JP2000312586A - Imparting of resistance against weed-controlling agent - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for importing resistance against a weed- controlling agent to a plant by directly transducing a gene into a plant cell which codes for a protein which specifically binds to a substance involved in a weed-controlling action of a weed-controlling agent, does not have an ability of denaturing it, and does not contain an immunoglobulin variable region. SOLUTION: This is a method for importing resistance to a plant against a weed-controlling agent such as protoporphyrinogen IX oxidase inhibiting herbicides which inhibit or suppress porphyrin synthesis of the plant by linking to a promotor and a terminator which are functionable in a plant cell in a funcitonable form, a gene coding for the protein which specifically binds to a substance involved in the weed-controlling action of the weed-controlling agent, does not have an ability of denaturing it to the specifically binding substance, and does not substantially contains a frame work region of an immunoglobulin variable region, followed by transducing the obtained gene into a plant cell for expression.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明が属する技術分野】本発明は、植物に雑草防除剤
に対する耐性を付与する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for imparting resistance to a weed control agent to a plant.

【０００２】[0002]

【従来の技術】雑草防除は作物の収量向上や高品質化を
図るうえで重要な作業であり、この目的の為に主として
除草剤が使用されている。ところが、除草剤等の雑草防
除剤の使用場面において、作物と近縁の雑草とを明確に
区別して、雑草のみを選択的に防除することは困難な場
合が多いことから、雑草防除剤に対して耐性を有する作
物の作出が試みられ、一部で実用化されるに至ってい
る。近年、このような雑草防除剤耐性作物の作出に遺伝
子工学的手法が用いられている。そのような手法として
は、例えば、グリフォセートの標的酵素である5-エノー
ルピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(5-enolpyruvyls
hikimate-3-phosphate synthase、以下、EPSPSと記
す。)の遺伝子に変異を加え、該遺伝子を栽培植物に導
入することによってグリフォセート耐性植物を作出する
方法が知られている[Hinchee,M.A.W. et al., BIO/TECH
NOLOGY, 6: p915 (1988)]。また、例えば、グリフォシ
ネートをアセチル化する酵素であるフォスフィノスリシ
ンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子を栽培植物に導
入することによってグリフォシネート耐性植物を作出す
る方法も知られている[Block,M.D.et al., EMBO J., 6;
p2513 (1987)]。2. Description of the Related Art Weed control is an important operation for improving crop yield and quality, and herbicides are mainly used for this purpose. However, in the use of weed control agents such as herbicides, it is often difficult to clearly distinguish crops from closely related weeds and selectively control only weeds. Attempts have been made to produce highly resistant crops, and some of them have been put to practical use. In recent years, genetic engineering techniques have been used to produce such crops resistant to weed control agents. Examples of such a technique include, for example, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (5-enolpyruvyls), which is a glyphosate target enzyme.
hikimate-3-phosphate synthase, hereinafter referred to as EPSPS. ) Is known to produce a glyphosate-tolerant plant by introducing the gene into a cultivated plant [Hinchee, MAW et al., BIO / TECH].
NOLOGY, 6: p915 (1988)]. Further, for example, a method of producing a glyphosinate-resistant plant by introducing a gene for phosphinothricin acetyltransferase, which is an enzyme for acetylating glyphosinate, into a cultivated plant is also known [Block, MD et al. , EMBO J., 6;
p2513 (1987)].

