CN110873711B - 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了试剂盒及其用途,其中,该试剂盒包括:已固定或欲固定至固体载体的第一多克隆抗体;以及标记物标记的第二多克隆抗体,其中,所述第一多克隆抗体和所示第二多克隆抗体均为鸡抗人IgY‑TK1多克隆抗体,并且,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体均特异性结合于胸苷激酶1。该试剂盒的检测灵敏度和准确度高,操作简单方便,适用于人群体检筛查影像不可检测的微小恶性肿瘤/癌前疾病和肿瘤风险评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,涉及磁微粒免疫夹心法技术的全自动化学发光分析仪的试剂盒的开发及其在常规人群体检筛查的应用的有效性。
背景技术
免疫磁微粒分离技术是一项基于抗原-抗体特异性结合所开展的免疫学技术。它主要是靠标记在磁微粒表面的修饰基团,如氨基、羧基、甲苯磺酰基、链霉亲和素等基团,与标记抗体共价或非共价偶联,可用于结合特异性抗原,在全自动免疫化学发光分析仪中,进行对应抗原物质的分离。
胸苷激酶1是一种在细胞质中表达并将脱氧胸苷(dTdR)转化为磷酸胸苷酸的激酶。它是dTdR通过补救途径引入到DNA合成的唯一途径的关键激酶。TK1的表达与细胞周期密切相关,它在细胞周期中的调控确保了DNA复制中3-磷酸胸苷酸的供应。这种方式补充了肿瘤细胞异常增殖时的DNA合成的需要。TK1的水平升降与DNA在细胞周期的S期DNA合成速度密切相关,处于增殖期的肿瘤细胞中TK1的水平在细胞周期的G1和S期交界处开始升高,随着细胞进入G1晚期,TK1酶的水平逐渐急剧上升,直至S和G2期交界处。因此TK1酶被称为S期特殊酶。在血清中检测胸苷激酶1的含量能够有效的在健康体检中筛选出在未来一段时间内癌前疾病进展为恶性肿瘤的高风险人群,同时也能应用于临床科室,监测恶性肿瘤患者的疗效、预后以及复发风险。但现有的检测胸苷激酶1的检测***不能自动化操作并重复准确度不高,影响检测结果的判断。由此,检测胸苷激酶1的试剂盒有待改进。
发明内容
本发明目的在于提出一种试剂盒可以适用于全自动化学发光分析仪,检测的准确度高,操作简单方便,适应于常规大规模人群筛查。
肿瘤疾病的特征是异常的细胞增殖。在某些酶和蛋白质中与细胞生长调控通路相关的多个基因突变导致正常细胞调节失控,从而导致恶性肿瘤异常增殖的发展。新的肿瘤增殖标志物的研发和检测技术建立是肿瘤精准检测和预防医学的重要课题之一。早在1950年,胸苷激酶1(TK1)被发现并公认是一个精准的蛋白质分子靶点,用于评估细胞增殖速率。TK1-嘧啶补救途径的酶,催化胸苷(dTDR)转化为胸苷一磷酸(dTMP)。哺乳动物的细胞周期中TK1被称为DNA合成的关键酶和S期特异性酶。TK1水平与DNA合成率密切相关,进而与肿瘤细胞增殖密切相关。发明人设计了人TK1抗原,成功的制备了鸡抗人TK1-IgY抗体,建立了商用型的高敏感的免疫增强化学发光斑点印迹(ECL斑点印迹)的检测试剂盒,测定血清中的TK1浓度,证实这检测***适用于各类肿瘤的疗效监测,癌症患者的复发和生存率,特别是早期发现癌前疾病恶性肿瘤和预测肿瘤发展的风险进程,是一预测肿瘤动态进程的风险的优选的生物标志物。基于对体检人群大数据血清样本35365人的荟萃(Meta)研究,发明人设定了STK1p(血清胸苷激酶1蛋白)=2pmol/L为一合理“风险阈值”,有效的评估常规人群筛查中的异常细胞生长速度。在6年内发生新发恶性肿瘤的发病率比中国肿瘤统计新发病率(0.2%-0.3%)高出3-5倍。与STK1p低风险组比较(≦2pmol/L),STK1p高风险组在11年内发生新的恶性肿瘤风险甚至更高(44倍)。现发表的总数为160086例的体检荟萃(Meta)研究,进一步验证了这检测试剂盒,适用于早期肿瘤发现,包括癌前疾病,与肿瘤相关的风险疾病和为早期微小潜伏的恶性肿瘤。但这方法仍为半自动化,特别是血清3微升点样需要精细手动技术操作,重复性不理想(检测的标准标准误差有时超过15%),不适应于常规大规模人群筛查。
