humanized chimeric antibodies are preferred for use in the treatment of human diseases or disorders (described below), because human or humanized antibodies produce an immune response, particularly an allergic response, by themselves over xenograft antibodies. It is very unlikely to cause it.

【０２２１】本発明に従って、一本鎖抗体の生産のため
に記載された技術(米国特許第4,946,778号)、がOBポリ
ペプチド特異的一本鎖抗体の生産に適応され得る。本発
明のさらなる実施態様は、Fab発現ライブラリーの構築
のために記載される技術[Huseら、Science, 246:1275-1
281 (1989)]が、obポリペプチド、あるいはその誘導体
またはアナログに対する所望の特異性を有するモノクロ
ーナルFab断片の迅速で容易な同定をもたらすために利
用する。According to the present invention, the techniques described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) can be adapted for the production of OB polypeptide-specific single-chain antibodies. A further embodiment of the present invention provides a technique described for the construction of a Fab expression library [Huse et al., Science, 246: 1275-1.
281 (1989)] is used to provide rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments having the desired specificity for an ob polypeptide, or derivative or analog thereof.

【０２２２】抗体分子のイディオタイプを含有する抗体
フラグメントを公知の技術により生じさせ得る。例え
ば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消
化で生産され得るF(ab')₂フラグメント、F(ab')₂フラグ
メントのジスルフィド架橋の還元で生じさせ得るFab'フ
ラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で
処理して生じさせ得るFabフラグメントを含むが、それ
に限定されない。[0222] Antibody fragments which contain the idiotype of the antibody molecule can be generated by known techniques. For example, such fragments include F (ab ') ₂ fragments that can be produced by pepsin digestion of antibody molecules, Fab' fragments that can be generated by reduction of disulfide bridges of F (ab ') ₂ fragments, and papain And Fab fragments that can be generated by treatment with a reducing agent.

【０２２３】抗体の生産において、所望の抗体のスクリ
ーニングは当該分野に公知の技術、例えば、ラジオイム
ノアッセイ、ELISA(酵素免疫吸着測定法)、「サンドウ
ィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッ
セイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、インサイチ
ュイムノアッセイ(例えば、金コロイド、酵素、または
放射性同位元素標識物使用)、ウェスタンブロット、沈
降反応、凝集測定法(例えば、ゲル凝集測定法、血液凝
集測定法)、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテ
インＡ測定法、および免疫電気泳動測定法など、により
達成され得る。１つの実施態様において、抗体は１次抗
体の標識を検出することにより検出される。他の実施態
様において、１次抗体は２次抗体または試薬の１次抗体
の結合を検出することにより検出される。さらなる実施
態様において、２次抗体は標識される。イムノアッセイ
における結合の検出のための多くの方法が当該分野にお
いて公知であり、本発明の範囲内にある。例えば、OBポ
リペプチドの特異的なエピトープを認識する抗体を選択
するために、このようなエピトープを含有するOBポリペ
プチドフラグメントに結合する生産物について、生じた
ハイブリドーマをアッセイし得る。特定の動物種からの
OBポリペプチドに特異的な抗体の選択のために、動物種
の細胞から発現または単離されるOBポリペプチドとの陽
性結合に基づいて選択し得る。In the production of antibodies, screening for the desired antibody can be performed by techniques known in the art, such as radioimmunoassay, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, immunoradiometric assay, gel diffusion sedimentation, Immunodiffusion assay, in situ immunoassay (e.g., using colloidal gold, enzyme, or radioisotope label), western blot, sedimentation reaction, agglutination assay (e.g., gel agglutination assay, blood agglutination assay), complement fixation It can be achieved by an assay, an immunofluorescence assay, a protein A assay, an immunoelectrophoresis assay, or the like. In one embodiment, the antibody is detected by detecting a label on the primary antibody. In another embodiment, the primary antibody is detected by detecting the binding of the secondary antibody or the primary antibody of the reagent. In a further embodiment, the secondary antibody is labeled. Many methods for the detection of binding in an immunoassay are known in the art and are within the scope of the present invention. For example, to select antibodies that recognize a specific epitope of an OB polypeptide, the resulting hybridomas can be assayed for products that bind to an OB polypeptide fragment containing such an epitope. From certain animal species
For selection of antibodies specific for an OB polypeptide, selection may be based on positive binding to the OB polypeptide expressed or isolated from cells of an animal species.

【０２２４】上記の抗体はOBポリペプチドの位置測定(l
ocalization)および活性に関連して、例えば、ウェスタ
ンブロッティング、インサイチュにおけるOBポリペプチ
ドのイメージング、適切な生理学的サンプル中のそのレ
ベルの測定など、当該分野で公知の方法で使用され得
る。The above antibodies were used to determine the position of the OB polypeptide (l
ocalization) and activity can be used in any manner known in the art, such as, for example, Western blotting, imaging of an OB polypeptide in situ, measuring its level in a suitable physiological sample, and the like.

【０２２５】特定の実施態様において、OBポリペプチド
の活性を作動的または拮抗的に作用する抗体を生じ得
る。そのような抗体は後述のリガンド同定のためのアッ
セイを使用して試験され得る。In certain embodiments, one may generate antibodies that agonize or antagonize the activity of the OB polypeptide. Such antibodies can be tested using the assays for ligand identification described below.

【０２２６】特定の実施態様において、抗体は、タンパ
ク質の配列から予想された合成ペプチドまたは細菌発現
ベクターを使用して作製された組換えタンパク質でウサ
ギを免疫して開発される。合成ペプチドの選択は上記の
ように、予想されるタンパク質構造の慎重な解析により
なされる。特に、推定上の切断部位の間のペプチド配列
が選択される。合成ペプチドはKLHヘモシアニンまたはB
SAのようなキャリアーにカルボジイミドを使用して結合
され、フロイントアジュバント中でウサギの免疫に使用
される。組換えタンパク質を調製するために、pGEXベク
ターがポリペプチドの発現に使用され得る(Smithら、19
88、上記)。あるいは、親水性ドメインのみが融合タン
パク質を生じさせるために使用され得る。発現タンパク
質は大量に調製されフロイントアジュバント中でウサギ
の免疫に使用される。In certain embodiments, antibodies are developed by immunizing rabbits with a synthetic peptide predicted from the sequence of the protein or a recombinant protein made using a bacterial expression vector. The selection of synthetic peptides is made by careful analysis of the expected protein structure, as described above. In particular, peptide sequences between putative cleavage sites are selected. Synthetic peptide is KLH hemocyanin or B
It is conjugated to a carrier such as SA using carbodiimide and used to immunize rabbits in Freund's adjuvant. To prepare recombinant proteins, pGEX vectors can be used for expression of polypeptides (Smith et al., 19
88, above). Alternatively, only the hydrophilic domain can be used to generate the fusion protein. The expressed protein is prepared in large quantities and used for immunization of rabbits in Freund's adjuvant.

【０２２７】他の特定の実施態様において、組換えOBポ
リペプチドはニワトリの免疫に使用され、ニワトリ抗OB
抗体は卵黄から、例えば、OBカラムのアフィニティ精製
によって、回収される。好ましくは、免疫に使用される
ニワトリは特定の無病原体(SPF)状態に保たれる。In another specific embodiment, the recombinant OB polypeptide is used for immunizing chickens and chicken anti-OB
Antibodies are recovered from the yolk, for example, by affinity purification on an OB column. Preferably, the chickens used for immunization are kept in a particular pathogen-free (SPF) state.

【０２２８】他の実施態様において、レプチンに対する
抗体が、循環OBタンパク質を欠くob/obマウスにおいて
生じ、それゆえ抗OBポリペプチド応答を生じる得ると期
待される、なぜなら、それはポリペプチドおよび野生型
マウスにたいして寛容でないからである。In another embodiment, it is expected that antibodies to leptin could be raised in ob / ob mice lacking circulating OB proteins, and thus produce an anti-OB polypeptide response, since it is the polypeptide and wild-type mouse Because they are not forgiving.

【０２２９】さらなる実施態様において、組換えOBポリ
ペプチドはウサギの免疫に使用され、ポリクローナル抗
体は以後の使用前に免疫精製される。精製された抗体
は、半定量的アッセイ、特に血清または血漿中の循環OB
ポリペプチドの存在の検出に、特に有用である。In a further embodiment, the recombinant OB polypeptide is used to immunize a rabbit, and the polyclonal antibody is immunopurified prior to subsequent use. Purified antibodies can be used in semi-quantitative assays, especially in circulating OBs in serum or plasma.
It is particularly useful for detecting the presence of a polypeptide.

【０２３０】モジュレーターペプチドに対して生産され
たモノクローナル抗体のパネルは種々の特性、すなわち
イソタイプ、エピトープ、親和性など、についてスクリ
ーニングされ得る。特に重要なのはモジュレーターペプ
チドの活性を中和するモノクローナル抗体である。その
ようなモノクローナルは体重モジュレーターの活性アッ
セイで容易に同定される。高親和性抗体はまた、天然の
または組換えモジュレーターの免疫親和性精製が可能で
あるときに有用である。Panels of monoclonal antibodies produced against modulator peptides can be screened for various properties, ie, isotype, epitope, affinity, and the like. Of particular interest are monoclonal antibodies that neutralize the activity of the modulator peptide. Such monoclonals are easily identified in a weight modulator activity assay. High affinity antibodies are also useful when immunoaffinity purification of natural or recombinant modulators is possible.

【０２３１】好ましくは、本発明の診断および治療方法
に使用される抗モジュレーター抗体は親和性精製された
ポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はモ
ノクローナル抗体(mAb)である。さらに、本明細書中で
使用される抗モジュレーター抗体は、抗体分子全体のFa
b、Fab'、F(ab')₂、またはF(v)の形態であることが好ま
しい。Preferably, the anti-modulator antibodies used in the diagnostic and therapeutic methods of the present invention are affinity purified polyclonal antibodies. More preferably, the antibody is a monoclonal antibody (mAb). In addition, anti-modulator antibodies as used herein refer to the Fa of the whole antibody molecule.
It is preferably in the form of b, Fab ', F (ab') ₂ , or F (v).

【０２３２】診断用途 本発明はまた、本発明の体重モジュレーターに媒介され
る活性を引き出すそれらの能力に関連して、体重の異常
または脂肪症に影響を与える状態および/または刺激の
存在を検出する方法を包含する、種々の診断への応用に
関する。上に記載したように、体重モジュレーターペプ
チドは種々の公知の技術により本ペプチドに対する抗体
を産生するために使用され得、次いでこのような抗体が
単離され、そして対象の標的細胞における特定の転写活
性の存在についての試験において使用され得る。あるい
は、本発明の核酸は診断に使用され得る。 Diagnostic Uses The present invention also detects the presence of conditions and / or stimuli affecting abnormalities in body weight or steatosis in relation to their ability to elicit the activity mediated by the weight modulators of the present invention. Various diagnostic applications, including methods. As described above, the weight modulator peptide can be used to raise antibodies to the peptide by a variety of known techniques, which are then isolated and specific transcriptional activities in target cells of interest. Can be used in tests for the presence of Alternatively, the nucleic acids of the invention can be used for diagnosis.

【０２３３】抗体に基づいた診断 上に示唆したように、本発明において有用な診断法は、
抗モジュレーター抗体、好ましくはアフィニティー精製
したポリクローナル抗体、より好ましくはモノクローナ
ル抗体(mAb)のようなモジュレータータンパク質に対す
るアンタゴニストの有効量を含むアッセイによって細胞
サンプルまたは培養液を試験することを包含する。さら
に、本明細書中で使用される抗モジュレーター抗体分子
は、好ましくは抗体分子全体のFab、Fab'、F(ab')₂、あ
るいはF(v)部分の形態または抗体分子全体である。既に
論じたように、この方法からの利益を得られ得る患者は
癌、AIDS、肥満症または異常な体重が特徴または因子と
なる他の状態を患う患者を含む。モジュレーターを単離
し、そして抗モジュレーター抗体を誘導する方法および
抗モジュレーター抗体の能力を測定し、そして最適化し
て標的細胞の試験を援助する方法は当該分野に周知であ
る。Antibody-Based Diagnosis As suggested above, diagnostic methods useful in the present invention include:
Testing the cell sample or culture by an assay comprising an effective amount of an anti-modulator antibody, preferably an affinity purified polyclonal antibody, more preferably an antagonist to a modulator protein such as a monoclonal antibody (mAb). Further, an anti-modulator antibody molecule as used herein is preferably in the form of an Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ , or F (v) portion of the whole antibody molecule or a whole antibody molecule. As discussed above, patients that may benefit from this method include patients with cancer, AIDS, obesity, or other conditions characterized or abnormal by abnormal weight. Methods for isolating modulators and inducing anti-modulator antibodies and measuring the ability of anti-modulator antibodies and optimizing them to aid in testing target cells are well known in the art.

【０２３４】また、ポリクローナルおよびモノクローナ
ル抗体の両方を含む抗体、および体重モジュレーターお
よび他の認識因子および/またはそのサブユニットの産
生または活性を調節する薬物は、ある種の診断への応用
を有し得、例えば、体重の異常が発症しているかあるい
は発達しそうであり得る状態を検出および/または測定
する目的のために利用され得る。例えば、モジュレータ
ーペプチドまたはその活性なフラグメントは、例えば、
融合されたマウス脾臓リンパ球および骨髄腫細胞を利用
するハイブリドーマ技術のような公知の技術によって、
種々の細胞培地中に自身に対するポリクローナルおよび
モノクローナル両方の抗体を産生することに使用され得
る。これらの技術については以下に詳細に記載する。同
様に、本発明のレセプター認識因子の活性を模倣するま
たはそれに拮抗する小分子が発見または合成され得、診
断的および/または治療的プロトコールに使用され得
る。In addition, antibodies, including both polyclonal and monoclonal antibodies, and drugs that modulate the production or activity of weight modulators and other recognition factors and / or subunits thereof may have certain diagnostic applications. For example, it can be used for the purpose of detecting and / or measuring a condition in which a weight abnormality has developed or is likely to develop. For example, a modulator peptide or an active fragment thereof can be, for example,
By known techniques, such as hybridoma technology utilizing fused mouse spleen lymphocytes and myeloma cells,
It can be used to produce both polyclonal and monoclonal antibodies to itself in various cell culture media. These techniques are described in detail below. Similarly, small molecules that mimic or antagonize the activity of the receptor recognizers of the present invention can be discovered or synthesized and used in diagnostic and / or therapeutic protocols.

【０２３５】細胞中の体重モジュレーターの存在は、こ
のような測定に応用され得る通常の免疫学的手順によっ
て確認され得る。多くの有用な手順が公知である。３つ
のこのような特に有用な手順は、検出可能な標識で標識
されたレセプター認識因子、検出可能な標識で標識され
た抗体Ab₁、または検出可能な標識で標識された抗体Ab₂
を利用する。手順は以下の式で要約され、ここで式中の
アステリスク（*）は粒子が標識されていることを示
し、「WM」は体重モジュレーターを表す。The presence of a body weight modulator in a cell can be confirmed by conventional immunological procedures applicable to such measurements. Many useful procedures are known. Three such particularly useful procedures are receptor recognizer labeled with a detectable label, antibody Ab ₁ labeled with a detectable label, or antibody Ab ₂ labeled with a detectable label.
Use The procedure is summarized in the following formula, where an asterisk (*) indicates that the particles are labeled and "WM" stands for weight modulator.

【０２３６】Ａ．ＷＭ^*＋Ａｂ₁＝ＷＭ^*Ａｂ₁ Ｂ．ＷＭ＋Ａｂ^* ₁＝ＷＭＡｂ₁ ^* Ｃ．ＷＭ＋Ａｂ₁＋Ａｂ₂ ^*＝Ａｂ₁ＷＭＡｂ₂ ^* 手順およびその応用はすべて当業者に周知であり、従っ
て本発明の範囲で利用され得る。「競合」手順、手順
Ａ、は米国特許第3,654,090号および同第3,850,752号に
記載されている。手順Ｂは周知の競合アッセイ技術の典
型である。手順Ｃ、「サンドウィッチ」手順、は米国特
許第RE 31,006号および同第4,016,043号に記載されてい
る。さらに「２重抗体」、または「DASP」手順のような
他の手順が公知である。A. _{^{WM * + Ab 1 = WM *}} Ab 1 B. _{^{WM + Ab * 1 = WMAb 1}} * C. ^{_{WM + Ab 1 + Ab 2 *}} = Ab 1 WMAb 2 * The procedures and their application are all well known to those skilled in the art, thus can be utilized in the scope of the present invention. The "competition" procedure, Procedure A, is described in U.S. Patent Nos. 3,654,090 and 3,850,752. Procedure B is typical of well-known competitive assay techniques. Procedure C, the "sandwich" procedure, is described in U.S. Patent Nos. RE 31,006 and 4,016,043. In addition, other procedures are known, such as the "double antibody" or "DASP" procedure.

【０２３７】各々の場合において、体重モジュレーター
は１つまたはそれ以上の抗体または結合パートナーと複
合体を形成し、複合体の１つのメンバーが検出可能な標
識で標識されている。複合体が形成された事実および、
所望する場合その量は、標識の検出に応用され得る公知
の方法により測定され得る。In each case, the weight modulator forms a complex with one or more antibodies or binding partners, one member of the complex being labeled with a detectable label. The fact that a complex was formed, and
If desired, the amount can be measured by known methods applicable to the detection of labels.

【０２３８】Ab₂の特徴的特性はそれがAb₁と反応するこ
とであることが上記から理解される。なぜなら、これは
１種の哺乳類種から生じたAb₁が、その他の動物種にお
いて抗体Ab₂を生じる抗原として使用されたからであ
る。例えばAb₂は、ウサギ抗体を用いて、ヤギ中で生じ
させ得る。Ab₂はそれゆえヤギで生じた抗ウサギ抗体で
ある。本明細書中および特許請求の範囲の目的のため
に、Ab₁は１次または抗体重モジュレーター抗体を意味
し、そしてAb₂は２次または抗Ab₁抗体を意味する。From the above it can be seen that the characteristic property of Ab ₂ is that it reacts with Ab ₁ . This is because Ab ₁ from one mammalian species has been used as an antigen to raise antibody Ab ₂ in other animal species. For example, Ab ₂ can be raised in goats using rabbit antibodies. Ab ₂ is therefore an anti-rabbit antibody raised in goats. For purposes herein and in the claims, Ab ₁ refers to a primary or antibody heavy modulator antibody, and Ab ₂ refers to a secondary or anti-Ab ₁ antibody.

【０２３９】これらの研究のために最も一般的に使用さ
れる標識は、放射性要素、酵素、紫外光線にさらすと蛍
光を発する化学物質などである。The labels most commonly used for these studies are radioactive elements, enzymes, chemicals that fluoresce when exposed to ultraviolet light, and the like.

【０２４０】多くの蛍光物質が公知であり標識として利
用され得る。これらは例えば、フルオレセイン、ローダ
ミンおよびオーラミンを含む。特定の検出物質はヤギで
調製された抗ウサギ抗体であり、イソチオシアネートに
よりフルオレセインと結合される。Many fluorescent substances are known and can be used as labels. These include, for example, fluorescein, rhodamine and auramine. A particular detector is a goat-prepared anti-rabbit antibody, which is bound to fluorescein by an isothiocyanate.

【０２４１】体重モジュレーターまたはその結合パート
ナーは放射性要素または酵素で標識され得る。放射性標
識は任意の現在入手し得る計数手順により検出され得
る。好ましい同位体元素は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、
³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵
Ｉ、¹³¹Ｉ、および¹⁸⁶Ｒｅから選択され得る。The weight modulator or its binding partner can be labeled with a radioactive element or an enzyme. The radiolabel can be detected by any currently available counting procedure. Preferred isotopes are ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S,
³⁶ Cl, ⁵¹ Cr, ⁵⁷ Co, ⁵⁸ Co, ⁵⁹ Fe, ⁹⁰ Y, ¹²⁵
I, ¹³¹ I, and ¹⁸⁶ Re.

【０２４２】酵素標識は同様に有用であり、任意の現在
利用される比色、分光光度、蛍光分光光度、電流測定ま
たはガス測定の技術により検出され得る。酵素は選択さ
れた粒子にカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタ
ルアルデヒドのような架橋分子を用いた反応により結合
される。これらの手順で使用され得る多くの酵素が公知
であり、そして利用され得る。好ましくは、ペルオキシ
ダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、
β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキ
シダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファ
ターゼである。米国特許第3,654,090号; 同第3,850,752
号; および同第4,016,043号が他の標識物質および方法
の開示例として引用される。Enzyme labels are similarly useful and can be detected by any of the currently available colorimetric, spectrophotometric, fluorescent spectrophotometric, amperometric or gas measuring techniques. The enzyme is attached to the selected particles by a reaction using a cross-linking molecule such as carbodiimide, diisocyanate, glutaraldehyde. Many enzymes that can be used in these procedures are known and can be utilized. Preferably, peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase,
β-D-galactosidase, urease, glucose oxidase plus peroxidase and alkaline phosphatase. U.S. Patent No. 3,654,090; 3,850,752
And No. 4,016,043 are cited as disclosure examples of other labeling substances and methods.

【０２４３】本発明のさらなる実施態様において、医学
専門家による使用に適切な試験キットが、対象の標的細
胞における所定の転写活性の有無、あるいは所定の転写
活性能を測定するために調製され得る。上記の試験技術
に従って、このようなキットの１つのクラスは少なくと
も標識された体重モジュレーターまたはその結合パート
ナー、例えばそれに特異的な抗体、およびもちろん、例
えば「競合」、「サンドウィッチ」、「DASP」などの選
択された方法に依存して、説明書を含有する。キットは
バッファー、安定化剤などの周辺試薬もまた含有し得
る。In a further embodiment of the present invention, a test kit suitable for use by a medical professional may be prepared to determine the presence or absence of a given transcriptional activity in a target cell of interest, or a given transcriptional activity. In accordance with the test techniques described above, one class of such kits comprises at least a labeled weight modulator or its binding partner, eg, an antibody specific thereto, and, of course, such as, eg, “competition”, “sandwich”, “DASP”, etc. It contains instructions, depending on the method chosen. The kit may also contain peripheral reagents such as buffers, stabilizers and the like.

【０２４４】従って、試験キットは所定の転写活性につ
いて細胞での存在または能力を示すために調製され得、
以下のものを含有する: (a) 所定量の少なくとも１つの標識された免疫化学的に
反応性の成分であって、検出されるレベルの本発明の体
重モジュレーターまたはその特異的な結合パートナーの
直接的または間接的な付着により得られる成分; (b) 他の試薬; および (c) そのキットの使用説明書 より具体的には、診断試験キットは以下のものを包含し
得る: (a) 既知の量の上記の体重モジュレーター(または結合
パートナーであって)一般に固相に結合して免疫吸着剤
を形成するか、あるいは適切なタグ、または複数のそれ
らの最終産物など(またはそれらの結合パートナー)の各
々の１つに結合した、体重モジュレーター; (b) 必要な場合、他の試薬; および (c) そのキットの使用説明書。Accordingly, test kits can be prepared to indicate the presence or ability of a cell for a given transcriptional activity,
Contains: (a) a predetermined amount of at least one labeled immunochemically reactive component which is directly detected by a detectable level of a weight modulator of the invention or a specific binding partner thereof. (B) other reagents; and (c) instructions for use of the kit.More specifically, the diagnostic test kit may include: (a) known Amount of the above weight modulators (or binding partners) generally bound to a solid phase to form an immunosorbent, or a suitable tag, or a plurality of their end products, etc. (or their binding partners) A weight modulator attached to each one of the following: (b) other reagents, if necessary; and (c) instructions for use of the kit.

【０２４５】さらなる多様性において、試験キットは上
記の目的のために調製および使用され、所定のプロトコ
ール(例えば、「競合」、「サンドウィッチ」、「２重
抗体」など)に従って作用し、以下のものを包含する: (a) 体重モジュレーターを検出し得る標識に結合して得
られる標識された成分; (b) １つまたはそれ以上の別の免疫化学的試薬であって
少なくとも１つの試薬がリガンドまたは固定化されたリ
ガンドであり、リガンドが以下からなる群より選択され
る免疫化学的試薬: (i) 標識された成分(a)に結合可能なリガンド; (ii) 標識された成分(a)の結合パートナーに結合可能
なリガンド; (iii) 測定しようとする単一または複数の成分の少な
くとも１つに結合可能なリガンド; および (iv) 測定しようとする少なくとも１つの単一または
複数の成分の少なくとも１つの結合パートナーに結合可
能なリガンド; ならびに (c) 体重モジュレーターとその特異的な結合パートナー
との間の免疫化学的反応の１つまたはそれ以上の成分の
検出および/または測定のプロトコールの実施のための
説明書。In a further variety, test kits are prepared and used for the above purposes and work in accordance with predetermined protocols (eg, “competition,” “sandwich,” “double antibody,” etc.) Including: (a) a labeled component obtained by binding a weight modulator to a detectable label; (b) one or more additional immunochemical reagents, wherein at least one reagent is a ligand or An immobilized ligand, an immunochemical reagent wherein the ligand is selected from the group consisting of: (i) a ligand capable of binding to the labeled component (a); (ii) a ligand capable of binding to the labeled component (a). A ligand capable of binding to the binding partner; (iii) a ligand capable of binding to at least one of the single or multiple components to be measured; and (iv) at least one single or multiple components to be measured. A ligand capable of binding to at least one binding partner; and (c) a protocol for detecting and / or measuring one or more components of an immunochemical reaction between the weight modulator and its specific binding partner. Instructions for the implementation of.

【０２４６】核酸に基づいた診断 下記の実施例に示すように、本発明の核酸は、結果とし
て肥満表現型を生じるOBポリペプチドにおける欠陥に関
連する欠陥の検出に使用され得る。例えば、核酸プロー
ブ(例えば、ノーザン解析またはRT-PCR解析)が肥満表現
型がOBmRNA発現の欠損、または非機能性OBmRNAの発現、
例えば、db/dbマウス(その欠陥はOBレセプターの欠損か
ら生じる)または突然変異により非転写mRNAを生じる場
合、のいずれと関連するのかを決定するために使用され
る。そのうえ、本発明の核酸に基づいた診断技術は抗体
に基づいた技術とともに使用され得、さらなる肥満また
は無食欲症の表現型の分子的理解を発展させる。Nucleic Acid-Based Diagnosis As shown in the Examples below, the nucleic acids of the invention can be used to detect defects associated with defects in the OB polypeptide that result in an obese phenotype. For example, a nucleic acid probe (e.g., Northern analysis or RT-PCR analysis) may have an obesity phenotype deficient in OB mRNA expression, or non-functional OB mRNA expression,
For example, it is used to determine whether it is associated with db / db mice (where the defect results from a defect in the OB receptor) or when the mutation results in non-transcribed mRNA. Moreover, the nucleic acid-based diagnostic techniques of the present invention can be used in conjunction with antibody-based techniques to further develop the molecular understanding of the obesity or anorexia phenotype.

【０２４７】近年単離されたヒトcDNAクローンが本明細
書中で示すように配列決定された。これによりヒト遺伝
子の完全な配列の決定が容易になった(図20A〜C; 配列
番号22を参照のこと)。ヒトOB遺伝子のイントロンから
のDNA配列が得られ(図20)、そしてこれらはOB遺伝子の
突然変異または対立遺伝子変異体(allelic variant)を
同定するためにヒトゲノムDNAからOB遺伝子のコード配
列をPCR増幅するためのPCRプライマーを調製するために
使用され、すべては本明細書中で上に詳細に記載したプ
ロトコールに従う。ヒトゲノムOBの増幅のための特異的
なPCRプライマーは下記の特定の実施例に記載される。A recently isolated human cDNA clone has been sequenced as set forth herein. This facilitated the determination of the complete sequence of the human gene (FIGS. 20A-C; see SEQ ID NO: 22). DNA sequences from introns of the human OB gene were obtained (Figure 20), and these were PCR amplified from human genomic DNA to identify coding or OB gene coding sequences to identify mutations or allelic variants of the OB gene. Used to prepare PCR primers, all following the protocol detailed herein above. Specific PCR primers for the amplification of the human genome OB are described in the specific examples below.

【０２４８】最新の仮説では、ob遺伝子におけるヘテロ
接合体の突然変異は軽度/中程度の肥満に関連し、一方
ホモ接合体の突然変異は肥満のためのいくつかのDNA配
列に基づいた診断的試験に関連する。これが真実であれ
ば、発症のおそれのある人々の肥満の進行についての確
認が行え、体重の増加が完全に進行する前に薬物治療お
よび/または生活様式の変化の適用が可能になる。The latest hypothesis is that heterozygous mutations in the ob gene are associated with mild / moderate obesity, while homozygous mutations are diagnostic based on several DNA sequences for obesity. Related to the test. If this is true, it will be possible to confirm the progression of obesity in at-risk individuals and to apply medications and / or lifestyle changes before weight gain has fully progressed.

【０２４９】あるいは、変異型ヒトOBとともに分離する
マイクロサテライト(microsatellite)の存在が診断に使
用され得る。（図20A〜Cに提供されるヌクレオチド配列
に基づいたプライマーを含む）種々のPCRプライマー
が、これに関して使用され得る。Alternatively, the presence of microsatellite that segregates with the mutant human OB can be used for diagnosis. A variety of PCR primers (including primers based on the nucleotide sequences provided in FIGS. 20A-C) can be used in this regard.

【０２５０】OB遺伝子はまた、特に栄養障害においてそ
のコードするRNAおよびタンパク質の測定に診断上有用
であり得る。特定の栄養障害において、OB RNAおよび/
またはそれにコードされるタンパク質が調節されていな
いかまたは負の調節がなされているかを知ることは重要
である。それゆえ、肥満型の人がOBレベルの増加を有す
る場合は、問題はOBの下流にありそうであり、一方OBが
減少していれば、OBの不適切に低いレベルが肥満の原因
であり得る(欠陥がOB遺伝子内であるか否かにかかわら
ず)。逆に、体重を落とした癌またはAIDSの患者が上昇
したレベルのOBを有する場合は、不適切に高いOBの発現
が体重低下の原因であると結論され得る。The OB gene may also be diagnostically useful for measuring its encoding RNA and protein, especially in nutritional disorders. In certain nutritional disorders, OB RNA and / or
Or it is important to know whether the protein encoded by it is unregulated or negatively regulated. Therefore, if an obese person has an increased OB level, the problem is likely downstream of the OB, whereas if the OB is decreasing, an inappropriately low level of the OB is responsible for obesity (Whether the defect is in the OB gene or not). Conversely, if patients with weight loss cancer or AIDS have elevated levels of OB, it can be concluded that inappropriately high OB expression is responsible for weight loss.

【０２５１】クローン化されたヒトcDNAはヒトOB RNAの
レベルの測定に使用される。さらに、組換えヒトタンパ
ク質は調製され、そしてOBタンパク質の脂肪およびおそ
らく血漿レベルの測定を可能にするイムノアッセイの開
発に使用される。[0251] The cloned human cDNA is used to measure the level of human OB RNA. In addition, recombinant human proteins are prepared and used to develop immunoassays that allow the measurement of fat and possibly plasma levels of OB protein.

【０２５２】治療用途 本発明のポリペプチド、核酸、および抗体は顕著な治療
能力を有する。 Therapeutic Uses The polypeptides, nucleic acids, and antibodies of the present invention have significant therapeutic potential.

【０２５３】好ましくは、このような試薬の治療有効量
を、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形
剤中で投与する。Preferably, a therapeutically effective amount of such a reagent is administered in a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient.

【０２５４】用語「薬学的に受容可能な」は、ヒトに投
与する場合、生理学的に許容可能であり、代表的にはア
レルギーまたは同様の厄介な反応(例えば、胃の不調、
めまいなど)を起こさない分子の実体および組成物を意
味する。好ましくは、本明細書で用いる場合、用語「薬
学的に受容可能な」は、動物における、そしてさらに特
定すればヒトにおける使用のために、連邦または州政府
の規制局により認可されていること、もしくは米国薬局
方(U.S. Pharmacopeia)、または他の一般に認められた
薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリ
ア」は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバン
ト、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような薬
学的なキャリアは、水、および油などの滅菌した液体で
あり得、これらは、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油
などのような石油、動物、植物、または合成起源の液体
を含む。好ましくは、水、または生理食塩水およびデキ
ストロース水溶液およびグリセロール溶液が、キャリア
として、特に注射液として使用される。適切な薬学的キ
ャリアは、Martin, Remington's Pharmaceutical Scien
s, 第18版、Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990)
に記載されている。The term “pharmaceutically acceptable” is physiologically acceptable when administered to humans, and is typically associated with allergic or similar untoward reactions (eg gastric upset,
Molecules that do not cause dizziness). Preferably, as used herein, the term "pharmaceutically acceptable" is approved by the Federal or State regulatory agencies for use in animals, and more particularly in humans; Or means listed in the United States Pharmacopeia, or other generally accepted pharmacopeias. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the compound is administered. Such pharmaceutical carriers can be water and sterile liquids, such as oils, which can be liquids of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Including. Preferably, water or saline and aqueous dextrose and glycerol solutions are used as carriers, particularly for injection. Suitable pharmaceutical carriers are Martin, Remington's Pharmaceutical Scien
s, 18th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990)
It is described in.

【０２５５】本明細書中で用いられる用語「治療有効
量」は、宿主の活性、機能、および応答において、臨床
的に重篤な欠陥を少なくとも約15％、好ましくは少なく
とも50％、さらに好ましくは少なくとも90％減少するた
めに、そして最も好ましくは予防するに十分な量を意味
する。あるいは、治療有効量は、宿主の、臨床的に重篤
な症状を改善するに十分である。As used herein, the term “therapeutically effective amount” refers to at least about 15%, preferably at least 50%, more preferably at least about 15% of clinically serious defects in host activity, function, and response. By an amount sufficient to reduce by at least 90%, and most preferably to prevent. Alternatively, a therapeutically effective amount is sufficient to ameliorate a clinically severe condition in the host.

【０２５６】組換えOBポリペプチドの投与は、体重減
少、特に脂肪組織の減少をもたらす。本明細書で先に全
てを詳細に記述したように、OBポリペプチドは、標準
の、細菌および／または哺乳動物発現ベクターを用い
て、合成的に、調製され得、または血漿または血清から
精製され得る。あるいは、天然OBポリペプチドの増加し
た発現が、上記のように相同組換え技術により誘導され
得る。[0256] Administration of the recombinant OB polypeptide results in weight loss, particularly in adipose tissue. As described in detail herein above, the OB polypeptide can be prepared synthetically, or purified from plasma or serum, using standard, bacterial and / or mammalian expression vectors. obtain. Alternatively, increased expression of a native OB polypeptide can be induced by homologous recombination techniques as described above.

【０２５７】OBポリペプチド活性の減少(アンタゴニス
ト、インヒビター、中和抗体の使用、またはアンチセン
ス分子を開発することによる)は、癌、AIDS、または神
経性食欲不振にともなう体重減少の処置が望まれる場
合、体重増加の結果を生じる。OB活性の調整は、体重の
減少(その活性を増加することによる)または体重の増加
(その活性を減少することによる)に有用であり得る。Reduction of OB polypeptide activity (by use of antagonists, inhibitors, neutralizing antibodies, or by developing antisense molecules) is desirable in treating weight loss associated with cancer, AIDS, or anorexia nervosa. If so, this results in weight gain. Modulation of OB activity can mean weight loss (by increasing its activity) or weight gain
(By reducing its activity).

【０２５８】ポリペプチドを基礎にした治療処置 最も単純な分析では、OB遺伝子は、哺乳動物、特にマウ
スおよびヒトで体重を決定する。OB遺伝子産物および対
応して同種の分子は、脂肪組織が脳および他の器官と連
絡するシグナル経路の一部分であるようである。OBポリ
ペプチドはそれ自身がシグナル分子、すなわちホルモン
であると考えられている。Polypeptide-Based Therapeutic Treatment In the simplest analysis, the OB gene determines body weight in mammals, especially mice and humans. The OB gene product and correspondingly homologous molecules appear to be part of the signaling pathway that connects adipose tissue to the brain and other organs. OB polypeptides are themselves considered to be signal molecules, ie hormones.

【０２５９】OBポリペプチド、または機能的に活性なそ
の断片、またはそのアンタゴニストは、経口または非経
口、好ましくは非経口的に投与され得る。なぜなら、代
謝恒常性は連続的なプロセスであり、OBポリペプチドの
制御された放出投与が好ましいからである。例えば、ポ
リペプチドは、静脈内注入、移植性浸透圧ポンプ、経皮
パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて投与
され得る。１つの実施態様では、ポンプが用いられ得る
[Langerら編、Medical Applications of Controlled Re
lease, CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974); Sefto
n, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buc
hwaldら、Surgery, 88:507 (1980); Saudekら、N. Eng
l. J. Med., 321:574 (1989)]。別の実施態様では、ポ
リマー材料が用いられ得る[Langer、1974、前出; Sefto
n, 1987、前出; Smolenら編、Controlled Drug Bioavai
lability, Drug Product Design and Performance, Wil
ey,New York (1984); Rangerら、J. Macromol. Sci. Re
v. Macromol. Chem., 23:61(1983); 以下も参照のこ
と、Levyら、Science, 228:190 (1985); Duringら、An
n. Neurol., 25:351 (1989); Howardら、J. Neurosur
g., 71:105 (1989)]。さらに別の実施態様では、制御さ
れた放出系は治療標的(すなわち、脳)に近接して配置さ
れ得、従って、全身投与量の一画分のみを必要とする
[例えば、Goodson, Medical Applications of Controll
ed Release, 第２巻、115-138頁(1984)参照]。他の制御
放出系は、 Langer、Science, 249:1527-1533(1990)に
よる総説で述べられている。別の実施態様では、治療用
化合物は、小胞、特にリポソームを用いて送達され得る
(Langer、1990 前出,を参照); Treatら、Liposomes in
the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lope
z-BeresteinおよびFidler(編)、Liss, New York, 353-3
65頁(1989); Lopez-Berestein,同書 、317-327頁;一般
に同書を参照)。An OB polypeptide, or a functionally active fragment thereof, or an antagonist thereof, may be administered orally or parenterally, preferably parenterally. Because metabolic homeostasis is a continuous process, controlled release administration of the OB polypeptide is preferred. For example, polypeptides can be administered using intravenous infusion, implantable osmotic pumps, transdermal patches, liposomes, or other modes of administration. In one embodiment, a pump may be used
[Edited by Langer et al., Medical Applications of Controlled Re
lease, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Sefto
n, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987); Buc
hwald et al., Surgery, 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Eng.
l. J. Med., 321: 574 (1989)]. In another embodiment, a polymeric material may be used [Langer, 1974, supra; Sefto
n, 1987, supra; edited by Smolen et al., Controlled Drug Bioavai.
lability, Drug Product Design and Performance, Wil
ey, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Re.
v. Macromol. Chem., 23:61 (1983); see also, Levy et al., Science, 228: 190 (1985); During et al., An.
n. Neurol., 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosur.
g., 71: 105 (1989)]. In yet another embodiment, the controlled release system can be placed in close proximity to the therapeutic target (i.e., the brain), and thus requires only a fraction of the systemic dose
[For example, Goodson, Medical Applications of Controll
ed Release, Vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. Other controlled release systems are described in the review by Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990). In another embodiment, the therapeutic compound may be delivered using vesicles, especially liposomes
(See Langer, 1990 supra); Treat et al., Liposomes in
the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lope
z-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, 353-3
65 (1989); Lopez-Berestein, ibid., Pp. 317-327; see generally ibid).

【０２６０】さらなる局面において、OB遺伝子でトラン
スフォームされた組換え細胞および高レベルのポリペプ
チドを発現する細胞は、OBポリペプチドを必要とする被
験体に移植され得る。好ましくは、拒絶を避けるため
に、OBでトランスフォームされた自己の細胞が移植され
る；あるいは、免疫認識および拒絶を防ぐポリマーマト
リックス内に、可溶性因子を生産する非自己の細胞を防
御する技術が有用である。In a further aspect, recombinant cells transformed with the OB gene and cells expressing high levels of the polypeptide can be transplanted into a subject in need of the OB polypeptide. Preferably, autologous cells transformed with the OB are transplanted to avoid rejection; or techniques to protect non-autologous cells that produce soluble factors within a polymer matrix that prevents immune recognition and rejection. Useful.

【０２６１】OBポリペプチドは、静脈内、動脈内、腹腔
内、筋肉内、または皮下経路の投与により送達され得
る。あるいは、OBポリペプチドは、適切に製剤化され、
鼻腔または経口投与により投与され得る。OBの一定供給
は、必要な間隔で、例えば、毎日、12時間毎に、治療有
効投与量(すなわち、被験体において代謝変化を誘導す
るために有効な投与量)を提供することにより確保され
得る。これらのパラメーターは、処置されている病状の
重篤度、他の作用(例えば、補充されている食餌改変)、
被験体の体重、年齢、および性別、ならびに他の基準に
依存するが、それらは、当業者による標準の良好な医療
の実践に従って容易に決定され得る。The OB polypeptides can be delivered by intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, or subcutaneous routes of administration. Alternatively, the OB polypeptide is appropriately formulated and
It can be administered by nasal or oral administration. A constant supply of OB can be ensured by providing a therapeutically effective dose (i.e., an effective dose to induce metabolic changes in a subject) at the required intervals, e.g., every 12 hours. . These parameters may include the severity of the condition being treated, other effects (e.g., dietary modification being supplemented),
Depending on the subject's weight, age, and gender, as well as other criteria, they can be readily determined according to standard good medical practice by those skilled in the art.

【０２６２】薬学的組成物 本発明のさらに別の実施態様では、上記の薬学的組成物
が提供される。このような薬学的組成物は、注射用、ま
たは経口、肺、鼻腔用の投与、または他の形態の投与用
であり得る。一般に、薬学的に受容可能な希釈剤、保存
剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または
キャリアとともに、本発明の有効量のタンパク質または
誘導体産物を含有する薬学的組成物が、本発明に包含さ
れる。このような組成物は、種々の緩衝液成分(例え
ば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pH、イオン強度の
希釈物；デタージェントおよび可溶化剤のような添加物
(例えば、Tween 80、Polysorbate 80)、抗酸化剤(例え
ば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存
剤(例えば、Thimersol、ベンジルアルコール)、および
増量物質(例えば、ラクトース、マンニトール)を含み；
ポリマー化合物(例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸
など)の粒子状調製物中またはリポソーム中への材料の
取り込みを含む。ヒラウロン酸(hylauronic acid)もま
た用いられ得る。このような組成物は、身体の状態、安
定性、インビボ放出速度、および本タンパク質および誘
導体のインビボクリアランス速度に影響し得る。例え
ば、本明細書中に参考として援用されるMartin, Reming
ton's Pharmaceutical Sciences, 第18版、(1990、Mack
Publishing Co., Easton, PA 18042)1435-1712頁を参
照。組成物は、液体形態で調製され得るか、または凍結
乾燥形態のような乾燥粉末であり得る。Pharmaceutical Compositions In yet another embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition as described above. Such pharmaceutical compositions may be for injection, or for oral, pulmonary, nasal or other forms of administration. Generally, a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a protein or derivative product of the present invention, together with a pharmaceutically acceptable diluent, preservative, solubilizer, emulsifier, adjuvant, and / or carrier, is used in the present invention. Included. Such compositions include various buffer components (eg, Tris-HCl, acetate, phosphate), pH, ionic strength dilutions; additives such as detergents and solubilizers.
(Eg, Tween 80, Polysorbate 80), antioxidants (eg, ascorbic acid, sodium metabisulfite), preservatives (eg, Thimersol, benzyl alcohol), and bulking substances (eg, lactose, mannitol);
Includes incorporation of the material into particulate preparations of polymeric compounds (eg, polylactic acid, polyglycolic acid, etc.) or into liposomes. Hylauronic acid may also be used. Such compositions may affect the state of the body, stability, rate of in vivo release, and rate of in vivo clearance of the proteins and derivatives. See, for example, Martin, Reming, incorporated herein by reference.
ton's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, (1990, Mack
Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712. The composition can be prepared in liquid form, or can be a dry powder, such as a lyophilized form.

【０２６３】経口送達 本明細書における使用には、参考として本明細書に援用
されるMartin, Remington's Pharmaceutical Sciences,
第18版、(1990、Mack Publishing Co. EastonPA 1804
2)の第89章に一般に記載されている経口固形投与量形態
が意図されている。固形投与形態は、タブレット、カプ
セル、ピル、トローチまたはロゼンジ、カシェ剤または
ペレットを含む。また、リポソームまたはプロテイノイ
ドカプセル化(例えば、米国特許第4,925,673号に報告さ
れているプロテイノイドマイクロスフェアのような)を
用いて、本発明の組成物を処方し得る。リポソームのカ
プセル化が用いられ得、そしてリポソームを種々のポリ
マーを用いて誘導体化し得る(例えば、米国特許第5,01
3,556号)。治療用の可能な固形投与形態の説明は、参考
として本明細書に援用されるMarshallによる、Modern P
harmrceutics, 第10章、BankerおよびRhodes編、(1979)
に記載されている。一般に、製剤は、タンパク質(また
は化学的に改変されたタンパク質)および胃の環境に対
する保護を可能とする不活性成分を含み、そして腸内に
生物学的に活性な物質を放出し得る。Oral Delivery For use herein, see Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, which is incorporated herein by reference.
Eighteenth Edition, (1990, Mack Publishing Co. Easton PA 1804
Oral solid dosage forms generally described in Chapter 89 of 2) are contemplated. Solid dosage forms include tablets, capsules, pills, troches or lozenges, cachets or pellets. Also, liposomes or proteinoid encapsulation (such as, for example, the proteinoid microspheres reported in US Pat. No. 4,925,673) can be used to formulate the compositions of the present invention. Liposomal encapsulation can be used, and liposomes can be derivatized with various polymers (see, for example, US Pat.
3,556). A description of possible solid dosage forms for treatment can be found in Modern P, by Marshall, which is incorporated herein by reference.
harmrceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes, eds. (1979)
It is described in. Generally, the formulation will contain a protein (or a chemically modified protein) and inert ingredients that allow protection for the stomach environment, and may release a biologically active substance into the intestine.

【０２６４】より特定すれば、上記の誘導体化タンパク
質の経口投与形態もまた意図される。タンパク質は化学
的に改変され得、誘導体の経口送達を有効にする。一般
に、タンパク質(またはペプチド)分子自身への少なくと
も１つの部分の付着が意図される化学的改変であり、こ
こで、この部分は、(a)タンパク質分解を阻害し得；そ
して(b)胃または腸から血流中への取り込みを可能にす
る。タンパク質の全体的な安定性の増加および体内での
循環時間の増加もまた所望される。このような部分の例
は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプ
ロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ならびにポリプロリンを含む。Ab
uchowskiら、1981、前出; Newmarkら、J. Appl. Bioche
m., 4:185-189(1982)。用いられ得る他のポリマーは、
ポリ-1,3-ジオキソランおよびポリ-1,3,6-チオキソカン
(tioxocane)である。上記に示したような薬学的用途に
は、ポリエチレングリコール部分が好ましい。More specifically, oral dosage forms of the above-described derivatized proteins are also contemplated. The protein can be chemically modified to effect oral delivery of the derivative. Generally, a chemical modification intended for attachment of at least one moiety to the protein (or peptide) molecule itself, wherein the moiety can (a) inhibit proteolysis; and (b) Allows uptake from the intestine into the bloodstream. It is also desirable to increase the overall stability of the protein and increase circulation time in the body. Examples of such moieties include polyethylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, and polyproline. Ab
uchowski et al., 1981, supra; Newmark et al., J. Appl. Bioche.
m., 4: 185-189 (1982). Other polymers that can be used are
Poly-1,3-dioxolane and poly-1,3,6-thioxocan
(tioxocane). For pharmaceutical uses as indicated above, polyethylene glycol moieties are preferred.

【０２６５】タンパク質(または誘導体)の放出場所は、
胃、小腸(十二指腸、空腸、または回腸)、または大腸で
あり得る。当業者は、胃で溶解せず、十二指腸または腸
の他の場所で物質を放出する入手可能な製剤を有する。
好ましくは、放出は、タンパク質(または誘導体)の保護
により、もしくは胃の環境を越えて、例えば腸における
生物学的に活性な物質の放出によるのいずれかにより胃
環境の有害な影響を避ける。The place of release of the protein (or derivative)
It can be the stomach, small intestine (duodenum, jejunum, or ileum), or large intestine. One skilled in the art has available formulations that do not dissolve in the stomach and release the substance in the duodenum or elsewhere in the intestine.
Preferably, the release avoids the deleterious effects of the gastric environment either by protection of the protein (or derivative) or beyond the gastric environment, for example by the release of biologically active substances in the intestine.

【０２６６】胃腸管における耐性を十分に確実にするた
めに、少なくともpH5.0までは不浸透性であるコーティ
ングが必須である。腸溶コーテイング剤として用いられ
る、より一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテ
ートトリメリテート(CAT)、ヒドロキシプロピルメチル
セルロースフタレート(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、ポ
リビニルアセテートフタレート(PVAP)、Eudragit L30
D、Aquateric、セルロースアセテートフタレート(CA
P)、 Eudragit L、 Eudragit S、およびShellacであ
る。これらのコーティング剤は混合フィルムとして用い
られ得る。In order to ensure sufficient resistance in the gastrointestinal tract, a coating that is impermeable at least up to pH 5.0 is essential. Examples of more common inert ingredients used as enteric coatings include cellulose acetate trimellitate (CAT), hydroxypropyl methylcellulose phthalate (HPMCP), HPMCP50, HPMCP55, polyvinyl acetate phthalate (PVAP), Eudragit L30
D, Aquateric, cellulose acetate phthalate (CA
P), Eudragit L, Eudragit S, and Shellac. These coatings can be used as mixed films.

【０２６７】コーティングまたはコーティング混合物は
また、胃に対する保護を意図しないで、タブレット上で
用いられ得る。これは、糖コーティング、またはタブレ
ットを飲み込み易くするコーティングを含み得る。カプ
セルは乾燥治療剤、すなわち、粉末の送達には硬い殻
(例えば、ゼラチン)からなり；液体形態には、柔軟なゼ
ラチン殻が用いられ得る。カシェ剤の殻材料は厚いデン
プンまたは他の食用紙であり得る。ピル、ロゼンジ、成
形タブレットまたはタブレット粉薬には、湿潤塊状化技
術が用いられ得る。The coating or coating mixture can also be used on tablets, without intending to protect the stomach. This may include a sugar coating, or a coating that makes the tablet easier to swallow. Capsules are dry therapeutic, i.e. hard shell for powder delivery
(Eg, gelatin); for liquid forms, soft gelatin shells may be used. The shell material for the cachet can be thick starch or other edible paper. For pills, lozenges, molded tablets or tablet powders, a moist bulking technique can be used.

【０２６８】治療剤は、粒子サイズ約1mmの顆粒または
ペレットの形態で微細な複数粒子として製剤に含まれ得
る。カプセル投与のための物質の製剤はまた、粉末、軽
く圧縮されたプラグ、またはタブレットであり得る。治
療剤は圧縮により調製され得る。The therapeutic agent can be included in the formulation as fine multiple particles in the form of granules or pellets having a particle size of about 1 mm. The formulation of the substance for capsule administration may also be a powder, lightly compressed plug, or tablet. The therapeutic can be prepared by compression.

【０２６９】着色料および香料もすべてに含有され得
る。例えば、タンパク質(または誘導体)(例えば、リポ
ソームまたはマイクロスフェアのカプセル化により)は
処方され得、次いで、食品、例えば、着色料および香料
を含有する冷却飲料中にさらに含有され得る。Colorants and perfumes may all be included. For example, the protein (or derivative) (eg, by encapsulation of liposomes or microspheres) can be formulated and then further included in a food product, such as a chilled beverage containing coloring and flavoring.

【０２７０】不活性物質を用いて治療剤の容量を希釈ま
たは増加し得る。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマ
ンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロ
ース、スクロース、改変デキストランおよびデンプンを
含み得る。特定の無機塩もまた、カルシウム三リン酸、
炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含有する充
填剤として用いられ得る。いくつかの市販の希釈剤は、
Fast-Flo、Emdex、STARx 1500、Emcompress、およびAvi
cellである。An inert substance can be used to dilute or increase the volume of the therapeutic. These diluents may include carbohydrates, especially mannitol, α-lactose, anhydrous lactose, cellulose, sucrose, modified dextrans and starch. Certain inorganic salts also include calcium triphosphate,
It can be used as a filler containing magnesium carbonate and sodium chloride. Some commercially available diluents are
Fast-Flo, Emdex, STARx 1500, Emcompress, and Avi
cell.

【０２７１】崩壊剤が、固形投与形態の治療剤の製剤中
に含まれ得る。崩壊剤として使用される物質は、デンプ
ン、Explotabに基づく市販の崩壊剤を含むデンプンを包
含するが、これに限定されない。デンプングリコール酸
ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、ウルトラアミロペクチン(ultramylopecti
n)、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ皮、酸
性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベ
ントナイトも全て用いられ得る。崩壊剤の別の形態は、
不溶性カチオン交換樹脂である。粉末化ゴムは崩壊剤お
よび結合剤として用いられ得、そしてこれらは寒天、Ka
raya、またはトラガカントゴムのような粉末化ゴムを含
み得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩
壊剤として有用である。Disintegrants may be included in the formulation of the therapeutic into solid dosage form. Materials used as disintegrants include, but are not limited to, starch, including the commercial disintegrant based on Explotab. Sodium starch glycolate, Amberlite, sodium carboxymethylcellulose, ultramylopecti
n), sodium alginate, gelatin, orange peel, acidic carboxymethylcellulose, natural sponges and bentonite can all be used. Another form of disintegrant is
It is an insoluble cation exchange resin. Powdered rubber can be used as a disintegrant and binder, and these are agar, Ka
It may include powdered rubber such as raya or tragacanth rubber. Alginic acid and its sodium salt are also useful as disintegrants.

【０２７２】結合剤を用いて、治療剤を一緒に保持し硬
いタブレットを形成し得、そして結合剤には、アラビア
ゴム、トラガカントゴム、デンプン、およびゼラチンの
ような天然物由来の物質が含まれる。その他には、メチ
ルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、およびカル
ボキシメチルセルロース(CMC)が含まれる。ポリビニル
ピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセル
ロース(HPMC)は、ともにアルコール溶液中で使用し得、
治療剤を顆粒化し得る。The binders can be used to hold the therapeutic agent together to form a hard tablet, and binders include materials derived from natural sources, such as acacia, tragacanth, starch, and gelatin. Others include methylcellulose (MC), ethylcellulose (EC), and carboxymethylcellulose (CMC). Polyvinyl pyrrolidone (PVP) and hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) can both be used in alcoholic solutions,
The therapeutic agent may be granulated.

【０２７３】減摩剤が治療剤の製剤に含まれ得、製剤プ
ロセスの間、粘着を妨ぐ。潤滑剤が治療剤と型版の壁の
間の層として使用され得、そしてそれらは、ステアリン
酸マグネシウムおよびステアリン酸カルシウムを含むス
テアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、液体
パラフィン、植物油、およびワックスを含み得るが、そ
れらに限定されない。可溶性潤滑剤がまた使用され得、
これには、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグ
ネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、お
よびCarbowax 4000および6000が含まれる。A lubricant may be included in the formulation of the therapeutic agent to prevent sticking during the formulation process. Lubricants can be used as a layer between the therapeutic agent and the mold wall, and they include stearic acid, including magnesium stearate and calcium stearate, polytetrafluoroethylene (PTFE), liquid paraffin, vegetable oils, and waxes. May include, but is not limited to. Soluble lubricants can also be used,
This includes sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, polyethylene glycols of various molecular weights, and Carbowax 4000 and 6000.

【０２７４】製剤の間の薬剤の流動特性を改良し、そし
て圧縮の間の転位を補助するために滑材を添加し得る。
滑材は、デンプン、タルク、火成シリカ、およびシリコ
アルミネート水和物を含み得る。[0274] Lubricants may be added to improve the flow properties of the drug during formulation and to assist in translocation during compression.
Lubricants may include starch, talc, fumed silica, and silicoaluminate hydrate.

【０２７５】水溶性環境への治療剤の溶解を補助するた
めに、界面活性剤を湿潤剤として添加し得る。界面活性
剤は、アニオン性デタージェント、例えば、ラウリル硫
酸ナトリウム、ジオクチルスルホスクシネートナトリウ
ム、およびジオクチルスルホン酸ナトリウムを含み得
る。カチオン性デタージェントが用いられ得、そして塩
化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウムを含み得
る。界面活性剤として製剤中に含まれ得る可能な非イオ
ン性デタージェントを列挙すれば、ラウロマクロゴール
400、ポリオキシル40ステアレート、ポリオキシエチレ
ン硬化ひまし油10、50、および60、グリセロールモノス
テアレート、ポリソルベート40、60、65および80、スク
ロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカル
ボキシメチルセルロースを含み得る。これらの界面活性
剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に、単独または
異なる割合の混合物としてのいずれかで存在し得る。A surfactant may be added as a wetting agent to assist in dissolving the therapeutic in an aqueous environment. Surfactants can include anionic detergents such as sodium lauryl sulfate, sodium dioctyl sulfosuccinate, and sodium dioctyl sulfonate. Cationic detergents may be used and may include benzalkonium chloride or benzethium chloride. Listing the possible non-ionic detergents that can be included in the formulation as surfactants is lauromacrogol
400, polyoxyl 40 stearate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50, and 60, glycerol monostearate, polysorbates 40, 60, 65, and 80, sucrose fatty acid esters, methyl cellulose, and carboxymethyl cellulose. These surfactants can be present in the formulation of the protein or derivative, either alone or as a mixture in different proportions.

【０２７６】潜在的にタンパク質(または誘導体)の取り
込みを促進する混合剤は、例えば、脂肪酸、オレイン
酸、リノール酸、およびリノレン酸である。Mixtures that potentially promote the uptake of proteins (or derivatives) are, for example, fatty acids, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid.

【０２７７】制御放出製剤が所望され得る。薬剤は、拡
散または浸出メカニズム(すなわちゴム)のいずれかによ
り放出を許容する不活性なマトリックス中に取り込まれ
得る。ゆっくりと変性するマトリックスもまた処方剤に
取り込まれ得る。この治療剤の制御放出の他の形態は、
Oros治療系(Alza Corp.)に基づく方法により、換言すれ
ば、薬剤が半透膜に包まれている。半透膜は、浸透性効
果に起因して、単一な小さな開口部を通じて水を入れ、
そして薬剤を押し出させる。いくつかの腸溶コーティン
グがまた、遅延放出効果を有する。A controlled release formulation may be desired. The drug can be incorporated into an inert matrix that permits release by either diffusion or leaching mechanisms (ie, rubber). Slowly denaturing matrices can also be incorporated into the formulation. Another form of controlled release of this therapeutic agent is
By methods based on the Oros therapeutic system (Alza Corp.), in other words, the drug is encapsulated in a semipermeable membrane. The semipermeable membrane allows water to enter through a single small opening, due to the osmotic effect,
Then, the medicine is pushed out. Some enteric coatings also have a delayed release effect.

【０２７８】他のコーティングを製剤に用い得る。これ
らは、コーティングパンで付加し得る種々の糖を含む。
治療剤はまた、フィルムでコートされたタブレットであ
り得；この例で用られる物質は、２つのグループに分け
られる。第１のグループは、非腸溶性物質であり、メチ
ルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、カルボキシナトリウム-メチルセルロース、
プロビドン、およびポリエチレングリコールを含む。第
２のグループは、一般にフタル酸のエステルである腸溶
性物質からなる。Other coatings may be used in the formulation. These include various sugars that can be added in a coating pan.
The therapeutic agent can also be a tablet coated with a film; the substances used in this example fall into two groups. The first group is non-enteric substances, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, methylhydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxy-methylcellulose,
Including providone, and polyethylene glycol. The second group consists of enteric substances, generally esters of phthalic acid.

【０２７９】物質の混合物を用いて、最適なフィルムコ
ーティングを提供し得る。フィルムコーティングは、コ
ーティング機または流動床でまたは圧縮コーティングに
より実施され得る。A mixture of materials can be used to provide an optimal film coating. Film coating may be performed on a coating machine or fluidized bed or by compression coating.

【０２８０】肺送達 本発明のタンパク質(またはその誘導体)の肺送達もまた
本明細書中で意図される。タンパク質(または誘導体)
は、吸入する間に哺乳動物の肺に送達され、そして血流
に沿って肺の上皮を横切って移動する。このことを示す
他の報告は、以下を含む：Adjeiら、Pharmaceutical Re
search, 7(6):565-569 (1990); Adjeiら、Internationa
l Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990)（酢
酸ロイプロレリン）; Braquetら、Journal of Cardiova
scular Pharmacology, 13(同上 5):143-146 (1989)（エ
ンドセリン-1）; Hubbardら、Annals of Internal Medi
cine, 3(3):206-212 (1989)（α1-アンチトリプシン）;
Smithら、J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989)
（α1-プロテイナーゼ）; Osweinら、"Aerosolization
of Proteins", Proceedings of Symposium on Respirat
ory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (March 1
990)（組換えヒト成長ホルモン）; Debsら、J. Immuno
l., 140:3482-3488 (1988)およびPlatzら、米国特許第
5,284,656号（顆粒球コロニー刺激因子）。Pulmonary Delivery Pulmonary delivery of a protein (or derivative thereof) of the invention is also contemplated herein. Protein (or derivative)
Is delivered to the lungs of a mammal during inhalation and travels along the bloodstream across the lung epithelium. Other reports showing this include: Adjei et al., Pharmaceutical Re.
search, 7 (6): 565-569 (1990); Adjei et al., Internationala
l Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (1990) (leuprorelin acetate); Braquet et al., Journal of Cardiova.
scular Pharmacology, 13 (ibid.): 143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medi.
cine, 3 (3): 206-212 (1989) (α1-antitrypsin);
Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989).
(Α1-proteinase); Oswein et al., “Aerosolization
of Proteins ", Proceedings of Symposium on Respirat
ory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (March 1
990) (recombinant human growth hormone); Debs et al., J. Immuno.
l., 140: 3482-3488 (1988) and Platz et al., U.S. Pat.
No. 5,284,656 (granulocyte colony stimulating factor).

【０２８１】本発明の実施ににおける使用には、治療用
製品の肺送達に設計された広範囲の機械的デバイスが意
図され、その全てが当業者によく知られたネブライザ
ー、投与量測定吸入器、および粉末吸入器を含むがこれ
らに限定されない。For use in the practice of the present invention, a wide range of mechanical devices designed for pulmonary delivery of therapeutic products are contemplated, all of which are nebulizers, dose-measuring inhalers, well known to those skilled in the art. And powder inhalers, but are not limited thereto.

【０２８２】本発明の実施に適切な市販されているデバ
イスのいくつかの特定の例は、Mallinckrodt, Inc.、S
t. Louis, Missouriにより製造されるUltraventネブラ
イザー；Marquest Medical Products, Englewood, Colo
radoにより製造されるAcornIIネブライザー；Glaxo In
c.、Research Triangle Park, North Carolinaにより製
造されるVentolin投与量測定吸入器；およびFisons Cor
p.、Bedford, Massachusettsにより製造されるSpinhale
r粉末吸入器である。Some specific examples of commercially available devices suitable for practicing the present invention are described in Mallinckrodt, Inc., S.
Ultravent nebulizer manufactured by t. Louis, Missouri; Marquest Medical Products, Englewood, Colo
AcornII nebulizer manufactured by rado; Glaxo In
c., a Ventolin dose measuring inhaler manufactured by Research Triangle Park, North Carolina; and Fisons Cor
p., Spinhale manufactured by Bedford, Massachusetts
r It is a powder inhaler.

【０２８３】このようなデバイス全ては、タンパク質
(または誘導体)の調剤に適した製剤の使用を必要とす
る。代表的には、各製剤は、使用したデバイスのタイプ
に特異的であり、そして治療に有用な通常の希釈剤、ア
ジュバント、および/またはキャリアに加えて適切な推
進剤の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカ
プセルまたはマイクロスフェア、封入複合体、または他
のタイプのキャリアの使用が意図される。化学的に改変
されたタンパク質もまた、化学的改変のタイプまたは使
用するデバイスのタイプに依存して異なる製剤中で調製
され得る。[0283] All of these devices use protein
(Or a derivative). Typically, each formulation is specific to the type of device used, and may include the use of suitable propellants in addition to the therapeutically useful diluents, adjuvants, and / or carriers. Also, the use of liposomes, microcapsules or microspheres, inclusion complexes, or other types of carriers is contemplated. Chemically modified proteins can also be prepared in different formulations depending on the type of chemical modification or the type of device used.

【０２８４】ジェットまたは超音波のいずれかのネブラ
イザーでの使用に適した製剤は、代表的には、溶液１ml
につき約0.1〜25mgの生物学的に活性なタンパク質の濃
度で水に溶解されたタンパク質(または誘導体)を含む。
製剤はまた、緩衝液および単糖を(例えば、タンパク質
の安定化および浸透圧の調節のために)含み得る。ネブ
ライザーの製剤はまた、界面活性剤を含み得、エアロゾ
ルの形成において、溶液の噴霧により生じるタンパク質
の表面誘導凝集を減少または妨ぎ得る。Formulations suitable for use in nebulizers, either jet or ultrasonic, typically contain 1 ml of solution
Contains protein (or derivative) dissolved in water at a concentration of about 0.1 to 25 mg of biologically active protein.
The formulation may also include a buffer and a simple sugar (eg, for protein stabilization and regulation of osmotic pressure). Nebulizer formulations may also include surfactants, which may reduce or prevent the surface-induced aggregation of proteins caused by spraying of the solution in the formation of an aerosol.

【０２８５】投与量測定吸入デバイスで用いる製剤は、
一般に、界面活性剤の助けで、推進剤中に懸濁されるタ
ンパク質(または誘導体)を含有する、微細に分けられた
粉末を含む。この推進剤は、この目的のために用いられ
る任意の従来物質であり得、例えば、クロロフルオロカ
ーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオ
ロカーボン、または炭化水素(トリクロロフルオロメタ
ン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオ
ロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタンを
含む)、またはそれらの組合せを含む。適切な界面活性
剤は、ソルビタントリオレートおよび大豆レシチンを含
む。オレイン酸もまた界面活性剤として有用であり得
る。The formulations used in the dosimetry inhalation device are:
Generally, it includes a finely divided powder containing the protein (or derivative) suspended in a propellant with the aid of a surfactant. The propellant can be any conventional material used for this purpose, such as chlorofluorocarbons, hydrochlorofluorocarbons, hydrofluorocarbons, or hydrocarbons (trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethanol, and 1,1,1,2-tetrafluoroethane), or combinations thereof. Suitable surfactants include sorbitan triolate and soy lecithin. Oleic acid may also be useful as a surfactant.

【０２８６】粉末吸入デバイスから調剤される製剤は、
タンパク質(または誘導体)を含有する、微細に分けられ
た乾燥粉末を含み、そしてまた、増量剤、例えば、デバ
イスからの粉末の散布を促進する量のラクトース、ソル
ビトール、スクロース、またはマンニトールを、例え
ば、製剤の50〜90重量％で含む。タンパク質(または誘
導体)は、肺末端に最も効率的に送達するために、10μm
(またはミクロン)以下の、最も好ましくは0.5〜5μmの
平均粒子サイズで粒子形態で最も有利に調製され得る。The formulations prepared from powder inhalation devices include:
Includes a finely divided dry powder containing the protein (or derivative) and also includes a bulking agent, such as lactose, sorbitol, sucrose, or mannitol, in an amount that facilitates distribution of the powder from the device, e.g., Contains 50-90% by weight of the formulation. The protein (or derivative) should be 10 μm for most efficient delivery to the lung end.
It can be most advantageously prepared in particle form with an average particle size of less than (or micron), most preferably 0.5-5 μm.