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな手法による雑草防除剤耐性植物の作出は未だ十分と
は言い難く、植物に雑草防除剤耐性を付与する為の新た
な方法の開発が望まれている。However, the production of plants resistant to a weed-controlling agent by such a technique is not yet sufficient, and it is desired to develop a new method for imparting plant-resistant weed-controlling agents. ing.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、ある種のタンパク質を
植物の細胞で産生させることにより、植物に雑草防除剤
耐性を付与することが可能であることを見出し本発明に
至った。即ち、本発明は、 １）雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する方法であ
って、下記(1)、(2)および(3)の性質を有するタンパク
質をコードする遺伝子を植物の細胞に導入し発現させる
工程を含むことを特徴とする方法(以下、本発明方法１
と記す。) (1)該雑草防除剤の雑草防除作用に関わる物質に特異的
に結合する。 (2)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ２）タンパク質が、雑草防除剤に有効成分として含まれ
る物質に特異的に結合する性質を有するタンパク質であ
る前項１）記載の方法、 ３）タンパク質が、植物細胞内で雑草防除剤の雑草防除
活性発現に関わる植物細胞内因性物質に特異的に結合す
る性質を有するタンパク質である前項１）記載の方法、 ４）雑草防除剤が、植物のポルフィリン生合成を阻害も
しくは抑制する雑草防除剤である前項１）〜３）記載の
方法、 ５）雑草防除剤が、プロトポルフィリノーゲンIXオキシ
ダーゼ阻害型除草剤である前項１）〜４）記載の方法、 ６）タンパク質がプロトポルフィリンIXに特異的に結合
する性質を有するタンパク質である前項１）、３）、
４）または５）記載の方法、 ７）タンパク質が、マグネシウムケラターゼのプロトポ
ルフィリンIX結合サブユニットタンパク質であるか、ま
たは該タンパク質の改変タンパク質であってプロトポル
フィリンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク質
である前項１）、３）、４）、５）または６）記載の方
法、 ８）タンパク質が、配列番号５１、配列番号５３、配列
番号５５、または配列番号５７で示されるアミノ酸配列
を含むタンパク質である前項１）、３）、４）、５）ま
たは６）記載の方法、 ９）タンパク質がプロトポルフィリノーゲンIXに特異的
に結合する性質を有するタンパク質である前項１）、
３）、４）または５）記載の方法、 １０）タンパク質が、プロトポルフィリノーゲンIXオキ
シダーゼの改変タンパク質であって、プロトポルフィリ
ノーゲンIXに対する酸化能を持たずプロトポルフィリノ
ーゲンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク質で
ある前項１）、３）、４）、５）または９）記載の方
法、 １１）タンパク質が、プロトポルフィリノーゲンIXオキ
シダーゼの改変タンパク質であって、プロトポルフィリ
ノーゲンIXに対する酸化能を持たずプロトポルフィリノ
ーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤に有効成分として含
まれる物質に特異的に結合する性質を有するタンパク質
である前項１）、２）、４）、５）または９）記載の方
法、 １２）タンパク質が、コプロポルフィリノーゲンIIIオ
キシダーゼの改変タンパク質であって、プロトポルフィ
リノーゲンIXおよびコプロポルフィリノーゲンIIIに対
する酸化能を持たず、プロトポルフィリノーゲンIXに特
異的に結合する性質を有するタンパク質である前項
１）、３）、４）、５）または９）記載の方法、 １３）雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する方法で
あって、下記(1)、(2)および(3)の性質を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子を植物の細胞に導入し発現させ
る工程を含むことを特徴とする方法、(以下、本発明方
法２と記す。) (1)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (2)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持た
ない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 １４）雑草防除剤が、植物のポルフィリン生合成を阻害
もしくは抑制する雑草防除剤である前項１３）記載の方
法、 １５）雑草防除剤が、プロトポルフィリノーゲンIXオキ
シダーゼ阻害型除草剤である前項１３）または１４）記
載の方法、 １６）タンパク質がマグネシウムケラターゼであるか、
または該タンパク質の改変タンパク質であってプロトポ
ルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク
質である前項１３）〜１５）記載の方法、 １７）タンパク質がフェロケラターゼであるか、または
該タンパク質の改変タンパク質であってプロトポルフィ
リンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク質であ
る前項１３）〜１５）記載の方法、 １８）タンパク質が４以上１００以下のアミノ酸からな
るタンパク質である前項１３）〜１５）記載の方法、 １９）雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する方法で
あって、下記(1)、(2)および(3)の性質を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子を植物の細胞に導入し発現させ
る工程を含むことを特徴とする方法、(以下、本発明方
法３と記す。) (1)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (2)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を持