因而,根据本发明的一个方面,本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例,该试剂盒包括:已固定或欲固定至固体载体的第一多克隆抗体;以及标记物标记的第二多克隆抗体。其中,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体均为鸡抗人IgY-胸苷激酶1(IgY-TK1)多克隆抗体,并且,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体均特异性结合于胸苷激酶1。
根据本发明实施例的试剂盒,发明人通过对大量胸苷激酶1(TK1)抗体进行筛选,发现第一多克隆抗体和第二多克隆抗体这两种鸡抗人IgY-TK1多克隆抗体能同时识别TK1的抗原表位的不同微区,即两种相同来源的多克隆抗体能同时与抗原的不同表面决定簇特异性结合,从而形成双抗体夹心复合物。基于检测复合物中的发光标记物标记的多抗上带的发光标记的光强度来判断样品中TK1抗原的浓度。并且,发明人研究发现,鸡抗人IgY-TK1,相对于其他动物来源的IgY-TK1,对血清中的TK1的结合的灵敏度和特异性更好。
进一步地,本发明实施例的试剂盒的检测灵敏度高、特异性强,检测时间短,检测成本低,自动化操作和易于推广。根据本发明的实施例,基于本发明实施例的试剂盒的检测结果能有效用于人群体检筛查,对有肿瘤疾病风险进程患者和非肿瘤疾病者进行区别,检测的重复准确率高。
进一步的,本发明实施例的试剂盒与全自动化学发光免疫分析仪配合使用,对样品中的胸苷激酶1进行检测,实现检测过程的全自动化,减少人为操作造成的误差。
其中,需要说明的是,本申请采用第一多克隆抗体和第二多克隆抗体两种多克隆抗体形成双抗体夹心复合物,而不是现有的鼠来源的单克隆抗体和多克隆抗体形成双抗体夹心复合物。现越来越多的肿瘤疾病患者采用单克隆小鼠抗体进行免疫治疗,其中一个干扰因素是人抗鼠IgG单克隆抗体(HAMA),因此经常引起抗体应答效应。在肿瘤治疗方面,特别是采用鼠单克隆抗体治疗时,又用单克隆抗体类型的肿瘤相关的标志物进行检测,将增加HAMA在体内的发生率。鸡抗体检测方法监视疗效的优点是不与HAMA反应。因此,本发明实施例的试剂盒采用鸡抗体的免疫测定法从理论上应该优于使用哺乳动物抗体。TK1-IgY多克隆抗体显示出比单抗体检测更具有优势,检测结果也更准确。
其中,需要说明的是,本发明实施例的第一和第二多克隆抗体为鸡抗人IgY抗体,采用鸡抗人IgY抗体具有以下优点的至少一种:
(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在分子遗传差异性;
(2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性;
(3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比较,IgY具有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子,即IgY);
(4)IgY抗体不激活人补体***,从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的激活;
(5)类风湿因子(RF)不与IgY抗体反应。这种RF是许多免疫测定中非特异反应的主要来源,因为RF与哺乳动物抗体IgG的Fc部分反应,可导致病人和健康人血清的假阳性。
另外,根据本发明上述实施例的试剂盒还可以具有如下附加的技术特征:
根据本发明的实施例,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体识别的抗原表位包括:
碳端的第三肽段,所述第三肽段具有SEQ ID NO:3所示的序列,是血清TK1形式的非常关键的特异性表位。该序列如下所示:
NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3)
还包括选自胸苷激酶1下述肽段的至少二种:碳端的第一肽段,该第一肽段是一个可及性表位,所述第一肽段具有SEQ ID NO:1所示的序列,该序列如下所示:
GQPAGPDNKEN(SEQ ID NO:1)
碳端的第二肽段,所述第二肽段具有SEQ ID NO:2所示的序列,该序列如下所示:
GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)
碳端的第四肽段,所述第四肽段具有SEQ ID NO:4所示的序列,该序列如下所示:
NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)
