JP2001041959A - 癌細胞検出システムおよび癌細胞検出キット - Google Patents
癌細胞検出システムおよび癌細胞検出キットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】癌の再発・転移を予測するため体液中の癌細胞
を直接検出する。 【解決手段】癌細胞を特異的に結合するリガンドを固定
化した担体と癌細胞を含む液体を接触させ、担体に結合
した癌細胞を標識する。
を直接検出する。 【解決手段】癌細胞を特異的に結合するリガンドを固定
化した担体と癌細胞を含む液体を接触させ、担体に結合
した癌細胞を標識する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液体中の癌細胞を
検出するシステムおよびキットに関する。
検出するシステムおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】癌の治療中および治療後における転移お
よび再発の早期発見は、癌治療における重要な課題の一
つである。従来、癌の検査・診断には、患部組織の細胞
の形態を病理標本から観察し判定する方法や、腫瘍マー
カーに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
を使ったサンドイッチＥＬＩＳＡ法が用いられてきた。
これらの方法は癌の診断・治療に大きく寄与したもの
の、良性、悪性の判定が困難であること、癌の進展と血
中腫瘍マーカー濃度との相関が未だ不明であり必ずしも
特異的であるとは言い難く、臓器特異性もあることか
ら、診断法として補助的な役割しか果たしていないのが
現状である。また、これらの方法では癌の再発・転移を
予測、診断できないという決定的な欠点がある。この欠
点を補うべく、近年、組織または血液中の癌細胞を腫瘍
マーカーの遺伝子を指標にしてＰＣＲ法で検出する試み
がなされ、悪性の患者の血液中に腫瘍マーカー遺伝子が
高率に検出され、血液中の癌細胞の存在が示唆されるよ
うになった。しかしながら、この方法はＰＣＲ法を用い
ているが故に擬陽性の可能性がつきまとい、定量化が難
しいだけでなく、癌細胞中の遺伝子か細胞外に放出され
た遺伝子かを判別することができないという問題があ
る。さらに、癌の種類によって腫瘍マーカーを選択しな
ければならない手間もある。このように、体液中の癌細
胞を検出するために、ひとつのマーカーで多くの癌細胞
を検出できる検出・診断・検査システムは今のところ見
出されていないのが実状である。
よび再発の早期発見は、癌治療における重要な課題の一
つである。従来、癌の検査・診断には、患部組織の細胞
の形態を病理標本から観察し判定する方法や、腫瘍マー
カーに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
を使ったサンドイッチＥＬＩＳＡ法が用いられてきた。
これらの方法は癌の診断・治療に大きく寄与したもの
の、良性、悪性の判定が困難であること、癌の進展と血
中腫瘍マーカー濃度との相関が未だ不明であり必ずしも
特異的であるとは言い難く、臓器特異性もあることか
ら、診断法として補助的な役割しか果たしていないのが
現状である。また、これらの方法では癌の再発・転移を
予測、診断できないという決定的な欠点がある。この欠
点を補うべく、近年、組織または血液中の癌細胞を腫瘍
マーカーの遺伝子を指標にしてＰＣＲ法で検出する試み
がなされ、悪性の患者の血液中に腫瘍マーカー遺伝子が
高率に検出され、血液中の癌細胞の存在が示唆されるよ
うになった。しかしながら、この方法はＰＣＲ法を用い
ているが故に擬陽性の可能性がつきまとい、定量化が難
しいだけでなく、癌細胞中の遺伝子か細胞外に放出され
た遺伝子かを判別することができないという問題があ
る。さらに、癌の種類によって腫瘍マーカーを選択しな
ければならない手間もある。このように、体液中の癌細
胞を検出するために、ひとつのマーカーで多くの癌細胞
を検出できる検出・診断・検査システムは今のところ見
出されていないのが実状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
上記の問題点に鑑み、癌細胞をその種類によらず検出す
る方法を検討した結果、多くの癌細胞の表面に発現する
物質と強い親和性を有する物質（以下、リガンドと表
記）を固定化した担体を用いて、体液中の癌細胞を直接
検出できることを見出し、本発明に至った。すなわち、
本発明は、癌細胞をその種類によらず、リガンドを固定
化した担体に吸着させ、吸着した癌細胞を標識物質で簡
便かつ特異的に検出する細胞検出システムを提供するこ
とを目的とする。
上記の問題点に鑑み、癌細胞をその種類によらず検出す
る方法を検討した結果、多くの癌細胞の表面に発現する
