JP2000514836A - リガンド／細胞溶解ペプチド組成物及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 両親媒性細胞溶解ペプチドは、特異的なリガンド相互作用に依存した異常あるいは正常細胞を特異的に阻害するためのリガンド／細胞毒素の組み合わせにおいて使用するうえで適当である。例として、不妊や長期の避妊の誘発、腫瘍細胞の攻撃、ウイルス感染細胞の選択的溶解、自己免疫疾患の原因となるリンパ球の攻撃などの目的での使用がある。ペプチドは細胞膜に対して直接作用し、細胞内に取り込まれる必要はない。ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）（またはＧｎＲＨのアゴニスト）と細胞膜に作用する溶解ペプチドとの組み合わせを投与することにより動物にin vivoで長期の避妊または不妊が行われる。リガンドと膜作用性溶解ペプチドとの組み合わせのin vivo投与によりそのリガンドに対するレセプターを有する細胞が殺される。この化合物は比較的小さく、抗原性を有さない。性腺刺激細胞は非常に速やかに溶解した(１０分のオーダー)。腫瘍細胞の溶解も速やかである。２つの要素、すなわちリガンドと細胞溶解ペプチドは、融合ペプチドとして投与することが可能であり、あるいはリガンドを溶解ペプチドよりも若干先に投与するようにして別々に投与することが可能である。この別々の投与は、リガンドに対するレセプターを有する細胞を活性化して溶解ペプチドによる細胞溶解を受けやすくするためのものである。細胞溶解ペプチドあるいは溶解ペプチド／ペプチドホルモン融合体をコードした遺伝子は造血幹細胞や骨髄前駆細胞に容易に挿入することが可能であるため、本発明の化合物は悪性または非悪性腫瘍及び特定のレセプターを有する「正常な」ホスト細胞（例リンパ球）のクローンあるいは集団に起因する他の疾患を治療するための遺伝子治療における使用に好適である。

Description

【発明の詳細な説明】 リガンド／細胞溶解ペプチド組成物及びその使用方法 米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、仮特許出願第６０／０４１，００ ９号の１９９７年３月２７日の出願日、及び仮特許出願第６０／０５７，４５６ 号の１９９７年９月３日の出願日の特典を米国にて権利主張し、米国外において は適用可能な条約や協定に基づき権利主張するものとする。米国特許法第１２０ 条に基づき、仮特許出願第０８／８６９，１５３号の１９９７年６月４日の出願 日の特典を米国内にて権利主張し、米国外においては適用可能な条約や協定に基 づき権利主張するものとする。 技術分野 本発明は、特異的なリガンド相互作用に依存した細胞を特異的に阻害するため の組成物及び方法に関する。その例として、長期の避妊または不妊処置を行うた めの組成物及び方法、悪性または非悪性のホルモン依存型腫瘍を阻害するかまた は殺すための組成物及び方法、ウイルス感染細胞を選択的に殺すための組成物及 び方法、及び自己免疫疾患の原因となるリンパ球を選択的に破壊するための組成 物及び方法などがある。 背景技術 長期避妊の目的で時として用いられる組成物には天然または合成ステロイドホ ルモンを用いて雌性生殖器官を「疑似妊娠」状態とするものがある。これらのス テロイドホルモンは発情周期や受胎の完結を防止するために繰返し投与しなけれ ばならない。ステロイドは危険な副作用を有する場合がある。 P.Olson et al.,“Endocrine Regulation of the Corpus Luteum of the Bitc h asa Potential Target for Altering Fertility,”J．Reprod．Fert．Suppl. ，vol．39，pp．27-40（1989）によれば、雌成犬における黄体形成及びその調節 について述べられている。その３７頁に以下の記述がある。「抗体やホルモンに 特定の毒素を結合させて特定の標的細胞に運ばせ、この毒素によって標的細胞を 殺すことが可能である。この「魔法の弾丸」のアイディアは数十年にわたって議 論されてきたが、最近になって他の組織には影響を及ぼすことなく特定の組織だ けを破壊するための高度に選択的な方法として新たな注目を浴びている。永年の 間、一種類の抗原決定因子のみに対して特異的に反応する抗体を大量に得ること は不可能であった。しかし、モノクローナル抗体の登場によってこの問題はほぼ 克服された。特定のホルモンレセプター（ＬＨ レセプターなど）に特異的な抗 体を作ってこれに毒素を結合させることが可能である。これによりＬＨ レセプ ターを有する全ての細胞は破壊される。イヌ黄体の異なる細胞が全て特徴付けら れたわけではないが、これらの細胞が物質のやりとりを行っているとすると、黄 体細胞のいずれかの種類の破壊が黄体融解につながる可能性がある。」(引用は 省略) P.Olson et al.,“New Developments in Small Animal Population Control, ”JAVMA，vol．202，pp．904-909(1993)には、小型の哺乳動物において望ましく ない妊娠を防止し、または中絶を行うための方法の概要が示されている。その９ ０５頁には以下の記述が見られる。「組織特異的細胞毒性…ゴナドトロピン放出 ホルモン（ＧｎＲＨ）に結合させた、ゴナドトロピン分泌脳下垂体細胞を選択的 に破壊する細胞毒素の投与により雌及び雄動物における永続的な避妊が可能であ る。同様に、ゴナドトロピンレセプターに対する抗体に結合させた細胞毒素によ り性腺機能を変化させることが可能である。毒素は他の全ての組織に対して安全 なものでなくてはならず、特定の細胞を慎重に狙わなければならない。」(引用 は省略) T.Janaky et al.,“Short Chain Analogs of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Containing Cytotoxic Moietoes,”Proc．Natl．Acad．Scj．USA，vol ．89，pp．10203-10207（1992）には、アルキル化剤であるナイトロジェンマス タードの担体として、ＧｎＲＨの特定のへキサペプチド及びへプタペプチド類似 体の使用について述べられている。筆者等は、これらの化合物のうち幾つかのも のが乳癌細胞ＭＣＦ-７系に対する細胞毒性を示したことを報告している。 D.Fitzgerald et al.,“Targeted Toxin Therapy for the Treatment of Canc er,”J．Natl．Cancer Inst.，vol．81，pp．1455-1463(1989)では、シュードモ ナスの体外毒素、ジフテリア毒素やリシンをモノクローナル抗体や成長因子など の細胞結合タンパク質に結合させることを含む、癌の選択的毒素療法について述 べられている。これらの結合体は細胞質に取り込まれ、細胞の活動を阻害する。 従来の選択的毒素療法には幾つかの難点がある。毒素に対する抗体を産生する 免疫応答が患者の免疫系によって獲得されるまでの時間が、特定の選択的毒素に よる治療では短い(約２週間程度)。これらの抗体により毒素は中和されるか、場 合によっては、細網内皮組織（例、肝臓、脾臓、リンパ節、肺、骨髄）内に毒素 が蓄積して、健康な組織にダメージを与えることもある。この難点とは別に、毒 素が効果を発揮するためには標的細胞によって取り込まれて細胞質内に移送され なければならないという点がある。 これに似た方法として酵素にモノクローナル抗体を結合させる方法がある。こ の結合体を腫瘍細胞の表面抗原に結合させる。次にプロドラッグを患者に投与す る。このプロドラッグの毒性は、プロドラッグが腫瘍部位においてモノクローナ ル抗体と結合した酵素によって活性化されて生じるドラッグよりも大幅に低い。 活性化されたドラッグは腫瘍細胞を選択的に攻撃する（参照 D．Kerr et al.， “Regressions and Cures of Malanoma Xenografts following Treatment with Monoclonal Antibody β-Lactamase Conjugates in Combination with Anticanc er Prodrugs,”Cancer Research，vol．55，pp．3558-3563(1995);H．Svensson et al.,“In Vitro and In Vivo Activities of a Doxorubicin Prodrug inComb ination with Monoclonal Antibody β-Lactamase Conjugates,”Cancer Resear ch，vol．55，pp．2357-2365(1995))。 S.Scalfon et al.,“Molecular Mechanisms of ligand interaction with the gonadotropin-releasing hormone receptor,”Endocrine Reviews，vol．18，p p．180-205（1997）ではＧｎＲＨとそのレセプターとの相互作用に関する研究に ついて述べられている。 F．Hu et al.,“Theophylline and Melanocyte-Stimulating Hormone Effects on Gamma-Glutamyl Transpeptidase and DOPA Reactions in Cultured Malanom a Cells,”J．Investigative Dermatology，vol．79，pp．57-61（1982）ではテ オフィリン及びメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のいずれによってもネズミ のメラノーマ細胞の色素沈着が、明らかに異なる機序によって促進されることに ついて述べられている。J.Murphy et al.，“Genetic Construction，Expressio n，and Melanoma-Selective Cytotoxicity of a Diphtheria Toxin-Related α- Melanocyte-Stimulating Hormone Fusion Peptide,”Proc.Natl．Acad．Sci．US A，vol．83，pp．8258-8262(1986)では、in vitroにおけるＭＳＨ−ジフテリア 毒素結合体のメラノーマ細胞に対する選択的活性に関して述べられている(D.Bar d,“An Improved Imaging Agent for Malignant Malanoma，Based on[Nle⁴,D-Ph e⁷]α-Melanocyte Stimulating Hormone,”Nucl．Med．Comm．vol．16，pp．860 -866(1995)も参照)。 W．Siegrist et al.，“Homologous and Heterologous Regulation of α-Mel anocyte Stlmulating Hormone Receptorsin Human and Mouse Melanoma Cell Lines,”Cancer Research，vol．54，pp．2604-2610(1994)では、ヒトメラ ノーマ細胞がα-ＭＳＨに対して高い特異的親和性を有するレセプターを有する ことについて述べられている(J．Tatro et al.，“Melanotropin Receptors Dem onstrated in Situin Human Melanoma,”J．Clin．Inest.，vol．85，pp．1825- 1832(1990)も参照)。 P.Bacha et al.,“Thyrotropin-Releasing Hormone-Diphtheria Toxin-relate d Polypeptide Conjugates,”J．Biol．Chem.，vol．258，pp．1565-1570(1983) では、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）と２種類のジフテリア毒素と の結合体について述べられており、この内の一方は３×１０^-9Ｍの濃度でラット のＧＨ₃脳下垂体細胞におけるタンパク質の合成を５０％阻害することが示され ている(P．Bacha et al.，“Organ-Specific Binding of a Thyrotropin-Releas ing Hormone-Diphtheria Toxin Complex after Intravenous Administration to Rats,”Endocrinology，vol．113，pp．1072-1076(1983)も参照)。 V．Chaudhary，“Activity of a Recombinant Fusion Protein between Trans forming Growth Factor Type α and Pseudomonas toxin,”Proc．Natl．Acad． Sci．USA，vol．84，pp．4538-4542(1987)では、改変されたシュードモナス毒素 とトランスフォーミング増殖因子αとの融合タンパク質が、上皮増殖因子レセプ ターを発現している細胞を選択的に殺すことについて述べられている(D.Cawley et al.,“Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates;ＥＧＦ-Ricin I s a Potent Toxin while EGF-Diphtheria Fragment A is Nontoxic,、”Cell，vo l．22，pp．563-570(1980)も参照)。 E．Vittera et al.，“Redesigning Nature's Poisons to Create Anti-Tumor Reagents,”Science，vol．238，pp．1098-1104(1987)では腫瘍に対する免疫毒 素の使用について述べられている。移植片に対するホストの拒絶反応の防止にお け る使用についても触れられている。筆者等はin vivoでの効果はそれほど高くな かったとしている。難点としては、血液循環中の毒素の標的細胞へのアクせシビ リティー、毒素の抗体への結合の不安定性、肝臓による血液循環中からの免疫毒 素の速やかな除去、患者の免疫系の毒素やモノクローナル抗体に対する応答、長 期治療、新たな腫瘍性細胞に対する特異性の欠如の可能性、正常細胞への交差反 応性、腫瘍細胞の不均一性、及び腫瘍細胞の表面抗体の脱落などが挙げられてい る。 P．Trail et al.，“Antigen-Specific Activity of Carcinoma-reactive BR6 4-Doxorubicin Conjugates Evaluated in Vitro and in Human Tumor Xenograft Models,”Cancer Research，vol．52，pp．5693-5700(1992)では、ドキソルビ シン誘導体への抗腫瘍抗体ＢＲ６４の結合について述べられており、この結合体 の抗腫瘍作用について述べられている。 J．Olson,“Laboratory Evidence for the Hormonal Dependency of Menigiom as,”Human Reproduction，vol．9，supp．1，pp．195-201(1994)では、良性の 頭蓋内腫瘍である髄膜腫がプロゲステロンレセプターを有する証拠について述べ られている。 S.Prigent et al.,”The Type I（EGFR-Related）Family of Growth Factor Receptors and theIr Ligands,”Progress in Growth Factor Research，vol．4 ，pp．1-24（1992）では、上皮増殖因子(ＥＧＦ)、そのレセプター、関連するリ ガンドやレセプター(例、c-erbB-2，c-erbB-3，TGFα，amphiregulin，hereguli n)、及び正常細胞の増殖やヒトの癌の病因におけるこれらの因子の役割について 述べられている（D.Davis etalI,“Targeting the Epidermal Growth Factor Re ceptor for Therapy of Carcinomas,”Biochem．Pharm.，vol．51，pp．1101-11 10(1996)も参照)。 D.Morbecketal.,“A Receptor Binding Site Identified in the Region 81-9 5 of the β-Subunit of Human Lutenizing Hormone（LH）and chorionic gonadotropin(hCG),”Molecular and Cellular Endocrinology，vol．97，pp ．173-181（1993）では、ＬＨ及びｈＣＧのレセプター結合部位として機能する アミノ酸１５個の領域について述べられている。（ＬＨ及びｈＣＧは同様の作用 を有する相同ホルモンである。) W.Theunis et al.,“Luteinising Hormone，Follicle Stimulating Hormone a nd Gonadtropin Releasing Hormone Immunoreactivity in Two Insects:Locusta migratoria migratoroides R & F and Sarcophaga bullata(Parker),”Invert ．