碳端的第五肽段,所述第五肽段具有SEQ ID NO:5所示的序列,该序列如下所示:
PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)。
根据本发明的实施例,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体是利用第一抗原对鸡进行免疫得到的,其中,所述抗原为人胸苷激酶1的碳端的多肽。发明人对大量的胸苷激酶1的不同肽段进行筛选,发现位于C端的胸苷激酶1的肽段免疫得到的抗体与TK1结合的特异性好和灵敏度高,并且,该抗体能够与血清中的TK1结合,从而实现对血清中TK1的检测。而其它肽段免疫得到的抗体几乎难以与血清TK1结合,无法对血清中TK1进行有效的检测。并且该抗体经过15年的临床实践以及超过10万例的样本分析得出结论,该抗体能够有效识别血清TK1并区分出增殖高风险人群。
根据本发明的实施例,所述抗原具有SEQ ID NO:6所示的序列,该序列如下所示;
GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ(SEQ ID NO:6)
进一步地,该抗原可以识别的表位含有4个特异性表位和一可及性表位,
其中,四个特异性表位和一可及性表位分别是:
碳端的第一肽段,一个可及性表位,所述第一肽段具有SEQ ID NO:1所示的序列,该序列如下所示:GQPAGPDNKEN(SEQ ID NO:1)
碳端的第二肽段,所述第二肽段具有SEQ ID NO:2所示的序列,该序列如下所示:
GEAVAARKLF(SEQ ID NO:2)
碳端的第三肽段,所述第三肽段具有SEQ ID NO:3所示的序列,该序列如下所示:
NCPVPGKPGEAV(SEQ ID NO:3),是血清TK1形式的非常关键的特异性表位。
碳端的第四肽段,所述第四肽段具有SEQ ID NO:4所示的序列,该序列如下所示:
NCPVPGKPGE(SEQ ID NO:4)
碳端的第五肽段,所述第五肽段具有SEQ ID NO:5所示的序列,该序列如下所示:
PVPGKPGEAV(SEQ ID NO:5)
发明人采用ELISA测定方法,检测碳端的第一肽段前述抗原免疫制备的IgY-TK1多克隆抗体,结果表明这抗体与上述的四个特异性表位和可及性区域(GQPAGPDNKEN195~205)都有免疫应答反应,但不同母鸡来源的抗体显示对四个特异性表位和可及性表位有不同的免疫应答反应百分比。碳端的第三肽段的表位显示出主要和最强的免疫反应。具体地,用人胸苷激酶1的C端的多肽做抗原免疫的每个母鸡,分别得到的抗体的免疫应答反应是有差异的,其中,第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗可以是通过免疫同一种属的两只的鸡得到抗体是识别不同表位应答反应的多克隆抗体,实现了本试剂盒夹心法的配对。根据本发明的实施例,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体识别的抗原表位均选自胸苷激酶1上述第一-第五肽段的至少3-4种,其中必须有碳端的第三肽段。
根据本发明的实施例,进一步包括:标记识别物偶联的底物发光催化,所述标记识别物特异性识别所述标记物;发光底物,所述发光底物在所述底物发光催化剂的作用下发出光信号。由此,通过标记识别物特异性识别标记物,形成了特异性信号放大体系,使得检测灵敏度和重复性提高,检测时间缩短。根据本发明的具体实施例,所述标记物为生物素,所述标记识别物为链霉亲和素。由此,采用生物素-链霉亲和素高特异性信号放大体系,检测灵敏度和重复性显著提高,反应时间由传统检测方法的7个小时缩短至50分钟。
根据本发明的实施例,该发光底物为APS-5。
根据本发明的实施例,该底物发光催化剂可以是碱性磷酸酶,则标记识别物偶联的底物发光催化剂可以是碱性磷酸酶标记的链霉亲和素;底物发光催化剂也可以是辣根过氧化物酶,则标记识别物偶联的底物发光催化剂可以是亲和素辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
根据本发明的实施例,所述固体载体为磁微粒。由此,通过将多克隆抗体偶联在磁微粒上,从而实现了免疫化学发光技术与全自动磁微粒免疫发光分析仪相结合,提供了一种接近均相的反应体系,并且采用了发光标记物-标记识别物的高特异性信号放大体系,使得检测灵敏度、重复性大大提高,反应时间由传统检测方法的7个小时缩短至50分钟。