【０２８７】鼻腔送達 タンパク質(または誘導体)の鼻腔送達もまた意図され
る。鼻腔送達は、鼻に治療製品を投与した後、肺におけ
る製品の沈着を必要とせずに、直接的に、血流へのタン
パク質輸送を可能にする。鼻腔送達のための製剤は、デ
キストランまたはサイクロデキストランともにこれらを
含む。Nasal Delivery Nasal delivery of proteins (or derivatives) is also contemplated. Nasal delivery allows for the transport of proteins into the bloodstream directly after administration of the therapeutic product to the nose, without requiring deposition of the product in the lungs. Formulations for nasal delivery include these together with dextran or cyclodextran.

【０２８８】処置方法、薬物の調製法 本発明のさらに他の局面では、処置方法および薬物の製
造方法が提供される。本発明の誘導体の投与による緩和
または調整される症状は、上記の症状である。Treatment Method and Method for Preparing Drug In still another aspect of the present invention, a method for treatment and a method for producing a drug are provided. Symptoms which are alleviated or adjusted by administration of the derivative of the present invention are those mentioned above.

【０２８９】投与量 上記の分子の全てについて、さらなる研究が行われ、種
々の患者における種々の症状の処置に対する適切な投与
量レベルについての情報が増え、そして受容体の治療情
況、年齢、および全身的な健康を考慮する当業者は、適
切な投与量を確かめる。一般に、注射または注入につい
て、投与量は、0.01μgの生物学的活性タンパク質/kg体
重(化学的改変のないタンパク質のみの量を計算)と10mg
/kg(同様に基づく)との間である。投与量スケジュール
は、用いるタンパク質または誘導体の循環半減期、ポリ
ペプチドがボーラス投与量または連続注入により送達さ
れるかどうか、および用いる製剤に依存して変化し得
る。Dosage Further studies on all of the above molecules have been performed to increase information on appropriate dosage levels for treatment of various conditions in various patients, and to assess the therapeutic context, age, and systemic status of the receptor. Those of skill in the art, considering their overall health, will determine the appropriate dosage. Generally, for injections or infusions, the dosage is 0.01 μg of biologically active protein / kg body weight (calculated protein-only amount without chemical modification) and 10 mg
/ kg (based on the same). Dosage schedules can vary depending on the circulating half-life of the protein or derivative used, whether the polypeptide is delivered by bolus dose or continuous infusion, and the formulation used.

【０２９０】他の化合物との投与 肥満症に関連した治療に対しては、本発明のタンパク質
(または誘導体)を、肥満症の他の医療合併症を処置する
ために用いられる1つまたはそれ以上の薬学的組成物、
例えば、糖尿病(例えば、インスリン)、高血圧、高コレ
ステロール、および肥満症に付随する他の有害な症状の
処置に用いられる薬学的組成物とともに投与し得る。ま
た、他の食欲抑制剤、例えばアンフェタミンが、ともに
投与され得る。投与は同時であり得る(例えば、本発明
のタンパク質およびインスリンの混合物の投与)か、ま
たは逐次であり得る。Administration with Other Compounds For treatments related to obesity, the proteins of the present invention
(Or derivative), one or more pharmaceutical compositions used to treat other medical complications of obesity,
For example, it can be administered with pharmaceutical compositions used to treat diabetes (eg, insulin), high blood pressure, high cholesterol, and other harmful symptoms associated with obesity. Also, other appetite suppressants, such as amphetamine, may be co-administered. Administration can be simultaneous (eg, administration of a mixture of a protein of the invention and insulin) or can be sequential.

【０２９１】核酸を基礎にした治療処置 OB遺伝子は、肥満症の遺伝子治療を開発するために、ヒ
ト脂肪細胞中に導入され得る。このような治療は、体重
を減少させると予期され得る。反対に、ヒト脂肪細胞中
へのアンチセンス構築物の導入は、活性OBポリペプチド
のレベルを減少し得、身体の脂肪症を増加すると予測さ
れ得る。Nucleic acid based therapeutic treatment The OB gene can be introduced into human adipocytes to develop gene therapy for obesity. Such treatment may be expected to reduce weight. Conversely, introduction of an antisense construct into human adipocytes can reduce the level of active OB polypeptide and be expected to increase steatosis in the body.

【０２９２】１つの実施態様では、OBポリペプチドをコ
ードしている遺伝子は、インビボでウイルスベクターで
導入される。このようなベクターは弱毒化または欠陥DN
Aウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピ
ローマウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、ア
デノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)などを含むが
これらに限定されない。完全にまたはほぼ完全にウイル
ス遺伝子を欠く欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルス
は、細胞に導入した後、感染性でない。欠陥ウイルスベ
クターの使用は、ベクターが他の細胞に感染し得ること
を考慮せずに、細胞中の特異的な局在領域に投与するこ
とが可能である。従って、脂肪組織が特異的に標的され
得る。特定のベクターの例は、欠陥ヘルペスウイルス1
(HSV1)ベクター[Kaplittら、Molec. Cell. Neurosci.,
2:320-330 (1991)]、弱毒化アデノウイルスベクター、
例えば、Stratford-Perricaudetら、J. Clin. Invest.,
90:626-630 (1992)により記載されるベクター、および
欠陥アデノ随伴ウイルスベクター[Samulskiら、J. Viro
l., 61:3096-3101 (1987); Samulskiら、J. Virol., 6
3:3822-3828 (1989)]を含むが、これらに限定されな
い。[0292] In one embodiment, the gene encoding the OB polypeptide is introduced in vivo into a viral vector. Such vectors can be attenuated or defective DN
A viruses, including, but not limited to, herpes simplex virus (HSV), papilloma virus, Epstein Barr virus (EBV), adenovirus, adeno-associated virus (AAV), and the like. Defective viruses that completely or almost completely lack viral genes are preferred. The defective virus is not infectious after introduction into the cell. The use of a defective viral vector allows for administration to a specific localized area in a cell without considering that the vector can infect other cells. Thus, adipose tissue can be specifically targeted. An example of a particular vector is defective herpesvirus 1
(HSV1) vector (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci.,
2: 320-330 (1991)], an attenuated adenovirus vector,
For example, Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest.,
90: 626-630 (1992), and defective adeno-associated virus vectors [Samulski et al., J. Viro
l., 61: 3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 6
3: 3822-3828 (1989)].

【０２９３】もう一つの実施態様では、遺伝子は、例え
ば以下に記載されるように、レトロウイルスベクターで
導入され得る：Andersonら、米国特許第5,399,346号; M
annら、Cell, 33:153(1983); Teminら、米国特許第4,65
0,764号; Teminら、米国特許第4,980,289号; Markowitz
ら、J. Virol., 62:1120(1988); Teminら、米国特許第
5,124,263号; Doughertyらによる、1995年3月16日に公
開された国際特許公開第WO95/07358号; およびKuoら、B
lood, 82:845(1993)。In another embodiment, the gene may be introduced in a retroviral vector, for example, as described below: Anderson et al., US Pat. No. 5,399,346; M
Ann et al., Cell, 33: 153 (1983); Temin et al., U.S. Patent No.
0,764; Temin et al., U.S. Patent No.4,980,289; Markowitz
J. Virol., 62: 1120 (1988); Temin et al., U.S. Pat.
5,124,263; Dougherty et al., International Patent Publication WO 95/07358, published March 16, 1995; and Kuo et al., B
lood, 82: 845 (1993).

【０２９４】あるいは、ベクターはインビボでリポフェ
クションにより導入され得る。過去10年間、インビトロ
で、核酸のカプセル化およびトランスフェクションのた
めのリポソームの使用が増加している。リポソームが介
在するトランスフェクションで遭遇する困難性および危
険性を限定するために設計された合成のカチオン性脂質
が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフ
ェクションのためのリポソームを調製するために用いら
れ得る[Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7
413-7417(1987); Mackeyら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 85:8027-8031(1988)参照]。カチオン性脂質の使用
は、負に荷電した核酸のカプセル化を促進し得、そして
負に荷電した細胞膜との融合も促進する[Felgnerら、Sc
ience, 337:387-388(1989)]。外因性遺伝子を、インビ
ボで、特定の器官に導入するためのリポフェクションの
使用は、特定の実用的な利点を有する。特定細胞へのリ
ポソームの分子標的は、１つの有益な領域である。特定
の細胞タイプをトランスフェクションすることは、細胞
の不均質性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、
および脳で特に有益であり得る。脂質は、標的の目的の
ために他の分子に化学的に結合され得る(Mackeyら、198
8、前出)。標的されたペプチド、例えば、ホルモンまた
は神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、また
は非ペプチド分子が化学的にリポソームに結合され得
る。Alternatively, the vector can be introduced in vivo by lipofection. In the past decade, the use of liposomes for nucleic acid encapsulation and transfection in vitro has increased. Synthetic cationic lipids designed to limit the difficulties and risks encountered in liposome-mediated transfection can be used to prepare liposomes for in vivo transfection of genes encoding markers [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7
413-7417 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 85: 8027-8031 (1988)]. The use of cationic lipids can facilitate the encapsulation of negatively charged nucleic acids and also promote fusion with negatively charged cell membranes [Felgner et al., Sc
ience, 337: 387-388 (1989)]. The use of lipofection to introduce exogenous genes into specific organs in vivo has certain practical advantages. Molecular targeting of liposomes to specific cells is one beneficial area. Transfecting a particular cell type can be performed in tissues with cellular heterogeneity, such as pancreas, liver, kidney,
And may be particularly beneficial in the brain. Lipids can be chemically attached to other molecules for targeting purposes (Mackey et al., 198
8, above). Targeted peptides, eg, hormones or neurotransmitters, and proteins such as antibodies, or non-peptide molecules can be chemically attached to liposomes.

【０２９５】裸のDNAプラスミドとしてインビボでベク
ターを導入することも可能である。遺伝子治療のための
裸のDNAベクターは、当該分野で公知の方法、例えば、
トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイ
クロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキ
ストラン、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、ま
たはDNAベクタートランスポーターの使用により、所望
の宿主細胞に導入され得る(例えば、Wuら、J. Biol., C
hem., 267:963-967(1992); Wuら、J. Biol., Chem., 26
3:14621-14624(1988); 1990年3月15日に出願されたHart
mutら、カナダ特許出願第2,012,311号を参照)。It is also possible to introduce the vector in vivo as a naked DNA plasmid. Naked DNA vectors for gene therapy can be obtained by methods known in the art, for example,
It can be introduced into a desired host cell by transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, use of a gene gun, or use of a DNA vector transporter (e.g., Wu et al., J. Biol., C
hem., 267: 963-967 (1992); Wu et al., J. Biol., Chem., 26.
3: 14621-14624 (1988); Hart filed on March 15, 1990
mut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311).

【０２９６】農業への応用 OB遺伝子はまた、家畜動物から単離され得、そしてそれ
によって相当するOBポリペプチドが得られ得る。下記の
特定の例では、マウスOB遺伝子由来のプローブは、多数
の種の動物由来の相当する相同性のコード配列にハイブ
リダイズする。ヒトの治療について述べられたように、
組換えタンパク質がまた調製され得、そして家畜動物に
投与され得る。ポリペプチドの投与は、より痩身型の食
用動物、例えば、ウシ、ブタ、家禽、ヒツジなどを生産
するために実行され得る。好ましくは、自己のポリペプ
チドOBポリペプチドが投与されるが、本発明はまた、抗
自己のポリペプチドの投与を意図する。OBポリペプチド
は約160のアミノ酸残基からなるので、高度に免疫原性
であり得ない。従って、非自己のポリペプチドの投与
は、免疫応答を生じ得ない。 Agricultural applications OB genes can also be isolated from domestic animals, and the corresponding OB polypeptides obtained. In the specific example below, probes from the mouse OB gene hybridize to corresponding homologous coding sequences from animals of many species. As mentioned for human treatment,
Recombinant proteins can also be prepared and administered to livestock animals. Administration of the polypeptide can be performed to produce leaner edible animals, such as cows, pigs, poultry, sheep, and the like. Preferably, an autologous polypeptide OB polypeptide is administered, but the invention also contemplates administration of an anti-self polypeptide. Since the OB polypeptide consists of about 160 amino acid residues, it cannot be highly immunogenic. Thus, administration of a non-self polypeptide cannot produce an immune response.

【０２９７】あるいは、トランスジェニック家畜動物へ
のクローン化遺伝子の導入は、OBトランスジーンの過剰
発現によるトランスジェニック家畜動物の潜在的な体重
および脂肪症の減少を可能にし得る。このことを達成す
るための最も簡単な手法は、それ自身のまたは別の脂肪
特異的なプロモーターを用いて、OBトランスジーンを脂
肪に標的することであり得る。Alternatively, introduction of the cloned gene into a transgenic livestock animal may allow for a potential reduction in the weight and steatosis of the transgenic livestock animal due to overexpression of the OB transgene. The simplest approach to accomplish this may be to target the OB transgene to fat using its own or another fat-specific promoter.

【０２９８】反対に、体脂肪の増加は、神戸牛またはフ
ォアグラをつくるための肥大肝臓の開発の目的のような
他の情況では所望される。これは、アンチセンスなOBト
ランスジーンを脂肪に標的すること、または遺伝子ノッ
クアウト技法を用いることにより達成され得た。あるい
は、体重において脂肪パーセントの増加が所望される場
合、OBポリペプチドのインヒビターまたはアンタゴニス
トが投与され得る。このようなインヒビターまたはアン
タゴニストは、ポリペプチドと反応性の抗体、およびOB
レセプターに結合するが活性化しないポリペプチドの断
片、すなわちOBポリペプチドのアンタゴニストを含む
が、それらに限定されない。Conversely, increasing body fat is desirable in other situations, such as for the purpose of developing a Kobe beef or a hypertrophic liver to make foie gras. This could be achieved by targeting the antisense OB transgene to fat or using gene knockout techniques. Alternatively, if an increase in percent fat in body weight is desired, inhibitors or antagonists of the OB polypeptide may be administered. Such inhibitors or antagonists include antibodies reactive with the polypeptide, and OB
Includes, but is not limited to, fragments of the polypeptide that bind to the receptor but do not activate, ie, antagonists of the OB polypeptide.

【０２９９】美容用途 OBポリペプチドは、健康の利益に加えて美容使用に重要
な価値を有する。特に、誘導体およびそのアゴニストア
ナログを含む本発明のOBポリペプチドが、動物の脂肪細
胞沈着の速度および量の調整に有用であるので、目ざわ
りな脂肪組織、例えば、肥満状態に必ずしも達しない
が、やはり個人の外見を損なう腹部、股関節部、腿、
首、および顎での脂肪沈着を減少するために有用であ
る。脂肪減少効果は、部分的には、食欲の減少、すなわ
ち食糧摂取の減少によるか、基礎代謝の増加によるか、
または両方により達成されると考えられている。従っ
て、本発明のOBポリペプチド、もしくはその誘導体また
はアゴニストアナログは、脂肪沈着を調整することによ
り、食欲を減少することにより、またはその両方によ
り、脂肪組織沈着において美容上の変化をもたらすため
に、被験体への投与に有用である。 Beauty Uses OB polypeptides have important value for cosmetic use in addition to health benefits. In particular, since the OB polypeptides of the invention, including derivatives and agonist analogs thereof, are useful in modulating the rate and amount of adipocyte deposition in animals, they do not necessarily reach striking adipose tissue, such as obesity, but also Abdominal, hip, thigh,
Useful for reducing fat deposition on the neck and chin. The fat-reducing effect is due, in part, to a decrease in appetite, that is, a decrease in food intake, an increase in basal metabolism,
Or both are believed to be achieved. Thus, the OB polypeptides of the invention, or derivatives or agonist analogs thereof, may provide a cosmetic change in adipose tissue deposition by modulating fat deposition, reducing appetite, or both. Useful for administration to a subject.

【０３００】さらに、本発明の組成物および方法は、脂
肪組織のパーセントを減少し、そして身体の外見を改善
するための試み得る方法の例として、種々の手順、例え
ば、身体の全体の外見を変えるために設計された美容手
術(例えば、脂肪組織を吸引または除去することにより
体重を減少するために設計された脂肪吸引(liposuctio
n)またはレーザー手術)、運動(特に、ランニングおよび
ウエートトレーニング)、低脂肪食餌、催眠、生体フィ
ードバックとともに用いられ得る。In addition, the compositions and methods of the present invention may be used to reduce the percentage of adipose tissue and improve the physical appearance of the body by various procedures, such as the overall appearance of the body. Cosmetic surgery designed to change (e.g., liposuctio designed to lose weight by aspirating or removing adipose tissue)
n) or laser surgery), exercise (particularly running and weight training), low fat diet, hypnosis, biofeedback.

【０３０１】従って、本発明は、個体において美容のた
めに脂肪組織調整を行う方法に関し、この方法は、OBポ
リペプチド、もしくは誘導体またはそのアゴニストアナ
ログの脂肪調整量を、身体全体の外見を改善するため
に、美容のために脂肪組織調整を所望する個体に投与す
る工程を包含する。特定の局面では、脂肪組織調整は食
欲抑制の結果である。好ましくは、脂肪組織調整は、脂
肪組織の減少である。Thus, the present invention relates to a method for adjusting adipose tissue in an individual for cosmetic purposes, which method improves the fat-adjusting amount of an OB polypeptide or a derivative or an agonist analog thereof to improve the appearance of the whole body. And administering to an individual who desires adipose tissue conditioning for cosmetic purposes. In certain aspects, adipose tissue adjustment is the result of appetite suppression. Preferably, the adipose tissue adjustment is a reduction in adipose tissue.

【０３０２】さらなる実施態様では、本発明は、美容の
ために脂肪組織損失を行う方法に関し、この方法は、OB
ポリペプチド、もしくは誘導体またはそのアゴニストア
ナログの脂肪調整量を、身体全体の外見を改善するため
に、美容のために脂肪組織調整を所望する個体に投与す
ることにより身体の外見を変化させるための手順を組み
合わせる工程を包含する。In a further embodiment, the present invention relates to a method of performing adipose tissue loss for cosmetics, the method comprising:
Procedure for altering the appearance of a body by administering a fat-adjusting amount of a polypeptide, or derivative or agonist analogue thereof, to an individual who desires adipose tissue conditioning for cosmetic purposes, in order to improve the appearance of the whole body Is combined.

【０３０３】OBレセプター OB因子の小分子アゴニストおよびアンタゴニストの開発
は、そのレセプターの単離により大きく促進される。こ
れは、活性なOBポリペプチドを調製しそしてそれを標準
的な方法を用いて発現ライブラリーをスクリーニングす
るために使用して達成され得る。発現ライブラリー中の
レセプターの結合は、細菌または哺乳動物発現ベクター
のいずれかを用いて調製された組換えポリペプチドを投
与する工程、および発現ライブラリーの細胞について組
換えポリペプチドの短期間および連続投与の効果を観察
する工程、または細胞へのOBポリペプチドの結合を直接
検出する工程により試験され得る。The development of small molecule agonists and antagonists of the OB receptor OB factor is greatly facilitated by the isolation of that receptor. This can be accomplished by preparing an active OB polypeptide and using it to screen an expression library using standard methods. Binding of the receptor in the expression library is accomplished by administering a recombinant polypeptide prepared using either a bacterial or mammalian expression vector, and the short-term and continuous administration of the recombinant polypeptide to cells of the expression library. One can test by observing the effect of the administration, or by directly detecting the binding of the OB polypeptide to the cells.

【０３０４】OBレセプターは、現在、視床下部およびお
そらく肝臓に局在するようであると考えられているの
で、好ましくは、これらの組織由来のcDNAライブラリー
が、標準的な発現クローニングベクター中で構築され
る。次に、これらのcDNAクローンが、プールとしてCOS
細胞に導入され得、そして得られるトランスフォーマン
トは、OBレセプターを発現するCOS細胞を同定するため
に、活性リガンドを用いてスクリーニングされ得る。次
いで、陽性のクローンが、クローン化レセプターを回収
するために単離され得る。クローン化レセプターは、OB
リガンド(それがホルモンであると仮定して)とともに用
いられ、OBの小分子モジュレーターのスクリーニングに
必要な成分を開発する。Since the OB receptor is now thought to be located in the hypothalamus and possibly in the liver, preferably, cDNA libraries from these tissues are constructed in standard expression cloning vectors. Is done. Next, these cDNA clones were pooled as COS
The cells can be introduced into cells, and the resulting transformants can be screened with an active ligand to identify COS cells that express the OB receptor. Positive clones can then be isolated to recover the cloned receptor. The cloned receptor is OB
Used in conjunction with a ligand (assuming it is a hormone) to develop the components required for screening for small molecule modulators of OB.

【０３０５】本発明に従って利用されるべき特定のアッ
セイ系は、レセプターアッセイとして公知である。レセ
プターアッセイでは、アッセイされるべき物質は、適切
に標識され、次いで、特定の細胞試験コロニーは、所定
量の標識および非標識の両物質が接種され、その後、標
識物質が細胞レセプターに結合する程度を決定するため
に結合研究が行われる。このように、物質間の親和性の
違いが確認され得る。The particular assay system to be utilized in accordance with the present invention is known as a receptor assay. In a receptor assay, the substance to be assayed is appropriately labeled, then a particular cell test colony is inoculated with a predetermined amount of both labeled and unlabeled substance, and then the extent to which the labeled substance binds to the cell receptor. Binding studies are performed to determine Thus, a difference in affinity between substances can be confirmed.

【０３０６】従って、所定量の精製体重モジュレーター
が、放射性標識され得、そして例えば、抗体またはそれ
らに対する他のインヒビターと組み合わされ、その後結
合研究が実施された得る。次いで、種々の量の標識およ
び非標識の組み合わされていない体積モジュレーターを
含む溶液が調製され得、次いで細胞試料が接種され、そ
してその後インキュベートされ得る。得られる細胞の単
層を、次いで洗浄し、可溶化し、そして５％以下の標準
誤差を生じるに十分な時間の長さの間、ガンマーカウン
ターで計測した。次いで、これらのデータは、スキャッ
チャード分析に供せられ、その後、物質の活性について
の観察および結論づけが行われ得る。先行する記載は例
示であり、それは、レセプターアッセイが行われ用いら
れる様式を例示し、例ではアッセイした物質の細胞結合
能力が区別する特徴として供し得る。あるいは、レセプ
ターアッセイは、dbレセプターのような本発明のモジュ
レーターに対する特異的レセプターの同定に特に有用で
ある。Thus, a predetermined amount of a purified body weight modulator can be radiolabeled and combined, eg, with an antibody or other inhibitor thereto, after which binding studies can be performed. Solutions containing various amounts of labeled and unlabeled uncombined volume modulators can then be prepared, and then a cell sample can be inoculated and subsequently incubated. The resulting cell monolayer was then washed, solubilized, and counted in a gamma counter for a length of time sufficient to produce a standard error of 5% or less. These data are then subjected to Scatchard analysis, after which observations and conclusions about the activity of the substance can be made. The preceding description is illustrative, which illustrates the manner in which the receptor assay is performed and used, in which case the cell binding capacity of the assayed material may serve as a distinguishing feature. Alternatively, receptor assays are particularly useful for identifying specific receptors for modulators of the present invention, such as the db receptor.

【０３０７】本発明による有用なそして意図されたさら
なるアッセイは、「シス／トランス」アッセイとして知
られている。簡単に説明すると、このアッセイは、２つ
の遺伝子構築物を使用し、その内の１つは、代表的に
は、適切な細胞株にトランスフェクトする場合、目的の
特定のレセプターを速続的に発現するプラスミドであ
り、そしてその第２番目は、レセプター／リガンド複合
体の制御下で、ルシフェラーゼのようなレポーターを発
現するプラスミドである。従って、例えば、特定のレセ
プターに対するリガンドとして化合物を評価することが
所望される場合、プラスミドの１つは、選択された細胞
株でレセプターの発現を生じる構築物であり得、その一
方、第二のプラスミドは、特定のレセプターに対して応
答要素が挿入されるルシフェラーゼ遺伝子に連結された
プロモーターを所有する。試験される化合物がレセプタ
ーに対するアゴニストである場合、リガンドはレセプタ
ーと複合体化し、そして生じた複合体は応答要素と結合
し、そしてルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始する。次
いで、生じた化学発光を光度計により測定し、投与量応
答曲線を得、そして既知のリガンドの投与量応答曲線と
比較する。前記のプロトコールは、当業者が参考とする
目的のために、米国特許第4,981,784号およびPCT国際公
開第WO88/03168号で詳細に記載されている。A further assay useful and contemplated according to the present invention is known as a "cis / trans" assay. Briefly, this assay uses two gene constructs, one of which typically expresses a particular receptor of interest rapidly when transfected into an appropriate cell line. The second is a plasmid that expresses a reporter, such as luciferase, under the control of a receptor / ligand complex. Thus, for example, if it is desired to evaluate a compound as a ligand for a particular receptor, one of the plasmids may be a construct that results in expression of the receptor in a selected cell line, while a second plasmid Possess a promoter linked to a luciferase gene into which a response element is inserted for a particular receptor. If the compound being tested is an agonist for the receptor, the ligand will complex with the receptor, and the resulting complex will bind to the response element and initiate transcription of the luciferase gene. The resulting chemiluminescence is then measured by a photometer, a dose response curve is obtained and compared to the dose response curve of the known ligand. The above protocol is described in detail in U.S. Patent No. 4,981,784 and PCT International Publication No. WO 88/03168 for reference purposes by those skilled in the art.

【０３０８】一旦、OBレセプター遺伝子配列を発現する
組換え体が同定されると、組換えOBレセプターが分析さ
れ得る。これは、レセプターの放射性標識を含むOBレセ
プターの物理学または機能的特徴に基づくアッセイとそ
れに続くゲル電気泳動、イムノアッセイ、リガンド結合
などによる分析により達成される。さらに、OBレセプタ
ーに対する抗体が上記のように生成され得る。Once a recombinant expressing the OB receptor gene sequence has been identified, the recombinant OB receptor can be analyzed. This is achieved by assays based on the physics or functional characteristics of the OB receptor, including the radiolabel of the receptor, followed by analysis by gel electrophoresis, immunoassays, ligand binding, and the like. In addition, antibodies to the OB receptor can be generated as described above.

【０３０９】OBレセプターの構造は、当該分野で公知の
種々の方法により分析され得る。好ましくは、種々のド
メインの構造、特にOB結合部位が分析される。構造分析
は、他の公知のタンパク質、特にホルモンおよびタンパ
ク質レセプターとの配列類似性を同定することにより行
われ得る。類似性(または相同性)の程度は、OBレセプタ
ーまたはそのドメインの構造および機能を推定するため
の基礎を提供し得る。特定の実施態様では、配列比較
は、例えば、FASTAおよびFASTPプログラム[Pearsonら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48(1988)]を用
いてGenBankで見い出される配列を用いて行われ得る。The structure of the OB receptor can be analyzed by various methods known in the art. Preferably, the structure of the various domains, especially the OB binding site, is analyzed. Structural analysis can be performed by identifying sequence similarities to other known proteins, particularly hormones and protein receptors. The degree of similarity (or homology) may provide a basis for estimating the structure and function of the OB receptor or its domain. In certain embodiments, the sequence comparison is performed, for example, using the FASTA and FASTP programs [Pearson et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-48 (1988)].

【０３１０】タンパク質配列は、親水性分析によりさら
に特徴付られ得る(例えば、Hoppら、1981、同上)。親水
性プロフィールを用いて、OBレセプタータンパク質の疎
水性および親水性領域を同定し得、それはまた、細胞質
外、膜結合性、および細胞質内領域を示し得る。[0310] Protein sequences can be further characterized by hydrophilicity analysis (eg, Hopp et al., 1981, supra). The hydrophilicity profile can be used to identify hydrophobic and hydrophilic regions of the OB receptor protein, which can also indicate extracytoplasmic, membrane-bound, and intracytoplasmic regions.

【０３１１】二次構造の分析(例えば、Chouら、1974、
同上)がまた行われ、特異的な二次構造をとると推定さ
れるOBレセプターの領域を同定し得る。Analysis of secondary structure (see, eg, Chou et al., 1974;
Id.) Can also be performed to identify regions of the OB receptor that are presumed to adopt a specific secondary structure.

【０３１２】操作、翻訳、および二次構造の推定、なら
びにオープンリーディングフレームの推定および製図(p
lotting)はまた、当該分野で利用可能なコンピューター
ソフトウエアプログラムを用いても達成され得る。Manipulation, translation, and estimation of secondary structure, and estimation and drafting of open reading frames (p
Lotting) can also be accomplished using computer software programs available in the art.

【０３１３】組換えOBポリペプチドの大量の供給源、お
よびOBレセプター(すなわち、db遺伝子産物)を単離する
機会を提供することにより、本発明は、OBポリペプチド
およびOBレセプター、またはそのドメインの活性なコン
ホメーションの定量的な構造決定を可能にする。特に、
十分量の物質が、核磁気共鳴(NMR)、赤外(IR)、Raman、
および紫外(UV)、特に円二色性(CD)、分光分析のために
提供される。特に、NMRは、溶液中の分子の非常に強力
な構造分析を提供し、それは、それらの天然環境により
緊密に近づける(Marionら、1983、同上: Barら、1985、
同上; Kimuraら、1980、同上)。構造分析の他の方法が
また使用され得る。これらは、Ｘ線結晶学(Engstom, 19
74,同上)を含むがこれらに限定されない。By providing a large source of recombinant OB polypeptide, and the opportunity to isolate the OB receptor (ie, the db gene product), the present invention provides a method for isolating the OB polypeptide and OB receptor, or a domain thereof. Enables quantitative structure determination of the active conformation. In particular,
Sufficient amounts of material are nuclear magnetic resonance (NMR), infrared (IR), Raman,
And ultraviolet (UV), especially circular dichroism (CD), provided for spectroscopic analysis. In particular, NMR provides a very powerful structural analysis of molecules in solution, which brings them closer to their natural environment (Marion et al., 1983, supra: Bar et al., 1985,
Id .; Kimura et al., 1980, id.). Other methods of structural analysis can also be used. These are based on X-ray crystallography (Engstom, 19
74, ibid.).

【０３１４】さらに好ましくは、OBポリペプチドおよび
OBレセプターの共結晶(co-crystal)が研究され得る。共
結晶の分析は、結合についての詳細な情報を提供し、そ
れはさらに、リガンドアゴニストおよびアンタゴニスト
の合理的な設計を可能にする。コンピューターモデリン
グもまた使用され得、特にNMRまたはＸ線法[Fletterick
ら編、Computer Graphics and Molecular Modeling, in
Current Communications in Molecular Biology, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York(1986)]と組み合わせて使用され得る。More preferably, the OB polypeptide and
The co-crystal of the OB receptor can be studied. Analysis of the co-crystals provides detailed information about the binding, which further allows the rational design of ligand agonists and antagonists. Computer modeling can also be used, especially NMR or X-ray methods [Fletterick
Ed., Computer Graphics and Molecular Modeling, in
Current Communications in Molecular Biology, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York (1986)].

【０３１５】本発明のOBレセプターをコードする遺伝子
の同定および単離は、天然供給源から単離され得るより
大量に、または細胞のトランスフェクションまたはトラ
ンスフォーメーション後に発現するレセプターの活性を
示すように特に加工されたインジケーター細胞でレセプ
ターの発現を提供する。従って、OBポリペプチドの構造
に基づくアゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設
計に加えて、本発明は、当該分野で公知の種々のスクリ
ーニングアッセイを用いて、OBレセプターの特異的リガ
ンドを同定する代替の方法を意図する。The identification and isolation of the gene encoding the OB receptor of the present invention may be more extensive than that which can be isolated from natural sources, or specifically to demonstrate the activity of the receptor expressed after transfection or transformation of the cell. Provides expression of the receptor in the processed indicator cells. Thus, in addition to rational design of agonists and antagonists based on the structure of the OB polypeptide, the present invention provides an alternative method of identifying specific ligands for the OB receptor using various screening assays known in the art. Intended.

【０３１６】本発明は、以下の実施例を参照してより良
好に理解され得、実施例は、本発明の例示であり、そし
て限定することを意図しない。The present invention can be better understood with reference to the following examples, which are illustrative of the present invention and are not intended to be limiting.

【０３１７】[0317]

【実施例】以下は、本発明の例示である遺伝子物質を同
定するために使用する方法の概要を述べる。この努力は
４つの連続的な工程を含む：Ａ）遺伝子地図作製、Ｂ）
物理地図作製、Ｃ）候補遺伝子単離、およびＤ）変異検
出。目的のマウス遺伝子が単離された(工程Ｄ)ことの確
認の後、相同なヒト遺伝子が捜され、そしてマウスおよ
びヒトの両遺伝子および推定タンパク質が特徴付られ
た。この工程は、さらに詳細に以下に要約される。The following outlines a method used to identify genetic material that is exemplary of the present invention. This effort involves four sequential steps: A) Genetic mapping, B)
Physical mapping, C) candidate gene isolation, and D) mutation detection. After confirming that the mouse gene of interest was isolated (Step D), homologous human genes were sought and both mouse and human genes and putative proteins were characterized. This step is summarized in more detail below.

【０３１８】Ａ．遺伝子地図作製 ob変異は遺伝的交雑で分離し、そして標準の連鎖分析を
用いて、RFLP(制限酵素断片長多型)に対する変異を位置
付けた。これらのデータは、OB遺伝子をマウス第６染色
体近位約５cＭに置いた。(５cMは、100匹の動物当たり
の５つのみかけの遺伝的交差に相当する遺伝子距離の測
定値である。) 全部で771の情報を与える減数***が生
じ、そしてその後の遺伝子地図作製(Friedmanら、199
1、同上)で用いられた。OBに対してマップされた遺伝子
座は、全て先に公開された。記載された最も近い２つの
RFLPは、カルボキシペプチダーゼおよびmetガン遺伝子
由来のプローブにより定義された。 A. Genetic mapping ob mutations were isolated in genetic crosses and standard linkage analysis was used to map mutations to RFLP (restriction fragment length polymorphism). These data placed the OB gene approximately 5 cM proximal to mouse chromosome 6. (5 cM is a measure of the gene distance corresponding to five apparent genetic crossings per 100 animals.) A total of 771 informative meiosis occurs and subsequent genetic mapping (Friedman et al. , 199
1, ibid.). All loci mapped to OBs were previously published. The closest two listed
RFLP was defined by a carboxypeptidase and a probe from the met oncogene.

【０３１９】上記の実験の遺伝子解析は、原理的には、
いずれの遺伝子マーカーも強く連鎖しないので、obをク
ローン化するためには不適当であった。強く連鎖する必
要とするRFLPを同定するために、特別のプローブが単離
され、そして遺伝的交雑を行った。公知の方法である染
色体顕微解剖を用いて、マウス第６染色体の近位からDN
Aのランダムな小片を単離した[Baharyら、Mammalian Ge
nome, 4:511-515(1993)]。個々のクローン化プローブを
obに対する強い連鎖について試験した。これらの研究を
基礎にして、１つのプローブD6Rck13(psd3とも称せられ
る)を、OBに対するその遺伝的近接性によりさらなる解
析のために選択した。[0319] In principle, the genetic analysis of the above experiment
Since none of the genetic markers were strongly linked, it was unsuitable for cloning ob. To identify RFLPs that need to be strongly linked, special probes were isolated and genetic crosses were performed. Using a well-known method, chromosome microdissection, DN from mouse chromosome 6
A random piece of A was isolated [Bahary et al., Mammalian Ge
nome, 4: 511-515 (1993)]. Individual cloning probes
We tested for strong linkage to ob. Based on these studies, one probe, D6Rck13 (also referred to as psd3), was selected for further analysis due to its genetic proximity to OB.

【０３２０】このプローブを、種間および亜種間交雑由
来の835のob子孫の遺伝子型決定のために用い、D6Rck13
が、Baharyらに報告されているように、835匹全ての動
物において非組換え体であることを示した。物理地図作
製の過程で、新規な多型マーカーを、YAC53A6由来のコ
スミドのサブクローンから同定した。この新規マーカー
は、D6Rck13とOB遺伝子との間に位置し、種間内交雑お
よび戻し交雑由来の別の771の情報を与える減数***の
遺伝子型決定のために用いた。１匹の動物#167は、obと
D6Rck39との間の組換え交差を保有すると同定された。
これらの研究は、D6Rck39/D6RcK13がobから約0.06cMで
あることを示した。別のプローブPax4は、obに0.12cM近
接していたことが同定された。Pax4は２匹の動物(#111
および#420)で組換えられていた。Pax4は、Grussおよび
共同研究者により、マウス第６染色体近位に先にマップ
された偽遺伝子である[Grussら、Genomics, 11:424-434
(1991)]。これを基礎に、OB遺伝子は、Pax4とD6Rck13と
の間の約0.2cM間隔で存在すると決定された。これは、O
Bを単離する成果において介在DNAをクローンする成果を
導く。This probe was used for genotyping 835 ob progeny from interspecific and subspecies crosses and used for D6Rck13
Showed non-recombinant in all 835 animals, as reported by Bahary et al. In the course of physical mapping, a novel polymorphic marker was identified from a cosmid subclone from YAC53A6. This new marker was located between D6Rck13 and the OB gene and was used for meiotic genotyping of another 771 informative from interspecific and backcrosses. One animal # 167 has an ob and
It was identified as carrying a recombination crossover with D6Rck39.
These studies showed that D6Rck39 / D6RcK13 was about 0.06 cM from ob. Another probe, Pax4, was identified that was 0.12 cM close to ob. Pax4 has two animals (# 111
And # 420). Pax4 is a pseudogene previously mapped to proximal mouse chromosome 6 by Gruss and coworkers [Gruss et al., Genomics, 11: 424-434.
(1991)]. On this basis, it was determined that the OB gene was present at approximately 0.2 cM intervals between Pax4 and D6Rck13. This is O
The outcome of isolating B leads to the outcome of cloning the intervening DNA.

【０３２１】Ｂ．物理地図作製 この間隔でのDNAのクローニングには、酵母人工染色体
(YAC)を使用した。YACは、比較的新しいクローニングベ
クターであり、しばしば長さが100万塩基対以上の連続
するDNAの長い鎖をクローニングし得る。 B. Physical mapping The cloning of DNA at these intervals requires the use of yeast artificial chromosomes.
(YAC) was used. YAC is a relatively new cloning vector, capable of cloning long strands of continuous DNA, often over one million base pairs in length.

【０３２２】酵母人工染色体は、D6Rck13およびPax4を
用いて単離された。これは、精製DNAプローブを調製
し、そして対応するYACを単離するためにそれらを使用
することにより達成された。これらのYAC(#8、#16、#10
7、および#24)を単離し、そして最初に特徴付け、そし
て得られた分析に基づき、YAC16は最も遠くまで、すな
わちobの最も近くまで伸びたYACであったと結論され
た。次いで、YAC#16の重要な末端を回収し、そしてこの
末端がPax4よりobに近いと決定された。この末端を16M
(+)と名付けた。このプローブは動物#420においては(Pa
x4と同様に)組換えられていなかったことが示されたの
で、この結果が得られた。この末端を配列決定し、そし
てPCRアッセイを開発するために用いた。このPCRアッセ
イを用いて、YACライブラリーをスクリーニングした。
４つの陽性のクローンを単離した。続いて、エンド-レ
スキュー法、制限地図作製、パルスフィールドゲル電気
泳動、および遺伝的交雑を用いるサザンブロットによる
これらのYACの特徴付けにより、これらのYACのうちの２
つaduおよびaadが、引き続く研究に重要であることを決
定した。YAC aadは、最も遠くまで伸びた550kBの非キメ
ラYACである。従って、このYAC、aad(pICL)の遠位末端
を用いて物理地図を完成した。YAC aduは370kbの非キメ
ラYACであり、そしてその遠位末端adu(+)は、動物#111
および#167を含む遺伝的交雑の全てのob子孫において非
組換え体であることが決定され、OB遺伝子がこのYACに
存在することを示唆した。The yeast artificial chromosome was isolated using D6Rck13 and Pax4. This was achieved by preparing purified DNA probes and using them to isolate the corresponding YAC. These YACs (# 8, # 16, # 10
7, and # 24) were isolated and initially characterized, and based on the resulting analysis, it was concluded that YAC16 was the YAC that extended the furthest, ie, closest to the ob. The critical end of YAC # 16 was then recovered and this end was determined to be closer to ob than Pax4. This end is 16M
(+). This probe is (Pa)
This result was obtained because it was shown (as in x4) that it had not been recombined. This end was sequenced and used to develop a PCR assay. This PCR assay was used to screen a YAC library.
Four positive clones were isolated. Subsequent characterization of these YACs by Southern blots using end-rescue, restriction mapping, pulsed-field gel electrophoresis, and genetic crosses revealed that two of these YACs were
One adu and aad were determined to be important for subsequent research. YAC aad is the furthest 550 kB non-chimeric YAC. Therefore, a physical map was completed using the distal end of this YAC, aad (pICL). YAC adu is a 370 kb non-chimeric YAC and its distal end adu (+) is animal # 111
And was determined to be non-recombinant in all ob progeny of the genetic cross, including # 167, suggesting that the OB gene was present in this YAC.

【０３２３】これら２つの末端、aad(pICL)およびadu
(+)に対するPCRアッセイを開発し、物理地図作製を続行
するために、さらにYACおよびP1クローンを単離するた
めに用いた。重要なP1クローンを、498、499、500(aad
(pICL)由来のプローブを用いて単離された)、ならびに3
22、323、および324(adu(+)由来のプローブを用いて)を
含むこの成果により単離した。The two ends, aad (pICL) and adu
A PCR assay for (+) was developed and used to continue physical mapping and to further isolate YAC and P1 clones. Significant P1 clones, 498, 499, 500 (aad
(isolated using a probe from (pICL)), and 3
Isolated with this work, including 22, 323, and 324 (using probes from adu (+)).

【０３２４】こうして、D6Rck13により単離されたYAC(5
3A6、25A8、25A9、25A10)を特徴付けた。これらの研究
により、53A6がaad YACの近くの方向に最も遠くまで伸
びることが決定された。53A6とaadとの間のギャップの
サイズは、約70kBであると決定された。次いで、53A6の
重要な末端である53(pICL)を用いて、３つの利用可能な
YACライブラリーおよびP1ライブラリーをスクリーニン
グした。重要なP1クローン、325を単離した。このP1ク
ローンは、上記のように、aad(pICL)により単離されたP
1クローンとオーバーラップし、そしてそれ故53(pICL)
とaad(pICL)の間のギャップを近づけるために供され
た。結果として、長さが約2.5百万塩基対のYACおよびP1
クローンを含み、そしてPax4、16M(+)、adu(+)、aad(pI
CL)、53(pICL)、D6Rck39、およびD6Rck13に達する全コ
ンティグがクローン化された。動物#111および#167にお
ける明らかな組換え部位を注意深くマッピングすること
により、OBが400kB間隔で位置していたと結論された。O
B遺伝子を単離するために作用するDNAの供給源を提供す
るために、この非組換え領域をカバーする約500kBを合
計24のP1クローンで単離した。これらのP1クローンは、
322および323を含み、それらは後に有用なクローンであ
ることが見い出され、エキソントラッピングのために用
いた。Thus, the YAC (5) isolated by D6Rck13
3A6, 25A8, 25A9, 25A10) were characterized. These studies determined that 53A6 extends farthest in the direction near the aad YAC. The size of the gap between 53A6 and aad was determined to be about 70 kB. Then, using 53 (pICL), the key terminus of 53A6, the three available
The YAC and P1 libraries were screened. An important P1 clone, 325, was isolated. This P1 clone was isolated from the Pad isolated by aad (pICL) as described above.
Overlap with one clone, and therefore 53 (pICL)
And aad (pICL) were provided to close the gap. As a result, YAC and P1 are approximately 2.5 million base pairs in length.
Clones, and Pax4, 16M (+), adu (+), aad (pI
All contigs reaching CL), 53 (pICL), D6Rck39, and D6Rck13 were cloned. Careful mapping of the obvious recombination sites in animals # 111 and # 167 concluded that the OBs were located at 400 kB intervals. O
Approximately 500 kB covering this non-recombinant region was isolated in a total of 24 P1 clones to provide a source of DNA that acted to isolate the B gene. These P1 clones
322 and 323, which were later found to be useful clones and were used for exon trapping.

【０３２５】OBを有する染色体の１部分の物理地図を図
７Ａに示す。図７ＢはYAコンティグを示す。図７ＣはP1
コンティグを示す。A physical map of a portion of the chromosome with OB is shown in FIG. 7A. FIG. 7B shows the YA contig. FIG. 7C shows P1
Indicates a contig.

【０３２６】Ｃ．候補遺伝子の単離 この間隔にある遺伝子を単離するために用いた方法は、
エキソントラッピングである。この方法では、市販のベ
クターを用い、試験構築物中に導入されたゲノムDNAに
おける機能的なスプライスアクセプターおよびドナー配
列について選択することにより、エキソンDNA(すなわ
ち、コード配列)を同定した。これらのP1クローン由来
のDNAを増幅し、エキソントラッピングベクター中にサ
ブクローニングした。これらのクローンは、Bluescript
ベクターにクローン化された短い挿入物であった。各ク
ローンを、挿入物に近接するプラスミド配列に対応する
PCRプライマーを用いてPCR増幅した。PCR増幅を、プラ
スミドを有する細菌に対し直接行った。反応はBiomekロ
ボットを用いてセットアップした。PCR産物は、臭化エ
チジウムを含むTBE緩衝液中１％アガロースゲルで電気
泳動した。エキソントラッピング技術を改変し、P1クロ
ーンから混入しているE. coli DNAを除去し、そして大
量の人工エキソンをスクリーニングした。人工エキソン
はトラップされた推定エキソンの80〜90％を超えた。エ
キソントラッピングベクターは、HIV配列；この人工産
物に対応するこれらベクター配列の短いセグメントを含
む。 C. Isolation of candidate genes The method used to isolate the genes in this interval was:
Exon trapping. In this method, exon DNA (ie, the coding sequence) was identified by using a commercially available vector and selecting for functional splice acceptor and donor sequences in the genomic DNA introduced into the test construct. DNA from these P1 clones was amplified and subcloned into exon trapping vectors. These clones are
It was a short insert cloned into the vector. Each clone corresponds to the plasmid sequence adjacent to the insert
PCR amplification was performed using PCR primers. PCR amplification was performed directly on plasmid-bearing bacteria. Reactions were set up using a Biomek robot. PCR products were electrophoresed on a 1% agarose gel in TBE buffer containing ethidium bromide. The exon trapping technique was modified to remove contaminating E. coli DNA from P1 clones and to screen for large numbers of artificial exons. Artificial exons exceeded 80-90% of the estimated exons trapped. Exon trapping vectors contain HIV sequences; short segments of these vector sequences that correspond to this artifact.

【０３２７】エキソントラッピング実験は種々のP1クロ
ーンを用いて行った。次いで、エキソントラッピング産
物をPCRにより増幅し、選択し、そして配列決定した。
推定「エキソン」配列を、Blastコンピュータープログ
ラムを用いて、Genbankの配列と比較した。約15のエキ
ソンを、さらなる実験のために、RT-PCR、ノーザン分
析、および対応するRNAまたは保存配列の存在について
のズーブロット(zoo blot)により選択した。15の推定エ
キソンのうち７つ、325-2、323-9、322-5、D1-F7、1H
3、および2G7が、RNA転写物をコードすることが見い出
された。325-2は、精巣に特異的な遺伝子であり；323-8
および323-9は、主に脳および腎臓で発現される同じ遺
伝子由来の２つのエキソンのようである。IH3および322
-5は、２つの低レベルの脳転写物を示す。D1-F7は、先
にクローン化された遺伝子であるイノシンモノホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ(IMPDH)由来のエキソンで、遍在
性発現パターンを有する。これらの遺伝子は、いずれ
も、OBをコードしないようであった。OBエキソンである
2G7を以下でさらに説明する。Exon trapping experiments were performed with various P1 clones. The exon trapping product was then amplified by PCR, selected and sequenced.
The putative "exon" sequence was compared to the sequence in Genbank using the Blast computer program. Approximately 15 exons were selected for further experiments by RT-PCR, Northern analysis, and zoo blot for the presence of the corresponding RNA or conserved sequence. 7 out of 15 putative exons, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H
3, and 2G7 were found to encode RNA transcripts. 325-2 is a testis-specific gene; 323-8
And 323-9 appear to be two exons from the same gene expressed primarily in brain and kidney. IH3 and 322
-5 indicates two low level brain transcripts. D1-F7 is an exon from inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH), a previously cloned gene, with a ubiquitous expression pattern. None of these genes appeared to encode OB. OB exon
2G7 is described further below.

【０３２８】OB遺伝子をエキソントラップできなかった
３回の結果の後に、他の試みを、重要なOB領域由来の全
てのP1からのDNAをプールすることにより行った。これ
らは、以下のP1を含む：258、259、322、323、324、32
5、498、499、500、653、654、およびその他。その後、
258、260、322、498、および499のP1をエキソントラッ
ピングベクターにサブクローニングし、次にいくつかの
プレートを、推定エキソンを有していた細菌クローンで
調製した。推定OB候補を示す約192のクローンを得た。
上記のように、多くの単離物がベクター由来の２つのト
ラップされたエキソン含むことに一致する人工産物が観
察された。従って、クローンは、それらのサイズによ
る、およびゲルのサザンブロット上の対応するバンドに
ハイブリダイズするこの人工産物に対応するDNAプロー
ブのハイブリダイゼーションの事実による両方により同
定された。この方法で、192クローンのうち185をさらな
る評価から除外した。結局、OBに対応するエキソンの排
除に至り得るので、サイズ単独を基礎にした人工産物の
排除は不可能であった。After three results that failed to exon trap the OB gene, another attempt was made by pooling DNA from all P1 from the critical OB region. These include the following P1: 258, 259, 322, 323, 324, 32
5, 498, 499, 500, 653, 654, and others. afterwards,
258, 260, 322, 498, and 499 P1 were subcloned into exon trapping vectors, and several plates were then prepared with bacterial clones that had putative exons. About 192 clones showing putative OB candidates were obtained.
As noted above, artifacts were observed consistent with many isolates containing two trapped exons from the vector. Thus, clones were identified both by their size and by the fact of hybridization of a DNA probe corresponding to this artifact that hybridized to the corresponding band on the Southern blot of the gel. In this way, 185 of the 192 clones were excluded from further evaluation. In the end, exclusion of artifacts based on size alone was not possible, as it could lead to elimination of exons corresponding to OB.

【０３２９】従って、192のエキソンのうち、合計７つ
のエキソンをさらなる研究のために選択した。７つのエ
キソンの配列決定のための鋳型を調製し、そして配列決
定を行った。７つのエキソンの配列を分析し、そして７
つが同一であり、そして１つが明らかに人工産物である
ことが見い出された。特に、クローン1D12は、「HIV配
列」、すなわち人工産物バンドを含んでいた。これは、
さらなる分析のために３つのエキソン：1F1、2G7、およ
び1H3を残した。1F1が重要領域の外側にマップされたの
で排除された。1H3および2G7の両方に対するPCRプライ
マーを選択し、そして合成した。Thus, out of the 192 exons, a total of 7 exons were selected for further study. Templates for sequencing of the seven exons were prepared and sequenced. The sequence of the seven exons was analyzed and 7
One was found to be identical and one was clearly an artifact. In particular, clone 1D12 contained the "HIV sequence", an artifact band. this is,
Three exons were left for further analysis: 1F1, 2G7, and 1H3. 1F1 was excluded because it was mapped outside the critical area. PCR primers for both 1H3 and 2G7 were selected and synthesized.

【０３３０】2G7に関するエキソン配列を決定し、図10
(配列番号７)に示す。2G7に対するPCRプライマーを選択
し、そして合成した。PCRプライマーに対応する配列部
分に下線を引く。用いたプライマーは以下のとおりであ
る： 5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm=60.0℃)(配列番号８) 3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm=60.0℃)(配列
番号９) これらのプライマーは、以下のようなPCR条件でゲノムD
NAを増幅した：標準PCR緩衝液中、55℃で２分間のアニ
ーリング、72℃で２分間の伸長、94℃で１分間の変性の
25〜30サイクル。これらのプライマーをまた、非放射能
dCTP量を対応して減少させ、PCR反応において、³²P-dCT
Pを含めることにより標識プローブを生成するために用
いた。The exon sequence for 2G7 was determined and
(SEQ ID NO: 7). PCR primers for 2G7 were selected and synthesized. The sequence corresponding to the PCR primer is underlined. The primers used are as follows: 5 'CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60.0 ° C) (SEQ ID NO: 8) 3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60.0 ° C) (SEQ ID NO: 9) These primers are used for genomic DNA under the following PCR conditions.
NA was amplified: annealing in standard PCR buffer at 55 ° C for 2 minutes, extension at 72 ° C for 2 minutes, denaturation at 94 ° C for 1 minute.
25-30 cycles. These primers can also be used
The amount of dCTP was correspondingly reduced, and ³² P-dCT
Used to generate labeled probes by including P.

【０３３１】RT-PCRを種々の組織RNAについて行い、そ
して2G7が試験された組織の中で白色脂肪において排他
的に発現されたと結論された(図11A)。その後、³²Pで標
識した2G7を組織RNAのノーザンブロットとハイブリダイ
ズし(図11B)、そしてそのRNAが脂肪組織で高レベルで発
現するが、他の全ての組織(ここで、シグナルは、組織
調製物中に混入する脂肪の結果であり得る)において
は、発現されないか、または非常に低いレベルで発現さ
れたことを示した。列挙された各組織由来の全RNAの10
μgを、ホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで電気
泳動した。プローブを、標準ハイブリダイゼーション緩
衝液Rapid Hybe(Amersham)中、65℃で、ブロットにハイ
ブリダイズさせた。RNAのサイズは約4.9kBであった。こ
の時点で、2G7はOBについての有効な候補遺伝子である
と考えられ、そしてさらに分析された。[0331] RT-PCR was performed on various tissue RNAs and it was concluded that 2G7 was exclusively expressed in white fat in the tissues tested (Figure 11A). Subsequently, 2P7 labeled with ³² P was hybridized with a Northern blot of tissue RNA (FIG. (Which may be the result of fat contamination in the preparation), showed no or very low levels of expression. 10 of total RNA from each tissue listed
μg was electrophoresed on an agarose gel containing formaldehyde. The probe was hybridized to the blot at 65 ° C. in the standard hybridization buffer Rapid Hybe (Amersham). The size of the RNA was about 4.9 kB. At this point, 2G7 was considered a valid candidate gene for OB and was further analyzed.

【０３３２】Ｄ．変異検出。 D. Mutation detection .

【０３３３】2G7がOB遺伝子をコードしていたことを確
認するために、野生型動物と比較して、変異体における
この遺伝子のDNA配列のRNA発現のレベルの違いを示すこ
とが必要であった。ob遺伝子の２つの別の変異(C57BL/6
J ob/ob (1J)およびCkc/Smjob/ob (2J))が、研究に利用
可能である。これらは、以降1Jおよび2Jとそれぞれ呼ば
れる。(非公式な命名を、研究されるマウス株を呼ぶた
めに用いる。本明細書および図面では、C57BL/6Jは、C5
7BL/6J +/+を意味し；CKC/smjは、SM/Ckc-＋ ^Dac-+/+を
意味し; CKC/smj ob/obは、SM/Ckc-＋^Dac-ob^2J/ob^2Jを
意味することを理解されたい)。RNAは、1J、2J、および
コントロール動物から単離された脂肪組織から調製され
た。各試料由来の全RNAを、DNアーゼで処理し、次い
で、プライマーとしてのオリゴ-dT、および逆転写酵素
を用いて逆転写した。次いで、得られる１本鎖cDNAを、
下方のバンドについて2G7プライマー(上記の条件)また
は上方のバンドについて市販のアクチンプライマーのい
ずれかを用いてPCR増幅した。RT-PCR産物を、臭化エチ
ジウムで染色した１％アガロースTBEゲルで泳動した(図
12A)。RT-PCRを用いて、2G7 mRNAが、1Jおよび全ての他
のコントロールマウスで発現されたが、それは2Jマウス
では完全に見あたらなかったことが見い出された。30サ
イクルの増幅後、シグナルは検出されなかった。この実
験は、2G7がOB遺伝子由来のエキソンに対応する直接的
な証拠を提供した。It was confirmed that 2G7 encoded the OB gene.
To compare with wild-type animals
The DNA sequence of this gene should show differences in the level of RNA expression.
Was needed. Two other mutations in the ob gene (C57BL / 6
J ob / ob (1J) and Ckc / Smjob / ob (2J)) used for research
It is possible. These are hereafter referred to as 1J and 2J respectively
It is. (Informal naming refers to the mouse strain being studied.
Used for As used herein and in the drawings, C57BL / 6J refers to C5
7BL / 6J means + / +; CKC / smj means SM / Ckc- + ^Dac-+ / +
Means CKC / smj ob / ob is SM / Ckc- +^Dac-ob^2J/ ob^2JTo
Please understand what that means). RNA is 1J, 2J, and
Prepared from adipose tissue isolated from control animals
Was. Treat total RNA from each sample with DNase, then
With oligo-dT as primer and reverse transcriptase
Was used for reverse transcription. Next, the obtained single-stranded cDNA is
For the lower band 2G7 primer (conditions above) or
Indicates the commercially available actin primer for the upper band
PCR amplification was performed using either of them. RT-PCR products
Electrophoresis was carried out on a 1% agarose TBE gel stained with dium.
12A). Using RT-PCR, 2G7 mRNA was reduced to 1J and all other
Was expressed in control mice, but it was expressed in 2J mice
Then it was discovered that it was not completely found. 30 sa
After amplification of the cycle, no signal was detected. This fruit
Experiments show that 2G7 corresponds directly to an exon from the OB gene
Provided proof.

【０３３４】2J変異は比較的最近であり、そして類似遺
伝子型株として維持されているので、この結果は、2G7
がOB遺伝子由来のエキソンであることを示した最初に得
られた証拠であった。変異は、mRNA合成の全体的な停止
に至るプロモーター領域に位置するようである。このRT
-PCR実験における1Jマウスにおけるシグナルの存在は、
1JがRNA試料のサイズに大きな変化を生じない点突然変
異を有し得ることを示唆した。さらに、RT-PCRにより試
験された場合、2G7 mRNAは、４匹の追加の2J動物には存
在しなかった。Since the 2J mutation is relatively recent and has been maintained as a similar genotype strain, this result indicates that 2G7
Was the first available evidence to indicate that the exon was from the OB gene. The mutations appear to be located in the promoter region leading to a global cessation of mRNA synthesis. This RT
-The presence of signal in 1J mice in PCR experiments
It was suggested that 1J could have a point mutation that did not result in a large change in the size of the RNA sample. In addition, 2G7 mRNA was absent in four additional 2J animals when tested by RT-PCR.

【０３３５】この結果は、ノーザンブロット上で確認さ
れた(図12B)。脂肪細胞RNAを、各株(C57B1/6J、1J、CKC
/smj、および2J)から調製した。これらのRNAの10μgを
泳動してブロットした。このブロットは、PCR反応中
に、³²P-dCTPを用いる物質、すなわち図11中のバンドの
増幅により、PCR標識された2G7プローブで釣った。アク
チンは、付与されたRNAの量に対するコントロールであ
る。アクチンシグナルは、全ての試料中でほぼ同じであ
る。mRNAが脂肪細胞に特異的であるので、OBシグナルは
脳では存在していない。This result was confirmed on a Northern blot (FIG. 12B). Adipocyte RNA was isolated from each strain (C57B1 / 6J, 1J, CKC
/ smj, and 2J). 10 μg of these RNAs were electrophoresed and blotted. This blot was probed with a PCR-labeled 2G7 probe during the PCR reaction by amplification of the material using ³² P-dCTP, ie, the band in FIG. Actin is a control for the amount of RNA provided. Actin signal is almost the same in all samples. The OB signal is absent in the brain because the mRNA is specific for adipocytes.

【０３３６】ノーザン分析の結果は、2G7特異的RNAが2J
マウスでは存在していないことを確認した。この肥満型
変異株においては、RNAが作られないように遺伝子が破
壊されているので、ob RNAはCKC/smj ob/obマウスで存
在していない。さらに、2G7 RNAのレベルは1Jおよびdb/
db脂肪で約10-20倍増加した。これらの結果は、OBが循
環ホルモンをコードしている、またはOBが体重を調整す
る脂肪細胞からのシグナル発生の原因であるといういず
れかの仮説に適合する。これらの結果は、2G7がOB遺伝
子であるという結論を支持し、そして1Jマウスが、点突
然変異、おそらく未成熟翻訳終止に至るナンセンス変異
を有することを予測した。The result of the Northern analysis showed that 2G7-specific RNA was 2J.
It was confirmed that it was not present in the mouse. In this obese mutant, the ob RNA is absent in CKC / smj ob / ob mice because the gene is disrupted so that RNA is not made. In addition, the level of 2G7 RNA was 1J and db /
db fat increased about 10-20 times. These results are consistent with either hypothesis that OB encodes a circulating hormone or that OB is responsible for the generation of signals from fat-regulating fat cells. These results support the conclusion that 2G7 is an OB gene, and predicted that 1J mice carry a point mutation, presumably a nonsense mutation leading to premature translation termination.

【０３３７】これらのノーザンの結果は、４つの異なる
2J動物からの脂肪細胞RNA調製物を用いても繰り返され
た(図13)。このアッセイでは、ap2は、図12Bのアクチン
と全く同様に、コントロールとして用いた脂肪特異的転
写物である。ap2バンドの変化する濃度には有意差はな
い。ap2は、公開されたap2配列からPCRプライマーを設
計することにより標識された。次いで、脂肪細胞RNAのR
T-PCR産物は、PCR標識のための同じプロトコールを用い
て再度標識された。この分析は、正常の同型接合(homoz
ygous)または異型接合(heterozygous)動物におけるOB m
RNAの存在、および2J変異体動物におけるその不在を示
す。These Northern results show four different
This was also repeated with adipocyte RNA preparations from 2J animals (FIG. 13). In this assay, ap2 is a fat-specific transcript used just as a control, just like actin in FIG. 12B. The changing concentration of the ap2 band is not significantly different. ap2 was labeled by designing PCR primers from the published ap2 sequence. Then, the adipocyte RNA R
T-PCR products were relabeled using the same protocol for PCR labeling. This analysis shows that normal homozygotes (homoz
OB m in (ygous) or heterozygous animals
2 shows the presence of RNA and its absence in 2J mutant animals.

【０３３８】変異は、1Jマウスで同定された。変異はＣ
からＴへの塩基の変化であり、それはアミノ酸108でア
ルギニンの見かけ上未成熟終止コドンへの変化を生じ、
そして、おそらくこれがob mRNAの高レベル発現に反す
る1J変異(図14)の原因である(図12および13、C57BL/6J
ob/obレーン参照)。The mutation was identified in 1J mice. Mutation is C
A base change from to T which results in a change to the apparently immature stop codon of arginine at amino acid 108;
And, perhaps, this is the cause of the 1J mutation (Figure 14), which opposes high level expression of ob mRNA (Figures 12 and 13, C57BL / 6J
ob / ob lane).

【０３３９】さらに最近では、サザンブロットを用い
て、2J変異が、RNA発現を完全になくするように見えるO
Bの5'末端で検出可能なDNA変化の結果であると結論され
た。この可能な再配置の正確な性質は、決定されるべき
ままである。More recently, using Southern blots, the 2J mutation appears to completely abolish RNA expression.
It was concluded that this was the result of a detectable DNA change at the 5 'end of B. The exact nature of this possible relocation remains to be determined.

【０３４０】４つの異なる制限エンドヌクレアーゼを用
いて、CKC/smj(SM/Ckc-+^Dac)およびC57BL/6Jマウス由来
のDNAのゲノムサザンブロットを、変異obが独特なフラ
グメントパターンを生じるかどうかを決定するために行
った(図15A)。約10μgのDNA(肝臓、腎臓、または脾臓か
ら調製されたゲノムDNA由来)を、示された制限酵素で切
断した。次いで、DNAを１％アガロースTBEゲルで電気泳
動した。DNAをイモビロン(imobilon)膜にトランスファ
ーし、PCR標識2G7プローブにハイブリダイズした。重要
なバンドは、CKC/smj ob/ob(SM/Ckc-+^Dac ob^2J/ob^2J)DN
AのBglII消化物中の一番上のバンドである。このバンド
は、他の株におけるより分子量が大きく、この株におけ
る変異を示している。Using four different restriction endonucleases, genomic Southern blots of DNA from CKC / smj (SM / Ckc- + ^Dac ) and C57BL / 6J mice were used to determine whether the mutant ob ^{resulted in a} unique fragment pattern. Performed to determine (FIG. 15A). Approximately 10 μg of DNA (from genomic DNA prepared from liver, kidney, or spleen) was cut with the indicated restriction enzymes. The DNA was then electrophoresed on a 1% agarose TBE gel. The DNA was transferred to an immobilon membrane and hybridized to a PCR-labeled 2G7 probe. Important band is CKC / smj ob / ob (SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J ) DN
The top band in the BglII digest of A. This band has a higher molecular weight than in other strains, indicating a mutation in this strain.

【０３４１】図15Bは、ob^2J/+×ob^2J/+交雑の子孫由来
のゲノムDNAのBglII消化物のサザンブロットである。い
くつかのDNAは、上方のバンドのみを有し、いくつかは
下方のバンドのみを有し、そしていくつかは両方のバン
ドを有する。上方のバンドのみを有する動物は、アロ型
の肥満型(allo-obese)、すなわちob^2J/ob^2Jである。こ
れらのデータは、図15Aに示される多型(すなわち、変
異)が遺伝的意味で(in agenetic sense)分離することを
示す。FIG. 15B is a Southern blot of a BglII digest of genomic DNA from progeny of ob ^2J / + × ob ^2J / + crosses. Some DNAs have only upper bands, some have only lower bands, and some have both bands. Animals with only the upper band are allo-obese, ie ob ^2J / ob ^2J . These data indicate that the polymorphism (ie, mutation) shown in FIG. 15A segregates in the genetic sense.

【０３４２】実施例１：OBのcDNAクローニングおよび配
列決定 標識2G7PCRプローブを用いて、マウス脂肪細胞λgt11 c
DNAライブラリー(Swissマウスの睾丸の脂肪パッド由来
のClonetech 5'-STRETCH cDNA、#ML3005b)からの合計50
のマウスcDNAクローン、およびヒト脂肪細胞λgt10cDNA
ライブラリー(腹部由来のClonetech 5'-STRETCH cDNA、
#HL1108a)からの30のクロスハイブリダイズするヒトcDN
Aクローンを単離した。ライブラリーのスクリーニング
は、プラークリフト手順を用いて行った。プラークリフ
トからのフィルターを、オートクレーブ法を用いて変性
した。フィルターをPCR標識2G7プローブを用いて２重(d
uplicate)ハイブリダイズした(Rapid Hybe緩衝液、65
℃、一晩)。２〜４時間のプレハイブリダイゼーション
の後、フィルターを２×SSC、２％SDS中、65℃で30分間
２回洗浄し、そしてｘ線フィルムに感光させた。２重陽
性についてプラーク精製した。プラーク精製したファー
ジを、市販のベクタープライマー、例えば、λgt10およ
びλgt11を用いて増幅した。得られたPCR産物は、いず
れかの末端に小量のベクター配列を有する各ファージに
ついてのcDNA挿入物に対応した。バンドをゲル精製し、
そしてABI自動シークエンサーおよびDNAポリメラーゼを
プローブするためのベクタープライマーを用いて配列決
定した。 Example 1 cDNA Cloning and Distribution of OB
Using string determination labeled 2G7PCR probe, mouse adipocytes lambda gt11 c
50 total from DNA library (Clonetech 5'-STRETCH cDNA from fat pad of Swiss testis, # ML3005b)
Mouse cDNA clone and human adipocyte λgt10 cDNA
Library (Clonetech 5'-STRETCH cDNA from abdomen,
# HL1108a) from 30 cross-hybridizing human cDNAs
The A clone was isolated. Library screening was performed using the plaque lift procedure. Filters from plaque lifts were denatured using the autoclave method. Filters were duplicated (d) using a PCR-labeled 2G7 probe.
uplicate) Hybridized (Rapid Hybe buffer, 65
° C, overnight). After 2-4 hours of pre-hybridization, the filters were washed twice in 2 × SSC, 2% SDS at 65 ° C. for 30 minutes and exposed to x-ray film. Plaque purified for double positivity. The plaque-purified phage was amplified using commercially available vector primers, for example, λgt10 and λgt11. The resulting PCR product corresponded to the cDNA insert for each phage with a small amount of vector sequence at either end. Gel-purify the band,
The sequence was determined using an ABI automatic sequencer and vector primers for probing DNA polymerase.