Reprod．and Develop.，vol．16，pp．111-117(1989)では、ＬＨ、ＦＳＨ、及 びＧｎＲＨに免疫学的に関連する物質がLocusta migrantoda及びSarcophaga bul lataの脳組織内に局在化していることについて述べられている(P.Verhaert et a l.，“Substances Resembling Peptides of the Vertebrate Gonadotropin Syst em Occur in the Central Nervous System of Periplaneta americana L.,”Ins ect Biochem.，vol．16，pp．191-197(1986)も参照)。 米国特許第５，３７８，６８８号、同５，４８８，０３６号、及び同５，４９ ２，８９３号は、哺乳類に不妊を誘発し、哺乳類における特定の性ホルモン関連 腫瘍を治療するうえで有用な化合物について開示している。開示されている化合 物はＧｎＲＨという遺伝子産物（またはＧｎＲＨ類似体）に毒素を結合させたも のである。毒素は好ましくはＧｎＲＨアゴニストの６番目のアミノ酸に結合され る。毒素は好ましくは細胞内への取り込みを促進する移送ドメインを有するもの である。発明者は、ＧｎＲＨアゴニストの毒素への結合は、「多くの場合、上述 の毒素は、それ自体では細胞膜に結合できないために必要なことである。すなわ ち、出願人等は、明細書中に述べられている種類のＧｎＲＨ類似体が上述した種 類の 毒素に結合させられた場合にのみ、毒素が細胞膜に結合可能となることを見出し たものである・・・・」と述べている(例、米国特許第５，４８８，０３６号、 第７コラム、４６〜５２行)。ここで具体的に挙げられている毒素は、リシン、 アブリン、モデクシン、各種植物由来リボソーム阻害タンパク質、アメリカヤマ ゴボウの抗ウイルスタンパク質、α-アマニチン、ジフテリア毒素、シュードモ ナス体外毒素、志賀毒素、メルファラン、メトトレキサート、ナイロトジェンマ スタード、ドキソルビシン、ダウノマイシンなど、全て代謝毒物である。これら の毒素の内で、細胞膜との直接の相互作用によって毒性を発揮するものはないも のと思われる。ここで示されているin vivo実験では、４週問にわたった毎週１ 回の注射投与が最も有効であると報告されている(例、米国特許第５，４８８， ０３６号、第２０コラム、４６−４７行)。記載されている結合体の多くは比較 的大きな化合物であるため、こうした投与法が用いられた場合には抗原性が問題 となる可能性がある。ＧｎＲＨ類似体は好ましくは記載された幾つかの異種二官 能性物質のいずれかによって毒素に結合される。この明細書では毒素をＧｎＲＨ アゴニストに結合するために大変な労力を要したことが記されている。通常、こ れらの毒素は効果を発揮するためには標的細胞内に取り込まれなければならず、 細胞膜に対して作用するわけではない。更に、これらの毒素の内、少なくとも幾 つかは、リボソーム、ミトコンドリアや他の細胞器官と相互作用するためには膜 結合小胞から細胞質内へと２次的に輸送されなければならない。 M．Kovacs et al.,“Recovery of pituitary function after treatment with a targeted cytotoxic analog of luteinizing hormone-releasig hormone,”P roc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．94，pp．1420-1425(1997)では、ＬＨ-ＲＨ（ ＧｎＲＨ）に結合されたドキソルビシン類似体はＬＨ−ＲＨレセプターを有する 細胞を選択的に攻撃し、脳下垂体細胞に対するその効果は可逆的であることが開 示されている。この論文では、ＬＨ−ＲＨレセプターを有する腫瘍を治療するう えでそうした結合体を用いることが可能であることを示唆している(A.Jungwirth et al.,“Regression of rat Dunning R-3227-H prostate carcinoma by treatment with targeted cytotoxic analog of lutenizing hormone-releasing hormone AN-207 containing 2-pyrrolinodoxorubicin,”Intl.J．Oncol.，vol．10，pp． 877-884（1997）も参照)。 R.Moretti et al.,“Lutenizing hormone-releasing hormone agonists inter fere with the stimulatory actions of epidermal growth factor in human pr ostatic cancer cell lines，LNCaP and DU 145,”J．Clin．Endocrin．& Metah .，vol．81，pp．3930-3937（1996）では、ＬＨ放出ホルモンアゴニストは、ア ンドロゲン依存型（ＬＮＣａＰ）及びアンドロゲン非依存型（ＤＵ 145）ヒト前 立腺癌細胞系のいずれをも阻害することについて述べられており、このアゴニス トは上皮増殖因子の刺激作用を妨害することで腫瘍細胞の増殖を阻害することが 示唆されている。 I．Mozo et al.,“Synthesis of GnRH analogs having direct antitumor and low LH-releasing activity,”J．Med．Chem.，vol．40，pp．3353-3358(1997) では、ニワトリＧｎＲＨアゴニスト及びアンタゴニストについて開示している。 アゴニストＭＩ-1892は内分泌学的な活性は低いが、抗腫瘍活性を有することが 報告されている。 A．Nechushtan et al.，“Adenocarcinoma cells are targeted by the new G nRH-PE₆₆ chimeric toxin through specific gonadotropin-releasing hormone binding sites,”J．Biol．Chem.，vol．272，pp．11597-11603(1997)では、特 定の種類の癌細胞を殺すための、ＧｎＲＨに結合させたシュードモナス体外毒素 の使用が開示されている。 X.Zhu,“Steroid-inde Pendent activation of androgen receptor in and ro gen-independent prostate canter．A possible role for the MAP kinase sign al transduction pathway?”Mol．& Cell．Endocrinol.，vol．134，pp．9-14(1997 )では、前立腺癌のアンドロゲンレセプターをアンドロゲンシグナルがない状態 で活性化することが可能であることが開示されている。 G．Emons et al.,“Growth-inhibitory actions of analogues of luteinizin g hormone releasing hormone on tumor cells,”Trends in Endocrin．Metab. ，vol．8，pp．355-362（1997）では、癌細胞のＧｎＲＨレセプターと、正常な 脳及び脳下垂体細胞のＧｎＲＨレセプターとの間の類似点及び相違点について述 べられており、ＬＨＲＨ類似体は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜腫といった、ヒトに 見られる多くの悪性腫瘍のチロシンキナーゼ活性に関連するオンコジーン産物及 び成長因子レセプターの、有糸***を誘発するシグナルトランスダクションを妨 害することが示唆されている。 D.Tang et al.,”Target to Apoptosis:A Hopeful Weapon for Prostate Canc er,”The Prostate，vol．32，pp．284-293(1997)では前立腺癌の治療につなが るものとしてのアポトーシスの研究について述べられている。 A.Goustin et al.,”Growth Factors and Cancer,”Cancer Research，vol．4 6，pp．1015-1029（1986）では、異なる癌に関連する様々な成長因子について述 べられている。 S.Cho et al.,“Evidence for autocrine inhibition of gonadotropin-relea sing hormone（GnRH）gene transcription by GnRH in hypothalamic GT1-1neur onal cells.”Mol．Brain Res.，vol．50，pp．51-58(1997)では、ＧｎＲＨニュ ーロンの神経内分泌を行うものはＧｎＲＨ及びＧｎＲＨ類似体に対して高い親和 性を有するレセプターを有することについて述べられている。 S．Sower et al.，“Primary structure and biological activity of a thir d gonadotropin-releasing hormone from lampreybrain,”Endocrinology，vol ．132，pp．1125-1131（1993）ではヤツメウナギIIIGnRHの構造について述べら れている。 E．Stopa et al.，“immunocytochemical evidence for a lamprey-like gona dotroPin-releasing hormone in human brain,”Soc．Neurosci．Abstr.，abstr act no．437.8，p．1577(1987)では、ヤツメウナギに似たGnRHIIIがヒトにおい て見出されることについて述べられている。 S．White et al.，“Three gonadotropin-releasing hormone genes in one o rganism suggest novel roles for an ancient prptide,”Proc．Natl．Acad．S ci．USA，vol．92，pp．8363-8367(1995);J．Powell et al.，“Three forms of gonadotropin-releasing hormone characterized from brains of one species ,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．91，pp．12081-12085(1994)は、脊椎動 物において３つの異なる形態のＧｎＲＨが一般的に存在することを報告した論文 の例である。 J．Warnock etal.，“Anxiety and mood disorders assoclated with gonadotropin-releasing hormone agonist therapy,”Psychopharmacology Bull.，vol．33，pp．311-316(1997)では、ＧｎＲＨアゴニストを用いた慢性的 な治療に伴う心理学的な副作用について述べられている。 L．Deligdisch et al.，“Pathological changes in gonadotropin releasing hormone agonist analogue treated uterine leiomyomata,”Fertility and St erility，vol．67，pp．837-841では、平滑筋腫の治療にＧｎＲＨを用いて医原 性閉経を誘発する際に伴う病理学的変化について述べられている。 J．Fuerst et al.,“Effect of active immunization against luteinizing h ormone-releasing hormone on the androgen-sensitlve Dunning R3327-PAP and Androgen-Independent Dunning R3327-AT2.1 prostate cancer sublines,”Pro state，vol．32，pp．77-84(1997)では、ＬＨＲＨ-ジフテリア毒素結合体を用い たラットの能動免疫化により精巣、前立腺、及びアンドロゲン感受性前立腺腫瘍 の萎縮が見られ、ここで、腫瘍の阻害は細胞死の増加によってではなく細胞*** の抑制によるものであったこと、アンドロゲン非依存型前立腺腫瘍の容積の増加 が若干抑制されたことについて述べられている。 C.Mantzoros et al.,“Insulin-like growth factor 1 in relation to prost ate cancer and benign prostatic hyperplasia,”Br.J．Cancer，vol．76，pp ．1115-1118（1997）では、インスリン様成長因子１のレベルの増大が前立腺癌 のリスクの増大に関連していることについて報告されている。 V．Ding，“Sex hormone-binding globulin mediates prostate androgen rec eptor action via a novel signaling pathway,”Endocrinology，vol．139，pp ．213-218（1998）では、アンドロゲン非依存径路が前立腺癌のあるものの進行 を促す可能性について述べられている。 J.King et al.,“Evolution of gonadotropin-releasing hormones,”Trends in Endocrin．Metab.，vol．3，pp．339-344(1992)では、様々な脊椎動物から得 られた異なるＧｎＲＨの一次構造について開示されている(J.King et al.,“Str ucture of chicken hypothalamic luteinizing hormone-releasing hormone II ．Isolation and characterization,”J．Biol．Chem.，vol．257，pp．10729-1 0732(1982)も参照)。 N.Mores et al.,“Activation of LHreceptors expressed in GnRH neurons s timulates cyclic AMP production and inhibits pulsatile neuropeptide rele ase,”Endocrinology，vol．137，pｐ.5731-5734(1996)では、ＬＨが脳内の神経 内分泌ニューロンに直接作用することについて述べられている(Z.Lei et al.， “Signaling and transacting factors in the transcriptional inhibition of gonadotropin releasing hormone gene by human chorionic gonadotropin in immortalized hypothalamic GT1-7 neurons,”Mol．& Cell．Endocrinology，vo l．109，pp．151-157(1995)も参照)。 米国特許第５，５９７，９４５号及び同５，５９７，９４６号では、様々な細 胞溶解ペプチドをコードした遺伝子を用いて形質転換した植物を開示している。 発明の開示 特異的なリガンド相互作用に依存した異常あるいは正常細胞を特異的に阻害す るためのリガンド／細胞毒素の組み合わせにおいて使用するうえで両親媒性細胞 溶解ペプチドが適当であることが予期せずして発見された。例として、不妊や長 期の避妊の誘発、腫瘍細胞の攻撃、ウイルス感染細胞の選択的溶解、自己免疫疾 患の原因となるリンパ球の攻撃などの目的での使用がある。ペプチドは細胞膜に 対して直接作用し、細胞内に取り込まれる必要はない。 例として、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）(またはＧｎＲＨのアゴ ニスト)と細胞膜に作用する溶解ペプチドとの組み合わせを投与することにより 動物にin vivoで長期の避妊または不妊が行われる。とりわけ驚きに値するのは 、この組み合わせを性的に未成熟な動物に投与した場合にも不妊効果が得られる ことである。すなわちこの組み合わせは性的な成熟を妨げる。 リガンドと膜作用性溶解ペプチドとの組み合わせのin vivo投与によりそのリ ガンドに対するレセプターを有する細胞が殺される。本発明において用いられる この化合物は比較的小さく、抗原性を有さない(細胞溶解ペプチドの抗原性はそ れほど高くないことが知られており、リガンドは全く抗原性を有さない。)。本 発明の化合物は、１回または２回またはより短い投与間隔にて投与することが可 能である。性腺刺激細胞は非常に速やかに溶解した(１０分のオーダー)。腫瘍細 胞の溶解も速やかである。