JP2000509140A - 酵素検出バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サンプル中の酵素の存在の検出に使用するためのバイオセンサーを提供する。このバイオセンサーは、膜と当該膜のインピーダンスを検出するための手段とを含む。前記膜はイオノフォアを含み、それにはリンカーが取り付けられている。当該リンカーは検出されるべき酵素によって切断され、リンカーの切断によりイオノフォアを介したイオンの膜透過性能に変化が引き起こされる。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素検出バイオセンサー 本発明は、バイオセンサーと、酵素活性を検出することによって酵素の存在を 検出することにおけるバイオセンサーの使用を伴う方法に関する。 免疫学的診断のアナライト(analytes)および疾患マーカーとして使用できる多 くのタンパク質は、特にプロテアーゼ活性等の酵素活性の付加的な特性を有する 。さらに、別のクラスのタンパク質はヌクレアーゼ活性を示す。 前立腺特異的抗原(Prostate Specific Antigen)(ＰＳＡ)、すなわち前立腺ガ ンの診断マーカーは、プロテアーゼ活性を示すタンパク質の一例であり、セリン プロテアーゼとして知られるタンパク質のクラスに属する。重要な免疫学的診断 マーカーである他のプロテアーゼの例には、血液凝固酵素、エラスターゼ、カテ プシンＢが含まれる。 また、ズブチリシン、パパインおよびα-アミラーゼ等の多くの工業的に重要 な酵素もある。 重要なヌクレアーゼの例は、BamHl、HindIII等の制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリ メラーゼのようにある条件下ではヌクレアーゼとして作用するポリメラーゼ、Ｒ ＮアーゼＨのようにある条件下ではＲＮアーゼとして作用する逆転写酵素、並び にＳ１ヌクレアーゼのようなエキソ-およびエンド-ヌクレアーゼである。 現行の診断試験は、ＰＳＡを検出するためのイムノアッセイを用いている（例 えば、Abbott's AXsym、Boehringer Mannheim's ElecsysおよびCIBA-Corning's ACS-180等の多くの分析装置であり、いずれもＥＬＩＳＡをベースとしたＰＳＡ 試験を備える）。これらの試験は、ＰＳＡ分子に対抗して生じた抗体を利用し、 係る抗体は当該タンパク質分子内の特異的エピトープ部位を認識する。 これらの手法の変形は、国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＡＵ９５／００５３６に 開示されている。この参考文献には、ＰＳＡによって特異的に切断された一連の 基質が開示されている。また、この参考文献には、プロテアーゼの活性を利用し たＰＳＡ等のプロテアーゼのアッセイ系も開示されている。このアッセイ系は、 ＰＳＡを捕獲するリガンドの使用と、その後のＰＳＡの基質の使用を含む。 本願発明者らは、タンパク質のプロテアーゼ活性を利用した酵素の検出装置並 びに方法を開発した。これらの装置並びに方法は、膜をベースとしたバイオセン サーの使用を含む。これらのバイオセンサーに関する情報は、国際特許出願ＰＣ Ｔ／ＡＵ８８／００２７３、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３５２、ＰＣＴ／ＡＵ９０ ／０００２５、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２，ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９ 、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６２０、ＰＣＴ／ＡＵ９４／００２０２およびＰＣＴ ／ＡＵ９５／００７６３に見出すことができる。これらの出願の開示を参照とし てここに含める。 本発明は、検出すべき酵素の基質を提供すること、並びに酵素による基質の分 解を検知することを含む。これは多くの方法で達成されうるが、例えば基質の分 解によりイオノフォアからある基が除去されてイオノフォアを放出することによ り当該イオノフォアが膜内を横方向に拡散するか、あるいは単に“立体”障害の 減少によってイオノフォアを経由するイオンの通過能力の増加を引き起こしても よい。