JP2000508661A - 放射線および化学療法に対する細胞の感作 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｒａｓシグナリング経路に関与するタンパク質産物の阻害剤を細胞に投与し、それによりタンパク質産物の阻害が細胞に放射線感受性を付与することを含んで成る、腫瘍細胞に放射線感受性を付与する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 放射線および化学療法に対する細胞の感作 関連出願の交差引用 本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、1996年４月15日に出願さ れた米国仮出願第60/015,477号に対する優先権を主張する。 政府の援助 本発明は米国政府からの資金（米国国立衛生研究所助成金第Ro1 CA 64227号） により一部援助されるので、米国政府は本発明に一定の権利を有しうる。 発明の分野 本発明の分野は放射線および化学療法である。 発明の背景 放射線療法および化学療法は多くの型の癌の治療に有効な道具であるが、しか し、腫瘍の成長を阻止する際のこの型の処置の成功は、いずれかのもしくは双方 の処置に対する細胞の固有の耐性により制限される。 細胞の放射線耐性は細胞内の活性化された癌遺伝子の存在の結果でありうるが ；しかしながら、この因子のみが全腫瘍細胞の増大された放射線耐性の原因でな い。例えば、組織培養物において、ｒａｓ癌遺伝子の発現が放射線耐性を増大さ せることが、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（フィッツジェラルド(Fitzgerald)ら、1985、 Am．J．Clin．Oncol．8:517-522;スクラー(Sklar)ら、1988、Science 239:645-6 47；ピローロ(Pirollo)ら、1993、Radiat．Res．135:234-243；セイミド(Samid) ら、1991、Radiat．Res．126 244-250）、ラット胚線維芽細胞（マッケンナ(McK enna)ら、1990、Int．J．Rad．Onc．Biol．Phys．18:849-860；リン(Ling)ら、 1989、Radiat．Res．120:267-279）、横紋筋肉腫細胞（ハーメンス（Hermens)ら 、1992、Cancer Res．52:3073-3082）、ヒト骨肉腫細胞（ミラ−(Miller)ら、19 93、Int．J．Cancer 53:302-307；ミラー(Miller)ら、1993、Int．J．Radiat．B iol．64:547-554）および***癌腫細胞（ブルイニール(Bruyneel)ら、1993、Eur ．Ｊ．Cancer 29A:1958-1963）で示されている。対照的に、ラット腎上皮細胞で のＫ−ｒａｓの存在は、これらの細胞を放射線に対しより感受性にした（ハリス (Harris)ら、1990、Somat．Cell & Molec．Genet．16:39-48)。さらに、ヒト乳 房上皮細胞もまた、ｒａｓの存在下で放射線耐性の増大を表さなかった（アラペ ティト(Alapetite)ら、1991、Int．J．Radiat．Biol．59:385-396）。 ヒト線維芽細胞の細胞系においては、げっ歯類細胞系と異なり、Ｈ−ｒａｓ単 独でのトランスフェクションは形質転換も細胞の放射線耐性ももたらさなかった （スー(Su)ら、1992、Int．J．Radiat．Biol．62:201-210）。Ｈ−ｒａｓでトラ ンスフェクションされたヒトＨａＣａＴケラチノサイト系もまた、高線量の放射 線で処理された場合に放射線感受性の変化をほとんど表さなかった。しかしなが ら、これらの細胞の低線量照射は、放射線耐性のあまり大きくない増大をもたら した（メンドンカ(Mendonca)ら、1991、Int．J．Radiat．Biol．59:1195-1206） 。 ｒａｓシグナリング経路に関与するｒａｓ以外の癌遺伝子の細胞中での存在も また、放射線に対する細胞の耐性を伴いうる。こうした癌遺伝子は、ｒａｆ（カ シド(Kasid)ら、1989、Science 243:1354-1356；ピローロ(Pirollo)ら、1989、I nternational Journal of Radiation Biology 55:783-796）、ｍｏｓ（ピローロ (Pirollo)ら、1989、上記；スズキ(Suzuki)ら、1992、Radiation Research 129: 157-162）、ｅｔｓおよび ｓｉｓ（ピローロ(Pirollo)ら、1993、上記）を包含する。 いくつかのｒａｓ突然変異は細胞の形質転換をもたらすことができ、また、他 のｒａｓ突然変異は細胞の形質転換をもたらさないことがある。腫瘍形成をもた らすｒａｓの突然変異は、ｒａｓタンパク質の活性化された形態を生じさせるも のであり、このタンパク質はｒａｓ発現細胞の形質転換、次いでそれから派生さ れる腫瘍の形成を促進する。 Ｈ−およびＫ−ｒａｓの突然変異は、頻繁に、上皮および間葉双方の起源のヒ ト腫瘍で見出される（ボス(Bos)ら、1989、Cancer Res．49:4682-4689）。Ｈ− ｒａｓ突然変異は、より高度の(higher grade)悪性で最多の発生を伴う膀胱癌の 45％程度で検出されている（チェルニアク(Czerniak)ら、1992、Human Pathol． 23:1199-1204）。Ｈ−ｒａｓ突然変異は、甲状腺（ルモワネ(Lemoine)ら、1989 、Oncogene 4:159-164）、頭部および頸部の癌（アンダーソン(Anderson)ら、19 92、J．Otolaryngol．21:321-326）ならびに肉腫（ヴィルケ(Wilke)ら、1993、M odern Pathol．6:129-132；ボール(Bohle)ら、1996、Am．J．Pathol．148:731-7 38、1996）、前立腺（コニシ(Konishi)ら、1995、Am．J．Pathol．147:1112-112 2；ワタナベ(Watanabe)ら、1994、Int．J．Cancer 58:174-178）ならびに子宮頸 部（リョウ(Riou)ら、1988、Oncogene 3:329-333）の癌腫でもまた見られる。Ｋ −ｒａｓの突然変異はヒト腫瘍でより高い有病率さえ示し、膵癌の75〜95％（ス ミット(Smit)ら、1988、Nucleic Acids Res．16:7773-7782；カペラ(Capella)ら 、1991、Environ．Health Perspec．93:125-131）および結腸直腸腫瘍の50％（ カペラ(Capella)ら、1991、上記；フォーゲルシュタイン(Vogelstein)ら、1988 、New Engl．J．Med．319:525-532）に発生する。Ｋ−ｒａｓ突然変異のかなり の発 生率はまた、肺の腺癌（フスガフヴェル−プルシアイネン(Husgafvel-Pursiaine n)ら、1995、J．Occup．Environ．Med．37:69-76）、後期の子宮頸部腫瘍（III およびIV）（シモンズ(Symonds)ら、1992、Eur．J．Cancer 28A:1615-1617；ヒ ワサ（Hiwasa)ら、1992、Eur．J．Gynaec．Oncol．13:241-245）ならびに前立腺 腫瘍（コニシ(Konishi)ら、1995、上記；ワタナベ(Watanabe)ら、1994、上記） でも報告されている。 多くのタンパク質がそれらの活性に翻訳後修飾を必要とすることが当該技術分 野で既知である。こうした翻訳後修飾は、タンパク質のファルネシル化およびゲ ラニルゲラニル化を包含するかも知れない。酵素ファルネシルトランスフェラー ゼ（ＦＴアーゼ）がタンパク質のファルネシル化の原因であり（ライス(Reiss) ら、1990、Cell 62:81-88；ライス(Reiss)ら、1991、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 88:732-736；ムーアズ(Moores)ら、1991、J．Biol．Chem．266:14603-14610 ）、また、酵素ゲラニルゲラニルトランフェラーゼ（ＧＧＴアーゼ）がタンパク 質のゲラニルゲラニル化の原因である（ムーモー(Moomaw)ら、1992、J．Biol．C hem．267:17438-17443；ヨコヤマ(Yokoyama)ら、1991、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 88:5302-5306；ヨコヤマ(Yokoyama)ら、1993、J．Biol．Chem．268:4055- 4060）。 ＦＴアーゼのタンパク質基質は、全て、そのカルボキシル末端にＣＡＡＸ配列 を有する共通の特徴を共有し、ここでＸは最もしばしばメチオニン、セリン、シ ステイン、アラニンもしくはグルタミンである（ライス(Reiss)ら、1990、上記 ；ライス(Reiss)ら、1991、上記；ムーアズ(Moores)ら、1991、上記）。Ｘがロ イシンもしくはイソロイシンであるＣＡＡＸ配列で終わるタンパク質は、20個の 炭素のコレステロール生合 成中間体ゲラニルゲラニルピロホスフェートのそれへの付加により修飾されてよ く、これはＧＧＴアーゼを介してタンパク質に付加される（ムーモー(Moomaw)ら 、1992、上記；ヨコヤマ(Yokoyama)ら、1991、上記；ヨコヤマ(Yokoyama)ら、19 93、上記）。 既知の哺乳動物のｒａｓ遺伝子すなわちＨ、Ｎ、Ｋ_AおよびＫ_Bのそれぞれ（バ ルバシド(Barbacid)、1987、Ann．Rev．Biochem．56:779-827）は、ＣＡＡＸボ ックスの形態の翻訳後シグナルをカルボキシル末端に含有し、ここでＣはシステ インであり、Ａはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであり、そしてＸはメ チオニンもしくはセリンである（ハンコック(Hancock)ら、1989、Cell 57:1167- 1177；ハンコック(Hancock)ら、1990、Cell 63:133-139）。Ｈ−ｒａｓは独占的 にファルネシル化されるとは言え、最低１種の他のｒａｓタンパク質すなわちＫ_B −ｒａｓが、ファルネシル化およびゲラニルゲラニル化の双方をされ得る（ジ ェイムズ(James)ら、1995、J．Biol．Chem．270:6221-6226；ラーナー(Lerner) ら、1995、J．Biol．Chem．270:26770-26773；ラーナー(Lerner)ら、J．Biol．C hem．270:26802-26806）。 ｒａｓの翻訳後修飾は、ｒａｓのファルネシル化もしくはゲラニルゲラニル化 のいずれかの阻害剤を使用して阻害されうる（ギブス(Gibbs)ら、1994、Cell 77 :175-178；バス(Buss)ら、1995、Chem．Biol．2:787-791；ハミルトン(Hamilton )ら、1995、Drug News and Perspectives 8:138-145）。とりわけ、タンパク質 −タンパク質相互作用を混乱させるペプチドメティック(peptidometics)、最も 具体的には癌遺伝子のカルボキシル末端のＣＡＡＸ構造を模倣するものが、熱心 な検討の主題であった（ライス(Reiss)ら、1990、上記）。これらのペプチドは 、いくつか の癌遺伝子の翻訳後修飾を阻害することが既知であるか、もしくは予測される。 ヒトを包含する動物の癌の最も普遍的な治療は、腫瘍の外科的切除、腫瘍の照 射および化学療法剤の投与である。これらのアプローチに対する改良を提供する 強い必要性が存在し、とりわけ、癌患者における放射線および化学療法の有効性 を向上させる強い必要性が存在する。本発明はこの必要性を満足する。 発明の要約 本発明は、ｒａｓシグナリング経路に関与するタンパク質産物の最低１種の阻 害剤を細胞に投与し、それによりタンパク質産物の阻害が細胞に放射線感受性を 付与することを含んで成る、腫瘍細胞に放射線感受性を付与する方法に関する。 本発明はまた、腫瘍の細胞で発現されるタンパク質産物の最低１種の阻害剤を 動物に投与することを含んで成る、動物の腫瘍の成長を抑制する方法にも関し、 このタンパク質産物はｒａｓシグナリング経路に関与し、また、それによりこの タンパク質産物の阻害が細胞に放射線感受性を付与し、阻害剤は当該タンパク質 産物の阻害を遂げるのに十分な量で動物に投与され、そして動物が照射されて、 それにより動物の腫瘍の成長を抑制する。 腫瘍の細胞で発現されるタンパク質産物の最低１種の阻害剤を動物に投与する ことを含んで成る、動物から腫瘍を除去する方法もまた本発明に包含され、この タンパク質産物はｒａｓシグナリング経路に関与し、また、それによりこのタン パク質産物の阻害が細胞に放射線感受性を付与し、阻害剤は当該タンパク質産物 の阻害を達成するのに十分な量で動 物に投与され、そして動物が照射されて、それにより腫瘍を動物から除去する。 本発明は、さらに、そのタンパク質の活性にプレニル化を必要とするタンパク 質を発現し、かつそのタンパク質がｒａｓシグナリング経路に関与する細胞集団 を提供すること、試験化合物をその細胞に添加すること、細胞を照射すること、 そして照射に対する細胞の感受性のレベルを測定することを含んで成る、細胞集 団に放射線感受性を付与するプレニル化阻害剤を同定する方法に関し、試験化合 物を投与されなかった細胞の放射線感受性のレベルに比較して、試験化合物を投 与された細胞の放射線感受性のより高いレベルは、試験化合物がその細胞集団に 放射線感受性を付与することの指標となる。 本発明の一局面において、動物はヒトである。 本発明の別の局面において、タンパク質産物は癌遺伝子タンパク質産物である 。 一態様において、癌遺伝子タンパク質産物はｒａｓタンパク質であり、これは Ｈ−ｒａｓ、Ｋ_A−ｒａｓ、Ｋ_B−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓから成る群から選択さ れてよい。 さらに別の態様において、タンパク質産物は、ｒｈｏＡ、ｒｈｏＢ、ｒｈｏＣ およびＲＡＣ−１から成る群から選択される。 本発明の別の局面において、阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである か、もしくは、阻害剤はリボザイムである。 本発明の別の態様において、タンパク質産物は当該タンパク質のカルボキシル 末端に配列ＣＡＡＸを有し、式中、Ｃはシステインであり、Ａは脂肪族アミノ酸 すなわちバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであ り、そしてＸはメチオニン、セリン、システイン、アラニン、グルタミン、ロイ シンもしくはイソロイシンである。 本発明のさらに別の態様において、阻害剤は、ファルネシル化阻害剤であって もよいタンパク質プレニル化阻害剤であり、これは、好ましくは、ＦＴＩ−２７ ６およびＦＴＩ−２７７から成る群から選択される。加えて、ファルネシル化阻 害剤は、除去されるいずれかのスルフェート基をそれに有するＦＴＩ−２７６お よびＦＴＩ−２７７を含んでよい。 プレニル化阻害剤はまたゲラニルゲラニル化阻害剤であってもよく、これは、 好ましくは、ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２９８から成る群から選択され る。加えて、ゲラニルゲラニル化阻害剤は、除去されるいずれかのスルフェート 基をそれに有するＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２９８を含んでよい。 本発明のさらに別の局面において、腫瘍は、前立腺、肺、結腸、***、膵、子 宮頸部癌腫、子宮頸部肉腫、直腸、結腸、卵巣、膀胱、甲状腺、頭部および頸部 から成る群から選択されうる固形癌である。好ましくは、腫瘍は、肺、膵、結腸 および直腸から成る群から選択される。 