【発明の詳細な説明】
病気の状態に対する治療標的およびその中和抗体様分子の同時検出法
発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関するものであり、さらに詳しくは、病気の状態
に対する未知の治療標的の検出法およびこれらの未知治療標的を中和する抗体様
分子の同時同定に関する。
発明の背景
抗体分子は研究の道具として非常に有用であることが判明している。これらは
蛋白質の構造を決定する助けとなり（１，２）、蛋白質−蛋白質相互作用のモジ
ュレーターとして（５，６）ラジオ−イムノアッセイ（３）および酵素結合イム
ノアッセイ（４）のごとき種々のアッセイ形式において使用されており、近年、
治療剤として使用するため試験されている（７，８）。特異的抗原に結合するこ
とが知られている抗体、特にｓｃＦｖのごときより小さい分子量の誘導体が、マ
イクロ−インジェクション（９）、エレクトロポレーション（１０）、および真
核生物発現ベクター（１１，１２，１３）を含めた様々な手段によって真核細胞
に導入されてきた。これらの抗体−様分子（１０）は、潜在的なヒト遺伝子治療
剤（１４）として使用する興味を生じさせてきた。
近年まで抗体は抗原の動物への注入により作られてきた（１５）。現在、種々
の抗体様分子のライブラリーが、種々の方法を用いて多くの実験室で作られてい
る（１６−２７）。また、組織細胞培養（２８）および原核生物細胞（２３，２
９）においてこれらの分子を大規模生産する方法が開発されてきた。既知の特徴
付けられた抗原（１８，３１）に結合するこれらのライブラリーから特異的抗体
が単離されている。
特異的遺伝子の発現を阻害する分子技法により、微生物および細胞経路の分析
および操作に対する非常に洗練されたアプローチが可能となる（マラスコ(Maras
co)（１９９５）イムノテク(Immunotech.)１：１−１９）。細胞により合成され
、特異的細胞区画を標的とする細胞内抗体（「イントラボディ
(intrabody)」）はこの分野において最も近年革新を示し、小胞体（ＥＲ）、細
胞質および核において蛋白質を不活性化するのに用いられてきた。抗体の細胞内
合成は、マイクロインジェクションのごとき初期の方法よりも細胞内輸送のより
正確な方法を可能としてきた。
初期の分子研究により、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerev
isiae)中の中和抗-アルコールデヒドロゲナーゼＩモノクローナル抗体の細胞質
重鎖および軽鎖の同時発現が、インビボにて酵素活性の限定された中和を供し得
ることが示されてきた。類似の研究により、適度のコリスミン酸ムターゼ(EC 5.
4.99.5)活性を有する触媒的抗体が天然の酵素を欠損する酵母細胞内で機能し得、
その触媒活性によりその宿主に増殖という利益を与えることが示されてきた。免
疫グロブリン重鎖および軽鎖の分泌、細胞質および核活性が哺乳類細胞において
また示されてきた。
抗体工学における近年の進歩により、抗体遺伝子を操作し、抗体分子を再び形
成することが可能となった。再配置された免疫グロブリン遺伝子の形態において
免疫系の遺伝情報を収集することにより、高アフィニティーで優れた特異性のイ
ントラボディーを作り出すことができる。古典的な細胞内タンパク輸送シグナル
について得られた豊富な情報と組み合わせたこれらの技術的進歩により、イント
ラボディーを多くの異なる細胞下区画に向かわせ、そこで機能的に活性ならしめ
ることが可能となる。
これらの２つの原理間の結合により、細胞内蛋白質を分析し操作するための新
しく強力な研究手段が作られた。例えば、研究手段として、イントラボディーを
感染性剤または細胞の個々の蛋白質に向けて、それらのインビボにおける重要な
機能を同定することができる。この研究手段の可能性の十分な実現は、しかしな
がら、研究者が、潜在的な治療標的である未知の細胞内蛋白質の同定および特徴
付けにおいてより効率的になるまでは遅延するであろう。
ファージ抗体工学は近年開発された技術であり、これは、繊維状ファージ粒子
の表面におけるモノクローナル抗体の発現を可能とする（５３，５４，５５）。
この工学の１つの利点は、同じファージ粒子における特異性をコードする遺伝情
報とモノクローナル抗体の特異性との結合であり、かくして、固相に付着した精
製抗原に結合させ、続いてファージ粒子を溶出させ増幅することによって特異的
ファージ抗体を強化することを可能とする（５６）。マイクロパニングまたはア
フィニティーカラム技術を用い、研究者はこの工学を、種々のハプテン、破傷風
トキソイド(tetanus toxoid)、ＨＩＶおよびＲＳ糖蛋白質、ＨＢＶコアおよび表
面抗原、プロゲステロン、チログロブリン、ＴＮＦアルファ、ＣＥＡ、可溶性Ｃ
Ｄ４、ＩＬ２Ｒ ｐ５５鎖、リゾチーム、ウシ血清アルブミン、トリプシン、無
水トリプシン、およびＬ６腫瘍関連抗原を含めた天然のもしくは組換産生物のい
ずれかとして、大量に精製できる、よく特徴付けられた抗原に対し反応性である