もしくは、基質が膜間成分(a membrane spanning component)に取り付け られた場合には、基質の分解によりイオノフォアの放出が引き起こされることに よって、イオノフォアが膜内を横方向に拡散してもよい。明らかに、このことは イオノフォアと膜間成分の両方に取り付けられた基質の分解によって達成するこ ともできる。 他の変更としては、基質の分解が、プローブを含むイオノフォアの放出を引き 起こし、次いで膜内にそれ自身を挿入する。 従って、本発明の第一の態様は、サンプル中の酵素の存在を検出するのに使用 するためのバイオセンサーであり、当該バイオセンサーは膜と当該膜のインピー ダンスを検出するための手段を含み、当該膜はイオノフォアを備え、当該イオノ フォアにリンカーが取り付けられており、当該リンカーは検出されるべき酵素に よって切断されうるものであり、リンカーの切断によりイオノフォアを介したイ オンの膜透過能力に変化が引き起こされる。 本発明の好ましい態様では、リンカーが膜に取り付けられることにより、イオ ノフォアが膜内を横方向に拡散することができない。リンカーは膜に設けられた 膜間成分に取り付けられていることが好ましい。この取り付けは共有結合等の多 くの方法で行うことができるが、現在のところ、リガンド結合対の一方をリンカ ーと膜間成分の両方に設けることによって取り付けることが好ましい。好ましい リガンド結合対はビオチンストレプトアビジンである。他の好ましい変更では、 膜間成分とリンカーの両方が、同一の分子に結合した部分を備えており、例えば ビオチンが膜間成分とリンカーの両方に設けられ、ストレプトアビジンを介して 架橋結合したものである。 膜間成分の当該部分は、リンカーを介して取り付けられてもよい。これは、イ オノフォアに設けられたものと同じリンカーであっても異なるものであってもよ い。 さらに好ましい態様では、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列(a closely p acked array)の第一層および第二層、膜において横方向に拡散できない複数のイ オノフォアと複数の膜間脂質を含み、イオノフォアは第一半膜間モノマー及び第 二半膜間モノマーを含み、第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間 モノマーは第二層に設けられている。第一半膜間モノマーは第一層において横方 向に拡散することができず、第二半膜間モノマーはリンカーを介して膜間脂質に 結合されている。酵素によるリンカーの切断後に、第二半膜間モノマーは、第一 半膜間モノマーとは別の第二層内を横方向に拡散することができる。 本発明の第二の態様では、サンプル中の酵素の存在を検出することに使用する ためのバイオセンサーであり、当該バイオセンサーは膜と当該膜のインピーダン スを測定するための手段を含み、この膜は複数のイオノフォアと複数の膜間成分 を備え、当該膜間成分にはリンカー分子が取り付けられ、当該リンカー分子にイ オノフォアが連結され、当該リンカー分子は検出されるべき酵素によって切断さ れうるものであり、リンカー分子の切断によりイオノフォアを介したイオンの膜 透過能力に変化が引き起こされる。 好ましい実施態様では、前記膜は、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第 一層および第二層を含み、膜間成分は膜内において横方向に拡散することができ ない。好ましくは、イオノフォアが第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマー を含み、第一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層 に設けられ、第一半膜間モノマーが第一層において横方向に拡散することができ ない。第二半膜間モノマーは、リンカー分子を介して膜間成分に連結されている 。 これら両方の態様におけるイオノフォアは、好ましくはグラミシジン又はその 類似体である。 一連の酵素は、本発明のバイオセンサーを用いて検出することができるが、こ のバイオセンサーは、プロテアーゼ、特にＰＳＡ、フィブリノーゲン等の臨床的 に重要なプロテアーゼの検出に特に使用できる。 本発明の第三の態様は、第一領域および第二領域、並びに酵素を含むことが疑 われるサンプルを第一領域に添加させる手段を備え、前記第一領域は酵素によっ て切断されうるリンカーを介してキャリアーに連結されたプローブと、第一領域 から第二領域へ非結合プローブを通過させる手段とを含む、酵素の検出のための バイオセンサーであり、前記第二領域は膜および当該膜のインピーダンスを測定 する手段を含み、そのインピーダンスはプローブの存在又は不在に依存する。 