【発明の詳細な説明】
トロンボポイエチン・ポリペプチドの製造のための発現ベクター、細胞、及び方
法
本発明の背景
造血は、骨髄内の多能性幹細胞から血液細胞が発達し、そして分化する過程で
ある。この過程は、標的細胞上の膜結合レセプターを介して作用するポリペプチ
ド成長因子（サイトカイン）の複雑な相互作用を含む。サイトカイン作用は、し
ばしば系統特異的及び／又は段階特異的である特定のサイトカインに応答する、
細胞増殖及び分化をもたらす。幹細胞からの単一細胞型、例えば血小板の発達は
、適当な順番における複数のサイトカインの協調作用を必要とすることができる
。
知られたサイトカインは、インターロイキン類、例えば、IL-1，IL-2，IL-3，
IL-6，IL-8等；及びコロニー刺激因子、例えば、G-CSF，M-CSF，GM-CSF、エリス
ロポイエチン(EPO)等を含む。一般に、インターロイキンは、免疫及び炎症応答
のメディアターとして働く。このコロニー刺激因子は、骨髄由来細胞の増殖を刺
激し、成熟白血球を活性化し、そしてさらに炎症性、感染性、及び免疫学的チャ
レンジに対する宿主応答の不可欠な部分を形成する。
さまざまなサイトカインが治療剤として開発されてきた。例えば、赤血球の発
達を剌激するエリスロポイエチンは、腎不全から生じる貧血症の治療において使
用される。このコロニー刺激因子のいくつかは、患者の免疫系の回復を促進する
癌化学療法に関連して使用されてきた。インターロイキン−２、ａ−インターフ
ェロン及びｃ−インターフェロンが特定の癌の治療において使用されている。巨
核球造血（megakaryocytopoiesis）及び血小板造血（thrombocytopoiesis）を刺
激する活性は、血小板減少症の動物の体液中で同定されており、そして“トロン
ボポイエチン(thrombopoietin)”として文献中に言及されている（最近、McDona
ld，Exp ．Hematol．16：201-205，1988及びMcDonald，Am ．J．Ped．Hematol．On col
．14：8-21，1992によりレビューされている）。この活性を精製し、そして
特徴付けする努力は、細胞Mplレセプターに結合し、そして巨核球造血及び血小
板造血を刺激するタンパク質のクローニングを導いた。de Sauvage et al.，Nat ure 369：533-538，1994；Lok et al.，Nature 369：565-568，1994；Kaushansk
y et al.，Nature 369：568-571，1994；Wending et al.，Nature 369：571-574
，1994；Bartley et al.，Cell 77：1117-1124，1994；及びWIPO公開WO 95／219
20を参照のこと。このMplレセプター結合性サイトカインがトロンボポイエチン
といわれる。
アミノ酸配列の分析は、成熟ヒトTPOが配列番号：２のアミノ酸残基１(Ser)か
らアミノ酸残基332（Gly）までにわたるということを示す。TPOは、タンパク質
分解に供され、そして不均質又は分解形態で単離されている(de Sauvage et al.
，Nature 369：533-538，1994；Bartley et al.，Cell 77：1117-1124，1994)。
25kD程の小さい分子種がインビトロにおいて活性であることが発見されており（
Bartley et al.，同書に）、そして174アミノ酸が（Bartley et al.，同書に）
インビトロにおいて活性であることが報告されている。同様に、完全長ヒトcDNA
の発現産物は活性を有し、これは、353アミノ酸の一次翻訳産物をコードしてい
る（Bartley et al.，同書に）。
大量に、かつ、経済的に、トロンボポイエチンを製造する必要性が本分野にお
いて存在する。真核微生物、例えば酵母内でトロンボ
ポイエチンを製造する方法の必要性も存在する。完全長分子よりもタンパク質分
解を受けにくい、トロンボポイエチンの低分子量形態の効率的な製造方法の必要
性もある。本発明は、上記の必要性を満し、かつ、他の関連する利点を提供する
。
本発明の要約
１の側面において、本発明は、真核宿主細胞内で複製することができる発現ベ
クターを提供する。これらのベクターは、以下の作用可能な状態で連結された要
素を含んで成る；（ａ）転写プロモーター；（ｂ）分泌リーダーをコードする第
１DNAセグメント；（ｃ）Ｃ−Ｘ−Ｂから成るトロンボポイエチン(TPO)ポリペプ
チドをコードする第２DNAセグメント、ここで、Ｃはヒト・トロンボポイエチン
・サイトカイン・ドメイン・ポリペプチドであり；Ｘはペプチド結合又は１又は
２のアミノ酸残基から成るリンカーであり、但し、Ｘは、単独又はＣ又はＢと共
に２塩基性アミノ酸対を提供しないという限定があり；そしてＢは配列番号：３
の残基１〜ｙから成るポリペプチドであり、ここで、ｙは５〜18の整数であり、
そしてＢのアミノ酸残基の35％以下が他のアミノ酸残基により個々に置換されて
おり；及び（ｄ）転写ターミネーター。本発明の１の態様においては、上記発現
ベクターは、酵母内で複製可能である。他の態様においては、上記分泌リーダー
はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のアルファ因子分
泌リーダーである。他の態様においては、ＢはArg-Argジペプチドを含まない。
さらなる態様においては、Ｂの残基番号４はThr又はAspであり；ｙは少なくとも
10であり、そしてＢの残基10はArg又はGluであり；そしてｙは少なくとも14であ
り、そしてＢの残基14はVal又はAlaである。他の態様においては、ｙは少なくと
も14であり、Ｂの残基４はThr
又はAspであり、Ｂの残基10はArg又はGluであり、そしてＢの残基14はVal又はAl
aである。他の態様においては、Ｘはペプチド結合であり又は単一のアミノ酸残
基である。
本発明の他の側面においては、先に開示したような発現ベクターを含む培養真
核細胞であって、上記TPOポリペプチドを製造し、かつ、分泌するものが提供さ
れる。好ましい態様においては、細胞は酵母細胞である。
本発明の第３の側面においては、Ｃ−Ｘ−Ｂ｛ここで、Ｃはヒト・トロンボポ
イエチン・サイトカイン・ドメイン・ポリペプチドであり；Ｘはペプチド結合又
は１又は２のアミノ酸残基から成るリンカーであり、但し、Ｘは、単独又はＣ又
はＢと共に、２塩基性アミノ酸対を提供しないという限定があり；そしてＢは配
列番号：３の残基１〜ｙから成るポリペプチドであり、ここで、ｙは５〜18の整
数であり、そしてＢの残基の35％以下が他のアミノ酸残基により個々に置換され
ている。｝から成るアミノ酸骨格を特徴とするトロンボポイエチン・ポリペプチ
ドが提供される。
本発明の第４の側面においては、先に開示したような発現ベクターでトランス
フェクトされ又は形質転換された真核宿主細胞を培養し（ここで、連結された第
１DNAセグメントと第２DNAセグメントが宿主細胞により発現されてTPOポリペプ
チドが製造される）、そしてそのTPOポリペプチドを回収する、ことを含むTPOポ
リペプチドの製造方法が提供される。
本発明の第５の側面においては、哺乳類において血小板数を増加させる方法で
あって、医薬として許容される賦形剤と共に先に開示したようなTPOをその哺乳
類に投与することを含む、前記方法が提供される。
本発明の上記の及び他の側面は、以下の詳細な説明を参照して明
らかになるであろう。
本発明の詳細な説明
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書中に使用する特定の用語を定義す
る：
用語“対立遺伝子変異体(allelic variant)”は、本明細書中、突然変異を通
じて生じた遺伝子の片側形態、又はその突然変異遺伝子によりコードされた変更
ポリペプチドを表すために使用される。遺伝子突然変異はサイレント（コードさ
れたポリペプチドにおいて変化がない）又は変更されたアミノ酸配列をもつポリ
ペプチドをコードすることができる。
“発現ベクター”は、その転写を規定する追加のセグメントに作用可能な状態
で連結された着目のポリペプチドをコードするセグメントを含む、直鎖状又は環
状のDNA分子である。このような追加のセグメントは、プロモーター配列とター
ミネーター配列を含む。発現ベクターは、１以上の複製起点、１以上の選択マー
カー、エンハンサー、ポリアデニレーション・シグナル、等を含むこともできる
。発現ベクターは、一般に、プラスミド又はウィルスDNAに由来し、又は両者の
要素を含むこともできる。用語“作用可能な状態で連結された(operably linked
)”とは、セグメントがそれらの意図された目的をもって協調して働く、例えば
、転写がプロモーター内で開始し、そしてコーディング・セグメントを通ってタ
ーミネーターまで進むように、それらセグメントが整列されていることを示す。
宿主生物内での発現ベクターの複製は、自律的に又は宿主ゲノム内への組み込み
を通して行われることができる。
用語“を特徴とする”は、特徴又は要素の限定を表すために使用される。例え
ば、与えられた配列のアミノ酸骨格を特徴とするポリ
ペプチドは列挙されたアミノ酸配列を含むが、追加のアミノ酸残基を含む。しか
しながら、このようなポリペプチドは、さらに、炭水化物鎖又は他の翻訳後修飾
を含むことができる。
“分泌リーダー”は、宿主細胞の分泌経路を通してタンパク質の通過を指令し
、そして容易にするポリペプチドである。分泌リーダーは、ときどき、プレプロ
配列ともいわれる。分泌リーダーは、疎水性アミノ酸のコアを特徴とするが、典
型的には（排他的にではなく）新たに合成されたタンパク質のアミノ末端に在る
。この分泌リーダーは、しばしば、１以上の解裂事件における分泌の間、その成
熟タンパク質から解裂される。このような分泌リーダーは、それらが分泌経路を
通るとき、その成熟タンパク質からのその分泌リーダーの解裂を許容するプロセ
ッシング部位を含む。
“プロモーター”は、RNAポリメラーゼが結合し、そしてmRNA合成が開始され
るところの遺伝子の一部分である。
“トロンボポイエチン(Thrombopoietin)”（又は“TPO”）は、同一種からのM
plレセプターに特異的に結合し、そしてインビボにおいて血小板製造を刺激する
能力を特徴とするタンパク質である。正常なテスト動物においては、TPOは、日
用投与を開始した後10日間以内に100％以上血小板レベルを上昇させることがで
きる。完全長TPOは、アミノ末端サイトカイン・ドメインとカルボキシル末端（
“Ｃ−末端”）ドメインを含む。配列番号：２を参照すると、そのサイトカイン
・ドメインは、７位と151位のシステイン残基により結合される。
用語“トロンボポイエチン・ポリペプチド”は、完全長トロンボポイエチン分
子、及びその生物学的に活性な部分、すなわち、その無傷の分子の定性的な生物
学的活性（レセプター結合性及びインビボにおける血小板製造の刺激）を示すト
ロンボポイエチンの断片、
を包含する。
完全長ヒト・トロンボポイエチンをコードする代表的なcDNAを、配列番号：１
に示す。当業者は、配列番号：１のDNA及びそのコードされたアミノ酸配列（配
列番号：２）がヒトTPO遺伝子の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変
異体が存在すると予想されるということを認めるであろう。配列番号：１の対立
遺伝子変異体は、異なる個体から調製された細胞、組織、又は核酸からのクロー
ニング、及び得られたクローンの配列決定により、得られることができる。
本明細書中に使用するとき、用語“トロンボポイエチン・サイトカイン・ドメ
イン・ポリペプチド”とは、そのコア・ポリペプチド（配列番号：２の残基７〜
151及び配列番号：２の対立遺伝子変異体の対応領域）をいい、これは、さらに
、その分子の不可欠な生物学的活性を破壊しない短いＮ−末端（例えば、配列番
号：２の残基１〜６）及び／又はＣ−末端(例えば、配列番号：２の残基152)伸
長物を含むことができる。これらの短い伸長物内にかなりの配列変化が許容され
る。ヒトTPOのＣ−末端ドメインは、配列番号：２の残基155（Ala）から残基332
（Gly）まで延びる。このドメインは、潜在的なＯ−及びＮ−結合グリコシル化
部位を含む。このドメインの全て又は一部は、生物学的活性の完全な損失を伴わ
ずに欠失されることができる。上記２つのドメインは、Arg-Argジペプチド(配列
番号：２の残基153〜154)により分離される。このジペプチドは、TPOの成熟の間
に解裂されるプロセッシング部位であるということが仮定されているけれども（
例えば、de Sauvage et al.,同書に）、本発明の譲受人により行われた研究は、
この部位で有意な解裂が生じないということを示している。
本明細書中に使用するとき、句“トロンボポイエチンＣ−末端ド
メインの部分”は、TPO Ｃ−末端ドメインの１アミノ酸から全体長TPOのＣ−末
端ドメインまで（Ｃ−末端ドメインを含む）を含む。一般に、このＣ−末端ドメ
インの部分は、その第１（アミノ末端）アミノ酸残基として、その対応の完全TP
OのＣ−末端ドメインの第１アミノ酸残基（すなわち、配列番号：２の残基155に
一致するアミノ酸残基）をもつ、天然TPO Ｃ−末端ドメインの隣接セグメントで
あろう。本発明において使用されるＣ−末端ドメインの部分は、好ましくは長さ
５〜18アミノ酸残基、より好ましくは長さ少なくとも９残基、最も好ましくは長
さ14〜18残基である。
本発明は、その方法内で有用である発現ベクター及び細胞と共に、トロンボポ
イエチン・ポリペプチドの改良製造方法を提供する。本発明は、一部、TPOポリ
ペプチド内の特定のアミノ酸の変更が真核宿主細胞による増加された分泌をもた
らすという発見に基づく。本発明においては、TPOポリペプチドの分泌は、生来
の分子のＣ−末端ドメインからそのサイトカイン・ドメインを分泌するArg-Arg
ジペプチドを欠失し又は置換することにより強化される。TPOポリペプチドは文
献中に仮定されているように（例えば、de Sauvage et al.,同書に）このArg-Ar
gジペプチドにおいて解裂されないけれども、このジペプチドが分泌を阻害する
ことが発見された。従って本発明は、サイトカイン・ドメインの直Ｃ−末端の２
塩基性アミノ酸対の除去を特徴とするTPOポリペプチドを提供する。従って、こ
れらのTPOポリペプチドは、Ｃ−Ｘ−Ｂ構造｛ここで、Ｃはヒト・トロンボポイ