抗体を作り出すために用いてきた。
近年、未知の未精製細胞表面抗原を同定し、特徴付け、およびクローニングす
るための方法が報告された。ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９４／２６７８７（２７）
は、例えば、重要な細胞タイプに対する新しい抗原を発見するための方法として
の、無傷の完全細胞上の以前知られておらず未精製の抗原に向けられた抗体を生
じさせるためのファージ抗体工学を用いた方法を報告する。
ＷＯ９４／２６７８７公開によって開示された方法において、細胞集団中の標
的細胞表面上の、以前に特徴付けられていない未精製抗原に対する抗体は、線維
状ファージ粒子の一部を標的細胞に結合させるのに十分な条件下にて該ファージ
粒子の表面で発現される抗体の組合せライブラリーを標的細胞集団と共にインキ
ュベートすることによって生じる。標的細胞および結合ファージ粒子を、次いで
未結合ファージ粒子から分離し、結合したファージを回収する。これらのファー
ジ粒子を次いで増幅させて、強化されたライブラリーを作成する。標的細胞特異
的モノクローナル抗体を引き続く使用のために次いで強化ライブラリーから単離
する。
ＷＯ９４／２６７８７公開は、その報告された技術を用いて同定された細胞表
面分子が重要な生物学的機能の媒介者のようであり、薬理学上の介在の標的とし
ての臨床的適用で用いてよいことを示す。あいにく、この工学は細胞表面分子を
同定できるにすぎず、同定するには、これらの分子が細胞表面膜に存在するまで
待つ必要がある。さらに、この工学は未知で未精製の細胞内抗原を検出し、同定
し、特徴付けることはできない。それゆえ、未知で未精製の細胞内抗原を同定し
、精製できる方法に対する要望が存在する。さらに、未知で未精製の表面および
細胞内抗原を同時に同定し精製する方法に対する要望が存在する。
発明の概要
本発明は、標的細胞由来の、以前特徴付けられておらず未精製の抗原に対する
抗体様分子を同定するためのファージ抗体工学と共に、合成的にまたは免疫化に
よって作り出された組合せライブラリーの使用方法を含む。
第一の具体例において、本発明の方法は繊維状ファージ粒子の表面に発現され
た抗体様分子の組合せライブラリーを供する工程を含み、該ライブラリーは、病
気または正常な標的細胞のホモジネートで動物を免疫化することにより生じる。
別法として、該ライブラリーは組合せ化学技術により合成される。該ライブラリ
ーを、次いで、正常標的細胞のホモジネートおよび病気標的細胞のホモジネート
と、別々に、ファージ粒子の一部が正常標的細胞のホモジネートに存在する抗原
に結合して、第一のファージ結合状態を形成し、かつファージ粒子の一部が病気
標的細胞のホモジネートに存在する抗原に結合して第二のファージ結合状態を形
成するのに充分な条件下にてインキュベートする。第一のファージ結合状態を、
次いで、第二のファージ結合状態と物理的に比較して、第一または第二ファージ
結合状態のいずれか１つのみに存在するそれらの結合ファージ粒子についてのい
ずれのユニークな抗原をも同定する。ユニークな抗原に結合したファージ粒子を
次いで単離し、回収し、増幅して強化されたライブラリーを得る。
好ましい具体例において、ユニークな抗原に特異的な抗体様分子を強化ライブ
ラリーから単離し、配列決定することができる。単離された抗体様分子を正常標
的細胞のホモジネートとおよび、これとは別に、病気標的細胞とを、抗体様分子
が正常標的細胞のホモジネートあるいは病気標的細胞のホモジネートに存在する
抗原に結合するのに充分な条件下にてインキュベーションすると、抗体様分子−
抗原複合体の形成が可能となる。複合体の単離に続き、標的細胞からの以前に特
徴付けられておらず未精製の抗原を回収し、配列決定することができる。
別の具体例において、本発明の方法は、治療標的としての既知の細胞内抗原を
確認することができる。この具体例において、既知抗原に対するｓｃＦｖライブ
ラリーからの抗体様分子を病気標的細胞の集団における細胞内抗体として発現さ
せる。異なる表現型を示す標的細胞を次いで同定する。抗原が未知である場合、
病気標的細胞培養での動物の免疫化により生じたライブラリーからの抗体様分子
が、病気標的細胞の集団における細胞内抗体として発現される。改変表現型を示
す標的細胞を単離する。改変表現型の原因たる抗体様分子を、例えばＰＣＲ増幅
および配列決定により同定する。
さらに、本発明はヒト抗体ＮＥＷＭ（カバット(Kabat)抗体データベース（リ
リース第５番、１９９１年））の合成ヒト抗体ライブラリーを提供する。このラ
イブラリーは、チャート２［配列番号：３］に示されるヒト抗体ＮＥＷＭアミノ
酸配列についての重鎖可変ドメインのうち、重鎖ＣＤＲ領域、ＨＣＤＲ２（残基
５０−６５）およびＨＣＤＲ３（残基９８−１０６）につき、およびチャート３
［配列番号：４］に示されるヒト抗体ＮＥＷＭについての軽鎖可変ドメインアミ
ノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣＤＲ３（残基８４−９２）につき、表２に定義され
