JP2000507849A

JP2000507849A - 生体適合性を向上させるためのポリマーによる表面の共有結合修飾

Info

Publication number: JP2000507849A
Application number: JP9531964A
Authority: JP
Inventors: ワグナー，ウィリアム，アール．; ディーブル，クリストファー; ベックマン，エリック，ジェー．; ルッセル，アラン
Original assignee: ユニヴァーシティオブピッツバーグ
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2000-06-27
Also published as: CZ278498A3; CN1217664A; CA2248124A1; WO1997032617A1; US5977252A; PL328720A1; NO984076L; HUP9903953A2; NO984076D0; AU2198897A; HUP9903953A3; IL126085A0; AU711031B2; EP0885023A1; SK122998A3

Abstract

(57)【要約】細胞の付着を阻止するために組織および細胞表面を共有結合修飾する技術が本明細書には記載される。本明細書に記載のプロセスは、インビボで許容される条件下で実施され、水性の穏やかな条件下で組織または細胞表面に存在する基と反応しそれによってポリマーを組織および細胞表面に共有結合で付着させる少なくとも１個の反応性の基を有する生体適合性ポリマーを使用する。ポリマーに付けられる反応性の基は、組織または細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応するものであることが好ましい。好ましい一実施例では、本明細書に記載の方法は、ＰＥＧ−イソシアナート溶液を用いて組織および細胞表面の共有結合修飾を実現する。本明細書に記載の方法は、血管中の血小板および白血球の沈着を減少させ、それによってＰＴＣＡおよび血管手術を含む血管処置でよく見られる合併症である血栓症および再狭窄を防止するのに特に有用である。さらに、本明細書に記載の方法は、組織表面のタンパク質を血液要素からマスクすることによって、移植物のトロンボゲン形成性を低下させ、血管手術の合併症を減らすのにも有用である。最後に、本明細書に記載の方法は、移植された組織および細胞の免疫原性を低下させ、それによって免疫抑制療法の必要を減らす。

Description

【発明の詳細な説明】名称生体適合性を向上させるためのポリマーによる表面の共有結合修飾発明の分野本発明は、生体適合性を向上させるための表面の修飾に関し、詳細には、ポリマーを使った組織および細胞表面の共有結合修飾技法に関する。発明の背景研究者達は、生物中に存在する表面、あるいは生物中に導入される表面に対する細胞付着を低下させようとして様々な技術を使用してきた。こうした技術は、それを使って様々な処置、移植片およびインプラントの生体適合性を改善するのに使えるので、重要な医学的用途がある。しかし、こうした技術は様々な問題点があるため、インビボでの使用、すなわちインビボの生体移植やインプラントに適しない。本明細書に記載する技術は、様々な医学的応用分野で使用できる。具体的には、本明細書に記載する技術は、血管措置および生体移植に数多くの用途がある。さらに詳細には、本明細書に記載の技術は、血管血栓症および再狭窄の低減、移植血栓症の低減、血管手術の合併症の低減、移植した組織および細胞群の免疫原性の低減のために使用できる。血管手術に関しては、研究者達は、様々な方法を使用して損傷を受けた血管上への血小板の沈着を阻止しようと追求してきた。こうした沈着が血栓症および再狭窄をもたらすからである。再狭窄は、主として血管の内側層における平滑筋細胞の遊走および細胞（有糸）***から生じる。これは、動脈内膜過形成と呼ばれる過程である。血管の管腔表面が損傷を受けると、内皮下基質タンパク質が露出して、血小板沈着を誘発し、急性血管閉塞をもたらす可能性がある。このような損傷はまた、血小板由来因子の放出によって動脈内膜過形成を誘発することもある。血小板から放出されたセロトニンおよびトロンボキサンＡ₂は、現在、急性血栓症性血管閉塞の重要因子であると考えられている血管収縮剤である。血小板由来成長因子（「ＰＤＧＦ」）は平滑筋細胞を刺激して活発に細胞***させることができる。血小板顆粒によるＰＤＧＦ、セロトニンおよびロイコトリエンの放出はまた、平滑筋細胞の血管動脈内膜層への移動を仲介することがある。最後に、血小板、免疫細胞、および機械的外傷によって損傷を受けた細胞から放出されたプロテアーゼは、内側弾性膜などの物理的境界の破壊により平滑筋細胞の移動を促進することがある。こうした血管への損傷は、経皮経管冠動脈形成術（「ＰＴＣＡ」）など普通の血管処置中に発生する。ＰＴＣＡは冠動脈バイパス移植術の代替策であり、１〜２本の血管に単純病変をもつ患者の詰まった冠動脈を再開通させるものである。ＰＴＣＡは初期成功率が高いが、現在は、ＰＴＣＡ手術の２〜４％で血栓症および血管収縮による再閉塞が直後に起こっている。その上、ＰＴＣＡにより開通に成功した動脈の約３０〜４０％に再閉塞または再狭窄が、それもしばしば３カ月以内に、起こっている。