物質と強い親和性を有する物質（以下、リガンドと表
記）を固定化した担体を用いて、体液中の癌細胞を直接
検出できることを見出し、本発明に至った。すなわち、
本発明は、癌細胞をその種類によらず、リガンドを固定
化した担体に吸着させ、吸着した癌細胞を標識物質で簡
便かつ特異的に検出する細胞検出システムを提供するこ
とを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、癌細
胞を含有する液体と担体を接触させる工程と、担体に結
合した該癌細胞を検出する工程を少なくとも含むことを
特徴とする、癌細胞検出システムである。
胞を含有する液体と担体を接触させる工程と、担体に結
合した該癌細胞を検出する工程を少なくとも含むことを
特徴とする、癌細胞検出システムである。
【０００５】また本発明は、人または動物の体液を癌細
胞と親和性のある物質に接触させて、体液中の癌細胞を
検出する癌細胞検出キットであって、癌細胞と親和性の
ある物質が糖類、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプ
チド、糖タンパク質、糖ペプチド、およびビタミン酸か
ら選ばれる少なくとも１つである癌細胞検出キットであ
る。
胞と親和性のある物質に接触させて、体液中の癌細胞を
検出する癌細胞検出キットであって、癌細胞と親和性の
ある物質が糖類、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプ
チド、糖タンパク質、糖ペプチド、およびビタミン酸か
ら選ばれる少なくとも１つである癌細胞検出キットであ
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】本発明の癌細胞検出システムおよび癌細胞
検出キットで用いる癌細胞と親和性のある物質（リガン
ド）としては、直接、癌細胞と結合する物質（リガン
ド）自体を担体そのものとして用いるだけでなく、リガ
ンドを担体上に固定させて、目的の癌細胞を特異的に結
合させることも望ましい。その場合の担体は液体と接触
したときに溶解せず、リガンドを固定化できるものであ
れば何でもよく材質も問わない。入手しやすいという点
でビーズ、プレート、チューブが好ましく用いられる。
検出キットで用いる癌細胞と親和性のある物質（リガン
ド）としては、直接、癌細胞と結合する物質（リガン
ド）自体を担体そのものとして用いるだけでなく、リガ
ンドを担体上に固定させて、目的の癌細胞を特異的に結
合させることも望ましい。その場合の担体は液体と接触
したときに溶解せず、リガンドを固定化できるものであ
れば何でもよく材質も問わない。入手しやすいという点
でビーズ、プレート、チューブが好ましく用いられる。
【０００８】リガンドは、癌細胞の表層に発現している
物質と親和性を有する物質であり、細胞表層物質に対し
て、静電相互作用、疎水相互作用、ファンデルワールス
相互作用などにより特異的に結合するものであればよ
い。特異的に結合するものとしては、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体、抗体の抗原認識部位を含むフ
ラグメント、細胞表層レセプター、レセプターのリガン
ド結合部位を含むフラグメント、糖鎖、ポリペプチド、
オリゴペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴ
ヌクレオチド、ヌクレオチド、脂質などがあげられ、こ
れら以外にも合成有機化合物、合成高分子化合物のリガ
ンドが利用できる。リガンドの例としては、抗インテグ
リン抗体、抗CD44抗体、抗MUC-1抗体、抗サイトケラチ
ン抗体、抗上皮細胞増殖因子抗体、抗インシュリン様増
殖因子抗体、抗インシュリン様増殖因子レセプター抗体
などの抗体または抗原認識部位を含む抗体の一部、コラ
ーゲンなどのポリペプチドあるいはオリゴペプチド、RG
D配列を含むオリゴペプチド、フィブロネクチンなどの
糖タンパク質、ヒアルロン酸、ホスホマンナンなどの多
糖、マンノース−６−リン酸五量体などのオリゴ糖、マ
ンノース−６−リン酸などの単糖、レチノイン酸などの
ビタミン酸などがあげられる。白血球、赤血球などの正
常細胞と相互作用しないという点で、抗インシュリン様
増殖因子レセプター抗体、マンノース−６−リン酸五量
体が好ましく用いられる。リガンドの数は、少なすぎる
と十分な検出感度が得られず、逆に多すぎるとリガンド
どうしが重なり合い、お互いに立体障害となる可能性が
ある。したがって、リガンド基の量としては、担体表面
積1cm2当たり1fmol〜10molが好ましく、さらに1pmol〜1
molがより好ましい。固定化するリガンドは一種類に限
定されず、複数のリガンドを固定化してもよい。
物質と親和性を有する物質であり、細胞表層物質に対し