エチン・サイトカイン・ドメイン・ポリペプチドであり、Ｘはペプチド結合又は
１又は２のアミノ酸残基から成るリンカーであり、そしてＢは、トロンボポイエ
チンＣ−末端ドメインの部分に由来し、但し、Ｘは、単独又はＣ又はＢと共に、
塩基性アミノ酸残基の対を形成しないという限定がある。｝を特徴とする。
それ故、本発明タンパク質内に、サイトカインと野生型トロンボポイエチンの
Ｃ−末端ドメインの接点(例えば、配列番号：２の残基153と154)において生じる
２塩基性配列は存在しない。このような２塩基性配列は、その分子内のどこにも
、特にＢ内にも存在しない。
本発明のTPOポリペプチドは、最も普通には、ペプチド結合を介して、哺乳類
（好ましくはヒト）のトロンボポイエチンのＣ−末端ドメインの部分に結合する
天然のヒトTPOサイトカイン・ドメイン・アミノ酸配列を含むであろう。本発明
の好ましい態様においては、Ｂは、Ｃ−末端ドメインのアミノ−末端残基から始
まるＣ−末端ドメインの５〜18の隣接残基から成り、ここで、Ｂのアミノ酸残基
の35％以下は他のアミノ酸残基により個々に置換されることができる。TPOサイ
トカイン・ドメインは、１〜約15の、好ましくは10以下の、より好ましくは７以
下の、アミノ酸置換を含むこともできる。アミノ酸置換は、非−臨界的アミノ酸
残基、すなわち、その置換がその分子の生物学的活性に実質的に影響を及ぼさな
い残基内で行われる。非−臨界的アミノ酸残基を同定するための方法は、本分野
において知られており、そしてアラニン走査突然変異誘発（alanine-scanning m
utagenesis）(Cunningham and Wells，Science 244，1081-1085，1989；Bass et
al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88：4498-4502，1991)を含み、ここで、単
一のアラニン突然変異が、その分子内のいずれかの残基において導入され、そし
て得られた突然変異分子が生物学的活性についてテストされる。タンパク質の活
性に対する多数のアミノ酸置換の効果は、Reidhaar-Olson and Sauer(Science 2 41
：53-57，1988)又はBowie and Sauer（Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86：2152
-2156，1989）により開示されたように評価されることができる。簡単に言えば
、上記著者らは、ポリ
ペプチド内の２以上の位置を同時に無作為化し、機能的なポリペプチドを選択し
、そして次に突然変異されたポリペプチドを配列決定して各位置における許容さ
れる置換のスペクトルを決定するための方法を開示する。使用されることができ
る他の方法は、ファージ・ディスプレイ（phage display）(例えば、Lowman et
al.，Biochem．30：10832-10837，1991；Ladner et al.，米国特許第5,223,409
号；Huse，WIPO公開WO 92／06204)及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et
al.,Gene 46：145，1986；Ner et al.，DNA 7：127，1988）を含む。生物学的
活性について突然変異されたポリペプチドをテストすることに加えて、それらポ
リペプチドをコードする発現ベクターは、ポリペプチド分泌に対する突然変異の
効果を評価するために培養された細胞内に形質転換されることができる。
Ｂ内では、天然TPO配列に比較したときのアミノ酸置換は、分泌に対する分子
の上記部分の有益な効果を保存し又は強化するようにデザインされる。好ましい
置換は、非電荷残基による電荷残基の置換を含む。他の好ましい置換は、アラニ
ンによるバリン(配列番号：２の残基168)の置換、グルタミン酸によるアルギニ
ン(配列番号：２の残基164)の置換、及びアスパラギン酸によるスレオニン(配列
番号：２の残基158)の置換を含む。このような置換は個々に又はいずれかの組合
せにおいて行われることができる。Ｂの残基の25％以下がその対応の天然の配列
に比較して置換されることが好ましい。例証的なＣ−末端ドメイン配列は配列番
号：４〜配列番号：７に見られる。
理論に拘束されることを欲しないが、Thr-Thrジペプチドは、Ｏ−結合された
炭水化物鎖のための付着部位を提供することができる。従って、本発明の１の態
様においては、ＢはThr-Thrジペプチド
を含む。特に好ましい態様においては、ＢのＮ−末端５アミノ酸残基はAla-Pro-
Pro-Thr-Thr(配列番号：８)である。
分泌レベルは、Ｎ−結合炭水化物付加部位(Asn-X-Ser／Thr)の付加によりさら
に強化されることができる。しかしながら、このような配列の存在は、特定の宿
主細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))にお
いて不所望の超糖添加（hyperglycosylation）を導くことができる。
当業者は、特定のアミノ酸置換の効果が宿主細胞特異的であることができると
いうことを認めるであろう。それ故、ポリペプチド製造のために使用されるであ
ろう宿主細胞型におけるこのような置換の効果を評価することが好ましい。
真核宿主細胞内で複製することができる本発明の発現ベクターは、先に開示し
たような分泌ペプチドをコードする第１DNAセグメント及びTPOポリペプチドをコ
ードする第２DNAセグメントに作用可能な状態で連結された転写プロモーターと
転写ターミネーターを含む。従って、この第２DNAセグメントは、Ｃ−Ｘ−Ｂ｛
ここで、Ｃ，Ｘ、及びＢは先に定義したものと同じである。｝から成るTPOポリ
ペプチドをコードする。本発明の好ましい態様においては、Ｂは、配列番号：３
の残基１〜ｙ｛ここで、ｙは５〜18の整数であり、そしてＢの上記残基の35％以
下、好ましくは25％以下が個々に他のアミノ酸残基により置換されている。｝か
ら成るポリペプチドである。
“Ｃ−Ｘ−Ｂから成るTPOポリペプチドをコードするDNAセグメント”は、その
新生ポリペプチドがそのアミノ末端からカルボキシル末端までを読んで、その言
及された要素から成るということを意味する。従って、用語“コーディング(enc
oding)”は、DNAセグメントの転写及び翻訳の直接生成物をいうために使用され
る。当業者
は、このようなポリペプチドが、追加の成分、例えば炭水化物鎖がそれに付加さ
れる翻訳後プロセッシングを経験することができるということを理解するであろ
う。このような翻訳後修飾の正確な性質は、その中でポリペプチドが製造される
ところの宿主細胞のタイプにより部分的に決定されるであろう。
マウス及びヒトTPOのDNAsは、WIPO公開WO 95／21920(その全体を引用により本
明細書中に取り込む)中に開示されたようにクローン化された。マウスTPO DNA配
列を含むプラスミドpZGmpl-1081は、American Type Culture Collection，12301
Parklawn Drive，Rockville，MDにブダペスト条約の規定の下1994年２月14日に
寄託され、そして受託番号69566を割り当てられた。ヒトTPO cDNAを含むプラス
ミドpZGmpl-124は、受託番号69615の下、E．coli DH106形質転換体として1984年
５月４日にAmerican Type Culture Collectionに寄託された。これらのマウス及
びヒトcDNAsは、ゲノムDNAs、対立遺伝子変異体、及び他の種からのDNAsを含む
他のTPO−コーディングDNAsを単離するためのプローブとして有用である。
本発明における使用のために好適な宿主細胞は、異種DNAを発現させるために
遺伝子操作されることができ、培養において増殖させることができ、そして分泌
経路をもつ真核細胞のいずれかのタイプを含む。
宿主細胞の分泌経路にTPOポリペプチドを向けるために、分泌リーダーが、TPO
ポリペプチドをコードするDNA配列と共に使用される。その分泌リーダーは、TPO
のもの又は他の分泌されたタンパク質、例えば組織型プラスミノーゲン・アクチ
ベーター（t-pA）又はサッカロミセス．セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae
）接合フェロモンα一因子のものであることができる。TPOポリペプチドと共に
異種分泌リーダーを使用するとき、それぞれのDNAセグメント
は、その連結されたセグメントが融合タンパク質をコードするように正しいリー
ディング・フレーム内で連結される。連結された分泌リーダー及びTPOポリペプ
チドは、典型的には、その分泌性リーダーが分泌の間にTPOポリペプチドから除
去されるように、それらの接点においてタンパク質分解性解裂部位を定めるであ
ろう。しかしながら、当業者は、融合タンパク質が回収され、そしてその後プロ
セスされてTPOポリペプチドを解放することができるということを認めるであろ
う。
酵母細胞、特にサッカロミセス(Saccharomyces)属の細胞は、本発明において
好ましい宿主である。酵母細胞は、ヒトによる消費のための製品の製造における
使用の長い歴史をもち、そして培養するのが比較的安価である。外来DNAにより
酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えタンパク質を製造するための方法
は、例えば、Kawasaki，米国特許第4,599,311号；Kawasaki et al.,米国特許第4
,931,373号；Brake,米国特許第4,870,008号；Welch et al.，米国特許第5,037,7
43号；及びMurray et al.,米国特許第4,845,075号（これらを引用により本明細
書中に取り込む。）により開示されている。形質転換された細胞は、選択マーカ
ー、一般には薬剤耐性又は特定の栄養（例えば、ロイシン）の非存在下で成長す
る能力により決定される表現型により選択される。酵母内での使用のための好ま
しいベクター系は、Kawasaki et al.(米国特許第4,931,373号)により開示されたPOT1
ベクター系であり、これは、細胞がグルコース含有培地中での培養により分
泌されることを許容する。酵母における使用のために好適なプロモーター及びタ
ーミネーターは、解糖酵素遺伝子(例えば、Kawasaki，米国特許第4,599,311号；
Kingsman et al.,米国特許第4,615,974号；及びBitter，米国特許第4,977,092号
(これらを引用により本明細書中に取り込む。))及びア
ルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。米国特許第4,990,446号；第5,063,1
54号；第5,139,936号；及び第4,661,454号（これらを引用により本明細書中に取
り込む。）をも参照のこと。ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha
）、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミ
セス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・フラジリス（
Kluyveromyces fragilis）、ウスティラゴ・マイディス(Ustilago maydis)、ピ
チア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・グイレルモンジイ（Pichia guil
lermondii）及びカンディダ・マルトサ(Candida maltosa)を含む他の酵母のため
の形質転換系も本分野において知られている。例えば、Gleeson et al.，J ．Gen ．Microbiol
．132：3459-3465，1986；Cregg，米国特許第4,882,279号；及びStr
oman et al.，米国特許第4,879,231号を参照のこと。
高レベルのTPOポリペプチド分泌のために選択された宿主株を使用することが
好ましい。発酵及びタンパク質製造に遺伝子型として適した親株は、慣用の方法
、例えば、紫外線照射又は例えばエチル・メタン・スルホネート又はニトロソグ
アニジンを使用した化学的突然変異誘発により、突然変異誘発される。生存細胞
は、慣用のアッセイ方法、例えば、フィルター・コロニー・アッセイであって細
胞がニトロセルロース上に重層され、それがその後ウェスタン・ブロット形式に
おいて抗体によりプローブされるようなアッセイを使用して、タンパク質分泌レ
ベルについてスクリーンされる。追加のアッセイ、例えば活性アッセイ(activit
y assays)も使用されることができる。
他の菌類細胞（fungal cells）も宿主細胞として好適である。例えば、アスペ
ルギルス(Aspergillus)細胞は、Mcknight et al.,米国特許第4,935,349号（これ
を引用により本明細書中に取り込む。
）の方法に従って使用されることができる。アクレモニウム・クリソゲナム（Ac
remonium chrysogenum）を形質転換させるための方法は、Sumino et al.,米国特
許第5,162,228号（これを引用により本明細書中に取り込む。）により開示され
ている。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換させる方法は、Lambowitz,米
国特許第4,486,533号（これを引用により本明細書中に取り込む。）により開示
されている。
哺乳類宿主細胞内に外来DNAを導入するための方法は、リン酸カルシウム−仲
介トランスフェクション（Wigler et al.，Cell 14：725，1978；Corsaro and P
earson，Somatic Cell Genetics ７；603，1981：Graham and Van der Eb.，Vir ology 52：456，1973）、エレクトロポレーション（Neumann et al.，EMBO J．１
：841-845，1982）、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション(Ausubel