ＰＴＣＡは米国で毎年３０万人を超える患者に実施されている。したがって、ＰＴＣＡの後に、損傷を受けた動脈内膜表面への血小板の沈着を止めることによってＰＴＣＡ技術を改良すると、動脈内膜過形成および冠動脈再狭窄を減す上で大きな利益が得られる可能性がある。血管は血管手術中にも同様に損傷を受ける。血管吻合術における急性血栓症性閉塞は、微小血管移植片配置術の主な合併症である。血小板は、アゴニストに応答し、吻合部位に存在するコラーゲンその他の接着性タンパク質に付着して、血小板の活性化とその後の凝集を引き起こす。吻合部位を修飾して、トロンボゲン形成性のないコーティングを形成すると、吻合部が治癒して最終的に内皮再生する時間が与えられる。さらに、トロンボゲン形成性タンパク質の一時的部位特異的マスキングを行うと、全身的抗血小板物質を使用せずに、急性血栓症および末梢組織の虚血が大幅に減少する。冠動脈形成術に伴う血管ステント配置は、長期的血管開通性を改善する技術として普及してきた。こうしたステントは、機械的反動に対する足場を血管に与える働きをする。ステントの配置は、血小板の沈着および血小板を介する過形成は阻止しないので、内膜過形成による再閉塞はステント配置でよく見られる。さらに、ステントによってもたらされる利点が、動脈壁の損傷、不適切なステント開口部、アクセス部位での出血と分離などステントに起因する血管合併症の増加によって打ち消されることもある。こうした合併症があると一般に入院期間が延びる。したがって、ステント配置の代わりに、あるいはステント配置の補足として使えるコーティングを開発できる技術、すなわちステントの重要な機械的利点を保持しながら急性血栓症および過形成を減らすことができる技術があれば、大きな利益となるはずである。薬品の全身送達を含めて血小板の沈着を阻止するために様々な技術が使用されてきた。遺憾ながら、薬品の全身送達は、出血性合併症の危険の増大を伴う。研究者達は、また、ポリマーゲルを使って血小板沈着を阻止しようと試みてきた。こうしたゲルは切断によって崩壊するので、少なくとも理論的には、崩壊過程で塞栓症の危険が増大する。当技術分野の若干の研究者達は血小板沈着の阻止を試み、光活性化剤および開始剤によって重合させたポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）ゲルで損傷を受けた動脈区間をコーティングして血栓症が大幅に減少したと報告している。たとえば、Hubbellらが報告した技術（Hummbell等に対する米国特許第５４６８５０５号）では、血小板の表面沈着を阻止するため光活性化エオシンＹ（「ＥＹ」）とトリエタノールアミン（「ＴＥＡ」）を使って血管表面上でＰＥＧ−ジアクリレートの重合を開始させる。遺憾ながら、これらの方法では、修飾を行うために多数の工程が必要なことが多い。また従来技術では、官能基を付けたポリエチレングリコールによる懸濁タンパク質の共有結合修飾も記載されている。遺憾ながら、こうした方法の温度、ｐＨ、時問および毒性因子／副産物のパラメータは生体組織に使用するには向かない。当技術分野の他の研究者は、血管再狭窄を防止するための種々の遺伝子工学的戦略を調査している。遺憾ながら、それらの遺伝子工学的手法は、調節および技術上の障害が大きい。遺伝子形質転換では血管をウィルス・ベクターにさらすことがしばしば必要であり、十分に制御されない細胞の形質転換を伴うことがある。さらに遺伝的形質転換は炎症を誘発し、本明細書に記載する技術よりも高価となり、かつ血小板の沈着を防止する作用が遅くなることがある。研究者達はまた、移植された組織および細胞の免疫原性を一時的に低下させる方法を求めてきた。移植細胞を免疫隔離するための現在の技術（たとえばカプセル化）はまだ問題がある。移植した細胞および組織の免疫原性を低下させるような移植表面の修飾により、免疫抑制療法の必要が減少することになる。同様に、表面修飾技術はまた、血液または血漿に接触するバイオリアクタ中のマイクロキャリア上の細胞を保護するのにも使用される。こうした適用例の一例は、人工肝臓に関するものであり、現在研究者は細胞を隔離するのに免疫分離性の膜またはカプセル化を使っている。移植の研究者達は、移植術に対する宿主の寛容性を誘導する方法を探している。宿主が細胞移植片および全器官移植片に対する寛容性を確立できるまで、移植した物質の免疫原性抗原をマスクする技術があれば、移植受容者に寛容性を誘導するように設計された他の方法に対する有用な相補物となるはずである。さらに、急性血栓症、繊維素溶解を減らし、ドナー器官の活性化を補完する技術があれば、臨床上大きな利益をもたらすはずである。したがって、生体内で許容される条件下で、細胞粘着力を減退させる性質を示すように組織および細胞表面を修飾する経済的かつ効率的な方法が当技術分野で依然必要とされている。具体的には、血管手術や外傷の後に、生体内で許容される条件下で血管表面への血小板および白血球の沈着を減退させる方法が当技術分野で依然必要とされている。本出願人は本願を通じて以下の略語を使用する。