JP2000501381A

JP2000501381A - 粘膜免疫応答のホルモン免疫調節誘導

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Publication number: JP2000501381A
Application number: JP9516083A
Authority: JP
Inventors: エム．ミッチェル，ウィリアム
Original assignee: バンダービルトユニバーシティー
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 2000-02-08
Also published as: DE69629202T2; EP0855919A1; EP0855919B1; AU7462096A; ATE245453T1; CA2233166A1; WO1997014442A1; DE69629202D1; CA2233166C; AU696850B2; EP0855919A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、粘膜免疫応答を誘導するために有効な所定量の抗原をコードするＤＮＡおよび所定量のビタミンＤ３を患者に投与する工程を含む患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡは、トランスフェクトした細胞の表面で発現して感染の厳密な要素を模倣する抗原をコードすることが可能である。ウイルス病原体のエンベロープ糖蛋白質をコードするＤＮＡが、本発明の方法に使用される。カチオン性脂質は、イオン電荷複合体を形成するＤＮＡ鎖の負に荷電したリン酸の酸素と正に荷電した基との配位が存在するカチオン基と共有結合した１個以上の疎水性鎖からなる二官能性分子である。カチオン性脂質の２つの好ましい例は、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミジン）およびＴＥＤＢＩ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルＮ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨウ化物）である。また、本発明は、カチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡを含有する組成物も提供する。より具体的には、本発明は、カチオン性脂質と複合体を形成した、ＨＩＶのエンベロープ抗原をコードする所定量のＤＮＡを含有する組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】粘膜免疫応答のホルモン免疫調節誘導発明の背景発明の属する技術分野本発明は、粘膜免疫に関する。具体的には、本発明は、患者にカチオン性脂質と複合体を形成させたＤＮＡおよびビタミンＤ３を投与することにより患者における粘膜免疫応答を誘導する方法に関する。背景技術粘膜表面は、通常、再感染に対して長期的保護を提供する二次的粘膜免疫を伴う大抵の全身性病原体の主要進入経路の代表である（２５）。Ｓａｂｉｎ経口ポリオワクチンにより産生される長寿命免疫対Ｓａｌｋ非経口ワクチンにより提供される比較的短期間の保護（４８）および改良された安全面を伴う単回投与の経口コレラワクチン対古くからの多数回投与の非経口コレラワクチン（２７）という例が挙げられる。感染に対する最良の長期粘膜および全身性保護は、投与を受けていない宿主感染を刺激するが病気を誘導できない生の弱毒化病原体により提供される（２８）。クローン化した微生物で弱毒化変異を生じさせる現行の能力に係わらず、毒性または宿主毒性決定要因への復帰可能性についての懸念は、事実上ヒトへの使用のための粘膜免疫誘導剤としての生の弱毒化病原体の開発を阻害してきた（２９）。例えば、１９９４年１１月のＮＩＨ主催のＨＩＶワクチンミーティングの最近のミーティングにおいて、ワクチン投与を受けていた新生レサス属アカゲザルにおいて、弱毒化ＳＩＶ（即ち、Ｎｅｆの欠失）がサルＡＩＤＳの発生原因であったことを報告したルスルプレヒト(Ruth Ruprecht)により、弱毒生ウイルスワクチンの提案者は打撃を受けた（２９）。弱毒化ＨＩＶは、ＨＩＶワクチンとしてＦＤＡの認可を将来的にも受けられそうにない。現在、世界中で毎日１０，０００の個人がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している。世界保健機構（ＷＨＯ）は、２０００年までに少なくとも４０００万の人がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染するであろうと見積もっている。ウイルスの残忍さおよび進行性の病原性により、感染者の大部分が１０年以内に死ぬであろう。さらに、２１世紀に入った時には１０００万の死者になると見積もっている。ワクチン開発のための産業上の初期の多大な努力にも係わらず、商業上の開発者はほとんど残っていない。最近、ＡＩＤＳ Research Advisor y Program Committee(ＡＲＡＣ)が、２つの先導的サブユニットワクチン候補のフェーズIII 臨床試験において続行しないという票決をした際に、ＮＩＨの国立ＨＩＶＶａｃｃｉｎｅは厳しい後退を被った。ＨＩＶワクチンの開発のための現努力に伴う別の困難さは、ＨＩＶに対する粘膜免疫応答発生における研究不足である。疫学的データにより、すべてのＡＩＤＳのケースの７０〜８０％がＨＩＶの異性間伝染の結果であることを明らかに示している（３０〜３８）。男性よりも女性の方がＨＩＶによる有意に大きな感染リスクを負っているというアメリカ合衆国において、異性間伝染は、伝染の最も速い増大ルートである（３９、４０）。ＨＩＶの９０％が性的に世界中に伝染するので、全身性免疫は進入の粘膜部位での初期感染を阻害しそうにない。ランゲルハウス細胞、粘膜マクロファージ、Ｔ細胞および生殖管の***中のＨＩＶ関連もしくはＨＩＶフリー細胞由来の上皮細胞の感染は、ＨＩＶ感染に対するワクチンの開発において、粘膜応答の誘導が全身性応答と少なくとも同じくらい重要であるということを強力に示唆する（３５〜３７、４１）。全身性免疫はめったに粘膜免疫を誘導しないけれども、粘膜免疫は同様にしばしば全身性応答を提供する（３６、４１、４２、４３、４４、４５、４６）。ＨＩＶ伝染に対する一次防御を確立する際に、この鍵となる要素に対して一層の努力を捧げることが必須である。生きた弱毒ウイルスを用いるという明確な危険性を伴い、粘膜免疫を誘導する見込みは困難である。ワクチン研究の最近の開発としては、インフルエンザウイルス核蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する細菌のプラスミドを用いるマウスの筋肉のトランスフェクションが、致死的ウイルスのチャレンジからマウスを保護する体液性応答および細胞性応答の発生という結果を生じたという証拠を含む（１）。これは、マウスの筋肉は裸のＤＮＡでのトランスフェクションにとってユニークな標的であり（３）、種々の種の筋肉が特に裸のＤＮＡでトランスフェクションされやすい（４〜１１）という発見を伴う。インフルエンザＡウイルスによるマウスの致死的チャレンジに対する保護ならびにインフルエンザＡウイルス（１、１３〜１５）およびＨＩＶ（１６、１７）に対する細胞傷害性リンパ球および中和抗体の誘導、その後の遺伝子ＩＭ免疫化は、多くの研究者により報告されている。この方法は、比較的大量のＤＮＡを必要とする不利な点を有する。今日まで有毒な副作用として報告されていないけれども、この大量のＤＮＡの必要性は、ＤＮＡそれ自体への抗体応答の可能性および自立性狼瘉様症候群の発生によりこの方法を制限するかもしれない。より重要なことには、保護免疫応答の印象的な誘導にもかかわらず、この方法は粘膜免疫を誘導しない。ボリスティック（ｂｏｌｉｓｔｉｃ）トランスフェクションを用いる遺伝子免疫へのより通常でないアプローチは、ＤＮＡ量の問題を克服するが、広範に利用できない機器を必要とする。具体的には、金またはタングステン粒子と複合体を形成したナノグラム量のＤＮＡを、微小弾丸砲撃により原形質膜を通して物理的に推進させる。両方法は、細胞性応答（２１、２２）および体液性応答（２２〜２４）を誘導するが、いずれも粘膜免疫を誘導しない。効果的な免疫戦略のための粘膜免疫の重要性にもかかわらず、粘膜免疫を誘導するＦＤＡが唯一認可したワクチンは、Ｓａｂｉｎ生弱毒化経口ポリオワクチンである。ごく最近、粘膜免疫発生における別の開発は、通常の蛋白質抗原を用いる活性化ビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシカルシフェロール〔１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３〕）の全身投与により、全身免疫に加え、粘膜応答を引き起こすことを示唆した（２）。従って、当該技術分野は、粘膜免疫応答を誘導する方法を活発に求めている。本発明は、抗原に対するＤＮＡ配列を有する細菌のプラスミドを用いて粘膜のトランスフェクションを促進することにより、病原体の抗原に対するインビボ粘膜免疫応答を誘導する方法を提供することにより、ワクチンの製造において非常に重要な要求を満たす。発明の概要本発明は、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するのに有効な所定量を患者に投与する工程を含む、患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。また、本発明は、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質（例えば、リポスペルミン／リポスペルミジン、ＴＥＤＢＩ等）と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するのに有効な所定量と粘膜免疫応答の誘導に有効な量の１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３とを患者に投与する工程を含む、患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡは、感染進行の間、感染細胞の表面に発現するかまたは病原体の表面付着蛋白質である抗原をコードすることができる。本発明の方法は、粘膜細胞上の受容体が全身的に進入する（すなわち、ほとんどの細菌病原体）かまたは標的細胞への細胞内進入を積極的に獲得する（すなわち、ウイルスとある種の細菌病原体）ための付着部位を提供する病原体の蛋白質を認識するすべての粘膜要求性病原体に適用するべきである。ウイルス病原体のエンベロープ糖蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明の方法において使用される合理的な選択である。カチオン性脂質は、電荷−電荷相互作用によりＤＮＡとそのリン酸基バックボーンで複合体を形成可能な電荷を有する脂質のクラスである。該脂質は、真核細胞の原形質膜の透過を促進する。例えば、イオン電荷複合体を形成するＤＮＡ鎖のリン酸の酸素と３個以上のアミドの水素との配位が存在するカチオン基と共有結合した１個以上の疎水性鎖からなる二官能性分子であるリポスペルミンおよびリポスペルミジンが挙げられる。リポスペルミンの１つの好ましい例は、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。ジオタデシルアミドグリシルスペルミジンは、ＤＯＧＳと同様の構造を有するが、２個の非必須カチオン電荷を有する２個のアームの１個を欠失しているので、別の有望な候補である。別の例は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルＮ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウン(b utanediannmoniun)ヨウ化物（ＴＥＤＢＩ）（ｔｆｘ^TM−５０試薬；Promega，Ma dison，WI）である。このカチオン性脂質も、イン・ビトロおよびイン・ビボでのトランスフェクションを促進する。また、本発明は、ＤＯＧＳまたはＴＥＤＢＩと複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡを含む組成物を提供する。より具体的には、本発明は、カチオン性脂質と複合体を形成した、ＨＩＶのエンベロープ抗原をコードする所定量のＤＮＡを含む組成物を提供する。図面の説明図１は、５’および３’ＬＴＲ間のＨＩＶｅｎｖ挿入物を示すｐＨｅｎｖの環状地図を示す。この構築物では、Ｒｅｖは機能を有する。図２は、ＣＭＶプロモーターの下流のＨＩＶｅｎｖを含み、ＬＴＲまたはｒｅｖ配列を欠くｐＣＭＶ−ｅｎｖ１６０の環状地図を示す。発明の詳細な説明本発明は、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するのに有効な量を患者の粘膜に投与する工程を含む、患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。また、本発明は、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するのに有効な所定量および粘膜免疫応答の生成に有効な量の１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３を患者に全身投与する工程を含む、患者に粘膜免疫応答を誘導する方法を提供する。抗原をコードするＤＮＡによりコードされる病原体抗原の発現が、トランスフェクトした細胞表面での病原体抗原の曝露という結果を生じ、病原体の複製サイクルの一部または病原体の細胞表面への最初の付着に必要な発現した抗原のいずれかに似ているので、本発明は、一般の病原体に対して適用できる。ウイルス病原体の例としては、特に、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ＲＳウイルス）、ピコルナウイルス（コクサッキーウイルス、ライノウイルス）、肝炎ウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス）、ブニアウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、アレナウイルス（ラッサ熱ウイルス）、フラビウイルス（デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、チクングニヤウイルス）およびコロナウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。細菌病原体の例としては、下記属の種が挙げられるが、これらに限定されない：特に、サルモネラ、赤痢菌、クラミジア、ヘリコバクター、エルシニア、ボルデテラ、シュードモナス、ナイセリア、ビブリオおよびヘモフィルス。抗原をコードするＤＮＡ本発明の方法は、自然感染進行中に粘膜細胞の表面上で抗原の発現が起こるかまたは表面抗原が粘膜細胞への付着に必要なすべての粘膜要求性病原体に適用することができる。粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡは、感染進行中、感染細胞の表面に発現するかまたは宿主の標的細胞への付着に必要な抗原をコードできる。本発明の方法は、粘膜免疫応答または全身のトランスフェクトした細胞（筋肉等）から粘膜免疫のホルモンによる誘導が発生する粘膜細胞の表面上に発現する、ＤＮＡによりコードされる抗原を生ずる。細菌に対する初期免疫応答が、比較的少数の細胞(call)表面抗原に対するものなので、本発明の方法に使用する細菌性病原体の抗原をコードするＤＮＡを選択する工程は、慣用的である。例えば、主な細菌免疫原は、露出した細菌の表面構造上のエピトープである（１９１）。例えば、ＣＤ４産生細胞へのＨＩＶエンベロープの場合等、ウイルス抗原の多くの例がある。かかる抗原の他の例としては、ウイルス学の教科書に記載されている（例えば、Fundamental Virology，2nd．E.，pp3 73-375（１８９）を参照）。他の微生物病原体抗原は、細胞表面構造上のエピトープとして発現される。