る配列を生じさせることによって得られる。
チャートの簡単な記載
チャート１は、ｐＢＰＶのＸｈｏＩ部位を、ｐＣＡＮＴＡＢ５ＥのＳｆｉＩ部
位に適合するＳｆｉＩ部位に変換するために必要とされるオリゴヌクレオチド類
［配列番号：１および：２］を示す；
チャート２は、ヒト抗体ＮＥＷＭ［配列番号：３］についての重鎖可変ドメイ
ンに対するアミノ酸配列を示す。
チャート３は、ヒト抗体ＮＥＷＭ［配列番号：４］についての軽鎖可変ドメイ
ンに対するアミノ酸配列を示す。
詳細な記載
本発明のプロセスは、標的細胞からの以前知られておらず未精製の抗原に対す
る抗体様分子（例えば、Ｈｖ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）2またはＡ
ｂ）を生じる方法を含む。これらの抗原は潜在的な治療標的と関連するので、抗
体様分子を特定のエピトープに結合させると、細胞膜に取り込まれる蛋白質また
はいくつかの細胞経路における蛋白質の機能に干渉し得る。
本発明の方法の第一の具体例において、繊維状ファージ粒子表面に発現された
抗体様分子の組合せライブラリーであって、病気または正常標的細胞のいずれか
のホモジネートで動物を免疫化することによって生じるか、または組合せ化学技
術を用いて合成される該ライブラリーを、ファージ粒子の一部をホモジネート中
に存在する抗原に結合させるのに充分な条件下にて正常（病気）標的細胞のホモ
ジネートと共にインキュベートする。病気または正常の状態からの蛋白質とのこ
の相互作用はイムノ−アフィニティー技術を用いて達成することができる。
この相互作用に続き、病気（正常）状態からの蛋白質の解像を、２−Ｄプロテ
インゲルで達成する。残存する（可溶性）抗体様分子を用いたウエスタンブロッ
トを次いで行って適当な標的を同定する（「蛋白質引き算アプローチ(protein s
ubstraction approach)」）。これらのユニーク抗原に結合するファージ粒子を
次いで単離し、回収し、増幅して強化ライブラリーを得る。
本発明の第二の具体例において、抗体様分子の組合せライブラリーを、病気ま
たは正常の状態を示す真核生物細胞系に導入する。抗体様分子は、病気標的細胞
の集団中の細胞内抗体(イントラボディー(intrabody))としてライブラリーから
発現され、続いてもし細胞が病気状態であるならば正常への復帰のための、また
正常細胞の病気の状態への誘導のためのトランスフェクト細胞のスクリ−ニング
および／または選択を行う（「スクリーニング」アプローチ）。改変表現型を示
す細胞を単離し、表現型を改変する原因であるファージ粒子（または抗体様分子
）を同定する。
抗体様ライブラリーの産生用の蛋白質抗原の源は、種々の源、例えば：１）適
当な細胞系または病気動物から精製した、病気状態を引き起こすことが知られて
いる蛋白質；または２）病気状態を引き起こすと考えられる蛋白質をコードする
と考えられている遺伝子であって、クローン化され所与の宿主において発現され
またはインビトロで転写され／翻訳される遺伝子から得ることができ、次いで精
製される。抗体様組換えライブラリーを、構成的または制御的発現のための適当
なベクター（類）にて、選択された宿主中で発現させる。要すれば、公知の転写
、翻訳、スプライス開始および終止シグナルを組み込む。真核細胞で発現された
抗体は細胞質に存在するが、もし所望であるかあるいは必要ならば、発現ベクタ
ーを公知の局在化シグナル（３８，３９，４０，４１）で修飾して、抗体をして
細胞下部位を標的とさせることができる。
免疫化技術を用いた抗体ライブラリーを得るのに加え、１９９３年１１月２３
日発行のＨｕｓｅに対する米国特許第５,２６４,５６３号に教示されるごとき組
合せ化学合成法は、これらの潜在的治療標的を同定するのに充分な多様性および
親和性を持つ抗体ライブラリーを生じることが可能である。略言すれば、Ｈｕｓ
ｅ法は、コドンのトリプレットによりＤＮＡを合成し、引き続いてその上でＤＮ
Ａが合成される樹脂を混合して、ランダム、セミランダム、またはオリゴヌクレ
オチドの標的化混合物を達成することを含む。後記の実施例３に示されるように
、この方法はカバット(Kabat)抗体データベース（３６ａ）に定義されるごとき
重鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ、ＬＣＤＲ３に対
するオリゴヌクレオチドのライブラリーを作り出すのに用いられる。別法として
、各ＣＤＲに対するオリゴヌクレオチドのライブラリーを、トリヌクレオチド指
向性突然変異誘発（５２）によって合成する。この方法では、全２０アミノ酸に
対するコドンを表すトリヌクレオチドホスホアミダイトを上記のごとく調整し、
次いで自動固相ＤＮＡ合成で用いる。ライブラリーは、各個々の残基位置にて所
望されるアミノ酸のパネルを表す調製されたコドンの混合物を添加することによ
って得られる。例えば、実施例３を参照して、カバット(Kabat)抗体データベー
スにおいて定義されるごときＬＣＤＲ３領域をコードするオリゴヌクレオチドの