つ。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。 ２０）雑草防除剤が、植物のポルフィリン生合成を阻害
もしくは抑制する雑草防除剤である前項１９）記載の方
法、 ２１）雑草防除剤が、プロトポルフィリノーゲンIXオキ
シダーゼ阻害型除草剤である前項１９）または２０）記
載の方法、 ２２）タンパク質がコプロポルフィリノーゲンIIIオキ
シダーゼであるか、または該タンパク質の改変タンパク
質であってプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合
する性質を有するタンパク質である前項１９）〜２１）
記載の方法、 ２３）前項１）〜２２）記載の方法により雑草防除剤耐
性を付与された植物、 ２４）前項２３）記載の植物を増殖させることを特徴と
する雑草防除剤耐性植物の製造方法、 ２５）前項２３）記載の植物の栽培域に雑草防除剤を散
布する雑草防除方法、 ２６）前項２３）記載の植物の栽培域に雑草防除剤を散
布する雑草防除剤耐性植物の選抜方法、 ２７）前項２３）記載の植物の細胞の培養域に雑草防除
剤を添加する雑草防除剤耐性植物細胞の選抜方法、を提
供するものである。Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, by imparting a certain type of protein to plant cells, the plant is imparted with a weed controlling agent resistance. The inventors have found that this is possible and have led to the present invention. That is, the present invention provides 1) a method for imparting resistance to a weed control agent to a plant, which comprises introducing a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) into plant cells: (Hereinafter referred to as Method 1 of the present invention)
It is written. (1) It specifically binds to a substance related to the weed controlling action of the weed controlling agent. (2) The protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 2) the method according to the above 1), wherein the protein is a protein having a property of specifically binding to a substance contained as an active ingredient in the weed controlling agent; 3) the weed controlling activity of the weed controlling agent in a plant cell; 1) The method according to the above 1), which is a protein having a property of specifically binding to an endogenous plant cell involved in expression; 4) The weed controlling agent is a weed controlling agent that inhibits or suppresses porphyrin biosynthesis in plants. 1) to 3), 5) the method according to 1) to 4), wherein the weed control agent is a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide, 6) the protein specifically binds to protoporphyrin IX 1), 3), which are proteins having the property of
4) or the method according to 5), 7) the protein is a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase, or is a modified protein of the protein and has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 1), 3), 4), 5) or 6), wherein the protein comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, or SEQ ID NO: 57 The method according to the above 1), 3), 4), 5) or 6), wherein the protein is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrinogen IX;
3) The method according to 4) or 5), 10) the protein is a modified protein of protoporphyrinogen IX oxidase, and has no ability to oxidize protoporphyrinogen IX and specifically to protoporphyrinogen IX 1), 3), 4), 5) or 9), wherein the protein is a protein having the property of binding, 11) the protein is a modified protein of protoporphyrinogen IX oxidase, and the protein is protoporphyrinogen IX. (1), (2), (4), (5), or (9), which is a protein that has no property of oxidizing the protein and specifically binds to a substance contained as an active ingredient in a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide 12) The protein is a modified protein of coproporphyrinogen III oxidase. 