根据本发明的实施例,所述磁微粒的粒径为2-5微米。优选地,该磁微粒的粒径为3微米。由此,磁微粒的粒径适宜,与全自动化学发光免疫分析仪的匹配度更好,在相匹配的磁场情况下能够得到更高效率的分离程度,同时该粒径范围的磁微粒对抗体的结合程度高,有利于提高检测的精度。
根据本发明的实施例,磁微粒偶合的第一抗体的制备方法如下:
1)将充分混匀后的甲苯磺酰基磁微粒浓缩液放入反应瓶中,将该反应瓶放置在磁场中15~20分钟,待甲苯磺酰基磁微粒全部被磁场吸附后,吸去上清,向反应瓶中加入2~20倍体积的磁微粒活化缓冲液,震荡洗涤10m分钟,再将反应瓶放置在磁场中15~20分钟,吸去上清;重复清洗甲苯磺酰基磁微粒2遍;最后将甲苯磺酰基磁微粒溶液稀释至1~20mg/ml,混匀待用;
2)连接反应按照质量比甲苯磺酰基磁微粒溶液:第一抗体=1000:1-10的比例在步骤1)中所制备得到的甲苯磺酰基磁微粒溶液中加入第一抗体,加入总体积1/10~1/2的磁微粒催化缓冲液,在37℃中保持混匀状态反应18小时;
3)在步骤2)中制备得到的磁微粒溶液中加入溶液总体积1/50~1/10的10%BSA,在37℃中保持混匀状态反应6小时;
4)反应瓶在磁场中放置15min,待甲苯磺酰基磁微粒吸附至磁场后用磁微粒清洗液清洗3遍,随后定容至1mg/ml,2~8℃保存,制得磁微粒偶合的第一抗体。
其中,该磁微粒活化缓冲液的配制方法是将5.18~7.36g硼酸溶于900ml去离子水中,用NaOH调整pH至8-10,定容至1L后用0.45μm滤膜过滤;所述磁微粒催化缓冲液的配制方法是:将100-150g硫酸铵溶解于1L磁微粒活化缓冲液中,完全溶解后用0.45μm滤膜过滤;所述磁微粒清洗液是pH7.4 TBST缓冲液。
根据本发明的实施例,进一步包括校准品、质控品、抗试剂、稀释液和洗涤液。
洗涤液是pH7.4 TBST缓冲液;
稀释液的制备方法:将0.1g~10g封闭剂溶于1L Tris缓冲液,加入0.1ml~5ml防腐剂,完全溶解后0.22μm滤膜过滤后制备而成。
抗试剂的配制方法:将0.1g~10g封闭剂溶于1L Tris缓冲液,加入0.1ml~5ml防腐剂,完全溶解后0.22μm滤膜过滤后制备而成。
根据本发明的实施例,校准品和质控品均为TK1纯品,其中,校准品包括5个浓度,用以确定标准曲线以计算浓度;质控品包括2个浓度,使用质控品来确认试剂的有效性,测试质控品结果是否在规定的范围内。
为了便于利用本发明实施例的试剂盒,在此提供利用该试剂盒测定血清中胸苷激酶1含量的一般方法,包括以下步骤:
1)将试剂盒中的试剂依次放入配套全自动化学发光分析仪中;
2)全自动化学发光分析仪分别吸取1~10ul待测样本、10~100ul稀释液、10-100ul磁微粒试剂、10~100ul抗试剂依次加入到反应杯中,37℃反应10分钟,在通过清洗装置进行磁分离,弃上清后用洗涤液对复合物沉淀清洗1~6次;
3)在反应杯中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶试剂10~100ul,37℃反应10分钟,再通过清洗装置进行磁分离,弃上清后用洗涤液对复合物沉淀清洗1~6次;
4)将发光底物10~500ul加入含有复合物沉淀的反应杯中,反应1~5分钟,进入暗箱读取发光值。样本中胸苷激酶1的含量与发光值成正相关关系,通过发光标准曲线计算胸苷激酶1的含量。
本发明实施例的试剂盒的技术原理为:偶合第一抗体的磁微粒与标记有生物素的第二抗体和样本、校准品或质控品中的胸苷激酶1结合形成夹心复合物。随后加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素试剂,链霉亲和素与生物素特异性结合并且起到信号放大作用,在外磁场的作用下,将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离,清洗复合物后,加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时发出光子,形成发光反应,通过全自动化学发光免疫分析仪光电倍增管读取光子强度并转换成数字信号。在检测范围内,发光强度与样本中的胸苷激酶1含量成正比,使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中胸苷激酶1的浓度。
