DE69629202T2

DE69629202T2 - Induktion von immunantworten der schleimhäute durch verabreichung von vitamine d3 und dns, die für ein antigen kodiert und die mit mit einem kationischen lipid ein complex bildet.

Info

Publication number: DE69629202T2
Application number: DE69629202T
Authority: DE
Inventors: M. William MITCHELL
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-10-18
Also published as: JP2000501381A; AU7462096A; WO1997014442A1; EP0855919A1; EP0855919B1; AU696850B2; ATE245453T1; CA2233166A1; DE69629202D1; EP0855919A4; CA2233166C

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft die Immunität der Schleimhäute. Vornehmlich ist die Erfindung darauf gerichtet, die Immunität der Schleimhäute in einem Subjekt zu veranlassen. Insbesondere ist die Erfindung auf die Verwendung von DNS, die mit einem kationischen Lipid einen Komplex bildet,, und Vitamin D3 gerichtet, die Gegenstand der Herstellung eines Medikamentes zur Veranlassung einer Immunität der Schleimhäute sind.
Stand der Technik:
Schleimhautoberflächen stellen die Hauptroute des Eintritts der meisten systemischen Pathogene dar, wobei die nachfolgende Immunität der Schleimhäute in der Regel einen lang anhaltenden Schutz gegen erneute Infektion bereitstellt (25). Beispiele beinhalten die langlebige Immunität, erzeugt durch das Sabin oral polio Vakzin, im Vergleich zu dem relativ kurzfristigen Schutz, welcher durch das Salk parenteral Vakzin (48) bereitgestellt wird, und das Einzeldosis oral Cholera Vakzin mit seinem erhöhten Sicherheits profil im Vergleich zu dem älteren Mehrfachdosis parenteral Cholera Vakzin (27). Der beste langfristige mukosale und systemische Schutz gegen Infektionen wird durch lebende, abgeschwächte Pathogene bereitgestellt, welche die Infektion des natürlichen Wirtes simulieren, aber unfähig sind, die Krankheit zu induzieren (28). Trotz der gegenwärtigen bestehenden Möglichkeit, abgeschwächte Mutationen in klonierten Mikroorganismen zu erzeugen, haben die Bedenken gegenüber potentieller Rückkehr zur Virulenz oder Wirtvirulenz Determinanten in wirksamer Weise die Entwicklung von lebenden, abgeschwächten Pathogenen als Veranlasser von Immunität der Schleimhaut für den menschlichen Gebrauch verhindert (29).
im Rahmen eines neueren Meetings der NIH, welche das HIV Vaccine Meeting im November 1994 gesponsert hat, erhielten zum Beispiel die Befürworter von abgeschwächten, lebenden Virus Vakzinen einen Rückschlag durch Ruth Ruprecht, welche berichtete, daß ein abgeschwächter SIV (d. h. eine Nef Deletion) verantwortlich war für die Entstehung von Affen AIDS in neugeborenen Rhesusaffen, welche das Vakzin erhalten hatten (29). Es ist unwahrscheinlich, daß ein abgeschwächter HIV jemals die FDA Bewilligung als ein HIV Vakzin erhalten wird.
Gegenwärtig werden weltweit täglich 10.000 Einzelpersonen durch den Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, daß bis zum Jahr 2000 mindestens 40 Millionen Menschen mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert sein werden. Aufgrund der unbarmherzigen und fortschreitenden Pathogenese des Virus werden die Mehrheit dieser Infizierten innerhalb von 10 Jahren sterben. Weiterhin wird geschätzt, daß die Zahl der Todesopfer bei 10 Millionen liegen wird, wenn wir das 21. Jahrhundert betreten. Trotz einer anfänglichen massiven Anstrengung der Industrie, ein Vakzin zu entwikkeln, sind wenige kommerzielle Entwickler verblieben. NIHs Nationale HIV Vakzin erhielt kürzlich einen kritischen Rückschlag, als das AIDS Research Advisory Program Committee (ARAC) dafür stimmte, nicht in die Phase III der klinischen Erprobung für die zwei führenden Kandidaten der Untereinheit Vakzine einzutreten.
Eine weitere Schwierigkeit bei den gegenwärtigen Anstrengungen zur Entwicklung eines HIV Vakzins besteht in dem Mangel an Forschung hinsichtlich einer Generierung von mukosalen Immunantworten auf HIV. Epidemiologische Daten deuten eindeutig darauf hin, daß 70 bis 80% aller AIDS-Fälle das Resultat einer heterosexuellen Übertragung von HIV sind (30–38). Heterosexuelle Übertragung ist der am schnellsten wachsende Übertragungsweg in den Vereinigten Staaten, wobei Frauen ein erheblich größeres Risiko einer HIV-Infektion haben als Männer (39, 42). Da weltweit 90% von HIV sexuell übertragen wird, ist es unwahrscheinlich, daß eine systemische Immunität die anfängliche Infektion an den mukosalen Seiten des Eintrittes blockieren wird. Infektion der Langerhans-Zellen, mukosalen Makrophagen, T-Zellen und sogar Epithelzellen von HIV-verbundenen oder HIV-freien Zellen im Samen des Genitaltraktes deuten dringend darauf hin, daß die Induktion von mukosalen Antworten mindestens genauso wichtig sind wie systemische Antworten in der Entwicklung eines Vakzins gegen eine HIV-Infektion (35–37, 41). Obwohl eine systemische Immunisierung selten eine mukosale Immunität hervorruft, sorgt eine mukosale Immunisierung häufig auch für eine systemische Antwort (36, 41, 42, 43, 44, 45, 46). Es ist unerläßlich, daß mehr Anstrengungen diesem Hauptelement in der Bildung einer primären Verteidigung gegen HIV-Übertragungen gewidmet werden. Mit der eindeutigen Gefahr der Verwendung lebender, abgeschwächter Vi ren sind die Aussichten zur Veranlassung einer mukosalen Immunität schwierig.
Neueste Entwicklungen in der Vakzin-Forschung beinhalten die Beweisführung, daß die Transfektion von Mäusemuskeln mit einem bakteriellen Plasmid, welches die DNS-Sequenz enthielt, die ein Influenza Virus Nukleoprotein dekodiert, in der Entstehung einer humoralen und zellulären Antwort mündete, welches die Mäuse von der letalen Viruserregung schützte (1). Dies folgt der Beobachtung, daß Mausmuskel ein einzigartiges Ziel für eine Transfektion mit nackter DNS ist (3) und daß Muskeln von einer Vielzahl an Spezies besonders anfällig für eine Transfektion mit nackter DNS sind (4–11). Schutz gegen eine letale Erregung in Mäusen durch Influenza A Virus und Induktion von zytotoxischen Lymphozyten und neutralisierenden Antikörpern gegen Influenza A Virus (1, 13–15) und HIV (16, 17) folgend einer genetischen IM Immunisierung wurde von einer Reihe von Forschern berichtet. Diese Methode hat den Nachteil, daß relativ große Mengen an DNS benötigt werden. Obwohl bis heute nicht über toxische Nebeneffekte berichtet wurde, kann diese Notwendigkeit an großen Mengen von DNS dieses Verfahren auf potenzielle Antikörperantworten auf die DNS selbst und die Generierung eines selbstversorgenden lupusähnlichen Syndroms begrenzen. Wichtiger aber, trotz der beeindruckenden Induktion einer schützenden Immunantwort, ist, daß diese Methode keine mukosale Immunität veranlaßt. Ein weniger gebräuchlicher Ansatz für die genetische Immunisierung benutzend bolistische Transformation überwindet das Problem der großen DNS Menge, benötigt aber eine Ausstattung, die nicht weithin erhältlich ist. Üblicherweise werden Nanogrammmengen an DNS, die mit Gold oder Wolframpartikel einen Komplex bilden, physikalisch durch die Plasmamembran durch Mikroprojektilbeschuß durchgetrieben. Während beide Methoden zelluläre (21, 22) und humorale (22–24) Antworten auslösen, veranlaßt keine von beiden eine mukosale Immunität .
Trotz der Wichtigkeit einer mukosalen Immunität für eine wirksame Immunisierungsstrategie ist das einzige FDA genehmigte Vakzin, das eine mukosale Immunität veranlaßt, das lebende, abgeschwächte Sabin oral polio Vakzin. Vor kurzem hat eine weitere Entwicklung in der Generierung einer mukosalen Immunität gezeigt, daß die systemische Verabreichung von aktiviertem Vitamin D3 (1,25-Dihydroxycalciferol [1,25(OH)₂D3]) mit einem üblichen Proteinantigen eine mukosale Antwort, zusätzlich zu einer systemischen Immunität, auslöst (2). Demnach wird in der Wissenschaft aktiv nach Wegen gesucht, eine mukosale Immunantwort zu induzieren.
Die vorliegende Erfindung kommt einem sehr wichtigen Bedarf in der Vakzinherstellung nach, indem eine Zusammensetzung bereitgestellt wird, welche eine in vivo mukosale Immunantwort auf Antigene aufgrund von Pathogenen durch die Förderung einer mukosalen Transfektion mit einem bakteriellen Plasmid, welches die DNS-Sequenz für ein Antigen enthält, veranlaßt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt die Verwendung von Vitamin D3 und Antigen-dekodierender DNS zur Herstellung eines Medikamentes für die Induzierung einer mukosalen Immunantwort bereit, welche in der Induzierung einer mukosalen Immunantwort wirksam sind, wobei die DNS mit einem die Transfektion fördernden kationischen Lipid komplexgebunden ist. Die Erfindung stellt auch die Verwendung von Antigen-dekodierender DNS zur Herstellung eines Medikamentes für die Induzie rung einer mukosalen Immunantwort bereit, welche in der Induzierung einer mukosalen Immunantwort wirksam ist, wobei die DNS mit einem die Transfektion fördernden kationischen Lipid (z. B. Lipospermin/Lipospermidin, TEDBI, etc.) und einer Menge an 1,25(OH)₂D3 komplexgebunden ist. Die Antigendekodierende DNS kann ein Antigen dekodieren, das an der Oberfläche von infizierten Zellen während dem Verlauf einer Infektion exprimiert wird, oder es ist ein Oberflächenanhaftungsprotein des Pathogens. Die vorliegende Erfindung sollte angewendet werden bei allen mukosal erworbenen Pathogenen, in welchen Rezeptoren auf den mukosalen Zellen Proteine des Pathogens erkennen und eine Anhaftungsseite für den systemischen Eintritt bereitstellen (d. h. die meisten bakteriellen Pathogene), oder bei aktiver Erlangung eines intrazellulären Eintrittes auf Zielzellen (d. h. Viren und einige bakterielle Pathogene). Die DNS, welche die Hüllglykoproteine von viralen Pathogenen dekodiert, ist eine vernünftige Auswahl für die Verwendung des vorliegenden Verfahrens.
Kationische Lipide sind eine Klasse von geladenen Lipiden, welche imstande sind, mit DNS durch Ladungs-Ladungs Interaktionen mit seinem Phosphatrückgrat Komplexe zu bilden. Das Lipid fördert das Durchdringen der Plasmamembran von eukaryotischen Zellen. Beispiele beinhalten Lipospermine und Lipospermidine, welche bifunktionale Moleküle sind, bestehend aus einer oder mehreren hydrophoben Ketten, die kovalent mit einer kationischen Gruppierung verbunden ist/sind, in welcher eine Koordination von drei oder mehr Amidhydrogenen mit einem Phosphatoxygen der DNS Kette besteht, welches einen ionisch geladenen Komplex bildet. Ein bevorzugtes Beispiel eines Lipospermins ist DOGS (Dioctadecylamidoglycylspermin), Dioctadecylamidoglycylspermidin ist ein weiterer geeigneter Kandidat, weil es die gleiche Struktur wie DOGS hat, dem aber einer der beiden Arme, welcher zwei nicht essentielle kationische Ladungen trägt, fehlt. Ein weiteres Beispiel ist N,N,N',N'-Tetramethyl N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butandiammoniuniodid (TEDBI) (tfx^TM-50 Reagent; Promega, Madison, WI). Dieses kationische Lipid fördert ebenfalls die Transfektion in vitro und in vivo.
Die Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, welche Vitamin D3 und eine Antigen-dekodierende DNS enthält, worin die DNS mit einem die Transfektion fördernden kationischen Lipid komplexgebunden ist. Vorzugsweise dekodiert die DNS ein Hüllantigen oder ein hüllverbundenes Antigen eines Pathogens und das kationische Lipid ist Lipospermin, Lipospermidin oder DOGS.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine kreisförmige Karte von pHenv, wobei der HIVenv Einschub (Insert) zwischen 5' und 3' LTRs gezeigt wird. Rev ist funktionsfähig in diesem Konstrukt.
2 zeigt eine kreisförmige Karte von pCMV-env160 enthaltend HIVenv unter einem CMV Promotor und welchem die LTRs oder rev Sequenzen fehlen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt die Verwendung von Vitamin D3 und einer Antigen-dekodierenden DNS bereit, welche wirksam sind in der Induzierung einer mukosalen Immunantwort, wobei die DNS mit einem transfektionsfördernden kationischen Li pid komplexgebunden ist, zur Herstellung eines Medikamentes für die Induzierung einer mukosalen Immunantwort. Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von einer Antigendekodierenden DNS bereit, welche wirksam ist in der Induzierung einer mukosalen Immunantwort, wobei die DNS mit einem transfektionsfördernden kationischen Lipid und eine Menge von 1,25(OH)₂D3 komplexgebunden ist, zur Herstellung eines Medikamentes, welches eine mukosale Antwort auslöst.
Die Erfindung ist generell bei Pathogenen einsetzbar, weil die Expression des pathogenen Antigens, welches durch die Antigen-dekodierende DNS dekodiert wird, in der Exposition des pathogenen Antigens auf der Oberfläche der transfizierten Zelle mündet, wobei entweder ein Teil des Replikationszyklus des Pathogen imitiert wird oder Antigene exprimiert werden, die für das anfängliche Anhaften des Pathogens an die Zelloberfläche benötigt werden. Beispiele für virale Pathogene beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Retroviren (Human Immunodeficiency Viren), Herpesviren (Herpes Simplex Virus; Epstein Barr Virus; Varicella Zoster Virus), Orthomyxoviren (Influenza), Paramyxoviren (Rötelnvirus; Mumpsvirus; Respiratory Syncytial Virus), Picornaviren (Coxsackieviren, Rhinoviren), Hepatitisviren (Hepatitis C), Bunyaviren (Hantavirus; Rift Valley Fiebervirus), Arenaviren (Lassa Fiebervirus), Flaviviren (Dengue Fiebervirus, Gelbfiebervirus, Chikungunyavirus) und Coronaviren, unter anderem. Beispiele für bakterielle Pathogene beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Spezies der folgenden Gattungen: Salmonella, Shigella, Chlamydia, Helicobacter, Yersinia, Bordatella, Pseudomonas, Neisseria, Vibrio und Haemophilus, unter anderem.
Antigen-dekodierende DNS
Die vorliegende Erfindung kann angewandt werden bei allen mukosal erworbenen Pathogenen, in welchen eine Antigenexpression auf der Oberfläche einer Schleimhautzelle während des Verlaufs einer natürlichen Infektion stattfindet oder in welchen ein Oberflächenantigen für das Anheften an Schleimhautzellen benötigt wird. In einem Verfahren zur Induzierung einer mukosalen Immunantwort kann die Antigendekodierende DNS ein Antigen dekodieren, das auf der Oberfläche von infizierten Zellen während des Infektionsverlaufs exprimiert wird, oder es wird für das Anheften an Zielzellen des Wirtes benötigt. Die vorliegende Methode wird dazu führen, daß das Antigen, welches durch die DNS dekodiert wird, auf der Oberfläche der Schleimhautzellen exprimiert wird, wo eine mukosale oder die hormonale Induktion einer mukosalen Immunität von systemisch transfizierten Zellen (z. B. Muskel) entwickelt wird. Weil die primäre Immunantwort auf Bakterien von einer vergleichsweise kleinen Anzahl von Zellenoberflächen Antigenen veranlaßt wird, ist das Verfahren zur Auswahl von Antigen-dekodierender DNS für bakterielle Pathogene zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren Routine. So sind z. B. die bakteriellen Hauptimmunogene Epitope auf exponierten bakteriellen Oberflächenstrukturen, welche dazu dienen, das Bakterium während der Infektion an die mukosalen Zellen anzuheften (191). Es gibt zahlreiche Beispiele von viralen Antigenen, in welchen dies der Fall ist, so z. B. HIV, welches sich in CD4 aufweisende Zellen einschließt. Beispiele für andere solcher Antigene werden in virologischen Lehrbüchern beschrieben (siehe z. B. Fundamental Virology, zweite Auflage, Seite 373–375 (189)). Antigene von anderen mikrobiellen Pathogenen werden als Epitope auf Zelloberflächenstrukturen exprimiert. Ein "Antigen", wie es hierin verwendet wird, ist ein Molekül, welches eine Immunantwort auslöst und welches untereinander auswechselbar mit "Immunogen" verwendet wird.
DNS, welche die Hüllglykoproteine (z. B. gp160HIV oder seine gespalteten Proteinderivate gp41 und gp120) von viralen Pathogenen dekodiert, ist eine vernünftige Auswahl für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Hüllverbundene Proteine, solche wie gpl7, sind ebenfalls vernünftige Auswahlen, weil sie auf der Zelloberfläche von infizierten Zellen präsentiert werden. Eine vernünftige Terminologie, um eine Teilmenge von viralen Antigenen zu definieren, die in diesem Verfahren wirksam sein können, ist: "Hülle (Envelope) und hüll-verbundene (envelope-associated) Proteine". Spezielle Epitope dieser Proteine, die eine Immunantwort in einem Subjekt auslösen können, können ausgewählt werden durch Routinemethoden, beinhaltend Epitopmarkierung (epitope mapping) und Analysen von Konformationsabhängigkeiten (178). Besonders Epitope, welche die Neutralisierungen von Antikörpern auslösen, sind eine wichtige Grundlage des vorliegenden Verfahrens. Epitope, welche die Neutralisierung von Antikörpern auslösen können, können durch Routinemethoden ausgewählt werden, beinhaltend Induktion von monoklonalen Antikörpern gegen spezielle Epitope gekoppelt mit einer Analyse für spezifische Neutralisation in Standard dosisabhängigen Assays (178). Die DNS, die diese Antigene dekodiert, kann durch Klonierungs- und Syntheseverfahren erhalten werden, welche in der Literatur bekannt sind und nachfolgend weiter beschrieben werden.
So kann z. B. die Antigen-dekodierende DNS ein Antigen für ein Human Immunodeficiency Virus (HIV) dekodieren. Als ein spezielleres Beispiel kann die Antigen-dekodierende DNS ein Human Immunodeficiency Virus (HIV) Hüllglycoprotein dekodieren. Obwohl erwartet wird, daß die Hüllantigene die Hauptveranlasser von Antikörpern und zytotoxischen Lymphozyten (CTLs ) sind, gibt es in der Literatur Hinweise von CTLs gegen gag (d. h. internes Antigen) von HIV. Antigendekodierende DNS beinhaltet gp160, gp120 und gp41, welche unabhängig voneinander exprimiert werden (d. h. gp160 wird normalerweise durch eine Wirtsprotease zu gp120 und gp41 gespalten). Die DNS, welche gp17 dekodiert, welches eines der gag Proteine ist, das über eine Myristylierungsverbindung mit der Hülle verbunden ist, und für welches es Hinweise in der Literatur für ein neutralisierendes Antikörperepitop gibt nah an der Myristylationsseite, kann ebenfalls enthalten sein. Die Antigen-dekodierende DNS kann Antigenfragmente der Hülle und der hüllverbundenen Proteine dekodieren, z. B. den V3 Loop (Schleife) des Human Immunodeficiency Virus (HIV) Hüllglykoproteins.
Eine Antigen-dekodierende DNS sollte ein Startcodon, ein Signalpeptid, Stoppcodon und einen Membrananker enthalten. Ein sezerniertes Antigen (ihm fehlt ein Membrananker) wird eine Immunantwort auslösen, aber es wird nicht erwartet, daß es gleich wirksam ist. Wenn dies nicht vorliegt oder um das vorliegende Verfahren zu optimieren, können darum die Sequenzen der Antigen-dekodierenden DNS in einem oder mehreren Wegen mutiert werden, um die Antigenizität des exprimierten Antigens zu bewahren oder zu erhöhen. Wenn separat gp120 und gp41 Immunogene verwendet werden, sollte jedes einen Membrananker, gefolgt von einem Stoppcodon, haben. Auf diese Weise kann ein Stoppsignal für gp120 sowie ein Membrananker an der C-terminalen Region des translatierten Proteins generiert werden. Zusätzlich kann die bekannte antikörpererhöhende Domäne (antibody enhancing domain) von gp41 für beide, HIV und RSV, entfernt werden, wie es ausführlich in den Beispielen beschrieben wird. Zahlreiche Versionen der V3 Region des Hüllglykoproteins können hergestellt werden, um die Hauptquasispezies, welche in viralen Isolaten gefunden werden, widerzuspiegeln. So wurden z. B. zahlreiche HIV-Varianten isoliert und sequenziert, wie es in der Literatur beschrieben steht. Diese können dann in mannigfachen genetischen Konstrukten verabreicht werden, wobei jedes einen einzelnen transkribierten ORF enthält, oder in einem einzelnen oder wenigen genetischen Konstrukten, wobei jeder einen mannigfachen transkribierten ORF enthält. Genetische Manipulationen dieser Art sind in der Literatur bekannt (188) und spezielle Beispiele werden in den Beispielen beschrieben.
Kurz dargestellt können Mutationen durch die Verwendung des p-Alter-1 Kit von Promega, welches eine antibiotische Selektion für die Auswahl der erwünschten Mutationen beinhaltet, erzeugt werden. Es ist notwendig, die ssDNS Template-Prozedur zu verwenden, um verläßlich die erwünschten Mutationen zu generieren. Eine kritische Änderung des Kit-Protokolls ist die Generierung der gegenwärtig gelehrten Helferphagen ssDNS. Das ss (single strand; Einzelstrang) Phagen-DNS Isolationskit und die Prozedur von Biolabs, Inc. wird verwendet für die Herstellung reiner ssDNS. Substitution von Es 1301 mutS E. coli, welches mit dem Kit und XL mutS E. coli geliefert wird, für welches die Subjekt mutS Mutationen generiert wurden, war ebenfalls erfolgreich. Die Späteren sind ohne Reparaturenzyme. Die Komponenten des obigen Verfahrens sind allgemein anwendbar auf DNS, welche andere Antigene dekodiert.