２つの要素、すなわちリガンドと細胞溶解ペプチドは 、融合ペプチドとして投与することが可能であり、あるいはリガンドを溶解ペプ チドよりも若干先に投与するようにして別々に投与することが可能である。この 別々の投与は、リガンドに対するレセプターを有する細胞を活性化して溶解ペプ チドによる細胞溶解を受けやすくするためのものである。融合ペプチドを用いる 場合、リガンドを溶解ペプチドに連結させるための連結部分は必要ないことが予 期せずして発見された。連結部分を介在させることなく、一方を他方に対して直 接結合させることが可能である。結合はリガンドの一端をペプチドの一端に結合 させるか、いずれかの中間部分にて結合させることで行うことが可能である。こ の毒素すなわち溶解ペプチドは、活性化された細胞の細胞膜に直接作用して細胞 溶解を引き起こすため、移送ドメインを必要とせず、細胞内に取り込まれる必要 がない。リガンドとしては完全な天然化合物を用いることが可能であり、または 結合ドメインのみを用いることも可能である。完全なリガンドが比較的大きい場 合、後者を用いることが好ましい。 細胞溶解ペプチドあるいは溶解ペプチド／ペプチドホルモン融合体をコードし た遺伝子は造血幹細胞や骨髄前駆細胞に容易に挿入することが可能であるため、 本発明の化合物は悪性または非悪性腫瘍及び特定のレセプターを有する「正常な 」ホスト細胞（例 リンパ球）のクローンあるいは集団に起因する他の疾患を治 療するための遺伝子治療における使用に好適である。 発明を実施するための態様 ある種の癌細胞（子宮、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣）はＬＨまたはｈＣＧ レセプターを発現する(Tao et al.,“Expression of Luteinizing Hormone/Huma n Chorionic Gonadotropin Receptor Gene in Benign Prostatic Hyperplasla a nd in Prostatic Carcinoma in Humans,”Biol．Reprod.，vol.56，pp．67-72(1 997))。したがって細胞溶解ペプチドとＬＨまたはＬＨ分子の一部との結合体を 用いてこれらの細胞を選択的に破壊することが可能である。例として、ＦＳＨ、 ＴＲＨ、やＬＨといったホルモンをコードしている遺伝子が知られており、細胞 溶解ペプチドをコードしているＤＮＡ配列と連鎖させて分泌融合ペプチドを産生 することが可能である。これは全て適当なプロモーターによる制御の下で行われ る。適当なプロモーターの例としては、１９９５年６月７日出願の米国特許第０ ８／４７４，６７８号及び１９９５年１月１２日公開の国際特許出願第ＷＯ９５ ／０１０９５号に開示されるアキュートフェイズ反応プロモータがある。ホルモ ンから得られた結合部位をホルモン全体に代用することも可能である。例として 、ＬＨ及びｈＣＧのアミノ酸１５個の結合部位を使用することが可能である(参 照D.Morbeck et al.,”A Receptor Binding Site Identified in the Region 81 -95 of the β-Subunit of Human Luteinizing Hormone（LH）and chorionic go nadotropin (hCG),”Molecular and Cellular Endoucrinology，vol．97,pp.173 -181(1993))。 細胞を遺伝子治療に用いるために形質転換させるうえで適当な強力なベクター として米国特許第５，７１９，０５５号に開示されるトランスポゾンに基づいた ベクターがある。 ＧｎＲＨのＤ-アミノ酸型は、脳下垂体の性腺刺激細胞、脳のＧｎＲＨニュー ロン、及び様々な種類の癌細胞に結合することが知られている。細胞溶解ペプチ ドのＤ-アミノ酸型は、Ｌ-アミノ酸型とほぼ同様の細胞膜を溶解する性質を有す る。したがって、本発明の化合物（融合ペプチドとして投与されるか、または別 々に 投与される）はＬ型またはＤ型のいずれの型で投与してもよい。Ｄ型ペプチドは 、Ｌ型のものと比較して一般的に高価であるが、通常の酵索反応では分解されな いという利点を有するため、経口投与することが可能であり、より長い生物学的 半減期を有する。Ｄ型ペプチドの経口投与において、ペプチド／ホルモン融合産 物を適当な担体に結合させて腸での吸収を促してその効果を向上させることが可 能である。適当な担体の例としてはビタミンＢ₁₂があり、この場合、G．Russell -Jones et al.，“Synthisis of LHRH Antagonists Suitable for Oral Adminis tration via the Vitamin B₁₂ Uptake System,Bioconjugate Chem.，vol．6，pp ．34-42(1995)に記載のビタミンＢ₁₂結合技術にほぼ従って投与を行う。 ＧｎＲＨまたはＧｎＲｈ類似体（まとめてＧｎＲＨアゴニスト）を本発明にお いて用いることが可能である。ＧｎＲＨデカペプチドの６番目及び１０番目のア ミノ酸の置換によりＧｎＲＨそのものよりもＧｎＲＨＬレセプターに対する親和 性が大きい「スーパーアゴニスト」を作ることが可能である。「スーパーアゴニ スト」には、ゴセレリン、ロイプロリド、ブセレリン、ナファレリンなどが含ま れる(参照米国特許第５，４８８，０３６号)。 この理論に拘泥するものではないが、本発明に基づく不妊／長期避妊の機序は （この機序だけによるものではないが）次のようなものである。ＧｎＲＨが脳内 の神経内分泌ＧｎＲＨニューロン及び脳下垂体の性腺刺激細胞を活性化する。活 性化された細胞は細胞溶解ペプチドによる溶解を非常に受けやすくなる。ここで 細胞溶解ペプチドにより、活性化された細胞を選択的に破壊する(若しくは大き なダメージを与える)。脳下垂体の性腺刺激細胞が破壊され、脳からのＧｎＲＨ が不足すると、脳下垂体が卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または黄体形成ホルモン （ＬＨ）を分泌しなくなり、動物は一時的または永続的に不妊となる。 リガンドと溶解ペプチドとは別々に投与することが可能であるが、これらを１ つの分子に結合させることにより、リガンドにより活性化される細胞の付近にお ける溶解ペプチドの有効濃度が大幅に高くなるために好ましい。更に、溶解ペプ チドの有効濃度が高くなることにより細胞を活性化する必要が小さくなる。ペプ チドはリガンドの結合部位に結合しさえすればよく、標的細胞の活性化のために 通常必要とされるリガンドの「残りの部分」は必要ではない。この結合は、Ｇｎ ＲＨ／ペプチドまたはペプチド／ＧｎＲＨのいずれの順序であってもよく、例と して改変ＧｎＲＨ／ヘカテ（配列番号３）やヘカテ／改変ＧｎＲＨ（配列番号４ ）がある。中間連結体は必要ではなく、２つのペプチドの一方のカルボキシ末端 を他方のアミノ末端に直接結合させることが可能である（発明者等は、融合ペプ チドのＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ部分の元々のピログルタミン酸残基を、それぞれ のペプチドの活性を大きく変えることなく、グルタミンに置換することが可能で あることを見出した。参照配列番号９、３及び４)。 実験結果 例１−６ 雌ラット成体の脳下垂体を採取し、大きさのほぼ等しい６個の切片に分けた。 ３７℃の組織培養培地を入れた６個のウェルのそれぞれに１個づつ脳下垂体切片 を入れた。各ウェルには以下に示すような異なる処理を行った。処理１０時間後 に各ウェルの組織を固定し、顕微鏡にて組織学的に調べた。 処理１はコントロールとして培地のみを加えた。処理後の組織は正常であった 。 処理２は培地１ｍＬ当たり５ナノグラムのＧｎＲＨ（配列番号１）を加えた。 処理後の組織は組織学的に見て正常であったが、細胞の液胞化が若干見られた。 比較のための数値として、非処理の正常なラットにおけるＧｎＲＨの濃度は発情 周期のＬＨサージ期において１ng／ｍＬから２0ng／ｍＬにまで変化する。 処理３は、培地に溶解ペプチドであるヘカテ（配列番号２）を５０μＭとなる ように加えた。処理後の組織は組織学的に見て正常であった。 処理４は、始めに培地１ｍＬ当たりＧｎＲＨ５ngを含む培地中で１５分間培養 した。この培養の後でＧｎＲＨを含んだ培地を除去し、組織を素培地にて１回洗 った。この培地を除去し、溶解ペプチドであるヘカテを５０μＭ含んだ培地に置 き換えた。この処理により好塩基性（性腺刺激）細胞の破壊が広範に見られた。 処理５は、５０μＭの融合ペプチドである修飾ＧｎＲＨ／ヘカテ（配列番号３ ）を加えた。この処理により好塩基性（性腺刺激）細胞の破壊が広範に見られた 。 処理６は、始めに融合ペプチドであるＧｎＲＨ／ヘカテ（配列番号３）を加え 、２時間後に融合ペプチドＧｎＲＨ／ヘカテを２回目として加えた。この処理に より間質細胞のみを残して細胞はほぼ完全に破壊された。 例７ 同腹の性的に未成熟な雌ラット（生後３３日目）２頭にコントロール溶液とし て生理食塩水を２回に分けて２４時間の間隔をおいて静脈内注射した。これらの ラットが交配年齢に達した後、接種後１０５日間にわたって観察した。外部生殖 器の外観は正常であった。接種後１０７日目〜１２１日目の１４日間の監視期間 の間にコントロールラットはそれぞれ少なくとも２回の発情周期を完了した。こ の後ラットを殺して剖検した。生殖器は組織学的に正常であった。 例８ 例７のラットと同腹の２頭の性的に未成熟なラット（生後３３日目）に、生理 食塩水に溶かしたＧｎＲＨ／ヘカテ融合ペプチドを２４時間の間隔をおいて２回 にわけて５００μｇづつ注射した。これらのラットが交配年齢に達した後、接種 後１０５日間にわたって観察した。外部生殖器は小さめであった。コントロール ラットと異なり、膣内への綿棒の挿入は困難であった。接種後１０７日目〜１２ １日目の１４日間の監視期間の間、処理を行ったラットのいずれも発情あるいは 発情後期の状態を示さなかった。この後ラットを殺して剖検した。ペプチド処理 したラットでは、子宮上皮及び卵管上皮は薄く不活化していた。また卵巣には大 きな卵胞は見られず、多数の退縮卵胞（***に至らなかった卵胞）が見られた。 例９−１４ １８頭の性的に成熟した血統の異なる雌ラットを３頭づつの６つのグループに ランダムに分けた。各グループに後述するような２回の処理を静脈内注射にて行 った。処理後２週間にラットを殺して剖検した。生殖器及び内分泌器官を取り出 し、重量を測って組織学的に調べた。 処理９はコントロールとして生理食塩水を用いた。このグループのラットでは 卵巣の機能は正常であった(正常な卵胞、新らしい黄体)。このグループの脳下垂 体の大きさは正常であった。組織学的に正常な数の脳下垂体の好塩基性細胞が見 られた。 処理１０は、生理食塩水に溶かしたＧｎＲＨ／ヘカテ融合ペプチド１．０ｍｇ を２４時間の間隔をおいて０．５ｍｇづつ２回に分けて注射した。このグループ のラットでは正常な卵胞の発育に障害が見られた。黄体はほとんど見られず、ま た見られたものは古いものであった。卵胞は大きく、破れていなかった。子宮の 形態はホルモンの不活化と符合するものであった。このグループの脳下垂体は生 理食塩水のコントロールグループと比較して若干小さめであった。組織学的には 、コントロールと比較して脳下垂体の好塩基性細胞の数において６０〜７０％の 減少が見られた。 処理１１は、生理食塩水にＧｎＲＨ（１６２μｇ）を溶かして１．３５ｍＭと した溶液を１００μＬ注射し、１５分後に生理食塩水にヘカテ（３３７μｇ）を 溶かして１．３５ｍＭとした溶液を１０μＬ注射した。２４時間後に同様の２段 階処理を行った。このグループのラットの子宮には組織学的な変化が見られた。 黄体はほとんど見られず、また見られたものは古いものであった。卵胞は大きく 、破れていなかった。子宮の形態はホルモンの不活化と符合するものであった。 脳下垂体及び脳下垂体の組織学的所見は処理１０において見られたものと同様で あった。 処理１２は、生理食塩水にヘカテ（３３７μｇ）を溶かして１．３５ｍＭとし た溶液を１００μＬ注射した。２４時間後に再びこの処理を行った。このグルー プのラットでは、卵巣の機能は正常であった(正常な卵胞及び新しい黄体)。脳下 垂体及び脳下垂体の組織学的所見は処理９において見られたものと同様であった 。 処理１３は、生理食塩水にＧｎＲＨ（１６２μｇ）を溶かして１．３５ｍＭと した溶液を１００μＬ注射した。２４時間後に再びこの処理を行った。このグル ープのラットでは、卵巣の機能は正常であった(正常な卵胞及び新しい黄体)。脳 下垂体及び脳下垂体の組織学的所見は処理９において見られたものと同様であっ た。 処理１４は、ＧｎＲＨ／ヘカテ融合ペプチドをＨＰＬＣによって更に単離した 点を除いて処理１０と同様の処理を行った。このグループのラットでは正常な卵 胞の発育に障害が見られた。黄体はほとんど見られず、また見られたものは古い ものであった。卵胞は大きく、破れていなかった。子宮の形態はホルモンの不活 化と符合するものであった。脳下垂体及び脳下垂体の組織学的所見は処理１０に おいて見られたものと同様であった。 これらの実験により、ＧｎＲＨ及び溶解ペプチドは別々に投与することも、あ るいは融合ペプチドとして投与することも可能であることが示されたが、融合ペ プチドは小さい投与量でより大きな活性が得られるためにより好ましい。 最適投与量を求めるための実験は本発明の出願時においては行われていなかっ たが、当業者によれば、この明細書の教示により、一般的なテストを通じて最適 投与量を求めることは容易であろう。 現在までの実験は雌の動物に対して行われたものであるが、ＧｎＲＨは雌雄の いずれにおいても脳下垂体細胞にゴナドトロピンを放出させろため、雄の動物に おいても同様の結果が得られるものと考えられる。 細胞毒性結合体の組織特異性及び細胞特異性は、溶解ペプチドに結合させた各 種ホルモンまたはホルモン類似体を用いて向上させることが可能である。その例 を幾つか挙げる。受胎能の制御のためには、ＧｎＲＨ／ヘカテ結合体により、脳 下垂体及び生殖軸の中心ＧｎＲＨ神経要素に選択的にダメージを与える。ニワト リIIGnRH及びヤツメウナギIIIGnRHは多くの哺乳動物において脳の機能に影響を 与える主要な分子であるため、中枢神経系の細胞でこの処理によってダメージを 受けるものはほとんどないはずである。受胎能制御はまた、ｂＬＨ／ヘカテ結合 体で動物を処理することにより選択的に達成することが可能である。この化合物 は生殖及び性腺を制御するＧｎＲＨニューロンに対して選択的に作用する。前立 腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌の細胞を攻撃するためには、1-ＬＨＲＨ-III− ヘカテ結合体を用いることが可能であるが、これは1-ＬＨＲＨ-III−ヘカテ結合 体は癌細胞のレセプターに結合するが、脳には何ら影響を及ぼさないことによる (これらの結合体でヘカテの代りに他の溶解ペプチドを使用することが可能であ る)。 本発明の化合物は上述の形態で投与するか、あるいは薬学的に可能な塩類とし て投与することが可能である。化合物は静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与や経 口投与（特に、好ましくはビタミンＢ₁₂などの担体と錯体を形成させた、Ｄ-ア ミノ酸型とした場合）することが可能である。 本発明の用途としては、ヒトにおける長期避妊または不妊、及び、家畜や野生 の哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、硬骨魚類、軟骨魚類、無顎類、昆虫や軟体 動物などの無脊椎動物における長期避妊及び不妊が含まれる。本発明を適用する ことが可能な家畜の例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが ある。ヒトに用いられる場合には早発閉経などの望ましくない副作用を防止する うえで長期のホルモン補充療法が必要とされる場合もある。不妊処置を施した患 者にゴナドトロピンホルモンを投与することにより、必要に応じて一時的に受胎 能を回復することが可能である。この意味において本発明の不妊処置は可逆的で ある。 一例として、本発明を望ましくない外来種の個体群駆除に用いることが可能で ある。 ニワトリや七面鳥などの家禽に不妊処置を行うことで成長速度を大きくするこ とが可能である。鳥を不妊するために本発明を実施するうえでは鳥のＧｎＲＨま たは類似体を使用することが可能である。ニワトリＩＧｎＲＨ（配列番号１７） 及びニワトリII ＧｎＲＨ（配列番号１８）という２種類の鳥ＧｎＲＨの形態が ある。本発明ではいずれの形態の鳥ＧｎＲＨをも用いることが可能である。好ま しい一実施形態では、ニワトリＩＧｎＲＨは６番目のアミノ酸においてヘカテな どの溶解ペプチドに結合されて融合ペプチドを形成する。またはＧｎＲＨアゴニ ストやアンタゴニストを使用することが可能である。I.Mezo et al.,“Synthesi s of GnRH analogs having direct antitumor and low LH-releasing activity, ”Biomed．Peptjdes，Protejns & Nucleic Acjds，vol．2，pp．33-40(1996)に 基づき一連のアゴニスト及びアンタゴニストが合成されている。 農作物や他の植物にとっての害虫である昆虫に対して処理を行う場合、昆虫に 食べられる植物の組織内ではペプチドを発現させ、食用の組織内ではペプチドを 発現させないようなプロモーターによる制御の下で、植物のゲノムにペプチド／ リガンドの組み合わせをコードした遺伝子を組み込むことが望ましい。