et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Son
s，Inc.，NY，1987)、及びカチオン脂質−仲介トランスフェクション(Howley-Ne
lson et al.，Focus 15：73-79，1993)(これらを引用により本明細書中に取り込
む。)を含む。培養された哺乳類細胞における組換えタンパク質の製造は、例え
ば、Levinson et al.,米国特許第4,713,339号；Hagen et al.，米国特許第4,784
,950号；Polmiter et al.,米国特許第4,579,821号；Mulvihill et al.，米国特
許第5,486,471号；Foster et al.,米国特許第5,358,932号；及びMulvihill et a
l.，米国特許第5,385,831号（これらを引用により本明細書中に取り込む。）に
より開示されている。好ましい培養哺乳類細胞は、COS-1(ATCC No．CRL 1650)，
COS-7(ATCC No．CRL 1651)，BHK(ATCC No．CRL 1632)，BHK 570(ATCC No．CRL 1
0314)，293（ATCC No．CRL 1573；Graham et al.，J ．Gen．Virol. 36：59-72，
1977）及びチャイニーズ・ハムス
ター卵巣(例えば、CHO-K1；ATCC No．CCL61)細胞系を含む。追加の好適な細胞系
は、本分野において知られており、そして公的寄託機関、例えばAmerican Type
Culture Collection，Rockville，Marylandから入手可能である。一般に、強い
転写プロモーター、例えばSV-40又はサイトメガロウィルスからのプロモーター
が好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照のこと。他の好適なプロモ
ーターは、メタロチオネイン遺伝子からのもの（米国特許第4,579,821号及び第4
,601,978号、これらを引用により本明細書中に取り込む。）及びアデノウィルス
の主要後期プロモーター(major late promoter)を含む。
薬剤選択は、一般に、その中に外来DNAが挿入されている培養された哺乳類細
胞を選択するために使用される。このような細胞は、一般に、“トランスフェク
タンツ(transfectants)”といわれる。選択剤の存在下で培養されており、そし
てそれらの子孫に着目の遺伝子を伝えることができる細胞は、“安定したトラン
スフェクタンツ”といわれる。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシン
に対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型の薬剤、例え
ば、G-418その他の存在下で行われる。選択系は、着目の遺伝子の発現レベルを
高めるために、“増幅（amplification）”といわれるプロセスのために使用さ
れることもできる。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタンツ
を培養し、そして次に選択剤の量を増加させて、高レベルの導入遺伝子をもつ生
成物を製造する細胞を選択することにより行われる。好ましい増幅性の選択マー
カーは、メトトレキセート（methotrexate）に対する耐性を付与するジヒドロ葉
酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、
多剤耐性、プロマイシン・アセチルトランスフェラーゼ）も使用することができ
る。
他の高等真核細胞であって昆虫細胞、植物細胞及びトリ細胞を含むものも宿主
として使用することができる。昆虫細胞の形質転換及びその中での外来タンパク
質の製造は、Guarino et al.，米国特許第5,162,222号；Bang et al.,米国特許
第4,775,624号；及びWIPO公開WO 94／06463(これらを、引用により本明細書中に
取り込む。)により開示されている。植物細胞内で遺伝子を発現させるためのベ
クターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）
の使用は、Sinkar et al.，J ．Biosci．（Bangalore） 11：47-58，1987により
レビューされている。
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選ばれた宿主細胞の成
長のために要求される栄養素と他の成分を含有する培養基中で慣用の手順に従っ
て培養される。規定培地及び複合培地を含むさまざまな好適な培地が本分野にお
いて知られており、そして一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン類
、及びミネラル類を含む。培地は、適宜、成長因子のような成分を含有すること
もできる。成長培地は、一般に、例えば、薬剤選択又は必須栄養素における欠陥
であって、発現ベクター上に担持され又は宿主細胞内へ共同トランスフェクトさ
れる選択マーカーにより相補されるものにより外来添加DNAを含む細胞を一般に
選択するであろう。
本発明に従って製造されるTPOポリペプチドは、本分野において一般に知られ
た方法、例えばアフィニティー精製及びそのタンパク質のサイズ、電荷、溶解度
その他の性質に基づく分離を使用して選択的に回収される。ポリペプチドが培養
された哺乳類細胞内で製造されるとき、汚染性タンパク質の量を制限するために
無血清培養基中で細胞を培養することが好ましい。この培地は収穫され、そして
分画される。好ましい分画の方法は、例えば、固定化Mplレセプター・タンパク
質又はそのリガンド結合性部分上の、又はアフィニテ
ィー・タグ（例えば、それについて抗体又は他の特異的結合性剤が利用できると
ころのポリヒスチジン、サブスタンスＰ又は他のポリペプチド又はタンパク質）
の使用を通じての、アフィニティー・クロマトグラフィーを含む。特定の解裂部
位が、着目のタンパク質とアフィニティー・タグの間に提供されることができる
。他のクロマトグラフィー方法、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、ア
ニオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用
することもできる。
本発明に従って製造されるTPOポリペプチドは、骨髄内で細胞の増殖を高める
ことが望ましい場合、例えば、血球減少、例えば、再生不良性貧血、脊髄形成異
常症候群、化学療法又は先天性血球減少により引き起こされるものの治療におい
て、治療的に使用されることができる。TP0ポリペプチドは、血小板生産を高め
るために、例えば、血小板減少症の治療においても有用である。血小板減少症は
、単独又は上記症状を作り出すために協調して働くことができる多様な群の疾患
及び臨床的症状と関連する。低下した血小板のカウントは、例えば、血小板の製
造における欠陥、異常な血小板の分布、多量の輸血による希釈損失、又は血小板
の異常な破壊から生じることができる。例えば、癌治療において使用される化学
療法剤は、骨髄内の血小板前駆細胞の発達を抑制することができ、そして得られ
た血小板減少は化学療法を制限し、そして輸血を必要とするかもしれない。さら
に特定の悪性疾患は血小板の生産及び血小板の分布を害することができる。悪性
細胞を殺すために使用される放射線療法も、血小板前駆細胞を殺す。血小板減少
は、薬剤、新生児の同種免疫（alloimmunity）又は血小板輸注同種免疫により誘
発されるさまざまな自己免疫疾患から生じることもできる。TPOポリペプチドは
、輸血の必要性を減じ又は取り除き、それにより血小板の同種免疫
の発生率を減少させる。血小板の異常な破壊は、（１）血管移植又は外傷性組織
内での増加した血小板消費；又は（２）例えば、薬剤誘発血小板減少、特発性血
小板減少紫斑(idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP))、自己免疫疾患、血
液学的失調、例えば白血病及びリンパ腫、又は骨髄を含む転移性癌と関連する免
疫メカニズム、から生じることができる。TPOについての他の症状は、再生不良
性貧血(aplastic anemia)及び薬剤誘発髄抑制であって、例えば化学療法又はAZT
によるHIV感染の治療から生じるものを含む。
血小板減少は、出血の増加、例えば、鼻・口腔領域又は胃腸管からの粘膜出血
、並びに外傷、潰瘍又は注射部位からの滲出（oozing）として顕出する。
医薬用途のためには、TPOポリペプチドは、慣用の方法に従って、非経口、特
に静脈内又は皮下デリバリーのために配合される。静脈投与は、ボーラス注射又
は１〜数時間の典型的な期間にわたる注入によるものであろう。一般に、医薬配
合物は、医薬として許容される賦形剤、例えば生理食塩水、緩衝液化生理食塩水
、水中５％デキストロースその他と共に、TPOポリペプチドを含むであろう。配
合物は、さらに１以上の賦形剤、保存料、可溶化剤、緩衝化剤、バイアル表面上
のタンパク質の損失を防止するためのアルブミン、等を含むことができる。さら
に、TPOポリペプチドは、他のサイトカイン、特に初期に働くサイトカイン、例
えば幹細胞因子、IL-3，IL-6，IL-11又はGM-CSFと組み合せられることができる
。このような併合療法を使用するとき、上記サイトカインは、単一配合物内に併
合されることができ、又は別個の配合物内で投与されることができる。配合方法
は、本分野において周知であり、そして例えば、Remington's Pharmacentical S ciences
，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990，（引用によ
り本明細書中に取り込む。）
中に開示されている。TPOの治療的投与量は、一般に、１日当り0.1〜100μｇ／k
g患者体重の範囲内で、好ましくは0.5〜50μｇ／kg／日であろう。その正確な投
与量は、処置されるべき症状の性質及び重度、患者の特質、等を考慮して許容さ
れた標準に従って臨床医により決定される。特定のケース、例えば、高い感受性
を示し又は長引く処置を必要とする患者を治療するときは、0.1〜20μｇ／kg／
日の範囲内の投与量が処方される。投与量の決定は、当業者の水準内にある。TP
Oポリペプチドは、一般に、化学療法又は骨髄移植後28日以内の期間にわたり又
は＞20,000／mm3、好ましくは＞50,000mm3の血小板カウントが達成されるまで投
与されるであろう。より一般的には、TPOポリペプチドは、１週間以内にわたり
、しばしば、１〜３日間の期間にわたり投与されるであろう。一般に、TPOポリ
ペプチドの治療的有効量は、リンパ球又は骨髄前駆細胞の増殖及び／又は分化に
おける臨床的に有意な増加を作り出すために十分な量であり、これは、成熟細胞
（例えば、血小板又は好中球）の循環レベルにおける増加として顕示されるであ
ろう。従って、血小板失調の処置は、少なくとも20,000／mm3、好ましくは50,00
0／mm3の血小板カウントが達成されるまで続けられるであろう。TPOポリペプチ
ドは、他のサイトカイン、例えば、IL-3，IL-6、及びIL-11；幹細胞因子；エリ
スロポイエチン；G-CSF及びGM-CSFと共に投与されることもできる。併合療法の
養生法においては、他のサイトカインの日用量は、一般に：EPO,≦150Ｕ／kg；G
M-CSF，５−15μｇ／kg；IL-3，１〜５μｇ／kg；及びG-CSF，１〜25μｇ／kgで
あろう。EPOとの併合療法は、例えば、低EPOレベルをもつ貧血患者において処方
される。
TPOポリペプチドは、造血細胞の分化及び発達のインビトロ研究のための、例
えば、細胞分化のメカニズムを解明し、そして成熟細
胞の系統を決定するための、貴重な道具でもあり、そして細胞培養における増殖
剤としての用途もある。
TPOポリペプチドは、エクスビボ（生体外）、例えば自己骨髄培養において使
用されることもできる。簡単に言えば、骨髄は、化学療法に先立って患者から取
り出され、そして場合により１以上の他のサイトカインと共にTPOポリペプチド
により処理される。その後、処理された骨髄は、骨髄の回復を促進するために化
学療法後に、その患者に戻される。さらに、TPOポリペプチドは、骨髄又は末梢
血液前駆（peripheral blood progenitor(PBPC)）細胞のエクスビボ拡大(expans
ion)のために使用されることもできる。化学療法処置に先立って、骨髄は、初期
前駆細胞を末梢循環内に放出するために、幹細胞因子(SCF)又はG-CSFにより刺激
されることができる。これらの前駆体は、末梢血液から集められ、そして濃縮さ
れ、そしてその後、場合により非限定的にSCF，G-CSF，IL-3，GM-CSF，IL-6又は
IL-11を含む１以上の他のサイトカインと共に１以上のTPOポリペプチドにより培
養物中で処理されて、高密度巨核球培養物に分化及び増殖される。これはその後
、高投与量化学療法後に、その患者に戻されることができる。
本発明をさらに、以下の非限定的実施例により説明する。
実施例実施例１
２つの発現ベクターを、配列番号：２の153-154位におけるArg-Argジペプチド
の存在又は非存在の点で相違する切断ヒトTPOポリペプチドの酵母、サッカロミ
セス・セレビシエ(S．cerevisiae)内での発現を比較するために構築した。これ
ら２つのベクターをプラスミド(ATCC ＃68001；米国特許第5,128,321号中に開示
されたもの)に由来した。両ベクターは、S．cerevisiaeのトリオース・ホ
スフェート・イソメラーゼ（TPI1）遺伝子プロモーター（米国特許第4,599,311
号参照、引用により本明細書中に取り込む。）、S．cerevisiae MFα１プレープ
ロ配列、TPO配列、及びS．cerevisiae TPIIターミネーターを含んで成るTPO発現
カセットを含んでいた。上記ベクターは、グルコースを含有する培地中での選択
を可能にする、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のト
リオース・ホスフェート・イソメラーゼ(POT)遺伝子、大腸菌(E．coli)内での選