Beispiele für die Genkonstruktion (gene engineering) von welchen erwartet wird, daß sie in einem Plasmid enthalten sind, beinhalten z. B: die HIV-Hülle für die Transfektion von eukaryotischen Zellen, und Antigenexpressionen auf der Zelloberfläche beinhalten: 1) Beseitigung des HIV LTR Kontrollelements und Plazierung unter einem leistungsfähigerem Promotor wie CMV, 2) Beseitigung der gp160 proteolytische Spaltstelle, so daß sich das gp120 nicht von dem an der Membran verankerten gp41 trennt, und 4) die Beseitigung der primären Enhancing-Domäne durch Punkt- oder Deletionsmutationen, welche diese Funktion zerstören. So resultiert z. B. eine In-Frame-Deletion von nt 1516 zu nt 1527 (d. h. RDKR) in ein gp160, welchem die proteolytische Spaltstelle an der Arginin-Alanin-Sequenz an den Resten 508–509 fehlt, wo die Proteolyse erfolgt. Weitere Beispiele für diese Mutationen sind die weiter unten beschriebenen. Obwohl spezifische Mutationen für das HIV Hüllglykoprotein gegeben werden versteht es sich, daß dieselben Betrachtungen für die Generierung eines wirksamen Immunisationskonstruktes angewandt werden bei der Generierung eines Konstruktes, wenn eine Antigen-dekodierende DNS für ein anderes Antigen verwendet wird.
Die Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Promotoren und regulatorische Sequenzen enthalten, die wichtig sind für die Antigen-dekodierende DNS. Üblicherweise muß der Vektor ein eukaryotischer Vektor sein, der zu einer Replikation in E. coli fähig ist. Der bevorzugte Vektor enthält eine bakterielle Replikationsquelle (origin of replication), ein Selektionsgen für antibiotische Resistenz, einen eukaryotischen Promotor, das Gen, welches in einer eukaryotischen Zelle transkribiert werden soll und ein Polyadenylierungsgen für eine effiziente Translation. Beschreibungen von Vektoren, die diese Charakteristika haben, sind in der Literatur üblich. Andere Vektoren, die nicht alle obigen Eigenschaften teilen, jedoch die Transfektion gestatten, können von einem Fachmann konstruiert werden.
Kationische Lipide
Die in der Erfindung verwendeten transfektionsfördernden kationischen Lipide sind bifunktionale Moleküle bestehend aus einer oder mehreren hydrophoben Ketten, die kovalent verbunden sind mit einer kationischen Gruppierung, in welcher ein kationisch geladener Komplex gebildet wird zwischen der negativen Ladung eines Phosphatoxigens und einer oder mehreren positiven Ladungen an dem kationischen Lipid. In den Fällen von DOGS gibt es eine Koordination von drei oder mehr Amidhydrogenen mit einem Phosphatoxigen der DNS-Kette, wobei ein ionisch geladener Komplex gebildet wird. Um die Transfektion zu fördern, kann das kationische Lipid auf der einen Seite die DNS schützen, ihre negative Nettoladung neutralisieren und sie hydrophober erscheinen lassen gegenüber der Zellmembran der Zelle, die transfiziert werden soll. So stellen z. B. die Ladungsinteraktionspositionen der hydrophoben Arme entlang der großen oder kleinen Grube der DNS (siehe die Beispiele) eine hydrophobe Ummantelung für das stark geladene DNS Makromolekül bereit, und ermöglichen die Förderung des zellulären Eintrittes durch die Vereinigung der hydrophoben Oberfläche umfassenden DNS mit der hydrophoben Komponente der Plasmamembran der Zelle. Basierend auf molekulares Modellieren (molecular modeling), verwendet DOGS, scheint es, daß das Aminohydrogen der Peptidbindung und die benachbarten Amidhydrogene alle an einem Phosphatoxigen koordinieren (d. h. 1.91 bis 2.0 Å Abstand).
Ein bevorzugtes Beispiel eines Lipospermins ist DOGS (Dioctadecylamidoglycylspermin). Obwohl weniger bevorzugt, kann das Lipospermin oder Lipospermidin eine einzelne hydrophobe Seitenkette haben (z. B. Monooctyl, Monooctadecyl, Monododecyl etc.). Die Art der geladenen Gruppe kann eben falls modifiziert werden, wie auch die Sättigung der hydrophoben Seitenketten modifiziert werden kann, wie z. B. mit TEDBI.
Ein mögliches Beispiel eines kationischen molaren Verhältnisses zwischen DOGS und DNS ist ungefähr 5 : 1. Alternativ dazu kann dieses Lipospermin komplexgebunden mit der DNS sein in einem kationischen molaren Verhältnis, welches sich bewegen kann von ungefähr 2 bis ungefähr 10. Weil die ionischen Interaktionen zwischen dem kationischen Lipid und der DNS die gleichen sind, ungeachtet des Antigens, das dekodiert wird, ist die vorliegende Lehre mit Bezug auf die Formulierung des DNS-kationischen Lipidkomplexes auf beliebige Antigen-dekodierende DNS anwendbar.
Darum stellt die Erfindung ebenfalls eine Zusammensetzung bereit, enthaltend Vitamin D3 und eine Menge an DNS, welche ein Hüllantigen oder ein hüllassoziiertes Antigen eines Pathogens dekodiert, komplexgebunden an ein Lipospermin. Insbesondere stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, enthaltend Vitamin D3 und eine Menge an DNS, welche ein Hüllantigen von HIV dekodiert, komplexgebunden an ein kationisches Lipid. Beispielsweise kann die Zusammensetzung ein Plasmid enthalten wie es in den Beispielen beschrieben steht. Weitere Beispiele von Antigendekodierender DNS werden nachstehend und in der Literatur beschrieben.
Hormon Immunmodulation
Die vorliegende Erfindung nützt Vitamin D3 in Verbindung mit einer erleichterten Transfektion durch die Verwendung von DNS und einem kationischen Lipid. Die Kombination von Vitamin D3 und DNS, komplexgebunden an einem ka tionischen Lipid, führt sogar zu einer mukosalen Immunantwort wenn es intramuskulär verabreicht wird.
Das Vitamin D3 kann 1,25(OH)₂D3 oder die unhydroxylierte Form sein. Die unhydroxylierte Form muß in der Leber oder in den Nieren in die hydroxylierte (aktivierte) Form überführt werden, um die mukosale Immunität zu veranlassen. Die Mengen an aktiviertem Vitamin D3 können wie in den Beispielen beschrieben sein. Diese Mengen können selbstverständlich an das jeweilige Verabreichungsprotokoll oder dem jeweiligen Subjekt sowie den anderen Komponenten in dem Vakzin angepaßt werden. Weil die Verwendung von unhydroxyliertem Vitamin D3 weniger wirksam ist, werden erheblich größere Mengen benötigt werden. Die Optimierung der Dosis ist ein Routineaspekt von Immunisierungsprotokollen.
Das mukosale Immunsystem
Bedeutsame indirekte Beweise weisen auf das Vorhandensein eines allgemeinen mukosalen Immunsystems hin (47, 50). Induktion einer mukosalen Immunität in bronchienassoziierten lymphoiden Gewebe liefert gewöhnlich Hinweise einer Immunität in darm-assoziierten lymphoiden Gewebe. Das gemeinsame Element ist die Generierung von mobilen IgA-absondernden Plasmazellen mit einer Affinität für mukosal assoziierten lymphoiden Gewebe von verschiedenen Typen (siehe Referenz 42). Obwohl IgG nach mukosaler Immunisation auf mukosalen Oberflächen gefunden werden kann, ist IgA das vorherrschende Ig bei mukosaler Immunität. Dieses liegt nebensächlich an der Anwesenheit von einem Ig-Rezeptor mit größter Affinität für polymer (p)IgA. Dieser Rezeptor wird an der Oberfläche von mukosalen Epithelzellen exprimiert und er transportiert aktiv plgA an die mukosale Oberfläche (47–49), durch mukosale Epithelzellen hindurch.
Eine schützende Immunität wurde als erstes festgestellt durch die Verwendung von Tiermodellen für die relevanten Pathogene. Obwohl eine schützende Immunität einer starken humoralen und/oder zellulären Immunantwort nach Verabreichung eines Vakzinkandidates folgen kann, war es möglich, die schützende Eigenschaft in Tiermodellen nachzuweisen. So können z. B. Mäuse mit Chlamydia infiziert werden. Darum kann die vorliegende Methode dazu verwendet werden DNS, welche Chlamydienantigene dekodiert, zu benutzen, um Mäuse zu immunisieren, welche anschließend mit den Bakterien erregt werden, um die Wirksamkeit des Vakzinkandidates vorzuführen. Bei anderen Pathogenen ist es jedoch schwieriger den schützenden Nutzen vor den humanen klinischen Versuchen vorzuführen, da es an einem passenden Ersatz im Tiermodell fehlt. So ist z. B. der einzige anerkannte Tierersatz für HIV-1 Infektion der Schimpanse, welcher eine gefährdete Spezies ist. SIV kann als Alternative für HIV-1 in Rhesusaffen verwendet werden. Trotzdem existieren beträchtliche Nukleotidsequenzunterschiede zwischen HIV-1 und SIV, welche eine direkte Extrapolation auf eine humane Infektion mit HIV-1 weniger als ideal machen. Ebenso können einige Speziesunterschiede in den Immunantworten erwartet werden. Trotzdem wird erwartet, daß Resultate mit anderen Tieren und anderen Pathogenen gleich sein werden. Auf jeden Fall sind diese Tierversuche Routine und geben die gegenwärtige Lehre in Immunisierungsprotokollen wieder.
Verabreichung
In einem Verfahren zur Induzierung einer mukosalen Immunantwort durch direkte Verabreichung auf die Zellen der Mukosa wird die Antigen-dekodierende DNS in einem Komplex mit einem kationischen Lipid auf die Mukosa des Subjektes abgegeben. Die Verabreichung kann direkt an die Mukosa erfolgen, wobei spezielle Beispiele für diese Fälle die nasale, orale, rektale und vaginale mukosale Verabreichung beinhalten. Nasale Verabreichung kann nasale Spülsprays (siehe Beispiel) oder Zerstäuber sein, welche übliche praktizierte Verfahren darstellen. Rektale, vaginale, vulvare oder perineale Verabreichung kann eine Vielzahl an Verfahren sein, beinhaltend Spülung (Duschen, Einläufe etc.), Zäpfchen, Cremes, Gels etc.
Systemische Verabreichung kann ebenfalls verwendet werden, um gezielte Immunantworten in der Mukosa des Subjektes auszulösen. Besonders wirksam ist die intramuskuläre Injektion von Vitamin D3 mit der DNS und anderen Komponenten der Vakzinformulierung, wie sie im Detail in den Beispielen beschrieben steht.
Abhängig von der beabsichtigten Art der Verabreichung können die Komponenten der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen in der Form einer festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsform sein, wie z. B. Tabletten, Zäpfchen, Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen, Lotionen, Cremes, Gels oder dergleichen, vorzugsweise in einer Dosierungsformeinheit, welche für die einzelne Verabreichung einer bestimmten Dosis geeignet ist. Die Zusammensetzungen können beinhalten, wie schon oben angemerkt wurde, eine wirksame Menge der DNS und zusätzlich können sie andere pharmazeutisch annehmbare medizinische Agenzien beinhalten, pharmazeutische Agenzien, Träger, Adjuvantien, Verdünnungsmittel etc. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist ein Material gemeint, das nicht biologisch oder sonstwie unerwünscht ist, d. h. das Material kann einem Individuum einher mit der Antigen-dekodierenden DNS verabreicht werden ohne irgendwelche unerwünschte biologische Wirkungen zu verursachen oder in einer schädlichen Art und Weise mit irgendeiner anderen Komponente der pharmazeutischen Zusammensetzung zu interagieren, in welches es enthalten ist.
Für die orale Verabreichung können große Dosen an komplexgebundener DNS mit Vitamin D3 gegeben werden. Die Form kann feine Pulver oder Granulate umfassen, die verdünnende, verteilende und/oder oberflächenaktivierende Agenzien enthalten können, und sie können in Wasser oder in einem Saft angeboten werden, in Kapseln oder Kissen, in getrockneter Form oder in einer nicht wäßrigen Lösung oder Suspension, worin suspendierende Agenzien enthalten sein können, in Tabletten, worin Bindemittel und Schmiermittel enthalten sein können, oder in einer Suspension in Wasser oder einem Saft. Soweit erwünscht oder notwendig, können Aromastoffe, Konservierungsmittel, Suspensionsmittel, Fettigungsmittel oder Emulgatoren enthalten sein. Tabletten und Granulate sind bevorzugte orale Verabreichungsformen, und diese können überzogen sein. Gegenwärtige Methoden für die Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt, oder sie sind dem Fachmann offensichtlich, siehe als Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences (190).
In der Erfindung ist die DNS komplexgebunden mit einem kationischen Lipid und sie wird dem Subjekt als eine einzelne primäre Vakzinierung verabreicht, und sie kann von einem oder mehreren Boostervakzinierungen in Intervallen von drei Wochen bis drei Monaten gefolgt werden. Die Boostervakzinierung kann in der gleichen Art oder in einer unterschiedlichen Art wie die primäre Vakzinierung erfolgen. So kann z. B. eine primäre intramuskuläre Verabreichung mit aktiviertem Vitamin D3, gefolgt von einer mukosalen Verabreichung des Boosters mit oder ohne Vitamin D3, erfolgen.
Die Optimierung der primären/Boosterverabreichungskur kann durch weithin bekannte und Routineoptimierungsprozeduren erfolgen.
Die genaue Menge an DNS, die benötigt wird, kann von Subjekt zu Subjekt schwanken, abhängig vom Alter, Gewicht und dem allgemeinen Befinden des Subjektes, der verwendeten gewählten Rezeptur, ihrer Art der Verabreichung und ähnlichem. Aus diesem Grund ist es nicht möglich, eine genaue Menge anzugeben. Trotzdem kann eine wirksame Menge von einem Fachmann festgelegt werden einzig durch die Verwendung von Routineexperimentieren, die die hierin enthaltenen Lehren wiedergeben. Demnach kann die Menge an DNS die verabreicht wird jede wirksame Menge sein. Es gibt keinen Grund, mehr als nur geringfügige Unterschiede zwischen einer humanen Immunisierungsdosis gegenüber einer Mausdosis zu erwarten, weil es keinen Grund zu erwarten gibt, daß humane Zellen mehr oder weniger empfänglich für eine Transfektion sind als Mäusezellen. Üblicherweise ist die bevorzugte Menge an DNS, die für eine wirksame Transfektion benötigt wird von ungefähr 10 ng bis 10 μg. Abweichungen in der Transfektionseffizienz zwischen Menschen und Mäusen können angepaßt werden durch Routineeinstellungen in der Dosis. So kann z. B. die Menge im Bereich von 1,0 ng bis 1 mg liegen. Alles über 10 μg DNS wird logistisch schwierig zu handhaben sein, erhöht das Risiko der Toxizität und ist unpraktikabel. Die Menge an 1,25(OH)D3 wird üblicherweise im Bereich von 10 ng bis 10 μg liegen und wird IM mit dem kationischen Lipid/ DNS-Komplex verabreicht.
Die nachfolgenden Beispiele beabsichtigten, die Erfindung zu erläutern, ohne sie einzuschränken. Obwohl die beschriebenen Protokolle im Kontext einer HIV-Immunisierung angelegt wurden, sind sie als anwendbar befunden worden mit anderen Pathogenen, die mukosale Infektionsmechanismen haben. Obwohl die beschriebenen Protokolle typisch sind für diese, die verwendet werden dürften, können andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, alternativ dazu zum Einsatz kommen.
Beispiele
Kationisches Lipid fördert eine genetische Immunisierung
Genetische Immunisierung
Die Möglichkeit, eine virale Replikation durch Transfektion mit nicht replizierenden, transkriptions-/translations- erlaubender viraler DNS, welche virale Proteine dekodiert, zu simulieren, ist essentiell für eine schützende Immunantwort durch den Wirt, welche bereitgestellt wird durch die Vorzüge eines abgeschwächten, lebenden Vakzins ohne das Potential einer Rückkehr zur Virulenz.
Die genetische Immunisierung ermöglicht einmalige Vorzüge auf dem Gebiet der Vakzine. Die DNS ist einfach zu präparieren und zu manipulieren. Eine Vielzahl an eukaryotischen Promotoren, Signalsequenzen und hydrophoben Ankern können konstruiert werden, um die Immunantworten zu maximieren. Vorteilhafte zielgerichtete (side-directed) Mutationen sind relativ einfach auszuführen. Die DNS ist stabil und sie benötigt keine Kühlung auf dem Gebiet während Massenpopulationsvakzinierungen. Genetische Immunisierung erzeugt beides, humorale und zelluläre Immunantworten, ähnlich dem abgeschwächter Mikroorganismen. Der wichtigste Vorteil für ein HIV-Vakzin ist jedoch die relativ einfache Formulierung von mannigfachen Sequenzvariationen in einer einzigen genetischen Immunisierung, wobei jede normalerwei se auf der Zelloberfläche exprimiert wird mit der Entstehung eines breiten Repertoires an schützenden Antworten. Der Hauptnachteil waren die relativ hohen Mengen an DNS, die benötigt wurden.
HIV phenotypische Expression
Eine primäre Infektion eines natürlichen Wirtes durch HIV-1 resultiert in einem variablen klinischen Verlauf (177). In der Mehrzahl der Fälle (50–70%) tritt ein akutes klinisches Syndrom von Unwohlsein und Fieber, welches ein bis zwei Wochen andauert, assoziiert mit Viremia etwa zwei bis vier Wochen nach Exposition (163–164), auf. In einer Minderheit an Patienten ist diese akute Phase der Infektion subklinisch. Obwohl gelegentlich primäre Infektionen sehr rasch (65) zu AIDS fortschreiten, treten die meisten Patienten in eine symptomatische Phase ein mit einem nachfolgend variablen Verlauf zu AIDS nach ein bis mehr als 10 Jahren (166). Vermutlich wird diese initiale viremische Phase durch eine wirksame Immunantwort gegen die initiale Infektion des viralen Genotypes (171) kontrolliert. Wenn die initiale viremische Phase anfänglich durch die Abwehrmechanismen des Wirtes kontrolliert wird bleibt die Frage, warum der Virus letztendlich die überhand gewinnt über den anfänglich effektiven humoralen und zellulären Abwehrmechanismus.
Eine der auffallenden Eigenschaften von HIV ist seine Mutabilität, insbesondere in der viralen Umhüllung der Glykoproteine gp120 und gp41. Es wird geglaubt, daß die hohe Mutationsrate von HIV eine Funktion der hohen Fehlerrate durch die Reverse Transkriptase in der Umwandlung der viralen 70S ss RNA in provirale DNS ist (geschätzte zwei Fehler pro virale Kopie). Diese hohe Mutationsrate deutet das Po tential für phenotypische Expressionsvarianten an, welches teilweise den hohen Grad von interindividuellen Variabilitäten bezüglich HIV-Infektion erklären könnte.
Die vorherrschenden Daten deuten darauf hin, daß die meisten primären Infektionen durch HIV-1 einen nicht-syncytialen veranlassten Phenotyp (NSI) (non-syncytial inducing) (d. h. monocytotropher Virus, welcher nicht in der Lage ist Syncytia in allogenen primären Co-Kulturen oder in T-Zellen Indikatorzellen zu bilden) haben, im Gegensatz zu dem syncytialen veranlaßten Phenotyp (NSI), welcher häufiger gefunden wird mit fortschreitendem Krankheitsverlauf (163–170). Ho und seine Kollegen (171) haben sorgfältig spezifische Sequenzen von gp120, gp41, nef und p17 untersucht, verwendend klonierte PCR amplifizierte DNS von PBMCs von fünf Serokonvertoren und zwei Sexualpartnern. Die HIV-Überträger wiesen beachtliche HIV-Sequenz-Heterogenität auf, während es eine merkliche HIV-Sequenz-Homogenität bei den frischen Serokonvertoren gab, welche einer Minderheit der Spezies bei den Überträgern entsprach. Überraschenderweise wies gp120 die größte Sequenz-Homogenität (über 99% Ähnlichkeit) auf. Diese Daten deuten darauf hin, daß die HIV-Infektion sehr viel mehr sequenzbegrenzt ist, zumindest für die sexuelle Übertragung, als jemals zuvor bedacht wurde. Zweitens deutet dies darauf hin, daß die phenotypische Expression der erworbenen genomischen Variation zumindest in Teilen verantwortlich ist für den variierenden klinischen Verlauf der HIV-Erkrankung, obwohl eine sekundäre HIV-Infektion nicht als Ursache für die genomische Variabilität während des Krankheitsverlaufes ausgeschlossen werden kann.
Ein Ausdruck der erworbenen genomischen Variation ist die Umwandlung von primären HIV-1 Isolaten von NSI, mo nocytrop zu SI, T-Zellinien erlaubende Varianten (d. h., so gut wie alle Isolate können in PBMCs repliziert werden, aber nur SI Isolate können in T-Zellinien repliziert werden). Der primär bestimmende Faktor für diesen funktionellen (NSV gegen SI) Tropismus (monocytotroph gegen T-Zellinie erlaubend) ist die dritte variable Domäne (V3 Loop) von gp120, ein Glykoprotein von HIV-1, welches komplett an der viralen Oberfläche exponiert wird (172). Der V3 Loop ist ein disulfidverbundenes Polypeptid bestehend aus 34–37 Aminosäuren mit einem konservierten tetraden Motiv GPGR in der Mitte seiner Sequenz (173). Der Rest der Sequenz ist hochgradig variabel und wurde als Fusionsdomäne von gp120 identifiziert (55). Ein anderes Labor (175, 176) hat gezeigt, daß Aminosäurensequenzänderungen in dem V3 Loop, welche die Spaltung durch verschiedene Serinproteasen reduzieren, den NSI funktionalen Phenotyp an viralen rekombinanten Vakzinviren, welche HIV-1 Hüllsequenzen exprimieren, verleihen. Diese V3 Loop Aminosäurenvariationen, die über den SI gegen den NSI funktionellen Phenotyp entscheiden, sind in Tabelle 1 dargelegt.