て、静電相互作用、疎水相互作用、ファンデルワールス
相互作用などにより特異的に結合するものであればよ
い。特異的に結合するものとしては、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体、抗体の抗原認識部位を含むフ
ラグメント、細胞表層レセプター、レセプターのリガン
ド結合部位を含むフラグメント、糖鎖、ポリペプチド、
オリゴペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴ
ヌクレオチド、ヌクレオチド、脂質などがあげられ、こ
れら以外にも合成有機化合物、合成高分子化合物のリガ
ンドが利用できる。リガンドの例としては、抗インテグ
リン抗体、抗CD44抗体、抗MUC-1抗体、抗サイトケラチ
ン抗体、抗上皮細胞増殖因子抗体、抗インシュリン様増
殖因子抗体、抗インシュリン様増殖因子レセプター抗体
などの抗体または抗原認識部位を含む抗体の一部、コラ
ーゲンなどのポリペプチドあるいはオリゴペプチド、RG
D配列を含むオリゴペプチド、フィブロネクチンなどの
糖タンパク質、ヒアルロン酸、ホスホマンナンなどの多
糖、マンノース−６−リン酸五量体などのオリゴ糖、マ
ンノース−６−リン酸などの単糖、レチノイン酸などの
ビタミン酸などがあげられる。白血球、赤血球などの正
常細胞と相互作用しないという点で、抗インシュリン様
増殖因子レセプター抗体、マンノース−６−リン酸五量
体が好ましく用いられる。リガンドの数は、少なすぎる
と十分な検出感度が得られず、逆に多すぎるとリガンド
どうしが重なり合い、お互いに立体障害となる可能性が
ある。したがって、リガンド基の量としては、担体表面
積1cm2当たり1fmol〜10molが好ましく、さらに1pmol〜1
molがより好ましい。固定化するリガンドは一種類に限
定されず、複数のリガンドを固定化してもよい。
【０００９】担体には、癌細胞以外の細胞および物質が
非特異的に吸着されるのを防ぐ処理が施されていること
が望ましく、例えば、血清アルブミンやゼラチンで被覆
する方法、親水性のモノマあるいはポリマを表面グラフ
ト重合する方法、プラズマ処理法などが好ましく用いら
れる。
非特異的に吸着されるのを防ぐ処理が施されていること
が望ましく、例えば、血清アルブミンやゼラチンで被覆
する方法、親水性のモノマあるいはポリマを表面グラフ
ト重合する方法、プラズマ処理法などが好ましく用いら
れる。
【００１０】これらの担体に癌細胞を結合させるため
に、癌細胞を含有する液体に担体を加えて癌細胞と担体
とを接触させる。このとき液体中の細胞数は任意で良
く、液体をそのまま用いても良いし、生理食塩水等で希
釈して用いても良い。癌細胞を担体に結合させる条件は
任意であるが、生きた細胞を確実に結合させるためには
体温付近の温度で１時間以上接触させるのが好ましく、
更に接触機会を増すために、振とうするのが好ましい。
に、癌細胞を含有する液体に担体を加えて癌細胞と担体
とを接触させる。このとき液体中の細胞数は任意で良
く、液体をそのまま用いても良いし、生理食塩水等で希
釈して用いても良い。癌細胞を担体に結合させる条件は
任意であるが、生きた細胞を確実に結合させるためには
体温付近の温度で１時間以上接触させるのが好ましく、
更に接触機会を増すために、振とうするのが好ましい。
【００１１】担体に結合した癌細胞の検出は、そのまま
液体中で行っても良いが、擬陽性を抑えるために、一度
液体から癌細胞を結合した担体を取り出して、生理食塩
水等で洗浄した後に行う方が好ましい。
液体中で行っても良いが、擬陽性を抑えるために、一度
液体から癌細胞を結合した担体を取り出して、生理食塩
水等で洗浄した後に行う方が好ましい。
【００１２】担体に結合した癌細胞の検出方法は任意で
良く、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセ
イで一般に用いられている方法で、標識化合物を結合し
た物質を用いる方法が好ましく用いられる。標識化合物
は、検出感度が高く、測定が容易なものであればよく、
特に限定されない。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソチオ
シアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
ト等の蛍光試薬、3H、14C、31P、125Ｉ等の放射性同位
体を含む化合物があげられる。また、担体に結合した癌
細胞を破壊して細胞内に含まれる物質の量や酵素活性を
利用して検出することも可能である。検出に際しては、
癌細胞を担体に結合させたままでも良いし、剥がしても
良い。剥がした細胞を再び培養して検出に用いることが
できる。
良く、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセ
イで一般に用いられている方法で、標識化合物を結合し
た物質を用いる方法が好ましく用いられる。標識化合物
は、検出感度が高く、測定が容易なものであればよく、
特に限定されない。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソチオ
シアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
ト等の蛍光試薬、3H、14C、31P、125Ｉ等の放射性同位
体を含む化合物があげられる。また、担体に結合した癌
細胞を破壊して細胞内に含まれる物質の量や酵素活性を
利用して検出することも可能である。検出に際しては、
癌細胞を担体に結合させたままでも良いし、剥がしても
良い。剥がした細胞を再び培養して検出に用いることが
できる。
【００１３】標識化合物を結合した物質は癌細胞と特異
的に結合するもの、あるいは癌細胞と特異的に結合する
物質に対して特異的な親和性を有するものを用いること
ができる。例えば、前者はモノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、抗体の抗原認識部位を含むフラグメン
ト、細胞表層レセプター、レセプターのリガンド結合部
位を含むフラグメント、糖鎖、ポリペプチド、オリゴペ
プチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チド、ヌクレオチド、脂質、アビジン、ビオチンなど
が、後者はモノクローナル抗体に対する２次抗体などが
それぞれ好ましく用いられる。これら以外にも合成有機
化合物、合成高分子化合物のリガンドが利用できる。
的に結合するもの、あるいは癌細胞と特異的に結合する
物質に対して特異的な親和性を有するものを用いること
ができる。例えば、前者はモノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、抗体の抗原認識部位を含むフラグメン
ト、細胞表層レセプター、レセプターのリガンド結合部
位を含むフラグメント、糖鎖、ポリペプチド、オリゴペ
プチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チド、ヌクレオチド、脂質、アビジン、ビオチンなど
が、後者はモノクローナル抗体に対する２次抗体などが
それぞれ好ましく用いられる。これら以外にも合成有機
化合物、合成高分子化合物のリガンドが利用できる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例及び比較例により更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】実施例１、２ アミノ基をビーズ１個あたり1nmol含有するポリスチレ
ンビーズ40個をポリエチレングリコールジグリシジルエ
ーテル15ml中に浸漬し、25℃で３日撹拌した。ビーズを
メタノールで洗浄後、メタノール15ml中に浸漬し、エチ
レンジアミン1mlを加えて、25℃で１日撹拌した。ビー
ズをメタノールで洗浄後、風乾した（ここで得られたビ
ーズを、以下Ａと略記する）。
ンビーズ40個をポリエチレングリコールジグリシジルエ
ーテル15ml中に浸漬し、25℃で３日撹拌した。ビーズを
メタノールで洗浄後、メタノール15ml中に浸漬し、エチ
レンジアミン1mlを加えて、25℃で１日撹拌した。ビー
ズをメタノールで洗浄後、風乾した（ここで得られたビ
ーズを、以下Ａと略記する）。
【００１６】Ａ20個を0.2Mリン酸緩衝液(pH=7.0)7mlに
浸漬し、マンノース−６−リン酸五量体10mgとテトラメ
チルアンモニウムボロハイドライド1.8mgを添加し、4℃
で一晩反応させ、水で洗浄後乾燥し、マンノース−６−
リン酸五量体固定化ビーズを作製した（以下、固定化ビ
ーズＡという）。
浸漬し、マンノース−６−リン酸五量体10mgとテトラメ
チルアンモニウムボロハイドライド1.8mgを添加し、4℃
で一晩反応させ、水で洗浄後乾燥し、マンノース−６−
リン酸五量体固定化ビーズを作製した（以下、固定化ビ
ーズＡという）。
【００１７】Ａ20個を0.2Mリン酸緩衝液(pH=7.0)7mlに
浸漬し、マンノース−６−リン酸2mgとテトラメチルア
ンモニウムボロハイドライド1.8mgを添加し、4℃で一晩
反応させ、水で洗浄後乾燥し、マンノース−６−リン酸
固定化ビーズを作製した（以下、固定化ビーズＢとい
う）。
浸漬し、マンノース−６−リン酸2mgとテトラメチルア
ンモニウムボロハイドライド1.8mgを添加し、4℃で一晩
反応させ、水で洗浄後乾燥し、マンノース−６−リン酸
固定化ビーズを作製した（以下、固定化ビーズＢとい
う）。
【００１８】上記固定化ビーズＡ（実施例１）、固定化