ライブラリーの合成は、ＬＣＤＲ３の残基位置８４と８５における２つの連続し
たグルタミンをコードするオリゴヌクレオチドＣＡＧＣＡＧの固相合成で始まる
。次いで、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＳｅｒおよびＧｌｙに対するコドンを示す
５つの異なるトリヌクレオチドホスホルアミダイトを等量で混合し、コアのＣＡ
ＧＣＡＧオリゴヌクレオチドに化学的に付加する。（異なるトリヌクレオチド比
の混合物は、所与の残基部分の個々のアミノ酸の他の予め決定された表現をコー
ド
するオリゴヌクレオチドを合成するために用いることができる。次の位置のため
に、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＳｅｒに対するコドンを示すトリヌクレオチ
ドホスホルアミダイトを等量で混合し、該オリゴヌクレオチドに化学的に付加す
る。要すれば、この一連の工程は、表２に示されるＣＤＲ位置にての残基の使用
則に基づき継続する。
スクリーニング法においても蛋白質引き算法においても、それらの各未知の抗
原に対して不充分な親和性を有する目的抗体のいずれもが、標準的分子生物学技
術（例えばＰＣＲ突然変異誘発）を用いて両方の鎖に対するＣＤＲを改変するこ
とによって最適化される。さらに、回収されたファージ抗体の増幅により、強化
ファージ抗体ライブラリーが得られる。この強化工程を数回繰り返すことによっ
て、それらの各抗原に対して高い特異性を有するファージ抗体ライブラリーが生
じる。強化の各ラウンドは標的抗原に対して高い親和性を持つ抗体の提示量を増
加させるが、ライブラリーの多様性を減少させる。従って、強化の量は使用者の
具体的要求に依存する。
一度強化ライブラリーが生じると、未知抗原に特異的なモノクローナル抗体を
ライブラリーから単離する。かくして、未知抗原に対し反応性であるファージ抗
体が得られる。該モノクローナル抗体を、公知であって、当業者に使用可能な方
法を用いて単離する。
構築可能な他のライブラリーは：１）上記に概説されたと同じ方法による異な
るヒト抗体の使用；２）残基部位にてのアミノ酸組成の選択のためのヒト抗体デ
ータベースの使用；３）重鎖および軽鎖ＣＤＲの異なる組合せのランダム化；お
よび４）上記１−３により構築されたライブラリーのいくつかの組合せである。
本方法と関連して使用される細胞集団は、凍結組織切片のごとき全組織切片を
含み、ここに治療標的細胞集団は同定可能である。治療標的細胞亜集団を同定し
、単離するための例示的方法は、免疫組織化学的マーカー、細胞集団の物理的位
置決定、または当業者に公知の他の方法の使用を含む。組織切片を用いた本発明
の実施において、ファージ粒子が未知抗原に結合するのに充分な条件下にて組織
切片のホモジネートを、ファージ抗体ライブラリーと共にインキュベートする。
本発明の好ましい具体例は、標的細胞からの抗原、それらの結合により目的フ
ァージ抗体を同定するための標的細胞の表現型特徴を使用する。別の具体例にお
いて、ファージ抗体は、もしそれらが同定可能であって予め選択可能な機能を有
することが示されるならば、そのような機能を有しない他のファージ抗体と比較
して選択される。いずれの具体例においても、ファージ抗体は、例えば、ファー
ジ抗体−抗原結合の機能の重要性につきアッセイできる。１のアッセイは細胞内
カリウム濃度を測定することであり得る。もう１つの効果的なアッセイは、細胞
活性化、細胞増殖、または細胞殺傷、あるいはこれらの活性阻害を検出するのに
使用できる。なおさらなるアッセイは公知であって当業者に入手可能なファージ
抗体を同定する他の機能的方法を用いることもできる。
該抗体は、膜内在性抗原を含めた目的抗原を同定するために細胞内またはイン
ビトロにて用いることができる；インビトロの有用性は上記を参照すれば明らか
であろう；しかしながら、全細胞について、抗原および抗体は、細胞膜に取り込
まれる抗原（例えば翻訳後修飾、および潜在的には細胞外エピトープそれ自体）
またはいくつかの細胞経路における蛋白質の機能に干渉するであろういずれのエ
ピトープをも認識する抗体を用いて細胞内で選択される。
低存在量の蛋白質は２−Ｄゲルを用いて同定することができる。２次元ゲル電
気泳動で使用されるゲルをＰＶＤＦメンブラン(シュライヒャーおよびシュル(Sc
hleicher and Schull))上にブロットし、抗体ライブラリーのプールでプローブ
する。抗体結合は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した第二抗体で検出
した。蛋白質のスポットは増強された化学発光により可視化した。異なって発現
された蛋白質のスポットが励起され得る。抗体ファージ粒子を回収し、ついでそ
れを用いてイー・コリ(E．coli)を感染させることができる。感染イー・コリか
ら回収された抗体を用いて、蛋白質を精製する。蛋白質のｃＤＮＡは、ＤＮＡ発
現ライブラリーを該抗体でスクリーニングすることにより得られる。