Tabelle 1. Beziehung von HIV Phenotyp Syncytium Expression und der Aminosäurensequenz des V3 Loop^a
Funktionale Immunantworten auf HIV
Ein wichtiges Konzept, welches bei der Betrachtung der Entwicklung eines HIV-Vakzins oft nicht berücksichtigt wird, besteht darin, daß sowohl schützende als auch nachteilige Immunantworten von dem Virus oder seinen Hüllkomponenten generiert werden kann.
1. Neutralisation von HIV
Eine Anzahl von HIV neutralisierenden Epitopen (ein Epitop wird definiert als die minimale Anzahl von Aminosäurenresten, entweder linear oder konformativ, die von einem Antikörper gebunden werden kann) oder Domänen (Regionen enthaltend eine Anhäufung (cluster) von Epitopen) wurden identifiziert, beinhaltend eine innerhalb des p17 gag Proteins (51) und viele innerhalb des gp160 Hüllproteins. Diese Domänen werden zusammengefaßt in Tabelle 2 in Bezug auf die spezifischen Sequenzen, die identifiziert wurden (Aminosäurenreste innerhalb ausgewiesener Peptide sind entsprechend der Los Alamos Datenbank numeriert worden (52), die Spezifität der neutralisierenden Antwort, die relative Immunogenizität der Domäne und die Rolle dieser Antikörper in der Blockierung einer CD4 Rezeptorbindung. Verschiedene Domänen wurden identifiziert durch Immunisierung von Tieren mit synthetischen Peptiden und Erprobung des Hyperimmunserums auf seine Fähigkeit HIV-1 in vitro zu neutralisieren. Mit Hilfe dieser Methode wurde berichtet, daß die Reste 247–267 (53), 296–331 (54–59), 451–477 (54) und 496–525 (60) innerhalb von gp120, und die Reste 593–604 (61), 609-625 (54) und 721–745 (54, 60, 62) innerhalb von gp41, alle die Produktion von HIV neutralisierenden Antikörpern in Tierversuchen stimulieren. Nichtsdestotrotz hatten die Forscher einige Schwierigkeiten in der Bestimmung, was eine wesentliche neutralisierende Antwort bedeutet, da einige dieser Peptide lediglich Antikörper stimulierten die HIV-1 auf einen Titer von 1 : 4 oder 1 : 8 neutralisieren konnten (54). In gleicher Weise ist der Antikörpereffekt von gp120, welches an den CD4 Rezeptor bindet, von einem wesentlichen Interesse. Jedoch sind nur zwei Domänen untersucht worden. Antikörper gegen die zweite konservierte Domäne (Domäne 1 von Tabelle 2) haben keine Wirkung auf die Bindung (53), während Antikörper gegen die erkannte CD4 rezeptor-bindende Domäne wirksam die Bindung hemmen (63).
Es gibt ebenfalls Anzeichen, die die Anwesenheit von Antikörpern bestätigen, die HIV im Serum von HIV-infizierten Menschen und Schimpansen neutralisieren. Die überwiegende Mehrheit der Berichte betreffen Antikörper gegen den V3 Loop (Reste 296–331) (57, 58, 64, 65). Es wurde gezeigt, daß diese Antikörper verantwortlich sind für die typ-spezifische Neutralisierungsantwort auf HIV-1. Typ-spezifische Antikörper neutralisieren einen Stamm (d. h. HIV_IIIB, HIV_RF etc.), während gruppen-spezifische Antikörper mehr als einen Stamm neutralisieren. Diese Region ist hypervariabel, jedoch enthält sie eine stark konservierte Arg-Gly-Pro-Gly-Arg Sequenz an den Resten 311–316 (66). Immunantworten auf den V3 Loop werden kompliziert durch die hypervariablen Seiten des Loops (Reste 296–309 und 317–333). Es scheint, daß viele der Antikörper gegen den Loop gegen die hypervariable Regionen gerichtet sind, und darum ist die Antikörperantwort gegen Loop typ-spezifisch (67–71). HIV, ist der am meisten universell erkannte HIV-Stamm in Nordamerika in Bezug auf die Häufigkeit der HIV-infizierten Subjekte mit neutralisierender Aktivität gegen HIV und dem geometrischen mittleren Titer aller Seren gegen HIV, (72). Obwohl die dominierende Antikörperantwort typ-spezifisch gegen lineare Epitope ist, könnte eine gruppen-spezifische neutralisierende Antwort gegen den HIV, V3 Loop vorhanden sein, vielleicht gegen konformationelle Epitope enthaltend die konservierte Sequenz an den Resten 311–315. Verwendend ihr umfangreiches Repertoire an menschlichem MAbs gegen den V3 Loop vertritt Zolla-Pazner überzeugend die Ansicht eines Einflusses der Konformation auf das Binden an einen infektiösen Virus. Ihre Daten milderten die Unterscheidung zwischen gruppen- und typen-spezifische Neutralisation ab. Die Rolle der V3 Loop Antikörper in einer HIV-Infektion wird in größerem Detail später diskutiert. Eine bestürzende Komplikation mit den V3-Ergebnissen ist das Aufkommen von anti-V3-loop-resistenten Viren nach einer in vitro Behandlung von HIV mit neutralisierenden anti-V3-loop monoklonalen oder polyklonalen Antikörper. Mutationen können sowohl innerhalb (73–76) als auch außerhalb des V3 Loop (77, 78) auftreten. In der Tat hat sich gezeigt, daß HIV-infizierte Patienten Variationen entwickeln können, die eine frühe, Isolat spezifische Neutralisation widerstehen können (79). Eine nicht-V3-Loop Mutante wurde sequenziert und die einzige Änderung in der Aminosäurensequenz des Hüllglykoproteins war eine Substitution von Threonin anstelle von Alanin am Rest 582 (78), einer Region, die nicht nur außerhalb des V3-Loops, sondern auch in der amino-terminalen Region von gp41 liegt. Es konnte überzeugend gezeigt werden, daß diese immun-ausgewählte Punktmutation nicht Teil eines spezifischen Neutralisationsepitopes ist (80). Darum könnten andere Regionen der Hülle mit dem V3-Loop interagieren und dadurch die Entwicklung eines Vakzins komplizieren. In vivo sind neutralisationsentflohene Mutanten ebenfalls in HIV-infizierten Schimpansen beschrieben worden (81), wo keine V3-Loop-Mutationen verantwortlich waren für das Entkommen aus HIV-neutralisierenden Antikörpern. Gruppen-spezifische Neutralisation von HIV-Infektion ist in verschiedenen Laboratorien gezeigt worden (82–86). Diese gruppen-spezifische Antikörper könnten eine Infektion durch CD4 oder einem alternativen HI Rezeptor verhindern (87–89).
In Bezug auf neutralisierende Antikörperdomänen wird anerkannt, daß relative Immunogenizität als ein Resultat einer natürlichen Infektion gegen die experimentelle Induktion durch synthetische Peptide, die an einen Träger gebunden sind, häufig voneinander abweichen (Tabelle 2). Die immundominanten Regionen von gp120 und pg41, welche große Mengen an Antikörper hervorrufen, sind relativ schwach als experimentelle Immunogene, weil die von gp120, die relativ wenig Antikörper während einer natürlichen Infektion hervorrufen, starke Verursacher von Antikörper sind, wenn sie an einen Träger gebunden sind. Dies läßt auf die Gegenwart von alternativen Antigen-prozessierenden Routen zwischen einer Infektion und die durch rekombinante virale Proteine oder synthetische Peptidimmunogene hervorgerufenen schließen, was wichtig sein könnte in der Gestaltung von Vakzinen. Wie auch immer, da die gegenwärtige genetische mukosale Immunisierung eine virale Infektion imitiert, sollten funktionelle Immunantworten korrekt die de novo HIV-Infektion widerspiegeln.
Die Identifikation von neutralisierenden Domänen wurde auch leichter gemacht durch die Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MAbs) gegen HIV. Verschiedene anti-V3 Loop MAbs wurden hergestellt, die ein spezifisches Virusisolat neutralisieren (91, 92, 108, 109) sowie ein MAb, welches auch eine zelluläre Zytotoxizität vermittelt (90). Diese beinhalten eine Reihe von mausartigen (MAbs) (mu-MAbs)(108, 109) und verschiedenen humanen MAbs (hu-MAbs) (91, 92). Einige neutralisierende monoklonale Antikörper gegen andere Regionen des HIV sind außerdem beschrieben worden, beinhaltend Aminosäurenreste 423–437 (63), die Reste 728–745 (186) und die CD4+ bindende Domäne (91). Bei einigen zusätzlichen neutralisierenden MAbs wurde gezeigt, daß sie an die HIV Hüllglykoproteine binden (92, 93). Einer von vier MAbs hat eine neutralisierende Aktivität und bindet an gp41 (92). Außerdem deutet ein Bericht von Hansen et al. (94) an, daß MAbs, die gegen drei unterschiedliche Carbohydrathmoietäten gerichtet sind, entweder N- oder O-verbunden, in der Lage sind beides zu neutralisieren, HIV_IIIB oder ein Patientenisolat in vitro. Eine Studie von Mueller et al. (95) demonstriert, daß polyklonales Antiserum gegen Hefe mannan die HIV-Replikation hemmt. Die Bedeutung der Virusglykosylierung in der HIV-Infektivität wurde zuvor durch einige Laboratorien berichtet (96–106). Dadurch könnte die einfache Hemmung von funktionellen Glykosylgruppen die neutralisierenden Effekte von Antiglykosylantikörpern erklären (94, 95). Wie auch immer deuten andere Daten darauf hin, daß Sekundär- und Tertiärstrukturen der Hüllglykoproteine signifikant wichtig sind in der Generierung von gruppen-spezifischen, eher als in der Generierung von typspezifischen, neutralisierenden Antikörpern. Eine Notwendigkeit für ein Kohlenhydrat in der gruppen-spezifischen Neutralisierung von HIV wurde dadurch nachgewiesen, daß Antikörper miteinander verglichen wurden, die gegen ein glykosyliertes bzw. gegen ein nicht-glykosyliertes gp120 (107) erschaffen wurden, und durch Vergleich der Spezifität der Neutralisation durch Serum, was von nicht-glykosylierten gp120 eluiert wurde (108). In beiden Fällen war ein Kohlenhydrat notwendig für die gruppen-spezifische, aber nicht für die typ-spezifische, Neutralisation von HIV. Zudem weist ein kürzlicher Bericht nach, daß die Entfernung aller fünf variabler Regionen durch Retention der Disulfidbindungen in einem nicht-glykosylierten rekombinanten HIV ein Immunogen erzeugt, das nicht in der Lage ist neutralisierende Antikörper zu generieren (107). Deshalb ist nicht bekannt, inwiefern Antikörper die spezifische Funktion durch Hemmung der Bindung des Kohlenhydrats blockieren oder inwiefern sie durch Unterbrechung von Sekundär- und Tertiärkonformationen hemmen, die für die Infektivität notwendig sind. Die Positionen von N-verbundenen Carbohydratstrukturen wurden in Bezug auf ihre linearen Beziehungen zu bekannten funktionellen Antikörperdomänen an gp1 und gp41 untersucht sowie an Epitope, die von CD8+ und CD4+CTLs von HIV seronegativen rHIV Vakzinen (20) erkannt werden.
Tabelle 2. (siehe nachfolgende Seite) Neutralisierende Regionen der HIV-1 Hüllglykoproteine und des gp17 Proteins. Immunodom., Immundominant; post-member., Post-Membrane; ND, nicht bestimmt; MAb, monoklonale Antikörper. Die gezeigte Sequenz "*" ist der H × B2 Klon des IIIB Stammes, wie in der Los Alamos Datenbank berichtet ist (52). Die Numerierung basiert auf den ersten Methionin open reading frame als Aminosäurennummer 1 bei dem Nukleotid 6224 für neutralisierende Hülldomänen und Nukleotid 789 für die p17 neutralisierende Domäne. Disulfidbindungen in den Domänen 2 und 6 sind durch verbundene Linien angedeutet. Die Spezifität der Neutralisation ist zitiert, wo es ein direktes experimentelles Anzeichen gibt; wo kein Anzeichen erhältlich ist, sind gruppen-spezifische Antworten wahrscheinlich, wo es eine Umwandlung der Sequenz zwischen verschiedenen viralen Isolaten gibt. Das beste Anzeichen, wo widersprüchliche Daten berichtet wurden. Die wichtigste Domäne "" des V3 Loop ist im Fettdruck gezeigt. Das aktuell getestete Peptid "**" umspannt gp120/gp41 Peptid Hydrolyseseiten von gp160, wie es durch den Pfeil angedeutet wird (66).
2. Antikörperabhängige Erhöhung von HIV
Antikörper, welche die virale Infektivität erhöhen, wurden für eine Anzahl an Viren beschrieben (120–126). Das am häufigsten zitierte Beispiel beinhaltet die Steigerung der Denguevirusinfektion (112–115). Die Ergebnisse deuten an, daß nicht-neutralisierende Antikörper tatsächlich die Anzahl von infektiösen Viren in vitro erhöhen können durch die Bindung des Virus an Fc Rezeptoren auf Monocyten und Makrophagen (118). Bei Dengueinfektion korreliert grob der Grad an anwesenden steigernden Antikörper mit der Schwere der Erkrankung (113). Zusätzlich zu diesem Fc Rezeptor vermittelten Mechanismus wurde gezeigt, daß die Verstärkung der Infektion durch ein Flavivirus, West Nile Virus, vermittelt werden kann durch Komplemente und Komplementrezeptoren auf Zellen (119). Eine Verstärkung wurde in vitro nachgewiesen für eine Anzahl von Viren enthaltend Flaviviren (116–122), Alphaviren (123), Tollwutviren (124), Sinbdisviren (125) und Coronaviren (126). Es gibt ein gewisses Anzeichen für in vivo Steigerung von mehreren anderen Viren, wo eine unwirksame Vakzinierung zu einer erhöhten Schwere der Erkrankung führte. Die erwähnenswertesten dieser Beispiele fanden statt, als Kinder gegen Respiratory syncytial virus (RSV) (127–130) immunisiert wurden, oder Wollratten, die gegen RSV immunisiert wurden (131). Andere Beispiele beinhalten ein inaktiviertes Masernvakzin (132, 133) und möglicherweise ein unwirksames Caprin Arthritis und Enzephalitis Virusvakzin, obwohl die schwerere Arthritis, die der Vakzinierung folgte, aufgrund von Antigen-Antikörper Komplexformierung entstanden sein könnte (134, 135).
Lentivirus erhöhende Antikörper wurden das erste Mal für eine HIV-Infektion 1987 beschrieben (110). Nachfolgende Berichte haben zwei Mechanismen für die Erhöhung dieser Funktion in vitro identifiziert. Die erste beinhaltet Antikörper gegen HIV in Kombination mit Komplementproteinen (157, 158) und benötigt Zellen, die beides aufweisen, CD4 und Komplementrezeptor Typ 2(CR2)(139). Der zweite Mechanismus benötigt Antikörper gegen HIV und Zellen, die Fc Wiedergaben aufweisen (140). Da der Fc Mechanismus im allgemeinen nur eine zweifache Erhöhung, gegenüber einer hundertfachen für komplement-vermittelte antikörperabhängige Erhöhung (C'-ADE), hat, konzentriert sich die vorliegende Forschung auf das spätere Phänomen.
Für C'-ADE ist bekannt, daß die HIV-Hüllglykoproteine Komplement aktivieren können, und daß Antikörper gegen HIV zu einer erhöhten Fixierung auf die Komplementkomponente C3 an HIV oder HIV-infizierten Zellen führt (141). Dieses Komplement kann HIV an CR2 binden und wirkt in der Erhöhung der Menge an HIV in der Nähe von CD4+ Zelloberflächen, was zu einer größeren Wahrscheinlichkeit führt, daß das gp12 mit dem CD4 Rezeptor miteinander reagieren wollen, was den Eintritt von HIV in die Zelle vermittelt. Spear und seine Kollegen haben direkt gezeigt, daß C'-ADE in eine erhöhte HI Bindung an Zielzellen und eine erhöhte integrierte provirale Kopienanzahl resultiert (141).
Darüber hinaus hat diese Gruppe gezeigt, daß 30% der CD4 Lymphozyten den CR2 Rezeptor tragen, und daß dieser CD4/CR2 Lymphozyt vorzugsweise ausgewählt wird während der frühen Phasen des CD4 Zellverfalls als eine Funktion der HIV-Infektion (142).
Mit der Erzeugung von huMAbs gegen das HIV-1 Hüllglykoprotein ist es möglich, die Virus Neutralisation von der Virus Verstärkung zu trennen. Es wurde gezeigt, daß verschiedene huMAbs gegen die HIV-1 Hüllglykoproteine die HIV-1 Infektion erhöhen, aber nicht HIV-1 in vitro neutralisieren können (143). Die Fähigkeit von huMAbs die Infektion zu erhöhen war nicht festgelegt durch die Fähigkeit der huMAbs, das Komplement (System) zu aktivieren noch von den IgG Subklassen der huMAbs (143, 144). Diese verstärkende huMAbs wurden kartiert auf lineare Domänen des HIV-1 gp41 Transmembranglykoproteins. Von bis heute sechs identifizierten verstärkenden huMAb kartieren fünf an den Aminosäureresten 579–613 (144, 145), der primären immundominanten Domäne von gp41 (146–148). Einer von den sechs kartiert auf einer anderen immundominanten Domäne (143, 145). Diese Ergebnisse deuten an, daß es nur ein paar wenige verstärkende Domänen in der Hülle von HIV-1 gibt und daß diese Domänen konservierte, immundominante Regionen der HIV-1 Hülle sind. Kürzlich wurden diese Beobachtungen ausgeweitet auf SIV durch den Nachweis, daß die TM Proteinregionen, die homolog sind mit der ersten und wichtigsten verstärkenden Domäne von HIV, die gleiche Kapazität haben, die Formation von verstärkenden Antikörpern zu veranlassen (150). Die Daten zeigen, daß in vitro eine Preimmunisierung mit einem synthetischen Peptid (Aminosäuren 603–622) von SIV_mac251 die Erzeugung von Antikörpern stimulieren, welche die vorteilhaften Blockierungen eines rekombinanten gp160 SIC Vakzins unterdrücken und anscheinend eine SIV-Infektion verstärken (150). Weiterhin gibt es Hinweise auf verschiedene Lentivirus Vakzine die andeuten, daß die humorale Antwort auf Hüllglykoproteine für den Wirt nachteilig sein können. So haben z. B. SIV Hüllglykoprotein rekombinante Vakzine es zum größten Teil verfehlt, Affen von einer nachfolgenden Viruserregung zu schützen (151, 152) während ähnliche Hüllenbasierende rekombinante Vakzine für HIV im wesentlichen unwirksam waren in der Veränderung einer HIV-Infektion bei Schimpansen (153–155). Im pferdeartigen infektiösen Anemiavirus (EIAV), führt ein rekombinantes Baculovirus Hüllgly koproteinvakzin offensichtlich zu einer schlimmen Erkrankung in Pferden, die im Anschluß mit EIAV erregt wurden (156). Kürzlich berichtete Gardner et al. (157), daß passive Immunisierung von Rhesusaffen durch Serum von SIV-infizierten Rhesusaffen zu einer offensichtlichen Verstärkung der Schwere der Erkrankung führte, wobei fünf von sechs dieser Tiere innerhalb von fünf Monaten nach der Erregung starben. In dieser Studie gab es eine direkte Korrelation zwischen dem Ausbleiben der passiven Immunisierung und des höheren Antikörperlevels gegen das ss 603–622 Peptid durch ELISA (158). Diese Daten unterscheiden sich von den von Putkonen et al. (159) berichteten passiven Immunisationsexperimenten für SIV und von dem Felinen (Katzen) Immunodeficiency Model (FIV) (160), obwohl die Forscher von erhöhter Infektion für FIV in vitro berichtet haben (161), und einem ähnlichen passiven Immunisationsausfall für SIV_mac (162) in vivo. Es ist darum klug, das Potential für eine Verstärkung in allen Vakzinpräparationen zu beachten. Jedoch ist HIV und SIV Verstärkung relativ schwach im Vergleich mit Dengue (150).
Induktion von mukosalen Immunantworten In Vivo
Eine der Transfektions-DNS, die als genetisches Immunogen verwendet wurde, war pHenv, ein 9600 bp pBR322 basierendes Plasmid, welches das gesamte HIV-1 Hüllgenom beinhaltete, funktionelle tat und rev Transaktivatorsequenzen und entsprechende LTR TAR und RRE Sequenzen, welche ursprünglich vom NIH AIDS Reference Programm erhalten wurden. 1 zeigt im Detail die zirkuläre Plasmidkarte. Es wurde gezeigt, daß dieses Plasmid bei einer Transfektion effizient die env Proteine von HIV-1_pNL4-3 exprimiert, was zu einer umfassenden Zellfusion mit Zellen, die CD4 exprimieren, führt (180). pACYC177 wurde als irrelevantes DNS Kontrol limmunogen verwendet. Plasmide wurden in E. coli JM 109 hergestellt, die in LB Brühe enthaltend 50μg/ml Ampicillin wuchsen, und Zellen wurden bei einer OD_600nm = 0,50 abgeerntet. Die DNS wurde von den Zellniederschlägen (pellets), verwendend eine SDS Lysisprozedur mit Reinigung auf Magic Prep Säulen (Promega Corp.), abgeerntet. Die Plasmid DNS wurde bei 70°C mit TE Puffer eluiert und bei –70°C in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,2 präzipitiert. Gereinigte Plasmid DNS wurde in Agaroseelectrophoresegels bezüglich der Größe bekannter Restriktionsendonucleasen Hydrolyseseiten hin untersucht. pHenv DNS stimmte mit einer 9600 bp DNS überein, die vier HindIII Seiten beinhaltete, was 3708, 5818, 7293 und 9520 bp Fragmente erzeugt. Das 3940 bp Kontrollplasmid pACYC177 enthält eine BamHI Seite und zwei StaI Fragmente bei 965 bp und 2305 bp. Die Konzentrationen an DNS basierte auf eine OD/Ia\Ia1(50μg, 260nm/I, 1cm) = 1.
Zusammenfassung der Resultate
Fünf bis sechs Wochen alte weibliche Balb/c Mäuse von Harlan Industries wurden zufällig in Gruppen von jeweils fünf Mäusen sortiert: Die Gruppen wurden in drei Klassen an DNS-Immunisierungen angeordnet plus irrelevante DNS Immunogen und natürliche Tierkontrollen. Tabelle 3 zeigt im Detail den Weg der Immunisation, die Zusammensetzung des Immunogens, Dosis, Anzahl der Immunisierungen und die totale DNS Dosis Aussetzung. Tabelle 4 faßt die Antikörperantworten zusammen, die im Serum der Mäuse als Resultat der Transfektion mit DNS enthaltend transkriptionskompetente HIV-1 env Sequenzen entdeckt wurden. Nackte DNS (100 μg) ergaben eine HIV-spezifische Serum IgG Antwort in zwei von fünf Tieren mit einer einzelnen großen IM Aussetzung und drei von fünf Tieren mit zwei oder drei IM Aussetzungen. Nackte DNS (10 μg) erzeugte eine HIV-spezifische Immunantwort mit IM Aussetzung. Der höchste durchschnittliche IgG Titer trat in der 10 μg pro Aussetzung Gruppe auf. DNS (10 μg oder 1 μg) komplexgebunden mit Dioctadecylamidoglycylspermidin (DOGS) erzeugte HIV-spezifische Immunantworten in 80% der IM behandelten Tiere nach einer, zwei oder drei Aussetzungen, mit dem Auftreten des höchsten durchschnittlichen Titers in der Gruppe, welche drei Aussetzungen erhielt. Nasale Lavage (Spülung) Aussetzung mit 10 μg DNS komplexgebunden mit DOGS erzeugte systemische HIV-spezifische Immunantworten in 20% der Mäuse mit einer Aussetzung, und 40% der Mäuse, die zwei oder drei Mal ausgesetzt wurden. Nasale Spülungen mit 1 μg DNS Komplex erzeugte spezifische IgG Antworten in 20% der Mäuse nach einer oder zwei Aussetzungen und 80% der Mäuse, die anschließend eine dritte Aussetzung mit einem durchschnittlichen Titer von 1 : 850 erhielten.
