JP2001151698A - Influenza vaccine - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、インフルエンザワ
クチン、より詳細にはインフルエンザウイルスのマトリ
ックスプロテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
を用いたインフルエンザＤＮＡワクチンに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an influenza vaccine, and more particularly to a DNA having a nucleotide sequence encoding a matrix protein of an influenza virus.
The present invention relates to an influenza DNA vaccine using E. coli.
【０００２】[0002]
【従来技術】インフルエンザ、特にＡ型インフルエンザ
は、世界的規模で流行することがある重大なウイルス感
染疾患の一つであり、効果的な予防法の確立が強く望ま
れている。しかし、インフルエンザウイルスは抗原変異
の頻度が比較的高いために、変異した抗原を有するイン
フルエンザウイルスに十分に対応できインフルエンザウ
イルス感染を高い確率で予防できるワクチンは未だ開発
されていないのが実情である。また、老人、子児あるい
は免疫力が低下した患者においては、インフルエンザ感
染による死亡例、あるいは脳炎を引き起こす症例が多数
認められている。さらに、インフルエンザ感染により、
死には至らないまでも発熱、頭痛、倦怠感などの身体症
状がもたらされれば、その患者は一定期間社会活動の停
止を余儀なくされ、これは特に先進国においては重大な
経済的損失へとつながる。従って、より効果的なインフ
ルエンザワクチンを開発する必要性が存在していた。2. Description of the Related Art Influenza, particularly influenza A, is one of serious viral infectious diseases that may spread worldwide, and it is strongly desired to establish an effective preventive method. However, since influenza virus has a relatively high frequency of antigen mutation, a vaccine that can sufficiently cope with an influenza virus having a mutated antigen and that can prevent influenza virus infection with a high probability has not yet been developed. Also, in the elderly, offspring or patients with reduced immunity, many deaths due to influenza infection or cases causing encephalitis have been observed. In addition, due to influenza infection,
Physical symptoms, such as fever, headache, and malaise, that do not result in death, force the patient to cease social activity for a period of time, which can lead to significant economic losses, especially in developed countries. Therefore, there was a need to develop more effective influenza vaccines.
【０００３】現在までに開発および実用化されているイ
ンフルエンザワクチンの主なものは、ヘマグルチニン
（ＨＡ）タンパク質またはニューラミニダーゼ（ＮＡ）
タンパク質に対する中和抗体の誘導を目的とするもので
ある。しかし、ＨＡタンパク質やＮＡタンパク質はウイ
ルス株により抗原性の変異の度合いが大きいため、これ
らワクチンは、インフルエンザウイルスの変異への対応
が不十分で、効果を十分に発揮できない場合があるとい
う欠点があった。[0003] The major influenza vaccines which have been developed and put to practical use so far are hemagglutinin (HA) protein or neuraminidase (NA).
The purpose is to induce a neutralizing antibody against the protein. However, since the HA and NA proteins have a high degree of antigenic variation depending on the virus strain, these vaccines have a drawback that they do not sufficiently respond to influenza virus mutations and may not be able to exert their effects sufficiently. Was.
【０００４】また、最近になって、遺伝子工学技術の進
歩によりＤＮＡワクチンが開発されている。ＤＮＡワク
チンとしては組み換えプラスミドを用いたものが一般的
であり、目的の抗原をコードするＤＮＡを含む組み換え
プラスミドを生体内に投与することによって、生体内で
当該ＤＮＡによってコードされる抗原性を有するアミノ
酸配列が発現し、このアミノ酸配列により免疫反応が生
体内で惹起される。しかし、ある特定のプラスミドＤＮ
Ａワクチンを生体に投与しても、喚起される免疫反応の
程度は一定ではなく、試験動物の種類、ＤＮＡの種類、
並びに接種方法などにより免疫反応の程度は多様であ
り、ＤＮＡプラスミドがＤＮＡワクチンとして有用であ
るかどうかを予測することは一般に困難である。[0004] Recently, DNA vaccines have been developed due to advances in genetic engineering technology. As a DNA vaccine, a vaccine using a recombinant plasmid is generally used. By administering a recombinant plasmid containing DNA encoding a target antigen into a living body, an amino acid having antigenicity encoded by the DNA in the living body can be obtained. The sequence is expressed and an immune response is elicited in vivo by this amino acid sequence. However, certain plasmids DN
Even if the A vaccine is administered to a living body, the degree of the evoked immune response is not constant, and the type of test animal, type of DNA,
In addition, the degree of the immune reaction varies depending on the inoculation method and the like, and it is generally difficult to predict whether a DNA plasmid is useful as a DNA vaccine.
【０００５】より最近になって、インフルエンザＡヌク
レオプロテイン（ＮＰ）をコードするプラスミドＤＮＡ
がインフルエンザウイルス感染の予防に役立つことが報
告されている（Ulmer, 1993, Science, 259, 1745-174
9:及びDonnelly, 1995, Nature Med., 1, 583-587)。Ul
merらはウイルス内のタンパク質であるヌクレオプロテ
イン（ＮＰ）をコードするＤＮＡをワクチンとして用い
ることにより、抗原変異にほとんど影響を受けることな
く細胞性免疫を誘導し、より強い感染防御効果を達成す
ることに成功している。しかしながら、インフルエンザ
感染の予防に効果的で、特に抗原変異に影響を受けるこ
とが少ない普遍的なインフルエンザワクチンを新たに開
発する必要性は依然として存在していた。More recently, plasmid DNA encoding influenza A nucleoprotein (NP)
Has been reported to help prevent influenza virus infection (Ulmer, 1993, Science, 259, 1745-174).
9: and Donnelly, 1995, Nature Med., 1, 583-587). Ul
mer et al. use a DNA encoding nucleoprotein (NP), a protein in the virus, as a vaccine to induce cell-mediated immunity with little effect from antigenic mutations and achieve a stronger protective effect against infection. Have been successful. However, there remains a need to develop new universal influenza vaccines that are effective in preventing influenza infections, and are particularly insensitive to antigenic variation.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、インフルエンザウイルスに対する
高い免疫能を付与することができる新規なインフルエン
ザＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき課題とし
た。また、本発明は、インフルエンザウイルスの抗原変
異によって影響を受けることが少ない普遍的なインフル
エンザＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき課題
とした。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a novel influenza DNA vaccine that can impart high immunity to influenza virus. Another object of the present invention is to provide a universal influenza DNA vaccine that is less affected by antigenic mutation of influenza virus.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、インフルエンザウ
イルスのマトリックスプロテインをコードする塩基配列
を有するＤＮＡをマウスに投与して免疫化した場合に細
胞傷害性Ｔ細胞による細胞性免疫が活性化されることを
見出した。また、本発明者らはインフルエンザウイルス
のマトリックスプロテインをコードする塩基配列を有す
るＤＮＡで免疫化したマウスの方が免疫化しなかったマ
ウスよりもインフルエンザ感染に対して高い耐性を示す
ことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成
したものである。即ち、本発明によれば、インフルエン
ザウイルスのマトリックスプロテインまたはその抗原性
エピトープをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む
インフルエンザワクチンが提供される。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, when a mouse having a DNA having a nucleotide sequence encoding a matrix protein of an influenza virus was administered to a mouse for immunization. It was found that cell-mediated immunity by cytotoxic T cells was activated. In addition, the present inventors have found that mice immunized with DNA having a nucleotide sequence encoding the matrix protein of influenza virus show higher resistance to influenza infection than mice not immunized. The present invention has been completed based on these findings. That is, according to the present invention, there is provided an influenza vaccine comprising a DNA having a base sequence encoding a matrix protein of an influenza virus or an antigenic epitope thereof.
【０００８】本発明のインフルエンザワクチンの一態様
では、インフルエンザウイルスのマトリックスプロテイ
ンまたはその抗原性エピトープをコードする塩基配列
は、インフルエンザウイルスの膜タンパク質と組み込み
膜タンパク質の両方をコードしている。本発明のインフ
ルエンザワクチンの一態様では、ＤＮＡはプラスミドＤ
ＮＡである。本発明のインフルエンザワクチンの一態様
では、ＤＮＡは、インフルエンザウイルスのマトリック
スプロテインとは異なる別の１または２以上のインフル
エンザ抗原をコードする塩基配列をさらに有している。
本発明のインフルエンザワクチンの一態様では、別のイ
ンフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン、ニューラミニダ
ーゼおよび核タンパク質から成る群から選択される１ま
たは２以上のインフルエンザ抗原である。In one embodiment of the influenza vaccine of the present invention, the base sequence encoding the influenza virus matrix protein or its antigenic epitope encodes both the influenza virus membrane protein and the integrated membrane protein. In one embodiment of the influenza vaccine of the invention, the DNA is plasmid D
NA. In one aspect of the influenza vaccine of the present invention, the DNA further has a nucleotide sequence encoding one or more different influenza antigens different from the matrix protein of the influenza virus.
In one aspect of the influenza vaccine of the present invention, the other influenza antigen is one or more influenza antigens selected from the group consisting of hemagglutinin, neuraminidase and nucleoprotein.
【０００９】本発明の別の側面によれば、本発明のイン
フルエンザワクチンを含む医薬組成物が提供される。本
発明の医薬組成物の一態様では、本発明のインフルエン
ザワクチンとリポソームとを配合して成る医薬組成物が
提供される。本発明の医薬組成物の一態様では、本発明
のインフルエンザワクチンとは異なる別の１または２以
上のインフルエンザワクチンをさらに含む医薬組成物が
提供される。本発明の医薬組成物の一態様では、別のイ
ンフルエンザワクチンは、ヘマグルチニン、ニューラミ
ニダーゼおよび核タンパク質から成る群から選択される
１または２以上のインフルエンザ抗原に対するワクチン
である。[0009] According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the influenza vaccine of the present invention. In one aspect of the pharmaceutical composition of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the influenza vaccine of the present invention and a liposome. In one aspect of the pharmaceutical composition of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition further comprising one or more other influenza vaccines different from the influenza vaccine of the present invention. In one aspect of the pharmaceutical composition of the present invention, another influenza vaccine is a vaccine against one or more influenza antigens selected from the group consisting of hemagglutinin, neuraminidase and nucleoprotein.
【００１０】本発明のインフルエンザワクチンの一使用
態様では、本発明のインフルエンザワクチンとは異なる
別の１または２以上のインフルエンザワクチンと併用さ
れる。本発明のインフルエンザワクチンまたは医薬組成
物は、好ましくは経皮投与される。[0010] In one embodiment of the influenza vaccine of the present invention, it is used in combination with one or more other influenza vaccines different from the influenza vaccine of the present invention. The influenza vaccine or pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered transdermally.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】以下、本発明のインフルエンザワ
クチン並びにそれを用いた医薬組成物の実施態様および
実施方法について詳細に説明する。本発明のインフルエ
ンザワクチンは、インフルエンザウイルスのマトリック
スプロテインまたはその抗原性エピトープをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを含むことを特徴とする。本明
細書において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生
じ得る物質を意味する。本明細書において、「インフル
エンザ」という用語は、特に断らない限り最も広義のイ
ンフルエンザウイルスを意味する。インフルエンザウイ
ルスは一般的には、インフルエンザウイルス属（これは
さらにＡ型とＢ型に分類される）とインフルエンザウイ
ルスＣ型属とに分類されるが、本明細書で「インフルエ
ンザウイルス」という用語を使用する場合には、特に断
らない限り、これら全てを包含し、またインフルエンザ
ウイルスのあらゆる変異体をも包含する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The influenza vaccine of the present invention and the embodiment and method of a pharmaceutical composition using the same will be described in detail below. The influenza vaccine of the present invention is characterized by containing a DNA having a base sequence encoding a matrix protein of an influenza virus or an antigenic epitope thereof. As used herein, the term "vaccine" refers to a substance that can generate an immune response. As used herein, the term "influenza" refers to the broadest influenza virus unless otherwise specified. Influenza viruses are generally divided into the genus Influenza virus (which is further classified into types A and B) and the genus Influenza virus type C, although the term "influenza virus" is used herein. If so, all of these are included, unless otherwise indicated, as well as any mutants of the influenza virus.
【００１２】本明細書で用いる「インフルエンザのマト
リックスプロテイン」という用語は、インフルエンザウ
イルスの５種類ある内部タンパク質の１種であるマトリ
ックスプロテインを意味する。インフルエンザマトリッ
クスプロテインの構造は公知である（LAMB,RA.,1981, V
irology, 112, 746-751)。本発明で用いるDNAは、イン
フルエンザウイルスのマトリックスプロテインまたはそ
の抗原性エピトープをコードする塩基配列を有する。本
発明で言うインフルエンザウイルスのマトリックスプロ
テインとは、当該タンパク質の免疫原性に関連するエピ
トープ（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞が認識するエピトー
プ）であるペプチドを含む限りは、完全タンパク質でも
あるいはその断片でもよい。従って、本発明で用いるＤ
ＮＡは、マトリックスプロテインの全長をコードする必
要はなく、エピトープを含む一部の断片をコードするも
のでもよい。なお、本明細書において「マトリックスプ
ロテイン」という場合には、完全タンパク質だけを意味
するのみではなく、抗原性エピトープを有するその断片
をも含む意味で用いられる場合がある。なお、インフル
エンザウイルスのマトリックスプロテインは変異が少な
いため、それに対するワクチンは抗原変異の影響を受け
ることが少なく有用である。As used herein, the term "influenza matrix protein" refers to a matrix protein that is one of the five internal proteins of influenza virus. The structure of the influenza matrix protein is known (LAMB, RA., 1981, V
irology, 112, 746-751). The DNA used in the present invention has a base sequence encoding a matrix protein of influenza virus or an antigenic epitope thereof. The influenza virus matrix protein referred to in the present invention refers to a complete protein or a fragment thereof as long as it contains a peptide that is an epitope related to the immunogenicity of the protein (eg, an epitope recognized by cytotoxic T cells). Good. Therefore, D used in the present invention
The NA need not encode the full length of the matrix protein, but may encode some fragment containing the epitope. In this specification, the term "matrix protein" may be used to mean not only a complete protein but also a fragment thereof having an antigenic epitope. Since the matrix protein of influenza virus has few mutations, vaccines against it are less affected by antigen mutation and are useful.
