JP2000507225A - ｍａｂ ３Ｅ１０ ならびにその突然変異体および／または機能性フラグメントを使用する送達システム - Google Patents

ｍａｂ ３Ｅ１０ ならびにその突然変異体および／または機能性フラグメントを使用する送達システム

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Abstract

(57)【要約】 本発明によれば，あるクラスの抗-dsＤＮＡ抗体，たとえばmＡb 3Ｅ10が固定されたヒト腎尿細管細胞の膜に結合し，インビボにおいて生体マウス腎尿細管細胞を透過し，細胞の核に局在することが発見された．mＡb 3Ｅ10はdsＤＮＡおよび丈の高い内皮細胞に発現された細胞外マトリックスタンパク質（すなわちＨＰ8/ＨＥＶＩＮ）の両者に結合する．以前の研究では，両者がmＡb 3Ｅ10の可変重鎖領域に，ＤＮＡおよびＨＰ8/ＨＥＶＩＮに対する別個の結合決定基を共有することが示された．細胞の透過におけるＨＰ8/ＨＥＶＩＮおよびＤＮＡの必要性を独立に評価するために，mＡb 3Ｅ10 ＶＨおよびＶｋの部位特異的突然変異体について腎細胞系の透過能を検討した．結果は，ＤＮＡの結合に要求されるがＨＰ8/ＨＥＶＩＮの結合には要求されない残基が抗体の透過に必要であることを示し，細胞の透過にはＤＮＡの存在またはＤＮＡに正確に類似する膜決定基に対する抗体の結合を要求することが指示された．抗体Ｆabが細胞を透過し，Ｆｃまたは多価抗体の結合のいずれも細胞の透過に必要ではないことが指示された．重鎖および軽鎖シグナルペプチドの欠失の結果として細胞質内で合成された抗体は核に移動しないことから，膜によって仲介される経路または抗体の翻訳後修飾の必要性が指示された．本発明は，自己抗体の透過および核局在の細胞性経路の研究における分子突然変異体および／またはその機能性フラグメントの使用の有用性を証明する．

Description

【発明の詳細な説明】 ｍａｂ 3Ｅ10ならびに その突然変異体および／または機能性フラグメントを使用する送達システム 発明の分野 本発明は，生物学的活性材料を細胞中に送達する方法およびそのために有用な 組成物に関する． 発明の背景 二重鎖テオキシリボース核酸（dsＤＮＡ）に対する自己抗体は全身性エリテマ トーデス（ＳＬＥ）に比較的特異的であり，この疾患の病因に関連づけられてい る．ある種の抗-ＤＮＡ自己抗体は細胞に透過し，細胞の核に局在することが明 らかにされている．抗-ＤＮＡ自己抗体による細胞の透過は最初末梢血Ｔ-リンパ 球において証明され（たとえば，Okudairaら，Arthritis Rheum．30：669，1987 およびAlarcon-Segoviaら，Clin.Exp.Immunol．35：364，1977参照），ついでそ れらの機能に影響することが示された（たとえばOkudairaら，前出，Alarcon -Segoviaら，J.Immunol．122：1855，1979，Alarcon-Segoviaら，Clin.Immunol.Immunopath ．23:22，1982，Alarcon-Segovia & Llorente，Clin.Exp.Immunol.52 :365，1963およびAlarcon-Segoviaら，Clinics in Immunology and Allergy 1 :117，1981参照）． 一部の研究では，抗体の透過はＦｃ受容体により仲介されると考えられていた （たとえばLlerenaら，Immunology 43:249，1081およびAlarcon-Segoviaら，Nature 271:67，1978参照）．他の抗-ＤＮＡ抗体では，細胞透過および細胞核へ の移動にＤＮＡの存在を要すると考えられた（たとえばOkudairaら，前出）．さ らに最近になって，抗-ＤＮＡ抗体の透過が糸球体間質細胞において証明された （Vlahakosら，T.Am.Soc.Nephrol．2(8):1345，1992）．抗-ＤＮＡ抗体は培養糸 球体間質細胞および肝癌細胞の核に時間および温度依存性様式で侵入することが 示されている（Yanaseら，Lab.Invest．71:52，1994）． 抗-ＤＮＡ抗体が細胞を透過すると考えられる機構には多重な機構がある．実 際，抗体によって様々な経路を使用することができる．一部の抗-ＤＮＡ抗体は ＤＮＡと交差反応性の膜タンパク質に結合することが明らかにされていることか ら，これらのタンパク質が細胞の透過に役立っている可能性がある（たとえば， Brentjens & Andres，Kidhey kidney International 35:954，1989，Razら，J. Immunol ．142:3076，1989，Madaioら，J.Immunol．138:2883，1987，Faaberら，J.Clin.Invest ．77:1824，1986，Ben-Chetritら，Clin.Exp.Immunol．60:159, 1985，Jacobら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3843，1984，Jacobら，Proc.Natl. Acad.Sci ．USA 86:4669，1989，Razら，Eur.J.Immunol．23:383.383，1993およ びJacobら，J.Clin.Invest．75:315，1985参照）．他の場合には，通常細胞内タ ンバク質と考えられているＤＮＡ結合タンパク質が一部の細胞の膜と会合すると 報告されている（たとえばBennettら，J.Clin.Invest．76:2182，1985 およびRefeneiderら，Clin.Immunol.Immunopath．63:245，1992参照）．抗-ＤＮ Ａ抗体はこれらのタンパク質とそれらのＤＮＡに対する相互結合性によって複合 体を形成することができるものと思われる． さらに他の背景情報については，米国特許第4,812,397号および"DNA Mimics a Self-Protein That May Be a Target for Some Anrti−ＤＮＡ Antibodies in Systemic Lupus Erythematosus"，Journal of Immunology，1987-1994頁（1995 年2月15日）を参照されたい．