Tabelle 3.
Tabelle 3 (fortgesetzt)
Tabelle 4. Serum Antikörper anti-HIV env Antworten auf DNS Immunisierung. Serumtiter der Antikörper gegen die env Proteine von HIV-1 wurden mit einer Dot-Blot Prozedur quantifiziert. H9 Zellen, die mit HIV-1_IIIB infiziert wurden, wurden mit RIPA Puffer bei 10⁶Zellen/100 ml lysiert und die (Zell) Trümmer durch Zentrifugation entfernt. 100 ml einer 1 : 100 Verdünnung in Tris-Saline des RIPA Lysates wurden auf einer Nitrocellulosemembran absorbiert und die überzähligen Seiten mit Rinderserum Albumin blockiert. Serielle Verdünnungen des Mausserums wurden mit jedem Dot-Blot inkubiert, 3x mit TE Puffer gewaschen. Spezifische IgG, IgM und IgA Titer wurden mit Überschuß an Immunglobulin Klassen anti-Maus Antikörper bestimmt, konjugiert mit Alkalin Phosphatase und mit p-Nitrophenylphosphat (PNPP, Pierce Chemical Company) entwickelt und in einem 96-well Platten Colorimeter, verwendend einen 414 nm Band Passfilter, quantifiziert. Die Titer Cut-Offs sind als die höchste Verdünnung wiedergegeben worden, die eine mittlere optische Dichte ± 1 S. D. über die Kontrolle erbrachte.
Es wurde die Western Blot Immunreaktivität in serokonvertierten Tieren bestimmt. Western Blots wurden angefertigt durch SDS-PAGE von HIV-1_IIIB infizierten H9 Zell-Lysaten mit Übertragung auf Nitrocellulose, was erreicht wurde mit einem vier Tage andauernden passiven Diffusionstransfer. Albumin blockierte Streifen wurden von den Nitrocelluloseblättern hergestellt und eine Stunde mit 200 μl einer 1 : 40 Lösung des Mausserums inkubiert. Die Detektion wurde mit einem Alkalinphospat konjugierten Antimausanti körper erzielt und mit 5-Bromo-4-chloro-3'-indolyphosphat p-toluidin/nitro-blau Tetrazoliumchlorid (BCIP/NBT, Pierce Chemical Company) entwickelt. Menschliches Ig (HIVIG), welches von Fred Prince am New York Blood Center erhalten wurde, wurde als menschliche positive Kontrolle mit einem anti-humanen Alkalinphosphat Detektionssystem verwendet. Mausantisera, die gegen die terminalen zwölf Aminosäuren von gp120 generiert wurden, wurden als eine positive Mauskontrolle verwendet. Dieses Antiserum wurde durch F-MOC feste Peptidphasensynthese hergestellt, Reinigung des Peptides durch HPLC auf einer C18 Säule verwendend einen TEFA/H₂O Gradienten, Konjugation an KLH, und Verabreichung an die Mäuse durch mannigfache intradermale Injektionen unter Verwendung von Freund'schem Adjuvanz. Die Western Blot Analyse deutete darauf hin, daß der Großteil der humoralen Immunantwort gegen gp41 gerichtet war, was eindeutig eine anti HIVenv systemische Antwort auf direkte mukosale genetische Immunisation nachweist.
Immunohistochemie der Lunge und des Darmes in Tieren von der nasalen Lavagegruppe deuteten darauf hin, daß eine spezifische Antwort auf HIV-env auf bronchialen und colonalen mukosalen Oberflächen anwesend war. Eine IgA-spezifische Phosphatase Dekoration auf Lungengewebe in einem Tier, welches mit einer nasalen Lavage von DOGS/HIVenv-DNS immunisiert wurde, wurde beobachtet. Das Kontrolltier offenbarte beständig keine Markierung (labeling) von IgA auf mukosalen Oberflächen. Eine anti-HIVenv Reaktivität eines bronchialen Epitheliums in einer Lunge von einer Maus, die mit einer nasalen Lavage Abgabe von DOGS/HIVenv-DNS immunisiert wurde, wurde nachgewiesen. Die Kontrolltiere zeigten keine bronchiale Reaktivität gegen HIVenv Antigene. Eine Fluoreszens-Antikörperdekoration bei Colonmukosa von einer Immunisation via einer nasalen Lavage wurde beobachtet. Diese Visualisierung von IgA Antworten, folgend einer gene tischen mukosalen Immunisation, und das Auffinden von HIV Hüllproteinen von H9/IIIB infizierten Zellen stellt eine spezifische sekretorische IgA Antwort dar auf mukosale genetische Immunisation. Dies ist die erste Vorführung einer mukosalen Immunantwort, die von einem genetischen Immunogen veranlaßt wurde.
Obwohl es umfangreiche Erfahrungen mit der Messung von humaner Neutralisation und verstärkende Antikörper gibt, offenbarten die anfänglichen Anstrengungen mit Balb/c Mausserum einen HIV inhibierenden Faktor, welcher inaktiviert wurde durch Erhitzen auf 56°C für eine halbe Stunde. Weitere Neutralisationsassays, die hitzeinaktiviertes Serum verwenden, werden rigoros standardisiert werden durch Verwendung hitzeinaktiviertes Balb/c Serum von Mäusen, die mit HIV-_IIIB als eine Positivkontrolle immunisiert wurden. Mäuse werden gegenwärtig mit inaktiviertem HIV-1_IIIB immunisiert. Zusätzlich können CTL-Antworten auf HIVenv genetische Immunogene quantifiziert werden.
Histochemische Anfärbeaktivitäten in Mäusen, die durch nasaler Lavage und DOGS/HIVenv DNS immunisiert wurden, wurden durchgeführt. Eingefrorene fünf Mikrometer Schnitte wurden ausgeführt von schnell gefrorener/schock gefrorener (flüssiger Stickstoff) Lunge und Colon von durch nasal Lavage immunisierten Mäusen, verwendend eine gekühlte Mikrotom und an Standardsiliziumglasträger bindend. Um mukosale Antikörper spezifisch für HIVenv Determinanten nachzuweisen wurde jeder Schnitt für 30 Minuten mit einer 1 : 100 Lösung von H9/IIIB Zell-Lysat inkubiert. Die Sektionen/ Schnitte wurden ausgiebig mit T-Puffer gewaschen und mit 100 μl von einer 1 : 100 Lösung von HIVIG inkubiert. Die Bindung von humanem Ig wurde nach umfangreichem Waschen in TE-Puffer mit einem ziegen-anti-humanem IgG Antiserum, welches mit Alkalin Phosphatase konjugiert war, detektiert und mit BCIP/NBT Detektion von maus-anti-HIV-mukosale Antikörper in Lunge und vaginalen Schnitten und ziegen-anti-humanem IgG Antiserum, konjugiert mit Fluorescein für die Detektion von anti-HIV mukosalen Antikörpern in Jejunum und Colon, entwickelt. Mukosale IgA Antikörper wurden in gefrorenen Lungenschnitten visualisiert verwendend ein ziegen-anti-Maus IgA gekoppelt mit Alkalin Phosphatase oder Fluorescein.
Die Bindung von DOGS an DNS wurde untersucht durch molekulares Modellieren (molecular modeling) verwendend den DREIDING II Force Field in einem Biograf Softwarepaket (Molecular Simulations, Inc.) und einem Silicon Graphics RISC basierenden Computer. Nach Molekular Dynamics wird gesehen, daß das Molekül an die große Gruppe der DNS bindet. Zwei von vier positiven Ladungen am polaren Ende von DOGS zuzüglich des Amidhydrogenpeptides koordinieren symmetrisch mit einem einzelnen Phosphat auf der DNS. Ein hydrophober Arm streckt sich von dem Phosphat aus, während der zweite in die entgegengesetzte Richtung sich ausstreckt, entlang der großen Gruppe, für mehrere Methylengruppen, und dann in Richtung des ersten Armes sich biegt. Diese Konformation plaziert eine Sequenz von 4–5 Methylengruppen, die pro Phosphat einem Lösungsmittel ausgesetzt wird. Eine der DOGS lipophilen Ketten dehnt sich in das Lösemittel aus. Mit einem molaren Ladungsverhältnis von 5 : 1 DOGS/DNS werden alle Phosphatgruppen ionisch komplexgebunden mit einem hydrophoben Mantel, der das gesamte DNS-Molekül bedeckt. Dies erklärt die Stabilität des Komplexes und seine Affinität für die lipide Plasmamembran. Es ist möglich, daß eine Struktur dieses Typs eine Passage durch das saure Milieu des Magens überleben würde, wenn der DOGS/DNS geladene Komplex relativ unzugänglich für Hydrogenionen wäre.
2. Vektorkonstruktion und Synthese
Der Vektor, der für die Pilotstudie an genetischer Immunisierung verwendet wurde, pHenv, ist ein 9600 bp Plasmid, welcher SV40 Promotoren enthält. Jedoch sind die HIV Hüllsequenzen innerhalb des LTRs enthalten, mit vollständig funktionsfähigen tat und rev Genen jeweils zuzüglich den RNA Rezeptorseiten TAR und RRE. Vermutlich ist die Expression von gp160 unter der Kontrolle des LTR Promotors. Es kann nun ermittelt werden, inwiefern dieses Expressionssystem vorteilhafter ist für die Expression der env Proteine und für die Induktion funktioneller Immunantworten als die Verwendung von anderen Promotoren (CMV) in Konstrukten, denen die rev Funktion fehlt. Nicht nur gp160, sondern auch gp120 und gp41 können separat voneinander oder in Kombination miteinander exprimiert werden.
Ein mögliches Problem ist die umfangreiche Sekundärstruktur von RRE, welches zu Schwierigkeiten in den initialen zielgerichteten Mutagenesebemühungen an der primären Verstärkungsdomäne von gp41 führte. Wir haben darum stille Mutationen eingeführt (d. h. keine Änderung der Aminosäurensequenz von gp41), die konzipiert wurden, um die Sekundärstruktur von RRE zu beseitigen. Wir haben zwei solcher Mutationen hergestellt. RRE-3C ist konzipiert, um die Bindungsseite für Rev zu unterbrechen, während RRE-4C das vollständige RRE umfangreich unterbrechen wird. 2 illustriert das RRE und die Mutageneseseiten. pHenv wurde mit Sall und EcoRI geschnitten und die 4700 bp gp160 Sequenz wurde aus der Agarose, folgend einer Elektrophorese, isoliert. Diese Sequenz wurde in den pAlter MCS kloniert, einer zielgerichteten Mutagenese unterworfen, auf dem RRE, Ampicillin (Reparatur) und Tetracyclin (Sensivität) Seiten waren und mit Ampicillin selektiert. Mutiertes RRE ergab die richtige Größe und die richtigen Restriktionsseiten folgend einer antibiotischen Auswahl. Sequenzanalyse bestätigte die Authentizität der RRE Mutationen. Überraschenderweise ergab RRE unter einem CMV Promotor dem ein funktionelles rev Protein fehlte bessere Immunantworten als ein RRE Negativkonstrukt (Tabelle 6). In ähnlicher Weise wird in vitro RRE für eine maximale Translation von gp160 benötigt. Darum ist die Anwesenheit eines intakten ARE ein wünschenswertes Merkmal in der Konstruktion eines genetischen Vakzins für die Hülle von HIV auch in der Abwesenheit von rev.
3. Molekulares Modellieren von HIV-Hüllproteinen
Obwohl die Hauptsequenz der HIV env-Proteine hypervariabel sind, verbleiben bestimmte strukturelle Merkmale zwischen allen Isolaten konstant. 2 ist eine Darstellung der strukturellen Daten für gp120, die von Leonard et al. berichtet wurden (174), in welchen die Sulfidpaarungen durch klassische chemische Methoden identifiziert wurden und die generischen Glykosylierungsmuster (sialliert gegen nicht-sialliert) durch enzymatische Methoden zugewiesen wurden. In 2 ist das einzelne Disulfid enthalten, welches in gp41 anwesend ist, und welches N-verbundene Glykosylierungsseiten von unbekannten Strukturen hat. Diese strukturellen Beziehungen sind mit den neutralisierenden und verstärkenden antikörperbindenen Domänen, welche von Robinson und Mitchell rezensiert wurden (178), kombiniert worden. Es gibt neun Disulfidbrückenbindungen und ein freies Sulfhydryl in gp120. Die Positionen der Cysteinreste in gp120 sind in allen Isolaten stark konserviert mit der Ausnahme des Z3 Isolates, in welchem zusätzlich zwei Cysteine in der vierten hypervariablen Domäne anwesend sind. Dies deutet streng darauf hin, daß die Disulfidpaarung im III_B zwischen allen Isolaten aufrechterhalten wird. Verwendend das Dreiding II Generic Force Field für molekulare Simulationen, haben Gabriel und Mitchell (172) eine molekulare Simulation für ein verstümmeltes (truncated) gp120 generiert, welches mit allen bekannten Daten betreffend gp120 Glykosylierung, antigene Struktur und gp120/CD4 bindende Interaktionen übereinstimmt. Andockende (docking) Inhibitionsstudien mit bekannten gp120/CD4 bindenden Inhibitoren sind kürzlich abgeschlossen worden, was einen weiteren Glauben an das Modell bereitstellt (179). Ähnliche Modellstudien mit gp41, in welchen der Cys-Cys Loop von gp41 an die C-terminale Wölbung von gp120 angedockt wurde, in Übereinstimmung mit den theoretischen Vorhersagen von Moore et al. (149), sind ausgeführt worden. Darum gibt es ein verläßliches Modell für die Beziehungen zwischen den hauptantigenen Seiten am gp120 und N-verbundenen Oligosaccariden, gp120/gp41 Interaktion und gp20 angedockt an CD4. Der V3 Loop von gp120 ist lösungsmittelempfänglich auf einer Fläche, obwohl ein Anteil eines Kohlenhydrates verdeckt ist. Die zweite konservierte Domäne ist nur von einer Seite zugänglich. Die CD4-bindende Domäne ist an einer Seite komplett durch das Kohlenhydrat abgedeckt, aber sie auf der gegenüberliegenden Seite ist einfach zugänglich. Die vorliegende Fähigkeit, eine Modelstruktur bereitzustellen, in welcher die Wirkungen von Sequenzvariationen in den genetischen Immunogenen vorhergesagt werden können ist ein wertvolles Hilfsmittel, das uns helfen wird in ihrer Konzeption und der Analyse derjenigen biologischen Antworten, die abhängig sind von strukturellen Ladungen in dem Proteinimmunogen.
3. Signifikanz bezüglich des HIV Vakzin Programms
Spezifische anti-HIV env Antworten sind in Balb/c Mäusen durch Förderung einer genetischen Immunisation der Mukosa generiert worden. Mäuse werden gegenwärtig gegen HIV-1_IIIB immunisiert, zwecks Erhalt eines polyklonalen neutralisierenden Mauskontroll HIV Serums, welches mit herkömmlichen Methoden erhalten wird. Die Quantifizierung der funktionellen humoralen Antworten gegen HIV in Menschen kann, wie hierin gelehrt wird, gemacht werden, und Schwierigkeiten werden nicht erwartet. Da bezeugt wurde, daß eine genetische Immunisierung CTL Antworten generiert, wurden zwei einmalige Zellinien von Viagene Inc. (San Diego, CA) erhalten, die dazu verwendet werden können, zytotoxische Lymphozyt (CTL) Antworten in Balb/c Mäusen als eine Funktion der Immunisation (182) zu evaluieren. Die Hu/D^d Linie ist ein CD4 exprimierendes HeLa Derivat, welches den D^d MHC Lokus der Balb/c Mäuse trägt und exprimiert. Diese Linie kann infiziert werden mit einem reichen Angebot an etablierten und primären HIV Isolaten, die als Ziel für Balb/c CTLs verwendet werden können. Die zweite Zellinie ist ein Balb/c Fibroblast, welcher dauerhaft transfiziert wurde mit HIVenv (IIIB) Sequenzen, welche an der Zelloberfläche exprimiert werden. Diese Zelle liefert ein weiteres geeignetes Ziel für eine CTL Analyse in Balb/c Mäusen als eine Funktion der Immunisation gegen HIV an.
4. Methodenentwicklung und Protokolle
A. Generelles Design
Die anfängliche Evaluierung verwendete pHenv als den allgemeinen Vektor in dem direkten Vergleich von mukosalen und systemischen Antworten auf genetische Immunisierung.
Balb/c Mäuse wurden evaluiert auf Serumtiter von Igs, Western Blot und Radioimmunopräzipitation Assay (RIPA) Spezifitäten der humoralen Immunantworten, sIgA Titer in Parotissekretionen und direkte Visualisierung von mukosalen Antikörpern, die spezifisch für HIV sind. Neutralisierender Titer von Serum und Parotisantikörpern und Milz CTL Aktivität gegen ⁵¹Cr markiert gegen Ziel Bcenv und Hu/D^d/HIV kann ebenfalls routinemäßig ermittelt werden. Die Fähigkeit von DOGS/DNSenv Komplexen eine allgemeine mukosale Antwort zu veranlassen, wird mit nasalen Lavages (Spülungen) evaluiert werden, colonale Exposition, vaginale Exposition und vom Magen abgegebene Formulierungen. In jedem Fall wird eine Dosisantwortanalyse durchgeführt werden, verwendend 10 μg DNS als die höchste totale DNS Einzeldosisexposition. Auf gleiche Weise wird eine Evaluierung der Antworten als eine Funktion von einer, zwei oder drei genetischen Immunisationsplänen durchgeführt, wobei zwei Wochen und/oder drei Monate Intervalle zwischen den Antworten zugelassen werden. Die Inklusion des Vitamins in den bolistischen DNS/Au Formulierungen kann evaluiert werden zwecks Feststellung, ob eine einzelne Formulierung möglich ist. Die Stabilität der Formulierung kann routinemäßig ermittelt werden unter verschiedenen physischen Zuständen.
Während die verschiedenen Wege und die Art und Weisen der oben umrissenen genetischen Immunisierung evaluiert werden, kann eine Vielfalt an DNS Konstrukten entwickelt werden für die Verwendung in der genetischen mukosalen Immunisierung. Die Wirkung der verschiedenen eukaryotischen Promotoren auf die Immunogenexpression wird routinemäßig untersucht. Der wirksamste bis heute untersuchte eukaryotische Promotor für eine genetische Immunisation ist der CMV Promotor für die Expression der HBV Untereinheit (18), obwohl andere wirksamere Promotoren gefunden werden könnten. Der Thymidin Kinase Promotor für Herpessimplexvirus (HSV) ist untersucht worden verwendend pTKb (GenBank accession # U02438), der SV40 frühe Promotor verwendend pSVb (GenBank accession # U02435), der CMW unmittelbare frühe Genpromoter verwendend pCMV-Lic (enthält CMV Promotor/Verstärker LIC Klonierungsseite, HGH Polyadenylierungsseite und SV40 frühe Promotor) oder pCMvb (GenBank accession # U02451) und der Adenovirus späte Hauptpromotor pTKb (GenBank accession # U02442). Verwendend gp160, dem LTRs fehlt, konnte evaluiert werden, welcher Vektor eine maximale Expression bereitstellt in einer Vielfalt von eukaryotischen Zellinien, wie z. B. HeLa und SG181 (ein humaner Fibroblast) und humane H9 ebenso wie primäre Mäuselunge, Darm und Organkulturen von Hautexplantaten. Jene Promotoren, die die beste gleichbleibende Expression bereitstellen, werden für die nachfolgenden Vektorkonstrukte verwendet.
Im Anschluß an der Identifizierung des besten Promoters(en) für eine Oberflächenexpression in den eukaryotischen Zielzellen werden Vektorkonstrukte hergestellt, welche konstruiert sind, um die besten Signalpeptidsequenzen zu identifizieren (d. h. z. B. die HIV Signalsequenz im Vergleich zu TPA Signalpeptid), Expression von einem Vektor, der die RRE Sekundärstruktur trägt, gp160 im Vergleich zu gp120 und/oder gp41 enthaltend die gp160 Membranankerdomäne, und gp160, in welchem die gp160 Spaltseite entfernt wurde. Im Anschluß an die Identifizierung der besten Konstrukte für die genetische Immunisierung wird ein Vektor gestaltet mit HIVenv Sequenzen zuzüglich p17, da eine N-terminale Neutralisationsseite in diesem HIV gag Protein identifiziert wurde. Verwendend das hierin Gelehrte, kann das beste Plasmidvektorkonstrukt ermittelt werden, damit beides, die Qualität und Quantität im Anschluß an einer genetischen Immunisierung, maximiert wird.
Die genetische Immunisierung bietet die beste Gelegenheit für die Generierung vielfacher Antworten auf die verschiedenen hypervariablen Formen der Grundbestandteile der neutralisierenden Domäne von HIV (d. h. V3 Loop). V3 Loop Mutationen an einer pNL4-3 DNS Hüllsequenz können generiert werden, die die Hauptmakrophagentrophen und Lymphotrophen Varianten vom Stamm B Viren widerspiegeln, ebenso wie diejenigen beschränkenden V3 Loop Sequenzen erkannt wurden als die infektiöse Variante aus einer Vielzahl an potentiellen infektiösen Varianten des infizierenden Donators (171). Für jede V3 Loop Variante kann die Wirkung auf die gp120/gp41 Konformation untersucht werden durch molekulares Modellieren (molecular modeling) zwecks Vorhersage der Änderungen an gruppen-spezifischen konformativen Epitopen. Auch kann die Antwort auf DNSenv Cocktails, enthaltend eine Vielzahl an V3 Loop Arten, untersucht werden durch die Verwendung des hierin gelehrten Verfahrens.
Detaillierteh Protokolle
1) Geförderte DNS env mukosale Immunisation
Diotadecylamidoglycylspermin (DOGS), welches von Promega als Transfectam^® erhalten wurde, wird in 100% Ethanol solubilisiert und komplexgebunden an DNS in H₂O bei einem 5 : 1 molaren kationischen Ladungsüberschuß und in Tris-Saline zu der Immunisationsdosis verdünnt, basierend auf die DNS Konzentration und sofort im Anschluß an die Formulierung verabreicht. 100 μl wird als nasale Lavage (Spülung) verabreicht, als Magenbolus, oder 25 μl werden intravaginal anästhesierten (Ketamin/Xylazin) sechs Wochen oder sechs Monate alten weiblichen Balb/c Mäusen deponiert. Alle Tiere werden zufällig in Gruppen von fünf Tieren angeordnet. Jedes Tier wird durch Ausblutung unter Ketamin/Xy lazin Anästhesie drei Wochen nach der letzten Immunisation euthanasiert. Das ganze Blut wird durch Kathedarisierung der abdominalen Aorta (#25 pediatrische cut-down set) eingesammelt. Die Milz wird eingesammelt und auf weiße Pulpa und PBMCs, isoliert auf Hypaque-Ficol, getestet. Lungen, Colon, Dünndarm und Vagina werden eingesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren (snap frozen) für nachfolgende Aufbereitung der gefrorenen Schnitte.
2) Vektor Konstrukte