択のためのアンピシリン耐性遺伝子、及びleu2-d選択マーカーをさらに含んでい
た。ベクターpD85は、残基168（Val）がAlaで置換された配列番号：２のアミノ
酸残基１〜残基172の野生型ヒトTPO配列をコードしていた。ベクターpD79は、ア
ルギニン残基153と154のためのコドンが欠失され、そしてバリンのコドン(残基1
68)がアラニンのコドンで置き替えられている変異体TPO１〜172配列をコードし
ていた（アミノ酸の位置は配列番号：２を引用する。）。
完全長ヒトTPO DNAを、その５’末端にMFａＩプレープロ配列の５つのコドン
を、そしてその３’末端に終結コドンを付加するためにポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)により修飾した。PCRを、プライマーZC7623（配列番号：９）及びZC7627（配
列番号：10）を使用して行った。PCRを、Taqポリメラーゼ及び〜20ngの鋳型DNA
を使用して、25サイクルの、94℃、１分間；53℃、１分間；及び72℃、1.5分間
をもって走らせた。修飾されたTPO配列を、479bpのHindIII−XbaＩ断片として単
離し、そして同一酵素で解裂されていたpUC１8にライゲートした。得られたプラ
スミドをpHB76と命名した。
pHB76内のTPO配列を、サイトカイン・ドメインをコードする配列の、５’末端
と３’末端において、それぞれ、BbeＩとSalＩ部位を導入するために修飾した。
PCRを、プライマーZC7868（配列番
号：11）とZC7870（配列番号：12）を使用して行った。PCRを、Taqポリメラーゼ
と〜20ngの鋳型DNAを使用して、９サイクルの、95℃、１分間；68℃、４分間；
その後、１サイクルの、95℃、１分間；68℃、10分間をもって走らせた。このTP
O配列を、482bpのHindIII−EcoRＩ断片として回収し、そして同一の酵素で解裂
されていたpUC19内にライゲートした。得られたプラスミドをpTPOGN２と命名し
た。
次に、変異体TPO配列を、HindIII＋XbaＩ消化pUC19との３者ライゲーションに
おいて、pTPOGN２からの457bp HindIII−SalＩ断片とオリゴヌクレオチドZC8488
（配列番号：13）とZC8489（配列番号：14）とを併合することにより構築した。
α−因子プレ−プロ・ペプチドの最後の数残基と切断TPOポリペプチドをコード
する539bpのHindIII−XbaＩ断片を、pTPOGN６から単離した。この断片を、（Bam
HＩで解裂され、そしてアルカリ性ホスファターゼで処理された）pDPOTとの４者
ライゲーションにおいて、TPI1プロモーターとMFα１プレープロ配列を含む1230
bpのBglII−HindIII断片、及びTPI1ターミネーターを含む680bpのXbaＩ−BamHＩ
断片と連結した。得られたプラスミドをpD79と命名した。
ヒトTPO(配列番号：12)の残基１〜172をコードする対照プラスミドを、４者ラ
イゲーションにおいて、（BamHＩにより解裂され、そしてアルカリ性ホスファタ
ーゼにより処理された）pDPOTと、1230bpのBglII−HindIII TPI1−MFα1(断片
と、α−因子プレ−プロ・ペプチドの最後の数残基と切断TPOポリペプチドをコ
ードする540bp断片と、680bpのXbaＩ−BamHＩ TPI1ターミネーター断片を連結す
ることにより構築した。得られたプラスミドをpD85と命名した。
プラスミドpD79とpD85は、Hinnen et al．（Proc ．Natl．Acad．S ci ．USA 75：1929-1933，1978）により本質的に開示されているようにサッカロ
ミセス．セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株JG 134（MATα Δtpil::U
RA3 ura 3-52 leu2-Δ２ pep4-Δ１〔cir°〕）内に形質転換した。形質転換
体を、唯一の炭素源としてグルコースを含有する培地上でのそれらの増殖能力に
ついて選択した。
形質転換体を、１％酵母エキス、１％ペプトン、及び５％グルコースを含有す
る液体培地中で約60時間培養した。これらの細胞を、遠心分離により上記培養基
から分離した。培地サンプルを、TPO希釈バッファー(10％子ウシ胎児血清、２mM
Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、50μｇ／mlペニシリン、50μｇ
／mlストレプトマイシン、100μｇ／mlネオマイシン、0.00033％ β−メルカプ
トエタノール、25mM Hepesを補われたRPMI 1640)中で１：100に希釈した。
TPOの生物学的活性を、標的細胞としてヒトMPLレセプターをコードする発現ベ
クターによりトランスフェクトされたBaF3細胞（Vigon et al.，Proc ．Natl．Ac ad．Sci．USA 89：5640-5644，1992）を使用した有系***誘発アッセイにおいて
評価した。BaF3は、ネズミ骨髄由来の、インターロイキン−３依存性のプレーリ
ンパ球細胞系である（Palacios and Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Math
ey-Prevot et al.，Mol ．Cell．Biol. ６：4133-4135，1986）。細胞を、37℃
で16〜19時間3Ｈ−チミジンの存在下テスト・サンプルに晒した。細胞のDNAに取
り込まれた3Ｈ−チミジンの量を、ヒトTPOの標準曲線との比較により定量した。
10Ｕ／mlを、上記有系***誘発アッセイの最大刺激の半分を与える量として定義
した。２つの実験の結果を表１に示す。
表１ 実 験 プラスミド TPO( ユニット／ml培地)
１ pD85 40
pD79 740
２ pD85 限界値未満
pD79 160実施例２
ペプチド結合又はArg-ArgジペプチドのいずれかによりＣ−末端セグメントに
連結されたヒトTPOのサイトカイン・ドメイン(配列番号：２の残基22〜152)から
成るTPOポリペプチドをコードする一連のプラスミドを構築した。表２は、コー
ドされたポリペプチドの構造を示し：Arg-Argは、上記ジペプチドの存在（＋）
又は非存在（−）を示し；上記Ｃ−末端セグメントについてのアミノ酸番号は、
配列番号：３を引用する。
表２ プラスミド Arg −Arg Ｃ−末端配列
pD117 − １−５
pD119 − １−９
pD121 − １−13
pD123 − １−18
pD125 ＋ １−18
プラスミドpTPOGN８を、HindIIIとXbaＩを用いた消化により線状化されていた
pUC19；α−因子分泌リーダーの一部及びヒトTPOサイトカイン・ドメインの部分
のためのコーディング配列を含むpTPOGN２の457bp HindIII−SalＩ断片（実施例
１）；及びオリゴヌクレオチドZC8486（配列番号：15）及びZC8487（配列番号：
16）から構築されたSalＩ−XbaＩアダプター、を使用した３者ライゲーションに
おいて構築した。
プラスミドpD83を以下の断片：BamHＩ消化アルカリ性ホスファターゼ処理pDPO
T；pHB105-4((米国特許第5,155,027号に開示された）pMVR１のプラスミド骨格内
のヒトTPOのサイトカイン・ドメインのためのコーディング配列に連結されたS．
cerevisiae TPI1プロモーターとα−因子分泌リーダーを含むプラスミド）の123
0bp BglII−HindIII断片、これは、S．cerevisiae TPI1プロモーターとα−因子
分泌リーダーを含んでいた；pTPOGN８の540bp HindIII−XbaＩ断片、これは、そ
のＣ−末端において配列番号：17の18残基ポリペプチドに連結された、α−因子
分泌リーダー・コーディング配列の一部とサイトカイン・ドメインから成るTPO
変異体のコーディング配列を含んでいた；680bp XbaＩ−BamHＩ S．cerevisiaeT
PI1ターミネーター断片、を使用した４者ライゲーションにおいて構築した。
表２中に示すプラスミドは、まず、TPI1ターミネーターとベクター配列を含む
pD83のBglII−EcoRＩ断片を、表３中に示すオリゴヌクレオチドの対の中の１を
もつ(SalＩとEcoRＩにより切断された)pUC19内に挿入することにより構築した。
得られたプラスミドを、表３中に示すようにpTPOMI１，２，３，４、及び５と命
名した。２つのpD83断片、すなわち、TPI1プロモーター、MFα１分泌リーダー、
５’TPOコーディング領域、及びベクター配列を含むBglＩ−SalＩ；及びベクタ
ー配列を含むEcoRＩ−BglＩ、を（３’TPOコーディング配列、TPI1ターミネータ
ー、及びベクター配列を含む）pTPOMI１−５からのSalＩ−EcoRＩ断片に連結し
て、それぞれ、pD117，pD119，pD121，pD123、及びpD125を構築した。
表３ プラスミド オリゴヌクレオチド
pTPOMI１ ZC10086（配列番号：18）
ZC10087（配列番号：19）
pTPOMI２ ZC10095（配列番号：20）
ZC10096（配列番号：21）
pTPOMI３ ZC10120（配列番号：22）
ZC10121（配列番号：23）
pTPOMI４ ZC10118（配列番号：24）
ZC10119（配列番号：25）
pTPOMI５ ZC10108（配列番号：26）
ZC10109（配列番号：27）
プラスミドをS．cerevisiae JG 134又はＭ35内に形質転換した。Ｍ35を、一夜
培養物のUV突然変異誘発によりpD79形質転換JG 134から得た。細胞を１：1000に
希釈し、そして50μｌの希釈物をYEPD（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％Ｄ
−グルコース、0.004％アデニン、0.006％Ｌ−ロイシン）上にプレートした。プ
レートを、暗室内で20秒間UV光に露出させ、光不透過性の箱の内に入れ、そして
30℃において２日間インキュベートした。次に各プレートを、新鮮YEPDプレート
上にレプリカ・プレートし、ニトロセルロースでカバーし、そして30℃で一夜イ
ンキュベートした。次にこのニトロセルロースを取り出し、そして接着酵母細胞
のいずれをも洗い流した。このニトロセルロースを、ブロッキングのための１×
PBS中５％ミルクとラット抗−ヒトTPO抗体を使用した標準ウェスタン技術を介し
て発色させた。一次スクリーンにおいて高レベルの分泌レベルを示すコロニーを
、ウェスタン・ブロッティングと活性アッセイによりさらにアッセイした。GN35
と命名された１つの突然変異体は、その親株よりも２〜４倍高い活性を一貫して
作り出した。GN35は、原核生物のカナマイシン耐性遺伝子とS．cerevisiae TPI1
遺伝子を含む２−ミクロン−ベースのプラスミドによる形質転換によりpD79
から矯正(cured)された。２mg／ml Ｇ418に耐性な形質転換体を選択し、そして
Ｇ418を含むYEPD中で、次にYEPGGE(0.004％アデニン、0.006％Ｌ−ロイシン、１
％酵母エキス、0.4％Ｄ−ガラクトース、２％ペプトン、３％グリセロール、１
％エタノール)中で培養した。次に細胞を、炭素源としてグルコース上で成長す
る能力がないことについてスクリーンした。このことは、pD79上のトリオース・
ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子の損失を示す。この矯正された細胞を株Ｍ35
と命名した。形質転換体を、２％ぺプトン、１％酵母エキス、及び５％グルコー
スを含む液培地中で70時間エアレーションしながら培養した。プラスミドpD79と
pD85が対照として含まれた。さらに、（ヒトTPOサイトカイン・ドメインを単独
でコードする）プラスミドpHB109と（pD85とpD125と同じポリペプチドをコード
する）pBJ118をアッセイした。
培地を集め、そして実施例１に開示したようにアッセイした。アッセイ結果を
表４中に示す。
表４ 宿主 プラスミド TPO(ng ／ml)
JG134 pD117 26
pD119 51
pD121 53
pD123 35
pD125 3
pD79 70
pD85 3
pHB109 検出限界以下
pBJ118 8
M35 pD79 180
実施例３
慣用の分子生物学の技術を使用して、TPOポリペプチドをコードする一連のpDP
OT−ベースのプラスミドを構築した。コードされたTPOポリペプチドのそれぞれ
が、ペプチド結合を介してヒトTPOのＣ末端ドメインから得られたＣ末端セグメ
ントに連結されたヒトTPOサイトカイン・ドメインから成っていた。これらのポ
リペプチドのＣ末端セグメントの配列を以下の表５中に示す。アミノ酸は慣用の
１文字コードを使用して表される。
表５ プラスミド Ｃ−末端ドメイン
pD91 APPDTAVPSRTSLVLTLN
（配列番号：５）
pD93 APPDTAVPSETSLVLTLN
（配列番号：６）
pD95 APPTTAVPSETSLVLTLN
（配列番号：７）
プラスミドをJG 134株内に形質転換し、そして形質転換体を実施例２中に開示
したように培養した。培地を収穫し、そして実施例１に開示したようにアッセイ
した。
結果を表６中に示す。
表６ プラスミド TPO( ユニット／ml)
pDPOT 0
pD79 700
pD85 100
pD91 200
pD93 300
pD95 600
以上、本発明の特定の態様を説明を目的として本明細書中に記載してきたけれ
ども、さまざまな修正が本発明の本質及び範囲から逸脱せずに行われることがで
きるということが理解されよう。従って、本発明は添付の請求の範囲以外によっ
て限定されるものではない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Expression vectors, cells, and methods for producing thrombopoietin polypeptides
Law
Background of the invention
Hematopoiesis is a process in which blood cells develop and differentiate from pluripotent stem cells in the bone marrow.