本明細書で用いる場合、「抗原」は、免疫応答を誘導する分子であり、「免疫原」と交換可能で使用される。ウイルス病原体のエンベロープ糖蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、ｇｐ１６０ＨＩＶまたはその切断派生蛋白質であるｇｐ４１およびｇｐ１２０）は、本発明の方法において使用するための合理的な選択である。感染細胞の細胞表面上での提示により、ｇｐ１７等のエンベロープ関連蛋白質も正当な選択である。本発明の方法において有効なウイルス抗原のサブセットを定義する正当な用語は、「エンベロープおよびエンベロープ関連蛋白質」である。患者の免疫応答を誘導するこれらの蛋白質の特異的なエピトープは、エピトープマッピングおよび構造依存性分析等の慣用的な方法により選択できる（１７８）。特に、中和抗体を誘導するエピトープが本発明の方法の重要な基礎である。中和抗体を誘導するエピトープは、標準用量依存性アッセイにおける特異的中和に関する分析と共役した特異的エピトープに対するモノクローナル抗体の誘導工程を含む慣用の方法により選択することができる（１７８）。これらの抗体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知のおよびさらに下記記載のクローニングおよび合成方法により得ることができる。例えば、抗原をコードするＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス抗原をコードすることができる。より具体的な例として、抗原をコードするＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖蛋白質をコードすることができる。エンベロープ抗原が、抗体および細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬｓ）の主要誘導剤であると予想されるけれども、ＨＩＶのｇａｇ（すなわち、中間抗原）に対するＣＴＬｓの文献の証拠がある。好ましい抗原をコードするＤＮＡは、別々に発現したｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１（すなわち、ｇｐ１６０は、通常宿主のプロテアーゼにより切断されてｇｐ１２０およびｇｐ４１となる）を含む。ミリスチル化結合によりエンベロープに付着しているｇａｇ蛋白質の１つであり、ミリスチル化部位の近傍の中和抗体エピトープに関する文献の証拠があるｇｐ１７をコードするＤＮＡも含むことができる。抗原をコードするＤＮＡは、エンベロープの抗原断片およびエンベロープ関連蛋白質をコードすることができ、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖蛋白質のＶ３ループが挙げられる。抗原をコードするＤＮＡは、開始コドン、シグナルペプチド、停止コドンおよび膜アンカーを有するべきである。分泌抗原（膜アンカーを欠く）は免疫応答を誘導するが、有効であるとは期待されない。従って、これらが存在しない場合または本発明の方法を最適化するために、抗原をコードするＤＮＡの配列を、１以上の方法で突然変異させ、発現する抗原の抗原性を保ったり高めたりすることができる。ｇｐ１２０免疫原とｇｐ４１免疫原を別々に使用するならば、それぞれ停止コドンの前に膜アンカーを有するべきである。従って、ｇｐ１２０に対して停止シグナルならびに翻訳蛋白質のＣ末端領域に膜アンカーを生じさせることができる。また、実施例で詳細に記載されるように、ＨＩＶおよびＲＳＶ両方に対してｇｐ４１の公知の抗体促進ドメインを除去することができる。ウイルス単離物で見出された主な準種（quasispecies）を反映するように、エンベロープ糖蛋白質のＶ３領域の多くのバージョンを作製することができる。例えば、文献記載のように、多くのＨＩＶ変異体が単離されてシーケンスされている。次いで、単一に転写されるＯＲＦをそれぞれ含む多数の遺伝子構築物の型でまたは複数に転写されるＯＲＦをそれぞれ含む１個もしくは数個の遺伝子構築物の型で、これらを投与することができる。この性質の遺伝子工学的操作は、当該技術分野において公知であり（１８８）、具体例が実施例に記載されている。要約すると、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐ−Ａｌｔｅｒ−１キットを用いて、突然変異を導入し、このことは、所望の突然変異を選択するための抗生物質による選択を取り込むものである。所望の突然変異の確実な作製のためのｓｓＤＮＡ鋳型手法を用いることが必要である。キットのプロトコールから厳密に変えたことは、本発明により教示されるヘルパーファージｓｓＤＮＡの作製である。Ｂｉｏｌａｂｓ社製のｓｓファージＤＮＡ単離キットおよび手法を用いて、精製ｓｓＤＮＡを調製する。目的のｍｕｔＳ変異を作製するためにキットに添付されていたＥｓ１３０１ｍｕｔＳ大腸菌をＸＬｍｕｔＳ大腸菌に替えたことも成功であった。後者は、修復酵素を欠いている。前記方法の成分は、通常、他の抗原をコードするＤＮＡに適用できる。例えば、真核細胞のトランスフェクションおよび細胞表面上の抗原発現のためのＨＩＶエンベロープを含むプラスミドに取り込まれると予想される遺伝子工学の例としては、以下に挙げられる：１）ＨＩＶＬＴＲの制御要素の除去およびＣＭＶ等のより強力なプロモーター支配下の置換、２）ｇｐ１２０が膜アンカーｇｐ４１から解離しないようにｇｐ１６０プロテアーゼ切断部位の除去、および４）この許容力を破壊する点突然変異または欠失突然変異による初期促進ドメインの除去。例えば、ｎｔ１５１６〜ｎｔ１５２７のイン・フレームの欠失（即ち、ＲＤＫＲ）は、プロテアーゼによる分解が起こる５０８〜５０９残基でのアルギニン−アラニン配列でのプロテアーゼによる切断部位を欠くｇｐ１６０を生ずる。これらの突然変異のさらなる例を、さらに以下に記載する。ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質に対して特異的変異が与えられるけれども、効率的な免疫構築物の作製に対する同じ考慮を、異なる抗原に対する抗原をコードするＤＮＡを用いる構築物の作製に適用することが理解される。本発明の方法に用いられるベクターは、抗原をコードするＤＮＡに関連するプロモーターおよび制御配列を含むことができる。一般的には、ベクターは、大腸菌で複製可能な真核生物ベクターでなければならない。好ましいベクターは、微生物の複製起点、抗生物質耐性選択遺伝子、真核生物プロモーター、真核細胞で転写される遺伝子および効率的な翻訳のためのポリアデニル化遺伝子を含む。これらの特徴を有するベクターの説明は、文献で公知である。当業者により、前記特徴のすべてを共有しないが、トランスフェクションは可能である他のベクターを設計することができる。カチオン性脂質本発明の方法に用いられるトランスフェクションを促進するカチオン性脂質は、リン酸基の酸素上の負の電荷とカチオン性脂質上の１以上の正の電荷との間で形成されたカチオン性電荷複合体が存在するカチオン基と共有結合した１個以上の疎水性鎖からなる二官能性分子である。ＤＯＧＳの場合、イオン電荷複合体を形成するＤＮＡ鎖のリン酸の酸素と３個以上のアミドの水素との配位が存在する。トランスフェクションを促進するために、カチオン性脂質がＤＮＡを保護して、その負の正味の電荷を中和することとトランスフェクション対象細胞の細胞膜に対してより疎水性らしくすることが両方とも可能である。例えば、電荷相互作用は、高度に荷電したＤＮＡ巨大分子に対して疎水性の覆いを提供するＤＮＡの主溝または小溝に沿った疎水性アームに位置し（実施例参照）、細胞の原形質膜の疎水性成分とＤＮＡを覆う疎水性表面との会合により細胞への進入を促進せしめる。ＤＯＧＳを用いる分子モデルに基づき、ペプチド結合のアミノ基の水素および隣接アミド基の水素すべてが１つのリン酸の酸素に配位（すなわち、１．９１〜２．０Åの距離）しているようである。リポスペルミンの１つの好ましい例は、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。ジオクタデシルアミドグリシルスペルミジンは、ＤＯＧＳと同様の構造を有するが、２個の非必須カチオン電荷を有する２個のアームの１個を欠失しているので、別の有望な候補である。さらに、８〜２０個の炭素数の疎水鎖を有するリポスペルミンまたはリポスペルミジンも同様に、ＤＮＡの主溝および小溝と相互作用することが予想される。あまり好ましくはないけれど、リポスペルミンまたはリポスペルミジンは、一本鎖の疎水性側鎖（例えば、モノオクチル、モノオクタデシル、モノドデシル等）を有してもよい。また、荷電基の性質は、ＴＥＤＢＩと同様の疎水性側鎖の飽和となるように修飾することも可能である。ＤＯＧＳ対ＤＮＡの好ましいモルカチオン比は、約５：１である。あるいは、約２〜約１０の範囲のモルカチオン比で、このリポスペルミンはＤＮＡとの複合体を形成することができる。カチオン性脂質とＤＮＡとの間のイオン相互作用は、コードされる抗原にかかわらず同じであるので、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体形成に関する本発明の教訓は、いかなる抗原をコードするＤＮＡにも適用できる。従って、本発明は、リポスペルミンと複合体を形成する病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡからなる組成物も提供する。より具体的には、本発明は、カチオン性脂質と複合体を形成するＨＩＶのエンベロープ抗原をコードする所定量のＤＮＡからなる組成物を提供する。例えば、該組成物は、実施例に記載のプラスミドを含んでもよい。抗原をコードするＤＮＡの他の例は、本明細書および文献に記載されている。ボリスティック投与粘膜免疫応答を誘導する方法において、抗原をコードするＤＮＡを、複合体カチオン性脂質の助けなしで投与することもできる。例えば、実施例に記載のように活性型ビタミンＤ３とともに、ＤＮＡをボリスティックに投与することができる。要約すると、ＤＮＡを金粒子と複合体を形成させ、それをヘリウム推進器を用いて原形質膜を通して推進させることにより、皮膚細胞に送達させる。活性型ビタミンＤ３を、裸のＤＮＡを含む金懸濁物中に包含させることにより同じ細胞に送達したり、同じ手段により該細胞内に推進させることができる。または、活性型ビタミンＤ３を、ジメチルスルフォキシド等の溶媒担体で局所適用することにより、トランスフェクトした皮膚細胞に送達することができる。このような手段において、粘膜免疫を誘導する可能性という見地から、皮膚は粘膜代用物として作用することができる。ホルモン免疫調節本発明の方法は、また、ＤＮＡとカチオン性脂質を用いる促進したトランスフェクションとともにビタミンＤ３も利用する。ビタミンＤ３とカチオン性脂質複合化ＤＮＡとの組み合わせは、筋肉内投与したときでも粘膜免疫応答を生ずる。ビタミンＤ３は、１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３またはその非ヒドロキシル化型でもよい。非ヒドロキシル化型は、粘膜免疫を誘導するために肝臓および腎臓でヒドロキシル化（活性化）型に変換されなければならない。活性化ビタミンＤ３の量は、実施例に記載されるようであってもよい。明らかに、これらの量は、特定の投与プロトコールまたは特定の患者ならびにワクチンの他の成分に適合させることができる。非ヒドロキシル化ビタミンＤ３の使用はより有効でないので、有意に大きな量が必要である。投与量の最適化は、免疫プロトコールの日常的な側面である。粘膜免疫系重要な間接的証拠により、共通の粘膜免疫系の存在が示唆される（４７、５０）。気管支関連リンパ組織における粘膜免疫誘導は、通常、腸関連リンパ組織における免疫の証拠を生じる。共通の要素は、種々の型の粘膜関連リンパ組織に対する親和性を有する移動性ＩｇＡ分泌プラズマ細胞の産生である（参考文献４２を参照）。粘膜免疫化後、粘膜表面にＩｇＧが見出されうるけれども、ＩｇＡは粘膜免疫において優位なＩｇである。このことは、ポリマー（ｐ）ＩｇＡに対する最大の親和性を有するＩｇ受容体の存在に対して二次的である。この受容体は、粘膜上皮細胞の表面で発現しており、粘膜上皮細胞を通して粘膜表面にｐＩｇＡを能動輸送する（４７〜４９）。まず、関連する病原体に対する動物モデルを用いて保護免疫が決定される。保護免疫は、投与したワクチン候補に対する強い体液性および／または細胞性免疫応答により推論してもよいが、保護許容力の証明は、可能な動物モデルで証明するべきである。例えば、マウスをクラミジアで感染することが可能である。従って、クラミジア抗原をコードするＤＮＡを用いる本発明の方法は、マウスを免疫するために使用することができ、その後、細菌でチャレンジして候補ワクチンの効力を証明することができる。しかしながら、他の病原体は好適な代理の動物モード(mode)がないので、ヒトの臨床試験の前に保護的有用性を証明することはより困難である。例えば、ＨＩＶ−１感染に対する唯一の許容される代理動物は、絶滅の危機に瀕した種であるチンパンジーである。ＳＩＶは、アカゲザルにおいてＨＩＶ−１の代替として使用することが可能である。それにもかかわらず、ＨＩＶ−１とＳＩＶとの間に、ＨＩＶ−１によるヒトの感染に対する直接の推定を典型化させなくする有意なヌクレオチド配列の相違が存在する。同様に、免疫応答における種の相違が予想されうる。それにもかかわらず、本発明の方法の作用機序は、一般に他の宿主や病原体に適用可能である。従って、他の動物と他の病原体での結果は同様であると予想される。いかなる場合においても、これらの動物試験は、本発明の免疫プロトコールの教示が慣用的に与えられる。投与粘膜細胞への直接適用による粘膜免疫応答を誘導する方法において、カチオン性脂質と複合体を形成した抗原をコードするＤＮＡを患者の粘膜に送達する。粘膜投与の具体例に鼻、経口、直腸および膣が含まれる場合において、投与は直接粘膜にできる。鼻への投与は、十分実施された方法の中でも、鼻洗浄噴霧（実施例参照）またはネブライザーにより行なわれる。直腸、膣、外陰部または会陰部の投与は、洗浄（圧注、浣腸等）、坐剤、クリーム、ゲル等を含む種々の方法により行なうことができる。また、全身投与も患者の粘膜に特異的免疫応答を誘発するために使用することができる。ＤＮＡとともにビタミンＤ３および実施例で詳細に記載されたワクチン処方の他の成分の筋肉内注射が、特に有効である。予定された投与様式に依存して、本発明の化合物を、例えば、錠剤、坐剤、丸薬、カプセル、粉末、液体、懸濁物、ローション、クリーム、ゲル等の固体、半固体または液体の調剤型で、好ましくは正確な調剤の１回の投与に好適な単位調剤型で医薬組成物に存在させることができる。前記したように、組成物は有効量のＤＮＡを含み、さらに他の製薬的に許容されうる医薬剤、薬剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含んでもよい。「製薬的に許容されうる」とは、生物学的ではなくそうでなければ好ましくない材料、すなわち、それが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれともいかなる好ましくない生物学的効果を生じさせることなく、または有害な方法で相互作用することなく、抗原をコードするＤＮＡとともに個体に投与してもよい材料を意味する。経口投与に対しては、ビタミンＤ３とともに複合体を形成した大量のＤＮＡを与えてもよい。形状は、微粉末または顆粒でもよく、希釈剤、分散剤および／または界面活性剤を含んでもよく、水もしくはシロップ状で、乾燥状態でカプセルもしくは香料袋（sachest ）で、または非水溶液状もしくは懸濁剤が含まれる懸濁物状で、結合剤および潤滑剤を含んでもよい錠剤型で、または水もしくはシロップ中で懸濁状で存在してもよい。所望もしくは必要な場合、香料、保存料、懸濁剤、濃縮剤または乳化剤を含んでもよい。錠剤および顆粒は、好ましい経口投与型であり、これらは被覆されてもよい。かかる投与型を調製する実際の方法は公知であり、または、当業者にとって明らかであろう、例えば、Remington's Ph armaceutical Sciences（１９０）を参照。本発明の方法において、ＤＮＡをカチオン性脂質と複合体を形成させ、１回の初回ワクチン接種として患者に投与し、３週間〜３ヵ月の間隔で１回以上のブースターワクチン接種を行なってもよい。