【０３４３】次いで、生の配列データは、コンピュータ
ープログラムに由来する誤りを正すために手動で塩基毎
に調べた。正しい配列が利用可能になったので、下流の
プライマーを合成し、配列決定を継続するために用い
た。各利用可能なcDNAクローンが配列決定され、コンテ
ィグに合成されるまで、このような実験を繰り返した。
現在までのところ、mRNAの５'末端から約3000塩基対が
蓄積された。cDNAクローンの１つは、mRNAの５'末端ま
で伸長しており、その配列は脂肪組織RNAの５'RACE産物
の配列と同一であった(データは示さない)。The raw sequence data was then manually checked on a base-by-base basis to correct errors derived from the computer program. As the correct sequence became available, downstream primers were synthesized and used to continue sequencing. These experiments were repeated until each available cDNA clone was sequenced and synthesized into a contig.
To date, about 3000 base pairs have accumulated from the 5 'end of the mRNA. One of the cDNA clones extended to the 5 'end of the mRNA, and its sequence was identical to the sequence of the 5' RACE product of adipose tissue RNA (data not shown).

【０３４４】配列データは、167アミノ酸のオープンリ
ーディングフレームが存在することを示した(図１)。Ko
zak翻訳開始共通配列は、ATGの３塩基上流のアデノシン
残基で存在した。cDNAの２つのクラスは、１つのグルタ
ミンコドンを含むまたは含まないで異なることが見い出
された。この残基は、2G7エキソンのスプライスアクセ
プターに対して３'側直ぐ近くに位置することが見い出
されている。グルタミンのCAGコドンは可能なAGスプラ
イスアクセプター配列を含むので、下記のようなcDNAの
サブセットにおいて見かけ上３塩基対欠失しているスプ
ライスアクセプター部位でのずれが存在しているようで
ある。The sequence data indicated that an open reading frame of 167 amino acids was present (FIG. 1). Ko
The zak translation initiation consensus sequence was at an adenosine residue 3 bases upstream of ATG. The two classes of cDNA were found to be different with or without one glutamine codon. This residue has been found to be located immediately 3 'to the splice acceptor of the 2G7 exon. Since the glutamine CAG codon contains a possible AG splice acceptor sequence, there appears to be a shift in the splice acceptor site that apparently lacks 3 base pairs in a subset of cDNAs as described below.

【０３４５】 上記の配列の「ag」は、グルタミンコドンの上流の推定
されたイントロン配列に相当し、そしてAGは推定のオル
タナティブスプライス部位である。このグルタミン残基
は分子の高度に保存された領域に位置し、そして生物学
的活性についてのその重要性は、未だに知られていな
い。[0345] "Ag" in the above sequence corresponds to the putative intron sequence upstream of the glutamine codon, and AG is a putative alternative splice site. This glutamine residue is located in a highly conserved region of the molecule, and its importance for biological activity is still unknown.

【０３４６】推定のＮ末端シグナル配列が検出され、そ
のシグナル切断部位は、アミノ酸位置21のアラニン残基
のカルボキシル末端にあると推測される。この推定のシ
グナル配列は、von Heijneの方法によるコンピューター
アルゴリズムの適用により確認された。この技術を用い
て、最も確からしいシグナル配列はアミノ酸1〜23に相
当するポリペプチドコード領域で同定され、以下の配列
を有する： ＭＣＷＲＰＬＣＲＦＬＷＬＷＳＹＬＳＹＶＱＡ↑ＶＰ
(配列番号10) ここで、矢印は、推定のシグナル配列切断部位を示す。
アミノ酸配列の残りの部分は非常に親水性であり、そし
て任意の注目すべき構造モチーフまたはＮ末端シグナル
配列以外の膜に達するドメインを有さなかった。特に、
本発明者らは、Ｎ結合型グリコシル化に関する、または
推定のプロセッシングされたタンパク質中のタンパク質
切断を示唆する二塩基性アミノ酸配列の共通配列を(Sab
atiniら、The metabolic basis of inherited disease,
pp.177-223, C.V. Scriverら編、McGraw-Hill, New Yo
rk)見出せなかった。BlastおよびBlockプログラムを用
いたデータベース検索は、任意の相同性配列を同定しな
かった。A putative N-terminal signal sequence was detected and its signal cleavage site is presumed to be at the carboxyl terminus of the alanine residue at amino acid position 21. This putative signal sequence was confirmed by applying a computer algorithm according to the method of von Heijne. Using this technique, the most probable signal sequence was identified in the polypeptide coding region corresponding to amino acids 1-23, and had the following sequence:
(SEQ ID NO: 10) Here, the arrow indicates a putative signal sequence cleavage site.
The remainder of the amino acid sequence was very hydrophilic and did not have any notable structural motifs or membrane reaching domains other than the N-terminal signal sequence. In particular,
We have identified a consensus sequence of dibasic amino acid sequences (Sab) for N-linked glycosylation or indicative of proteolytic cleavage in putatively processed proteins.
atini et al., The metabolic basis of inherited disease,
pp.177-223, CV Scriver et al., McGraw-Hill, New Yo
rk) could not be found. Database searches using the Blast and Block programs did not identify any homologous sequences.

【０３４７】ヒト脂肪組織RNAをノーザンブロットで分
析し、マウスob遺伝子と同様のサイズのRNA種を検出し
た。cDNAクローンの配列決定および分析は、ヒトOBがま
た、167アミノ酸ポリペプチドをコードすることを示し
た(図2AおよびB、図３)。３塩基対の欠失を有するかま
たは有さない２つのcDNAクラスが、同様にヒトで見い出
された(図６)。マウスおよびヒトOB遺伝子は、推定のコ
ード領域において高度に相同性であるが、得られた３'
および５'の非翻訳領域で30％だけの相同性を有する。
Ｎ末端シグナル配列はまた、ヒトOBポリペプチド中に存
在していた。ヒトおよびマウスOBポリペプチド配列の比
較により、２つの分子はアミノ酸レベルで全体で83％の
同一性を有することを示した(図４)。両方の種由来の成
熟タンパク質のＮ末端は、Ｎ末端の100アミノ酸残基の
うち６つの保存および３つの非保存アミノ酸置換だけを
有して、より高い相同性を共有する。[0347] Human adipose tissue RNA was analyzed by Northern blot to detect RNA species of the same size as the mouse ob gene. Sequencing and analysis of the cDNA clones indicated that human OB also encodes a 167 amino acid polypeptide (FIGS. 2A and B, FIG. 3). Two cDNA classes with or without a 3 base pair deletion were also found in humans (FIG. 6). The mouse and human OB genes are highly homologous in the putative coding region, but the resulting 3 '
And only 30% homology in the 5 'untranslated region.
The N-terminal signal sequence was also present in the human OB polypeptide. Comparison of the human and mouse OB polypeptide sequences indicated that the two molecules had an overall 83% identity at the amino acid level (FIG. 4). The N-termini of the mature proteins from both species share higher homology, with only six conserved and three non-conserved amino acid substitutions of the N-terminal 100 amino acid residues.

【０３４８】ゲノムDNAを、マウス、ラット、ウサギ、
ハタネズミ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヒト、ニワト
リ、ウナギ、およびショウジョウバエから単離し、EcoR
1で制限切断した。切断物を１％アガロースTBEゲルで電
気泳動した。次いで、DNAをイモビロン膜にトランスフ
ァーし、そしてPCR標識2G7プローブで釣った。このフィ
ルターを、65℃でハイブリダイズし、そして20分間の各
洗浄につき、65℃で、２×SSC、0.2％SDSで２回洗浄し
た(すなわち、緩衝液を２回変えた)。これらのデータ
は、OBが脊椎動物間で保存されていることを示した(図1
6)。この観点から、ウナギDNAに2+のシグナルがあるこ
と；ウナギは魚であることに留意。The genomic DNA was used for mouse, rat, rabbit,
Isolated from voles, cats, cattle, sheep, pigs, humans, chickens, eels, and Drosophila, EcoR
Cut by 1 at limit. The cuts were electrophoresed on a 1% agarose TBE gel. The DNA was then transferred to Immobilon membranes and fished with a PCR-labeled 2G7 probe. The filters were hybridized at 65 ° C. and washed twice with 2 × SSC, 0.2% SDS at 65 ° C. for each 20 minute wash (ie, the buffer was changed twice). These data indicated that OBs were conserved among vertebrates (Figure 1).
6). In this respect, note that eel DNA has a 2+ signal; eels are fish.

【０３４９】要約すると、得られた証拠は、体重および
脂肪症が生理学的に制御されることを示唆する。７年
前、この系の２つの重要な成分(OBおよびDB遺伝子)を同
定する努力を開始した。この実施例に示すように、OB遺
伝子は、今や、体重を調節する重要な役割を果たす脂肪
特異的遺伝子として同定された。この遺伝子の産物は、
分泌ホルモンである可能性が最も高く、ヒトおよびヒト
以外の動物における栄養障害の診断および処置のための
重要な用途を有し得る。In summary, the evidence obtained suggests that body weight and steatosis are physiologically controlled. Seven years ago, efforts began to identify two key components of this system (OB and DB genes). As shown in this example, the OB gene has now been identified as a fat-specific gene that plays an important role in regulating body weight. The product of this gene is
It is most likely a secreted hormone and may have important uses for the diagnosis and treatment of nutritional disorders in human and non-human animals.

【０３５０】実施例２：細菌におけるOBの発現 obをコードしているマウスおよびヒトの両方のcDNAを、
pET-15b発現ベクター(Novagen)にクローン化した。この
ベクターは、lacオペレーターとともにT7プロモーター
を含み、そしてヒスチジンtag(His-tag)およびコード配
列挿入部位の直ぐ上流のトロンビン切断部位(図17)(配
列番号１１および１２)を含む融合タンパク質を発現す
る。 Example 2 Expression of OB in Bacteria Both mouse and human cDNAs encoding ob are obtained from
It was cloned into the pET-15b expression vector (Novagen). This vector contains a T7 promoter with a lac operator and expresses a fusion protein containing a histidine tag (His-tag) and a thrombin cleavage site (FIG. 17) just upstream of the coding sequence insertion site (FIG. 17) (SEQ ID NOs: 11 and 12). .

【０３５１】マウスおよびヒトcDNAを、シグナル配列の
末端のアラニンをNdeI部位に変えるように改変した。こ
れは、別の配列が３'領域において存在していたからで
ある。NdeI部位の挿入は、以下の新規なプライマーを用
いるPCRを用いて達成された：Mnde-5'（マウス５プライムプライマー）： CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC（配列番号13）Mnde-3'（マウス３プライムプライマー）： TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC（配列番号14）Hnde-5'（ヒト５プライムプライマー）： TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC（配列番号15）Hnde-3'（ヒト３プライムプライマー）： TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA（配列番号16） プライマーは、PCRフラグメントの各末端にNdeI制限部
位を導入する、中央に６塩基対のミスマッチを含む。マ
ウスまたはヒトcDNAのいずれかを有するファージを、こ
れらのプライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物をNdeI
で切断し、１％低融点アガロースゲルでゲル精製した。
ゲル精製したバンドをpETベクターにサブクローニング
した。得られるプラスミドを配列決定し、変異がクロー
ニングのPCR増幅工程の間に導入されないことを確実に
した。グルタミン49をコードする、およびグルタミン49
を欠失するヒトおよびマウスcDNAの構築物を調製した。
特に、ヒトまたはマウスいずれかのOBコード配列を含
み、シグナル配列がなく、そしてHis-tagと融合したpET
15b構築物を、PCRクローニング法を用いて作成した。
この構築物は、配列の誤りがPCR増幅工程の間にOB遺伝
子のコード領域に導入されていないことを確認するため
に配列決定した。The mouse and human cDNAs were modified to change the alanine at the end of the signal sequence to an NdeI site. This is because another sequence was present in the 3 'region. Insertion of the NdeI site was achieved using PCR with the following new primers: Mnde-5 ′ (mouse 5 prime primer): CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID NO: 13) Mnde-3 ′ (mouse 3 prime primer) ): TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID NO : 14) Hnde-5 '(human 5 prime primer): TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID NO: 15) Hnde-3' (human 3 prime primer): TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO: 16) The primer contains a central 6 base pair mismatch that introduces an NdeI restriction site at each end of the PCR fragment. Phages with either mouse or human cDNA were PCR amplified using these primers. NdeI PCR product
And gel purified on a 1% low melting point agarose gel.
The gel purified band was subcloned into the pET vector. The resulting plasmid was sequenced to ensure that no mutation was introduced during the PCR amplification step of cloning. Encodes glutamine 49, and glutamine 49
Constructs of human and mouse cDNAs lacking were prepared.
In particular, pET containing the OB coding sequence, either human or mouse, lacking a signal sequence, and fused to a His-tag
The 15b construct was created using the PCR cloning method.
This construct was sequenced to ensure that no sequence errors were introduced into the coding region of the OB gene during the PCR amplification step.

【０３５２】２つの得られたプラスミド構築物であるpE
TM9およびpETH14を細菌発現宿主をトランスフォームす
るために選択した。最適条件下で1mM IPTGを用いた誘導
に際し、トランスフォームされた細菌は、100-300μg/m
lのOB融合物を生産し得た。大部分のOB融合タンパク質
が封入体で見い出された。6Mグアニジン-HClまたは尿素
を用いた可溶化の後、融合タンパク質は、His結合(Ni-
キレート化)樹脂カラムを通して精製された。OB融合タ
ンパク質のカラム精製のための条件(結合、洗浄、およ
び溶出を含む)は、実験的に確立された。OB融合タンパ
ク質は、5mMイミダゾール/6Mグアニジン-HClで樹脂に結
合し、そして20mMまでのイミダゾール/6Mグアニジン-HC
lで結合したままである。タンパク質は、樹脂から60mM
イミダゾール/6Mグアニジンで溶出し得る(図18A、B)。
精製ヒトおよびマウスの両OB融合タンパク質を、PBS中
でさらに透析し、調製物からグアニジン-HClを除去し、
次いでポリクローナル抗体を惹起するために用いた。The two resulting plasmid constructs, pE
TM9 and pETH14 were chosen to transform bacterial expression hosts. Upon induction with 1 mM IPTG under optimal conditions, transformed bacteria yield 100-300 μg / m
1 OB fusion could be produced. Most OB fusion proteins were found in inclusion bodies. After solubilization with 6M guanidine-HCl or urea, the fusion protein binds to His-bound (Ni-
Purified through a (chelated) resin column. Conditions for column purification of the OB fusion protein, including binding, washing, and elution, were established experimentally. The OB fusion protein binds to the resin with 5 mM imidazole / 6M guanidine-HCl and up to 20 mM imidazole / 6M guanidine-HC
It remains connected with l. 60 mM protein from resin
It can be eluted with imidazole / 6M guanidine (FIGS. 18A, B).
Both purified human and mouse OB fusion proteins were further dialyzed in PBS to remove guanidine-HCl from the preparation,
It was then used to raise polyclonal antibodies.

【０３５３】融合タンパク質産物の生物学的活性を試験
するために、精製タンパク質の再フォールディング条件
を試験しそして開発した。これは、1Mグアニジン溶液中
で融合タンパク質を最初に透析し、次いで0.4Mアルギニ
ン溶液を用いて希釈することを含む。His-tagを、生物
学的機能をアッセイする前に、融合タンパク質から除去
した。tagの除去は、ヒト胎盤由来のトロンビンで融合
タンパク質を処理することにより達成された。To test the biological activity of the fusion protein product, the refolding conditions of the purified protein were tested and developed. This involves first dialyzing the fusion protein in a 1 M guanidine solution and then diluting with a 0.4 M arginine solution. His-tag was removed from the fusion protein before assaying for biological function. Tag removal was achieved by treating the fusion protein with thrombin from human placenta.

【０３５４】さらに、シグナル配列のないヒトおよびマ
ウスOB遺伝子コード配列を、PCRクローニング法を用い
てpET12cベクターにそれぞれ挿入した。これらの構築物
は、細菌宿主細胞の周辺腔(periplasmic space)に合成
したOB融合タンパク質を指向し得る。周辺腔から回収し
たOB融合タンパク質は、他の宿主タンパク質から精製す
るために簡単なゲル濾過を必要とするだけで、そしてこ
のようなプロセスの間変性されない。In addition, the human and mouse OB gene coding sequences without the signal sequence were each inserted into the pET12c vector using the PCR cloning method. These constructs can direct the OB fusion protein synthesized in the periplasmic space of the bacterial host cell. The OB fusion protein recovered from the periplasm requires only a simple gel filtration to purify from other host proteins and is not denatured during such a process.

【０３５５】実施例３：ＯＢポリペプチドに対する抗体
の調製 ポリクローナル抗体を生成するために組換えタンパク質
を用いることに加えて、論理的に推理されたマウスＯＢ
配列由来の４種のペプチド配列のセットを、免疫原性プ
ロットソフトウエア(GCG Package)を用いて同定した。
４つのカルボキシ末端ペプチドフラグメントは以下の通
りである： （配列番号18）： Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Le
u-Ile-Lys-Thr （配列番号19）： Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Th
r-Leu-Ala （配列番号20）： Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gl
n-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp （配列番号21）：Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-As
p-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cysこれ
らのペプチドは、KLHと結合し、そしてこのペプチド−K
LH結合体を用いて、標準的技術を用いてウサギを免疫し
た。各ペプチドに特異的なポリクローナル抗血清をウサ
ギから回収する。 Example 3 Antibodies Against OB Polypeptide
In addition to using the recombinant protein to generate polyclonal antibodies, a logically inferred mouse OB
A set of four peptide sequences from the sequence was identified using immunogenicity plot software (GCG Package).
The four carboxy terminal peptide fragments are as follows: ( SEQ ID NO : 18 ): Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Le
u-Ile-Lys-Thr ( SEQ ID NO : 19 ): Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Th
r-Leu-Ala ( SEQ ID NO : 20 ): Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gl
n-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp ( SEQ ID NO : 21 ): Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-As
p-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys These peptides bind to KLH and the peptide-K
Rabbits were immunized with the LH conjugate using standard techniques. Polyclonal antisera specific for each peptide is recovered from the rabbit.

【０３５６】実施例４：ＯＢポリペプチドのインビトロ
転移 機能的シグナル配列の存在を確認するために、オープン
リーディングフレーム全体を含むヒトcDNAをpGEMベクタ
ーにサブクローニングした。この実験にはヒトcDNAのみ
を用いた。なぜなら、適切なマウスサブクローンは回収
されなかったからである。ポジティブ鎖であるヒトob R
NAをSp6ポリメラーゼを用いて転写し、イヌ膵臓ミクロ
ソーム膜を伴ってまたは伴わずにインビトロ翻訳反応に
用いた。一次翻訳産物は、約18kD（これは、cDNA配列か
ら予想された分子量と一致する）の見かけの分子量で移
動した。ミクロソーム膜を反応物中に含有することによ
り翻訳の全体的な効率が約５倍阻害された。それにも関
わらず、約50〜70％のOBの一次翻訳産物は、膜調製物の
存在下では約２kDに短縮された。このことは、シグナル
配列が機能的であることを示唆する（図19A）。インタ
ーロイキン-1αRNA（これはシグナル配列をコードしな
い）の一次翻訳産物のサイズは、反応物にミクロソーム
膜が含まれない場合には、変化しなかった。OBタンパク
質の転移(translocation)が起こったことを確認するた
めに、インビトロ翻訳産物をプロティナーゼ-Ｋで処理
した。プロテアーゼ処理の結果、18kDの一次翻訳産物は
完全にタンパク質分解されたが、16kDのプロセスされた
形態は酵素処理により影響を受けなかった。このこと
は、それがミクロソームの内腔へ転移したことを示す
（図19B）。これらのデータは、OBが分泌された分子で
あるという仮説に適合する。 Example 4 In Vitro of OB Polypeptide
To confirm the presence of the transposable functional signal sequence, a human cDNA containing the entire open reading frame was subcloned into a pGEM vector. In this experiment, only human cDNA was used. This is because no appropriate mouse subclone was recovered. Human ob R, the positive strand
NA was transcribed using Sp6 polymerase and used in in vitro translation reactions with or without canine pancreatic microsomal membrane. The primary translation product migrated at an apparent molecular weight of approximately 18 kD, which corresponds to the molecular weight predicted from the cDNA sequence. The inclusion of microsomal membranes in the reaction inhibited the overall efficiency of translation by about 5-fold. Nevertheless, about 50-70% of the primary translation product of OB was reduced to about 2 kD in the presence of the membrane preparation. This suggests that the signal sequence is functional (FIG. 19A). The size of the primary translation product of interleukin-1α RNA, which does not encode a signal sequence, did not change when the reaction did not include a microsomal membrane. To confirm that translocation of the OB protein had occurred, the in vitro translation product was treated with proteinase-K. As a result of the protease treatment, the primary translation product of 18 kD was completely proteolytically processed, but the processed form of 16 kD was not affected by the enzyme treatment. This indicates that it has translocated to the lumen of the microsome (FIG. 19B). These data fit the hypothesis that OB is a secreted molecule.

【０３５７】シグナル配列の開裂後、２つのシステイン
残基が予想されたタンパク質中に残り、この分子が他の
分泌ポリペプチドの特徴であるジスルフィド結合を含む
可能性を高めた[Shenら、Science, 224:168-171 (198
4)]。After cleavage of the signal sequence, two cysteine residues remain in the predicted protein, increasing the likelihood that this molecule contains a disulfide bond characteristic of other secreted polypeptides [Shen et al., Science, 224: 168-171 (198
Four)].

【０３５８】実施例５：ＯＢ遺伝子の特徴付け ヒトにおける肥満症とＯＢ遺伝子内の遺伝的改変との関
係を確証するために、ヒトＯＢ遺伝子の配列を決定した
（図20A〜20C）（配列番号22および24）。ヒトコード配
列由来の特定のプライマーを用いてヒトP1ライブラリー
をスクリーニングした。３つの異なるP1クローンを入手
し、増殖させ、そして第１コードエキソンと第２コード
エキソンとの間のスプライシング部位に隣接するプライ
マーを用いてPCR増幅を行った。約2kbの全イントロン領
域を増幅し、部分的に配列決定した(図20A参照；および
配列番号22および24に示す)。 Example 5 Characterization of the OB Gene To confirm the relationship between obesity in humans and genetic alterations in the OB gene, the sequence of the human OB gene was determined (Figures 20A-20C) (SEQ ID NO: 22 and 24). The human P1 library was screened using specific primers from the human coding sequence. Three different P1 clones were obtained, expanded, and PCR amplified using primers flanking the splice site between the first and second coding exons. The entire intron region of about 2 kb was amplified and partially sequenced (see FIG. 20A; and shown in SEQ ID NOs: 22 and 24).

【０３５９】マウス遺伝子およびヒト遺伝子の両方の遺
伝子構造を、PCRアッセイおよび他の標準的技術を用い
て特徴付けた。マウスＯＢ遺伝子は、３つのエキソンか
らなることが見出され、第２および第３のエキソンがコ
ード配列を占める（図20D）。ヒトＯＢ遺伝子のコード
領域は、同じ構造を有する；しかし、ヒト遺伝子は５’
エキソンおよびイントロンを欠いている（図20E）。The gene structure of both mouse and human genes was characterized using PCR assays and other standard techniques. The mouse OB gene was found to consist of three exons, with the second and third exons occupying the coding sequence (FIG. 20D). The coding region of the human OB gene has the same structure; however, the human gene has a 5 '
Lacks exons and introns (FIG. 20E).

【０３６０】ヒト遺伝子のイントロン配列から生成され
た２セットのプライマーを調製した（図20A〜C）。プラ
イマーの配列は以下の通りである（ＦおよびＲはそれぞ
れフォワードおよびリバースを表す）： HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' （配列番号29） HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' （配列番号30） HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' （配列番号31） HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' （配列番号32） DNAサンプルを種々の供給源から入手し、そしてこれら
のプライマーのセットを用いて深刻な肥満の人由来のヒ
トゲノムDNAを増幅させた。このPCR産物を低融点アガロ
ースゲル上で流し、バンドを切り出してアガラーゼ(aga
rase）で消化した。ABI 373A DNAシークエンサーおよび
Taqジデオキシターミネーターキット(ABI,Perkin-Elme
r)を用いてその配列を得た。患者サンプル由来のob遺伝
子内に１点変異が現在までに検出された。この変異は第
１エキソン内にあり、アミノ酸配列を変化させない。予
備データは、別の患者の第１エキソン内に挿入配列が存
在し得ることを示す。Taq DNAポリメラーゼの代わりにS
equenaseを用いる異なる自動化された配列決定法が、変
異検出のためにより容易に読める配列を得るために用い
られ得る。Two sets of primers generated from the intron sequence of the human gene were prepared (FIGS. 20A-C). The sequences of the primers are as follows (F and R represent forward and reverse, respectively): HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3 '(SEQ ID NO: 29) HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO: 30) HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3 '(SEQ ID NO: 31) HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NO: 32) DNA samples were obtained from a variety of sources and severe Human genomic DNA from obese people was amplified. The PCR product is run on a low melting point agarose gel, the band is cut out and agarase (aga
rase). ABI 373A DNA sequencer and
Taq dideoxy terminator kit (ABI, Perkin-Elme
The sequence was obtained using r). A single point mutation in the ob gene from a patient sample has been detected to date. This mutation is in the first exon and does not change the amino acid sequence. Preliminary data indicates that the inserted sequence may be present in the first exon of another patient. S instead of Taq DNA polymerase
Different automated sequencing methods using equenase can be used to obtain more readable sequences for mutation detection.

【０３６１】実施例６：酵母におけるＯＢの発現 ＯＢのポジショナルクローニングに続き、ＯＢタンパク
質が食物の摂取量および体重を減少させる生理学的メカ
ニズムを明らかにすることが重要になった。この方針の
第１段階は、発現系を用いて機能的タンパク質を組換え
によって産生させることであった。細菌の発現系が好結
果であることに加えて、酵母の発現系もまた選択され
た。酵母発現は、ＯＢの発現のためにいくつかの魅力的
な特徴を有する。最も重要なのは、生物学的に活性な真
核生物のタンパク質が産生されやすいということであ
る。ＯＢポリペプチドは哺乳動物細胞によって分泌され
る。タンパク質の分泌は全ての真核生物について非常に
類似している。このことは、細菌の分泌経路が似ている
よりずっと酵母の分泌器官が哺乳動物の分泌経路に似て
いることを意味する。特に、哺乳動物細胞で見られるＯ
Ｂのタンパク質改変は、酵母の分泌系を通じての発現に
おいてもよく見られる。さらに、タンパク質のフォール
ディングは分泌器官を通過中に行われ、従って酵母の分
泌器官を介してobを送達することは、天然の生物学的活
性を有する適切にフォールディングしたタンパク質を生
じやすい。このことは、２つのシステイン残基がジスル
フィド結合を形成し得るのでＯＢについて著しい。分泌
経路とは対照的に、細胞の細胞質の還元環境は、ジスル
フィド結合の形成を妨げる；従って、インビボでこのジ
スルフィド結合が形成されるためにはＯＢが分泌経路を
通過することが必須である。他の利点は、酵母の操作の
簡便性と迅速性、ベクターおよび株の利用性、ならびに
酵母の組換え技術の膨大な経験に関係する。 Example 6 Expression of OB in Yeast Following positional cloning of OB, it became important to elucidate the physiological mechanisms by which OB protein reduces food intake and body weight. The first step in this strategy was to produce a functional protein recombinantly using an expression system. In addition to successful bacterial expression systems, yeast expression systems were also selected. Yeast expression has several attractive features for OB expression. Most importantly, biologically active eukaryotic proteins are more likely to be produced. The OB polypeptide is secreted by mammalian cells. Protein secretion is very similar for all eukaryotes. This means that the yeast secretory organs are much more similar to mammalian secretory pathways than bacterial secretory pathways are. In particular, the O found in mammalian cells
Protein modification of B is also common in expression through the yeast secretion system. In addition, protein folding occurs during passage through secretory organs, and thus delivering ob through yeast secretory organs is likely to result in properly folded proteins with natural biological activity. This is significant for OB because two cysteine residues can form a disulfide bond. In contrast to the secretory pathway, the cytoplasmic reducing environment of the cell prevents the formation of disulfide bonds; thus, it is essential that OBs pass through the secretory pathway in order for this disulfide bond to form in vivo. Other advantages relate to the ease and speed of manipulation of yeast, the availability of vectors and strains, and the vast experience of yeast recombinant technology.

【０３６２】Pichia pastoris発現系を以下の４つの理
由により選択した：（１）それが他の酵母の系（例え
ば、S.cerevisiae）より高レベルの異種タンパク質の発
現を有する；（２）P.pastorisにおけるタンパク質のグ
リコシル化がS.cerevisiaeにおいてより哺乳動物の系に
類似している（もっとも、コンピューターサーチを用い
てグリコシル化部位をobにおいて検出したのではない
が、認識されていない部位でのグリコシル化の可能性は
まだ残っている）；（３） P.pastorisは、天然にはほ
とんどタンパク質を分泌しない、従って、一般に発現し
た外来タンパク質を精製することが容易である；そして
（４）ベクターおよび酵母の株が市販されている（Invi
trogenから）。図21および22に酵母発現ベクターを生成
する２つのストラテジーを示す。The Pichia pastoris expression system was selected for four reasons: (1) it has a higher level of heterologous protein expression than other yeast systems (eg, S. cerevisiae); Glycosylation of proteins in P. pastoris is more similar to mammalian systems in S. cerevisiae (although glycosylation sites were not detected in ob using computer search, but glycosylation at unrecognized sites) (3) P. pastoris secretes little protein in nature, thus making it easier to purify generally expressed foreign proteins; and (4) vectors and Yeast strains are commercially available (Invi
from trogen). Figures 21 and 22 show two strategies for generating yeast expression vectors.

【０３６３】選択されたベクターはpPIC.9であった。こ
のベクターは、α-接合因子(α-mating factor)プレプ
ロコード配列のすぐ下流のクローニング部位を含む。こ
の配列は、分泌経路によって分泌されるクローニング部
位にクローン化された遺伝子によってコードされるタン
パク質を支配する。このベクターの別の重要な特徴はHI
S4遺伝子である。この遺伝子は、このベクターによって
酵母をトランスフォームした後、ヒスチジン欠損培地で
増殖させた酵母の栄養要求性株を用いてこのベクターの
取り込みに関して選択を可能にする。クローニングのス
トラテジーは以下の通りであった：ＯＢcDNAを５'プラ
イマーを用いてPCR増幅する。このプライマーは、３'末
端部に、予想されるリーダーペプチド開裂部位のすぐ後
ろのＯＢ配列と相補的な配列を、そしてそのほぼ５'末
端部にはベクターのα-接合因子配列の３'末端部に相補
的な配列を含む。この５'プライマーはまたXhoI部位も
含む。３'プライマーは、その３'末端部にＯＢの最後の
数個のアミノ酸に相補的な配列を、その５'末端部にはE
coRI部位を有するように設計された。PCR増幅の後、こ
のPCR産物をXhoIおよびEcoRIで消化して同様に消化した
pPIC.9にクローニングした。マウスおよびヒトの両ＯＢ
cDNAをクローニングした後（各々、コドン49位にグル
タミンを有するものおよび有さないもの）、個々のクロ
ーンを４つの構築物全てについて単離し、配列決定して
構築物が正しい方向、およびフレームにクローニングさ
れたこと、およびPCR増幅工程に由来する変異を含まな
いことを立証した。正しい配列を有するクローンの同定
後、これらをP.pastoris GS115株（ヒスチジン要求株）
にトランスフォームした。[0363] The vector selected was pPIC.9. This vector contains a cloning site immediately downstream of the α-mating factor preprocoding sequence. This sequence governs the protein encoded by the gene cloned into the cloning site secreted by the secretory pathway. Another important feature of this vector is HI
S4 gene. This gene allows selection for uptake of this vector using an auxotrophic strain of yeast grown in a histidine-deficient medium after transforming the yeast with the vector. The cloning strategy was as follows: OB cDNA was PCR amplified using 5 'primers. This primer has, at the 3 'end, a sequence complementary to the OB sequence immediately after the predicted leader peptide cleavage site, and almost at the 5' end, the 3 'end of the α-mating factor sequence of the vector. Part contains a complementary sequence. The 5 'primer also contains an XhoI site. The 3 'primer has a sequence complementary to the last few amino acids of OB at its 3' end, and an E
Designed to have a coRI site. After PCR amplification, the PCR product was digested with XhoI and EcoRI and digested similarly
It was cloned into pPIC.9. Both mouse and human OB
After cloning the cDNA (with and without glutamine at codon 49, respectively), individual clones were isolated for all four constructs and sequenced to clone the constructs in the correct orientation and frame. And the absence of mutations from the PCR amplification step. After identification of clones having the correct sequence, these were cloned into P. pastoris strain GS115 (histidine-requiring strain).
Was transformed into

【０３６４】２つのマウスＯＢ構築物に関して、トラン
スフォームされた酵母クローンをタンパク質の発現に関
してスクリーニングした。トランスフォームされた酵母
はＯＢを含むという証拠として、DNAドット−ブロット
アッセイおよびコロニーハイブリダイゼーションアッセ
イを行った。これらはどちらもＯＢ配列がトランスフォ
ームされた酵母内にはあるが、トランスフォームされて
いない酵母内にはないことを示した。さらに、トランス
フォームされた酵母は今では16kDaのタンパク質を培養
培地に分泌したが、トランスフォームされていない酵母
はこのサイズのタンパク質を分泌しない（図23A）。こ
れはＯＢの予想されたサイズである。ＯＢの高い発現体
である両方のマウスの構築物の個々のクローンを同定し
た。現在、obを均一に精製するための精製ストラテジー
が開発されている。１つのストラテジーは、ＯＢをカチ
オン交換カラムで精製することである（図23B）；予備
データは、強いカチオン交換体が有用であり得ることを
示唆している。しかし、カチオン交換クロマトグラフィ
ー後、推定されるob産物は失われている。このことは、
サンプル中のプロテアーゼの存在を示す。For the two mouse OB constructs, transformed yeast clones were screened for protein expression. DNA dot-blot and colony hybridization assays were performed as evidence that the transformed yeasts contained OB. Both indicated that the OB sequence was in the transformed yeast but not in the untransformed yeast. Furthermore, transformed yeast now secretes a 16 kDa protein into the culture medium, whereas untransformed yeast does not secrete proteins of this size (FIG. 23A). This is the expected size of the OB. Individual clones of both mouse constructs, which are high expressors of OB, were identified. At present, a purification strategy for uniformly purifying ob has been developed. One strategy is to purify OB on a cation exchange column (FIG. 23B); preliminary data suggests that strong cation exchangers may be useful. However, after cation exchange chromatography, the putative ob product has been lost. This means
Indicates the presence of protease in the sample.

【０３６５】この問題を克服する１つのストラテジー
は、酵母における発現のためにob-His-tag融合物を調製
することである（図22）。さらなる評価は、His-tagを
持たないＯＢがNi-キレート化カラムにしっかりと結合
していることを示した。Ni-キレート化とそれに続くゲ
ル濾過によるＯＢポリペプチドの精製は、質量分析法に
十分な純度の産物を生じた。質量分析は、発現されたタ
ンパク質の分子量が予想した分子量と同じであることを
裏付け、このことはＯＢがPichiaにおいて成功裡に発現
されたことを強く確証する。One strategy to overcome this problem is to prepare an ob-His-tag fusion for expression in yeast (FIG. 22). Further evaluation showed that OB without His-tag was tightly bound to the Ni-chelation column. Purification of the OB polypeptide by Ni-chelation followed by gel filtration yielded a product of sufficient purity for mass spectrometry. Mass spectrometry confirms that the molecular weight of the expressed protein is the same as the expected molecular weight, which strongly confirms that OB was successfully expressed in Pichia.

【０３６６】しかし、Ni-キレート化/ゲル濾過精製プロ
トコルは、ＯＢポリペプチドを十分に純粋な形態で生じ
ない。別の小分子が存在する。タンパク質分解活性はNi
-キレート化カラムからの排除体積に溶出するようであ
る。従って、3工程の精製プロセスを計画する： Ni-キ
レート化、続いてカチオン交換（これは小分子混入物を
除く）、その後ゲル濾過。However, the Ni-chelation / gel filtration purification protocol does not yield the OB polypeptide in a sufficiently pure form. Another small molecule exists. Proteolytic activity is Ni
-It seems to elute in the excluded volume from the chelation column. Therefore, a three-step purification process is planned: Ni-chelation, followed by cation exchange (this excludes small molecule contaminants), followed by gel filtration.

【０３６７】SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色による
推定発現レベルは、酵母が振とうフラスコ内で増殖され
た場合には、約10mg/lであることを示す。これらのレベ
ルは発酵容器内で増加することが期待され、そして本発
明者らはより多量のタンパク質を得るという希望を持っ
て発酵を開始しようとしている。ヒトＯＢ構築物に関し
ては、高コピー数のＯＢ遺伝子を含むトランスフォーム
された酵母のクローンが同定され、それらはＯＢタンパ
ク質を発現することが予想される。抗体が開発されれ
ば、分泌された16kDaのタンパク質の独自性(identity)
の確認のためにそれらが用いられるであろう。The estimated expression level by Coomassie blue staining of the SDS-PAGE gel indicates that the yeast is about 10 mg / l when grown in shake flasks. These levels are expected to increase in the fermentation vessel, and we are starting the fermentation with the hope of obtaining more protein. For the human OB construct, transformed yeast clones containing a high copy number of the OB gene were identified and they are expected to express the OB protein. Once antibodies are developed, the identity of the secreted 16kDa protein
They will be used for confirmation.

【０３６８】実施例７：細菌におけるＯｂ融合ペプチド
の高レベルの発現 フリーザー貯蔵物の調製：炭素供給源を含まない滅菌さ
れたM9ZB培地の2つの4mlアリコートのそれぞれに、40μ
lのストックデキストロース(0.4g/ml、フィルター滅菌
済み)、10μlのアンピシリンストック(200mg/ml)、およ
び5μlのクロラムフェニコールストック(34mg/ml、エタ
ノール中）を添加した。それらに、Novagen pET-14bベ
クター内にクローン化されたマウスおよびヒトOB1 DNA
を有するE.coliの単一のコロニーそれぞれを用いてこれ
らを接種した。チューブを37℃で一晩インキュベートし
た。 Example 7: Ob fusion peptide in bacteria
Preparation of high-level expression freezer stocks: 40 μl of each of two 4 ml aliquots of sterile M9ZB medium without carbon source
1 stock dextrose (0.4 g / ml, filter sterilized), 10 μl ampicillin stock (200 mg / ml), and 5 μl chloramphenicol stock (34 mg / ml in ethanol) were added. They contain mouse and human OB1 DNA cloned into Novagen pET-14b vector.
These were inoculated using each single colony of E. coli having E. coli. The tubes were incubated at 37 ° C. overnight.

【０３６９】一晩培養した培養物0.5mlを用いて、デキ
ストロース、アンピシリン、およびクロラムフェニコー
ルを含む50mlのM9ZB培地に接種した。これらを30℃でイ
ンキュベートして600nmでの吸光度(A₆₀₀)を定期的にモ
ニターした。A₆₀₀が約1〜1.2の時点で、175μlの培養物
のアリコートを2mlのエッペンドルフチューブ内で25μl
の60％グリセロールと混合し、液体窒素中で瞬間凍結し
-80℃で保存した。0.5 ml of the overnight culture was used to inoculate 50 ml of M9ZB medium containing dextrose, ampicillin, and chloramphenicol. These were incubated at 30 ° C. and the absorbance at 600 nm (A ₆₀₀ ) was monitored periodically. At the time of A ₆₀₀ of about 1 to 1.2, 25 [mu] l aliquots of culture 175μl in 2ml eppendorf tubes
Mix with 60% glycerol and flash freeze in liquid nitrogen
Stored at -80 ° C.

【０３７０】培養物の増殖：0.5mlの40％デキストロー
ス、125μlのアンピシリンストックおよび50μlのクロ
ラムフェニコールストックを含む50mlのM9ZB培地に1ml
の凍結ストックを接種して30℃でインキュベートした。
A₆₀₀が1〜1.2の時点で、この培養物10mlを用いて、デキ
ストロース、アンピシリンおよびクロラムフェニコール
を含む500mlのM9ZB培地の入った2Lのフラスコ4本に接種
した。これらを、A₆₀₀が約1〜1.2の時点で最終濃度0.5m
MのIPTGを用いた誘導まで30℃でインキュベートした。
培養物を一晩インキュベートした。細胞を4000rpmで20
分間遠心分離して回収した。この発現系は全タンパク質
のかなり高い割合（グラム/ 1リットルE.coliのオーダ
ーで）として組換えＯＢポリペプチドを生じる。Growth of the culture: 1 ml in 50 ml M9ZB medium containing 0.5 ml 40% dextrose, 125 μl ampicillin stock and 50 μl chloramphenicol stock
Was inoculated and incubated at 30 ° C.
A ₆₀₀ is at the point of 1-1.2, using this culture 10 ml, dextrose, was inoculated into 2L flask four containing the M9ZB medium 500ml containing ampicillin and chloramphenicol. These final at the time of the A ₆₀₀ of about 1-1.2 concentration 0.5m
Incubated at 30 ° C. until induction with M IPTG.
Cultures were incubated overnight. 20 cells at 4000 rpm
Collected by centrifugation for minutes. This expression system yields the recombinant OB polypeptide as a fairly high percentage of total protein (on the order of grams / liter E. coli).

【０３７１】細胞溶解および封入体の再懸濁：細胞ペー
ストを最少容量の20mM HEPES,pH7.2、10%グリセロー
ル、0.1M KCl、5mM MgCl₂、1%アプロチニン、1mM PMS
F、5μg/mlロイペプチン、および50μg/mlDNase Iに再
懸濁した。懸濁物を液体窒素および温湯を用いて凍結融
解を3度行った。溶解した細胞を18000rpmで30分間遠心
分離して、20mM HEPES,pH7.5、0.1M NaClに再懸濁し
た。懸濁物を超音波処理してTriton X100を最終濃度2％
になるように添加した。これを18000rpmで15分間遠心分
離した。このサイクルをさらに2回行った後、Tritonな
しで3サイクル洗浄した。最後に、ペレットを、超音波
処理およびそれに続く遠心分離により6M GdHCl(グアニ
ジン-HCl)、20mM HEPES,pH7.5に溶解した。上清をさら
なる精製に用いた。Cell lysis and resuspension of inclusion bodies: Cell paste was applied to a minimum volume of 20 mM HEPES, pH 7.2, 10% glycerol, 0.1 M KCl, 5 mM MgCl ₂ , 1% aprotinin, 1 mM PMS
F, resuspended in 5 μg / ml leupeptin, and 50 μg / ml DNase I. The suspension was freeze-thawed three times using liquid nitrogen and hot water. Lysed cells were centrifuged at 18000 rpm for 30 minutes and resuspended in 20 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 M NaCl. Sonicate the suspension to a final concentration of 2% Triton X100
Was added so that This was centrifuged at 18000 rpm for 15 minutes. This cycle was performed twice more, followed by three cycles without Triton. Finally, the pellet was dissolved in 6M GdHCl (guanidine-HCl), 20 mM HEPES, pH 7.5 by sonication followed by centrifugation. The supernatant was used for further purification.

【０３７２】フォールディングされていない状態のＯＢ
タンパク質を固定化金属イオンアフィニティークロマト
グラフィー(IMAC)により精製した。5カラム容量の50mM
NiSO ₄で帯電させて6M GdHCl、20mM HEPES,pH7.5で平衡
化したPharmacia chelating fast flow sepharoseの40m
lカラムに溶液をかけた。このカラムを6M GdHCl、30mM
イミダゾール、20mM HEPES,pH7.5で洗浄した。最後に、
タンパク質を0.2Mイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出
した。6M GdHCl中のフォールディングされていないタン
パク質を、酢酸ナトリウム(NaAc)を10mMまで添加してpH
を酢酸で約4.5に調整した後、4℃で保存した。OB in the unfolded state
Metal ion affinity chromatography for immobilizing proteins
Purified by chromatography (IMAC). 5 column volumes of 50 mM
NiSO _FourAnd equilibrated with 6M GdHCl, 20mM HEPES, pH7.5
Pharmacia chelating fast flow sepharose 40m
The solution was applied to the column. Use this column with 6M GdHCl, 30mM
Washed with imidazole, 20 mM HEPES, pH 7.5. Finally,
Elute proteins with the same buffer containing 0.2M imidazole
did. Unfolded tan in 6M GdHCl
The protein is added to 10 mM sodium acetate (NaAc) to
Was adjusted to about 4.5 with acetic acid and stored at 4 ° C.

【０３７３】タンパク質の再フォールディングおよび精
製：100mgのタンパク質を含む6M GdHCl溶液を、67μlの
1Mジチオスレイトール(DTT)で処理し、そして6M GdHC
l、10mM NaAc, pH4.5で約67mlまで希釈した。それを室
温で約1時間撹拌した。それを撹拌しながら4Lの20％グ
リセロール、2.5mM CaCl₂、20mM Tris, pH8.4緩衝液に
希釈した。適切に混合した後、この溶液をさらには撹拌
せずに室温に約8時間おいた。次いで、2000単位の精製
ウシトロンビン(Parke-Davis製品のthrombostat由来)を
添加し、そしてこの溶液を緩やかに撹拌しながら放置し
た。2.5時間後、2000単位のトロンビンを再度投与し、
ヒスチジン-tagの開裂をさらに3時間続けた。トロンビ
ンの開裂はPMSFを最終濃度0.1mMまで添加することによ
り停止させた。この溶液を濾過して4℃で保存した。Protein refolding and purification: A 6M GdHCl solution containing 100 mg of protein was added to 67 μl of
Treated with 1M dithiothreitol (DTT) and 6M GdHC
l, diluted to about 67 ml with 10 mM NaAc, pH 4.5. It was stirred at room temperature for about 1 hour. While stirring it 20% glycerol _{4L, 2.5mM CaCl 2, 20mM Tris} , diluted in pH8.4 buffer. After appropriate mixing, the solution was left at room temperature for about 8 hours without further stirring. Then 2000 units of purified bovine thrombin (from thrombostat from Parke-Davis product) were added and the solution was left with gentle stirring. 2.5 hours later, 2000 units of thrombin was administered again,
Histidine-tag cleavage continued for an additional 3 hours. Thrombin cleavage was stopped by adding PMSF to a final concentration of 0.1 mM. This solution was filtered and stored at 4 ° C.

【０３７４】開裂したタンパク質を、1M KCl、20%グリ
セロール、20mM HEPES, pH8.4緩衝液で平衡化した上記
と同じIMACカラムでさらに精製した。タンパク質溶液を
ロード後、それを同じ緩衝液で洗浄し、そして開裂した
タンパク質を1M KCl、20%グリセロール、40mMイミダゾ
ール、20mM HEPES, pH8.4で溶出した。開裂しなかった
タンパク質を0.2Mイミダゾールで溶出した。The cleaved protein was further purified on the same IMAC column as above, equilibrated with 1 M KCl, 20% glycerol, 20 mM HEPES, pH 8.4 buffer. After loading the protein solution, it was washed with the same buffer and the cleaved protein was eluted with 1 M KCl, 20% glycerol, 40 mM imidazole, 20 mM HEPES, pH 8.4. The uncleaved protein was eluted with 0.2M imidazole.

【０３７５】精製された開裂タンパク質を濃縮し、50〜
100ｍＭのEDTA、10mMフェリシアン化カリウムで処理し
て（全ての不完全な酸化を完全にするため）、superdex
7516/60カラムでゲル濾過した。この手順を用いた収率
は出発ペプチドの約50％に近づいた。The purified cleaved protein is concentrated and
Treatment with 100 mM EDTA, 10 mM potassium ferricyanide (to complete any incomplete oxidation) and superdex
Gel filtration was performed on a 7516/60 column. Yields using this procedure approached about 50% of the starting peptide.

【０３７６】一旦精製されると、発現されたタンパク質
はいくつかの方法によって特徴付けられた。物理的な特
徴付けは、構造の均一性を決定するための動的光散乱を
含み、そして適切なフォールディングの尺度として用い
られる。光散乱データは、ヒトＯＢポリペプチドは、主
に、または専らモノマーとして発現され、一方、マウス
ＯＢポリペプチドは、ダイマーならびにモノマーとして
見出され得ることを示した。Once purified, the expressed protein was characterized by several methods. Physical characterization includes dynamic light scattering to determine structural uniformity and is used as a measure of proper folding. Light scatter data indicated that human OB polypeptides were expressed predominantly or exclusively as monomers, whereas mouse OB polypeptides could be found as dimers as well as monomers.

【０３７７】Ellman試薬および質量分析法を用いるアッ
セイは、システイン残基がタンパク質内でジスルフィド
結合を形成することを確証した。このポリペプチドの酸
化型は以下のようにマウスに投与され、そして生物学的
活性を示した。Assays using Ellman's reagent and mass spectrometry confirmed that cysteine residues formed disulfide bonds within the protein. The oxidized form of this polypeptide was administered to mice as described below and exhibited biological activity.

【０３７８】円偏光二色性を用いてこのタンパク質の構
造的な形状を概略で決定した。生理学的緩衝液（pH約
8、およそ生理学的イオン強度）中のCDスペクトルは、
ヒトＯＢポリペプチドが約60％のαヘリックス構造およ
び約40％のランダムコイル構造を有することを示す。マ
ウスＯＢポリペプチドは、CD分光学により約50％のαヘ
リックスおよび50％のランダムコイルを有することが見
出された。The structural shape of the protein was roughly determined using circular dichroism. Physiological buffer (pH approx.
8, the CD spectrum in about physiological ionic strength)
2 shows that the human OB polypeptide has about 60% α-helical structure and about 40% random coil structure. Mouse OB polypeptide was found by CD spectroscopy to have about 50% alpha helix and 50% random coil.

【０３７９】制限タンパク質分解に続く質量分析(Cohen
ら、1995、前出）を用いて、タンパク質分解の影響を受
けやすいＯＢポリペプチドの部分を同定した。この分析
はアミノ酸残基54位〜60位の可動性ループ構造の存在を
示した（図４に図示）。この可動性ループは定義された
２°の構造（例えば、α-ヘリックス）の２つのドメイ
ンに結合しているようである。Restriction proteolysis followed by mass spectrometry (Cohen
Et al., 1995, supra) were used to identify portions of the OB polypeptide that are susceptible to proteolysis. This analysis indicated the presence of a mobile loop structure at amino acid residues 54-60 (illustrated in FIG. 4). This mobile loop appears to bind to two domains of a defined 2 ° structure (eg, α-helix).

【０３８０】重要なことは、次の実施例で示すように、
精製されたタンパク質の生物学的活性を、そのタンパク
質を痩身型齧歯類および肥満型齧歯類の両方に浸透圧ポ
ンプ（例えば、Alza Corporation, Palo Alto, CAのALZ
ET浸透圧ポンプ）を介して投与することにより、または
少なくとも2週間にわたって毎日腹腔内にボーラス投与
することによりアッセイし、そして摂食行動および体重
に及ぼす影響を観察した。Importantly, as shown in the following example,
The biological activity of the purified protein can be used to convert the protein into osmotic pumps in both lean and obese rodents (eg, ALZ from Alza Corporation, Palo Alto, CA).
(ET osmotic pump) or by daily intraperitoneal bolus injection for at least 2 weeks and observed effects on eating behavior and body weight.

【０３８１】実施例８：ＯＢポリペプチド（レプチン）
の体重減少効果 マウスＯＢ遺伝子座の遺伝子産物は、体重調節に重要な
役割を果たす。この実施例は、マウス、ラット、および
ヒト血漿においてＯＢタンパク質が循環していることを
立証する。３つの全ての種における循環形態は、SDS-PA
GEによるとシグナル配列を持たない推定ポリペプチド配
列と同じ分子量を有する。このことは、インビボではこ
のタンパク質がシグナル配列を開裂した後でプロセスさ
れないことを示す。ＯＢタンパク質はC57/B16J ob/obマ
ウス由来の血漿には存在せず、コントロールと比較して
db/dbマウスの血漿中には10倍高い濃度で存在し、fa/fa
ラットの血漿中には20倍高いレベルで存在した。これら
の肥満動物変異体はＯＢの効果に耐性であることが示唆
される。６人の痩身型ヒト被検者の群内でＯＢタンパク
質の血漿レベルに７倍の差があった。組換えマウスＯＢ
タンパク質の毎日の注射は、ob/obマウスの体重を劇的
に減少させ、野生型マウスの体重に対して有意な効果を
有したが、db/dbマウスに対しては影響を有さなかっ
た。これらのデータは、ＯＢ遺伝子座の遺伝子産物が体
重調節のための内分泌機能を提供することを示唆する。 Example 8: OB polypeptide (leptin)
Weight loss effect of the gene product at the mouse OB locus plays an important role in weight regulation. This example demonstrates that OB protein is circulating in mouse, rat, and human plasma. The circulating form in all three species is SDS-PA
According to GE, it has the same molecular weight as the putative polypeptide sequence without the signal sequence. This indicates that in vivo this protein is not processed after cleaving the signal sequence. OB protein is not present in plasma derived from C57 / B16J ob / ob mice and compared to control
It is present at a 10-fold higher concentration in the plasma of db / db mice, fa / fa
It was present at a 20-fold higher level in rat plasma. These obese animal mutants are suggested to be resistant to the effects of OB. There was a 7-fold difference in plasma levels of OB protein within the group of 6 lean human subjects. Recombinant mouse OB
Daily injection of protein dramatically reduced the weight of ob / ob mice and had a significant effect on body weight of wild-type mice but no effect on db / db mice . These data suggest that the gene product at the OB locus provides an endocrine function for weight control.

【０３８２】材料および方法 ウサギをフロイントアジュバント(HRP, Inc.)中の組換
えタンパク質で免疫した。免疫精製された抗マウスＯＢ
抗体を、記載されたように組換えタンパク質に結合させ
たsepharose 4Bカラムに抗血清を通過させることにより
調製した[Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY(1988)]。マウス血漿の免疫沈降を次のよう
に行った：約2.5mMのEDTAを含むマウス、ラット、およ
びヒト由来の血漿0.5mlを、結合していないsepharose-4
Bと揺り動かしながら室温で２時間予め明澄化(pre-clea
red)した。スピンによりsepharoseを取り出し、アフィ
ニティー精製した抗体を1mg/mlのパックされたsepharos
eの濃度で含む抗体結合sepharoseの50％スラリー50mlを
添加した。1/2mlの２×RIPA緩衝液を添加して最終結合
条件を次のようにした：50mM Tris-HCl, pH7.5、100mM
NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、0.5％デオキシコール酸
ナトリウム、および0.025％アジ化ナトリウム。反応を
揺らしながら４℃で一晩行った。抗体結合sepharoseをR
IPA緩衝液を用いて８回洗浄し、続いて、PBSを用いて３
回濯ぎ、15％のSDS-PAGE上で泳動した。タンパク質をニ
トロセルロースフィルターに移し、組換えタンパク質に
対するビオチン化した免疫精製抗体でウエスタンブロッ
トした。用いた二次抗体はHRP-ストレプトアビジンであ
り、ECLを検出に用いた。 Materials and Methods Rabbits were immunized with the recombinant protein in Freund's adjuvant (HRP, Inc.). Immunopurified anti-mouse OB
Antibodies were prepared by passing the antiserum over a sepharose 4B column conjugated to the recombinant protein as described [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY (1988)]. Immunoprecipitation of mouse plasma was performed as follows: 0.5 ml of plasma from mice, rats, and humans containing approximately 2.5 mM EDTA was unbound sepharose-4
Pre-clear for 2 hours at room temperature while rocking with B
red). Sepharose is removed by spinning, and affinity-purified antibody is added to 1 mg / ml packed sepharos.
50 ml of a 50% slurry of antibody-bound sepharose containing e concentration was added. The final binding conditions were as follows by adding 1/2 ml of 2 × RIPA buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM
NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, and 0.025% sodium azide. The reaction was carried out overnight at 4 ° C. with shaking. Antibody-bound sepharose R
Wash 8 times with IPA buffer, then 3 times with PBS
Rinse once and run on a 15% SDS-PAGE. Proteins were transferred to nitrocellulose filters and Western blotted with biotinylated immunopurified antibodies against recombinant proteins. The secondary antibody used was HRP-streptavidin, and ECL was used for detection.

【０３８３】マウス血清中のＯＢの量を定量するため
に、再びフォールディングした(refolded)組換えマウス
ＯＢタンパク質の量を増加させて(0.01、0.1、0.5、2.
0、15.0ng)100λのC57BL/6J ob/ob血漿に添加し、prote
in A sepharoseに結合した抗体と共に４℃で３時間イン
キュベートした。緩衝液Ａ(10mMリン酸ナトリウム緩衝
液, pH7.4；100mM NaCl；１％ Triton X-100、５mM EDT
A、１mM PMSF)による多数回の洗浄の後、サンプルをサ
ンプル緩衝液に再懸濁し、15％SDS-PAGEにロードして、
ニトロセルロースメンブレンに移した。免疫精製ビオチ
ン化抗アミノ末端抗体を一次抗体として、HRP-ストレプ
トアビジンを二次抗体として用いてウエスタンブロット
を行い、続いてECL検出を行った。To quantify the amount of OB in mouse serum, the amount of refolded recombinant mouse OB protein was increased (0.01, 0.1, 0.5, 2.
0, 15.0 ng) added to 100λ C57BL / 6J ob / ob plasma, prote
Incubated with antibody bound to in A sepharose at 4 ° C. for 3 hours. Buffer A (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4; 100 mM NaCl; 1% Triton X-100, 5 mM EDT
A, after many washes with 1 mM PMSF), the sample was resuspended in sample buffer, loaded on 15% SDS-PAGE,
Transferred to nitrocellulose membrane. Western blotting was performed using the immunopurified biotinylated anti-amino terminal antibody as the primary antibody and HRP-streptavidin as the secondary antibody, followed by ECL detection.

【０３８４】細胞質抽出物は脂肪組織をNDS緩衝液(10mM
Tris, pH7.5、10mM NaCl、60mM ICCI、0.15mMスペルミ
ン、0.5mMスペルミジン、14mM β-メルカプトエタノー
ル、0.5mM EGTA、２mM EDTA、0.5％ NP-40)中でpolytro
nおよびdounceホモジナイゼーションによってホモジナ
イズすることにより調製し、そして核の除去は700gでの
遠心分離によって行った。The cytoplasmic extract was prepared by removing adipose tissue from NDS buffer (10 mM
Polytro in Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0.15 mM spermine, 0.5 mM spermidine, 14 mM β-mercaptoethanol, 0.5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 0.5% NP-40)
Prepared by homogenization by n and dounce homogenization, and nuclei were removed by centrifugation at 700 g.

【０３８５】免疫沈降は、免疫精製抗ヒトＯＢ抗体を用
いたこと以外は、上記のように行った。ELISAに関して
は、免疫精製抗ヒトＯＢ抗体の1mg/ml溶液100mlをホウ
酸緩衝PBS溶液に溶解し、マイクロタイター(Corning ca
t.#2595)プレートに入れ一晩４℃でおいた。次いで、こ
のプレートを0.05%Tween20を含むホウ酸生理食塩水溶液
で４回洗浄し、余分な液体を除いた。プレートを室温で
２時間１ウェル当たり240mlの0.3%ゼラチンを含むホウ
酸生理食塩水溶液とともにインキュベートすることによ
りブロックし、次いで、洗浄して乾燥した。既知量の再
びフォールディングしたヒトＯＢタンパク質または血漿
サンプルのいずれかを100mlの容量で個々のウェル中４
℃で一晩インキュベートした。洗浄後、このプレートを
100mlのビオチン化免疫精製抗ヒト抗体（ゼラチン-ホウ
酸緩衝溶液中0.1mg/ml）とともに室温で４時間インキュ
ベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HR
P)-ストレプトアビジンをこのプレートに添加した（ホ
ウ酸緩衝液中0.1mg/ml、0.3%ゼラチン）。次いで、HRP
基質溶液（クエン酸中ABTS、0.3mg/mlおよびH₂O₂、0.01
%）を検出に用いてO.D.を414nmで測定して抗体の結合を
定量した。The immunoprecipitation was performed as described above, except that immunopurified anti-human OB antibody was used. For ELISA, 100 ml of a 1 mg / ml solution of the immunopurified anti-human OB antibody was dissolved in a borate buffered PBS solution, and the solution was added to a microtiter (Corning ca.
t. # 2595) The plate was placed at 4 ° C. overnight. Next, the plate was washed four times with a boric acid saline solution containing 0.05% Tween 20 to remove excess liquid. Plates were blocked by incubating with 240 ml per well of 0.3% gelatin in borate saline solution at room temperature for 2 hours, then washed and dried. A known amount of either the refolded human OB protein or a plasma sample was added to each well in a volume of 100 ml.
Incubated overnight at ° C. After washing, remove this plate
Incubated with 100 ml of biotinylated immunopurified anti-human antibody (0.1 mg / ml in gelatin-borate buffer) for 4 hours at room temperature. After washing, horseradish peroxidase (HR
P) -Streptavidin was added to the plate (0.1 mg / ml in borate buffer, 0.3% gelatin). Then HRP
Substrate solution (ABTS in citric acid, 0.3 mg / ml and H ₂ O ₂ , 0.01
%) Was used for detection and the OD was measured at 414 nm to quantify the antibody binding.

【０３８６】マウスおよびヒトＯＢ遺伝子コード配列
を、ＯＢ cDNA配列を含むプラスミドからPCR増幅し、pP
IC.9プラスミド(Invitrogen) にサブクローニングし
た。用いたヒト５’プライマーは 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG3'（配列
番号34） であり、そして３’プライマーは 5'GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC3'（配列番号35）
であった。The mouse and human OB gene coding sequences were PCR amplified from a plasmid containing the OB cDNA sequence and pP
It was subcloned into the IC.9 plasmid (Invitrogen). The human 5 'primer used was 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG3' (SEQ ID NO: 34) and the 3 'primer was 5'GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC3' (SEQ ID NO: 35).
Met.

【０３８７】マウスに関しては、５’プライマーは 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG3'（配列
番号36） であり、そして３’プライマーは 5'GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC3'（配列番号37）
であった。For the mouse, the 5 'primer is 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG3' (SEQ ID NO: 36) and the 3 'primer is 5'GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC3' (SEQ ID NO: 37).
Met.

【０３８８】マウスおよびヒトのどちらの５'プライマ
ーも、５'末端にXhoI部位、およびベクターpPIC.9内に
存在するα接合因子シグナル配列の最後の４アミノ酸の
コード配列を含む。このベクターは不均一に発現される
遺伝子の細胞から培養培地への分泌を支配する。５'PCR
プライマーはまた、シグナル配列開裂部位の後で21位の
アミノ酸アラニンの前のＯＢ遺伝子のオープンリーディ
ングフレームの最初の19ヌクレオチドを含む。３'プラ
イマーはその５'末端にEcoRI部位を含む。この部位のす
ぐ後ろに推定ＯＢ停止コドンと相補的な配列が続いてい
る。PCR条件は次の通りであった：94℃で１分間の変
性、55℃で１分間のアニーリング、そして72℃で2.5分
間の伸長。低サイクルPCR（15サイクル）および校正ポ
リメラーゼPFU(Stratagene）を用いてPCRによって生成
される変異の数を制限した。PCR産物をXhoIおよびEcoRI
によって消化し、そして同様に消化されたベクターpPI
C.9にクローニングした。全ての構築物を両方の鎖につ
いて配列決定し、PCRによって生成された変異がないこ
とを確認した。クローンを、スフェロプラスト法によっ
てPichia pastoris(His^-)にトランスフォームし、ヒス
チジン欠損培地で選択した。コロニーハイブリダイゼー
ションアッセイによって高コピー数の組み込みに関して
約200のマウスおよびヒトクローンがスクリーニングさ
れた。次いで、高コピー数のクローンを、ＯＢ発現につ
いてアッセイした。始めはクマシー染色によって、トラ
ンスフォームされた酵母の培養培地中に存在する新規な
16kDタンパク質の存在が示された。この16kDのバンド
は、細菌で発現されたＯＢタンパク質に対して生じた抗
体を用いてＯＢであることが確証された。この組換えタ
ンパク質は以下に記載する２段階の精製方法によって精
製された。質量分析および臭化シアン処理をBeavisら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6873-6877(1990)に記載の
ように行った。Both mouse and human 5 'primers contain an XhoI site at the 5' end and the coding sequence for the last 4 amino acids of the alpha mating factor signal sequence present in the vector pPIC.9. This vector governs the secretion of heterogeneously expressed genes from cells into the culture medium. 5 'PCR
The primer also contains the first 19 nucleotides of the OB gene open reading frame after the signal sequence cleavage site and before amino acid alanine at position 21. The 3 'primer contains an EcoRI site at its 5' end. Immediately after this site is a sequence complementary to the putative OB stop codon. PCR conditions were as follows: denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 55 ° C. for 1 minute, and extension at 72 ° C. for 2.5 minutes. Low cycle PCR (15 cycles) and the proofreading polymerase PFU (Stratagene) were used to limit the number of mutations generated by PCR. XhoI and EcoRI PCR products
Digested with and similarly digested vector pPI
Cloned in C.9. All constructs were sequenced on both strands to confirm that there were no mutations generated by PCR. Clones, Pichia pastoris by spheroplast method (His ^-) transformed to and selected on histidine deficient media. Approximately 200 mouse and human clones were screened for high copy number integration by colony hybridization assays. The high copy number clones were then assayed for OB expression. Initially, by Coomassie staining, the novel yeast present in the transformed yeast culture medium
The presence of a 16 kD protein was indicated. This 16 kD band was confirmed to be OB using an antibody raised against the OB protein expressed in bacteria. This recombinant protein was purified by a two-step purification method described below. Beavis et al. For mass spectrometry and cyanogen bromide treatment.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6873-6877 (1990).