例として 、ジャガイモで、植物の葉では活性を有するが塊茎では不活性なプロモーターを 使用することが可能である。植物組織における発現は構成性であるか、あるいは 、植物の天然の防御機構を誘導するような刺激によって誘導されることが可能で ある。これは例えば植物体内において防御機構を誘導する刺激によって誘導され る 天然プロモーターの制御下にペプチドの遺伝子を置くことによって行われる。 (参照米国特許第０８／２７９，４７２号、１９９４年７月２２日出願)。 魚類や軟体動物などの水性動物の不妊処置を行う場合には、本発明の化合物は 単に水中に投与することが可能であり、動物の成体、幼体、または幼生の段階で 吸収される。好ましくは、ペプチドはリポソームにカプセル化され、稚貝、稚魚 、幼体、または成体において動物に与えられる。リポソームは動物に摂取される とペプチドを動物の血液循環内に放出し、不妊にさせる。また、ペプチドを充分 な大きさに成長した動物に注射することも可能である。 例として、本発明の化合物をイガイなどの好ましくない外来軟体動物を不妊に させるために用いることが可能である。養殖される動物の不妊処置が望ましい場 合もある。例として、カキを不妊にさせることにより夏季に性腺が成熟すること が防止され、市場価値が上がる。 例１５−２２ ８頭の性的に成熟したSprague-Dawley系の雌ラットに８つの異なる処理をラン ダムに割り当てて行った。各グループのラットに以下に示すような単一の処理を 行った。処理４８時間後または９６時間後にラットを殺して剖検した。卵巣、子 宮、膵臓、肝臓、脾臓、肺、心臓、甲状腺、及び副腎を１０％の緩衝ホルマリン で固定し、切片化してＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色法にて染色し た。ただし脳下垂体は対比染色を行わずにＰＡＳ（過ヨウ素酸シッフ染色）染色 法にて染色した。各動物に等モル量の処理化合物が与えられるよう処理を選択し た。 処理１５及び１６は、２００μｌの生理食塩水に溶かしたＤ-ヘカテ６７４μ ｇ（１．３５ｍＭ）を静脈内注射した。処理１５のラットは注射４８時間後に殺 し、処理１６のラットは注射９６時間後に殺した。いずれの動物の臓器において も肉眼的病変は認められなかった。いずれのラットの脳下垂体もＰＡＳ陽性細胞 の数は正常であった。 処理１７及び１８は、２００μｌの生理食塩水に溶かしたＧｎＲＨ３３４μｇ （１．３５ｍＭ）を静脈内注射した。処理１７のラットは注射４８時間後に殺し 、処理１８のラットは注射９６時間後に殺した。いずれの動物の臓器においても 肉眼的病変は認められなかった。いずれのラットの脳下垂体もＰＡＳ陽性細胞の 数は正常であった。 処理１９−２２は、１００μｌの生理食塩水に溶かしたＧｎＲＨ−ヘカテ融合 ペプチド（配列番号３）１ｍｇ（２．７ｍＭ）を静脈注射した。処理１９及び２ ０のラットは注射４８時間後に殺し、処理２１及び２２のラットは注射９６時間 後に殺した。４頭の動物のいずれの臓器にも脳下垂体を除いて肉眼的病変は認め られなかった。処理１９及び２０の動物の脳下垂体には若干の肥大、充血、浮腫 が認められた。処理２１及び２２の動物の脳下垂体には若干の充血が認められた ものの大きさは正常であった。４頭のラット全ての脳下垂体でＰＡＳ陽性細胞が 顕著に不足していた。この不足はコントロールグループのＰＡＳ陽性細胞の数の ８０〜９０％であると算定された(ＰＡＳ染色法は糖ペプチドを選択的に染色す る。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＭＳＨは糖ペプチドホルモンであり、分泌液胞にこ れらのホルモンが蓄えられた細胞はＰＡＳに染まる)。 すなわち、ＧｎＲＨ−溶解ペプチドの組み合わせにより、ラットの雌成体の生 殖システムに形態的かつ機能的変化が引き起こされ、思春期前の雌ラットの性的 成熟の防止機能に変化が引き起こされること、融合ペプチドは脳下垂体のＰＡＳ 陽性細胞の特定の集団を選択的に除去していることが理解される。 例２３ ヘカテは細胞内に取り込まれることなく細胞膜に対して作用する両親媒性の細 胞溶解ペプチドである。ヘカテはミツバチ毒の主要な毒素であるメリチンの合成 ペプチド類似体である。ヘカテは細胞膜を破壊することで作用すると考えられて いる。この研究で用いられる改変ＧｎＲＨ−ヘカテ結合体の構造は配列番号３で 示される。 発明者等はまた、ＧｎＲＨドメインのＧｎＲＨレセプターへの結合に対する干 渉が最小となる位置であるＤ-Lys⁶にヘカテが結合されるように、D-Lys⁶GnRH（ 配列番号１３）を合成した。これらの合成ペプチドはラットの脳下垂体細胞膜か ら放射性同位体標識モノイオドＧｎＲＨを特異的に置換した。放射能のｃｐｍの 測定によって示されるように、D-Lys⁶GnRH−ヘカテによる置換は天然哺乳類Ｇｎ ＲＨによる置換と同等であった（実際は若干それよりも大きかった）。ＧｎＲＨ の結合とＧｎＲＨ−ヘカテの結合とを１０００倍の濃度範囲（ｎ−６）において モル数で比較した場合、ＧｎＲＨ−ヘカテは、モル濃度の等しいＧｎＲＨによる 結合の１２３％±４％に等しい程度で放射性同位体標識されたペプチドを特異的 に置換した。モル濃度の等しいD-Lys⁶GnRHは天然ＧｎＲＨによって置換されたｃ ｐｍの１８７％±８％を置換した。 例２４−３１ 発明者等は、ＧｎＲＨ−ヘカテ結合体、及びヘカテ−ｂＬＨ結合体（配列番号 １２）によるウシ黄体細胞のin vitro溶解を調べた(結合体のｂＬＨ部分（配列 番号１１）は黄体ホルモンのβ鎖の１５量体断片である。)。屠殺後のウシの黄 体から小黄体細胞を採取した。小黄体細胞はＬＨレセプターを豊富に有し、ヘカ テ−ｂＬＨ結合体による溶解を非常に受けやすいことが知られている。 小黄体細胞に以下の処理の一つを行って２２時間培養し、トリパンブルー色素 排除試験及び乳酸デヒドロゲナーゼの放出により生存度について調べた。 処理２４はコントロールとし、何らの処理も行わなかった(培地のみ)。 処理２５ １０ng ｂＬＨ （正のコントロール） 処理２６ ヘカテ−ｂＬＨ、１０μＭ 処理２７ ヘカテ−ｂＬＨ、５μＭ 処理２８ ヘカテ−ｂＬＨ、１μＭ 処理２９ ヘカテ（単独）、１０μＭ 処理３０ ヘカテ（単独）、５μＭ 処理３１ ヘカテ（単独）、１μＭ １０μＭのヘカテ単独、及び５μＭのヘカテ単独で２２時間培養した場合、顕 著な小黄体細胞の死が認められた(約５０％の死)。１μＭのヘカテ単独の場合の 細胞死は、負のコントロール（培地のみ）またはｂＬＨ単独の場合と比較して有 意の差は認められなかった。ヘカテ−ｂＬＨを投与した３つの処理の全てにおい て、ヘカテ単独の処理と比較して細胞死に有意の増加が認められた。ヘカテ−ｂ ＬＨ結合体により、同じ濃度のヘカテ単独の場合の約２倍の細胞数が死んだ。 乳酸デヒドロゲナーゼの活性レベルによってもヘカテ−ｂＬＨ処理がヘカテ単 独の処理と比較して大幅に多くの細胞を殺したことが示された。 例３２−３３ 発明者等は更に、ＧｎＲＨ−ヘカテ結合体及びヘカテ−ｂＬＨ結合体によるウ シ顆粒膜細胞のin vitroの細胞溶解を調べた。顆粒膜細胞はウシの***前の卵胞 から単離した(顆粒膜細胞は多くのＬＨレセプターを有する、ホルモンに対して 活性な細胞である)。顆粒膜細胞を用いた実験の他の点は例２４＝３１について 上述した実験と基本的に同様である。これらの実験により、（１）顆粒膜細胞は 小黄体細胞と比較してヘカテ単独の処理によって非常に死にやすいこと、（２） 小黄体細胞の場合と同様、顆粒膜細胞は最も低い濃度（１μＭ）においても、ヘ カテ単独よりヘカテ−ｂＬＨによって遥かに死にやすいことが示された。１μＭ ではヘカテ−ｂＬＨ結合体はヘカテ単独の場合と比較して約２倍の数の標的細胞 を殺した。ここでもやはり１μＭのンヘカテ−ｂＬＨによる処理後に放出された 乳酸デヒドロケナーゼのレベルは、１μＭのへカテ単独による処理の後に放出さ れた同酵素のレベルよりも大幅に高かった。 更なる研究により(データは示していない)、ｂＬＨサブユニットの１５量体断 片は標的顆粒膜細胞のＬＨレセプターに特異的に結合したが、刺激に対する応答 が起きていることを示すステロイドホルモンの産生は引き起こさないことが示さ れた。したがって発明者等により、溶解ペプチドが標的細胞の物理的近傍に存在 することによって選択的な細胞の死がもたらされるが、これはＬＨサブユニット の結合によるものであることが示された。標的細胞のホルモン産生の刺激は細胞 溶解に必要ではなかった。標的細胞が細胞溶解を受けやすくするためには標的細 胞の活性化が必要であると以前には考えられていたため、この結果は意外なもの であった。これらのデータはこうした活性化が必要でないことを示すものである 。しかし、これらのデータは、細胞の活性化も細胞を溶解ペプチドの作用を受け やすくするための一つの径路であることを示す発明者等の他のデータに符合する ものである。 例３４−３７ ＧｎＲＨ−ヘカテ結合体の雌ラット及びウサギに対するin vivoでの影響を調 べるため更なる実験を行った。卵巣、子宮、卵管、副腎、脾臓、甲状腺、膵臓、 肝臓、肺、及び心臓に対して組織学的分析を行った。甲状腺では、ＰＡＳ染色法 にて染色した細胞、及び、ｂＬＨ、ＢＦＳＨ(ウシ卵胞刺激ホルモン)、副腎皮質 刺激ホルモン、他のプロオピオメラノコルチンペプチド産物(最も有名なものと してはα-メラニン細胞刺激ホルモン)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、プロラク チン(ＰＲＬ)、バソプレッシン(ＶＰ)、オキシトシン(ＯＸＹ)、や成長ホルモン (ＧＨ)について免疫細胞学的に染色した細胞について組織学的な分析を行った。 ここで 用いた免疫細胞学的染色法は、M．Rahmanian et al.，“Histological and immu nocytochemical characterization of pituitary cell types in ponies,”Proc ．13^thSoc．Equine Nutrition & Phys．Symp.，pp．348-349(1993);M.Rahmanian et al.，“Immunocytochemical localization of luteinizig hormone and follicle-stimulating hormone in the equine pituitary,”J Animal Sci.，vo l．76,839-846(1998);M.Rahmanian et al.，“Immunocytochemical localizatio n of prolactin and growth hormone in the equine pituitary,”Animal．Sei. ，vol．75,pp．3010-3018(1997);P．Melrose et al.，“Comparative topograp hy of the immunoreactive alpha-melanocyte-stimulating hormone neuronal s ystem in the brains of horses and rats,”Brain Beh.& Evol.，vol．32，pp. 226-235(1988)に基づく方法に基本的に従っている。 脳はブロカ対角帯から乳頭体に至るレベルまでビブロトーム上で連続切片にし た。一つおきの切片を４〜５個のシャーレに連続的に分けて入れ、一つおきのシ ャーレの切片をクレシルバイオレットで染色するか、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ前 駆体、ＶＰ、ＯＸＹ、またはチロシンヒドロキシラーゼ（カテコールアミン合成 における律速酵素）については免疫細胞学的に染色した。上述の染色法に加え、 発明者等は、 P．Melrose et al.,“Distribution and morphology of immunor eactive gonadotropin-releasing hormone（GnRH）neurons in the basal foreb rain of ponies,”J．Comp.Neurol.，vol.339，pp．269-287(1994);P.Melrose e t al.，“Topography of oxytosin and vasopressin neurons in the forebrain of Equus caballus:Further support of proposed evolutionary relationship s for proopiomelanocortin，oxytocin and vasopressin neurons,”Baain.Beh. & Evol.，vol．33．pp．193-204(1989)に記載の免疫細胞学的染色法も用いた。 生後３３日目の性的に未成熟なラットに以下を静脈内投与した。 処理３４ ０．０３μｇＧｎＲＨ（生理学的な通常量）（ラット２頭） 処理３５ １．６２μｇＧｎＲＨ （処理３６のＧｎＲＨと等モル量）（ラッ ト１頭） 処理３６ ０．５ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ （ラット１頭） 処理３７ ０.０３μｇＧｎＲＨの投与の１１分後に０.３３７μｇヘカテ（ラ ット２頭） 処理１４日後に動物を殺した。２頭のＧｎＲＨコントロールグループと比較し て、ＧｎＲＨ−ヘカテによる処理、及びＧｎＲＨの後にヘカテ単独を投与した処 理により、脳下垂体の重量においてそれぞれ１３％及び１４％の減少が見られ、 ｂＬＨ-特異的性腺刺激細胞の数においてそれぞれ９２％及び８７％の減少が見 られた。更にこれら２つの処理の後、脳の下垂体刺激性領域におけるＧｎＲＨ染 色されたニューロンの細胞体ではしばしば変形が見られ、かなりの量の免疫反応 性物質が多くの細胞体が密集する周辺領域（終板の血管板器官）に漉し出された 。２つの処理により海馬のＣ１及びＣ３領域において細胞に組織学的な損傷が認 められ、室傍核の小細胞性ＶＰニュ一ロンは著明に染色された(ＶＰ染色は脳内 の特定の領域における沈殿物の生成によるものであった可能性がある。後に行っ たより精製度の高いペプチドを用いた研究では沈殿は生じなかった)。恐らくは 副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンにおける変化に基づく、ＶＰ発現の変化によ り、下垂体末端部におけるプロオピオメラノコルチンペプチド産物の翻訳後プロ セシングがシフトするが、これは、ＧｎＲＨヘカテ処理及びＧｎＲＨ＋ヘカテ処 理により、副腎皮質刺激ホルモンレベルが減少し、この脳下垂体切片におけるα ‐ＭＳＨ染色細胞の数が増加したためである。他の組織においては病理学的な変 化は認められなかった。 脳のニューロンは再生しないため、これらのニューロンへの大きなダメージは ＧｎＲＨ／溶解ペプチドの組み合わせによる不妊を永続的なものとする可能性が ある(しかし性腺刺激ホルモンの投与により一時的に逆転させることが可能であ る)。 例３８−４２ 性的に未成熟（生後３３日目）の雌ラット（３頭づつのグループにランダムに 分けたもの）に生理食塩水または生理食塩水に溶かしたＧｎＲＨ−ヘカテを以下 の要領で投与した。 処理３８ ０．０ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ 処理３９ ０．１ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ 処理４０ ０．５ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ 処理４１ １．０ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ 処理４２ １．５ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ 処理２４時間後または１４日後に動物を殺した。結果は、脳内に沈殿物が見ら れず、中枢神経系におけるＶＰ染色が変化しなかった点を除いて例３４−３７に ついての上述の結果と同様であった。高レベルのＧｎＲＨ−ヘカテを投与した処 理では、細胞の細胞体部分の変形や軸索の退化など、形態に異常をきたしたＧｎ ＲＨレセプター保有ニューロンを多数生じた。処理１４日後に殺したラットでは 、１．０ｍｇ及び１．５ｍｇのＧｎＲＨ−ヘカテを投与したラットのＧｎＲＨ保 有ニューロンのそれぞれ６６％及び８７％に異常が見られた。１．５ｍｇのＧｎ ＲＨ−ヘカテを投与したグループにおける軸索の退化はＧｎＲＨに対する正中隆 起の染色の９０％以上の減少を伴った。 例４３−４５ ７頭の性的に成熟したニュージーランド種のウサギに以下に示すようなＧｎＲ Ｈ−ヘカテを含む生理食塩水を静脈内注射した。 処理４３ ０ｍｇ ＧｎＲＨ−ヘカテ （ｎ＝３） 処理４４ ５ｍｇ ＧｎＲＨ−ヘカテ （ｎ−３） 処理４５ １０ｍｇ ＧｎＲＨ−ヘカテ （ｎ＝１） ４６日後に全てのウサギにＧｎＲＨ１００μｇを筋肉内注射した。０、１、４ 、及び２４時間後に血液サンプルを採取し、ラジオイムノアッセイによってサン プル中のＬＨ及びＦＳＨレベルを測定した。ホルモン分析によりコントロール及 び各処理を行った動物のいずれにおいてもＧｎＲＨに対してＬＨが放出されるこ とが示された。このことは、少なくともリガンド／ペプチドが低投与量である場 合の脳下垂体の性腺刺激細胞では、処理に対してある程度の可逆性があることを 示している。組織学的分析を行うために翌日ウサギを殺した。