本発明のこの態様における好ましい実施態様では、前記膜が、両親媒性分子の 密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、および第一半膜間モノマー及び第 二半膜間モノマーを含む複数のイオノフォアを備え、前記第一半膜間モノマーは 第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に設けられ、第二半膜間モノマ ーは第一半膜間モノマーとは独立の第二層内を横方向に拡散することができ、第 一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することができず、リガンドが 少なくとも第二半膜間モノマーに設けられており、前記リガンドはプローブ又は その一部と反応性を有し、プローブのリガンドへの結合が第一半膜間モノマーと 第二半膜間モノマーとの間の関係に変化を引き起こすことによって、イオノフォ アを介して膜を通過するイオンが流れるかまたは妨げられる。 好ましい実施態様では、プローブがストレプトアビジンを含み、リガンドがビ オチンを含む。 さらに別の好ましい実施態様では、プローブがイオノフォアを含むこと、こよ り、プローブが膜と接触した際に、イオノフォアが自身を膜内に挿入し、膜のイ ンピーダンスを変化させる。このような変更の例として、プローブは、膜内に自 身 を挿入するバリノマイシンを含んでもよい。 本発明の好ましい実施態様では、検出すべき酵素はプロテアーゼであり、特に 前立腺特異的抗原である。この場合、リンカーもしくはリンカー分子は、配列Ａ ｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含むことが好ましい。 当業者であれば理解できるように、使用される実際のリンカーは検出すべき酵 素に依存する。ある酵素及び対応する基質の例は、WhittakerらによるAnalytica l Biochemistry:220，238-243(1994)に記述されており、その開示を相互参照と して含める。 さらに別の態様としては、本発明は、本発明の第一、第二もしくは第三の態様 のバイオセンサーにサンプルを添加すること、および膜のインピーダンスの変化 を測定することを含む、サンプル中の酵素の存在を検出する方法である。 明白なことではあるが、本発明のバイオセンサーと方法は、全体の酵素を検出 するのではなく、活性酵素のみを検出する。多くの状況において、関心が向けら れるのは、単に標準的なサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定されるような存在する 酵素の全体量ではなく、存在する活性酵素の量であることから、これは重要なこ とである。 また、本発明のセンサーは広範囲の酵素を検出するのに使用されることも明ら かである。これらの酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等を含む 。このセンサーは、リンカーの作製を調節することによって、検出すべき特定の 酵素に適合される。例えばプロテアーゼを検出するために、リンカーは酵素によ って切断されるペプチド部位を一般的に含む。特異的プロテアーゼによって切断 されるペプチド配列についての情報は、上記Whittakerらの参照文献に開示され ている。検出すべき酵素がヌクレアーゼであれば、リンカーは一般的に核酸配列 を含む。特異的酵素によって切断される特異的配列に関する情報は、“Current Protocols in Molecular Biology”Ausebelら（1987）John Wiley & Sons，NYに 開示されている。 本発明のセンサーは、ＤＮＡ−薬剤結合部位を決定するための薬剤開発におい て使用してもよい。このセンサーは、ＤＮＡ−タンパク質結合部位を決定する際 にも使用することもできる。また、このセンサーは、感染を診断する際に使用し てもよい。例えば、病原体と特異的に関連する酵素活性を検出するために使用す ることができる。 産業上かつ臨床上適切なプロテアーゼと基質は、トロンビンとＰＳＡを含むセ リンプロテアーゼを含む。溶解酵素の一覧は、“タンパク質分解の特異性（Spec ificity of Proteolysis）”Borivoj Keil（1992）Springer Verlag NY pp.283- 323に開示されている。