a. Die Konstrukte verwenden einen Plasmidvektor, welcher einen CMV Promotor, eine Multiklonierungsseite (MCS) und eine poly-A Signalseite enthält. HIVenv DNS Sequenzen werden durch PCR mit einzigartigen überhängenden Restriktionsseiten für die Insertion in die elterliche Plasmid MCS amplifiziert. Für diesen Zweck wurden die NotI/MluI Seiten verwendet für die Konstruktion von natürlichen und mutierten DNS Immunogenen.
b. Zielgerichtete Mutagenese: Die P-Alter^® Methode wurde routinemäßig verwendet für die Einschleusung von Mutationen an spezifischen Seiten. Ein SalI/EchoRI Agarose gereinigtes Restriktionsfragment von pHenv, welches die HIV_NL4-3 Hüllsequenz enthielt, wurde in den p-Alter Vektor kloniert. Dieser Vektor enthält ein mutiertes Ampicillin Resistenzgen und Tetracylin Resistenzgen für die Selektion während vielfacher Runden an additiver Mutagenesen. JM 109 E. coli, welches mit dem p-Alter_HIVenv transformiert wurde, wurde dazu veranlaßt Einzelstrang (ss) DNS zu produzieren, verwendend Helferphagen DNS. Drei veränderliche Primer wurden an die ssDNS bei Raumtemperatur hybridisiert (Ampicillin Resistenz Reparaturprimer, Tetracyclin Resistenz Inaktivierungsprimer und ein veränderlicher Primer des Gens, welches analysiert wird). Die hybridisierte DNS wird aufgefüllt mit T7 Polymerase und veränderliche Reparatur E. coli wird verwendet für die Transformation und die Mutagenese der Plasmidausbeute auf antibiotischen Selektionsplatten. Diese Methode hat die höchste Ausbeute an erwünschten, verifizierten Mutationssequenzen der verschiedenen getesteten Methoden bereitgestellt. Die kritischen Faktoren betreffen die Reinheit der Phagen DNS und die Verwendung von MutS-Blue E. coli, dem alle DNS Reparaturensysteme fehlen.