ブースターワクチン接種は、初回ワクチン接種と同じまたは異なる様式であってもよい。例えば、活性化ビタミンＤ３との初回筋肉内投与の後、ビタミンＤ３ありまたはなしで粘膜のブースター投与を行なってもよい。初回／ブースター投与レジュメの最適化は、広範に知られた慣用的最適化手順を用いて行なうことができる。必要なＤＮＡの正確な量は、患者の年齢、体重および総合状態、用いる特定の処方、その投与様式等に依存して患者間で変えることができる。従って、正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、本明細書での教訓を示す日常的実験のみを用いて、当該技術分野において通常の知識を有する者により、有効な量を決定してもよい。従って、投与するＤＮＡ量は、いかなる有効量であってもよい。ヒト細胞はマウス細胞よりもトランスフェクションしやすいかしにくいかを予想する理由は何もないので、ヒト免疫用量対マウス用量において微小な相違以上を予想する理由はない。典型的には、効果的なトランスフェクションのために必要なＤＮＡの好ましい量は、約１０ｎｇ〜１０μｇである。ヒトおよびマウス間トランスフェクション効率の変化は、用量の日常的調整により調節することができる。例えば、該量は、１．０ｎｇ〜１ｍｇの範囲とすることができる。１０μｇを超えるＤＮＡはいずれも、論理上取扱いが困難になり、毒性の危険が増大し実行不可能である。１，２５（ＯＨ）Ｄ３の量は、一般的には１０ｎｇ〜１０μｇの範囲であり、カチオン性脂質／ＤＮＡ複合体とともにＩＭ投与される。以下の実施例により、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。記載されたプロトコールは、ＨＩＶの免疫化という面において適用されるけれども、粘膜感染機構を有する他の病原体にも応用できる。記載されたプロトコールは、用いられる典型的な物であるけれども、代わりに当業者に公知の他の手法を用いてもよい。実施例カチオン性脂質は遺伝子免疫を促進する遺伝子免疫宿主の保護免疫応答に必須のウイルス蛋白質をコードする非複製、転写／翻訳 −許容性ウイルスＤＮＡのトランスフェクションによるウイルス複製を模倣する能力は、毒性復帰の可能性のない弱毒生ワクチンの有利性を提供する。遺伝子免疫は、ワクチン分野にとって、ユニークな有利性を提供する。ＤＮＡは、調製および操作が容易である。真核細胞由来のプロモーター、シグナル配列および疎水性アンカーの多様性は、免疫応答を極大にするために構築することができる。有利な部位特異的突然変異は、比較的達成することが容易である。多集団ワクチン接種の間、現場では、ＤＮＡは安定であり、冷蔵を要しない。遺伝子免疫は、弱毒微生物と同様に、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を産生する。しかし、ＨＩＶワクチンに対して最も重要な有利性は、１回の遺伝子免疫で多数の配列多様性をもつ比較的容易な処方であり、配列のそれぞれが、保護応答の広いレパートリーの開発を伴い、通常細胞表面で発現する。主な不利な点は、比較的大量のＤＮＡを必要とすることである。ＨＩＶ表現型の発現感染を受けていない宿主のＨＩＶ−１による初期感染は、様々な臨床経過を生じる（１７７）。大半の場合（５０〜７０％）、１〜２週間続くウイルス血症を伴う倦怠感および熱の急性臨床症候群が、曝露後約２〜４週間に起こる（１６３〜１６４）。少数の患者では、この感染の急性相は不顕性である。時折、初期感染が非常に迅速にＡＩＤＳに進行することがある（６５）けれども、大抵の患者は、１ないし１０年以上の後、その後の様々なＡＩＤＳへの進行を伴う症候相に入る（１６６）。この初期ウイルス血症相を、初期感染ウイルス遺伝型に対する効果的な免疫応答により制御できるであろう（１７１）。初期ウイルス血症相が宿主(hose)防御機構により初期に制御されるなら、なぜウイルスが初期の効果的な体液性および細胞性防御機構を超えて遂に優位性を獲得するのかという疑問が残る。ＨＩＶの著しい特徴の１つは、特に、ウイルスエンベロープ糖蛋白質のｇｐ１２０およびｇｐ４１における突然変異性である。ＨＩＶにおける高い突然変異率は、ウイルスの７０ＳｓｓＲＮＡのプロウイルスＤＮＡへの変換における逆転写酵素による高エラー率の関数であると信じられている（ウイルスコピー当たり２個のエラーと概算される）。この高い突然変異率は、高度のＨＩＶ感染の個体間多様性を一部説明できる表現型発現変異型の能力を示唆する。データの優位性により、ＨＩＶ−１によるほとんどの初期感染は、疾病の進行とともに高頻度で見出される合胞体誘導（ＳＩ）表現型に対して、非合胞体誘導（ＮＳＩ表現型（すなわち、単細胞向性ウイルスは、同種異系の初期共培養またはＴ細胞指標細胞において、合胞体を形成できない）を有する（１６３〜１７０）ことが示される。ホウ（Ｈｏ）およびその共同実験者（１７１）は、５名のセロコンバーターおよび２名の性パートナーのＰＢＭＣｓ由来のクローン化ＰＣＲ増幅ＤＮＡを用いて、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｎｅｆおよびｐ１７の特異的配列を注意深く調べた。最近のセロコンバーターからは、伝染者ではマイナーな種に相当する顕著なＨＩＶ配列同質性があったが、ＨＩＶ伝染者は実質的なＨＩＶ配列異質性を示した。驚くべきことにｇｐ１２０は、最大の配列同質性を示した（＞９９％類似性）。これらのデータは、ＨＩＶ感染は少なくとも性間伝染に対して以前に考えられていたよりもずっと大きく配列限定されていることを示唆する。第２に、それらは、疾病進行の間ゲノム変異性源としてＨＩＶの二次感染が排除されないけれども、後天性ゲノム変化の表現型発現は、少なくとも一部はＨＩＶ疾病の多様な臨床的進行に対して応答可能であることを示す。後天性ゲノム変化の１つの発現は、ＮＳＩ変異体、ＳＩに対する単細胞向性変異体、Ｔ細胞株許容変異体由来の初期ＨＩＶ−１単離物の変化（すなわち、実質的にすべての単離物はＰＢＭＣｓで複製可能であるが、ＳＩ単離物のみがＴ細胞株で複製する）である。この機能的（ＮＳＶ対ＳＩ）トロピズム（単細胞向性対Ｔ細胞株許容性）に関する初期決定因子は、ウイルス表面上で十分露出したＨＩＶ−１の糖蛋白質であるｇｐ１２０の第３の可変ドメイン（Ｖ３ループ）である（１７２）。Ｖ３ループは、その配列の中ほどに保存された４分子のＧＰＧＲモチーフを有する３４〜３７アミノ酸からなるジスルフィド結合したポリペプチドである（１７３）。配列の残りの部分は、高可変性であり、ｇｐ１２０の融合ドメインとして同定された（５５）。別の研究グループ（１７５、１７６）は、いくつかのセリンプロテアーゼにより還元切断されたＶ３ループのアミノ酸の変化が、ＨＩＶ−１エンベロープ配列を発現するウイルス組み換えワクシニアウイルスにおいてＮＳＩの機能的表現型を与えることを示した。ＳＩ対ＮＳＩの機能的表現型を決定するこれらのＶ３ループのアミノ酸の変化を、表１に示す。表１．ＨＩＶ表現型合胞体発現およびＶ３ループのアミノ酸配列の関係^a ＨＩＶに対する機能的免疫応答ＨＩＶワクチンの設計を考慮してしばしば却下される重要な概念は、ウイルスまたはそのエンベロープ成分により保護および逆免疫応答の両方が引き起され得るということである。１．ＨＩＶの中和ｐ１７ｇａｇ蛋白質内の１つ（５１）およびｇｐ１６０エンベロープ蛋白質内の多数を含むたくさんのＨＩＶ−中和エピトープ（抗体により結合され得る最小の数のアミノ酸残基として定義されるエピトープ、直鎖状または立体的のいずれか）またはドメイン（エピトープのクラスターを含む領域）が同定された。これらのドメインを、同定された特異的配列（ＬｏｓＡｌａｍｏｓデータベースに従って数字を示したペプチド内のアミノ酸残基（５２）、中和応答の特異性、ドメインの相対的免疫原性およびＣＤ４受容体結合を阻害する際のこれらの抗体の役割について表２に要約する。合成ペプチドを動物に免疫し、インビトロでＨＩＶ−１を中和する能力について超免疫血清を試験することにより、いくつかのドメインが同定された。この方法により、ｇｐ１２０内の残基２４７〜２６７（５３）、２９６〜３３１（５４〜５９）、４５１〜４７７（５４）および４９６〜５２５（６０）ならびにｇｐ４１内の残基５９３〜６０４（６１）、６０９〜６２５（５４）および７２１〜７４５（５４、６０、６２）すべてが、実験動物においてＨＩＶ−中和抗体の産生を刺激することが報告されている。しかし、これらのいくつかのペプチドは、１：４または１：８の力価でＨＩＶ−１を中和することができる抗体しか刺激しないので（５４）、研究者は、何が有意な中和応答の構成成分となるかを決定することに関して、いくらかの困難性を持っていた。同様に、ＣＤ４受容体と結合するｇｐ１２０に対する抗体効果もかなり興味深い。しかし、２つのドメインだけ実験を行なった。第２の保存ドメイン（表２のドメイン１）に対する抗体は、結合に関して何の効果もなかった（５３）が、認識されたＣＤ４受容体結合ドメインに対する抗体は、結合を効果的に阻害する（６３）。ＨＩＶ感染者およびＨＩＶ感染チンパンジー由来の血清中のＨＩＶを中和する抗体の存在を確認する証拠も存在する。非常に多くの報告は、Ｖ３ループ（残基２９６〜３３１）に対する抗体に関する（５７、５８、６４、６５）。これらの抗体は、ＨＩＶ−１に対する型特異的中和応答を招くことを示した。型特異的抗体は、１つの株（すなわち、ＨＩＶ_IIIB、ＨＩＶ_RF等）を中和するが、群特異的抗体は、１以上の株を中和する。この領域は超可変性であるが、残基３１１〜３１６に高度に保存されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列を含む（６６）。Ｖ３ループに対する免疫応答は、ループの超可変側（残基２９６〜３０９および３１７〜３３３）により複雑化される。ループに対する抗体の大部分は、超可変領域に対して濃縮され、従って、ループに対する抗体応答は型特異的であるように思われる（６７〜７１）。ＨＩＶ_MNは、ＨＩＶ_MNへの中和活性およびＨＩＶ_MNに対するすべての幾何学的平均力価を有するＨＩＶ感染患者の頻度という観点から、北アメリカにおいて最も普遍的に認識されるＨＩＶ株である（７２）。優位な抗体応答が直鎖状エピトープに対して型特異的であるけれども、ＨＩＶ_MNのＶ３ループ、おそらく残基３１１〜３１５の保存配列を含む立体的エピトープに対するいくつかの群特異的中和応答が存在するかもしれない。Ｖ３ループに対する広いレパートリーのヒトＭＡｂｓを用いて、ゾラ−パツナー（Zolla-Pa zner）は、感染ウイルスに結合する際の立体的影響に関して説得力のある主張を行なう。彼女のデータは、群−および型−特異的中和間の違いを鈍らせる。ＨＩＶ感染におけるＶ３ループ抗体の役割を、より詳細に後述する。Ｖ３の知見に伴う１つの妨害的な複雑性は、中和抗−Ｖ３−ループモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、インビトロでＨＩＶを処理した後に抗−Ｖ３−ループ耐性ウイルスが生じるという非常事態である。突然変異は、Ｖ３ループ内（７３〜７６）およびＶ３ループ外（７７、７８）の両方で起きることが可能である。実際、ＨＩＶ感染患者が以前の単離物特異的中和に耐性を示す変異体を産生可能であることが示された（７９）。１つの非Ｖ３−ループ変異体をシーケンスし、エンベロープ糖蛋白質のアミノ酸配列の変化は、Ｖ３ループ外ばかりでなくｇｐ４１のアミノ末端領域に属する領域である残基５８２のスレオニンのアラニンへの置換のみであった（７８）。この免疫選択的点突然変異は特異的中和エピトープの一部ではないことが、確信して示された（８０）。従って、エンベロープの他の領域は、Ｖ３ループと相互作用してもよく、それ故にワクチンの開発を複雑にする。また、インビボの中和逃避突然変異体は、ＨＩＶ感染チンパンジーにおいても記載され（８１）、非Ｖ３−ループ突然変異がＨＩＶ中和抗体からの逃避を招いた。ＨＩＶ感染の群−特異的中和は、いくつかの研究所で示唆された（８２〜８６）。これらの群−特異的抗体は、ＣＤ４またはいくつかの別のＨＩ受容体を介して感染を阻害する（８７〜８９）。中和抗体ドメインに関して、自然感染対担体に結合した合成ペプチドを介した実験的誘導の結果としての相対的免疫原性が、しばしば散在性であることが認識される（表２）。大量の抗体を誘導するｇｐ１２０およびｇｐ４１の免疫優位領域は、実験的免疫原としては比較的弱いが、自然感染の間、比較的少量の抗体を誘導するｇｐ１２０の免疫原は、担体と結合させた場合は抗体の強力な誘導剤である。このことにより、ワクチンの設計において重要であるかもしれない、組み換えウイルス蛋白質または合成ペプチド免疫原により産生され、感染の間進行する抗原の別の経路の存在が示唆される。しかしながら、本発明の遺伝的粘膜免疫化はウイルス感染に似ているので、機能的免疫応答は、ｄｅｎｏｖｏのＨＩＶ感染由来のものをより正確に反映するべきである。また、中和領域の同定は、ＨＩＶに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の製造により、より容易になった。特異的ウイルス単離物を中和するいくつかの抗 −Ｖ３ループＭＡｂｓ（９１、９２、１０８、１０９）ならびに細胞の細胞傷害性をも介する１つのＭＡｂ（９０）が製造された。これらは、たくさんのネズミＭＡｂｓ（ｍｕ−ＭＡｂｓ）（１０８、１０９）およびいくつかのヒトＭＡｂｓ（ｈｕ−ＭＡｂｓ）（９１、９２）を含む。また、アミノ酸残基４２３〜４３７（６３）、残基７２８〜７４５（１８６）およびＣＤ４＋結合ドメイン（９１）を含むＨＩＶエンベロープの他の領域に対するいくつかの中和モノクローナル抗体も記載されている。いくつかの追加の中和ＭＡｂｓが、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質と結合することが示された（９２、９３）。４つのＭＡｂｓの１つが中和活性を有し、ｇｐ４１に結合した（９２）。さらに、ハンセン（Hansen）らによる報告（９４）は、Ｎ−またはＯ−結合のいずれかの３つの異なる炭水化物部分に対するＭＡｂｓが、ＨＩＶ_IIIBまたはインビトロでの患者単離物の両方を中和することが可能であったことを示唆する。ミューラー（Mueller ）らによる研究（９５）は、酵母マンナンに対するポリクローナル抗血清がＨＩＶの複製を阻害したことを示した。ＨＩＶの感染力におけるウイルス糖蛋白質の重要性は、いくつかの研究室ですでに報告されている（９６〜１０６）。従って、機能的グリコシル基の単純な阻害により、抗グリコシル抗体による中和効果を説明できる（９４、９５）。しかし、他のデータにより、エンベロープ糖蛋白質の二次および三次構造が、型特異的中和抗体よりも群特異的中和抗体の産生に有意に重要であることが示唆される。ＨＩＶの群特異的中和における炭水化物要求性は、グリコシル化対非グリコシル化ｇｐ１２０に対して惹起される抗体を比較することにより（１０７）、および非グリコシル化ｇｐ１２０から溶出される血清による中和特異性を比較することにより（１０８）示される。両方の場合において、炭水化物は、群特異的であるが型特異的でないＨＩＶの中和に対して必要である。さらに、最近の報告は、非グリコシル化組み換えＨＩＶにおけるジスルフィド結合を保有した５つの可変領域すべての除去により、中和抗体を産生できない免疫原を製造することを示す（１０７）。従って、抗体が炭水化物結合を妨害することにより特異的機能を妨害するかどうか、または、抗体が感染力に必須の天然の二次および三次構造を崩壊させることにより阻害するかどうかはわからない。ｇｐ１２０およびｇｐ４１の公知の機能的抗体ドメインならびにＨＩＶセロネガティブｒＨＩＶワクチン由来のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＣＴＬｓにより認識されるエピトープの直線関係という面から、Ｎ−結合炭水化物構造の局在を研究した（２０）。２．ＨＩＶの抗体依存性促進ウイルス感染力を促進する抗体が、多くのウイルスに関して記載されている（１１２〜１２６）。最も頻繁に引用される例は、デング熱ウイルス感染の促進である（１１２〜１１５）。単球およびマクロファージのＦｃ受容体にウイルスを結合させることにより、非中和抗体が、インビトロで感染ウイルス粒子の数を実質的に増大することができることが結果から示唆される（１１８）。デング熱感染において、存在する促進抗体の程度と疾病の重症度がおおよそ相関している（１１３）。