本発明はさらに以下の限定されない実施例にて記載される。これらの実施例は
第一に「既知の」治療標的を同定し特徴付ける方法の使用法を示す。後のほうの
実施例は次いで「未知の」治療標的を同定し特徴付ける方法の使用法を示す。実施例１ Ａ．「マウス」ｓｃＦｖライブラリーの構築
マクロファージの侵入に際して、シゲラ・フレクネリ(Shigella flexneri)は
細胞質に存在し（４２）、数種類の蛋白質を分泌するが、そのうちの１つがｉｐ
ａＢ遺伝子によりコードされている（４３）。この遺伝子産物はマクロファージ
でアポトーシスをトリガーするので（４４）、これは潜在的治療標的であって、
本発明の方法を示すのに用いることができる。
ｓｃＦｖ抗体分子のライブラリーを生じる第一工程は、精製ｉｐａＢをマウス
に注射することである。マウスを殺し、それらの脾臓を収集した後、ネズミ抗体
重鎖および軽鎖のためのポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを単離する。重および軽可変鎖を
ファルマシア・バイオテク・リコンビナント・ファージ・アンチボディー・シス
テム・マウス・エスエフシーブイ・モジュール(Pharmacia Biotech Recombinant
Phage Antibody System Mouse scFv Modu1e)(カタログ番号２７−９４００−０
１)によって連結する。発現された組換え抗−ｉｐａＢ ｓｃＦｖ抗体のライブ
ラリーが、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅの原核細胞での発現により生じる。このプラスミ
ドおよびｓｃＦｖライブラリーを生じる手段は、ファルマシア・バイオテク・リ
コンビナント・ファージ・アンチボディー・システム・マウス・エスエフシーブ
イ・モジュール(Pharmacia Biotech Recombinant Phage Antibody System Expre
ssion Modu1e)(カタログ番号２７−９４０１−０１)によって行う。
引き続き、それらを適当な真核細胞発現ベクターにサブクローンする。ファル
マシア・バイオテクから購入したがこれらに限られないこれらのベクターは、ｐ
ＢＰＶ（カタログ番号２７−４３９０−０１）およびｐＳＶＫ３（カタログ番号
２７−４５１１−０１）であり、これにはウシ・パピローマウイルスおよびＳＶ
４０複製起点をそれぞれ有する。クローニングに使用される与えられた真核生物
発現ベクターのための制限部位は、サブクローニングを可能とする設計されたオ
リゴヌクレオチド類のｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅのそれらと組み合わせ可能な適当なＳ
ｆｉＩおよび／またはＮｏｔＩ部位に変換される。例えば、ｐＢＰＶベクターの
ためのＸｈｏＩ部位は、オリゴヌクレチド１および２（チャート１）［配列番号
：１および２］を用いてＳｆｉＩ部位に変換され；ＮｏｔＩ部位は不変である。
他のベクターに適当な改変を行い、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅからのサブクローニング
の制限部位の和合性を可能とする。Ｂ．スクリーニングアプローチによる既知抗原の同定
ｐＢＰＶにサブクローンされたマウス抗−ｉｐａＢ ｓｃＦｖライブラリーを
、エレクトロポレーション手段（５０）により、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションから入手可能なネズミ単球−マクロファージセルライン（カタ
ログ番号ＡＴＣＣ ＴＩＢ６７）にトランスフェクトする。トランスフェクトさ
れたライブラリーを次いでシゲラ・フレクネリ(Shigella flexneri)、血清型２
のビルレント株で感染させる。エス・フレクネリのビルレント株はマクロファー
ジにおいてアポトーシスを誘導することが示されてきた（５１）。アポトーシス
の事象を生き延びたマクロファージ細胞を次いでサブクローンし、大量に培養す
る。
全ＤＮＡは、これらの生き延びたトランスフェクト細胞系から通常の抽出法に
より得られる(例えば、ハート(Hirt)法、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Me
thods in Enzymology)(1971)、W．B．JakobyおよびI．H．Pastan編、第５８巻、
第４０６頁−第４０８頁)。ファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech)から
購入した適当なオリゴヌクレオチドプライマー(pCANTAB5E・ジーン・レスキュー
・プライマーズ、カタログ番号２７−１５８１−０１）を用いて、ｓｃＦｖ抗体
をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、単離し、サブクローンした。ファ
ルマシア・バイオテク・pCANTAB5E・ジーン・シーケンシング・プライマーズ(Ph