【００１３】上記のような抗原性エピトープを含む一部
の断片をコードするＤＮＡの例としては、インフルエン
ザウイルスの膜タンパク質（membrane protein(M1)）と
組み込み膜タンパク質（integral membrane protein(M
2)）の両方をコードしているＤＮＡが挙げられる。ま
た、本発明で用いるＤＮＡは、上記したようなインフル
エンザウイルスのマトリックスプロテインをコードする
塩基配列の少なくとも１コピーを有するものであり、２
コピー以上の上記塩基配列を有するものでもよい。Examples of the DNA encoding a fragment containing the above antigenic epitope include a membrane protein of influenza virus (membrane protein (M1)) and an integral membrane protein (M1).
2))). The DNA used in the present invention has at least one copy of the nucleotide sequence encoding the matrix protein of influenza virus as described above,
It may have the above base sequence of more than copies.
【００１４】本発明のワクチンを用いて体液性免疫を生
じさせることを意図する場合には、抗原タンパク質（即
ち、マトリックスプロテイン）全体あるいはその大部分
をコードするDNAを用いることが好ましい。When it is intended to generate humoral immunity using the vaccine of the present invention, it is preferable to use a DNA encoding the whole or most of the antigen protein (ie, matrix protein).
【００１５】本発明のインフルエンザワクチンはヒトを
含む哺乳動物に投与され、投与を受けた動物にはインフ
ルエンザに対する免疫が生じる。本発明で用いるＤＮＡ
によってコードされるインフルエンザウイルスのマトリ
ックスプロテインが生体内で合成され、これが抗原とな
って細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されて細胞性免疫が喚起
され（場合によってはＢ細胞も抗体産生細胞へと分化
し、体液性免疫も喚起される）、インフルエンザに対す
る免疫が生じることになる。本発明のインフルエンザワ
クチンを用いる免疫は、インフルエンザの予防のみでな
く治療にも役立つものである。[0015] The influenza vaccine of the present invention is administered to mammals including humans, and the administered animals are immunized against influenza. DNA used in the present invention
In vivo, the matrix protein of the influenza virus encoded by the influenza virus is synthesized in vivo, and this is used as an antigen to activate cytotoxic T cells to elicit cellular immunity (in some cases, B cells are also separated into antibody-producing cells). And humoral immunity is also evoked), resulting in immunity against influenza. Immunization using the influenza vaccine of the present invention is useful not only for prevention but also for treatment of influenza.
【００１６】本発明で用いるＤＮＡは、インフルエンザ
ウイルスのマトリックスプロテインをコードする塩基配
列を生体内で発現できるような状態で保持している。本
発明で用いるＤＮＡは、一般的には、インフルエンザウ
イルスのマトリックスプロテインをコードする塩基配列
を発現ベクターと連結させて成るＤＮＡである。発現ベ
クターは好ましくはプラスミドベクターである。発現プ
ラスミドの作製において有用なベクターとしては、構成
性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロ
モーター、あるいはインフルエンザウイルスのマトリッ
クスプロテイン由来のプロモーターなどのプロモーター
を含むベクターなどが挙げられるが、これらに限定され
るわけではない。The DNA used in the present invention holds a base sequence encoding a matrix protein of influenza virus in such a state that it can be expressed in vivo. The DNA used in the present invention is generally a DNA obtained by connecting a base sequence encoding a matrix protein of influenza virus to an expression vector. The expression vector is preferably a plasmid vector. Vectors useful in producing expression plasmids include, but are not limited to, vectors containing promoters such as constitutive promoters, inducible promoters, tissue-specific promoters, or promoters derived from the matrix protein of influenza virus. Do not mean.
【００１７】構成性プロモーターの具体例としては、例
えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉
腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０
（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）由来のプロモーターなどのウイルス由来の強力な
プロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターの
具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられ
る。誘導性あるいは調節性のプロモーターとしては、例
えば、成長ホルモン調節性プロモーター、lacオペロン
配列の制御下にあるプロモーター、あるいは抗生物質誘
導性プロモーター、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネイ
ンプロモーターなどが挙げられる。Specific examples of the constitutive promoter include, for example, those derived from cytomegalovirus (CMV), those derived from Rous sarcoma virus (RSV), and Simian virus-40.
(SV40) or herpes simplex virus (H
Strong promoters derived from viruses, such as promoters derived from SV), may be mentioned. Specific examples of the tissue-specific promoter include a muscle β-actin promoter. Examples of the inducible or regulatable promoter include a growth hormone-regulated promoter, a promoter under the control of a lac operon sequence, an antibiotic-inducible promoter, and a zinc-inducible metallothionein promoter.
【００１８】本発明で用いるベクターは、プロモーター
（例えば、上記の構成性または誘導性プロモーター）Ｄ
ＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことが好ましい。ベ
クターはさらに、エンハンサー要素、転写あるいはポリ
アデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０あるいはウシ成
長ホルモン（ＢＧＨ）由来）のスプライシングのための
イントロン配列などのＲＮＡプロセシング配列、発現タ
ンパク質分泌のシグナル配列、あるいはＣｐＧモチーフ
として知られている免疫刺激ＤＮＡ配列の２以上のコピ
ーを含んでいてもよい。また、ベクターは、細菌の複製
起点配列および／または抗生物質耐性（例えば、カナマ
イシン）あるいは非抗生物質耐性（例えば、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子）に用いられ得る選択マーカー用のＤ
ＮＡ配列を含んでいてもよい。The vector used in the present invention comprises a promoter (for example, the above-mentioned constitutive or inducible promoter) D
It is preferable to include an expression control sequence including an NA sequence. The vector may also be known as an enhancer element, an RNA processing sequence such as an intron sequence for splicing transcription or polyadenylation signals (eg, from SV40 or bovine growth hormone (BGH)), a signal sequence for secretion of expressed proteins, or a CpG motif. May contain more than one copy of a given immunostimulatory DNA sequence. The vector may also include a bacterial origin of replication and / or a D for a selectable marker that can be used for antibiotic resistance (eg, kanamycin) or non-antibiotic resistance (eg, the β-galactosidase gene).
It may include an NA sequence.
【００１９】非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する
オリゴヌクレオチドは免疫系を活性化することが示され
ている（A. Kriegら、「CpG motifs in Bacterial DNA
Trigger Directed B Cell Activation」Nature 374: 54
6-549 (1995)）。フランキング配列に依存して、あるＣ
ｐＧモチーフは、Ｂ細胞あるいはＴ細胞応答に対してよ
り免疫刺激性となる場合がある。従って、DNA発現ベク
ターに存在するるＣｐＧモチーフは、発現タンパク質に
対する免疫応答の誘発を促進するアジュバントとして作
用する。ＣｐＧモチーフ、すなわち、特定の配列におけ
るＣｐＧジヌクレオチドを含むＤＮＡ伸長部は、長さが
５〜４０塩基対程度であり得る。複数のＣｐＧモチーフ
を、発現ベクターの非コード領域に挿入することができ
る。体液性免疫応答を所望する場合に好ましいＣｐＧモ
チーフは、Ｂ細胞応答を優先的に刺激するＣｐＧモチー
フである。細胞性免疫を所望する場合に好ましいＣｐＧ
モチーフは、CD８ +Ｔ細胞応答を促進することが知られ
ているサイトカインの分泌を刺激するＣｐＧモチーフで
ある。本発明で用いるＤＮＡ中に、このようなCpGモチ
ーフを含めてもよい。Having an unmethylated CpG dinucleotide
Oligonucleotides have been shown to activate the immune system
(A. Krieg et al., “CpG motifs in Bacterial DNA
Trigger Directed B Cell Activation, Nature 374: 54
6-549 (1995)). Depending on the flanking sequence, some C
The pG motif is better for B cell or T cell responses.
May be immunostimulatory. Therefore, the DNA expression vector
CpG motif present in the expressed protein
As an adjuvant to promote the induction of an immune response to
To use. CpG motif, ie, in a specific sequence
The DNA extension containing the CpG dinucleotide has a length of
It may be on the order of 5 to 40 base pairs. Multiple CpG motifs
Can be inserted into the non-coding region of the expression vector.
You. Preferred CpG models when a humoral immune response is desired
The chief is a CpG motivator that preferentially stimulates B cell responses.
It is. Preferred CpG when cell-mediated immunity is desired
The motif is CD8 +Is known to promote T cell responses
CpG motif that stimulates secretion of cytokines
is there. In the DNA used in the present invention, such CpG
May be included.
【００２０】本発明で用いるＤＮＡの中には、インフル
エンザウイルスのマトリックスプロテインをコードする
塩基配列に加えて、さらにこれとは異なる別の１または
２以上のインフルエンザ抗原をコードする塩基配列を有
していてもよい。そのような別の抗原をコードする塩基
配列の具体例としては、インフルエンザウイルスのヘマ
グルチニン、ニューラミニダーゼまたは核タンパク質を
コードする塩基配列が挙げられる。The DNA used in the present invention has, in addition to the nucleotide sequence encoding the matrix protein of influenza virus, another nucleotide sequence encoding one or more different influenza antigens. You may. Specific examples of the nucleotide sequence encoding such another antigen include a nucleotide sequence encoding influenza virus hemagglutinin, neuraminidase or nucleoprotein.
【００２１】異なる２種以上の抗原をコードする２つ以
上のDNA配列が１つのベクター内に存在する場合、各抗
原をコードするDNA配列の転写がそれぞれに特有の別個
のプロモーターによって指令を受けることができるよう
に、抗原をコードするＤＮＡ配列とプロモーター配列と
をベクター内に配置することができる。あるいは、１つ
のプロモーターが、互いにインフレームで接続された２
以上の抗原をコードするDNA配列の発現を駆動し、融合
タンパク質を発現するように、抗原をコードするＤＮＡ
配列とプロモーター配列とを配置してもよい。プロモー
ターの種類、並びに抗原をコードするＤＮＡ配列とプロ
モーターとの配置関係は当業者により適宜設定すること
ができる。When two or more DNA sequences encoding two or more different antigens are present in one vector, the transcription of the DNA sequence encoding each antigen is directed by a separate promoter unique to each. The DNA sequence encoding the antigen and the promoter sequence can be placed in a vector so that Alternatively, two promoters are connected in frame with each other.
The DNA encoding the antigen is driven so as to drive the expression of the DNA sequence encoding the antigen and express the fusion protein.
The sequence and the promoter sequence may be arranged. The type of the promoter, and the positional relationship between the DNA sequence encoding the antigen and the promoter can be appropriately set by those skilled in the art.
【００２２】本発明で用いるインフルエンザウイルスの
マトリックスプロテインをコードする塩基配列を有する
ＤＮＡは、常法により大量に調製することができる。例
えば、プラスミドＤＮＡである場合には、宿主の細菌に
形質転換し、形質転換体を大量に培養し、培養液からア
ルカリ溶解法などの当業者に周知の技法によりプラスミ
ドＤＮＡを回収することができる。本発明の方法におい
て用いられるDNAは、好ましくは、精製プラスミドDNAで
ある。The DNA having the nucleotide sequence encoding the matrix protein of the influenza virus used in the present invention can be prepared in a large amount by a conventional method. For example, when it is a plasmid DNA, it can be transformed into a host bacterium, the transformant can be cultured in a large amount, and the plasmid DNA can be recovered from the culture solution by a technique well known to those skilled in the art such as an alkali lysis method. . The DNA used in the method of the present invention is preferably a purified plasmid DNA.
【００２３】本発明の別の側面によれば、本発明のイン
フルエンザワクチンを含む医薬組成物が提供される。本
発明の医薬組成物は、本発明のインフルエンザワクチン
と薬学的に許容可能な担体（トランスフェクション試
薬）またはアジュバンドとを含む。本発明の医薬組成物
はインフルエンザの予防または治療のために用いること
ができる。本発明で用いる薬学的に許容可能な担体と
は、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトランスフェクシ
ョンするのに適したものである。このような薬学的に許
容可能な担体の具体例としては、カチオン性リポソー
ム、フルオロカーボンエマルジョン、蝸牛状剤（cochle
ate）、筒状剤（tubule）、金粒子、生体分解性ミクロ
スフェア、あるいはカチオン性ポリマーなどの公知のト
ランスフェクション試薬が挙げられる。当業者はこのよ
うなトランスフェクション試薬を用いて、本発明で用い
るDNAを適宜処方することができる。According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the influenza vaccine of the present invention. The pharmaceutical composition of the present invention comprises the influenza vaccine of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier (transfection reagent) or adjuvant. The pharmaceutical composition of the present invention can be used for preventing or treating influenza. The pharmaceutically acceptable carrier used in the present invention is one suitable for transfecting a DNA vaccine into living cells. Specific examples of such pharmaceutically acceptable carriers include cationic liposomes, fluorocarbon emulsions, cochleates
ate), tubule, gold particles, biodegradable microspheres, or a known transfection reagent such as a cationic polymer. Those skilled in the art can appropriately formulate the DNA used in the present invention using such a transfection reagent.
【００２４】本発明のＤＮＡワクチンを生体に投与する
のに有用なリポソームとしては、市販のリポソーム、あ
るいはカチオン性脂質あるいはカチオン性ポリマーのい
ずれかを含むリポソームなどが挙げられる。本発明の好
ましい実施態様においては、リポソームは、ジオレイル
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）あるいは
コレステロールなどの中性脂質とカチオン性脂質との混
合物を含むリポソームが用いられる。そのようなリポソ
ームの調製方法は当業者に公知である。カチオン性脂質
とは異なり、カチオン性ポリマーはエステル結合を有さ
ず、その結果、インビボにおいて高い安定性を有する。
カチオン性ポリマー（デンドリマーとも称される）の構
造は、鎖状でも環状でもよく、ダイマー、オリゴマーあ
るいはポリマーの何れでもよい。中性脂質を有さない水
溶液中のカチオン性ポリマーもまた、本発明において好
ましく用いることができる。Examples of liposomes useful for administering the DNA vaccine of the present invention to a living body include commercially available liposomes and liposomes containing either a cationic lipid or a cationic polymer. In a preferred embodiment of the present invention, a liposome containing a mixture of a neutral lipid and a cationic lipid such as dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE) or cholesterol is used. Methods for preparing such liposomes are known to those skilled in the art. Unlike cationic lipids, cationic polymers do not have ester linkages and, as a result, have high stability in vivo.