発明者等は、３次 卵胞、黄体、及びＧｎＲＨ誘導***の数はＧｎＲＨ−ヘカテ処理によって減少す ることを見出した。１０ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテ処理により卵巣及び脳下垂体の重 さは減少した。ＧｎＲＨ−ヘカテ処理を行ったものから得られた組織では、免疫 反応性ＧｎＲＨは微量であり、かつ通常細胞体を有するＣＮＳ領域において拡散 可能に局在化していた。正常な細胞体の数は少なくとも５０％減少し、ＧｎＲＨ レセプターニューロンの軸索が通常見られる末端領域はＧｎＲＨについて染色さ れなかった。これらの観察は、一連の実験におけるウサギに対するＧｎＲＨ−ヘ カテ処理の最も著明な効果は脳の神経内分泌ニューロンに対するものである可能 性を示唆するものである。高い濃度のＧｎＲＨを含む脳の海馬及び他の領域では ＧｎＲＨ−ヘカテ処理による顕著な影響は見られなかった。ＧｎＲＨ−ヘカテ処 理により下垂体末端部におけるＰＡＳ染色された脳下垂体細胞の数はコントロー ルウサギの場合の１７７％に増大した。この増大はα−ＭＳＨ染色細胞数の増加 及びＬＨ染色細胞数の減少を反映したもののようである。 例４６−４７ ９頭の性的に成熟したウサギに、ＧｎＲＨ−ヘカテを、０ｍｇ（ｎ−４）(処 理４６)、または１０ｍｇ（ｎ＝５）(処理４７)含む生理食塩水を静脈内注射し た。処理６日後にＧｎＲＨを筋肉内注射した。上述の例と同様、血液サンプルを 採取してＬＨ及びＦＳＨについてラジオイムノアッセイを行い、処理７日後にウ サギを殺した。コントロール及び処理動物のいずれにおいてもＧｎＲＨに対する ＬＨの放出が見られたが、ＬＨの放出量はコントロールよりも処理動物の方が低 かった。ＧｎＲＨ−ヘカテ処理により３次卵胞の数及びＧｎＲＨ誘導***の数は 減少した。周辺組織及び脳下垂体重量のいずれにも影響は見られなかった。中枢 神経系の形態及び免疫細胞化学的結果に対するＧｎＲＨ−ヘカテの効果は上述の 例３４−４５において述べたものと同様であった。ここでもやはり脳下垂体の性 腺刺激細胞の染色よりもＧｎＲＨニューロンにおいて効果はより顕著であった。 例４６及び４７の１０ｍｇＧｎＲＨ−ヘカテで処理したウサギでは、生理食塩 水のコントロールと比較して***部位の数は減少した。４頭の生理食塩水コント ロールの***部位数の平均は１２．２±５．４（Ｓ．Ｅ．Ｍ．＝２．７）であっ た。１０ｍｇのＧｎＲＨ−ヘカテを与えた５頭のウサギの***部位数の平均は３ ．６±１．１（Ｓ．Ｅ．Ｍ．＝０．５）であった。コントロールとの差は有意で あった（ｐ＝０．０２５）。 「ＬＨサージ」（ＧｎＲＨ投与１時間後のＬＨのレベルから投与前のレベルを 引いたもの）は４頭のコントロールでは６１．２±１６．５ｎｇ／ｍＬ（Ｓ．Ｅ ．Ｍ．＝８．３）であり、処理グループでは４９．６±２６．１ｎｇ／ｍＬ（Ｓ ．Ｅ．Ｍ．＝１２）（ｐ＝０．２２）であった。したがって処理グループではＬ Ｈレベルは低下する傾向にある。 以上のｉｎ ｖｉｖｏの研究によりＧｎＲＨ−ヘカテ結合体が脳のＧｎＲＨレ セプター保有細胞（ニューロン）及び脳下垂体のＧｎＲＨレセプター保有細胞（ 性腺刺激細胞）に選択的にダメージを与えることが明らかに示された。更に、こ れらの研究により、恐らくは脳−脳下垂体軸の生殖中枢における変化に基づくも のと考えられる、卵巣における顕著な変化が示された。また次に列挙する観察か ら結合体の選択性が示された。すなわち、（１）ＧｎＲＨレセプターを有さない ニューロンでは細胞毒性による変化は認められなかった点、（２）ＧｎＲＨレセ プターを有さない脳下垂体細胞では何らの変化も認められなかった点、（３）他 の内分泌及び非内分泌組織では何らの変化も認められなかった(脳下垂体の性腺 刺激細胞の破壊に対して間接的に応答したものと考えられる卵巣を除く)点であ る。 ＧｎＲＨ−ヘカテ処理したウサギにおいて「***」と呼ばれる現象の多くは機 能的な***部位ではなく、出血性の前***退行変化を表す場合もある。機能性卵 の***が防止されることを確認するためには更なる繁殖試験が行われる。 例４８−５１ 以下の例は、ＧｎＲＨと溶解ペプチドとの組み合わせが昆虫の受胎能を低減さ せる能力を示すものである。溶解ペプチド単独で使用された場合（ＧｎＲＨなし の投与）でも同様の効果を奏することが予期せずして発見された。昆虫は哺乳動 物において見られるＧｎＲＨと同じものを分泌するとは考えられていないが、昆 虫は哺乳動物由来のＧｎＲＨ及び細胞溶解ペプチドであるヘカテに結合されたＧ ｎＲＨに対して反応し、この点において両者には相同性がある。 成長段階後期のDiatraea saccharalis（サトウキビの害虫である蛾の一種）蛹 に、上述の要領で濃度１．３５ｍＭのペプチドを含む生理食塩水１．０μＬ、ま たは生理食塩水単独を接種し、蛹に変態を完了させた。変態を終えた昆虫で形態 に異常をきたしたものはなかった。雌の蛾の成虫を処理を行った雄と交配させ、 産卵させた。幼虫に孵化した卵の数を計数して卵の生存率を算出した。 処理４８はコントロールであり、２１体の蛹に生理食塩水のみを接種した。 この内１２体が変態を完了して成虫となった(雄４匹、雌８匹)。この８匹の雌は 、１匹当たり平均で約１１２個、全体で約９００個の卵を産卵した。卵の内、約 ２２％、雌１匹当たり約２５個の卵が幼虫にリ孵化した。 処理４９では、１０体の蛹に１．３５ｍＭのＧｎＲＨ−ヘカテを接種した。 この内４体が変態を完了して成虫となった（雄２匹、雌２匹）。この２匹の雌は 、１匹当たり平均で約１５０個、全体で約３００個の卵を産卵した。卵の内、約 ４０％、雌１匹当たり約６０個の卵が幼虫に孵化した。 処理５０では、１０体の蛹に１．３５ｍＭのＧｎＲＨ−ヘカテ（配列番号３） を接種した。この内８体が変態を完了して成虫となった(雄３匹、雌５匹)。この ５匹の雌は、１匹当たり平均で４０個、全体で約２００個の卵を産卵した。卵の 内、約４０％、雌１匹当たり１６個の卵が幼虫に孵化した。 処理５１は、１０体の輔にＤ−ヘカテを接種した。この内６体が変態を完了して 成虫となった（雄２匹、雌４匹）。この４匹の雌は、１匹当たり平均で４．５個 、全体で１８個の卵を産卵した。卵の１００％、雌１匹当たり４．５個の卵が幼 虫に孵化した。 コントロールと比較した場合、蛹の後期においてＧｎＲＨ単独による処理を行 った雌では、生殖率が向上した。ＧｎＲＨ−ヘカテによる処理を行ったものでは 生殖率は低下し、Ｄ−ヘカテ単独による処理を行ったものでは生殖率の更なる低 下を見た。 この仮説に束縛されるものではないが、以上の結果は次のように説明される。 すなわち、異なる分類群にまたがった配列の相同性（現時点では特定されていな いが）により、哺乳動物の生殖の制御において活性を有すろ小ペプチドは昆虫の 生殖機能に対しても影響を与えるものと考えられる(参照W．Theunis et al.,“L utenising Hormone，Follicle Stimulating Hormone and Gonadotropin Releasi ng Hormone Immunoreactivity in Two Insects:Locusta migratoria migratoroj des R & F and Sarcophaga bullata(Parker),”hwert．Reprod．and Develop.， vol．16，pp．111-117(1989);P．Verhaert et al.，“Substances Resembling P eptides of the Vertebrate Gonadotropin System Occur in the Central Nervo us System of Periplaneta americana L.，”Insect．Biochem.，vol.16,pp.191 -197(1986))。 この活性は、これらのペプチドがリガンド−レセプター相互作用によって適当 な介在細胞と反応し、介在細胞の機能活性を変化させるというペプチドの内在的 な能力によって媒介されるものと考えられる。より具体的には、昆虫は哺乳動物 由来のＧｎＲＨに反応するレセプターを有する。ＧｎＲＨはそれのみで昆虫の生 殖活性を刺激する。細胞溶解ペプチドに結合させられたＧｎＲＨは昆虫の介在細 胞を攻撃し、生殖活性を阻害する。 ＧｎＲＨなしでＤ−ヘカテを投与した場合の結果は予想外のものであり、幾分 異なった説明が与えられるが、やはりこの仮説に束縛されるものではない。変態 期には細胞の活性は高まっているが、通常、溶解ペプチドは活性細胞に対してよ り高い活性を有する。ヘカテ単独の場合に見られた応答は活性化細胞による一般 化された応答であって、レセプターによって媒介される特異的な応答ではないも のと考えられる。Ｄ型のペプチドの生物学的半減期はより長いため、この実験に おいてヘカテのＤ型が用いられていることが重要であるのかもしれない。同様の 結果がＬ−ヘカテ単独の場合でも見られるかどうかは現時点では不明である(研 究者が以前に合成したものを容易に利用できたという単純な理由から処理２６に おいてＤ−ヘカテが用いられた)。 悪性及び良性腫瘍の治療 本発明の組成物は、ＧｎＲＨ、ＬＨ、ｈＣＧ、1-ＬＨＲＨ-IIIやステロイドに 対するレセプターを発現している悪性及び良性腫瘍を殺す、あるいはその成長を 阻害するうえで有用である。このリガンドを細胞溶解ペプチドと共に投与するこ とにより(前後して投与するか、互いに結合させたものを投与する)、標的細胞は 死ぬか、阻害される。 ホルモンまたはリガンドが関与した癌（例、卵巣癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、 子宮内膜腫、脳下垂体癌、前立腺癌）の治療においては、腫瘍がそれに対するレ セプターあるいはレセプター群を発現しているホルモンに溶解ペプチドを結合さ せる。こうしたホルモンの例としては、エストロゲン、テストステロン、ＬＨ、 ＦＳＨ、エストラジオール−１７β、トランスフォーミング増殖因子α(ＴＧＦ α)、上皮増殖囚子(ＥＧＦ)、ＧｎＲＨ、ＬＨ、ｈＣＧ、ヤツメウナギIII ＬＨ ＲＨ（1-ＬＨＲＨ-III)、およびメラニン細胞刺激ホルモンなどがある。例とし て、溶解ペプチドのカルボキシル末端をエストラジオールやテストステロンなど のステロイドの１７位の炭素の水酸基と縮合させることで溶解ペプチドをステロ イドに対してエステル結合させることが容易に可能である。エストラジオール／ 溶解ペプチドの組合わせは乳癌や卵巣癌の治療に用いることが可能であり、テス トステロン／溶解ペプチドの組合わせは前立腺癌の治療に用いることが可能であ る。更に、ペプチドホルモンであるＬＨやＦＳＨの特異的な結合ドメインを溶解 ペプチドとの融合ペプチドにおいて用いることにより、これらのホルモンに対す る細胞表面レセプターによって融合ペプチドを標的腫瘍細胞に選択的に結合させ ることが可能である。例として、ＬＨ及びｈＣＧのβサブユニットのレセプター 結合部位を用いることが可能である（配列番号１１）(参照Morbeck et al.,Mol. and Cell.Endocrin.,vol.97,pp.173-186(1993))。 脳下垂体腫瘍 脳下垂体前葉は、成長、生殖、乳汁分泌、甲状腺機能や副腎機能の複雑なプロ セスを制御する異なるタイプの上皮細胞を有する。脳下垂体細胞はその高い可塑 性（刺激に応じて異なる細胞表現型に分化する能力）のために、特に異常な行動 をとりやすい。脳下垂体が応答する信号の多くはレセプターを介したものである ため、リガンド−レセプター相互作用を適当に選択することによって病理学的な 状態の制御が可能である。以下に幾つか例を示す。 プロラクチノーマ及び他の腺腫のドーパミンレセプター 慢性的なドーパミン欠乏にはある種の脳下垂体腫瘍が関与している。ある種の 腺腫ではドーパミン結合部位の数は約５０％も減少し、ドーパミン作動性治療の 間においてはこの数は更に減少しうる。神経成長因子がプロラクチノーマ細胞を 刺激することによりドーパミンレセプターが再発現することが報告されている。 ドーパミン／溶解ペプチドの組合わせによる処理の前に神経成長因子でプロラク チノーマを前処理することにより、本発明に基づく処理に対してプロラクチノー マが感受性を有するようにすることが可能である。溶解ペプチドは、例えばペプ チドのカルボキシ末端をドーパミンのアミノ末端と縮合させてアミド基を形成す ることによりドーパミンに結合させろことが可能である。 この療法はプロラクチノーマばかりでなく、成長ホルモン分泌腺腫、甲状腺刺 激ホルモン放出ホルモン分泌腺腫やゴナドトロピン分泌腺腫などのドーパミンレ セプターを発現している他の腺腫に対しても有効である。 成長ホルモン分泌腺腫のソマトスタチンレセプター 成長ホルモン（ＧＨ）分泌腺腫のソマトスタチンレセプターの数は非常に変化 しやすいことが報告されている(異なる腫瘍間において少なくとも１０倍の変化 が見られる)。結合部位の分布においても大きな変異が見られる。ソマトスタチ ンレセプターは一様に分布するか、腫瘍組織の特定部分に固まって存在するか、 あるいはこれらの中間の状態で分布する。 ソマトスタチンレセプターは他のタイプの脳下垂体腫瘍にも見られる。ＧＨ分 泌腺腫及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＨＲ）分泌腺腫の大半の細胞表 面ではソマトスタチンレセプターの数が増加していることが報告されている。 こうした腫瘍は本発明のソマトスタチン／ペプチドの組合わせによって治療す ることが可能である。 他の脳下垂体腺腫 他の脳下垂体腺腫を治療するためにリガンド／溶解ペプチドの組合わせにおい て用いることが可能な他のリガンドとしては、ＴＲＨ、ＭＳＨ、ＧｎＲＨ、副腎 皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、血管作用性腸ペプ チド、及び脳下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチドが含まれる。ＭＳＨ の代りに使用することが可能なαＭＳＨの短鎖類似体として、Ser-Tyr-Cys-Met- Glu-His-Phe-Arg-Trp-Asn-Lys-Pro-Val-NH₂（配列番号１０）がある。 他の内分泌関連疾患 他の用途としては、内分泌関連の疾患一般を治療するために本発明のリガンド ／溶解ペプチドの組合わせを使用することが可能である。疾患が特定のホルモン レセプターを有する細胞の機能不全に関係している場合、ホルモンと溶解ペプチ ドとの組み合わせを投与することによりこれらのレセプターを選択的に不活化す ることが可能である。 別のアプローチにおいて、乳癌及び前立腺癌の患者においてＬＨ及びＦＳＨの レベルを低減させることが有効であることがこれまでに知られている。脳下垂体 の性腺刺激細胞がＧｎＲＨ／溶解ペプチドの組合わせによって選択的に殺される と、脳下垂体はＬＨ及びＦＳＨを分泌しなくなる。これらのホルモンのレベルの 低下は癌の拡大の防止を助ける。この別の間接的なアプローチは、ＬＨ／溶解ペ プチドまたはＦＳＨ／溶解ペプチドの組合わせによって直接癌を治療する代りに 、あるいはこれに併せて用いることが可能である。ＧｎＲＨの長期投与はＧｎＲ Ｈレセプターのダウンレギュレーションに以前から用いられてきたが、これによ り血液循環から効果的にＬＨが除去され、前立腺癌患者の「化学的去勢」が行わ れる。しかし、ＧｎＲＨ及びある種のＧｎＲＨ類似体は前立腺細胞の増殖に直接 的な影響も及ぼす。 これと対比して、脳下垂体前葉の外科的な除去が性ホルモン関連疾患の治療に 有効であることがよく知られている。したがって本発明による脳下垂体の性腺刺 激細胞の化学的な破壊は性ホルモン関連疾患に対して同様の効果をもたらすが、 術者のリスクや手術の合併症を伴わない。 例５２−５８ 以下の実験では、ヒト前立腺癌細胞系のin vitroの細胞溶解を行った。ヒト前 立腺癌細胞系ＬＮＣａＰ ＦＧＣ及びＤＵ１４５をアメリカンタイプカルチャー コレクション（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）から購入した。ＡＴＣＣ 承認番号はそれぞれＣＲＬ１７４０及びＨＴＢ-８１である。ＬＮＣａＰ ＦＧＣ 腺癌細胞系は元々５０才の白人男性から得られたものである。ＬＮＣａＰ ＦＧ Ｃ細胞はジヒドロテストステロン及びエストロゲンに対して感受性を有する(Ａ ＋)。ＤＵ１４５癌は元々、前立腺に転移性癌を有する６９才の白人男性の脳か ら単離されたものである。この細胞系はステロイドホルモンに対する感受性を有 さない(Ａ−)。 細胞を培養フラスコから外し、２４ウェル培養プレートに１０００細胞／ウェ ルとなるように移した。細胞を１０％ウシ血清で２４時間培養した。この後細胞 を血清なしで４８時間培養した。更に細胞を以下の処理のいずれか一つで２２時 間培養した。 処理５２ １０μＬ黄体化ホルモン（ＬＨ） 処理５３ ３０μＬ遊離ヘカテ 処理５４ ９０μＬヘカテ−ｂＬＨ 処理５５ ６０μＬヘカテ−ｂＬＨ 処理５６ ５０μＬ ＧｎＲＨ−ヘカテ 処理５７ １０μＬ ＧｎＲＨ−ヘカテ 処理５８ ＦＳＨ前処理の後、９０μＬヘカテ−ｂＬＨ トリパンブルー色素排除法を用いて処理後の細胞の生存度を評価した。Ａ＋及 びＡ−癌細胞系の両方を最も効率よく殺した処理は高投与量（５０μＬ）のＧｎ ＲＨ−ヘカテの場合であった。低投与量（１０μＬ）のＧｎＲＨ−ヘカテはアン ドロゲン非感受性のＤＵ１４５細胞に対して同様に有効であった。ＤＵ１４５細 胞はヘカテ単独の場合にも殺された。しかし溶解ペプチド単独による処理は、特 定のタイプの細胞の活性を制御するホルモンなどにより特定のタイプの細胞を別 々に刺激しない限りin vivoでは選択的ではないかもしれない。