図面の簡単な説明 図ＩＡはペプチドメテック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｔｉｃ）ファルネシルトラン スフェラーゼ阻害剤Ｌ−７３１，７３５、Ｂ５８１及びＬ−７３９，７５０の化 学構造を示す図面である。 図１Ｂはペプチドメテックファルネシル阻害剤Ｌ−７４４，８３２の化学構造 を示す図面である。 図２はペプチドメテックファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＦＴＩ−２０ ５、ＦＴＩ−２４９、ＦＴＩ−２５４、ＦＴＩ−２７６、Ｆ ＴＩ−２７７、Ｂ９５６、Ｂ１０８６、ＢＺＡ−２Ｂ及びＢＺＡ−５Ｂの化学構 造を示す図面である。 図３はペプチドメテックファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＦＴＩ−２６ ５、ＦＴＩ−２８１、ＦＴＩ−２８９及びＬ７４５，６３１の化学構造を示す図 面である。 図４はペプチドメテックファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＢＭＳ−１８ ５８７８、ＢＭＳ−１８４４６７及びＢＭＳ−１９３２６９の化学構造を示す図 面である。 図５は２つのファルネシルピロホスフェート類似体、ファルネシルトランスフ ェラーゼ阻害剤、２−ヒドロキシファルネシルホスホン酸及びファルネシルメチ ルヒドロキシホスフィニルメチルホスホン酸の化学構造を示す図面である。 図６は天然の生成物または化学ライブラリースクリーニングから得られた４つ のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の化学構造を示す図面である。これら の阻害剤はケトメリン酸（ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ）Ａ、ザラゴジ ン酸（Ｚａｒａｇｏｚｉｃ ａｃｉｄ）Ａ類似体、マヌマイシン（Ｍａｎｕｍｙ ｃｉｎ）及びＳＣＨ−４４３４２を含む。 図７はペプチドメテックゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩ阻害剤ＧＧＴ Ｉ−２７９、ＧＧＴＩ−２８０、ＧＧＴＩ−２８７、ＧＧＴＩ−２８６、ＧＧＴ Ｉ−２９７及びＧＧＴＩ−２９８の化学構造を示す図面である。 図８Ａはファルネシル化型から非ファルネシル化型へのｒａｓタンパ ク質の移動度の変化の時間経過を示すウェスタンブロットの像である。Ｈ−ｒａ ｓ ^V12 癌遺伝子でトランスフォームした５Ｒ細胞を５μＭ ＦＴＩ−２７７で処理 した。示される時間（時間）でサンプルを採取し、Ｈ−ｒａｓの検出のために抗 −Ｈ−ｒａｓ抗体を用いるウェスタンブロット分析のために細胞ライセートを調 製した。ゲルの上の方のバンドは非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓタンパク質に相当 する。Ｃはコントロール細胞を示す。 図８Ｂは細胞培養物からファルネシル化阻害剤を除いた後の非ファルネシル化 型からファルネシル化型へのｒａｓタンパク質の移動度の変化の時間経過を示す ウェスタンブロットの像である。Ｈ−ｒａｓ ^V12とｖ−ｍｙｃ癌遺伝子で同時に トランスフォームした３．７細胞を５μＭ ＦＴＩ−２７７で３０時間処理した 後に阻害剤を培地から除いた。除去後の示される時間（時間）でサンプルを採取 し、Ｈ−ｒａｓの検出のために抗−Ｈ−ｒａｓ抗体を用いるウェスタンブロット 分析のために細胞ライセートを調製した。 図８Ｃは示される濃度のＦＴＩ−２７７で２４時間処理した後の３．７、４Ｒ 、５Ｒ、ＭＲ４、ＲＥＦ及びＲＥＦ−ＧＧ細胞におけるｒａｓファルネシル化へ の阻害剤、ＦＴＩ−２７７の影響を示すウェスタンブロットの像である。対数増 殖期培養の細胞を示される投与量のＦＴＩ−２７７（μＭ）で処理した。２４時 間後にサンプルを採取し、ウェスタンブロット分析のために細胞ライセートを調 製した。Ｈ−ｒａｓ特異的抗体を用いてＭＲ４細胞以外の全ての細胞型のｒａｓ を検出し、ＭＲ４細胞では、これらの細胞における非常に低いレベルのＨ−ｒａ ｓ発現の ために全（ｐａｎ）ｒａｓ特異的抗体の結果が示される。 図９は阻害剤で２４時間処理した後の３．７、５Ｒ及びＭＲ４細胞におけるｒ ａｓファルネシル化への阻害剤、Ｌ−７４４，８３２の影響を示すウェスタンブ ロットの像である。対数増殖期培養の細胞を示される投与量の阻害剤（μＭ）で 処理した。２４時間後にサンプルを採取し、Ｈ−ｒａｓ特異的モノクローナル抗 体を用いてウェスタンブロッティングにより細胞ライセートを分析した。ＭＲ４ 細胞ブロットは３．７または５Ｒ細胞ブロットより２０倍長く感光させた。 図１０は示される濃度（μＭ）の阻害剤で２４時間処理した後の５Ｒ及びＲＥ Ｆ−ＧＧ細胞におけるｒａｓファルネシル化への阻害剤、ＧＧＴＩ−２８６の影 響を示すウェスタンブロットの像である。２４時間処理の後にサンプルを採取し 、Ｈ−ｒａｓ特異的モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングによ り細胞ライセートを分析した。Ｕ−Ｆ：非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓ；Ｕ−ＧＧ ：非ゲラニルゲラニル化ｒａｓ−ＧＧ。キメラのＨ−ｒａｓ^V12は示されるゲル でファルネシル化Ｈ−ｒａｓよりわずかに速く移動し、従って、ＲＥＦ−ＧＧか らの非プレニル化Ｈ−ｒａｓは５Ｒ細胞からのファルネシル化Ｈ−ｒａｓと共に 移動した。 図１１Ａは２．５μＭＦ ＴＩ−２７７（右）またはＤＭＳＯ（左）を含有す る培地中で４８時間培養した３．７細胞の像である。 図１１Ｂは５μＭ ＦＴＩ−２７７（右）またはＤＭＳＯ（左）を含有する培 地中で４８時間培養したＲＥＦ−ＧＧ細胞の像である。 図１２Ａは示される濃度のＦＴＩ−２７７での処理及び１０グレイで のＲＥＦ及び３．７細胞の放射線照射後のこれらの細胞のアポトーシスへの影響 を示すグラフである。ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）で細胞を染色 した後に核の形態の変化を評点することにより処理の２４時間後にアポトーシス を定量した。 図１２Ｂは示される濃度のＦＴＩ−２７７での処理及び１０グレイでの４Ｒ、 ５Ｒ及びＲＥＦ−ＧＧ細胞の放射線照射後のこれらの細胞のアポトーシスへの影 響を示すグラフである。ヨウ化プロピジウムで細胞を染色した後に核の形態の変 化を評点することにより処理の２４時間後にアポトーシスを定量した。 図１３Ａは示される濃度の阻害剤で２４時間処理した後の原発及び転移腫瘍由 来の培養細胞におけるｒａｓファルネシル化へのＦＴＩ−２７７の影響を示すウ ェスタンブロットの像である。Ｈ−ｒａｓ ^V12及びｍｙｃ癌遺伝子でトランスフ ォームしたマウス前立腺腫瘍細胞を示される投与量（μＭ）のＦＴＩ−２７７で 処理した。２４時間後に、抗−Ｈ−ｒａｓ抗体を用いるウェスタンブロット分析 のためにサンプルを採取した。上の方のバンド（矢印）は非ファルネシル化Ｈ− ｒａｓに相当する。Ｃはコントロールを示す。 図１３Ｂは前立腺腫瘍細胞の放射線誘導アポトーシスへの示される濃度（μＭ ）の阻害剤、ＦＴＩ−２７７の影響を示すグラフである。細胞をＦＴＩ−２７７ で２４時間処理した後に１０グレイで放射線照射した。ヨウ化プロピジウムで細 胞を染色した後に核の形態の変化を評点することにより照射の２４時間後にアポ トーシスを定量した。パネルＡは原発腫瘍から培養した前立腺腫瘍細胞を示す。 パネルＢは腫瘍由来の単離さ れた転移から培養した前立腺腫瘍細胞を示す。 図１４Ａは５Ｒ、３．７、ＭＲ４及びＲＥＦ細胞のＦＴＩ−２７７での処理及 び放射線照射後のこれらの細胞のクローン原性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）生存を 示す一連のグラフを含んでなる。放射線照射のすぐ前に、ＦＴＩ−２７７を２． ５μＭ（３．７細胞）または５μＭ（５Ｒ、ＭＲ４及びＲＥＦ細胞）の濃度で添 加した。２４時間後に阻害剤を培養培地から希釈し、１μＭ（３．７細胞）また は２μＭ（５Ｒ、ＭＲ４及びＲＥＦ）の阻害剤の最終濃度にした。ＭＲ４及び５ Ｒ細胞の平板効率はＦＴＩ−２７７での処理により影響を受けず、それぞれ１０ ０％及び３２−３８％であった。ＦＴＩ−２７７は３．７及びＲＥＦ細胞の平板 効率をそれぞれ７５％及び５％であった未処理のコントロール値を５０％下げた 。これらの結果はこの薬剤のいかなる毒性作用によるものでもない。示されるデ ータ点は少なくとも３枚の別々の皿の細胞から得られた結果の平均を表す。開い た記号は未処理の細胞で得られた結果を示し、閉じた記号はＦＴＩ−２７７で処 理した細胞で得られた結果のものである。３．７と記したパネルで、開いた三角 は未処理のＭＲ４細胞で得られた結果である。 図１４ＢはＧＧＴＩ−２９８での処理及び放射線照射後のＲＥＦ−ＧＧ細胞の クローン原性生存を示す２つのグラフを含んでなる。ＲＥＦ−ＧＧ細胞を８μＭ のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、ＧＧＴＩ−２９８の非存在下（ 上のパネル）または存在下（下のパネル）でマイクロタイタープレートでウェル 当たり１ないし５細胞で平板培養した。次に、細胞を２グレイで放射線照射する かまたは模擬照射した。２ ４時間後に阻害剤を含まない培地を細胞に再供給し、従って、阻害剤を０．８μ Ｍに希釈した。次に、これらの細胞を２週間インキュベートした後にコロニー形 成を評点した。データは陰性ウェルの割合の自然対数として示される。放射線照 射及び未照射細胞の分析の線形回帰により得られる傾きの差から２グレイの生存 割合を決定した。ＧＧＴＩ−２９８処理後に放射線照射した細胞に対して計算さ れる２グレイでの生存割合は０．６４であった。２グレイでのコントロール細胞 の生存割合は０．９１であった。線形回帰分析の相関係数（ｒ²）は全ての場合 において０．９５より大きかった。 図１４Ｃは転移性肺結節から培養したネズミ前立腺腫瘍細胞に対する５μＭ ＦＴＩ−２７７及び２グレイ放射線照射の影響を示す一連のグラフである。阻害 剤の濃度を０．５μＭに希釈するために放射線照射の２４時間後に細胞に（培地 を？）再供給した。生存細胞の割合を図１４Ｂに記述されるように決定した。線 形回帰分析の相関係数（ｒ²）は全ての場合において０．９５より大きかった。 図１５ＡはＦＴＩ−２７７処理後の初期ＲＥＦ細胞（丸）及び３．７細胞（四 角）の成長を示すグラフである。２ ｘ １０⁵の細胞を２．５μＭ（３．７細胞 ）または５μＭ（ＲＥＦ細胞）のＦＴＩ−２７７を含有する培地で平板培養した 。２４時間後に阻害剤の濃度が著しく下げられるように培地を希釈した。１日間 隔で複製皿から細胞を採取し、血球計算器を用いて数えて各培養物の全細胞数を 決定した。開いた記号：ＤＭＳＯ（薬剤担体）処理細胞；閉じた記号：ＦＴＩ− ２７７処理細胞。 図１５ＢはＦＴＩ−２７７での処理後のＭＲ４細胞（丸）及び５Ｒ細 胞（四角）の成長を示すグラフである。３ ｘ １０⁵の細胞を５μＭ ＦＴＩ−２ ７７を含有する培地で平板培養した。１日間隔で複製皿から細胞を採取し、血球 計算器を用いて数えて各培養物の全細胞数を決定した。開いた記号：ＤＭＳＯ（ 薬剤担体）処理細胞；閉じた記号：５μＭ ＦＴＩ−２７７処理細胞。 図１６ＡはＦＴＩ−２７７でヒト膀胱癌細胞を処理した後のＨ−ｒａｓ^V12の ファルネシル化の変化を示すウェスタンブロットの像である。Ｔ２４膀胱癌細胞 を５μＭのＦＴＩ−２７７で示される時間（時間）の間処理した。サンプルを採 取し、抗−Ｈ−ｒａｓ抗体を用いるウェスタンブロット分析のために細胞ライセ ートを調製した。０及び３０時間で採取した未処理のコントロールサンプルを比 較のために示す。 図１６ＢはヒトＴ２４膀胱癌細胞のＦＴＩ−２７７処理及び放射線照射後のコ ロニー形成を示すグラフである。細胞を５μＭのＦＴＩ−２７７で２４時間処理 し、採取し、ＤＭＳＯ（左のパネル）または５μＭ ＦＴＩ−２７７（右のパネ ル）を含有する培地で示される細胞密度で平板培養し、すぐに放射線照射した。 ２４時間後に阻害剤を含まない培地を細胞に再供給した。これにより培地中０． ５μＭの最終阻害剤濃度になった。これらの細胞を２週間成長させた後にコロニ ー形成を評点した。開いた四角：未照射細胞；閉じた丸：２グレイ放射線照射細 胞。細胞の生存割合を図１４Ｂの説明に記述したように計算した。線形回帰分析 の相関係数（ｒ²）は全ての場合において０．９５より大きかった。 図１７ＡはヒトＳＷ４８０大腸癌細胞におけるＫ−ｒａｓプレニル化のＦＴＩ −２７７による阻害を示すウェスタンブロットの像である。Ｓ Ｗ４８０細胞を示される濃度のＦＴＩ−２７７（μＭ）で４８時間処理した。サ ンプルを採取し、Ｈ−ｒａｓモノクローナル抗体（上）またはＫ−ｒａｓモノク ローナル抗体（下）のいずれかを用いてウェスタンブロッティングにより細胞ラ イセートを分析した。矢印は非ファルネシル化ｒａｓバンドを示す。 図１７ＢはＫ−ｒａｓプレニル化のＦＴＩ−２７７阻害後のＳＷ４８０大腸癌 細胞の放射線生存の減少を示すグラフである。ＳＷ４８０細胞を３０μＭ ＦＴ Ｉ−２７７で２４時間処理した後に放射線照射した。続いて、これらの細胞にお いてクローン原性生存を評価した。照射後に阻害剤での処理を２４時間継続し、 その時点で阻害剤を含まない培地で培地を置き換えた。コントロール細胞を希釈 剤で上記のように処理した。開いた四角エコントロール細胞；閉じた四角：ＦＴ Ｉ−２７７処理細胞。 図１８ＡはＦＴＩ−２７７及びＧＧＴＩ−２９８併用処理によるＫ−ｒａｓプ レニル化の特異的阻害を示すウェスタンブロットの像である。ヒト膵臓癌細胞（ Ｐａｎｃ−１）及び大腸癌細胞（ＳＷ４８０）の対数増殖期培養物を５μＭ Ｆ ＴＩ−２７７及び８μＭ ＧＧＴＩ−２９８で４８時間処理した。次に、細胞サ ンプルを採取し、Ｋ−ｒａｓ及び核ラミンＢに対するモノクローナル抗体を用い るウェスタンブロット分析のために細胞ライセートを調製した。ＳＷ４８０のＫ −ｒａｓ突然変異体の電気泳動の移動はＰａｎｃ−１細胞の突然変異体Ｋ−ｒａ ｓのものより遅い。 図１８ＢはＦＴＩ−２７７及びＧＧＴＩ−２９８によるＫ−ｒａｓプレニル化 の阻害後のＳＷ４８０細胞の放射線生存の減少を示すグラフで ある。ＳＷ４８０細胞を５μＭ ＦＴＩ−２７７及び８μＭ ＧＧＴＩ−２９８で ２４時間処理した後に放射線照射し、クローニ原性生存を評価した。照射後に阻 害剤処理を２４時間継続し、その時点で阻害剤を含まない培地で培地を置き換え た。コントロール細胞を薬剤を含まない等量の希釈剤で上記のように処理した。 開いた四角：コントロール細胞；閉じた四角：ＦＴＩ及びＧＧＴＩ処理細胞。 図１８ＣはＦＴＩ−２７７及びＧＧＴＩ−２９８で処理したＡ５４９ヒト肺癌 細胞のコロニー形成を示すグラフである。５μＭ ＦＴＩ−２７７及び８μＭ Ｇ ＧＴＩ−２９８の存在下（パネルＢ）または非存在下（パネルＡ）で９６ウェル マイクロタイタープレートでウェル当たり示される細胞数で細胞を平板培養した 。次に、細胞を２グレイで放射線照射するか（閉じた記号）または模擬照射した （開いた記号）。照射の２４時間後に阻害剤を含まない培地を培養物に供給し、 培養物中阻害剤を１０倍希釈した。細胞のコロニーを３週間の成長の後に評点し た。細胞の生存割合を図１４Ｂの説明に記述されるように計算した。線形回帰分 析の相関係数（ｒ²）は全ての場合において０．９５より大きかった。 図１９Ａはヌードマウスで成長させたトランスフォームしたラット胚繊維芽細 胞腫瘍組織におけるＨ−ｒａｓの検出を示すウェスタンブロットの像である。以 下のような各種細胞から得られたライセートで抗−Ｈ−ｒａｓモノクローナル抗 体を用いたウェスタンブロッティングによりＲａｓ発現を分析した。レーン１： 組織培養で成長させた５Ｒ細胞。レーン２：ヌードマウスで腫瘍として成長させ た５Ｒ細胞。レーン３：陰性コントロールとして使える正常マウス肝臓組織。５ ０μｇのタンパク 質を各レーンに添加した。分子量標準の移動を左側に示す（ｋＤａ）。 図１９Ｂはヌードマウスで成長させたヒト腫瘍における変化したＨ−ｒａｓの 移動を示すウェスタンブロットの像である。