ＡＮＯＶＡ＝分散分析ＥＣＧＭ＝内皮成長因子を含む内皮細胞生育培地ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ＥＹ＝エオシンＹＨＣＡＥＣ＝ヒト冠動脈内皮細胞ＨＴ＝Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅｓ混合物ＭＷ＝分子量ＰＥＧ＝ポリエチレングリコールＰＴＣＡ＝経皮経管冠動脈血管形成術ＴＥＡ＝トリエタノールアミン発明の概要本明細書に記載する発明は、ポリマーの少なくとも１つの末端に付着させた反応性の基によって水溶性ポリマーを共有結合で付着させることにより、細胞および細胞表面上の反応性の基を修飾できるという原理に基づくものである。ポリマーの反応性末端基は、組織または細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応し、それによってその表面を共有結合で修飾することが好ましい。どんな生体適合性ポリマーも使用できる。アミンと水酸基を含めて組織および細胞表面に存在する基と穏やかな水性条件下で反応できる基を、ポリマーの少なくとも１つの末端に付ける。反応性末端基の性質により、共有結合修飾がどれだけ迅速に達成できるかが決まる。従来技術とは違って、本明細書に記載の技術によると、生体内処置に適合する条件下で、ポリマーが表面組織タンパク質または表面細胞タンパク質に直接付着して接着性または抗原性リガンドをマスクするように表面の共有結合ポリマー修飾を行うことが可能となる。さらに、光を使用する従来技術の技法とは対照的に、組織または細胞表面のアミン基および恐らくは水酸基へのポリマーの結合は、ほぼ生理条件で十分速やかに行われ、光または光開始剤なしで高度のタンパク質修飾が可能である。血管処置に使用する場合、本発明は、損傷を受けた血管壁に沈着する血小板および恐らくは白血球から放出される因子が、平滑筋細胞の生育と化学走性を促すという原理に基づいている。共有結合で付着したポリマーでトロンボゲン形成性血管壁タンパク質を血液細胞との相互作用から遮蔽することにより、本発明の技術は血小板および白血球の初期沈着を阻止し、細胞***活性化および化学走性に対する促進事象をなくする。この処置で使用するポリマーは表面組織タンパク質のアミンおよび水酸基残基と直接反応し、生体内で許容される条件下でこれらのタンパク質にポリマーを共有結合で付着させる。したがって、ＰＴＣＡなどの血管処置に使用する場合、血管腔をポリマーで直接共有結合修飾すると、ＰＴＣＡ後の冠動脈再狭窄の発生が低下するはずである。本明細書に記載の技術は、現在開発中または使用中の他の技術に勝るいくつかの利点がある。たとえば、トロンボゲニン形成巣が局所的にマスクされるが患者の血小板機能は維持されるので、ポリマー表面修飾の効率がより高くなる。Ｆｉｇ．１ａおよびＦｉｇ．１ｂを参照のこと。このポリマー表面修飾技術はまた、特異的付着性リガンドをマスクするためにモノクローナル抗体または生物活性ペプチドを局所的に送達する提案された技術に比べて経済的および理論的に勝る利点を有する。モノクローナル抗体は生産コストが高く入手が難しいが、ポリマーは容易に入手でき比較的安価である。その上、モノクローナル抗体は組織または細胞表面に存在する抗原に限定され、それらの抗原に特異的であるが、ポリマーは表面上の様々な座に付着できる。他の研究者達が使用している動脈の光重合性ゲルコーティングに対して、本明細書に記載する技術は様々な理由で勝っている。たとえば、本明細書に記載するポリマー共有結合修飾戦略は光重合性ゲル法に伴う光源や光開始剤を必要としない。さらに、本明細書に記載する技術は表面タンパク質へのポリマーの直接付着を実現するので、血管が自然に再建されるにつれ、ポリマーはゆっくり除去される。従来技術に記載のゲルでは、ゲルの分解をポリマー内の生分解性結合の切断に頼っている。光重合性ゲルおよび本明細書に記載する技術の分解過程をＦｉｇ．２ａおよび２ｂにそれぞれ示す。すなわち、本明細書に記載する技術は、治癒過程で損傷を生じる可能性のある塞栓を生じる可能性がより低いと思われる。光重合性ゲル技法の血管に対する効果および作用と本明細書に記載する技術の違いは、光重合ゲルをコーティングしたヒト胎盤動脈（Ｆｉｇ．３参照）と本明細書に記載する技術を使ってコーティングしたヒト胎盤動脈（Ｆｉｇ．６参照）の走査電子顕微鏡写真を比較すると直ちに明らかである。ゲルは均質な表面を作り出すが、本明細書に記載する技術は、血管輪郭の完全性を保持し、下にある血管のよりよい評価が可能である。ポリマーによる表面の共有結合修飾はまた、血管内にステントを配置する代わりにあるいはその補足として使用するのにもよく適している。補足として使用する場合は、急性血栓症および過形成を抑えかつステントの重要な機械的利点を保持することが可能である。さらに、記載の技術の反応速度論は、１分未満の反応時間で修飾が達成できることを示唆している。タンパク質の修飾には一般に数時間または数日を要することを当業者なら理解されよう。本明細書に記載する技術を血管に応用する場合、反応が速く光開始要件がないため、血管虚血時間が最短になり、カテーテルを含めて送達様式の複雑さが減り、それによって合併症の危険が低減する。最後に、本明細書に記載する技術は、ヒト細胞の遺伝子修飾を必要としない。したがって、調査中の遺伝子工学法とは違って、ポリマー表面修飾は調節および技術上の障害がより少なく、炎症を起こす可能性がより低く、より安価であり、直ちに血小板沈着を防止する働きをする。