ヘカテ−ｂＬＨ 結合体はほとんど全てのＤＵ１４５細胞を殺したが、Ａ＋のＬＮＣａＰ細胞には ほとんど影響を与えなかった。この結果はＬＨがＤＵ１４５細胞には特異的に結 合するが、ＬＮＣａＰ細胞には特異的に結合しないと考えるとつじつまが合う。 ＬＨはＤＵ１４５細胞に特異的に結合するが、ＬＨのＡ＋ＬＮＣａＰ細胞に対す る特異的結合を示す結果はこれまでのところ得られていない。ＦＳＨで前処理し たＬＮＣａＰ細胞は前処理しない細胞と比較してヘカテ−ｂＬＨ結合体に対する 感受性がより高かった。 自己免疫疾患の治療及び異常細胞を標的とすることを含む他の用途 本発明は、特異的なリガンド相互作用により制御されるか、これに依存した異 常（または正常）細胞を特異的に阻害することが望ましい場合において使用する ことが可能である。別の一例として、本発明は、原因となる抗原やエピトープが 知られている自己免疫疾患を治療するために使用することが可能である。 特異的な免疫応答はＢ-リンパ球、Ｔ-リンパ球、またはこの両方によって媒介 される。リンパ球が「非自己」の代りに「自己」を不適切に攻撃すると、様々な 自己免疫疾患の原因となり、その中には深刻な結果をもたらすものもある。自己 免疫に関連した疾患としては、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、全身性エリテ マトーデス、アジソン病、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、グ レーヴズ病、橋本甲状腺炎、突発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿 病、重症筋無力症、心筋梗塞、再生不良性貧血、悪性貧血、連鎖球菌感染後の糸 球体腎炎、突発性不妊症、強直性脊椎炎、強皮症、シェーグレン症候群が含まれ る。 Ｔ細胞またはＢ細胞のいずれによって媒介されるかによらず、自己免疫疾患は 、抗体分泌、増殖、細胞毒性因子の分泌、または炎症性サイトカインの分泌とい ったリンパ球の機能を引き起こす自己エピトープに対する特異的なレセプターを 有するリンパ球によって特徴付けられる。これらの応答によって自己細胞あるい は自己臓器が損傷、破壊される。 リンパ球を刺激するリガンドとして作用する特異的抗体及びエピトープが、専 らこれらがリンパ球において誘発するin vitro増殖性応答によって特定されてき た。例として、橋本病では甲状腺刺激ホルモンがリンパ球によって認識される自 己抗体である可能性が示唆されてきた。エピトープが分かっている場合、自己免 疫疾患は細胞溶解ペプチドに結合させたそのエピトープを含む化合物の投与によ り治療することが可能である。この化合物は自己応答性リンパ球のクローンを選 択的に除去する。 現在までのところ自己免疫疾患に対する一般的な治療法は存在しない。従来の 治療法では細胞毒性化合物及びコルチコステロイドが用いられるが、これらのい ずれも長期治療においてリスクを伴う。またこれらのいずれも自己応答性リンパ 球を選択的に攻撃しない。 ある種の異常細胞（例、ＨＩＶ感染細胞などのウイルス感染細胞や癌細胞）で は、正常細胞には見られない細胞表面レセプターが見られる。これらのレセプタ ーの中にはウイルスの核酸によってコードされているものがある。これらのレセ プターに対するモノクローナル抗体や、D．Fitzgerald et al.,“Targeted Toxi n Therapy for the Treatment of Cancer,”J.Natl.Cancer Inst.,vol.81,pp.14 55-1463の表２に記載のレセプター／リガンドのペアのような、これらのレセプ ターに対するリガンドを本発明のリガンド／細胞溶解ペプチドの組合わせにおい て使用してレセプターを発現している細胞を選択的に破壊することが可能である 。ウイルス感染細胞を、例えばウイルスの成熟サイクルが完了する前にこのよう に破壊することにより不完全な感染性のないウイルス粒子が放出され、したがっ てウイルス感染は治療されたことになる。こうした癌細胞の破壊により更なる転 移は防止される。リガンドとして抗体が用いられる場合、この抗体と細胞溶解ペ プチドを結合体としてではなく、別々に連続的に投与することがしばしば好まし い。結合した抗体に対する補体応答や他の応答により細胞は溶解ペプチドによる 攻撃をより受けやすくなる 本発明において有用な細胞溶解ペプチド （この理論に束縛されるものではないが）溶解ペプチドは細胞膜を破壊するこ とで作用するものと考えられている。「休止状態」の真核細胞は細胞膜の損傷を 修復する能力により自らを防御する。これに対し、活性化された細胞（ＧｎＲＨ によって刺激された細胞）は損傷した細胞膜を修復することができない(あるい は修復能が低い)。ＧｎＲＨにより活性化された脳下垂体細胞の細胞膜修復能は 低下しているため、これらの細胞は溶解ペプチドによって選択的に破壊されるが 、周辺の活性化されていない細胞は細胞膜を修復して生き残る。 現在までに試験された本発明の実施形態ではエフェクターである溶解ペプチド としてヘカテが用いられているが、本発明において他の溶解ペプチドとリガンド の組合わせを用いることも可能である。当該技術分野においては多くの溶解ペプ チドが知られており、以下の記載において引用される文献に触れられているもの が例として含まれる。 細胞溶解ペプチドは小さい塩基性ペプチドである。天然の溶解ペプチドは、昆 虫、両生類、及び哺乳動物などの多くの動物種における細菌に対する防御システ ムの主要な要素である。溶解ペプチドは通常は２３〜２９個のアミノ酸からなる が、これよりも小さい場合もある。溶解ペプチドは両親媒性のα-ヘリックス構 造をとりうる(参照 Boman et al.，“Humoral immunity in Cecropia pupae,” Curr．Top．Microbiol．Immunol.，vol.94/95，pp．75-91(1981);Boman et al. ，“Cell-free immunity in insects,”Annu．Rev．Micbol.，vol．41，pp．103 -126(1987);Zasloff,“Magainins，a class of antimicrobial peptides from X enopusskin:isolation，characterization of two active forms，and partial DNAsequence of a precursor,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．84，pp．36 28-3632(1987);Ganz et al.，“Defensins natural peptide antiblotics of hu man neutrophiles,“J Clin.invest.，vol．76，pp．1427-1435(1985);and Lee et al.，“Antibacterial peptides from pig intestine:isolation of a mamma lian cecropin,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA,vol．86，PP．9159-9162(1989)) 。 ペプチドの両親媒性が保存されるようなアミノ酸残基の置換(例、極性残基を 別の極性残基で置換、または非極性残基を別の非極性残基で置換)、電荷分布が 保存されるような置換(例、酸性残基を別の酸性残基で置換、または塩基性残基 を別の塩基性残基で置換)、または、両親媒性あるいは電荷分布が保存されるよ うにアミノ酸配列を長くしたり短くしたりすることによって、溶解ペプチドの公 知のアミノ酸配列を改変し、やはり細胞溶解活性を有する新たなペプチドを創製 することが可能である。溶解ペプチド及びその配列は、以下の文献に開示されて いる。Yamada et al.,“Production of recombinant sarcotoxin IA in Bombyxm oricells”Biochem．J,vol．272，pp．633-666(1990);Taniai et al.，“Isolat ion and nucleotide sequence of cecropin B cDNA clones from the silkworm, Bombyxmori,”Biochemica Et Biophysica Acta,vol.1132,pp.203-206(1992);Bom an et al.，”Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids,”Febs Letters，vol．259，pp．103-106(1989 );Tessir et al.，“Enhanced secretion from insect cells of a foreign pro tein fused to the honeybee melittin signal peptide,”Gene，vol．98，pp． 177-183(1991);Blondelle et al.，“Hemolytic and antimicrobial activities of the twenty-four individualomission analogs of melittin,”Biochemistr y，vol.30，pp.4671-4678(1991);Andren et al.，“Shortened cecropin A-meli ttin hybrids．Significant size reduction retains potent antibiotic activ ity,”Febs Letters，vol．296，pp．190-194(1992);Macias et al.，“Bacteri cidal activity of magainin 2:use of lipopolysaccharide mutants,”Can．J Microbiol.，vol．36，pp．582-584(1990);Rana et al.,“Interactions betwee n magainin-2 and Salmonella typhimuriumouter membranes:effect of Lipopol ysaccharide structure,”Biochemistry，vol．30,pp.5858-5866(1991);Diamond et al.,“Airway epithelial cells are the site of expression of a mammal ian antimicrobial peptide gene,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．90，pp ．4596 ff(1993);Selsted et al.,“Purification,primary structures and ant ibacterial activities of β-defensins，a new family of antimicrobial peptides from bovine neutrophils,”J．Biol.Chem.，vol．268 ，pp．6641ff(1993);Tang et al.,“Characterization of the disulfide motif in BNBD-12，an antimicrobial β-defensin peptide from bovine neutrophils ,”J．Biol.Chem.，vol．268,pp.6649 ff(1993);Lehrer et al.，Blood,vol．76 ,pp.2169-2181(1990);Ganz et al.，Sem．Resp．Infect．I.，pp．107-117(1986 );Kagan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．87，pp．210-214(1990);W ade et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，vol．87，pp．4761-4765(1990);Ro meo et al.，J．Biol．Chem.，vol．263，pp．9573-9575(1988); Jaynes et al. ，“Therapeutic Antimicrobial Polypeptides，Their Use and Methods for Pr eparation,”WO 89100199(1989);Jaynes，“Lytic Peptides，Use for Growth， Infection and Cancer,”WO 90/12866(1990);Berkowitz,“Prophylaxis and Tre atment of Adverse Oral Conditions with Biologically Active Peptides,”WO 93/01723(1993)． 自然界に存在する溶解ペプチドのファミリーとしては、セクロピン類、ディフ ェンシン類、サルコトキシン類、メリチン類、マガイニン類などがある。スウェ ーデンのボーマン（Boman）等は、大型のカイコであるHyalophora cecropiaが細 菌の感染から自らを防御するための体液性防御システムに関する独創的な研究を 行った(参照Hultmark et al.，“Insect immunity,Purification of three indu cible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyaloph ora cecropia,”Eur．J．Biochem.，vol．106，pp．7-16(1980); and Hultmark et al.，“Insect immunity.Isolation and structure of cecropin D,and four minor antibacterial components from cecropia pupae,”Eur.J．Biochem.，v ol．127，pp.207-217(1982))。 H．cecropiaでは細菌の感染により、細菌の細胞膜を破壊し、溶菌及び細胞死 に至らしめる能力を有する特殊なタンパク質の合成が誘導される。これらの特殊 なタンパク質の中にセクロピン類として知られるものがある。主要なセクロピン である、セクロピンＡ、セクロピンＢ、及びセクロピンＤは小さく、相同性の高 い塩基性ペプチドである。ボーマンのグループはメリフィールド（Merrifield） との共同研究において各種セクロピンのアミノ末端側の半分は両親媒性のα‐ヘ リックスを形成する配列を含むことを示した(Andrequ et al.，“N-terminal an alogues of cecropin A:synthesis，antibacterial activity，and conformatio nal properties,”Biochem.，vol．24，pp．1683-1688(1985))。ペプチドのカル ボキシ端側の半分は疎水性の尾を形成する(参照Boman et al.,“Cell-free immu nity in Cecropia,”Eur.J．Biochem.，vol．201，pp．23-31(1991))。 ブタの小腸からセクロピン様ペプチドが単離されている(Lee et al.，“Antib acterial peptides from pig intestine:isolation of a mammalian cecropin, ”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．86，pp．9159-9162(1989))。 セクロピンペプチドは細菌以外の動物の病原体の多くを殺すことが観察されて いる(参照 Janes et al.,“InVitro Cytocidal Effect of Novel Lytic Peptid es on Plasmodium falciparum and Trypanosoma cruzi,”FASEB，2878-2883(199 8);Arrowood et al.，“Hemolytic properties of lytic peptides active agai nst the sporozoites of Cryptosporidium parvum,”J．Protozool.，vol．38， No．6，pp．161S-163S(1991);and Arrowood et al.,“In vitro activities of lytic peptides against the sporozoites of Cryptosporidium parvum,”Antim icrob．Agents Chemother.，vol．35，pp．224-227(1991))。しかし正常な哺乳 動物細胞は高濃度においてもセクロピンによって大きな影響は受けないようであ る(参照 Jaynes et al.，“In vitro effect of lytic peptides on normal an d transformed mammalian cell lines,”Peptide Research,vol．2，No.2，pp． 