is there. This process involves polypeptides acting through membrane-bound receptors on target cells.
Involves the complex interactions of growth factors (cytokines). Cytokine action
Respond to specific cytokines that are often strain-specific and / or stage-specific,
Leads to cell proliferation and differentiation. The development of single cell types, such as platelets, from stem cells
May require the coordinated action of multiple cytokines in the proper order
.
Known cytokines are interleukins, such as IL-1, IL-2, IL-3,
IL-6, IL-8, etc .; and colony-stimulating factors such as G-CSF, M-CSF, GM-CSF, Ellis
Including lopoietin (EPO). In general, interleukins provide an immune and inflammatory response
Work as a mediater for This colony-stimulating factor stimulates the growth of bone marrow-derived cells.
Intense, activates mature leukocytes, and further enhances inflammatory, infectious, and immunological
Form an integral part of the host response to the range.
Various cytokines have been developed as therapeutics. For example, the development of red blood cells
Stimulating erythropoietin is used in the treatment of anemia resulting from renal failure
Used. Some of this colony-stimulating factor promotes recovery of the patient's immune system
It has been used in connection with cancer chemotherapy. Interleukin-2, a-Interf
And C-interferon have been used in the treatment of certain cancers. Huge
Nucleated hematopoiesis (megakaryocytopoiesis) and platelet hematopoiesis (thrombocytopoiesis)
Intense activity has been identified in the body fluids of thrombocytopenic animals, and
Referred to in the literature as "thrombopoietin" (Recently, McDona
ld,Exp . Hematol.16: 201-205, 1988 and McDonald,Am . J. Ped. Hematol. On col
.14: 8-21, reviewed in 1992). Purify this activity, and
Efforts to characterize the binding of cellular Mpl receptors and megakaryocyte hematopoiesis and hematopoiesis
The cloning of proteins that stimulate plate hematopoiesis has been led. de Sauvage et al.,Nat ure 369: 533-538, 1994; Lok et al.,Nature 369: 565-568, 1994; Kaushansk
y et al.,Nature 369: 568-571, 1994; Wending et al.,Nature 369: 571-574
Bartley et al., 1994;Cell 77: 1117-1124, 1994; and WIPO published WO 95/219.
See 20. This Mpl receptor binding cytokine is thrombopoietin
It is said that
Amino acid sequence analysis revealed that mature human TPO was amino acid residue 1 (Ser) of SEQ ID NO: 2.
To amino acid residue 332 (Gly). TPO is a protein
Subjected to degradation and isolated in a heterogeneous or degraded form (de Sauvage et al.
,Nature 369: 533-538, 1994; Bartley et al.,Cell 77: 1117-1124, 1994).
Molecular species as small as 25 kD have been found to be active in vitro (
Bartley et al., Ibid.) And 174 amino acids (Bartley et al., Ibid.)
It has been reported to be active in vitro. Similarly, full-length human cDNA
Expression product is active and encodes a primary translation product of 353 amino acids.
(Bartley et al., Ibid.).
The need to produce thrombopoietin in large quantities and economically is an issue in this field.
Exist. Eukaryotic microorganisms, such as thrombo in yeast
There is also a need for a method for producing poietin. Protein content than full-length molecule
A need for an efficient method for the production of low molecular weight forms of thrombopoietin, which is difficult to solve
There is also. The present invention fulfills the above needs, and provides other related advantages.
.
SUMMARY OF THE INVENTION
In one aspect, the invention provides an expression vector capable of replicating in a eukaryotic host cell.
Provide a technician. These vectors must be operably linked as follows:
(A) a transcription promoter; (b) a gene encoding a secretory leader;
One DNA segment; (c) thrombopoietin (TPO) polypeptide consisting of C—X—B
A second DNA segment encoding a tide, where C is human thrombopoietin
X is a cytokine domain polypeptide; X is a peptide bond or 1 or
A linker consisting of two amino acid residues, provided that X is alone or in combination with C or B.
Does not provide a dibasic amino acid pair; and B is SEQ ID NO: 3.
Is a polypeptide consisting of residues 1 to y, wherein y is an integer from 5 to 18,
And less than 35% of the amino acid residues of B are individually replaced by other amino acid residues
And (d) a transcription terminator. In one embodiment of the present invention, the above expression
The vector is replicable in yeast. In another embodiment, the secretion leader as described above.
Is the alpha factor of Saccharomyces cerevisiae
He is a leader. In other embodiments, B does not include an Arg-Arg dipeptide.
In a further embodiment, residue number 4 of B is Thr or Asp;
10 and residue 10 of B is Arg or Glu; and y is at least 14
And residue 14 of B is Val or Ala. In other embodiments, y is at least
And residue 4 of B is Thr
Or Asp, residue 10 of B is Arg or Glu, and residue 14 of B is Val or Al
a. In other embodiments, X is a peptide bond or a single amino acid residue.
Group.
In another aspect of the invention, a culture medium comprising an expression vector as disclosed above.
A nuclear cell that produces and secretes the TPO polypeptide is provided.
It is. In a preferred embodiment, the cells are yeast cells.
In a third aspect of the present invention, C—X—B, wherein C is human thromboposome.
X is a Yetin cytokine domain polypeptide; X is a peptide bond or
Is a linker consisting of one or two amino acid residues, provided that X is singly or C or
Has the limitation that it does not provide a dibasic amino acid pair with B;
SEQ ID NO: 3 is a polypeptide consisting of residues 1 to y, wherein y is an integer of 5 to 18
And less than 35% of the residues in B are individually substituted by other amino acid residues
ing. Thrombopoietin polypeptide characterized by an amino acid skeleton consisting of｝
Code is provided.
In a fourth aspect of the present invention, the expression vector as disclosed above is transfected.
The transfected or transformed eukaryotic host cell is cultured (where the ligated
The first DNA segment and the second DNA segment are expressed by a host cell and
Producing the TPO polypeptide) and recovering the TPO polypeptide.
A method for producing a lipopeptide is provided.
In a fifth aspect of the present invention, a method for increasing platelet count in a mammal is provided.
The TPO as disclosed above together with pharmaceutically acceptable excipients
The method is provided, comprising administering to the animal.
The above and other aspects of the present invention will be apparent with reference to the following detailed description.
Will be clear.
Detailed description of the invention
Before describing the present invention in more detail, certain terms used herein are defined.
RU:
The term “allelic variant” is used herein to refer to a mutation.
The unilateral form of the resulting gene, or the alteration encoded by the mutant gene
Used to represent a polypeptide. Gene mutations are silent (coded
No change in the altered polypeptide) or a polypeptide having an altered amino acid sequence
The peptide can be encoded.
An “expression vector” is a state in which it can act on additional segments that regulate its transcription.
Linear or cyclic, including a segment encoding the polypeptide of interest linked by
DNA molecule. Such additional segments include promoter sequences and terminators.
Contains a minator sequence. The expression vector contains one or more origins of replication, one or more
Can also include cars, enhancers, polyadenylation signals, etc.
. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or both.
Elements can also be included. The term “operably linked
) "Means that the segments work in concert with their intended purpose, eg
Transcription begins in the promoter and passes through the coding segment.
Indicates that the segments are aligned to proceed to the terminator.
Replication of the expression vector in the host organism can be autonomous or integrated into the host genome.
Can be done through
The term "characterize" is used to indicate a limitation of a feature or element. example
If a polysaccharide is characterized by an amino acid backbone of a given sequence
Peptides include the recited amino acid sequences, but include additional amino acid residues. Only
However, such polypeptides may further comprise carbohydrate chains or other post-translational modifications.
Can be included.
A “secretory leader” directs the passage of a protein through the secretory pathway of a host cell.
And facilitating polypeptides. Secretory leaders are sometimes pre-pro
Also called an array. Secretory leaders are characterized by a core of hydrophobic amino acids,
Typically (but not exclusively) at the amino terminus of newly synthesized proteins
. This secretory leader often forms its secretions during secretion in one or more cleavage events.
Cleaved from mature proteins. Such secretion leaders are responsible for
When passed, a process that permits cleavage of its secretory leader from its mature protein
Includes shinging site.
The “promoter” is where the RNA polymerase binds and mRNA synthesis is initiated.
Part of the gene.
“Thrombopoietin” (or “TPO”) refers to M from the same species.
specifically binds to pl receptor and stimulates platelet production in vivo
It is a protein characterized by its ability. In normal test animals, TPO is
Can increase platelet levels by 100% or more within 10 days after starting
Wear. Full-length TPO consists of an amino-terminal cytokine domain and a carboxyl-terminal (
"C-terminal") domain. Referring to SEQ ID NO: 2, the cytokine
-The domains are linked by cysteine residues at positions 7 and 151.
The term "thrombopoietin polypeptide" refers to the full-length thrombopoietin component.
Offspring and their biologically active parts, that is, the qualitative organisms of the intact molecule
Biological activity (receptor binding and stimulation of platelet production in vivo)
Fragments of rhombopoietin,
Is included.
A representative cDNA encoding full-length human thrombopoietin is SEQ ID NO: 1.