1), 3), 4), 5) or 9 which is a protein that does not have the ability to oxidize protoporphyrinogen IX and coproporphyrinogen III and has the property of specifically binding to protoporphyrinogen IX. 13) A method for imparting resistance to a weed control agent to a plant, which comprises introducing a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) into plant cells: A method characterized by including a step of causing expression (hereinafter, referred to as method 2 of the present invention). (1) Specific binding to protoporphyrin IX. (2) It does not have the ability to transform protoporphyrinogen IX. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 14) The method according to the above 13), wherein the weed controlling agent is a weed controlling agent that inhibits or suppresses porphyrin biosynthesis of a plant; ) Or the method of 14), 16) whether the protein is magnesium keratase,
Or 13) to 15), wherein the protein is a modified protein of the protein and has a property of specifically binding to protoporphyrin IX; 17) the protein is ferrochelatase, or a modified protein of the protein; The method according to the above 13) to 15), which is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrin IX, and 18) the method according to the above 13) to 15), wherein the protein is a protein consisting of 4 to 100 amino acids. Method 19) A method for imparting resistance to a weed control agent to a plant, comprising the step of introducing a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) into a plant cell and expressing the gene: (Hereinafter referred to as Method 3 of the present invention). (1) Specific binding to protoporphyrinogen IX To. (2) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 20) The method according to the above item 19), wherein the weed controlling agent is a weed controlling agent that inhibits or suppresses plant porphyrin biosynthesis; 22) The method according to 19), wherein the protein is coproporphyrinogen III oxidase or a modified protein of the protein, which is a protein having a property of specifically binding to protoporphyrinogen IX. ) To 21)
23) A plant to which weed control agent resistance has been imparted by the method according to any one of 1) to 22), 24) A method for producing a plant resistant to weed control, which comprises growing the plant according to 23). 25) a method for controlling weeds, which comprises spraying a weed controlling agent on the cultivation area of the plant according to the above item 23); 27) A method for selecting a plant cell resistant to a weed controlling agent, which comprises adding a weed controlling agent to the culture area of the plant cell according to the above item 23).