4) Systemische Antikörperanalyse

a. Ig Titer. Serum Titer von Antikörpern gegen die env Proteine von HIV-1 sind quantifiziert worden mit einer Dot-Blot Prozedur. H9 Zellen, die mit HIV-1_IIIB infiziert sind, sind mit RIPA Lysispuffer (0,05 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% Deoxycholat, 1 mM mit Phenylmethylsulfonylfluorid) bei 10⁶ Zellen/100 μl lysiert worden und die Trümmer sind durch Zentrifugation entfernt worden. 100 μl einer 1 : 100 Verdünnung in Tris-Saline des RIPA Lysates sind auf einer Nitrocellulosemembran absorbiert worden und die überzähligen Seiten sind mit Rinderserum Albumin blockiert worden. Serielle Verdünnungen des Mausserums sind mit jedem Dot Blot inkubiert und mit TE Puffer drei Mal gewaschen worden. Total IG oder spezifische IgG, IgM und IgA Titer sind bestimmt worden mit einem Überschuß an anti-Maus Ig Antikörper Immunoglobulin Klassen anti-Maus Antikörpern, konjugiert mit Alkalin Phosphatase, und mit p-Nitrophenylphosphat (PNPP, Pierce Chemical Company) entwickelt worden und in einem 96-Vertiefungen (96-well) Platten Flow Kolorimeter, verwendend einen 414 nm Bandpassfilter, quantifiziert worden. Ein optischer Dichtescanner erlaubt die Durchführung von OD Scans direkt in den Dot Blots. Titer Cut-Offs werden bezeichnet als die höchste Verdünnung, die eine mittlere optische Dichte ± 1. S. D. über die Kontrolle ergab.
b. Western Blot. Western Blots sind vorbereitet worden durch SDS-PAGE von HIV-1IIIB mit Transfer auf Nitrocellulose, was mit einem viertägigen passiven Diffusionstransfer erreicht wurde. Mit Albumin blockierte Streifen werden von Nitrocelluloseblättern angefertigt und eine Stunde mit 200 μl eine 1 : 40 Verdünnung von Mausserum inkubiert. Die Detektion wird erreicht mit einem Alkalin Phosphatase konjugiertem anti-Maus Antikörper und mit 5-Bromo-4-chloro-3'-Indolyphosphat p-Toluidin/ nitro-blue Tetrazoliumchlorid (BCIP/NBT, Pierce Chemical Company) entwickelt. HIVIG, was von Fred Prince am New York Blood Center erhalten wurde, ist als Positivkontrolle mit einem anti-humanem Alkalin Phosphatase Detektionssystem verwendet worden.
c. Radioimmunopräzipitationsanalyse (RIPA). H9/IIIB Zellen wurden mit ³⁵S-Cystein in einem cysteinfreien Medium für vier Stunden mit 1 mCi/ml, enthaltend 1 × 10⁶ Zellen, markiert. Die Zellen wurden drei Mal in PBS gewaschen und in RIPA-Puffer (siehe 4a oben) lysiert. Ansätze wurden gemacht, um 20 × 10⁶ cpm mit 2 × 10⁵ cpm/μl zu erhalten. Die Seren die getestet werden sollten wurden mit 100 μl einer verdünnten Protein G- Sepharose (Pierce) für eine Stunde bei 4°C inkubiert. Das Lysat wurde bei einer Äquivalenz von 0,5 bis 1 × 10⁶ Zellen hinzugegeben. Die Serumantikörper und die Lysatantigene sind über Nacht bei 4°C inkubiert worden und in RIPA Waschpuffer (d. h. RIPA Lysispuffer minus Deoxycholat und Phenylmethylsulfonylfluorid) gewaschen worden. Die Immunkomplex-Protein G Beads sind bei 1000 g zentrifugiert, drei Mal mit 4 ml RIPA Waschpuffer gewaschen, bei 100°C für zwei Minuten denaturiert worden und auf einem SDS-PAGE in 10% auflösende Gele gelaufen. Nach der Elektrophorese ist das Gel in 30% Methanol, 10% Essigsäure, 60 ddH₂O oder Äquivalente fixiert worden und die radioaktiven Banden sind mit einem Molecular Dynamics PhosphoImager visualisiert worden.
d. Neutralisierungsassays
(i) Standard Mikrotiter Neutralisierungsassay. Die neutralisierenden Antikörperaktivitäten werden in Mikrotiterinfektionsassays gemessen, wie sie ursprünglich von diesem Labor beschrieben wurden (183). Kurz dargestellt werden hitze-inaktivierte (60°C, 30 Min.) Serumproben serienmäßig in dreifacher Ausführung zweifach in RPMI 1640 Wachstumsmedium enthalten 12 FCS verdünnt. Der Virus wird hinzugegeben (5–10 × 10⁵ infizierte Einheiten) und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Als nächstes werden 2–5 × 10⁵ MT-2 Zellen in 100 μl des Wachstumsmediums jeder Vertiefung hinzugegeben und die Platten für zwei bis drei Tage bei 37°C in 5% CO₂/95% Luft inkubiert. Die Zellen werden durch Phasenkontrastmikroskopie auf Syncytiaformierung überwacht und untersucht wenn die Virus Kontrollvertiefungen (kein Mausserum) eine umfangreiche zytopathische Wirkung zeigen. Dies findet üblicher weise bei 3 1/2 Tagen statt, wenn MOI ≥ 1 verwendet wird. Die Zellen werden auf poly-L-Lysin beschichtete Platten überführt und mit Fainter's Neutral Red Dye für eine Stunde inkubiert. Adherente Zellen werden mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen und der Vitalfarbstoff wird mit saurem Alkohol (acid alcohol) freigesetzt. Die Platten werden auf einem Flow Titertek Mikrokolorimeter bei 540 nm auf lebensfähige Zellen analysiert. Die Lebensfähigkeit wird ermittelt relativ zu den Kontrollvertiefungen der Zellen(n = 4). Der neutralisierende Titer ist definiert als die höchste Verdünnung, die ± 50% Lebensfähigkeit der Zelle im Vergleich zu der Kontrollzelle ergibt.
(ii) Primäre Isolatneutralisation. Der goldene Standard für die Neutralisation ist die Befähigung, die Fähigkeit eines Feldes an primären Isolaten humane PBMC zu infizieren, zu neutralisieren. Die letzteren sind frisch isoliert auf Hypaque-Ficol. 5 × 10⁶ Zellen in 10 μl eines unverdünnten primären Isolates von HIV (d. h. immer vermehrt auf PBMCs) werden in dreifacher Ausfertigung in seriellen Fünffachverdünnungen des Mausserums für eine Stunde bei 4°C inkubiert und dann auf 1ml RPMI/12% FCS, enthaltend biologisch abgeleitetes IL2, hinzugegeben. Die Überstände werden nach sieben Tagen auf RT und/oder P24 Levels gegen Kontrollkulturen untersucht. Die höchste Verdünnung, die ± 50% Inhibition erbringt; wird als der Neutralisationstiter bezeichnet.

5) Mukosale Antikörperanalyse

a. Parotissekretion IgA/IgG Titer: Die Titer werden wöchentlich überwacht auf kurzfristigen Immunisationstabellen und monatlich auf langfristige Tabellen. Parotissekretion in anästhesierten (IM Ketamin/Xylazin) Balb/c Mäuse werden mit Pilokarpin (20 μg pro Maus) induziert und die Speichelflüssigkeit an festgelegten Tagen mit einer Pasteurpipette eingesammelt. Eine Analyse einer zweifachen seriellen Verdünnung wird mit einer Dot Blot Prozedur, wie sie unter 4a oben beschrieben steht, bestimmt. Detektion von spezifischen Antworten auf verschiedene V3 Loop exprimierende Immunogene, Parotissekretionen werden titriert verwendend V3 Loop Peptide, die auf einem Miligen 9050 Peptid Synthesizer durch die F-moc Methode synthetisiert wurden. 1 μg an synthetischem Peptid in 100 μl des Beschichtungspuffers (coating buffer) (0,1 M Bicarbonatpuffer [pH 9,6]) werden auf jedes Feld der Immulon 2 Mikrotiterplatten hinzugegeben und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Die Vertiefungen werden als nächstes drei Mal in phosphatgepufferter Saline (PBS), enthaltend 0,05 Tween 20, gewaschen und dann serienmäßig verdünnte (zweifach) Speichelflüssigkeit auf jede der in dreifacher Ausfertigung vorliegenden Vertiefungen hinzugegeben. Nach der Inkubation für zwei Stunden bei 37°C werden die Vertiefungen drei Mal mit dem Waschpuffer gewaschen. Als nächstes wird ziegen-anti-maus-Immunoglobulin A oder G (spezifisch für die schwere und leichte Ketten), welches an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist, bei einer Verdünnung von 1 : 1000 hinzugeben und für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Nachdem die Vertiefungen fünf Mal mit PBS, enthaltend 0,05 Tween 20, gewaschen wurden wird das Substrat 2, 2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolinsulfonat) (ABTS) hinzugeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte (OD) von jeder Vertiefung wird an einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay Reader (ELISA) bei 410 nm abgelesen. Für detailliertere Beschreibungen der Prozeduren und der Analyse wird auf die Referenzen 143–145 verwiesen.
b. Immunozytochemie: Fünf Mikrometer gefrorene Schnitte werden von schockgefrorenen (flüssigem Stickstoff) Lungen-, Darm-, Jejunum- und Vaginalgeweben von genetisch immunisierten Mäusen aufbereitet, verwendend eine gekühlte Mikrotom und an Standard Siliziumglasträger gebunden. Um mukosale Antikörper spezifisch für HIVenv Determinanten nachzuweisen, ist jeder Schnitt für 30 Min. in einer 1 : 100 Verdünnung von H9/IIIB Zell-Lysat (1 : 100 RIPA Tris-Saline) inkubiert worden. Die Schnitte sind umfassend mit TE Puffer gewaschen worden und mit 100 μl einer 1 : 100 Verdünnung von HIVIG inkubiert worden. Die Bindung von humanem Ig (HIVIG) ist detektiert worden nach umfassendem Waschen in TE Puffer mit einem ziegen-anti-humanen IgG Antiserum, welches an Alkalin Phosphatase gekoppelt ist, und mit BCIP/NBT Detektion von maus-anti-HIV mukosalen Antikörpern in Lunge- und Vaginalschnitten und ziegen-anti-humanen IgG Antiserum, welches mit Fluorescein für die Detektion von anti-HIV mukosalen Antikörpern in Jejunum und Colon gekoppelt ist, umhüllt worden. Mukosale IgA und IgG Antikörper werden in gefrorenen Schnitten visualisiert durch Verwendung eines ziegen-anti-Maus IgA, welcher mit Alkalin Phosphatase oder Fluorescein gekoppelt ist.