ヌードマウスで成長させたヒト大腸 腺癌、ＳＷ４８０及びＬｏＶｏのライセートの抗−Ｈ−ｒａｓモノクローナル抗 体を用いたウェスタンブロット分析によりＨ−ｒａｓの発現を検出した。ビヒク ル（ＤＭＳＯ）処理したマウス（レーン１）及び５０ｍｇ／ｋｇのＦＴＩ−２７ ７の腹腔内注射で２回処理したマウス（レーン２及び３）から処理を開始して１ ８時間後に切り出した腫瘍からライセートを得た。レーン１及び２：ＳＷ４８０ 、レーン３：ＬｏＶｏ。矢印は非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓの移動を示す。 発明の詳細な説明 選択された癌遺伝子の機能を阻害する化合物が細胞を放射線および化学療法に 対しより影響を受けやすくすることが、本発明において発見された。とりわけ、 選択された癌遺伝子の翻訳後修飾を阻害する化合物が細胞を放射線および化学療 法に対しより影響を受けやすくすることが発見されている。 かように、本発明は腫瘍細胞を殺す方法を提供し、細胞は、慣習的な放射線も しくは化学療法と共同して癌遺伝子の阻害剤を投与される。癌遺伝子の翻訳後(p osttranslation)の阻害剤は候補の抗腫瘍剤であり、かつ、慣習的な放射線もし くは化学療法は既知の抗癌治療である一方、放射線治療と共同しての腫瘍細胞へ の癌遺伝子の阻害剤の投与は、放射線単独での細胞の治療と比較される場合に、 細胞の死を遂げることにおいて優れていることが、本発明において発見されてい る。本明細書に提示される理由から、本発明はまた、腫瘍細胞を殺す化学療法に も応用可 能である。 本発明の方法は、かように、動物での腫瘍の成長の抑制もしくは腫瘍の除去（ すなわち阻止）を達成するのに有用である。さらに、動物の腫瘍の成長を抑制も しくは腫瘍を除去するために、これまで可能であったより少ない放射線および／ もしくは化学療法が動物を治療するのに必要とされることができ、これにより治 療を受けている動物により経験される有害な副作用のレベルを低下させる。 本明細書で使用されるところの「腫瘍の成長の抑制」もしくは「腫瘍の成長を 抑制すること」という用語により、腫瘍の成長速度もしくは大きさが阻害剤を投 与されていない腫瘍の成長速度もしくは大きさと比較される場合に、腫瘍が放射 線もしくは化学療法と組み合わせられた本発明の阻害剤を投与されている場合の 腫瘍の成長速度の低下もしくは腫瘍の全体の大きさの減少を意味する。 本明細書で使用されるところの「腫瘍の除去」もしくは「腫瘍の阻止」という 用語により、動物の腫瘍の存在が、本発明の時点で当該技術分野で既知の通常の 腫瘍検出技術を使用して検出され得ないことを意味する。 本発明の方法は、かように、急性の癌治療のこれまで未知の手段を提供し、動 物の標的腫瘍細胞は阻害剤の投与により感作され、そしてその後、放射線もしく は化学療法のいずれかにより殺される。 本発明において有用である阻害剤は、細胞中の癌遺伝子タンパク質の機能を阻 害するものであり、この癌遺伝子タンパク質は細胞の放射線および／もしくは化 学療法の耐性の原因である。 阻害剤の型は、主題の癌遺伝子のｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌク レオチドを包含するがしかしこれらに制限されない、癌遺伝子 タンパク質の産生を阻害するものを包含する。抗癌遺伝子リボザイムもまた、癌 遺伝子タンパク質産生の阻害剤として本発明に包含される。 本発明の好ましい癌遺伝子タンパク質阻害剤は、癌遺伝子タンパク質のプレニ ル化（ファルネシル化もしくはゲラニルゲラニル化）を包含する翻訳後修飾を阻 害する阻害剤である。しかしながら、ｒａｓ活性の阻害の標的としてのｒａｓの プレニル化に加え（ｒａｓファミリーの構成員は好ましい癌遺伝子である）、ｒ ａｓのファルネシル化の後に発生するパルミトイル化もまた、ｒａｓ活性の阻害 の標的として使用されてよい（ゲルプ(Gelb)、1997、Science 275:1750-1751） 。 アンチセンスのアプローチを使用するタンパク質機能の阻害は公知であり、か つ、タンパク質機能の調節の技術分野で容認される。アンチセンスオリゴヌクレ オチドは、細胞に進入すること、およびそれらが向けられる標的遺伝子の発現の 調節で有効であることが既知である（ヴァグナー(Wagner)、1994、Nature 372:3 33-335）。実際のところ、少なくとも一例において、ヒトへのアンチセンスオリ ゴヌクレオチドの投与がサイトメガロウイルス関連網膜炎に対し立証された有効 性をもたらしている（Antiviral Agents Bulletin 5:161-163、1992;Bio World Today）1993年12月20日）。かように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含ん で成る製薬学的組成物は、当業者により、ヒトで安全かつ有効の双方であるとみ なされる（コーエン(Cohen)ら、1994年12月、Scientific American、pp.76）。 ｒａｓ機能のアンチセンス阻害剤は、好ましくは、その阻害剤が向けられる特 異的ｒａｓタンパク質を条件として指定する(specifying)ｍＲＮＡの５’部分に 向けられるオリゴヌクレオチドを包含する。ｒａｓ癌 遺伝子のヌクレオチド配列は既知であるため、ｒａｓのｍＲＮＡの５’部分に特 異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発は、十分にアンチセンス技 術の当業者の熟練内にある。アンチｒａｓオリゴヌクレオチドはまた、またアン チセンス技術の当業者に利用可能であるプロトコールを使用して、それとともに それが細胞などに進入するその安定性を高めかつその有効性を高めるよう修飾さ れてもよい。 同様に、ｒａｓに向けられるリボザイムは当該技術分野で既知であり、そして 、従って、腫瘍細胞に放射線および／もしくは化学療法の感受性を付与する阻害 剤として有用である（バリナガ(Barinaga)、1993、Science 262:1512-1514；パ イル(Pyle)、1993、Science、261:709-714；キジマ(Kijima)ら、1995、Pharmac ．Ther．68:247-267）。 本明細書で使用されるところの「タンパク質産物の阻害」という用語は、主題 のタンパク質の活性の阻害を意味する。例えば、タンパク質が酵素である場合、 このタンパク質の活性の阻害は酵素活性の阻害を意味する。この用語はタンパク 質産物の活性の完全な阻害を意味すると解釈されるべきでない。むしろ、この用 語は、タンパク質産物の活性のレベルが、タンパク質産物の阻害剤の存在下に、 阻害剤の非存在下でのタンパク質産物の活性のレベルに比較して、部分的にもし くは完全にのいずれかで低下されることを意味すると解釈されるべきである。 それが阻害剤を指す際に本明細書で使用されるところの「タンパク質産物の阻 害を達成するのに十分な量で」という用語により、本明細書で定義されるような タンパク質産物の活性を阻害する阻害剤の濃度が意味される。 好ましくは、本発明の方法において有用である翻訳後修飾阻害剤は、 癌遺伝子タンパク質のファルネシル化もしくはゲラニルゲラニル化を阻害するも のである。かように、本発明の方法は、より具体的には、ＦＴアーゼもしくはＧ ＧＴアーゼの阻害剤、または双方の酵素の阻害剤を包含する。タンパク質のファ ルネシル化およびゲラニルゲラニル化は、集合的にプレニル化として知られる。 ＦＴアーゼおよびＧＧＴアーゼは、癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化を触媒 する酵素であり、かように、本発明の方法において最も有用である阻害剤は、本 明細書で「プレニル化阻害剤」と称される。 主題の癌遺伝子タンパク質産物のいかなる阻害剤も放射線および／もしくは化 学療法に対する腫瘍細胞の感作に有用でありうる一方、一例すなわち癌遺伝子タ ンパク質プレニル化阻害剤としての用途に従う論考は、本発明の方法は単にこれ らの型の阻害剤に制限されると解釈されるべきでないことが理解される。 本発明に従えば、癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化阻害は細胞を放射線に 対して感作し、それにより細胞の死を遂げることにおける放射線の有効性を高め る。癌遺伝子タンパク質のプレニル化阻害が放射線に対し細胞を感作する機構は 未知である。いかなる理論によっても拘束されることを望まない一方、ｒａｓの ような癌遺伝子タンパク質の翻訳後修飾が阻害される細胞の高められた放射線感 受性は、細胞周期に対する阻害の影響(affect)の結果であることが考えられる。 例えば、ｒａｓもしくはｍｙｃタンパク質の場合において、これらのタンパク質 のいずれかが細胞中で活性化される場合、細胞は、これらのタンパク質のいずれ かが活性化されていない細胞によりＧ２で費やされる時間に比較してより長い時 間、細胞周期のＧ２期に留まる（マッケンナ(McKenna)ら、199 1、Radiat．Res．125:283-287）。Ｇ２に留まる細胞はＤＮＡを複製せず；従っ て、これらの細胞は放射線治療に対しより耐性である。なぜなら、放射線治療は 、その効果に関して細胞中の進行中のＤＮＡ複製に頼るからである。ｒａｓもし くはｍｙｃの阻害は、細胞周期のＧ２期から細胞が出ること(egress)を促進し、 それにより細胞でのＤＮＡ複製を助し、これはその後細胞に放射線感受性を付与 する。 本発明の方法は、従って、細胞中の癌遺伝子の活性化を阻害するいずれかのお よび全てのタンパク質プレニル化阻害剤の使用を包含すると解釈されるべきであ り、この癌遺伝子は、活性化される場合に、その癌遺伝子が活性化されていない 細胞でのものより長い時間、細胞を細胞周期のＧ２期に留まらせる。 細胞中の癌遺伝子のプレニル化阻害が、細胞を細胞周期のＧ２期を出させ、そ してついにはＤＮＡ複製を再開させることを考えれば、本発明の方法は、化学療 法がその効果に関して細胞のＤＮＡ複製に頼る場合に、腫瘍細胞死を高める手段 としての化学療法の使用を包含するともまた解釈されるべきである。 ここで使用されるところの「プレニル化阻害剤」もしくは「プレニル化の阻害 剤」という用語は、イソプレノイド部分のタンパク質への付着(attachment)を阻 害する化合物を意味する。 本明細書で使用されるところの「イソプレノイド部分」は、ファルネシルもし くはゲラニルゲラニル部分を意味すると解釈されるべきである。 本明細書で使用されるところの「ファルネシル化阻害剤」という用語は、ファ ルネシル部分のタンパク質への付着を阻害する化合物を意味する。 本明細書で使用されるところの「ゲラニルゲラニル化阻害剤」という用語は、 ゲラニルゲラニル部分のタンパク質への付着を阻害する化合物を意味する。 本明細書で論考されるように、本発明において有用であるタンパク質プレニル 化の阻害剤はＦＴアーゼおよびＧＧＴアーゼの阻害剤を包含し、ＦＴアーゼおよ びＧＧＴアーゼ双方は、ファルネシルもしくはゲラニルゲラニル部分を癌遺伝子 タンパク質のカルボキシル末端のアミノ酸配列ＣＡＡＸに転移するよう機能し、 式中、Ｃはシステインであり、Ａは脂肪族アミノ酸すなわちバリン、ロイシンも しくはイソロイシンであり、また、Ｘは、ＣＡＡＸがＦＴアーゼの基質である場 合はメチオニン、セリン、システイン、アラニンもしくはグルタミンであり、そ してＣＡＡＸがＧＧＴアーゼの基質である場合はＸはロイシンもしくはイソロイ シンである。 かように、本発明の方法の一態様は、テトラペプチドＣＡＡＸもしくはその類 似物を含んで成るペプチドメティックの使用を包含する。ＣＡＡＸは、対応する 完全長タンパク質と同じくらい効率的にＦＴアーゼによりファルネシル化されう ることが既知である。さらに、ＣＡＡＸはＦＴアーゼの強力な競争阻害剤である ことが既知である（ライス(Reiss)ら、1990、上記）。 ＣＡＡＸペプチドの修飾は本発明の方法において有用であるが、しかし、こう した修飾は、本明細書で提供される実験的実施例で記述されるプレニル化アッセ イで癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化を阻害するペプチドを生じさせる。例 えば、保存的アミノ酸変化がこのペプチドでなされてもよいが、これは、それら がこのタンパク質もしくはペプチド の一次配列を変えるとは言え、通常はその機能を変えない。保存的アミノ酸置換 は、典型的には、以下の群内の置換を包含する。すなわち グリシン、アラニン； バリン、ィソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アルパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン； リシン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン。 （通常は一次配列を変えない）修飾は、インビボもしくはインビトロのポリペプ チドの化学的誘導体化、例えばアセチル化もしくはカルボキシル化を包含する。 グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセシングの間、もしくはさら なるプロセシング段階でのポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾すること により；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシ ル化もしくは脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露することによりなされる ものもまた包含される。ホスホリル化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシ ン、ホスホセリンもしくはホスホスレオニンを有する配列もまた包含される。 タンパク質分解性分解に対するそれらの耐性を向上させるもしくは可溶性の特 性を至適化するように、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されているポリ ペプチドもまた包含される。こうしたポリペプチドの類似物は、天然に存在する Ｌ−アミノ酸以外、例えばＤ−アミノ酸もしくは天然に非存在の合成アミノ酸の 残基を含有するものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特 定の例示的方法のいずれか の産物に制限されない。 本明細書に記述されるテトラペプチドＣＡＡＸに加え、多様なアミノ酸長さを 有するペプチドもまた本発明に包含されるが、しかし、それらは、本明細書に提 示される実験の詳細に記述されるプレニル化アッセイで評価される際に細胞中の 癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化を阻害する。こうしたペプチドは、最低２ アミノ酸の長さを含んでよく、これらのアミノ酸は、そのプレニル化が阻害され ることになる主題の癌遺伝子タンパク質産物のカルボキシル末端由来である。こ うしたペプチドは、２アミノ酸より大きいアミノ酸長を含んでよく、すなわち、 これは長さが２アミノ酸と15アミノ酸との間である。当該ペプチドは、長さが３ と11アミノ酸との間、長さが４と10アミノ酸との間、もしくは約５と９アミノ酸 との間の長さを含んでよい。好ましくは、当該ペプチドは長さが約４アミノ酸で ある。 タンパク質分解性分解に対する耐性に関する当該ペプチドの安定性を高める、 および当該ペプチドが細胞により取り込まれる効率を高める、ＣＡＡＸテトラペ プチドの特異的修飾がなされてもよい。こうした修飾は、アミド結合が二級アミ ンに還元されているシュウドペプチドの合成；アミド窒素が炭素原子により置き 換えられているカルバペプチドの合成；およびα−炭素が窒素原子で置き換えら れているアザペプチドの合成を包含するが、しかしこれらに制限されない。いず れかのおよび全てのこうした修飾を有するペプチドが本発明の方法に包含される と解釈されるべきであるが、しかし、修飾されたペプチドは、本明細書で記述さ れるアッセイで癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化を阻害する。 