要約すると、本明細書に記載の表面の共有結合修飾は、従来技術に勝る多くの利点を提供する。たとえば、血管処置に適用する場合、本明細書に記載する技術は、現在の技術および提案されている技術に勝る多くの利点を提供する。これは、速い反応速度を示し、血管損傷部位に限定してリガンドを広くカバーし、比較的簡単な送達法で処理できる。合併症を伴う恒久的血管内装置は本明細書に記載の技術には必要でない。ポリマー共有結合修飾はまた、血管が自然に再建され治癒するとき、安全に分解する。その上、この分解の副産物は無害性である。本発明の一目的は、生体内で許容される条件下で組織または細胞表面の共有結合修飾を行う技法を提供することである。本発明の他の目的は、様々な血管内処置中および血管外傷後の合併症を減らすことである。本発明の他の目的は、血管内ステント配置を使用するまたは使用しない、ＰＴＣＡを含む様々な血管処置の後の再狭窄の発生を減らすことである。本発明の他の目的は、血栓症および血管収縮によって生じる急性再閉塞を防止することにより、ＰＴＣＡを含む血管処置の初期成功率を高めることである。本発明の他の目的は、血小板、白血球、細菌の付着を防止することにより、移植した細胞および組織の生体適合性を向上させる技術を提供することである。本発明の他の利点は、添付の図面を参照して行う現在好ましい実施例についての以下の詳細な説明を読めば明らかになるであろう。発明の詳細な説明本明細書には、生体適合性を向上させるために組織および細胞表面を共有結合修飾する方法を開示する。本明細書に記載する発明は、ポリマー末端に付けた反応性の基を介して水溶性ポリマーを共有結合で付着させることにより、細胞および組織表面上の反応性の基を修飾できるという原理に基づいている。どんな水溶性ポリマーでも、そのポリマーが多数表面に共有結合で付着して自然な形態をとった場合に、修飾すべき組織または細胞表面をほぼ覆うバリアを形成するのに十分な長さであれば、使用することができる。すなわち、たとえばポリペプチドや糖類もポリマーとして使用できる。ＰＥＧポリマーは、高い生体適合性を示すので、これを使用することが好ましい。穏やかな水性条件下で組織および細胞表面に存在するアミン基や水酸基などの反応性の基と共有結合で反応できる基ならどんな基も、ポリマーの少なくとも１つの末端に付けることができる。この反応性末端基の諸特性によって、この共有結合修飾がどれだけ迅速に実現されるかが決まる。組織表面および生体内細胞表面は通常、多数のアミン基および水酸基を含むので、ポリマーに付いた反応性末端基は、好ましくは組織および細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応し、それによってその表面を共有結合修飾し、ポリマーを付着させる。組織および細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応するには、ポリマーに付けた反応性末端基は、エステル、酸無水物（Ｎ−カルボキシ無水物を含む）、イソシアナート、アルデヒド、トシレート、トレシレートまたはエポキシドとすることができる。反応性末端基は、ポリマーの共有結合付着に対して小さな分子あるいは有毒な分子を放出しないものが好ましい。したがって、環状エステル、環状酸無水物、イソシアナートが、ポリマー末端に付けて共有結合修飾を実施するための好ましい反応性の基である。具体的には、ジイソシアナートが、組織および細胞表面上のアミン基および水酸基との反応時間が１分未満であることがわかっているので好ましい。組織および細胞表面上のアミン基および水酸基以外の分子基と反応させるために、本明細書に記載の技法でマレイミドも使用できる。本明細書に記載する技法は、移植組織の生体適合性を向上させるために、移植する組織または細胞にその移植前に適用することができる。インビボで使用する場合、所望の場所に適した方法ならどんな方法を使っても（たとえば注射またはカテーテル）、反応性末端基の１つを有するポリマーを含む溶液を所望の部位に適用することができる。この共有結合修飾は反応動熊が速いので、一般にこの技法は所望の部位でのみ働く。ある種のカテーテルによって形成されるような機械的バリアを立てて、共有結合修飾を所望の領域だけに制限することもできる。本出願人は、共有結合付着が可能なポリマーで処理した表面の諸特徴および本発明の諸方法を実証する証拠資料を提出する。本発明は、以下の非限定的な例および好ましい実施例によってさらに理解できるであろう。実施例１血管表面のＰＥＧジイソシアナートによる修飾本明細書で使用するプロトコルおよび血小板の沈着を検出する方法の評価のため、本出願人は、他の発明者が提起した血小板沈着を減らす技法を追試し、類似の結果を得ることができた。光重合性ＰＥＧゲルを、損傷を受けた動脈部分に含浸させて、上述の系中における血小板沈着に対するその効果を査定した。本明細書に記載する実験で使用した光重合化ゲルは、Hubbellらが記載した方法で形成した。ただし、１８，５００ＭＷＰＥＧテトラアクリレートの代わりに４００ＭＷおよび１０００ＭＷＰＥＧジアクリレートを使用した。血管表面を４％ＥＹで１分間インキュベートし、次いでｐＨ７．４のＨｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅｓ（ＨＴ）緩衝液で洗浄した。２３％ＰＥＧジアクリレート（分子量４００）０．