6) Analyse von Zytotoxischer Lymphozytenaktivität gegen HIV exprimierende Ziele (CTLenv)
CTLenv wird quantifiziert unter Verwendung der Hu/D^d Zellinie, welche mit primären HIV Isolaten infiziert wurde, oder in der mausartigen Bcenv Linie (HIV exprimierend), wie zuvor unter "Zusammenfassung der Ergebnisse" beschrieben wurde. Nicht infizierte Hu/D^d und entsprechend Bcgal (b Galactosidase exprimierend) werden als Kontrollen verwendet. Zielzellen werden intrazellulär beladen mit ⁵¹Cr durch Inkubation für 45 Min. unter 5% CO₂ 1,5 × 10⁶ Zellen in RPMI 1640 mit 150 μl Na₂ ⁵¹CrO₄ in PBS (1 mCi/ml, spezifische Aktivität 400–1200 Ci des Cr pro Gramm von DuPont/NEN). Markierte Zellen werden in kaltem RPMI/10% FCS drei Mal gewaschen und für die Zytotoxizitätassays auf Eis gehalten. Mausmilz mononukleare Zellen, die durch Hypaque-Ficol isoliert wurden, werden den Zielzellen hinzugegeben (10⁴ Zellen in 100 μl RPMI 1640/10%FCS) bei einem Effektor: Zielverhältnis von 100 : 1, 50 : 1, 25 : 1 und 12 : 5,1, bei 37°C unter 5% CO₂ für vier Stunden inkubiert, zentrifugiert und 100 μl in einem Gammazähler abgezählt. Die Kontrollzielzellen sind mit 5% Triton X-100 lysiert worden, um maximale Freisetzungswerte zu erhalten und die Zytotoxizität ist errechnet worden durch % Zytotoxizität -\lf (exptl Freisetzung – spontane Freisetzung, maximale Freisetzung – spontane Freisetzung) × 100.
7) Analyse der Persistenz von transfizierten DNSenv in Geweben
Primäres Transfektionsseitengewebe wird abgeerntet als eine Funktion der Zeit, folgend der Transfektion und Aliquots in 1% Triton X-100, 10mM Tris und 1mM EDTA lysiert, bei 1000 × g zentrifugiert, um unlösliche Trümmer zu entfernen und der Überstand wurde entfernt und bei 100°C für 5 Min. erhitzt. Zur Analyse der DNSenv wird die PCR Amplifikation der V3–V5 Regionen verwenden, unter Einsatz von EDS (5'-ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTG) und ED12 (5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCCAAGAACCCAAG) Primer, welcher ein 1200 by DNS Produkt erbrachte, das -bp6160-7358 entspricht. Die Standardbedingungen für dieses Genprodukt in einem 50 μl Volumen ist 35 Zyklen mit einer Sekunde Auslaufzeiten zwischen den Schritten von 94°C für 60 Sekunden, 55°C für 60 Sekunden und 72°C für 120 Sekunden mit zyklischen Initiierungen folgend einer Fünfminuten-Inkubation bei 95°C und einem Wax Bead "hot start". Die PCR Reaktion verwendet 0,2 μM von jedem Primer in 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 200 μM von jedem dNTP, 2,5 U Taq DNS Polymerase und 1,5 mM MgCl. Zwei bis zehn μl des Zell-Lysates ist also als Template verwendet worden. Die amplifizierte DNS ist separiert und identifiziert worden durch Elektrophorese in 1,2% Agarose- oder 6% Polyacrylamidgelen, die in THE Puffer (88 mM Tris-Borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) bei 120 Volt für eine Stunde liefen. Die DNS Banden wurden durch Ethidiumbromidfärbung und UV Licht Detektion identifiziert. Die Primerspezifität ist verifiziert worden durch Verwendung einer pNL4-3 plasmiderhaltenen DNS und dem totalen Genom, welches von ACH-2 Zellen (positive Kontrolle) erhalten wurde.
8) In situ Analyse von DNSenv transfizierten Zelltypen
In situ Hybridisierung einer PCR amplifizierten DNS verwendend eine geeignete Probe mit hoher Spezifität wird die Detektion von transfizierten DNSenv in einer normalen zellulären Architektur erlauben, was ansonsten unentdeckbar gewesen wäre. Biopsieproben von den transfizierten Geweben werden für eine Stunde in einem nicht quervernetzenden, wasserlöslichen Fixiermittel (Strekk Tissue Fixative (STF)) fixiert, in Paraffingewebeblöcken eingebettet, die Schnitte werden an polylysinbeschichten Glasträgern präpariert und für eine routinemäßige H&E Histologie verarbeitet. Zwecks Ausführung einer PCR Amplifikation werden 4 μm Schnitte, enthaltend drei Schnitte pro Träger, vom Paraffin durch aufeinanderfolgendes Waschen in Xylen und stufenweise verdünnte Alkohollösungen befreit. Vom Paraffin befreite Schnitte werden einer Permeabilisierung der Plasmamembranen durch Proteinase K (10 μg/ml für 20 Min. bei Raumtemperatur) unterworfen. Jeder Membranpermeabilisierte (Objekt) Träger wird dann auf ein heißes Gestell (5° > der Schmelztemperaturen der Primer) des Perkin-Elmer In Situ PCR Slide Prep Apparatur plaziert. Zwei Schnitte dienen als Kontrollen (d. h. einem fehlen die Primer und der zweite verwendet eine hausgemachte Genamplifikation, wie ein F-Actin als Positivkontrolle für die Membranpermeabilisation). 35 μl des PCR Mix, enthaltend die passenden Ionen und den pH, der als optimal für die PCR Lösung gefunden wurde (d. h. MgCl₂, KCl, in 10 mM Tris-HCl) und 7,5 Units der Ampli-Taq DNS Polymerase) plus den oben beschriebenen Primer für die PCR Lösung, aber enthaltend ein 5'-Biotin (hergestellt auf dem DNS Cyklon) plus dem Primer für die hausgemachte Kontrolle. Jeder Schnitt wird abgedichtet mit einer wegwerfbaren Plastikkammer und einer externen Metallklemme, die als Kühlkörper dient. Jeder vorbereitete (Objekt) Träger wird sukzessive auf den In Situ PCR Zykler überführt, der an die Temperatur Slide Prep Apparatur gehalten ist und welcher eine Kapazität von zehn (Objekt) Trägern hat. Die Temperatur für die Zykluszeiten sind diejenigen, die vorher etabliert wurden durch Verwendung der PCR Lösung. Diese Prozedur stellt einen hot Start (heißen Start) bereit, zur Minimierung nicht-spezifischer Primerbindungen und Polymeraseabbau während des Prozeduraufbaus. Folgend der in situ Amplifikation von spezifischen DNS-Sequenzen wird die Detektion bereitgestellt durch Streptavidin gekoppelt an Alkalin Phosphatase, um eine spezifische Sequenz der amplifizierten DNS, die 5'-Biotin enthält, zu detektieren. Das wasserlösliche Substrat (Nitrobluetetrazolium und 5-Bromo-4-chloro-3'-Indoylphosphat-p-Toluidin) wird auf der Seite der emzymkatalysierten Substrathydrolyse präzipitiert, was eine blaue Färbung von transfizierten Zellen hervorruft. Diese Technologie kann das Perkin-Elmer In Situ PCR Equipment nutzen.
Hormonale, immunmodulierte peripherale genetische Immunisation (HIPGV)
DOGS/Vitamin D3 geförderte Transfektion.
Zusammenfassung der Ergebnisse
Ausgenommen wenn anderweitig angezeigt, sind die oben beschriebenen Protokolle für die kationischen Lipid/DNS Methoden verwendet worden für die kationischen Lipid/DNS/Vitamin D3 Methoden, die in diesem Beispiel beschrieben sind.
Die vorliegenden Experimente zeigen, daß 1,25(OH)₂D3 als ein molekularer Schalter dient, um mukosale Immunantworten an die systemische Antwort anzuhängen. Wichtiger ist der Hinweis, daß 1,25(OH)₂D3, was an ein förderndes genetisches Immunogen angehängt wird, beides veranlaßt, die Bereitstellung von systemischen und mukosalen Antworten. Verwendend den pCMV-env 160, welcher einen intakten RRE enthält, wurden humorale Antworten durch fördernde Transfektion von Mausmuskel induziert, in welchem 1,25(OH)₂D3 in dem Inokulum enthalten war. Vier von vier Mäusen antworteten bei zwei Wochen mit signifikanten Titer von IgG, IgM und IgA gegen gp160 (Tabelle 5). sIgA Titer wurden weiter untersucht folgend einer fördernden genetischen Immunisierung verwendend 10 μg und 1 μg DNS. Dies wurde weiter als eine Funktion der Anwesenheit oder Abwesenheit von dem RRE analysiert. Alle Inokulate enthielten auch 1 μg 1,25(OH)₂D3.
Ein Tier in der 10 μg DNS Dosis und zwei Tiere in der 1 μg Dosis mit mutiertem RRE entwickelten signifikante IgA Titer in den Parotidsekretionen nach zwei Wochen (d. h. 38% totale Antwortrate). Im Gegensatz dazu entwickelten alle Tiere die eine 10 μg oder 1 μg DNS Dosis erhielten, in welcher das RRE intakt war, IgA Titer gegen gp160 (Tabelle 5). Wenn darüber hinaus das aktivierte Vitamin D3 nicht anwesend ist, wird kein signifikantes sIgA beobachtet in Parotissekretionen trotz guter systemischer Antworten auf die genetische Immunisation (Tabelle 7). Sechs von sieben in der Vitamin D3 Gruppe überschritten die Detektionsgrenze von 1:1250. Auf diese Weise ist eine 100%ige Antwortrate für IgA in Parotidsekretionen (n = 7) beobachtet worden, welche abhängig von der Anwesenheit von 1,25(OH)₂D3 war. IgA Immunpräzipitationanalyse von Parotidsekretionen (10 μl) von einem immunisierten Tier ließ eine relativ starke gp41 Bande erkennen und Tracer von gp160 und gp120, wenn sie mit einer HIVIG Kontrolle verglichen werden. Die Interpretation dieser RIPA Analyse wird durch kleinere Banden in Kontrollparotis und U937 Extrakt, welches Antikörper und seronegatives Mausserum imitiert, kompliziert. Eine kleinere 355 Komponente in U937IIIB Zellen könnte an Protein A in der Abwesenheit von spezifischen Antikörpern/env Protein binden. Andere HIV produzierende Zellinien können untersucht werden, um zu versuchen, dieses Artefakt zu eliminieren.
Tabelle 5. Serum Ig Titer nach 2 Wochen folgend einer IM Verabreichung von 10μg pCHV-Env₁₆₀(+RRE), komplexgebunden mit DOGS plus 1 μg 1,25 (OH)₂D3 bei 6 Monaten alten weiblichen Balb/c Mäusen. Titer wurden erhalten mit einem ELISA, verwendend ein von einem immobilisierten Baculovirus erhaltenes rgp160 Antigen auf Immulon 4 Platten (1 μg/ Vertiefung). Spezifische Bindung des Mausserum Igs wurden quantifiziert mit Biotin-markiertem ziegen-anti-Maus IgG, IgA, and IgM Antiseren. Farbentwicklung verwendet ein Streptavidin-Alkalin Phosphatase Konjugat und entwickelt mit p-Nitrophenylphosphat (PNPP, Pierce Chemical Company) und quantifiziert auf einem 96-Vertiefung Platte Flow Kolorimeter, unter Verwendung eines 414 nm Bandpassfilters. Titer Cut-Offs werden als die höchsten Verdünnungen bezeichnet, die eine mittlere optische Dichte von > 1 S. D. über Hintergrund erbrachten.
Tabelle 6.
Unter Verwendung eines von einem Bakulovirus erhaltenen rpg160, welcher mit Biotin als eine spezifische Gewebeprobe für gp160 Bindungsseiten markiert war, wurden Gewebe auf ein qualitatives Anzeichen für gp160 Bindung an mukosalen Oberflächen untersucht. Organe von Mäusen, die mit CMV-Env160(+RRE) und CMV-Env160(-RRE) durch Muskeltransfektion von DNS/DOGS Komplexen in der Gegenwart von 1 μg 1,25(OH)₂D3 immunisiert wurden, wurden in gepuffertem For malin fixiert, in Paraffin eingebettet, Dünnschnitte auf Glas (Objekt)-träger übertragen und stufenweise in Alkohol vom Paraffin befreit. Die Schnitte wurden eine halbe Stunde rgp160-Biotin ausgesetzt, drei Mal in Tris-HCl, pH 7,2, gewaschen, mit Streptavidin-β-Galactosidase inkubiert, drei Mal gewaschen und mit X Gal (5-Bromo-3 indoyl-β)-galactopyranosid, bei pH 7,6 (Säuger β-Galactosidase ist bei diesem pH inaktiv) für eine halbe Stunde entwickelt. Die Schnitte wurden mit Fast Red kontrastgefärbt.
Ein histochemisches Anzeichen für mukosale Bindungsseiten wurde beobachtet in Lunge, Dick- und Dünndarm und Uterus/Vagina, welche an diesen Orten als sIgR basierend interpretiert wurden. Umfangreiche Markierung ist an der bronchialen Mukosa sowie an den Alveolen gesehen worden. Die gp160 Bindung erstreckt sich über die Zotten des Jejunums runter zu den Krypten. Im Darm ist die Oberfläche auf gp160 Bindung markiert. gp160 Bindung ist anwesend an beiden – Gebärmutter- und Vaginalmukosa. Die Kontrollen bestanden aus anliegenden Gewebeschnitten, in welchen die gp160-Biotinprobe aus dem Inkubationsmedium ausgelassen wurde und natürliche Tiere, in welchen alle Komponenten anwesend waren. Die einzige nicht-spezifische Gewebemarkierung, die detektiert wurde, sind Serosaloberflächen der natürlichen Mäusekontrollen.
Des weiteren wurde das Gewebe zwei Wochen nach Immunisation (Postimmunisation) untersucht. Es gibt eine inflammatorische Antwort an einer Immunisierungsseite mit intensivem mononuklearen Zelleinstrom in einem Bereich eines nekrotischem Muskels, in welchem die Mehrheit der mononuklearen Zellen mit der gp160-Biotinprobe markiert sind.
Zusätzlich zu DOGS wurde der Nutzwert eines zweiten kationischen Lipides (TEDBI) zur Förderung der in vivo DNS Immunisierung untersucht. Tabelle 7 stellt die systemischen Ig Antworten bei Ladungsverhältnissen von 3 : 1 und 4 : 1 (kationisches Lipid : DNS) dar. Dies ist das erste Beispiel für die Befähigung dieses kationischen Lipides die DNS Transfektion in vivo zu fördern. Tabelle 8 zeigt Ig Antworten auf TEDBI Dosen, komplexgebunden an DNS.
Titer
Titer
Allgemeine experimentelle Konzeption
Basierend auf die vergleichenden Daten der Induktion von mukosalen Antworten durch drei unterschiedliche Methoden der genetischen Immunisation (mukosale Zelltransfektion, ganzheitliche Vakzinierung und HIPGV) scheint HIPGV die wirksamste zu sein. HIPGV verwendet eine fördernde Transfektion von Muskelzellen, in welchen die HIV Hüllsequenzen in einer Weise auf der Zelloberfläche exprimiert werden, die analog HIV-infizierten Zellen ist. Das hormonelle Adjuvant – 1,25(OH)₂D3 – scheint als ein molekularer Schalter zu fungieren, was in einen Verkehr von HIV-spezifischen B-Zellen, die als IgA sezernierende Plasmazellen an die Mukosa in einer allgemeinen mukosalen Antwort übergeben werden, mündet. Es ist vernünftig anzunehmen, daß ein ähnliches Phänomen für T-Zellen existiert, die dafür bestimmt sind, zytotoxische Funktionen zu vermitteln. Hoffmann-LaRoche hat 5 mg eines synthetischen 1,25(OH)₂D3 zur Verfügung gestellt, welches identisch ist zu dem, welches von Dayne und Arranes verwendet wurde. Dies ist ausreichend für 5000 genetische Immunisationen bei Mäusen mit dem momentanen Protokoll. Neun genetische Vakzine von HIV-Hüllen wurden konstruiert (Tabelle 3) unter der Kontrolle des CMV frühen Promotors. CMV_env160 enthält die ganze Länge von gp160, enthaltend die Leadersequenzen, gp120/gp41 Proteolyseseite, intaktes ARE, Enhancingdomäne und die Membranankersequenz. CMV env1R160 ist identisch mit CMV env160 mit Ausnahme das es eine vier Aminosäurendeletion an der Proteolyse (-seite) enthält, was das gp160 Molekül resistent gegen Proteolyse macht. Der Rest (n = 7) der genetischen Konstrukte der HIV-Hülle sind identisch zu CMV env160 mit der Ausnahme, daß sie Deletionen oder Punktmutationen in der Enhancingdomäne (verstärkende Domäne) enthalten. Abhängig von ihren Wirksamkeiten als genetische Immunogene und der Wirksamkeit von CMV env1R160 wird eine oder mehrere dieser Mutationen an der Enhancingdomänen in den gegen Proteolyse resistenten Mutanten hergestellt. Durch die Inhibierung der Proteolyse und des gp120 Sheddings von transfizierten Zellen können die Antworten auf gp120 verstärkt werden, während die Stärke der gp41 Antworten beibehalten wird. Durch Einführung von Mutationen der Enhancingdomäne in solch einen Konstrukt können vorteilhafte funktionelle Antworten auf beide, gp120 und gp41, maximiert werden, während schädliche funktionelle Antworten auf die Enhancingdomäne minimiert sind. Obwohl die initialen Bemühungen, welche sich an den Hüllsequenzen der NL4-3 Isolate fokussierten, die die Untersuchung der Mechanismen und der Genetik von genetisch induzierten mukosalen Immunantworten erlauben wird, können gp160 Hüllsequenzen, die von primären Isolaten aus mukosalen neuinfizierten Subjekten gewonnen werden, verwendet werden. Diese Betrachtungen haben zu den folgenden Zielsetzungen und ihrer experimentellen Konzeption geführt:
1) Quantifizierung der IgA in Parotissekretionen
Es ist wünschenswert, die Konzentration von IgA in Parotis-, Jejunum-, Colon-, rektal und uteral/vaginal Sekretionen im Vergleich zu systemischen Ig zu quantifizieren als eine Funktion der Zeit und der Konzentration von pCMW Vektoren enthaltend verschiedene HIV-env_NL4-3 Einschübe (inserts). Unter Verwendung von 1 μg 1,25(OH)₂D3 als das etablierte homornelle Adjuvant sind Parotis IgA und IgG Titer überwacht worden, um den Gipfel und die Dauer der primären IM genetischen Vakzinierung zu ermitteln. Basierend auf diesen Daten ist eine größere Tiergruppe etabliert worden, um Tieropfer über die Zeit mit einer Quantifizierung der jejunalen, colonalen und uteralen/vaginalen mukosalen IgA Konzentrationen sowie Parotis zu ermöglichen. Die kürzlich publizierte Technik des Neutra Labors (188), bei welcher ein polyfiltrierender Docht verwendet wird, um die mukosalen Sekretionen (> 90% IgA Ausbeute) aufzunehmen, wird eingesetzt werden. Aufgenommenes Ig wird mit PBS eluiert und bei 16000 X g zentrifugiert, um eine maximale Extraktion zu gewährleisten. Eluiertes IgA, welches primär sIgA und IgG darstellt, wird quantifiziert mit einem ELISA Assay (siehe spezifische Verfahren).
2) Verstärkung der mukosalen sIga Antworten
Methoden zur Erhöhung der rektalen und uteralen/vaginalen mukosalen SIgA Antworten, folgend einer primären HIPGV gegen HIV-Hüllen, können routinemäßig evaluiert werden. Soweit die optimalen Bedingungen zur Erhaltung von mukosalen Immunantworten mit einer primären HIPGV definiert sind, kann das Boosten rektale und uterale/vaginale mukosale Antworten durch lokale (direkte mukosale) Verabreichung von Antigen (gp160) und durch Förderung der Transfektion von rektaler und uteraler/vaginaler Mukosa mit dem ursprünglichen genetischen Immunogen in einer Weise, die analog zu der ursprünglichen atemwegsgeförderten Transfektionsmethode erfolgt, gemacht werden. Das Grundprinzip in diesem experimentellen Ansatz besteht darin, daß entweder Proteinantigen oder Antigen, welches lokal durch die lokale sekundäre genetische Vakzinierung erzeugt wird, zu einer lokalen amnestischen Antwort führt.
3) Quantifizierung der funktionalen Ab Aktivität
Die funktionellen Antikörperaktivitäten in mukosalen Sekretionen, folgend einer HIPGV und lokaler amnestischer Induktion, kann quantifiziert werden. Mausserum enthält eine kraftvolle HIV Neutralisierungsaktivität, die durch Erhitzen bei 56°C für eine halbe Stunde inaktiviert werden kann. Nachdem ermittelt wird, ob mukosale neutralisierende Aktivitäten in natürlichen Tieren anwesend sind, wird das Standardneutralisationsprotokoll (185) auf mukosale Sekretionen in Mäusen entsprechend angepaßt. p24 und RT Assays in primären humanen PBMC Kulturen können verwendet werden, um Neutralisationstiter zu etablieren. Der Standard verstärkende Assay (enhacing assay), verwendend humanes Komplement, kann an mukosale Sekretionen angepaßt werden. Die Bindungsaktivität von mukosalen IgA und IgG auf ein 35 Aminosäurenpeptid, welches vorher verwendet wurde und die Enhancingdomäne umfaßt (145), kann dazu verwendet werden die Abwesenheit von Enhancingepitopen nachzuweisen.
4) Evaluierung von lymphozyten Subpopulationen
Als eine Funktion der Zeit, folgend einer primären HIPGV, sind lymphozyte Subpopulationen in entwässerten Lymphknoten und an mukosalen Seiten (d. h. intraepithelial und Lamnia propria) Lymphozyten mit HIV-Hüllrezeptoren an der Oberfläche, regulatorische Proteine und relevante Oberflächenadhesionsmoleküle ausgewertet worden. Diese Daten sind relevant, um den Verkehr von HIV-env spezifischen Lymphozyten, induziert durch 1,25(OH)₂D3, und die B-Zellantworten, im Vergleich zu T-Zellantworten, antwortend auf HIPGV, zu verstehen. Die relativen Dichten von B-Zellen, CD4- und CD8-Zellen, als eine Funktion von HIPGV in Formalin fixiertem Gewebe, kann bestimmt werden. In ähnlicher Weise können mukosale Lymphozyten und auf die Anwesenheit von Adhesionsmolekülen untersucht werden, von welchen bekannt ist, daß sie in der mukosalen Zielsuche (mucosal homing), wie z. B. VLA-4α (189, 190), involviert sind. Die Methode von Ni (192) wird eingesetzt werden mit frischem Gewebe, um mukosale Lymphozyten zu isolieren und diese der Standardanalyse durch eine Durchflusszytometry (flow cytomentry) zu unterwerfen.
5) Zelluläre Zytotoxizität gegen HIVenv
Zelluläre Zytotoxizitätaktivitäten gegen HIV-Hüllen exprimierende Balb/c Fibroblasten von der Milz und mukosalen Seiten wurden quantifiziert. Der Hauptpunkt in diesem spezifischen Ziel besteht in der Überwachung von CTL auf Wirkungen, die sekundär zu den mutierten Konstrukten sind. Obwohl die CTL Epitope in Mäusen und Menschen im allgemeinen nicht identisch sein werden, sichert dieser Assay ab, daß die verschiedenen Immunogene nicht die CTL Entwicklung inhibieren werden, wenn er an Menschen praktiziert wird. Wie im Detail in der Zusammenfassung der Ergebnisse beschrieben steht, wird ein Assay gelehrt, welcher die Milz-(splenocyte) CTL Aktivität quantifiziert. Verwendend die Methode von Ni et al. können ausreichend Lymphozyten von mukosalen Stellen isoliert werden die imstande sind, für diesen Assay verwendet zu werden, um zu erkunden, ob CTLs verstärkt werden durch Vitamin D3, welches an mukosalen Stellen anwesend ist.
6) Toxizität von DNS Immunogenen
Die potentielle Toxizität der DNS Immunogene in Bezug auf die Persistenz des genetischen Konstruktes in Muskel als eine Funktion der Zeit, und ob die genetischen Konstrukte in Nicht-Muskelgeweben (Gonaden, Leber, Milz, Lunge etc.) ermittelt werden können, kann bestimmt werden. Ein grundsätzliches Hindernis einer FDA Bewilligung jedes Phase I genetisches Immunogens ist, daß die Tierdaten einen Beleg für die Ungefährlichkeit begründen. Von besonderer Wichtigkeit für die FDA ist der Beweis, daß das genetische Immunogen an der Vakzinierungsseite lokalisiert ist und nicht in Nicht-Muskelseiten gefunden werden kann, insbesondere an Stellen der Gonaden. Eine Vorlage für eine Vektorenmappe wird mit der FDA errichtet werden zum Zwecke der Erlangung von RAC und FDA Bewilligungen.
Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen werden überwacht werden für die Entwicklung von Antikörpern gegen Plasmidvektoren DNS, verwendend ein ELISA Format, in wel chem DNS adhärent ist zu Immulonplatten, wie vorher für Peptidantigene beschrieben wurde, und Albumin blockierte Vertiefungen dem Serum von transfizierten Tieren ausgesetzt sind. Die Antikörperbindung an DNS wird detektiert durch anti-Maus (oder Ratte, Meerschweinchen oder Kaninchen) Ig konjugiert an Alkalin Phosphatase. Die Quantifizierung wird basieren auf Enzymausbeuten minus den Enzymausbeuten von Kontrolltieren unter den Bedingungen von Substratüberschuß (d. h. um eine 0 Kinetik zu erbringen). Mäuse werden die primären Tiere sein zur Evaluierung der Ungefährlichkeit. Abhängig von dem FDA Bescheid wird eine weitere Art als sekundäres Toxizitätstestziel ausgewählt. Die Gewichte während der HIPGV und der insgesamt eingebrachte Standard (standard gross) und die Histopathologie an dem abschließenden Abschluß des experimentellen Protokolls wird an allen Mäusen ausgeführt werden. Zusätzlich wird eine PCR Amplifikation für die HIV-Hüllimunogene an Lunge, Milz, Leber und Gonadengewebe ausgeführt. Diese Prozedur ist gängig mit reproduzierbaren Amplifikationen einer 1200 by Sequenz. Die Identifikation wird durch eine Standardagaroseelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung der amplifizierten DNS zuzüglich Basenleitergrößenmarkierungen hergestellt. Eine FDA anerkannte anti-fos-Gentherapie Phasen I Studie in metastasenbildendem Brustkarzinoma von Holt kann als Modell verwendet werden.
7) Zusätzliche Immunogene
Um relevantere genetische Immunogene der HIV-Hülle von primären Isolaten zu konstruieren, basierend auf die Daten, die mit genetische Immunogene der pNL4-3 HIV-Hülle erzeugt wurden, sind HIV-Hüllsequenzen routinemäßig mit einer PCR in einem p-Alter oder p-CMV Vektor durch 5'-Verlängerung von Restriktionsseiten kloniert worden, für das Klo nieren in eine MCS des Plasmidvektors. Die Klonierung von Hüllsequenzen von den klonierten primären Isolaten können erhalten werden, sobald sie erhältlich sind.
Systemische Antikörperanalyse