Shown in One of skill in the art will appreciate that the DNA of SEQ ID NO: 1 and its encoded amino acid
Column number: 2) represents a single allele of the human TPO gene and
It will acknowledge that variants are expected to exist. Allele of SEQ ID NO: 1
Gene variants can be cloned from cells, tissues, or nucleic acids prepared from different individuals.
By sequencing and sequencing of the resulting clones.
As used herein, the term “thrombopoietin cytokine cytokine domain”
The term "in polypeptide" refers to the core polypeptide (residues 7 to 7 of SEQ ID NO: 2).
151 and the corresponding region of the allelic variant of SEQ ID NO: 2),
, A short N-terminus that does not destroy the essential biological activity of the molecule (eg,
No.:2 residues 1-6) and / or C-terminal (e.g., residue 152 of SEQ ID NO: 2).
Can include long items. Considerable sequence changes are tolerated within these short extensions
You. The C-terminal domain of human TPO is from residue 155 (Ala) to residue 332 of SEQ ID NO: 2.
(Gly). This domain is a potential O- and N-linked glycosylation
Including the site. All or part of this domain is accompanied by a complete loss of biological activity.
Be deleted. The two domains are Arg-Arg dipeptide (sequence
No. 2 is separated by residues 153 to 154). This dipeptide during TPO maturation
Although it is assumed that the processing site is cleaved into
For example, de Sauvage et al., Ibid.), Studies conducted by the assignee of the present invention include:
This indicates that no significant cleavage occurs at this site.
As used herein, the phrase “thrombopoietin C-terminal domain”
The main part is from one amino acid of the TPO C-terminal domain to the C-terminal of the entire length TPO.
Including the terminal domain (including the C-terminal domain). Generally, this C-terminal domain
The in-part is, as its first (amino-terminal) amino acid residue, the corresponding complete TP
The first amino acid residue of the C-terminal domain of O (ie, at residue 155 of SEQ ID NO: 2)
Contiguous segment of the native TPO C-terminal domain
There will be. The portion of the C-terminal domain used in the present invention is preferably of length
5-18 amino acid residues, more preferably at least 9 residues in length, most preferably long
14-18 residues.
The present invention, together with expression vectors and cells useful in the method, comprises
Provided is an improved method for producing a ietin polypeptide. The present invention relates, in part, to TPO poly
Alterations of certain amino acids in peptides have increased secretion by eukaryotic host cells
Based on the discovery that In the present invention, secretion of a TPO polypeptide is inherently
Arg-Arg secreting its cytokine domain from the C-terminal domain of the molecule
Enhanced by deleting or replacing dipeptides. TPO polypeptide is a statement
The Arg-Ar (as described in de Sauvage et al., Ibid.)
Although not cleaved in g dipeptide, this dipeptide inhibits secretion
It was discovered. Thus, the present invention relates to the immediate C-terminal 2
Provided are TPO polypeptides characterized by the removal of basic amino acid pairs. Therefore,
These TPO polypeptides have a C—X—B structure, where C is human thrombopoi.
An ethyne cytokine domain polypeptide, wherein X is a peptide bond or
A linker consisting of one or two amino acid residues and B is a thrombopoiet
Derived from a portion of the tin C-terminal domain, wherein X is alone or with C or B
There is a limitation that a pair of basic amino acid residues is not formed. ｝ Is characterized.
Therefore, the cytokine and wild-type thrombopoietin in the protein of the present invention
Occurs at the junction of the C-terminal domain (eg, residues 153 and 154 of SEQ ID NO: 2)
There are no dibasic sequences. Such a dibasic sequence can appear anywhere in the molecule.
, Especially not in B.
The TPO polypeptides of the present invention are most commonly used in mammalian cells via peptide bonds.
Binds to part of the C-terminal domain of (preferably human) thrombopoietin
Will contain the native human TPO cytokine domain amino acid sequence. The present invention
In a preferred embodiment, B starts at the amino-terminal residue of the C-terminal domain.
Consisting entirely of the 5-18 contiguous residues of the C-terminal domain, wherein the amino acid residues of B
Up to 35% can be individually replaced by other amino acid residues. TPO rhino
The tokine domain may have from 1 to about 15, preferably 10 or less, more preferably 7 or less.
Below, amino acid substitutions can also be included. Amino acid substitution is a non-critical amino acid
Residue, i.e., the substitution does not substantially affect the biological activity of the molecule.
Is performed within a small residue. Methods for identifying non-critical amino acid residues are described in the art.
And alanine-scanning mutagenesis.
utagenesis) (Cunningham and Wells,Science 244, 1081-1085, 1989; Bass et
al.,Proc . Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502, 1991), where
An alanine mutation is introduced at any residue in the molecule, and
The resulting mutant molecules are tested for biological activity. Activity of protein
The effect of multiple amino acid substitutions on sex is described in Reidhaar-Olson and Sauer (Science Two 41
: 53-57, 1988) or Bowie and Sauer (Proc . Natl. Acad. Sci. USA 86： 2152
-2156, 1989). Simply put
The authors mentioned above
Simultaneously randomize two or more positions in a peptide to select a functional polypeptide
And then sequence the mutated polypeptide to determine the tolerance at each position
Disclosed are methods for determining the spectrum of substitutions to be made. Can be used
Other methods are available on phage displays (eg, Lowman et al.).
al.,Biochem.30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409.
No .; Huse, WIPO published WO 92/06204) and region-directed mutagenesis (Derbyshire et al.
al.,Gene 46: 145, 1986; Ner et al.,DNA 7: 127, 1988). biological
In addition to testing mutated polypeptides for activity,
The expression vector encoding the repeptide is mutated for polypeptide secretion.
It can be transformed into cultured cells to evaluate the effect.
Within B, the amino acid substitution when compared to the native TPO sequence is the molecular
It is designed to preserve or enhance the beneficial effects of the above parts. preferable
Substitution includes replacement of a charged residue with an uncharged residue. Another preferred substitution is alani
Of valine (residue 168 of SEQ ID NO: 2) with arginine with glutamic acid
Substitution (residue 164 of SEQ ID NO: 2) and threonine (sequence
No. 2 includes residue 158). Such substitutions may be made individually or in any combination
Can be done in a short time. Less than 25% of the residues in B have their corresponding natural sequences
Is preferably substituted as compared with An exemplary C-terminal domain sequence is SEQ ID NO:
No .: 4 to SEQ ID NO: 7.
Without wishing to be bound by theory, the Thr-Thr dipeptide is O-linked
Attachment sites for carbohydrate chains can be provided. Therefore, one aspect of the present invention
In an embodiment, B is a Thr-Thr dipeptide
including. In a particularly preferred embodiment, the N-terminal 5 amino acid residues of B are Ala-Pro-
Pro-Thr-Thr (SEQ ID NO: 8).
Secretion levels are further increased by the addition of N-linked carbohydrate addition sites (Asn-X-Ser / Thr).
Can be enhanced. However, the existence of such an arrangement is
In main cells (e.g., Saccharomyces cerevisiae)
And can lead to undesired hyperglycosylation.
One skilled in the art will recognize that the effects of certain amino acid substitutions can be host cell-specific.
I will admit that. Therefore, it is used for the production of polypeptides.
It is preferred to evaluate the effect of such substitutions on a wax host cell type.
Expression vectors of the present invention that are capable of replicating in eukaryotic host cells are described above.
The first DNA segment encoding such a secretory peptide and the TPO polypeptide
A transcription promoter operably linked to the second DNA segment
Includes transcription terminator. Therefore, this second DNA segment is CXB ｛
Here, C, X, and B are the same as defined above. TPO poly consisting of｝
Encodes a peptide. In a preferred embodiment of the present invention, B is SEQ ID NO: 3
Where y is an integer from 5 to 18 and no more than 35% of the above residues of B
Below, preferably up to 25%, are individually replaced by other amino acid residues. Pika
A polypeptide comprising
"A DNA segment encoding a TPO polypeptide consisting of C-X-B"
The nascent polypeptide reads from its amino terminus to the carboxyl terminus
It means that it is composed of the elements mentioned. Therefore, the term "coding (enc
oding) "is used to refer to the direct product of transcription and translation of a DNA segment.
You. Skilled person
Such polypeptides have additional components, such as carbohydrate chains, added to them.
Understand that you can experience some post-translational processing
U. The precise nature of such post-translational modifications is the polypeptide in which the polypeptide is produced.
It will be determined in part by the type of host cell.
Mouse and human TPO DNAs can be found in WIPO Publication WO 95/21920, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
Cloned as disclosed in U.S. Pat. Mouse TPO DNA distribution
The plasmid containing the sequence, pZGmpl-1081, is from the American Type Culture Collection, 12301.
Parklawn Drive, Rockville, MD on 14 February 1994 under the terms of the Budapest Treaty
Deposited and assigned accession number 69566. Plus including human TPO cDNA
Mid pZGmpl-124 was obtained under the accession number 69615 under E. coli. 1984 as a transformant of E. coli DH106
Deposited with the American Type Culture Collection on May 4th. These mice and
And human cDNAs include genomic DNAs, allelic variants, and DNAs from other species
Useful as probes for isolating other TPO-encoding DNAs.
Host cells suitable for use in the present invention are suitable for expressing heterologous DNA.
Can be genetically engineered, grown in culture, and secreted
Includes any type of eukaryotic cell that has a pathway.
To direct the TPO polypeptide into the secretory pathway of the host cell, the secretory leader
Used with a DNA sequence that encodes a polypeptide. Its secretory leader is TPO
Or other secreted proteins, such as tissue-type plasminogen activator
Beta (t-pA) or Saccharomyces. Saccharomyces cerevisiae
) The conjugated pheromone α can be of one factor. With TPO polypeptide
When using a heterologous secretory leader, each DNA segment
Is correct for its linked segment to encode the fusion protein.
Connected in the same frame. Linked secretory leader and TPO polypep
The tide is typically removed from the TPO polypeptide by its secretory leader during secretion.
To define a proteolytic cleavage site at their junction as
Would. However, one skilled in the art will recognize that the fusion protein is recovered and
Will be able to release the TPO polypeptide
U.
Yeast cells, especially cells of the genus Saccharomyces, are used in the present invention.
Preferred host. Yeast cells are used in the manufacture of products for human consumption.
It has a long history of use and is relatively inexpensive to culture. By foreign DNA
Method for transforming yeast cells and producing recombinant proteins therefrom
Are described, for example, in Kawasaki, U.S. Pat. No. 4,599,311; Kawasaki et al., U.S. Pat.
Brake, U.S. Patent No. 4,870,008; Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,7.
No. 43; and Murray et al., US Pat. No. 4,845,075, which are hereby incorporated by reference.
Capture in the book. ). The transformed cells are labeled with a selection marker.
-Generally grows in the absence of drug resistance or certain nutrients (eg, leucine)
Selected by the phenotype determined by the ability. Preferred for use in yeast
A new vector system was disclosed by Kawasaki et al. (U.S. Pat.No. 4,931,373)POT1
Vector system, in which cells are separated by culture in a glucose-containing medium.
Allow to be excreted. Promoters and tags suitable for use in yeast
Terminators are glycolytic enzyme genes (eg, Kawasaki, US Pat. No. 4,599,311;
Kingsman et al., U.S. Patent No. 4,615,974; and Bitter, U.S. Patent No. 4,977,092.
(These are incorporated herein by reference.))
It contains the Lucol dehydrogenase gene. U.S. Pat. No. 4,990,446; 5,063,1
No. 54, 5,139,936; and 4,661,454, which are incorporated herein by reference.
Embed. See also). Hansenula polymorpha
), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromi
Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis (
Kluyveromyces fragilis), Ustilago maydis, Pi
Chia pastoris (Pichia pastoris), Pichia guilermonjii (Pichia guil
lermondii) and other yeasts, including Candida maltosa
Are also known in the art. For example, Gleeson et al.,J . Gen . Microbiol
.132: 3459-3465, 1986; Cregg, U.S. Patent No. 4,882,279; and Str.
See oman et al., U.S. Patent No. 4,879,231.
Using selected host strains for high levels of TPO polypeptide secretion
preferable. Parent strains suitable as genotypes for fermentation and protein production can be obtained by conventional methods
For example, UV irradiation or, for example, ethyl methane sulfonate or nitrosog
Mutagenesis is achieved by chemical mutagenesis using anidine. Viable cells
Is a conventional assay method, such as a filter colony assay,
Vesicles are layered on nitrocellulose, which is then converted to a Western blot format.