５ｍｌと、３．５％ＴＥＡ１０ｍｌとｎ−ビニルピロリジノン２００μｌの混合物５ μｌの溶液を、血管が軽い被覆で覆われるまで一滴ずつ表面に加え、紫外光（１０ワット／ｃｍ²）に５分間曝露して、ポリマーのゲル化を最大にした。このゲルをｐＨ７．４のＨＴ緩衝液で洗浄して、未重合のＰＥＧを除去した。Ｆｉｇ．４に、７回の実験の結果を示す。各棒は試験した最高４本の血管の平均を表す。分子量４００と１０００のＰＥＧジアクリレートゲルはいずれも血小板沈着の著しい低下（ｐ＜０．０５）を示し、互いに有意な差はなかった（ｐ＞０．５）。本明細書に記載の技法を実証するため、ＰＥＧ（分子量３４００）ジイソシアナート（米国アラバマ州HuntsvilleのShearwater Polymers社）０．２ｇをｐＨ８．０に調整したリン酸緩衝食塩水１ｍｌに溶かして、ＰＥＧジイソシアナート溶液を作成した。ＰＥＧポリマーを選んだのは、その親水性、水溶性、生体適合性のためである。ジイソシアナートを選んだのは、アミン基および水酸基との反応時間が特に速いためである。ヒト胎盤からの動脈切片の管腔表而をＰＥＧジイソシアナート溶液に３０分、１５分、５分および１分間浸漬することによってそれら切片を修飾した。物理的に吸着したＰＥＧの効果を調べ、官能性末端基の重要性を明らかにするため、血管表面のタンパク質と共有結合できる末端基を持たないＰＥＧとも血管切片をインキュベートした。ｐＨ８．０のリン酸塩緩衝食塩水１ｍｌに溶かしたＰＥＧ（分子量３４００）（非反応性）０．２ｇを使って対照を作成し、血管を３０分および１分間インキュベートした。様々のＰＥＧ血管コーティングおよび修飾の有効性を評価するため、以前にBa dimonらによってJ．Lab．Clin．Med.，1987，110(6)：750-12に記載された潅流システム中で、ＰＥＧでコーティングした損傷を受けた動脈に¹¹¹インジウムで標識した血小板を含むヒト全血を流して、実験を行った。ＰＴＣＡ後の冠動脈のモデルとして使用したのは、内皮除去したヒト胎盤動脈であった。分娩後２時間以内に得た胎盤を洗浄し、絨毛膜を除去した。この胎盤動脈をそっくり分離し、漏れを最小限に抑えるための分岐点を通って長手方向に切り、金属スパチュラで引っ掻いて内皮を除去した。潅流用血液は、１０日間アスピリンを飲んでいない、すなわち血液が抗凝固性になっていない健康なボランテアの肘前静脈から得た。JohnsonらがPlast．Reconst．Surg.，1992，90(4)：650-8.Aに以前に記載したように¹¹¹インジウムオキシン（ミズーリ州セントルイスのMalｌinkrodt）で血液を標識し、潅流する直前に赤血球と血漿で元に戻した。Ｆｉｇ．５に示すように、ＰＥＧジイソシアナートで３０分間の反応時間共有結合修飾した血管への血小板の沈着は対照の未処理の血管および非反応性ＰＥＧで処理した（ＰＥＧ吸着）血管に比べて有意に減少した（ｐ＜０．０００５）。５分および１５分間ＰＥＧジイソシアナートにさらしてそれと反応させてＰＥＧジイソシアナートで共有結合修飾した血管も、ＰＥＧ吸着切片よりも有意に低い血小板沈着を示した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、組織または細胞表面をポリマーの共有結合的付着で修飾した場合に、ポリマーが細胞相互作用を防ぐ上で有効かつ適切であることを示している。より具体的には、これらの結果は、組織表面と反応させたとき、細胞相互作用を防ぐ上での共有結合的に付着したＰＥＧの有効性と適切さを示している。５分または１５分間反応させた血管切片への血小板沈着は、３０分間反応させたものと有意な差はなかった（ｐ＞０．９）。血小板の活性に変動があるため、３０分、１５分および５分間浸漬の結果は、ＰＥＧジイソシアナートで処理した血管への血小板沈着を３０分間血小板にさらされた未処理の裸の血管への沈着で割った比として表す。ＰＥＧジイソシアナート溶液に１分間浸漬した血管の結果は１分間血小板にさらされた未処理の裸の血管への沈着で割った比として表す。すべてのテストで、分散分析（「ＡＮＯＶＡ」）を使って、テスト群間に統計的差があるかどうか判定し、Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を使って群間のｐ値を得た。処理および未処理の血管の走査電子顕微鏡写真を比較すると、この技術の効果はただちに明らかであった。Ｆｉｇ．６ａに前述のプロトコルに従った未処理でむき出しにした胎盤動脈の走査電子顕微鏡写真を示す。多数の血小板が組織表面に付着しているのが観察できる。組織表面への血小板の付着およびひろがりは、未処理でむき出しの胎盤動脈の高い表面トロンボゲン形成性を示している。それとは対照的に、Ｆｉｇ．６ｂは本明細書に記載した技術を使って処理した、より具体的には前述のようにＰＥＧジイソシアナート溶液で処理した裸の胎盤動脈の走査電子顕微鏡写真を示す。処理済みの血管に付着している血小板は非常に少なく、付着した血小板はひろがりを示さず、それにより処理した血管のトロンボゲン形成性が低いことを示している。Ｆｉｇ．６ｃは、組織表面と共有結合で付着できる反応基を持たないポリマーで処理した裸の胎盤動脈の走査電子顕微鏡写真を示す。この例では、ＰＥＧジイソシアナートで胎盤動脈を処理するのに使ったのと同じプロトコルに従って裸の胎盤動脈をＰＥＧ−ＯＨ溶液で処理した。