このＦｃ受容体を介する機構に加え、フラビウイルスであるＷｅｓｔＮｉｌｅウイルスによる感染の促進は、細胞上の補体および補体受容体により仲介されることが可能であることが示された（１１９）。促進は、フラビウイルス（１１６〜１２２）、アルファウイルス（１２３）、狂犬病ウイルス（１２４）、シンドビス(Sinbdis)ウイルス（１２５）およびコロナウイルス（１２６）を含む多くのウイルスに関してインビトロで示唆されている。有効でないワクチン接種により疾病の重症度が増大するという結果となった、いくつかの他のウイルスのインビボでの促進に関するいくつかの証拠がある。これらの中で最も顕著な例は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫を受けた小児（１２７〜１３０）またはＲＳＶに対する免疫を受けたコットンラット(cotton rats)（１３１）で起こった。他の例としては、不活化麻疹ワクチン（１３２、１３３）ならびにワクチン接種後抗原−抗体複合体形成により、より重症の関節炎に罹ったが恐らく有効でないヤギの関節炎および脳炎ウイルスワクチンが含まれる（１３４、１３５）。１９８７年、最初に、レンチウイルス促進抗体がＨＩＶ感染に関して記載された（１１０）。その後の報告により、インビトロで機能する促進に関する２つの機構が同定された。第１は、補体蛋白質と結合したＨＩＶに対する抗体を含み（１５７、１５８）、ＣＤ４および補体受容体２型（ＣＲ２）の両方を産生する細胞を必要とする（１３９）。第２の機構は、ＨＩＶに対する抗体およびＦｃレポート(report)を産生する細胞を必要とした（１４０）。Ｆｃ機構は、一般に、補体を介する抗体依存性促進（Ｃ’−ＡＤＥ）に関する＞１００倍に対して２倍の促進しか有しないので、本願研究は、後者の現象に焦点を合わせる。Ｃ’−ＡＤＥに関しては、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質が補体を活性化できること、およびＨＩＶに対する抗体がＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞上の補体成分Ｃ３の固定を増大させるように導くことが公知である（１４１）。この補体は、ＨＩＶをＣＲ２に結合させ、ｇｐ１２−が、ＨＩＶの細胞内への進入を介するＣＤ４受容体と相互作用するであろうよりも大きな見込みを生じる、ＣＤ４＋細胞表面に近接してＨＩＶの量を増大させるように作用することができる。スペア（Sp ear ）および彼の共同実験者は、Ｃ’−ＡＤＥが標的細胞へのＨＩ結合を増大させ、組み込まれたプロウイルスのコピー数を増大させるという結果を生じることを直接示した（１４１）。さらに、このグループは、３０％のＣＤ４リンパ球がＣＲ２受容体を産生し、このＣＤ４／ＣＲ２リンパ球が、ＨＩＶ感染の関数としてＣＤ４細胞減退の初期相の間、優先的に選択されることを示した（１４２）。ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質に対するｈｕＭＡｂｓの製造を用いて、促進からウイルス中和を分離することが可能である。ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質に対するいくつかのｈｕＭＡｂｓは、ＨＩＶ−１感染を促進することができるが、インビトロでＨＩＶ−１を中和しないことが示された（１４３）。感染を促進するｈｕＭＡｂｓの能力は、補体を活性化するｈｕＭＡｂｓの能力によっては決定されないし、ｈｕＭＡｂｓのＩｇＧサブクラスによっても決定されなかった（１４３、１４４）。これらの促進ｈｕＭＡｂｓは、ＨＩＶ−１ｇｐ４１膜貫通糖蛋白質の直鎖ドメインにマップされた。今日まで同定された６つの促進ｈｕＭＡｂｓの中で、５つがアミノ酸残基５７９〜６１３（１４４、１４５）、ｇｐ４１の初期免疫優性ドメイン（１４６〜１４８）にマップされる。６つのうちの１つは、別の免疫優性ドメインにマップされる（１４３、１４５）。これらの結果により、ＨＩＶ−１のエンベロープにはわずかの促進ドメインのみが存在し、これらのドメイン、ＨＩＶ−１のエンベロープの免疫優性領域は保存されていることが示唆される。最近、これらの発見は、ＨＩＶの第１および初期促進ドメインと相同なＴＭ蛋白質領域が促進抗体の形成を誘導する類似の許容力を有することを示すことにより、ＳＩＶに範囲を広げた（１５０）。データは、ＳＩＶ_mac251 由来の合成ペプチド（ａａ６０３〜６２２）を用いる前免疫化が、組み換えｇｐ１６０ＳＩＣワクチンの有益な効果を抑制する抗体の産生を刺激したこと（１５０）をインビトロで示す。エンベロープ糖蛋白質に対する体液性応答が、宿主に対して損傷を与えるかもしれないということを示唆するいくつかのレンチウイルスワクチンからのさらなる証拠がある。例えば、ＳＩＶエンベロープ糖蛋白質組み換えワクチンは、大抵はその後のウイルスチャレンジからサルを保護しなかった（１５１、１５２）が、ＨＩＶに対する類似のエンベロープに基づく組み換えワクチンは、チンパンジーのＨＩＶ感染を予防することにおいては、大抵は有効でなかった（１５３〜１５５）。ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）において、バキュロウイルス組み換えエンベロープ糖蛋白質ワクチンは、その後にＥＩＡＶでチャレンジしたウマで明らかに疾病を悪化させてしまった（１５６）。最近、ガードナー(Gardner)ら（１５７）は、ＳＩＶ感染レサス属アカゲザル由来の血清によるレサス属アカゲザルの受動免疫により、６頭のかかる動物のうち５頭がチャレンジ５ヵ月以内で死亡するという明らかな疾病の促進されたコースに導くことを報告した。その研究において、ＥＬＩＳＡにより、受動免疫の失敗およびｓｓ６０３〜６２２ペプチドに対するより高度の抗体レベル間の直接の相関があった（１５８）。研究者は、インビトロでＦＩＶに対する促進感染（１６１）およびインビボでＳＩＶ_macに対する類似の受動免疫化の失敗（１６２）を報告したけれども、これらのデータは、ＳＩＶに関するプトコーネン（Putkonen）らにより（１５９）およびネコ免疫不全（ＦＩＶ）モデルにおいて（１６０）報告された受動免疫実験とは異なっている。従って、すべてのワクチン製剤において促進能力を考慮することが賢明である。しかしながら、ＨＩＶおよびＳＩＶ促進は、デング熱に比べて比較的弱い（１５０）。インビボでの粘膜免疫応答の誘導遺伝子免疫原として用いたトランスフェクトしたＤＮＡの１つは、ｐＨｅｎｖ、すなわち、ＮＩＨＡＩＤＳリファレンスプログラムから独自に得た全ＨＩＶ −１エンベロープゲノム、機能的なｔａｔおよびｒｅｖトランスアクティベーター配列ならびに対応するＬＴＲＴＡＲおよびＲＲＥ配列を含む９６００ｂｐのｐＢＲ３２２に基づくプラスミドであった。図１は、環状のプラスミドマップを詳細に示す。トランスフェクションの際のこのプラスミドは、ＨＩＶ−Ｉ_pNL4-3 のｅｎｖ蛋白質を効率良く発現し、ＣＤ４発現細胞と広範な細胞融合を生じることが示された（１８０）。無関係なＤＮＡ対照免疫原として、ｐＡＣＹＣ１７７を用いた。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロスで生育させた大腸菌ＪＭ１０９で、プラスミドを製造し、ＯＤ_600nm＝０．５０で細胞を集めた。ＭａｇｉｃＰｒｅｐカラム(Promega Corp．)での精製を用いるＳＤＳ溶解手法を用いて、ＤＮＡを細胞ペレットから集めた。プラスミドＤＮＡを、ＴＥ緩衝液を用いて７０℃で溶出させ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２中、−７０℃で沈殿させた。精製したプラスミドＤＮＡを、アガロース電気泳動ゲルで、公知の制限エンドヌクレアーゼ加水分解部位に対するサイズにより調べた。ｐＨｅｎｖＤＮＡは、３７０８、５８１８、７２９３および９５２０ｂｐ断片を生じる４つのＨｉｎｄIII 部位を含む９６００ｂｐのＤＮＡからなっていた。３９４０ｂｐの対照プラスミドであるｐＡＣＹＣ１７７は、１つのＢａｍＨＩ部位ならびに９６５ｂｐおよび２３０５ｂｐの２つのＳｔａＩ断片を含む。ＤＮＡの濃度は、ＯＤ／｜ａ＼｜ａｌ（５０μｇ，２６０ｎｍ／｜，１ｃｍ）＝１に基いた。結果の要約Ｈａｒｌａｎインダストリーズから入手した５ないし６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを、各５匹のマウス群にランダムに分けた。該群を、ＤＮＡ免疫化プラス無関係なＤＮＡ免疫原および非感染動物対照という３つのクラスにアレンジした。表３は、免疫経路、免疫原の組成、投与量、免疫回数および全ＤＮＡ用量曝露を詳細に示す。表４は、転写可能なＨＩＶ−ｌｅｎｖ配列を含むＤＮＡを用いるトランスフェクションの結果としてマウスの血清中に検出される抗体応答をまとめたものである。裸のＤＮＡ（１００μｇ）は、１回のＩＭ曝露で５匹中２匹の動物で、２または３回のＩＭ曝露で５匹中３匹の動物でＨＩＶ特異的血清ＩｇＧ応答を生じた。裸のＤＮＡ（１０μｇ）は、ＩＭ曝露でＨＩＶ特異的免疫応答を起こさなかった。群の曝露当たり１０μｇで、最高の平均ＩｇＧ力価が生じた。ジオクタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）と複合体を形成したＤＮＡ（１０μｇまたは１μｇ）は、１、２または３回の曝露後８０％のＩＭ処理動物で、ＨＩＶ特異的免疫応答を生じ、３回の曝露を受けた群で最高の平均力価が生じた。ＤＯＧＳと複合体を形成した１０μｇのＤＮＡの鼻洗浄曝露は、１回の曝露で２０％のマウスで、２または３回曝露したマウスの４０％で、全身的ＨＩＶ特異的免疫応答を起こした。１μｇのＤＮＡ複合体を用いる鼻洗浄は、１または２回の曝露後２０％のマウスで、および３回目の曝露後８０％のマウスで、平均力価ｆ１：８５０を有する特異的ＩｇＧ応答を起こした。表３．５ないし６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＤＮＡ免疫感作の一覧表。３週間毎に免疫原への曝露。ＩＭ＝両側の鍵の筋肉間の筋肉内の分割投与量（１００μｌ）。ＮＡ＝小分割量で１００μｌの最終容量まで投与された鼻洗浄。裸のＤＮＡは水中のｐＨｅｎｖ−ＤＮＡを指す。ジオクタデシルアミドグリ epracor,France）から入手し、製造者の指示に従って５：１のモルカチオン電荷過剰で、ＤＮＡと複合体を形成させた。複合体を調製し、免疫感作前にすぐに使用した。ｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡを無関係の対照ＤＮＡとして用いた。 ^a２個の試料。表４．ＤＮＡ免疫感作に対する血清抗体抗−ＨＩＶｅｎｖの応答。ＨＩＶ−１のｅｎｖ蛋白質に対する抗体の血清力価を、ドット−ブロット手法により定量した。ＨＩＶ−１_IIIBで感染させたＨ９細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて１０⁶細胞／１００ｍｌで溶解し、遠心分離により細胞の破片を除去した。ＲＩＰＡ溶解液のＴｒｉｓ生理食塩水での１：１００希釈物の１００ｍｌを、ニトロセルロース膜に吸着させ、ウシ血清アルブミンで過剰の部位をブロックした。マウス血清の連続希釈液を、各ドットブロットとともにインキュベートし、ＴＥ緩衝液で３回洗浄した。過剰のアルカリフォスファターゼ結合免疫グロブリン型抗−マウス抗体を用いて、特異的ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの力価を決定し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ、Pierce Chemical Company)で発色させ、４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いて、９６ウエルプレートＦｌｏｗ比色計で定量した。対照を超える平均光学密度±１Ｓ．Ｄ．を生じる最高希釈として、力価のカットオフを報告する。セロコンバートした動物におけるウエスタンブロット免疫反応性を決定した。ウエスタンブロットは、４日間の受動拡散転移により成されたニトロセルロースへの転移を伴うＨＩＶ−１_IIIB感染Ｈ９細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調製された。アルブミンでブロックしたストリップをニトロセルロースシートから調製し、２００μｌのマウス血清の１：４０希釈物で１時間インキュベートした。アルカリフォスファターゼ結合抗マウス抗体を用いて検出を行い、５−ブロモ −４−クロロ−３’−インドリフォスフェートｐ−トルイジン／ニトローブルーテトラゾリウムクロリド(ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Pierce Chemical Company)を用いて発色させた。ニューヨーク血液センターのフレッドプリンス（Fred Pri nce ）から入手したヒトＩｇ（ＨＩＶＩＧ）を、抗ヒトアルカリフォスファターゼ検出系でヒト陽性対照として用いた。ｇｐ１２０の末端の１２個のアミノ酸に対して作製したマウス抗血清を、マウス陽性対照として用いた。Ｆ−ＭＯＣペプチド固相合成、ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏグラジエントを用いるＣ１８カラムのＨＰＬＣによるペプチドの精製、ＫＬＨへの結合およびFreundのアジュバントを用いる複数回の皮下注射によるマウスへの投与により、この抗血清を製造した。ウエスタンブロット分析により、大部分の体液性免疫応答がｇｐ４１に向けられ、直接の粘膜遺伝子免疫に対する明らかな抗ＨＩＶｅｎｖ全身応答を示唆することが示された。鼻洗浄群由来の動物における肺と結腸の免疫組織化学により、ＨＩＶ−ｅｎｖに対する特異的応答が細気管支と結腸の粘膜表面に存在することが示された。ＤＯＧＳ／ＨＩＶｅｎｖ−ＤＮＡの鼻洗浄で免疫した動物の肺の組織のＩｇＡ特異的アルカリフォスファターゼ装飾が、観察された。対照動物は、一貫して粘膜表面のＩｇＡ標識を示さなかった。ＤＯＧＳ／ＨＩＶｅｎｖ−ＤＮＡの鼻洗浄送達により免疫したマウスの肺の細気管支上皮の抗ＨＩＶｅｎｖ反応性が示された。対照動物は、ＨＩＶｅｎｖ抗原に対する細気管支反応性を示さなかった。鼻洗浄を介する免疫由来の結腸粘膜の蛍光抗体修飾が観察された。遺伝子粘膜免疫およびＨ９／ IIIＢ感染細胞由来のＨＩＶエンベロープ蛋白質の発見後のＩｇＡ応答のこの可視化は、粘膜遺伝子免疫感作に対する特異的分泌ＩｇＡ応答を表す。これは、遺伝子免疫原により誘導された粘膜免疫応答の最初の証明である。ヒト中和および促進抗体の測定を伴う広範な実験があるけれども、Ｂａｌｂ／ｃマウス血清を用いる初期の努力により、５６℃で０．５時間で熱不活化されたＨＩＶ阻害因子が明らかになった。熱不活化血清を用いるさらなる中和測定は、陽性対照としてのＨＩＶ−_IIIBで免疫したマウス由来の熱不活化Ｂａｌｂ／ｃ血清を用いて正確に標準化されるであろう。マウスは、現在、不活化ＨＩＶ−１_II _IB を用いて免疫されている。さらに、ＨＩＶｅｎｖ遺伝子免疫原に対するＣＴＬ応答が定量されうる。ＤＯＧＳ／ＨＩＶｅｎｖＤＮＡの鼻洗浄で免疫したマウスにおける組織化学的染色活性を行なった。冷凍ミクロトームを用いて、鼻洗浄免疫マウスの急速凍結（液体窒素）肺および結腸から５ミクロンの凍結切片を調製し、標準シリコン化(silinized)スライドグラスに付着させた。ＨＩＶｅｎｖ決定基に特異的な粘膜抗体を示すために、各切片を、Ｈ９／ IIIＢ細胞溶解物の１：１００希釈物と３０分間インキュベートした。Ｔ緩衝液で切片を十分洗浄し、１００μｌのＨＩＶＩＧの１：１００希釈物とともにインキュベートした。ＴＥ緩衝液で十分洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いて肺および膣切片におけるマウス抗−ＨＩＶ粘膜抗体のＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出で現像し、ならびに空腸および結腸における抗−ＨＩＶ粘膜抗体の検出のためにフルオレッセイン結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いてヒトＩｇの結合を検出した。