1-5(1989);and Reed et al.，“Enhanced in vitro growth of murine fibrobla st cells and preimplantation embryos cultured in medium supplemented wit h an amphipathic peptide,”Mol．Reprod．Devel.，vol．31，No．2，pp．106 -113(1992))。 ディフェンシンは元々哺乳動物において見出された、６〜８個のシステイン残 基を有する小ペプチドである(Ganz et al.，“Defensins natural peptlde anti biotics of human neutrophils,”J．Clin.Invest.，vol．76，pp．1427-1435(1 985))。正常なヒト好中球からの抽出物には、ヒト好中球ペプチドである、ＨＮ Ｐ-1、ＨＮＰ-2、ＨＮＰ-３の３種類のディフェンシンペプチドが含まれる。デ ィフェンシンペプチドは昆虫及び高等植物においても見出されている(Dimareq e t al.，“Insect immunity:expression of the two major inducible antibacte rial peptideS，defensin nad diptericin，in Phormia terranvae,”EMB0 J.， vol．9．pp．2507-2515(1990);Fisher et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，v ol．84，pp．3628-3632(1987))。 ニクバエSarcophaga peregrinaからサルコトキシンと呼ばれるやや大きなペプ チドが単離されている(Okada et al.，“Primary structure of sarcotoxin I,a nantibacterial protein induced in the hemolymph of Sarcophaga peregrina( flesh fly)larvae,”J．Biol．Chem.，vol．260，pp．7174-7177(1985))。サル コトキシンはセクロピンやディフェンシンとはかなり異なっているものの、同様 の抗生物質としての作用を有するものと考えられる。 両生類から他の溶解ペプチドが発見されている。ギブソン（Gibson）は共同研 究者と共にアフリカツメガエルXenopus laevisからＰＧＳ及びGly¹⁰Lys²²PGSと 命名された２種類のペプチドを単離した(Gibson et al.，“Novel peptide frag ments originating from PGL₀and the caervlein and xenopsin precursors fro m Xenopus laevis,”J Biol．Chem.，vol．261，pp．5341-5349(1986);and Giva nnini et al.，“Biosynthesis and degradation of peptides derived from Xe nopus laevis prohormones,”Biochem.J.，vol．243，pp．113-120(1987))Zaslo ff(ザスロフ)はXenopus由来のペプチドが抗菌活性を有することを示し、 これをマガイニンと名付けた(Zasloff，“Magainins，a class of antimicrobia l peptides from Xenopus skin:isolation，Characterization of two active f orms，and partial DNA sequence of aprecursor,”Proc．Natl．Acad．Sci．US A，vol．84，pp．3628-3632(1987))。 異なるクラスの溶解ペプチドの非相同性類似体の合成により、ペプチドのある クラスにおいては、少なくとも２０個のアミノ酸を含み、プラスの電荷を帯びた 両親媒性の配列が細胞溶解活性に必要であることが示された(Shiba et al.，“S tructure-activity relationship of Lepidoteran，a self-defense peptide of Bombyx more,”Tetrahedron.，vol．44，No．3，pp.787-803(1988))。他の研究 によりこれよりも小さなペプチドもまた溶解性を示すことが示された(参照McLau ghganhlin et al.，下記に引用)。 セクロピンは正常なホスト細胞に影響を与えることなく病原体や易感染性細胞 を選択的に攻撃することが示されている。Ｓ-1（またはShiva１）として知られ る合成溶解ペプチドが、Brucella abortus、 Trypanosoma cruzi、Cryptospori dium parvum、及び感染性ウシヘルペスウイルスＩ（ＩＢＲ）に細胞内感染した ホスト細胞を破壊し、非感染呻乳動物細胞に対しては全くあるいはほとんど細胞 毒性を示さないことが示されている(参照Jaynes et al.，“In vitro effect of lytic peptides on normal and transformed mammalian cell lines,”Peptide Research，vol．2，No．2，pp．1-5(1989);Wood et al.,“Toxicity of a Nove l Antimicrobial Agent to Cattle and Hamster cells In vitro,”Proc．Ann． Amer．Soc．Anim．Sci.，Utah State University，Logan，UT.J．Anim．Sci.(Su ppl.1)，vol．65，p．380(1987);Arrowood et al.，“Hemolytic properties of lytic peptides active against the sporozoites of Cryptosporidium parvum ,”J．Protozool.，vol．38，No．6，pp．161S-163S(1991);Arrowood et al.,“ In vitro activities of lyticpeptides against the sporozoites of Cryprosp oridium parvum,”Antimicrob. Agents Chemother.，vol．35，pp．224-227(1991);and Reed et al.,”Enhanced in vitro growth of murine fibroblast cells and preimplantation embryos cultured in medium supplemented with an amphipathic peptide,”Mol．Reprd ．Devel.，vol．31，No．2，pp．106-113(1992))。 Morvan et al.，“In vitro activity of the antimicrobial peptide magain in lagainst Bonamia ostreae，the intrahemocytic parasite of the flat oys ter Ostrea edulis,”Mol．Mar．Biol.，vol．3，pp．327-333(1994)ではマガイ ニンをin vitroにて使用し、カキの一種である0strea edulisの細胞には影響を 与えない量で寄生虫Bonamia ostreaeの生存度を選択的に低下させることについ て報告されている。 また、以下の係属中の特許出願に開示されている合成ペプチドも興味深い。こ のペプチドは１０〜１４個だけのアミノ酸残基で細胞溶解活性を示す(McLaughli n et al.，“Amphipathic peptides,”米国特許出願第０８／６８１，０７５号 １９９６年７月２２日出願、及び、Mark L．McLaughlin et al.，“ShortAmphip athic peptides with Activity against Bacteria and Intracellular Pathogen s,”米国特許出願第０８／７９６，１２３号、１９９７年２月６日出願)。 本発明を実施するうえで当該技術分野において一般的に知られているような溶 解ペプチドを使用することが可能である。特にリガンドとペプチドとが別々に投 与される場合には、リガンドによって活性化された細胞に対して選択的な毒性を 有することが望ましい。リガンドとペプチドとが互いに結合されている場合には 選択的毒性はそれほど重要ではない。これは、こうした場合、リガンドに対する レセプターを有する細胞の近傍においてペプチドの濃度が効率的に高くなってい るためである。 こうしたペプチドの例として、Ｄ１Ａ２１（配列番号５）、Ｄ２Ａ２１ (配列 番号６)、Ｄ５Ｃ(配列番号７)、及びＤ５Ｃ１（配列番号８）として示したもの がある。本発明において用いるのに適当なこれらのペプチド及び他の溶解ペプチ ドがJaynesによる“Methods for the Design of Amphipathic Peptides Having Enhanced Biological Activities,”米国特許仮出願第６０／０２７，６２８号 １９９６年１０月４日出願に開示されている。これらのペプチド単独（上記４種 のペプチドのいずれか一つをリガンドなしで使用）を使用した現在までの治験に おいて、ヒト前立腺癌に対するin vitroのＬＤ₅₀値は、約０．５７μＭ〜約１． ６１μＭの範囲であった。Ｄ２Ａ２１ペプチド単独（リガンドなし）を用いた現 在までの治験においてヒト乳癌、膀胱癌、結腸癌、頚癌、肺癌、結腸癌、及び皮 膚癌の細胞系に対するＬＤ₅₀値は、約０．２８μＭ〜約３．１μＭの範囲であっ た。これと比較するうえで、正常な非癌性ヒト細胞である、内皮細胞、繊維芽細 胞、腸細胞、ケラチノサイトのそれぞれに対するＤ２Ａ２１、Ｄ５Ｃ、及びＤ５ Ｃ１のＬＤ₅₀値はそれぞれ１００μＭを上回る値であった。Ｄ２Ａ２１では、ヒ ト末梢血単球細胞に対するＬＤ₅₀値は約１００μＭであり、ヒト末梢血T-細胞に 対するＬＤ₅₀値は１００μＭを上回る値であった。 他のＧｎＲＨ類似体を本発明に基づく溶解ペプチドに結合させることも可能で ある。こうした結合体の一部として使用が可能な類似体として、1-ＬＨＲＨ-III （またはI-ＧｎＲＨ-III）（配列番号１６）がある。このペプチドはある種の癌 細胞の成長を抑制することが報告されている(参照I．Mezo et al.，“Synthesis of Gonadotropin-Releasing Hormone III analogues．Structure-Antitumor Activity Relationships,”J．Med．Chem.，vol．40，pp．3353-3358(1997))。 同じ1-ＬＨＲＨ-IIIがＦＳＨの放出を選択的に引き起こす(参照W．Yu et al.， “Ahypothalamic follicle-stimulating hormone-releasing decapeptide in th e rat,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，vol．94，pp．9499-9503(1997)及び、米 国特許出願第０８／８６９，１５３号１９９７年７月４日出願)。1-ＬＨＲＨ-II Iの細胞溶解 ペプチド結合体は避妊薬として、また前立腺癌などの癌の治療において有用であ る。米国特許出願第０８／８６９，１５３号に開示されるような1-ＬＨＲＨ-III のアゴニストも同様に使用することが可能である。 付記 請求の範囲において用いられている組成物の「有効量」とは、非標的細胞集団 中の標的細胞を選択的に殺すだけの充分量のことである。意味内容によっては、 組成物の「有効量」はまた、動物の長期避妊または不妊を誘発するだけの充分量 を意味する。意味内容によって、ＧｎＲＨまたは1-ＬＨＲＨ-IIIの「有効量」と は性腺刺激細胞の破壊により不妊状態とされた動物に一時的に受胎能を回復させ るだけの充分量のことを指す。請求の範囲において用いられている「動物」とは ヒト及びヒト以外の後生動物を含むものとする。 本明細書において引用される全ての引例の開示全体を、１９９７年３月２７日 出願の米国特許仮出願第６０／０４１，００９号、１９９７年９月３日出願の米 国仮出願第６０／０５７，４５６号、及び、１９９７年６月４日出願の米国特許 出願第０８／８６９，１５３号の開示全体と同様、ここに援用するものである。 調停不能の係争の場合には本明細書に従うものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/575 Ｃ０７Ｋ 14/575 14/59 14/59 14/655 14/655 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／０５７，４５６ (32)優先日 平成９年９月３日(1997．9．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 エンライト、フレデリック エム. アメリカ合衆国 70808 ルイジアナ州 バトンルージュ ノース チャレット コ ート 5238 (72)発明者 ジェインズ、ジェシー エム. アメリカ合衆国 27606 ノースキャロラ イナ州 ローリー ハイ リッジ ドライ ブ 2417 (72)発明者 ハンセル、ウィリアム. アメリカ合衆国 70808 ルイジアナ州 バトンルージュ ケニルワース パークウ ェイ 356 (72)発明者 クーンス、ケネス エル. アメリカ合衆国 70808 ルイジアナ州 バトンルージュ エス．フィールドゲート コート 6976 (72)発明者 マッキャン、サミュエル エム. アメリカ合衆国 70809 ルイジアナ州 バトンルージュ ジェファーソン プレイ ス ブルーバード 7834 アパートメント ビー (72)発明者 ユー、ウェン エイチ. アメリカ合衆国 70809 ルイジアナ州 バトンルージュ エッセン レーン 4155 アパートメント 117 (72)発明者 メルローズ、パトリシア エー. アメリカ合衆国 70808 ルイジアナ州 バトンルージュ シュルーズベリー アベ ニュー 7446 (72)発明者 フォイル、レーン ディ. アメリカ合衆国 70808 ルイジアナ州 バトンルージュ スタンフォード アベニ ュー 1180 (72)発明者 エルザー、フィリップ エイチ. アメリカ合衆国 70809 ルイジアナ州 バトンルージュ アズロック アベニュー 10231

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）ゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、ｂＬＨ、エスト ロゲン、テストステロン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激 ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ドーパミン、ソマト スタチン、及びこれらのホルモンの類似体からなる群から選択されるホルモンの ドメインと、（ｂ）細胞溶解ペプチドのドメインとを含む化合物。 ２． 前記ホルモンドメインは前記細胞溶解ペプチドドメインに対して、該ホ ルモンドメインと該細胞溶解ペプチドドメインとを連結する中間連結ドメインを 用いずに直接結合させられる請求項１に記載の化合物。 ３． 前記細胞溶解ペプチドドメインは、セクロピンペプチド、メリチンペプ チド、ディフェンシンペプチド、マガイニンペプチド、サルコトキシンペプチド 、及びこれらのペプチドの類似体からなる群から選択される請求項１に記載の化 合物。 ４． 前記細胞溶解ペプチドドメインはヘカテを含む請求項１に記載の化合物 。 ５． 前記ホルモンドメインは1-ＬＨＲＨ-IIIを含む請求項１に記載の化合物 。 ６． 前記ホルモンドメインはゴナドトロピン放出ホルモンを含む請求項１に 記載の化合物。 ７． 前記化合物は配列番号３または配列番号４の配列を有する請求項１に記 載の化合物。 ８． 前記化合物は配列番号１２または配列番号１５の配列を有する請求項１ に記載の化合物。 ９． 前記ホルモンドメインはエストロゲンを含む請求項１に記載の化合物。 １０． 前記ホルモンドメインはテストステロンを含む請求項１に記載の化合物 。 １１． 前記ホルモンドメインは黄体形成ホルモンを含む請求項１に記載の化合 物。 １２． 前記ホルモンドメインは絨毛性ゴナドトロピンを含む請求項１に記載の 化合物。 １３． 前記ホルモンドメインは卵胞刺激ホルモンを含む請求項１に記載の化合 物。 １４． 前記ホルモンドメインはメラニン細胞刺激ホルモンを含む請求項１に記 載の化合物。 １５． 前記ホルモンドメインはエストラジオールを含む請求項１に記載の化合 物。 １６． 前記ホルモンドメインはドーパミンを含む請求項１に記載の化合物。 １７．前記ホルモンドメインはソマトスタチンを含む請求項１に記載の化合物。 １８． 前記ホルモンドメイン、前記細胞溶解ペプチドドメインまたはこれらの 両方がＤ型アミノ酸残基を含む請求項１に記載の化合物。 １９． 