armacia Biotech pCANTAB5E Gene Sequencing Primers)(カタログ番号２７−１
５８５−０１)と関連して、これらのｓｃＦｖ ＤＮＡ類もまた配列決定する。
興味のあるインサートを含むプラスミドＤＮＡもまた全ＤＮＡ調製物からＰＣＲ
により直接単離できる。いずれの方法によっても、同様に、興味のあるｓｃＦｖ
を含むプラスミドをマクロファージに導入し、シゲラ・フレクネリ誘導アポトー
シスを阻害するそれらの能力を試験する。最も効率良くアポトーシスを防ぐ構築
物が興味のあるものである。それらは、アポトーシスの原因となる薬剤であろう
抗原（蛋白質）の精製で使用される。抗体ライブラリーは精製されたｉｐａ
Ｂ抗原に由来するので、これは同定された蛋白質である。実施例２ 蛋白質引き算アプローチによる抗原の同定
エシェリキア・コリ宿主タイプおよび野生型Ｍ１３ファージとの同時感染が使
用されるか否かに依存して、ｓｃＦｖ分子（上記参照、実施例１）を、可溶性抗
体またはＭ１３遺伝子３タンパク質の融合分子として発現させる。細菌の周辺腔
に可溶性抗体を生じるために、ｓｃＦｖ抗体のライブラリーをイー・コリのサプ
レッサー欠損株(sup-)で発現させる。細胞に浸透圧ショックを与え、抗体を部分
的に精製する；例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅのペプチドタグに向けられた商業的
な抗体(バイオテク・ファルマシア(Biotech Pharmacia)カタログ２７−９４１２
−０２))をイムノ−アフィニティ精製のために用いる。
全蛋白質ホモジネートをＪ７７４Ａ．１単球−マクロファージ細胞系およびシ
ゲラ・フレクネリで感染させた同じ細胞系の両方から調製する。ホモジネートは
、破壊された細胞の全ての成分または典型的な生化学分離技術、例えば、膜、オ
ルガネラ、核または細胞質画分の抽出により単離されたあらゆる画分からなる。
未感染マクロファージ細胞の全蛋白質ホモジネートを可溶性ｓｃＦｖ抗体の精製
ライブラリーと混合する。抗原に結合しない抗体は、適当なセファデックス(Sep
hadex)カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。蛋白質
調製物に結合するこれらの抗体を集め、捨てる。未結合で可溶性抗体(SA)を含む
他の画分を維持する。
シゲラ・フレクネリで感染させたマクロファージから得られた全蛋白質抽出物
を２−Ｄ蛋白質ゲル上で泳動させる（４５）。ウェスタンブロットを、残りの可
溶性抗体（ＳＡ）を用いて行う。これらの抗体に結合する蛋白質をゲルから切り
出し、ミクロアミノ酸配列分析（４６）を用いて、蛋白質配列を得る。実施例３ 「ヒト」ｓｃＦｖライブラリーの構築
ヒト抗体ＮＥＷＭの重および軽鎖可変ドメイン配列（３６ａ）を、合成ｓｃＦ
ｖ分子のライブラリーを得るための基礎として使用する。ＮＥＷＭ抗体可変領域
のアミノ酸配列をチャート２および３に示す［配列番号：３および４］。重鎖可
変領域は残基５０−６４（ＣＤＲ２）および９８−１０６（ＣＤＲ３）を含む。
ＮＥＷＭ ｓｃＦｖは、重および軽鎖可変領域配列をコードする合成オリゴデオ
キシ−リボヌクレオチド類を、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーペプチドをコードす
る合成オリゴヌクレオチド配列と、インフレームにて接合することにより得られ
る。ＮＥＷＭ ｓｃＦｖ蛋白質をコードするこの合成ＤＮＡのこの合成は、合成
ｓｃＦｖライブラリーの構築への出発点である。
ライブラリーにおける配列変化は、抗体−抗原相互作用および／または適当な
抗体構造のために重要と確認される残基位置における既知のネズミ抗体ＣＤＲｓ
の配列のための大きいデータベースでの異なるアミノ酸の使用頻度に基づく（３
２−３６）。アミノ酸頻度データを、公開されたジャーナルの論文（３２−３６
）およびカバット(Kabat)抗体データベース（リリース番号５，１９９１年）（
３６ａ）からの情報とコンパイルする。ネズミ抗体のために使用可能なアミノ酸
配列データを全て並べ、定量化して、最初のライブラリー中のそれぞれの変化可
能な残基におけるそれぞれのアミノ酸の相対頻度を決定する。データベース中の
異なる数種類を示すために必要とされる最小数を示す個々のアミノ酸の組合せを
決定する。表２は該ＣＤＲ領域の示された部位における取込み用に選択されたア
ミノ酸を示す。
ライブラリーは、ヒューズ(Huse)に対して１９９３年１１月２３日発行された
米国特許第５,２６４,５６３号に教示されているコドンをベースとした組合せ化
学合成で生じる。略言すれば、該方法はコドンのトリプレットによりＤＮＡを合
成し、続いてその上でＤＮＡが合成される樹脂を分け、混合して、ランダム、セ
ミ−ランダムまたはオリゴヌクレオチドの標的化混合物を得ることを含む。この
方法は、重鎖ＣＤＲｓ、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに軽い鎖ＣＤＲ、