ビーズＢ（実施例２）を、それぞれヒト乳癌由来細胞株
MCF-7を懸濁したPBS（0.9%塩化ナトリウム含有リン酸緩
衝液）に浸漬し、37℃で１時間静置した。そのビーズを
PBSで洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート
で標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬し、37℃で3
0分静置した後、ビーズをPBSで洗浄した。励起波長495n
m、検出波長520nmで蛍光強度を測定したところ、実施例
１、２のそれぞれにおいて蛍光が観測された。
ビーズＢ（実施例２）を、それぞれヒト乳癌由来細胞株
MCF-7を懸濁したPBS（0.9%塩化ナトリウム含有リン酸緩
衝液）に浸漬し、37℃で１時間静置した。そのビーズを
PBSで洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート
で標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬し、37℃で3
0分静置した後、ビーズをPBSで洗浄した。励起波長495n
m、検出波長520nmで蛍光強度を測定したところ、実施例
１、２のそれぞれにおいて蛍光が観測された。
【００１９】実施例３、４ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例３）、固定化ビーズＢ（実施例４）を、それ
ぞれヒト乳癌由来細胞株MCF-7を懸濁した10%ウシ胎児血
清含有ダルベッコ変法最小必須培地（10%FCS D-MEM）に
浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25%ウ
シ血清アルブミン(BSA)含有ハンクス平衡塩類溶液(HBS
S)で洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネートで
標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬し、室温で１
時間静置した後、ビーズを0.25%BSA含有HBSSで洗浄し
た。励起波長495nm、検出波長520nmで蛍光強度を測定し
たところ、実施例３、４のそれぞれにおいて蛍光が観測
された。
Ａ（実施例３）、固定化ビーズＢ（実施例４）を、それ
ぞれヒト乳癌由来細胞株MCF-7を懸濁した10%ウシ胎児血
清含有ダルベッコ変法最小必須培地（10%FCS D-MEM）に
浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25%ウ
シ血清アルブミン(BSA)含有ハンクス平衡塩類溶液(HBS
S)で洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネートで
標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬し、室温で１
時間静置した後、ビーズを0.25%BSA含有HBSSで洗浄し
た。励起波長495nm、検出波長520nmで蛍光強度を測定し
たところ、実施例３、４のそれぞれにおいて蛍光が観測
された。
【００２０】実施例５、６ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例５）、固定化ビーズＢ（実施例６）を、それ
ぞれヒト乳癌由来細胞株MCF-7を懸濁した10%FCS D-MEM
に浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25%B
SA含有HBSSで洗浄した後、抗サイトケラチン（CK）抗体
を分散したPBSに浸漬し、室温で１時間静置した。ビー
ズを0.25%BSA含有HBSSで洗浄し、HRPで標識した抗マウ
ス免疫グロブリンＧ(IgG)抗体溶液を250ml加え、室温で
１時間静置した後、0.25%BSA含有HBSSで洗浄し、発色試
薬を250ml加えた。室温で１５分間静置した後、1規定硫
酸を250ml加えて反応を停止させ、分光光度計により450
nmの吸光度を測定したところ、実施例５、６のそれぞれ
においてコントロールと比較して強い吸収が観測され
た。
Ａ（実施例５）、固定化ビーズＢ（実施例６）を、それ
ぞれヒト乳癌由来細胞株MCF-7を懸濁した10%FCS D-MEM
に浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25%B
SA含有HBSSで洗浄した後、抗サイトケラチン（CK）抗体
を分散したPBSに浸漬し、室温で１時間静置した。ビー
ズを0.25%BSA含有HBSSで洗浄し、HRPで標識した抗マウ
ス免疫グロブリンＧ(IgG)抗体溶液を250ml加え、室温で