アルカリフォスファターゼまたはフルオレッセイン結合ヤギ抗−マウスＩｇＡを用いて、肺凍結切片における粘膜ＩｇＡ抗体を可視化した。ＤＮＡに対するＤＯＧＳの結合は、ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓＲＩＳＣに基づくコンピューターでＢｉｏｇｒａｆソフトウエアパッケージ（Molecu lar Simulations，Inc．)のＤＲＥＩＤＩＮＧ II フォースフィールドを用いる分子モデルにより研究された。分子ダイナミックス後、該分子はＤＮＡの主溝と結合するように見える。ＤＯＧＳの極性末端の４つの陽電荷の２つとペプチドアミド水素は、ＤＮＡ上の単一のリン酸と対称的に配位している。１つの疎水性アームが、リン酸から伸び、２つめは、いくつかのメチレン基に対する主溝に沿って反対方向に伸び、それから第１のアームに向かって折れ曲がっている。この構造は、リン酸塩当たり溶媒に曝された４〜５個のメチレン基配列を配置する。ＤＯＧＳの脂質親和性鎖の１つが溶媒内に伸びている。５：１：：ＤＯＧＳ／ＤＮＡの分子荷電比で、すべてのリン酸基は、全ＤＮＡ分子を覆う疎水性外殻とイオン的に複合体を形成するであろう。このことにより、複合体の安定性およびその脂質原形質膜に対する親和性が説明される。ＤＯＧＳ／ＤＮＡ荷電複合体が比較的水素イオンに対して近寄り難いならば、この型の構造は、胃という酸性環境を通過して残存することが可能である。１．ボリスティック免疫化 un）は、０．９５μｍの金粒子に結合したＤＮＡを、ヘリウム推進力を用いて原形質膜を物理的に通過推進させる「１２連発銃」である。ＤＮＡを金に結合させ、水平に分散させて１／８”ＯＤポリエチレンチューブで乾燥させ、標準の１／２”の長さに切断する。５週齢および６ヵ月齢のＢａｌｂ／ｃマウスの背部皮膚および頭頂部皮膚における基底層への皮膚浸透およびランゲルハンス細胞に対する最適ヘリウム圧を決定する初期の研究が遂行された。金の浸透性のレベルを組織学的に決定するためおよびケラチノサイトまたはランゲルハンス細胞の原形質膜上のＨＩＶｅｎｖ蛋白質の発現が検出できるかどうかを免疫組織化学により決定するために、切片を処理する。２．ベクターの設計および合成試験的遺伝子免疫感作研究に用いるベクターであるｐＨｅｎｖは、ＳＶ４０プロモーターを含む９６００ｂｐのプラスミドである。しかし、ＨＩＶエンベロープ配列は、それぞれ十分に機能的なｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子とＲＮＡ受容体部位のＴＡＲおよびＲＲＥを有するＬＴＲｓ内に含まれている。恐らく、ｇｐ１６０の発現は、ＬＴＲプロモーター制御下にある。この発現系がｅｎｖ蛋白質を発現させて機能的な免疫応答を誘導するために、ｒｅｖ機能を欠く構築物中での他のプロモーター（ＣＭＶ）の使用よりも有利であるかどうかがここで決定されうる。ｇｐ１６０ばかりでなくｇｐ１２０およびｇｐ４１も別々にまたは組み合わせて発現されうる。１つの起こり得る問題は、ｇｐ４１の初期促進ドメインにおける初期の部位特異的突然変異誘発の努力において困難を生じさせたＲＲＥの広範な二次構造である。従って、我々は、ＲＲＥの二次構造を完全に破壊するように設計したサイレント突然変異を導入した（すなわち、ｇｐ４１のアミノ酸配列の変化なし）。我々は、２つのかかる突然変異を作製した。ＲＲＥ−３Ｃを、Ｒｅｖに対する結合部位を崩壊するように設計し、一方、ＲＲＥ−４Ｃを、全ＲＲＥをより広範に崩壊する。図２は、ＲＲＥおよび突然変異部位を図示する。ｐＨｅｎｖを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、電気泳動後アガロースから４７００ｂｐのｇｐｌ６０を単離した。この配列を、ｐＡｌｔｅｒＭＣＳにクローニングし、ＲＲＥ、アンピシリン（修復）およびテトラサイクリン（感受性）部位での部位特異的突然変異を行い、アンピシリンで選別した。変異したＲＲＥは、抗生物質選別後、正確なサイズおよび制限部位を得た。配列分析によりＲＲＥの突然変異の確実性が確認された。驚くべきことに、ＣＭＶプロモーターで機能的ｒｅｖ蛋白質を欠く条件下でのＲＲＥは、ＲＲＥ陰性構築物よりも良好な免疫応答を生じた（表６）。同様に、イン・ビトロでのＲＲＥは、ｇｐ１６０の最大翻訳を必要とする。従って、無傷のＲＲＥの存在は、ｒｅｖの非存在下でもＨＩＶのエンベロープに対する遺伝子ワクチンの構築において望ましい態様である。３．ＨＩＶエンベロープ蛋白質の分子モデルＨＩＶのｅｎｖ蛋白質の一次配列は、超可変的であるけれども、ある種の構造上の特徴は、すべての単離物間で定常に残存している。図２は、レオナルド（Le onard ）ら（１７４）により報告されたｇｐ１２０に対する構造的なデータを表し、図中、ジスルフィド対を古典的化学方法により同定し、一般的なグリコシル化パターン（シアル化対非シアル化）を、酵素的方法により示した。ｇｐ４１に存在する唯一のジスルフィドおよび構造が不明なＮ−結合グリコシル化部位が、図２に含まれる。これらの構造上の相関は、ロビンソン（Robinson）とミッチェル（Mitchell）（１７８）により評論された中和および促進抗体結合ドメインと組み合わせられる。ｇｐ１２０では、９個のジスルフィド結合および１個の遊離スルフヒドリルが存在する。ｇｐ１２０のシステイン残基の位置は、追加の２個のシステインが４番目の超可変ドメインに存在するＺ３単離物を除いて、すべての単離物で高度に保存されている。このことにより、III_Bにおけるジスルフィド対をすべての単離物間で維持されることが強く示唆される。分子シュミレーションのためのＤｒｅｉｄｉｎｇ II 一般的フォースフィールドを用いて、ガブリエル（Gabriel ）とミッチェル（Mitchell）（１７２）は、ｇｐ１２０のグリコシル化、抗原構造およびｇｐ１２０／ＣＤ４結合相互作用に関するすべての公知のデータと一致する切断型ｇｐ１２０に対する分子シュミレーションを作成した。該モデルにさらなる信用を提供する公知のｇｐ１２０／ＣＤ４結合阻害剤とのドッキング阻害研究が、最近完成した（１７９）。ムーア（Moore ）ら（１４９）の理論的予言と一致するｇｐ４１のＣｙｓ−Ｃｙｓループがｇｐ１２０のＣ末端凹部にドッキングしたｇｐ４１に関する同様なモデル研究が行なわれた。従って、ｇｐ１２０における主要な抗原決定部位とＮ−結合オリゴサッカリド、ｇｐ１２０／ｇｐ４１相互作用とＣＤ４にドッキングしたｇｐ２０との間の相関に対する確実なモデルが存在する。ｇｐ１２０のＶ３ループは、一部が炭水化物により不明瞭であるけれども、一方の面で溶媒に接近できる。第２の保存ドメインは、一方の側からのみ接近できる。ＣＤ４−結合ドメインは、一方の面で炭水化物により全く不明瞭であるが、反対側の面で容易に接近可能である。遺伝子免疫原における配列可変性の効果が予想できるモデル構造を提供する現可能性は、蛋白質の免疫原の構造変化に依存しているそれらの生物学的応答の設計および分析において助けとなる価値の高い道具である。３．ＨＩＶワクチンプログラムに対する重要性粘膜の遺伝子免疫感作の促進により、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて特異的抗ＨＩＶｅｎｖ応答が生じた。通常の方法により得られるマウスポリクローナル対照ＨＩＶ中和血清を得るために、マウスを現在ＨＩＶ−１_IIIBに対して免疫化している。ヒトのＨＩＶに対する機能的体液性応答の定量化は、本明細書で教示されたようになされることが可能であり、何の困難性も予期しない。遺伝子免疫化によりＣＴＬ応答を起こすことが示されたので、免疫化の関数としてＢａｌｂ／ｃマウスの細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）応答を評価するために用いることが可能な２つのユニークな細胞株がViagene社（サンジエゴ、カルフォルニア）から得られた（１８２）。Ｈｕ／Ｄ^d株は、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＤ^dＭＨＣ座を有して発現するＣＤ４発現ＨｅＬａ派生株である。この株は、Ｂａｌｂ／ｃＣＴＬｓに対する標的として用いられる種々の確立されたおよび初代ＨＩＶ単離物で感染させることができる。第２の細胞株は、細胞表面上で発現するＨＩＶｅｎｖ（ IIIＢ）配列で永久にトランスフェクトしたＢａｌｂ／ｃ繊維芽細胞である。この細胞は、ＨＩＶに対する免疫の関数としてのＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴＬ分析に対する別の好適な標的を提供する。４．方法の設計およびプロトコールＡ．一般的な設計最初の評価は、遺伝子免疫に対する粘膜および全身応答の直接比較において、通常のベクターとしてのｐＨｅｎｖを用いた。Ｉｇの血清力価、ウエスタンブロットおよび免疫体液性応答のラジオ免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）特性、耳下腺分泌におけるｓＩｇＡ力価、ならびにＨＩＶに特異的な粘膜抗体による直接的な可視化に関して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを評価した。血清および耳下腺抗体の中和力価ならびに⁵¹Ｃｒ標識標的ＢｃｅｎｖおよびＨｕ／Ｄ^d／ＨＩＶに対する脾臓ＣＴＬ活性も慣用の方法により決定することができる。通常の粘膜応答を誘導するＤＯＧＳ／ＤＮＡｅｎｖ複合体の能力を、鼻洗浄、結腸曝露、膣曝露および胃送達処方で評価する。それぞれの場合、最高の全ＤＮＡ１回投与量曝露として１０μｇのＤＮＡを用いて、投与量応答分析を行なう。同様に、応答の間、２週間および／または３ヵ月の間隔を可能にする１、２または３回の遺伝子免疫感作スケジュールを関数として応答を評価する。単純な処方が可能であるかを確立するために、ボリスティックＤＮＡ／Ａｕ処方に該ビタミンを包含させることを評価することができる。種々の物理学的状態下での処方の安定性が慣用的に確立されうる。前記概略した遺伝子免疫感作の種々の経路および様式を評価中であるが、遺伝子粘膜免疫に使用するために種々のＤＮＡ構築物を開発することが可能である。免疫原の発現に関する種々の真核細胞のプロモーターの効果が慣用的に調べられる。遺伝子免疫に対して現在まで調べた真核細胞のプロモーターで最も有効なプロモーターは、他のより有効なプロモーターが発見されるかもしれないけれども、ＨＢＶサブユニット発現に対するＣＭＶプロモーターである（１８）。ｐＴＫｂ（GenBank accession # U02438）を用いる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼプロモーター、ｐＳＶｂ（GenBank accession # U02435）を用いるＳＶ４０初期プロモーター、ｐＣＭＶ−Ｌｉｃ（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーＬＩＣクローニング部位、ＨＧＨポリアデニル化部位およびＳＶ４０初期プロモーター）またはｐＣＭｖｂ（GenBank accession # U02451）を用いるＣＭＶ即時型遺伝子プロモーター、およびアデノウイルス主要後期プロモーター（ GenBank accession # U02442）を試験する。ＬＴＲｓを欠失したｇｐ１６０を用いて、ＨｅＬａおよびＳＧ１８１（ヒト繊維芽細胞）およびヒトＨ９ならびに初代マウス肺、腸および皮膚移植組織培養物等の種々の真核細胞株で、どのベクターが最大の発現を提供するかを評価することができる。最良の一貫した発現を提供するそれらのプロモーターは、その後のベクター構築物に用いる。標的真核細胞の表面発現に対する最良のプロモーターの同定後、最良のシグナルペプチド配列（すなわち、例えば、ＨＩＶシグナル配列対ＴＰＡシグナルペプチド）、ＲＲＥ二次構造を有するベクターからの発現、ｇｐ１６０対ｇｐ１２０および／またはｇｐ１６０膜アンカードメインを含むｇｐ４１ならびにｇｐ１６０の切断部位を除去したｇｐ１６０を同定するように設計されたベクター構築物を調製する。遺伝子免疫に対する最良の構築物の同定後、このＨＩＶｇａｇ蛋白質において、Ｎ末端中和部位が同定されているので、ＨＩＶｅｎｖ配列とｐ１７を有するベクターを構築する。本明細書での教示を用いて、最良のプラスミドベクター構築物を以下の遺伝子免疫を質および量の両方を最大にするために同定することが可能である。遺伝子免疫は、ＨＩＶの原則中和ドメイン（すなわち、Ｖ３ループ）の種々の超可変型に対する多数の応答を起こす最良の機会を提供する。クレード(clade) Ｂウイルスの主要なマクロファージ指向性およびリンパ球指向性変異体ならびに感染ドナーの感染力を有する多くの変異体から感染変異体であることを認識されたそれらの限定されたＶ３ループ配列を反映するｐＮＬ４−３ＤＮＡエンベロープ配列上でＶ３ループ突然変異を作製することができる（１７１）。各Ｖ３ループ変異体に対して、群特異的構造的エピトープ上の変化を予想するために、分子モデルによりｇｐ１２０／ｇｐ４１構造上の効果を調べることができる。また、本明細書で教示された方法を用いて、多数のＶ３ループ種を含むＤＮＡｅｎｖカクテルに対する応答を調べることも可能である。詳細なプロトコール１）ＤＮＡｅｎｖ粘膜免疫感作の促進 (diotadecyl)アミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）を、１００％のエタノールに溶解し、５：１のモルカチオン電荷過剰で、Ｈ₂Ｏ中でＤＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡの濃度に基づいて免疫感作投与量までＴｒｉｓ生理食塩水で希釈し、以下の処方で即時に投与する。６週齢または６ヵ月齢の麻酔（ケタミン／キシラジン）メスＢａｌｂ／ｃマウスに、１００μｌを、鼻洗浄、胃ボーラスもしくは結腸浴または２５μｌ寄託した膣内投与する。すべての動物を、５つの群に無作為に分ける。最終免疫感作後３週間でケタミン／キシラジン麻酔下、全採血により各動物を安楽死させる。腹部大動脈のカテーテル法（#25 小児科用切断セット）により全血を採取する。脾臓を採集し、白色パルプを掻き裂いてHypaque-Fico l でＰＢＭＣｓを単離する。肺、結腸、小腸および膣を採集し、その後の凍結切片処理のために、液体窒素で急速凍結する。２）ベクター構築物ａ．ベクター構築物は、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）およびポリＡシグナル部位を含むプラスミドベクターを使用する。ＨＩＶｅｎｖＤＮＡ配列を親のプラスミドＭＣＳへの挿入のためのユニークな突出制限部位を用いてＰＣＲにより増幅する。この目的のために、ＮｏｔＩ／ＭｌｕＩ部位を天然および変異体ＤＮＡ免疫原の構築に使用した。ｂ．部位特異的突然変異：いた。ＨＩＶ_NL4-3エンベロープ配列を含むｐＨｅｎｖのＳａｌＩ／ＥｃｈｏＲＩアガロース精製制限断片を、ｐ−Ａｌｔｅｒベクターにクローニングした。このベクターは、複数回の追加の突然変異の間、選択のための変異アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。ｐ−Ａｌｔｅｒ_HIVenvで形質転換したＪＭ１０９大腸菌を誘導して、ヘルパーファージＤＮＡを用いて一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを製造する。３つの変異プライマー（アンピシリン耐性修復プライマー、テトラサイクリン耐性不活化プライマーおよび分析対象遺伝子の変異プライマー）を、室温でｓｓＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼで埋め、変異修復大腸菌を形質転換に用いて、抗生物質選択プレート上で突然変異したプラスミドを回収する。この方法は、試験した種々の方法で変異を確かめた所望の配列の最高の収量を提供した。厳密な因子は、ファージＤＮＡの精製度とすべてのＤＮＡ修復系を欠失したＭｕｔＳ−Ｂｌｕｅ大腸菌の使用に関わる。３）ボリスティックＤＮＡ免疫１．５ｍｌのマイクロフュージチューブ中で、５０μｇ（０．９５μｍ）の金粒子を、１００μｌの０．１Ｍスペルミジンと混合し、５秒間超音波処理し、０．１〜５．０μｇＤＮＡ／ｍｇ金となる濃度で、等容量またはそれ以下のプラスミドＤＮＡを添加して、ボルテックスにより混合する。