ＬＣＤＥ３に対するオリゴヌクレオチドのライブラリーを作り出すために使用す
る。
例えば、ＬＣＤＲ３領域をコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーの合
成は、ヌクレオチド配列ＣＡＧＣＡＧ（ＬＣＤＲ３位置８４および８５に対し）
を含むグルタミンのための２つの連続したコドンの単一バッチの樹脂上での合成
で開始する。該樹脂を次いで、表２に示されるようにＬＣＤＲ３位置８６のため
に選択された５つの異なる可変アミノ酸を示す５つの当量に分ける。使用される
コドンは、該ライブラリーを望む発現ベクターにクローンするのに用いられる制
限部位のいずれもが合成インサート中に存在しないように選択される。現実のコ
ドンは異なるベクター系について異なっていてもよい。１つの例として、Ｈｉｓ
をコードするヌクレオチドＣ、Ａ、Ｔ、ＴｙｒをコードするＴ、Ａ、Ｔ、Ｔｒｐ
をコードするＴ、Ｇ、Ｇ、ＳｅｒをコードするＴ、Ｃ、ＴまたはＧｌｙをコード
するＧ、Ｇ、Ｔを、樹脂の第一、第二、第三、第四、および第五の部分のＣＡＧ
ＣＡＧオリゴヌクレオチドに化学的に付加させる。５つの部分を組み換え、混合
し、次いで、ＬＣＤＲ３における位置８７のために選択された４アミノ酸の変化
を表す４つの等しい部分に分ける。ＴｙｒをコードするＴ、Ａ、Ｔ、Ｔｈｒをコ
ードするＡ、Ｃ、Ｔ、ＡｓｎをコードするＡ、Ａ、Ｔ、またはＳｅｒをコードす
るＴ、Ｃ、Ｔのヌクレオチドを樹脂上の第一の部分から第四の部分までのオリゴ
ヌクレオチド類にそれぞれ付加する。樹脂の４つの各部分を再び組み換える。要
すれば、一連の樹脂の配列、示されたコドンの合成、および再混合を、表２に示
されるＣＤＲ位置にての残基の使用則に基づき継続する。
各ＣＤＲ領域用のオリゴヌクレオチドのライブラリーを用いて、ＮＥＷＭ ｓ
ｃＦｖをコードする親オリゴヌクレオチドにおける対応するＣＤＲ領域を置換す
る。各オリゴヌクレオチド混合物におけるセミ−ランダム領域を、親ＮＥＷＭ抗
体からの隣接配列の隣に置き、以前詳細に記載されているごとくハイブリダイゼ
ーション突然変異誘発を可能とする（４７、４８、４９）。３つのＣＤＲ領域を
連続してまたは組合せにおいて置換する。組合せｓｃＦｖ抗体ライブラリーの多
様性を最大にするために、該組合せｓｃＦｖライブラリーは上記の３つのセミ−
ランダムコドンライブラリーの各々を含む。カセットを導入し、該ライブラリー
を、ｐＣＡＮＴＡＢ５のごとき適当なベクターへのクローニング（上記の実施例
１に記載）するための標準的合成もしくは分子生物学的技術を用いて、限定され
るものではないが、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩのごとき制限部位を含む適当なオリ
ゴヌクレオチドリンカーを添加する。この技術により全ｓｃＦｖライブラリーま
たは個々のｓｃＦｖクローンの導入が促進される。要すれば、適当なベクターは
、選択された宿主内での構成的発現を可能とする公知の転写および翻訳開始なら
びに終止シグナルを含むが、制御されたプロモーターを用いることもできる（３
７）。実施例４ 「ヒト」ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの使用
実施例２に記載されている方法を、実施例１に記載されているマウスｓｃＦｖ
ライブラリーよりむしろ実施例３に記載されているヒトｓｃＦｖ抗体ライブラリ
ーを用いて複製する。該ｉｐａＢ遺伝子産物に加えて、ヒトｓｃＦｖライブラリ
ーは、ｉｐａＢの下流のアポトーシス事象に関与する真核（マクロファージ）蛋
白質の同定を可能とする。マクロファージのアポトーシス経路につき同定される
抗原を、他の細胞タイプにおいてアポトーシス経路と比較して、潜在的に共通で
あるかまたは具体的治療的成分の同定が可能となる。この情報は、どの抗原が潜
在的治療的標的であるかを決定するために役立つように有用である。
実施例２におけるように、これらの抗原に結合する抗体を発現させ精製する。
次いで、これらを用いて、それらの各抗原をイムノ−アフィニティー精製する。
引き続き抗原を配列決定し、それらの遺伝子を合成し、クローン化し発現させる
。蛋白質およびＤＮＡデータベースのサーチを行って、同定可能な活性がこれら
の抗原と関連するか、例えば、それらがキナーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ
、リパーゼ、グリコラーゼ、リガーゼであるか否かを調べる。同定された活性に
ついて、生化学アッセイが薬物発見努力における使用のために開発される。すな
わち、精製された抗原を、抗原の活性を阻害するであろう小さい有機分子につい
て試験する。これらの小さい有機分子をテストして、ｓｃＦｖ抗体のごとく、そ
れらがやはり抗原を阻害することを確認する。
相同性がデータベースから確認されない場合は、生化学研究を行って潜在的能
力を確認する。もし生物学的活性が精製された抗原につき測定されなければ、抗
原の可能な使用は、置換アッセイを開発することである。置換アッセイによって