未処理で裸の胎盤動脈の場合と同様に、多数の血小板が組織表面に付着してそこで広がり、高い表面トロンボゲン形成性を示している。実施例２光重合性ＰＥＧゲルで処理した移植片本明細書に記載する技術の効果をさらに実証し、本明細書に記載する技術を評価するために使用するテスト方法を検証するため、本出願人はこの技術をプレクロット（preclotted）ダクロンに適用した。プレクロットダクロン（ニュージャージー州オークランドのＭｅｄｏｘ社）の表面を上記と同じ反応条件を用いてＰＥＧジイソシアナートで共有結合修飾した。また光重合化ゲルをＰＥＧジアクリレート（分子量４００）を用いてダクロン移植片をコーティングした。Ｆｉｇ．７に示すように、ＰＥＧジイソシアナートで修飾した移植片も光重合性ゲルで処理した移植片も、本明細書で使用する実験のテスト方法を検証するために前述の技術を使って修飾すると、未処理のプレクロットダクロン血管移植片よりも有意に低い血小板沈着を示した（ｐ＜０．０５）。実施例３ヒト冠動脈内皮細胞に対する本発明の生体適合性を実証する毒性データ以下では、本発明を実証するために使用したヒト冠動脈内皮細胞の好ましい培養方法について述べる。ここに示す実験では、商業的に培養され冷凍保存したヒトの培養冠動脈内皮細胞（「ＨＣＡＥＣ」）をClonetics社から入手した。この内皮細胞を７５ｃｍ²の培養フラスコに接種した。できた細胞集団は分けて多数の均質な継代培養をつくる。ＥＣＧＭを培養を維持するために加えた。ＥＣＧＭをフラスコから除去し、残留ＥＣＧＭを除去するため、０．２５％のＥＤＴＡ（重量／体積）を含むトリプシン約１ｍｌを加えた。０．２５％のＥＤＴＡ（重量／体積）を含むトリプシン約５〜７ｍｌを加えて約１０分間３７℃に保ち、培養フラスコ表面から細胞をはがした。すべての細胞がはがれたのを確認するため、培養を光学顕微鏡検査した。内皮細胞をフラスコの表面から外した後、懸濁液と細胞の全体積が５０ｃｃとなるようにＭｅｄｉａ１９９（Ｓｉｇｍａ社）に懸濁させた。円錐試験管を遠心分離機に入れ、１１００ｒｐｍで６分間回して内皮細胞と培地とを分離した。遠心による分離プロセスの終了後、ピペットで円錐試験管から培地を除去した。細胞ペレットを入れた各円錐試験管に、内皮細胞成長因子（Clonetics社提供）を含む内皮細胞増殖培地（「ＥＣＧＭ」）を加えた。ＥＣＧＭは細胞ペレットを再懸濁させるために加えた。細胞ペレットの再懸濁後、内皮細胞の集団をウェルに分注して均質な継代培養を作った。目視検査ですべての細胞がＥＣＧＭの薄い層で覆われるように、十分なＥＣＧＭを各内皮細胞の継代培養に加えた。効率のよい細胞の生育を確保するため、製造元の指示通りＥＣＧＭは２〜３日毎に交換した。３つの処理群を作った。（１）ＨＣＡＥＣにＰＥＧジイソシアナート溶液を直接加えた「直接群」；（２）ＨＣＡＥＣにＥＣＧＭを加え、続いてＰＥＧジイソシアナート溶液を加えた「培地群」；（３）ＰＥＧジイソシアナート溶液を加えなかった「対照群」。直接群も培地群も、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ８．０）１ｍｌ当たり０．２ｇのＰＥＧジイソシアナートを用いて作成したＰＥＧジイソシアナート溶液を使用した。直接群では、ＨＣＡＥＣを覆うＥＣＧＭをピペットで除去し、目視検査ですべてのＨＣＡＥＣが覆われたように見えるまでＰＥＧジイソシアナート溶液を１滴ずつＨＣＡＥＣに直接加えた。ＨＣＡＥＣ／ＰＥＧジイソシアナート混合物を１分間インキュベートした後、ＥＣＧＭを加えた。培地群では、直接群の各継代培養物で使用したのと同量のＰＥＧジイソシアナート溶液を、ＥＣＧＭ中のＨＣＡＥＣに直接加えた。すなわち、ＰＥＧジイソシアナート溶液を加える前にＥＣＧＭを除去しなかった。対照群では、ＨＣＡＥＣを入れたウェルからＥＣＧＭを除去し、ウェルを１分間インキュベートし、ＨＣＡＥＣにＥＣＧＭを加えた。ＰＥＧジイソシアナート溶液の効果を決定するため、目視検査で確認しながら、細胞が接着した直後、細胞が急速に生育しているとき、および細胞が集密状態になった時の様々な時点でＰＥＧジイソシアナート溶液を直接群および培地群の継代培養に加えた。したがって、継代培養作成後、下記間隔で直接群および培地群の継代培養物にＰＥＧジイソシアナート溶液を加えた。（１）２〜４時間（すなわち細胞接着の直後）；（２）１〜２日（すなわち、急速な生育中）；（３）４〜７日（すなわち細胞が集密状態にある時）。サンプリング法で細胞数を計算した。これらの実験の結果をＦｉｇ．８に示す。０日目および２日目にＰＥＧジイソシアナートに曝露した後のＨＣＡＥＣの正規化生育比（０、２、６日目の細胞数を０日目の細胞数で割った値で表す）をＦｉｇ．８に示す。このデータから、ＰＥＧジイソシアナート溶液がＨＣＡＥＣに対して、処理直後の細胞生育を減少させるという弱い作用を示したことがわかる。しかし、ＰＥＧジイソシアナート溶液で処理したＨＣＡＥＣは回復して、対照細胞が集密状態に達してから１日以内に同じく集密状態になった。同様に、Ｆｉｇ．９は、０日目にＰＥＧジイソシアナートにさらした後のＨＣＡＥＣの平均生育比（２、６、９日目の細胞数を０日目の細胞数で割った値で示す）を示している。Ｆｉｇ．９はまた、ここに述べた実験の標準偏差をバーで示している。