The structure of the cationic polymer (also called a dendrimer) may be linear or cyclic, and may be any of a dimer, an oligomer, or a polymer. A cationic polymer in an aqueous solution having no neutral lipid can also be preferably used in the present invention.
【００２５】ホスファチジルセリン、コレステロール、
およびカルシウムから成る安定なリン脂質カルシウム沈
殿剤である蝸牛状剤は、消化系で存続することができる
非毒性および非炎症性トランスフェクション試薬として
知られている。また、ポリエステルであるポリ（ラクチ
ド−コ−グリコライド）などのポリマーからなる生体分
解性ミクロスフェアを、トランスフェクションのために
DNAをマイクロカプセル化するために用いることができ
る。筒状剤はらせん状に巻かれた二層の脂質からなり、
その縁が合わされてパックされている脂質ベースの微小
筒（microcylinder）として知られている。筒状剤を用
いる場合、DNAは、動物体内に送達および制御放出を行
うための中空中心部に配置することができる。Phosphatidylserine, cholesterol,
Cochlear agents, which are stable phospholipid calcium precipitants consisting of calcium and calcium, are known as non-toxic and non-inflammatory transfection reagents that can persist in the digestive system. In addition, biodegradable microspheres made of a polymer such as polyester (poly (lactide-co-glycolide)) are used for transfection.
It can be used to microencapsulate DNA. Tubular agents consist of two layers of lipid wound in a spiral,
Known as lipid-based microcylinders whose edges are packed together. If a tubular agent is used, the DNA can be placed in a hollow center for delivery and controlled release into the animal.
【００２６】本発明の医薬組成物を調製するために用い
ることができる免疫用アジュバントは当技術分野で周知
である。当業者は、医薬組成物を形成するための適切な
アジュバントを適宜選択することができる。本発明にお
いて好ましく用いられるアジュバントとしては、非メチ
ル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するミョウバンまたはDN
A分子などが挙げられる（ＣｐＧアジュバントとも呼
ぶ）。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴ
ヌクレオチドは、免疫系を活性化することが示されてい
る（A. Kriegら、「細菌性DNAトリガー特異的Ｂ細胞活
性化におけるＣｐＧモチーフ」Nature 374:546-549 (19
95)）。本明細書中上述した通り、ＣｐＧモチーフは、
プラスミドDNAワクチンベクターに挿入することができ
る。そしてＣｐＧは細菌中で複製され、それによりＣｐ
Ｇモチーフが非メチル化形態を維持することが可能にな
る。このような場合、プラスミドベクターにクローニン
グされたＣｐＧアジュバントの投与は、プラスミドDNA
ワクチンの投与と同時である。あるいは、遊離オリゴヌ
クレオチドの形態のＣｐＧアジュバントを、プラスミド
DNAワクチンの投与前、投与中、または投与後に投与す
ることができる。Adjuvants for immunization which can be used to prepare the pharmaceutical compositions of the present invention are well-known in the art. Those skilled in the art can appropriately select an appropriate adjuvant for forming a pharmaceutical composition. The adjuvant preferably used in the present invention is alum or DN having an unmethylated CpG dinucleotide.
A molecule and the like (also called CpG adjuvant). Oligonucleotides with unmethylated CpG dinucleotides have been shown to activate the immune system (A. Krieg et al., "CpG motif in bacterial DNA trigger-specific B cell activation" Nature 374: 546- 549 (19
95)). As described herein above, the CpG motif is
It can be inserted into a plasmid DNA vaccine vector. And CpG is replicated in bacteria, thereby
This allows the G motif to maintain an unmethylated form. In such a case, administration of the CpG adjuvant cloned into the plasmid vector will require plasmid DNA
Simultaneous with administration of vaccine. Alternatively, a CpG adjuvant in the form of a free oligonucleotide is
It can be administered before, during or after administration of the DNA vaccine.
【００２７】ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチ
ドは、安定化のために、ホスホジエステル結合において
必要に応じて改変することができる。このような改変
は、当業者には周知である。例えば、オリゴヌクレオチ
ド中のホスホジエステル結合は、ホスホロチオエート結
合と置換することができる。本発明で用いるＤＮＡは、
受容者の免疫系に影響を与えるタンパク質、アジュバン
ト又は他の物質と結合していないものでもよい。このよ
うな場合、該ポリヌクレオチドは、滅菌塩水又は滅菌緩
衝塩水のような（但し、それには限定されない）生理的
に許容し得る溶液中にあることが望ましい。本発明のワ
クチンは、カプセル剤、懸濁液、エリキシル剤又は溶液
のような任意の投与形態で用いることができる。[0027] Oligonucleotides having a CpG motif can be modified as necessary at the phosphodiester linkage for stabilization. Such modifications are well-known to those skilled in the art. For example, a phosphodiester linkage in an oligonucleotide can be replaced with a phosphorothioate linkage. The DNA used in the present invention is
It may not be bound to proteins, adjuvants or other substances that affect the recipient's immune system. In such cases, it is desirable that the polynucleotide be in a physiologically acceptable solution, such as, but not limited to, sterile saline or sterile buffered saline. The vaccine of the invention can be used in any dosage form such as a capsule, suspension, elixir or solution.
【００２８】本発明の医薬組成物は、本発明のインフル
エンザワクチンとは異なる別の１または２以上のインフ
ルエンザワクチン（本明細書中以下において、第２のワ
クチンとも言う）をさらに含んでいてもよい。第２のイ
ンフルエンザワクチンとしては、例えば、インフルエン
ザウイルスのヘマグルチニン、ニューラミニダーゼおよ
び核タンパク質から成る群から選ばれる少なくとも１種
の抗原に対するワクチンが挙げられる。この場合、例え
ば、インフルエンザマトリックスプロテインとは異なる
別の抗原をコードするDNA配列を、第２のベクターと結
合することによって第２のＤＮＡワクチンを調製し、こ
れを本発明のインフルエンザワクチンと組み合わせて医
薬組成物とすることができる。あるいは、インフルエン
ザマトリックスプロテインとは異なる別の抗原を調製
し、これを第２のワクチンとして（即ち、抗原ベースの
ワクチンとして）用いてもよい。[0028] The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise one or more other influenza vaccines different from the influenza vaccine of the present invention (hereinafter also referred to as a second vaccine). . The second influenza vaccine includes, for example, a vaccine against at least one antigen selected from the group consisting of influenza virus hemagglutinin, neuraminidase and nucleoprotein. In this case, for example, a second DNA vaccine is prepared by ligating a DNA sequence encoding another antigen different from the influenza matrix protein to a second vector, and this is combined with the influenza vaccine of the present invention to obtain a drug. It can be a composition. Alternatively, another antigen different from the influenza matrix protein may be prepared and used as a second vaccine (ie, as an antigen-based vaccine).
【００２９】本発明の別の態様によれば、本発明のイン
フルエンザワクチンと第２のワクチンとは単一の医薬組
成物に配合することなく、それぞれ別個の医薬組成物と
して調製し、同時あるいは逐次的に、好ましくは同時に
被験者に投与することができる。即ち、本発明のインフ
ルエンザワクチンは、本発明のインフルエンザワクチン
とは異なる第２のインフルエンザワクチンと併用するこ
とができる。この場合、本発明のインフルエンザワクチ
ンと第２のインフルエンザワクチンとを含むワクチンキ
ットの形態で提供することもできる。本発明のインフル
エンザワクチンを第２のインフルエンザワクチンと併用
する場合、それらの投与の順番は制限されず、どちらを
先に投与してもよい。また、第２のワクチンは、ＤＮＡ
ワクチンでも抗原ベースのワクチン（すなわち、組換え
タンパク質あるいは全死病原体など）の何れでもよい。
一つの好ましい実施態様においては、第２のワクチンは
抗原ベースのワクチンであり、本発明のインフルエンザ
ＤＮＡワクチンは、抗原ベースの第２のワクチンと同時
に投与される。あるいはまた、別の好ましい実施態様に
おいては、まず、本発明のDNAワクチンを投与して免疫
応答を感作し、次いで、２週間から８週間後に、抗原ベ
ースの第２のワクチンを投与することによって、免疫応
答を高めることができる。According to another aspect of the present invention, the influenza vaccine of the present invention and the second vaccine are prepared as separate pharmaceutical compositions without being combined into a single pharmaceutical composition, and may be prepared simultaneously or sequentially. And preferably simultaneously administered to the subject. That is, the influenza vaccine of the present invention can be used in combination with a second influenza vaccine different from the influenza vaccine of the present invention. In this case, the vaccine can be provided in the form of a vaccine kit containing the influenza vaccine of the present invention and the second influenza vaccine. When the influenza vaccine of the present invention is used in combination with the second influenza vaccine, the order of administration is not limited, and either may be administered first. The second vaccine is DNA
It can be either a vaccine or an antigen-based vaccine (ie, a recombinant protein or a whole dead pathogen).
In one preferred embodiment, the second vaccine is an antigen-based vaccine, and the influenza DNA vaccine of the present invention is administered simultaneously with the second antigen-based vaccine. Alternatively, in another preferred embodiment, a DNA vaccine of the invention is administered to sensitize an immune response, and then two to eight weeks later, a second antigen-based vaccine is administered. , Can enhance the immune response.
【００３０】単回投与量のワクチンＤＮＡを含む製剤を
調製するために担体物質と組み合わせるべきワクチンＤ
ＮＡの量は、一般的には、投与経路および投与方法、用
いる塩基配列および発現ベクターの種類、発現される抗
原タンパク質あるいはペプチドの安定性および活性（免
疫原性）、被験者の性別、年齢、体重、全体的な健康状
態、予防または治療の対象となるインフルエンザの種類
または性質を含む多くの要因に依存する。投与すべきＤ
ＮＡの量はまた、薬学的に許容可能な担体（トランスフ
ェクション試薬）およびアジュバンドの種類および量に
も依存する。Vaccine D to be combined with a carrier substance to prepare a formulation containing a single dose of vaccine DNA
The amount of NA is generally determined by the route and method of administration, the type of base sequence and expression vector used, the stability and activity (immunogenicity) of the expressed antigenic protein or peptide, the sex, age, and body weight of the subject. Depends on a number of factors, including the overall health condition, the type or nature of the flu being prevented or treated. D to be administered
The amount of NA also depends on the pharmaceutically acceptable carrier (transfection reagent) and the type and amount of adjuvant.
【００３１】本発明のインフルエンザワクチンをヒトに
投与する場合、インフルエンザの予防または治療に有効
な量で投与されるが、例えば、１回当たり１０〜１００
０μｇのＤＮＡ用量が有効であると考えられる。一般的
には、免疫学的又は予防学的に有効な用量である１０μ
ｇ〜１０００μｇ、好ましくは約１０〜３００μｇを筋
肉組織に直接投与する。経皮投与、皮下注入、皮内導
入、経皮圧入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静脈内
又は吸入投与、経口投与も可能であり、投与経路は特に
限定されない。また、追加免疫接種を行うことも可能で
ある。When the influenza vaccine of the present invention is administered to humans, it is administered in an amount effective for preventing or treating influenza.
A DNA dose of 0 μg is considered effective. Generally, an immunologically or prophylactically effective dose of 10μ
g to 1000 μg, preferably about 10 to 300 μg, is administered directly to the muscle tissue. Transdermal administration, subcutaneous injection, intradermal introduction, transdermal injection and other administration methods such as intraperitoneal, intravenous or inhalation administration, and oral administration are also possible, and the administration route is not particularly limited. It is also possible to perform booster vaccinations.
【００３２】ワクチンを皮膚から投与する方法は、皮膚
角化層があることが障壁になっているが、尿素酸軟膏に
ＤＮＡワクチンを含ませたり、あるいは薄いＳＤＳの中
に入れたりして、皮膚角化層を破壊することにより効率
的に投与することができる。特に、ＤＮＡワクチンは毒
性あるいは病原性を有さないので、尿素酸あるいはＳＤ
Ｓ等を使用して皮膚の角化層を融解しつつ、ＤＮＡワク
チンが皮膚中に侵入していけば、生体にとって負荷が少
ない臨床上大変有用な方法を提供することができる。経
鼻免疫も小児には負荷が少ないため好ましく、粘膜免疫
あるいは細胞性免疫の両方を高めるので、本発明のイン
フルエンザワクチンを経鼻投与あるいは、経皮投与する
免疫方法は臨床上非常に有用である。In the method of administering the vaccine from the skin, there is a barrier due to the presence of a cornified layer of the skin, but the DNA vaccine is contained in urea ointment, or the skin is put in a thin SDS, and the skin is cut off. It can be administered efficiently by disrupting the keratin layer. In particular, DNA vaccines have no toxicity or pathogenicity, and
If the DNA vaccine penetrates into the skin while melting the cornified layer of the skin using S or the like, a clinically useful method with less burden on the living body can be provided. Nasal immunization is also preferable because it places less burden on children, and enhances both mucosal immunity and cellular immunity. Therefore, the immunization method of intranasal or transdermal administration of the influenza vaccine of the present invention is extremely useful clinically .