、真核細胞内で活性を阻害することが公知である抗体が、インビボにてその真の
生
理学的活性に必須の抗原上のエピトープを認識することが推測される。このアッ
セイにおいて、抗原またはその同族体ｓｃＦｖ抗体が（例えば、放射性同位体標
識（Ｉ125）または蛍光標識（フルオロセリンイソチオシアナート）によって）
標識される。これらの２つの同族体分子、抗原および抗体に結合する場合、標識
された物質を未標識物質から置換する小さい有機化合物のサーチを行う。実施例５ 新規な治療標的の同定
上記実施例は既知の（純粋蛋白質）または未知の標的および／またはこれらの
標的に対して生じた抗体の使用を含む。これらの方法は、新規治療標的を同定す
るために拡大できる。ｐ５３−誘導アポトーシスに重要な蛋白質の同定は注目に
値する例として役立つ。ｐ５３−依存性アポトーシスの臨床的重要性は、化学療
法および放射線照射に抵抗のある癌中の機能不全ｐ５３の存在により強調される
（５７）。対照的に、化学療法剤および放射線照射によく反応する癌は、誘導ア
ポトーシスにより標的細胞を除去するために機能的ｐ５３を利用するように思わ
れる（５７）。ｐ−５３誘導アポトーシスの分子メカニズムは未知である。
以前の実施例において議論されたように、ヒト・ｓｃＦｖ抗体ライブラリーの
プールの、ｐ５３−依存性アポトーシスを経験する細胞へのトランスフェクショ
ンが、重要なアポトーシス蛋白質を中和し、同定するために用いられる。このア
プローチにおいて、約１０3抗体クローンを含むプールが、ＭＣＦ−７胸部癌細
胞の培養にトランスフェクトされる。（アクセッションナンバーＨＴＢ２２でア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州ベセスダ(Ameri
can Type Culture Collection，Bethesda，Maryland)より入手可能な）ＭＣＦ−
７細胞は、経験するアポトーシスにより様々な剌激に反応する。アポトーシス誘
導剌激は、例えば、腫瘍壊死因子、ＵＶ照射およびエトポシドを含む。抗体プー
ルの誘導に従い、細胞をＵＶ照射への暴露により剌激し、培養培地中でインキュ
ベートして保護されない細胞の死を可能とする。耐性コロニーを維持し、別個の
コロニーのサブカルチャーにより拡大する。クローン集団が拡大し、潜在的保護
抗体が、ＰＣＲ増幅および配列決定により同定される。この抗体を次いで
元の細胞モデル由来の発現ライブラリーのスクリーニングにより興味のある蛋白
質を同定するのに用いる。実施例６ 治療標的としてのインターロイキン−１変換酵素の同定
多くの細胞タイプでの細胞死の誘導には、インターロイキン−１変換酵素（Ｉ
、ＣＥ）に相同性のあるプロテアーゼのファミリーの活性化がしばしば伴う。Ｉ
ＣＥプロテアーゼの６つのヒトホモログが現在存在する（５８）。様々な組織に
おけるこれらのプロテアーゼの役割ははっきり分からない。上記実施例の教示に
従い、抗体ライブラリーネズミを、このプロテアーゼファミリーの代表的なイソ
型を用いて得る。インビトロプロテアーゼアッセイにより、該ファミリーメンバ
ーに向けられる特異的な阻害抗体が同定される（３０）。これらの抗体を引き続
いてクローニングし、細胞死の様々なモデルにおいて、これらの抗体の引き続く
発現のための哺乳類発現ベクターへ導入する。ＩＣＥプロテアーゼに対して向け
られた抗体での細胞死の阻害により、これらの蛋白質が薬剤開発のための潜在的
標的として確認され、様々なＩＣＥプロテアーゼファミリーメンバーの関与の特
異性が示される。
先行する発明が例示および理解の明晰さの目的のための実施例によっていくら
か詳細に記載されてきたが、ある変化および修飾が、本明細書中で特許請求され
る範囲内で行うことができる。
全ての引用された文献はその完全な形で参考文献に包含される。参考文献
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５７．Lowe，Ｓ.Ｗ.(1995).癌療法およびp53(カル・オビン・イン・オンコロジ
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ゼ活性化:千のカットによる死？(Protease activation during apoptosis: deat
h by a thousand cuts?)セル(Cell)82:349-352.
表２．抗体ＮＥＷＭについてのＣＤＲにおける特異的残基に挿入されたアミノ酸 チャート１ チャート２ チャート３
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ
，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，
ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ
(72)発明者 フィッシャー，ハワード・ディ
アメリカ合衆国49004ミシガン州カラマズ
ー、イースト・エイチジェイ・アベニュー
5804番