これらの内容はそれぞれ引用によりそれらの全体 が本明細書に導入される． 細胞を透過できる抗体の利用性の点からみて，生物学的材料の意図的な操作の ためにはこのような細胞透過性を選択的に利用することが望ましい． 発明の簡単な説明 本発明によれば，本発明者らは，インビボにおいて腎尿細管細胞を透過して細 胞の核に局在する抗-dsＤＮＡ自己抗体（すなわち，ループス腎炎を有するMRL/m pj/lprマウスから得られたmＡb 3Ｅ10）を同定した．ＤＮＡへの結合に加えて， mＡb 3Ｅ10は，ＨＰ8，すなわち丈の高い内皮細胞性小静脈に見出された細胞外 マトリックスタンパク質ＨＥＶＩＮと同一の新たに認識されたタンパク質に結合 することを発見した（Girard & Springer，Immunity 2:113，1994参照）．mＡb 3Ｅ10の可変重鎖（ＶＨ）領域の突然変異誘発試験により，ＤＮＡとＨＰ8は一部 の抗体結合部位をともに有するが，しかしながら，他の結合部位は分離し ていて，ＤＮＡとＨＰ8では別個であることが明らかにされた．mＡb 3Ｅ10の異 なる突然変異体がＤＮＡとＨＰ8を区別して認識することから，これらの突然変 異体はいずれの結合特異性がmＡb 3Ｅ10の細胞透過性および核局在性に関連する のかを決定するために利用することができる．mＡb 3Ｅ10の細胞透過性および核 局在性に対する細胞質タンパク質の役割における抗体の定常フラグメント（Ｆｃ ）の要求を評価するために，さらに分子構築体が製造された． 発明の詳細な説明 本発明によれば，生物学的に活性な化合物を標的細胞に輸送するための方法が 提供される．本発明の方法は，生物学的に活性な化合物をmＡb 3Ｅ10もしくは突 然変異体またはそれらの機能性フラグメントと組合せ，得られた組合せを上記細 胞に投与することからなる． 本発明の他の実施態様によれば，上記方法は生物学的に活性な化合物を標的細 胞に輸送する方法において，生物学的に活性な化合物を，上記細胞への輸送をエ ネルギー非依存性様式で促進し，抗-ＲＮＰではない非病原性モノクローナル抗 体と組合せ，得られた組合せを上記細胞に投与することからなる． 本発明の実施に有用なモノクローナル抗体（mＡb）たとえば細胞への輸送をエ ネルギー非依存性様式で促進し，抗-ＲＮＰ抗体ではない非病原性モノクローナ ル抗体は，インビボにおいて腎尿細管細胞を，また一次培養ニューロンを透過す ることができる．透過すると，本発明のmＡb（たとえば3Ｅ10ならびにそれらの 突然変異体および／または機能性フラグメント）は細胞の核に局在する． 本発明によれば，広範囲の生物学的に重要な化合物を，標的細胞たとえば腎臓 細胞，脳細胞，卵巣細胞．骨細胞等に輸送するために利用できるモノクローナル 抗体（たとえば，mＡb 3Ｅ10ならびにそれらの突然変異体および／または機能性 フラグメント）のクラスの存在が見出された．本発明の抗体（たとえば，mＡb 3 Ｅ10ならびにそれらの突然変異体および／または機能性フラグメント）は興味あ る生物学的化合物に接合して，細胞への輸送が可能な抗体接合体を形成させるこ とができる．細胞に侵入すると，抗体接合体は細胞の核内およびその周辺に局在 する．本発明の抗体接合体は，抗体または他の標的化ビヒクルが興味ある生物学 的化合物に接合された他の接合送達システムと同じ様式で，インビボまたはイ ンビトロ環境における所望の細胞への送達を達成するために使用できる． 本発明の抗体（たとえば，mＡb 3Ｅ10ならびにそれらの突然変異体および／ま たは機能性フラグメント）は，広範囲の生物学的に活性な材料，たとえば核転写 因子，酵素，酵素阻害剤，遺伝子等を，様々な治療効果を期待して細胞の核に輸 送するために利用できる．無機および有機化合物，医薬，薬物，ペプチド，タン パク質，遺伝子材料等を含む薬理学的に活性な化合物を，それらの送達のために 本発明の抗体（たとえば，mＡb 3Ｅ10ならびにそれらの突然変異体および／また は機能性フラグメント）に接合させることができる． 天然に存在する抗体は一般に，２個の軽鎖と２個の重鎖を含有するテトラマー である．実験的に抗体は蛋白分解酵素のパパインで切断することが可能で，それ ぞれの重鎖の切断を生じ，３個の分離したサブユニットが生成する．軽鎖および 軽鎖と質量のほぼ等しい重鎖のフラグメントから構成される２個のユニットは， Ｆabフラグメント（すなわち「抗原結合」フラグメント）と呼ばれる．第三のユ ニットは重鎖の２個の等しいセグメントから構成され，Ｆｃフラグメントと呼ば れる．Ｆｃフラグメントは通常，抗原-抗体結合には関与しないが，抗原の本体 の除去を包含する以後の過程に重要である． 本明細書で用いられるmＡb 3Ｅ10の突然変異体の語には，mＡb 3Ｅ10と同一の 細胞透過特性を維持する3Ｅ10の変異体ならびに突然変異によりその有用性が改 善された（たとえば，特異的な細胞種を標的化する能力の改善，細胞膜の透過能 の改善，細胞性ＤＮＡに局在する能力の改善等）変異体を包含する．このような 突然変異体には，抗体の重鎖，軽鎖および／または定常領域（単数または複数） に１個または２個以上の保存的置換が導入された変異体が包含される． 本明細書で用いられるmＡb 3Ｅ10の機能性フラグメントの語は，mＡb 3Ｅ10と 同一の細胞透過特性を維持する3Ｅ10の部分を包含する．このような機能性フラ グメントには少なくともmＡb 3Ｅ10の抗原結合部位を含有するフラグメントが包 含される． 本技術分野の熟練者には既に自明のように，改変された抗体［たとえば，キメ ラ，人化，ＣＤＲ-接木．二官能性，抗体ポリペプチドダイマー（すなわち抗体 の２つのポリペプチド鎖成分の会合，たとえば重鎖および軽鎖，またはＶL，ＶH ， ＣLおよびＣH１抗体ドメインからなるFabフラグメント，またはＶLドメインおよ びＶHドメインからなるＦvフラグメント）からなる抗体の１つのアーム］，単一 鎖抗体［たとえば，リンカーによってＶドHメインに連結されたＶLドメインから なるＳcＦv（すなわち，単一鎖Ｆv）フラグメントもまた本技術分野においてよ く知られた方法により製造することができる．