【０３８９】マウスおよびヒトＯＢ遺伝子のＣ末端から
シグナル配列までの全ＯＢコード配列をpET15b発現ベク
ター(Novagen)にサブクローニングし、そしてEscherich
ia coli[BL21(DE3)plYsS]内でT7 RNAポリメラーゼ系を
用いて過剰発現させた[Studierら、Meth.Enzymology, 1
85:80-89(1990)]。30℃で595nmにおける吸光度が0.7に
なるまで増殖させ、そして0.5mMのイソプロピル-β-D-
チオガラクト-ピラノシドで一晩誘導した細胞を低速遠
心分離により回収した。溶解を３サイクルの凍結溶解に
よって行い、DNA消化はDNaseIを用いて行った。膜抽出
を超音波処理およびデタージェント可溶化(detergent s
olubilization)によって行い、そして最終封入体ペレッ
ト(final inclusion body pellet)を6Mグアニジン-HC
l、20mM HEPES,pH8.4に溶解した。組換えＯＢタンパク
質を、Niイオンアフィニティーカラムを用い、イミダゾ
ールの量を増加させながら洗浄するIMACによって、変性
条件下で精製した。次いで、精製された変性ＯＢタンパ
ク質を6Mグアニジン-HCl、10mM酢酸ナトリウム(NaAc),p
H5中で貯蔵し、そして1mM DTTを用いて室温で１時間還
元した。還元したタンパク質を20%グリセロール、5mM C
aCl₂、5mM NaAc, pH5に希釈し、混合して室温で８〜12
時間インキュベートすることによって変性を行った。変
性後、Trisを10mMまで添加することによりpHを8.4に調
整し、そしてヘキサ-ヒスチジンtagをトロンビン開裂に
よって除いた。開裂され、復元されたタンパク質をIMAC
によって再精製し、トロンビンおよび開裂されなかった
融合タンパク質から生成物を分離した。開裂され、復元
されたタンパク質はNiイオンアフィニティーカラムから
40mMイミダゾールで溶出するが、トロンビンは保持され
ず、そして開裂されなかった融合タンパク質は0.2mMイ
ミダゾールで溶出する。次いで、生成物を濃縮し、100m
M EDTAおよび10mMフェリシアン化カリウムで処理してPh
armacia superdex 75 16/60カラムを用いるゲル濾過に
よってさらに精製した。The entire OB coding sequence from the C-terminus of the mouse and human OB genes to the signal sequence was subcloned into the pET15b expression vector (Novagen) and Escherich
Overexpressed in ia coli [BL21 (DE3) plYsS] using the T7 RNA polymerase system [Studier et al., Meth. Enzymology, 1
85: 80-89 (1990)]. Grow at 30 ° C. to an absorbance at 595 nm of 0.7, and 0.5 mM isopropyl-β-D-
Cells induced overnight with thiogalacto-pyranoside were collected by low speed centrifugation. Lysis was performed by three cycles of freeze-thaw, and DNA digestion was performed using DNaseI. Sonicate membrane extraction and detergent solubilization (detergent s
olubilization), and the final inclusion body pellet is treated with 6M guanidine-HC.
l, dissolved in 20 mM HEPES, pH 8.4. Recombinant OB protein was purified under denaturing conditions by IMAC using a Ni ion affinity column and washing with increasing amounts of imidazole. Next, the purified denatured OB protein was added to 6 M guanidine-HCl, 10 mM sodium acetate (NaAc), p
Stored in H5 and reduced with 1 mM DTT for 1 hour at room temperature. Reduced protein to 20% glycerol, 5 mM C
aCl ₂ , diluted to 5 mM NaAc, pH 5, mixed and mixed at room temperature for 8-12
Denaturation was performed by incubating for hours. After denaturation, the pH was adjusted to 8.4 by adding Tris to 10 mM and the hexa-histidine tag was removed by thrombin cleavage. IMAC for cleaved and restored protein
To separate the product from thrombin and the uncleaved fusion protein. The cleaved and reconstituted protein is removed from the Ni ion affinity column.
The fusion protein elutes at 40 mM imidazole but does not retain thrombin, and the uncleaved fusion protein elutes at 0.2 mM imidazole. The product was then concentrated to 100 m
Ph treated with M EDTA and 10 mM potassium ferricyanide
Further purification by gel filtration using an armacia superdex 75 16/60 column.

【０３９０】EllmanアッセイをEllman,Arch.Biochem.Bi
ophys.,82:70-77(1959)に記載のように行った。Ellman
試薬は、39.6mgの5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸)
(DTNB)を10mlの0.05Mホスフェート、pH8に溶解すること
により調製した。較正曲線を10〜120mMの遊離スルフヒ
ドリル（還元DTTの1mMストック溶液を用いる）の濃度範
囲で412nmで構成した。各アッセイは0.02mlのEllman試
薬および総反応混合物0.5mlを用いて行った。測定され
た消衰係数は遊離スルフヒドリル基に関しては12974M^-1
cm^-1(相関係数0.99987)であり、これは、先に報告され
た値13600M^-1cm^-1の５％以内である。The Ellman assay was performed according to Ellman, Arch. Biochem. Bi.
ophys., 82: 70-77 (1959). Ellman
The reagent was 39.6 mg of 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)
(DTNB) was prepared by dissolving in 10 ml of 0.05 M phosphate, pH 8. The calibration curve was constructed at a concentration range of 10-120 mM free sulfhydryl (using a 1 mM stock solution of reduced DTT) at 412 nm. Each assay was performed with 0.02 ml of Ellman reagent and 0.5 ml of the total reaction mixture. The measured extinction coefficient is 12974 M ^{-1 for} free sulfhydryl groups
cm ⁻¹ (correlation coefficient 0.99987), which is within 5% of the previously reported value of 13600 M ⁻¹ cm ⁻¹ .

【０３９１】50mlの2mg/ml精製ゲル濾過タンパク質（最
終反応混合物中の可能な遊離スルフヒドリル濃度約24mM
に相当）をEllmanアッセイに供した。得られた溶液はＡ
₄₁₂が約0.02であり、このことはタンパク質中の２つの
システイン残基がシスチンを形成する酸化された状態で
あるか、またはそれらの遊離スルフヒドリル基が、フォ
ールディングしたタンパク質の近づきにくいコア内に完
全に埋まっていることを示唆する。同じアッセイを６Ｍ
グアニジン-HClの存在下でフォールディングされていな
いタンパク質に関して行うことによって同じ結果が得ら
れた。50 ml of 2 mg / ml purified gel-filtrated protein (possible free sulfhydryl concentration in the final reaction mixture of about 24 mM
Was subjected to the Ellman assay. The resulting solution is A
₄₁₂ is about 0.02, which means that the two cysteine residues in the protein are in an oxidized state forming cystine, or that their free sulfhydryl groups are completely within the inaccessible core of the folded protein. Indicates that it is buried. 6M for the same assay
The same result was obtained by performing on unfolded protein in the presence of guanidine-HCl.

【０３９２】マウスを病原体のない環境で個別にケージ
に入れ、35％(w/w)Laboratory Rodent Diet 5001(PMP F
eeds, Inc.)、5.9％(w/w)タピオカプリンミックス(Gene
ralFoods)、および59.1％水を含む飼料（エネルギー含
量1.30kcal/gm）に順応させた。この飼料はオートクレ
ーブで滅菌されそして60mmプラスチック皿（この皿は10
0mmのペトリ皿の頂部に固定されている）に詰めた。タ
ピオカは飼料に糊状の性質を与え、それにより動物が食
物をケージに散らかすのを困難にする。100mmの蓋によ
り動物がこぼした少量の食物を回収する。毎朝新鮮な食
物をケージに入れそして前日の皿を取り出して重量を量
った。重量の差は毎日の食物消費の尺度を提供する。組
換えタンパク質が食物摂取量および体重に与える影響は
３系統のマウスで測定された：C57Bl/6J ob/ob、C57 Bl
/Ks db/db、およびCBA/J +/+（Jackson Laboratoryから
購入）。30匹の各系統のマウスを10匹ずつの群に分け
た。各系統の１群には毎日300μlのPBS中5mg/g/日の用
量で再びフォールディングした細菌obタンパク質を腹腔
内(i.p.)に注射した。第２の群には同容量のPBSを腹腔
内注射した。これらのコントロールマウスに組換えタン
パク質をPBSで透析したものを注射した。このPBSはActi
clean ETOXカラムを用いてエンドトキシンを取り除かれ
た。第３群の動物には注射しなかった。食物摂取量を毎
日記録し、そして体重測定値を3.5週間隔で定期的に記
録した。ペアーフィーディング実験については、別の群
のｏｂマウスの食物摂取量は、タンパク質を与えられて
いるｏｂマウスによって消費される食物摂取量と日毎ベ
ースで(on a daily basis)一致した。Mice were individually caged in a pathogen-free environment and treated with 35% (w / w) Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP F
eeds, Inc.), 5.9% (w / w) tapioca pudding mix (Gene
ralFoods) and a diet containing 59.1% water (energy content 1.30 kcal / gm). The feed is sterilized in an autoclave and a 60 mm plastic dish (this dish contains 10
(Fixed to the top of a 0 mm petri dish). Tapioca imparts a pasty character to the feed, thereby making it difficult for animals to spread food into cages. Collect a small amount of food spilled by the animal with a 100 mm lid. Each morning, fresh food was placed in cages and the previous day's dishes were removed and weighed. Weight differences provide a measure of daily food consumption. The effect of the recombinant protein on food intake and body weight was measured in three strains of mice: C57Bl / 6J ob / ob, C57 Bl.
/ Ks db / db, and CBA / J + / + (purchased from Jackson Laboratory). Thirty mice of each strain were divided into groups of ten. One group of each strain was injected intraperitoneally (ip) with daily refolded bacterial ob protein at a dose of 5 mg / g / day in 300 μl of PBS. A second group was injected intraperitoneally with the same volume of PBS. These control mice were injected with dialyzed recombinant protein against PBS. This PBS is Acti
Endotoxin was removed using a clean ETOX column. A third group of animals was not injected. Food intake was recorded daily and body weight measurements were recorded periodically at 3.5 week intervals. For pair feeding experiments, the food intake of another group of ob mice was on a daily basis with the food intake consumed by protein-fed ob mice.

【０３９３】結果 ＯＢタンパク質はマウス、ラット、およびヒト血漿中を
循環している 組換えマウスおよびヒトＯＢタンパク質をpET 15b細菌
発現ベクター(Novagen)を用い、そしてPichia pastoris
（酵母の発現系で組換えタンパク質を培養培地に直接分
泌する）にクローニングすることにより調製した。酵母
で発現されるｏｂタンパク質は、カルボキシ末端からシ
グナル配列までの146アミノ酸を含む。ウサギを細菌タ
ンパク質(HRP,Inc.)で免疫した。抗体を免疫精製して(R
esearchGenetics)、免疫沈降、および血漿および脂肪組
織由来のタンパク質のウエスタンブロットに用いた。 Results The OB protein is circulating in mouse, rat, and human plasma. Recombinant mouse and human OB proteins were purified using the pET 15b bacterial expression vector (Novagen) and Pichia pastoris
(The recombinant protein is directly secreted into the culture medium in a yeast expression system). The ob protein expressed in yeast contains 146 amino acids from the carboxy terminus to the signal sequence. Rabbits were immunized with a bacterial protein (HRP, Inc.). Immunopurify the antibody (R
esearchGenetics), immunoprecipitation, and Western blot of proteins from plasma and adipose tissue.

【０３９４】マウスの血漿由来のＯＢタンパク質はSDS-
PAGEにより見かけの分子量16kDで移動した。電気泳動に
よる移動性が、シグナル配列を除去した後の酵母によっ
て分泌される組換えＯＢタンパク質と一致する（図24
A）。このタンパク質は、105位のコドンにナンセンス変
異を有するC57BL/6J ob/obマウス由来の血漿では検出さ
れなかった。いくつかの異なる抗血清は、cDNA配列から
予想された短縮された105残基ポリペプチド鎖を同定で
きなかった。The OB protein derived from mouse plasma was SDS-
PAGE migrated with an apparent molecular weight of 16 kD. Electrophoretic mobility is consistent with recombinant OB protein secreted by yeast after removal of the signal sequence (FIG. 24).
A). This protein was not detected in plasma from C57BL / 6J ob / ob mice having a nonsense mutation at codon 105. Several different antisera failed to identify the shortened 105 residue polypeptide chain predicted from the cDNA sequence.

【０３９５】db/dbマウスではコントロール動物に比べ
て循環タンパク質のレベルが10倍増大していることが観
察された（図24A）。野生型およびfa/faラット由来の血
漿の免疫沈降は、変異ラットにおけるＯＢタンパク質の
レベルが、野生型と比較して20倍増加していることを明
らかにした(図24B)。db変異は、結果としてｏｂマウス
に見られるのと同じ肥満型表現型になる(Baharyら、199
0、前出)。fattyのラットは、dbに相同な遺伝子内の劣
性変異の結果として肥満する(Truettら、1991、前
出）。マウス血漿中ＯＢのレベルを定量するために、組
換えタンパク質の量を増加させながら血清に添加して免
疫沈降させた(図24C)。組換えタンパク質の量の増加に
伴ってウエスタンブロットのシグナル強度の直線的増加
が見られた。マウス血漿中の天然タンパク質のシグナル
強度と標準との比較は、野生型マウスにおいて循環して
いるＯＢタンパク質のレベルは約20ng/mlであることを
示した。これらのデータは、免疫沈降およびウエスタン
ブロットが抗体過剰条件下で行われたことを示す。コン
トロールと比較して増加したレベルのＯＢタンパク質は
db/dbマウス由来の脂肪組織のタンパク質抽出物におい
ても見られる(図24D)。分泌されたタンパク質について
予想されたように、脂肪組織由来のタンパク質は粗膜画
分と一緒に分画された（データは示していない）。It was observed that the levels of circulating proteins were increased 10-fold in db / db mice compared to control animals (FIG. 24A). Immunoprecipitation of plasma from wild-type and fa / fa rats revealed that levels of OB protein in mutant rats were increased 20-fold compared to wild-type (FIG. 24B). The db mutation results in the same obese phenotype as seen in ob mice (Bahary et al., 199).
0, supra). Fatty rats become obese as a result of a recessive mutation in the gene homologous to db (Truett et al., 1991, supra). To quantify OB levels in mouse plasma, increasing amounts of recombinant protein were added to serum and immunoprecipitated (FIG. 24C). A linear increase in Western blot signal intensity was seen with increasing amounts of recombinant protein. Comparison of the signal intensity of the native protein in mouse plasma with a standard showed that the level of circulating OB protein in wild-type mice was about 20 ng / ml. These data indicate that immunoprecipitation and Western blot were performed under conditions of antibody overload. Increased levels of OB protein compared to control
It is also found in protein extracts of adipose tissue from db / db mice (FIG. 24D). As expected for secreted proteins, proteins from adipose tissue fractionated along with the crude membrane fraction (data not shown).

【０３９６】体重指数(Body Mass Index)(BMI=体重／身
長²)が25より小さい６人の痩身型ヒト被検者の血漿サン
プルを、ヒトタンパク質に対する免疫精製抗体を用いて
免疫沈降させた。免疫沈降した物質は、酵母で発現され
た146アミノ酸のヒトタンパク質で見られた電気泳動の
移動度と同じ移動度で移動した。シグナルの強度は６サ
ンプル間で有意に異なった（図25A）。オートラジオグ
ラフのデンシトメトリーは、個体HP1およびHP6における
レベルはおよそ５倍の差があり、他の被検者におけるレ
ベルは中間にあることを明らかにした。酵素連結免疫ア
ッセイ(ELISA)を、免疫精製された抗体およびスタンダ
ードとして再びフォールディングした細菌タンパク質を
用いて行った（下記参照）。得られた標準曲線を図25B
に示す。このアッセイを用いると、この６人のヒト血漿
サンプル中のＯＢタンパク質血漿レベルは２〜15ng/ml
の間で変化した（図25C）。HP6由来の血漿中のＯＢタン
パク質のレベルは免疫アッセイの直線範囲の外側にあ
り、≧15ng/mlである。これらの量的な差はウエスタン
ブロットで見られる差と相関していた。Plasma samples from six lean human subjects with a Body Mass Index (BMI = weight / height ² ) of less than 25 were immunoprecipitated using immunopurified antibodies against human proteins. The immunoprecipitated material migrated with the same mobility as electrophoresis seen with the 146 amino acid human protein expressed in yeast. The signal intensity was significantly different among the six samples (FIG. 25A). Autoradiographic densitometry revealed that levels in individuals HP1 and HP6 differed approximately 5-fold and levels in other subjects were intermediate. Enzyme-linked immunoassays (ELISA) were performed using immunopurified antibodies and refolded bacterial proteins as standards (see below). Figure 25B shows the resulting standard curve.
Shown in Using this assay, OB protein plasma levels in the six human plasma samples were 2-15 ng / ml.
(Figure 25C). Levels of OB protein in plasma from HP6 are outside the linear range of the immunoassay, ≧ 15 ng / ml. These quantitative differences correlated with those seen on Western blots.

【０３９７】予備データは、レプチンが少なくとも部分
的に別の１つのまたは複数のタンパク質と複合体化して
循環し得ることを示唆する。この結論は、組換えスタン
ダードに比べて血清の滴定曲線の形の不均一性に基づ
く。変性条件および非変性条件下でゲル濾過HPLCにより
ウサギ抗ＯＢカラムで免疫精製された多量のレプチンの
分析(ELISAおよびSDS-PAGEによりモニターした）は、Ｏ
Ｂポリペプチドが高分子量複合体のように振る舞うこと
を示唆した。しかし、これらのデータは予備的なままで
ある；もし必要であれば、ＯＢ結合タンパク質をさらに
特徴付けなければならない。Preliminary data suggests that leptin may at least partially complex and circulate with another protein or proteins. This conclusion is based on the heterogeneity of the serum titration curve shape compared to the recombinant standard. Analysis of large amounts of leptin immunopurified on rabbit anti-OB columns by gel filtration HPLC under denaturing and non-denaturing conditions (monitored by ELISA and SDS-PAGE)
This suggested that the B polypeptide behaved like a high molecular weight complex. However, these data remain preliminary; if necessary, the OB binding protein must be further characterized.

【０３９８】ＯＢタンパク質の構造的特徴 ＯＢタンパク質は２つのシステイン残基を有するので、
インビボの酸化条件下では分子内または分子間ジスルフ
ィド結合を形成し得る。サンプル緩衝液に還元剤を添加
してまたはしないでウエスタンブロットを繰り返した。
どちらの条件下でも、ヒト血清中のＯＢタンパク質はモ
ノマーとして移動した（データは示さない）。非還元条
件下ではdbマウス血清から免疫沈降したタンパク質が、
16kDのモノマーおよび約32kDのダイマーの両方のタンパ
ク質と一致した位置に検出された（図26A）。高分子量
部分が還元条件下で消失したことは、マウスＯＢ画分が
分子間ジスルフィド結合の形成を通じて高分子量種とし
て循環していることを示唆する。約80％のマウスＯＢが
約16kDのタンパク質として循環し、そして20％が約32kD
の形態で循環している。Structural Features of OB Protein Since the OB protein has two cysteine residues,
Under oxidizing conditions in vivo, it can form intramolecular or intermolecular disulfide bonds. Western blots were repeated with and without reducing agent in the sample buffer.
Under both conditions, the OB protein in human serum migrated as a monomer (data not shown). Under non-reducing conditions, protein immunoprecipitated from db mouse serum,
Both the 16 kD monomer and the ~ 32 kD dimer were detected at positions consistent with the protein (Figure 26A). The disappearance of the high molecular weight portion under reducing conditions suggests that the mouse OB fraction is circulating as a high molecular weight species through the formation of intermolecular disulfide bonds. About 80% of the mouse OB circulates as a protein of about 16 kD and 20% of about 32 kD
It circulates in the form of

【０３９９】マウスおよびヒトのタンパク質がPichia p
astori中で発現される場合に、同じ分子形態が見られる
[Abramsら、Immunol.Rev.,:5-24(1992)]。これらの研究
において、146アミノ酸の成熟ＯＢタンパク質に対応す
るDNA配列がpPIC.9ベクター(Invitrogen)内の酵母α接
合因子シグナル配列の下流にクローニングされた。ＯＢ
タンパク質を、マウスおよびヒトのタンパク質を発現す
る株の酵母培地から精製し、そして還元条件および非還
元条件下で電気泳動した（図26A）。マウスのタンパク
質は非還元条件下では主にダイマーとして酵母内で発現
され、還元剤存在下でモノマーとしてのみ発現された。
組換えヒトタンパク質はどちらの条件下でもモノマーの
位置に移動した（データは示さない）。The mouse and human proteins are Pichia p
The same molecular form is seen when expressed in astori
[Abrams et al., Immunol. Rev.,: 5-24 (1992)]. In these studies, the DNA sequence corresponding to the mature OB protein of 146 amino acids was cloned downstream of the yeast alpha mating factor signal sequence in the pPIC.9 vector (Invitrogen). OB
The protein was purified from mouse and human protein expressing strains of yeast medium and electrophoresed under reducing and non-reducing conditions (FIG. 26A). The mouse protein was mainly expressed in yeast as a dimer under non-reducing conditions, and was expressed only as a monomer in the presence of a reducing agent.
The recombinant human protein migrated to the monomer position under both conditions (data not shown).

【０４００】Pichia内で発現された精製ヒトタンパク質
は、質量分析1990(Beavis, 1990,前出)により測定され
た16,024±3Daの分子量を有した。この値は、１個の分
子内ジスルフィド架橋を含むタンパク質のアミノ酸配列
から計算した質量(16,024Da)と一致する。このタンパク
質の臭化シアン開裂産物のマトリックスアシストレーザ
ー脱着(Matrix-assisted laser desorption)質量分析
は、117位のシステインと167位のシステインとが分子内
ジスルフィド結合を通じて結合していることを示す（図
26B）。臭化シアンはカルボキシ末端からメチオニン残
基までを開裂する。The purified human protein expressed in Pichia had a molecular weight of 16,024 ± 3 Da as determined by mass spectrometry 1990 (Beavis, 1990, supra). This value is consistent with the mass (16,024 Da) calculated from the amino acid sequence of the protein containing one intramolecular disulfide bridge. Matrix-assisted laser desorption mass spectrometry of the cyanogen bromide cleavage product of this protein shows that cysteine at position 117 and cysteine at position 167 are linked through an intramolecular disulfide bond (Fig.
26B). Cyanogen bromide cleaves from the carboxy terminus to the methionine residue.

【０４０１】生物活性な組換えタンパク質の調製および
特徴付け マウスＯＢタンパク質は、E.coli内でpET 15bプラスミ
ドから、トロンビン開裂部位を含む20残基のN-末端のヘ
キサ-ヒスチジンtagを有する不溶性融合タンパク質とし
て発現された。細菌の封入体をグアニジン-HClを用いて
可溶化しそして固定化金属イオンアフィニティークロマ
トグラフィー(IMAC)を用いて変性条件下で精製した（図
27）。精製され、変性された融合タンパク質を還元、希
釈して室温で水溶液中で再びフォールディングさせた。
トロンビン開裂に続いて、さらに４つのN-末端残基(Gly
-Ser-His-Met；配列番号38)を含む復元した(renatured)
マウスＯＢタンパク質を、IMACによって（SDS-PAGEおよ
び質量分析による判定によると）＞98％均一まで再精製
した。マトリックスアシストレーザー脱着質量分析は、
16,414±3Daの質量を測定された（予想された質量＝16,
415Da）。還元および非還元SDS-PAGEゲルは共に、見か
けの分子量が16kDである単一の分子種を示した（データ
は示していない）。Preparation and Characterization of Biologically Active Recombinant Proteins The mouse OB protein was derived from the pET 15b plasmid in E. coli using an insoluble fusion with a 20-residue N-terminal hexa-histidine tag containing a thrombin cleavage site. Expressed as a protein. Bacterial inclusion bodies were solubilized with guanidine-HCl and purified under denaturing conditions using immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) (FIG.
27). The purified and denatured fusion protein was reduced, diluted and refolded in aqueous solution at room temperature.
Following thrombin cleavage, four additional N-terminal residues (Gly
-Ser-His-Met; SEQ ID NO: 38)
Mouse OB protein was repurified by IMAC (as determined by SDS-PAGE and mass spectrometry) to> 98% homogeneity. Matrix assisted laser desorption mass spectrometry
A mass of 16,414 ± 3 Da was measured (expected mass = 16,
415Da). Both reduced and non-reduced SDS-PAGE gels showed a single species with an apparent molecular weight of 16 kD (data not shown).

【０４０２】DP801 Molecular Size Detector(Protein
Solutions,Inc.)を用いる動的光散乱測定は、復元した
マウスＯＢタンパク質が主としてモノマー性であり、い
くつかはより高次の凝集物であることを示した。このタ
ンパク質をEDTAで処理して化学的に酸化した。次いで、
高分子量種をゲル濾過により除いた。さらなる動的光散
乱測定は、精製され復元された組換えマウスＯＢタンパ
ク質が単分散していることを確証した。リン酸緩衝生理
食塩水(PBS)に対して透析した後、細菌のエンドトキシ
ンをActiclean ETOXカラム(Stereogene Bioseparation
s,Inc.)を用いて除去した。タンパク質の最終収量は45m
g/lであった。[0402] DP801 Molecular Size Detector (Protein
Dynamic light scattering measurements using Solutions, Inc.) showed that the reconstituted mouse OB protein was primarily monomeric and some were higher order aggregates. This protein was treated with EDTA and chemically oxidized. Then
High molecular weight species were removed by gel filtration. Further dynamic light scattering measurements confirmed that the purified and reconstituted recombinant mouse OB protein was monodispersed. After dialysis against phosphate-buffered saline (PBS), bacterial endotoxin is purified using an Acticlean ETOX column (Stereogene Bioseparation
s, Inc.). 45m final protein yield
g / l.

【０４０３】精製され復元された組換えマウスＯＢタン
パク質についてEllmanアッセイを行い、その酸化状態を
評価した(Ellman,1959,前出)。復元されたタンパク質も
6Mグアニジン-HClによってフォールディングしないタン
パク質もどちらも遊離のスルフヒドリル含有量が＜0.5
％であることを示し、モノマー産物が分子内ジスルフィ
ド結合を含むことが示された。このことは再フォールデ
ィングした細菌性タンパク質の臭化シアン開裂生成物の
質量分析により確かめられた。The purified and reconstituted recombinant mouse OB protein was subjected to an Ellman assay to assess its oxidation state (Ellman, 1959, supra). The recovered protein
Both proteins that do not fold by 6M guanidine-HCl have a free sulfhydryl content of <0.5.
%, Indicating that the monomer product contains intramolecular disulfide bonds. This was confirmed by mass spectrometry of the cyanogen bromide cleavage product of the refolded bacterial protein.

【０４０４】ＯＢタンパク質の生物活性。 精製され、
復元された組換えマウスＯＢタンパク質を、５mg/kg/日
の腹腔内注射として10匹のC57B1/6J ob/ob(16週齢）、C
57Bl/Ks db/db（12週齢）、およびCBA/J +/+（８週齢）
マウスの群に毎日投与した。同数の動物にPBSを毎日注
射した。コントロール注射に用いたPBSは、タンパク質
を平衡化した後の透析物に由来した。３種のマウス系統
のさらに10匹の動物は注射を受けなかった。個々の動物
の食物摂取量を毎日モニターし、そしてその動物の体重
を３、４日おきに記録した。９群のマウスのそれぞれの
食物摂取量と体重の累積結果を図28A〜Fに示し、そして
データの統計学的な有意性を表１に示す。タンパク質を
注射したC57B1/6J ob/obマウスの食物摂取量は、最初の
注射の後有意に減少し、第５日目（すなわち、PBSの注
射を受けた動物の摂取量の約40％と同じレベルに安定し
たとき）まで減少し続けた(p＜0.001)。擬注射したＯＢ
マウスは３週間の研究期間を通じて、体重が減少しなか
った。タンパク質を与えたC57B1/6J ob/obマウスは、５
日後に体重が約10％減少した(p＜0.001)。これらの動物
は３週間の処理を通して体重が減少し続け、その時点
で、タンパク質を与えられていたｏｂ動物の体重は、平
均でそれらの始めの体重の60％まで減少していた(p.＜
0.0001)。別の群のｏｂマウスとタンパク質を与えられ
ているｏｂマウスとをペアフィードした。図29Bに示し
たデータは、ペアフィードしたマウスの体重の減少が組
換えタンパク質を与えられた動物より有意に少ないこと
を示す(p＜0.02)。タンパク質またはビヒクルのいずれ
かの注射を受けた２匹のマウスの写真は、タンパク質処
置の結果として外見に著しい違いを示している（図29
B）。このタンパク質の効果をさらに確かめるために、
各群の２匹のマウスの剖検を行った。タンパク質を与え
たｏｂマウスの総合的な視診により、体脂肪および肝臓
のサイズの劇的な減少が明らかにされた。dbマウスおよ
び野生型マウスの肝臓の重量は処置によって変化しなか
った。PBSの注射を受けたｏｂマウスの肝臓は5.04ｇお
よび5.02ｇであり、これに対して組換えタンパク質を与
えた動物のそれは2.23ｇおよび2.03ｇであった。ｏｂマ
ウスに特徴的な色の薄い脂肪肝とは対照的に、タンパク
質を与えたｏｂマウスの肝臓は、正常な肝臓の特徴であ
る濃い色をしていた（図29C）。肝臓の組織切片は、未
処置の動物は、タンパク質で処置した動物では著しく改
善された脂肪肝を有することを示した（データは示して
いない）。OB protein biological activity. Purified,
The reconstituted recombinant mouse OB protein was injected as an intraperitoneal injection of 5 mg / kg / day into 10 C57B1 / 6J ob / ob (16 weeks old), C
57Bl / Ks db / db (12 weeks old) and CBA / J + / + (8 weeks old)
Groups of mice were dosed daily. An equal number of animals were injected daily with PBS. The PBS used for control injection was derived from the dialysate after protein equilibration. An additional 10 animals of the three mouse strains did not receive injections. The food intake of each animal was monitored daily and the animal's body weight was recorded every 3 or 4 days. The cumulative food intake and body weight results for each of the nine groups of mice are shown in Figures 28A-F, and the statistical significance of the data is shown in Table 1. Food intake of C57B1 / 6J ob / ob mice injected with protein was significantly reduced after the first injection, and at day 5 (ie, about 40% of the intake of animals injected with PBS). (When level stabilized) (p <0.001). Mock injection OB
Mice did not lose weight over the three week study period. C57B1 / 6J ob / ob mice receiving the protein
After 10 days, weight was reduced by about 10% (p <0.001). These animals continued to lose weight throughout the three weeks of treatment, at which point the weight of the protein-fed ob animals had decreased on average to 60% of their initial weight (p. <
0.0001). Another group of ob mice and the ob mice receiving the protein were pair fed. The data shown in FIG. 29B show that the pair-fed mice lose significantly less weight than animals that received the recombinant protein (p <0.02). Pictures of two mice receiving either protein or vehicle injections show significant differences in appearance as a result of protein treatment (FIG. 29).
B). To further confirm the effect of this protein,
Necropsy of two mice in each group was performed. Comprehensive inspection of the protein-fed ob mice revealed a dramatic decrease in body fat and liver size. Liver weights of db and wild type mice did not change with treatment. The livers of ob mice receiving PBS injections were 5.04 g and 5.02 g, compared to 2.23 g and 2.03 g for animals receiving the recombinant protein. In contrast to the light-colored fatty liver characteristic of ob mice, livers of protein-fed ob mice were darker in color, characteristic of normal liver (FIG. 29C). Liver tissue sections showed that untreated animals had significantly improved fatty liver in animals treated with protein (data not shown).

【０４０５】このｏｂマウスとは対照的に、タンパク質
を与えたC57BL/Ks db/dbマウスの体重または食物摂取量
はビヒクルを与えたコントロール群と比較して有意差は
なかった（図28A〜F、表１）。db/dbマウスの３つ全て
の群は処置期間中に２〜５ｇ体重が減少した。ｄｂマウ
スの平均血糖値をグルコメーターを用いて測定し、それ
は全てのマウスで≧500mg/dlであった。このことは、こ
れらの動物が肥満症に続いて糖尿病を発症したことを示
す。ｄｂマウスの注射は、２週間後に終止した。In contrast to the ob mice, the body weight or food intake of C57BL / Ks db / db mice receiving protein was not significantly different from control group receiving vehicle (FIGS. 28A-F). , Table 1). All three groups of db / db mice lost 2-5 g body weight during the treatment period. The average blood glucose level of db mice was measured using a glucometer and was ≧ 500 mg / dl in all mice. This indicates that these animals developed diabetes following obesity. Injection of db mice ceased after 2 weeks.

【０４０６】野生型マウスでは、組換えｏｂタンパク質
の投与に続いて少ないが有意な体重減少があった（図28
A〜F、表１）。タンパク質注射の５日後、処置したマウ
スは平均0.5gの減少であったが、コントロールマウスは
0.4g増加していた(p＜0.02)。続く２回の時点では、タ
ンパク質を与えたマウスは毎日PBSを注射されたマウス
より有意に軽かった。体重変化の有意性は、後の時点で
は減少した。体重の減った動物では、食物摂取量はコン
トロール動物と有意差はなかった。PBSの注射は、注射
を受けなかったマウスと比較して少ないが有意な影響を
ｏｂ、ｄｂ、および野生型マウスの食物摂取量および体
重に及ぼした(p＜0.05)。The wild-type mice had a small but significant weight loss following administration of the recombinant ob protein (FIG. 28).
A to F, Table 1). Five days after protein injection, treated mice lost an average of 0.5 g whereas control mice
It increased by 0.4 g (p <0.02). At the next two time points, the mice receiving the protein were significantly lighter than the mice injected with PBS daily. The significance of weight change decreased at later time points. Food intake was not significantly different from control animals in animals that had lost weight. Injection of PBS had a lesser but significant effect on food intake and body weight of ob, db, and wild-type mice compared to non-injected mice (p <0.05).

【０４０７】[0407]

【表１】 [Table 1]

【０４０８】考察 ＯＢ遺伝子座位のタンパク質産物に対する内分泌機能
は、Colemanによって最初に示唆された。彼は、ob/obマ
ウスの体重が正常またはｄｂマウスに対する並体癒合(p
arabiotic union)の後減少することを示した(Coleman
ら、1978、前出)。上記に示した結果は、ＯＢタンパク
質が血流中で循環し、組換えタンパク質の注射が体重を
減少させることを示すことによりこの仮説を支持した。
ＯＢ遺伝子によってコードされる遺伝子産物の分子量は
およそ16kDであり、これは、カルボキシ末端からシグナ
ル配列までの146アミノ酸配列と等しい。組換えＯＢタ
ンパク質はPichia pastoris中で発現される場合には改
変されない。Pichiaにおける哺乳動物遺伝子の発現は、
一般に結果として、正しいタンパク質構造の形成に至る
[Creggら、Bio/Technology, 11:905-914(1993)]。これ
らの知見は、インビボでＯＢタンパク質がグリコシル化
されず、そして翻訳後にプロセスされないことを示唆す
る。このデータは、ＯＢタンパク質が、それ自身あるい
は血漿または脂肪組織内の他のタンパク質に非共有結合
している可能性を排除するものではない。このタンパク
質のタンパク質分解性開裂は排除されていないが、低分
子量形態のＯＢタンパク質は、どのような抗血清（４種
の抗ペプチド抗体を含む）を用いても検出されなかっ
た。 Discussion The endocrine function for protein products at the OB locus was first suggested by Coleman. He found that ob / ob mice weighed normal or parabolic fusion to db mice (p
arabiotic union) (Coleman
Et al., 1978, supra). The results presented above support this hypothesis by showing that OB protein circulates in the bloodstream and injection of recombinant protein reduces body weight.
The molecular weight of the gene product encoded by the OB gene is approximately 16 kD, which is equivalent to a 146 amino acid sequence from the carboxy terminus to the signal sequence. The recombinant OB protein is not modified when expressed in Pichia pastoris. Expression of mammalian genes in Pichia
Generally results in the formation of the correct protein structure
[Cregg et al., Bio / Technology, 11: 905-914 (1993)]. These findings suggest that the OB protein is not glycosylated and is not processed post-translationally in vivo. This data does not exclude the possibility that the OB protein is non-covalently associated with itself or other proteins in plasma or adipose tissue. Although proteolytic cleavage of this protein has not been ruled out, the low molecular weight form of the OB protein was not detected with any antiserum (including four anti-peptide antibodies).

【０４０９】ＯＢタンパク質は、２つのシステイン残基
を有し、ヒトにおいてはモノマーとして、マウスにおい
てはモノマーおよびダイマーとして循環している。分泌
される分子に典型的な分子内ジスルフィド結合は、ヒト
タンパク質がPichia pastris内で発現される場合に見出
され、このことは、それがインビボで存在しやすいこと
を示唆する。このことは、分子内ジスルフィド結合を有
する組換え細菌タンパク質の生物活性によって支持され
る。マウスＯＢタンパク質は、血漿中でモノマーおよび
ダイマーとして見出され得る。このモノマーおよびダイ
マーは、マウスＯＢタンパク質が酵母で発現される場合
に見られ、このマウスタンパク質がダイマーを形成する
傾向は、一次配列がヒトと比べて異なることに起因する
ことを示す。モノマーが生物活性を有することは明らか
であるが、ダイマーの機能的活性は不明である。The OB protein has two cysteine residues and circulates as a monomer in humans and as a monomer and dimer in mice. An intramolecular disulfide bond typical of a secreted molecule is found when the human protein is expressed in Pichia pastris, suggesting that it is likely to be present in vivo. This is supported by the biological activity of the recombinant bacterial protein with an intramolecular disulfide bond. Mouse OB protein can be found as a monomer and dimer in plasma. The monomers and dimers are found when the mouse OB protein is expressed in yeast, indicating that the propensity of the mouse protein to form a dimer is due to the different primary sequences as compared to humans. It is clear that the monomers have biological activity, but the functional activity of the dimer is unknown.

【０４１０】ｏｂマウスにおいてＯＢタンパク質が食物
摂取量および体重に与える影響は、劇的である。３週間
の処置の後、組換えタンパク質を毎日注射されたｏｂマ
ウスはその体重を40％減少させ、そしてコントロール動
物の40％程度の食物を消費した。さらに、処置されたｏ
ｂマウスの体重は、実験を終了した時点でもまだ平衡化
していなかった。ペアーフィーディング実験の結果は、
体重の減少が、食物摂取量およびエネルギー消費量の両
方に対する影響の結果であることを示す。従って、カロ
リー摂取量が、タンパク質を与えられたｏｂマウスの摂
取量に制限された別の群のｏｂマウスは、タンパク質を
与えた動物より体重減少が有意に少なかった。 ＯＢタ
ンパク質を与えて１日以内に、ob/obマウスの食物摂取
量が野生型マウスのそれよりも低いレベルに減少するこ
とは、ob/obマウスがＯＢタンパク質の効果に対して特
に感受性であることを示す。実際、ＯＢレセプターは、
これらの動物においてアップレギュレートされ得る。処
置されたｏｂマウスの食物摂取量は５日間の処置後には
比較的一定になった。もしこれがタンパク質が定常期レ
ベルに達したことの結果なら、このタンパク質が比較的
長い半減期を有することが示唆される[The Pharmacolog
ical Basis of Therapeutics, pp. 19-45, Goodman お
よびGilman編、Pergamon Press, New York, (1990)]。
この結論は、並体癒合実験のデータに一致する[Coleman
ら、1978、前出；Weigle, Int.J.Obesity,12:567-578(1
988)]。The effect of OB protein on food intake and body weight in ob mice is dramatic. After three weeks of treatment, ob mice injected daily with the recombinant protein lost 40% of their body weight and consumed as much as 40% of the food of control animals. In addition, treated o
b The weight of the mice had not yet equilibrated at the end of the experiment. The result of the pair feeding experiment is
Figure 4 shows that weight loss is the result of an effect on both food intake and energy expenditure. Thus, another group of ob mice, whose caloric intake was restricted to that of the protein-fed ob mice, had significantly less weight loss than the protein-fed animals. Within 1 day of feeding OB protein, the food intake of ob / ob mice is reduced to lower levels than that of wild-type mice, indicating that ob / ob mice are particularly sensitive to the effects of OB protein Indicates that In fact, the OB receptor is
It can be up-regulated in these animals. The food intake of the treated ob mice was relatively constant after 5 days of treatment. If this is the result of the protein reaching stationary phase levels, it indicates that the protein has a relatively long half-life [The Pharmacolog
ical Basis of Therapeutics, pp. 19-45, edited by Goodman and Gilman, Pergamon Press, New York, (1990)].
This conclusion is consistent with the data from the parallel fusion experiments [Coleman
1978, supra; Weigle, Int. J. Obesity, 12: 567-578 (1
988)].

【０４１１】実験の最初の２週間の間に、組換えタンパ
ク質が野生型マウスの体重に与える影響は小さいが、統
計的には有意であった。タンパク質を与えた野生型マウ
スとPBSを与えた野生型マウスとの間の体重の差は後の
時点でも維持されたが、データの統計的有意性は３週間
後に著しく減少した。初期の体重減少は、食物摂取量の
違いによると説明され得ない。おそらく、食物摂取量の
測定は、処置期間中の体重の１ｇの差を生じる減少を検
出するには正確さが十分ではなかった。この観察は、先
の実験の結果と異なる。先の実験では、野生型の齧歯類
が、ｄｂマウス、ｆａラット、視床下部を損傷したラッ
ト、および高カロリーの飼料によって肥満にさせたラッ
トとの並体癒合によって結合された[Colemanら、1978、
前出；Harrisら、1987、前出；Harrisら、「Physiologi
cal and metabolic changes in parabiotic partners o
f obese rats」、Hormones, Thermogenesis and Obesit
y,LardyおよびStraatman編、Elsevier Science Publish
ing Co., New York(1989)；Hervey、J.Physiol.,145:33
6-352(1959)]。それぞれの場合において、野生型動物は
食欲が減退し大量の体重が減少する。ｄｂマウスおよび
ｆａラットではＯＢタンパク質のレベルが増加し、そし
て視床下部を損傷したマウスではOB RNAのレベルが増加
するので、野生型マウスは、ＯＢタンパク質が十分に高
いレベルで血漿中を循環している場合には、ＯＢに応答
し得るようである。本明細書で報告される知見は、投与
されるタンパク質のレベルが内因性レベルよりも低かっ
たという可能性と一致し、それは、僅かに少ない体重で
平衡化することにつながる。処置されたマウスにおいて
ＯＢタンパク質の循環レベルを定量することは、この問
題を解決するであろう。マウスタンパク質の免疫アッセ
イは未だ利用し得ないが、免疫沈降は、循環ＯＢタンパ
ク質のレベルがタンパク質を与えた野生型マウスにおい
て実質的に上昇しないことを示唆した。[0411] During the first two weeks of the experiment, the effect of the recombinant protein on the weight of wild-type mice was small but statistically significant. Although the difference in body weight between wild-type mice fed protein and PBS-fed mice was maintained at later time points, the statistical significance of the data was significantly reduced after 3 weeks. Early weight loss cannot be explained by differences in food intake. Presumably, measurements of food intake were not accurate enough to detect a 1 g difference in body weight during the treatment period. This observation differs from the results of previous experiments. In previous experiments, wild-type rodents were bound by paranormal union with db mice, fa rats, rats with hypothalamic injuries, and rats rendered obese by a high-calorie diet [Coleman et al. 1978,
Harris et al., 1987, supra; Harris et al., Physiologi
cal and metabolic changes in parabiotic partners o
f obese rats '', Hormones, Thermogenesis and Obesit
y, Lardy and Straatman eds., Elsevier Science Publish
ing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol., 145: 33.
6-352 (1959)]. In each case, wild-type animals lose appetite and lose large amounts of weight. Wild-type mice circulate in plasma at sufficiently high levels of OB protein because db and fa rats have increased levels of OB protein, and mice with damaged hypothalamus have increased levels of OB RNA. If so, it appears to be able to respond to the OB. The findings reported herein are consistent with the possibility that the level of protein administered was lower than the endogenous level, which leads to equilibration with slightly less body weight. Quantifying circulating levels of OB protein in treated mice would solve this problem. Although immunoassays for mouse proteins are not yet available, immunoprecipitation suggested that levels of circulating OB protein were not substantially increased in wild-type mice fed the protein.

【０４１２】このタンパク質が野生型マウスに与える影
響の低さおよびｄｂマウスにおける応答の欠如により、
この処置が非特異的または有害な影響を有するというこ
とはありそうもない。全てのｄｂマウスは、それらがｏ
ｂタンパク質を与えられたか否かに関わらず、処置期間
中に少量の体重が減少した。ｄｂ動物は明らかに高血糖
症であり、体重の減少は糖尿病の結果であって、実験プ
ロトコルの結果ではないようである。C57BL/Ks db/dbマ
ウスは、しばしば糖尿病を発症し、この実験に用いられ
た動物の年齢で少量の体重が減少し始める(Colemanら、
1978、前出)。同様な年齢のC57Bl/6J ob/obマウスは、
著しい高血糖症を発症しない。これらの表現型的な違い
は、変異を有する系統間(C57Bl6J対C57Bl/Ks)の遺伝的
違いの結果であると考えられる(Colemanら、1978、前
出)。Due to the low effect of this protein on wild type mice and the lack of response in db mice,
It is unlikely that this treatment has nonspecific or detrimental effects. All db mice have o
A small amount of weight was lost during the treatment period, whether or not the b protein was given. The db animals are apparently hyperglycemic, and the weight loss appears to be a result of diabetes and not of the experimental protocol. C57BL / Ks db / db mice often develop diabetes and begin to lose a small amount of weight at the age of the animals used in this experiment (Coleman et al.,
1978, supra). C57Bl / 6J ob / ob mice of similar age,
Does not develop significant hyperglycemia. These phenotypic differences are thought to be the result of genetic differences between strains with mutations (C57Bl6J versus C57Bl / Ks) (Coleman et al., 1978, supra).

【０４１３】C57Bl/6J ob/obマウスにおけるＯＢ遺伝子
のcDNA配列から予想された短縮された105アミノ酸タン
パク質の検出の失敗は、変異タンパク質が分解されるか
翻訳されないかのどちらかであることを示唆する。しか
し、用いた抗血清がこの短縮されたタンパク質を検出し
ないという可能性は排除され得ない。ｄｂマウスにおけ
るｏｂタンパク質のレベルが野生型と比較して10倍増加
していることが観察されたことは、ｏｂタンパク質の効
果に対して耐性がある場合にはｏｂタンパク質が過剰に
産生されることを示唆する。これらのデータは、OB mRN
Aの研究と相関する。言及したように、先の実験は、マ
ウスｄｂ遺伝子およびラットｆａ遺伝子の変異（これら
は相同な染色体領域に位置する）が、体重を抑制する血
漿因子の過剰生産に結果として至ることを示した(Truet
tら、1991、前出；Coleman、1978、前出；Hervey、195
9、前出)。どちらの場合においても、変異動物がＯＢタ
ンパク質の効果に対して耐性であることが示唆された。
この可能性は、ＯＢタンパク質がｄｂマウスに投与され
た場合には体重または食物摂取量に影響を及ぼさないと
いう観察によって確認される。Failure to detect the truncated 105 amino acid protein predicted from the cDNA sequence of the OB gene in C57Bl / 6J ob / ob mice suggests that the mutant protein is either degraded or not translated I do. However, the possibility that the antiserum used does not detect this truncated protein cannot be ruled out. Observation of a 10-fold increase in the level of ob protein in db mice compared to wild-type indicates that overproduction of ob protein occurs when resistant to the effects of ob protein. Suggests. These data are stored in the OB mRN
Correlate with A study. As mentioned, previous experiments have shown that mutations in the mouse db and rat fa genes, which are located in homologous chromosomal regions, result in overproduction of body factors that suppress body weight ( Truet
et al., 1991, supra; Coleman, 1978, supra; Hervey, 195.
9, supra). In both cases, it was suggested that the mutant animals were resistant to the effects of the OB protein.
This possibility is confirmed by the observation that OB protein does not affect body weight or food intake when administered to db mice.

【０４１４】ヒトの肥満症は、ホルモンに比較的非応答
性である個人の血漿中のＯＢタンパク質のレベルの増加
と関連し得る。一方、ＯＢの発現の減少もまた肥満症に
つながる。この場合、「正常」（すなわち、不適切に低
い）レベルのこのタンパク質が見出され得る。したがっ
て、ヒト血漿中のＯＢタンパク質のレベルは、肥満症の
別の形態のマーカーであり得る。BMI＜25である痩身型
被検者の少人数の群では、低いナノグラムレベルの循環
ＯＢタンパク質がELISAによって検出される。重要なの
は、種々の濃度が示されたことにより、発現のレベルお
よび／またはタンパク質に対する感受性が体重の決定に
ある役割を果たし得るということが示唆されることであ
る。[0414] Human obesity can be associated with increased levels of OB protein in the plasma of individuals who are relatively unresponsive to hormones. On the other hand, reduced expression of OB also leads to obesity. In this case, "normal" (ie, inappropriately low) levels of this protein may be found. Thus, levels of OB protein in human plasma may be another form of marker for obesity. In a small group of lean subjects with a BMI <25, low nanogram levels of circulating OB protein are detected by ELISA. Importantly, the various concentrations indicated suggest that the level of expression and / or sensitivity to the protein may play a role in determining body weight.

【０４１５】このＯＢタンパク質の作用部位は不明であ
る。このタンパク質は、食物摂取量およびエネルギー消
費量のどちらにも影響する。これは両システムの変更
が、体重の調節に働くことを示す臨床研究[Leibelら、
N.Engl.J.Med.、332:621-628(1995)；Keeseyら、「Meta
bolic defense of the body weight set-point（体重セ
ットポイントの代謝的防御）」、Association for Rese
arch in Nervous and Mental Disease、pp.87-96、Stun
kardおよびStellar編、Raven Press, New York.(1984)]
と一致する知見である。視床下部は、体重を制御する経
路においてＯＢの下流にあるようであるが、直接的な影
響を種々の器官に及ぼすことは可能である。[0415] The site of action of this OB protein is unknown. This protein affects both food intake and energy expenditure. This is a clinical study [Leibel et al.
N. Engl. J. Med., 332: 621-628 (1995); Keesey et al., "Meta
bolic defense of the body weight set-point ”, Association for Rese
arch in Nervous and Mental Disease, pp.87-96, Stun
kard and Stellar, Raven Press, New York. (1984)]
This is a finding consistent with the above. The hypothalamus appears to be downstream of the OB in the body weight control pathway, but it is possible to have a direct effect on various organs.

【０４１６】実施例９：視床下部に損傷を受けたマウス
およびdb遺伝子座に変異を有するマウスにおけるOB RNA
の脂肪細胞における発現の増加 最近クローニングされたマウス肥満遺伝子(OB)の遺伝子
産物は、脂肪組織の量の調節に重要な役割を果たす。OB
RNAは、褐色脂肪を含むいくつかの異なる脂肪細胞貯蔵
部それぞれにおいてインビボでマウス脂肪細胞によって
特異的に発現される。それはまた、分化に誘導された培
養3T3-442A前脂肪細胞においても発現される。視床下部
に損傷を有するマウスおよびdb遺伝子座に変異を有する
マウスは、脂肪組織中で20倍高いレベルのOB RNAを発現
する。これらのデータは、db遺伝子および視床下部のど
ちらも、脂肪組織の量を調節する経路においてＯＢ遺伝
子の下流にあることを示唆し、そしてdb遺伝子座がＯＢ
レセプターをコードすることを示唆する先の実験と一致
する。db/dbおよび損傷マウスでは、OB RNAの発現レベ
ルにおける量的な差が脂肪細胞の脂質含有量と相関して
いた。脂肪細胞中でＯＢ遺伝子の発現レベルを調節する
分子は、ＯＢの作用部位でＯＢの効果を仲介する分子の
ように、体重の決定に重要な役割を果たしているようで
ある。Example 9: Mice with hypothalamic damage
RNA in mice with mutations at the loci and db loci
Increased expression in human adipocytes The recently cloned mouse obesity gene (OB) gene product plays an important role in regulating adipose tissue mass. OB
RNA is specifically expressed by mouse adipocytes in vivo in each of several different adipocyte reservoirs, including brown fat. It is also expressed in differentiated cultured 3T3-442A preadipocytes. Mice with hypothalamic lesions and mutations at the db locus express 20-fold higher levels of OB RNA in adipose tissue. These data suggest that both the db gene and the hypothalamus are downstream of the OB gene in a pathway that regulates adipose tissue mass, and that the db locus is
Consistent with previous experiments suggesting that it encodes a receptor. In db / db and injured mice, quantitative differences in OB RNA expression levels correlated with adipocyte lipid content. Molecules that regulate the level of expression of the OB gene in adipocytes, like those that mediate the effects of OB at the site of action of OB, appear to play an important role in determining body weight.

【０４１７】材料および方法 インサイチュハイブリダイゼーション 野生型(wt)およびdbマウスの同じ腹部領域由来の白色脂
肪(white fat)組織を、Richardsonら、Growth,Developm
ent & Aging,56:149-157(1992)によって記載された改変
方法に従って、同時にプロセスした。簡単にいうと、組
織をBouin溶液中で２時間４℃で固定した。次いで、そ
れらをエタノール濃度を10％から100％まで増加させる
連続処理（４℃で各５分間ずつ）により脱水した。組織
をキシレン（１時間）とそしてパラフィン（２時間）と
ともに65℃でさらにインキュベートした。包埋されたwt
およびdb/db脂肪組織を切片にし、後に同じ条件により
マウントした。薄切片を65℃で１時間ベイクし、そして
キシレン、およびエタノールの100％から50％の連続希
釈液（室温で各３分間ずつ）で処理した。ＯＢ遺伝子の
アンチセンスRNAプローブを、Sp6 RNAポリメラーゼプロ
モーターの上流の直鎖状化(linearized)されたＯＢ遺伝
子コード配列のインビトロ転写により合成した。インサ
イチュハイブリダイゼーションをSchaeren-Wiemersら、
Histochemistry,100:431-440(1993)に正確に従って行っ
た。 Materials and Methods In Situ Hybridization White fat tissue from the same abdominal region of wild-type (wt) and db mice was obtained from Richardson et al., Growth, Development
ent & Aging, 56: 149-157 (1992). Briefly, tissues were fixed in Bouin's solution for 2 hours at 4 ° C. They were then dehydrated by a continuous treatment (5 min each at 4 ° C.) increasing the ethanol concentration from 10% to 100%. The tissue was further incubated at 65 ° C. with xylene (1 hour) and with paraffin (2 hours). Embedded wt
And db / db adipose tissue was sectioned and later mounted under the same conditions. Thin sections were baked at 65 ° C. for 1 hour and treated with xylene and 100% to 50% serial dilutions of ethanol (3 minutes each at room temperature). An antisense RNA probe for the OB gene was synthesized by in vitro transcription of a linearized OB gene coding sequence upstream of the Sp6 RNA polymerase promoter. In situ hybridization was performed by Schaeren-Wiemers et al.
Histochemistry, 100: 431-440 (1993).

【０４１８】RNA調製および細胞培養 全RNAおよびノーザンブロットを記載されたように調製
した。間質血管細胞および脂肪細胞をRodbellに従って
調製し、そしてDaniら、Mol.Cell.Endocrinol.,63:199-
208(1989)；Rodbell,J.Biol.Chem.239:375-380(19 )に
従って、両画分からRNAを調製した。サブクローニング
後、3T3-F442細胞を、10％ウシ胎児血清を含むDulbecco
の改変Eagle培地（標準培地と規定した）中で生育させ
た[Daniら、"Molecular biology techniques in the st
udy of adipocyte differentiation（脂肪細胞の分化の
研究における分子生物学技術）"、Obesity in Europe v
ol 88, pp.371-376,BjorntorpおよびRossner編、Johon
Libbey Company Ltd.,London, England(1989)]。集密時
に、細胞を、2nMトリヨードチロニン (T3)および17nMイ
ンスリンを補足した標準培地中で処理した。12日後、上
記のようにRNAを調製した。RNA Preparation and Cell Culture Total RNA and Northern blots were prepared as described. Stromal vascular cells and adipocytes were prepared according to Rodbell, and Dani et al., Mol. Cell. Endocrinol., 63: 199-
RNA was prepared from both fractions according to 208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem. 239: 375-380 (19). After subcloning, 3T3-F442 cells were transformed with Dulbecco's containing 10% fetal bovine serum.
Grown in modified Eagle's medium (defined as standard medium) [Dani et al., "Molecular biology techniques in the st.
udy of adipocyte differentiation ", Obesity in Europe v
ol 88, pp. 371-376, edited by Bjorntorp and Rossner, John
Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. At confluence, cells were treated in standard medium supplemented with 2 nM triiodothyronine (T3) and 17 nM insulin. After 12 days, RNA was prepared as described above.

【０４１９】金チオグルコース処理(GTG) ２ヶ月齢の雌性CBA/Jマウスをオーロチオグルコース(au
rothioglucose)(SigmaCatalog No.A0632) 単回腹腔内注
射（用量0.2mg/g、正常生理食塩水中）で処置した。コ
ントロール動物には正常生理食塩水を注射した。処置の
１ヶ月後にマウスの体重を測定した。GTG処理後に20ｇ
以上体重が増加した処置動物由来の脂肪組織RNAを単離
した。Gold thioglucose treated (GTG) Two month old female CBA / J mice were treated with aurothioglucose (au
rothioglucose) (SigmaCatalog No. A0632) Treated with a single intraperitoneal injection (dose 0.2 mg / g, in normal saline). Control animals were injected with normal saline. One month after the treatment, the mice were weighed. 20g after GTG treatment
Adipose tissue RNA from the treated animals whose body weight was increased as described above was isolated.

【０４２０】結果 最近、ＯＢ遺伝子は脂肪組織で発現されることが見出さ
れた[Zhangら、Nature,372:425-432(1994)]。脂肪組織
は脂肪細胞、前脂肪細胞、線維芽細胞、および血管細胞
を含む多くの細胞タイプから成るので、インサイチュハ
イブリダイゼーションをセンスおよびアンチセンスＯＢ
リボプローブを用いて正常動物の精巣上体脂肪パッドの
薄切片に対して行った[Richardsonら、1992、前出；Was
serman,"The concept of the fat organ（脂肪器官の概
念）"、Rodhal,Issekutz,fat asa tissue",pp.22-92,Mc
Graw Hill,New York(1964)]。アンチセンスプローブを
用いる場合、ポジティブシグナルは薄切片中の全ての脂
肪細胞において検出された。（図30、Wtと標記した）。
アンチセンスプローブを脳の薄切片とハイブリダイズさ
せた場合、シグナルは示されなかった（データは示さ
ず）。C57Bl/Ks db/dbマウス由来の脂肪組織の薄切片へ
のアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションは、
著しく増加し、そのことは、OB RNAの脂肪細胞特異的発
現を確証し、そしてこれらの動物における脂肪細胞当た
りのOB RNAレベルの大きな増加を示した（図30、db/db
と標記した）。db遺伝子座におけるマウスの変異は、C5
7Bl/6J ob/obマウスに見られる症候群と表現型的に同一
の症候群の一部としての広範囲の肥満である(Bahary
ら、1990、前出)。 Results Recently, the OB gene was found to be expressed in adipose tissue [Zhang et al., Nature, 372: 425-432 (1994)]. Because adipose tissue is composed of many cell types, including adipocytes, preadipocytes, fibroblasts, and vascular cells, in situ hybridization is sense and antisense OB
Was performed on thin sections of normal animal epididymal fat pads using riboprobes [Richardson et al., 1992, supra;
serman, "The concept of the fat organ", Rodhal, Issekutz, fat asa tissue, pp. 22-92, Mc
Graw Hill, New York (1964)]. When using an antisense probe, a positive signal was detected in all adipocytes in thin sections. (FIG. 30, labeled Wt).
No signal was shown when the antisense probe was hybridized to a thin section of the brain (data not shown). Hybridization of an antisense probe to a thin section of adipose tissue from C57Bl / Ks db / db mouse
Significantly increased, confirming adipocyte-specific expression of OB RNA and indicating a large increase in OB RNA levels per adipocyte in these animals (FIG. 30, db / db
With the title). The mouse mutation at the db locus is C5
Extensive obesity as part of a syndrome phenotypically identical to the syndrome seen in 7Bl / 6J ob / ob mice (Bahary
Et al., 1990, supra).

【０４２１】OB RNAは、脂肪細胞から分離された脂肪組
織間質細胞によって合成されなかった。予想したよう
に、脂肪細胞画分中の細胞はノーザンブロットを用いる
とOB RNAを発現していた（図31）。RT-PCRを用いても同
じ結果が得られた（データは示さず）。これらのデータ
は、脂肪細胞のみがＯＢ遺伝子を発現するという結論を
支持する。培養された脂肪細胞由来のデータはこの結論
を確証する。これらの研究において、3T3-F442A細胞
は、脂肪細胞への分化につながる細胞プログラムの一部
としての脂質蓄積を導く条件を用いて、培養された。OB
RNAは指数関数的に増殖する細胞内で発現されたので
も、集密3T3-F442A前脂肪細胞（初期のマーカーを発現
する）内で発現されたのでもない。しかし、これらの細
胞の脂肪細胞への分化は、検出可能なレベルのOB RNAの
発現につながった（図31）[Daniら、J.Biol.Chem.,264:
10119-10125(1989)]。OB RNAのレベルは、培養条件に非
常に感受性である。なぜなら、インスリンに曝されなか
った後期の集密後(post-confluent)細胞では、メッセー
ジが観察されなかったからである。[0421] OB RNA was not synthesized by adipose tissue stromal cells isolated from adipocytes. As expected, cells in the adipocyte fraction expressed OB RNA using Northern blot (FIG. 31). The same results were obtained using RT-PCR (data not shown). These data support the conclusion that only fat cells express the OB gene. Data from cultured adipocytes confirm this conclusion. In these studies, 3T3-F442A cells were cultured using conditions that lead to lipid accumulation as part of a cell program that leads to adipocyte differentiation. OB
RNA was not expressed in exponentially growing cells, nor was it expressed in confluent 3T3-F442A preadipocytes (expressing early markers). However, differentiation of these cells into adipocytes led to the expression of detectable levels of OB RNA (FIG. 31) [Dani et al., J. Biol. Chem., 264:
10119-10125 (1989)]. OB RNA levels are very sensitive to culture conditions. This is because no messages were observed in late post-confluent cells that were not exposed to insulin.

【０４２２】ハイブリダイゼーション研究は、OB RNAが
精巣上体、子宮傍組織、腹部、腎周囲、および鼠蹊部の
脂肪パッドを含むいくつかの異なる脂肪貯蔵部において
インビボで発現されることを示した（図32A）。各貯蔵
部における正確な発現レベルはいくらか可変であり、鼠
蹊部および子宮傍組織の脂肪はより低いレベルのOB RNA
を発現した。OB RNAはまた、褐色脂肪組織でも発現され
るが、発現レベルは他の脂肪組織貯蔵部と比べて褐色脂
肪内ではおよそ50倍低い。これらの量的な違いは、先に
報告された異なる脂肪細胞貯蔵部間の細胞サイズの違い
と緩やかに相関している[Johnsonら、J.Lipid Res.,13:
2-11(1972)]。褐色脂肪中のOB RNAの量は低温に曝され
ることによって影響を受けない（図32B）。この実験で
は、カップリングしていないタンパク質RNA(UCP)のレベ
ルは低温に曝された後に褐色脂肪中で増加したが、ob R
NAレベルは変化しなかった[Jacobssonら、J.Biol.Che
m.,260:16250-16254(1985)]。凝集体において、これら
のデータは、全ての脂肪細胞がOB RNAを産生し得、そし
て異なる脂肪貯蔵部で種々の発現レベルを示すことを確
証する。これらのデータは、コードされたタンパク質の
レベルが脂肪組織の総量と相関するという可能性を支持
する。Hybridization studies have shown that OB RNA is expressed in vivo in several different fat stores, including epididymis, parametrial tissue, abdomen, perirenal, and inguinal fat pads ( (Figure 32A). The exact expression level in each depot is somewhat variable, and the groin and parauterine tissue fat has lower levels of OB RNA
Was expressed. OB RNA is also expressed in brown adipose tissue, but expression levels are approximately 50-fold lower in brown adipose compared to other adipose tissue stores. These quantitative differences moderately correlate with the previously reported differences in cell size between different adipocyte reservoirs [Johnson et al., J. Lipid Res., 13:
2-11 (1972)]. The amount of OB RNA in brown fat is not affected by exposure to low temperatures (FIG. 32B). In this experiment, uncoupled protein RNA (UCP) levels increased in brown fat after exposure to low temperatures, but ob R
NA levels did not change [Jacobsson et al., J. Biol.
m., 260: 16250-16254 (1985)]. In aggregates, these data confirm that all adipocytes can produce OB RNA and show different expression levels in different fat stores. These data support the possibility that the level of the encoded protein correlates with the total amount of adipose tissue.

【０４２３】db/dbマウスおよび視床下部に損傷を受け
たマウスにおけるOB RNAレベルを測定した。腹内側視床
下部(VMH)の損傷は、ob/obマウスおよびdb/dbマウスに
見られるのと似た症候群の一部としての肥満症に至る[B
rayら、Metabolism,24:99-117(1975)]。並体癒合実験
は、そのような損傷が結果として血液によって運ばれる
食物摂取量および体重を抑制する因子の過剰発現につな
がることを示唆する(Hervay,1959,前出)。db遺伝子座に
変異を有するマウス変異体を正常マウスと並体癒合させ
る場合、同様の結果が示され、このことは、ＯＢレセプ
ターがdb遺伝子座によってコードされ得ることを示唆す
る(Coleman等、1978、前出）。従って、VMH損傷およびd
b変異の結果に由来する肥満症は、ＯＢタンパク質の効
果に対する耐性の結果であり得る。もしそうなら、脂肪
組織中のOB RNAのレベルの二次的な増加が予想される。OB RNA levels were measured in db / db mice and mice with hypothalamic injury. Damage of the ventromedial hypothalamus (VMH) leads to obesity as part of a syndrome similar to that seen in ob / ob and db / db mice [B
ray et al., Metabolism, 24: 99-117 (1975)]. Parabolic fusion experiments suggest that such damage results in overexpression of factors that suppress blood-borne food intake and body weight (Hervay, 1959, supra). Similar results are shown when mice mutants with mutations at the db locus are parazygously fused to normal mice, suggesting that the OB receptor can be encoded by the db locus (Coleman et al., 1978). , Supra). Therefore, VMH damage and d
Obesity resulting from the b mutation may be the result of resistance to the effects of the OB protein. If so, a secondary increase in the level of OB RNA in adipose tissue is expected.

【０４２４】化学物質金チオグルコース(GTG)を用いて
雌性CBAマウスに視床下部損傷を誘導した(Debonsら、Fe
d.Proc.,36:143-147(1977)]。この処置は結果として視
床下部（主として腹内側視床下部(VMH)）に特定された
損傷を生じ、続いて、数週間のうちに肥満症が発症し
た。通常、単回のGTG腹腔内注射(0.2mg/gm体重)の結
果、４週間以内に肥満症が発症する。１ヶ月齢の雌性CB
A/Jマウス(20〜25g)をGTGで処置し、その後の体重増加
の処置およびコントロール動物を示す（表２）。脂肪組
織RNAをdb/dbマウスおよび＞20gm体重増加したこれらGT
G処置動物から調製した。ノーザンブロットは、２ヶ月
齢のdb/dbマウスおよびGTG処置マウスでは正常動物に比
べてOB RNAレベルが20倍増加していることを示した（図
33）。The chemical substance gold thioglucose (GTG) was used to induce hypothalamic injury in female CBA mice (Debons et al., Fe
d. Proc., 36: 143-147 (1977)]. This treatment resulted in specific damage to the hypothalamus, primarily the ventromedial hypothalamus (VMH), followed by obesity in the coming weeks. Usually, as a result of a single intraperitoneal injection of GTG (0.2 mg / gm body weight), obesity develops within four weeks. 1 month old female CB
A / J mice (20-25 g) were treated with GTG, followed by treatment for weight gain and control animals are shown (Table 2). Adipose tissue RNA gained by db / db mice and> 20 gm body weight of these GTs
Prepared from G-treated animals. Northern blot showed that 2-month-old db / db mice and GTG-treated mice had a 20-fold increase in OB RNA levels compared to normal animals (Fig.
33).