この場合も、処理群の間に生育速度の著しい違いはない。直接群および培地群の集密状態ＨＣＡＥＣにＰＥＧジイソシアナート溶液を加えたとき、対照群と比べて形態または細胞数に対する効果は認められなかった。実施例４ヒト繊維芽細胞に対する本発明の生体適合性を実証する毒性データ本明細書に記載する技術の生体適合性をさらに実証するため、ヒト皮膚組織のサンプルから繊維芽細胞を分離し、培養した。前述の直接群で使用したプロトコルに従ってヒト繊維芽細胞をＰＥＧジイソシアナート溶液に浸漬した。前記の例１で述べた技術を用いて作成したＰＥＧジイソシアナート溶液にさらした後４日間繊維芽細胞の生育を測定した。これらの実験の結果をＦｉｇ．１０に示す。これらの結果は、本明細書に記載する技術、具体的には本明細書に記載するＰＥＧジイソシアナート溶液を使用した技術が、ヒト繊維芽細胞の生育に対して何の作用ももたないことを示している。図面の簡単な説明Ｆｉｇ．１は、未処理の組織表面への血小板の付着機構を示す、未処理の組織表面の概略図である。Ｆｉｇ．１ｂは、細胞の付着力を低減させるために付着性リガンドがマスクされた共有結合修飾された血管の模式図である。Ｆｉｇ．２ａは、生物表面に付着させたゲルの分解プロセスの模式図である。Ｆｉｇ．２ｂは、本明細書に記載の技術を用いて共有結合修飾した組織表面の分解プロセスの模式図である。Ｆｉｇ．３は、光重合ゲルでコーティングした胎盤動脈の例示的走査電子顕微鏡写真であり、スケールバーは１０ミクロンを表す。Ｆｉｇ．４は、光重合性ＰＥＧゲルでコーティングした動脈上への¹¹¹インジウムで標識した血小板の沈着のＦｉｇ．７の実験の結果、および日平均値を示すものであり、各棒はテストした最大４個の動脈の平均を表す。Ｆｉｇ．５は、ＰＥＧジイソシアナートで修飾した動脈表面への¹¹¹インジウムで標識した血小板の沈着と対照の日平均の比として表した実験結果を示すものであり、この場合、ヒト胎盤動脈をＰＥＧジイソシアナートに３０分、１５分、５分および１分間さらした。Ｆｉｇ．６ａは、未処理の裸の胎盤動脈の走査電子顕微鏡写真であり、スケールバーは１０ミクロンを表す。Ｆｉｇ．６ｂは、ＰＥＧジイソシアナート溶液を使って共有結合修飾した裸の胎盤動脈の走査顕微鏡写真であり、スケールバーは１０ミクロンを表す。Ｆｉｇ．６ｃは、組織表面に共有結合的に付着する反応基を持たないポリマーで処理した裸の胎盤動脈の走査電子顕微鏡写真であり、スケールバーは１０ミクロンを表す。Ｆｉｇ．７は、ポリエチレングリコールで修飾したプレクロットダクロン移植物上への¹¹¹インジウムで標識した血小板の沈着、および未処理のプレタロットダクロン移植片上への血小板の沈着を示す図である。Ｆｉｇ．８は、０日目および２日目にＰＥＧジイソシアナートをＨＣＡＥＣに加えた毒性実験の結果をプロットしたグラフであり、ＰＥＧジイソシアナートをＨＣＡＥＣに直接添加（「直接」群）、生育培地中のＨＣＡＥＣに添加（「培地」群）、または加えなかった（「対照」群）実験についてＨＣＡＥＣの正規化生育比（０日目、２日目、６日目の細胞数を０日目の細胞数で割った値として表す）を示す。Ｆｉｇ．９は、ＨＣＡＥＣにＰＥＧジイソシアナートを加えた毒性実験の結果を表す棒グラフであり、０日目にＰＥＧジイソシアナートにさらした後のＨＣＡＥＣの平均生育比（生育比は２日目、６日目、９日目の細胞数を０日目の細胞数で割った値として表す）を示し、ＰＥＧジイソシアナートをＨＣＡＥＣに直接加える（「直接」群）、生育培地中のＨＣＡＥＣに加える（「培地」群）、または加えなかった（「対照」群）ものであり、標準偏差をバーで示す。Ｆｉｇ．１０は、ＰＥＧジイソシアナート溶媒に曝露してから４日後のヒト組織芽細胞の生育、および未処理のヒト組織芽細胞の４日後の生育（対照）を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＵ，ＢＡ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＳ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ (72)発明者ベックマン，エリック，ジェー. アメリカ合衆国．15218 ペンシルヴァニア，エッジウッド，ウィロープレイス 417 (72)発明者ルッセル，アランアメリカ合衆国．15260 ペンシルヴァニア，ピッツバーグ，ガードナースティールカンファレンスセンター 200 【要約の続き】に、本明細書に記載の方法は、移植された組織および細胞の免疫原性を低下させ、それによって免疫抑制療法の必要を減らす。

Claims