【００３３】本発明の特徴の一つは、ＤＮＡをワクチン
として用いる点にある。ＤＮＡによる免疫感作の方がそ
の遺伝子産物による免疫感作よりも、以下の点において
有利である。 （１）第１の利点は、抗原性タンパク質はインビボで合
成され、体液性免疫応答および細胞（細胞傷害性Ｔ細
胞）仲介性免疫応答の両方を惹起する。しかし、生体内
でタンパク質の合成も行う弱毒化生存病原体から成るワ
クチンとは異なり、DNAワクチンは不本意な感染の危険
を有さない。 （２）第２の利点は、抗原ベースのワクチンによる免疫
化と異なり、DNAベースのワクチンは、効果的な免疫応
答を生じさせるための従来のアジュバントの使用を必要
としない。One of the features of the present invention is that DNA is used as a vaccine. Immunization with DNA is more advantageous than immunization with its gene product in the following respects. (1) First, the antigenic protein is synthesized in vivo and elicits both a humoral immune response and a cell (cytotoxic T cell) -mediated immune response. However, unlike vaccines consisting of live attenuated pathogens that also synthesize proteins in vivo, DNA vaccines do not carry the risk of unwilling infection. (2) The second advantage is that, unlike immunization with antigen-based vaccines, DNA-based vaccines do not require the use of conventional adjuvants to generate an effective immune response.
【００３４】（３）第３の利点は、本発明の方法で使用
されるDNAは安価で、そして製造および精製が容易であ
るという点である。 （４）第４の利点は、DNAベースの免疫化はまた、宿主
動物自体の組織内での外来抗原の産生を可能にし、それ
により以下のような利点が得られる。１つ目の利点は、
抗原提示細胞であり得る自己細胞内でのタンパク質の発
現によって、効率的に免疫系に外来抗原を提示すること
である。２つ目の利点は、宿主細胞において発現される
タンパク質の正確な折り畳み、タンパク質修飾、および
ジスルフィド結合が達成されるということである。細菌
または酵母中で合成される組換えウイルスタンパク質を
ワクチンとして使用する場合には、翻訳後、不適切に修
飾される可能性があり、これによりタンパク質の精製が
困難になるか、あるいは非精製形態で投与された場合に
はワクチンとしての効果が弱くなる可能性があるという
問題点があるが、ＤＮＡワクチンを使用する場合にはこ
のような問題点がない。(3) A third advantage is that the DNA used in the method of the present invention is inexpensive and easy to produce and purify. (4) A fourth advantage is that DNA-based immunization also allows for the production of foreign antigens in the tissues of the host animal itself, thereby providing the following advantages. The first advantage is that
Efficient presentation of foreign antigens to the immune system by expression of proteins in autologous cells, which may be antigen presenting cells. A second advantage is that correct folding, protein modification, and disulfide bonds of the protein expressed in the host cell are achieved. When a recombinant viral protein synthesized in bacteria or yeast is used as a vaccine, it may be inappropriately modified after translation, which makes protein purification difficult or unpurified. However, there is a problem that the effect as a vaccine may be weakened when the DNA vaccine is administered, but there is no such a problem when a DNA vaccine is used.
【００３５】[0035]
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は実施例によって限定されることは
ない。 （実施例１） ＜材料および方法＞マウス マウスは雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（４から８週齢）を日本
ＳＬＣ社（静岡、日本）から購入したものを用いて、免
疫化およびウイルス投与試験に用いた。マウスは全て、
無菌の食物および水を自由に摂取させた。ウイルスタンパク質発現プラスミド プラスミドｐＭＥ１８Ｓ Ｍは、インフルエンザＡ／Ｗ
ＳＮ／３３ウイルスの膜タンパク質（membrane protein
(M1)）と組み込み膜タンパク質（integral membrane pr
otein(M2)）の両方をコードするインフルエンザＡ／Ｐ
Ｒ／８ＲＮＡセグメント７のｃＤＮＡの複数のコピーを
含有する。ＰＭＥ１８Ｓ ＮＰは、インフルエンザＡ／
ＷＳＮ／３３ウイルスの核タンパク質をコードする。こ
れらは、名古屋市立大学医学部ウイルス学科のナカジマ
氏により提供された。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples. (Example 1) <Materials and Methods> Mouse BALB / c mice (4 to 8 weeks old) purchased from SLC Japan (Shizuoka, Japan) were used for immunization and virus administration tests. Was. All mice,
Sterile food and water were available ad libitum. The viral protein expression plasmid plasmid pME18SM was used for influenza A / W
Membrane protein of SN / 33 virus
(M1)) and integral membrane pr
otein (M2)) influenza A / P encoding both
Contains multiple copies of the cDNA for R / 8 RNA segment 7. PME18S NP is for influenza A /
It encodes the nucleoprotein of the WSN / 33 virus. These were provided by Nakajima of the Department of Virology, Nagoya City University School of Medicine.
【００３６】ワクチン調製および免疫化方法 カチオン性リポソーム調製法の詳細は既に報告されてい
る（Gao.X., 1991, Biochem Biophys Res Communicatio
n 179, 280-285）。注入前に、０．１５ＭのＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．２）中のＤＮＡプラスミドをリポソーム溶液と２
７：３の容量比で混合した。これらの混合物をボルテッ
クスし、注入した。マウスを２週間隔で３回、経鼻投与
または筋肉内投与により免疫化した。経鼻投与の場合に
は、マウスはジエチルエーテル麻酔下において、１頭当
たりカチオン性リポソームを有する３０μｌの滅菌ＰＢ
Ｓ中の１０ｍｅｇの発現プラスミドＤＮＡを投与するこ
とによって免疫化した。筋肉内投与の場合には、既に報
告されているように、マウスの誹腹筋内にＤＮＡワクチ
ンを注入した。免疫前および３回目の免疫の１週間後に
血液試料を採取した。３回目の免疫の２週間後にＤＴＨ
応答およびＣＴＬアッセイを行った。 Vaccine Preparation and Immunization Methods Details of the preparation of cationic liposomes have already been reported (Gao. X., 1991, Biochem Biophys Res Communicatio).
n 179, 280-285). Prior to injection, 0.15 M PBS (p
H7.2) DNA plasmid in liposome solution
The mixture was mixed at a volume ratio of 7: 3. These mixtures were vortexed and injected. Mice were immunized intranasally or intramuscularly three times at two week intervals. For nasal administration, mice were treated with 30 μl of sterile PB with cationic liposomes per animal under diethyl ether anesthesia.
Immunization was performed by administering 10 meg of expression plasmid DNA in S. In the case of intramuscular administration, the DNA vaccine was injected into the abdominal muscle of mice as previously reported. Blood samples were taken before immunization and one week after the third immunization. DTH two weeks after the third immunization
Response and CTL assays were performed.
【００３７】ウイルス インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスは国立衛生研
究所の微生物学科のナカジマ氏から提供された。インフ
ルエンザＡ／ＰＲ／８ウイルスは、田代真人博士（国立
予防衛生研究所ウイルス第一部）から提供された。ウイ
ルスは感染したＭＤＣＫ細胞から回収し、プラーク法で
力価を測定した。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイ
ルスの力価は×１０7ＰＦＵ／μＬであり、インフルエ
ンザＡ／ＰＲ／８ウイルスの力価は×１０7ＰＦＵ／μ
Ｌであった。 Virus Influenza A / WSN / 33 virus was provided by Nakajima, Department of Microbiology, National Institutes of Health. Influenza A / PR / 8 virus was provided by Dr. Masato Tashiro (National Institute of Health). Virus was recovered from infected MDCK cells and titered by plaque assay. The titer of the influenza A / WSN / 33 virus is a × 10 7 PFU / μL, the titer of the influenza A / PR / 8 virus × 10 7 PFU / μ
L.
【００３８】組み換えタンパク質およびペプチド ｐＭＥ１８Ｓ−ＭおよびｐＭＥ１８ｓ−ＮＰからのイン
フルエンザＭおよびＮＰタンパク質をコードするＤＮＡ
を、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ−３
Ｘ（Pharmacia Biotech）にダイレクトクローニングに
よって挿入した。ＰＧＥＸ−ｉｎｆＭおよびＮＰは、大
腸菌ＪＭ１０１に形質転換した。精製したｉｎｆＭおよ
びＮＰ融合タンパク質を細菌発現システムによって得
た。ＣＴＬアッセイに用いるペプチドとして、ＮＰの配
列はＴＹＱＲＴＲＡＬＶ、Ｍペプチドの配列は、ＹＲＫ
ＥＱＱＮＡＶＤＶＤＤを使用した。これらは、酸性また
は塩基性のアミノ酸がリッチな配列を主に合成し、使用
した。純度は９５％以上である。DNA encoding influenza M and NP proteins from recombinant proteins and peptides pME18S-M and pME18s-NP
Was amplified by PCR. Transfer the PCR product to pGEX-3
X (Pharmacia Biotech) by direct cloning. PGEX-infM and NP were transformed into E. coli JM101. Purified infM and NP fusion proteins were obtained with a bacterial expression system. As the peptides used for the CTL assay, the sequence of NP was TYQRTRALV, and the sequence of M peptide was YRK.
EQQNAVDVDD was used. These were mainly synthesized and used for sequences rich in acidic or basic amino acids. Purity is above 95%.
【００３９】抗原特異的抗体および全ＩｇＧ、Ｍを用い
るＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡは既に報告されている通り行った。血液試料
を免疫前および三回目の免疫の１週間後に回収し、−４
０℃で保存した。１０μｇ／ｍｌの組み換えＭまたはＮ
Ｐタンパク質を９６マイクロウエルプレート（Nunc, Ro
skilde, Denmark）上にコートし、ウエルをブロッキン
グ溶液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で処理した。連続的に希
釈した試料血清を添加し、３７℃で２時間反応させた。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄した後、ウエ
ルを二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）で処理した。特異
的抗体力価を検出可能な最大希釈率の反比例値として表
し、これにより各々の免疫前試料と比較した場合に≧
０．２ＯＤ単位のＯＤ415が得られた。全ＩｇＧおよび
Ｍは同じ試料を用いて測定した。プレートに抗マウス普
遍Ｉｇ抗体をコートしたものを使用した。全ＩｇＧおよ
びＭ抗体力価は、既知の希釈率の高力価抗血清を用いて
作成した標準曲線との比較により測定した。Using an antigen-specific antibody and whole IgG, M
ELISA ELISA was performed as previously reported. Blood samples were collected before immunization and one week after the third immunization,
Stored at 0 ° C. 10 μg / ml recombinant M or N
P protein was transferred to a 96-microwell plate (Nunc, Ro
skilde, Denmark) and the wells were treated with a blocking solution (1% BSA in PBS). Serially diluted sample serum was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
After washing with 0.05% Tween 20 / PBS, the wells were treated with a secondary antibody (anti-mouse IgG antibody). The specific antibody titer is expressed as the inverse of the maximum detectable dilution, whereby when compared to each pre-immune sample ≧
An OD 415 of 0.2 OD units was obtained. Total IgG and M were measured using the same sample. A plate coated with an anti-mouse universal Ig antibody was used. Total IgG and M antibody titers were determined by comparison to a standard curve generated using high titer antisera at known dilutions.
【００４０】中和化試験 Nasser他が記載しているように（Nasser, EH, 1996, J.
Virol., 70(12), 8639-44）、マイクロタイタープレー
トにウエル当たり１０4ＭＤＣＫ細胞を接種した。３７
℃で１０％胎児ウシ血清を含有する増殖培地中で４８時
間かけて単層を成長させ、７５％以上のコンフルエンシ
ーに達した。ウエルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
で洗浄し、ＭＥＭ中に異なる濃度の血清試料を含む５０
μｌの溶液と一緒にインキュベートし、０．２％ウシ血
清アルブミンを含むＰＢＳで希釈した５０μｌのインフ
ルエンザＡ／ＰＲ／８／３４を接種した。ウイルスを添
加した３０分後に、１ｍ１当たり２μｇのトリプシンを
含む１００μｌのＭＥＭを添加した。さらに４８時間
後、単層をクリスタルバイオレットで染色し、ＣＰＥを
試験した。 Neutralization Test As described by Nasser et al. (Nasser, EH, 1996, J.
Virol., 70 (12), 8639-44), were inoculated with 10 4 MDCK cells per well in microtiter plates. 37
Monolayers were grown at 48 ° C. in growth medium containing 10% fetal calf serum over 48 hours to reach a confluency of 75% or more. Wells in phosphate buffered saline (PBS)
With different concentrations of serum samples in MEM
Incubated with μl of solution and inoculated with 50 μl of influenza A / PR / 8/34 diluted in PBS containing 0.2% bovine serum albumin. Thirty minutes after virus addition, 100 μl MEM containing 2 μg trypsin per ml was added. After a further 48 hours, the monolayer was stained with crystal violet and tested for CPE.
【００４１】遅延型過敏応答 ＤＴＨ反応は、既に報告されているフットパッド膨潤試
験法を用いて分析した。三回目の免疫の２週間後に、マ
ウスの各々のフットパッドに不活化インフルエンザＡ／
ＰＲ／８またはＡ／ＷＳＮ／３８を４０μｇ注入した。
２４時間後、フットパッド膨潤の広がりを、ピーコック
ダイアル厚さゲージ（オザキ社、東京、日本）を用いて
注入前および注入後のフットパッドの厚さの差として測
定した。コントロールマウスにはマッコウクジラのミオ
グロビンを注入した。 Delayed type hypersensitivity response The DTH reaction was analyzed using the previously reported footpad swelling test method. Two weeks after the third immunization, inactivated influenza A /
40 μg of PR / 8 or A / WSN / 38 were injected.
Twenty-four hours later, the extent of footpad swelling was measured as the difference in footpad thickness before and after injection using a Peacock dial thickness gauge (Ozaki, Tokyo, Japan). Control mice were injected with sperm whale myoglobin.
【００４２】ＣＴＬアッセイ 免疫化マウスおよび未処理マウスから単離した脾臓細胞
を、ＩｎｆＮＰまたはＩｎｆＭ１ペプチドをパルスした
放射同質遺伝子脾臓細胞の存在下で５日間培養した。６
時間クロム放出アッセイにおいてＩｎｆＮＰまたはＩｎ
ｆＭ１ペプチドをパルスしたＰ８１５マストロサイトー
マ細胞（Ｈ−２ｄ）のエフェクター細胞に仲介された溶
解によってＣＴＬ活性を測定した。Ｅ／Ｔ比率は、５：
１〜８０：１であった。特異的51Ｃｒ放出の百分率は、 １００×（実験による放出−自発による放出）／（最大
放出−自発放出） として計算した。 CTL assay Spleen cells isolated from immunized and untreated mice were cultured for 5 days in the presence of radioisotope spleen cells pulsed with InfNP or InfM1 peptide. 6
InfNP or In in a time chromium release assay
CTL activity was measured by effector cell-mediated lysis of P815 mastrocytoma cells (H-2d) pulsed with the fM1 peptide. The E / T ratio is 5:
1-80: 1. The percentage of specific 51 Cr release was calculated as 100 × (experimental release−spontaneous release) / (maximum release−spontaneous release).