Protein secretion levels using assays that are probed by antibodies in
Screened about the bell. Additional assays, such as activity assays (activit
y assays) can also be used.
Other fungal cells are also suitable as host cells. For example, Aspe
Aspergillus cells are described in Mcknight et al., U.S. Pat.
Is incorporated herein by reference.
)). Acremonium chrysogenum (Ac
remonium chrysogenum) is described in Sumino et al., US Pat.
No. 5,162,228, which is incorporated herein by reference.
ing. Methods for transforming Neurospora are described in Lambowitz, US
No. 4,486,533, which is incorporated herein by reference.
Have been.
Methods for introducing foreign DNA into mammalian host cells include calcium phosphate-mediated
Transfection (Wigler et al.,Cell 14: 725, 1978; Corsaro and P
earson,Somatic Cell Genetics 7603, 1981: Graham and Van der Eb.,Vir ology 52: 456, 1973), electroporation (Neumann et al.,EMBO J.1
: 841-845, 1982), DEAE-dextran mediated transfection (Ausubel
et al., eds.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Son
s, Inc., NY, 1987), and cationic lipid-mediated transfection (Howley-Ne
lson et al.,Focus 15: 73-79, 1993) (these are incorporated herein by reference).
No. )including. Production of recombinant proteins in cultured mammalian cells, for example,
See, for example, Levinson et al., US Pat. No. 4,713,339; Hagen et al., US Pat. No. 4,784.
Polmiter et al., U.S. Pat. No. 4,579,821; Mulvihill et al., U.S. Pat.
No. 5,486,471; Foster et al., US Pat. No. 5,358,932; and Mulvihill et a.
l., US Patent No. 5,385,831, which is incorporated herein by reference.
More disclosed. Preferred cultured mammalian cells are COS-1 (ATCC No. CRL 1650),
COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 1
0314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al.,J . Gen. Virol. 36: 59-72,
1977) and Chinese Hams
Ovary (eg, CHO-K1; ATCC No. CCL61) cell lines. Additional suitable cell lines
Are known in the art and public depositories, such as American Type
Available from Culture Collection, Rockville, Maryland. Generally strong
Transcription promoters, such as promoters from SV-40 or cytomegalovirus
Is preferred. See, for example, U.S. Patent No. 4,956,288. Other suitable promo
The promoter was derived from the metallothionein gene (U.S. Pat. Nos. 4,579,821 and
No., 601,978, which are incorporated herein by reference. ) And adenovirus
Major late promoter.
Drug selection generally involves cultured mammalian cells into which foreign DNA has been inserted.
Used to select cells. Such cells are generally referred to as "transfected cells.
It is called “transfectants”. It has been cultured in the presence of
Cells that can transfer the gene of interest to their progeny are
The preferred selection marker is the antibiotic neomycin.
Is a gene encoding resistance to The choice is a neomycin-type drug, for example
In the presence of G-418 or other. The selection system controls the expression level of the gene of interest.
Used for a process called “amplification” to enhance
It can also be. Amplification is performed with transfectants in the presence of low levels of the selection agent.
And then increasing the amount of selection agent to produce products with high levels of the transgene.
This is done by selecting the cells that produce the product. Preferred Amplifying Selector
Kerr is a dihydro leaf that provides resistance to methotrexate
It is an acid reductase. Other drug resistance genes (eg, hygromycin resistance,
Multidrug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used
You.
Other higher eukaryotic cells, including insect cells, plant cells and avian cells, may also be hosts.
Can be used as Transformation of insect cells and foreign proteins therein
The production of quality is described in Guarino et al., US Pat. No. 5,162,222; Bang et al., US Pat.
No. 4,775,624; and WIPO Publication WO 94/06463 (which are incorporated herein by reference.
take in. ). A method for expressing genes in plant cells.
Agrobacterium rhizogenes as an actor
Is used in Sinkar et al.,J . Biosci. (Bangalore) 11: According to 47-58, 1987
Have been reviewed.
The transformed or transfected host cell may be a member of the selected host cell.
Follow conventional procedures in culture medium containing nutrients and other ingredients required for length.
And cultured. A variety of suitable media, including defined media and complex media, are available in the art.
And generally known as carbon sources, nitrogen sources, essential amino acids, vitamins
, And minerals. Medium should contain components such as growth factors as appropriate
You can also. The growth medium generally contains, for example, defects in drug selection or in essential nutrients.
Which are carried on an expression vector or co-transfected into a host cell.
In general, cells containing exogenous added DNA are complemented by a selectable marker
Would choose.
TPO polypeptides produced according to the present invention are generally known in the art.
Methods, such as affinity purification and its protein size, charge, and solubility
It is selectively recovered using separations based on other properties. The polypeptide is cultured
To limit the amount of contaminating proteins when produced in isolated mammalian cells
Preferably, the cells are cultured in a serum-free medium. This medium is harvested, and
Fractionated. A preferred method of fractionation is, for example, immobilized Mpl receptor protein.
On the substance or its ligand-binding part, or on the affinity
Tag (eg, for which antibodies or other specific binding agents are available)
Roller polyhistidine, substance P or other polypeptide or protein)
And affinity chromatography through the use of Specific tear
Position can be provided between the protein of interest and the affinity tag
. Other chromatographic methods, such as cation exchange chromatography,
Uses Nion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography
You can also.
TPO polypeptides produced according to the invention enhance cell proliferation in bone marrow
If it is desirable, e.g., cytopenia, e.g., aplastic anemia, myelodysplasia
Odor in the treatment of common syndrome, chemotherapy or those caused by congenital cytopenias
And can be used therapeutically. TP0 polypeptide enhances platelet production
Therefore, it is also useful, for example, in the treatment of thrombocytopenia. Thrombocytopenia
A diverse group of diseases that can work alone or in concert to produce the above symptoms
And associated with clinical symptoms. Decreased platelet counts, for example,
Defects in the structure, abnormal distribution of platelets, dilution loss due to heavy transfusion, or platelets
Can result from abnormal destruction of For example, chemistry used in cancer treatment
Therapeutic agents can inhibit the development of platelet progenitor cells in the bone marrow, and
Thrombocytopenia limits chemotherapy and may require a blood transfusion. Further
Certain malignancies can impair platelet production and platelet distribution. Malignant
Radiation therapy used to kill cells also kills platelet progenitor cells. Thrombocytopenia
Is triggered by drugs, neonatal alloimmunity, or platelet transfusion alloimmunity
It can also result from a variety of autoimmune diseases that arise. TPO polypeptide
Reduce or eliminate the need for blood transfusions, thereby alloimmunizing platelets
To reduce the incidence of Abnormal destruction of platelets can be caused by (1) vascular transplantation or traumatic tissue
Increased platelet consumption within or; (2) eg, drug-induced thrombocytopenia, idiopathic blood
Platelet-reduced purpura (idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)), autoimmune disease, blood
Immunity associated with humoral ataxia, such as leukemia and lymphoma, or metastatic cancer, including bone marrow
Epidemic mechanism, which can result from. Other symptoms about TPO are poor regeneration
Aplastic anemia and drug-induced myelosuppression, such as chemotherapy or AZT
And those resulting from treatment of HIV infection by
Thrombocytopenia is an increase in bleeding, for example, mucosal bleeding from the nasal and oral regions or the gastrointestinal tract
As well as trauma, ulcers or oozing from the injection site.
For pharmaceutical use, the TPO polypeptides are administered parenterally, particularly according to conventional methods.
For intravenous or subcutaneous delivery. Intravenous administration may be by bolus injection or
May be by infusion over a typical period of one to several hours. Generally, pharmaceutical delivery
The compound is a pharmaceutically acceptable excipient, such as saline, buffered saline
Will contain a TPO polypeptide, along with 5% dextrose in water and the like. Arrangement
The compound may further comprise one or more excipients, preservatives, solubilizers, buffers, vial surfaces.
And albumin for preventing protein loss. Further
In addition, TPO polypeptides may be used in combination with other cytokines, especially those that act early, e.g.
For example, it can be combined with stem cell factor, IL-3, IL-6, IL-11 or GM-CSF
. When using such combination therapy, the cytokines are combined in a single formulation.
Can be combined or administered in separate formulations. Mixing method
Are well known in the art and, for example,Remington's Pharmacentical S ciences
Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, (by citation).
Incorporated herein. )
Are disclosed in Therapeutic doses of TPO generally range from 0.1 to 100 μg / k per day.
g Within the range of patient weight, preferably 0.5 to 50 μg / kg / day. That exact throw
The dosage should be acceptable considering the nature and severity of the condition to be treated, the characteristics of the patient, etc.
Determined by the clinician according to established standards. In certain cases, for example, high sensitivity
0.1-20 μg / kg / kg when treating patients who show or require prolonged treatment
Dosages in the range of days are prescribed. Determination of the dosage is within the level of ordinary skill in the art. TP
O polypeptides are generally expressed for up to 28 days after chemotherapy or bone marrow transplantation.
Is> 20,000 / mmThree, Preferably> 50,000mmThreeUntil the platelet count is reached.
Will be given. More generally, the TPO polypeptide will be
Will often be administered over a period of 1 to 3 days. Generally, TPO poly
A therapeutically effective amount of the peptide will increase the proliferation and / or differentiation of lymphocytes or bone marrow progenitor cells.
A sufficient amount to produce a clinically significant increase in
Manifest as an increase in circulating levels of (eg, platelets or neutrophils)
Would. Thus, treatment of platelet ataxia is at least 20,000 / mmThree, Preferably 50,00
0 / mmThreeWill be continued until a platelet count of is achieved. TPO Polypeptide
Can be used for other cytokines such as IL-3, IL-6, and IL-11; stem cell factor;
Sulopoietin can also be administered with G-CSF and GM-CSF. Combination therapy
In the regimen, the daily dose of other cytokines is generally: EPO, ≤150 U / kg;
M-CSF, 5-15 μg / kg; IL-3, 1-5 μg / kg; and G-CSF, 1-25 μg / kg
There will be. Combination therapy with EPO is prescribed, for example, in anemic patients with low EPO levels.
Is done.
TPO polypeptides are useful for in vitro studies of hematopoietic cell differentiation and development.
For example, elucidate the mechanisms of cell differentiation and
It is also a valuable tool for determining cell lineage and growth in cell culture
There are also uses as agents.
TPO polypeptides are used ex vivo, for example, in autologous bone marrow cultures.
Can also be used. Briefly, bone marrow is obtained from patients prior to chemotherapy.
TPO polypeptide, optionally together with one or more other cytokines
Is processed by The treated bone marrow is then transformed to promote bone marrow recovery.
After chemotherapy, he is returned to the patient. Further, the TPO polypeptide may be found in bone marrow or peripheral
Ex vivo expansion of peripheral blood progenitor (PBPC) cells (expans
ion). Prior to chemotherapy treatment, bone marrow
Stimulated by stem cell factor (SCF) or G-CSF to release progenitor cells into the peripheral circulation
Can be done. These precursors are collected from peripheral blood and are concentrated
And then optionally, but not exclusively, SCF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-6 or
Culture with one or more TPO polypeptides with one or more other cytokines, including IL-11
Treated in nutrients to differentiate and proliferate into high density megakaryocyte cultures. This is then
Can be returned to the patient after high-dose chemotherapy.
The present invention is further described by the following non-limiting examples.
ExampleExample 1
Arg-Arg dipeptide at positions 153-154 of SEQ ID NO: 2
Of a truncated human TPO polypeptide differing in the presence or absence of
Constructed to compare expression in S. cerevisiae. this
These two vectors have been disclosed in plasmids (ATCC # 68001; US Pat. No. 5,128,321).
). Both vectors are S. Triose ho of cerevisiae
The sulfate isomerase (TPI1) gene promoter (US Pat. No. 4,599,311)
No., incorporated herein by reference. ), S.P. cerevisiae MFα1 Prep
B sequence, TPO sequence, and S.B. TPO expression comprising cerevisiae TPII terminator
Cassette included. Selection of the above vector in a medium containing glucose
Of Schizosaccharomyces pombe
Lyose phosphate isomerase (POT) gene, selection in E. coli
Further comprises an ampicillin resistance gene for selection, and a leu2-d selection marker.