修飾されたＣＡＡＸペプチドの例は、ＣＶＬＳ偽ペプチドであるペプ チドメティックＬ−７３１，７３５を包含するが、しかしこれに制限されない。 これでは最初の２個のペプチド結合が図１Ａに示されるように還元されている（ コール(Kohl)ら、1993、Science 260;1934-1937；グレアム(Graham)ら、1994、J ．Med．Chem．37:725-732）。同様に、また図１Ａに示されるＢ５８１と命名さ れた対応するＣＶＦＭシュウドペプチドが記述されている（ガルシア(Garcia)ら 、1993、J．Biol．Chem．268:18415-18418）。Ｌ−７３９，７５０と命名されか つまた図１Ａに示される別のペプチドメティックは、メチレンオキシ基がアミド 結合により置き換えられている修飾されたペプチド等配電子体(isostere)である 。この化合物およびＬ−７３９，７４９と命名されたそのメチルエステルは、イ ンビトロでＦＴアーゼの非常に強力な阻害剤である（コール(Koh１)ら、1995、J ．Cell．Biochem．22:145-150）。同様に、Ｂ５８１およびそのメチルエステル もまたＦＴアーゼを阻害する（ガルシア(Garcia)ら、1993、上記）。実験の詳細 の節において本明細書に記述されることができるように、図１Ｂに示され、かつ 図１Ａに示される化合物に構造が類似である別の化合物Ｌ−７４４，８３２もま た強力なＦＴアーゼ阻害剤である。 タンパク質のプレニル化を阻害することが可能であるテトラペプチドの修飾の ためのさらに別のアプローチを使用して、中央の２個の脂肪族アミノ酸が疎水性 ジペプチド模倣物(mimetic)により置き換えられてよい。これは、タンパク質分 解性分解に対する増大された耐性を有し、そしてまた高められた細胞取込み特性 を有するペプチドメティックをもたらす。一態様において、ＣＶＩＭ中のジペプ チド「ＶＩ」が、システインおよびメチオニンを分離する単純なジペプチド模倣 性３−アミノメチ ル安息香酸により置き換えられてよい。これはペプチドメティックＦＴＩ−２０ ５をもたらし（図２）、これは４個よりむしろ２個のアミノ酸を含有し、また、 ペプチドの性質のアミド結合を有しない（ナイガム(Nigam)ら、1993、J．Biol． Chem．268:20695-20698）。これらの構造的差異にもかかわらず、ＦＴＩ−２０ ５は強力なＦＴアーゼ阻害活性を保持する（ナイガム(Nigam)ら、1993、上記） 。この分子はその親テトラペプチドＣＶＩＭと同様に全細胞のｒａｓタンパク質 のファルネシル化を阻害する能力がないとは言え、系統的な誘導体化およびスペ ーサー４−アミノ安息香酸にシステインを連結するアミド結合の還元がＦＴＩ− ２４９を生じさせ、これは強力なＦＴアーゼ阻害剤である。さらに、マスキング された(masked)遊離カルボキシレートの陰電荷を含む、ＦＴＩ−２５４と命名さ れたＦＴＩ−２４９のメチルエステルもまたＦＴアーゼの阻害剤である（キアン (Qian)ら、1994、J．Biol．Chem．269:12410-12413；キアン(Qian)ら、1994、Bi oorg．Med．Chem．Lett．4:2579-2584）。 上述の化合物を生じさせるのに使用された戦略は、疎水性置換を必要とし、ま た、ＦＴアーゼのＣＶＩＭ結合部位内にジペプチド「ＶＩ」の嵩高い側鎖を補足 する疎水性ポケットが存在するという仮定に基づいていた。親ペプチドＣＶＩＭ およびそのペプチドメティックＦＴＩ−２４９の構造の比較は、より大きな結合 エネルギーが、スペーサーを修飾してＦＴアーゼ中の大きな疎水性「ＶＩ」結合 ポケットを完全にふさぐことによって得られうることをはっきりと示す。これは 、ＦＴＩ−２４９の芳香環に多様な置換基を配置することにより成し遂げられた 。４−アミノ安息香酸の２位の単純な芳香族置換は、ＦＴアーゼ活性の阻害の劇 的な向上をもたらした。図２に示されるペプチドメティックＦＴＩ−２７６およ びそのメチルエステルＦＴＩ−２７７はＦＴアーゼ活性を阻害した（ラーナー(L erner)ら、1995、J．Biol．Chem．270:26802-26806；ラーナー(Lerner)ら、1995 、J．Biol．Chem．26770-26773）。 プレニル化阻害剤を含んで成るペプチドメティックの産出のための類似の戦略 が使用されてもよく、ここで、ＣＡＡＸ分子の中央の２アミノ酸がベンジル置換 アルカンスペーサーにより置き換えられてよい（ハリントン(Harrington)ら、19 94、Bioorg．Med．Chem．Lett．4:2775-2780；ナガス(Nagasu)ら、1995、Cancer Res．55:5310-5314）。図２に示されるようなＢ９５６およびそのメチルエステ ルＢ１０８６を包含するこうしたペプチドメティックもまた、ＦＴアーゼを阻害 することが可能である（ナガス(Nagasu)ら、1995、上記）。 本発明の方法において有用なＣＡＡＸテトラペプチドの他の修飾は、ＣＡＡＸ の中央の２アミノ酸残基の３−アミノ−１−カルボキシルメチル−５−フェニル ベンゾジアゼピン−２−オンでの置換を包含する（ジェイムズ(James)ら、1993 、Science 60:1937-1942）。図２に示されるベンゾジアゼピンペプチドメティッ クＢＺＡ−２ＢおよびそのメチルエステルＢＺＡ−５Ｂは、優れたＦＴアーゼ阻 害活性を有する（ジェームズ(James)ら、1993、上記）。 図１および２に記述される化合物の重要な特徴は、ＧＧＴアーゼに比較してＦ Ｔアーゼの阻害に関するそれらの高特異性である。 記述されたペプチドメティックは、ある程度まではペプチドの特性を有する。 まさに記述された疎水性スペーサーの戦略は、真の非ペプチド性ペプチドメティ ックを得るために、メチオニン残基の置換を包含する よう拡大されてもよい。これは、還元されたシステインをトリペプチド「ＶＩＭ 」の模倣物４−アミノ−３−カルボキシビフェニルに連結することにより成し遂 げられる。図３に、ペプチドメティックＦＴＩ−２６５が示され、これは加水分 解可能な結合およびペプチド性の特徴をを含有しないが、それでもなおそれは強 力なＦＴアーゼ阻害活性を保持する（フォクト(Vogt)ら、1995、J．Biol．Chem ．270:660-664）。さらに、ＦＴＩ−２６５は、この化合物が、通常ＧＧＴアー ゼに対する特異性を指図する、メチオニン残基を欠くという事実にもかかわらず 、ＧＧＴアーゼに比較してＦＴアーゼに対し高度に特異性である（フォクト(Vog t)ら、1995、上記）。加えて、ビフェニル部分の第一フェニル環の２位の疎水性 置換はまた、増大された酵素結合親和性ももたらし（キアン(Qian)ら、1996、J ．Med．Chem．39:217-223）、また、この位置でのメトキシもしくはフェニル基 の置換（図３）は、ＦＴアーゼ阻害の能力を２ないし10倍増大させる。 ＣＡＡＸの「ＩＩＭ」トリペプチド末端がアリール置換ピペラジンにより置き 換えられている一連の非ペプチド性ペプチドメティックもまた、本発明の方法に おいて有用である（図３）。例えば、ペプチドメティックＬ−７４５，６３１は 全細胞のFTアーゼ活性を阻害する。興味深いことに、このペプチドメティックは 、遊離カルボキシレートの欠如を包含する大きな構造的差異にもかかわらず、Ｆ ＴアーゼへのＨ−Ｒａｓの結合に関して競争的である（ウィリアムズ(Williams) ら、1996、J．Med.Chem．39:1345-1348）。 ＣＡＡＸテトラペプチドおよびイソプレノイド、ファルネシルピロホスフェー ト双方の特徴を利用して、これらの特徴がＦＴアーゼ阻害剤の 設計に組み込まれてよい。この理論的根拠は、ある酵素はその遷移状態に関して 最高の親和性を有するという事実に基づく。トリペプチドＶＶＭがホスフィン酸 もしくはホスホン酸をそれぞれ含有するスペーサーによりファルネシル基に連結 されるいくつかの二基質類似物が生じられている。これらの分子は図４に示され る。これらの分子はＧＧＴアーゼに比較してＦＴアーゼに対し高度に選択性であ る（バイデ(Bhide)ら、1994、Bioorg．Med．Chem．Lett．4:2107-2112；マンネ( Manne)ら、1995、Oncogene 10:1763-1779；パテル(Patel)ら、1995、J．Med．Ch em．38:435-442）。 本発明の方法において有用であるいくつかの他のＦＴアーゼ阻害剤が合成され ている。例えば、Ａ₂がコンホメーション的に束縛されたアミノ酸、（Ｌ）−１ ，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソクニリンカルボン酸（Ｔｉｃ）により置 き換えられているＫＣＡ₁Ａ₂Ｘペプチドメティックが生じられている。この群の 化合物でのそれらの最も強力な化合物の１種がＫＣＶＴｉｃＭである（クレルク (Clerc)ら、1995、J．Bioorg.Med．Chem．Lett．5:1779-1784）。システインが イミダゾールのような非チオール含有誘導体によりうまく置き換えられているＢ ＭＳ−１９３２６９を包含するペプチドメティックの一族が生じられている。Ｂ ＭＳ−１９３２６９（図４）はＦＴアーゼの強力な阻害剤である（ハント(Hunt) ら、1996、J．Med．Chem．39:353-358）。さらに、ＦＴアーゼ活性を阻害する非 チオール含有化合物、ｂｚ−（０）Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ(ＰＤ−１５１６９ ）が製造されている（セボルト−レオポルド(Sebolt-Leopold)ら、1995、86th A nnual Meetings of the American Association for Cancer Research）カナダ・ トロント、要旨#2561）。 本明細書に記述されるペプチドメティックのそれぞれについて、「ＦＴアーゼ 阻害」という用語の使用は、別の方法で明快に言明されない限り、癌遺伝子プレ ニル化阻害を包含すると解釈されるべきである。 本明細書に記述されるペプチドメティックに加え、本発明の方法において有用 な他のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ファルネシルピロホスフェー ト（ＦＰＰ）類似物を包含する。ＦＰＰ類似物は、ＦＴアーゼの阻害剤として使 用される場合に２個の制限を有する。それらは、ピロホスフェートの存在により 高度に荷電された特徴を有し、また、さらに、ＦＴアーゼの阻害は、それにより 、スクアレンシンターゼのような酵素を利用する他のＦＰＰに及ぶことができ、 この拡大は本発明の方法において望ましくないことができる。しかしながら、こ れらの制限にもかかわらず、本発明の方法において有用であるいくつかの生物学 的に活性かつ選択的なＦＰＰ類似物が存在する。これらは、２−ヒドロキシファ ルネシルホスホン酸（ギブス(Gibbs)ら、1993、J．Biol．Chem.268:7617-7620） およびファルネシルメチルヒドロキシホスフィニルメチルリン酸を包含し、この 双方が図５に示される（コタパリ(Kothapalli)ら、1993、Lipids 28:969-973； コーエン(Cohen)ら、1995、Biochem.Pharm．49:839-845）。これらの化合物の双 方がＦＴアーゼを阻害する。α−ヒドロキシファルネシルホスホン酸もまたＨ− Ｒａｓのプロセシングを阻害する（ギブス(Gibbs)ら、1993、J．Biol．Chem．26 8:7616-7620）。 微生物、土壌もしくは植物から得られる天然の生成物ならびに合成化学物質の ライブラリーが、ＦＴアーゼ阻害の無作為スクリーニングのための構造の巨大な プールを提供する。これらのスクリーニングは、さら なる薬物開発のため伝統的な薬化学を使用して修飾されうる化学的化合物を得る 強力な手段を付与する。多様なスクリーニングから15個を越えるＦＴアーゼ阻害 剤が報告されている。これらの化合物のいくつかの構造が図６に示される。これ らの化合物のより詳述された論考は、サトラー(Sattler)ら（1996、Mol．Biol． Intelligence Unit Series）マルタ(Maruta)編、Ｒ．Ｇ．ランデス(R.G．Landes )、テキサス州オースチン）およびタマノイ(Tamanoi)（1993、Trends Biochem． Sci．18:349-353）に提示される。１個の特定の化合物ＳＣＨ−４４３４２が有 用な特性を保有する。この分子は、チオールもしくはカルボン酸基を含有しない ＦＴアーゼの非ペプチド性三環性阻害剤であり（図６）、それでもなおそれはｒ ａｓタンパク質のプレニル化の阻害に関してＦＴアーゼの競争的阻害剤である（ ビショップ(Bishop)ら、1995、J．Biol．Chem．270:30611-30618）。 ＧＧＴアーゼ、とりわけＧＧＴアーゼＩの活性を阻害する化合物もまた本発明 の方法に包含される。ＧＧＴアーゼＩは、配列ＣＡＡＸを有するペプチドのプレ ニル化が可能である一方、ＧＧＴアーゼIIはプレニル化の基質としてタンパク質 全体を必要とする。ＧＧＴアーゼＩの基質特異性はＦＴアーゼのものより厳しい 。しかしながら、本明細書に記述されるように、今や、ヒトの癌で最も頻繁に突 然変異されるｒａｓの形態であるＫ_B−ｒａｓがゲラニルゲラニル化されうるこ と、また、ＧＧＴアーゼＩ阻害剤ＧＧＴＩ−２８６が、Ｋ_B−ｒａｓ癌遺伝子で 形質転換されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞においてＫ_B−ｒａｓタンパク質のプロセシ ングを封鎖することが既知である（ジェイムズ(James)ら、1995、J．Biol．Chem ．270:6221-6226；ラーナー(Lerner)ら、1995、J．Biol．Chem. 270:26770-26773；ラーナー(Lerner)ら、1995、J．Biol．Chem．270:26802-2680 6）。 ＧＧＴＩ−２７９と命名されたＧＧＴアーゼＩペプチドメティック阻害剤が設 計されており（図６）、これは、還元されたシステインおよびロイシンが４−ア ミノ安息香酸スペーサーにより連結されたＣＶＬＬペプチドメティックである。 ＧＧＴＩ−２７９はＦＴアーゼの阻害を優先的に上回ってＧＧＴアーゼＩを阻害 した（カウフマン(Kauffman)ら、1995、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:10919- 10923）。化合物ＧＧＴＩ−２８７で示されるもののように（図７）スペーサー の疎水性が増大された場合に、ＧＧＴアーゼＩおよびＦＴアーゼの阻害の能力が 20倍増大された（ラーナー(Lerner)ら、1995、上記）。メチルエステル化合物Ｇ ＧＴＩ−２８６は、ＧＧＴアーゼＩの独占的基質ＲａｐｌＡの翻訳後プロセシン グの強力な阻害剤であり、かつ、Ｋ_B−ｒａｓのプロセシングもまた阻害したが 、しかしＲａｐｌＡに関して観察される阻害より小さな程度であった（ラーナー (Lerner)ら、1995、上記）。 ２−ナフチル４−アミノ安息香酸でのメチオニンへの還元されたシステインの 連結は、ＧＧＴＩ−２９７およびそのメチルエステルＧＧＴＩ−２９８（図７） をもたらし、これらはまたＧＧＴアーゼＩおよびＦＴアーゼの阻害剤でもある（ フォクト(Vogt)ら、1996、Oncogene、13:1991-1999；マクガイア(McGuire)ら、1 996、J．Biol．Chem．271:27402-27407）。ＧＧＴＩ−２９７は２個の興味深い 特性を有する。まず最初に、それはＧＧＴＩ−２８７より10倍より小さく強力で あるという事実にもかからわず、そのメチルエステルＧＧＴＩ−２９８は全細胞 のＲａｐｌＡのプロセシングの阻害に関してＧＧＴＩ−２８６と同じくらい強力 で ある。これは、より疎水性のスペーサー（２−ナフチル対２−フェニル）から生 じる高められた細胞取り込みによることができる。第二に、ＦＴアーゼを上回る ＧＧＴアーゼＩに対するＧＧＴＩ−２９７の選択性がインビトロでわずか５倍で あるとしても、そのメチルエステルＧＧＴＩ−２９８は、10μMの濃度で、Ｈ− ｒａｓのプロセシングに影響を及ぼすことなくＲａｐｌＡタンパク質のプロセシ ングを完全に阻害することが可能である。 