このような抗体はまたたとえば， Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，２版（Cold Spring Har bor Laboratory，1989；引用によって本明細書に導入される）およびHarlow &L ane，Antibodies:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory，1988 ；引用により本明細書に導入される）に記載されているハイブリドーマ法，化学 的合成法，または組換え法によって製造することができる．抗-ペプチドおよび 抗-融合タンパク質抗体の両者が使用できる（たとえば，Bahouthら，Trends Pha rmacol.Sci ．12:338，1991；Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology ，John Wiley and Sons，NY，1989参照．これらは引用により本明細書に 導入される）． 本発明の実施に際して使用が意図される現時点で好ましい突然変異体は，位置 31（3Ｅ10-31）におけるアスパラギン酸残基のアスパラギンへの単一の変化を包 含するmＡb 3Ｅ10VH突然変異体である．この突然変異体の調製およびその細胞透 過能の証明は実施例５に掲げる．この特定のmＡb 3Ｅ10突然変異体は生物学的化 合物を腎臓および脳細胞に送達させるのにとくに適している．他の3Ｅ10突然変 異体および／またはそれらの機能性フラグメントは生物学的化合物の標的化を提 供するために使用される．広範囲の突然変異体および／またはそれらの機能性フ ラグメントが，送達のために選択された生物学的物質に接合させたのち，mＡb 3 Ｅ10および3Ｅ10-31と実質的に同一の細胞透過特性を発揮することが可能である ． mＡb 3Ｅ10重鎖または軽鎖は，様々な生物学的活性材料，たとえば，核転写因 子，酵素，酵素阻害剤等との融合タンパク質として製造することが可能で，それ により上述のタンパク質の，標的細胞の細胞核への輸送が可能になる．さらにm Ａb 3Ｅ10はＤＮＡに結合する他のタンパク質（たとえばポリＬ-リジンのような ）との融合タンパク質の形態で製造することができる．mＡb 3Ｅ10とポリＬ- リジンの融合タンパク質はＤＮＡ（たとえば興味ある遺伝子を含有するプラスミ ド）と結合し，そのＤＮＡを標的細胞の核に輸送する． 融合タンパク質は，抗体の重鎖または軽鎖のいずれかのアミノまたはカルボキ シ末端に興味あるタンパク質が配置されるように設計される．mＡb 3Ｅ10の抗原 結合フラグメント（Ｆab）は細胞に侵入して核に局在することが示されているの で，重鎖の全体が必要ではない．したがって，可能な相対的配置には，結合する タンパク質の機能的統合性を維持するために必要に応じてスペーサー配列を用い てまたは用いないで，重鎖および軽鎖の切断部分の使用が包含される． 上述の融合タンパク質を製造するための別法として，普遍的な担体システムを 創案することができる．たとえば，様々なタンパク質またはＤＮＡを共通の担体 たとえばプロテインＡ，ポリＬ-リジン，hex-ヒスチジン等に接合させることが できる．接合した担体で，ついで本発明の抗体との複合体を形成させることにな る．担体分子の免疫グロブリンの結合に関与する小部分を担体として使用するこ とができる．抗体の重鎖または軽鎖中に操作されるタンパク質と相互作用する担 体の設計には，他の類似の相対的配置が包含される． 本発明による抗体接合体の患者または動物への投与に選択される送達様式は， 大部分，その接合体中に存在する特定の生物学的化合物および標的細胞に依存す る．一般的には，生物学的化合物の単独を投与するために用いられるのと同一の 投与量および投与経路が，抗体接合体についてもその出発点として用いられる． しかしながら，最初は，生物学的化合物の細胞透過性の増大が期待されることか ら，小用量を使用するのが好ましい．与えられた投与経路での現実の最終投与量 はルーチンの実験により容易に決定される．一般的に，抗体ベースの他の標的化 接合体に以前に用いられたのと同一の操作およびプロトコール（たとえば，静脈 内，気管内等）がまた，本発明の抗体接合体に適している． 多くの抗-ＤＮＡ抗体が数種の細胞に侵入し，細胞の核に局在することができ る．最近の研究では，細胞の透過には抗体とＤＮＡの複合体が要求されることを 指示している．MＡb 3Ｅ10は組織培養において，多くの異なる細胞種に透過でき る．これに反して，mＡb 3Ｅ10では，インビボで結合し透過できる細胞に制限が あり，この場合，その透過を促進する遊離のＤＮＡは存在しない．インビボ におけるmＡb 3Ｅ10の腎臓細胞への透過は，ある種の細胞が細胞を透過し，細胞 の核に局在する機構とは異なる機構によって起こるものと思われる．腎臓細胞お よび脳細胞を透過するmＡb 3Ｅ10の使用にはＤＮＡまたは抗体Ｆｃ結合の存在を 要求する他の抗-ＤＮＡ抗体とは共通しない機構が関与する． 多くの異なる自己抗体がＲＮＰ（たとえばAlarcon-Segoviaら，前出，1978； Maら，Clin.Exp.Immunol．93:396，1993，Galoppinら，J.Invest.Dermatol．76: 264，1981参照），ＲＮＡ（たとえば，Varesioら，Cancer Res．35:3558，1975 参照），Ｒｏ（たとえば，Leeら，Arthritis Rheum．29:782，1986参照），プロ テイナーゼ３（たとえばCsernokら，Adv.Exp.Med.Biol．336:45，1993参照）． リボソームタンパク質Ｐ（たとえばReichlinら，J.Clin.Invest．93:443，1994 ならびにKorenら，J.Immunol．