化合物が経口投与される場合に腸からの吸収を促進するための担体ドメ インを更に含む請求項１８に記載の化合物。 ２０． 前記担体ドメインはビタミンＢ₁₂のドメインを含む請求項１９に記載の 化合物。 ２１． 動物において長期の避妊または不妊を行うための方法であって、該動物 に（ａ）ゴナドトロピン放出ホルモン、ｂＬＨ、及び、1-ＬＨＲＨ-IIIからなる 群から選択されるホルモンの有効量と、（ｂ）細胞溶解ペプチドの有効量とを投 与することを含む方法。 ２２． 前記細胞溶解ペプチドは前記ホルモンが投与された後に投与される請求 項２１に記載の方法。 ２３． 前記動物は哺乳類である請求項２１に記載の方法。 ２４． 前記動物は鳥類である請求項２１に記載の方法。 ２５． 前記鳥類はニワトリまたは七面鳥である請求項２４に記載の方法。 ２６． 前記動物は昆虫である請求項２１に記載の方法。 ２７． 前記ホルモンまたは前記細胞溶解ペプチドは前記昆虫によって摂食され た植物体内の外来遺伝子によって発現される請求項２６に記載の方法。 ２８． 前記ホルモン、前記細胞溶解ペプチド、またはこれらの両方はＤ型アミ ノ酸残基を含む請求項２１に記載の方法。 ２９． Ｄ型アミノ酸残基を含む前記化合物は更に、化合物が経口投与された場 合に腸からの吸収を促進するための担体ドメインを含む請求項２８に記載の方法 。 ３０． 前記担体ドメインはビタミンＢ₁₂のドメインを含む請求項２９に記載の 方法。 ３１． 動物に長期の避妊または不妊を行うための方法であって、該動物にホル モンドメインと細胞溶解ペプチドドメインとを含む化合物の有効量を投与するこ とを含み、該ホルモンドメインはゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III 、及びｂＬＨからなる群から選択される方法。 ３２． 前記ホルモンドメインは前記細胞溶解ペプチドドメインに対して、該ホ ルモンドメインと該細胞溶解ペプチドドメインとを連結する中間連結ドメインを 用いずに直接結合させられる請求項３１に記載の方法。 ３３． 前記細胞溶解ペプチドドメインは、セクロピンペプチド、メリチンペプ チド、ディフェンシンペプチド、マガイニンペプチド、サルコトキシンペプチド 、及びこれらのペプチドの類似体からなる群から選択される請求項３１に記載の 方法。 ３４．前記細胞溶解ペプチドドメインはヘカテを含む請求項３１に記載の方法。 ３５． 前記化合物は配列番号３の配列を有する請求項３１に記載の方法。 ３６． 前記化合物は配列番号４の配列を有する請求項３１に記載の方法。 ３７． 前記化合物は配列番号１２または配列番号１５の配列を有する請求項３ １に記載の方法。 ３８． 前記動物は哺乳類である請求項３１に記載の方法。 ３９． 前記動物は鳥類である請求項３１に記載の方法。 ４０． 前記鳥類はニワトリまたは七面鳥である請求項３９に記載の方法。 ４１． 前記動物は昆虫である請求項３１に記載の方法。 ４２． 前記ペプチドは前記昆虫によって摂食された植物体内中の外来遺伝子に よって発現される請求項４１に記載の方法。 ４３． 脳下垂体の性腺刺激細胞の選択的破壊によって不妊状態にされた動物に 一時的に受胎能を回復させるための方法であって、該動物にゴナドトロピン放出 ホルモンまたは1-ＬＨＲＨ-IIIの有効量を投与することを含む方法。 ４４． （ａ）ゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、及びｂＬＨから なる群から選択されるホルモンの有効量と、（ｂ）細胞溶解ペプチドの有効量と を予め不妊状態にされた哺乳動物に投与することにより該動物に受胎能を回復さ せる請求項４３に記載の方法。 ４５． ホルモンドメインと細胞溶解ペプチドドメインとを含む化合物の有効量 を予め不妊状態にされた哺乳動物に投与することにより該動物に受胎能を回復さ せ、前記ホルモンドメインはゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、及 びｂＬＨからなる群から選択される請求項４３に記載の方法。 ４６． ホルモンドメインと細胞溶解ドメインとを含むペプチドをコードする外 来遺伝子を有し、該ホルモンドメインはゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲ Ｈ-III、及びｂＬＨからなる群から選択される植物。 ４７． ゴナドトロピン放出ホルモンをコードするか、1-ＬＨＲＨ-IIIをコード するか、またはｂＬＨをコードする第１の外来遺伝子と、細胞溶解ペプチドをコ ードする第２の外来遺伝子とを有する植物。 ４８． 哺乳動物のホルモン依存型またはリガンド依存型腫瘍の細胞を殺すかそ の成長を阻害するための方法であって、前記腫瘍の成長が依存しているホルモン またはリガンドの有効量と、細胞溶解ペプチドの有効量とを前記哺乳動物に投与 することを含む方法。 ４９． 前記細胞溶解ペプチドは前記ホルモンまたリガンドが投与された後に投 与される請求項４８に記載の方法。 ５０． 前記ホルモン及びリガンドの一方及び前記細胞溶解ペプチドは、ホルモ ン及びリガンドの一方と細胞溶解ペプチドとが互いに化学的に結合されている化 合物を前記哺乳動物に投与することによりそれぞれ投与される請求項４８に記載 の方法。 ５９． 前記細胞は脳下垂体腺腫の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドは 、ゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、コルチコステロイド放出ホル モン、 成長ホルモン放出ホルモン、血管作用性腸ペプチド、及び脳下垂体アデニレート シクラーゼ活性化ペプチドからなる群から選択される請求項４８に記載の方法。 ６０． 前記細胞は乳癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドはゴナドト ロピン放出ホルモンまたは1-ＬＨＲＨ-IIIを含む請求項４８に記載の方法。 ６１． 前記細胞は卵巣癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドはゴナド トロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、またはｂＬＨを含む請求項４８に記載 の方法。 ６２． 前記細胞は前立腺癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドはゴナ ドトロピン放出ホルモンまたは1-ＬＨＲＨ-IIIを含む請求項４８に記載の方法。 ６３． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ６４． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項２に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ６５． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項３に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ６６． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項４に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ６７． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項５に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ６８． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項６に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ６９． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項７に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ７０． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項８に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ７１． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項９に記載の化合物の有効量を投与すること を含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含む 方法。 ７２． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１０に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７３． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１１に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７４． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１２に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７５． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１３に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７６． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１４に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７７． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１５に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７８． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１６に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ７９． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１７に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ８０． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１８に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ８１． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項１９に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ８２． 哺乳動物のホルモン依存型腫瘍の細胞を殺すかその成長を阻害するため の方法であって、該哺乳動物に請求項２０に記載の化合物の有効量を投与するこ とを含み、該化合物の前記ホルモンドメインは腫瘍が依存しているホルモンを含 む方法。 ８３． 哺乳動物の細胞を殺すかその成長を阻害するための方法であって、該細 胞の活性は細胞表面のレセプターのリガンドへの結合に依存し、該方法は該哺乳 動物に細胞の活性が依存しているリガンドの有効量と細胞溶解ペプチドの有効量 とを投与することを含む方法。 ８４． 前記細胞溶解ペプチドは前記リガンドが投与された後に投与される請求 項８３に記載の方法。 ８５． 前記リガンド及び前記細胞溶解ペプチドは、該リガンドと該細胞溶解ペ プチドとが互いに化学的に結合された化合物を前記哺乳動物に投与することによ ってそれぞれ投与される請求項８４に記載の方法。 ８６． 前記細胞は自己免疫応答の原因となるリンパ球であり、前記リガンドは 該リンパ球が選択的に結合するエピトープである請求項８３に記載の方法。 ８７． 前記細胞はウイルスに感染していない点を除いて同様の細胞には見られ ない表面レセプターが見られるウイルス感染細胞であり、前記リガンドは該表面 レセプターに選択的に結合する請求項８３に記載の方法。 ８８． 昆虫の生殖能力を阻害するための方法であって、該昆虫に細胞溶解ペプ チドの有効量を投与することを含む方法。 ８９． 前記細胞溶解ペプチドは、セクロピンペプチド、メリチンペプチド、デ ィフェンシンペプチド、マガイニンペプチド、サルコトキシンペプチド、及びこ れらのペプチドの類似体からなる群から選択される請求項８８に記載の方法。 ９０． 前記細胞溶解ペプチドはＬ-ヘカテを含む請求項８８に記載の方法。 ９１． 前記細胞溶解ペプチドはＤ-ヘカテを含む請求項８８に記載の方法。 ９２． 前記細胞溶解ペプチドは前記昆虫によって摂食された植物体内の外来遺 伝子によって発現される請求項８８に記載の方法。 ９３． 前記植物によって発現される細胞溶解ペプチドはＬ-ヘカテを含む請求 項９２に記載の方法。 ９４． Ｌ-ヘカテをコードする外来遺伝子を有する植物。 ９５． 前記哺乳動物はイヌである請求項２３に記載の方法。 ９６． 前記哺乳動物はネコである請求項２３に記載の方法。 ９７． 前記哺乳動物は雌ウシまたは雄ウシである請求項２３に記載の方法。 ９８． 前記哺乳動物はブタである請求項２３に記載の方法。 ９９． 前記哺乳動物はウマである請求項２３に記載の方法。 １００．前記哺乳動物はヒツジである請求項２３に記載の方法。 １０１．前記哺乳動物はヒトである請求項２３に記載の方法。 １０２．前記動物は軟体動物である請求項２１に記載の方法。 １０３．前記軟体動物はイガイである請求項１０２に記載の方法。 １０４．前記軟体動物はカキである請求項１０２に記載の方法。 １０５．前記哺乳動物はイヌである請求項３８に記載の方法。 １０６．前記哺乳動物はネコである請求項３８に記載の方法。 １０７．前記哺乳動物は雌ウシまたは雄ウシである請求項３８に記載の方法。 １０８．前記哺乳動物はブタである請求項３８に記載の方法。 １０９．前記哺乳動物はウマである請求項３８に記載の方法。 １１０．前記哺乳動物はヒツジである請求項３８に記載の方法。 １１１．前記哺乳動物はヒトである請求項３８に記載の方法。 １１２．前記動物は軟体動物である請求項３１に記載の方法。 １１３．前記軟体動物はイガイである請求項１１２に記載の方法。 １１４．前記軟体動物はカキである請求項１１２に記載の方法。 １１５．動物の脳下垂体の性腺刺激細胞を選択的に殺すための方法であって、（ ａ）ゴナドトロピン放出ホルモンと1-ＬＨＲＨ-IIIとからなる群から選択される ホルモンの有効量と、（ｂ）細胞溶解ペプチドの有効量とを投与することを含む 方法。 １１６．動物の脳下垂体の性腺刺激細胞を選択的に殺すための方法であって、該 動物に、ホルモンドメインと細胞溶解ペプチドドメインとを含む化合物の有効量 を投与することを含み、該ホルモンドメインはゴナドトロピン放出ホルモンと1- ＬＨＲＨ-IIIとからなる群から選択される方法。 １１７．動物のゴナドトロピンレセプターを有するニューロンを選択的に殺すた めの方法であって、該動物に、（ａ）ゴナドトロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ -III、及びｂＬＨからなる群から選択されるホルモンの有効量と、（ｂ）細胞溶 解ペプチドの有効量とを投与することを含む方法。 １１８．動物のゴナドトロピンレセプターを有するニューロンを選択的に殺すた めの方法であって、該動物に、ホルモンドメインと細胞溶解ペプチドドメインと を含む化合物の有効量を投与することを含み、該ホルモンドメインはゴナドトロ ピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、及びｂＬＨからなる群から選択される方法 。 １１９．前記動物は性的に未成熟である請求項２１に記載の方法。 １２０．前記動物は性的に未成熟である請求項３１に記載の方法。 １２１．前記哺乳動物は性的に未成熟である請求項２３に記載の方法。 １２２．前記哺乳動物は性的に未成熟である請求項３８に記載の方法。 １２３．前記細胞は卵巣癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドは1ーＬＨ ＲＨ-IIIを含む請求項４８に記載の方法。 １２４．前記細胞は前立腺癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドは1ーＬ ＨＲＨ-IIIを含む請求項４８に記載の方法。 １２５．前記細胞は乳癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドは1-ＬＨＲ Ｈ-IIIを含む請求項４８に記載の方法。 １２６．前記細胞は子宮内膜癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドは1- ＬＨＲＨ-IIIを含む請求項４８に記載の方法。 １２７．前記ホルモンドメインはｂＬＨを含む請求項１に記載の化合物。 １２８．前記細胞は精巣癌の一部であり、前記ホルモンまたはリガンドはゴナド トロピン放出ホルモン、1-ＬＨＲＨ-III、またはｂＬＨを含む請求項４８に記載 の方法。