要約すると、多様なＦＴアーゼおよびＧＧＴアーゼＩ阻害剤が当該技術分野で 既知であり、かつ、癌遺伝子タンパク質産物の翻訳後修飾を阻害することに加え て、これらの酵素の活性を阻害することが可能である。本発明の方法は、従って 、癌遺伝子タンパク質のプレニル化を阻害しかつ細胞を放射線もしくは化学療法 のいずれかに対しより感受性とするまたは細胞を放射線および化学療法双方に対 しより感受性とする、いずれかのおよび全てのＦＴアーゼおよびＧＧＴアーゼＩ の阻害剤を包含すると解釈されるべきである。 本明細書に提供される実験の詳細の節で、より詳細に記述されることができる ように、癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化の阻害は、細胞の増大された放射 線感受性をもたらす。本明細書で論考されるように、癌遺伝子タンパク質産物の プレニル化の阻害は、化学療法剤がそれが細胞を殺すことを遂げる手段として細 胞のＤＮＡ複製に頼る場合に、化学療法剤に対する増大された感受性もまた細胞 に与えうる。 本発明の方法は、実験の詳細の節に例示される特定の癌遺伝子すなわちＨ−ｒ ａｓもしくはＫ−ｒａｓ癌遺伝子に制限されると解釈されるべきでない。むしろ 、本発明は、癌遺伝子のタンパク質産物が阻害される 場合に腫瘍細胞が放射線および／もしくは化学療法に対しより感受性となる、い ずれかのおよび全てのｒａｓ癌遺伝子を包含すると解釈されるべきである。かよ うに、本発明の方法において好ましい癌遺伝子は、ｒａｓシグナル発生経路に関 与するものである。 本発明はまた、単に癌遺伝子それ自体に制限されると解釈されるべきでない。 ｒａｓシグナル発生経路に参与する他のタンパク質産物もまた、阻害、好ましく はタンパク質プレニル化の阻害の標的として本発明に包含されるが、しかし、こ れらの他のタンパク質の機能の阻害は放射線および／もしくは化学療法に対する 細胞の高められた感受性をもたらす。 本明細書で使用されるところの「ｒａｓシグナル発生経路への参与」という用 語により、ｒａｓシグナル発生経路の不可欠の構成要素であるタンパク質が意味 される。 とりわけ、プレニル化阻害剤に関して、本発明の方法において有用である癌遺 伝子タンパク質産物および他のタンパク質は、カルボキシル末端にＣＡＡＸ配列 を有し、かつそのプレニル化の阻害が放射線および／もしくは化学療法に対する 細胞の増大された感受性をもたらすタンパク質を包含する。本発明において有用 である癌遺伝子は、Ｈ、Ｋ_A、Ｋ_BおよびＮ−ｒａｓのようなｒａｓタンパク質の それぞれを包含するが、しかしこれらに制限されない。加えて、本明細書に示さ れるように、本発明は、細胞の放射線耐性につながるｒａｓシグナル発生経路に 参与する他のタンパク質を包含すると解釈されるべきである。これらのタンパク 質は、ｒｈｏＡ、ｒｈｏＢ、ｒｈｏＣおよびＲＡＣ−１を包含するがこれらに制 限されず、このそれぞれがプレニル化される。 腫瘍細胞は、例えばウエスタンブロッティングを包含するいずれかの 数の免疫化学的技術を使用して、所望の癌遺伝子タンパク質産物の存在について 試験されてよい。腫瘍細胞は、またウエスタンブロッティングを使用して、プレ ニル化された形態の癌遺伝子タンパク質の存在についてさらに試験されてよい。 腫瘍が、プレニル化される癌遺伝子タンパク質産物を発現する細胞を含有するこ とが既知になる場合は、その腫瘍中の細胞は、その細胞に放射線および／もしく は化学療法の感受性を付与するためのプレニル化阻害剤の使用の候補の標的細胞 である。 特定の化合物の特性に関して本明細書で使用されるところの「細胞に放射線感 受性を付与すること」という用語により、細胞が、その化合物の非存在下よりそ の化合物の存在下で放射線の影響に対しより感受性にされることが意味される。 癌遺伝子およびプレニル化阻害剤のどの組み合わせが細胞に放射線および／も しくは化学療法の感受性を付与するかを決定するため、以下の手順が使用されて よい。癌遺伝子および既知もしくは推定の阻害剤のある組み合わせが、（ｉ）癌 遺伝子タンパク質産物のプレニル化を阻害する能力、ならびに（ii）細胞の放射 線および／もしくは化学療法の感受性を増大させる能力について試験されうる。 こうした試験の詳細は、本明細書の実験の詳細の節に記述される。 本質的に、適する細胞集団は、癌遺伝子を含んで成るＤＮＡでトランスフェク ションされる。プレニル化阻害剤は、ＤＮＡに付随して細胞に添加されるか、ま たはＤＮＡの添加の前もしくは後のいずれかに細胞に添加されるかのいずれかで ある。主題の癌遺伝子のプレニル化、もしくはその欠如が、ウエスタンブロッテ ィングなどのような免疫化学的手段により評価されてよい。放射線治療に対する 細胞の感受性は、実験の詳 細の節に記述されるように、アポトーシスアッセイ、細胞生存アッセイなどで評 価されてよい。化学療法に対する細胞の感受性は、細胞の放射線感受性の評価に 使用されるものに類似の方法論を使用して評価されてよい。加えて、化学療法に 対する細胞の感受性は、カーマイケル(Carmichael)ら（1987、Cancer Res．47:9 36-942）に記述されるプロトコールのいずれかを使用して評価されてよい。 そのタンパク質産物がプレニル化阻害剤により操作されうる癌遺伝子の同定は 、プレニル化阻害剤が有効であることができる腫瘍の型の発見に重要である。プ レニル化阻害剤を投与されかつ癌遺伝子タンパク質産物のプレニル化が阻害され る、癌遺伝子でトランスフェクションされた細胞を、その後、放射線および化学 療法に対するそれらの相対的感受性について試験し、そしてその結果を、トラン スフェクションされていないかもしくはプレニル化阻害剤を投与されていないか のいずれかである同様に処理された細胞で得られるものと比較する。この様式に おいて、それらが特定の癌遺伝子を発現するため、放射線および／もしくは化学 療法に対するそれらの感受性を増大させるための適切なプレニル化阻害剤での処 理に適する候補である細胞が同定されうる。 本発明の方法は、細胞に放射線感受性を付与する手段としての単一のタンパク 質産物阻害剤の使用に制限されない。むしろ、本発明の方法は、細胞に放射線感 受性を付与する手段としての１個もしくはそれ以上のタンパク質産物阻害剤の使 用を包含してよい。この目的上使用されてよい阻害剤の組み合わせの型は、本明 細書に記述される手順およびアッセイを使用して同定されうる。 本明細書に提示されるデータから明らかであることができるように、 本発明の方法は、前立腺、肺、結腸、***、膵の腫瘍、子宮頸部の癌腫もしくは 肉腫、直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膀胱および甲状腺の腫瘍ならびに頭部および頸部の 腫瘍のような固形癌を包含するがしかしこれらに制限されない、いくつかの異な る型の動物の腫瘍に応用可能である。本発明の方法を使用して最も好ましく治療 される腫瘍は、膵、肺の腫瘍および結腸直腸腫瘍を包含する。 ｒａｓタンパク質阻害剤を投与される動物は、阻害剤の投与とともに照射され るかもしくは化学療法を投与されるかのいずれかである。腫瘍をもつ動物への放 射線もしくは化学療法のいずれかの投与に使用されるべき正確なプロトコールは 、動物の齢および治療されるべき腫瘍の型を包含するいずれかの数の因子に依存 することができることが真価をみとめられることができる。しかしながら、腫瘍 の治療の当業者は、本発明、患者の腫瘍の状態および患者の年齢などを所有すれ ば、使用されるべき正確なプロトコールを知ることができることもまた真価をみ とめられることができる。 動物を照射する場合、一般に、動物の皮膚の損傷を最小限にしかつ動物での腫 瘍の成長に対する放射線の効果を最大限にするために、放射線の複数の線量(dos e)が一定時間にわたって動物に投与される。複数線量型の放射線のプロトコール に関与する理論的根拠および方法は、ホール(Hall)（1994、Radiobiology for t he Radiologist;Time，Dose and Fractionation in Radiotherapy，pp212-229、 Ｊ．Ｂ リッピンコット カンパニー(J.B Lippincott Company)、ペンシルバニ ア州フィラデルフィア）に記述され、また、本発明で使用されてよい。 腫瘍をもつ動物への化学療法の投与のプロトコールもまた、ホール (Hall)（1994、Radiobiology for the Radiologist;Chemotherapeutic Agents f rom the Perspective of the Radiation Biologist，pp.289、Ｊ．Ｂ リッピン コット カンパニー(J.B Lippincott Company)・ペンシルバニア州フィラデルフ ィア）に記述され、この方法は本発明の方法に包含されうる。加えて、化学療法 の目標を例えば抗体標的化(antibody tagging)などにより動物の特定の腫瘍部位 に設定することが好ましい場合は、化学療法の目標設定のこうした方法はまた、 動物の腫瘍の成長の抑制もしくは排除を遂げる本発明の方法内に包含されると解 釈されるべきである。 特定の腫瘍の型の場合には、照射のプロトコールは治療される腫瘍の特定の型 に適合するよう変えられてよい。例えば、結腸直腸腫瘍を有する動物の照射およ び化学療法のプロトコールがモヒウディン(Mohiuddin)ら（1991、Seminars，Onc ology 18:411-419）に記述される。肉腫を有する動物の照射および化学療法のプ ロトコールはデラニー(Delaney)ら（1991、Oncology 5:105-118）に記述される 。後者の例においては、放射線は肉腫に好ましい治療であることが言及されるべ きである。***腫瘍を有する動物の照射および化学療法のプロトコールは、マン スフィールド(Mansfield)ら（1991、Seminars Oncology 18:525-535）およびレ ヴィット（Levitt)（1994、Cancer 74:1840-1846）に記述される。頭部もしくは 頸部の腫瘍を有する動物の照射および化学療法のプロトコールは、ハラリ(Harar i)ら（1995、Curr．Opin．in Oncol．7:248-254）に記述される。子宮頸部腫瘍 の治療のプロトコールは、ペレス(Perez)（1993、Oncology 7:89-96）に記述さ れ、また、前立腺腫瘍の治療のプロトコールは、ペレス(Perez)ら（1993、Cance r 72:3156-3173）に記述さ れる。 好ましくは、治療される動物はヒトである。 本発明において有用な、好ましいプレニル化阻害剤は、ＦＴＩ−２７６、ＦＴ Ｉ−２７７、ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２９８である。これらの阻害剤 は、それら阻害剤の生物学的半減期が延長されるようにそのスルフヒドリル基が 除去される場合に、本発明の方法においてより有用にさえされうる。これらの化 合物からのスルフヒドリル基の除去の方法は、プレニル化阻害剤の分野で働く熟 練した化学者に公知である。 プレニル化阻害剤が向けられる好ましい癌遺伝子はｒａｓタンパク質である。 癌遺伝子タンパク質プレニル化阻害剤の正確な投与経路および量、ならびに、 動物、好ましくはヒトに投与される阻害剤の投与頻度は、腫瘍の所在、動物の齢 および疾患の重篤度を包含するがしかしこれらに制限されないいずれかの数の因 子に依存することができる。正確な投与経路、投与頻度および投与される用量が こうした化合物の癌患者への投与の当業者に明らかであることができることが真 価をみとめられることができる。 一般に、プレニル化阻害剤は、伝統的様式（例えば、経口、非経口、経皮もし くは経粘膜）の１種で、生物分解性生物適合性ポリマーを使用する持続放出性製 剤で、もしくはミセル、ゲルおよびリポソームを使用する現場での送達により、 あるいは直腸（例えば坐剤もしくは浣腸剤により）または鼻（例えば鼻スプレー により）で動物に投与されてよい。適切な製薬学的に許容できる担体、塩溶液な どが当業者に明らかであることができ、また、主に投与経路に依存することがで きる。 企図される治療計画は、単一用量、あるいは時間に、日に、週にもしくは月に 、または年に投与される投薬量を包含する。投薬量は、１μgから1000mg/kg体重 の阻害剤まで変動してよく、また、その化合物の送達に適する形態であることが できる。 阻害剤の投与経路はまた、治療されるべき疾患に依存して変動してよい。本発 明は、動物の癌を治療する目的上、動物への阻害剤の投与を企図する。ヒトへの プレニル化阻害剤の投与の−プロトコールが、プレニル化阻害剤をヒトに投与す る方法の一例として提供される。このプロトコールは、使用され得る唯一のプロ トコールであると解釈されるべきでなく、しかし、むしろ、単にその一例として 解釈されるべきである。本発明を所有している場合に、他のプロトコールが当業 者に明らかとなることができる。本質的に、ヒトへの投与のためには、阻害剤は 約１mlの生理的食塩水に溶解され、そして、体重１kgあたり１μg、10μg、100 μgもしくは数ミリグラムさえの用量が、48時間間隔で静脈内に投与される。 プレニル化阻害剤を投与されている、腫瘍を有する動物は、その後、本明細書 に記述されるような動物の照射もしくは動物への化学療法の投与のプロトコール に従って、照射されるかもしくは化学療法を投与される。 本発明はまた、細胞集団に放射線もしくは化学療法の感受性を付与するプレニ ル化阻害剤を同定する方法も包含する。この方法は、ｒａｓシグナリング経路に 関与しかつその活性にプレニル化を必要とするタンパク質産物を発現する細胞集 団を提供することを含んで成る。試験化合物を、また照射されもしくは化学療法 剤で処理される細胞に添加する。照 射もしくは化学療法に対する細胞の感受性のレベルをその後評価する。試験化合 物を投与されなかった細胞の放射線もしくは化学療法の感受性のレベルと比較し た、試験化合物を投与された細胞の放射線もしくは化学療法に対する細胞の感受 性のより高いレベルは、試験化合物がその細胞集団に放射線もしくは化学療法の 感受性を付与することの指標となる。細胞の放射線および／もしくは化学療法の 感受性の評価は、本明細書の実験の詳細の節に記述される方法、およびカーマイ ケル(Carmichael)ら（1987、上記）に記述されるものを使用して成し遂げてよい 。例えば、放射線もしくは化学療法に対する細胞の感受性を、細胞集団のアポト ーシスの程度を測定することにより評価してよいか、または、単純な細胞生存ア ッセイを実施してよい。 本発明はさらに、以下の実験的実施例への言及により詳細に記述される。これ らの実施例は具体的な説明のみの目的上提供され、また、別の方法で明記されな い限り制限することを意図されない。かように、本発明は、決して、以下の実施 例に制限されると解釈されるべきでなく、しかし、むしろ、本明細書に提供され る教示の結果として明らかになるいずれかのおよび全ての変動を包含すると解釈 されるべきである。 実験の詳細 実施例１．プレニルトランスフェラーゼ阻害剤を用いた齧歯類細胞の放射線増感細胞 この研究に用いられる癌遺伝子トランスフェクト細胞は全て、ＥＪ膀胱癌から 単離されたＨ−ｒａｓ遺伝子を含有するｐＥＪプラスミドでのトランスフェクシ ョンにより初期継代ラット胚繊維芽細胞（ＲＥＦ）か ら得られた。このベクターを単独でかまたはｖ−ｍｙｃを含有するｐＭＣ２９ベ クターと共に初期ＲＥＦ中にリン酸カルシウムＤＮＡトランスファーにより導入 した。導入されたＨ−ｒａｓ遺伝子及びｖ−ｍｙｃ遺伝子の両方を含有する一つ のクローンは３．７である（ＭｃＫｅｎｎａ等、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．５０：９７−１０２）。４Ｒ及び５Ｒ細胞はｐＥＪプラスミドのみでのトラ ンスフェクション後の稀なトランスフォーマントとして得られた（ＭｃＫｅｎｎ ａ等、１９９３、上記）。