１時間静置した後、0.25%BSA含有HBSSで洗浄し、発色試
薬を250ml加えた。室温で１５分間静置した後、1規定硫
酸を250ml加えて反応を停止させ、分光光度計により450
nmの吸光度を測定したところ、実施例５、６のそれぞれ
においてコントロールと比較して強い吸収が観測され
た。
【００２１】実施例７、８ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例７）、固定化ビーズＢ（実施例８）を、それ
ぞれヒト健常者から採取した白血球を懸濁したPBSに浸
漬し、37℃で１時間静置した。そのビーズをPBSで洗浄
した後、フルオレセインイソチオシアネートで標識した
抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬し、37℃で30分静置し
た後、ビーズをPBSで洗浄した。励起波長495nm、検出波
長520nmで蛍光強度を測定したところ、実施例７、８の
それぞれにおいて蛍光は観測されなかった。
Ａ（実施例７）、固定化ビーズＢ（実施例８）を、それ
ぞれヒト健常者から採取した白血球を懸濁したPBSに浸
漬し、37℃で１時間静置した。そのビーズをPBSで洗浄
した後、フルオレセインイソチオシアネートで標識した
抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬し、37℃で30分静置し
た後、ビーズをPBSで洗浄した。励起波長495nm、検出波
長520nmで蛍光強度を測定したところ、実施例７、８の
それぞれにおいて蛍光は観測されなかった。
【００２２】実施例９、１０ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例９）、固定化ビーズＢ（実施例１０）を、そ
れぞれヒト健常者から採取した白血球を懸濁した10%FCS
D-MEMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを
0.25%BSA含有HBSSで洗浄した後、フルオレセインイソチ
オシアネートで標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸
漬し、室温で１時間静置した後、ビーズを0.25%BSA含有
HBSSで洗浄した。励起波長495nm、検出波長520nmで蛍光
強度を測定したところ、実施例９、１０のそれぞれにお
いて蛍光は観測されなかった。
Ａ（実施例９）、固定化ビーズＢ（実施例１０）を、そ
れぞれヒト健常者から採取した白血球を懸濁した10%FCS
D-MEMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを
0.25%BSA含有HBSSで洗浄した後、フルオレセインイソチ
オシアネートで標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸
漬し、室温で１時間静置した後、ビーズを0.25%BSA含有
HBSSで洗浄した。励起波長495nm、検出波長520nmで蛍光
強度を測定したところ、実施例９、１０のそれぞれにお
いて蛍光は観測されなかった。
【００２３】実施例１１、１２ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例１１）、固定化ビーズＢ（実施例１２）を、
それぞれマウス繊維芽細胞株L929を懸濁した10%FCS D-M
EMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25
% BSA含有HBSSで洗浄した後、フルオレセインイソチオ
シアネートで標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬
し、室温で１時間静置した後、ビーズを0.25%BSA含有HB
SSで洗浄した。励起波長495nm、検出波長520nmで蛍光強
度を測定したところ、実施例１１、１２のそれぞれにお
いて蛍光は観測されなかった。
Ａ（実施例１１）、固定化ビーズＢ（実施例１２）を、
それぞれマウス繊維芽細胞株L929を懸濁した10%FCS D-M
EMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25
% BSA含有HBSSで洗浄した後、フルオレセインイソチオ
シアネートで標識した抗CD44抗体を分散したPBSに浸漬
し、室温で１時間静置した後、ビーズを0.25%BSA含有HB
SSで洗浄した。励起波長495nm、検出波長520nmで蛍光強
度を測定したところ、実施例１１、１２のそれぞれにお
いて蛍光は観測されなかった。