根据本发明提供的试剂盒,其检测的特异性是通过比较分析测定肿瘤细胞TK1阳性株和TK1阴性株中TK1的水平,验证本发明提供的试剂盒检测TK1的特异性。
根据本发明的另一方面,本发明提供了试剂盒在检测胸苷激酶1中的用途。血清中检测胸苷激酶1可以反映细胞异常的增殖度,因而能在早于影像学检测的情况下,在体检人群中预警早期潜在的异常细胞增殖,警示被检者可能进程为恶性肿瘤的风险,同时,也可以用于检测微小肿瘤的增殖速率。
根据本发明的又一方面,本发明提供了前述的试剂盒在影像不可检测的微小恶性肿瘤和肿瘤风险评估中的用途。也就是说,该试剂盒可以评估早期发现恶性肿瘤和预测肿瘤发展的风险进程的有效性。换句话说,在肿瘤的早期,由于瘤体的体积较小,影像学难以检测到,通过本发明实施例的试剂盒,通过对胸苷激酶1的检测和分析,结合其他的医学检测,可以对肿瘤的发病进行早期的判断,并可用于肿瘤的风险评估。具体地,利用该试剂盒检测试方法包括使用根据所述实施方案的方法或试剂盒来测定来自所述体检人群受试者的身体样本中的血清TK1物质的水平。然后将所述血清样本中的血清TK1物质的水平或与先前在所述受试者中测得的血清TK1物质的水平相比较。如果所测得的血清TK1水平升高,表明所述受试者中的肿瘤相关的风险疾病进程增加可能性。
根据本发明的又一方面,本发明提供了一种用于测定受试者血清中细胞异常增殖的方法,该方法尤其适用于体检人群。根据本发明的实施例,该方法包括:利用前述的试剂盒测定所述患者血清中的胸苷激酶1的含量;并基于所述血清胸苷激酶1的含量评价所述受试者的细胞增殖是否异常。
根据本发明的一个具体实施例,测定正常或肿瘤细胞增殖的水平且与所测得的血清TK1的水平相比较,以确定受试者是具有正常或基线细胞增殖还是升高的细胞增殖。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明实施例的标准曲线图;
图2显示了根据本发明实施例的检测血清TK1浓度分布与人数%的结果图,其中,A为试剂盒1,B为试剂盒2,C为试剂盒3;
图3显示了根据本发明实施例的试剂盒,肿瘤细胞TK1阳性细胞株裂解液的稀释浓度高低与TK1的表达高低有相关性的结果图;
图4显示了根据本发明实施例的人STK1p浓度与肿瘤生长之间相关性的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
下面参考具体实施例,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品,例如可以采购自Sigma公司。
实施例1
本发明实施例的试剂盒包括校准品、质控品、封闭剂、偶合第一抗体的磁微粒试剂、生物素标记的第二抗体,链霉亲和素标记的碱性磷酸酶、发光底物、抗试剂、稀释液、洗涤液的制备方法如下:
1、偶合第一抗体的磁微粒试剂
1)将充分混匀后的甲苯磺酰基磁微粒浓缩液放入反应瓶中,将该反应瓶放置在磁场中15分钟,待甲苯磺酰基磁微粒全部被磁场吸附后,吸去上清,向反应瓶中加入10倍体积的磁微粒活化缓冲液,震荡洗涤10m分钟,再将反应瓶放置在磁场中151分钟,吸去上清;重复清洗甲苯磺酰基磁微粒2遍;最后将甲苯磺酰基磁微粒溶液稀释至10mg/ml,混匀待用;
2)连接反应按照质量比甲苯磺酰基磁微粒溶液:第一抗体=100:1的比例在步骤1)中所制备得到的甲苯磺酰基磁微粒溶液中加入第一抗体,加入总体积1/10的磁微粒催化缓冲液,在37℃中保持混匀状态反应18小时;
3)在步骤2)中制备得到的磁微粒溶液中加入溶液总体积1/20的10%BSA,在37℃中保持混匀状态反应6小时;
4)反应瓶在磁场中放置15min,待甲苯磺酰基磁微粒吸附至磁场后用磁微粒清洗液清洗3遍,随后定容至1mg/ml,4℃保存,制得磁微粒偶合的第一抗体。
其中,该磁微粒活化缓冲液的配制方法是将5.18~7.36g硼酸溶于900ml去离子水中,用NaOH调整pH至8-10,定容至1L后用0.45μm滤膜过滤;
磁微粒催化缓冲液的配制方法是:将100-150g硫酸铵溶解于1L磁微粒活化缓冲液中,完全溶解后用0.45μm滤膜过滤;
磁微粒清洗液是pH7.4 TBST缓冲液。
2、生物素标记的第二抗体
使用PBS配制成2-5mg第二抗体溶液,生物素使用DMSO配制成5~50mM溶液,添加biotin溶液到抗体溶液里混匀,冰浴2小时或室温反应30分钟,制得生物素标记的第二抗体溶液。
3、发光底物
APS-5(购于华信行)
4、封闭剂