ボルテックスの間、２００μｌの２．５ＭＣａＣｌ₂を添加し、混合物を室温で１０分間放置して沈殿させる。混合物を短時間遠心分離して、溶液中の残存した金を沈殿させる。上清を捨てる。４℃で５００μｌのエタノールでペレットを３回洗浄し、洗浄間で３０秒のマイクロフュージスピンを行なう。エタノールの容量を７ｍｇ金／ｍｌに調整し、ボルテックスし、超音波処理（３秒間）して、Ａｇｒｉｃｅｔｕｓチューブターナーに水平に固定した回転１／８”ＯＤＴｅｆｚｅｌポリエチレンチューブに、５００μｌを移す。粒子を放置して沈殿させる（５分間）。過剰のエタノールを機械的にゆっくり除き、２０ｒｐｍで回転を開始する。３０秒後、０．４１ｐｍでＮ₂を用いてチューブを乾燥させる。次いで、チューブを１／２’ 切片に切断する。量の制御のために、光学顕微鏡によりチューブの各末端の金粒子数を測定し、所望のｐｓｉで、３％のアガーに浸透させる。チューブを、乾燥剤中、４℃で貯蔵する。Ｏｓｉｅｒ細剪断クリッパーを用いる最初の剪断により、ボリスティックトランスフェクションのためにマウス皮膚を調製し、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ乾式／湿式電気かみそりを用いて、最終調製する。金と錯体を形成した付着ＤＮＡを有する１／２インチのチューブを、Ａｃｃｅｌ．ＰｕｌｓｅＧｕｎ内に負荷し、種、部位、動物の年齢および皮膚からの距離（標準）に基づき、予め決定しておいた最適の皮膚浸透ｐｓｉのＨｅによりＤＮＡ／金錯体を推進させる。浸透部位は、容易に観察され、必要なら次の処理のためにＩｎｄｉａインクで永久に印を付けることができる。４）全身抗体分析ａ．Ｉｇ力価。ＨＩＶ−１のｅｎｖ蛋白質に対する抗体の血清力価を、ドット −ブロット手法で定量する。ＨＩＶ−１_IIIBで感染したＨ９細胞を、１０⁶細胞／１００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコーレート、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）で溶解し、遠心分離により細胞の破片を除去する。ＲＩＰＡ溶解液のＴｒｉｓ生理食塩水での１：１００希釈物の１００μｌを、ニトロセルロース膜に吸着させ、ウシ血清アルブミンで過剰の部位をブロックする。マウス血清の連続希釈液を、各ドットブロットとともにインキュベートし、ＴＥ緩衝液で３回洗浄した。過剰のアルカリフォスファターゼ結合抗−マウスＩｇ抗体免疫グロブリン型抗−マウス抗体を用いて、全ＩＧまたは特異的ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの力価を決定し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ、Pierce Chemical Company)で発色させ、４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いて、９６ウエルプレートＦｌｏｗ比色計で定量する。光学密度スキャナーは、ドット−ブロットで直接ＯＤスキャンを行なうことを可能にする。対照を超える平均光学密度±１．Ｓ．Ｄ．を得る最高希釈として、力価のカットオフを報告する。ｂ．ウエスタンブロット。ウエスタンブロットは、４日間の受動拡散転移により成されたニトロセルロースへの転移を伴うＨＩＶ−１_IIIB感染Ｈ９細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調製される。アルブミンでブロックしたストリップをニトロセルロースシートから調製し、２００μｌのマウス血清の１：４０希釈物で１時間インキュベートする。アルカリフォスファターゼ結合抗−マウス抗体を用いて検出を行い、５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリフォスフェートｐ −トルイジン／ニトロ−ブルーテトラゾリウムクロリド(ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、P ierce Chemical Company)を用いて発色させた。ニューヨーク血液センターのFre d Princeから入手したＨＩＶＩＧを、抗−ヒトアルカリホスファターゼ検出系を用いてヒト陽性対照として使用する。ｃ．ラジオ免疫沈降分析（ＲＩＰＡ）。Ｈ９／III Ｂ細胞を、１ｘ１０⁶細胞を含むシステインを含まない培地中、４時間、１ｍＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−システインで標識する。ＲＩＰＡ緩衝液（前記４ａを参照）で溶解した細胞を、ＰＢＳで３回洗浄する。２ｘ１０⁵ｃｐｍ／μｌで２０ｘ１０⁶ｃｐｍを達成するように試験がなされた。試験対象の血清を、４℃で１時間、１００μｌの希釈したＰｒｏｔｅｉｎＧ−セファロース（Pierce）とともにインキュベートする。０．５〜１ｘ１０⁶細胞と同等の溶解物を添加する。血清抗体および溶解物抗原を、４ ℃で一晩インキュベートし、ＲＩＰＡ洗浄緩衝液（すなわち、ＲＩＰＡ溶解緩衝液からデオキシコーレートとフェニルメチルスルフォニルフルオリドを除いたもの）で洗浄する。免疫複合体−ＰｒｏｔｅｉｎＧ粒子を、１０００ｇで遠心分離し、４ｍｌのＲＩＰＡ洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００℃で２分間変性させ、１０％の分離ゲル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させる。電気泳動後、３０％メタノール、１０％酢酸、６０ｄｄＨ₂Ｏまたは同等物でゲルを固定し、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒを用いて放射活性のバンドを可視化する。ｄ．中和測定。（ｉ）標準マイクロタイター中和アッセイ。中和抗体活性を、本研究室から最初に記載されたように、マイクロタイター感染測定で測定する（１８３）。要約すると、熱不活化（６０℃、３０分間）血清試料を、１２％ＦＣＳを含むＲＰＭ１１６４０生育培地に３連で２倍連続希釈する。ウイルス（５〜１０ｘ１０⁶感染単位）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次に、１００μｌの生育培地中の２〜５ｘ１０⁵個のＭＴ−２細胞を、各ウエルに添加し、プレートを、５％ＣＯ₂／９５％空気中、３７℃で２〜３日間インキュベートする。合胞体形成に関して、細胞を位相差顕微鏡でモニターし、ウイルス対照ウエル（マウス血清なし）が広範な細胞変性効果を示したときに測定する。これは、ＭＯＩ≧１を使用したとき、通常３．５日で起こる。細胞を、ポリ−Ｌ−リシン被覆プレートに移し、Fainter のニュートラルレッド染色剤と共に１時間インキュベートする。付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、酸アルコールを用いて生細胞染色を遊離する。プレートを、生細胞に対して５４０ｎｍで、ＦｌｏｗＴｉｔｅｒｔｅｋマイクロ比色計で測定する。細胞対照ウエル（ｎ＝４）と比較して、生存率を決定する。中和力価を、細胞対照と比べて、≧５０％細胞生存率を生じる最高希釈として定義する。（ii）初代単離物中和。中和に対する金標準は、初代単離物パネルのヒトＰＢＭＣを感染させる能力を中和する能力である。ＰＢＭＣを、Hypaque-Ficol で新たに単離する。１０μｌの非希釈初代単離ＨＩＶ（すなわち、ＰＢＭＣｓで常に増殖させる）中の５ｘ１０⁶細胞を、３連で、マウス血清の連続５倍希釈液中、４℃で１時間インキュベートし、次いで、生物学的に派生したＩＬ２を含む１ｍｌのＲＰＭＩ／１２％ＦＣＳに添加する。７日めの上清を、対照培養液に対してＲＴおよび／またはｐ２４レベルを測定する。≧５０％阻害を生じる最高希釈を、中和力価として報告する。５）粘膜抗体分析ａ．耳下腺分泌ＩｇＡ／ＩｇＧ力価：短期免疫感作スケジュールに対しては毎週、長期スケジュールに対しては毎月、力価をモニターする。麻酔（ＩＭケタミン／キシラジン）Ｂａｌｂ／ｃマウスの耳下腺分泌を、ピロカルピン（２０μｇ／マウス）を用いて誘導し、パスツールピペットを用いて、特定の日に唾液を集める。前記４ａで記載のドットブロット手法により、２倍の連続希釈物の分析を決定する。種々のＶ３ループ発現免疫原に対する特異的応答の検出、すなわち耳下腺分泌は、Ｆ−ｍｏｃ法によりＭｉｌｉｇｅｎ９０５０ペプチド合成機で合成したＶ３ループペプチドを用いて滴定する。１００μｌの被覆緩衝液（０．１Ｍの重炭酸緩衝液〔ｐｈ９．６〕）中の１μｇの合成ペプチドを、Ｉｍｍｕｌｏｎ２マイクロタイタープレートの各ウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートする。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回ウエルを洗浄し、次いで、連続希釈（２倍）唾液を、各３連のウエルに添加する。３７℃で２時間インキュベーション後、洗浄緩衝液で３回ウエルを洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウスイムノグロブリンＡまたはＧ（重鎖および軽鎖特異的）を、１：１，０００希釈で添加し、３７℃でもう１時間インキュベートする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回ウエルを洗浄後、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ）を基質として添加し、室温で３０分間インキュベートする。各ウエルの光学密度（ＯＤ）を、４１０ｎｍで酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）リーダーで読む。該手法および分析のより詳細な記載に関しては、参考文献１４３〜１４５を参照されたい。ｂ．免疫細胞化学：冷凍ミクロトームを用いて、遺伝子免疫マウスの急速凍結（液体窒素）肺、結腸、空腸および膣組織から５ミクロンの凍結切片を調製して、標準シリコン化(silinized)スライドグラスに付着させる。ＨＩＶｅｎｖ決定基に特異的な粘膜抗体を示すために、各切片を、Ｈ９／ IIIＢ細胞溶解物の１：１００希釈物（１：１００：：ＲＩＰＡ：Ｔｒｉｓ生理食塩水）と３０分間インキュベートする。ＴＥ緩衝液で切片を十分洗浄し、１００μｌのＨＩＶＩＧの１：１００希釈物と共にインキュベートする。ＴＥ緩衝液で十分洗浄後、アルカリフォスフェート結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いて肺および膣切片におけるマウス抗−ＨＩＶ粘膜抗体のＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出で、ならびに空腸および結腸における抗−ＨＩＶ粘膜抗体の検出のためにフルオレッセイン結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗血清を用いてヒトＩｇ（ＨＩＶＩＧ）の結合を検出する。アルカリフォスファターゼまたはフルオレッセイン結合ヤギ抗−マウスＩｇＡを用いて、凍結切片における粘膜ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を可視化する。６）ＨＩＶ発現標的に対する細胞傷害性リンパ球活性（ＣＴＬｅｎｖ）の分析初代ＨＩＶ単離物で感染させたＨｕ／Ｄ^d細胞株または結果の要約として早期に記載したようにネズミＢｃｅｎｖ株（ＨＩＶ発現）を用いて、ＣＴＬｅｎｖを定量する。非感染Ｈｕ／Ｄ^dおよびＢＣｇａｌ（ｂガラクトシダーゼ発現）を、それぞれ対照として用いる。ＰＢＳ中の１５０μｌのＮａ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄（１ｍＣｉ／ｍｌ、Dupont/NEN製のグラム当たり４００〜１２００Ｃｉの比活性のＣｒ）を有するＲＰＭＩ１６４０中１．５ｘ１０⁶細胞を５％ＣＯ₂下、４５分間インキュベートすることにより、標的細胞に⁵¹Ｃｒを細胞内に入れる。標識された細胞を、冷ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで３回洗浄し、細胞傷害性測定のために、氷上に保つ。Hypaque-Ficol により単離したマウス脾臓単核細胞を、１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１のエフェクター：標的比で、標的細胞（１００μｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ中１０⁴細胞）に添加し、５％ＣＯ₂下、３７℃で４時間インキュベートし、遠心分離し、ガンマカウンターで１００μ ｌを計数する。対照標的細胞を、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて溶解し、最大放出値および％細胞傷害度−＼｜ｆ（測定放出−自発放出、最大放出−自発放出）ｘ１００により計算された細胞傷害度を得る。７）組織中のトランスフェクトしたＤＮＡｅｎｖの持続性の分析最初のトランスフェクション部位組織を、トランスフェクション後の時間を関数として集め、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．０および１ｍＭＥＤＴＡ中で一部を溶解し、１０００ｘｇで遠心分離して不溶性の細胞の破片を除去し、上清を取って、１００℃で５分間加熱する。ＤＮＡｅｎｖの分析は、約６１６０〜７３５８ｂｐに相当する１２００ｂｐのＤＮＡ産物を生じるＥＤ５（５’−ＡＴＧＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＴＧ）およびＥＤ１２（５’−ＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＡＧ）プライマーを用いるＶ３〜Ｖ５領域のＰＣＲ増幅を使用する。５０μｌ容量におけるこの遺伝子産物の標準条件は、９５℃およびワックスビーズ「ホットスタート」で５分間のインキュベーション後のサイクル開始を伴う、９４℃６０秒間、５５℃６０秒間および７２℃１２０秒間の工程間に１秒のランプタイムを有する３５サイクルである。ＰＣＲ反応は、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１．５ｍＭＭｇＣｌ中で０．２μＭの各プライマーを用いた。鋳型として、２〜１０μｌの細胞溶解物を用いる。増幅ＤＮＡを、ＴＨＥ緩衝液（８８ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸塩、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ）中、１２０ボルトで１時間、１．２％アガロースゲルまたは６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分離かつ同定する。ＤＮＡのバンドを、臭化エチジウム染色およびＵＶ光検出により同定する。プライマーの特異性は、ｐＮＬ４−３プラスミド由来ＤＮＡおよびＡＣＨ−２細胞（陽性対照）から得た全ゲノムＤＮＡを用いることにより、確認する。８）ＤＮＡｅｎｖをトランスフェクトした細胞型のin situ 分析高い特異性の好適なプローブを用いるＰＣＲ増幅ＤＮＡのin situ ハイブリダイゼーションは、別な方法では検出できないであろう正常細胞構造におけるトランスフェクトしたＤＮＡｅｎｖの検出を可能にする。トランスフェクトした組織由来の生検標本を、非架橋性水溶性固定液［Strekk Tissue Fixative(STF)］中、１時間固定し、パラフィン組織ブロック中に埋めて、切片をポリリシン被覆スライドクラス(class)にマウントし、慣用的なＨ＆Ｅ組織学用に作製する。ＰＣＲ増幅を行うために、スライス当たり３つの切片を含む４μｍの切片を、キシレンでの連続洗浄により脱パラフィンし、累進的にアルコール溶液で希釈する。脱パラフィンしたスライドを、原形質膜のプロテアーゼK浸透（１０μｇ／ｍｌ、ＲＴで２０分間）に付す。