【００２４】実施例１３、１４ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例１３）、固定化ビーズＢ（実施例１４）を、
それぞれヒト健常者から採取した白血球を懸濁した10%F
CS D-MEMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズ
を0.25% BSA含有HBSSで洗浄した後、抗CK抗体を分散し
たPBSに浸漬し、室温で１時間静置した。ビーズを0.25%
BSA含有HBSSで洗浄し、HRPで標識した抗マウスIgG抗体
溶液を250ml加え、室温で１時間静置した。0.25% BSA含
有HBSSで洗浄し、発色試薬を250ml加えた。室温で１５
分間静置した後、1規定硫酸を250ml加えて反応を停止さ
せ、分光光度計により450nmの吸光度を測定したとこ
ろ、実施例１３、１４のそれぞれにおいてコントロール
と比較して、吸収に差がみられなかった。
Ａ（実施例１３）、固定化ビーズＢ（実施例１４）を、
それぞれヒト健常者から採取した白血球を懸濁した10%F
CS D-MEMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズ
を0.25% BSA含有HBSSで洗浄した後、抗CK抗体を分散し
たPBSに浸漬し、室温で１時間静置した。ビーズを0.25%
BSA含有HBSSで洗浄し、HRPで標識した抗マウスIgG抗体
溶液を250ml加え、室温で１時間静置した。0.25% BSA含
有HBSSで洗浄し、発色試薬を250ml加えた。室温で１５
分間静置した後、1規定硫酸を250ml加えて反応を停止さ
せ、分光光度計により450nmの吸光度を測定したとこ
ろ、実施例１３、１４のそれぞれにおいてコントロール
と比較して、吸収に差がみられなかった。
【００２５】実施例１５、１６ 実施例１，２で用いたのと同様のリガンド固定化ビーズ
Ａ（実施例１５）、固定化ビーズＢ（実施例１６）を、
それぞれマウス繊維芽細胞株L929を懸濁した10%FCS D-M
EMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25
% BSA含有HBSSで洗浄した後、抗CK抗体を分散したPBSに
浸漬し、室温で１時間静置した。ビーズを0.25%BSA含有
HBSSで洗浄し、HRPで標識した抗マウスIgG抗体溶液を25
0ml加え、室温で１時間静置した。0.25%BSA含有HBSSで
洗浄し、発色試薬を250ml加えた。室温で１５分間静置
した後、1規定硫酸を250ml加えて反応を停止させ、分光
光度計により450nmの吸光度を測定したところ、実施例
１５、１６のそれぞれにおいてコントロールと比較し
て、吸収に差がみられなかった。
Ａ（実施例１５）、固定化ビーズＢ（実施例１６）を、
それぞれマウス繊維芽細胞株L929を懸濁した10%FCS D-M
EMに浸漬し、37℃で１時間振盪した。そのビーズを0.25
% BSA含有HBSSで洗浄した後、抗CK抗体を分散したPBSに
浸漬し、室温で１時間静置した。ビーズを0.25%BSA含有
HBSSで洗浄し、HRPで標識した抗マウスIgG抗体溶液を25
0ml加え、室温で１時間静置した。0.25%BSA含有HBSSで
洗浄し、発色試薬を250ml加えた。室温で１５分間静置
した後、1規定硫酸を250ml加えて反応を停止させ、分光
光度計により450nmの吸光度を測定したところ、実施例
１５、１６のそれぞれにおいてコントロールと比較し
て、吸収に差がみられなかった。
【００２６】
【発明の効果】液体中に含まれる癌細胞を、その種類に
よらず、簡便にかつ特異的に検出することができる。
よらず、簡便にかつ特異的に検出することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ
Claims (10)
- 【請求項１】 癌細胞を含有する液体と、癌細胞と親和
性のある物質を接触させる工程と、該物質に結合した該
癌細胞を検出する工程を少なくとも含むことを特徴とす
る癌細胞検出システム。 - 【請求項２】人または動物の体液を癌細胞と親和性のあ
る物質に接触させて、体液中の癌細胞を検出する癌細胞
検出キットであって、癌細胞と親和性のある物質が糖
類、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、糖タン
パク質、糖ペプチド、およびビタミン酸から選ばれる少
なくとも１つである癌細胞検出キット。 - 【請求項３】該糖類がリン酸化糖を含むことを特徴とす
る請求項２に記載の癌細胞検出キット。 - 【請求項４】該糖類がマンノース−６−リン酸を含むこ
とを特徴とする請求項３に記載の癌細胞検出キット。 - 【請求項５】該糖類がマンノース−６−リン酸を末端と
するマンノース五量体であることを特徴とする請求項４