脱脂奶粉
5、稀释液
将0.1g~10g封闭剂溶于1L Tris缓冲液,加入0.1ml~5ml防腐剂,完全溶解后0.22μm滤膜过滤后制备而成。
6、抗试剂
将生物素化抗胸苷激酶1-IgY多克隆抗体稀释至终浓度为0.2μg/ml。
7、洗涤液
pH7.4 TBST缓冲液(30倍浓缩液)
8、链霉亲和素标记的碱性磷酸酶
链霉亲和素标记的碱性磷酸酶是购买Invitrogen链霉亲和素标记的碱性磷酸酶,使用稀释液稀释50000倍后制得。
实施例2
对实施例1得到的检测血清TK1的试剂盒进行评估,具体方法如下:
1.样本制备:
(1)基础血清:血清1ml(浓度2.2pmol/L)+蒸馏水0.1ml;
(2)回收样本1:血清1ml+0.1ml TK1抗原溶液(浓度11pmol/L);
(3)回收样本2:血清1ml+0.1ml TK1抗原溶液(浓度80pmol/L)。
(4)质控样本1:取1ml标准品1+5ml标准品稀释液(终浓度为2.2pmol/L)
(5)质控样本2:取1ml标准品1+1ml标准品稀释液(终浓度为10pmol/L)
2.实验前准备
1)取一瓶洗涤液用纯化水进行30倍稀释;
2)将磁微粒试剂充分混匀至无肉眼可见沉淀。
3.实验方法,本试剂盒由全自动化学发光分析仪自动完成,也可手工操作完成。
1)在检测管中加入10μl待测样本,60μl样本稀释液以及30μl磁微粒试剂混匀,在37℃下温育10分钟;
2)添加磁场,使检测管中反应体系的磁微粒沉降,去除上清液,清洗多次后,去除磁场;
3)向步骤2)洗涤后的体系中加入100μl抗试剂在37℃下温育10分钟;
4)添加磁场,使检测管中反应体系的磁微粒沉降,去除上清液,清洗多次后,去除磁场;
5)向步骤4)中洗涤后的体系链霉亲和素标记的碱性磷酸酶试剂100μl,在37℃下温育10分钟;
6)添加磁场,使检测管中反应体系的磁微粒沉降,去除上清液,清洗多次后,去除磁场;
7)加入200μl化学发光底物,充分混匀后,室温避光反应2min,检测相对发光强度(RLU)。
5、标准曲线
1)标准品的制备
将31肽抗原冻干粉(外购)溶于标准品稀释液中(10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4,150mM NaCl,1%BSA,5%甘油,pH7.4)配制成1mg/ml浓度,使用试剂盒3测试及确认此抗原溶液浓度,测试后将调整至浓度20pmol/L(标准品1)。继续使用标准品稀释液将标准品1稀释3倍,得到标准品2,将标准品2使用标准品稀释液稀释3倍得到标准3,将标准品3稀释2倍得到标准品4,将标准品稀释液作为标准品5.得到标准品1-5的理论浓度分别为:20pmol/L、6.6pmol/L、2.2pmol/L、1.1pmol/L以及0pmol/L。
2)标准曲线的绘制
对5个标准品使用试剂盒1进行测试,得出发光值。按照理论浓度结合发光值绘制出标准曲线,如图1所示,R值为0.999。
6、回收率实验
将基础血清、回收样本1和回收样本2,每种样本分别按照本发明所述的方法重复测定3次,结果如下:
7、精密度实验
质控样本1(2.2pmol/L)和质控样本2(10pmol/L)分别按照本发明所述的方法重复各测试20次,结果如下:
实验结果表明,本发明实施例的试剂盒具有较高的回收率和精密度。
实施例3
本实施例中,利用三种试剂盒对148例体检血清进行TK1检测,这三种试剂盒分别使用3种不同抗体及方法,具体如下:
试剂盒1:实施例1得到试剂盒,并匹配全自动化学发光免疫分析仪进行测试;
试剂盒2:该试剂盒含有实施例1的31肽免疫得到的IgY多抗与实施例1的31肽免疫得到的小鼠IgG单抗形成的夹心IgY+IgG,并匹配全自动化学发光免疫分析仪的试剂盒测试;
试剂盒3:斑点印迹增强型化学发光(ECL)免疫检测试剂盒(购自华瑞同康生物技术有限公司,商品名:胸苷激酶1(TK1)细胞周期分析试剂盒)