154:4857，1995参照），リンパ球（たとえば， Okudairaら，J.Clin.Invest．69:1026，1982参照），シナプトソーム（たとえば ，Fabianら，Neurology 38:1775，1988参照）およびニューロン（たとえば， Dalmauら，Neurology 41:1757，1991およびHormigo & Lieberman，J.Neuroimmun ol ．55:205，1994参照）に対する抗体を含め細胞を透過することが示され，その 一部は細胞の核に局在することが示されている．リボソームタンパク質Ｐはブタ 腎臓細胞を透過し，核に局在し，細胞傷害を誘発する（たとえば，Reichlinら， 前出およびKorenら，前出）が，ＤＮＡの存在を要しないことが明らかにされて いる． 遊離ＤＮＡの要求および細胞性透過に対するＦc結合の役割は抗体によって異 なるように思われるが，検討した抗体は，抗原の結合に他とは異なる特異性を有 し，異なる細胞種を標的とするように思われる．したがって，細胞の透過および 核局在には多重の機構が働いている可能性がある．mＡb 3Ｅ10の細胞の透過およ び核局在の機構を決定するための予備的研究では，ＤＮアーゼ処理およびＦc遮 断実験の再現が困難であったことから，これらの操作には複雑性と人為結果の可 能性が指示される．したがって，抗原緋合特異性と細胞透過性の間の関係が決定 的に確立されたmＡb 3Ｅ10可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（「可変性κ」 についてのＶｋ）の突然変異体を製造することを決定した．Ｆc結合のための要 求および細胞透過性のための多価結合は，酵素消化によって調製されたＦab 中に存在する非消化抗体およびＦcフラグメントの夾雑が全くない分子Ｆabを製 造することによって近似させた． モノクローナル抗体3Ｅ10は最近，新たに同定された細胞外マトリックスタン パク質，ＨＰ8/ＨＥＶＩＮと交差反応することが明らかにされた（たとえば，Za ckら，Journal of Immunology 154:1987-1994，1995年2月15日参照）．しかしな がら，本研究では，ＨＰ8/ＨＥＶＩＮはＣＯＳ-7または3Ｔ3細胞へのmＡb 3Ｅ10 の透過には関与しないことが指示される．実際，mＡb 3Ｅ10による細胞の透過は ，ＤＮＡ結合と相関するが，Ｆc結合とは独立であることが最終的に明らかにさ れた．しかも多価結合は必要ではない．これらの結果はmＡb 3Ｅ10の細胞透過は 抗体およびＤＮＡを含有する複合体の形成を介して起こることを示唆するが，m Ａb 3Ｅ10がＤＮＡに正確に類似する膜決定基に結合する可能性も排除できない ．さらに検討した細胞系は他の（ただしすべてではない）抗-ＤＮＡ自己抗体に よっても透過され，mＡb 3Ｅ10のインビボにおける腎尿細管細胞に対する結合特 異性およびインターナリゼーションを反映しない透過のＤＮＡ依存性機構が示唆 される． 抗-ＤＮＡ抗体による細胞透過に加えて，抗ニューロン抗体がニューロンを透 過することが示され，細胞内標的への結合が疾患の病因の機構として提案されて いる（たとえば，Fabianら，Neurology 40:419，1990参照）．さらに非免疫グロ ブリンタンパク質がニューロンを透過し，核に移動することが示されている．シ ョウジョウバエタンパク質，アンテナペディアのホモドメインに相当する60アミ ノ酸ポリペプチドは最近，神経細胞を透過し，細胞核に移動し，ＤＮＡに結合し ，神経形態発生を調節することが示された（たとえば，Joliotら，Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 88:1864，1991；La Rouxら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9120, 1993；Bloch-Gallegoら，The Journal of Cell Biology 120:485，1993および Derossiら，J.Biol.Chem．269:10444，1994参照）．無傷のペプチドの回収は標 的化がライソソーム小胞へではないことを示唆する．アンテナペディアのホモド メインペブチドとmＡb 3Ｅ10 ＶＨまたはＶｋの間の配列ホモロジーは明らかで はない． 抗-ＤＮＡ抗体の核への輸送の機構は未だ不明であるが，抗-ＤＮＡ抗体は，核 転写因子および他のタンパク質に関連する核輸送シグナルに類似するアルギニン に富む配列の結果として，細胞の核に輸送されることが示唆されている（たとえ ば，Hanover，The FASEB Journal 6:2288，1992参照）．mＡb 3Ｅ10 ＶＨおよび Ｖｋのアミノ酸配列は既知核輸送シグナルに類似する線状配列を示さないが，こ れらのシグナルはきわめて多様で，容易に認識されない．ある種の抗-ＤＮＡ抗 体によってのみ共有され，ＦＲ１およびＦＲ３中の保存されたアミノ酸配列から 構成されるmＡb 3Ｅ10 ＶＨの新規な結合ドメインが報告されている（たとえば ，Zackら，Immunology and Cellular Biology 72:513，1994参照）．これらの領 域はそれらの三次元構造の近似性により核輸送シグナルを形成できる多くのアル ギニンおよびリジン残基を有する．したがって，mＡb 3Ｅ10は核輸送シグナルと して働くことができる可能性のある数種の決定基を有する．これらが，ある種の 核局在配列の機能性受容体として作用し，核膜を横切る輸送を助ける他のタンパ ク質（たとえば，最近報告されたｈＳＲＰ１α）に結合する可能性がある（たと えば，Weisら，Science 268:1049，1995参照）．また，ある場合には，炭水化物 が核への輸送のシグナルとしても用いられる（たとえば，Duvergerら，Exp.Cell Res ．207:197，1993参照）．重鎖または軽鎖の可変領域のグリコシル化が核輸 送シグナルとして働く可能性がある． mＡb 3Ｅ10の核への輸送の機構を評価するために，シグナルペプチド配列を欠 く重鎖および軽鎖ｃＤＮＡをＣＯＳ-7細胞にトランスフェクトした．