有益なものはセリンプロテアーゼおよびシステインプロ テアーゼである。“タンパク質分解酵素（Proteolytic Enzymes）”実用的な手 法（a Practical Approach）R.J.Benyon & J.S.Bond(eds)1989 Oxford Universi ty Press NY p232，pp.241-249も参照。本発明の技術に適した商業上重要なプロ テアーゼとプロテアーゼインヒビターは、セリン、システイン、アスパラギン酸 並びにメタロ(metallo)タイプが利用できる。セリンプロテアーゼは、エンドプ ロテイナーゼ−Ａｒｇ−Ｃ、−Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｘａ因子(factor Xa) 、プロテイナーゼＫ、ズブチリシンおよびトリプシンを含み、かつエキソペプチ ダーゼ アシルアミノ酸遊離酵素、カルボキシペプチダーゼＰ、およびカルボキシペプ チダーゼＹを含む。システインプロテアーゼは、エンドペプチダーゼ ブロメラ イン、カテプシンＢ、クロストリパイン、パパインおよびエキソペプチダーゼカ テプシンＣおよびピログルタマートアミノペプチダーゼ(pyroglutamate aminope ptidase)を含む。アスパラギン酸プロテアーゼは、エンドペプチダーゼ カテプ シンＤおよびペプシンを含む。メタロプロテアーゼ(metallo proteases)は、エ ンドペプチダーゼ サーモリシンおよびエキソペプチダーゼ アミノペプチダー ゼＭ、カルボキシペプチダーゼ−Ａ、−Ｂおよびロイシンアミノペプチダーゼを 含む。この一覧は排他的なものではなく、本願発明の広い実用性を示す。他の商 業上使用できるプロテアーゼは、先に引用された文献に掲載されており、これら を参照としてここに含む。例えば、既知の種類のエンドペプチド エンドプロテ イナーゼ−Ａｓｐ−Ｎも含む。 本発明の性質をより明確に理解するために、以下の実施例および添付図面を参 照しながら以下にその好ましい形態を記述する。 図１は、本発明の第三の態様の装置の実施態様の図式的描写を示す。この図か ら判るように、装置１０は第一領域１１と第二領域１２とを含む。第一領域１１ には、ペプチドリンカー１５を介してストレプトアビジン１４（プローブ）に結 合したポリマービーズ１３（キャリアー）が設けられている。このペプチドリン カー１５はプロテアーゼ１６によって切断される。 この図に示すように、プロテアーゼ（またはヌクレアーゼ）１６の添加により 、ストレプトアビジン１４が遊離され、第二領域１２に流れる。第二領域１２は 、ストレプトアビジン１４の存在を検出するバイオセンサー膜１７を含む。バイ オセンサー膜１７に到達したストレプトアビジン１４は、膜のインピーダンスに 変化を引き起こす。 図２は、本発明の第一および／または第二態様の実施態様を示す。図２に示す ようにバイオセンサー膜２０は膜２１と電極２２とを含む。膜２１は、両親媒性 分子の列の第一層２３と第二層２４とを備える。膜内を横方向に拡散することが できない第一半膜間モノマー２５が層２４に含まれている。層２３は第二半膜間 モノマー２６を含む。この膜は、膜内を横方向に拡散することができない膜間脂 質２７も含む。第二半膜間モノマー２６は、ペプチド２８を介して膜間脂質２７ に連結されている。ペプチド２８はプロテアーゼ２９で切断される。プロテアー ゼ２９によるペプチド２８の切断により、半膜間モノマー２６は自由に膜内を横 方向に拡散する。この結果、膜のインピーダンスに変化が生じる。 実施例 実施例１： ストレプトアビジン−グラミシジン結合のプロテアーゼ切断 第一層：９．３ｎＭ リンカーグラミシジンＢ(Linker Gramicidin B)（図３） １．１μＭ 膜間脂質Ｄ(Hembrane Spanner Lipid D)（図４） ３７μＭ ＭＡＡＤ（図５） ７５μＭ リンカー脂質Ａ(Linker Lipid A)（図６） 第二層：エタノール中に１０ｍＭ（ＤＰＥ−ＰＣ（図７）：ＧＤＰＥ（図８）= ７：３）：ビオチニル化グラミシジンＥ(Biotinylated Gramicidin E)（図９）= ６６６７７：１ クロム付着層（ガラス顕微鏡スライド上に２００Å）上に新たに蒸着された金 （１０００Å）を備えた電極を室温で１時間第一層成分のエタノール溶掖中に浸 し、エタノールで濯ぎ、インピーダンスの測定に使用するまでエタノール下、４ ℃で貯蔵した。