a. Ig Titer. Serum Titer von Antikörpern gegen die env Proteine von HIV-1 sind mit einer ELISA Prozedur quantifiziert worden verwendend ein von einem Bakulovirus erhaltenen rgp160 als der auf der Platte immobilisierte Ligand. 10 ng rgp160 (AMAC, Inc.) in 50 μg Coatingpuffer (0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,5) ist auf jede Vertiefung einer 96-Vertiefung Immulonmikrotiterplatte für eine Stunde bei 37°C immobilisiert worden. Die Platte ist mit PBS-0,15% Tween20 drei Mal gewaschen worden und ist dann mit PBS 1% BSA, 0,15% Tween20 bei 300 μg pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert worden, und dann drei Mal mit PBS 0,15% Tween20 gewaschen worden. Serum oder mukosale Sekretionen sind serienmäßig in PBS in einer gesonderten Platte in dreifacher Ausführung verdünnt worden und 50μg von jeder Vertiefung ist auf entsprechende Vertiefungen einer gp160 Ligandenplatte überführt worden und die nachfolgende Sequenz folgte anschließend. Inkubiere bei 37°C für eine Stunde verwendend eine Paraffinabdeckung. Wasche mit PBS 1% FCS 0,05% NaN₃ fünf Mal. Inkubiere jede Vertiefung mit einer vorgegebenen Verdünnung von Biotin konjugiertem anti-Maus IgG, IgA oder IgM. Inkubiere bei 37°C für eine Stunde mit der Abdeckung. Wasche mit PBS-1% FCS-0,05% NaN₃ fünf Mal. Schließe an mit 50 μg Streptavidin-Alkalin Phosphatase Konjugat (1 : 200 in PBS-1% BSA-0,15% Tween20) für eine Stunde bei 37°C mit der Abdeckung. Wasche fünf Mal mit PBS-16 FCS-0,05% NaN₃. Die Farbe wird entwickelt mit p-Nitrophenylphosphat in Glycinpuffer bei pH 9,6. Die Farbausbeute wird gemessen an einem Flow Mikrotiter Colorimeter verwendend einen 405 nm Filter. Der Hintergrund ist routinemäßig < 0,23 mit einer Reproduzierbarkeit von < ± 0,0005). Der Endpunkttiter ist die höchste Verdünnung von dem Serum oder der Sekretion, die eine Farbausbeute > 150 über den Hintergrund (n = 3) ergibt.

Mukosale Antikörperanalyse

a. Analyse von jejunalen, colonalen und uteralen/vaginalen Sekretionen für IgA/IgG: Die Sekretionen werden auf polyfiltrierenden absorbierenden Dochtfiltern, wie kürzlich von dem Neutra Laboratorium (188) beschrieben wurde, eingesammelt. IgA und IgGs, eluiert von den Dochten, werden durch die vorliegende ELISA Prozedur untersucht.
b. Immunozytochemie: rgp160 konjugiert mit Biotin (AMAC, Inc.) wurde verwendet als eine spezifische Probe für Gewebe, das gebunden war an Antikörper/Rezeptoren, die durch die vorliegende genetische Immunisationsprozeduren erzeugt wurden. Die Prozedur kann verwendet werden entweder für gefrorene oder formalinfixierte Gewebe. Dünne Schnitte werden mit 250 μl des biotinilierten Liganden (10 ng/ml) für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und zwei Mal mit PBS gewaschen. 250 μl der Streptavidin-β-Galactosidase (Kirkegaard & Perry Labors) in 100 mM Tris, pH 7,4 wird auf den Schnitt für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur aufge tragen und zwei Mal mit PBS gewaschen. Die Farbe wird entwickelt bei pH 7,6 verwendend X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3 indoyl-β)-Galactopyranosid als Substrat (Histomark Kit von K&P Laboratorien), welches ein azurblaues Präzipitat abgibt auf der Seite des gebundenen Enzyms. Typischerweise wird ein benachbarter, nicht dem Liganden ausgesetzter Schnitt als eine Kontrolle für eine nicht-spezifische Produkteinlagerung verwendet, ebenso wie Schnitte von einem natürlichen Tier, das dem Liganden ausgesetzt war.

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Claims

Verwendung von Vitamin D3 und einer Antigen-dekodierenden DNS, wobei die DNS mit einem die Transfektion fördernden kationischen Lipid komplexgebunden ist, zur Herstellung eines Medikamentes zum Induzieren einer mukosalen Immunantwort.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das kationische Lipid aus der Gruppe Lipospermin, Lipospermidin oder Dioctadecylamidoglycylspermin gewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNS ein Hüllantigen oder ein hüllverbundenes Antigen dekodiert.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die DNS ein Hüllantigen dekodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Vitamin D3 1,25(OH)₂D3 ist.
Zusammensetzung, welche Vitamin D3 und eine Antigendekodierende DNS enthält, wobei die DNS mit einem die Transfektion fördernden kationischen Lipid komplexgebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das kationische Lipid aus der Gruppe Lipospermin, Lipospermidin oder Dioctadecylamidoglycylspermin gewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die DNS ein Hüllantigen oder ein hüllverbundenes Antigen dekodiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, Verwendung nach Anspruch 3, wobei die DNS ein Hüllantigen dekodiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Vitamin D3 1,25(OH)₂D3 ist.