【０４２５】[0425]

【表２】 [Table 2]

【０４２６】２ヶ月齢の雌性CBA/Jマウスを金チオグル
コース(GTG)で処置した。金チオグルコース(Sigma A063
2)を正常生理食塩水中で2.0mg/gの用量で腹腔内投与し
た。コントロールおよび処置動物の体重を注射の前およ
び１ヶ月後に記録した。１つのケージに５匹の動物をい
れ、自由に摂食させた。注射の１ヶ月後に増えた体重の
量を表２に示す。注射１ヶ月後に体重が20ｇ以上増加し
た動物を更なる研究用に選択した。[0447] Two month old female CBA / J mice were treated with gold thioglucose (GTG). Gold thioglucose (Sigma A063
2) was administered intraperitoneally at a dose of 2.0 mg / g in normal saline. Control and treated animal body weights were recorded before and one month after injection. Five animals were placed in one cage and fed ad libitum. Table 2 shows the amount of weight gained one month after the injection. Animals that gained more than 20 g one month after injection were selected for further study.

【０４２７】考察 マウスＯＢ遺伝子の遺伝子産物はマウスおよびヒトとの
血漿中で循環する。ここでは、その産物は脂肪組織の質
量を調節するように作用し得る。ＯＢの作用の発現およ
びメカニズムの調節に関するさらなる研究は、体重を調
節する生理学的経路についての理解にとって重要な示唆
を有するであろう。 Discussion The gene product of the mouse OB gene circulates in the plasma of mice and humans. Here, the product may act to regulate the mass of adipose tissue. Further studies on the regulation of the manifestation and mechanism of action of OB will have important implications for understanding the physiological pathways regulating body weight.

【０４２８】この実施例はＯＢ遺伝子産物が脂肪組織貯
蔵部中の脂肪細胞によって著しく発現されることを示
す。この結果は、ＯＢ遺伝子のタンパク質産物が身体の
脂質貯蔵と相関するという可能性と一致する。さらに、
OB RNAは、dbマウスおよび視床下部損傷を受けたマウス
において20倍アップレギュレートされる。これらの動物
においては、細胞当たりのOB RNAレベルの実際の増加は
20倍より高いようである。なぜなら、脂肪細胞の細胞サ
イズはこれらの動物において約５倍増加しているからで
ある（図30参照）(Debonsら、1977、前出）。これらの
データはdb遺伝子および視床下部が体重を調節する経路
においてＯＢの下流にあると位置づけ、そしてＯＢレセ
プターがｄｂ遺伝子座でコードされるという仮説に一致
する[Colemanら、Diabetologia 14:141-148(1978)]。Ｏ
Ｂレセプター遺伝子および／またはdb遺伝子の分子クロ
ーニングがこの問題を解決するであろう。db/dbマウス
およびGTG処置マウスにおけるOB RNAレベルの増加もま
た、脂肪細胞におけるＯＢ遺伝子産物の非細胞自律機能
を示唆する[Ashwellら、Proc.R.Soc.Lond.,195:343-353
(1977)；Ashwellら、Diabetologia,15:465-470]。従っ
て、コードされたタンパク質が脂肪細胞に直接作用して
成長または分化を阻害するならば、GTG処置されたマウ
スにおける野生型OB遺伝子の過剰発現は、結果として痩
身型表現型となる。This example shows that the OB gene product is significantly expressed by adipocytes in adipose tissue stores. This result is consistent with the possibility that the protein product of the OB gene correlates with lipid storage in the body. further,
OB RNA is up-regulated 20-fold in db mice and mice with hypothalamic injury. In these animals, the actual increase in OB RNA levels per cell is
Seems higher than 20 times. Because the cell size of adipocytes is increased about 5-fold in these animals (see FIG. 30) (Debons et al., 1977, supra). These data position the db gene and the hypothalamus downstream of OB in the pathway that regulates body weight, and are consistent with the hypothesis that the OB receptor is encoded at the db locus [Coleman et al., Diabetologia 14: 141-148. (1978)]. O
Molecular cloning of the B receptor gene and / or the db gene will solve this problem. Increased OB RNA levels in db / db and GTG-treated mice also indicate non-cell autonomous function of OB gene product in adipocytes [Ashwell et al., Proc. R. Soc. Lond., 195: 343-353.
(1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15: 465-470]. Thus, if the encoded protein acts directly on adipocytes to inhibit growth or differentiation, overexpression of the wild-type OB gene in GTG-treated mice will result in a lean phenotype.

【０４２９】このデータの最も注意深い(parsimonious)
説明は、ＯＢタンパク質が脂肪細胞によって分泌される
内分泌シグナル分子として機能し、視床下部に直接ある
いは間接的に作用するというものである。視床下部への
直接の影響には、ＯＢ遺伝子産物が血液脳関門を通過す
ることを可能にするメカニズムの存在が必要である。脳
室周囲器官(circumventricular organ)および／または
特定の輸送体を含むメカニズムが、ＯＢ遺伝子によって
コードされるサイズの分子を脳へ進入させ得るであろう
[Johnsonら、FASEB J.,7:678-686(1983)；Bauraら、J.C
lin.Invest.,92:1824-1830(1993)；Pardridge, Endocri
ne Reviews,7:314-330(1986)]。しかし、この仮説は、
タンパク質を血液脳関門を通過させ得る手段が同定され
るまでは注意して考慮されなければならない。さらに、
他の標的器官におよぼす可能な影響が評価されることが
必要であろう。The most parsimonious of this data
The explanation is that the OB protein functions as an endocrine signal molecule secreted by adipocytes and acts directly or indirectly on the hypothalamus. Direct effects on the hypothalamus require the presence of a mechanism that allows the OB gene product to cross the blood-brain barrier. Mechanisms involving circumventricular organs and / or specific transporters could allow molecules of the size encoded by the OB gene to enter the brain
[Johnson et al., FASEB J., 7: 678-686 (1983); Baura et al., JC
lin. Invest., 92: 1824-1830 (1993); Pardridge, Endocri
ne Reviews, 7: 314-330 (1986)]. However, this hypothesis
Care must be taken into account until means have been identified that allow proteins to cross the blood-brain barrier. further,
Possible effects on other target organs will need to be evaluated.

【０４３０】ＯＢ遺伝子の発現レベルの量的な変動の原
因である脂肪細胞シグナルは未だ知られていないが、脂
肪細胞の細胞サイズの差と相関する。db/dbマウスの脂
肪細胞は正常マウスのそれの５倍の大きさであり、細胞
サイズはおよそ1.0μｇ脂質／細胞である(Johnsonら、1
972、前出）。先の証拠は、脂肪細胞の脂質含有量およ
び／またはサイズが体重決定の重要なパラメーターであ
ることを示した[Faustら、Am.J.Physiol.,235:279-286
(1978)；Faustら、Science,197:393-396(1977)]。各脂
肪細胞は、細胞サイズに比例してさらに増加する低レベ
ルのOB RNAを発現し得る。細胞サイズは意味のあるパラ
メーターではなく、db/dbマウスおよびVMH損傷マウスの
脂肪細胞内のＯＢ遺伝子発現を増加させる細胞内シグナ
ルと単に相関することもあり得る。どの場合も、OB RNA
の合成を調節するシグナル伝達経路の要素が体重の決定
には重要であるようである。コードされたタンパク質に
対する感受性を減少させる影響が働くにつれ、ＯＢの発
現レベルを低下させる遺伝的および環境的影響が働いて
体重を増加させるであろう。ＯＢ遺伝子の発現レベルを
調節する特定の分子は、未だ不明であり、OB RNAのレベ
ルにおける量的な変動につながる遺伝子コントロールの
レベルの決定、およびＯＢ遺伝子の調節因子の研究が待
たれる。脂肪細胞におけるＯＢ遺伝子の発現を調節する
分子、およびコードされたタンパク質の効果をその作用
部位で仲介する分子の同定は、体重を調節する生理学的
メカニズムに対する理解を大いに高めるであろう。The fat cell signal responsible for the quantitative fluctuations in the expression level of the OB gene is not yet known, but correlates with the difference in the cell size of the fat cell. The adipocytes of db / db mice are five times larger than those of normal mice, and the cell size is approximately 1.0 μg lipid / cell (Johnson et al., 1).
972, supra). Previous evidence has shown that lipid content and / or size of adipocytes is an important parameter for weight determination [Faust et al., Am. J. Physiol., 235: 279-286.
(1978); Faust et al., Science, 197: 393-396 (1977)]. Each adipocyte can express low levels of OB RNA, which further increases in proportion to cell size. Cell size is not a meaningful parameter and may simply correlate with intracellular signals that increase OB gene expression in adipocytes of db / db and VMH-lesioned mice. In each case, OB RNA
It appears that elements of the signaling pathway that regulate the synthesis of are important in determining body weight. As the effect of reducing susceptibility to the encoded protein acts, genetic and environmental effects that reduce the expression levels of OB will work to increase weight. The specific molecules that regulate the expression level of the OB gene are still unknown, and the determination of the level of gene controls leading to quantitative fluctuations in the level of OB RNA and the study of modulators of the OB gene are awaited. Identification of molecules that regulate the expression of the OB gene in adipocytes, and those that mediate the effects of the encoded protein at its site of action, will greatly enhance our understanding of the physiological mechanisms that regulate body weight.

【０４３１】実施例10: RNA発現パターンおよび第7染色
体の物理的、細胞遺伝学的、遺伝学的地図におけるマッ
ピング OB RNAはヒトの脂肪組織において高いレベルで発現し、
そして胎盤および心臓においてはかなり低いレベルで発
現する。ヒトOB遺伝子地図は、染色体7q31.3に由来する
大きな酵母人工染色体(YAC)コンティグに、マッピング
される。マウス-ヒト比較マッピングに基づいて遺伝子
の相対位置を確証することに加えて、この研究は、ヒト
OB遺伝子に物理的に近接した位置にある、8つの確立さ
れたマイクロサテライトマーカーを同定した。マウスOB
における突然変異は、ヒトの病的肥満に非常に類似する
症候群を生じさせ得るので、これらの遺伝マーカーは、
ヒト肥満症の遺伝形態におけるOB遺伝子の可能な役割を
研究するための重要なツールを表す。 Example 10: RNA expression pattern and seventh staining
Map on the physical, cytogenetic and genetic map of the body
Ping OB RNA is expressed at high levels in human adipose tissue,
It is expressed at much lower levels in the placenta and heart. The human OB genetic map maps to a large yeast artificial chromosome (YAC) contig derived from chromosome 7q31.3. In addition to validating the relative location of genes based on mouse-human comparison mapping, this study
Eight established microsatellite markers were identified that were physically close to the OB gene. Mouse OB
Since mutations in can result in a syndrome very similar to morbid obesity in humans, these genetic markers
It represents an important tool for studying the possible role of the OB gene in the genetic form of human obesity.

【０４３２】材料と方法 ノーザンブロット分析 全RNAを脂肪組織からChirgwinら、Biochem., 18:5294-5
299(1979)の方法を用いて調製した。ノーザンブロッ
ト、放射性標識法、およびハイブリダイゼーションは記
述(Zhangら、1994、上記)に従って行った。ポリA⁺ RNA
(ヒトMTN、ヒトMTNII、およびヒト胎児MTNII)のノーザ
ンブロットは、放射性標識化したヒトアクチンプローブ
を生成するために用いられるPCRプライマーと同様に、C
LONETECH(Palo Alto, CA)から得た。 Materials and Methods Northern blot analysis Total RNA was obtained from adipose tissue by Chirgwin et al., Biochem., 18: 5294-5.
299 (1979). Northern blot, radiolabelling, and hybridization were performed as described (Zhang et al., 1994, supra). Poly A ⁺ RNA
Northern blots of (human MTN, human MTNII, and human fetal MTNII) were similar to PCR primers used to generate radiolabeled human actin probes.
Obtained from LONETECH (Palo Alto, CA).

【０４３３】STS 展開 配列タグ部位(STS)特異的PCRアッセイは、本質的に次の
記述に従って展開および最適化した[(Greenら、PCR Met
hods Applic., 1991;Greenら、Genomics, 11:548-564(1
991); Green,「ヒト染色体の物理的マッピング: 染色体
特異的配列タグ部位の生成」, Methods in Molecular G
enetics Vol.1, Gene and Chromosome Analysis(Part
A), pp. 192-210, Adolph編., Academic Press, Inc.,
San Diego(1993); Greenら、Hum. Mol. Genet.,3:489-5
01(1994)]。それぞれのSTSは接頭辞「sWSS」の後に独自
の番号をつなげたものを用いて命名する。ここで報告し
た19のSTSについての詳細は、表3に示し、追加情報(例
えば、PCR反応条件、完全DNA配列)は、GenBankおよび／
あるいはGenome Data Base(GDB)で入手可能である。マ
イクロサテライト特異的STSについて、 PCRアッセイに
用いたオリゴヌクレオチドプライマー(表3)は、遺伝子
型分析に使用したもの(表4)、あるいはGenBankで入手可
能なDNA配列を用いて設計されたもの(通常コンピュータ
ープログラムOSPを用いる)[Hillierら、PCR Methods Ap
plic., 1:124-128(1991)]のどちらかに相当した。表3
は、ヒトOB遺伝子を含むYACコンティグでのSTSを示す。STS Expansion The sequence tag site (STS) specific PCR assay was developed and optimized essentially as described below [(Green et al., PCR Met
hods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11: 548-564 (1
991,); Green, "Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence tag sites", Methods in Molecular G
enetics Vol.1, Gene and Chromosome Analysis (Part
A), pp. 192-210, edited by Adolph., Academic Press, Inc.,
San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3: 489-5.
01 (1994)]. Each STS is named using the prefix "sWSS" followed by a unique number. Details of the 19 STSs reported here are shown in Table 3 and additional information (eg, PCR reaction conditions, complete DNA sequence) is provided by GenBank and / or
Alternatively, it is available at Genome Data Base (GDB). For microsatellite-specific STS, the oligonucleotide primers used in the PCR assay (Table 3) were used for genotyping (Table 4) or were designed using DNA sequences available on GenBank (typically (Using the computer program OSP) [Hillier et al., PCR Methods Ap
plic., 1: 124-128 (1991)]. Table 3
Indicates the STS in the YAC contig containing the human OB gene.

【０４３４】[0434]

【表３】 [Table 3]

【０４３５】ヒトOB遺伝子含有YACコンティグにマッピ
ングされた19の第７染色体特異的STS(図35)を列挙す
る。それぞれの場合において、各「sWSS」名、関連別
名、GDB指定遺伝子座名、STS供給源、PCRプライマー配
列、STSサイズ、GDB同定番号を示す。STSの供給源は次
の通りである：「YAC末端」(YACの単離された挿入物末
端)(Green,1993,上記)、「ラムダクローン」(ランダム
第７染色体特異的ラムダクローン)(Greenら、1991,上
記；Green, 1993,上記)、「遺伝子マーカー」(マイクロ
サテライトマーカー, 表２参照)(Greenら、1994,上
記)、「YAC 挿入物」(YAC挿入物由来のランダムセグメ
ント)、および「遺伝子」(遺伝子特異的STS)。注意すべ
きことは、いくつかの遺伝マーカー特異的STSについ
て、YACを同定するために用いたPCRプライマー(この表
に示した)は遺伝子型分析を行うために用いられたもの
(表４)と異なっていることであり、この理由としては、
遺伝子マーカーを含むYACの検出には多型領域自体の増
幅を必要としないことが挙げられる。指示したPCRアッ
セイは、全て55℃のアニーリング温度を用いた[但しsWS
S494、sWSS883、sWSS1529、およびsWSS2619(50℃)、sWS
S999およびsWSS1174(60℃)、ならびにsWSS808(65℃)を
除く]。STS特異的PCRアッセイに関する追加の詳細は、G
DBにおいて入手可能である。Listed are 19 chromosome 7-specific STSs (FIG. 35) mapped to the human OB gene-containing YAC contig. In each case, the name of each “sWSS”, related alias, GDB designated locus name, STS source, PCR primer sequence, STS size, and GDB identification number are shown. The sources of STS are as follows: "YAC end" (the isolated insert end of YAC) (Green, 1993, supra), "lambda clone" (random chromosome 7 specific lambda clone) (Green 1991, supra; Green, 1993, supra), "Gene markers" (microsatellite markers, see Table 2) (Green et al., 1994, supra), "YAC inserts" (random segments from YAC inserts), And "gene" (gene-specific STS). Note that for some genetic marker-specific STSs, the PCR primers used to identify YACs (shown in this table) were used for genotyping.
This is different from (Table 4).
The detection of YAC containing a genetic marker does not require amplification of the polymorphic region itself. All indicated PCR assays used an annealing temperature of 55 ° C [except for sWS
S494, sWSS883, sWSS1529, and sWSS2619 (50 ° C), sWS
Except S999 and sWSS1174 (60 ° C) and sWSS808 (65 ° C)]. For additional details regarding STS-specific PCR assays, see G
Available in DB.

【０４３６】[0436]

【表４】 [Table 4]

【０４３７】ヒトOB遺伝子含有YACコンティグにマッピ
ングされた８つのマイクロサテライトマーカー(図35)を
列挙する。それぞれの場合において、マーカー名(表3に
別名として示した)、マイクロサテライトモチーフのタ
イプ (テトラヌクレオチド-「Tetra」反復あるいは(CA)
_n反復)、GDB指定遺伝子座名、 PCRに基づいた遺伝子型
分析で用いたプライマー配列およびGDB同定番号を示
す。PCRアッセイおよび多型性に関する追加の詳細は、G
DBで入手可能である。Eight microsatellite markers (FIG. 35) mapped to the YAC contig containing the human OB gene are listed. In each case, the marker name (aliased in Table 3), the type of microsatellite motif (tetranucleotide-`` Tetra '' repeat or (CA)
_(n repeats), GDB designated locus name, primer sequence and GDB identification number used in PCR-based genotyping. Additional details regarding PCR assays and polymorphisms can be found in G
Available in DB.

【０４３８】ヒトOB特異的STS(sWSS2619)を、cDNAの３'
非翻訳領域から得られたDNA配列を用いて設計した。ヒ
トPax4特異的STS(sWSS808)は、次のストラトジーを用い
て生成した。マウスPax4遺伝子(GGCTGTGTGAGCAAGATCCTA
GGA)(配列番号63)および(GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG)
(配列番号93)[Waltherら、1991, Genomics 11:424-434)
(1991)]に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、ヒトゲノムDNA(マウスゲノムDNAから生成
させたものと同サイズの産物)由来の204bpフラグメント
を増幅した。このPCRアッセイは、対応するYACを同定す
るのには適していなかった。これは、同様のサイズの産
物(200bp)もまた酵母DNAから増幅されたからである。し
かしながら、ヒトDNAから生成されたPCR産物のDNA配列
分析は、分析された156の塩基中20箇所で置換が生じて
いることを明らかにした(データは示していない)。この
ヒト特異的配列を用いて、新しいプライマー(TTGCCAGGC
AAAGAGGGCTGGAC)(配列番号64)を設計し、また、最初の
上記マウスPax4特異的プライマーと共に用いた (表3を
参照のこと)。得られるヒトPax4特異的PCRアッセイは、
酵母DNAからの有意な産物を増幅しなかったので、この
アッセイを対応するYACの同定に用いた。[0438] The human OB-specific STS (sWSS2619) was ligated to the 3 '
It was designed using the DNA sequence obtained from the untranslated region. Human Pax4-specific STS (sWSS808) was generated using the following strategy. Mouse Pax4 gene (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTA
GGA) (SEQ ID NO: 63) and (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG)
(SEQ ID NO: 93) (Walther et al., 1991, Genomics 11: 424-434)
(1991)], a 204 bp fragment from human genomic DNA (a product of the same size as that generated from mouse genomic DNA) was amplified. This PCR assay was not suitable for identifying the corresponding YAC. This is because a similarly sized product (200 bp) was also amplified from yeast DNA. However, DNA sequence analysis of PCR products generated from human DNA revealed that substitutions occurred at 20 of the 156 bases analyzed (data not shown). Using this human-specific sequence, a new primer (TTGCCAGGC
AAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID NO: 64) was designed and used with the first mouse Pax4-specific primer described above (see Table 3). The resulting human Pax4 specific PCR assay is
This assay was used to identify the corresponding YAC, as it did not amplify any significant product from yeast DNA.

【０４３９】PCRに基づくスクリーニングによるYACの同
定 図35に示したYACの多くは、PCRに基づくスクリーニング
ストラトジー[Greenら、1995,上記；Greenaら、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 87：1213-1217(1990)]を用いた
ヒト第７染色体DNA「第７染色体YAC供給源」(Greenら、
1995,上記)について高く富化されたクローンのコレクシ
ョンに由来した。数例では、クローンは、CEPH[Dausset
ら、Behring Inst. Mitt., 91:13-20(1992)； Albertse
nら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：4256-4260(199
0)]あるいはICI[Anandら、Nucl.Acids Res., 17：3425-
3433(1989)；Anand ら., Nucl. Acids Res.18：1951-19
56(1990)]で構築された入手可能な全ヒトゲノムYACライ
ブラリーのPCRに基づくスクリーニング(Greena ら、199
0, 上記)により単離された。それぞれのYACは、接頭辞
「yWSS」の後に独自の番号をつなげたものを用いて命名
する。Identification of YACs by PCR-Based Screening Many of the YACs shown in FIG. 35 are PCR-based screening strategies [Green et al., 1995, supra; Greena et al., Proc.
atl. Acad. Sci. USA, 87: 1213-1217 (1990)], using the chromosome 7 YAC source (Green et al.
1995, supra) from a collection of highly enriched clones. In some cases, the clone was CEPH [Dausset
Et al., Behring Inst. Mitt., 91: 13-20 (1992); Albertse.
Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4256-4260 (199).
0)] or ICI [Anand et al., Nucl. Acids Res., 17: 3425-
3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res. 18: 1951-19.
56 (1990)] and a PCR-based screening of the entire human genomic YAC library constructed (Greena et al., 199
0, supra). Each YAC is named using the prefix "yWSS" followed by a unique number.

【０４４０】結果および考察 ノーザンブロット分析によるヒトOB遺伝子の組織発現の
検査では、OB RNAがヒト脂肪組織において高レベルで発
現し、そして胎盤および心臓においてはかなり低レベル
で発現することが示された(図34)。RNAのサイズ(およそ
4.5kb)は、ヒトおよびマウスにおいてならびに発現して
いる組織のそれぞれにおいて等価であった。これらの研
究では、2μgのポリA⁺胎盤RNAにおいてと同様に、5倍高
いシグナルが10μgの全脂肪組織RNAで見られた。胎盤と
比較して心臓のポリA⁺RNAでは、5倍低いシグナルが見ら
れた。OB RNAのレベルは、脂肪組織よりも胎盤組織の方
がおよそ250倍低いと概算される。この実験では、OB RN
Aは、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓を含
む、分析を行った他の組織のいずれにおいても、検出さ
れなかった。追加の実験では、脾臓、胸腺、前立腺、睾
丸、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、あるいは、胎児
の脳、肝臓または腎臓においてOB RNAを示さなかった
(データは示していない)。OBは、これらの後者の組織あ
るいは研究されていない他の組織において、検出できな
い(ノーザンブロット分析により)レベルで発現している
可能性がある。ヒトで観測された発現パターンは、OB R
NAが脂肪組織においてほぼ独占的に検出されるマウスの
場合と幾分異なっている。 Results and Discussion Examination of tissue expression of the human OB gene by Northern blot analysis showed that OB RNA was expressed at high levels in human adipose tissue and at much lower levels in placenta and heart. (FIG. 34). RNA size (approximately
4.5 kb) was equivalent in humans and mice and in each of the expressing tissues. In these studies, a 5-fold higher signal was seen with 10 μg of total adipose tissue RNA, as with 2 μg of poly A ⁺ placental RNA. Five-fold lower signal was seen with cardiac poly A ⁺ RNA compared to placenta. OB RNA levels are estimated to be approximately 250 times lower in placental tissue than in adipose tissue. In this experiment, OB RN
A was not detected in any of the other tissues analyzed, including brain, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and pancreas. Additional experiments did not show OB RNA in spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, colon, peripheral blood leukocytes, or fetal brain, liver or kidney
(Data not shown). OB may be expressed at undetectable (by Northern blot analysis) levels in these latter tissues or other tissues that have not been studied. The expression pattern observed in humans is OBR
Somewhat different from mice where NA is detected almost exclusively in adipose tissue.

【０４４１】マウスおよびヒトゲノムにおけるOB遺伝子
領域の比較マッピング。マウスOB遺伝子は、ヒト第７染
色体qの一部と相同な領域にある近位の第６染色体上に
位置している。このセグメント内の遺伝子は、以下を含
んでいる(近位から遠位へ)：Met癌原遺伝子、嚢胞性線
維症膜貫通伝導調節因子(Cftr)、対合ボックス含有遺伝
子4(Pax4)、OB、およびカルボキシペプチダーゼA(Cpa)
(Zhangら、1994,上記；Friedmanら、1991,上記)。マウ
スでは、遺伝的マッピングを用いて、Pax4が強くobに連
鎖していることが示された[Waltherら、1991,上記；Zha
ngら、1994,上記]。OBおよびPax4間の物理的距離は、お
よそ1メガ塩基対(Mb)であることが明らかとなった(Zhan
gら、1994、上記)。これらの比較マッピングの研究に基
づくと、ヒトOB遺伝子は染色体7q上のPax4およびCPA間
に存在すると予測された。さらに、ヒトCFTR[Hengら、C
ell Genet., 62:108-109(1993)]およびPax4[Tamuraら、
Cytogenet. Cell Genet., 66:132-134(1994)]は、蛍光
インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)により、そ
れぞれ、7q31.3および7q32にマッピングされたので、ヒ
トOB遺伝子の最も考えられる細胞遺伝的位置は、7q31.3
〜q32境界の付近であり得る。Comparative mapping of OB gene regions in mouse and human genome. The mouse OB gene is located on the proximal chromosome 6 in a region homologous to part of human chromosome 7q. Genes within this segment include (proximal to distal): Met proto-oncogene, cystic fibrosis transmembrane conduction regulator (Cftr), pairing box containing gene 4 (Pax4), OB , And carboxypeptidase A (Cpa)
(Zhang et al., 1994, supra; Friedman et al., 1991, supra). In mice, genetic mapping has shown that Pax4 is strongly linked to ob [Walther et al., 1991, supra;
ng et al., 1994, supra]. The physical distance between OB and Pax4 was found to be approximately 1 megabase pair (Mb) (Zhan
g et al., 1994, supra). Based on these comparative mapping studies, the human OB gene was predicted to be between Pax4 and CPA on chromosome 7q. In addition, human CFTR [Heng et al., C
ell Genet., 62: 108-109 (1993)] and Pax4 [Tamura et al.
Cytogenet. Cell Genet., 66: 132-134 (1994)] has been mapped to 7q31.3 and 7q32, respectively, by fluorescence in situ hybridization (FISH), thus indicating the most likely cytogenetic location of the human OB gene. Is 7q31.3
Qq32 boundary.

【０４４２】ヒト第７染色体におけるOB遺伝子のマッピ
ング ヒトOB遺伝子の3'非翻訳領域の小セグメントを増幅して
いるSTS(sWSS2619)を、ヒト第７染色体のDNA(Greenら、
1995a, Genomics 25：170-183)について高く富化されて
いるYACクローンのコレクションをスクリーンするのに
用いた。そして、９のYACを同定した(yWSS691、yWSS133
2、yWSS1998、yWSS2087、yWSS3319、yWSS3512、yWSS487
5、yWSS4970、およびyWSS5004)。これらのYACが真正ヒ
トOB遺伝子を含むことを証明するために、二つの追加実
験を行った。第一に、YACのそれぞれを別のヒトOB特異
的PCRアッセイでテストした。その結果、全てが陽性で
あることが明らかとなった(データは示していない)。第
二に、それぞれのクローン由来の酵母DNAを、EcoRIで消
化し、ヒトOB cDNA-由来プローブを用いたゲルトランス
ファーハイブリダイゼーションにより分析した。全ての
例において、単独のハイブリダイズバンドが見られた。
そしてこのバンドは、ヒトOB遺伝子を含むことが既知で
あるYACおよびP1クローンにおいて同サイズであった
(データは示していない)。Mapping of OB gene on human chromosome 7 STS (sWSS2619), which amplifies a small segment of the 3 'untranslated region of the human OB gene, was replaced with human chromosome 7 DNA (Green et al.
1995a, Genomics 25: 170-183) was used to screen a collection of highly enriched YAC clones. Then, 9 YACs were identified (yWSS691, yWSS133
2, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS487
5, yWSS4970, and yWSS5004). To demonstrate that these YACs contain the authentic human OB gene, two additional experiments were performed. First, each of the YACs was tested in a separate human OB-specific PCR assay. The results revealed that all were positive (data not shown). Second, yeast DNA from each clone was digested with EcoRI and analyzed by gel transfer hybridization using a human OB cDNA-derived probe. In all cases, a single hybridized band was seen.
And this band was the same size in YAC and P1 clones known to contain the human OB gene
(Data not shown).

【０４４３】コンピュータープログラムSEGMAP(Greenお
よびGreen, 1991, 上記)および本発明者らが第７染色体
について生じさせた他のYACに基づくSTS内容データ(Gre
enら、1991,上記; Greenら、1994,上記;Greenら、1995,
上記)を用いて、ヒトOB遺伝子が図35に示したYACコンテ
ィグ内に存在することが明らかとなった。特筆すべき
は、このコンティグは、43の重複YACおよび19の独自に
整列化したSTSから構成されていることである。19のSTS
のそれぞれについての詳細は、表3に示す。OB特異的STS
に加えて、コンティグはまたヒトPax4遺伝子に対して特
異的なSTS(sWSS808)(Tamuraら、1994,上記；Stapleton
ら、1993, Nature Genet. 3：292-298)、第７染色体特
異的YAC由来の７つのSTS、第７染色体特異的ラムダクロ
ーン由来の2つのSTS、および重要なことに、8つのマイ
クロサテライト特異的STSを含む。遺伝子型分析に用い
たプライマーの配列を含む、これらの8つの遺伝マーカ
ーについての追加の詳細は、表2に示す。ここで注意し
たいのは、コンティグ全体にわたって多くのYACに基づ
く連結性がある(すなわち、 STSのそれぞれの隣接対に
接続する２あるいはそれ以上のYACが存在する)ことであ
り、図35に示されるSTSの相対順序に対する強い支持を
与える。The computer program SEGMAP (Green and Green, 1991, supra) and other YAC-based STS content data generated by the inventors for chromosome 7 (Green
en et al., 1991, supra; Green et al., 1994, supra; Green et al., 1995, supra.
Using the above), it was revealed that the human OB gene was present in the YAC contig shown in FIG. Notably, this contig consists of 43 overlapping YACs and 19 uniquely aligned STSs. 19 STS
Table 3 shows the details of each of the above. OB-specific STS
In addition to, Contig also has an STS (sWSS808) specific for the human Pax4 gene (Tamura et al., 1994, supra; Stapleton
1993, Nature Genet. 3: 292-298), 7 STSs from chromosome 7 specific YACs, 2 STSs from chromosome 7 specific lambda clones and, importantly, 8 microsatellite specificities. Includes strategic STS. Additional details for these eight genetic markers, including the sequences of the primers used for genotyping, are provided in Table 2. Note that there is a lot of YAC-based connectivity throughout the contig (i.e., there are two or more YACs connecting to each adjacent pair of STSs), as shown in FIG. Gives strong support for the relative order of STS.

【０４４４】図35に示したように、ヒトOB含有YACコン
ティグの推定配位は、sWSS1734は最もセントロメア側(c
entrometric-most)STS(すなわち、CFTRに最も近接)であ
り、一方、sWSS2367は、最もテロメア側(teromeric-mos
t)STS(すなわち、CPAに最も近接)である。この配位は、
主として、比較マッピングデータに基づき、これはマウ
スおよびヒトDNAに存在するシンテニックブロック内のP
ax4近位およびOB遠位に位置する(Zhangら、1994,上記)
。 OB遺伝子は、 OB特異的STS(sWSS2619)の配置に基づ
くと、コンティグのテロメア末端近傍にマップされる。As shown in FIG. 35, the putative coordination of the human OB-containing YAC contig indicates that sWSS1734 is most centromeric (c
entrometric-most) STS (i.e., closest to the CFTR), while sWSS2367 is the telomeric-most
t) STS (ie closest to CPA). This configuration is
Primarily based on comparative mapping data, this indicates that Ps in syntenic blocks present in mouse and human DNA
Located ax4 proximal and OB distal (Zhang et al., 1994, supra)
. The OB gene maps near the telomere end of the contig, based on the location of the OB-specific STS (sWSS2619).

【０４４５】図35に示すコンティグは、YACサイズを考
慮せずにSEGMAPより推定した(それにより、 STSを互い
から等距離で示す)が、YACサイズについて説明したSEGM
APによるデータの同様の解析は、コンティグによりカバ
ーされた領域の全サイズがちょうど２Mb強であることを
示した(データは示していない)。このように、８つのマ
イクロサテライト特異的STS(表４)の全てが、概算で２M
bにわたるゲノム区間間隔内に含まれている一方、コン
ティグのテロメア末端に最も近い３つ(sWSS1392、sWSS1
148、およびsWSS2367)は、特にOB遺伝子自体に近い(お
そらく約500kb程度の小さな間隔内)。実際、後者の３つ
のSTSの全ては、ヒトOB含有YACの少なくとも１つに存在
する。ここで注意したいのは、ヒトPax4(sWSS808)およ
びob(sWSS2619)の間の間隔がおよそ400kbと見積もられ
ている一方、この領域はマウスにおいては、約1Mbにわ
たると予測されていたことである(Zhangら、1994,上
記)。最後に、コンティグ内の３つのYAC(yWSS691、yWSS
999およびyWSS2935)もまたFISHにより分析されており、
そしてそれぞれは、専ら7q31.3とハイブリダイズするこ
とが明らかとなった。これらのYACの1つ(yWSS691)は、O
B特異的STSを含む一方、その他の２つのクローンは、Pa
x4特異的STSを含む。後者の結果は、一般的に7q32への
ヒトPax4の以前の細胞遺伝的割り当て(Tamuraら、1994,
上記)と一致する。これらのデータに基づいて、ヒトOB
遺伝子は、細胞遺伝的バンド7q31.3に割り当てられ得
る。The contig shown in FIG. 35 was estimated from SEGMAP without considering YAC size (so STSs are shown equidistant from each other), but the SEGM described for YAC size was used.
Similar analysis of data by AP showed that the total size of the area covered by the contig was just over 2 Mb (data not shown). Thus, all eight microsatellite-specific STSs (Table 4) had an approximate 2M
b, while the three closest to the telomeric end of the contig (sWSS1392, sWSS1
148, and sWSS2367) are particularly close to the OB gene itself (possibly within a small interval of about 500 kb). In fact, all of the latter three STSs are present in at least one of the human OB-containing YACs. Note that while the spacing between human Pax4 (sWSS808) and ob (sWSS2619) has been estimated to be approximately 400 kb, this region was predicted to span about 1 Mb in mice. (Zhang et al., 1994, supra). Finally, the three YACs in the contig (yWSS691, yWSS691
999 and yWSS2935) have also been analyzed by FISH,
And it became clear that each hybridized exclusively with 7q31.3. One of these YACs (yWSS691)
While containing the B-specific STS, the other two clones
Includes x4 specific STS. The latter result generally indicates the previous cytogenetic assignment of human Pax4 to 7q32 (Tamura et al., 1994,
Above). Based on these data, human OB
The gene may be assigned to cytogenetic band 7q31.3.

【０４４６】実施例11: ヒトOBポリペプチドは、マウス
において生物学的に活性である 10匹のob/obマウスのグループを、10μg/g/日の組換え
(細菌性)ヒトおよびマウスOBポリペプチドあるいは食塩
水の腹腔内注射により処理した。４日後、食塩水を与え
たグループは、0.3g増加した。マウスOBを与えたグルー
プは、3.2g減少した。ヒトOBを与えたグループは、２g
減少した (p<0.01 食塩水コントロールと比較)。これら
のグループへは、食物摂取のテストも行った。食物摂取
のデータを表５に、体重に対するデータを表６に示す。 Example 11: Human OB polypeptide is expressed in mouse
A group of 10 ob / ob mice biologically active at 10 μg / g / day recombinant
(Bacterial) Human and mouse OB polypeptides or saline were treated by intraperitoneal injection. Four days later, the group receiving saline gained 0.3 g. The group given the mouse OB lost 3.2 g. 2g for human OB
Decreased (p <0.01 compared to saline control). These groups were also tested for food intake. Table 5 shows data on food intake, and Table 6 shows data on body weight.

【０４４７】[0447]

【表５】 [Table 5]

【０４４８】[0448]

【表６】 [Table 6]

【０４４９】これらのデータは、ヒトOBがマウスにおい
て生物学的に活性であることを実証している。[0449] These data demonstrate that human OB is biologically active in mice.

【０４５０】実施例12：高用量OBが野生型マウスに影響
を及ぼす 野生型マウス(C57B16J +/?)を、10μg/g/日の組換えマ
ウスOBの腹腔内注射で処理し、4日ごとに体重の測定を
行った。その結果を表7に示す。 Example 12: High-dose OB affects wild-type mice
The wild-type mice on a (C57B16J + /?), Treated with intraperitoneal injections of recombinant murine OB of 10 [mu] g / g / day, was measured body weight every 4 days. Table 7 shows the results.

【０４５１】[0451]

【表７】 [Table 7]

【０４５２】これらのデータは、非常に程度が低いとは
いえ、OBが肥満型(ob/ob)マウスと同様、野生型マウス
の体重に影響を及ぼすことを実証している。These data demonstrate that, albeit to a lesser extent, OB affects the weight of wild-type mice as well as obese (ob / ob) mice.

【０４５３】実施例13: 連続ポンプ注入により投与され
たOBポリペプチド 本実施例は、OBポリペプチドの連続注入が正常なマウス
の体重損失をもたらすことを実証している。正常な(肥
満型でない)マウスに浸透ポンプ注入によってマウスのo
bポリペプチドを投与した。0.5mgタンパク質/kg 体重/
日の用量が、６日目の注入により、基線体重から4.62%
損失(+/-1.34%)を生じさせた。 Example 13: Administered by continuous pump infusion
OB polypeptide present embodiment, the continuous infusion of OB polypeptide is demonstrated to result in weight loss in normal mice. Normal (non-obese) mice are injected with o
b polypeptide was administered. 0.5mg protein / kg body weight /
Daily dose increased 4.62% from baseline weight by day 6 infusion
Loss (+/- 1.34%) occurred.

【０４５４】材料および方法 動物 本実施例では、野生型(+/+)C57B16マウスを用いた。マ
ウスには、個室を与えゆったりとした条件下で飼育し
た。初期時点におけるマウスの年齢は８週齢であり、ま
た、動物の体重は安定していた。各グループ(媒体(vehi
cle)対タンパク質)に対して、10匹のマウスを用いた。 Materials and Methods Animals In this example, wild-type (+ / +) C57B16 mice were used. The mice were kept in a private room with ample room. The mice were 8 weeks of age at the initial time point and the weight of the animals was stable. Each group (medium (vehi
cle) versus protein), 10 mice were used.

【０４５５】給餌および体重測定 マウスへは、粉末化食物フィーダー(Allentown Caging
and Equipment)で粉末状齧歯類用食物(PMI Feeds,Inc.)
を与え、これにより通常の固形状食物を用いる場合より
正確および鋭敏な食物摂取の測定が可能であった。体重
は、6日間、毎日同時刻(午後2:00)に測定した。注入前
の日の体重を、基線体重として定義した。Feeding and weighing The mice were fed a powdered food feeder (Allentown Caging).
and Equipment) and powdered rodent food (PMI Feeds, Inc.)
Which allowed for a more accurate and sensitive measurement of food intake than with normal solid food. Body weight was measured at the same time every day (2:00 pm) for 6 days. Body weight on the day prior to infusion was defined as baseline weight.

【０４５６】マウスOB DNAのクローニング E. coliでの発現のために、マウスOB DNAのクローニン
グを以下のように行った。発行された(Zhangら、1994,
上記,すなわち、実施例１,上記)公開ペプチド配列から
推定したDNA配列を、E. coli最適コドンを用いて逆翻訳
した。末端クローニング部位は、XbaIからBamHIであっ
た。リボソーム結合エンハンサーおよび強いリボソーム
結合部位は、コード領域の前方に含まれていた。二本鎖
DNA配列を標準的な技法により合成した。正確なクロー
ンは、組換えタンパク質の発現およびレジデント(resid
ent)プラスミド中の正確なOB DNA配列の存在を実証する
ことにより確認した。アミノ酸配列(およびDNA配列)
は、以下の通りである：組換えマウスmet OB(二本鎖)DN
Aおよびアミノ酸配列(配列番号94および95)： Cloning of Mouse OB DNA For expression in E. coli, cloning of mouse OB DNA was performed as follows. Published (Zhang et al., 1994,
The DNA sequence deduced from the published peptide sequence (above, ie, Example 1, supra) was back-translated using E. coli optimal codons. The terminal cloning site was from XbaI to BamHI. Ribosome binding enhancers and strong ribosome binding sites were included in front of the coding region. Double strand
DNA sequences were synthesized by standard techniques. The correct clone is the recombinant protein expression and resident (resid
ent) was confirmed by demonstrating the presence of the correct OB DNA sequence in the plasmid. Amino acid sequence (and DNA sequence)
Is as follows: recombinant mouse met OB (double-stranded) DN
A and amino acid sequence (SEQ ID NOs: 94 and 95):

【０４５７】[0457]

【化１】 Embedded image

【０４５８】発現ベクターおよび宿主株 タンパク質を生産するために用いたプラスミド発現ベク
ターは、pCFM1656、アメリカンタイプカルチャーコレク
ション(ATCC)受託番号第69576号であった。上記のDNA
を、XbaIおよびBamHIで線形化した発現ベクターpCFM165
6に連結し、E. coli宿主株FM5をトランスフォームさせ
た。E. coli FM5細胞は、Amgen Inc.,Thousand Oaks, C
Aにおいて、E. coli K-12株[Bachmannら、Bacteriol. R
ev., 40:116-167(1976)]から派生したが、これは組み込
みラムダファージリプレッサー遺伝子cI₈₅₇[Sussman
ら、C.R.Acad. Sci., 254:1517-1579(1962)]を含んでい
る。ベクター生産、細胞トランスフォーメーションおよ
びコロニー選択は標準的な方法(例えば、Sambrookら、1
989,上記)に従って行った。宿主細胞を、LB培地で成長
させた。Expression Vector and Host Strain The plasmid expression vector used to produce the protein was pCFM1656, American Type Culture Collection (ATCC) Accession No. 69576. DNA above
The expression vector pCFM165 linearized with XbaI and BamHI
6 and transformed E. coli host strain FM5. E. coli FM5 cells were purchased from Amgen Inc., Thousand Oaks, C
In A, E. coli strain K-12 [Bachmann et al., Bacteriol.
ev., 40: 116-167 (1976)], which is an integrated lambda phage repressor gene cI ₈₅₇ [Sussman
CRAcad. Sci., 254: 1517-1579 (1962)]. Vector production, cell transformation and colony selection were performed by standard methods (eg, Sambrook et al., 1).
989, supra). Host cells were grown in LB medium.

【０４５９】タンパク質あるいは媒体の投与 この実験では、組換えマウスOBポリペプチドを一般的に
約0.9mg/ml濃度でリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)中で
用いた。用いたアミノ酸配列(およびDNA配列)をすぐ上
に示す。タンパク質あるいは媒体(リン酸緩衝化生理食
塩水、pH7.4)を、浸透ポンプ注入によって投与した。Al
zert浸透ミニポンプ(Alza, Palo Alto, CA, model no.
1007D)を、それぞれのマウスの肩甲下領域にある皮下ポ
ケットへ外科的に配した。ポンプは、0.5mgタンパク質/
kg 体重/日の用量のために、１時間当たり0.5mlの溶液
中にタンパク質を投与するように目盛りを付けた。コン
トロール動物は、 Alzert浸透ミニポンプを用いてリン
酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)を注入した。Administration of Protein or Vehicle In this experiment, recombinant mouse OB polypeptide was generally used at a concentration of about 0.9 mg / ml in phosphate buffered saline (pH 7.4). The amino acid sequence (and DNA sequence) used is shown immediately above. Protein or vehicle (phosphate buffered saline, pH 7.4) was administered by osmotic pump infusion. Al
zert osmosis mini pump (Alza, Palo Alto, CA, model no.
1007D) was surgically placed into the subcutaneous pocket in the subscapular region of each mouse. Pump uses 0.5mg protein /
For a dose of kg body weight / day, the protein was calibrated to administer the protein in 0.5 ml of solution per hour. Control animals were infused with phosphate buffered saline (pH 7.4) using an Alzert osmotic minipump.

【０４６０】発酵プロセス：供給バッチプロセスとして
知られる三相発酵プロトコールをタンパク質を調製する
ために用いた。培地組成は以下に説明する。Fermentation Process: A three-phase fermentation protocol known as a fed-batch process was used to prepare the protein. The medium composition is described below.

【０４６１】バッチ: 窒素およびリン酸塩源を、発酵容
器(Biolafitte, 12リットル容量)内で滅菌した(18〜20p
siで35分間122℃まで温度を上昇させることによった)。
冷却時に、炭素源、マグネシウム源、ビタミン源および
微量金属源を、無菌的に添加した。一晩培養(16時間あ
るいはそれ以上)500mlの上記組換えマウスタンパク質生
産細菌(LB培地内で成長)を、発酵槽に加えた。Batch: The nitrogen and phosphate sources were sterilized (18-20p) in fermentation vessels (Biolafitte, 12 liter volume).
by raising the temperature to 122 ° C. for 35 min with si).
Upon cooling, carbon, magnesium, vitamin and trace metal sources were added aseptically. 500 ml of the above recombinant mouse protein producing bacteria (grown in LB medium) in overnight culture (16 hours or more) were added to the fermentor.

【０４６２】供給材Ｉ: 4.0〜6.0 O.D.₆₀₀間に達した際
に、供給材Ｉを培養物に加えた。その後、グルコースを
成長速度(μ)を制御するために、制限速度で加えた。自
動システム(分布制御システムと呼ばれる)は、0.15世代
hr^-1に成長速度を制御するようプログラムした。[0462] feed material I: Upon reaching between 4.0 to 6.0 OD _600, was added feed stock I to the culture. Thereafter, glucose was added at a limited rate to control the growth rate (μ). Automatic system (called distribution control system) is 0.15 generation
hr- ¹ was programmed to control the growth rate.

【０４６３】供給材II: O.D.が30に達したとき、温度を
ゆっくり42℃まで上げ、供給材を以下に記述のように供
給材ＩIに変更した。その後、発酵を２時間ごとにサン
プリングを行いながら10時間続けた。10時間後、発酵槽
の中身を20℃以下に冷却した後、遠心分離により採集し
た。Feed II: When the OD reached 30, the temperature was slowly raised to 42 ° C. and the feed was changed to Feed II as described below. The fermentation was then continued for 10 hours, sampling every 2 hours. After 10 hours, the contents of the fermenter were cooled to 20 ° C. or lower and collected by centrifugation.

【０４６４】 ビタミン溶液(バッチ、供給材Ｉ): 0.5gビオチン、0.4g
葉酸、および4.2gリボフラビンを450mlのH₂Oおよび3ml
の10N NaOHに溶解し、その後H₂Oを加えて500mlとした。
14gのピリドキシン-HClおよび61gのナイアシンを150ml
のH₂Oおよび50mlの10N NaOHに溶解し、その後をH₂Oを加
えて250mlとした。54gのパントテン酸を200mlのH₂Oに溶
解して250mlとした。3つの溶液を混合し、全容積を10リ
ットルとした。[0464] Vitamin solution (batch, feed I): 0.5 g biotin, 0.4 g
Folic acid, and 4.2 g riboflavin in 450 ml H ₂ O and 3 ml
Was dissolved in 10N NaOH, and then H ₂ O was added to make up to 500 ml.
150 ml of 14 g of pyridoxine-HCl and 61 g of niacin
Was dissolved in H ₂ O and 50 ml of 10N NaOH, and then H ₂ O was added to 250 ml. 54 g of pantothenic acid was dissolved in 200 ml of H ₂ O to 250 ml. The three solutions were mixed to a total volume of 10 liters.

【０４６５】微量金属溶液(バッチ、供給源Ｉ)： 塩化鉄(FeCl₃・6H₂O)：27g/L 塩化亜鉛(ZnCl₂・4H₂O)：2g/L 塩化コバルト(CoCl₂・6H₂O)：2g/L モリブデン酸ナトリウム(NaMoO₄・2H₂O)：2g/L 塩化カルシウム(CaCl₂・2H₂O)：1g/L 硫酸銅(CuSO₄・5H₂O)：1.9g/L ホウ酸(H₃BO₃)：0.5g/L 塩化マンガン(MnCl₂・4H₂O)：1.6g/L クエン酸ナトリウム二水和物：73.5g/L マウスOBポリペプチドの精製プロセス 精製は、以下の工程により行った(もし他に記されてい
なければ、以下の工程は４℃で行った)。Trace metal solution (batch, source I): iron chloride (FeCl ₃ .6H ₂ O): 27 g / L zinc chloride (ZnCl ₂ .4H ₂ O): 2 g / L cobalt chloride (CoCl ₂ .6H ₂₎ O): 2g / L sodium molybdate _{(NaMoO 4 · 2H 2 O)} : 2g / L of calcium chloride _{(CaCl 2 · 2H 2 O)} : 1g / L copper sulfate _{(CuSO 4 · 5H 2 O)} : 1.9g / L Boric acid (H ₃ BO ₃ ): 0.5 g / L Manganese chloride (MnCl ₂ .4H ₂ O): 1.6 g / L Sodium citrate dihydrate: 73.5 g / L Purification process of mouse OB polypeptide The following steps were performed (unless otherwise noted, the following steps were performed at 4 ° C.).

【０４６６】１．細胞ペースト. E. coli 細胞ペースト
を、５倍容量の７mM EDTA(pH7.0)で懸濁した。EDTA中の
細胞を、マイクロフルイダイザー(microfluidizer)の2
つの流路により、さらに破壊した。破壊した細胞を、J5
-4.2ローターを用いてBeckmanJB-6遠心機において4.2kr
pmで１時間遠心分離した。[0466] 1. Cell paste. E. coli cell paste was suspended in 5 volumes of 7 mM EDTA (pH 7.0). Transfer cells in EDTA to a microfluidizer.
Further breakage was caused by two flow paths. The destroyed cells are
4.2kr in Beckman JB-6 centrifuge using -4.2 rotor
Centrifuged at pm for 1 hour.

【０４６７】２．封入体洗浄＃1. 上記から上清を除去
し、ペレットを5倍容量の7mMのEDTA(pH7.0)で再懸濁さ
せ、ホモジナイズした。この混合物を、工程１と同様に
遠心分離した。[0467] 2. Inclusion Body Wash # 1. The supernatant was removed from above and the pellet was resuspended in 5 volumes of 7 mM EDTA (pH 7.0) and homogenized. This mixture was centrifuged as in step 1.

【０４６８】３．封入体洗浄＃2. 上記から上清を除去
し、ペレットを10倍容量の20mM Tris(pH8.5)、10mM DT
T、1%デオキシコール酸塩で再懸濁し、ホモジナイズし
た。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。[0468] 3. Inclusion body washing # 2. Remove the supernatant from the above, and pellet 10 volumes of 20 mM Tris (pH 8.5), 10 mM DT.
Resuspended in T, 1% deoxycholate and homogenized. This mixture was centrifuged as in step 1.

【０４６９】４．封入体洗浄＃3. 上記から上清を除去
し、ペレットを10倍容量の蒸留水で再懸濁し、ホモジナ
イズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離し
た。[0469] 4. Inclusion Body Wash # 3. The supernatant was removed from above and the pellet was resuspended in 10 volumes of distilled water and homogenized. This mixture was centrifuged as in step 1.

【０４７０】５．再フォールディング. ペレットを15倍
容量の10mM HEPES(pH8.5)、1%ナトリウムサルコシン(N-
lauryl sarcosine)を用い、室温で再フォールディング
させた。60分後、溶液を60mM 硫酸銅にし、その後一晩
撹拌した。[0470] 5. Refold. Pellet 15 volumes of 10 mM HEPES (pH 8.5), 1% sodium sarcosine (N-
lauryl sarcosine) at room temperature. After 60 minutes, the solution was brought to 60 mM copper sulfate and then stirred overnight.

【０４７１】６．サルコシンの除去. 再フォールディン
グ混合物を5倍容量の10mM Tris緩衝液(pH7.5)で希釈
し、その後、工程１と同様に遠心分離した。上清を集
め、Dowex 1-X4樹脂、20〜50メッシュ、塩化物型ととも
に１時間撹拌して混合した(0.066%希釈再フォールディ
ング混合物の全容量)。次に、この混合物をカラムに通
し、その溶出液を集めた。サルコシンの除去は、HPLCに
よって確認した。[0471] 6. Removal of sarcosine. The refolding mixture was diluted with 5 volumes of 10 mM Tris buffer (pH 7.5) and then centrifuged as in step 1. The supernatant was collected and mixed with Dowex 1-X4 resin, 20-50 mesh, chloride form for 1 hour with stirring (total volume of 0.066% diluted refold mixture). Next, the mixture was passed through a column, and the eluate was collected. Removal of sarcosine was confirmed by HPLC.

【０４７２】７．酸沈殿. 以前の工程からの溶出液を集
め、そのpHをpH5.5に調整した後、室温で30分間インキ
ュベートした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離
した。[0472] 7. Acid precipitation. The eluate from the previous step was collected, its pH was adjusted to pH 5.5 and incubated at room temperature for 30 minutes. This mixture was centrifuged as in step 1.

【０４７３】８．カチオン交換クロマトグラフィー. 以
前の工程からの上清のpHをpH4.2に調整し、CMSepharose
Fast Flow上に流した。20カラム容量の塩勾配を、20mM
NaOAC、pH4.2、0M〜1.0M NaClで用いた。[0473] 8. Cation exchange chromatography. Adjust the pH of the supernatant from the previous step to pH 4.2 and use CMSepharose
Flowed on Fast Flow. A 20 column volume salt gradient was run at 20 mM
Used with NaOAC, pH 4.2, 0M to 1.0M NaCl.

【０４７４】９．HICクロマトグラフィー. 上記工程か
らのピーク画分CMSepharoseプール(紫外分析から確認)
を、 0.2Mの硫酸アンモニウムとなるよう調整した。20
カラム容量の逆塩勾配は、0.4Mから0Mの硫酸アンモニウ
ムを有する5mM NaOAc, pH4.2で行った。この物質を濃縮
し、PBS中へダイアフィルトレートした。[0474] 9. HIC chromatography. The peak fraction from the above process CMSepharose pool (confirmed by UV analysis)
Was adjusted to be 0.2M ammonium sulfate. 20
A reverse salt gradient of the column volume was performed with 5 mM NaOAc, pH 4.2 with 0.4M to 0M ammonium sulfate. This material was concentrated and diafiltered into PBS.

【０４７５】結果 以下に、C57B16Jマウス(８週齢)の基線体重からのパー
セント(%)差を示す。 Results The following shows the percentage (%) difference from the baseline body weight of C57B16J mice (8 weeks old).

【０４７６】[0476]

【表８】 [Table 8]

【０４７７】見て分かるように、6日間の連続注入処方
の終わりに、OBポリペプチドを与えていた動物では、基
線と比較して体重が４%以上減少した。これは、腹腔内
(i.p.)注射で観測された体重損失よりも、実質的に急速
な体重損失である。10mg/kg用量の組換えマウスOBポリ
ペプチドの毎日のi.p.注射では、受けた野生型(正常)マ
ウスにおいて、32日注入期間の終わりで、ほんの2.6〜
3.0%の体重損失しか見られなかった。また、投与スケジ
ュール中いかなるときにも、体重損失は４%を超えるこ
とはなかった(データは示していない)。本データは、連
続注入において20倍低い投与量(10mg/kgに対して0.5mg/
kg)が、より短い期間でさらなる体重損失を達成するこ
とを示す。As can be seen, at the end of the 6-day continuous infusion regimen, animals receiving the OB polypeptide lost more than 4% of their body weight compared to baseline. It is intraperitoneal
(ip) Substantially more rapid weight loss than that observed with injection. Daily ip injections of a 10 mg / kg dose of recombinant mouse OB polypeptide in recipient wild-type (normal) mice, at the end of the 32 day infusion period,
Only 3.0% weight loss was seen. Also, weight loss did not exceed 4% at any time during the dosing schedule (data not shown). This data shows a 20-fold lower dose (0.5 mg / kg vs. 10 mg / kg) for continuous infusion.
kg) achieves further weight loss in a shorter period of time.

【０４７８】ここに見られた結果は、統計学的に有意で
ある、例えば、-4.62% は p＜0.0001である。The results seen here are statistically significant, eg -4.62% with p <0.0001.

【０４７９】実施例14：組換えヒトOBポリペプチドアナ
ログのクローニングおよび発現 本実施例は、OBポリペプチドのアナログ組換えヒト型の
組成および調製方法を提供する。 Example 14: Recombinant human OB polypeptide ana
Cloning and Expression of Logs This example provides methods for the composition and preparation of analog recombinant human forms of the OB polypeptide.

【０４８０】OB DNAのヒト型は、上記実施例13と同様
に、20のコドン置換が設計されている2本鎖DNA(合成オ
リゴヌクレオチドから生成)を有するMluIおよびBamHI部
位間の領域を置換することによってマウスOB DNAから構
築した。マウス成熟35位のアルギニンおよびマウスの成
熟74位のロイシンに対するコドンは変化しなかった。下
記の配列ではMluI部位を実線の下に示す。このDNAは、
上記のように、組換えマウスタンパク質と同様の様式
で、pCFM1656ベクター(ATCC受託番号第69576号)中に入
れた。The human form of the OB DNA replaces the region between the MluI and BamHI sites with the double-stranded DNA (generated from a synthetic oligonucleotide) in which 20 codon substitutions have been designed, as in Example 13 above. Was constructed from mouse OB DNA. The codons for arginine at mouse mature position 35 and leucine at mouse mature position 74 did not change. In the sequences below, the MluI site is shown below the solid line. This DNA
As described above, it was placed in the pCFM1656 vector (ATCC Accession No. 69576) in a manner similar to the recombinant mouse protein.

【０４８１】組換えヒトmet OB(二本鎖)DNAおよびアミ
ノ酸配列(配列番号96および97)Recombinant human met OB (double stranded) DNA and amino acid sequence (SEQ ID NOs: 96 and 97)

【０４８２】[0482]

【化２】 Embedded image

【０４８３】発酵 組換えヒトOBポリペプチドを生産するための上記宿主細
胞の発酵を、組換えマウス物質について上述した条件お
よび組成を用いて行った。結果は、組換えヒトOB物質
(および微量の細菌性タンパク質)の収率(グラム/リット
ル)(精製前)について解析を行い、そして細菌発現を解
析するために関連づけた。Fermentation Fermentation of the above host cells to produce recombinant human OB polypeptide was performed using the conditions and compositions described above for the recombinant mouse material. The result is a recombinant human OB substance
Analyzes were performed for (and trace bacterial protein) yields (grams / liter) (before purification) and related to analyze bacterial expression.

【０４８４】[0484]

【表９】 [Table 9]

【０４８５】略語：Ind.＋ 時間は、タンパク質発現の
誘導後の時間を意味し、これはpCFM1656を用いた組換え
マウス物質のための実施例１３の記載と同様である。Abbreviation: Ind. + Time means the time after induction of protein expression, which is as described in Example 13 for recombinant mouse material using pCFM1656.

【０４８６】O.D.：光学濃度、分光光度計で測定。１リ
ットル当たり１O.D.当たりミリグラムmg/O.D.・L：１リ
ットル当たり１O.D.単位当たりタンパク質mgに換算した
発現 組換えヒトobポリペプチドの精製 組換えヒトタンパク質は、上記実施例13のように組換え
マウスタンパク質の精製について用いられた方法と同様
の方法を用いて精製され得る。組換えヒトOBポリペプチ
ドの調製のために、工程７の上清のpHをpH5.0に調整す
ることにより工程８を行い、これをCMSepharose fast f
lowカラムへ流した。20カラム容量塩勾配は、20mM NaOA
C, pH5.5, 0M〜0.5MのNaClで行った。工程９はCMSephar
oseプールを水で4倍に希釈し、pHを7.5に調整すること
によって行った。この混合物を、0.7Mの硫酸アンモニア
にした。20カラム容量の逆塩勾配を5mMのNaOAc,pH5.5,
0.2Mから0Mの硫酸アンモニアで行った。その他の点で
は、上記の工程は同一であった。OD: Optical density, measured with a spectrophotometer. Expression in terms of milligram mg / OD · L per liter per liter: mg of protein per OD per liter. Purification of recombinant human ob polypeptide Recombinant human protein was obtained as in Example 13 above. Can be purified using methods similar to those used for the purification of recombinant mouse proteins. For the preparation of recombinant human OB polypeptide, step 8 was performed by adjusting the pH of the supernatant of step 7 to pH 5.0, and this was followed by CMSepharose fast f
Flowed to low column. 20 column volume salt gradient is 20 mM NaOA
C, pH 5.5, performed with 0M to 0.5M NaCl. Step 9 is CMSephar
This was done by diluting the ose pool 4 times with water and adjusting the pH to 7.5. This mixture was made up to 0.7 M ammonia sulfate. A 20 column volume reverse salt gradient was run with 5 mM NaOAc, pH 5.5,
Performed with 0.2M to 0M ammonia sulfate. Otherwise, the above steps were identical.

【０４８７】実施例15: 用量応答研究 追加研究は、OBタンパク質の連続投与に対する用量応答
が存在することを実証した。この研究では、野生型マウ
ス(肥満型でない、体重35〜40gのCD-1マウス)に実施例1
2および13と同様の方法を用いて組換えマウスOBタンパ
ク質を投与した。その結果は次の通りであった(上記の
ように測定した、基線と比較した体重損失%を示す)。 Example 15: Dose Response Studies Additional studies demonstrated that there was a dose response to continuous administration of the OB protein. In this study, wild-type mice (non-obese, CD-1 mice weighing 35-40 g) were tested in Example 1.
Recombinant mouse OB protein was administered using methods similar to 2 and 13. The results were as follows (showing the% weight loss compared to baseline, measured as described above).

【０４８８】[0488]

【表１０】 [Table 10]

【０４８９】見て分かるように、0.03mg/kg/日から1mg/
kg/日まで用量の増加に伴い、体重損失も3.5%から7.5%
へ増加した。注目すべきは14日目において、1mg/kg/日
投与量の結果が、14%の体重損失となったことである。As can be seen, 0.03 mg / kg / day to 1 mg / kg
Weight loss from 3.5% to 7.5% with increasing dose to kg / day
Increased to Noteworthy is 1 mg / kg / day on day 14
The dosage result was a 14% weight loss.

【０４９０】実施例16: ob/obマウスの体組成における
レプチンの効果 C57Bl/6J ob/ob 16週齢マウスに、5μg/g/日のマウスレ
プチン、媒体で処理するか、あるいは33日間いかなる処
理も施さなかった。第二の実験では、、7週齢ob/obマウ
スに10μg/g/日のヒトレプチン、マウスレプチン、ある
いは媒体で12日間処理した。マウスを屠殺し、全体重、
体組成、インスリンレベル、およびグルコースレベルを
評価した。これらの実験のデータを表11において報告す
る。 Example 16: In ob / ob mouse body composition
Effect of Leptin C57Bl / 6J ob / ob 16 week old mice were treated with 5 μg / g / day of mouse leptin, vehicle, or without any treatment for 33 days. In a second experiment, 7-week-old ob / ob mice were treated with 10 μg / g / day of human leptin, mouse leptin, or vehicle for 12 days. Sacrifice the mouse and weigh,
Body composition, insulin levels, and glucose levels were evaluated. The data from these experiments are reported in Table 11.

【０４９１】[0490]

【表１１】 [Table 11]

【０４９２】体組成データは、以下の体の３つのコンパ
ートメントにおけるレプチンの効果を実証している:脂
肪量、痩身体重、および水分量 。データは、レプチン
が、体脂肪量を有意に減少させ、そして痩身体重には最
低限の効果を及ぼすことを示している。しかしながら、
痩身体重への効果は、統計上有意ではなかった。The body composition data demonstrates the effects of leptin in the three body compartments: fat mass, lean body mass, and water mass. The data indicate that leptin significantly reduces body fat mass and has minimal effect on lean body weight. However,
The effect on lean body weight was not statistically significant.

【０４９３】レプチン処理マウスおよびコントロール
(未処理)マウスにおけるインスリンおよびグルコースレ
ベルの比較により、レプチンが血糖およびインスリンレ
ベルを低下させ、従ってこれらの糖尿病の徴候を改善す
ることが示された。Leptin-treated mice and controls
Comparison of insulin and glucose levels in (untreated) mice indicated that leptin reduced blood glucose and insulin levels and thus ameliorated these signs of diabetes.

【０４９４】実施例17: 野生型マウスにおけるレプチン
の高用量効果 ob/obマウス(C57B1/6J+/?)の痩身コントロールに、10μ
g/gのマウスレプチンあるいは媒体(PBS)を一日一度腹腔
内注射し、体重および食物摂取を次の二週間にわたって
測定した。４日目から体重に有意な減少が現れ、最初の
一週間は食物摂取にも有意な減少が現れた。しかしなが
ら、一週間後には食物摂取のレベルは双方のマウスグル
ープ間で区別が付かなくなった。動物を、二週間後に屠
殺し、体組成を測定した。体組成分析の結果を表12に示
す。データは、レプチンを与えた動物対PBSを与えた動
物の体脂肪の減少を示す。 Example 17: Leptin in wild-type mice
High dose effect of ob / ob mice (C57B1 / 6J + /?)
g / g mouse leptin or vehicle (PBS) was injected intraperitoneally once a day and body weight and food intake were measured over the next two weeks. There was a significant decrease in body weight from day 4 and a significant decrease in food intake during the first week. However, after one week, the level of food intake became indistinguishable between both groups of mice. Animals were sacrificed two weeks later and body composition was measured. Table 12 shows the results of the body composition analysis. The data shows the reduction in body fat in animals receiving leptin versus animals receiving PBS.

【０４９５】[0495]

【表１２】 [Table 12]

【０４９６】第二の実験は、野生型マウスC57B1/6Jへの
12.5μg/gのマウスレプチンの一日二度の腹腔内注射の
効果を示した。ポリペプチドの一日二度の注射と関連し
た体重および食物摂取の有意の減少が見られた。この実
験のために、動物は代謝室に配した。食物は、粉末状Pu
rina＃5001チャウダイエットで構成された。この食物
は、チャウダイエット、タピオカ、および水で構成され
た食物を用いた初期の実験とは異なった。このように代
謝室で用いた食物は、高カロリーであった。これによ
り、消費した食物の量が、水分含有食物を与えられたこ
れらの動物とは異なることが説明される。The second experiment was performed on wild-type mouse C57B1 / 6J.
The effect of intraperitoneal injection of mouse leptin at 12.5 μg / g twice daily was demonstrated. There was a significant decrease in body weight and food intake associated with twice daily injection of the polypeptide. For this experiment, animals were placed in a metabolic chamber. Food is powdered Pu
rina # 5001 made up of Chow Diet. This food was different from earlier experiments with foods composed of chow diet, tapioca, and water. The food used in the metabolic chamber was thus high in calories. This explains that the amount of food consumed is different from those animals fed the water-containing food.

【０４９７】以下は、上記の開示および特に実験手順お
よび考察に関連する参考文献のリストである。The following is a list of references related to the above disclosure and especially the experimental procedures and discussions.