【００４３】ウイルス投与 ジエチルエーテル麻酔下において、２４−Ｇａｕｇｅ動
物フィーディングステンレススチール（Popper）を用い
てインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルス（８０μｌ
中４．６×１０6ＰＦＵ）を気管内投与によって同時に
感染させた。 Virus administration Under diethyl ether anesthesia, influenza A / WSN / 33 virus (80 μl) was prepared using 24-Gauge animal feeding stainless steel (Popper).
4.6 × 10 6 PFU) were simultaneously infected by intratracheal administration.
【００４４】サイトカインＥＬＩスポットアッセイ サイトカインＥＬＩスポットアッセイは既に報告されて
いる通り行った（Shirai, 1993, J.Immunol. 150(3), 7
93-799）。三回目の免疫の７日後に、細胞を脾臓、気管
近傍、鼡径部、または大動脈近傍リンパ節から単離し
た。５×１０6細胞／ウエルから始まる単一の細胞懸濁
物の連続的な３倍ずつの希釈物を、１０μｇ／ｍｌのＲ
１０Ｉの存在下または非存在下において５％ＣＯ2、３
７℃で１２時間インキュベートした。スポットを各ウエ
ルで計測し、希釈率を使用して、１試料当たりのサイト
カイン分泌細胞の総数を計算した。データ分析 値は全て平均値±ＳＥＭで表した。実験データおよびコ
ントロールの統計分析はtwo-tailed Studentのｔ試験ま
たはone-way ANOVAを用いて行った。 Cytokine ELI spot assay The cytokine ELI spot assay was performed as previously described (Shirai, 1993, J. Immunol. 150 (3), 7).
93-799). Seven days after the third immunization, cells were isolated from spleen, paratracheal, inguinal, or paraaortic lymph nodes. Serial three-fold dilutions of a single cell suspension starting from 5 × 10 6 cells / well were added to 10 μg / ml R
5% CO 2 in the presence or absence of 10I, 3
Incubated at 7 ° C for 12 hours. Spots were counted in each well and the dilutions were used to calculate the total number of cytokine secreting cells per sample. All data analysis values were expressed as mean ± SEM. Statistical analysis of experimental data and controls was performed using a two-tailed Student t-test or one-way ANOVA.
【００４５】＜結果＞血清中の抗原特異的抗体ＥＬＩＳＡの結果 血液試料は三回目の免疫の７日後に回収した。死滅した
ＡＰＲ／８ウイルスに対する抗体力価をＥＬＩＳＡで分
析した。得られた結果を以下の表１に示す。<Results> Results of antigen-specific antibody ELISA in serum Blood samples were collected 7 days after the third immunization. Antibody titers against the killed APR / 8 virus were analyzed by ELISA. The results obtained are shown in Table 1 below.
【００４６】[0046]
【表１】 [Table 1]
【００４７】Ｍタンパク質特異的なＩｇＧに関しては、
ｐＭＥ１８ＳｉｎｆＭの筋肉内投与および経鼻投与にお
いて、９．２５および８．７とそれぞれ抗原特異的抗体
の誘導が示された。一方、ＣＦＡと不活化インフルエン
ザウイルスをｉｐ投与した場合には、１３．６と非常に
高い値を示した。同様に、ｐＭＥ１８ＳｉｎｆＮＰに関
しては、ＮＰの筋肉投与および経鼻投与で高い抗体価が
認められた。全ＩｇＧ及びＩｇＭに関しては、不活化イ
ンフルエンザウイルスとＣＦＡをｉｐした群において非
常に高い値が認められた。これに対してＤＮＡワクチン
を筋肉内投与または経鼻投与した群においては、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭとも中程度の抗体産生であった。For IgG specific to the M protein,
Intramuscular and nasal administration of pME18SinfM showed induction of antigen-specific antibodies at 9.25 and 8.7, respectively. On the other hand, when CFA and inactivated influenza virus were administered by ip, a very high value of 13.6 was shown. Similarly, for pME18SinfNP, a high antibody titer was observed in the intramuscular and intranasal administration of NP. With respect to total IgG and IgM, very high values were observed in the group in which inactivated influenza virus and CFA were ip. In contrast, in the group to which the DNA vaccine was intramuscularly or intranasally administered,
Both G and IgM produced moderate antibody production.
【００４８】インフルエンザ抗原に対するフットパッド
膨潤応答 ３回目の免疫の２週間後に不活化インフルエンザウイル
スをフットパッドに注入し、その反応の結果を測定し
た。結果を表２に示す。Footpad against influenza antigen
Swelling response Two weeks after the third immunization, inactivated influenza virus was injected into the footpad and the results of the reaction were measured. Table 2 shows the results.
【００４９】[0049]
【表２】 [Table 2]
【００５０】表２から分かるように、ｐＭＥ１８Ｓ Ｍ
の筋肉内投与および経鼻投与においては、コントロール
と比較して、有意に膨潤応答が認められた。ＮＰタンパ
ク質に関しても同様の膨潤応答が認められた。これに対
し、ＣＦＡプラス不活性化ＰＲ８に関しても膨潤応答が
認められた。一方、コントロールとして免疫したミオグ
ロビンタンパク質は免疫した群に対してのみミオグロビ
ン特異的フットパッド膨潤が認められた。As can be seen from Table 2, pME18SM
In the case of intramuscular administration and intranasal administration of swelling, a significant swelling response was observed as compared with the control. A similar swelling response was observed for the NP protein. In contrast, a swelling response was also observed for CFA plus inactivated PR8. On the other hand, myoglobin protein immunized as a control showed myoglobin-specific footpad swelling only in the immunized group.
【００５１】中和化試験 中和化試験の結果を表３に示す。[0051] Table 3 shows the results of neutralization test neutralization test.
【００５２】[0052]
【表３】 [Table 3]
【００５３】ＣＴＬアッセイ ＣＴＬアッセイは、３回免疫したマウスの脾臓細胞を取
り出し、標的としてＭペプチドをパルスしたＰ８１５細
胞を用いた。ＣＴＬアッセイの結果は図１に示す。図１
から分かるように、陽性コントロールであるＰＲ８に感
染したマウスより取り出した脾臓細胞に関しては非常に
高いＣＴＬ値を示した。これに対し、Ｍ、ＮＰタンパク
質を使用したＤＮＡプラスミドを経鼻および筋肉内投与
した群に関しても同様に、５０〜６０％程度の免疫の反
応が認められた。これに対し、不活性化ＰＲ８ウイルス
と一緒のＣＦＡをｉ．ｐ．投与した群に関しては３０％
程度の比較的低い値を示した。これらの結果から、イン
フルエンザＭまたはＮＰ発現プラスミドは高レベルのＣ
ＴＬ応答を含むことが結論付けられた。 CTL Assay In the CTL assay, spleen cells of a mouse immunized three times were removed, and P815 cells pulsed with M peptide as a target were used. The results of the CTL assay are shown in FIG. FIG.
As can be seen from the figure, spleen cells extracted from mice infected with the positive control PR8 showed very high CTL values. On the other hand, about 50 to 60% of immunity reactions were similarly observed in the groups to which the DNA plasmid using the M and NP proteins was intranasally and intramuscularly administered. In contrast, CFA with inactivated PR8 virus was administered i.p. p. 30% for the treated group
The value was relatively low. These results indicate that the influenza M or NP expression plasmid has high levels of C
It was concluded that it contained a TL response.
【００５４】サイトカインＥＬＩスポットアッセイ ＥＬＩスポットアッセイを脾臓および各リンパ節につい
て行った結果を表４に示す。 Cytokine ELI spot assay The results of the ELI spot assay performed on the spleen and each lymph node are shown in Table 4.
【００５５】[0055]
【表４】 [Table 4]
【００５６】表４の結果から分かるように、経鼻免疫で
はＭＡＬＴを中心の分布が確認され、筋肉内投与におい
ては大腿リンパ節に抗原特異的リンパ球が集積してい
た。As can be seen from the results in Table 4, the distribution centered on MALT was confirmed in the nasal immunization, and the antigen-specific lymphocytes accumulated in the femoral lymph nodes in the intramuscular administration.
【００５７】ＷＳＮおよびＰＲ８ウイルス投与 ＷＳＮウイルスおよびＰＲ８について、５倍のＬＤ５０
で経鼻投与し、その結果をまとめた。得られた結果を図
２および図３に示す。Ｍの経鼻投与群においては、ＷＳ
Ｎの投与において非常に高い８０％という生存率であっ
た。これに対し、ＣＦＡＷＳＮに関しては３０％前後と
比較的低い生存率であった。コントロール群に関しては
全ての死亡を確認した。ＰＲ８の感染の実験に関して
は、Ｍにおいてやや高い傾向がみられ、６０％程度の生
存率が認められた。これに対し、ＣＦＡアジュバンドお
よびコントロールに関しては、ほとんど全てが死亡し
た。 WSN and PR8 Virus Administration A 5-fold LD50 for WSN virus and PR8
And the results were summarized. The obtained results are shown in FIGS. In the nasal administration group of M, WS
There was a very high 80% survival rate with the administration of N. In contrast, CFAWSN had a relatively low survival rate of around 30%. All deaths were confirmed in the control group. Regarding the experiment of infection with PR8, a tendency was found to be slightly higher in M, and a survival rate of about 60% was observed. In contrast, almost all of the CFA adjuvant and control died.
【００５８】（実施例２） ＜材料および方法＞実験動物 雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を日本ＳＬＣ社
（静岡、日本）から購入し、無菌食物および水を自由に
摂取させて飼育した。(Example 2) <Materials and Methods> Experimental BALB / c mice (6-8 weeks old) were purchased from SLC Japan (Shizuoka, Japan), and sterile foods and water were ingested freely. Bred.
【００５９】ウイルスタンパク質発現プラスミド及び抗
体 ｐＭＥ１８Ｓ−Ｍ及びｐＭＥ１８Ｓ−ＮＰ発現プラスミ
ドは、ｐＭＥ１８Ｓ発現ベクター（Casares, S. et a
l., 1997, J. Exp.Med. 186, 1481-1486）とインフルエ
ンザＤＮＡを用いて構築した。インフルエンザ株Ａ／Ｐ
Ｒ／８／３４由来のＭ及びＮＰ領域をｐＭＥ１８Ｓ中に
別々に挿入した。蛋白質の発現はウエスタンブロットに
より確認した。Ａ／ＰＲ／８／３４株のＮＰ遺伝子のＤ
ＮＡワクチン（Ａ／ｐＣＭＶ−Ｖ１ＮＰ）はC.Bona, M
t.Sinai Hospital, NY1から提供された。抗ＨＡ（Ｃ１
７９）及び抗−Ｍモノクローナル抗体（Ｃ１１１）はタ
カラバイオメディカル社（東京、日本）から購入した。 Viral Protein Expression Plasmid and Anti-
The pME18S-M and pME18S-NP expression plasmids were constructed using the pME18S expression vector (Casares, S. et a).
l., 1997, J. Exp. Med. 186, 1481-1486) and influenza DNA. Influenza strain A / P
The M and NP regions from R / 8/34 were inserted separately into pME18S. Protein expression was confirmed by Western blot. D of NP gene of A / PR / 8/34 strain
NA vaccine (A / pCMV-V1NP) is available from C. Bona, M.
Courtesy of t.Sinai Hospital, NY1. Anti-HA (C1
79) and anti-M monoclonal antibody (C111) were purchased from Takara Biomedical (Tokyo, Japan).
【００６０】リポソームの調製 クロロホルム中の３β［Ｎ−（Ｎ７’，Ｎ７’−ジメチ
ルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ
−Ｃｈｏｌ）及びジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＯＰＥ）の混合物を乾燥し、真空乾燥し、
滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）に再懸濁した。水
和した後、分散物を超音波処理し、平均粒径１５０から
２００ｎｍを有するリポソームを形成した（Casares,
S. et al., 1997, J. Exp.Med. 186, 1481-1486；Chen,
Z et al., 1999, Vaccine 17, 653-659；及びToda, S.
et al., 1997, Immunology 92, 111-117）。塗布前に、
０．１５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の適量のＤＮＡ
プラスミドを１７：３の体積比で上記リポソーム溶液と
混合した。これらの混合物をボルテックスし、露出した
皮膚に塗布した。Preparation of liposome 3β [N- (N7 ′, N7′-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DC
-Chol) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) are dried, vacuum dried,
Resuspended in sterile HEPES buffer (pH 7.8). After hydration, the dispersion was sonicated to form liposomes with an average particle size of 150 to 200 nm (Casares,
S. et al., 1997, J. Exp. Med. 186, 1481-1486; Chen,
Z et al., 1999, Vaccine 17, 653-659; and Toda, S.
et al., 1997, Immunology 92, 111-117). Before application
Appropriate amount of DNA in 0.15 ml PBS (pH 7.2)
The plasmid was mixed with the liposome solution in a 17: 3 volume ratio. These mixtures were vortexed and applied to the exposed skin.