【０００５】[0005]

【発明の実施形態】以下、さらに詳細に本発明を説明す
る。本発明において、雑草防除剤としては、除草剤、植
物生長調節剤等があげられる。かかる除草剤としては、
有効成分として、光合成における電子伝達を阻害する化
合物、カロチノイド生合成を阻害する化合物、ポルフィ
リン生合成を阻害する化合物、アミノ酸生合成を阻害す
る化合物、脂質生合成を阻害する化合物、細胞壁の生合
成を阻害する化合物、タンパク質、核酸もしくは細胞分
裂に影響を与える化合物またはオーキシン拮抗作用を有
する化合物を含有する組成物等があげられる。より具体
的には、ポルフィリン生合成を阻害する化合物として
は、プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ(protopo
rphyrinogen IX oxidase; EC 1.3.3.4。以下、ＰＰＯと
記す。)の活性を阻害する化合物（以下、ＰＰＯ阻害型
除草性化合物と記す。）等をあげることができる。ま
た、光合成における電子伝達を阻害する化合物として
は、光化学系IもしくはIIを阻害する化合物、プラスト
キノン生合成系の上流に位置する4-ヒドロキシピルビン
酸ジオキシゲナーゼ(4-hydroxyphenyl pyruvate dioxyg
enase; EC 1.13.11.27。以下、4-HPPDと記す。)を阻害
する化合物等をあげることができる。カロチノイド生合
成を阻害する化合物としては、例えば、フィトエンデサ
チュラーゼ(phytoene desaturase、以下、PDSと記す。)
を阻害する化合物等をあげることができる。アミノ酸生
合成を阻害する化合物としては、EPSPSを阻害する化合
物、アセト乳酸合成酵素(acetolactatesynthase; EC 4.
1.3.18。以下、ALSと記す。)を阻害する化合物、グルタ
ミン合成酵素(glutamine synthetase; EC 6.3.1.2。以
下、GSと記す。)を阻害する化合物、または、ジヒドロ
プテロイン酸合成酵素(dihydropteroate synthase; EC
2.5.1.15。以下、DHPと記す。)を阻害する化合物等をあ
げることができる。脂質生合成を阻害する化合物として
は、例えば、アセチルCoAカルボキシラーゼ(acetylCoA
carboxylase; EC 6.4.1.2。以下、ACCと記す。)を阻害
する化合物等をあげることができる。細胞***に影響を
与える化合物としては、具体的には、微小管の形成を阻
害する化合物等をあげることができ、細胞壁の生合成を
阻害する化合物としては、具体的には、セルロース合成
を阻害する化合物等をあげることができる。植物生長調
節剤としては、有効成分として、細胞の伸長や分化を促
す植物ホルモンに拮抗する作用を有する化合物等、具体
的には例えば、2,4-D、フェノキシアルカンカルボン
酸、安息香酸またはピコリン酸などの誘導体を含む組成
物等を挙げることができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. In the present invention, examples of the weed control agent include a herbicide, a plant growth regulator and the like. Such herbicides include:
As active ingredients, compounds that inhibit electron transfer in photosynthesis, compounds that inhibit carotenoid biosynthesis, compounds that inhibit porphyrin biosynthesis, compounds that inhibit amino acid biosynthesis, compounds that inhibit lipid biosynthesis, and cell wall biosynthesis Examples include compounds that inhibit compounds, proteins, nucleic acids, or compounds that affect cell division, or compositions containing compounds that have auxin antagonism. More specifically, compounds that inhibit porphyrin biosynthesis include protoporphyrinogen IX oxidase (protopo
rphyrinogen IX oxidase; EC 1.3.3.4. Hereinafter, it is described as PPO. )) (Hereinafter referred to as PPO-inhibiting herbicidal compounds). Compounds that inhibit electron transfer in photosynthesis include compounds that inhibit photosystem I or II, and 4-hydroxypyruvate dioxygenase (4-hydroxyphenyl pyruvate dioxygase) located upstream of the plastoquinone biosynthesis system.
enase; EC 1.13.11.27. Hereinafter, it is referred to as 4-HPPD. ) Can be exemplified. Examples of the compound that inhibits carotenoid biosynthesis include phytoene desaturase (hereinafter, referred to as PDS).
And the like, which inhibit the activity. Compounds that inhibit amino acid biosynthesis include compounds that inhibit EPSPS, acetolactates synthase (EC 4.
1.3.18. Hereinafter, it is referred to as ALS. ), A compound that inhibits glutamine synthetase (EC 6.3.1.2; hereinafter referred to as GS), or a compound that inhibits dihydropteroate synthase (EC).
2.5.1.15. Hereinafter, it is referred to as DHP. ) Can be exemplified. Compounds that inhibit lipid biosynthesis include, for example, acetyl-CoA carboxylase (acetylCoA
carboxylase; EC 6.4.1.2. Hereinafter, it is referred to as ACC. ) Can be exemplified. Specific examples of compounds that affect cell division include compounds that inhibit microtubule formation, and specific examples of compounds that inhibit cell wall biosynthesis include cellulose synthesis. And the like. As a plant growth regulator, as an active ingredient, a compound having an action of antagonizing a plant hormone that promotes cell elongation or differentiation, specifically, for example, 2,4-D, phenoxyalkanecarboxylic acid, benzoic acid or picoline A composition containing a derivative such as an acid can be used.