Was. Vector pD85 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which residue 168 (Val) has been replaced with Ala.
It encoded a wild-type human TPO sequence from acid residue 1 to residue 172. Vector pD79
The codons for luginine residues 153 and 154 have been deleted and the valine codon (residues 1
68) encodes the variant TPO1-172 sequence replaced by an alanine codon.
(The amino acid positions refer to SEQ ID NO: 2).
Full-length human TPO DNA has 5 codons at the 5 'end of the MFaI prepro sequence.
And a polymerase chain reaction (P) to add a termination codon to its 3 'end.
CR). PCR was performed using the primers ZC7623 (SEQ ID NO: 9) and ZC7627 (SEQ ID NO: 9).
Column number: 10). PCR was performed using Taq polymerase and ~ 20 ng of template DNA.
For 25 cycles at 94 ° C. for 1 minute; 53 ° C. for 1 minute; and 72 ° C. for 1.5 minutes
I ran with. The modified TPO sequence was simply constructed as a 479 bp HindIII-XbaI fragment.
Release and ligated into pUC18 which had been cleaved with the same enzyme. The obtained plastic
The sumid was named pHB76.
The TPO sequence in pHB76 is replaced by the 5 'end of the sequence encoding the cytokine domain.
And at the 3 'end were modified to introduce BbeI and SalI sites, respectively.
PCR was performed using primer ZC7868 (SEQ ID NO:
No .: 11) and ZC7870 (SEQ ID NO: 12). PCR, Taq polymerase
And 〜20 ng of template DNA for 9 cycles at 95 ° C. for 1 minute; 68 ° C. for 4 minutes;
Thereafter, one cycle was run at 95 ° C for 1 minute; 68 ° C for 10 minutes. This TP
The O sequence was recovered as a 482 bp HindIII-EcoRI fragment and cleaved with the same enzyme.
Was ligated into pUC19. The resulting plasmid was named pTPOGN2
Was.
Next, the mutant TPO sequence was ligated to a tripartite ligation with HindIII + XbaI digested pUC19.
457 bp HindIII-SalI fragment from pTPOGN2 and oligonucleotide ZC8488
It was constructed by combining (SEQ ID NO: 13) and ZC8489 (SEQ ID NO: 14).
encodes the last few residues of the α-factor pre-pro peptide and the truncated TPO polypeptide
A 539 bp HindIII-XbaI fragment was isolated from pTPOGN6. This fragment is (Bam
(With cleaved with HI and treated with alkaline phosphatase)
In ligation, 1230 containing TPI1 promoter and MFα1 prepro sequence
bp BglII-HindIII fragment and 680 bp XbaI-BamHI containing TPI1 terminator
The fragment was ligated. The resulting plasmid was named pD79.
A control plasmid encoding residues 1 to 172 of human TPO (SEQ ID NO: 12)
In the ligation, (cleaved by BamHI and alkaline phosphatase
PDPOT and a 1230 bp BglII-HindIII TPI1-MFα1 (fragment
And the last few residues of the α-factor pre-pro peptide and the cleaved TPO polypeptide.
540 bp fragment to be ligated to the 680 bp XbaI-BamHI TPI1 terminator fragment
It was built by doing. The resulting plasmid was named pD85.
Plasmids pD79 and pD85 are provided by Hinnen et al. (Proc . Natl. Acad. S ci . USA 75: 1929-1933, 1978) as essentially disclosed by Saccharo
Mrs. Saccharomyces cerevisiae strain JG134 (MATα Δtpil :: U
RA3 ura 3-52 leu2-Δ2 pep4-Δ1 [cir °]). Transformation
The body to their ability to grow on media containing glucose as the sole carbon source
I chose about it.
Transformants contain 1% yeast extract, 1% peptone, and 5% glucose.
For about 60 hours in a liquid medium. These cells are separated by centrifugation from the above culture medium.
Separated from The medium sample was diluted with TPO dilution buffer (10% fetal calf serum, 2 mM
L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 50 μg / ml penicillin, 50 μg
/ Ml streptomycin, 100 μg / ml neomycin, 0.00033% β-mercap
1: 100 in RPMI 1640) supplemented with triethanol, 25 mM Hepes.
The biological activity of TPO can be measured using an expression vector encoding the human MPL receptor as a target cell.
BaF3 cells (Vigon et al.,Proc . Natl. Ac ad. Sci. USA 89: 5640-5644, 1992) in a mitogenesis assay
evaluated. BaF3 is an interleukin-3-dependent prairie derived from murine bone marrow.
Is a hematopoietic cell line (Palacios and Steinmetz,Cell 41: 727-734, 1985; Math
ey-Prevot et al.,Mol . Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Cells are incubated at 37 ° C
16-19 hours inThreeThe test samples were exposed in the presence of H-thymidine. Extraction into cell DNA
StuckThreeThe amount of H-thymidine was quantified by comparison with a standard curve of human TPO.
10 U / ml is defined as the amount that gives half the maximal stimulation of the mitogenesis assay.
did. Table 1 shows the results of the two experiments.
Table 1 Experiment Plasmid TPO ( Unit / ml medium)
1 pD85 40
pD79 740
2 pD85 below the limit
pD79 160Example 2
To the C-terminal segment by either a peptide bond or an Arg-Arg dipeptide
From the linked cytokine domain of human TPO (residues 22-152 of SEQ ID NO: 2)
A series of plasmids encoding the resulting TPO polypeptides were constructed. Table 2 shows the
1 shows the structure of the polypeptide as shown: Arg-Arg is the presence of the dipeptide (+)
Or the absence (-); the amino acid number for the C-terminal segment is
Reference is made to SEQ ID NO: 3.
Table 2 Plasmid Arg −Arg C-terminal sequence
pD117-1-5
pD119-1-9
pD121-1-13
pD123-1-18
pD125 + 1-18
Plasmid pTPOGN8 had been linearized by digestion with HindIII and XbaI.
pUC19; part of the α-factor secretion leader and part of the human TPO cytokine domain
457 bp HindIII-SalI fragment of pTPOGN2 containing the coding sequence for
1); and oligonucleotides ZC8486 (SEQ ID NO: 15) and ZC8487 (SEQ ID NO:
16) Ligation using a SalI-XbaI adapter, constructed from 16)
Was built.
Plasmid pD83 was converted to the following fragment: BamHI digested alkaline phosphatase treated pDPO
T; pHB105-4 (disclosed in US Pat. No. 5,155,027) within the plasmid backbone of pMVR1
S. ligated to the coding sequence for the cytokine domain of human TPO.
plasmid containing the cerevisiae TPI1 promoter and the α-factor secretion leader)
A 0 bp BglII-HindIII fragment, which is cerevisiae TPI1 promoter and α-factor
It contained the secretory leader; a 540 bp HindIII-XbaI fragment of pTPOGN8, which
Α-factor linked to the 18 residue polypeptide of SEQ ID NO: 17 at the C-terminus of
TPO consisting of a part of secretory leader coding sequence and cytokine domain
The coding sequence of the mutant was included; 680 bp XbaI-BamHI S. cerevisiaeT
The PI1 terminator fragment was constructed in a four-party ligation using
The plasmids shown in Table 2 first contain the TPI1 terminator and the vector sequence
The BglII-EcoRI fragment of pD83 was replaced with one of the oligonucleotide pairs shown in Table 3.
It was constructed by inserting it into pUC19 (cut with SalI and EcoRI).
The resulting plasmids were designated as pTPOMI1,2,3,4 and 5 as shown in Table 3.
Named. Two pD83 fragments: a TPI1 promoter, an MFα1 secretion leader,
A BglI-SalI comprising a 5 'TPO coding region and a vector sequence; and a vector
EcoRI-BglI containing a 3′-TPO coding sequence, TPI1 terminator
And the SalI-EcoRI fragment from pTPOMI1-5 (including the vector sequence).
Thus, pD117, pD119, pD121, pD123, and pD125 were constructed, respectively.
Table 3 Plasmid Oligonucleotide
pTPOMI1 ZC10086 (SEQ ID NO: 18)
ZC10087 (SEQ ID NO: 19)
pTPOMI2 ZC10095 (SEQ ID NO: 20)
ZC10096 (SEQ ID NO: 21)
pTPOMI3 ZC10120 (SEQ ID NO: 22)
ZC10121 (SEQ ID NO: 23)
pTPOMI4 ZC10118 (SEQ ID NO: 24)
ZC10119 (SEQ ID NO: 25)
pTPOMI5 ZC10108 (SEQ ID NO: 26)
ZC10109 (SEQ ID NO: 27)
Plasmid was S. cerevisiae JG134 or M35. M35, overnight
Cultures were obtained from pD79 transformed JG134 by UV mutagenesis. 1: 1000 cells
Dilute and 50 μl of the dilution with YEPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% D
-Glucose, 0.004% adenine, 0.006% L-leucine). Step
The rate is exposed to UV light for 20 seconds in a dark room, placed in a light impermeable box, and
Incubated at 30 ° C. for 2 days. Next, place each plate on a fresh YEPD plate
Replica plate on top, cover with nitrocellulose, and incubate at 30 ° C overnight.
Incubated. The nitrocellulose is then removed and the adherent yeast cells
Were washed away. This nitrocellulose is mixed with 1 × for blocking.
Via standard Western technology using 5% milk in PBS and rat anti-human TPO antibody
Color. Colonies showing high secretion levels in the primary screen
Were further assayed by Western blotting and activity assay. GN35
One mutant, named, consistently has 2-4 times higher activity than its parent strain
Created. GN35 is a prokaryotic kanamycin resistance gene and S. aureus. cerevisiae TPI1
PD79 by transformation with a 2-micron-based plasmid containing the gene.
Cured from. Selecting transformants resistant to 2 mg / ml G418;
In YEPD containing G418, then YEPGGE (0.004% adenine, 0.006% L-leucine, 1
% Yeast extract, 0.4% D-galactose, 2% peptone, 3% glycerol, 1%
% Ethanol). The cells are then grown on glucose as a carbon source.
Screened my inability to do so. This means that triose on pD79
3 shows the loss of the phosphate isomerase gene. The corrected cells are transferred to strain M35.
It was named. Transformants were treated with 2% peptone, 1% yeast extract, and 5% glucose.
The cells were cultured for 70 hours in a liquid medium containing agarose with aeration. With plasmid pD79
pD85 was included as a control. In addition, (human TPO cytokine domain alone
Encodes the same polypeptide as plasmid pHB109 (encoded by pD85 and pD125)
Do) assay pBJ118.
Media was collected and assayed as disclosed in Example 1. Assay results
It is shown in Table 4.
Table 4 Host Plasmid TPO (ng / Ml)
JG134 pD117 26
pD119 51
pD121 53
pD123 35
pD125 3
pD79 70
pD85 3
pHB109 below detection limit
pBJ118 8
M35 pD79 180
Example 3
A series of pDPs encoding TPO polypeptides using conventional molecular biology techniques
An OT-based plasmid was constructed. Each of the encoded TPO polypeptides
Is a C-terminal segment obtained from the C-terminal domain of human TPO via a peptide bond.
And a human TPO cytokine domain linked to the These ports
The sequence of the C-terminal segment of the polypeptide is shown in Table 5 below. Amino acids are conventional
It is represented using a one-letter code.
Table 5 Plasmid C-terminal domain
pD91 APPDTAVPSRTSLVLTLN
(SEQ ID NO: 5)
pD93 APPDTAVPSETSLVLTLN
(SEQ ID NO: 6)
pD95 APPTTAVPSETSLVLTLN
(SEQ ID NO: 7)
The plasmid was transformed into strain JG134 and the transformants were disclosed in Example 2.
The culture was performed as described above. The medium is harvested and assayed as disclosed in Example 1.
did.
The results are shown in Table 6.
Table 6 Plasmid TPO ( (Unit / ml)
pDPOT 0
pD79 700
pD85 100
pD91 200
pD93 300
pD95 600
Thus, specific embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration.
However, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention.
It will be understood that it can. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
It is not limited.
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ
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ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 モリソン―ネルソン，ゲイリー アール.
アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ
アトル，シックスティーンス アベニュ
ノース ウエスト 7029──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/02 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, I S, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO , RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor Morrison-Nelson, Gary Earl. Su Avenue North West 7029