操作された 抗体は細胞質中で発現し，細胞の核は移動した（たとえばBioccaら，EMBO9(1):1 01，1990参照）．これに反し，mＡb 3Ｅ10は細胞質から核へ移動しなかった．し たがって，一次配列単独では抗体の核への輸送を誘発しないかまたは核への輸送 は細胞膜への結合によって開始される経路を利用しないかのいずれかである．い ずれの場合も，mＡb 3Ｅ10の核における局在の機構は，細胞質タンパク質たとえ ば核転写因子に使用される機構とは異なっている．mＡb 3Ｅ10は抗体を産生し分 泌するＣＯＳ-7細胞の核にはみいだされなかったことから，抗体の分泌および核 の輸送経路も別個のものであるに違いない． 本発明は生物活性化合物の細胞への導入のための特異的抗体の有用性ならびに 自己抗体透過および核の局在の細胞性経路の研究におけるこのような自己抗体の 分子突然変異体および／または機能性フラグメントの製造の有用性を証明する． 抗体の細胞透過および核局在の機構および経路を解明する研究は，このような種 の健康および疾患における役割の更なる理解を助け，このような材料の様々な治 療的適用への使用を可能にするものである． 次に，本発明を以下の非限定的実施例を参照しながらさらに詳細に説明する． 実施例１ モノクローナル抗体 mＡb 3Ｅ10，5Ｃ6，および4Ｈ2は，MRL-mpj/lprマウスの脾臓細胞を，FOX-NY 細胞系からの細胞と既報のように（Weisbartら，J.Immunol．144:2653，1990参 照）融合させて産生されたＩgＧ2a抗-dsＤＮＡ抗体である．ＤＮＡに結合しない マウスＩgＧ2a抗体，mＡb ＰＰ102（Chemicon International，Temucula,CA）を 非抗-ＤＮＡ抗体アイソタイプにマッチした対照として用いた． 実施例２ モノクローナル抗-ＤＮＡ抗体の インビトロにおけるヒト臓器の組織への結合 モノクローナル抗体はプロテインＡ-Sepharoseを用いてアフィニティークロマ トグラフィーにより腹水から精製し，腎臓への結合について試験した．mＡb 3Ｅ 10については，血管，神経幹，肝臓，結合組織，肺臓，膵臓，消化管，心筋，横 紋筋，脾臓，卵巣，睾丸，甲状腺，皮膚，眼，副腎，脳，下垂体，および骨を含 む19の他のヒト臓器からの組織への結合能も試験した．モノクローナル抗体の結 合は，既報（Taylor & Lote，Immunomicroscopy:A diagnostic tool for the su rgical pathologist ．Saunders，W.B.，Philadelphia，1994）のようにペルオキ シダーゼ接合アフィニティー精製したマウスIgGに特異的なウサギ抗体で検出し た． m Ａb 3Ｅ10はインビトロでヒト腎尿細管細胞に結合する ３種の抗-dsＤＮＡ抗体，すなわちmＡb 3Ｅ10，5Ｃ6，および4Ｈ2について固 定正常ヒト腎臓からの組織への結合をインビトロで検討した．すべての抗体が細 胞の核に結合し，それら抗-ＤＮＡ反応性と一致した．すなわち，mＡb 3Ｅ10と インキュベートした腎尿細管細胞の低倍率では腎尿細管細胞膜および核との反 応性が見られる．さらに高い倍率では，腎尿細管細胞の膜へのmＡb3Ｅ10の線状 結合が強調される．mＡb 3Ｅ10のみが腎尿細管細胞の細胞表面に結合することか 観察される． 細胞表面への結合は細胞膜への結合と一致するように見えた．mＡb 3Ｅ10は試 験した５例の正常ヒト腎臓中５例で尿細管細胞に結合したが，染色の強度にはあ る程度の変動が認められた．他の抗-ＤＮＡ抗体，mＡb 5Ｃ6を正常ヒト腎尿細管 とインキュベートした結果は核への結合を示すが，尿細管細胞膜への結合は認め られなかった．mＡb 5Ｃ6の抗-ＤＮＡ反応性は核染色により証明される．しかし ながら，mＡb 3Ｅ10とは異なり，mＡb 5Ｃ6は腎尿細管膜には結合しなかった． 同様に，mＡb 4Ｈ2は腎尿細管膜には結合しなかった．モノクローナル抗-dsＤ ＮＡ抗体のいずれにも腎糸球体における抗原への結合は観察されなかった． mＡb 3Ｅ10の腎尿細管への結合の特異性は，他のヒト臓器からの組織に対する その結合を試験することによって評価した．mＡb 3Ｅ10は．血管．神経幹，肝臓 ，結合組織，肺臓，膵臓，消化管，心筋，横紋筋，脾臓，睾丸，甲状腺，皮膚， 眼，副腎，下垂体および骨を含む19の多くの他の臓器からの組織における膜また は細胞質抗原には結合しなかった．しかしながら，卵巣および脳への結合の結果 は確定しなかった． 実施例３ モノクローナル抗-ＤＮＡ抗体の インビボにおける正常ＢＡＬＢ/ｃマウスの組織への結合 正常ＢＡＬＢ/ｃマウスをプリスタンによって感作し，2×107ハイブリドーマ 細胞を腹腔内に注射した．２週後，動物には抗-dsＤＮＡ反応性を有する抗体を 含む腹水が発生した．心臓，肝臓および腎臓組織を採取し．組織の組織学的検討 まで液体窒素中に保存した．抗-ＤＮＡ抗体の組織への結合は，既報（Taylor & Lote，Immunomicroscopy:A diagnostic tool for the surgical pathologist. Saunders，W.B.，Philadelphia，1994）のようにペルオキシダーゼ接合アフィニ ティー精製したマウスＩgＧに特異的なウサギ抗体で検出した． m Ａb 3Ｅ10はインビボでマウス腎尿細管細胞に結合する すなわち，mＡb 3Ｅ10がインビボでマウス腎尿細管細胞と反応するかどうかを 決定するために，正常ＢＡＬＢ/ｃマウスに3E10細胞を腹腔内注射して２週後， 高濃度のmＡb 3Ｅ10を含む腹水が確立したマウスからの腎臓を試験した．mＡb 3 Ｅ10は肝臓，心筋または腎糸球体の膜，細胞質または核のいずれにも局在しなか った．しかしながら，腎尿細管細胞の検査では核の染色を示し，インビボにおい てmＡb 3Ｅ10が腎尿細管細胞に選択的にインターナライズされ，核に輸送される ことが指示された．3Ｅ10からの腹水を有するＢＡＬＢ/ｃマウス３例中３例でも ，同じ結果が観察された．