【０４９８】Baharyら、Genomics,11:33-47(1991). Baharyら、Genomics,13:761-769(1992). Baharyら、Molecular mapping of mouse chromosomes 4
and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromoso
me(1991). Blankら、Mammalian Genome, 1:s51-s78(1991). Bogardusら、Annals of the New York Academy of Scie
nses, 630:100-115(1991). Friedmanら、Mammalian Genome, 1:130-144(1991). Harris, FASEB J., 4:3310-3318(1990). Jacobowitzら、N. Engl. J. Med., 315:96-100(1986). Kessey, Obesity, pp.144-166, Stunkard編., Philadel
phia, W.B. Sauders Co.(1980). Kesseyら、Ann. Rev. Psychol., 37:109-133.22(1986). Leibelら、「肥満症における遺伝子変化および栄養: 肥
満症の分子遺伝学へのアプローチ」 Genetic Variation
and Nutrition, pp.90-101.1, SimopoulosおよびChild
s編、S. Karger, Basel(1990). Siegelら、Cytogenet. Cell Genet., 61(3):184-185(19
92). 本発明は、その意図的あるいは不可欠な特性から逸脱す
ることなく、他の形式で実施され得たり、他の方法で実
行され得る。従って、本開示は、全ての点で例示的であ
りかつ非限定的であり、発明の範囲は添付の請求の範囲
によって示されてると考えられるべきである。また、意
味および等価の範囲内の全ての変化が、本発明中に含ま
れることが意図される。Bahary et al., Genomics, 11: 33-47 (1991). Bahary et al., Genomics, 13: 761-769 (1992). Bahary et al., Molecular mapping of mouse chromosomes 4.
and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromoso
me (1991) .Blank et al., Mammalian Genome, 1: s51-s78 (1991) .Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Scie.
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phia, WB Sauders Co. (1980). Kessey et al., Ann. Rev. Psychol., 37: 109-133.22 (1986). Genetic Variation
and Nutrition, pp. 90-101.1, Simopoulos and Child
s, S. Karger, Basel (1990) .Siegel et al., Cytogenet.Cell Genet., 61 (3): 184-185 (19
92). The invention may be embodied in other forms or practiced in other ways without departing from its intended or essential characteristics. Therefore, the present disclosure is to be considered in all respects as illustrative and non-limiting and the scope of the invention is indicated by the appended claims. Also, all changes that come within the meaning and range of equivalents are intended to be embraced by the present invention.

【０４９９】様々な参考文献が本明細書に引用され、そ
れぞれの文献は、その全体が、本明細書中で参考として
援用される。Various references are cited herein, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０５００】クレームされた発明は、上記の明細書およ
び容易に入手できる参考文献および開始物質に従って実
施可能である。それにも関わらず、出願人は、1995年8
月９日に以下の寄託をアメリカンタイプカルチャーコレ
クション、12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852-
1178,U.S.A.に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認
に関するブダペスト条約の規定に従って行った：プラス
ミドpETH14保有E. coli H14、受託番号第69880号；プラ
スミドpETM9保有E. coli M9；受託番号第69879号。The claimed invention can be practiced according to the above specification and readily available references and starting materials. Nevertheless, the applicant filed
On the 9th, the following deposits were made with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-
1178, USA, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure: E. coli H14 with plasmid pETH14, accession no. 69880; E. coli M9 with plasmid pETM9; accession no. issue.

【０５０１】[0501]

【発明の効果】本発明により、哺乳動物の脂肪蓄積およ
び脂肪含量の制御を可能にする体重のモジュレーターが
提供される。Industrial Applicability According to the present invention, there is provided a body weight modulator which enables control of fat accumulation and fat content in mammals.

【０５０２】[0502]

【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：2793塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 他の情報：マウスob cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：マウス 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：57..560 配列： GGATCCCTGC TCCAGCAGCT GCAAGGTGCA AGAAGAAGAA GATCCCAGGG AGGAAA 56 ATG TGC TGG AGA CCC CTG TGT CGG TTC CTG TGG CTT TGG TCC TAT CTG 104 Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 TCT TAT GTT CAA GCA GTG CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC ACC AAA 152 Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 ACC CTC ATC AAG ACC ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG 200 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 CAG TCG GTA TCC GCC AAG CAG AGG GTC ACT GGC TTG GAC TTC ATT CCT 248 Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 GGG CTT CAC CCC ATT CTG AGT TTG TCC AAG ATG GAC CAG ACT CTG GCA 296 Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 GTC TAT CAA CAG GTC CTC ACC AGC CTG CCT TCC CAA AAT GTG CTG CAG 344 Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln 85 90 95 ATA GCC AAT GAC CTG GAG AAT CTC CGA GAC CTC CTC CAT CTG CTG GCC 392 Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110 TTC TCC AAG AGC TGC TCC CTG CCT CAG ACC AGT GGC CTG CAG AAG CCA 440 Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro 115 120 125 GAG AGC CTG GAT GGC GTC CTG GAA GCC TCA CTC TAC TCC ACA GAG GTG 488 Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 GTG GCT TTG AGC AGG CTG CAG GGC TCT CTG CAG GAC ATT CTT CAA CAG 536 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln 145 150 155 160 TTG GAT GTT AGC CCT GAA TGC TGA AGTTTCAAAG GCCACCAGGC TCCCAAGA 588 Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys * 165 ATCATGTAGA GGGAAGAAAC CTTGGCTTCC AGGGGTCTTC AGGAGAAGAG AGCCATGTGC 648 ACACATCCAT CATTCATTTC TCTCCCTCCT GTAGACCACC CATCCAAAGG CATGACTCCA 708 CAATGCTTGA CTCAAGTTAT CCACACAACT TCATGAGCAC AAGGAGGGGC CAGCCTGCAG 768 AGGGGACTCT CACCTAGTTC TTCAGCAAGT AGAGATAAGA GCCATCCCAT CCCCTCCATG 828 TCCCACCTGC TCCGGGTACA TGTTCCTCCG TGGGTACACG CTTCGCTGCG GCCCAGGAGA 888 GGTGAGGTAG GGATGGGTAG AGCCTTTGGG CTGTCTCAGA GTCTTTGGGA GCACCGTGAA 948 GGCTGCATCC ACACACAGCT GGAAACTCCC AAGCAGCACA CGATGGAAGC ACTTATTTAT 1008 TTATTCTGCA TTCTATTTTG GATGGATCTG AAGCAAGGCA TCAGCTTTTT CAGGCTTTGG 1068 GGGTCAGCCA GGATGAGGAA GGCTCCTGGG GTGCTGCTTT CAATCCTATT GATGGGTCTG 1128 CCCGAGGCAA ACCTAATTTT TGAGTGACTG GAAGGAAGGT TGGGATCTTC CAAACAAGAG 1188 TCTATGCAGG TAGCGCTCAA GATTGACCTC TGGTGACTGG TTTTGTTTCT ATTGTGACTG 1248 ACTCTATCCA AACACGTTTG CAGCGGCATT GCCGGGAGCA TAGGCTAGGT TATTATCAAA 1308 AGCAGATGAA TTTTGTCAAG TGTAATATGT ATCTATGTGC ACCTGAGGGT AGAGGATGTG 1368 TTAGAGGGAG GGTGAAGGAT CCGGAAGTGT TCTCTGAATT ACATATGTGT GGTAGGCTTT 1428 TCTGAAAGGG TGAGGCATTT TCTTACCTCT GTGGCCACAT AGTGTGGCTT TGTGAAAAGG 1488 ACAAAGGAGT TGACTCTTTC CGGAACATTT GGAGTGTACC AGGCACCCTT GGAGGGGCTA 1548 AAGCTACAGG CCTTTTGTTG GCATATTGCT GAGCTCAGGG AGTGAGGGCC CCACATTTGA 1608 GACAGTGAGC CCCAAGAAAA GGGTCCCTGG TGTAGATCTC CAAGGTTGTC CAGGGTTGAT 1668 CTCACAATGC GTTTCTTAAG CAGGTAGACG TTTGCATGCC AATATGTGGT TCTCATCTGA 1728 TTGGTTCATC CAAAGTAGAA CCCTGTCTCC CACCCATTCT GTGGGGAGTT TTGTTCCAGT 1788 GGGAATGAGA AATCACTTAG CAGATGGTCC TGAGCCCTGG GCCAGCACTG CTGAGGAAGT 1848 GCCAGGGCCC CAGGCCAGGC TGCCAGAATT GCCCTTCGGG CTGGAGGATG AACAAAGGGG 1908 CTTGGGTTTT TCCATCACCC CTGCACCCTA TGTCACCATC AAACTGGGGG GCAGATCAGT 1968 GAGAGGACAC TTGATGGAAA GCAATACACT TTAAGACTGA GCACAGTTTC GTGCTCAGCT 2028 CTGTCTGGTG CTGTGAGCTA GAGAAGCTCA CCACATACAT ATAAAAATCA GAGGCTCATG 2088 TCCCTGTGGT TAGACCCTAC TCGCGGCGGT GTACTCCACC ACAGCAGCAC CGCACCGCTG 2148 GAAGTACAGT GCTGTCTTCA ACAGGTGTGA AAGAACCTGA GCTGAGGGTG ACAGTGCCCA 2208 GGGGAACCCT GCTTGCAGTC TATTGCATTT ACATACCGCA TTTCAGGGCA CATTAGCATC 2268 CACTCCTATG GTAGCACACT GTTGACAATA GGACAAGGGA TAGGGGTTGA CTATCCCTTA 2328 TCCAAAATGC TTGGGACTAG AAGAGTTTTG GATTTTAGAG TCTTTTCAGG CATAGGTATA 2388 TTTGAGTATA TATAAAATGA GATATCTTGG GGATGGGGCC CAAGTATAAA CATGAAGTTC 2448 ATTTATATTT CATAATACCG TATAGACACT GCTTGAAGTG TAGTTTTATA CAGTGTTTTA 2508 AATAACGTTG TATGCATGAA AGACGTTTTT ACAGCATGAA CCTGTCTACT CATGCCAGCA 2568 CTCAAAAACC TTGGGGTTTT GGAGCAGTTT GGATCTTGGG TTTTCTGTTA AGAGATGGTT 2628 AGCTTATACC TAAAACCATA ATGGCAAACA GGCTGCAGGA CCAGACTGGA TCCTCAGCCC 2688 TGAAGTGTGC CCTTCCAGCC AGGTCATACC CTGTGGAGGT GAGCGGGATC AGGTTTTGTG 2748 GTGCTAAGAG AGGAGTTGGA GGTAGATTTT GGAGGATCTG AGGGC 2793 配列番号：2 配列の長さ：167アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：マウスobポリペプチド 配列： Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln 85 90 95 Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro 115 120 125 Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln 145 150 155 160 Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys 165 配列番号：3 配列の長さ：700塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 他の情報： ヒトob cDNAここでNは任意のヌクレオチドを表す ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：46..546 配列： NNNGNNGTTG CAAGGCCCAA GAAGCCCANN NTCCTGGGAA GGAAA ATG CAT TGG 54 Met His Trp 1 GGA ACC CTG TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC 102 Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val 5 10 15 CAA GCT GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC 150 Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 20 25 30 35 AAG ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG CAG TCA GTC 198 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val 40 45 50 TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC CAC 246 Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 55 60 65 CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC CAA 294 Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln 70 75 80 CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC AAC 342 Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn 85 90 95 GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT AAG 390 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 100 105 110 115 AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC CTG 438 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu 120 125 130 GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC CTG 486 Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 135 140 145 AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC CTC 534 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu 150 155 160 AGC CCT GGG TGC TGAGGCCTT GAAGGTCACT CTTCCTGCAA GGACTNACGT 585 Ser Pro Gly Cys 165 TAAGGGAAGG AACTCTGGTT TCCAGGTATC TCCAGGATTG AAGAGCATTG CATGGACACC 645 CCTTATCCAG GACTCTGTCA ATTTCCCTGA CTCCTCTAAG CCACTCTTCC AAAGG 700 配列番号：4 配列の長さ：167アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報： ヒトobポリペプチド 起源：ヒト 配列： Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 85 90 95 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 配列番号：5 配列の長さ：166アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：49位でGlnを欠くマウスobポリペプチド 起源： 生物名：マウス 配列： Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly 50 55 60 Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile 85 90 95 Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe 100 105 110 Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu 115 120 125 Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val 130 135 140 Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu 145 150 155 160 Asp Val Ser Pro Glu Cys 165 配列番号：6 配列の長さ：166アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：49位でGlnを欠くヒトobポリペプチド 起源： 生物名：ヒト 配列： Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly 50 55 60 Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile 85 90 95 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 100 105 110 Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp 115 120 125 Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 130 135 140 Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu 145 150 155 160 Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 配列番号：7 配列の長さ：175塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 他の情報：エクソン2G7 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列： GTGCAAGAAG AAGAAGATCC CAGGGCAGGA AAATGTGCTG GAGACCCCTG TGTCGGGTCC 60 NGTGGNTTTG GTCCTATCTG TCTTATGTNC AAGCAGTGCC TATCCAGAAA GTCCAGGATG 120 ACACCAAAAG CCTCATCAAG ACCATTGTCA NCAGGATCAC TGANATTTCA CACACG 176 配列番号：8 配列の長さ：18塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：エクソン2G7に対するPCR 5 プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列： CCAGGGCAGG AAAATGTG 18 配列番号：9 配列の長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：エクソン2G7に対するPCR 3プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：YES 配列： CATCCTGGAC TTTCTGGATA GG 22 配列番号：10 配列の長さ：23アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：推定のN末端シグナルペプチド 配列 Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro 20 配列番号：11 配列の長さ：287塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA (plasmid) 他の情報：発現ベクターpET-15b ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号：T7プロモーター 存在位置：20..37 配列の特徴 特徴を表す記号：lacオペレーター 存在位置：39..64 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：108..243 配列の特徴 特徴を表す記号：His-Tag 存在位置：123..137 配列の特徴 特徴を表す記号：トロンビン切断部位 存在位置：184..196 配列 AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA 60 TTCCCCTCTA CAAATAATTT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACC ATG GGC AGC 116 Met Gly Ser 1 AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC 164 Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 5 10 15 CAT ATG CTC GAG GAT CCC GCT GCT AAC AAA GCC CGA AAG GAA GCT GAG 212 His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu 20 25 30 35 TTG GCT GCT GCC ACC GCT GAG CAA TAA CTA G CATAACCCCT TGGGGCCTCT 263 Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln * 40 AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTG 287 配列番号：12 配列の長さ：43アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Leu Glu Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys 20 25 30 Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln 35 40 配列番号：13 配列の長さ：32塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マウス5プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列 CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC 32 配列番号：14 配列の長さ：32塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マウス3プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：Yes 配列 TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC 32 配列番号：15 配列の長さ：32塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： ヒト5プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列 TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC 32 配列番号：16 配列の長さ：32塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： ヒト3プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：Yes 配列 TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA 32 配列番号：17 配列の長さ：11塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 他の情報：obにおけるスプライスアクセプター部位 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列の特徴 特徴を表す記号：Splice acceptor site 配列 AGCAGTCGGT A 11 配列番号：18 配列の長さ：16アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 他の情報： ob ペプチドフラグメント フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：マウス 配列 Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr 1 5 10 15 配列番号：19 配列の長さ：15アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 他の情報： ob ペプチドフラグメント フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：マウス 配列 Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 1 5 10 15 配列番号：20 配列の長さ：19アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 他の情報： ob ペプチドフラグメント フラグメント型：中間部フラグメント 起源： 生物名：マウス 配列 Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu 1 5 10 15 Ser Leu Asp 配列番号：21 配列の長さ：20アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 他の情報： ob ペプチドフラグメント フラグメント型：カルボキシル末端 起源： 生物名：マウス 配列 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val 1 5 10 15 Ser Pro Glu Cys 20 配列番号：22 配列の長さ：414塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 他の情報：第１エクソンの非コード配列上流を含むヒトob遺伝子の一部分、第 １エクソンのコード配列、および第１イントロンの5領域 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：38..181 配列の特徴 特徴を表す記号：第１イントロンの5領域 存在位置：182..414 配列の特徴 特徴を表す記号：HOB 1gF DNAプライマーが生成されたヒトob遺伝子の5非コー ド配列 存在位置：11..28 配列の特徴 特徴を表す記号：HOB 1gRプライマーが生成されたヒトob遺伝子のイントロン の配列 存在位置：241..260 配列 GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG 55 Met His Trp Gly Thr Leu 1 5 TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG 103 Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val Gln Ala Val 10 15 20 CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT 151 Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile 25 30 35 GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA 201 Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 40 45 CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261 AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT 321 TTGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA 381 GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414 配列番号：23 配列の長さ：48アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：第１エクソンによりコードされるヒトobタンパク質のN末端部分 配列 Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 配列番号：24 配列の長さ：801塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 他の情報：第１イントロンの3領域、第２エクソンのコード配列、および3非コ ード配列を含むヒトob遺伝子の一部分 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：291..648 配列の特徴 特徴を表す記号：第１イントロンの3 存在位置：1..290 配列の特徴 特徴を表す記号：HOB 2gFプライマーが生成されたヒトob遺伝子のイントロン の配列 存在位置：250..269 配列の特徴 特徴を表す記号：HOB 2gR DNAプライマーが生成されたヒトob遺伝子の3非コー ド配列 存在位置：707..728 配列 CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT 60 GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG 120 CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG 180 AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG 240 CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA 296 Gln Ser 1 GTC TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC 344 Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu 5 10 15 CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC 392 His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr 20 25 30 CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC 440 Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser 35 40 45 50 AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT 488 Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 55 60 65 AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC 536 Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 70 75 80 CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC 584 Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 85 90 95 CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC 632 Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp 100 105 110 CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTGCAAGG ACTACGTTAA 688 Leu Ser Pro Gly Cys 115 GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC 748 TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG 801 配列番号：25 配列の長さ：119アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：第２エクソンによりコードされるヒトobタンパク質のC末端部分 配列 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 1 5 10 15 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 20 25 30 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 35 40 45 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 50 55 60 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser 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配列の種類：DNA (primer) 他の情報：ヒトob遺伝子の3 非コード配列から生成されたHOB 2gR DNAプライ マー ハイポセティカル：NO アンチセンス：YES 配列 CTTCAATCCT GGAGATACCT GG 22 配列番号：33 配列の長さ：51塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA 他の情報： pPIC.9 クローニング部位 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA GGCCGGCCGG G 51 配列番号：34 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：ヒトob cDNA 配列を増幅するためのPCR 5プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列 GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCCATCCAA AAAGTCCAAG 40 配列番号：35 配列の長さ：31塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：ヒトob cDNA 配列を増幅するためのPCR 3プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：YES 配列 GCGCGAATTC TCAGCACCCA GGGCTGAGGT C 31 配列番号：36 配列の長さ：40塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マウスob cDNA配列を増幅するためのPCR 5プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列 GTATCTCTCG AGAAAAGAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 40 配列番号：37 配列の長さ：31塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マウスob cDNA 配列を増幅するためのPCR 3プライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：YES 配列 GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C 31 配列番号：38 配列の長さ：4アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：トロンビン切断後の再生マウスob タンパク質のN末端におけるテト ラペプチド 起源： 生物名：マウス 配列 Gly Ser His Met 1 配列番号：39 配列の長さ：19塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：配列タグ部位に特異的なPCRプライマー sWSS1734 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 CAAGACAAAT GAGATAAGG 19 配列番号：40 配列の長さ：18塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： 配列タグ部位に特異的なPCRプライマー sWSS1734 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 AGAGTTACAG CTTTACAG 18 配列番号：41 配列の長さ：19塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： 配列タグ部位に特異的なPCRプライマー sWSS494 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 CTAAACACCT TTCCATTCC 19 配列番号：42 配列の長さ：22塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： 配列タグ部位に特異的なPCRプライマー sWSS494 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC 22 配列番号：43 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： 配列タグ部位に特異的なPCRプライマー sWSS883 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20 配列番号：44 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報： 配列タグ部位に特異的なPCRプライマー sWSS883 ハイポセティカル：NO 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ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 TCTGATTGCT GGCTGC 16 配列番号：90 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マーカーAFM199xh12 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 GCGCGTGTGT ATGTGAG 17 配列番号：91 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マーカーAFMa345wc9 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 AGCTCTTGGC AAACTCACAT 20 配列番号：92 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マーカーAFMa345wc9 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ヒト 配列 GCCTAAGGGA ATGAGACACA 20 配列番号：93 配列の長さ：24塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (primer) 他の情報：マウスPax4遺伝子に対するプライマー ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：マウス 配列 GGGAGCCTTG TCCTGGGTAC AAAG 24 配列番号：94 配列の長さ：491塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 他の情報： 組換えマウスmet ob ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：マウス 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：41..478 配列 TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATG GTA CCG ATC CAG 55 Met Val Pro Ile Gln 1 5 AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT AAA ACG ATC GTT ACG CGT 103 Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr 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information: Human ob polypeptide Origin: Human Sequence: Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 85 90 95 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 166 amino acid sequence Type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein Other information: Mouse ob polypeptide lacking 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carboxyl terminus Origin: organism name: mouse Sequence Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val 1 5 10 15 Ser Pro Glu Cys 20 SEQ ID NO: 22 Sequence length: 414 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear sequence species Class: DNA (genomic) Other information: Part of human ob gene including non-coding sequence upstream of exon 1, coding sequence of exon 1, and 5 regions of intron 1. Hypothetical: NO Antisense: NO Origin ： Organism name ： Human Sequence characteristics Characteristic symbol ： CDS Location ： 38. . 181 Sequence characteristics Symbols representing characteristics: 5 regions of the first intron Location: 182. . 414 Sequence characteristics Characteristic symbol: 5 non-coding sequences of human ob gene from which HOB 1gF DNA primer was generated Location: 11. . 28 Characteristic of sequence Symbol for characteristic: Intron sequence of human ob gene from which HOB 1gR primer was generated Location: 241. . 260 sequences GGTTGCAAGG CCCAAGAAGC CCATCCTGGG AAGGAAA ATG CAT TGG GGA ACC CTG 55 Met His Trp Gly Thr Leu 15 TGC GGA TTC TTG TGG CTT TGG CCC TAT CTT TTC TAT GTC CAA GCT GTG 103 Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Proyr Val Gln Ala Val 10 15 20 CCC ATC CAA AAA GTC CAA GAT GAC ACC AAA ACC CTC ATC AAG ACA ATT 151 Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile 25 30 35 GTC ACC AGG ATC AAT GAC ATT TCA CAC ACG GTAAGGAGAG TATGCGGGGA 201 Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 40 45 CAAAGTAGAA CTGCAGCCAG CCCAGCACTG GCTCCTAGTG GCACTGGACC CAGATAGTCC 261 AAGAAACATT TATTGAACGC CTCCTGAATG CCAGGCACCT ACTGGAAGCT GAGAAGGATT 321 TTGGATAGCA CAGGGCTCCA CTCTTTCTGG TTGTTTCTTN TGGCCCCCTC TGCCTGCTGA 381 GATNCCAGGG GTTAGNGGTT CTTAATTCCT AAA 414 SEQ ID NO: 23 sequence of Length: 48 amino acids Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: protein Other information: N-terminal part of human ob protein encoded by exon 1 Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 SEQ ID NO: 24 Sequence length: 801 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (genomic) Other information: Part of the human ob gene containing three regions of one intron, the coding sequence of the second exon, and three non-coding sequences Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence characteristics Characteristic symbols: CDS Location: 291. . 648 Sequence features Symbol indicating feature: 3 in intron 1 Location: 1. . 290 Sequence characteristics Characteristic symbol: Intron sequence of human ob gene from which HOB 2gF primer was generated Location: 250. . 269 Sequence characteristics Symbol indicating characteristics: 3 non-coding sequence of human ob gene from which HOB 2gR DNA primer was generated Location: 707. . 728 sequence CTGGTTCTTT CAGGAAGAGG CCATGTAAGA GAAAGGAATT GACCTAGGGA AAATTGGCCT 60 GGGAAGTGGA GGGAACGGAT GGTGTGGGAA AAGCAGGAAT CTCGGAGACC AGCTTAGAGG 120 CTTGGCAGTC ACCTGGGTGC AGGANACAAG GGCCTGAGCC AAAGTGGTGA GGGAGGGTGG 180 AAGGAGACAG CCCAGAGAAT GACCCTCCAT GCCCACGGGG AAGGCAGAGG GCTCTGAGAG 240 CGATTCCTCC CACATGCTGA GCACTTGTTC TCCCTCTTCC TCCTNCATAG CAG TCA 296 Gln Ser 1 GTC TCC TCC AAA CAG AAA GTC ACC GGT TTG GAC TTC ATT CCT GGG CTC 344 Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu 5 10 15 CAC CCC ATC CTG ACC TTA TCC AAG ATG GAC CAG ACA CTG GCA GTC TAC 392 His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr 20 25 30 CAA CAG ATC CTC ACC AGT ATG CCT TCC AGA AAC GTG ATC CAA ATA TCC 440 Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser 35 40 45 50 AAC GAC CTG GAG AAC CTC CGG GAT CTT CTT CAC GTG CTG GCC TTC TCT 488 Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 55 60 65 AAG AGC TGC CAC TTG CCC TGG GCC AGT GGC CTG GAG ACC TTG GAC AGC 536 Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 70 75 80 CTG GGG GGT GTC CTG GAA GCT TCA GGC TAC TCC ACA GAG GTG GTG GCC 584 Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 85 90 95 CTG AGC AGG CTG CAG GGG TCT CTG CAG GAC ATG CTG TGG CAG CTG GAC 632 Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp 100 105 110 CTC AGC CCT GGG TGC T GAGGCCTTGA AGGTCACTCT TCCTAA ACTACGTTAA 688 Leu Ser Pro Gly Cys 115 GGGAAGGAAC TCTGGCTTTC CAGGTATCTC CAGGATTGAA GAGCATTGCA TGGACACCCC 748 TTATCCAGGA CTCTGTCAAT TTCCCTGACT CCTCTAAGCC ACTCTTCCAA AGG 801 SEQ ID NO: 25 Sequence length: 119 amino acids Sequence type: amino acid Information: C-terminal partial sequence of human ob protein encoded by exon 2 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 1 5 10 15 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 20 25 30 Val Tyr Gln Gln Il e Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 35 40 45 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 50 55 60 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 85 90 95 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 100 105 110 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 115 SEQ ID NO: 26 Sequence length: 8 amino acids Sequence type: Amino acid Topology: Unknown Sequence type: Peptide Fragment type: Middle fragment Origin: Organism name: pichia yeast Sequence Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 15 SEQ ID NO: : 27 Sequence length: 4 amino acids Sequence type: Amino acid Topology: Unknown Sequence type: Peptide Fragment type: Middle fragment Origin: Organism name: pichia yeast Sequence Glu Ala Glu Ala 1 SEQ ID NO: 28 Sequence length: 4 amino acid Sequence type: Amino acid Topology: Unknown Sequence type: Peptide Fragment type: Intermediate fragment Origin: Organism name: pichia yeast Sequence Leu Glu Lys Arg 1 SEQ ID NO: 29 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: HOB 1gF DNA primer generated from 5 non-coding sequences of human ob gene Hypothetical: NO Antisense: NO sequence CCCAAGAAGC CCATCCTG 18 SEQ ID NO: 30 Sequence Length: 20 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: HOB generated from the first intron sequence of human ob gene 1gR DNA primer Hypothetical: NO Antisense: YES sequence GACTATCTGG GTCCAGTGCC 20 SEQ ID NO: 31 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information HOB 2gF DNA primer generated from the sequence of the first intron of the human ob gene Hypothetical: NO Antisense: NO sequence CCACATGCTG AGCACTTGTT 20 SEQ ID NO: 32 Sequence length: 22 base pairs Sequence type: Number of nucleic acid chains : Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: HOB 2gR DNA primer generated from 3 non-coding sequences of human ob gene Hypothetical: NO Antisense: YES sequence CTTCAATCCT GGAGATACCT GG 22 SEQ ID NO: 33 Sequence length: 51 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: circular Sequence type: DNA Other information: pPIC. 9 Cloning site Hypothetical: NO Antisense: NO sequence CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTACGTA GAATTCCCTA 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Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Type of linear sequence: DNA (primer) Other information: PCR 3 primer for amplifying mouse ob cDNA sequence Hypothetical: NO Antisense: YES sequence GCGCGAATTC TCAGCATTCA GGGCTAACAT C 31 SEQ ID NO: 38 Sequence length : 4 amino acids Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein Other information: Tetrapeptide at N-terminal of regenerating mouse ob protein after thrombin cleavage Origin: Organism: Mouse Sequence Gly Ser His Met 1 SEQ ID NO: : 39 Sequence length: 19 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: Specific to sequence tag site Different PCR primers sWSS1734 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human sequence CAAGACAAAT GAGATAAGG 19 SEQ ID NO: 40 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology : Linear type of sequence: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS1734 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism name: Human sequence AGAGTTACAG CTTTACAG 18 Sequence number: 41 Sequence Length: 19 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS494 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Biological name: Human Sequence CTAAACACCT TTCCATTCC 19 SEQ ID NO: 42 Sequence length: 22 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA ( primer) Other information: PCR primer specific to the sequence tag site sWSS494 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence TTATATTCAC TTTTCCCCTC TC 22 SEQ ID NO: 43 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands : Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS883 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism name: Human sequence TGCAGTAAGC TGTGATTGAG 20 SEQ ID NO: 44 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS883 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human sequence GTGCAGCTTT AATTGTGAGC 20 SEQ ID NO: 45 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear sequence Type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS2359 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence AGTGTTGTGT TTCTCCTG 18 SEQ ID NO: 46 Sequence length: 19 base pairs Sequence Type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS2359 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Biology Name: human sequence AAAGGGGATG TGATAAGTG 19 SEQ ID NO: 47 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: sequence tag Site-specific PCR primers sWSS2336 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism name: Human sequence GGTGTTACGT TTAGTTAC 18 SEQ ID NO: 48 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: One Chain topology: straight Type Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS2336 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism name: Human Sequence GGAATAATGA GAGAAGATTG 20 SEQ ID NO: 49 Sequence length : 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS1218 Hypothetical: NO antisense : NO Origin: Organism name: Human sequence GCTCAACTGA CAGAAAAC 18 SEQ ID NO: 50 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) etc. Information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS1218 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism name: Human sequence GACTATGTAA AAGAAATGCC 20 SEQ ID NO: 51 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid chain Number of: one Chain Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific for sequence tag site sWSS1402 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human sequence AAAGGGCTTC TAATCTAC 18 SEQ ID NO: 52 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS1402 Hypose Tical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence CCTTCCAACT TCTTTGAC 18 SEQ ID NO: 53 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS999 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence TAAACCCCCT TTCTGTTC 18 SEQ ID NO: 54 Sequence length: 19 base pairs Sequence Type: Number of acid chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to the sequence tag site sWSS999 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence TTGCATAATA GTCACACCC 19 SEQ ID NO: 55 Sequence length: 22 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: Specific to sequence tag site Typical PCR primers sWSS1751 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism name: Human Sequence CCAAAATCAG AATTGTCAGA AG 22 SEQ ID NO: 56 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology : Linear Sequence type: DNA (primer) 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sWSS2061 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence GTTGCACAAT ACAAAATCC 19 Sequence number 60 Sequence length: 20 base pairs Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific to sequence tag site sWSS2061 Hypose Tical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence CTTCCATTAG TGTCTTATAG 20 SEQ ID NO: 61 Sequence length: 18 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: PCR primer specific for sequence tag site sWSS2588 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human sequence ATCACTACAC ACCTAATC 18 SEQ ID NO: 62 Sequence length: 18 base pairs Sequence Type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (primer) Other information: Sequence primer specific PCR primer sWSS2588 Hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Biology Name: Human 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50 AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG CAG GTG TTA ACC TCC CTG 247 Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu 55 60 65 CCG TCC CAG AAC GTT CTT CAG ATC GCT AAC GAC CTC GAG AAC CTT CGC 295 Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg 70 75 80 85 GAC CTG CTG CAC CTG CTG GCA TTC TCC AAA TCC TGC TCC CTG CCG CAG 343 Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln 90 95 100 ACC TCA GGT CTT CAG AAA CCG GAA TCC CTG GAC GGG GTC CTG GAA GCA 391 Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala 105 110 115 TCC CTG TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG TCC CGT CTG CAG GGT TCC 439 Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser 120 125 130 CTT CAG GAC ATC CTT CAG CAG CTG GAC GTT TCT CCG GAA TGT TAATGGA 488 Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys 135 140 145 TCC 491 SEQ ID NO: 95 Sequence Length: 147 amino acids Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: protein Other information: Recombinant mouse met ob protein sequence Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys 15 10 15 Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser 20 25 30 Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln 50 55 60 Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp 65 70 75 80 Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95 Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp 100 105 110 Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125 Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser 130 135 140 Pro Glu Cys 145 SEQ ID NO: 96 Sequence length: 454 base pairs Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear sequence Type: DNA Other information: Recombinant human met ob hypothetical: NO Antisense: NO Origin: Organism: Human Sequence characteristics Characteristic symbol: CDS Location: 4. . 444 Sequence CAT ATG GTA CCG ATC CAG AAA GTT CAG GAC GAC ACC AAA ACC TTA ATT 48 Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile 1 5 10 15 AAA ACG ATC GTT ACG CGT ATC AAC GAC ATC AGT CAC ACC CAG TCG GTG 96 Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val 20 25 30 AGC TCT AAA CAG CGT GTT ACA GGC CTG GAC TTC ATC CCG GGT CTG CAC 144 Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His 35 40 45 CCG ATC CTG ACC TTG TCC AAA ATG GAC CAG ACC CTG GCT GTA TAC CAG 192 Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln 50 55 60 CAG ATC TTA ACC TCC ATG CCG TCC CGT AAC GTT CTT CAG ATC TCT AAC 240 Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln Ile Ser Asn 65 70 75 GAC CTC GAG AAC CTT CGC GAC CTG CTG CAC GTG CTG GCA TTC TCC AAA 288 Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 80 85 90 95 TCC TGC CAC CTG CCA TGG GCT TCA GGT CTT GAG ACT CTG GAC TCT CTG 336 Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu 100 105 110 G GC GGG GTC CTG GAA GCA TCC GGT TAC AGC ACC GAA GTT GTT GCT CTG 384 Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 115 120 125 TCC CGT CTG CAG GGT TCC CTT CAG GAC ATG CTT TGG CAG CTG GAC CTG 432 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu 130 135 140 TCT CCG GGT TGT TAATGGATCC 454 Ser Pro Gly Cys 145 SEQ ID NO: 97 Sequence length: 147 amino acids Sequence type: 147 amino acids Topology : Linear Sequence type: Protein Other information: Recombinant human met ob protein Sequence Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys 1 5 10 15 Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser 20 25 30 Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln 50 55 60 Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln Ile Ser Asn Asp 65 70 75 80 Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95 Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110 Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125 Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser 130 135 140 Pro Gly Cys 145 SEQ ID NO: 98 Sequence length: 21 amino acids Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Fragment type: N-terminal fragment Sequence Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met 20 SEQ ID NO: 99 Sequence length: 20 amino acids Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Fragment type: N-terminal His-tag Sequence Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser Pro 20

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】図1(A〜E)は、マウスOB cDNAについて誘導さ
れる核酸配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列
番号2)を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測167
アミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7kb
の3'非翻訳配列が続く。(既に1994年11月30日出願の出
願第08/347,563号および1995年5月10日出願の第08/438,
431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が続
いて決定され、クローニングアーチファクトとされた。
このアーチファクトは、コード領域、図1に示されてい
る39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コード
領域とは関係がない。)3'非翻訳配列の約2500塩基対の
すべてを示す。観察およびSigSeqコンピュータプログラ
ムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シグナ
ル配列の存在を示す(下線)。cDNAの微小不均一性(micro
heterogeneity)が認められ、約70%のcDNAがコドン49に
グルタミンのコドンを有し、そして30%が有しなかった
(以下の図5および6を参照のこと)。このアミノ酸には下
線を付し、C57BL/6J ob/obマウス(1Jマウス)内で変異し
ているアルギニンのコドンにも同様に下線を付す。FIG. 1 (AE) shows the derived nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) for mouse OB cDNA. Predicted 167 behind a 39 base pair 5 'leader
Amino acid open reading frame and about 3.7kb
Followed by the 3 'untranslated sequence. (Application No. 08 / 347,563 already filed on November 30, 1994 and No. 08/438, filed on May 10, 1995
In No. 431, an additional 58 base 5 'non-coding sequence was subsequently determined and was considered a cloning artifact.
This artifact is unrelated to the coding region, the 39 base 5 ′ noncoding region shown in FIG. 1, or the 3 ′ noncoding region of the gene. ) Shows all about 2500 base pairs of 3 'untranslated sequence. Observation and analysis of the putative protein by using the SigSeq computer program indicates the presence of the signal sequence (underlined). cDNA microheterogeneity (micro
heterogeneity), about 70% of the cDNAs had a glutamine codon at codon 49 and 30% did not
(See FIGS. 5 and 6 below). This amino acid is underlined, and the arginine codon mutated in the C57BL / 6J ob / ob mouse (1J mouse) is also underlined.

【図１Ｂ】図1(A〜E)は、マウスOB cDNAについて誘導さ
れる核酸配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列
番号2)を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測167
アミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7kb
の3'非翻訳配列が続く。(既に1994年11月30日出願の出
願第08/347,563号および1995年5月10日出願の第08/438,
431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が続
いて決定され、クローニングアーチファクトとされた。
このアーチファクトは、コード領域、図1に示されてい
る39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コード
領域とは関係がない。)3'非翻訳配列の約2500塩基対の
すべてを示す。観察およびSigSeqコンピュータプログラ
ムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シグナ
ル配列の存在を示す(下線)。cDNAの微小不均一性(micro
heterogeneity)が認められ、約70%のcDNAがコドン49に
グルタミンのコドンを有し、そして30%が有しなかった
(以下の図5および6を参照のこと)。このアミノ酸には下
線を付し、C57BL/6J ob/obマウス(1Jマウス)内で変異し
ているアルギニンのコドンにも同様に下線を付す。FIG. 1 (AE) shows the derived nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) for mouse OB cDNA. Predicted 167 behind a 39 base pair 5 'leader
Amino acid open reading frame and about 3.7kb
Followed by the 3 'untranslated sequence. (Application No. 08 / 347,563 already filed on November 30, 1994 and No. 08/438, filed on May 10, 1995
In No. 431, an additional 58 base 5 'non-coding sequence was subsequently determined and was considered a cloning artifact.
This artifact is unrelated to the coding region, the 39 base 5 ′ noncoding region shown in FIG. 1, or the 3 ′ noncoding region of the gene. ) Shows all about 2500 base pairs of 3 'untranslated sequence. Observation and analysis of the putative protein by using the SigSeq computer program indicates the presence of the signal sequence (underlined). cDNA microheterogeneity (micro
heterogeneity), about 70% of the cDNAs had a glutamine codon at codon 49 and 30% did not
(See FIGS. 5 and 6 below). This amino acid is underlined, and the arginine codon mutated in the C57BL / 6J ob / ob mouse (1J mouse) is also underlined.

【図１Ｃ】図1(A〜E)は、マウスOB cDNAについて誘導さ
れる核酸配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列
番号2)を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測167
アミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7kb
の3'非翻訳配列が続く。(既に1994年11月30日出願の出
願第08/347,563号および1995年5月10日出願の第08/438,
431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が続
いて決定され、クローニングアーチファクトとされた。
このアーチファクトは、コード領域、図1に示されてい
る39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コード
領域とは関係がない。)3'非翻訳配列の約2500塩基対の
すべてを示す。観察およびSigSeqコンピュータプログラ
ムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シグナ
ル配列の存在を示す(下線)。cDNAの微小不均一性(micro
heterogeneity)が認められ、約70%のcDNAがコドン49に
グルタミンのコドンを有し、そして30%が有しなかった
(以下の図5および6を参照のこと)。このアミノ酸には下
線を付し、C57BL/6J ob/obマウス(1Jマウス)内で変異し
ているアルギニンのコドンにも同様に下線を付す。FIG. 1 (AE) shows the derived nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) for mouse OB cDNA. Predicted 167 behind a 39 base pair 5 'leader
Amino acid open reading frame and about 3.7kb
Followed by the 3 'untranslated sequence. (Application No. 08 / 347,563 already filed on November 30, 1994 and No. 08/438, filed on May 10, 1995
In No. 431, an additional 58 base 5 'non-coding sequence was subsequently determined and was considered a cloning artifact.
This artifact is unrelated to the coding region, the 39 base 5 ′ noncoding region shown in FIG. 1, or the 3 ′ noncoding region of the gene. ) Shows all about 2500 base pairs of 3 'untranslated sequence. Observation and analysis of the putative protein by using the SigSeq computer program indicates the presence of the signal sequence (underlined). cDNA microheterogeneity (micro
heterogeneity), about 70% of the cDNAs had a glutamine codon at codon 49 and 30% did not
(See FIGS. 5 and 6 below). This amino acid is underlined, and the arginine codon mutated in the C57BL / 6J ob / ob mouse (1J mouse) is also underlined.

【図１Ｄ】図1(A〜E)は、マウスOB cDNAについて誘導さ
れる核酸配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列
番号2)を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測167
アミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7kb
の3'非翻訳配列が続く。(既に1994年11月30日出願の出
願第08/347,563号および1995年5月10日出願の第08/438,
431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が続
いて決定され、クローニングアーチファクトとされた。
このアーチファクトは、コード領域、図1に示されてい
る39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コード
領域とは関係がない。)3'非翻訳配列の約2500塩基対の
すべてを示す。観察およびSigSeqコンピュータプログラ
ムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シグナ
ル配列の存在を示す(下線)。cDNAの微小不均一性(micro
heterogeneity)が認められ、約70%のcDNAがコドン49に
グルタミンのコドンを有し、そして30%が有しなかった
(以下の図5および6を参照のこと)。このアミノ酸には下
線を付し、C57BL/6J ob/obマウス(1Jマウス)内で変異し
ているアルギニンのコドンにも同様に下線を付す。FIG. 1 (AE) shows the derived nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) for mouse OB cDNA. Predicted 167 behind a 39 base pair 5 'leader
Amino acid open reading frame and about 3.7kb
Followed by the 3 'untranslated sequence. (Application No. 08 / 347,563 already filed on November 30, 1994 and No. 08/438, filed on May 10, 1995
In No. 431, an additional 58 base 5 'non-coding sequence was subsequently determined and was considered a cloning artifact.
This artifact is unrelated to the coding region, the 39 base 5 ′ noncoding region shown in FIG. 1, or the 3 ′ noncoding region of the gene. ) Shows all about 2500 base pairs of 3 'untranslated sequence. Observation and analysis of the putative protein by using the SigSeq computer program indicates the presence of the signal sequence (underlined). cDNA microheterogeneity (micro
heterogeneity), about 70% of the cDNAs had a glutamine codon at codon 49 and 30% did not
(See FIGS. 5 and 6 below). This amino acid is underlined, and the arginine codon mutated in the C57BL / 6J ob / ob mouse (1J mouse) is also underlined.

【図１Ｅ】図1(A〜E)は、マウスOB cDNAについて誘導さ
れる核酸配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列
番号2)を示す。39塩基対の5'リーダーの後方に予測167
アミノ酸オープンリーディングフレームおよび約3.7kb
の3'非翻訳配列が続く。(既に1994年11月30日出願の出
願第08/347,563号および1995年5月10日出願の第08/438,
431号において、さらなる58塩基の5'非コード配列が続
いて決定され、クローニングアーチファクトとされた。
このアーチファクトは、コード領域、図1に示されてい
る39塩基の5'非コード領域、または遺伝子の3'非コード
領域とは関係がない。)3'非翻訳配列の約2500塩基対の
すべてを示す。観察およびSigSeqコンピュータプログラ
ムを用いることによる推定タンパク質の分析は、シグナ
ル配列の存在を示す(下線)。cDNAの微小不均一性(micro
heterogeneity)が認められ、約70%のcDNAがコドン49に
グルタミンのコドンを有し、そして30%が有しなかった
(以下の図5および6を参照のこと)。このアミノ酸には下
線を付し、C57BL/6J ob/obマウス(1Jマウス)内で変異し
ているアルギニンのコドンにも同様に下線を付す。FIG. 1 (AE) shows the derived nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) for mouse OB cDNA. Predicted 167 behind a 39 base pair 5 'leader
Amino acid open reading frame and about 3.7kb
Followed by the 3 'untranslated sequence. (Application No. 08 / 347,563 already filed on November 30, 1994 and No. 08/438, filed on May 10, 1995
In No. 431, an additional 58 base 5 'non-coding sequence was subsequently determined and was considered a cloning artifact.
This artifact is unrelated to the coding region, the 39 base 5 ′ noncoding region shown in FIG. 1, or the 3 ′ noncoding region of the gene. ) Shows all about 2500 base pairs of 3 'untranslated sequence. Observation and analysis of the putative protein by using the SigSeq computer program indicates the presence of the signal sequence (underlined). cDNA microheterogeneity (micro
heterogeneity), about 70% of the cDNAs had a glutamine codon at codon 49 and 30% did not
(See FIGS. 5 and 6 below). This amino acid is underlined, and the arginine codon mutated in the C57BL / 6J ob / ob mouse (1J mouse) is also underlined.

【図２Ａ】図２(AおよびB)は、ヒトOB cDNAについて誘
導された核酸配列(配列番号3)を示す。ヌクレオチドに
は1〜701の番号を付し、開始部位はヌクレオチド46で終
始はヌクレオチド550である。FIG. 2 (A and B) shows the derived nucleic acid sequence for human OB cDNA (SEQ ID NO: 3). The nucleotides are numbered from 1 to 701, with the start site at nucleotide 46 and the end at nucleotide 550.

【図２Ｂ】図２(AおよびB)は、ヒトOB cDNAについて誘
導された核酸配列(配列番号3)を示す。ヌクレオチドに
は1〜701の番号を付し、開始部位はヌクレオチド46で終
始はヌクレオチド550である。FIG. 2 (A and B) shows the derived nucleic acid sequence for human OB cDNA (SEQ ID NO: 3). The nucleotides are numbered from 1 to 701, with the start site at nucleotide 46 and the end at nucleotide 550.

【図３】図３は、図2AおよびBの核酸配列に対応するヒ
トOB遺伝子について誘導された全推定アミノ酸配列(配
列番号4)を示す。アミノ酸には1〜167の番号を付す。シ
グナル配列切断部位がアミノ酸21(Ala)の後に位置し、
このため成熟タンパク質がアミノ酸22(Val)からアミノ
酸167(Cys)に伸長している。FIG. 3 shows the entire deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) derived for the human OB gene corresponding to the nucleic acid sequences of FIGS. 2A and 2B. Amino acids are numbered 1-167. The signal sequence cleavage site is located after amino acid 21 (Ala),
For this reason, the mature protein extends from amino acid 22 (Val) to amino acid 167 (Cys).

【図４】図４は、マウス(配列番号２)とヒト(配列番号
４)との推定アミノ酸配列間の比較を示す。ヒトOB推定
アミノ酸配列の配列は、マウスの配列に対して高度に相
同性である。保存的変化を破線で、そして非保存的変化
をアステリスクで示す。可変のグルタミンのコドンには
下線を付し、これはC57BL/6J ob/ob(1J)マウスのナンセ
ンス変異の位置にも同様に下線を付す。全体的では、ア
ミノ酸レベルで83%の同一性があるが、コドン22のバリ
ン(シグナル配列切断(overage)のすぐ下流と117位のシ
ステインとの間には8個の置換しか見出されなかった。FIG. 4 shows a comparison between the deduced amino acid sequences of mouse (SEQ ID NO: 2) and human (SEQ ID NO: 4). The sequence of the human OB deduced amino acid sequence is highly homologous to the mouse sequence. Conservative changes are indicated by dashed lines and non-conservative changes are indicated by asterisks. Variable glutamine codons are underlined, as are the positions of nonsense mutations in C57BL / 6J ob / ob (1J) mice as well. Overall, there is 83% identity at the amino acid level, but only eight substitutions were found between valine at codon 22 (immediately downstream of signal sequence overage and cysteine at position 117) .

【図５】図５は、図３に示されたマウスOB遺伝子につい
て誘導される全長アミノ酸配列(配列番号5)であるが、
グルタミン49を欠失する配列を示す。アミノ酸には1〜1
66の番号を付す。シグナル配列切断部位がアミノ酸21(A
la)の後(つまりグルタミン酸49欠失の前方)に位置し、
このため成熟タンパク質がアミノ酸22(Val)からアミノ
酸166(Cys)に伸長している。FIG. 5 shows the full length amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) derived for the mouse OB gene shown in FIG. 3,
Shows the sequence lacking glutamine 49. 1 to 1 for amino acids
Number 66. The signal sequence cleavage site is amino acid 21 (A
la) (i.e. before the glutamate 49 deletion),
For this reason, the mature protein extends from amino acid 22 (Val) to amino acid 166 (Cys).

【図６】図６は、図４に示されたヒトOB遺伝子について
誘導される全長推定アミノ酸配列(配列番号6)であるが
グルタミン49を欠失する配列を示す。アミノ酸には1〜1
66の番号を付す。シグナル配列切断部位がアミノ酸21(A
la)の後(つまりグルタミン酸49欠失の前方)に位置し、
このため成熟タンパク質がアミノ酸22(Val)からアミノ
酸166(Cys)に伸長している。FIG. 6 shows the full-length deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) derived for the human OB gene shown in FIG. 4, but lacking glutamine 49. 1 to 1 for amino acids
Number 66. The signal sequence cleavage site is amino acid 21 (A
la) (i.e. before the glutamate 49 deletion),
For this reason, the mature protein extends from amino acid 22 (Val) to amino acid 166 (Cys).

【図７】(A)マウス染色体におけるobの位置の物理地図
ならびにYACおよびPlクローニング地図。「MおよびN」はM
ulIおよびNotI制限部位に対応する。数字は、評価され
た1606減数***中のobの領域において組み換えた個々の
動物に対応する。Met、Pax4、D6Rck39、D6Rck13、およ
びCpaは、DNAプローブに結合するobの領域内の位置を意
味する。D6Rack13およびPax‐4を用いてYACを単離し、
そしてベクトレット(vectorette)PCRおよび/またはプラ
スミドエンドレスキュー(plasmid end rescue)を用いて
末端を回収し、そして順次新たなYACを単離するために
使用した。(B)得られたYACコンティグ(contig)。このコ
ンティグにおけるYACの1つ(Y902A0925)はキメラであっ
た。組換え動物の遺伝子型を決定するために使用したプ
ローブのそれぞれを括弧内に示す。(6)はYAC107に対応
する;(5)はM16(+)(またはM16(pLUS))に対応する;(4)はa
du(+)に対応する;(3)はaad(pICL)に対応する;(2)は53(p
ICL)に対応する;そして(1)は53(+)に対応する。(C)選択
されたYAC末端プローブにより単離されるバクテリオフ
ァージP1のP1コンティグ。YAC YB6S2F12の遠位末端(末
端(4))(あるいは、本明細書中においてadu(+)と呼ぶ)を
用いて、単離されたP1クローンにおいてob遺伝子を単離
した。FIG. 7 (A) Physical map of ob position on mouse chromosome and YAC and Pl cloning maps. "M and N" is M
Corresponds to ulI and NotI restriction sites. The numbers correspond to individual animals recombined in the area of the 1606 meiotic ob evaluated. Met, Pax4, D6Rck39, D6Rck13, and Cpa refer to positions within the region of ob that bind to the DNA probe. Isolate YAC using D6Rack13 and Pax-4,
The ends were then recovered using vectorette PCR and / or plasmid end rescue and used sequentially to isolate new YACs. (B) The obtained YAC contig. One of the YACs in this contig (Y902A0925) was chimeric. Each of the probes used to determine the genotype of the recombinant animal is shown in parentheses. (6) corresponds to YAC107; (5) corresponds to M16 (+) (or M16 (pLUS)); (4) corresponds to a
corresponds to du (+); (3) corresponds to aad (pICL); (2) corresponds to 53 (p
ICL); and (1) corresponds to 53 (+). (C) P1 contig of bacteriophage P1 isolated by the selected YAC-terminal probe. The ob gene was isolated in the isolated P1 clone using the distal end of YAC YB6S2F12 (terminal (4)) (alternatively referred to herein as adu (+)).

【図８】図８は、第４エキソンのトラッピング実験の19
2個の個々の単離物(PCRで増幅し、そして特徴付けした)
のエチジウムブロミド染色の写真を示す。FIG. 8 shows the results of the trapping experiment of the fourth exon.
2 individual isolates (amplified by PCR and characterized)
3 shows a photograph of ethidium bromide staining of E. coli.

【図９】図９は、obを有していると思われるPCR増幅ク
ローンのエチジウムブロミド染色の写真である。アーチ
ファクトを有さない７個のクローンのそれぞれをPCRを
用いて再増幅し、そしてTBE中の１%アガロースゲル上で
電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色した。サ
イズマーカー(最も左側の番号を付していないレーン)は
市販の「1kBラダー」である。レーン１-‐「HIV配列」を含
有するクローン1Dl2。レーン２‐‐クローン1F1、ob領
域外の新規のクローン。レーン３‐‐クローンlH3。レ
ーン４‐‐クローン2B2(lFlと同一)。レーン５‐‐クロ
ーン2G7(obエキソンを含有)。レーン６- -クローン2Gll
(1F1と同一)。レーン７- -クローン2H1(挿入物を含有し
ない)。FIG. 9 is a photograph of ethidium bromide staining of a PCR amplified clone suspected of having ob. Each of the seven clones with no artifacts PCR was reamplified using, and electrophoresed on a 1% agarose gel in TBE and stained with ethidium bromide. The size marker (the leftmost unnumbered lane) is a commercially available “1 kB ladder”. Lane 1—clone 1D12 containing “HIV sequence”. Lane 2—clone 1F1, a new clone outside the ob region. Lane 3—clone lH3. Lane 4—clone 2B2 (identical to 1F1). Lane 5—clone 2G7 (containing ob exon). Lane 6--Clone 2Gll
(Same as 1F1). Lane 7-clone 2H1 (no insert).

【図１０】図１０は、OB遺伝子の一部をコードするエキ
ソンを含む2G7クローン(配列番号７)の配列を示す。こ
のエキソンの増幅に使用したプライマー配列を図の枠内
に示す(配列番号８および９)。FIG. 10 shows the sequence of a 2G7 clone (SEQ ID NO: 7) containing an exon encoding a part of the OB gene. The primer sequences used to amplify this exon are shown in the box of the figure (SEQ ID NOs: 8 and 9).

【図１１Ａ】図11(A)2G7プライマーおよびアクチンプラ
イマーを用いた同マウスの異なる組織由来のmRNAの逆転
写PCR分析。第1鎖cDNA合成用プライマーとして、オリゴ
dTを用いて逆転写した100ngの全RNAを用い、RT‐PCR反
応を実施した。PCR増幅を、94℃の熱変性1分間、55℃の
ハイブリダイゼーション１分間、１サイクルあたり１秒
間の自動延長を含む72℃の伸長2分間で35サイクル実施
した。RT‐PCR産物を１×TBE緩衝液中で泳動した2%低融
点アガロースゲル内で分離した。(B)プローブとしてPCR
標識2G7を用いるマウスの異なる器官由来のmRNAのノー
ザンブロット。各組織由来の全RNAの10μgを、ホルムア
ルデヒドを含むアガロースゲル上で電気泳動した。プロ
ーブを65℃でRapid Hybe(Amersham)内でハイブリダイズ
した。暴露の1時間後にオートラジオグラフシグナルが
出現した;示す実験は、24時間暴露の結果である。FIG. 11 (A) Reverse transcription PCR analysis of mRNA from different tissues of the same mouse using 2G7 primer and actin primer. Oligos as first-strand cDNA synthesis primers
RT-PCR reaction was performed using 100 ng of total RNA reverse transcribed using dT. PCR amplification was performed for 35 cycles with 2 minutes of extension at 72 ° C., including 1 minute of heat denaturation at 94 ° C., 1 minute of hybridization at 55 ° C., and 1 second per cycle. RT-PCR products were separated in a 2% low melting point agarose gel run in 1 × TBE buffer. (B) PCR as a probe
Northern blot of mRNA from different organs of mice using labeled 2G7. 10 μg of total RNA from each tissue was electrophoresed on an agarose gel containing formaldehyde. Probes were hybridized at 65 ° C. in Rapid Hybe (Amersham). An autoradiographic signal appeared one hour after exposure; the experiment shown is the result of a 24-hour exposure.

【図１１Ｂ】図11(A)2G7プライマーおよびアクチンプラ
イマーを用いた同マウスの異なる組織由来のmRNAの逆転
写PCR分析。第1鎖cDNA合成用プライマーとして、オリゴ
dTを用いて逆転写した100ngの全RNAを用い、RT‐PCR反
応を実施した。PCR増幅を、94℃の熱変性1分間、55℃の
ハイブリダイゼーション１分間、１サイクルあたり１秒
間の自動延長を含む72℃の伸長2分間で35サイクル実施
した。RT‐PCR産物を１×TBE緩衝液中で泳動した2%低融
点アガロースゲル内で分離した。(B)プローブとしてPCR
標識2G7を用いるマウスの異なる器官由来のmRNAのノー
ザンブロット。各組織由来の全RNAの10μgを、ホルムア
ルデヒドを含むアガロースゲル上で電気泳動した。プロ
ーブを65℃でRapid Hybe(Amersham)内でハイブリダイズ
した。暴露の1時間後にオートラジオグラフシグナルが
出現した;示す実験は、24時間暴露の結果である。FIG. 11 (A) Reverse transcription PCR analysis of mRNA from different tissues of the same mouse using 2G7 primer and actin primer. Oligos as first-strand cDNA synthesis primers
RT-PCR reaction was performed using 100 ng of total RNA reverse transcribed using dT. PCR amplification was performed for 35 cycles with 2 minutes of extension at 72 ° C., including 1 minute of heat denaturation at 94 ° C., 1 minute of hybridization at 55 ° C., and 1 second per cycle. RT-PCR products were separated in a 2% low melting point agarose gel run in 1 × TBE buffer. (B) PCR as a probe
Northern blot of mRNA from different organs of mice using labeled 2G7. 10 μg of total RNA from each tissue was electrophoresed on an agarose gel containing formaldehyde. Probes were hybridized at 65 ° C. in Rapid Hybe (Amersham). An autoradiographic signal appeared one hour after exposure; the experiment shown is the result of a 24-hour exposure.

【図１２Ａ】図12(A)記載される各マウス株由来の脂肪
細胞(白色脂肪組織)RNA上でのRT‐PCR反応からのエチジ
ウムブロミド染色。各サンプルに対する全RNA(100ng)
を、オリゴdTおよび逆転写酵素を用いて逆転写し、そし
て得られた一本鎖cDNAを2G7プライマー(下のバンド)ま
たはアクチンプライマー(上のバンド)でPCR増幅した。2
G7プライマーおよびアクチンプライマーの両方は、同一
のPCR反応に含まれた。産物をl%アガロースTBEゲル上で
泳動した。(B)(A)に対応するノーザン分析。示される各
株由来の脂肪細胞(白色脂肪組織)RNAの10μgを泳動し、
そして上の図11BのPCR標識2G7プローブで検出した。2G7
mRNAのレベルにおける約20倍の増加がC57BL/6J ob/ob
(1J)株由来の白色脂肪において、痩身型同腹子に比較し
て明白であった。RT‐PCRおよびノーザン実験の両方に
おいて、SM/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2J(2J)マウス由来の2G7 R
NAの検出し得るシグナルは、2週間の暴露後でも存在し
なかった。24時間のオートラジオグラフ暴露が示され
る。同じフィルターをアクチンプローブに対してハイブ
リダイズした(パネル下部)。FIG. 12A shows ethidium bromide staining from RT-PCR reaction on adipocyte (white adipose tissue) RNA from each mouse strain described in FIG. 12 (A). Total RNA (100ng) for each sample
Was reverse transcribed using oligo dT and reverse transcriptase, and the resulting single-stranded cDNA was PCR amplified with 2G7 primer (lower band) or actin primer (upper band). Two
Both G7 and actin primers were included in the same PCR reaction. The products were run on a 1% agarose TBE gel. (B) Northern analysis corresponding to (A). Electrophores 10μg of adipocytes (white adipose tissue) RNA from each strain shown,
Then, detection was performed using the PCR-labeled 2G7 probe shown in FIG. 11B. 2G7
Approximately 20-fold increase in mRNA levels is due to C57BL / 6J ob / ob
The white fat from the (1J) strain was evident as compared to the lean littermates. In both RT-PCR and Northern experiments, 2G7 R from SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J (2J) mice
No detectable signal of NA was present after 2 weeks of exposure. A 24-hour autoradiographic exposure is indicated. The same filter was hybridized to the actin probe (bottom panel).

【図１２Ｂ】図12(A)記載される各マウス株由来の脂肪
細胞(白色脂肪組織)RNA上でのRT‐PCR反応からのエチジ
ウムブロミド染色。各サンプルに対する全RNA(100ng)
を、オリゴdTおよび逆転写酵素を用いて逆転写し、そし
て得られた一本鎖cDNAを2G7プライマー(下のバンド)ま
たはアクチンプライマー(上のバンド)でPCR増幅した。2
G7プライマーおよびアクチンプライマーの両方は、同一
のPCR反応に含まれた。産物をl%アガロースTBEゲル上で
泳動した。(B)(A)に対応するノーザン分析。示される各
株由来の脂肪細胞(白色脂肪組織)RNAの10μgを泳動し、
そして上の図11BのPCR標識2G7プローブで検出した。2G7
mRNAのレベルにおける約20倍の増加がC57BL/6J ob/ob
(1J)株由来の白色脂肪において、痩身型同腹子に比較し
て明白であった。RT‐PCRおよびノーザン実験の両方に
おいて、SM/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2J(2J)マウス由来の2G7 R
NAの検出し得るシグナルは、2週間の暴露後でも存在し
なかった。24時間のオートラジオグラフ暴露が示され
る。同じフィルターをアクチンプローブに対してハイブ
リダイズした(パネル下部)。FIG. 12B. Ethidium bromide staining from RT-PCR reaction on adipocyte (white adipose tissue) RNA from each mouse strain described in FIG. 12 (A). Total RNA (100ng) for each sample
Was reverse transcribed using oligo dT and reverse transcriptase, and the resulting single-stranded cDNA was PCR amplified with 2G7 primer (lower band) or actin primer (upper band). Two
Both G7 and actin primers were included in the same PCR reaction. The products were run on a 1% agarose TBE gel. (B) Northern analysis corresponding to (A). Electrophores 10μg of adipocytes (white adipose tissue) RNA from each strain shown,
Then, detection was performed using the PCR-labeled 2G7 probe shown in FIG. 11B. 2G7
Approximately 20-fold increase in mRNA levels is due to C57BL / 6J ob / ob
The white fat from the (1J) strain was evident as compared to the lean littermates. In both RT-PCR and Northern experiments, 2G7 R from SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J (2J) mice
No detectable signal of NA was present after 2 weeks of exposure. A 24-hour autoradiographic exposure is indicated. The same filter was hybridized to the actin probe (bottom panel).

【図１３】図13は、さらなる2J動物およびコントロール
動物のノーザンブロット分析であり、ここで2J動物由来
のob mRNAがないことを確認している。ノーザン分析
は、図11および12の通りに実施した。この場合、コント
ロールRNAはap2(脂肪特異的転写物)であった。ap2のバ
ンドの密度の変化に有意性は認められない。FIG. 13 is a Northern blot analysis of additional 2J and control animals, confirming the absence of ob mRNA from 2J animals. Northern analysis was performed as in FIGS. In this case, the control RNA was ap2 (a fat-specific transcript). There is no significant change in the density of the ap2 band.

【図１４】図14は、変異株のcDNAにおける未成熟な終始
コドン(ナンセンス変異)の導入を引き起こす点突然変異
の領域において、C57BL/6J(正常)マウスとC57BL/6J ob/
ob(1J)マウスのDNA配列を比較している。ob/obマウス
は、105位のアルギニン残基を変化させるC→T変異を有
する。この塩基の変化は、自動DNAシークエンサーから
の出力として示される。5'および3'非翻訳領域由来のプ
ライマーを用いて両株(+/+およびob/ob)由来の自色脂肪
のRNAを用いるRT‐PCRを実施した。PCR反応産物をゲル
精製し、そしてコード配列の両鎖に沿ったプライマーを
用いて直接手動で、およびApplied Biosystems,Inc.373
A自動シークエンサーを用いて配列を決定した。FIG. 14 shows C57BL / 6J (normal) mice and C57BL / 6J ob / in the region of a point mutation that causes the introduction of an immature stop codon (nonsense mutation)
The DNA sequence of ob (1J) mouse is compared. ob / ob mice have a C → T mutation that changes the arginine residue at position 105. This base change is indicated as output from an automated DNA sequencer. RT-PCR using RNA from autologous fat from both strains (+ / + and ob / ob) was performed using primers from the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions. The PCR reaction product is gel purified and manually, directly with primers along both strands of the coding sequence, and in Applied Biosystems, Inc. 373.
A The sequence was determined using an automatic sequencer.

【図１５Ａ】図15(A)記載される各マウス株由来のゲノ
ムDNAのサザンブロット。約５μgのDNA(肝臓、腎臓、ま
たは脾臓から調製されるゲノムDNAに由来する)を示され
た制限酵素で制限消化した。DNAを、次に1%アガロースT
BEゲル内で電気泳動し、そしてPCR標識2G7プローブで検
出した。BglIIによる制限消化は、 SM/Ckc-＋^Dacob^2J/o
b^2J(2J) DNAにおいて約9kB(最大)のBglIIフラグメント
のサイズの増大があることを示した。RFLPは、他のいず
れの制限酵素でも検出されなかった。ゲノムDNAの予備
制限マッピングは、多型のBglII部位が転写開始部位の
約7kB上流にあることを示した。試験を行った他のいず
れの酵素でもmRNA開始部位を越えるものはない。(B) SM
/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2J株におけるBglII多型の分離。(A)
に示されたBglII多型を評価することによって、類似遺
伝子型のSM/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2J(2J)コロニーの同世代
由来の6匹の肥満型の子孫および5匹の痩身型の子孫の遺
伝子型を決定した。表現型上で肥満型の動物のすべて
が、多型BglIIフラグメントの大きい方の対立遺伝子に
対してホモ接合型であった。「コントロール」レーンのDN
Aを、 SM/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2Jコロニーとは別に飼育し
た血縁の無いSM/Ckc-＋^Dac＋/＋マウスから調製した。FIG. 15A is a Southern blot of genomic DNA from each mouse strain described in FIG. 15 (A). About 5 μg of DNA (derived from genomic DNA prepared from liver, kidney, or spleen) was restriction digested with the indicated restriction enzymes. DNA, then 1% agarose T
Electrophoresed in a BE gel and detected with a PCR-labeled 2G7 probe. For restriction digestion with BglII, SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / o
b ^2J (2J) DNA showed an increase in size of the BglII fragment of about 9 kB (maximum). RFLP was not detected with any of the other restriction enzymes. Preliminary restriction mapping of genomic DNA indicated that the polymorphic BglII site was approximately 7 kB upstream of the transcription start site. None of the other enzymes tested crossed the mRNA start site. (B) SM
Isolation of BglII polymorphism in / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J strain. (A)
6 obese offspring and 5 lean offspring from the same generation of SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J (2J) colonies of similar genotype by evaluating the BglII polymorphisms shown in Offspring were genotyped. All phenotypically obese animals were homozygous for the larger allele of the polymorphic BglII fragment. "Control" lane DN
A was prepared from unrelated SM / Ckc- + ^Dac + / + mice ^housed separately from SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J colonies.