检测发现,试剂盒1与试剂盒3的检测结果符合率为73%,而试剂盒2与试剂盒3的检测结果符合率仅为54%,。具体实验结果见图2,如图试剂盒1和3所示,对人群体检个体的血清TK1浓度值从低到高值的分布,采用Excel做图进分析,其特点与现发表的常规体检筛查人群调查研究相同,图3显示试剂盒1与试剂盒3的分布特点为近似的正态分布,主峰在0.2-0.3pmol/L之间,当STK1p浓度从0.6pmol/L逐渐上升到2pmol/L,发现有一微小的连续降低尾峰,体检人群的血清TK1浓度分布呈现为近似正态分布特点的观察事实是一重要的发现,指出血清TK1p浓度分布符合自然规律分布,其测定灵敏度可达到0.1-0.2pmol/L。但观察血清TK1浓度的分布位于0.6pmol/L-2.0pmol/L->2.0pmol/L之间有一个升高连续小尾峰,这种升高连续小尾峰反映了这区段个体人群将可能有发展癌前疾病/恶性肿瘤的风险升高。但试剂盒2,血清TK1值出现83%的负值,血清TK1值也不显示有一主峰在0.2-0.3pmol/L之间为近似的正态分布特点,说明灵敏度不高。
实施例4
本实施例中,使用实施例3中的试剂盒1与试剂盒2对TK1阳性细胞株及阴性细胞株的细胞裂解液进行TK1测试,具体如下:
将TK1阳性细胞株(人结肠肿瘤TK1+:ht29)及TK1阴性细胞株(人结肠肿瘤:143bTK-,TK1基因敲除细胞)分别培养至细胞对数生长期,浓度为1*107/ml,取1ml细胞悬浮液离心后,去上清加入1ml细胞裂解液(50mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA,1%NP40),4℃处理20min,15 000转离心10min后取上清。用PBS分别稀释阴性细胞株裂解液以及阳性细胞株裂解液,阴性细胞株裂解液稀释10倍,阳性细胞株裂解液分别稀释10倍,50倍,100倍后,使用试剂盒1和试剂盒2分别测试此细胞裂解液。
试剂盒1的检测结果见图3。TK1阳性细胞株裂解液的稀释浓度高低与TK1的表达高低有相关性,但试剂盒2的结果异常,没有发现TK1阳性细胞株裂解液的稀释浓度高低与TK1的表达高低有相关性(图未显示)。按照检测结果在图中给出的阳性细胞株的TK1值的数据,计算出一个对数期生长的肿瘤细胞含有≈0.021pg TK1蛋白质,按一个肿瘤细胞总蛋白质为200pg计算,仅为0.01%(0.021pg/200pg总蛋白=0.01%)。所以TK1在一个生长的肿瘤细胞中的含量很低的,只有灵敏度高的检测***才能进行准确的检测。当肿瘤细胞中的TK1释放到血液中,按照人体血液约5000毫升量计算,需有5200万个生长肿瘤的细胞数,即可检测到血清中的TK1值,但现有的成像***需要10亿个肿瘤细胞,达到直径约1mm的小肿瘤,才可能被影像检出。
本发明的试剂盒1检测***,具有高灵敏度,在影像不可检测的微小恶性肿瘤情况下,检测出血清TK1值的升高,预警患者有异常增殖细胞的癌前疾病/影像不可检测的微小恶性肿瘤。按照试剂盒图2和3,绘制了STK1p的值与肿瘤细胞生长数(增殖速度)及时间的相关示意图4。其中,影像检测阈值线下方表示影像不可检测或不可触摸的癌前基本或微小恶性肿瘤,影像检测阈值线上方表示影像可检测或可触摸的恶性肿瘤,本发明实施例的试剂盒可检测STK1>2pmol/L,影像不可检测的微小恶性肿瘤/异常增殖细胞的癌前疾病。如图所示,血清TK1表达在肿瘤生长早期和中期与肿瘤细胞生长数密切相关(小于10亿个肿瘤细胞),然而,在许多情况下,血清TK1表达在肿瘤生长的晚期呈现下降,这是因为肿瘤生长后期虽然肿瘤组织增大并达到一较大的体积,并通过影像可检测,但此类较大的肿瘤组织中心会出现不同程度的组织坏死,导致增殖速率下降,STK1p浓度水平相应低下。进而,利用本发明实施例的试剂盒可通过检测血清TK1的升高值对影像不可检测的微小潜伏恶性肿瘤进行早期的检测,同时,也可以用异常增殖细胞的癌前疾病进程风险评估。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 华瑞同康生物技术(深圳)有限公司
<120> 一种基于全自动化学发光分析仪的血清TK1检测试剂盒
<130> PIDC4180130
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第一肽段
<400> 1
Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第二肽段
<400> 2
Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第三肽段
<400> 3
Asn Cys Pro Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> NCPVPGKPGE
<400> 4
Asn Cys Pro Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第五肽段