インビトロでmＡb 3Ｅ10とインキュベートした屠殺， 固定組織切片で核を抗体に暴露した場合とは異なり，ＢＡＬＢ/ｃマウスの生体 の無傷の腎臓では，抗体が細胞膜に結合して細胞内に侵入しないと細胞内に抗体 を含有することは期待できない．mＡb 3Ｅ10が生体の腎尿細管細胞を透過した事 実からみて，固定された死細胞で認められた細胞表面の染色は細胞膜への結合に よるものと考えられる． 3Ｅ10腹水を有するＢＡＬＢ/ｃマウスからの腎尿細管細胞をヘマトキシリン/ エオシンまたは過ヨード酸シッフ試薬のいずれかで染色した顕微鏡切片で検査し た．有意な異常は認められなかった． 無傷の腎尿細管細胞へのmＡb 3Ｅ10の選択的な透過はインターナリゼーション が特異的抗体の結合の結果であったことを示唆する．さらに，mＡb 3Ｅ10は生体 の腎尿細管細胞において核膜を横切って輸送され，核に局在しものと思われる． これに反し，mＡb 4Ｈ2抗-dsＤＮＡ抗体を含む腹水を有するＢＡＬＢ/ｃマウス ３例中いずれでも肝臓，心筋または腎臓へのmＡb 4Ｈ2の結合は見られなかった ．３回の実験に用いた腹水中には匹敵する量のmＡb 3Ｅ10（0.8mg/ml）およびm Ａb 4Ｈ2（1.0mg/ml）が存在した．mＡb 4Ｈ2と異なり，mＡb 3Ｅ10は尿細管細 胞に侵入し，細胞の核に結合する． これらの結果はインビボにおいて，mＡb 3Ｅ10がマウスならびにヒト腎臓にお いて腎尿細管細胞上の膜抗原と反応性を示し，抗-腎臓抗体は腎尿細管細胞に結 合してインターナライズされ，核に輸送されることを示唆する． 実施例４ 細胞系 ＭＤＣＫイヌ腎細胞はMostov博士（California大学，San Francisco，CA）か ら恵与された（Apodacaら，The Journal of Cell Biology 125:67，1994参照） ．293ヒト胎児腎細胞，ＣＯＳ-7サル腎細胞，ＮＩＨ 3Ｔ3細胞，ＨＴ-29結腸癌 細胞およびＬＳ 174Ｔ結腸癌細胞はAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣ Ｃ，Rockville，MA）から入手した．細胞は96または48ウエル組織培養プレート においてダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，Gibco BRL Life Technologie s，Inc.，Gaithersburg，MD）中，10％ウマ血清（293細胞）または胎児ウシ血清 （残りの細胞系）の存在下，37℃，５％ＣＯ2，湿潤雰囲気内で一夜増殖させた ． １日後，すべての培地を吸引し，モノクローナル抗体を含有する新鮮培地で置 換した．予備試験において，細胞への結合を証明するためには精製モノクローナ ル抗体濃度10μg/mlを要することが決定された．これに対し，0.5μg/mlを含む ハイブリドーマ上清（新鮮培地で1:1に希釈）は精製抗体と同様に有効であり， したがって以後の試験は精製抗体（10μg/ml）またはハイブリドーマ上清を用い て実施した． 細胞は抗体と１〜２時間インキュベートし，ハンクス平衡塩溶液およびリン酸 緩衝食塩液（ＰＢＳ）で３回洗浄した．細胞をついで70％エタノールで10〜20分 間固定し，再びＰＢＳで何回も洗浄した．ついで細胞をＩgＧ2aに特異的に結合 するアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗-マウス抗体と１時間インキュベートし た．細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し，レバミゾール含有発色溶液中ニトロブルーテ トラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドールリン酸ｐ-トルイジン塩（ＮＢＴ /ＢＣＩＰ）によって染色した． m Ａb 3Ｅ10は組織培養生存腎細胞を透過し核に移動する 数種の細胞系についてmＡb 3Ｅ10の結合を調べた．ヒト（293細胞），サル（ ＣＯＳ-7細胞）およびイヌ（ＭＤＣＫ細胞）からの細胞系はすべて，インキュベ ーションからわずか１時間後に，mＡb 3Ｅ10をインターナライズし，その抗体を 核に輸送することが観察された．これに反し，mＡb 3Ｅ10はＬＳ 174ＴおよびＨ Ｔ-29細胞系からのヒト結腸癌細胞を透過しなかった．さらに，ＤＮＡ結合反応 性をもたないマッチしたアイソタイブ対照抗体，ＰＰ102はいずれの腎 臓細胞系も透過しなかった．抗体の透過および核への局在は，わずか15分後では 認められなかったが．それは30分くらいから観察され始め，60〜90分後に最大に なった． 実施例５ m Ａb 3Ｅ10 Ｖｋの突然変異誘発 mＡb 3Ｅ10重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのクローニングは既報（たとえば，Zackら ，1994，前出，およびZackら，J.Immunol．154:1987，1995）．mＡb 3Ｅ10 ＶＨ およびＶｋの部位特異的突然変異誘発はEcksteinらの方法によって実施した（オ リゴヌクレオチド−特異的インビトロ突然変異誘発系，Amersham Corp.,Arlingt on，IL）．これらの研究に用いたＶＨ31突然変異体は既に報告されている（Zack ら，1995，前出参照）．突然変異重鎖および軽鎖ｃＤＮＡはｐＳＧ5発現べクタ ーにライゲートした（Stratagene，La Jolla，CA）．形質転換したコンピーテン ト細菌細胞から個々のコロニーを選択し，Wizard ＤＮＡ精製システム（Promega Corp.，Madison，WI）を用いてプラスミドを調製した．突然変異はジデオキシ ヌクレオチド配列決定によって確認した．mＡb 3Ｅ10 Ｖｋの突然変異誘発に用 いたオリゴヌクレオチドを以下に掲げる． m Ａb 3Ｅ10による細胞透過に対するＶＨ突然変異の影響 モノクローナル抗体mＡb 3Ｅ10重鎖および軽鎖ｃＤＮＡをＣＯＳ-7細胞にトラ ンスフェクトしＣＯＳ-7細胞によるmＡb 3Ｅ10の分泌を証明した（たとえば，Za ckら，Journal of Immunology 154:1987-1994，1995年2月15日参照）．