に記載の癌細胞検出キット。 - 【請求項６】該ポリペプチドが抗体またはその一部であ
ることを特徴とする請求項２に記載の癌細胞検出キッ
ト。 - 【請求項７】該ビタミン酸がレチノイン酸であることを
特徴とする請求項２に記載の癌細胞検出キット。 - 【請求項８】癌細胞と親和性のある物質を固定する担体
が、ビーズ、プレートおよびチューブから選ばれる少な
くとも１つであることを特徴とする請求項２に記載の癌
細胞検出キット。 - 【請求項９】該体液が、血液、血漿、血清、リンパ液、
尿、腹水、胸水、唾液および骨髄液から選ばれる少なく
とも１つであることを特徴とする請求項２に記載の癌細
胞検出キット。 - 【請求項１０】検出に用いる物質が、ポリペプチド、オ
リゴペプチド、ペプチド、糖類、ビタミン酸、アビジ
ン、ビオチンから選ばれる少なくとも一つであることを
特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の癌細胞検出
キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000146225A JP2001041959A (ja) | 1999-05-24 | 2000-05-18 | 癌細胞検出システムおよび癌細胞検出キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-143332 | 1999-05-24 | ||
| JP14333299 | 1999-05-24 | ||
| JP2000146225A JP2001041959A (ja) | 1999-05-24 | 2000-05-18 | 癌細胞検出システムおよび癌細胞検出キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001041959A true JP2001041959A (ja) | 2001-02-16 |
Family
ID=26475098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000146225A Pending JP2001041959A (ja) | 1999-05-24 | 2000-05-18 | 癌細胞検出システムおよび癌細胞検出キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001041959A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009539097A (ja) * | 2006-06-02 | 2009-11-12 | ファイザー・プロダクツ・インク | 循環腫瘍細胞アッセイ |
| WO2012086802A1 (ja) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | アークレイ株式会社 | 癌細胞の検出方法 |
-
2000
- 2000-05-18 JP JP2000146225A patent/JP2001041959A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009539097A (ja) * | 2006-06-02 | 2009-11-12 | ファイザー・プロダクツ・インク | 循環腫瘍細胞アッセイ |
| JP4943504B2 (ja) * | 2006-06-02 | 2012-05-30 | ファイザー・プロダクツ・インク | 循環腫瘍細胞アッセイ |
| US8940493B2 (en) | 2006-06-02 | 2015-01-27 | Veridex Llc | Circulating tumor cell assay |
| WO2012086802A1 (ja) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | アークレイ株式会社 | 癌細胞の検出方法 |
| EP2657346A1 (en) * | 2010-12-24 | 2013-10-30 | Arkray, Inc. | Method for detecting cancer cell |
| EP2657346A4 (en) * | 2010-12-24 | 2014-12-24 | Arkray Inc | METHOD FOR THE DETECTION OF CANCER CELLS |
| US9645154B2 (en) | 2010-12-24 | 2017-05-09 | Arkray, Inc. | Method for detecting cancer cell |
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