【０００６】本発明において、雑草防除剤の雑草防除作
用に関わる物質（以下、本物質と記す。）とは、雑草防
除剤に有効成分として含まれる化合物、および、雑草防
除剤が植物に施用された際に植物細胞内で該雑草防除剤
の雑草防除作用発現に関わる植物細胞内因性物質を意味
する。雑草防除剤に有効成分として含まれる化合物とし
ては、除草剤、植物生長調節剤等に含まれる上記のよう
な化合物をあげることができる。具体的には、例えばＰ
ＰＯ阻害型除草性化合物としては、Duke, S.O., Rebei
z, C.A. ACS Symposium Series 559, Porphyric Pestic
ides, Chemistry, Toxicology, and Pharmaceutical Ap
plications. American Chemical Society, Washington
DC (1994)等に記載の化合物等があげられる。ＰＰＯ阻害
型除草性化合物は多くの異なる構造の分子種を包含し[D
uke et al., Weed Sci. 39: p465(1991); Nandihalli e
t al.、Pesticide Biochem. Physiol. 43: p193(1992);
Matringe et al., FEBS Lett. 245: p35(1989); Yanas
e, Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: p70(198
9)]、具体的には、ジフェニルエーテル〔例えばクロル
メトキシニル、ビフェノックス、クロルニトロフェン(C
NP)、アシフルオルフェン{5-[2-クロロ-4-(トリフルオ
ロメチル)フェノキシ]-2-ニトロ安息香酸}、アシフルオ
ルフェンのエチルエステル、アシフルオルフェン-ソデ
ィウム、オキシフルオルフェン[2-クロロ-1-(3-エトキ
シ-4-ニトロフェノキシ)-4-トリフルオロメチルベンゼ
ン]、オキサジアゾール〔例えばオキサジアゾン｛3-[2,
4-ジクロロ-5-(1-メチルエトキシ)フェニル]-5-(1,1-ジ
メチルエチル)-1,3,4-オキサジアゾール-2 (3H)-オ
ン）}〕、環状イミド〔例えば S-23142[N-(4-クロロ-2-
フルオロ-5-プロパギルオキシフェニル)-3,4,5,6-テト
ラヒドロフタルイミド]、クロロフタリム［N-(4-クロロ
フェニル)-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド］〕、フ
ェニルピラゾール〔例えば TNPP-エチル{エチル 2-[1-
(2,3,4-トリクロロフェニル)-4-ニトロピラゾリル-5-オ
キシ]プロピオネート}〕、ピリジン誘導体〔例えば LS8
2-556［N3-(1-フェニルエチル)-2,6-ジメチル-5-プロピ
オニルニコチンアミド］〕、フェノピレート、フェノピ
レートの O-フェニルピロリジノカルバメート類似体、
フェノピレートのピペリジノカルバメート類似体等であ
る。In the present invention, the substance related to the weed controlling action of the weed controlling agent (hereinafter, referred to as the present substance) is a compound contained as an active ingredient in the weed controlling agent and a compound which is applied to a plant. Means a plant cell endogenous substance involved in the expression of the weed controlling action of the weed controlling agent in the plant cell. Examples of the compound contained as an active ingredient in the weed control agent include the above compounds contained in herbicides, plant growth regulators and the like. Specifically, for example, P
PO inhibiting herbicidal compounds include Duke, SO, Rebei
z, CA ACS Symposium Series 559, Porphyric Pestic
ides, Chemistry, Toxicology, and Pharmaceutical Ap
plications. American Chemical Society, Washington
DC (1994) and the like. PPO-inhibiting herbicidal compounds encompass many different structural molecular species [D
uke et al., Weed Sci. 39: p465 (1991); Nandihalli e
t al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: p193 (1992);
Matringe et al., FEBS Lett. 245: p35 (1989); Yanas
e, Andoh, Pesticide Biochem.Physiol. 35: p70 (198
9)], specifically, diphenyl ethers such as chlormethoxynil, bifenox, chloronitrophen (C
NP), acifluorfen {5- [2-chloro-4- (trifluoromethyl) phenoxy] -2-nitrobenzoic acid}, ethyl ester of acifluorfen, acifluorfen-sodium, oxyfluorfen [2-chloro -1- (3-ethoxy-4-nitrophenoxy) -4-trifluoromethylbenzene], oxadiazole [eg oxadiazone ｛3- [2,
4-dichloro-5- (1-methylethoxy) phenyl] -5- (1,1-dimethylethyl) -1,3,4-oxadiazol-2 (3H) -one)}], cyclic imide [eg S-23142 [N- (4-chloro-2-
Fluoro-5-propargyloxyphenyl) -3,4,5,6-tetrahydrophthalimide], chlorophthalim [N- (4-chlorophenyl) -3,4,5,6-tetrahydrophthalimide]], phenylpyrazole [eg TNPP -Ethyl {ethyl 2- [1-
(2,3,4-trichlorophenyl) -4-nitropyrazolyl-5-oxy] propionate}], pyridine derivative [eg LS8
2-556 [N3- (1-phenylethyl) -2,6-dimethyl-5-propionylnicotinamide]], phenopyrate, an O-phenylpyrrolidino carbamate analog of phenopyrate,
And piperidino carbamate analogs of phenopyrate.