mＡb 3Ｅ 10はＣＯＳ-7細胞に侵入できるので，分泌された抗体が培養細胞に再びインター ナライズできるかどうかを決定することに興味がもたれた．小分画のＣＯＳ-7細 胞のみが抗体を産生するので，ＣＯＳ-7細胞の上清中の抗体の濃度はわずか30〜 50ng/mlの範囲である．これは以前の実験で抗体のインターナリゼーションの証 明に要する精製抗体の濃度10〜50μg/mlおよびハイブリドーマ上清の500ng/mlに 対し著しく対照的である．期待されたように，ネイティブなmＡb 3Ｅ10はトラン スフェクション後のＣＯＳ-7細胞の約１％の細胞質に検出された．しかしながら ，核への移動の証拠はなく，抗体が分泌された経路は核移動の経路を迂回してい ることが指示されている．さらにＣＯＳ-7細胞上清における抗体濃度は隣接細胞 への抗体の再侵入の検出には不十分であった． ＣＤＲ１の残基31にアスパラギン酸からアスパラギンへの変化を含むmＡb 3Ｅ 10 ＶＨの突然変異体が以前に調製されている．この突然変異は抗体のＤＮＡへ の結合能を上昇させる（Zackら，1995，前出参照）．ＣＯＳ-7細胞をこのネィテ ィブな3Ｅ10軽鎖のｃＤＮＡおよびＶＨ31突然変異体のｃＤＮＡでトランスフェ クトすると，隣接ＣＯＳ-7細胞への侵入および核への局在が容易に観察される抗 体が生じた．突然変異体とネイティブな重鎖ｃＤＮＡについてトランスフェクシ ョン効率は同じであり，ＣＯＳ-7細胞上清中の突然変異体mＡb 3Ｅ10の濃度はネ イティブな抗体と同じであった． 結合特異性および細胞透過に対するmＡb 3Ｅ10 Ｖｋの影響 以前の研究において，新しく認識された細胞外マトリックスタンパク質ＨＰ8 のｃＤＮＡ発現ライブラリー中での同定にmＡb 3Ｅ10を用いた（Zackら，1995, 前出参照）．さらに，ＤＮＡおよびＨＰ8はmＡb 3Ｅ10 ＶＨ上に多重結合決定基 を共有することを示した．本研究では，mＡb 3Ｅ10 Ｖｋ軽鎖のＣＤＲにおける 突然変異は，dsＤＮＡおよびＨＰ8の両者，dsＤＮＡ単独ならびにＨＰ8単独への 結合を消失させることが観察された（表Ｉ）．表Ｉ 結合特異性および細胞透過に対する m Ａb 3Ｅ10 ＶＨおよびＶｋ突然変異の影響 これらの結果は，dsＤＮＡとＨＰ8がmＡb 3Ｅ10 ＶＨの結合決定基のすべてで はないが，一部を共有するとの以前の観察と一致する．3Ｔ3細胞もＨＰ8を発現 することがノーザンハイブリダイゼーションによって示された． これらの差をさらに評価するために，dsＤＮＡおよびＨＰ8への抗体の結合と ＣＯＳ-7細胞および3Ｔ3細胞への抗体透過の間の関係を検討した．ＣＯＳ-7細胞 および3Ｔ3細胞を3Ｅ10重鎖31突然変異体に相当するｃＤＮＡおよび様々なκ鎖 突然変異体に相当するｃＤＮＡでコトランスフェクトした．dsＤＮＡに対する結 合が消失または減弱したmＡb 3Ｅ10 Ｖｋ中に４つの突然変異それぞれを含有す る抗体（表１参照）では，細胞の透過は証明できなかった．これらの突然変異は ＣＤＲ１中の残基27-Ｄおよび32ならびにＣＤＲ３中の残基92および94を包含す る．２つの突然変異，ＣＤＲ１における27Ａ-Ｄの欠失およびＣＤＲ３における 残基94の変化はdsＤＮＡおよびＨＰ8両者への抗体の結合を消失させた．ＣＤＲ １の残基32およびＣＤＲ３の残基92の２つの突然変異はdsＤＮＡとの反応性を消 失させたが，ＨＰ8への結合には影響しなかった．残基27Ｃまたは残基53の突然 変異のようにＨＰ8単独との反応性が除去されても， dsＤＮＡとの結合に必須の決定基が無傷に維持されている限り，突然変異抗体で も，細胞の透過能は維持された．これらの結果は，これらの細胞系のいずれにお いてもＨＰ8は抗体のインターナリゼーションには関与しないことを示唆する．m Ａb 3Ｅ10による細胞の透過は，抗体-ＤＮＡ複合体の形成によるか，あるいはm Ａb 3Ｅ10がＤＮＡに正確に類似する膜決定基に結合することによる可能性が考 えられる． 実施例６ m Ａb 3Ｅ10重鎖および軽鎖ｃＤＮＡの分子構成体 リーダー配列のないmＡb 3Ｅ10重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを，ＦＲ１に始まりヌ クレオチド配列ＡＴＧを付加したセンスプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し た．用いたプライマーは， 重鎖センスプライマー： 重鎖アンチセンスプライマー： 軽鎖センスプライマー： 軽鎖アンチセンスプライマー： であった． mＡb 3Ｅ10のＦabの調製にはＣＨ１から停止コドンに終結する重鎖リーダー配 列を含む重鎖構成体をＰＣＲで増幅した．用いたプライマーは， 重鎖センスプライマー： 重鎖アンチセンスプライマー： であった． ＰＣＲに用いた条件は95℃で変性１分間，55℃でアニーリング１分間，および 72℃で伸長1.5分間38サイクル，各サイクルあたり２秒の付加的伸長とした． シグナルペプチドを欠くmＡb 3Ｅ10の局在 mＡb 3Ｅ10が細胞質タンパク質との結合の結果として核に輸送されるか否かを 決定するために，mＡb 3Ｅ10を，小胞体への局在ついで細胞からの分泌を防止す るためにシグナルペプチドなしでＣＯＳ-7細胞に発現させた．mＡb 3Ｅ10の産生 およびその細胞質への局在はマウスκ鎖に対する抗体を用いる組織学的染色によ って証明した．ＥＬＩＳＡで測定し，ＣＯＳ-7上清における抗体の不存在は抗体 分泌を生じないことを示した．mＡb 3Ｅ10は細胞質内に局在したが，核には移動 しなかった．偽トランスフェクトしたＣＯＳ-7細胞を対照とし，マウスκ鎖に対 する抗体を用いて同様に染色した． m Ａb 3Ｅ10 Ｆabによる細胞透過 細胞透過における抗体Ｆcならびに多価抗体結合の必要性を検討するために，m Ａb 3Ｅ10 Ｆabの細胞透過を検討した．リーダー配列を包含するmＡb 3Ｅ10重鎖 ｃＤＮＡ，ＶＨおよびＣＨ１をmＡb 3Ｅ10 ＶＨ31突然変異体のｃＤＮＡから， ＰＣＲによって増幅した．