次いで、膜浸透スライドそれぞれを、Perkin-Elmer I n Situ PCR スライド Prep 装置の熱い載物台（５℃＞プライマーの融解温度）に置く。対照として２つの切片（すなわち、１つは陰性対照としてプライマーを欠失したもの、および２つめは膜透過に関する陽性対照としてＦ−アクチン等のハウスキーピング遺伝子増幅を用いたもの）を用意する。溶液ＰＣＲに関して最適の適当なイオンおよびｐＨ（すなわち、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中ＭｇＣｌ₂ 、ＫＣｌ）ならびに７．５ユニットのＡｍｐｌｉ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）と前記溶液ＰＣＲのためのプライマーを含むが、５’−ビオチン（ＤＮＡＣｙｃｌｏｎｅで調製）とハウスキーピング対照のためのプライマーを含む３５ μｌのＰＣＲ混合物。各切片を使い捨てのプラスチックチャンバーおよび加熱シンクとして役立つ外部の金属クランプで密封する。引き続いて、各調製スライドをスライド Prep 装置の温度で保温し、１０枚のスライド収容量を有する In Si tu PCR Cycler に移す。温度サイクル時間は、溶液ＰＣＲを用いて予め確立したものである。この手法は、手法の準備の間の非特異的プライマー結合およびポリメラーゼ伸長を最小にするホットスタートを提供する。特異的ＤＮＡ配列のin s itu 増幅後、５’−ビオチンを含む増幅ＤＮＡの特異的配列を検出するために、アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジンにより検出を提供する。水溶性基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドイルホスフェートｐトルイジン）は、酵素触媒基質加水分解部位で沈殿し、トランスフェクトした細胞の青色染色が生じる。この技術は、Perkin-Elmer In Situ PCR装置を利用することができる。ホルモン免疫調節末梢遺伝子免疫法（HIPGV） DOGS/ ビタミンD3はトランスフェクションを促進した。結果の要約特に明記する場合を除き、この実施例に記述するカチオン性脂質/DNA/ ビタミンD3法では、上述のカチオン性脂質/DNA法のプロトコルを使用する。本実験は、1,25(OH)₂D3が、全身応答に粘膜免疫応答を加える分子スイッチとして機能することを示す。さらに重要なことに、促進遺伝子免疫原に添加された 1,25(OH)₂D3が、全身応答と粘膜応答の両方を誘導するという証拠が示される。完全なRRE を含有するpCMV-env160 を使用すると、体液性応答が、接種材料に1, 25(OH)₂D3 を含めたマウス筋肉の促進トランスフェクションによって誘導された。４匹のマウス中４匹が、２週間の時点で、gp160 に対する有意な力価のIgG 、 IgM およびIgA をもって応答した（表５）10μg と１μg のDNA を用いる促進遺伝子免疫後に、sIgA価をさらに調べた。さらにこれを、RRE の存在または不在の関数として分析した。すべての接種材料に、１μg の1,25(OH)₂D3 をも含めた。突然変異型RRE を用いた場合、10μgDNA投与群の１匹と１μgDNA投与群の２匹が、２週間の時点で耳下腺分泌物中に有意なIgA 価を発生させた（すなわち総応答率38％）。これに対し、RRE が無傷である場合は、10μg または１μg 量のDNA を投与した動物はすべて、gp160 に対するIgA 価を発生させた（表５）。さらに、活性型ビタミンD3が存在しない場合は、遺伝子免疫に対する良好な全身応答にもかかわらず、耳下腺分泌物中には有意なsIgAが観測されない（表７）。ビタミンD3群の７匹のうち６匹が1:1250の検出限界を越えた。したがって、耳下腺分泌物中のIgA について、100 ％の応答率（ｎ＝７）が観測され、それは1,25(OH)₂D 3 の存在に依存する。免疫した動物から得られる耳下腺分泌物（10μl ）のIgA 免疫沈降分析は、HIVIG 対照と比較して、比較的強いgp41バンドと痕跡量のgp16 0 およびgp120 を示す。このRIPA分析の解釈を複雑にしているのは、対照耳下腺およびU937抽出物中の微量バンドが、抗体および血清反応陰性マウス血清とよく似た挙動を示すことである。U937/IIIB 細胞中の微量な35S 成分は、特異抗体/e nvタンパク質の不在下にプロテインA に結合することができた。このアーチファクト（人工産物）の排除を試みるために、他のHIV 生産細胞系を調べることができる。ａ力価の逆数表５．６ヶ月齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスへのＤＯＧＳと複合化させた１０μｇのｐＣＭＶ−Ｅｎｖ₁₆₀（＋ＲＲＥ）と１μｇの１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３のＩＭ投与後２週間の血清Ｉｇ力価。力価は、Immulon4プレート上で固定したバキュロウイルス由来のｒｇｐ１６０抗原（１μｇ／ウエル）を用いてＥＬＩＳＡで得られた。マウス血清Ｉｇの特異的結合を、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗血清で定量した。発色は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用してｐ−ニトロフェニルホスフェート(PNPP，Pierc e Chemical Company)で発色させ、４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いて９６ウエルプレートFlow比色計で定量した。力価のカットオフは、バックグランドを越える平均光学密度＞１Ｓ．Ｄ．を生じる最高希釈として報告する。ａ力価の逆数ｂＮＴ＝試験せず（麻酔により死亡）。表６．６ヶ月齢のＢａｌ／ｃマウスにおけるＤＮＡ免疫化に対する耳下腺ＩｇＡ抗ＨＩＶ応答。ＤＮＡ免疫原は、天然のｍＲＮＡ（＋ＲＲＥ）またはＲＲＥ二次構造を欠く変異したｍＲＮＡ（−ＲＲＥ）を発現するｇｐ１６０挿入物を下流に有するＣＭＶプロモーターを使用した。すべてのＤＮＡ免疫原はＤＯＧＳと複合化させて１μｇの１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３を含有していた。ＩｇＡ力価は、表５に記載のように得た。投与を受けていない動物では、ＩｇＡ抗ｇｐ１６０応答は検出されなかった（即ち、＜１０）。ビオチンで標識したバキュロウイルス由来のrpg160をgp160 結合部位の特異的組識プローブとして使用することにより、粘膜表面でのgp160 結合の定性的証拠について組識を調べた。１μg の1,25(OH)₂D3 の存在下にDNA/DOGS複合体の筋トランスフェクションによってCMV-Env160（+RRE）とCMV-Env160（-RRE）で免疫したマウスの器官を緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、スライドグラスに薄片化し、等級化（graded）アルコール中で脱パラフィン処理した。切片をrgp160- ビオチンに1/2 時間さらし、トリス-HCl(pH7.2)中で３回洗浄し、ストレプトアビジン- β- ガラクトシダーゼと共にインキュベートし、３回洗浄し、pH7.6（哺乳類β- ガラクトシダーゼはこのpHで不活性である）で、X-Gal（5- ブロモ-3- インドイル- β）- ガラクトピラノシドを用いて1/2 時間発色させた。スライドをファストレッドで対比染色した。粘膜結合部位の組識化学的証拠は、肺、大腸、小腸および子宮/ 膣に認められ、これらはその位置からsIgAと解釈される。気管支粘膜と肺胞（alveoli ）には多量の標識が認められる。gp160 結合は空腸の絨毛全体に広がり、陰窩に及んでいる。結腸では、その表面にgp160結合のしるしが示される。gp160 結合は子宮粘膜と膣粘膜の両方に存在する。対照は、gp160-ビオチンプローブをインキュベーション培地から省いた隣接組識切片と、全ての成分を存在させた非処置動物からなった。非処置マウス対照の漿膜表面には、非特異的組識標識のみが検出される。さらに、免疫後２週間の時点で組識を調べた。免疫部位には、壊死筋の領域に大量の単核細胞流入を伴う炎症反応が認められ、その単核細胞の大半はgp160-ビオチンプローブで標識される。 DOGSに加えて、生体内DNA 免疫の促進に関する第２のカチオン性脂質（TEDBI ）の有用性をも調べた。表７は、3:1 および4:1（カチオン性脂質：DNA ）の電荷比率における全身Ig応答を例示している。これは、このカチオン性脂質が生体内でのDNA トランスフェクションを促進できることを示す最初の例である。表８はTEDBI 複合化DNA の用量に対するIg応答を示している。ａＴＥＤＢＩのＤＮＡに対する電荷比表７．３ヶ月齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスへのＴＥＤＢＩと複合化させた１μｇのｐＣＭＶ−Ｅｎｖ₁₆₀（＋ＲＲＥ）のＩＭ投与後２週間の血清Ｉｇ力価。力価は、Immulon4プレート上で固定したバキュロウイルス由来のｒｇｐ１６０抗原（１μｇ／ウエル）を用いてＥＬＩＳＡで得られた。マウス血清Ｉｇの特異的結合を、ビオチン標識ヤギ(goal)抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗血清で定量した。発色は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用してｐ−ニトロフェニルホスフェート(PNPP，Pierce Chemical Company)で発色させ、９６ウエルプレート中で定量した。４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いるFlow比色計。力価のカットオフは、バックグランドを越える平均光学密度＞１Ｓ．Ｄ．を生じる最高希釈として報告する。ａＴＥＤＢＩのＤＮＡに対する電荷比表８．３ヶ月齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスへのＤＯＧＳと複合化させた１μｇのｐＣＭＶ−Ｅｎｖ₁₆₀（＋ＲＲＥ）のＩＭ投与後２週間の血清Ｉｇ力価。力価は、Immulon4プレート上で固定したバキュロウイルス由来のｒｇｐ１６０抗原（１ μｇ／９６ウエルプレート）を用いてＥＬＩＳＡで得られた。マウス血清Ｉｇの特異的結合を、ビオチン標識ヤギ(goal)抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗血清で定量した。発色は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用してｐ−ニトロフェニルホスフェート(PNPP，Pierce Chemical Com pany)で発色させ、９６ウエルプレート中で定量した。４１４ｎｍのバンド通過フィルターを用いるFlow比色計。力価のカットオフは、バックグランドを越える平均光学密度＞１Ｓ．Ｄ．を生じる最高希釈として報告する。全般的な実験計画３種類の遺伝子免疫法（粘膜細胞トランスフェクション、ボリスティックワクチン接種およびHIPGV ）による粘膜応答の誘導に関する比較データによれば、HI PGV が最も有効であると思われる。HIPGV は、HIV エンベロープ配列をHIV 感染細胞と類似の様式で細胞表面に発現させる筋細胞の促進トランスフェクションを使用する。ホルモンアジュバント−1,25(OH)₂D3 −は、通常の粘膜応答において、IgA 分泌プラズマ細胞として粘膜に引き渡されるHIV 特異的Ｂ細胞の移行をもたらす分子スイッチとして作用するようである。同様の現象が細胞傷害機能を媒介するように運命付けられたＴ細胞にも存在すると仮定することは妥当である。 Hoffman-LaRoche から、ダイン(Dayne)とアランス(Arranes)が使用したものと同じ合成1,25(OH)₂D3 を５mg得た。現行のプロトコルでは、これにより、マウスに 5000回の遺伝子免疫を行なうことができる。CMV 初期プロモーターの制御下に９種類のHIV-エンベロープ遺伝子ワクチンを構築した（表３）。CMV env160は、リーダー配列、gp120/gp41タンパク質分解部位、完全なRRE 、増強ドメインおよび膜アンカー配列を含む完全長gp160 を含有する。CMV env1R160は、それが上記タンパク質分解部位に、そのgp160 分子をタンパク質分解に対して耐性にする４アミノ酸欠失を含有する点以外は、CMV env160と同一である。残りのHIV-エンベロープ遺伝子構築物（ｎ＝７）は、それらが上記増強ドメイン内に欠失または点変異を含有する点以外は、CMV env160と同一である。遺伝子免疫原としてのそれらの有効性およびCMV env1R160の有効性に応じて、これら増強ドメイン突然変異の１つ以上を、タンパク質分解耐性変異体中に作成することになる。タンパク質分解とトランスフェクションされた細胞からのgp120 脱離を阻害することにより、 gp41応答の強度を維持しながら、gp120 に対する応答を強化することができる。増強ドメインの突然変異をそのような構築物に導入することにより、gp120 とgp 41の両方に対する有益な機能的応答を最大化し、同時に増強ドメインに対する有害な機能的応答を最小化することができる。まずはNL4-3 分離株エンベロープ配列に努力を集中することによって、遺伝子的に誘導される粘膜免疫応答の機序と動態の探査が可能になるだろうが、新たに粘膜感染した患者の一次分離株から得られるgp160 エンベロープ配列を使用することができる。これらの考察から、次に挙げる具体的な目的とそれらの実験計画を導いた。１）耳下腺分泌物中のIgA の定量耳下腺、空腸、結腸、直腸および子宮/ 膣分泌物中のIgA の濃度を全身Igに対して、時間と、種々のHlv-env_NL4-3挿入物を含有するpCMVベクターの濃度の関数として定量することが望ましい。１μg の1,25(OH)₂D3 を、確立したホルモンアジュバントとして使用し、耳下腺IgA およびIgG 力価を監視することにより、一次IM遺伝子ワクチン接種のピークと持続時間を確立する。このデータに基づいて、より大きな動物コホートを設定することにより、耳下腺、空腸、結腸および子宮/ 膣粘膜IgA 濃度を定量しながら経時的に動物を犠牲にする。最近Neutra研究室から公表された技術(188)（この技術では粘膜分泌物の吸着にPolyfiltronic ウィックを使用する）を使用する（IgA 回収率は＞90％）。吸着されたIgはPBS で溶出し、最大限の抽出を確保するために16,000×ｇで遠心分離する。主として sIgAからなる溶出IgA とIgG を、ELISA 検定法（「具体的方法」の項参照）で定量する。２）粘膜sIga応答の増強 HIV-エンベロープに対する一次HIPGV 後の直腸および子宮 /膣粘膜sIgA応答を増強する方法は、日常的に評価することができる。一次HIPGV によって粘膜免疫応答を得るための至適条件を決定したら、抗原（gp160 ）の局所（直接粘膜）投与と、最初の気道促進トランスフェクション法に類似する方法で最初の遺伝子免疫原を用いる直腸および子宮/ 膣粘膜の促進トランスフェクションにより、直腸および子宮/ 膣粘膜応答の増幅を行なうことができる。この実験法の理論的根拠は、タンパク質抗原または局所二次遺伝子ワクチン接種によって局所的に生産された抗原のいずれかが局所的な記憶消失応答（amnestic response ）をもたらすことにある。３）機能的Ab活性の定量 HIPGV と局所的記憶消失誘発後の粘膜分泌中の機能的な抗体活性を定量することができる。マウス血清は、56℃で1/2 時間の加熱により不活化することができる強力なHIV 中和活性を含有する。粘膜中和活性が非処置動物中に存在するかどうかを確認した後、それに応じて標準的な中和プロトコル（185 ）をマウスの粘膜分泌物に適合させる。一次ヒトPBMC培養におけるp24 検定とRT検定を用いて、中和力価を確立することができる。ヒト補体を用いる標準的な増強検定法を粘膜分泌物に適合させることができる。