<400> 5
Pro Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val
1 5 10
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗原
<400> 6
Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val Pro Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro Gln
20 25 30
Claims (10)
1.一种试剂盒,其特征在于,包括:
已固定或欲固定至固体载体的第一多克隆抗体;以及
标记物标记的第二多克隆抗体,
其中,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体均为鸡抗人IgY-胸苷激酶1多克隆抗体,并且,所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体均特异性结合于胸苷激酶1;
所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体识别的抗原表位包括:
碳端的第三肽段,所述第三肽段具有SEQ ID NO:3所示的序列;以及
选自下述肽段的至少二种:
碳端的第一肽段,所述第一肽段具有SEQ ID NO:1所示的序列;
碳端的第二肽段,所述第二肽段具有SEQ ID NO:2所示的序列;
碳端的第四肽段,所述第四肽段具有SEQ ID NO:4所示的序列;
碳端的第五肽段,所述第五肽段具有SEQ ID NO:5所示的序列;
所述第一多克隆抗体和所述第二多克隆抗体是利用抗原对不同的鸡进行免疫得到的,其中,所述抗原为人胸苷激酶1的碳端的多肽;
所述抗原具有SEQ ID NO:6所示的序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括:
标记识别物偶联的底物发光催化剂,所述标记识别物特异性识别所述标记物;
发光底物,所述发光底物在所述底物发光催化剂的作用下发出光信号。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述标记物为生物素,所述标记识别物为链霉亲和素。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固体载体为磁微粒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述磁微粒的粒径为2-5微米。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括校准品、质控品、抗试剂、稀释液和洗涤液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,洗涤液是pH7.4 TBST缓冲液;
稀释液的制备方法包括:将0.1g~10g封闭剂溶于1L Tris缓冲液,加入0.1ml~5ml防腐剂,完全溶解后0.22μm滤膜过滤后制备而成;
抗试剂的配制方法包括:将0.1g~10g封闭剂溶于1L Tris缓冲液,加入0.1ml~5ml防腐剂,完全溶解后0.22μm滤膜过滤后制备而成;
校准品和质控品均为TK1纯品,其中,校准品包括5个浓度;质控品包括2个浓度。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在体外检测胸苷激酶1中的用途,所述用途用于非疾病诊断目的。
9.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在体外进行影像不可检测的微小恶性肿瘤和肿瘤/ 癌前疾病风险评估中的用途,所述用途用于非疾病诊断目的。
10.一种用于在体外测定受试者中细胞异常增殖的方法,所述方法用于非疾病诊断目的,其包括:
利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒测定所述受试者 血清中的胸苷激酶1的含量;以及
基于所述胸苷激酶1的含量评价所述受试者的细胞增殖是否异常。
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