【図１５Ｂ】図15(A)記載される各マウス株由来のゲノ
ムDNAのサザンブロット。約５μgのDNA(肝臓、腎臓、ま
たは脾臓から調製されるゲノムDNAに由来する)を示され
た制限酵素で制限消化した。DNAを、次に1%アガロースT
BEゲル内で電気泳動し、そしてPCR標識2G7プローブで検
出した。BglIIによる制限消化は、 SM/Ckc-＋^Dacob^2J/o
b^2J(2J) DNAにおいて約9kB(最大)のBglIIフラグメント
のサイズの増大があることを示した。RFLPは、他のいず
れの制限酵素でも検出されなかった。ゲノムDNAの予備
制限マッピングは、多型のBglII部位が転写開始部位の
約7kB上流にあることを示した。試験を行った他のいず
れの酵素でもmRNA開始部位を越えるものはない。(B) SM
/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2J株におけるBglII多型の分離。(A)
に示されたBglII多型を評価することによって、類似遺
伝子型のSM/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2J(2J)コロニーの同世代
由来の6匹の肥満型の子孫および5匹の痩身型の子孫の遺
伝子型を決定した。表現型上で肥満型の動物のすべて
が、多型BglIIフラグメントの大きい方の対立遺伝子に
対してホモ接合型であった。「コントロール」レーンのDN
Aを、 SM/Ckc-＋^Dacob^2J/ob^2Jコロニーとは別に飼育し
た血縁の無いSM/Ckc-＋^Dac＋/＋マウスから調製した。FIG. 15B is a Southern blot of genomic DNA from each mouse strain described in FIG. 15 (A). About 5 μg of DNA (derived from genomic DNA prepared from liver, kidney, or spleen) was restriction digested with the indicated restriction enzymes. DNA, then 1% agarose T
Electrophoresed in a BE gel and detected with a PCR-labeled 2G7 probe. For restriction digestion with BglII, SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / o
b ^2J (2J) DNA showed an increase in size of the BglII fragment of about 9 kB (maximum). RFLP was not detected with any of the other restriction enzymes. Preliminary restriction mapping of genomic DNA indicated that the polymorphic BglII site was approximately 7 kB upstream of the transcription start site. None of the other enzymes tested crossed the mRNA start site. (B) SM
Isolation of BglII polymorphism in / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J strain. (A)
6 obese offspring and 5 lean offspring from the same generation of SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J (2J) colonies of similar genotype by evaluating the BglII polymorphisms shown in Offspring were genotyped. All phenotypically obese animals were homozygous for the larger allele of the polymorphic BglII fragment. "Control" lane DN
A was prepared from unrelated SM / Ckc- + ^Dac + / + mice ^housed separately from SM / Ckc- + ^Dac ob ^2J / ob ^2J colonies.

【図１６】図16は、記載される種由来のEcoRI消化ゲノ
ムDNAのサザンブロットであり、プローブとしてOB cDNA
を用いている(即ち動物ブロット)。中程度にストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション後でも、すべての脊椎
動物サンプルにおいてハイブリダイゼーションシグナル
が検出された。本実験のネコDNAは僅かに分解してい
た。制限されたDNAを1%アガロースTBEゲル上で泳動し、
そしてプローブ分析用にimobi1on膜に移した。65℃でフ
ィルターをハイブリダイズし、そして2×SSC/0.2%SDS中
65℃で2回、20分間洗浄し、そしてKodak(Rochester,N.
Y.)X‐0MATフィルムを用いて3日間暴露した。FIG. 16 is a Southern blot of EcoRI digested genomic DNA from the described species, with OB cDNA as probe.
(Ie, animal blot). Hybridization signals were detected in all vertebrate samples, even after moderately stringent hybridization. The cat DNA in this experiment was slightly degraded. Run the restricted DNA on a 1% agarose TBE gel,
And transferred to imobi1on membrane for probe analysis. Hybridize filters at 65 ° C. and in 2 × SSC / 0.2% SDS
Wash twice at 65 ° C. for 20 minutes, and Kodak (Rochester, N.
Y.) Exposed for 3 days using X-0 MAT film.

【図１７】図17は、ベクターpET‐15b(Novagen)の発現
クローニング領域(配列番号11および12)を示す。FIG. 17 shows the expression cloning region of the vector pET-15b (Novagen) (SEQ ID NOs: 11 and 12).

【図１８Ａ】図18は、His‐tagに対する組換え成熟マウ
スob融合体(A)、およびHis‐tagに対する組換え成熟ヒ
トOB融合体(B)に関するHis‐結合樹脂(Ni)カラムからの
溶出物の分析を示す。細菌をベクターpETM9およびpETH1
4でそれぞれトランスフォームした。至適条件での１mM
IPTGによる誘導において、トランスフォームされた細菌
は、まず封入体(inclusion body)中に、100-300μg/ml
のOB融合タンパク質を生産し得た。インクルージョンボ
ディを６Mグアニジン‐HClまたは尿素で可溶化し、そし
て融合タンパク質(溶解物上清に存在する)を尿素を含む
10mlの1×結合緩衝液中のHis‐結合樹脂(Ni)カラムに添
加した。カラムを、５m1アリコートの20μM、60μM、お
よび300μMイミダゾールで段階的に溶出し、最後にスト
リップ(strip)緩衝液で溶出した。そのアリコートを、1
5%アクリルアミドゲル上でOBポリペプチド融合体の存在
について分析した。各レーンは、100μlの細菌抽出物の
同等物を含む。FIG. 18 shows elution from a His-binding resin (Ni) column for a recombinant mature mouse ob fusion to His-tag (A) and a recombinant mature human OB fusion to His-tag (B). 2 shows the analysis of the product. Bacteria are transformed into vectors pETM9 and pETH1
Transformed each in step 4. 1 mM under optimal conditions
In the induction with IPTG, the transformed bacteria are first included in an inclusion body (inclusion body) at 100-300 μg / ml.
OB fusion protein was produced. Inclusion bodies are solubilized with 6M guanidine-HCl or urea and the fusion protein (present in the lysate supernatant) contains urea
Loaded on a His-binding resin (Ni) column in 10 ml of 1 × binding buffer. The column was eluted stepwise with 5 ml aliquots of 20 μM, 60 μM, and 300 μM imidazole and finally with strip buffer. That aliquot, 1
The presence of the OB polypeptide fusion was analyzed on a 5% acrylamide gel. Each lane contains the equivalent of 100 μl of bacterial extract.

【図１８Ｂ】図18は、His‐tagに対する組換え成熟マウ
スob融合体(A)、およびHis‐tagに対する組換え成熟ヒ
トOB融合体(B)に関するHis‐結合樹脂(Ni)カラムからの
溶出物の分析を示す。細菌をベクターpETM9およびpETH1
4でそれぞれトランスフォームした。至適条件での１mM
IPTGによる誘導において、トランスフォームされた細菌
は、まず封入体(inclusion body)中に、100-300μg/ml
のOB融合タンパク質を生産し得た。インクルージョンボ
ディを６Mグアニジン‐HClまたは尿素で可溶化し、そし
て融合タンパク質(溶解物上清に存在する)を尿素を含む
10mlの1×結合緩衝液中のHis‐結合樹脂(Ni)カラムに添
加した。カラムを、５m1アリコートの20μM、60μM、お
よび300μMイミダゾールで段階的に溶出し、最後にスト
リップ(strip)緩衝液で溶出した。そのアリコートを、1
5%アクリルアミドゲル上でOBポリペプチド融合体の存在
について分析した。各レーンは、100μlの細菌抽出物の
同等物を含む。FIG. 18 shows elution from a His-binding resin (Ni) column for a recombinant mature mouse ob fusion to His-tag (A) and a recombinant mature human OB fusion to His-tag (B). 2 shows the analysis of the product. Bacteria are transformed into vectors pETM9 and pETH1
Transformed each in step 4. 1 mM under optimal conditions
In the induction with IPTG, the transformed bacteria are first included in an inclusion body (inclusion body) at 100-300 μg / ml.
OB fusion protein was produced. Inclusion bodies are solubilized with 6M guanidine-HCl or urea and the fusion protein (present in the lysate supernatant) contains urea
Loaded on a His-binding resin (Ni) column in 10 ml of 1 × binding buffer. The column was eluted stepwise with 5 ml aliquots of 20 μM, 60 μM, and 300 μM imidazole and finally with strip buffer. That aliquot, 1
The presence of the OB polypeptide fusion was analyzed on a 5% acrylamide gel. Each lane contains the equivalent of 100 μl of bacterial extract.

【図１９Ａ】図19(A)OB RNAのインビトロ翻訳。ヒトOB
cDNAをpGEMベクターにサブクローニングした。プラスミ
ドを線状化し、そしてSp6ポリメラーゼを用いて＋鎖RNA
を合成した。インビトロで合成されたRNAを、イヌ膵ミ
クロソーム膜の存在または非存在下で翻訳した。インビ
トロ翻訳後に、約18kDの一次翻訳産物が認められた。ミ
クロソーム膜を反応物に添加すると、一次翻訳産物より
約2kD小さい第2の翻訳産物が出現した。コードされたシ
グナル配列を欠くインターロイキン-1αRNAの翻訳産物
のサイズは、ミクロソーム膜の添加によっては変化しな
かった。これらのデータは、機能的シグナル配列の存在
を示す。(B)プロテイナーゼKの存在または非存在下での
インビトロ翻訳。プロテアーゼ処理により、18kD一次翻
訳産物の完全な蛋白質分解を得たが、16kDのプロセスを
受けた形態は影響を受けなかった。0.l%TRIT0N‐X100に
よるミクロソームの透過化は、プロセスを受けた形態を
プロテアーゼ感受性にした。これらの結果は、この産物
がミクロソームの内腔へ翻訳していたことを示す。FIG. 19 (A) In vitro translation of OB RNA. Human OB
The cDNA was subcloned into a pGEM vector. Plasmid is linearized and + strand RNA using Sp6 polymerase
Was synthesized. RNA synthesized in vitro was translated in the presence or absence of canine pancreatic microsomal membranes. After in vitro translation, a primary translation product of approximately 18 kD was observed. When a microsomal membrane was added to the reaction, a second translation product appeared that was approximately 2 kD smaller than the primary translation product. The size of the translation product of interleukin-1α RNA lacking the encoded signal sequence was not changed by the addition of microsomal membranes. These data indicate the presence of a functional signal sequence. (B) In vitro translation in the presence or absence of proteinase K. Protease treatment provided complete proteolysis of the 18 kD primary translation product, but did not affect the 16 kD processed form. Microsomal permeabilization with 0.1% TRIT0N-X100 made the processed form protease-sensitive. These results indicate that this product had translated into the microsome lumen.

【図１９Ｂ】図19(A)OB RNAのインビトロ翻訳。ヒトOB
cDNAをpGEMベクターにサブクローニングした。プラスミ
ドを線状化し、そしてSp6ポリメラーゼを用いて＋鎖RNA
を合成した。インビトロで合成されたRNAを、イヌ膵ミ
クロソーム膜の存在または非存在下で翻訳した。インビ
トロ翻訳後に、約18kDの一次翻訳産物が認められた。ミ
クロソーム膜を反応物に添加すると、一次翻訳産物より
約2kD小さい第2の翻訳産物が出現した。コードされたシ
グナル配列を欠くインターロイキン-1αRNAの翻訳産物
のサイズは、ミクロソーム膜の添加によっては変化しな
かった。これらのデータは、機能的シグナル配列の存在
を示す。(B)プロテイナーゼKの存在または非存在下での
インビトロ翻訳。プロテアーゼ処理により、18kD一次翻
訳産物の完全な蛋白質分解を得たが、16kDのプロセスを
受けた形態は影響を受けなかった。0.l%TRIT0N‐X100に
よるミクロソームの透過化は、プロセスを受けた形態を
プロテアーゼ感受性にした。これらの結果は、この産物
がミクロソームの内腔へ翻訳していたことを示す。FIG. 19 (A) In vitro translation of OB RNA. Human OB
The cDNA was subcloned into a pGEM vector. Plasmid is linearized and + strand RNA using Sp6 polymerase
Was synthesized. RNA synthesized in vitro was translated in the presence or absence of canine pancreatic microsomal membranes. After in vitro translation, a primary translation product of approximately 18 kD was observed. When a microsomal membrane was added to the reaction, a second translation product appeared that was approximately 2 kD smaller than the primary translation product. The size of the translation product of interleukin-1α RNA lacking the encoded signal sequence was not changed by the addition of microsomal membranes. These data indicate the presence of a functional signal sequence. (B) In vitro translation in the presence or absence of proteinase K. Protease treatment provided complete proteolysis of the 18 kD primary translation product, but did not affect the 16 kD processed form. Microsomal permeabilization with 0.1% TRIT0N-X100 made the processed form protease-sensitive. These results indicate that this product had translated into the microsome lumen.

【図２０Ａ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20 (A to E) Sequence of human OB gene (SEQ ID NO: 2)
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２０Ｂ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20 (A to E) Sequence of human OB gene (SEQ ID NO: 2)
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２０Ｃ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20 (A to E) Sequence of human OB gene (SEQ ID NO: 2)
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２０Ｄ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20D shows the sequence of the human OB gene (SEQ ID NO: 2).
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２０Ｅ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20E shows the sequence of the human OB gene (SEQ ID NO: 2).
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２０Ｆ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20 (A to E) Sequence of human OB gene (SEQ ID NO: 2)
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２０Ｇ】図20(A〜E)ヒトOB遺伝子の配列(配列番号2
2および24)。(F)マウスOB遺伝子の概略図。(G)ヒトOB遺
伝子の概略図。(F)および(G)両者においては、開始コド
ンおよび終始コドンに下線を付す。ヒト遺伝子におけ
る、マウスの第１イントロンに相同的な第１イントロン
の証拠は認められないが、その存在は否定できない。FIG. 20G shows the sequence of the human OB gene (SEQ ID NO: 2).
2 and 24). (F) Schematic representation of the mouse OB gene. (G) Schematic diagram of the human OB gene. In both (F) and (G), the start and stop codons are underlined. Although there is no evidence for a first intron homologous to the first intron of the mouse in human genes, its presence cannot be ruled out.

【図２１Ａ】図21は、Pichia酵母におけるOBの組換え発
現を達成するために用いたクローニングストラテジーの
一つの概略図を示す。(A)α-接合因子シグナル配列を有
するOBの発現ベクター。(B)組換え融合タンパク質構造
の概略図で、XhoI部位、ならびに推定KEX‐2およびSTE-
13切断部位を示したアミノ酸配列(配列番号26)、および
KEX‐2切断後に存在するN末端余剰アミノ酸(配列番号2
7)を含む。(C)成熟OBを生産するための別のストラテジ
ーは、成熟obポリペプチド配列のすぐ上流のXhoI切断部
位およびKEX-2切断部位に対応するアミノ酸配列(配列番
号28)を有する構築物を調製する工程を包含する。FIG. 21 shows one schematic of the cloning strategy used to achieve recombinant expression of OB in Pichia yeast. (A) An OB expression vector having an α-mating factor signal sequence. (B) Schematic representation of the recombinant fusion protein structure, with XhoI sites, and putative KEX-2 and STE-
13 amino acid sequence showing the cleavage site (SEQ ID NO: 26), and
N-terminal extra amino acid present after KEX-2 cleavage (SEQ ID NO: 2
Including 7). (C) Another strategy for producing a mature OB is to prepare a construct having an amino acid sequence corresponding to the XhoI and KEX-2 cleavage sites immediately upstream of the mature ob polypeptide sequence (SEQ ID NO: 28). Is included.

【図２１Ｂ】図21は、Pichia酵母におけるOBの組換え発
現を達成するために用いたクローニングストラテジーの
一つの概略図を示す。(A)α-接合因子シグナル配列を有
するOBの発現ベクター。(B)組換え融合タンパク質構造
の概略図で、XhoI部位、ならびに推定KEX‐2およびSTE-
13切断部位を示したアミノ酸配列(配列番号26)、および
KEX‐2切断後に存在するN末端余剰アミノ酸(配列番号2
7)を含む。(C)成熟OBを生産するための別のストラテジ
ーは、成熟obポリペプチド配列のすぐ上流のXhoI切断部
位およびKEX-2切断部位に対応するアミノ酸配列(配列番
号28)を有する構築物を調製する工程を包含する。FIG. 21 shows one schematic of the cloning strategy used to achieve recombinant expression of OB in Pichia yeast. (A) An OB expression vector having an α-mating factor signal sequence. (B) Schematic representation of the recombinant fusion protein structure, with XhoI sites, and putative KEX-2 and STE-
13 amino acid sequence showing the cleavage site (SEQ ID NO: 26), and
N-terminal extra amino acid present after KEX-2 cleavage (SEQ ID NO: 2
Including 7). (C) Another strategy for producing a mature OB is to prepare a construct having an amino acid sequence corresponding to the XhoI and KEX-2 cleavage sites immediately upstream of the mature ob polypeptide sequence (SEQ ID NO: 28). Is included.

【図２１Ｃ】図21は、Pichia酵母におけるOBの組換え発
現を達成するために用いたクローニングストラテジーの
一つの概略図を示す。(A)α-接合因子シグナル配列を有
するOBの発現ベクター。(B)組換え融合タンパク質構造
の概略図で、XhoI部位、ならびに推定KEX‐2およびSTE-
13切断部位を示したアミノ酸配列(配列番号26)、および
KEX‐2切断後に存在するN末端余剰アミノ酸(配列番号2
7)を含む。(C)成熟OBを生産するための別のストラテジ
ーは、成熟obポリペプチド配列のすぐ上流のXhoI切断部
位およびKEX-2切断部位に対応するアミノ酸配列(配列番
号28)を有する構築物を調製する工程を包含する。FIG. 21 shows one schematic of the cloning strategy used to achieve recombinant expression of OB in Pichia yeast. (A) An OB expression vector having an α-mating factor signal sequence. (B) Schematic representation of the recombinant fusion protein structure, with XhoI sites, and putative KEX-2 and STE-
13 amino acid sequence showing the cleavage site (SEQ ID NO: 26), and
N-terminal extra amino acid present after KEX-2 cleavage (SEQ ID NO: 2
Including 7). (C) Another strategy for producing a mature OB is to prepare a construct having an amino acid sequence corresponding to the XhoI and KEX-2 cleavage sites immediately upstream of the mature ob polypeptide sequence (SEQ ID NO: 28). Is included.

【図２２Ａ】図22 Pichiaにおける別の発現ストラテジ
ー。(A)α-接合因子シグナル配列制御下で、pET発現系
から採用されたHis‐tagを含有するOB融合体の発現ベク
ター(配列番号33)。(B)His‐tagを含有する組換えOB融
合タンパク質構造の概略図で、α‐接合因子シグナル配
列、推測KEX‐2およびSTE‐13切断部位、His‐tag、お
よびトロンビン切断部位を含み、3つの余剰N末端アミノ
酸残基を伴うOBを産出する。FIG. 22. Another expression strategy in Pichia. (A) An expression vector of an OB fusion containing a His-tag adopted from a pET expression system under the control of the α-mating factor signal sequence (SEQ ID NO: 33). (B) Schematic representation of the recombinant OB fusion protein structure containing the His-tag, including the α-mating factor signal sequence, putative KEX-2 and STE-13 cleavage sites, His-tag, and thrombin cleavage site, Yields an OB with two extra N-terminal amino acid residues.

【図２２Ｂ】図22 Pichiaにおける別の発現ストラテジ
ー。(A)α-接合因子シグナル配列制御下で、pET発現系
から採用されたHis‐tagを含有するOB融合体の発現ベク
ター(配列番号33)。(B)His‐tagを含有する組換えOB融
合タンパク質構造の概略図で、α‐接合因子シグナル配
列、推測KEX‐2およびSTE‐13切断部位、His‐tag、お
よびトロンビン切断部位を含み、3つの余剰N末端アミノ
酸残基を伴うOBを産出する。FIG. 22. Another expression strategy in Pichia. (A) An expression vector of an OB fusion containing a His-tag adopted from a pET expression system under the control of the α-mating factor signal sequence (SEQ ID NO: 33). (B) Schematic representation of the recombinant OB fusion protein structure containing the His-tag, including the α-mating factor signal sequence, putative KEX-2 and STE-13 cleavage sites, His-tag, and thrombin cleavage site, Yields an OB with two extra N-terminal amino acid residues.

【図２３Ａ】図23(A)トランスフォームされたpichia酵
母におけるマウスOB(両微小不均一性形態、即ち、Gln49
を含有する形態および含有しない形態)の発現のPAGE分
析。約16kDの予想バンドが、トランスフォームされた酵
母培養液において認められる(2番目および3番目のレー
ン)が、トランスフォームされていない酵母の培養液で
は認められない(1番目のレーン)。(B)カルボキシメチル
セルロース(弱い陽イオン交換体)上の部分精製組換えOB
ポリペプチドのPAGE分析。約16kDのバンドは、カラムか
ら250mM NaClで溶出された画分3および4においてよく認
められる。レーン１‐-添加されたサンプル;レーン2‐
‐素通り；レーン３〜５‐‐250mM NaClによる溶出画
分。FIG. 23 (A) shows mouse OB (both microheterogeneous forms, ie, Gln49) in transformed pichia yeast.
PAGE analysis of expression in the form with and without). The expected band of approximately 16 kD is seen in the transformed yeast culture (second and third lanes), but not in the untransformed yeast culture (first lane). (B) Partially purified recombinant OB on carboxymethyl cellulose (weak cation exchanger)
PAGE analysis of polypeptide. A band at about 16 kD is often seen in fractions 3 and 4 eluted from the column with 250 mM NaCl. Lane 1—Sample added; Lane 2—
-Flow through; lanes 3-5-fraction eluted with 250 mM NaCl.

【図２３Ｂ】図23(A)トランスフォームされたpichia酵
母におけるマウスOB(両微小不均一性形態、即ち、Gln49
を含有する形態および含有しない形態)の発現のPAGE分
析。約16kDの予想バンドが、トランスフォームされた酵
母培養液において認められる(2番目および3番目のレー
ン)が、トランスフォームされていない酵母の培養液で
は認められない(1番目のレーン)。(B)カルボキシメチル
セルロース(弱い陽イオン交換体)上の部分精製組換えOB
ポリペプチドのPAGE分析。約16kDのバンドは、カラムか
ら250mM NaClで溶出された画分3および4においてよく認
められる。レーン１‐-添加されたサンプル;レーン2‐
‐素通り；レーン３〜５‐‐250mM NaClによる溶出画
分。FIG. 23 (A) shows mouse OB (both microheterogeneous forms, ie, Gln49) in transformed pichia yeast.
PAGE analysis of expression in the form with and without). The expected band of approximately 16 kD is seen in the transformed yeast culture (second and third lanes), but not in the untransformed yeast culture (first lane). (B) Partially purified recombinant OB on carboxymethyl cellulose (weak cation exchanger)
PAGE analysis of polypeptide. A band at about 16 kD is often seen in fractions 3 and 4 eluted from the column with 250 mM NaCl. Lane 1—Sample added; Lane 2—
-Flow through; lanes 3-5-fraction eluted with 250 mM NaCl.

【図２４Ａ】図24は、OBタンパク質がマウス血漿中を循
環することを示す。(A)マウス血液からの免疫沈降。0.5
mlのマウス血漿を非結合型セファロースで予め澄明に
し、そしてセファロース4Bビーズに結合した免疫精製抗
OB抗体と一晩インキュベートした。免疫沈降物を15%SDS
‐PAGEゲル上で分離し、トランスファーし、そして抗OB
抗体でウエスタンブロットを行った。タンパク質は約16
kDの分子量で、酵母で発現された成熟マウスobタンパク
質と同じ位置まで泳動した。C57BL/6L ob/obマウス由来
の血漿にはこのタンパク質は認められず、そしてC57BLB
/Ks db/dbマウス由来の血漿では、野生型マウスに比較
して10倍増加した。dbマウスは、OBタンパク質を過剰生
産することが示唆されており、またそれに伴いその効果
に対する耐性も示唆されている。(B)脂肪過多ラットに
おけるOBレベルの増加。脂肪過多ラットは、ラット第5
染色体の劣性変異の結果、肥満型である。遺伝子データ
は、dbマウスにおいて変異した同遺伝子の欠損を示唆し
ている。脂肪過多ラットおよび痩身型の同腹子由来の血
漿を免疫沈降し、そしてウエスタンブロット上で泳動し
た。OBの循環レベルの20倍の増加が変異動物内に認めら
れた。(C)。マウス血漿におけるOBタンパク質の定量。
組換えマウスタンパク質の増加量をobマウス由来の100
λの血漿に添加し、免疫沈降を行った。ウエスタンブロ
ットのシグナルの強度を野生型マウス由来の100λの血
漿からのシグナル強度と比較した。組み換えタンパク質
量の増加に伴い、シグナル強度の直線的増加が認めら
れ、本免疫沈降が抗体過剰の条件下で実施されたことが
示された。同様のシグナルが野生型血漿サンプルおよび
2ngの組換えタンパク質を有するサンプルに認められ、
マウス血漿における循環レベルが約20ng/mlであること
が示された。(D)肥満組織抽出物におけるOBタンパク
質。マウス肥満組織の細胞質抽出物をdbおよび野生型マ
ウスから調製した。ウエスタンブロットは、dbマウスか
ら調製した抽出物において16kDのタンパク質のレベルの
増加を示した。FIG. 24 shows that OB protein circulates in mouse plasma. (A) Immunoprecipitation from mouse blood. 0.5
ml of mouse plasma was pre-cleared on unbound Sepharose and immunopurified antibody bound to Sepharose 4B beads.
Incubated overnight with OB antibody. Immunoprecipitate 15% SDS
-Separation on PAGE gel, transfer, and anti-OB
Western blots were performed with antibodies. About 16 proteins
At a molecular weight of kD, it migrated to the same position as the mature mouse ob protein expressed in yeast. This protein is not found in plasma from C57BL / 6L ob / ob mice, and C57BLB
Plasma from / Ks db / db mice increased 10-fold compared to wild-type mice. db mice have been suggested to overproduce the OB protein, and concomitantly tolerated its effects. (B) Increased OB levels in fat-rich rats. Fatty rats are the 5th rat
Obesity is the result of a recessive chromosomal mutation. Genetic data suggests a deletion of the mutated gene in db mice. Plasma from fat-rich rats and lean littermates was immunoprecipitated and run on Western blots. A 20-fold increase in circulating levels of OB was observed in the mutant animals. (C). Quantification of OB protein in mouse plasma.
Increase the amount of recombinant mouse protein to 100
λ was added to plasma and immunoprecipitation was performed. The signal intensity of the Western blot was compared with the signal intensity from 100λ plasma from wild-type mice. A linear increase in signal intensity was observed with an increase in the amount of recombinant protein, indicating that this immunoprecipitation was performed under conditions of antibody excess. Similar signals are seen in wild-type plasma samples and
Found in samples with 2 ng of recombinant protein,
Circulating levels in mouse plasma were shown to be about 20 ng / ml. (D) OB protein in obese tissue extract. Cytoplasmic extracts of mouse obese tissue were prepared from db and wild type mice. Western blot showed increased levels of 16 kD protein in extracts prepared from db mice.

【図２４Ｂ】図24は、OBタンパク質がマウス血漿中を循
環することを示す。(A)マウス血液からの免疫沈降。0.5
mlのマウス血漿を非結合型セファロースで予め澄明に
し、そしてセファロース4Bビーズに結合した免疫精製抗
OB抗体と一晩インキュベートした。免疫沈降物を15%SDS
‐PAGEゲル上で分離し、トランスファーし、そして抗OB
抗体でウエスタンブロットを行った。タンパク質は約16
kDの分子量で、酵母で発現された成熟マウスobタンパク
質と同じ位置まで泳動した。C57BL/6L ob/obマウス由来
の血漿にはこのタンパク質は認められず、そしてC57BLB
/Ks db/dbマウス由来の血漿では、野生型マウスに比較
して10倍増加した。dbマウスは、OBタンパク質を過剰生
産することが示唆されており、またそれに伴いその効果
に対する耐性も示唆されている。(B)脂肪過多ラットに
おけるOBレベルの増加。脂肪過多ラットは、ラット第5
染色体の劣性変異の結果、肥満型である。遺伝子データ
は、dbマウスにおいて変異した同遺伝子の欠損を示唆し
ている。脂肪過多ラットおよび痩身型の同腹子由来の血
漿を免疫沈降し、そしてウエスタンブロット上で泳動し
た。OBの循環レベルの20倍の増加が変異動物内に認めら
れた。(C)。マウス血漿におけるOBタンパク質の定量。
組換えマウスタンパク質の増加量をobマウス由来の100
λの血漿に添加し、免疫沈降を行った。ウエスタンブロ
ットのシグナルの強度を野生型マウス由来の100λの血
漿からのシグナル強度と比較した。組み換えタンパク質
量の増加に伴い、シグナル強度の直線的増加が認めら
れ、本免疫沈降が抗体過剰の条件下で実施されたことが
示された。同様のシグナルが野生型血漿サンプルおよび
2ngの組換えタンパク質を有するサンプルに認められ、
マウス血漿における循環レベルが約20ng/mlであること
が示された。(D)肥満組織抽出物におけるOBタンパク
質。マウス肥満組織の細胞質抽出物をdbおよび野生型マ
ウスから調製した。ウエスタンブロットは、dbマウスか
ら調製した抽出物において16kDのタンパク質のレベルの
増加を示した。FIG. 24 shows that OB protein circulates in mouse plasma. (A) Immunoprecipitation from mouse blood. 0.5
ml of mouse plasma was pre-cleared on unbound Sepharose and immunopurified antibody bound to Sepharose 4B beads.
Incubated overnight with OB antibody. Immunoprecipitate 15% SDS
-Separation on PAGE gel, transfer, and anti-OB
Western blots were performed with antibodies. About 16 proteins
At a molecular weight of kD, it migrated to the same position as the mature mouse ob protein expressed in yeast. This protein is not found in plasma from C57BL / 6L ob / ob mice, and C57BLB
Plasma from / Ks db / db mice increased 10-fold compared to wild-type mice. db mice have been suggested to overproduce the OB protein, and concomitantly tolerated its effects. (B) Increased OB levels in fat-rich rats. Fatty rats are the 5th rat
Obesity is the result of a recessive chromosomal mutation. Genetic data suggests a deletion of the mutated gene in db mice. Plasma from fat-rich rats and lean littermates was immunoprecipitated and run on Western blots. A 20-fold increase in circulating levels of OB was observed in the mutant animals. (C). Quantification of OB protein in mouse plasma.
Increase the amount of recombinant mouse protein to 100
λ was added to plasma and immunoprecipitation was performed. The signal intensity of the Western blot was compared with the signal intensity from 100λ plasma from wild-type mice. A linear increase in signal intensity was observed with an increase in the amount of recombinant protein, indicating that this immunoprecipitation was performed under conditions of antibody excess. Similar signals are seen in wild-type plasma samples and
Found in samples with 2 ng of recombinant protein,
Circulating levels in mouse plasma were shown to be about 20 ng / ml. (D) OB protein in obese tissue extract. Cytoplasmic extracts of mouse obese tissue were prepared from db and wild type mice. Western blot showed increased levels of 16 kD protein in extracts prepared from db mice.

【図２４Ｃ】図24は、OBタンパク質がマウス血漿中を循
環することを示す。(A)マウス血液からの免疫沈降。0.5
mlのマウス血漿を非結合型セファロースで予め澄明に
し、そしてセファロース4Bビーズに結合した免疫精製抗
OB抗体と一晩インキュベートした。免疫沈降物を15%SDS
‐PAGEゲル上で分離し、トランスファーし、そして抗OB
抗体でウエスタンブロットを行った。タンパク質は約16
kDの分子量で、酵母で発現された成熟マウスobタンパク
質と同じ位置まで泳動した。C57BL/6L ob/obマウス由来
の血漿にはこのタンパク質は認められず、そしてC57BLB
/Ks db/dbマウス由来の血漿では、野生型マウスに比較
して10倍増加した。dbマウスは、OBタンパク質を過剰生
産することが示唆されており、またそれに伴いその効果
に対する耐性も示唆されている。(B)脂肪過多ラットに
おけるOBレベルの増加。脂肪過多ラットは、ラット第5
染色体の劣性変異の結果、肥満型である。遺伝子データ
は、dbマウスにおいて変異した同遺伝子の欠損を示唆し
ている。脂肪過多ラットおよび痩身型の同腹子由来の血
漿を免疫沈降し、そしてウエスタンブロット上で泳動し
た。OBの循環レベルの20倍の増加が変異動物内に認めら
れた。(C)。マウス血漿におけるOBタンパク質の定量。
組換えマウスタンパク質の増加量をobマウス由来の100
λの血漿に添加し、免疫沈降を行った。ウエスタンブロ
ットのシグナルの強度を野生型マウス由来の100λの血
漿からのシグナル強度と比較した。組み換えタンパク質
量の増加に伴い、シグナル強度の直線的増加が認めら
れ、本免疫沈降が抗体過剰の条件下で実施されたことが
示された。同様のシグナルが野生型血漿サンプルおよび
2ngの組換えタンパク質を有するサンプルに認められ、
マウス血漿における循環レベルが約20ng/mlであること
が示された。(D)肥満組織抽出物におけるOBタンパク
質。マウス肥満組織の細胞質抽出物をdbおよび野生型マ
ウスから調製した。ウエスタンブロットは、dbマウスか
ら調製した抽出物において16kDのタンパク質のレベルの
増加を示した。FIG. 24 shows that OB protein circulates in mouse plasma. (A) Immunoprecipitation from mouse blood. 0.5
ml of mouse plasma was pre-cleared on unbound Sepharose and immunopurified antibody bound to Sepharose 4B beads.
Incubated overnight with OB antibody. Immunoprecipitate 15% SDS
-Separation on PAGE gel, transfer, and anti-OB
Western blots were performed with antibodies. About 16 proteins
At a molecular weight of kD, it migrated to the same position as the mature mouse ob protein expressed in yeast. This protein is not found in plasma from C57BL / 6L ob / ob mice, and C57BLB
Plasma from / Ks db / db mice increased 10-fold compared to wild-type mice. db mice have been suggested to overproduce the OB protein, and concomitantly tolerated its effects. (B) Increased OB levels in fat-rich rats. Fatty rats are the 5th rat
Obesity is the result of a recessive chromosomal mutation. Genetic data suggests a deletion of the mutated gene in db mice. Plasma from fat-rich rats and lean littermates was immunoprecipitated and run on Western blots. A 20-fold increase in circulating levels of OB was observed in the mutant animals. (C). Quantification of OB protein in mouse plasma.
Increase the amount of recombinant mouse protein to 100
λ was added to plasma and immunoprecipitation was performed. The signal intensity of the Western blot was compared with the signal intensity from 100λ plasma from wild-type mice. A linear increase in signal intensity was observed with an increase in the amount of recombinant protein, indicating that this immunoprecipitation was performed under conditions of antibody excess. Similar signals are seen in wild-type plasma samples and
Found in samples with 2 ng of recombinant protein,
Circulating levels in mouse plasma were shown to be about 20 ng / ml. (D) OB protein in obese tissue extract. Cytoplasmic extracts of mouse obese tissue were prepared from db and wild type mice. Western blot showed increased levels of 16 kD protein in extracts prepared from db mice.

【図２４Ｄ】図24は、OBタンパク質がマウス血漿中を循
環することを示す。(A)マウス血液からの免疫沈降。0.5
mlのマウス血漿を非結合型セファロースで予め澄明に
し、そしてセファロース4Bビーズに結合した免疫精製抗
OB抗体と一晩インキュベートした。免疫沈降物を15%SDS
‐PAGEゲル上で分離し、トランスファーし、そして抗OB
抗体でウエスタンブロットを行った。タンパク質は約16
kDの分子量で、酵母で発現された成熟マウスobタンパク
質と同じ位置まで泳動した。C57BL/6L ob/obマウス由来
の血漿にはこのタンパク質は認められず、そしてC57BLB
/Ks db/dbマウス由来の血漿では、野生型マウスに比較
して10倍増加した。dbマウスは、OBタンパク質を過剰生
産することが示唆されており、またそれに伴いその効果
に対する耐性も示唆されている。(B)脂肪過多ラットに
おけるOBレベルの増加。脂肪過多ラットは、ラット第5
染色体の劣性変異の結果、肥満型である。遺伝子データ
は、dbマウスにおいて変異した同遺伝子の欠損を示唆し
ている。脂肪過多ラットおよび痩身型の同腹子由来の血
漿を免疫沈降し、そしてウエスタンブロット上で泳動し
た。OBの循環レベルの20倍の増加が変異動物内に認めら
れた。(C)。マウス血漿におけるOBタンパク質の定量。
組換えマウスタンパク質の増加量をobマウス由来の100
λの血漿に添加し、免疫沈降を行った。ウエスタンブロ
ットのシグナルの強度を野生型マウス由来の100λの血
漿からのシグナル強度と比較した。組み換えタンパク質
量の増加に伴い、シグナル強度の直線的増加が認めら
れ、本免疫沈降が抗体過剰の条件下で実施されたことが
示された。同様のシグナルが野生型血漿サンプルおよび
2ngの組換えタンパク質を有するサンプルに認められ、
マウス血漿における循環レベルが約20ng/mlであること
が示された。(D)肥満組織抽出物におけるOBタンパク
質。マウス肥満組織の細胞質抽出物をdbおよび野生型マ
ウスから調製した。ウエスタンブロットは、dbマウスか
ら調製した抽出物において16kDのタンパク質のレベルの
増加を示した。FIG. 24 shows that OB protein circulates in mouse plasma. (A) Immunoprecipitation from mouse blood. 0.5
ml of mouse plasma was pre-cleared on unbound Sepharose and immunopurified antibody bound to Sepharose 4B beads.
Incubated overnight with OB antibody. Immunoprecipitate 15% SDS
-Separation on PAGE gel, transfer, and anti-OB
Western blots were performed with antibodies. About 16 proteins
At a molecular weight of kD, it migrated to the same position as the mature mouse ob protein expressed in yeast. This protein is not found in plasma from C57BL / 6L ob / ob mice, and C57BLB
Plasma from / Ks db / db mice increased 10-fold compared to wild-type mice. db mice have been suggested to overproduce the OB protein, and concomitantly tolerated its effects. (B) Increased OB levels in fat-rich rats. Fatty rats are the 5th rat
Obesity is the result of a recessive chromosomal mutation. Genetic data suggests a deletion of the mutated gene in db mice. Plasma from fat-rich rats and lean littermates was immunoprecipitated and run on Western blots. A 20-fold increase in circulating levels of OB was observed in the mutant animals. (C). Quantification of OB protein in mouse plasma.
Increase the amount of recombinant mouse protein to 100
λ was added to plasma and immunoprecipitation was performed. The signal intensity of the Western blot was compared with the signal intensity from 100λ plasma from wild-type mice. A linear increase in signal intensity was observed with an increase in the amount of recombinant protein, indicating that this immunoprecipitation was performed under conditions of antibody excess. Similar signals are seen in wild-type plasma samples and
Found in samples with 2 ng of recombinant protein,
Circulating levels in mouse plasma were shown to be about 20 ng / ml. (D) OB protein in obese tissue extract. Cytoplasmic extracts of mouse obese tissue were prepared from db and wild type mice. Western blot showed increased levels of 16 kD protein in extracts prepared from db mice.

【図２５Ａ】図25は、OBタンパク質が種々のレベルでヒ
ト血漿中を循環することを示す。(A)ヒト血漿のウエス
タンブロット。6名の痩身体型の志願者から血漿サンプ
ルを得た。免疫沈降およびウエスタンブロッティング
は、免疫反応性の16kDのタンパク質の存在を示し、この
タンパク質は酵母で発現された組換え型の146アミノ酸
ヒトタンパク質とサイズが同一であった。6つのサンプ
ルのそれぞれにおいて、一定しないレベルのタンパク質
が認められた。(B)ヒトobに対するELlSA(酵素結合イム
ノアッセイ)。マイクロタイタープレートを免疫精製抗
ヒトOB抗体でコートした。既知量の組換えタンパク質を
プレートに添加し、そして免疫精製ビオチン化抗ob抗体
を用いて検出した。414nmでの吸光度を既知濃度のOBに
対してプロットし、標準曲線を作成した。得られた標準
曲線は、このアッセイが1ng/mlまたはそれ以上のヒトOB
タンパク質を検出可能であることを示した。(C)ヒト血
漿におけるOBタンパク質の定量。ELlSAイムノアッセイ
を、6名の痩身型志願者由来の100スの血漿およびパネル
Bで使用した標準物を用いて実施した。HPlの２ng/ml〜H
P6の15ng/mlの範囲のOBタンパク質のレベルが認められ
た。これらのデータは、パネルAのウエスタンブロット
のデータと相関した。FIG. 25 shows that OB proteins circulate in human plasma at various levels. (A) Western blot of human plasma. Plasma samples were obtained from six lean volunteers. Immunoprecipitation and western blotting indicated the presence of an immunoreactive 16 kD protein, which was identical in size to the recombinant 146 amino acid human protein expressed in yeast. Variable levels of protein were observed in each of the six samples. (B) ELlSA (enzyme-linked immunoassay) for human ob. Microtiter plates were coated with immunopurified anti-human OB antibody. A known amount of the recombinant protein was added to the plate and detected using an immunopurified biotinylated anti-ob antibody. The absorbance at 414 nm was plotted against known concentrations of OB to create a standard curve. The resulting standard curve shows that the assay was performed for human OB at 1 ng / ml or higher.
It showed that the protein was detectable. (C) Quantification of OB protein in human plasma. ELlSA immunoassay was performed on 100 plasma and panels from 6 lean volunteers.
Performed using the standard used in B. HPl 2ng / ml ~ H
OB protein levels in the range of 15 ng / ml of P6 were observed. These data correlated with the data of the Western blot in Panel A.

【図２５Ｂ】図25は、OBタンパク質が種々のレベルでヒ
ト血漿中を循環することを示す。(A)ヒト血漿のウエス
タンブロット。6名の痩身体型の志願者から血漿サンプ
ルを得た。免疫沈降およびウエスタンブロッティング
は、免疫反応性の16kDのタンパク質の存在を示し、この
タンパク質は酵母で発現された組換え型の146アミノ酸
ヒトタンパク質とサイズが同一であった。6つのサンプ
ルのそれぞれにおいて、一定しないレベルのタンパク質
が認められた。(B)ヒトobに対するELlSA(酵素結合イム
ノアッセイ)。マイクロタイタープレートを免疫精製抗
ヒトOB抗体でコートした。既知量の組換えタンパク質を
プレートに添加し、そして免疫精製ビオチン化抗ob抗体
を用いて検出した。414nmでの吸光度を既知濃度のOBに
対してプロットし、標準曲線を作成した。得られた標準
曲線は、このアッセイが1ng/mlまたはそれ以上のヒトOB
タンパク質を検出可能であることを示した。(C)ヒト血
漿におけるOBタンパク質の定量。ELlSAイムノアッセイ
を、6名の痩身型志願者由来の100スの血漿およびパネル
Bで使用した標準物を用いて実施した。HPlの２ng/ml〜H
P6の15ng/mlの範囲のOBタンパク質のレベルが認められ
た。これらのデータは、パネルAのウエスタンブロット
のデータと相関した。FIG. 25 shows that OB proteins circulate in human plasma at various levels. (A) Western blot of human plasma. Plasma samples were obtained from six lean volunteers. Immunoprecipitation and western blotting indicated the presence of an immunoreactive 16 kD protein, which was identical in size to the recombinant 146 amino acid human protein expressed in yeast. Variable levels of protein were observed in each of the six samples. (B) ELlSA (enzyme-linked immunoassay) for human ob. Microtiter plates were coated with immunopurified anti-human OB antibody. A known amount of the recombinant protein was added to the plate and detected using an immunopurified biotinylated anti-ob antibody. The absorbance at 414 nm was plotted against known concentrations of OB to create a standard curve. The resulting standard curve shows that the assay was performed for human OB at 1 ng / ml or higher.
It showed that the protein was detectable. (C) Quantification of OB protein in human plasma. ELlSA immunoassay was performed on 100 plasma and panels from 6 lean volunteers.
Performed using the standard used in B. HPl 2ng / ml ~ H
OB protein levels in the range of 15 ng / ml of P6 were observed. These data correlated with the data of the Western blot in Panel A.

【図２５Ｃ】図25は、OBタンパク質が種々のレベルでヒ
ト血漿中を循環することを示す。(A)ヒト血漿のウエス
タンブロット。6名の痩身体型の志願者から血漿サンプ
ルを得た。免疫沈降およびウエスタンブロッティング
は、免疫反応性の16kDのタンパク質の存在を示し、この
タンパク質は酵母で発現された組換え型の146アミノ酸
ヒトタンパク質とサイズが同一であった。6つのサンプ
ルのそれぞれにおいて、一定しないレベルのタンパク質
が認められた。(B)ヒトobに対するELlSA(酵素結合イム
ノアッセイ)。マイクロタイタープレートを免疫精製抗
ヒトOB抗体でコートした。既知量の組換えタンパク質を
プレートに添加し、そして免疫精製ビオチン化抗ob抗体
を用いて検出した。414nmでの吸光度を既知濃度のOBに
対してプロットし、標準曲線を作成した。得られた標準
曲線は、このアッセイが1ng/mlまたはそれ以上のヒトOB
タンパク質を検出可能であることを示した。(C)ヒト血
漿におけるOBタンパク質の定量。ELlSAイムノアッセイ
を、6名の痩身型志願者由来の100スの血漿およびパネル
Bで使用した標準物を用いて実施した。HPlの２ng/ml〜H
P6の15ng/mlの範囲のOBタンパク質のレベルが認められ
た。これらのデータは、パネルAのウエスタンブロット
のデータと相関した。FIG. 25 shows that OB proteins circulate in human plasma at various levels. (A) Western blot of human plasma. Plasma samples were obtained from six lean volunteers. Immunoprecipitation and western blotting indicated the presence of an immunoreactive 16 kD protein, which was identical in size to the recombinant 146 amino acid human protein expressed in yeast. Variable levels of protein were observed in each of the six samples. (B) ELlSA (enzyme-linked immunoassay) for human ob. Microtiter plates were coated with immunopurified anti-human OB antibody. A known amount of the recombinant protein was added to the plate and detected using an immunopurified biotinylated anti-ob antibody. The absorbance at 414 nm was plotted against known concentrations of OB to create a standard curve. The resulting standard curve shows that the assay was performed for human OB at 1 ng / ml or higher.
It showed that the protein was detectable. (C) Quantification of OB protein in human plasma. ELlSA immunoassay was performed on 100 plasma and panels from 6 lean volunteers.
Performed using the standard used in B. HPl 2ng / ml ~ H
OB protein levels in the range of 15 ng / ml of P6 were observed. These data correlated with the data of the Western blot in Panel A.

【図２６Ａ】図26は、OBタンパク質が分子間または分子
内のジスルフィド結合を形成することを示す。(A)還元
および非還元条件下でのウエスタンブロット。マウスお
よびヒト血漿のウエスタンブロットを、還元剤をサンプ
ル緩衝液に添加するかまたはせずに繰り返した。β-メ
ルカプトエタノールをサンプル緩衝液から除いた場合
は、db血漿由来の免疫沈降物が見かけの分子量16kDおよ
び32kDで泳動する。緩衝液にβ-メルカプトエタノール
を添加すると、32kDの部分が消失する(図24を参照のこ
と)。この結果は酵母(Pichia pastoris)でマウスタンパ
ク質を発現する場合にも再現される。この場合、マウス
OBタンパク質はダイマーの位置まで泳動する。還元状態
では、精製された組換えマウスタンパク質は、見かけの
分子量16kDで泳動することから、32kDの分子形態は１つ
または２つの分子間ジスルフィド結合の結果であること
が示される。インビボおよびPichia pastorisで発現さ
れたヒトタンパク質は、還元および非還元状態で、分子
量16kDで泳動する(データ示さず)。(B)酵母内で発現さ
れたヒトタンパク質は、分子内ジスルフィド結合を有す
る。分泌されたタンパク質は、一般にPichia pastoris
発現系で発現された場合でも正確なコンフォーメーショ
ンをとる。146アミノ酸成熟ヒトタンパク質をPichia pa
storisで発現させ、そしてIMACおよびゲル濾過を含む２
工程の精製プロトコールによって酵母培地から精製し
た。臭化シアン分解の前後に、精製組換えタンパク質を
質量分析に供した。臭化シアンはメチオニン残基のカル
ボキシ端で切断する。組換え酵母タンパク質の分子質量
は、16,024±3Da(算出された分子質量＝16,024Da)であ
った。臭化シアンは、タンパク質配列中のアミノ酸75、
89、および157の3つのメチオニンの後ろを切断する。測
定された質量8435.6Daを有する臭化シアンフラグメント
は、cys-117とcys-167との間のジスルフィド結合で結合
したアミノ酸90〜157およびアミノ酸158〜167に対応す
る(算出された分子質量=8434.5Da)。N.D.＝検出され
ず。FIG. 26 shows that OB proteins form intermolecular or intramolecular disulfide bonds. (A) Western blot under reducing and non-reducing conditions. Western blots of mouse and human plasma were repeated with or without reducing agent added to the sample buffer. When β-mercaptoethanol is omitted from the sample buffer, immunoprecipitates from db plasma migrate with apparent molecular weights of 16 kD and 32 kD. When β-mercaptoethanol is added to the buffer, the 32 kD portion disappears (see FIG. 24). This result is also reproduced when expressing mouse proteins in yeast (Pichia pastoris). In this case, the mouse
The OB protein migrates to the position of the dimer. In the reduced state, the purified recombinant mouse protein migrates with an apparent molecular weight of 16 kD, indicating that the 32 kD molecular form is the result of one or two intermolecular disulfide bonds. Human proteins expressed in vivo and in Pichia pastoris migrate in a reduced and non-reduced state with a molecular weight of 16 kD (data not shown). (B) Human proteins expressed in yeast have intramolecular disulfide bonds. Secreted proteins are generally Pichia pastoris
Accurate conformation is achieved even when expressed in an expression system. Pichia pa 146 amino acid mature human protein
storis expressed and includes IMAC and gel filtration
Purified from yeast medium by the purification protocol of the step. The purified recombinant protein was subjected to mass spectrometry before and after cyanogen bromide degradation. Cyanogen bromide cleaves at the carboxy end of a methionine residue. The molecular mass of the recombinant yeast protein was 16,024 ± 3 Da (calculated molecular mass = 16,024 Da). Cyanogen bromide is amino acid 75 in the protein sequence,
Cleave after the three methionines at 89 and 157. The cyanogen bromide fragment with a measured mass of 8435.6 Da corresponds to amino acids 90-157 and amino acids 158-167 linked by a disulfide bond between cys-117 and cys-167 (calculated molecular mass = 8434.5 Da). ND = not detected.

【図２６Ｂ】図26は、OBタンパク質が分子間または分子
内のジスルフィド結合を形成することを示す。(A)還元
および非還元条件下でのウエスタンブロット。マウスお
よびヒト血漿のウエスタンブロットを、還元剤をサンプ
ル緩衝液に添加するかまたはせずに繰り返した。β-メ
ルカプトエタノールをサンプル緩衝液から除いた場合
は、db血漿由来の免疫沈降物が見かけの分子量16kDおよ
び32kDで泳動する。緩衝液にβ-メルカプトエタノール
を添加すると、32kDの部分が消失する(図24を参照のこ
と)。この結果は酵母(Pichia pastoris)でマウスタンパ
ク質を発現する場合にも再現される。この場合、マウス
OBタンパク質はダイマーの位置まで泳動する。還元状態
では、精製された組換えマウスタンパク質は、見かけの
分子量16kDで泳動することから、32kDの分子形態は１つ
または２つの分子間ジスルフィド結合の結果であること
が示される。インビボおよびPichia pastorisで発現さ
れたヒトタンパク質は、還元および非還元状態で、分子
量16kDで泳動する(データ示さず)。(B)酵母内で発現さ
れたヒトタンパク質は、分子内ジスルフィド結合を有す
る。分泌されたタンパク質は、一般にPichia pastoris
発現系で発現された場合でも正確なコンフォーメーショ
ンをとる。146アミノ酸成熟ヒトタンパク質をPichia pa
storisで発現させ、そしてIMACおよびゲル濾過を含む２
工程の精製プロトコールによって酵母培地から精製し
た。臭化シアン分解の前後に、精製組換えタンパク質を
質量分析に供した。臭化シアンはメチオニン残基のカル
ボキシ端で切断する。組換え酵母タンパク質の分子質量
は、16,024±3Da(算出された分子質量＝16,024Da)であ
った。臭化シアンは、タンパク質配列中のアミノ酸75、
89、および157の3つのメチオニンの後ろを切断する。測
定された質量8435.6Daを有する臭化シアンフラグメント
は、cys-117とcys-167との間のジスルフィド結合で結合
したアミノ酸90〜157およびアミノ酸158〜167に対応す
る(算出された分子質量=8434.5Da)。N.D.＝検出され
ず。FIG. 26 shows that OB proteins form intermolecular or intramolecular disulfide bonds. (A) Western blot under reducing and non-reducing conditions. Western blots of mouse and human plasma were repeated with or without reducing agent added to the sample buffer. When β-mercaptoethanol is omitted from the sample buffer, immunoprecipitates from db plasma migrate with apparent molecular weights of 16 kD and 32 kD. When β-mercaptoethanol is added to the buffer, the 32 kD portion disappears (see FIG. 24). This result is also reproduced when expressing mouse proteins in yeast (Pichia pastoris). In this case, the mouse
The OB protein migrates to the position of the dimer. In the reduced state, the purified recombinant mouse protein migrates with an apparent molecular weight of 16 kD, indicating that the 32 kD molecular form is the result of one or two intermolecular disulfide bonds. Human proteins expressed in vivo and in Pichia pastoris migrate in a reduced and non-reduced state with a molecular weight of 16 kD (data not shown). (B) Human proteins expressed in yeast have intramolecular disulfide bonds. Secreted proteins are generally Pichia pastoris
Accurate conformation is achieved even when expressed in an expression system. Pichia pa 146 amino acid mature human protein
storis expressed and includes IMAC and gel filtration
Purified from yeast medium by the purification protocol of the step. The purified recombinant protein was subjected to mass spectrometry before and after cyanogen bromide degradation. Cyanogen bromide cleaves at the carboxy end of a methionine residue. The molecular mass of the recombinant yeast protein was 16,024 ± 3 Da (calculated molecular mass = 16,024 Da). Cyanogen bromide is amino acid 75 in the protein sequence,
Cleave after the three methionines at 89 and 157. The cyanogen bromide fragment with a measured mass of 8435.6 Da corresponds to amino acids 90-157 and amino acids 158-167 linked by a disulfide bond between cys-117 and cys-167 (calculated molecular mass = 8434.5 Da). ND = not detected.

【図２７】図27は、生物活性な組換えタンパク質の調製
を示す。145アミノ酸成熟マウスOBタンパク質に対応す
るヌクレオチド配列を、pET15b発現ベクターにクローン
化した。このpETベクターは、固定化金属アフィニティ
ークロマトグラフィー(IMAC)を用いた効率的な精製を可
能にする、ポリヒスチジン領域(His‐tag)をクローン化
配列の上流に挿入している。細菌溶解後、この組換え細
菌タンパク質は、はじめ不溶性の膜画分に分配された。
塩酸グアニジンを用いて膜画分を可溶化し、そしてIMAC
カラム上に添加した。示されたように、イミダゾールの
濃度を上昇して段階的にタンパク質を溶出した。記載の
通り、溶出したタンパク質を再フォールディング(refol
d)し、そしてトロンビンで処理してHis-tagを除去し
た。可溶性タンパク質の最終収量は、45ng/ml細菌培養
物であった。FIG. 27 shows the preparation of a biologically active recombinant protein. The nucleotide sequence corresponding to the 145 amino acid mature mouse OB protein was cloned into the pET15b expression vector. This pET vector has a polyhistidine region (His-tag) inserted upstream of the cloned sequence, which allows for efficient purification using immobilized metal affinity chromatography (IMAC). After bacterial lysis, the recombinant bacterial protein was initially partitioned into an insoluble membrane fraction.
The membrane fraction is solubilized using guanidine hydrochloride and IMAC
Loaded on column. As indicated, the protein was eluted stepwise with increasing concentrations of imidazole. Refold the eluted protein as described (refol
d) and treated with thrombin to remove the His-tag. The final yield of soluble protein was 45 ng / ml bacterial culture.

【図２８Ａ】図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示
す。食物摂取(パネルA〜C)および体重(パネルD〜F)の時
間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタ
ンパク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒
丸)、または未処置(黒三角)のいずれかを受けた。処置
グループは、C57Bl/6J ob/obマウス(パネルAおよびD)、
C57Bl/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+
/+マウス(パネルCおよびF)を含んだ。示した通り、マウ
スの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間の間隔で
記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マ
ウス対obおよびdbマウスで異なる。)タンパク質を受け
たobマウスの食物摂取は、最初の注入後に滅少し、そし
て4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められ
たレベルの約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これ
らの動物の体重は平均l.3グラム/日減少し、そして3週
間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.
0001)。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示され
なかった。早期の2つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定
値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有
意性を表1に示す。FIG. 28 shows the biological effects of OB proteins. Time course of food intake (panels AC) and body weight (panels DF). Groups of 10 animals received either daily intraperitoneal injections of OB protein (solid squares), daily injections of PBS (solid circles), or untreated (solid triangles) at a dose of 5 mg / kg / day. Treatment groups were C57B1 / 6J ob / ob mice (panels A and D),
C57Bl / Ks db / db mouse (panels B and E), and CBA / J +
/ + Mice (panels C and F) were included. As indicated, the food intake of the mice was measured daily and recorded at 3-4 day intervals. (The weight scale on the gram label is different for wild-type vs. ob and db mice.) Food intake of ob mice receiving the protein diminishes after the first injection and on day 4 sham It stabilized at about 40% of the level observed in the injected group (p <.001). These animals lost an average of 1.3 grams / day in weight and stabilized after 3 weeks at a level of about 60% of the starting weight (p <.
0001). db mice showed no effect of this protein. A small but significant effect on body weight was observed in CBA / J mice at the two early time points (p <.02). The standard error of the measured values is indicated by a bar, and the statistical significance of the results is shown in Table 1.

【図２８Ｂ】図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示
す。食物摂取(パネルA〜C)および体重(パネルD〜F)の時
間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタ
ンパク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒
丸)、または未処置(黒三角)のいずれかを受けた。処置
グループは、C57Bl/6J ob/obマウス(パネルAおよびD)、
C57Bl/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+
/+マウス(パネルCおよびF)を含んだ。示した通り、マウ
スの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間の間隔で
記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マ
ウス対obおよびdbマウスで異なる。)タンパク質を受け
たobマウスの食物摂取は、最初の注入後に滅少し、そし
て4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められ
たレベルの約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これ
らの動物の体重は平均l.3グラム/日減少し、そして3週
間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.
0001)。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示され
なかった。早期の2つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定
値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有
意性を表1に示す。FIG. 28 shows the biological effects of OB proteins. Time course of food intake (panels AC) and body weight (panels DF). Groups of 10 animals received either daily intraperitoneal injections of OB protein (solid squares), daily injections of PBS (solid circles), or untreated (solid triangles) at a dose of 5 mg / kg / day. Treatment groups were C57B1 / 6J ob / ob mice (panels A and D),
C57Bl / Ks db / db mouse (panels B and E), and CBA / J +
/ + Mice (panels C and F) were included. As indicated, the food intake of the mice was measured daily and recorded at 3-4 day intervals. (The weight scale on the gram label is different for wild-type vs. ob and db mice.) Food intake of ob mice receiving the protein diminishes after the first injection and on day 4 sham It stabilized at about 40% of the level observed in the injected group (p <.001). These animals lost an average of 1.3 grams / day in weight and stabilized after 3 weeks at a level of about 60% of the starting weight (p <.
0001). db mice showed no effect of this protein. A small but significant effect on body weight was observed in CBA / J mice at the two early time points (p <.02). The standard error of the measured values is indicated by a bar, and the statistical significance of the results is shown in Table 1.

【図２８Ｃ】図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示
す。食物摂取(パネルA〜C)および体重(パネルD〜F)の時
間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタ
ンパク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒
丸)、または未処置(黒三角)のいずれかを受けた。処置
グループは、C57Bl/6J ob/obマウス(パネルAおよびD)、
C57Bl/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+
/+マウス(パネルCおよびF)を含んだ。示した通り、マウ
スの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間の間隔で
記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マ
ウス対obおよびdbマウスで異なる。)タンパク質を受け
たobマウスの食物摂取は、最初の注入後に滅少し、そし
て4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められ
たレベルの約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これ
らの動物の体重は平均l.3グラム/日減少し、そして3週
間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.
0001)。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示され
なかった。早期の2つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定
値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有
意性を表1に示す。FIG. 28 shows the biological effects of OB proteins. Time course of food intake (panels AC) and body weight (panels DF). Groups of 10 animals received either daily intraperitoneal injections of OB protein (solid squares), daily injections of PBS (solid circles), or untreated (solid triangles) at a dose of 5 mg / kg / day. Treatment groups were C57B1 / 6J ob / ob mice (panels A and D),
C57Bl / Ks db / db mouse (panels B and E), and CBA / J +
/ + Mice (panels C and F) were included. As indicated, the food intake of the mice was measured daily and recorded at 3-4 day intervals. (The weight scale on the gram label is different for wild-type vs. ob and db mice.) Food intake of ob mice receiving the protein diminishes after the first injection and on day 4 sham It stabilized at about 40% of the level observed in the injected group (p <.001). These animals lost an average of 1.3 grams / day in weight and stabilized after 3 weeks at a level of about 60% of the starting weight (p <.
0001). db mice showed no effect of this protein. A small but significant effect on body weight was observed in CBA / J mice at the two early time points (p <.02). The standard error of the measured values is indicated by a bar, and the statistical significance of the results is shown in Table 1.

【図２８Ｄ】図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示
す。食物摂取(パネルA〜C)および体重(パネルD〜F)の時
間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタ
ンパク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒
丸)、または未処置(黒三角)のいずれかを受けた。処置
グループは、C57Bl/6J ob/obマウス(パネルAおよびD)、
C57Bl/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+
/+マウス(パネルCおよびF)を含んだ。示した通り、マウ
スの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間の間隔で
記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マ
ウス対obおよびdbマウスで異なる。)タンパク質を受け
たobマウスの食物摂取は、最初の注入後に滅少し、そし
て4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められ
たレベルの約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これ
らの動物の体重は平均l.3グラム/日減少し、そして3週
間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.
0001)。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示され
なかった。早期の2つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定
値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有
意性を表1に示す。FIG. 28 shows the biological effects of OB proteins. Time course of food intake (panels AC) and body weight (panels DF). Groups of 10 animals received either daily intraperitoneal injections of OB protein (solid squares), daily injections of PBS (solid circles), or untreated (solid triangles) at a dose of 5 mg / kg / day. Treatment groups were C57B1 / 6J ob / ob mice (panels A and D),
C57Bl / Ks db / db mouse (panels B and E), and CBA / J +
/ + Mice (panels C and F) were included. As indicated, the food intake of the mice was measured daily and recorded at 3-4 day intervals. (The weight scale on the gram label is different for wild-type vs. ob and db mice.) Food intake of ob mice receiving the protein diminishes after the first injection and on day 4 sham It stabilized at about 40% of the level observed in the injected group (p <.001). These animals lost an average of 1.3 grams / day in weight and stabilized after 3 weeks at a level of about 60% of the starting weight (p <.
0001). db mice showed no effect of this protein. A small but significant effect on body weight was observed in CBA / J mice at the two early time points (p <.02). The standard error of the measured values is indicated by a bar, and the statistical significance of the results is shown in Table 1.

【図２８Ｅ】図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示
す。食物摂取(パネルA〜C)および体重(パネルD〜F)の時
間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタ
ンパク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒
丸)、または未処置(黒三角)のいずれかを受けた。処置
グループは、C57Bl/6J ob/obマウス(パネルAおよびD)、
C57Bl/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+
/+マウス(パネルCおよびF)を含んだ。示した通り、マウ
スの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間の間隔で
記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マ
ウス対obおよびdbマウスで異なる。)タンパク質を受け
たobマウスの食物摂取は、最初の注入後に滅少し、そし
て4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められ
たレベルの約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これ
らの動物の体重は平均l.3グラム/日減少し、そして3週
間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.
0001)。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示され
なかった。早期の2つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定
値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有
意性を表1に示す。FIG. 28 shows the biological effects of OB proteins. Time course of food intake (panels AC) and body weight (panels DF). Groups of 10 animals received either daily intraperitoneal injections of OB protein (solid squares), daily injections of PBS (solid circles), or untreated (solid triangles) at a dose of 5 mg / kg / day. Treatment groups were C57B1 / 6J ob / ob mice (panels A and D),
C57Bl / Ks db / db mouse (panels B and E), and CBA / J +
/ + Mice (panels C and F) were included. As indicated, the food intake of the mice was measured daily and recorded at 3-4 day intervals. (The weight scale on the gram label is different for wild-type vs. ob and db mice.) Food intake of ob mice receiving the protein diminishes after the first injection and on day 4 sham It stabilized at about 40% of the level observed in the injected group (p <.001). These animals lost an average of 1.3 grams / day in weight and stabilized after 3 weeks at a level of about 60% of the starting weight (p <.
0001). db mice showed no effect of this protein. A small but significant effect on body weight was observed in CBA / J mice at the two early time points (p <.02). The standard error of the measured values is indicated by a bar, and the statistical significance of the results is shown in Table 1.

【図２８Ｆ】図28は、OBタンパク質の生物学的効果を示
す。食物摂取(パネルA〜C)および体重(パネルD〜F)の時
間的経過。10匹の動物の群が、５mg/kg/日用量でのOBタ
ンパク質の連日腹腔内注入(黒四角)、PBSの連日注入(黒
丸)、または未処置(黒三角)のいずれかを受けた。処置
グループは、C57Bl/6J ob/obマウス(パネルAおよびD)、
C57Bl/Ks db/dbマウス(パネルBおよびE)、およびCBA/J+
/+マウス(パネルCおよびF)を含んだ。示した通り、マウ
スの食物摂取を、連日測定し、そして3〜4日間の間隔で
記録した。(グラム標示の体重のスケールは、野生型マ
ウス対obおよびdbマウスで異なる。)タンパク質を受け
たobマウスの食物摂取は、最初の注入後に滅少し、そし
て4日目には、疑似(sham)注入したグループで認められ
たレベルの約40%のレベルで安定化した(p＜.001)。これ
らの動物の体重は平均l.3グラム/日減少し、そして3週
間後、開始時の体重の約60%のレベルで安定化した(p＜.
0001)。dbマウスでは、このタンパク質の効果は示され
なかった。早期の2つの時点でCBA/Jマウスに、体重に対
して少ないが有意な効果が観察された(p＜.02)。画測定
値の標準誤差をバーで示し、そしてこの結果の統計的有
意性を表1に示す。FIG. 28 shows the biological effects of OB proteins. Time course of food intake (panels AC) and body weight (panels DF). Groups of 10 animals received either daily intraperitoneal injections of OB protein (solid squares), daily injections of PBS (solid circles), or untreated (solid triangles) at a dose of 5 mg / kg / day. Treatment groups were C57B1 / 6J ob / ob mice (panels A and D),
C57Bl / Ks db / db mouse (panels B and E), and CBA / J +
/ + Mice (panels C and F) were included. As indicated, the food intake of the mice was measured daily and recorded at 3-4 day intervals. (The weight scale on the gram label is different for wild-type vs. ob and db mice.) Food intake of ob mice receiving the protein diminishes after the first injection and on day 4 sham It stabilized at about 40% of the level observed in the injected group (p <.001). These animals lost an average of 1.3 grams / day in weight and stabilized after 3 weeks at a level of about 60% of the starting weight (p <.
0001). db mice showed no effect of this protein. A small but significant effect on body weight was observed in CBA / J mice at the two early time points (p <.02). The standard error of the measured values is indicated by a bar, and the statistical significance of the results is shown in Table 1.