【００６１】ワクチン調製および動物の処理 経鼻（i.n.）（Shirai, A et al., 1993, J.Immunol. 1
50, 793）及び筋肉内（i.m.）（Okada,E et al., 1997,
J.Immunol. 159, 3638-3647）投与の詳細は既報の通り
行った。局所投与（t.a.）は以下の通り行った。マウス
（６〜８週齢）はネンブタール（ネンブタールナトリウ
ム溶液、Abbott Laboratories, NorthChicago, Illinoi
s, U.S.A.）で麻酔した。背中の全毛髪を剥がし、７０
％エタノールで消毒した。次に、即効性接着剤（AlonAl
fa, TOA,日本）をガラススライド上に塗り、約０．５ｃ
ｍ2を覆い、腰部付近のマウスの背中にくっつけた。２
０〜３０秒後に、スライドを剥ぎ取り皮膚のケラチン層
を除去した。２０〜３０μｌの生理食塩水に溶解した１
０〜１００μｇのＤＮＡ発現プラスミドの溶液を新たに
露出した皮膚領域に塗布し、免疫を行った。この操作は
実験の０日目、７日目及び１４日目に行った。また、毛
髪又は表皮ケラチン細胞を除去することなくＤＮＡワク
チンを塗布する実験も行った（Lamb,R.A. et al., 198
1, Virology112, 746-751）。 Vaccine Preparation and Animal Treatment Nasal (in) (Shirai, A et al., 1993, J. Immunol. 1
50, 793) and intramuscular (im) (Okada, E et al., 1997,
J. Immunol. 159, 3638-3647) The details of administration were as described previously. Local administration (ta) was performed as follows. Mice (6-8 weeks old) were treated with Nembutal (Nembutal sodium solution, Abbott Laboratories, NorthChicago, Illinoi)
s, USA). Remove all hair from back, 70
Disinfected with% ethanol. Next, a quick-acting adhesive (AlonAl
fa, TOA, Japan) on a glass slide, about 0.5c
m 2 and attached to the back of the mouse near the waist. 2
After 0-30 seconds, the slide was stripped off and the keratin layer of the skin was removed. 1 dissolved in 20-30 μl of physiological saline
A solution of 0-100 μg of the DNA expression plasmid was applied to the newly exposed skin area to immunize. This operation was performed on days 0, 7, and 14 of the experiment. An experiment was also performed in which a DNA vaccine was applied without removing hair or epidermal keratinocytes (Lamb, RA et al., 198).
1, Virology112, 746-751).
【００６２】試料の回収 免疫の前、及び最後の接種から７日目に、血液および糞
抽出物を抗体測定のために採取した（Bukawa,H et al.,
1995, Nat.Med. 1, 681-685; Clerici,M et al., 199
1, J.Immunol. 146, 2214-2219;及び Davis,H.L. et a
l., 1993, Hum.Mol.Genet. 2, 1847-1851）。血液は、
マウスをイソフルランで麻酔しつつ、ヘパリン化したNa
telsonキャピラリーチューブ（Baxter Healthcare Corp
oration, McGaw Park, IL）を用いて眼窩後方血管叢か
ら回収した。糞抽出物の試料は既報の通り調製した（Da
vis,H.L. et al., 1993, Hum.Mol.Genet. 2, 1847-185
1）。簡単に説明すると、１００ｍｇの糞ペレットを１
ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と混合した後、試料
をボルテックスし、１５分間静置し、全物質が均一に懸
濁するまで再撹拌し、１２，０００ｒｐｍで遠心した。
上清を回収しアッセイに使用するまで２０℃で保存し
た。 Sample collection Blood and fecal extracts were collected prior to immunization and seven days after the last inoculation for antibody determination (Bukawa, H et al.,
1995, Nat.Med. 1, 681-685; Clerici, M et al., 199
1, J. Immunol. 146, 2214-2219; and Davis, HL et a.
l., 1993, Hum. Mol. Genet. 2, 1847-1851). Blood is
Heparinized Na while anesthetizing mice with isoflurane
telson capillary tube (Baxter Healthcare Corp
oration, McGaw Park, IL). Fecal extract samples were prepared as previously reported (Da
vis, HL et al., 1993, Hum. Mol. Genet. 2, 1847-185
1). Briefly, a 100 mg fecal pellet is added to one
After mixing with ml of phosphate buffered saline (PBS), the sample was vortexed, allowed to stand for 15 minutes, re-mixed until all the material was uniformly suspended, and centrifuged at 12,000 rpm.
Supernatants were collected and stored at 20 ° C until used in the assay.
【００６３】ウイルス マウスに適合したインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４
（Ｈ１Ｎ１）を本実施例で使用した。ウイルスは感染し
たMadin-Darby canine 腎臓（ＭＤＣＫ）細胞から回収
し、プラーク形成法で力価を測定した。Influenza A / PR / 8/34 adapted to viral mice
(H1N1) was used in this example. Virus was recovered from infected Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and titered by plaque formation.
【００６４】組み換えタンパク質およびペプチド インフルエンザＭおよびＮＰ遺伝子のほぼ全長をコード
するＤＮＡフラグメントを、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｍおよびｐ
ＭＥ１８ｓ−ＮＰからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
により増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharma
cia Biotech）にダイレクトクローニングにより挿入し
た。ｐＧＥＸ−ＭおよびｐＧＥＸ−ＮＰを大腸菌ＪＭ１
０１に形質転換した。精製したインフルエンザＭ蛋白質
およびＮＰ蛋白質を細菌発現システムにより得た。ＣＴ
Ｌアッセイを行う際には、ＮＰ蛋白質としてペプチドＴ
ＹＱＲＴＲＡＬＶを、Ｍ１蛋白質としてペプチドＫＡＶ
ＫＬＹＲＫＬＫＲＥを、Ｍ２蛋白質としてペプチドＹＲ
ＫＥＱＱＳＡＶＤＡＤＤを使用した。ペプチドはペプチ
ド合成機（Shimazu Corp., 東京、日本）で合成した。
これらのペプチドは塩基性及び酸性アミノ酸の両方を含
む（Atassi, M.Z. 1975, Immunochem. 12, 423-438）。 Recombinant proteins and peptides DNA fragments encoding almost the full length of the influenza M and NP genes were constructed using pME18S-M and pME18S-M.
Polymerase chain reaction (PCR) from ME18s-NP
Amplified by The PCR product was transferred to pGEX-3X (Pharma
cia Biotech) by direct cloning. pGEX-M and pGEX-NP were transformed into E. coli JM1
01. Purified influenza M and NP proteins were obtained with a bacterial expression system. CT
When performing the L assay, the peptide T was used as the NP protein.
Using YQTRALV as M1 protein and peptide KAV
KLYRKLKRE is converted to peptide YR as M2 protein.
KEQQSAVDADD was used. Peptides were synthesized on a peptide synthesizer (Shimazu Corp., Tokyo, Japan).
These peptides contain both basic and acidic amino acids (Atassi, MZ 1975, Immunochem. 12, 423-438).
【００６５】ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体アッセイ ＥＬＩＳＡは既に報告されている通り行った（Okada,E
et al., 1997, J.Immunol. 159, 3638-3647；及びOkud
a,K et al., 1995, AIDS Res. Hum. Retrov. 11, 933-9
43）。１０μｇ／ｍｌの組み換えＭ、ＮＰタンパク質又
はマッコウクジラミオグロビン（Okuda,K et al., 197
9, J.Immunol. 123, 182-188）、並びに５μｇ／ｍｌの
Ｍ１、Ｍ２及びＮＰ合成ペプチドを９６ウエルプレート
（Nunc,Roskilde, Denmark）上にコートし、ウエルをブ
ロッキング溶液（ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ））で処理した。連続的に希釈した試料血清を添加
し、３７℃で２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳで洗浄した後、ウエルをセイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ph
arMingen, San Diego, CA）で処理した。糞ＩｇＡ抗体
の検出のためには、抗マウスＩｇＡ及びＨＲＰ−標識抗
−ヤギＩｇＧ抗体（Sigma）を各々二次抗体及び三次抗
体として使用した。特異的抗体力価を検出可能な最大希
釈率の反比例値として表し、これにより各々の免疫前試
料と比較した場合に≧０．２ＯＤ単位のＯＤ415が得ら
れた。 Antigen specific antibody assay by ELISA ELISA was performed as previously reported (Okada, E
et al., 1997, J. Immunol. 159, 3638-3647; and Okud
a, K et al., 1995, AIDS Res.Hum.Retrov. 11, 933-9
43). 10 μg / ml recombinant M, NP protein or sperm whale myoglobin (Okuda, K et al., 197
9, J. Immunol. 123, 182-188) and 5 μg / ml of M1, M2 and NP synthetic peptides were coated on 96-well plates (Nunc, Roskilde, Denmark) and the wells were blocked with blocking solution (1% in PBS). Bovine serum albumin (B
SA)). Serially diluted sample serum was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. 0.05% Tween
After washing with 20 / PBS, the wells were washed with horseradish peroxidase (HRP) labeled anti-mouse IgG antibody (Ph
arMingen, San Diego, CA). For detection of fecal IgA antibodies, anti-mouse IgA and HRP-labeled anti-goat IgG antibodies (Sigma) were used as secondary and tertiary antibodies, respectively. Specific antibody titers were expressed as the inverse of the maximum detectable dilution, which gave an OD 415 of ≧ 0.2 OD units when compared to each pre-immune sample.
【００６６】サイトカインのアッセイ 鼠径リンパ腺又は膝窩リンパ腺からの２００万個のリン
パ球を、照射（３０Ｇｙ）した５μｇのＭペプチド（Ｋ
ＡＶＫＬＹＲＫＬＫＲＥ）の存在下でインビトロで再刺
激した。２４時間後、培養上清中のＩＬ−４をＩＬ−４
特異的ＥＬＩＳＡで定量した。ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡで
は、上清を回収し、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｂ
ＶＤ６−１０１１（抗ＩＬ−４、PharMingen, San Dieg
o, CA）を補足剤として使用した。次いで、ＢＶＤ６−
２４Ｇ２−ビオチン（PharMingen）をビオチニル化発色
抗体として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡでは、４
８時間培養物の上清を回収し、モノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）、Ｒ４−６Ａ２（抗ＩＦＮ−γ）を補足剤として
使用した。ＸＭＧ１．２−ビオチン（PharMingen）も使
用した。アビジン結合アルカリホスファターゼを発色ア
ッセイ（Shirai, Aet al., 1994, Cytokine, 6, 329-33
6）で使用して、結合した二次抗体およびヒトサイトカ
インの存在を検出した。リンフォカインの濃度は組換え
マウスＩＦＮ−γ又はＩＬ−４（共にPharMingenから）
について作製した標準曲線を用いて測定した。 Assay of cytokines 2 million lymphocytes from inguinal or popliteal lymph glands were irradiated (30 Gy) with 5 μg of M peptide (K
(AVKLYRKLKRE) in vitro. After 24 hours, IL-4 in the culture supernatant was replaced with IL-4.
It was quantified by specific ELISA. In the IL-4 ELISA, the supernatant was collected and the monoclonal antibody (mAb), B
VD6-1011 (anti-IL-4, PharMingen, San Dieg
o, CA) was used as a supplement. Then, BVD6-
24G2-biotin (PharMingen) was used as a biotinylated chromogenic antibody. In the IFN-γ ELISA, 4
The supernatant of the 8-hour culture was collected, and the monoclonal antibody (m
Ab), R4-6A2 (anti-IFN-γ) was used as a supplement. XMG1.2-biotin (PharMingen) was also used. Avidin-conjugated alkaline phosphatase was assayed using a colorimetric assay (Shirai, Aet al., 1994, Cytokine, 6, 329-33
Used in 6) to detect the presence of bound secondary antibodies and human cytokines. The concentration of lymphokine was determined by recombinant mouse IFN-γ or IL-4 (both from PharMingen)
Was measured using a standard curve prepared for
【００６７】遅延型過敏（ＤＴＨ）応答 ＤＴＨ応答は、既に報告されているフットパッド膨潤試
験法を用いて分析した（Ishii, N et al., 1997, AIDS
Res. Hum. Retrov. 13, 1421-1428;及びOkuda,K et a
l., 1995, AIDS Res. Hum. Retrov. 11, 933-943）。三
回目の免疫の２週間後に、マウスの各々のフットパッド
に熱不活化インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４またはＡ
／ＷＳＮ／３３を約２μｇ注入した。２４時間後、フッ
トパッド膨潤の広がりを、ピーコックダイアル厚さゲー
ジ（オザキ社、東京、日本）を用いて注入前および注入
後のフットパッドの厚さの差として測定した。コントロ
ールマウスにはマッコウクジラミオグロビンを注入し
た。 Delayed Type Hypersensitivity (DTH) Response The DTH response was analyzed using the previously reported footpad swelling test (Ishii, N et al., 1997, AIDS).
Res. Hum. Retrov. 13, 1421-1428; and Okuda, K et a
l., 1995, AIDS Res. Hum. Retrov. 11, 933-943). Two weeks after the third immunization, heat-inactivated influenza A / PR / 8/34 or A
/ WSN / 33 was injected at approximately 2 μg. Twenty-four hours later, the extent of footpad swelling was measured as the difference in footpad thickness before and after injection using a Peacock dial thickness gauge (Ozaki, Tokyo, Japan). Control mice were injected with sperm whale myoglobin.
【００６８】ＣＴＬアッセイ 脾臓細胞を非免疫マウスから回収した。非免疫マウスは
陰性コントロールとして使用した。約１×１０6個のリ
ンパ細胞を、ＮＰ１、Ｍ１又はＭ２ペプチドでパルスし
た同質遺伝子脾臓細胞でインビトロで再刺激した。５日
間培養後、これらの脾臓細胞の細胞毒活性をペプチドパ
ルスした標的細胞を用いる６時間５１Ｃｒ放出アッセイ
により測定した（Clerici, M. et al., 1991, J.Immuno
l. 146,2214-2219）。標的細胞は、同一の蛋白質でパル
スしたｐ８１５細胞（Ｈ−２d）を用いて調製した。特
異的５１Ｃｒ放出の百分率は、１００×（実験による放
出−自発による放出）／（最大放出−自発放出）として
計算した。培地単独又は培地＋５％Triton X-100でイン
キュベートした標的細胞を使用して各々自発放出および
最大放出を測定した。 CTL assay Spleen cells were collected from non-immunized mice. Non-immunized mice were used as negative controls. Approximately 1 × 10 6 lymphocytes were restimulated in vitro with isogenic spleen cells pulsed with NP1, M1 or M2 peptide. After 5 days of culture, the cytotoxic activity of these spleen cells was determined by a 6 hour 51Cr release assay using peptide-pulsed target cells (Clerici, M. et al., 1991, J. Immunol).
l. 146,2214-2219). Target cells were prepared using the p815 cells pulsed with the same protein (H-2 d). The percentage of specific 51Cr release was calculated as 100 × (experimental release−spontaneous release) / (maximum release−spontaneous release). Spontaneous release and maximal release were measured using target cells incubated with medium alone or medium + 5% Triton X-100, respectively.