ＭＲ４細胞はネオマイシン耐性選択マーカーに連結さ れたｖ−ｍｙｃを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクションにより不死 化された（ＭｃＫｅｎｎａ等、１９９１、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１２５：２８ ３−２８７）。ＲＥＦ−ＧＧ細胞はＣＡＡＸモチーフがＣＶＬＬであるキメラのＨ−ｒａｓ （ｖ１２）でＲＥＦ細胞をトランスフォームすることにより得られた 。全ての細胞系はマイコプラズマを含まなかった。放射線生存測定 対数増殖期培養物から得られる細胞を６０ｍｍ皿で平板培養し、４時間接着さ せた後にＦＴＩ−２７７を培地に添加した。次に、平板培養培地を取り除き、Ｄ ＭＳＯ中のＦＴＩ−２７７または（コントロールの皿には）ＤＭＳＯのみを含有 する新しい培地を添加し、すぐ後に放射線照射した。Ｍａｒｋ Ｉセシウム照射 機（ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ）（Ｊ．Ｓ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｓａｎ Ｆｅｒｎａ ｎｄｏ、ＣＡ）を用いて１分当たり１．７グレイの線量率で細胞を照射した。照 射の１０−１４日後に細胞のコロニーを染色し、数えた（ＭｃＫｅｎｎａ等、１ ９９０、上記）。与えられる線量での細胞の生存割合を として定義する。 生存曲線の各点は少なくとも３枚の皿の細胞からの平均の生存割合を表す。アポトーシス測定 ２４ウェルプレートで３ ｘ １０³細胞/ウェルを１２時間接着させ、次にＤＭ ＳＯ中にＦＴＩ−２７７を含有する培地または阻害剤を含まない等容量のＤＭＳ Ｏで処理した。上記の照射機を用いて１０グレイで照射した２４時間後に、接着 及び非接着細胞の両方を採取した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色した（Ｍｕ ｓｃｈｅｌ等、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５5：９９５−９９８）。各 サンプルに対して１００細胞の最低３つの独立した視野を数えた。二重ブライン ド方式でサンプルの評点を実施した。ウェスタンブロッティング １ ｘ還元レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプルバッファーを用いて培養皿で 細胞を溶解した。サンプルを煮沸し、剪断し、そして微量遠心機（ｍｉｃｒｏｆ ｕｇｅ）で１４，０００ｒｐｍでの遠心分離により清澄にした後−２０℃で保存 した。等量のタンパク質を含有するサンプルを１２％ＳＤＳポリアクリルアミド ゲルで分離し、ニトロセルロース膜へ電気泳動的に移した。膜を０．１％Ｔｗｅ ｅｎ−２０及び５％ドライミルクを含有するＰＢＳ中で１−２時間ブロックした 後に抗体を添加した。膜を０．５μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル全−ｒａｓ 抗体ＡＢ−４（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｎｉｏｎｄａｌｅ、 ＮＹ）またはモノクローナルＨ−ｒａｓ抗体ＬＡ０６９（１：５０００希釈：Ｑ ｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）で調べた。タンパク質の 検出をＥＣＬ化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉ ｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて実施した。Ａｒｃｕｓ Πスキャナーを用いて像をデ ジタル化し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ３．０を用いて図を組み立てた 。 次に、実施例１に示される実験の結果を記述する。Ｈ−ｒａｓでトランスフォームしたＲＥＦ細胞をＦＴＩ−２７７処理した後のＨ −ｒａｓのプレニル化の阻害 非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓの蓄積の時間経過を明らかにするために、Ｒ５細 胞系由来のトランスフォームしたＲＥＦ細胞を５μＭ ＦＴＩ−２７７で処理し た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでｒａｓのプレニル化型は非プレニル化ｒ ａｓより速く移動する（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ等、１９８９、ＥＭＢＯ Ｊ．８： １０９３−１０９８；Ｆａｒｈ等、１９９５、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ ｏｐｈｙｓ．１８：１１３−１２１）。この移動度の変化を用いてファルネシル トランスフェラーゼ阻害剤処理後のＨ−ｒａｓのプレニル化状態を評価した。 様々な時点でサンプルを採取し、抗−Ｈ−ｒａｓ抗体を用いてウェスタンブロ ット分析により存在するタンパク質を同定した（図８Ａ）。ＦＴＩ−２７７を細 胞に添加した４時間後までにＨ−ｒａｓのより遅い移動型への転化が見られた。 阻害剤の添加の６−８時間後までに、検出できるＨ−ｒａｓの約５０％が非ファ ルネシル化型であった。同じ結果が３．７ＲＥＦ細胞系を同様に処理した場合に 得られた。 ＦＴＩ−２７７阻害の可逆性も調べた。３．７ＲＥＦ細胞系由来の細 胞を５μＭ ＦＴＩ−２７７で３０時間処理した。次に阻害剤を取り除き、これ らの細胞におけるファルネシル化Ｈ−ｒａｓの再出現を調べた（図８Ｂ）。検出 できる量のファルネシル化Ｈ−ｒａｓが２時間までに見られ、６時間までにファ ルネシル化型である約５０％のＨ−ｒａｓに増加する。２4時間までに、細胞の Ｈ−ｒａｓの大部分がファルネシル化型であった。従って、非ファルネシル化Ｈ −ｒａｓの蓄積はＨ−ｒａｓでトランスフォームしたＲＥＦ細胞で迅速に起こり 、阻害剤の除去後２４時間以内に逆になる。 ＦＴＩ−２７７によるＨ−ｒａｓ^V12ファルネシル化の特異性阻害をｒａｓで トランスフォームしたＲＥＦ細胞のパネルに対するこの阻害剤の効果を比較する ことにより調べた。Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子でトランスフォームしたＲＥＦ細胞（３ ．７、４Ｒ及び５Ｒ）を様々な投与量のＦＴＩ−２７７（２．５ないし１０μＭ ）に２４時間さらすことにより、主にファルネシル化されていないＨ−ｒａｓタ ンパク質が生じた（図８Ｃ）。しかしながら、野生型ｃ−Ｈ−ｒａｓを発現する 細胞はこの阻害剤の影響を受けにくかった。トランスフォームされていないＲＥ Ｆの処理では、３０μＭまでの阻害剤の投与量で細胞を処理したにもかかわらず 大部分のＨ−ｒａｓがファルネシル化型のままであったが、より遅く移動する非 ファルネシル化型の検出可能なＨ−ｒａｓを生じた。ＭＲ４細胞（ｖ−ｍｙｃで 不死化したＲＥＦ）は非常に低いレベルのＨ−ｒａｓを発現すると思われ（これ らの細胞でｒａｓタンパク質は全−ｒａｓ抗体を用いてのみ検出可能であった） 、１０μＭまでのＦＴＩ−２７７の処理でｒａｓの移動度の何の変化も見られな かった。Ｈ−ｒａｓでトランスフォームしたＲＥＦ細胞を阻害剤、Ｌ−７４４， ８３２で処理した後のＨ− ｒａｓのプレニル化の阻害 構造が図１Ｂに示される別のファルネシル化阻害剤、Ｌ−７４４，８３２をｒ ａｓでトランスフォームしたＲＥＦ細胞においてｒａｓのファルネシル化を阻害 する能力に関して試験した。この阻害剤を用いて得られた結果は阻害剤ＦＴＩ− ２７７を用いて得られたものと同様であった（図９）。対数増殖期培養物の細胞 を各種投与量の阻害剤Ｌ−７４４，８３２で処理した。この阻害剤での２４時間 の処理は３．７及び５Ｒ細胞において０．５μＭないし５μＭの間の投与量で非 ファルネシル化型のＨ−ｒａｓの大部分の蓄積をもたらした。ＭＲ４細胞の内在 性Ｈ−ｒａｓは、用いた阻害剤の最も高い投与量でこのタンパク質のファルネシ ル化型がこれらの細胞において存続するのが見られるという点でファルネシル化 阻害を受けにくいと理解された。阻害剤ＧＧＴＩ−２８６を用いたゲラニルゲラニル化の阻害 プレニルトランスフェラーゼの特定のｒａｓタンパク質へのターゲッティング はｒａｓ及び他のプレニル化タンパク質のカルボキシル末端部分に見いだされる ＣＡＡＸ認識配列により主に決定される（Ｒｅｉｓｓ等、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：７３２−７３６）。Ｈ−ｒａｓの カルボキシル末端、ＣＶＬＳ内のシステインはファルネシルトランスフェラーゼ によるプレニル化の標的である。それに反して、ロイシンで終わるＣＡＡＸ配列 はファルネシルトランスフェラーゼに対して非常に減少した親和性を有し、その 代わりにＧＧＴａｓｅＩによりゲラニルゲラニル化される（Ｃｏｘ等、１９９２ 、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６０６−２６１５）。ＣＡＡＸモチー フとしてＣＶＬＬを有するキメラのＨ−ｒａｓ ^V12はＮＩＨ ３Ｔ ３細胞及びＲａｔ−１細胞をトランスフォームすることができる。また、この改 変されたＨ−ｒａｓはｖ−ｍｙｃと同時にトランスフェクトされると初期ＲＥＦ もトランスフォームする（Ｂｅｒｎｈａｒｄ等、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．５６：１７２７−１７３０）。 ３．７または５Ｒに比較して、Ｈ−ｒａｓ ^V12ＣＶＬＬでトランスフォームし たＲＥＦ細胞（ＲＥＦ−ＧＧ）は組織培養皿に十分に接着せず、分離したコロニ ーを形成しない。Ｈ−ｒａｓ^V12ＣＶＬＬタンパク質はＦＴＩ−２７７の影響を 受けないはずであるが、ＧＧＴＩ−２８６がもたらすＧＧＴａｓｅＩの阻害に感 受性であるはずであるので、これらの細胞は本明細書に記述される実験の有用な コントロールとして使える。ＲＥＦ−ＧＧ細胞を１０μＭまでのＦＴＩ−２７７ で処理した場合、Ｈ−ｒａｓ−ＣＶＬＬの移動度の何の変化も見られなかった（ 図８Ｃ）。これらの結果は、ＦＴＩ−２７７がＧＧＴａｓｅＩよりむしろＦＴａ ｓｅに特異的であることを明らかにする。以下に報告するアポトーシス及び生存 実験は１０μＭ未満の投与量のＦＴＩ−２７７を用いて実施されたので、これら の結果はＧＧＴａｓｅＩ活性に影響を及ぼさないこの阻害剤の濃度で得られた。 ヒト腫瘍細胞系において、阻害剤、ＦＴＩ−２７７はＫ−ｒａｓよりむしろＨ −ｒａｓの翻訳後プロセシングに主に影響を付与する。２つの可能な説明により この結果を説明することができる。第一のものはＦＴＩ−２７７がＦＴａｓｅの 競合阻害剤であることである。ＦＴａｓｅはＫ−ｒａｓ ＣＡＡＸ配列に対して Ｈ−ｒａｓ配列に対するより７倍高い親和性を有する（Ｒｅｉｓｓ等、１９９１ 、上記）ので、Ｋ−ｒａｓファルネシル化のＦＴＩ−２７７阻害はこの化合物に よるＨ−ｒａｓファ ルネシル化の阻害より効率が低いと予想される。第二に、ファルネシル化が阻害 される場合にＧＧＴａｓｅＩによるＫ−ｒａｓの交差（ｃｒｏｓｓ）プレニル化 が起こる可能性がある（Ｊａｍｅｓ等、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ７０：６２２１−６２２６）。いくらかのＫ−ｒａｓがゲラニルゲラニル化によ り修飾される可能性に対処するために、Ｋ−ｒａｓプロセシングに対する新規ゲ ラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、ＧＧＴＩ−２８６（Ｌｅｒｎｅｒ等 、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６７７０−２６７７３）及び より有効な阻害剤、ＧＧＴＩ−２９８（ＭｃＧｕｉｒｅ等、１９９６、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７４０２−２７４０７；Ｖｏｇｔ等、１９９６、Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ １３：１９９１−１９９９）の影響を評価するために研究を開 始した。阻害剤ＧＧＴＩ−２８６を用いた予備結果では、ＲＥＦ−ＧＧ細胞によ り発現されるＧＧＴａｓｅＩのＣＶＬＬ認識配列を有するキメラＨ−ｒａｓ^V12 のゲラニルゲラニル化の有効な阻害が４μＭのような低い阻害剤投与量で示され た。それに反して、ファルネシルトランスフェラーゼ認識配列ＣＶＬＳを有し、 従ってファルネシル化される５Ｒ細胞系により発現されるＨ−ｒａｓ（^V12？） は３２μＭの投与量でこの阻害剤により部分的に阻害されるだけである（図１０ ）。ＭＲ４細胞系の内在性野生型ｃ−Ｈ−ｒａｓは非常に低いレベルで発現され るが、ＧＧＴＩ−２８６処理によるこのタンパク質の移動度に対する影響は見ら れなかった。これらのデータはＧＧＴａｓｅＩ阻害剤がゲラニルゲラニル化の有 効で且つ特異的な阻害剤であることを示す。 これらのデータを考えると、ＧＧＴａｓｅＩ阻害剤と共に用いられるＦＴａｓ ｅ阻害剤がいずれかの化合物のみよりＫ−ｒａｓプレニル化を 阻害することに有効であるかどうかを試験することが今や可能である。たとえＫ −ｒａｓがファルネシルトランスフェラーゼ及びゲラニルゲラニルトランスフェ ラーゼＩの両方の基質であっても、両方の型の阻害剤を一緒に用いると癌遺伝子 タンパク質のプレニル化の阻害が促進される。ＦＴＩ−２７７により細胞において誘導される形態変化 Ｈ−ｒａｓでトランスフォームしたＲＥＦ細胞のＦＴＩ−２７７での処理はこ れらの細胞のトランスフォーメーションの部分的復帰をもたらす（図１１Ａ）。 ２．５μＭ ＦＴＩ−２７７で処理した３．７細胞は屈折力が低くなり、だんだ ん広がる。５Ｒ細胞もより平たくなり、より少ない突起を有するが、これらの細 胞では３．７細胞でより変化が顕著ではない。この阻害剤により誘導される形態 変化の４８時間にわたる時間経過はウェスタンブロッティングにより検出される Ｈ−ｒａｓ移動度の変化の時間経過よりかなり長かった。これはｒａｓでトラン スフォームした細胞の形態復帰に関与する他のタンパク質の存在を示す可能性が ある。しかしながら、ＲＥＦ−ＧＧ細胞の５μＭ ＦＴＩ−２７７での処理は変 化した細胞形態を誘導せず（図１１Ｂ）、細胞形態に対するこの阻害剤の影響が ｒａｓプレニル化に対するこの化合物の活性により影響されることを示している 。放射線照射後のアポトーシスに対するＦＴＩ−２７７処理の影響 ｖ−ｍｙｃで不死化したＲＥＦ細胞を電離放射線にさらすことは高レベルのア ポトーシスをもたらし、一方、Ｈ−ｒａｓとｖ−ｍｙｃでトランスフォームした 細胞は実質的により低いレベルのアポトーシスを示す。これらの結果から、放射 線照射で殺すことに対してより耐性である活性化Ｈ−ｒａｓを発現するトランス フォーム細胞が、放射線によるアポト −シスの誘導に対してもＨ−ｒａｓを発現しない細胞より耐性であることが明ら かである。また、これらの結果は、これらの細胞でＨ−ｒａｓ活性が存在しない ことが増加した放射線誘導アポトーシス及び減少したクローン原性生存をもたら すことも意味する。この予想の最初の試験として、放射線照射後のアポトーシス に対するＨ−ｒａｓファルネシル化の阻害の影響を調べた。 細胞を１０グレイで放射線照射し、各種濃度のＦＴＩ−２７７で同時に処理し た。活性化Ｈ−ｒａｓ及びｖ−ｍｙｃを発現する３．７細胞の放射線照射により 誘導されるアポトーシスの程度はＦＴＩ−２７７での処理により非常に高められ た（図１２Ａ）。これらの細胞に対する阻害剤の最大効果は５μＭの阻害剤濃度 で見られた。しかしながら、２．５μＭの阻害剤の濃度でも著しい増加が見られ た。従って、Ｈ−ｒａｓ（^V12？）ファルネシル化を阻害するＦＴａｓｅ阻害剤 の投与量は細胞の放射線照射後の細胞集団のアポトーシスのレベルの増加をもた らす。トランスフォームされていないＲＥＦ細胞のＦＴＩ−２７７処理は放射線 照射後のこれらの細胞のアポトーシスの増加を生じなかったので、観察されたア ポトーシスレベルの増加は活性化Ｈ−ｒａｓを発現する細胞に特異的である。 Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子でトランスフォームした細胞において放射線照射が誘導す るアポトーシスを増大するＦＴＩ−２７７の能力を４Ｒ及び５Ｒ細胞で確かめた （図１２Ｂ）。これらの細胞はＨ−ｒａｓ（^V12？）のみでトランスフォームし たＲＥＦ細胞の２つの独立したクローンである。これらの結果は活性化Ｈ−ｒａ ｓのみの存在がＦＴＩ−２７７処理後の増加した放射線誘導アポトーシスを生じ るために十分であることを 示す。図１２Ａ及び１２Ｂに示される結果は処理の２４時間後に得られ、３．７ 細胞のみにおいて最も高い投与量で阻害剤の何らかの毒性が明らかになったこと を除いて、同等の結果が処理の４８時間後に見られた。 放射線照射後のアポトーシス誘導の特異性を調べるために、さらなるコントロ ールとしてＲＥＦ−ＧＧ細胞系を用いた。これらの細胞により発現されるＨ−ｒ ａｓ^V12はＦＴＩ−２７７処理により影響を受けない。従って、ＦＴＩ−２７７ で処理される場合に、これらの細胞では放射線照射後のアポトーシスのレベルは 増加しないはずである。ＲＥＦ−ＧＧ細胞は約６％の比較的高いアポトーシスの 基準レベルを示した（図１２Ｂ）。このレベルは放射線照射により１２％に増加 した。これらの細胞のＦＴＩ−２７７での処理はアポトーシスの基準レベルをわ ずかに増加したが、放射線照射後のアポトーシスの程度を高めることに対して何 の顕著な影響もなかった。従って、放射線照射及びＦＴＩ−２７７処理後に見ら れるアポトーシスの増加はファルネシル基の付加によりプロセシングされる癌遺 伝子Ｈ−ｒａｓを含む細胞に特異的であると思われる。Ｈ−ｒａｓ（^V12？）でトランスフォームしたマウス前立腺腫瘍細胞におけるｒ ａｓファルネシル化の阻害及び放射線誘導アポトーシスに対する影響 Ｈ−ｒａｓ及びｖ−ｍｙｃをマウス胚泌尿生殖器洞細胞に形質導入することに より得られたマウス前立腺腫瘍細胞（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８９、Ｃｅｌｌ ５６：９１７−９３０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ ７１ ：Ｓ１１６５−Ｓ１１７１）にＲＥＦモデル系で得られた結果を拡大した。原発 腫瘍細胞またはこの腫瘍系の転移クローンのいずれかの処理はファルネシル化型 の投与量依存的減少及びよ り遅く移動するＨ−ｒａｓの非プロセシング型の蓄積を示した（図１３Ａ）。従 って、ＦＴＩ−２７７はトランスフォームした前立腺上皮細胞におけるｒａｓフ ァルネシル化の有効な阻害剤である。 ｒａｓファルネシル化を阻害する投与量のＦＴＩ−２７７で処理した後の放射 線誘導アポトーシスに関して前立腺上皮細胞を調べると、アポトーシスの著しい 増加が見られた（図１３Ｂ）。従って、前立腺細胞並びに繊維芽細胞におけるフ ァルネシル化の阻害は増加した放射線誘導アポトーシスをもたらした。ＦＴＩ−２７７で処理したｒａｓトランスフォームＲＥＦ細胞の減少した放射線 生存 Ｈ−ｒａｓでトランスフォームしたＲＥＦ細胞はトランスフォームされていな いＲＥＦ細胞より著しく放射線耐性である。さらに、ｍｙｃで不死化したＲＥＦ 細胞は親のＲＥＦ細胞に比較して放射線に抵抗する能力が変えられていない。そ れ故、ファルネシル化阻害剤を用いたＨ−ｒａｓ活性の阻害は癌遺伝子のＨ−ｒ ａｓを発現する細胞において放射線耐性を減少すると期待されるかもしれない。 示される線量の電離放射線で細胞を照射し、照射後にＦＴＩ−２７７で２４時 間処理した（図１４Ａ）。３．７及び５Ｒ細胞の生存曲線から、これらの細胞が 放射線に対してＭＲ４またはＲＥＦ細胞より耐性であり、ＭＲ４細胞が放射線に 対してＲＥＦ細胞よりわずかに耐性であることが示された。ＦＴＩ−２７７での 処理後に、３．７及び５Ｒ細胞の放射線耐性はＭＲ４細胞、ｍｙｃで不死化した ＲＥＦ細胞またはＲＥＦ細胞自体で見られる生存レベルと同様なレベルまで減少 した。生存曲線の肩は生存曲線の全体的な傾きと同様に減少した。細胞系ＭＲ４ またはＲＥＦ をＦＴＩ−２７７にさらすことは放射線生存に対して何の影響もなかった。これ らの結果はＦＴＩ−２７７が活性化Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子を発現する細胞の特異的 放射線増感剤として作用することができるが、この阻害剤がｒａｓを発現しない 細胞には何の影響もないことを示す。ＲＥＦ−ＧＧ細胞は接着がゆるく、コロニ ーを形成することができないので、これらを標準的なクローン原性生存アッセイ で試験することができなかった。この細胞系のＳＦ₂（すなわち、２グレイの線 量での照射で生存するクローン原性細胞の割合）を５μＭ ＦＴＩ−２７７また は８μＭ ＧＧＴＩ−２９８の存在下で２グレイ照射後に生じるクローン原（ｃ ｌｏｎｏｇｅｎｓ）の限界希釈分析により測定した（Ｔｈｉｌｌｙ等、１９８０ 、Ｓｅｒｒｅｓ等、（編集）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｕｔａｇｅｎｓ、第６巻、 ｐｐ３３１−３６４、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ；Ｇｒｅｎｍａｎ等、１ ９８９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４４：１３１−１３６）。このアッセイに おいて、１個またはそれ以上の細胞の生存はウェルにコロニー形成を生じ、陰性 ウェルの頻度を評点するので二次的なコロニーはもはやクローン原性生存の評点 を複雑にせず、そして生存はポアソン統計分析から導かれる。 薬剤担体のみで処理した後の２グレイでの照射は０．９１のＳＦ₂であった（ 図１４Ｂ、上）。５μＭ ＦＴＩ−２７７での処理は０．８１のＳＦ₂までのわ ずかな生存の減少をもたらした。それに反して、ＲＥＦ−ＧＧ細胞の８μＭ Ｇ ＧＴＩ−２９８での処理はＳＦ₂を０．６４まで下げ（図１４Ｂ、下）、ｒａｓ がゲラニルゲラニルトランスフェラーゼにより修飾される場合にｒａｓプレニル 化の阻害が放射線耐性も減少することを示す。 また、ネズミ前立腺腫瘍細胞のＦＴＩ−２７７処理による放射線増感も観察さ れた。図１４Ｃに示されるように、Ｈ−ｒａｓとｖ−ｍｙｃでトランスフォーム したマウス前立腺腫瘍細胞の２グレイ放射線照射後の生存は０．８５から０．３ ６まで減少した。このことは繊維芽細胞由来の３．７及び５Ｒ腫瘍細胞のような 間葉起源のものである肉腫だけでなく前立腺腫瘍のような内皮起源の腫瘍におい ても放射線増感を達成できることを示す。ＲＥＦ細胞成長に対するＦＴＩ−２７７処理の影響 ファルネシルトランスフェラーゼ阻害はｒａｓ状態に関係ないと思われる様式 で細胞成長に影響を付与することが知られている（Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎ ｏ等、１９９５、Ｃａｎｃｃｒ Ｒｅｓ．５５：５３０２−５３０９）。クロー ン原性生存アッセイで得られた結果が単に完全な成長阻害のためではなかっこと を確かめるために、ｍｙｃ＋ｒａｓでトランスフォームした３．７細胞及びｍｙ ｃ で不死化したＭＲ４細胞系の成長をＦＴＩ−２７７の存在下及び非存在下で調 べた（図１５Ａ）。これらの結果は、放射線生存実験で用いられた条件下でＦＴ Ｉ−２７７処理が３．７細胞において細胞成長のいくらかの阻害を生じたことを 示すが、しかしながら、薬剤処理の４日後までに細胞数の５０倍の増加が見られ た。同様の結果が５Ｒ細胞系のＦＴＩ−２７７処理後に得られ（図１５Ｂ）、５ Ｒ細胞系は成長阻害に対してより耐性であるようであった。これらのデータはク ローン原性生存実験で得られた平板効率と共に、Ｈ−ｒａｓをトランスフェクト したＲＥＦ細胞において示される放射線増感がＦＴＩ−２７７の存在下での減少 した細胞成長のアーチファクトではないことを示す。 実施例２．プレニルトランスフェラーゼ阻害剤でのヒト細胞の放射線増感ヒトＴ２４細胞をＦＴＩ−２７７処理した後のＨ−ｒａｓのプレニル化の阻害 実施例１に記述した結果をヒト細胞に拡張するために、天然に存在するｒａｓ 突然変異体を保有するヒト腫瘍細胞系のパネルを調べた。ヒト膀胱癌細胞系Ｔ２ ４に対するＦＴＩ−２７７の影響をまず調べた。これらの細胞はＨ−ｒａｓ（^{V1 2} ？）癌遺伝子が最初に単離された細胞である。非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓの 蓄積の時間経過はこれ及び他のヒト細胞系ではＲＥＦ細胞でより遅かった（図１ ６Ａ）。この阻害剤はタンパク質のプロセシングの間に作用し、阻害剤の存在下 でのファルネシル化型の持続（１６Ａ）及び阻害剤を回収した後の非ファルネシ ル化型の存在は両方ともこれらのヒト細胞ではＲＥＦ細胞でより長いので、これ はヒト細胞における代謝回転よりむしろこれらの細胞におけるＨ−ｒａｓのより 遅い合成速度のためと思われる。非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓは５μＭ ＦＴＩ −２７７での処理の５時間後に検出可能であったが、ｒａｓでトランスフォーム したＲＥＦと異なり、ヒト細胞では非ファルネシル化型の５０％のｒａｓを得る ために２４時間を必要とした。 Ｔ２４細胞では非ファルネシル化Ｈ−ｒａｓの蓄積がより長くかかることを考 慮して、これらの細胞を放射線照射及びそれに続くクローン原性生存のアッセイ の前に２４時間前処理した。細胞の前処理により生じるさらなる考慮すべき事柄 は、ＦＴＩ−２７７及び他のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤が細胞形態 に関与するｒｈｏタンパク質のファルネシル化に影響を与え、従って細胞接着を 変化させる可能性があるこ とである。Ｔ２４細胞のＦＴＩ−２７７での前処理は、再び平板培養した後にこ れらの細胞が分離したコロニーを形成する能力を減少させ、二次的なサテライト コロニーの形成をもたらした。この厄介な問題を避けるために、前処理したＴ２ ４細胞の生存アッセイを細胞の複数の希釈物を用いて９６ウェルマイクロタイタ ー皿で実施した。このアッセイの結果は、ＦＴＩ−２７７処理及び２グレイでの 照射後のコロニー形成の著しい減少を２グレイ照射の生存割合の０．５８から０ ．３５までの付随する減少と共に示す（図１６Ｂ）。ＦＴＩ−２７７処理のみは コロニーを生じるウェルの割合を顕しく減少しなかった。これらの結果は、ＦＴ Ｉ−２７７が突然変異の結果として活性化Ｈ−ｒａｓを自然に発現するヒト細胞 を放射線増感できることを示し、さらに活性化ｒａｓを発現するヒト細胞の放射 線増感を放射線療法で用いられる放射線線量で検出できることを示す。ヒトＳＷ４８０細胞をＦＴＩ−２７７処理した後のＫ−ｒａｓプレニル化の阻害 ＦＴＩ−２７７処理の影響はＫ−ｒａｓよりむしろＨ−ｒａｓに対して主に特 異的であり、ＦＴＩ−２７７によるＫ−ｒａｓプレニル化の阻害を調べた。図１ ７Ａに示されるように、Ｈ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓを発現するＳＷ４８０大腸癌 細胞系は２．５μＭのような少量のＦＴＩ−２７７を用いた場合にＨ−ｒａｓの 変化した移動を示し、一方、Ｋ−ｒａｓの変化した移動は３０μＭ ＦＴＩ−２ ７７でのみ明らかになった。この後者の投与量で、ＦＴＩ−２７７はファルネシ ル化及びゲラニルゲラニル化の両方を阻害する（Ｌｅｒｎｅｒ等、１９９５、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６７７０−２６７７３）。従って、３０μＭ 未満 のＦＴＩ−２７７の投与量ではＦＴＩ−２７７はＨ−ｒａｓのファルネシル化を 特異的に阻害し、Ｋ−ｒａｓはプレニル化されたままであるが、３０μＭのこの 阻害剤ではＫ−ｒａｓプレニル化のいくらかの阻害が見られる。 ＳＷ４８０細胞を３０μＭの投与量のＦＴＩ−２７７で処理してこれらの細胞 を放射線増感することができたかどうかを測定した（図１７Ｂ）。クローン原性 生存アッセイの結果から、ＦＴＩ−２７７のみを用いて活性化Ｋ−ｒａｓを発現 するヒト腫瘍細胞を放射線増感する可能性が示された。ＦＴＩ−２７７及びＧＧＴＩ−２９８での併用処理によるヒト４８０大腸癌細胞 及びＰａｎｃ−Ｉ膵臓細胞におけるＫ−ｒａｓプレニル化の阻害 Ｋ−ｒａｓプレニル化を阻害するために必要なＦＴＩ−２７７の比較的高い投 与量、すなわちＧＧＴａｓｅＩの阻害も期待される投与量を考慮して、ＦＴａｓ ｅ及びＧＧＴａｓｅＩの阻害剤の併用を研究してそのような組み合わせが細胞に 対して放射線感受性を付与することになおさらに有効である可能性があるかどう かを測定した。これらの実験の結果から、その組み合わせでの細胞の処理がＫ− ｒａｓプレニル化の阻害を増加するように働くことが明らかである（図１８Ａ） 。Ｋ−ｒａｓプレニル化を阻害するために必要なＦＴＩ−２７７の濃度は８μＭ ＧＧＴＩ−２９８と併用した場合にはＦＴＩ−２７７のみを用いる場合にＫ− ｒａｓプレニル化の同等の阻害のために必要な濃度（図１７Ａ）より６倍低かっ た。８μＭ ＧＧＴＩ−２９８のみでの細胞の処理はＫ−ｒａｓのプレニル化に 何の影響もなかった。従って、プレニルトランスフェ ラーゼ阻害剤の併用処理はＫ−ｒａｓプレニル化を阻害することに対して相乗効 果を有した。用いた濃度で、別のファルネシル化タンパク質の核ラミンＢは影響 を受けなかったので、併用阻害剤処理は活性化Ｋ−ｒａｓプレニル化に対して特 異性を有すると思われる。クローン原性生存アッセイにこれらの濃度の阻害剤を 用い、結果からヒト細胞のＦＴａｓｅ及びＧＧＴａｓｅＩ阻害剤併用処理がＳＷ ４８０細胞系を放射線増感することにおいても有効であったことが明らかである （図１８Ｂ）。この結果をＫ−ｒａｓの活性化突然変異体を発現する他のヒト腫 瘍に拡張した。図１８Ｃに示されるように、Ａ５４９肺癌細胞系もＦＴａｓｅ及 びＧＧＴａｓｅＩ阻害剤での併用処理後に２グレイで著しい放射線増感を示した 。 従って、ＦＴＩ−２７７のようなＦＴａｓｅ阻害剤はＫ−ｒａｓを発現するヒ ト腫瘍細胞を放射線増感することに有効である。さらに、ＦＴａｓｅ及びＧＧＴ ａｓｅＩ阻害剤での細胞の併用処理は活性化Ｋ−ｒａｓのプレニル化を阻害する ため及びＫ−ｒａｓ癌遺伝子産物を発現するヒト細胞の放射線感受性をさらに高 めるために役立つ。この処理の放射線増感効果は活性化ｒａｓ癌遺伝子を発現す る大腸及び肺の両方の癌細胞において有効であることが示されている。 プレニルトランスフェラーゼ処理後に獲得される放射線増感の程度は大きくな かったが、臨床放射線療法で用いられるもののような分割線量は細胞を殺すこと においてさらに小さい増加を生じる可能性があり、それは患者の臨床結果をかな り改善する。臨床放射線療法は幾週もの処理にわたって毎日少ない線量の放射線 を付与することを伴うのでこれが言える。本明細書に提示される処理は、放射線 増感のわずかな差をなされ る処置の数の累乗に増幅する効果を有する(治療上の目的で処置がなされる場合 には典型的には３０またはそれ以上の処置がなされる(Ｆｅｒｔｉｌ等、１９８ １、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｎｃ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．７：６２１−６２９； Ｓｔｅｅｌ等、１９９１、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇ ｙ ２０：７１−８３；Ｔｈａｍｅｓ等、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｎ ｃ．２２：２４１−２４６))。従って、放射線感受性のわずかな差でも癌治療に おける臨床結果に対して非常に大きい影響を有する可能性がある。 有望な臨床試験においてこのことが当てはまると実際に示されていることに触 れることは重要である。Ｗｅｓｔ等による子宮頸癌の研究において、０．