【図２９Ａ】図29は、obマウスのペアフィーディングの
結果を示す。(A)4匹のC57Bl/6J ob/obマウスの群に、組
換えタンパク質を受けたobマウスの群が消費した量に等
しい量の食物を与えた。両グループに対する重量の消失
を、５、８、および12日後に算出した。食物制限された
マウス(斜線バー)は、タンパク質を受けたobマウス(黒
色バー)よりも少ない重量を消失した(p＜.02)。この結
果は、OBタンパク質の体重滅少効果が、食物摂取および
エネルギー消費両者に対する効果の結果であることを示
す。(B)処置されたobマウスの写真。2匹のC57Bl/6J ob/
obマウスを示す。左側のマウスはPBSを受け、体重65グ
ラム(開始時の重量)であった。右側のマウスは、組換え
OBタンパク質の連日注入を受けた。この動物の開始時の
重量も65グラムで、そしてタンパク質処理の3週間後の
重量は38グラムであった。(C)処理および未処理obマウ
ス由来の肝臓。処理および未処理のC57B1/6J ob/obマウ
ス由来の肝臓を示す。PBSを受けたマウス由来の肝臓
は、脂肪過多肝臓の肉眼的外観を有し、そして重量は5.
04グラムであった。組換えobタンパク質を受けたマウス
は、正常な外観を有し、そして重量は2.23グラムであっ
た。FIG. 29 shows the results of pair feeding of ob mice. (A) Groups of four C57B1 / 6J ob / ob mice were fed food equivalent to the amount consumed by the group of ob mice that received the recombinant protein. Weight loss for both groups was calculated after 5, 8, and 12 days. Food-restricted mice (shaded bars) lost less weight (p <.02) than ob mice that received protein (black bars). This result indicates that the weight loss effect of OB protein is the result of an effect on both food intake and energy expenditure. (B) Photograph of the treated ob mouse. 2 C57Bl / 6J ob /
The ob mouse is shown. The mouse on the left received PBS and weighed 65 grams (starting weight). The mouse on the right is recombinant
Received daily injections of OB protein. The starting weight of the animal was also 65 grams, and the weight three weeks after protein treatment was 38 grams. (C) Liver from treated and untreated ob mice. 2 shows livers from treated and untreated C57B1 / 6J ob / ob mice. Livers from mice receiving PBS have the macroscopic appearance of fatty liver and weigh 5.
It was 04 grams. Mice receiving the recombinant ob protein had a normal appearance and weighed 2.23 grams.

【図２９Ｂ】図29は、obマウスのペアフィーディングの
結果を示す。(A)4匹のC57Bl/6J ob/obマウスの群に、組
換えタンパク質を受けたobマウスの群が消費した量に等
しい量の食物を与えた。両グループに対する重量の消失
を、５、８、および12日後に算出した。食物制限された
マウス(斜線バー)は、タンパク質を受けたobマウス(黒
色バー)よりも少ない重量を消失した(p＜.02)。この結
果は、OBタンパク質の体重滅少効果が、食物摂取および
エネルギー消費両者に対する効果の結果であることを示
す。(B)処置されたobマウスの写真。2匹のC57Bl/6J ob/
obマウスを示す。左側のマウスはPBSを受け、体重65グ
ラム(開始時の重量)であった。右側のマウスは、組換え
OBタンパク質の連日注入を受けた。この動物の開始時の
重量も65グラムで、そしてタンパク質処理の3週間後の
重量は38グラムであった。(C)処理および未処理obマウ
ス由来の肝臓。処理および未処理のC57B1/6J ob/obマウ
ス由来の肝臓を示す。PBSを受けたマウス由来の肝臓
は、脂肪過多肝臓の肉眼的外観を有し、そして重量は5.
04グラムであった。組換えobタンパク質を受けたマウス
は、正常な外観を有し、そして重量は2.23グラムであっ
た。FIG. 29 shows the results of pair feeding of ob mice. (A) Groups of four C57B1 / 6J ob / ob mice were fed food equivalent to the amount consumed by the group of ob mice that received the recombinant protein. Weight loss for both groups was calculated after 5, 8, and 12 days. Food-restricted mice (shaded bars) lost less weight (p <.02) than ob mice that received protein (black bars). This result indicates that the weight loss effect of OB protein is the result of an effect on both food intake and energy expenditure. (B) Photograph of the treated ob mouse. 2 C57Bl / 6J ob /
The ob mouse is shown. The mouse on the left received PBS and weighed 65 grams (starting weight). The mouse on the right is recombinant
Received daily injections of OB protein. The starting weight of the animal was also 65 grams, and the weight three weeks after protein treatment was 38 grams. (C) Liver from treated and untreated ob mice. 2 shows livers from treated and untreated C57B1 / 6J ob / ob mice. Livers from mice receiving PBS have the macroscopic appearance of fatty liver and weigh 5.
It was 04 grams. Mice receiving the recombinant ob protein had a normal appearance and weighed 2.23 grams.

【図２９Ｃ】図29は、obマウスのペアフィーディングの
結果を示す。(A)4匹のC57Bl/6J ob/obマウスの群に、組
換えタンパク質を受けたobマウスの群が消費した量に等
しい量の食物を与えた。両グループに対する重量の消失
を、５、８、および12日後に算出した。食物制限された
マウス(斜線バー)は、タンパク質を受けたobマウス(黒
色バー)よりも少ない重量を消失した(p＜.02)。この結
果は、OBタンパク質の体重滅少効果が、食物摂取および
エネルギー消費両者に対する効果の結果であることを示
す。(B)処置されたobマウスの写真。2匹のC57Bl/6J ob/
obマウスを示す。左側のマウスはPBSを受け、体重65グ
ラム(開始時の重量)であった。右側のマウスは、組換え
OBタンパク質の連日注入を受けた。この動物の開始時の
重量も65グラムで、そしてタンパク質処理の3週間後の
重量は38グラムであった。(C)処理および未処理obマウ
ス由来の肝臓。処理および未処理のC57B1/6J ob/obマウ
ス由来の肝臓を示す。PBSを受けたマウス由来の肝臓
は、脂肪過多肝臓の肉眼的外観を有し、そして重量は5.
04グラムであった。組換えobタンパク質を受けたマウス
は、正常な外観を有し、そして重量は2.23グラムであっ
た。FIG. 29 shows the results of pair feeding of ob mice. (A) Groups of four C57B1 / 6J ob / ob mice were fed food equivalent to the amount consumed by the group of ob mice that received the recombinant protein. Weight loss for both groups was calculated after 5, 8, and 12 days. Food-restricted mice (shaded bars) lost less weight (p <.02) than ob mice that received protein (black bars). This result indicates that the weight loss effect of OB protein is the result of an effect on both food intake and energy expenditure. (B) Photograph of the treated ob mouse. 2 C57Bl / 6J ob /
The ob mouse is shown. The mouse on the left received PBS and weighed 65 grams (starting weight). The mouse on the right is recombinant
Received daily injections of OB protein. The starting weight of the animal was also 65 grams, and the weight three weeks after protein treatment was 38 grams. (C) Liver from treated and untreated ob mice. 2 shows livers from treated and untreated C57B1 / 6J ob / ob mice. Livers from mice receiving PBS have the macroscopic appearance of fatty liver and weigh 5.
It was 04 grams. Mice receiving the recombinant ob protein had a normal appearance and weighed 2.23 grams.

【図３０】図30は、脂肪組織に対するobのインサイチュ
ハイブリダイゼーションを示す。センスおよびアンチセ
ンスOB RNAを、Sp6およびT7ポリメラーゼおよびジゴキ
シゲニン(digoxigenin)を用いて、インビトロで標識し
た。標識したRNAを、８週齢のC57Bl/Ksマウス(野生型と
標示)およびC57Bl/Ks db/dbマウス(dbと標示)の副睾丸
の脂肪パッド由来の脂肪組織のパラフィン埋包切片にハ
イブリダイズした。この図では、脂質小滴が細胞内の非
染色空砲として認められる。細胞質は細胞周縁部の薄い
縁であり、そして細胞膜と区別できない。アンチセンス
プローブを用いた場合のみ、この範囲におけるすべての
脂肪細胞に対するハイブリダイゼーションが、野生型切
片において検出され、そしてdb/db動物由来の組織切片
において、かなり増加したレベルが認められた。FIG. 30 shows in situ hybridization of ob to adipose tissue. Sense and antisense OB RNA were labeled in vitro with Sp6 and T7 polymerase and digoxigenin. Labeled RNA was hybridized to paraffin-embedded sections of adipose tissue from epididymal fat pads of 8-week-old C57Bl / Ks mice (labeled wild type) and C57Bl / Ks db / db mice (labeled db). did. In this figure, lipid droplets are seen as unstained air bubbles in the cells. The cytoplasm is the thin border of the cell periphery and is indistinguishable from the cell membrane. Only with the antisense probe, hybridization to all adipocytes in this range was detected in wild-type sections and significantly increased levels were observed in tissue sections from db / db animals.

【図３１】図31は、OB RNAが、インビボおよびインビト
ロで発現されることを示す。いくつかの異なる供給源由
来の全RNA(10マイクログラム)を電気泳動してブロット
し、obプローブに対してハイブリダイズした。まず、コ
ラゲナーゼ消化後、細胞浮力の差を利用して脂肪細胞を
精製した。OB RNAは脂肪細胞画分にのみ存在した。レー
ンSは、間質血管画分を示し、そしてレーンAは脂肪細胞
画分を示す。さらに、未分化の3T3-442前脂質細胞ではO
B RNAは発現されなかった(レーンU)。これらの細胞系統
由来の分化脂質細胞は、明らかに検出可能なレベルのOB
mRNAを発現した(レーンD)。FIG. 31 shows that OB RNA is expressed in vivo and in vitro. Total RNA (10 micrograms) from several different sources was electrophoretically blotted and hybridized to the ob probe. First, after collagenase digestion, fat cells were purified using the difference in cell buoyancy. OB RNA was only present in the adipocyte fraction. Lane S shows the stromal vascular fraction and lane A shows the adipocyte fraction. In addition, undifferentiated 3T3-442 prolipid cells
B RNA was not expressed (lane U). Differentiated lipid cells from these cell lines have clearly detectable levels of OB
mRNA was expressed (lane D).

【図３２Ａ】図32は、すべての脂肪組織貯蔵所(depot)
においてOB RNAが発現されたことを示す。試験したすべ
ての脂肪組織貯蔵所がob RNAを発現した。鼠蹊脂肪パッ
ドは、若干低いRNAを発現したが、種々の実験において
シグナルレベルの多様性が認められた(図31A)。レーン
(１)副睾丸脂肪パッド、(２)鼠蹊脂肪パッド、(３)腹部
脂肪パッド、(４)傍子宮脂肪パッド。褐色脂肪も低レベ
ルのOB RNAを発現した(図31B)。褐色脂肪中のOB発現レ
ベルは、４℃で１週間飼育された動物では変化しなかっ
たが、褐色特異的UCP RNAの量(低温誘導性で知られる)
は５倍に増加した。FIG. 32 shows all adipose tissue depots.
Indicates that the OB RNA was expressed in. All adipose tissue repositories tested expressed ob RNA. The inguinal fat pad expressed slightly lower RNA, but signal level diversity was observed in various experiments (FIG. 31A). lane
(1) epididymal fat pad, (2) inguinal fat pad, (3) abdominal fat pad, (4) parauterine fat pad. Brown fat also expressed low levels of OB RNA (FIG. 31B). OB expression levels in brown fat did not change in animals housed at 4 ° C. for 1 week, but the amount of brown-specific UCP RNA (known as cold-induced)
Increased by a factor of five.

【図３２Ｂ】図32は、すべての脂肪組織貯蔵所(depot)
においてOB RNAが発現されたことを示す。試験したすべ
ての脂肪組織貯蔵所がob RNAを発現した。鼠蹊脂肪パッ
ドは、若干低いRNAを発現したが、種々の実験において
シグナルレベルの多様性が認められた(図31A)。レーン
(１)副睾丸脂肪パッド、(２)鼠蹊脂肪パッド、(３)腹部
脂肪パッド、(４)傍子宮脂肪パッド。褐色脂肪も低レベ
ルのOB RNAを発現した(図31B)。褐色脂肪中のOB発現レ
ベルは、４℃で１週間飼育された動物では変化しなかっ
たが、褐色特異的UCP RNAの量(低温誘導性で知られる)
は５倍に増加した。FIG. 32 shows all adipose tissue depots.
Indicates that the OB RNA was expressed in. All adipose tissue repositories tested expressed ob RNA. The inguinal fat pad expressed slightly lower RNA, but signal level diversity was observed in various experiments (FIG. 31A). lane
(1) epididymal fat pad, (2) inguinal fat pad, (3) abdominal fat pad, (4) parauterine fat pad. Brown fat also expressed low levels of OB RNA (FIG. 31B). OB expression levels in brown fat did not change in animals housed at 4 ° C. for 1 week, but the amount of brown-specific UCP RNA (known as cold-induced)
Increased by a factor of five.

【図３３】図33は、db/dbおよび金チオグルコース処理
マウスにおけるOB RNAの発現を示す。金チオグルコース
(GTG)およびdb/db処理マウスの傍子宮脂肪パッド由来の
全RNAを電気泳動およびノーザンブロットした。単回用
量として投与されたGTGは、特異的な視床下部の損傷を
誘導することによって、肥満症を引き起こすことが知ら
れている。(A)１月齢CBA雌性マウスをGTG(.2mg/g)で処
理したところ、コントロール動物(＜５gの増加)に比較
して、処理動物では＞20gの増加が得られた。(B)db/db
およびGTG処理マウス由来のRNAに対するOBプローブのハ
イブリダイゼーションは、コントロールRNA(アクチンま
たはGAPDH)に比較して20倍増加量のob RNAを示した。FIG. 33 shows OB RNA expression in db / db and gold thioglucose treated mice. Gold thioglucose
Total RNA from (GTG) and parauterine fat pads of db / db treated mice were electrophoresed and Northern blotted. GTG administered as a single dose is known to cause obesity by inducing specific hypothalamic damage. (A) Treatment of 1 month old CBA female mice with GTG (.2 mg / g) resulted in> 20 g increase in treated animals compared to control animals (<5 g increase). (B) db / db
Hybridization of the OB probe to RNA from GTG- and GTG-treated mice showed a 20-fold increase in ob RNA compared to control RNA (actin or GAPDH).

【図３４Ａ】図34は、ヒトRNAのノーザンブロット分析
を示す。ヒト脂肪組織(FAT、パネルA)由来の全RNAl0mg
およびヒト以外の組織(パネルB)由来のポリA+RNA２mgを
含むノーザンブロットを、示されたヒトobプローブまた
はヒトβ-アクチンプローブにハイブリダイズした。脂
肪組織全RNAについて、約4.5kbでの強度のシグナルが認
められた。ポリA+RNAに対するハイブリダイゼーション
は、心臓(HE)および胎盤(PL)において検出可能なシグナ
ルを示したが、脳(BL)、肺(LU)、肝臓(LI)、骨格筋(S
M)、腎臓(KI)、および膵臓(PA)ではOB RNAは検出されな
かった。各場合における、オートラジオグラフィー暴露
の長さを示す。注:胎盤RNAに認められる低分子の方のバ
ンドの起源(例えば、オルタネートスプライシング(alte
rnate splicing)、RNA分解)については知られていな
い。FIG. 34 shows Northern blot analysis of human RNA. 0mg of total RNA from human adipose tissue (FAT, panel A)
And Northern blots containing 2 mg of poly A + RNA from non-human tissue (Panel B) were hybridized to the indicated human ob probe or human β-actin probe. For adipose tissue total RNA, a signal with an intensity of about 4.5 kb was observed. Hybridization to poly A + RNA showed detectable signals in heart (HE) and placenta (PL), but not in brain (BL), lung (LU), liver (LI), skeletal muscle (S
OB RNA was not detected in (M), kidney (KI), and pancreas (PA). In each case, the length of the autoradiographic exposure is shown. Note: The origin of the smaller band found in placental RNA (e.g., alternative splicing (alte
rnate splicing) and RNA degradation) are not known.

【図３４Ｂ】図34は、ヒトRNAのノーザンブロット分析
を示す。ヒト脂肪組織(FAT、パネルA)由来の全RNAl0mg
およびヒト以外の組織(パネルB)由来のポリA+RNA２mgを
含むノーザンブロットを、示されたヒトobプローブまた
はヒトβ-アクチンプローブにハイブリダイズした。脂
肪組織全RNAについて、約4.5kbでの強度のシグナルが認
められた。ポリA+RNAに対するハイブリダイゼーション
は、心臓(HE)および胎盤(PL)において検出可能なシグナ
ルを示したが、脳(BL)、肺(LU)、肝臓(LI)、骨格筋(S
M)、腎臓(KI)、および膵臓(PA)ではOB RNAは検出されな
かった。各場合における、オートラジオグラフィー暴露
の長さを示す。注:胎盤RNAに認められる低分子の方のバ
ンドの起源(例えば、オルタネートスプライシング(alte
rnate splicing)、RNA分解)については知られていな
い。FIG. 34 shows Northern blot analysis of human RNA. 0mg of total RNA from human adipose tissue (FAT, panel A)
And Northern blots containing 2 mg of poly A + RNA from non-human tissue (Panel B) were hybridized to the indicated human ob probe or human β-actin probe. For adipose tissue total RNA, a signal with an intensity of about 4.5 kb was observed. Hybridization to poly A + RNA showed detectable signals in heart (HE) and placenta (PL), but not in brain (BL), lung (LU), liver (LI), skeletal muscle (S
OB RNA was not detected in (M), kidney (KI), and pancreas (PA). In each case, the length of the autoradiographic exposure is shown. Note: The origin of the smaller band found in placental RNA (e.g., alternative splicing (alte
rnate splicing) and RNA degradation) are not known.

【図３５Ａ】図35は、ヒトOB遣伝子および8個のマイク
ロサテライトマーカーを含むYACコンティグを示す。ヒ
トOB遺伝子を含む第7染色体領域のYACに基づくSTS含有
地図を示し、これは、SEGMAP/バージョン3.29[Green
ら、PCR Methods Applic.,1:77-90(1991)]から推定し
た。19個の独特な順に配列したSTS(表3を参照のこと)を
上部に示す。8個のマイクロサテライト特異的STSを星印
で示す(表4を参照のこと)。Pax4およびOB遺伝子、なら
びにコンティグに対して相対的なセントロメア(CEN)お
よびテロメア(TEL)の予想された位置も示す。各43のYAC
クローンを、水平の線で示し、左側に名称を付し、そし
て括弧内に推定YACのサイズ(kbで、パルスフィールドゲ
ル電気泳動により測定された)を示す。各YACにおけるST
Sの存在を適切な位置に黒丸で示す。STSがYACの挿入末
端に対応する場合は、対応する円の周囲(上部(STSの名
称付近)およびSTSが誘導されるYACの末端の両方)に四角
を置いた。下部(水平破線の下)の５つのYACについて
は、(確立されたSTSの順番に基づいて)存在が予想され
る1つまたはそれ以上のSTSは検出されず(対応するSTS‐
特異的PCRアッセイで少なくとも2回、個々のYACを試験
することによって評価した)、そしてこれらを適切な位
置で白丸で示す。ほとんどのYACをヒト-ハムスターハイ
ブリッド細胞由来ライブラリー[Greenら、Genomics, 2
5:170-183(1995)]から単離し、示された通り元の名称を
付した。残りのYACを全ヒトゲノムライブラリーから単
離し、そして元のライブラリーの位置を表3に示す。7q3
1.3に対してFISH分析によってマップすることが見出さ
れた3つのYAC(yWSS691、yWSS999、およびyWSS2935)の名
称の周囲に枠を置く。コンティグは「未計算の」形態で表
し、YACのサイズを用いてはクローンの重複またはSTSス
ペーシングを概算せず、従ってすべてのSTSを等間隔で
配置した。「計算された」形態では、YACのサイズを用い
て隣接するSTSの各対を隔てる相対的距離およびクロー
ンの重複の範囲が概算され、総YACコンティグは全長が2
Mbを若干超えるようである。FIG. 35 shows a YAC contig containing the human OB gene and eight microsatellite markers. Shown is a YAC-based STS-containing map of the chromosome 7 region containing the human OB gene, which is shown in SEGMAP / version 3.29 [Green
PCR Methods Applic., 1: 77-90 (1991)]. The 19 uniquely ordered STSs (see Table 3) are shown at the top. Eight microsatellite-specific STSs are indicated by an asterisk (see Table 4). The Pax4 and OB genes, as well as the expected centromere (CEN) and telomere (TEL) positions relative to the contig are also shown. 43 YACs each
Clones are indicated by a horizontal line, labeled on the left and the size of the putative YAC (in kb, measured by pulsed field gel electrophoresis) in parentheses. ST at each YAC
The presence of S is indicated by a solid circle at the appropriate location. If the STS corresponds to the insertion end of the YAC, a square was placed around the corresponding circle (both at the top (near the name of the STS) and at the end of the YAC from which the STS was derived). For the five YACs below (below the horizontal dashed line), one or more STSs that are expected to be present (based on the established STS order) are not detected (the corresponding STS-
(Evaluated by testing individual YACs at least twice in a specific PCR assay), and these are indicated by open circles at appropriate locations. Most YACs were converted from human-hamster hybrid cell-derived libraries [Green et al., Genomics, 2
5: 170-183 (1995)] and given the original name as indicated. The remaining YACs were isolated from the whole human genomic library and the location of the original library is shown in Table 3. 7q3
Box around the names of the three YACs (yWSS691, yWSS999, and yWSS2935) found to map by FISH analysis to 1.3. Contigs were represented in "uncalculated" form, and the size of the YAC was not used to estimate clone duplication or STS spacing, and therefore all STS were evenly spaced. In the “calculated” form, the size of the YACs was used to estimate the relative distance separating each pair of adjacent STSs and the extent of clone overlap, and the total YAC contig had a total length of 2
It seems to be slightly above Mb.

【図３５Ｂ】図35は、ヒトOB遣伝子および8個のマイク
ロサテライトマーカーを含むYACコンティグを示す。ヒ
トOB遺伝子を含む第7染色体領域のYACに基づくSTS含有
地図を示し、これは、SEGMAP/バージョン3.29[Green
ら、PCR Methods Applic.,1:77-90(1991)]から推定し
た。19個の独特な順に配列したSTS(表3を参照のこと)を
上部に示す。8個のマイクロサテライト特異的STSを星印
で示す(表4を参照のこと)。Pax4およびOB遺伝子、なら
びにコンティグに対して相対的なセントロメア(CEN)お
よびテロメア(TEL)の予想された位置も示す。各43のYAC
クローンを、水平の線で示し、左側に名称を付し、そし
て括弧内に推定YACのサイズ(kbで、パルスフィールドゲ
ル電気泳動により測定された)を示す。各YACにおけるST
Sの存在を適切な位置に黒丸で示す。STSがYACの挿入末
端に対応する場合は、対応する円の周囲(上部(STSの名
称付近)およびSTSが誘導されるYACの末端の両方)に四角
を置いた。下部(水平破線の下)の５つのYACについて
は、(確立されたSTSの順番に基づいて)存在が予想され
る1つまたはそれ以上のSTSは検出されず(対応するSTS‐
特異的PCRアッセイで少なくとも2回、個々のYACを試験
することによって評価した)、そしてこれらを適切な位
置で白丸で示す。ほとんどのYACをヒト-ハムスターハイ
ブリッド細胞由来ライブラリー[Greenら、Genomics, 2
5:170-183(1995)]から単離し、示された通り元の名称を
付した。残りのYACを全ヒトゲノムライブラリーから単
離し、そして元のライブラリーの位置を表3に示す。7q3
1.3に対してFISH分析によってマップすることが見出さ
れた3つのYAC(yWSS691、yWSS999、およびyWSS2935)の名
称の周囲に枠を置く。コンティグは「未計算の」形態で表
し、YACのサイズを用いてはクローンの重複またはSTSス
ペーシングを概算せず、従ってすべてのSTSを等間隔で
配置した。「計算された」形態では、YACのサイズを用い
て隣接するSTSの各対を隔てる相対的距離およびクロー
ンの重複の範囲が概算され、総YACコンティグは全長が2
Mbを若干超えるようである。FIG. 35 shows a YAC contig containing the human OB gene and eight microsatellite markers. Shown is a YAC-based STS-containing map of the chromosome 7 region containing the human OB gene, which is shown in SEGMAP / version 3.29 [Green
PCR Methods Applic., 1: 77-90 (1991)]. The 19 uniquely ordered STSs (see Table 3) are shown at the top. Eight microsatellite-specific STSs are indicated by an asterisk (see Table 4). The Pax4 and OB genes, as well as the expected centromere (CEN) and telomere (TEL) positions relative to the contig are also shown. 43 YACs each
Clones are indicated by a horizontal line, labeled on the left and the size of the putative YAC (in kb, measured by pulsed field gel electrophoresis) in parentheses. ST at each YAC
The presence of S is indicated by a solid circle at the appropriate location. If the STS corresponds to the insertion end of the YAC, a square was placed around the corresponding circle (both at the top (near the name of the STS) and at the end of the YAC from which the STS was derived). For the five YACs below (below the horizontal dashed line), one or more STSs that are expected to be present (based on the established STS order) are not detected (the corresponding STS-
(Evaluated by testing individual YACs at least twice in a specific PCR assay), and these are indicated by open circles at appropriate locations. Most YACs were converted from human-hamster hybrid cell-derived libraries [Green et al., Genomics, 2
5: 170-183 (1995)] and given the original name as indicated. The remaining YACs were isolated from the whole human genomic library and the location of the original library is shown in Table 3. 7q3
Box around the names of the three YACs (yWSS691, yWSS999, and yWSS2935) found to map by FISH analysis to 1.3. Contigs were represented in "uncalculated" form, and the size of the YAC was not used to estimate clone duplication or STS spacing, and therefore all STS were evenly spaced. In the “calculated” form, the size of the YACs was used to estimate the relative distance separating each pair of adjacent STSs and the extent of clone overlap, and the total YAC contig had a total length of 2
It seems to be slightly above Mb.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/04 3/10 3/06 9/12 3/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 9/12 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/19 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｎ 1/19 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:465） 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 イイン ザン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10010, ニューヨーク， ウォーターサイド プ レイス 30， アパートメント 27エフ (72)発明者 リカード プロエンカ アメリカ合衆国 ニューヨーク 11102, アストリア， 30ティーエイチ ストリ ート 26−62 (72)発明者 マルガリータ マフェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク， イースト 63アールデ ィ ストリート 504， アパートメント 36エス (72)発明者 ジェフリー エル． ハラース アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク， イースト 70ティーエ イチ ストリート 420， アパートメン ト ９ジェイ (72)発明者 ケタン カジワラ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク， イースト 63アールデ ィ ストリート 500， アパートメント 11エフ (72)発明者 スティーブン ケイ． バーリー アメリカ合衆国 ニューヨーク 10021, ニューヨーク， イースト 63アールデ ィ ストリート 500， アパートメント 20エイ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) 47 9/12 16/18 C07K 14/47 C12N 1/19 16/18 1/21 C12N 1/19 C12P 21/02 C 1/21 21/08 5/10 C12Q 1/68 A C12P 21/02 (C12N 1/19 21/08 C12R 1:72) C12Q 1/68 (C12N 1/19 // (C12N 1/19 C12R 1:85) C12R 1:72) (C12N 1/19 (C12N 1/19 C12R 1: 19) C12R 1:85) (C12N 1/19 (C12N 1/19 C12R 1:07) C12R 1:19) (C12N 1/21 (C12N 1/19 C12R 1: 465) C12R 1:07) (C12N 1 / 21 (C12N 1/21 C12R 1:38) C12R 1: 465) 1:91) (C12N 1/2 1 (C12P 21/02 C C12R 1:38) C12R 1:19) (C12N 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:91) A61K 37/02 (C12P 21/02 C12N 5/00 B C12R 1:19 ) C C12R 1:91) (72) Inventor Yin Zan United States of America New York 10010, New York, Waterside Place 30, Apartment 27F (72) Inventor Ricard Proenca United States of America New York 11102, Astoria, 30T Street 26- 62 (72) Inventor Margarita Mafei New York 10021, New York, East 63 Ard Street 504, Apartment 36S (72) Inventor Jeffrey El. Harrah's United States New York 10021, New York, East 70 T.I. Street 420, Apartment 9 Jay (72) Inventor Ketan Kajiwara USA New York 10021, New York, East 63 Ard Street 500, Apartment 11F (72) Inventor Stephen Kay. Barrie United States New York 10021, New York, East 63 Ard Street 500, Apartment 20 E

Claims (76)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 動物において体重を調整し得る、約１４
５〜約１６７アミノ酸を有する肥満症（ＯＢ）ポリペプ
チド、あるいはフラグメントを包含する、同じ生物学的
活性を有するそれらの対立遺伝子変異体またはアナロ
グ。1. The method according to claim 1, wherein the weight can be adjusted in the animal.
Allelic variants or analogs thereof having the same biological activity, including obesity (OB) polypeptides having 5 to about 167 amino acids, or fragments. 【請求項２】 配列番号２、４、５、または６のアミノ
酸配列を含む請求項１に記載のＯＢポリペプチド、ある
いはフラグメントを包含する、それらの対立遺伝子変異
体またはアナログ。2. An allelic variant or analog thereof comprising the OB polypeptide of claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 5, or 6, or a fragment thereof. 【請求項３】 請求項１または２に記載のＯＢポリペプ
チドの免疫原性フラグメント。3. An immunogenic fragment of the OB polypeptide according to claim 1 or 2. 【請求項４】 以下の配列からなる群より選択されるＯ
Ｂポリペプチドの免疫原性フラグメント： Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号１８）； Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号１９）； Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
（配列番号２０）；および Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−Ｃｙｓ（配列番号２１）。4. An O selected from the group consisting of the following sequences:
Immunogenic fragments of the B polypeptide: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-G
ln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Le
u-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-L
eu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Th
r-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-P
ro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gl
n-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp
(SEQ ID NO: 20); and Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-L
eu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gl
n-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu
-Cys (SEQ ID NO: 21). 【請求項５】 アミノ酸５３、５６、７１、８５、８
９、９２、９５、９８、１１０、１１８、１２１、１２
２、１２６、１２７、１２８、１２９、１３２、１３
９、１５７、１５９、１６３、および１６６（配列番号
４の番号付けに従う）からなる群から選択される１つま
たはより多くのアミノ酸が別のアミノ酸と置換されてい
る、請求項２に記載のヒトＯＢポリペプチドアナログ。5. Amino acids 53, 56, 71, 85, 8
9, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 12
2, 126, 127, 128, 129, 132, 13
3. The human of claim 2, wherein one or more amino acids selected from the group consisting of 9, 157, 159, 163, and 166 (according to the numbering of SEQ ID NO: 4) have been replaced with another amino acid. OB polypeptide analog. 【請求項６】 前記置換が、配列番号２に記載のマウス
ＯＢポリペプチドの分岐アミノ酸とで行われる、請求項
５に記載のヒトＯＢポリペプチドアナログ。6. The human OB polypeptide analog according to claim 5, wherein said substitution is made with a branched amino acid of the mouse OB polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2. 【請求項７】 前記置換が、アラニンとで行われる、請
求項５に記載のヒトＯＢポリペプチドアナログ。7. The human OB polypeptide analog of claim 5, wherein said substitution is made with alanine. 【請求項８】 以下のポリペプチドからなる群から選択
される、請求項５に記載のヒトＯＢポリペプチドアナロ
グ： （ａ）５３位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリ
ン、システイン、メチオニン、またはトレオニンと置換
される； （ｂ）９８位のセリン残基がグリシン、アラニン、バリ
ン、システイン、メチオニン、またはトレオニンと置換
される；および （ｃ）９２位のアルギニン残基がアスパラギン、リジ
ン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、セリン、トレオニン、メチオニン、またはシス
テインと置換される。8. The human OB polypeptide analog according to claim 5, which is selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) the serine residue at position 53 is glycine, alanine, valine, cysteine, methionine, or (B) replacing the serine residue at position 98 with glycine, alanine, valine, cysteine, methionine, or threonine; and (c) replacing the arginine residue at position 92 with asparagine, lysine, histidine, Replaced with glutamine, glutamic acid, aspartic acid, serine, threonine, methionine, or cysteine. 【請求項９】 配列番号２、４、５、または６に記載の
ヒトＯＢポリペプチドアミノ酸配列と、８３％以上のア
ミノ酸配列相同性を有する、請求項２に記載のＯＢポリ
ペプチドアナログ。9. The OB polypeptide analog according to claim 2, which has an amino acid sequence homology of 83% or more with the amino acid sequence of the human OB polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 5, or 6. 【請求項１０】 以下のポリペプチドからなる群から選
択される、請求項２に記載のヒトＯＢポリペプチドアナ
ログ： （ａ）１つまたはより多くのアスパラギン酸残基がグル
タミン酸と置換される； （ｂ）１つまたはより多くのイソロイシン残基がロイシ
ンと置換される； （ｃ）１つまたはより多くのグリシンまたはバリン残基
がアラニンと置換される； （ｄ）１つまたはより多くのアルギニン残基がヒスチジ
ンと置換される； （ｅ）１つまたはより多くのチロシンまたはフェニルア
ラニン残基がトリプトファンと置換される； （ｆ）１２１位から１２８位（配列番号４の番号付けに
従う）の１つまたはより多くの残基がグリシンまたはア
ラニンと置換される；および （ｇ）５４位から６０位または１１８位から１６６位
（配列番号４の番号付けに従う）の１つまたはより多く
の残基がリジン、グルタミン酸、システイン、またはプ
ロリンと置換される。10. The human OB polypeptide analog of claim 2, wherein the analog is selected from the group consisting of: (a) one or more aspartic acid residues are replaced with glutamic acid; b) one or more isoleucine residues are replaced with leucine; (c) one or more glycine or valine residues are replaced with alanine; (d) one or more arginine residues (E) replacing one or more tyrosine or phenylalanine residues with tryptophan; (f) one of positions 121 to 128 (according to the numbering of SEQ ID NO: 4) or More residues are replaced with glycine or alanine; and (g) positions 54-60 or 118-166 (SEQ ID NO: 4) One or more of the residues from the subject to issue dated) lysine is substituted glutamic acid, and cysteine, or proline. 【請求項１１】 以下のポリペプチドからなる群から選
択される、請求項１、２、３、５、６、または９のいず
れかに記載のＯＢポリペプチド： （ａ）１位から２１位の残基が欠失されている；および （ｂ）２１位でメチオニン、または１８位から２１位で
グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列
番号３８）、または１位から２１位でメチオニン−グリ
シン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒス
チジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン
−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−ア
ルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン
配列（配列番号９８）を有するサブパート（ａ）のポリ
ペプチド。11. The OB polypeptide according to any one of claims 1, 2, 3, 5, 6, or 9, wherein the OB polypeptide is selected from the group consisting of the following polypeptides: And (b) a methionine at position 21 or a glycine-serine-histidine-methionine sequence at positions 18-21 (SEQ ID NO: 38), or a methionine-glycine at positions 1-21. Subpart (a) having the serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98) Polypeptide. 【請求項１２】 以下のポリペプチドからなる群から選
択される、請求項１、２、３、５、６、または９のいず
れかに記載のＯＢポリペプチド： （ａ）１位から２１位の残基が欠失されている；および （ｂ）１４位から２１位でロイシン−グルタミン酸−リ
ジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニン−グルタミ
ン酸−アラニン配列（配列番号２６）、または１８位か
ら２１位でグルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−ア
ラニン配列（配列番号２７）、または１８位から２１位
でロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列
（配列番号２８）、または２位から２１位でメチオニン
−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン
−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−
セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリ
ン−アルギニン−グリシン−セリン−プロリン配列（配
列番号９９）、または１８位から２１位でグリシン−セ
リン−プロリン配列を有するサブパート（ａ）のポリペ
プチド。12. The OB polypeptide according to any one of claims 1, 2, 3, 5, 6, or 9, wherein the OB polypeptide is selected from the group consisting of: Residues are deleted; and (b) the leucine-glutamic acid-lysine-arginine-glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence at positions 14-21 (SEQ ID NO: 26), or glutamic acid at positions 18-21. An alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 27), or a leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence at positions 18-21 (SEQ ID NO: 28), or a methionine-glycine-serine-serine-histidine-position at positions 2-21. Histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-
A polypeptide of subsequence (a) having a serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99) or a glycine-serine-proline sequence at positions 18-21. 【請求項１３】 以下のポリペプチドからなる群から選
択される、請求項７、８、９、または１０のいずれかに
記載のＯＢポリペプチド： （ａ）１位から２１位の残基が欠失されている；および （ｂ）２１位でメチオニン、または１８位から２１位で
グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン配列（配列
番号３８）、または１位から２１位でメチオニン−グリ
シン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒス
チジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン
−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロリン−ア
ルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メチオニン
配列（配列番号９８）、または１４位から２１位でロイ
シン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン
酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号
２６）、または１８位から２１位でグルタミン酸−アラ
ニン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２７）、
または１８位から２１位でロイシン−グルタミン酸−リ
ジン−アルギニン配列（配列番号２８）、または２位か
ら２１位でメチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒ
スチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒス
チジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイ
シン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリ
ン−プロリン配列（配列番号９９）、または１８位から
２１位でグリシン−セリン−プロリン配列を有するサブ
パート（ａ）のポリペプチド。13. The OB polypeptide according to claim 7, selected from the group consisting of the following polypeptides: (a) lacking the residues from position 1 to position 21; And (b) a methionine at position 21 or a glycine-serine-histidine-methionine sequence at positions 18 to 21 (SEQ ID NO: 38), or a methionine-glycine-serine-serine at positions 1 to 21. Histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98), or leucine-glutamic acid at positions 14 to 21 -A lysine-arginine-glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence ( Column number 26), or 18 from 21-position glutamic acid - alanine - glutamic acid - alanine sequence (SEQ ID NO: 27),
Or a leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence at positions 18 to 21 (SEQ ID NO: 28), or a methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histine-serine- A polypeptide of serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99), or subpart (a) having a glycine-serine-proline sequence at positions 18-21. 【請求項１４】 以下のポリペプチドからなる群（配列
番号４の番号付けに従う）から選択される、請求項２に
記載のヒトＯＢポリペプチド短縮型アナログ： （ａ）１２１位から１２８位の１つまたはより多くの残
基が欠失される； （ｂ）１〜１１６位の残基が欠失される； （ｃ）１〜２１位および５４〜１６７位の残基が欠失さ
れる； （ｄ）１〜６０位および１１７〜１６７位の残基が欠失
される； （ｅ）１〜６０位の残基が欠失される； （ｆ）１〜５３位の残基が欠失される； （ｇ）１〜２１位の残基が欠失されるサブパート（ａ）
のアナログ；および （ｈ）以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸ま
たはアミノ酸配列を有するサブパート（ａ）から（ｇ）
のアナログ： （１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒスチジ
ン−メチオニン配列（配列番号３８）、（３）メチオニ
ン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン
−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロ
リン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メ
チオニン配列（配列番号９８）、（４）ロイシン−グル
タミン酸−リジン−アルギニン−グルタミン酸−アラニ
ン−グルタミン酸−アラニン配列（配列番号２６）、
（５）グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニ
ン配列（配列番号２７）、（６）ロイシン−グルタミン
酸−リジン−アルギニン配列（配列番号２８）、（７）
メチオニン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒ
スチジン−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリ
ン−プロリン−アルギニン−グリシン−セリン−プロリ
ン配列（配列番号９９）、および（８）グリシン−セリ
ン−プロリン配列。14. The human OB polypeptide truncated analog according to claim 2, which is selected from the group consisting of the following polypeptides (according to the numbering of SEQ ID NO: 4): (a) 1 from position 121 to position 128 (B) residues 1 to 116 are deleted; (c) residues 1 to 21 and 54 to 167 are deleted; (D) residues at positions 1-60 and 117-167 are deleted; (e) residues at positions 1-60 are deleted; (f) residues at positions 1-53 are deleted (G) a subpart (a) in which residues 1-21 are deleted
And (h) subparts (a) to (g) having an N-terminal amino acid or amino acid sequence selected from the group consisting of:
Analogs of (1) methionine, (2) glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 38), (3) methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine- Serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98), (4) leucine-glutamic acid-lysine-arginine-glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 26) ,
(5) glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 27), (6) leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence (SEQ ID NO: 28), (7)
Methionine-glycine-serine-serine-histidine-
Histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99), and (8) glycine-serine-proline sequence. 【請求項１５】 請求項１から１４のいずれかに記載の
組換えＯＢポリペプチド。15. The recombinant OB polypeptide according to any one of claims 1 to 14. 【請求項１６】 請求項１から１４のいずれかに記載の
化学合成ＯＢポリペプチド。16. A chemically synthesized OB polypeptide according to any one of claims 1 to 14. 【請求項１７】 １つまたはそれより多くの化学部分が
結合している、請求項１から１６のいずれかに記載のＯ
Ｂポリペプチドの誘導体。17. The method according to claim 1, wherein one or more chemical moieties are attached.
Derivatives of the B polypeptide. 【請求項１８】 前記化学部分が水溶性ポリマーであ
る、請求項１７に記載の誘導体。18. The derivative according to claim 17, wherein said chemical moiety is a water-soluble polymer. 【請求項１９】 前記水溶性ポリマーがポリエチレング
リコールである、請求項１８に記載の誘導体。19. The derivative according to claim 18, wherein said water-soluble polymer is polyethylene glycol. 【請求項２０】 モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、トリＰＥ
Ｇ化、またはテトラＰＥＧ化されている、請求項１９に
記載の誘導体。20. Mono-pegylated, di-pegylated, tri-PE
The derivative according to claim 19, which is G- or tetra-PEG-modified. 【請求項２１】 Ｎ末端がモノＰＥＧ化されている、請
求項２０に記載の誘導体。21. The derivative according to claim 20, wherein the N-terminus is monoPEGylated. 【請求項２２】 配列番号４の２２位から１６７位のア
ミノ酸残基または配列番号６の２２位から１６６位の残
基を含むＯＢポリペプチドである、請求項２１に記載の
誘導体。22. The derivative according to claim 21, which is an OB polypeptide comprising an amino acid residue from position 22 to position 167 of SEQ ID NO: 4 or a residue from position 22 to position 166 of SEQ ID NO: 6. 【請求項２３】 配列番号４の２２位から１６７位のア
ミノ酸残基または配列番号６の２２位から１６６位の残
基を含み、そして２１位にメチオニンを有するＯＢポリ
ペプチドである、請求項２１に記載の誘導体。23. An OB polypeptide comprising the amino acid residues from positions 22 to 167 of SEQ ID NO: 4 or the residues from positions 22 to 166 of SEQ ID NO: 6 and having methionine at position 21. The derivative according to 1. 【請求項２４】 請求項１から６、９、または１１のい
ずれかに記載のＯＢポリペプチドをコードする単離され
た核酸分子。24. An isolated nucleic acid molecule encoding the OB polypeptide according to any one of claims 1 to 6, 9, or 11. 【請求項２５】 請求項７、８、１０、１２、１３、ま
たは１４のいずれかに記載のＯＢポリペプチドをコード
する単離された核酸分子。25. An isolated nucleic acid molecule encoding an OB polypeptide according to any one of claims 7, 8, 10, 12, 13, or 14. 【請求項２６】 哺乳動物の体重を調整する生物学的活
性を有するＯＢポリペプチドの発現を得るために用いら
れるＤＮＡ分子であって、以下からなる群から選択され
る、ＤＮＡ分子： （ａ）配列番号１および３に記載のＤＮＡ分子またはそ
れらのフラグメント； （ｂ）（ａ）に定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズす
るＤＮＡ分子またはそれらのハイブリダイズし得るフラ
グメント；および （ｃ）該ＤＮＡ分子のいずれかによりコードされるアミ
ノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ分子。26. A DNA molecule used to obtain expression of an OB polypeptide having biological activity that modulates the weight of a mammal, wherein the DNA molecule is selected from the group consisting of: (a) (B) a DNA molecule that hybridizes with the DNA molecule defined in (a) or a fragment capable of hybridizing them; and (c) any of the DNA molecules. A DNA molecule that encodes the expression of the amino acid sequence encoded thereby. 【請求項２７】 配列番号２２および２４のヒトゲノム
ＤＮＡ分子である、請求項２６に記載のＤＮＡ分子。27. The DNA molecule of claim 26, which is a human genomic DNA molecule of SEQ ID NOs: 22 and 24. 【請求項２８】 以下に記載されるアミノ酸配列からな
る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードする、請求項２４に記載のＤＮＡ分子： （ａ）配列番号２； （ｂ）配列番号２の２２位から１６７位のアミノ酸； （ｃ）配列番号４； （ｄ）配列番号４の２２位から１６７位のアミノ酸； （ｅ）配列番号５； （ｆ）配列番号５の２２位から１６６位のアミノ酸； （ｇ）配列番号６； （ｈ）配列番号６の２２位から１６６位のアミノ酸； （ｉ）以下からなる群から選択されるＮ末端アミノ酸ま
たはアミノ酸配列を有するサブパート（ｂ）、（ｄ）、
（ｆ）、または（ｈ）のアミノ酸配列： （１）メチオニン、（２）グリシン−セリン−ヒスチジ
ン−メチオニン配列（配列番号３８）、（３）メチオニ
ン−グリシン−セリン−セリン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン
−セリン−セリン−グリシン−ロイシン−バリン−プロ
リン−アルギニン−グリシン−セリン−ヒスチジン−メ
チオニン配列（配列番号９８）。28. The DNA molecule of claim 24, which encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth below: (a) SEQ ID NO: 2; (b) SEQ ID NO: (C) SEQ ID NO: 4; (d) amino acids 22 to 167 of SEQ ID NO: 4; (e) SEQ ID NO: 5; (f) amino acids 22 to 166 of SEQ ID NO: 5 (G) SEQ ID NO: 6; (h) amino acids 22 to 166 of SEQ ID NO: 6; (i) a subpart (b) having an N-terminal amino acid or amino acid sequence selected from the group consisting of: (D),
Amino acid sequence of (f) or (h): (1) methionine, (2) glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 38), (3) methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine -Histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-histidine-methionine sequence (SEQ ID NO: 98). 【請求項２９】 以下からなる群から選択されるＮ末端
アミノ酸配列を有する（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、または
（ｈ）のアミノ酸配列をコードする、請求項２８に記載
のＤＮＡ分子： （１）ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン−
グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン配列
（配列番号２６）、（２）グルタミン酸−アラニン−グ
ルタミン酸−アラニン配列（配列番号２７）、（３）ロ
イシン−グルタミン酸−リジン−アルギニン配列（配列
番号２８）、（４）メチオニン−グリシン−セリン−セ
リン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジ
ン−ヒスチジン−ヒスチジン−セリン−セリン−グリシ
ン−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン−グリシ
ン−セリン−プロリン配列（配列番号９９）、および
（５）グリシン−セリン−プロリン配列。29. The DNA molecule of claim 28, which encodes the amino acid sequence of (b), (d), (f), or (h) having an N-terminal amino acid sequence selected from the group consisting of: : (1) Leucine-glutamic acid-lysine-arginine-
Glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 26), (2) glutamic acid-alanine-glutamic acid-alanine sequence (SEQ ID NO: 27), (3) leucine-glutamic acid-lysine-arginine sequence (SEQ ID NO: 28), (4) )) Methionine-glycine-serine-serine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-histidine-serine-serine-glycine-leucine-valine-proline-arginine-glycine-serine-proline sequence (SEQ ID NO: 99), and (5) ) Glycine-serine-proline sequence. 【請求項３０】 配列番号３のタンパク質コード配列と
して記載される配列を含む、請求項２４に記載のＤＮＡ
分子。30. The DNA of claim 24, comprising the sequence set forth as the protein coding sequence of SEQ ID NO: 3.
molecule. 【請求項３１】 配列番号３の２２位から１６７位のア
ミノ酸をコードする配列として記載される配列を含む、
請求項２４に記載のＤＮＡ分子。31. a sequence comprising the sequence described as the sequence encoding amino acids 22 to 167 of SEQ ID NO: 3.
A DNA molecule according to claim 24. 【請求項３２】 請求項２４から３１のいずれかに記載
のＤＮＡ分子にハイブリダイズし得る検出可能な標識を
された核酸分子。32. A detectably labeled nucleic acid molecule capable of hybridizing to the DNA molecule according to claim 24. 【請求項３３】 ＯＢ核酸の非コード領域にハイブリダ
イズし得る核酸であって、該非コード領域がイントロ
ン、５’非コード領域、および３’非コード領域からな
る群から選択される、核酸。33. A nucleic acid capable of hybridizing to a non-coding region of an OB nucleic acid, wherein said non-coding region is selected from the group consisting of an intron, a 5 ′ non-coding region, and a 3 ′ non-coding region. 【請求項３４】 ＯＢポリペプチドをコードするヒトゲ
ノムＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライ
マー。34. An oligonucleotide primer for amplifying human genomic DNA encoding an OB polypeptide. 【請求項３５】 以下からなる群から選択される、請求
項３２に記載のオリゴヌクレオチド： HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3'（配列番号２９）; HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3'（配列番号３
０）; HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3'（配列番号３
１）；および HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3'（配列番号３
２）。35. The oligonucleotide according to claim 32, selected from the group consisting of: HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3 '(SEQ ID NO: 29); HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO: 29) 3
0); HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3 '(SEQ ID NO: 3)
1); and HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
2). 【請求項３６】 請求項２４から３１のいずれかに記載
のＤＮＡ分子を含むベクター。36. A vector comprising the DNA molecule according to claim 24. 【請求項３７】 発現制御配列と作動可能に関連され
た、請求項２４、２６、３０、または３１に記載のＤＮ
Ａ分子を含む発現ベクター。37. The DN of claim 24, 26, 30, or 31, operably associated with an expression control sequence.
An expression vector containing the A molecule. 【請求項３８】 発現制御配列と作動可能に関連され
た、請求項２７または２９に記載のＤＮＡ分子を含む発
現ベクター。38. An expression vector comprising the DNA molecule of claim 27 or 29 operably associated with an expression control sequence. 【請求項３９】 発現制御配列と作動可能に関連され
た、請求項２５に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクタ
ー。39. An expression vector comprising the DNA molecule of claim 25 operably associated with an expression control sequence. 【請求項４０】 請求項２４または２５に記載のＤＮＡ
分子または請求項３６から３９のいずれかに記載の発現
ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトさ
れた単細胞宿主。40. The DNA according to claim 24 or 25.
A unicellular host transformed or transfected with a molecule or an expression vector according to any of claims 36 to 39. 【請求項４１】 前記単細胞宿主が細菌、酵母、哺乳動
物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養における
ヒト細胞からなる群から選択される、請求項４０に記載
の単細胞宿主。41. The single cell host of claim 40, wherein said single cell host is selected from the group consisting of bacteria, yeast, mammalian cells, plant cells, insect cells, and human cells in tissue culture. 【請求項４２】 前記単細胞宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ
Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭ
Ｔ１０、およびＳｆ９細胞からなる群から選択される、
請求項４０に記載の単細胞宿主。42. The method according to claim 42, wherein said single cell host is E. coli. coli, P
pseudomonas, Bacillus, Strep
tomyces, yeast, CHO, R1.1, BW, L
M, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BM
Selected from the group consisting of T10 and Sf9 cells,
A single cell host according to claim 40. 【請求項４３】 前記単細胞宿主が、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ、およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓからなる群か
ら選択される酵母宿主である、請求項４０に記載の単細
胞宿主。43. The method according to claim 43, wherein the unicellular host is Saccharo.
myces, Pichia, Candida, Hans
41. The unicellular host of claim 40, which is a yeast host selected from the group consisting of enula, and Tolulopsis. 【請求項４４】 ＯＢポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列を含み、そして該ＯＢポリペプチドをコードする配
列に対して機能的に近接した位置に発現調節配列を挿入
することからなる相同的組換え事象によって、ＯＢポリ
ペプチドの高発現を可能にするようにインビトロで改変
された、哺乳動物細胞。44. A DNA encoding an OB polypeptide
A homologous recombination event comprising the sequence and inserting an expression control sequence in a functional proximity to the sequence encoding the OB polypeptide to allow for high expression of the OB polypeptide. A mammalian cell modified in vitro. 【請求項４５】 前記発現調節配列がＯＢポリペプチド
発現調節配列であり、そして前記相同的組換え事象が変
異ＯＢポリペプチド発現制御配列を置き換える、請求項
４４に記載の細胞。45. The cell of claim 44, wherein said expression control sequence is an OB polypeptide expression control sequence, and wherein said homologous recombination event replaces a mutant OB polypeptide expression control sequence. 【請求項４６】 前記発現制御配列挿入部がＯＢポリペ
プチド制御配列ではない、請求項４５に記載の細胞。46. The cell of claim 45, wherein said expression control sequence insert is not an OB polypeptide control sequence. 【請求項４７】 以下の工程を包含する、ＯＢポリペプ
チドを調製する方法： （ａ）請求項４０から４６のいずれかに記載の細胞をＯ
Ｂポリペプチドの発現を提供する条件下で培養する工
程；および （ｂ）該発現されたＯＢポリペプチドを回収する工程。47. A method for preparing an OB polypeptide, comprising the steps of: (a) converting the cell according to claim 40 to
Culturing under conditions that provide for expression of the B polypeptide; and (b) recovering the expressed OB polypeptide. 【請求項４８】 前記細胞が細菌または酵母である、請
求項４７に記載の方法。48. The method of claim 47, wherein said cells are bacteria or yeast. 【請求項４９】 以下の工程をさらに包含する、請求項
４７または４８に記載の方法： （ｃ）前記ＯＢポリペプチドをＮｉキレートカラムでの
クロマトグラフィーにかける工程；および （ｄ）前記ＯＢポリペプチドをゲル濾過により精製する
工程。49. The method of claim 47 or 48, further comprising: (c) chromatography of the OB polypeptide on a Ni-chelate column; and (d) the OB polypeptide. Is purified by gel filtration. 【請求項５０】 工程（ｃ）後かつ工程（ｄ）前に、前
記ＯＢポリペプチドを強陽イオン交換カラムでのクロマ
トグラフィーにかける工程をさらに包含する、請求項４
９に記載の方法。50. The method according to claim 4, further comprising, after step (c) and before step (d), subjecting the OB polypeptide to chromatography on a strong cation exchange column.
10. The method according to 9. 【請求項５１】 請求項１から１６のいずれかに記載の
ＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方
法により生産されるＯＢポリペプチドに対して特異的な
抗体。51. An antibody specific for the OB polypeptide according to any one of claims 1 to 16 or the OB polypeptide produced by the method according to claims 47 to 50. 【請求項５２】 モノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体である、請求項５１に記載の抗体。52. The antibody according to claim 51, which is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. 【請求項５３】 検出可能な標識で標識された、請求項
５２に記載の抗体。53. The antibody of claim 52, wherein said antibody is labeled with a detectable label. 【請求項５４】 請求項５２に記載のモノクローナル抗
体を生産する不死化細胞系。54. An immortalized cell line that produces the monoclonal antibody of claim 52. 【請求項５５】 以下の工程を包含する、ＯＢポリペプ
チドに対して特異的な抗体を調製する方法： （ａ）請求項１から１６のいずれかに記載のＯＢポリペ
プチドまたは請求項４７から５０に記載の方法により生
産されたＯＢポリペプチドを、キャリアタンパク質に複
合体化させる工程； （ｂ）アジュバントと混合させた工程（ａ）のＯＢポリ
ペプチドフラグメント−キャリアタンパク質複合体で宿
主動物を免疫する工程；および （ｃ）該免疫宿主動物から抗体を得る工程。55. A method for preparing an antibody specific to an OB polypeptide, comprising the steps of: (a) an OB polypeptide according to any one of claims 1 to 16 or 47 to 50; (B) mixing an OB polypeptide produced by the method described in (1) with a carrier protein; and (b) immunizing a host animal with the OB polypeptide fragment-carrier protein complex of step (a) mixed with an adjuvant. And (c) obtaining an antibody from the immunized host animal. 【請求項５６】 以下の工程を包含する、試料において
ＯＢポリペプチドの存在を測定する方法： （ａ）ＯＢポリペプチドを含有すると思われる試料を、
該ＯＢポリペプチドに特異的に結合する抗体と、該抗体
および該ＯＢポリペプチドを含む反応複合体の形成を可
能にする条件下で接触させる工程；および （ｂ）該抗体および該試料中の該ＯＢポリペプチドを含
む反応複合体の形成を検出する工程であって、ここで該
反応複合体の形成の検出が該試料におけるＯＢポリペプ
チドの存在を示す、工程。56. A method for determining the presence of an OB polypeptide in a sample, comprising the steps of: (a) isolating a sample suspected of containing an OB polypeptide;
Contacting the antibody that specifically binds to the OB polypeptide under conditions that allow the formation of a reaction complex comprising the antibody and the OB polypeptide; and (b) contacting the antibody and the antibody in the sample. Detecting the formation of a reaction complex comprising the OB polypeptide, wherein detecting the formation of the reaction complex is indicative of the presence of the OB polypeptide in the sample. 【請求項５７】 前記抗体が固相支持体に結合される、
請求項５６に記載の方法。57. The antibody is bound to a solid support,
57. The method according to claim 56. 【請求項５８】 以下の工程を包含する、生物学的試料
におけるＯＢポリペプチドレベルを評価するインビトロ
方法： （ａ）請求項５６または５７に記載の方法に従って、生
物学的試料における反応複合体の形成を検出する工程；
および （ｂ）形成された反応複合体の量を評価する工程であっ
て、ここで該反応複合体の量は、該生物学的試料におけ
るＯＢポリペプチドレベルに対応する、工程。58. An in vitro method for assessing OB polypeptide levels in a biological sample, comprising the steps of: (a) the reaction complex in a biological sample according to the method of claim 56 or 57. Detecting the formation;
And (b) assessing the amount of the reaction complex formed, wherein the amount of the reaction complex corresponds to the OB polypeptide level in the biological sample. 【請求項５９】 以下の工程を包含する、哺乳動物被験
体におけるＯＢポリペプチドレベルの上昇または低下に
関連した疾患の存在を検出または診断するインビトロ方
法： （ａ）請求項５８に記載の哺乳動物被験体由来の生物学
的試料におけるＯＢポリペプチドレベルを評価する工
程；および（ｂ）工程（ａ）において検出されたレベル
と、正常被験体または初期の該被験体に存在するＯＢポ
リペプチドレベルとを比較する工程であって、ここで、
正常レベルに比較した該ＯＢポリペプチドレベルの上昇
はＯＢポリペプチドレベルの上昇に関連した疾患を示
し、そして正常レベルに比較した該ＯＢポリペプチドレ
ベルの低下はＯＢポリペプチドレベルの低下に関連した
疾患を示す、工程。59. An in vitro method for detecting or diagnosing the presence of a disease associated with increasing or decreasing OB polypeptide levels in a mammalian subject, comprising: (a) the mammal of claim 58. Assessing the level of OB polypeptide in a biological sample from the subject; and (b) comparing the level detected in step (a) with the level of OB polypeptide present in a normal or early subject. Is a step of comparing
An increase in the level of the OB polypeptide relative to a normal level indicates a disease associated with an increase in the level of the OB polypeptide, and a decrease in the level of the OB polypeptide relative to the normal level is a disease associated with a decrease in the level of the OB polypeptide. Showing the process. 【請求項６０】 哺乳動物被験体におけるＯＢポリペプ
チドのレベルの上昇または低下と関連した疾患の治療処
置をモニターするインビトロ方法であって、請求項５８
に記載の方法に従って、ＯＢポリペプチドレベルの上昇
または低下に関連した疾患について治療処置を受ける哺
乳動物被験体から異なる時点で得られた一連の生物学的
試料におけるＯＢポリペプチドレベルを評価する工程を
包含する、方法。60. An in vitro method for monitoring a therapeutic treatment for a disease associated with elevated or decreased levels of an OB polypeptide in a mammalian subject, wherein the method is an in vitro method.
Assessing OB polypeptide levels in a series of biological samples obtained at different times from a mammalian subject undergoing therapeutic treatment for a disease associated with elevated or decreased OB polypeptide levels according to the method of Including, methods. 【請求項６１】 請求項１から１６のいずれかに記載の
ＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方
法により生産されたＯＢポリペプチドと、薬学的に受容
可能なキャリアとを含む薬学的組成物。61. A pharmaceutical comprising the OB polypeptide according to any one of claims 1 to 16 or the OB polypeptide produced by the method according to claim 47 to 50, and a pharmaceutically acceptable carrier. Composition. 【請求項６２】 動物の体重を減少させるための、請求
項６１に記載の薬学的組成物。62. The pharmaceutical composition according to claim 61, for reducing the weight of an animal. 【請求項６３】 請求項１から１６のいずれかに記載の
ＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方
法により生産されるＯＢポリペプチドのアンタゴニスト
と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、動物の体重
を増大させるための薬学的組成物。63. An OB polypeptide according to any one of claims 1 to 16 or an antagonist of the OB polypeptide produced by the method according to claims 47 to 50, and a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical composition for increasing the weight of an animal. 【請求項６４】 前記アンタゴニストが、前記ＯＢポリ
ペプチドに結合しそしてその活性を中和する抗体、該Ｏ
Ｂポリペプチドのレセプターに結合するがこれを活性化
しない該ＯＢポリペプチドのフラグメント、および該Ｏ
Ｂポリペプチドの小分子アンタゴニストからなる群から
選択される、請求項６３に記載の薬学的組成物。64. The antibody, wherein said antagonist binds to said OB polypeptide and neutralizes its activity.
A fragment of the OB polypeptide that binds to but does not activate a receptor for the B polypeptide;
64. The pharmaceutical composition of claim 63, wherein the composition is selected from the group consisting of a small molecule antagonist of a B polypeptide. 【請求項６５】 請求項１から１６のいずれかに記載の
ＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方
法により生産されたＯＢポリペプチドと、薬学的に受容
可能なキャリアとを含む、個体の体重を減少させるため
の体型改善美容組成物。65. An individual comprising the OB polypeptide of any one of claims 1 to 16 or the OB polypeptide produced by the method of claim 47 to 50, and a pharmaceutically acceptable carrier. A cosmetic composition for reducing body weight. 【請求項６６】 請求項１から１６のいずれかに記載の
ＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方
法により生産されたＯＢポリペプチドのアンタゴニスト
と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、個体の体重
を増大させるための体型改善美容組成物。66. An OB polypeptide according to any of claims 1 to 16 or an antagonist of the OB polypeptide produced by the method of claims 47 to 50, and a pharmaceutically acceptable carrier. And a body composition improving cosmetic composition for increasing the weight of an individual. 【請求項６７】 前記アンタゴニストが、前記ＯＢポリ
ペプチドに結合しそしてその活性を中和する抗体、該Ｏ
Ｂポリペプチドのレセプターに結合するがこれを活性化
しない該ＯＢポリペプチドのフラグメント、および該Ｏ
Ｂポリペプチドの小分子アンタゴニストからなる群から
選択される、請求項６６に記載の美容組成物。67. The antibody, wherein the antagonist binds to the OB polypeptide and neutralizes its activity.
A fragment of the OB polypeptide that binds to but does not activate a receptor for the B polypeptide;
67. The cosmetic composition of claim 66, wherein the cosmetic composition is selected from the group consisting of a small molecule antagonist of a B polypeptide. 【請求項６８】 個体の体型を改善するための美容方法
であって、請求項６５から６７のいずれかに記載の美容
組成物が、個体に、該個体の体重を所望のレベルに調整
するに十分な用量で投与される、方法。68. A cosmetic method for improving the physical shape of an individual, wherein the cosmetic composition according to any one of claims 65 to 67 adjusts the weight of the individual to a desired level. The method is administered in a sufficient dose. 【請求項６９】 哺乳動物の体重を調整するための医薬
品の製造のための、請求項１から４、または９のいずれ
かに記載のＯＢポリペプチドをコードする核酸にハイブ
リダイズし得るアンチセンス核酸分子の使用。69. An antisense nucleic acid capable of hybridizing to the nucleic acid encoding the OB polypeptide according to any one of claims 1 to 4, or 9 for the manufacture of a medicament for adjusting the weight of a mammal. Use of molecules. 【請求項７０】 動物の体重を改変するための遺伝子治
療医薬品の製造のための、請求項１から１６のいずれか
に記載のＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に
記載の方法により生産されたＯＢポリペプチドをコード
する核酸分子の使用。70. An OB polypeptide according to any one of claims 1 to 16 or produced by a method according to claims 47 to 50 for the manufacture of a gene therapy medicament for modifying the weight of an animal. Use of a nucleic acid molecule encoding an OB polypeptide. 【請求項７１】 動物の体重を改変するための医薬品の
製造のための、請求項１から１６のいずれかに記載のＯ
Ｂポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方法
により生産されたＯＢポリペプチドの使用。71. The method according to claim 1, for the manufacture of a medicament for modifying the weight of an animal.
Use of a B polypeptide or an OB polypeptide produced by the method of claims 47-50. 【請求項７２】 糖尿病、高血圧、および高コレステロ
ール症からなる群から選択される障害の処置における哺
乳動物の体重を調整するための医薬品の製造のための、
請求項１から１６のいずれかに記載のＯＢポリペプチド
または請求項４７から５０に記載の方法により生産され
たＯＢポリペプチドの使用。72. For the manufacture of a medicament for adjusting the weight of a mammal in the treatment of a disorder selected from the group consisting of diabetes, hypertension, and hypercholesterolemia,
Use of an OB polypeptide according to any of claims 1 to 16 or an OB polypeptide produced by a method according to claims 47 to 50. 【請求項７３】 糖尿病、高血圧、および高コレステロ
ール症の処置のための医薬品と組み合わせて用いられる
哺乳動物の体重を調整するための医薬品の製造のため
の、請求項１から１６のいずれかに記載のＯＢポリペプ
チドまたは請求項４７から５０に記載の方法により生産
されたＯＢポリペプチドの使用。73. A method according to any one of claims 1 to 16 for the manufacture of a medicament for adjusting the weight of a mammal for use in combination with a medicament for the treatment of diabetes, hypertension and hypercholesterolemia. Use of an OB polypeptide according to any one of claims 47 to 50. 【請求項７４】 動物の体重を増大させるための医薬品
の製造のための、請求項１から１６のいずれかに記載の
ＯＢポリペプチドまたは請求項４７から５０に記載の方
法により生産されたＯＢポリペプチドのアンタゴニスト
の使用。74. An OB polypeptide according to any one of claims 1 to 16 or an OB polypeptide produced by the method according to claims 47 to 50 for the manufacture of a medicament for increasing the weight of an animal. Use of antagonists of the peptide. 【請求項７５】 前記アンタゴニストが、前記ＯＢポリ
ペプチドに結合しそしてその活性を中和する抗体、該Ｏ
Ｂレセプターに結合するがこれを活性化しない該ＯＢポ
リペプチドのフラグメント、および該ＯＢポリペプチド
の小分子アンタゴニストからなる群から選択される、請
求項７４に記載の使用。75. An antibody, wherein said antagonist binds to said OB polypeptide and neutralizes its activity.
75. The use of claim 74, wherein the use is selected from the group consisting of a fragment of the OB polypeptide that binds but does not activate a B receptor, and a small molecule antagonist of the OB polypeptide. 【請求項７６】 静脈内送達、動脈内送達、腹腔内送
達、筋内送達、皮下送達、鼻内送達、経口送達、または
肺送達のための医薬品の製造のための、請求項７１から
７５のいずれかに記載の使用。76. The method of claims 71 to 75 for the manufacture of a medicament for intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, oral or pulmonary delivery. Use as described in any of the above.