このスライドを作用電極の範囲を約１６ｍｍ²に限定したテフロ ン被覆ウェルを収容したブロック中に固定した。 ５μＬの第二層を作用電極に添加した後、１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水 （６．２６ｍＭ ＮａＣｌ、５９．４ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏ、２．５３ｍ ＭＮａ₂ＨＰＯ₄．１２Ｈ₂Ｏ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４；ＰＢＳ）を添加 した。電極をＰＢＳで４回洗浄し、３０分間以上６０℃まで温度を上げた。スト レプトアビジンをセンサーウェルに添加し（ＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍｌを５ μＬ）、インキュベートした。ストレプトアビジンのビオチニル化グラミシジン Ｅへの結合により、最小位相におけるアドミタンスが減少した（図１０）。１５ 分後に過剰のストレプトアビジンをＰＢＳで洗浄した。ストレプトアビジンを添 加していないウェルを対照として用いた。 プロテイナーゼＫを検出ウェルおよび対照ウェルに添加して、１２．５ｍｇ／ ｍｌの最終的なウェル濃度とした（ＰＢＳ中に調製されたBoehringer Mannheim D-68298）。対照ウェルへのプロテイナーゼＫの添加では、膜アドミタンス特性 に著しい変化を生じなかった。ストレプトアビジンが結合したセンサー膜は、最 小位相におけるアドミタンスの増加を示した（図１１）。最小位相におけるアド ミタンスの増加の量および速度は、試験溶液中に存在するプロテイナーゼＫの量 に関係しており、それゆえ試験溶液中の酵素活性を調べるために用いることがで きる。 実施例２： ＤＮＡ結合チャネルのＤＮアーゼ１切断 第一層：９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ（Linker Gramicidin B） １．１μＭ膜間脂質Ｄ(Membrane Spanner Lipid D) ２７．５ｎＭ膜間脂質Ｃ(Hembrane Spanner Lipid C)（図１２） ３７μＭ ＭＡＡＤ ７５μＭ リンカー脂質Ａ(Linker Lipid A) 第二層：エタノール中に１４ｍＭ（ＤＰＥ−ＰＣ：ＧＤＰＥ=７：３）：ビオチ ニル化グラミシジンＥ=５００００：１ クロム付着層（ガラス顕微鏡スライド上に２００Å）上に新たに蒸着された金 （１０００Å）を備えた電極を室温で１時間第一層成分のエタノール溶液中に浸 し、エタノールで濯ぎ、インピーダンスの測定に使用するまでエタノール下、４ ℃で貯蔵した。このスライドを作用電極の範囲を約１６ｍｍ²に限定したテフロ ン被覆ウェルを収容したブロック中に固定した。 ５μＬの第二層を作用電極に添加した後、１８０μＬのリン酸緩衝生理食塩水 （１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ ｍＭ ＫＣｌ；ＰＢＳ）を添加した。電極をＰＢＳで４回洗浄した。これらの工 程は室温で行われた。以下の全ての工程は３０℃で行われた。ストレプトアピジ ンを全てのウェルに添加し（ＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍｌを５μＬ）、ビオチ ニル化グラミシジンＥと１０−１５分間反応させ、過剰の非結合のストレプトア ビジンをＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡプローブＦ（２００ｎＭ）：ＤＮＡプローブＧ （ＰＢＳ中に２００ｎＭ）の１：１混合物５μＬをセンサーウェルに添加した。 ＤＮＡ非特異的結合プローブＨ（ＰＢＳ中に４００ｎＭを５μＬ）を対照ウェル に添加した。結合プローブＨは対象の標的ＤＮＡに非相補的であるため、標的Ｄ ＮＡは結合しない。前記プローブを１０−１５分間ストレプトアビジンと反応さ せ、過剰の非結合プローブをＰＢＳで洗い流した。ＰＢＳ中の１００μＬのＤＮ Ａ標 的Ｉ（１０ｎＭ）を各ウェルに添加した。ＤＮＡ標的Ｉのセンサーウェルに対す る結合により、最小位相におけるアドミタンスが減少したが、対照ウェルにおけ る膜アドミタンスでは著しい変化はなかった（図１３）。１５分後に、非結合Ｄ ＮＡ標的ＩをＤＮアーゼ１活性化バッファーで洗浄した。