【特許請求の範囲】１．インビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在する基と反応する少なくとも１個の末端官能基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織および細胞表面をポリマーで共有結合修飾する方法。２．インビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在する基と反応する少なくとも１個の末端官能基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織および細胞表面をポリマーで共有結合修飾する方法であって、組織または細胞表面を、少なくとも１個の末端官能基を有する生体適合性ポリマーを含む溶液にさらすことを特徴とする方法。３．インビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織および細胞表面をポリマーで共有結合修飾する方法。４．インビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織および細胞表面をポリマーで共有結合修飾する方法であって、組織または細胞表面を、少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを含む溶液にさらすことを特徴とする方法。５．インビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織または細胞表面への細胞の付着を減らす方法。６．インビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能化末端基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織または細胞表面への血小板および白血球の付着を選択的に減らす方法。７．血管組織表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを、インビボで許容される条件下で共有結合的に付着させることからなる、血管組織表面を修飾する方法。８．血管組織表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを、インビボで許容される条件下で共有結合的に付着させることからなる、血管手術または傷害後の血栓症および再狭窄を軽減する方法。９．血管組織表面に存在するアミン基および水酸基と反応する少なくとも１個の官能末端基を有する生体適合性ポリマーを、インビボで許容される条件下で共有結合的に付着させることからなる、経皮冠動脈経管血管形成術を改良する方法。１０．移植組織および細胞表面をポリマーで共有結合修飾することを含む、組織または細胞性移植物の免疫原性を減少させる方法であって、少なくとも１個の末端官能基を有する生体適合性ポリマーをインビボで許容される条件下で組織および細胞表面に存在する基と共有結合させる方法。１１．官能末端基が、エステル、酸無水物、イソシアナート、アルデヒド、トシレート、トレシレート、エポキシドまたはマレイミドである、請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。１２．官能末端基が、エステル、酸無水物、イソシアナート、アルデヒド、トシレート、トレシレート、またはエポキシドである、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。１３．官能末端基が、環状エステル、環状酸無水物、またはイソシアナートである、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。１４．生体適合性ポリマーが、官能末端基として付加されたジイソシアナートを有する、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか一項に記載の方法。１５．生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。１６．生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールであり、官能末端基が、エステル、酸無水物、イソシアナート、アルデヒド、トシレート、トレシレート、エポキシドまたはマレイミドである、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。１７．生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールであり、官能末端基が、環状エステル、環状酸無水物、またはイソシアナートである、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。１８．生体適合性ポリマーがポリエチレングリコールであり、官能末端基が、ジイソシアナートである、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。１９．リン酸緩衝食塩水に溶かしたポリエチレングリコール（分子量３４００）−ジイソシアナートを含む溶液に組織または細胞表面をさらす、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。２０．リン酸緩衝食塩水に溶かしたポリエチレングリコール（分子量３４００）−ジイソシアナートを含む溶液に組織または細胞表面をさらし、溶液のｐＨを８．０に調節する、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。２１．細胞の生育可能性の維持に適合する条件下で組織または細胞表面に存在する基と反応する少なくとも１個の末端官能基を有する生体適合性ポリマーを共有結合的に結合させることからなる、組織および細胞表面をポリマーで共有結合修飾する方法。