【００６９】ウイルス投与 軽いジエチルエーテル麻酔下において、マウスを２４−
Ｇａｕｇｅ動物フィーディングステンレススチール（Po
pper＆Son, New York, NY）を用いて３０μｌのＰＢＳ
中のインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３又はＡ／ＰＲ／８
／３４の５致死量（ＬＤ50）を鼻腔内投与によって同時
に感染させた。 Virus administration Under mild diethyl ether anesthesia, mice were treated with 24-
Gauge Animal Feeding Stainless Steel (Po
30 μl of PBS using pper & Son, New York, NY)
A / WSN / 33 or A / PR / 8 influenza
Five lethal doses (LD 50 ) of / 34 were co-infected by intranasal administration.
【００７０】モノクローナル抗体を用いた防御機構の分
析 Ａ／ＰＲ／８／３４投与によるマウスの致死性に対する
ＣＤ４+又はＣＤ８+細胞の排除の効果を調べるために、
モノクローナル抗体（Epstein, S.L. et al.,2000, In
t. Immunol. 12, 91-101）を使用した。８から１０週齢
のＢＡＬＢマウスに３０μｇのＤＮＡワクチンを０日
目、１４日目及び２８日目に局所投与により免疫化し
た。３３日目に、マウスに５ＬＤ50のＡ／ＰＲ／８／３
４を投与した。各々１００μｇの抗ＣＤ−８又は抗ＣＤ
−４モノクローナル抗体を３３日目、３５日目及び３７
日目にｉ．ｐ．注入した。次いで、死亡したマウスの百
分率をさらに２８日間計測した。Description of the defense mechanism using monoclonal antibodies
To examine the effect of elimination of CD4 + or CD8 + cells on the lethality of mice by A / PR / 8/34 administration,
Monoclonal antibodies (Epstein, SL et al., 2000, In
t. Immunol. 12, 91-101) was used. Eight to ten week old BALB mice were immunized by topical administration on day 0, 14 and 28 with 30 μg of DNA vaccine. On day 33, mice received 5 LD50 of A / PR / 8/3.
4 were administered. 100 μg each of anti-CD-8 or anti-CD
-4 monoclonal antibody on days 33, 35 and 37
On day i. p. Injected. The percentage of dead mice was then counted for a further 28 days.
【００７１】データ分析 値は全て平均値±標準偏差（ＳＥ）で表した。実験デー
タおよびコントロールの統計分析はtwo-tailed Student
のｔ試験を用いて行い、統計的有意差はｐ＜０．０５と
定義した。All data analysis values were expressed as mean ± standard deviation (SE). Statistical analysis of experimental data and controls is a two-tailed Student
The statistical significance was defined as p <0.05.
【００７２】＜結果＞各経路の免疫による免疫原性の比
較 本方法による高力価のインフルエンザＭ特異的ＩｇＧ抗
体を誘導するのに必要なｐＭＥ１８Ｓ−Ｍの最適投与量
を決定するために、０日目、７日目及び１４日目に皮膚
の表面ケラチン細胞または表面層を引き剥がした後に、
マウスに局所的に５、２０及び１００μｇのＤＮＡを投
与した。血清と糞試料を２１日目に回収し、抗体価を測
定した。結果を表５に示す。<Results> Ratio of immunogenicity by immunization of each pathway
To determine the optimum dose of pME18S-M required to induce high titers of influenza M-specific IgG antibodies by compare the method, day 0, 7 and 14 days on the surface keratin of the skin After peeling off the cells or surface layer,
Mice received 5, 20, and 100 μg of DNA locally. Serum and fecal samples were collected on day 21 and antibody titers were measured. Table 5 shows the results.
【００７３】[0073]
【表５】 [Table 5]
【００７４】表５に示す通り、２０μｇのＤＮＡワクチ
ンで、ストリップ法による検出可能な水準の血清インフ
ルエンザ特異血清抗体応答を誘導できることが判明し
た。ＤＮＡワクチンにより誘導される免疫応答は各経路
の免疫の間で相違を示した。本実施例で使用した局所投
与免疫を、鼻腔内（ｉ．ｎ．）及び筋肉内（ｉ．ｍ．）
免疫と比較した。局所投与免疫は３カ月後に検出可能な
強い免疫応答およびインフルエンザ特異的免疫応答を誘
導することができた。本方法で誘導された抗体産生のレ
ベルは、鼻腔内（ｉ．ｎ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）注
入の場合と同様であった。この免疫応答はｐＧＭ−ＣＳ
Ｆのリポソームの添加により増加した。これらの結果
は、ＤＮＡワクチンの皮膚への局所投与がインフルエン
ザＭ蛋白質に対する免疫の有用な経路であることを示唆
している。また、皮膚の表面を引き剥がすことなく局所
投与した場合は、１００μｇのＤＮＡワクチンを投与し
た場合でも、弱い抗体応答しか誘導されなかった。As shown in Table 5, it was found that 20 μg of the DNA vaccine was able to induce a detectable level of serum influenza-specific serum antibody response by the strip method. The immune response elicited by the DNA vaccine showed differences between the immunities of each route. The locally administered immunizations used in this example were administered intranasally (in) and intramuscularly (im).
Compared to immunity. Local administration immunization was able to induce a strong and influenza specific immune response detectable after 3 months. The levels of antibody production induced by this method were similar to intranasal (in) or intramuscular (im) injections. This immune response is pGM-CS
Increased by the addition of F liposome. These results suggest that topical administration of a DNA vaccine to the skin is a useful route of immunization against influenza M protein. In addition, when topical administration was performed without peeling the surface of the skin, even when 100 μg of the DNA vaccine was administered, only a weak antibody response was induced.
【００７５】局所投与したＤＮＡワクチンに対するサイ
トカイン発現プラスミドの作用を調べるために、２０μ
ｇのｐＩＬ−１２及び／又はｐＧＭ−ＣＳＦを３０μｇ
のＤＮＡワクチンと一緒に塗布した。局所投与によりＤ
ＮＡワクチンを接種すると、高力価のインフルエンザ特
異的血清ＩｇＧ及びＩｇＡｌｏｇ2抗体が誘導された。
ｐＩＬ−１２と一緒又はそれなしにｐＧＭ−ＣＳＦを同
時投与すると抗体産生が増強された。これらの結果は、
ｐＩＬ−１２及びｐＧＭ−ＣＳＦのこれらサイトカイン
が体液性免疫を増大する効力を有していることを示唆し
ている。対照的に、糞ＩｇＡ抗体産生については実質レ
ベルが常には得られなかった。To investigate the effect of the cytokine expression plasmid on the locally administered DNA vaccine, 20 μl
g of pIL-12 and / or pGM-CSF
Was applied along with the DNA vaccine. D by local administration
When inoculated with NA vaccine, high titers of influenza-specific serum IgG and IgAlog 2 antibodies were induced.
Co-administration of pGM-CSF with or without pIL-12 enhanced antibody production. These results
These cytokines of pIL-12 and pGM-CSF suggest that they have the potential to increase humoral immunity. In contrast, substantial levels of fecal IgA antibody production were not always obtained.
【００７６】次に、ＤＮＡワクチンにより誘導されるＩ
ｇＧサブクラスを調べた。血清を回収し、ＩｇＧサブク
ラスについて試験した。結果を表６に示す。表６は、血
清中の抗原特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの相対量を示
す。平均ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を、表６と同一の方法
を用いてサイトカイン発現プラスミドを使用する場合と
使用しない場合でワクチンの局所投与によりさらに調べ
た。得られた結果は各々、１．６０（ｐＭＥ１８Ｓ−Ｍ
単独）、１．４２（ｐＩＬ−２を使用）、１．５３（ｐ
ＩＬ−２及びｐＧＭ−ＣＳＦを使用）および１．８４
（ｐＧＭ−ＣＳＦを使用）であった。筋肉内免疫では、
既報の通り（Fan, H. et al., 1999, 9,870-872; Robi
nson, H. L. et al., 1997, J.Infec.Dis. 176, 50-55;
Tamura,S. et al., 1996, J. Imunol. 156; Ulmer, J.
B. et al., 1994, Vaccine. 12,1541-1544;及びUlmer,
J.B. et al., 1993, Science, 259, 1745-1749）、Ｉｇ
Ｇ２ａ力価の相対的増加が生じ、Ｔｈ１型免疫応答への
相対偏差がみられた。対照的に、皮膚への局所投与では
ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のレベルが向上する傾向が見ら
れ、局所投与がＴｈ２型応答を支持していることが示唆
される。Next, I induced by the DNA vaccine
The gG subclass was examined. Serum was collected and tested for IgG subclass. Table 6 shows the results. Table 6 shows the relative amounts of antigen-specific IgG1 and IgG2a in serum. The average IgG1 / IgG2a ratio was further investigated by topical administration of the vaccine with and without the cytokine expression plasmid using the same method as in Table 6. The results obtained were each 1.60 (pME18S-M
Alone, 1.42 (using pIL-2), 1.53 (p
(Using IL-2 and pGM-CSF) and 1.84
(Using pGM-CSF). In intramuscular immunity,
As previously reported (Fan, H. et al., 1999, 9,870-872; Robi
nson, HL et al., 1997, J. Infec. Dis. 176, 50-55;
Tamura, S. et al., 1996, J. Imunol. 156; Ulmer, J.
B. et al., 1994, Vaccine. 12,1541-1544; and Ulmer,
JB et al., 1993, Science, 259, 1745-1749), Ig
A relative increase in G2a titers occurred, with a relative deviation to a Th1-type immune response. In contrast, topical administration to the skin tends to increase the level of the IgG1 / IgG2a ratio, suggesting that local administration supports a Th2-type response.
【００７７】[0077]
【表６】 [Table 6]
【００７８】フットパッド膨潤応答 次に、局所投与したＤＮＡワクチンが細胞仲介免疫（Ｃ
ＭＩ）応答を誘導できるかどうかを調べた。インフルエ
ンザ特異的ＤＴＨ応答を３回目の免疫の１週間後におけ
るフットパッド膨潤応答を用いて分析した。ｐＭＥ１８
Ｓ−Ｍを局所投与したマウスは、偽ワクチン（ｐＣＭＶ
なし、又はｐＣＡＧＧＳなし）を投与したマウスよりも
有意に大きい膨潤を示した（表７）。Footpad Swelling Response Next, the locally administered DNA vaccine was treated with cell-mediated immunity (C
MI) It was examined whether a response could be induced. Influenza-specific DTH responses were analyzed using the footpad swelling response one week after the third immunization. pME18
Mice to which SM was administered locally were given a mock vaccine (pCMV).
No or no pCAGGS) (Table 7).
【００７９】[0079]
【表７】 [Table 7]
【００８０】インフルエンザＤＮＡワクチンをｐＩＬ−
１２又はｐＧＭ−ＣＳＦと一緒に塗布した場合、ＤＴＨ
はＤＮＡワクチン単独を投与した場合と比較して有意に
増加した。これらの結果は、ｐＩＬ−１２及びｐＧＭ−
ＣＳＦがインフルエンザＤＮＡワクチンの塗布により誘
導されるフットパッド膨潤応答の増大においてアジュバ
ンドとしての役割を担うことを示唆している。An influenza DNA vaccine was prepared using pIL-
12 or DGM when applied with pGM-CSF
Was significantly increased as compared to the case where the DNA vaccine was administered alone. These results indicate that pIL-12 and pGM-
It has been suggested that CSF plays an adjuvant role in increasing the footpad swelling response induced by influenza DNA vaccine application.
【００８１】ＣＴＬアッセイ ＣＴＬ応答もＤＮＡワクチンの局所投与により分析し
た。マウスをＤＮＡワクチンでサイトカインプラスミド
と一緒に処理した。最後の免疫化後に、脾臓細胞を回収
し、ペプチドをパルスした同質遺伝子脾臓細胞と一緒に
培養した。図４に示す通り、局所投与によるＤＮＡワク
チンにより実質的レベルのＣＴＬが誘導された。ＤＮＡ
ワクチンをｐＩＬ−１２又はｐＧＭ−ＣＳＦと一緒に同
時投与すると、ＤＮＡワクチン単独の場合と比べて、強
いＣＴＬ応答が誘導された。ＮＫ細胞標的としてＹＡＣ
細胞を使用した場合、弱いレベルの溶解のみが観察され
た。これらの結果は、改良した投与により高レベルのイ
ンフルエンザ特異的ＣＴＬ応答が誘導されることを実証
している。ｐＩＬ−１２及びｐＧＭ−ＣＳＦの両方でｐ
ＭＥ１８Ｓ−Ｍを免疫化すると高レベルのＣＴＬ応答が
誘導された（Ｅ：Ｔ比８０：１で６０．９±１１．０
％）。表皮ケラチン細胞を引き剥がすことなくＤＮＡを
ワクチン接種した場合には、有意なレベルのＣＴＬ応答
は生じなかった（Ｅ：Ｔ比８０：１で１２．７±２．５
％）。 CTL Assay The CTL response was also analyzed by local administration of the DNA vaccine. Mice were treated with the DNA vaccine together with the cytokine plasmid. After the last immunization, spleen cells were harvested and cultured with peptide-pulsed isogenic spleen cells. As shown in FIG. 4, a substantial level of CTL was induced by the DNA vaccine by local administration. DNA
Co-administration of the vaccine with pIL-12 or pGM-CSF induced a strong CTL response compared to the DNA vaccine alone. YAC as NK cell target
When cells were used, only a weak level of lysis was observed. These results demonstrate that improved dosing induces high levels of influenza-specific CTL responses. In both pIL-12 and pGM-CSF, p
Immunization of ME18S-M induced a high level of CTL response (60.9 ± 11.0 at 80: 1 E: T ratio).