ＤＮアーゼ１活性化バ ッファーは、５０ｎＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｎＭ ＮａＣｌ、１ ０ｎＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｎＭ ＭｎＣｌ₂、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡからなる。 ＤＮアーゼ１をセンサーウェルと対照ウェルに添加した（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ． ＨＣｌの５０％ｗ／ｖグリセロール溶液、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂中に１ ｍｇ／ｍＬを２μＬ）。ＤＮアーゼ１の添加により、センサーウェルの最小位相 におけるアドミタンスは増大したが、対照ウェルには顕著な変化が見られなかっ た（図１４）。最小位相におけるアドミタンスの増加の量および速度は、試験溶 液中に存在するＤＮアーゼ１の量と関係しており、それゆえ試験溶液中の酵素活 性を調べるために用いることができる。 ＤＮＡプローブＦ： ビオチンとＤＮＡとの間に３１原子ホスホラミダイト(phosphoramidite)リン カー基を備えた５’ビオチニル化リステリア(listeria)プローブＤＮＡ ＤＮＡプローブＧ： ビオチンとＤＮＡとの間に１３原子ホスホラミダイトリンカー基を備えた５’ ビオチニル化コレラ毒素プローブＤＮＡ ＤＮＡ非特異的結合プローブＨ： ビオチンとＤＮＡとの間に３１原子ホスホラミダイトリンカー基を備えた５’ ビオチニル化１５マーオリゴヌクレオチド、標的ＤＮＡ配列のあらゆる部分に対 して非相補的である。 ＤＮＡ標的Ｉ： １９塩基リステリア配列、１０塩基“スペーサー”および２３塩基コレラ毒素 配列を含む５２塩基ＤＮＡｂｉｏ=ビオチン Ｌ= Ｍ= 広く記載された本発明の精神もしくは範囲から離れることなく、特定の実施態 様に示したように、多数の変更および／または修正を本発明に加えてもよいこと は、当業者に理解されるところである。しかして、上記の実施態様は、あらゆる 点において例示的なものであって、限定的なものではないと考えるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ブラーチ―マクスヴィティス，ヴィジョレ ータ ルシージャ ブロニスラヴァ オーストラリア国 2203 ニュー サウス ウェールズ ダルウイッチ ヒルズ ダ ーリー ストリート ９ (72)発明者 コーネル，ブルース アンドリュー オーストラリア国 2089 ニュー サウス ウェールズ ニュートラル ベイ ウィ コーム ロード 58 (72)発明者 トムソン，デヴィッド ジェフリー オーストラリア国 2250 ニュー サウス ウェールズ ナララ コニンデリー パ レイド 19 (72)発明者 ラグース，バークハード オーストラリア国 2075 ニュー サウス ウェールズ セイント イーヴス マデ ィース ロード ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 膜と当該膜のインピーダンスを測定するための手段とを含み、当該膜はリ ンカーが取り付けられたイオノフォアを備え、当該リンカーは検出されるべき酵 素によって切断されうるものであり、リンカーの切断によりイオノフォアを介し たイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる、サンプル中の酵素の存在を検出 することに使用するためのバイオセンサー。 ２． リンカーが膜に取り付けられたことにより、イオノフォアが膜内を横方向 に拡散することができない、請求項１記載のバイオセンサー。 ３． リンカーが膜に設けられた膜間成分に取り付けられた、請求項２記載のバ イオセンサー。 ４． リンカーがリガンド結合対を介して膜間成分に取り付けられた、請求項３ 記載のバイオセンサー。 ５． 膜が、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、膜に おいて横方向に拡散することができない複数のイオノフォアおよび複数の膜間脂 質を含み、前記イオノフォアは第一半膜間モノマーおよび第二半膜間モノマーを 含み、第一半膜間モノマーは第一層に設けられ、第二半膜間モノマーは第二層に 設けられ、第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散することかできず 、第二半膜間モノマーはリンカーを介して膜間脂質に結合された、請求項１ない し４のいずれか一項に記載のバイオセンサー。 ６． イオノフォアがグラミシジン又はその類似体である、請求項１ないし５の いずれか一項に記載のバイオセンサー。 ７． 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１ないし６のいずれか 一項に記載のバイオセンサー。 ８． プロテアーゼがＰＳＡである、請求項７記載のバイオセンサー。 ９． 検出されるべき酵素がヌクレアーゼである、請求項１ないし６のいずれか 一項に記載のバイオセンサー。 １０． 膜と当該膜のインピーダンスを測定するための手段を含み、当該膜は複 数のイオノフォアと複数の膜間成分を備え、当該膜間成分にはリンカー分子が取 り付けられ、当該リンカー分子にイオノフォアが連結され、当該リンカー分子は 検出されるべき酵素によって切断されうるものであり、リンカー分子の切断によ りイオノフォアを介したイオンの膜透過能力に変化が引き起こされる、サンプル 中の酵素の存在を検出することに使用するためのバイオセンサー。 １１． 膜が両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層を含み 、膜間成分が膜において横方向に拡散することができない、請求項１０記載のバ イオセンサー。 １２． イオノフォアが第一半膜間モノマーと第二半膜間モノマーとを含み、第 一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層に設けられ 、第一半膜間モノマーが第一層において横方向に拡散することができない、請求 項１０または１１に記載のバイオセンサー。 １３． イオノフォアがグラミシジン又はその類似体である、請求項１０ないし １２のいずれか一項に記載のバイオセンサー。 １４． 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１０ないし１３のい ずれか一項に記載のバイオセンサー。 １５． プロテアーゼがＰＳＡである、請求項１４記載のバイオセンサー。 １６． 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１０ないし１３のい ずれか一項に記載のバイオセンサー。 １７． 第一領域および第二領域、並びにプロテアーゼを含むことが疑われるサ ンプルを第一領域に添加させる手段を備え、前記第一領域は酵素によって切断さ れうるリンカーを介してキャリアーに連結されたプローブと、第一領域から第二 領域へ非結合プローブを通過させる手段とを含み、前記第二領域は膜および当該 膜のインピーダンスを測定する手段を含み、当該インピーダンスはプローブの存 在又は不在に依存する、酵素を検出するためのバイオセンサー。 １８． 膜が、両親媒性分子の密接に詰め込まれた列の第一層および第二層、お よび第一半膜間モノマー及び第二半膜間モノマーを含む複数のイオノフォアを含 み、前記第一半膜間モノマーが第一層に設けられ、第二半膜間モノマーが第二層 に設けられ、第二半膜間モノマーは第一半膜間モノマーとは独立の第二層円を横 方向に拡散することができ、第一半膜間モノマーは第一層において横方向に拡散 することができず、リガンドが少なくとも第二半膜間モノマーに設けられ、前記 リガンドはプローブ又はその一部と反応性を有し、プローブのリガンドへの結合 により第一半膜間モノマーと第二半膜間モノマーとの間の関係に変化が引き起こ されることによって、イオノフォアを介して膜を通過するイオンが流れるかまた は妨げられる、請求項１７記載のバイオセンサー。 １９． 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項１７または１８に記 載のバイオセンサー。 ２０． プロテアーゼがＰＳＡである、請求項１９記載のバイオセンサー。 ２１． 検出されるべき酵素がヌクレアーゼである、請求項１７または１８に記 載のバイオセンサー。 ２２． 半膜間モノマーがラミシジンまたはその類似体である、請求項１７ない し２１のいずれか一項に記載のバイオセンサー。 ２３． プローブがイオノフォアを含む、請求項１７記載のバイオセンサー。 ２４． 請求項１ないし２３のいずれか一項に記載のバイオセンサーにサンプル を添加し、かつ膜のインピーダンスにおける変化を測定することを含む、サンプ ル中の酵素の存在を検出する方法。 ２５． 検出されるべき酵素がプロテアーゼである、請求項２４記載の方法。 ２６． プロテアーゼがＰＳＡである、請求項２５記載の方法。