増幅フラグメントをｐＳＧ5にライゲートし，mＡb 3 Ｅ10軽鎖のｃＤＮＡとともにＣＯＳ-7細胞にコトランスフェクトした．ＣＯＳ-7 細胞にによる抗体Ｆabの分泌を，マウスγ鎖（ＣＨ１）に対するヤギ抗体でコー トしたプレートを用い，マウスκ鎖に対するヤギ抗体により検出する捕獲ＥＬＩ ＳＡによって確認した．Ｆabは隣接細胞中に再びインターナライズされ，核に局 在することが，マウスγ鎖に対する抗体による検出で見出された．偽トランスフ ェクトしたＣＯＳ-7細胞を対照とし，マウスγ鎖に対する抗体を用いて同様に染 色した．これらの結果から，mＡb 3Ｅ10による細胞透過におけるＦcおよび多価 抗体結合の必要性は除外される． 実施例７ 抗体の発現 重鎖および軽鎖遺伝子挿入体を含有する精製ｐＧＳ5プラスミドをＣＯＳ-7哺 乳動物細胞で発現させた．重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡを含有するプラスミ ドＤＮＡそれぞれ２μｇを，ＤＥＡＥ-デキストランを用い，ＤＭＥＭならびに1 0％胎児ウシ血清中で増殖させた105ＣＯＳ-7細胞にトランスフェクトした． ３日間培養したのち，上清を収穫し，軽鎖および重鎖の存在についてＥＬＩＳＡ により試験した．細胞を70％エタノールで１〜２分間固定し，再度ＰＢＳ中で何 回も洗浄した．細胞をついでＩgＧ2aに特異的に結合するアルカリホスファター ゼ接合ヤギ抗-マウス抗体とインキュベートした．細胞をＰＢＳ中で３時間洗浄 し，レバミゾール含有発色溶液中ＮＢＴ/ＢＣＩＰで染色した． 以上，本発明をそのある種の好ましい実施態様を参照しながら詳細に説明した が，記載し請求された本発明の精神および範囲内において修飾および改変が可能 であることを理解すべきである．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的に活性な化合物を標的細胞に輸送する方法において上記生物学的 に活性な化合物をmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれらの機能性フラグメ ントと組合せ，得られた組合せを上記細胞に投与することからなる方法． ２．生物学的に活性な化合物は核転写因子，酵素，酵素阻害剤，遺伝子材料， 無機および有機化合物，医薬，薬物，ペプチドまたはタンパク質である「請求項 １」記載の方法． ３．標的細胞は腎臓細胞，脳細胞，卵巣細胞または骨細胞である「請求項１」 記載の方法． ４．mＡb 3Ｅ10またはその突然変異体はmＡb 3Ｅ10またはmＡb 3Ｅ10-31であ る「請求項１」記載の方法． ５．生物学的に活性な化合物およびmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれ らの機能性フラグメントはペプチド結合により共有結合で連結させる「請求項１ 」記載の方法． ６．生物学的に活性な化合物およびmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれ らの機能性フラグメントはそれらの普遍的担体と共投与する「請求項１」記載の 方法． ７．普遍的担体はプロテインＡ，ポリ-Ｌ-リジンまたはhex-ヒスチジンである 「請求項６」記載の方法． ８．生物学的に活性な化合物を標的細胞に輸送する方法において，上記生物学 的に活性な化合物とmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれらの機能性フラグ メントの組合せを上記細胞に投与することからなる方法． ９．生物学的に活性な化合物は核転写因子，酵素，酵素阻害剤，遺伝子材料， 無機および有機化合物，医薬，薬物，ペプチドまたはタンパク質である「請求項 ８」記載の方法． 10．標的細胞は腎臓細胞，脳細胞，卵巣細胞または骨細胞である「請求項８」 記載の方法． 11．mＡb 3Ｅ10またはその突然変異体はmＡb 3Ｅ10またはmＡb 3Ｅ10-31 である「請求項８」記載の方法． 12．生物学的に活性な化合物およびmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれ らの機能性フラグメントはペプチド結合により共有結合で連結させる「請求項８ 」記載の方法． 13．生物学的に活性な化合物およびmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれ らの機能性フラグメントはそれらの普遍的担体と共投与する「請求項８」記載の 方法． 14．普遍的担体はプロテインＡ，ポリ-Ｌ-リジンまたはhex-ヒスチジンである 「請求項13」記載の方法． 15．mＡb 3Ｅ10，その機能性フラグメントまたはその突然変異体を生物学的に 活性な化合物と組合せてなる接合体． 16．生物学的に活性な化合物は核転写因子，酵素，酵素阻害剤，遺伝子材料， 無機および有機化合物，医薬，薬物，ペプチドまたはタンパク質である「請求項 15」記載の接合体． 17．mＡb 3Ｅ10またはその突然変異体はmＡb 3Ｅ10またはmＡb 3Ｅ10-31であ る「請求項15」記載の接合体． 18．生物学的に活性な化合物およびmＡb 3Ｅ10もしくは突然変異体またはそれ らの機能性フラグメントはペプチド結合により共有結合で連結させる「請求項15 」記載の接合体． 19．mＡb 3Ｅ10，それらの機能性フラグメントまたは突然変異体，生物学的に 活性な化合物およびそれらの担体からなる複合体． 20．担体はプロテインＡ，ポリ-Ｌ-リジンまたはhex-ヒスチジンである「請求 項19」記載の複合体． 21．生物学的に活性な化合物を標的細胞に輸送する方法において，上記生物学 的に活性な化合物を，エネルギー非依存的様式で上記細胞への輸送を促進し，抗 -ＲＮＰではない非病原性のモノクローナル抗体と配合し，得られた組合せを上 記細胞に投与することからなる方法．
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