【０００７】特に重要なジフェニルエーテルとしては、
下記 化１記載の構造式１〜７で示される化合物等があ
げられる［構造式４: Maigrot et al.、Brighton Crop
Protection Conference-Weeds:47-51(1989) 参照； 構
造式５: Hayashi et al.、Brighton Crop Protection C
onference-Weeds: 53-58(1989) 参照； 構造式６: ビフ
ェノックス、Dest et al.、Proc. Northeast Weed Sci.
Conf. 27:31(1973)参照］。Particularly important diphenyl ethers include:
Compounds represented by the following structural formulas 1 to 7 may be mentioned [Structural formula 4: Maigrot et al., Brighton Crop
See Protection Conference-Weeds: 47-51 (1989); Structural Formula 5: Hayashi et al., Brighton Crop Protection C
onference-Weeds: 53-58 (1989); Structural formula 6: Bifenox, Dest et al., Proc. Northeast Weed Sci.
Conf. 27:31 (1973)].

【化１】 Embedded image

【０００８】さらに、その他の特に重要なＰＰＯ阻害型
除草性化合物として、下記 化２記載の一般式で示され
る化合物等をあげることができ、より具体的には、下記
化７〜化１０記載の構造式８〜３７で示される化合物
などがあげられる。Further, other particularly important PPO-inhibiting herbicidal compounds include compounds represented by the following general formula (2), and more specifically, compounds represented by the following chemical formulas (7) to (10): Compounds represented by structural formulas 8 to 37 are exemplified.

【化２】Ｊ−Ｇ ここで、Ｇとしては下記 化３記載のＧ−１〜９で示さ
れる基があげられ、Ｊとしては下記 化４〜６記載のＪ
−１〜３０で示される基があげられる。Wherein G is a group represented by G-1 to G-9 shown in the following Chemical Formula 3, and J is a J shown in the following Chemical Formulas 4 to 6.
And groups represented by -1 to 30.