過去に使用された、増強ドメインにまたがる 35アミノ酸ペプチド（145 ）に対する粘膜IgA とIgG の結合活性を用いて、増強エピトープの不在を立証することができる。４）リンパ球亜集団の評価一次HIPGV 後の時間の関数として、リンパ節排液中および粘膜部位（すなわち、上皮内および粘膜固有層(lamnia propria)）のリンパ球亜集団、表面HIV-エンベロープレセプター、調節タンパク質および関連する表面接着分子を持つリンパ球を評価する。このデータは、1,25(OH)₂D3 によって誘導されるHIV-env 特異的リンパ球の移行とHIPGV に対するＢ細胞対Ｔ細胞の応答を理解するのに関連している。ホルマリン固定組識中のＢ細胞、CD4 細胞およびCD8 細胞の相対密度をHI PGV の関数として決定することができる。同様に、粘膜リンパ球と節リンパ球を、粘膜ホーミングに関与することが知られているVLA-4 αのような接着分子の存在について調べることができる（189，190）。粘膜リンパ球を単離し、それらをフローサイトメトリーによる標準的な分析にかけるには、新鮮な組識と共にニー (Ni)の方法（192 ）を使用する。５）HIVenvに対する細胞性細胞傷害脾臓および粘膜部位に由来するHIV-エンベロープ発現性Balb/c線維芽細胞に対する細胞性細胞傷害活性を定量する。この具体的目的のポイントは、突然変異誘発性構築物に従属する効果についてCTLを監視することである。マウスとヒトにおけるCTL エピトープは一般的には同一でないだろうが、この検定により、種々の免疫原をヒトに適用した場合に、それらがCTL の発生を阻害しないことをが保障される。結果の要約で詳述したように、脾細胞CTL 活性を定量する検定法が教示されている。ニーらの方法を使用すれば、CTL が粘膜部位に存在するビタミン D3によって高められるかどうかの確認にこの検定法を利用できるほど充分な量のリンパ球を、粘膜部位から単離することができる。６）DNA 免疫原の毒性時間の関数としての筋内での遺伝子構築物の持続性と、遺伝子構築物が非筋組識（生殖腺、肝臓、脾臓、肺など）中に検出されうるかどうかに関して、DNA 免疫原の潜在的毒性を決定することができる。いかなるフェーズＩ遺伝子免疫原の FDA認可にとって基本的な障害は、安全性の証拠を立証する動物データである。その遺伝子免疫原がワクチン接種部位に局在化し、非筋部位（特に生殖腺部位）には見つけることができないことの証明が、FDA にとっては特に重要である。RA C およびFDA 認可を得る目的で、マスターベクターファイル（Mater Vector Fil e ）がFDA に制定されるだろう。ペプチド抗原について既に記述されているようにして、DNA をImmulon プレートに付着させ、アルブミンで遮断したウェルをトランスフェクションされた動物由来の血清にさらすELISA 形式を用いて、マウス、ラット、モルモットおよびウサギを、プラスミドベクターDNA に対する抗体の発生について監視する。DNA に結合する抗体は、アルカリホスファターゼに結合した抗マウス（またはラット、モルモットまたはウサギ）Igによって検出される。定量は、基質過剰の（すなわちゼロ次速度論が得られる）条件下に、酵素収率から対照動物酵素収率を差引いた値に基づいて行われる。マウスを安全性評価用の第一の動物とする。FDA の勧告によっては、二次毒性試験の標的として異なる種を選択することになるだろう。HIPGV 中の重量測定と、実験プロトコルの最後に一般的な肉眼解剖学的検査と組識病理学的検査を、全てのマウスについて行なう。さらに、HIV-エンベロープ免疫原に関するPCR 増幅を肺、脾臓、肝臓および生殖腺組識で行なう。この操作は充分に確立されており、1200bpの配列が再現性よく増幅される。同定は、増幅されたDNA と塩基ラダーサイズマーカーの一般的なアガロース電気泳動と臭化エチジウム染色によって行われる。FDA に認可されたホルト(Holt)の転移性乳癌における抗fos 遺伝子療法フェーズＩ試験をモデルとして使用することができる。７）その他の免疫原 pNL4-3 HIV- エンベロープ遺伝子免疫原を用いて作成したデータに基づき、一次分離株から、より適切なHIV-エンベロープ遺伝子免疫原を構築するには、慣例に従って、p-Alter またはpCMVベクターに、そのプラスミドベクターのMCS にクローニングするための制限部位の5'- 伸長によって、HIV エンベローブ配列をPC R クローニングする。入手できるクローン化一次分離株からエンベロープ配列をクローニングすることにより、それらが利用可能になる。真皮ボリスティックトランスフェクション表皮遺伝子免疫に対するダイン(Dayne)博士の最初の観察結果を拡張し評価するには、Agricetus 遺伝子銃を使用することができる。この技術では、真皮および表皮の細胞への高圧ヘリウム投入用の担体としての金と錯化したDNA を使用する。一般に、この方法では、免疫応答を得るのに必要なDNA 量が、他の方法よりはるかに少ない。このことから、この技術による予備実験を、他の研究室で得られた至適DNA 濃度に及ぶように調節した。また、適用する1,25(OH)₂D3 は、ボリスティック免疫の３日後に皮膚トランスフェクション部位に適用した。1,25(OH)₂ D3 の不在下に25ngのDNA 濃度で最良の応答（IgM ）が観測された。器官の組識化学的分析では、いずれの組識にもgp160 結合は検出できなかった。ボリスチティック免疫による結果は、直接筋接種よりも劣っている。より高濃度のDNA を用いれば、より良い応答が得られるかもしれないが、この方法は、筋の促進トランスフェクションよりもはるかに困難であり、必要なDNA 量が同量であるなら、努力するに値しない。全身抗体分析ａ．Ig価。HIV-1 のenv タンパク質に対する血清抗体価は、プレート固定化リガンドとしてバキュロウイルス由来のrgp160を用いるELISA 法で定量される。コーティング緩衝液（0.1M炭酸ナトリウム，pH9.5）50μg 中のrgp160（AMAC Inc．）10ngを、96ウェルImmulon 4 マイクロタイタープレートの各ウェルに、37℃で時間固定する。そのプレートをPBS-0.15% Tween20 で３回洗浄した後、１ウェルにつき300 μg のPBS-1% BSA-0.15% Tween20を用いて室温で１時間ブロックし、次に、PBS-0.15% Tween20 で３回洗浄する。別のプレートで、血清または粘膜分泌物を３連でPBS 中に連続希釈し、各ウェルの50μg をgp160 リガンドプレートの対応するウェルに移し、次の手順に従う。パラフィルムカバーを用いて37℃ で１時間インキュベートする。PBS-1% FCS-0.05% NaN₃で５回洗浄する。各ウェルを予め決定した希釈のビオチン結合抗マウスIgG 、IgA またはIgM と共にインキュベートする。カバーをして37℃で１時間インキュベートする。PBS-1% FCS-0 .05% NaN₃で５回洗浄する。次に、カバーをして、50μg のストレプトアビジン- アルカリホスファターゼコンジュゲート（PBS-1% BSA-0.15% Tween20中1:200 ）と共に37℃で１時間インキュベートする。PBS-1% FCS-0.05% NaN₃で５回洗浄する。p-ニトロフェニルホスフェートを用いて、pH9.6 のグリシン緩衝液中で発色させる。Flowマイクロタイター比色計で405nm フィルターを用いて、発色収率を測定する。通例、バックグランドは、±0.005 未満の再現性で、0.23未満である。終点力価は、バックグランドに対して150 を越える発色収率を与える血清または分泌物の最高希釈率である（ｎ＝３）。粘膜抗体分析ａ．IgA/IgG に関する空腸、結腸および子宮/ 膣分泌の分析：ニュートラ（Neut ra）研究室が最近記述したように(188)、分泌物をPolyfiltronics吸収ウィックフィルターに集める。そのウィックから溶出したIgA とIgG を本ELISA 法で検定する。ｂ．免疫細胞化学：ビオチンと結合したrgp160（AMAC Inc．）を、本遺伝子免疫法によって生成した組識結合型抗体/ レセプターの特異プローブとして使用した。この方法は凍結組識とホルマリン固定組識のいずれかに使用できる。薄い切片を250 μl のビオチニル化リガンド（10ng/ml ）と共に室温で1/2 時間インキュベートし、PBS で２回洗浄する。100mM トリス（pH7.4 ）中のストレプトアビジン- βガラクトシダーゼ（Kirkegaard & Perry Labs ）250 μl を、その切片に室温で1/2 時間適用し、PBS で２回洗浄する。酵素が結合した部位にアズレン(a zure)ブルー沈澱を生じるX-Gal（5- ブロモ-4- クロロ-3- インドイル- β）-ガラクトピラノシドを基質としてpH7.6 で発色させる（K & P Labs製のHistomark キット）。通例、リガンドに曝露した非処置動物由来の切片と共に、リガンドに曝露していない隣接する切片を、非特異的生成物沈着に関する対照として使用する。本出願を通して、種々の刊行物が挿入番号により引用される。これらの刊行物に関する全ての引用を以下に示す。これらの刊行物の全体の開示は、本発明に属する技術水準をより完全に記載するために、参照により本願発明に取り込まれる。参考文献 1． Ulmer JB，Donnelly JJ，Parker SE，Rhodes GH，Felgner PL，Dw arki VJ，Gromkowski SH，Deck RR，DeWitt CM，Friedman A，Hawe LA，Leander KR，Martinez D，Perry HC，Shiver JW，Montgomery DL，and Liu MA．ウイルス蛋白質をコードするＤＮＡの注入によるインフルエンザに対する異種防御。 Science 1993，259:1745-1749． 2． Dayne RA，and Aranes BA．ｉｎｖｉｖｏでのＴ−Ｃｅｌｌリンホカイン生成の自然調節を用いる効果的なワクチンアジュバントの発達。 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【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年９月２２日（１９９７．９．２２）【補正内容】請求の範囲１．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するための有効量を、患者の粘膜に投与する工程を含む患者に粘膜免疫応答を誘導する方法。２．粘膜投与が鼻である請求項１記載の方法。３．粘膜投与が経口である請求項１記載の方法。４．粘膜投与が直腸である請求項１記載の方法。５．粘膜投与が膣である請求項１記載の方法。６．カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミンである請求項１記載の方法。７．ＤＮＡがエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする請求項１記載の方法。８．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫誘導量を含有してなる組成物。９．粘膜免疫応答を誘導するための有効量で、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した抗原をコードするＤＮＡおよびビタミンＤ３を患者に投与する工程を含む患者に粘膜免疫応答を誘導する方法。１０．ビタミンＤ３が１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３である請求項９記載の方法。１１．投与が筋肉内である請求項９記載の方法。１２．粘膜免疫を誘導するための有効量で、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードするＤＮＡおよびビタミンＤ３を含有してなる組成物。１３．ビタミンＤ３が１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３である請求項１２記載の組成物。１４．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡおよび所定量のビタミンＤ３を含有してなるキット。１５．ビタミンＤ３を投与する工程を含む遺伝子粘膜免疫方法。１６．カチオン性脂質がリポスペルミンまたはリポスペルミジンである請求項１２記載の組成物。１７．カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミンである請求項１２記載の組成物。１８．カチオン性脂質がリポスペルミンまたはリポスペルミジンである請求項１４記載のキット。１９．カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミンである請求項１４記載のキット。２０．生理学的に許容されうる賦形剤をさらに含有してなる請求項１２記載の組成物。２１．ビタミンＤ３が１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３である請求項１４記載のキット。２２．生理学的に許容されうる賦形剤をさらに含有してなる請求項１４記載のキット。２３．トランスフェクションを促進するカチオン脂質と複合体を形成した、病原体の抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫誘導量を含有してなる組成物。２４．ビタミンＤ３をさらに含有してなる請求項２３記載の組成物。２５．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するための有効量を含有してなる、粘膜免疫を誘導する医薬の製造のための組成物の使用。２６．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するための有効量を含有してなる、粘膜免疫応答の誘導に使用するための組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 47/48 Ｚ 48/00 48/00

Claims

【特許請求の範囲】１．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫応答を誘導するための有効な量を、患者の粘膜に投与する工程を含む患者に粘膜免疫応答を誘導する方法。２．粘膜投与が鼻である請求項１記載の方法。３．粘膜投与が経口である請求項１記載の方法。４．粘膜投与が直腸である請求項１記載の方法。５．粘膜投与が膣である請求項１記載の方法。６．カチオン性脂質がジオクタデシルアミドグリシルスペルミンである請求項１記載の方法。７．ＤＮＡがエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする請求項１記載の方法。８．トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードするＤＮＡの粘膜免疫誘導量を含有してなる組成物。９．粘膜免疫応答を誘導するための有効量で、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した抗原をコードするＤＮＡおよびビタミンＤ３１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３を患者に投与する工程を含む患者に粘膜免疫応答を誘導する方法。１０．ビタミンＤ３が１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３である請求項９記載の方法。１１．投与が筋肉内である請求項９記載の方法。１２．粘膜免疫を誘導するための有効量で、トランスフェクションを促進するカチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードするＤＮＡおよびビタミンＤ３を含有してなる組成物。１３．ビタミンＤ３が１，２５（ＯＨ）₂Ｄ３である請求項１２記載の組成物。１４．トランスフェクション促進カチオン性脂質と複合体を形成した、病原体のエンベロープ抗原またはエンベロープ関連抗原をコードする所定量のＤＮＡおよび所定量のビタミンＤ３を含有してなるキット。１５．ビタミンＤ３を投与する工程を含む遺伝子粘膜免疫方法。