%). Vaccination with DNA without detaching epidermal keratinocytes did not produce a significant level of CTL response (12.7 ± 2.5 at an E: T ratio of 80: 1).
%).
【００８２】サイトカインプロフィール ＤＮＡワクチンを単独又はｐＩＬ−１２又はｐＧＭ−Ｃ
ＳＦと一緒に局所投与することにより免疫化したマウス
からの脾臓細胞を同質遺伝子ペプチドと一緒に培養した
場合、これらの細胞のサイトカイン産生のレベルを調べ
た。結果を表８に示す。 Cytokine Profile DNA vaccine alone or with pIL-12 or pGM-C
When spleen cells from mice immunized by local administration with SF were cultured with isogenic peptides, the levels of cytokine production of these cells were examined. Table 8 shows the results.
【００８３】[0083]
【表８】 [Table 8]
【００８４】表８に示す通り、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の
有意な増加が、ＤＮＡワクチンを投与しないマウスと比
較して、ＤＮＡワクチンを局所投与により免疫化したマ
ウスで観察された。ＩＬ−４産生の増加は、筋肉内免疫
の場合と比較して局所投与の場合の方がＩＦＮ−γの増
加よりも高かった。これらの結果は、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｍ
プラスミドの局所投与が、筋肉内免疫化と比較してＴｈ
２サイトカイン産生を優先的に活性化することを示唆し
ている。As shown in Table 8, a significant increase in IFN-γ and IL-4 was observed in mice immunized by local administration of the DNA vaccine as compared to mice not receiving the DNA vaccine. The increase in IL-4 production was higher with local administration than with IFN-γ compared to intramuscular immunity. These results indicate that pME18S-M
Local administration of plasmids is not as effective as Th
2 suggests that cytokine production is preferentially activated.
【００８５】インフルエンザＡウイルス投与後の生存率 ３回目の免疫化の後に、５ＬＤ50のＡ／ＰＲ／８／３４
ウイルスを投与した。生存率の結果を図５に示す。図５
に示す通り、マウスをｐＭＥ１８Ｓ−Ｍ単独で局所投与
して免疫した後、Ａ／ＰＲ／８／３４を投与した場合、
６５％のマウスが生存した。ｐＭＥ１８Ｓ−Ｍで筋肉内
免疫したグループでは、７１％のマウスが防御された
（ｎ＝１４）。インフルエンザ遺伝子のＮＰ＋Ｍ（Epst
ein, S.L.et al., 2000, Int. immunol. 12, 91-101）
又はＮＰ（ Ulmer, J.B. et al., 1994, Vaccine. 12,
1541-1544;及びUlmer, J.B. et al., 1993, Science, 2
59,1745-1749）から構築したＤＮＡワクチンの免疫はイ
ンフルエンザウイルス投与に対して防御性であるとの報
告が複数ある。ｐＭＥ１８Ｓ−ＭおよびＡ／ｐＣＭＶ−
Ｖ１ＮＰの両方の局所投与免疫は、Ａ／ＰＲ／８／３４
投与に対して良好な防御（７４％）を示し、この防御活
性は、ｐＧＭ−ＣＳＦを添加した場合には８２％まで増
大した。不活化Ａ／ＰＲ／８／３４とｐＧＭ−ＣＳＦを
局所投与により免疫した場合（ｎ＝１７）、マウスの生
存率は１５であった。これらの結果は、ＤＮＡワクチン
の局所投与により、Ａ／ＰＲ／８／３４投与に対する高
レベルの防御免疫が誘導されることを示唆している。局
所投与により誘導される防御免疫の機構を解明するため
に、Ａ／ＰＲ／８／３４投与の期間中にＣＤ８+又はＣ
Ｄ４+細胞を排除することを試みた。ＣＤ８+細胞の排除
によりＡ／ＰＲ／８／３４投与に対する防御活性を大き
く減少したが、ＣＤ４+細胞の排除は生存率にあまり影
響しなかった。この結果をＣＴＬ誘導のデータ（図４）
と合わせて考えると、ＣＤ８+ＣＴＬ応答がｐＭＥ１８
Ｓ−Ｍによる局所投与免疫により誘導される防御活性で
重要な役割を担っていると言える。[0085] After the viability third immunization after the influenza A virus administration, of 5LD 50 A / PR / 8/ 34
The virus was administered. The results of the survival rate are shown in FIG. FIG.
As shown in Figure 2, when mice were locally administered with pME18S-M alone and immunized, and then administered with A / PR / 8/34,
65% of the mice survived. In the group immunized intramuscularly with pME18S-M, 71% of the mice were protected (n = 14). Influenza gene NP + M (Epst
ein, SLet al., 2000, Int. immunol. 12, 91-101)
Or NP (Ulmer, JB et al., 1994, Vaccine. 12,
1541-1544; and Ulmer, JB et al., 1993, Science, 2
59,1745-1749) have been reported to be protective against influenza virus administration. pME18S-M and A / pCMV-
Both topically administered immunizations of V1NP show A / PR / 8/34
It showed good protection against administration (74%), and this protective activity was increased to 82% when pGM-CSF was added. When the inactivated A / PR / 8/34 and pGM-CSF were immunized by local administration (n = 17), the survival rate of the mice was 15. These results suggest that local administration of the DNA vaccine induces a high level of protective immunity against A / PR / 8/34 administration. To elucidate the mechanism of protective immunity induced by local administration, CD8 + or C8 during A / PR / 8/34 administration
An attempt was made to eliminate D4 + cells. Elimination of CD8 + cells greatly reduced protective activity against A / PR / 8/34 administration, but elimination of CD4 + cells did not significantly affect viability. This result was compared with CTL induction data (Fig. 4).
When considered together, the CD8 + CTL response is pME18
It can be said that it plays an important role in the protective activity induced by local administration immunization with SM.
【００８６】[0086]
【発明の効果】本発明により、インフルエンザウイルス
に対する高い免疫能を被験者に付与することができ、ま
たインフルエンザウイルスの抗原変異によって影響を受
けることが少ない普遍的なインフルエンザワクチンを提
供することが可能になった。According to the present invention, it is possible to provide a subject with high immunity against influenza virus and to provide a universal influenza vaccine which is less affected by antigenic mutation of influenza virus. Was.
【００８７】[0087]
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Kenji Okuda et al <120> Influenza vaccine <130> A01411MA <160> 3[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Kenji Okuda et al <120> Influenza vaccine <130> A01411MA <160> 3
【００８８】 [0088]
【００８９】 [0089]
【００９０】 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Peptide <400> 3 Tyr Arg Lys Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp 5 10<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Peptide <400> 3 Tyr Arg Lys Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp 5 10
【図１】図１は、ＣＴＬアッセイの結果を示す。ＣＴＬ
アッセイは、３回免疫したマウスの脾臓細胞を取り出
し、Ｍペプチドを添加したＰ８１５細胞と一緒に５日間
培養した後のエフェクター細胞を使用した。標的とし
て、ペプチドをパルスしたＰ８１５細胞を用いた。Ｅ：
Ｔ比率は、５：１、２０：１、８０：１である。FIG. 1 shows the results of a CTL assay. CTL
The assay used effector cells after removing spleen cells of mice immunized three times and culturing them for 5 days with P815 cells supplemented with M peptide. P815 cells pulsed with peptide were used as targets. E:
The T ratio is 5: 1, 20: 1, 80: 1.
【図２】図２は、ＷＳＮウイルス投与試験の結果を示
す。ＷＳＮウイルスの５倍のＬＤ５０を経鼻投与し、死
亡率を時間とともに示した。各群は１０頭のマウスから
成る。FIG. 2 shows the results of a WSN virus administration test. LD50 was administered nasally 5 times that of the WSN virus and the mortality was shown over time. Each group consists of 10 mice.
【図３】図３は、ＰＲ８ウイルス投与試験の結果を示
す。ＰＲ８ウイルスの５倍のＬＤ５０を経鼻投与し、死
亡率を時間とともに示した。各群は１０頭のマウスから
成る。FIG. 3 shows the results of a PR8 virus administration test. The LD50 was administered nasally 5 times that of the PR8 virus, and the mortality was shown over time. Each group consists of 10 mice.
【図４】図４は、インフルエンザＭタンパク質ペプチド
抗原に対するＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を示す。
各免疫グループ由来のリンパ細胞をインフルエンザペプ
チドでパルス同質遺伝子脾臓細胞を使用して５日間再刺
激した。ペプチドでパルスしたｐ８１５細胞を標的とし
て使用した。aＹＡＣ細胞をＮＫ活性の標的細胞として
使用した。データは５〜６頭のマウスの平均力価±ＳＥ
である。対照のリンパ細胞は免疫していないマウスから
のものである。ｎ：使用したマウスの数；＊はＤＮＡワ
クチンを投与したグループと対照の免疫していないグル
ープとの間で有意差があることを示す（ｐ＜０．０
５）。FIG. 4 shows the CTL response of BALB / c mice to influenza M protein peptide antigen.
Lymphocytes from each immunization group were restimulated with influenza peptide using pulsed isogenic spleen cells for 5 days. P815 cells pulsed with peptide were used as targets. a YAC cells were used as target cells for NK activity. Data are mean titers of 5-6 mice ± SE
It is. Control lymphocytes are from non-immunized mice. n: number of mice used; * indicates that there is a significant difference between the group receiving the DNA vaccine and the control non-immunized group (p <0.0
5).
【図５】図５は、インフルエンザＤＮＡワクチンを免疫
したマウスの生存率を示す。第０日目、１４日目及び２
８日目に、各グループのマウスを３０μｇのｐＭＥ１８
Ｓ−Ｍ及び／又はＡ／ｐＣＭＶ−Ｖ１ＮＰで免疫し、場
合によりリポソームまたは２０μｇのｐＧＭ−ＣＳＦを
添加した。４２日目に、５ＬＤ50のＡ／ＰＲ／８／３４
を投与した。モノクローナル抗体は２日毎にｉ．ｖ．注
入した。マウスの生存率を計測した。上向きの矢印はＡ
／ＰＲ／８／３４の投与を示し、下向の矢印は抗体の注
入を示す。FIG. 5 shows the survival rate of mice immunized with the influenza DNA vaccine. Day 0, Day 14 and 2
On day 8, each group of mice was treated with 30 μg of pME18.
Immunized with SM and / or A / pCMV-V1NP, optionally with liposomes or 20 μg of pGM-CSF. On day 42, 5 LD 50 of A / PR / 8/34
Was administered. Monoclonal antibodies are given every 2 days i. v. Injected. The survival rate of the mice was measured. The upward arrow is A
/ PR / 8/34, with down arrow indicating infusion of antibody.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat (reference) // C07K 16/10 C12R 1:93) C12N 15/09 ZNA A61K 37/02 (C12N 15/09 ZNA C12N 15/00) ZNAA C12R 1:93) C12R 1:93)
Claims (11)
プロテインまたはその抗原性エピトープをコードする塩
基配列を有するＤＮＡを含むインフルエンザワクチン。1. An influenza vaccine comprising a DNA having a nucleotide sequence encoding a matrix protein of an influenza virus or an antigenic epitope thereof.
プロテインまたはその抗原性エピトープをコードする塩
基配列が、インフルエンザウイルスの膜タンパク質と組
み込み膜タンパク質の両方をコードしている、請求項１
に記載のインフルエンザワクチン。2. The base sequence encoding the influenza virus matrix protein or an antigenic epitope thereof encodes both the influenza virus membrane protein and the integrated membrane protein.
The influenza vaccine according to the above.
項１または２に記載のインフルエンザワクチン。3. The influenza vaccine according to claim 1, wherein the DNA is a plasmid DNA.
トリックスプロテインとは異なる別の１または２以上の
インフルエンザ抗原をコードする塩基配列をさらに有し
ている、請求項１から３の何れか１項に記載のインフル
エンザワクチン。4. The DNA according to any one of claims 1 to 3, wherein the DNA further has a nucleotide sequence encoding one or more other influenza antigens different from the matrix protein of the influenza virus. Influenza vaccine.
ニン、ニューラミニダーゼおよび核タンパク質から成る
群から選択される１または２以上のインフルエンザ抗原
である、請求項４に記載のインフルエンザワクチン。5. The influenza vaccine according to claim 4, wherein the another influenza antigen is one or more influenza antigens selected from the group consisting of hemagglutinin, neuraminidase and nucleoprotein.
フルエンザワクチンを含む医薬組成物。6. A pharmaceutical composition comprising the influenza vaccine according to any one of claims 1 to 5.
フルエンザワクチンとリポソームとを配合して成る請求
項６に記載の医薬組成物。7. The pharmaceutical composition according to claim 6, comprising the influenza vaccine according to any one of claims 1 to 5 and a liposome.
フルエンザワクチンとは異なる別の１または２以上のイ
ンフルエンザワクチンをさらに含む、請求項６または７
に記載の医薬組成物。8. The influenza vaccine according to claim 6, further comprising another one or more influenza vaccines different from the influenza vaccine according to any one of claims 1 to 5.
A pharmaceutical composition according to claim 1.
ルチニン、ニューラミニダーゼおよび核タンパク質から
成る群から選択される１または２以上のインフルエンザ
抗原に対するワクチンである、請求項８に記載の医薬組
成物。9. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein another influenza vaccine is a vaccine against one or more influenza antigens selected from the group consisting of hemagglutinin, neuraminidase and nucleoprotein.
ンフルエンザワクチンとは異なる別の１または２以上の
インフルエンザワクチンと併用するための、請求項１〜
５の何れか１項に記載のインフルエンザワクチン。10. An influenza vaccine for use in combination with another one or more influenza vaccines different from the influenza vaccine according to any one of claims 1 to 5.
6. The influenza vaccine according to any one of 5.
れか１項に記載のインフルエンザワクチンまたは医薬組
成物。11. The influenza vaccine or pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 10, which is administered transdermally.
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