３８な いし０．５４の間のメジアンＳＦ₂の差はｐ＝０．０１レベルでの生存に対して 重要であった（Ｗｅｓｔ等、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｎｃ．３１：８ ４１−８４６）。この差は活性化ｒａｓを発現するヒト細胞においてＦＴＩ−２ ７７を用いて本明細書に記述される実験で観察されているＳＦ₂の差より少ない 。この理由から、本明細書に記述される実験で観察される放射線増感の程度は臨 床環境において放射線感受性の顕しい増加に変わる可能性があると考えられる。 臨床環境での分割放射線照射スケジュールにおけるプレニルトランスフェラーゼ 阻害剤の効果を調べることにより、癌治療のための放射線照射と組み合わせたプ レニル化阻害剤の投与の的確な方法及び量が与えられる。ヌードマウスで成長させたヒト大腸癌を用いたインビボでのＨ−ｒａｓプレニル 化の阻害 動物におけるインビボでのプレニル化阻害剤の有効性を調べるために、ヌード マウスで成長する腫瘍移植片においてこれらの阻害剤に対する齧 歯類及びヒト腫瘍の両方の反応を調べた。Ｈｏｆｆｍａｎ（１９９２、Ｃｕｒｒ ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．ｏｎ Ｍｏｌｅｃ．＆Ｃｅｌｌ．Ｏｎｃｏｌ．１：３１１ −３２６）に記述されたプロトコルに従ってヌードマウスで腫瘍を樹立し、成長 させた。 アッセイを実施するために、腫瘍を移植し、約１２５ｍｍ³まで成長させた。 次に、これらの腫瘍を保有するマウスに腹腔内注射により５０ｍｇ／ｋｇのＦＴ Ｉ−２７７を投与した。コントロールは等容量の薬剤を含まない担体溶液を注射 したマウスを含んだ。各マウスを屠殺する１８時間前に１回、そして５時間前に もう１回の２回の注射を各マウスに与えた。続いて、マウスの腫瘍ｒａｓプレニ ル化状態を本明細書に記述されるように評価した。 腫瘍サンプルにおいてｒａｓタンパク質発現を分析することの実現可能性は、 ヌードマウスで腫瘍として成長させた５Ｒ細胞系から得られたサンプルからのＨ −ｒａｓの発現を調べることによりまず明らかになった。図１９Ａに示されるよ うに、Ｈ−ｒａｓの発現は腫瘍サンプルから直接得られた細胞ライセートで容易 に検出された。検出されたＨ−ｒａｓは、腫瘍細胞のＨ−ｒａｓを検出するため に用いられた同じモノクローナル抗体が組織のＨ−ｒａｓ発現を検出することが できなかった、正常なマウスの肝臓（図１９Ａ）、皮膚または脾臓のウェスタン ブロット分析において評価されるように腫瘍由来であった。また、ヌードマウス で成長させたヒト大腸癌腫瘍でもＨ−ｒａｓを検出することができる。さらに、 ＦＴａｓｅ阻害剤でインビボで動物を処理した後にＨ−ｒａｓの非ファルネシル 化型が検出可能であった（図１９Ｂ）。 ここに記述されるアッセイは、動物においてインビボで腫瘍でｒａｓ タンパク質発現を検出することができること、そしてさらに、ヌードマウスで成 長させた齧歯類及びヒト起源の腫瘍においてＦＴａｓｅ処理後のｒａｓ移動度の 変化も検出できることを明らかにする。従って、これらのアッセイは動物におけ るインビボでのプレニルトランスフェラーゼ阻害剤の有効性を示す。 本明細書に引用される各々及び全ての特許、特許出願及び出版物の開示は全部 引用することにより本明細書に組み込まれる。 本発明は特定の態様に関して開示されているが、当業者が本発明の真の趣旨及 び範囲からそれずに本発明の他の態様及び変形を考案できることは明らかである 。付加した請求の範囲は全てのそのような態様及び同等の変形を含むと解釈され ると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/7088 Ａ６１Ｋ 31/70 ６２３ 31/7105 ６２４ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 マツケナ，ダブリユー・ジルズ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19130フ イラデルフイア・グリーンストリート2114 (72)発明者 ムシエル，ルース・ジエイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19130フ イラデルフイア・グリーンストリート2114 (72)発明者 バーンハード，エリツク・ジエイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19130フ イラデルフイア・ノーストエンテイフオー スストリート775 (72)発明者 セブテイ，セイド・エム アメリカ合衆国フロリダ州33647タンパ・ マグノリアチエイスサークル8957 (72)発明者 ハミルトン，アンドリユー・デイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州15215ピ ツツバーグ・メドウハイツ108

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｒａｓシグナリング経路に関与するタンパク質産物の最低１種の阻害剤を腫 瘍細胞に投与し、それにより前記タンパク質産物の阻害が前記細胞に放射線感受 性を付与することを含んで成る、前記細胞に放射線感受性を付与する方法。 ２．前記タンパク質産物が癌遺伝子タンパク質産物である、請求の範囲１に記載 の方法。 ３．前記癌遺伝子タンパク質産物がｒａｓタンパク質である、請求の範囲２に記 載の方法。 ４．前記ｒａｓタンパク質が、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ_A−ｒａｓ、Ｋ_B−ｒａｓおよびＮ −ｒａｓから成る群から選択される、請求の範囲３に記載の方法。 ５．前記タンパク質産物が、ｒｈｏＡ、ｒｈｏＢ、ｒｈｏＣおよびＲＡＣ−１か ら成る群から選択される、請求の範囲１に記載の方法。 ６．前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１に記載 の方法。 ７．前記阻害剤がリボザイムである、請求の範囲１に記載の方法。 ８．前記タンパク質産物がタンパク質のカルボキシル末端に配列ＣＡＡＸを有す る、請求の範囲１に記載の方法であって、式中Ｃはシステインであり、Ａは脂肪 族アミノ酸すなわちバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであり、そしてＸは メチオニン、セリン、システイン、アラニン、グルタミン、ロイシンもしくはイ ソロイシンである方法。 ９．前記阻害剤がタンパク質プレニル化阻害剤である、請求の範囲８に記載の方 法。 １０．前記プレニル化阻害剤がファルネシル化阻害剤である、請求の範囲９に記 載の方法。 １１．前記ファルネシル化阻害剤が、ＦＴＩ−２７６およびＦＴＩ−２７７から 成る群から選択される、請求の範囲１０に記載の方法。 １２．ＦＴＩ−２７６およびＦＴＩ−２７７のスルフェート基が除去されている 、請求の範囲１１に記載の方法。 １３．前記プレニル化阻害剤がゲラニルゲラニル化阻害剤である、請求の範囲９ に記載の方法。 １４．前記ゲラニルゲラニル化阻害剤が、ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２ ９８から成る群から選択される、請求の範囲１３に記載の方法。 １５．ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２９８のスルフェート基が除去されて いる、請求の範囲１４に記載の方法。 １６．前記腫瘍細胞が固形癌の腫瘍細胞である、請求の範囲１に記載の方法。 １７．前記固形癌が、前立腺、肺、結腸、***、膵、子宮頸部癌腫、子宮頸部肉 腫、直腸、結腸、卵巣、膀胱、甲状腺、頭部および頸部から成る群から選択され る、請求の範囲１６に記載の方法。 １８．前記固形癌が、肺、膵、結腸および直腸から成る群から選択される、請求 の範囲１７に記載の方法。 １９．動物の腫瘍の成長を抑制する方法であって、 前記腫瘍の細胞で発現されるタンパク質産物の最低１種の阻害剤を前記動物に 投与することであって、このタンパク質産物はｒａｓシグナリング経路に関与し 、そしてそれにより前記タンパク質産物の阻害が前記細胞に放射線感受性を付与 し、 前記阻害剤は前記タンパク質産物の阻害を達成するのに十分な量で前記動物に 投与され、そして 前記動物を照射し、それにより前記動物の前記腫瘍の成長を抑制すること、 を含んで成る方法。 ２０．前記動物がヒトである、請求の範囲１９に記載の方法。 ２１．前記タンパク質産物が癌遺伝子タンパク質産物である、請求の範囲１９に 記載の方法。 ２２．前記癌遺伝子タンパク質産物がｒａｓタンパク質である、請求の範囲２１ に記載の方法。 ２３．前記ｒａｓタンパク質が、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ_A−ｒａｓ、Ｋ_B−ｒａｓおよび Ｎ−ｒａｓから成る群から選択される、請求の範囲２２に記載の方法。 ２４．前記タンパク質産物が、ｒｈｏＡ、ｒｈｏＢ、ｒｈｏＣおよびＲＡＣ−１ から成る群から選択される、請求の範囲１９に記載の方法。 ２５．前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１９に 記載の方法。 ２６．前記阻害剤がリボザイムである、請求の範囲１９に記載の方法。 ２７．前記タンパク質産物がタンパク質のカルボキシル末端に配列ＣＡＡＸを有 する、請求の範囲１９に記載の方法であって、式中Ｃはシステインであり、Ａは 脂肪族アミノ酸すなわちバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであり、そして Ｘはメチオニン、セリン、システイン、アラニン、グルタミン、ロイシンもしく はイソロイシンである方法。 ２８．前記阻害剤がタンパク質プレニル化阻害剤である、請求の範囲２ ７に記載の方法。 ２９．前記プレニル化阻害剤がファルネシル化阻害剤である、請求の範囲２８に 記載の方法。 ３０．前記ファルネシル化阻害剤が、ＦＴＩ−２７６、ＦＴＩ−２７７から成る 群から選択される、請求の範囲２９に記載の方法。 ３１．ＦＴＩ−２７６およびＦＴＩ−２７７のスルフェート基が除去されている 、請求の範囲３０に記載の方法。 ３２．前記プレニル化阻害剤がゲラニルゲラニル化阻害剤である、請求の範囲２ ８に記載の方法。 ３３．前記ゲラニルゲラニル化阻害剤が、ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２ ９８から成る群から選択される、請求の範囲３２に記載の方法。 ３４．ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２９８のスルフェート基が除去されて いる、請求の範囲３３に記載の方法。 ３５．前記腫瘍が固形癌である、請求の範囲１９に記載の方法。 ３６．前記固形癌が、前立腺、肺、結腸、***、膵、子宮頸部癌腫、子宮頸部肉 腫、直腸、結腸、卵巣、膀胱、甲状腺、頭部および頸部から成る群から選択され る、請求の範囲３５に記載の方法。 ３７．前記固形癌が、肺、膵、結腸および直腸から成る群から選択される、請求 の範囲３６に記載の方法。 ３８．動物から腫瘍を排除する方法であって、 前記腫瘍の細胞で発現されるタンパク質産物の最低１種の阻害剤を前記動物に 投与することであって、このタンパク質産物はｒａｓシグナリング経路に関与し 、そしてそれにより前記タンパク質産物の阻害が前記細胞に放射線感受性を付与 し、 前記阻害剤は前記タンパク質産物の阻害を達成するのに十分な量で前記動物に 投与され、そして 前記動物を照射し、それにより前記動物から前記腫瘍を除去すること、 を含んで成る方法。 ３９．前記動物がヒトである、請求の範囲３８に記載の方法。 ４０．前記タンパク質産物が癌遺伝子タンパク質産物である、請求の範囲３８に 記載の方法。 ４１．前記癌遺伝子タンパク質産物がｒａｓタンパク質である、請求の範囲４０ に記載の方法。 ４２．前記ｒａｓタンパク質が、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ_A−ｒａｓ、Ｋ_B−ｒａｓおよび Ｎ−ｒａｓから成る群から選択される、請求の範囲41に記載の方法。 ４３．前記タンパク質産物が、ｒｈｏＡ、ｒｈｏＢ、ｒｈｏＣおよびＲＡＣ−１ から成る群から選択される、請求の範囲３８に記載の方法。 ４４．前記阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求の範囲３８に 記載の方法。 ４５．前記阻害剤がリボザイムである、請求の範囲３８に記載の方法。 ４６．前記タンパク質産物がタンパク質のカルボキシル末端に配列ＣＡＡＸを有 する、請求の範囲３８に記載の方法であって、式中Ｃはシステインであり、Ａは 脂肪族アミノ酸すなわちバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであり、そして Ｘはメチオニン、セリン、システイン、アラニン、グルタミン、ロイシンもしく はイソロイシンである方法。 ４７．前記阻害剤がタンパク質プレニル化阻害剤である、請求の範囲４ ６に記載の方法。 ４８．前記プレニル化阻害剤がファルネシル化阻害剤である、請求の範囲４７に 記載の方法。 ４９．前記ファルネシル化阻害剤が、ＦＴＩ−２７６およびＦＴＩ−２７７から 成る群から選択される、請求の範囲４８に記載の方法。 ５０．ＦＴＩ−２７６およびＦＴＩ−２７７のスルフェート基が除去されている 、請求の範囲４９に記載の方法。 ５１．前記プレニル化阻害剤がゲラニルゲラニル化阻害剤でぁる、請求の範囲４ ７に記載の方法。 ５２．前記ゲラニルゲラニル化阻害剤が、ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２ ９８から成る群から選択される、請求の範囲５１に記載の方法。 ５３．ＧＧＴＩ−２９７およびＧＧＴＩ−２９８のスルフェート基が除去されて いる、請求の範囲５２に記載の方法。 ５４．前記腫瘍が固形癌である、請求の範囲３８に記載の方法。 ５５．前記固形癌が、前立腺、肺、結腸、***、膵、子宮頸部癌腫、子宮頸部肉 腫、直腸、結腸、卵巣、膀胱、甲状腺、頭部および頸部から成る群から選択され る、請求の範囲５４に記載の方法。 ５６．前記固形癌が、肺、膵、結腸および直腸から成る群から選択される、請求 の範囲５５に記載の方法。 ５７．細胞集団に放射線感受性を付与するプレニル化阻害剤を同定する方法であ って、 前記タンパク質の活性にプレニル化を必要とするタンパク質を発現する細胞集 団を提供することであって、かつ、このタンパク質はｒａｓシグナリング経路に 関与し、 前記細胞に試験化合物を添加すること、 前記細胞を照射すること、そして 照射に対する前記細胞の感受性のレベルを測定することであって、試験化合物 を投与されなかった細胞の放射線感受性のレベルに比較して、試験化合物を投与 された細胞の放射線感受性のより高いレベルが、前記試験化合物が前記細胞集団 に放射線感受性を付与することの指標となる、を含んで成る方法。 ５８．前記タンパク質がタンパク質のカルボキシル末端に配列ＣＡＡＸを有する 、請求の範囲５７に記載の方法であって、式中Ｃはシステインであり、Ａは脂肪 族アミノ酸すなわちバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであり、そしてＸは メチオニン、セリン、システイン、アラニン、グルタミン、ロイシンもしくはイ ソロイシンである方法。 ５９．前記タンパク質が、ｒｈｏＡ、ｒｈｏＢ、ｒｈｏＣおよびＲＡＣ−１から 成る群から選択される、請求の範囲５８に記載の方法。 ６０．前記タンパク質が癌遺伝子タンパク質産物である、請求の範囲５８に記載 の方法。 ６１．前記タンパク質がｒａｓタンパク質である、請求の範囲６０に記載の方法 。 ６２．前記ｒａｓタンパク質が、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ_A−ｒａｓ、Ｋ_B−ｒａｓおよび Ｎ−ｒａｓから成る群から選択される、請求の範囲６１に記載の方法。