【化３】 Embedded image

【化４】 Embedded image

【化５】 Embedded image

【化６】 Embedded image

【０００９】ここで、式 J-5、J-6、J-12 および J-24
における破線は、左側の環が一重結合のみを含むことま
たは環内のひとつの結合が炭素原子間の二重結合である
ことを表し、X は酸素原子または硫黄原子を表し、Y は
酸素原子または硫黄原子を表し、R¹ は水素原子または
ハロゲン原子を表し、R² は水素原子、C₁-C₈ アルキル
基、C₁-C₈ ハロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、-O
R²⁷ 基、-SH 基、-S(O)pR²⁷ 基、-COR²⁷ 基、-CO₂R²⁷
基、-C(O)SR²⁷基、-C(O)NR²⁹R³⁰ 基、-CHO 基、-CR²⁷=N
OR³⁶ 基、-CH=CR³⁷CO₂R²⁷ 基、-CH₂CHR ³⁷CO₂R²⁷ 基、-C
O₂N=CR³¹R³² 基、ニトロ基、シアノ基、-NHSO₂R³³ 基、
-NHSO₂NHR³³ 基、-NR²⁷R³⁸ 基、-NH₂ 基、または、1つ
以上の同種もしくは異種の C1-C4アルキル基で置換され
ていてもよいフェニル基を表し、p は 0、1 または 2
を表し、R³ は C₁-C₂ アルキル基、C₁-C₂ ハロアルキル
基、-OCH₃ 基、-SCH₃ 基、-OCHF₂基、ハロゲン原子、シ
アノ基、またはニトロ基を表し、R⁴ は水素原子、C₁-C₃
アルキル基、C₁-C₃ ハロアルキル基、またはハロゲン
原子を表し、R⁵ は水素原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロ
ゲン原子、C₁-C₃ ハロアルキル基、シクロプロピル基、
ビニル基、C₂ アルキニル基、シアノ基、-C(O)R³⁸ 基、
-CO₂R^{3 8} 基、-C(O)NR³⁸R³⁹ 基、-CR³⁴R³⁵CN 基、-CR³⁴R
³⁵C(O)R³⁸ 基、-CR³⁴R³⁵CO₂R³⁸基、-CR³⁴R³⁵C(O)NR³⁸R
³⁹ 基、-CHR³⁴OH 基、-CHR³⁴OC(O)R³⁸ 基、または -OCH
R³⁴OC(O)NR³⁸R³⁹ 基を表すか、あるいは、G が G-2 も
しくは G-6 の場合に R⁴とR⁵とはこれらが結合している
炭素原子とで C=O 基を表していてもよく、R⁶ は C₁-C₆
アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₂-C₆ アルコキ
シアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ ア
ルキニル基を表し、X¹ は直接結合、酸素原子、硫黄原
子、-NH基、-N(C₁-C₃ アルキル)基、-N(C₁-C₃ハロアル
キル)基、または -N(アリル)基を表し、R⁷ は水素原
子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、ハロゲ
ン原子、-S(O)₂(C₁-C₆アルキル)基、または -C(=O)R⁴⁰
基を表し、R⁸ は水素原子、C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈
シクロアルキル基、C₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキ
ニル基、C₁-C₈ ハロアルキル基、C₂-C₈ アルコキシアル
キル基、C₃-C₈ アルコキシアルコキシアルキル基、C₃-C
₈ ハロアルキニル基、C₃-C₈ハロアルケニル基、C₁-C₈
アルキルスルホニル基、C₁-C₈ ハロアルキルスルホニル
基、C₃-C₈ アルコキシカルボニルアルキル基、-S(O)₂NH
(C₁-C₈ アルキル)基、-C(O)R⁴¹ 基、またはフェニル環
上で R⁴² で置換されていてもよいベンジル基を表し、n
および m はそれぞれ独立して 0、1、2 または 3 であ
り、かつ m + n が 2または 3 を表し、Z は -CR⁹R¹⁰
基、酸素原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂ 基、また
は -N(C₁-C ₄ アルキル)基を表し、それぞれの R⁹ は独
立して水素原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロゲン原子、ヒ
ドロキシ基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル
基、C₁-C₆ ハロアルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニ
ルオキシ基、または C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオ
キシ基を表し、それぞれの R¹⁰ は独立して水素原子、C
₁-C₃ アルキル基、ヒドロキシ基、またはハロゲン原子
を表し、R¹¹ および R¹² はそれぞれ独立して水素原
子、ハロゲン原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケニ
ル基、または C₁-C₆ ハロアルキル基を表し、R¹³ は水
素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃
-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ ア
ルキニル基、C₃-C₆ ハロアルキニル基、HC(=0)基、(C₁-
C₄ アルキル)C(=O) 基、または -NH₂ 基を表し、R¹⁴ は
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ アルキルチオ基、C₁-C₆ ハ
ロアルキル基、または -N(CH₃)₂ 基を表し、W は窒素原
子または -CR¹⁵ 基を表し、R¹⁵ は水素原子、C₁-C₆ ア
ルキル基、ハロゲン原子、または、C₁-C₆ アルキル基、
1 ないし 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基も
しくは -CF₃ 基で置換されていてもよいフェニル基を表
し、それぞれの Q は独立して酸素原子または硫黄原子
を表し、Q¹ は酸素原子または硫黄原子を表し、Z¹ は -
CR¹⁶R¹⁷ 基、酸素原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂
基、または -N(C₁-C₄ アルキル)基を表し、それぞれの
R¹⁶ は独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C
₆ ハロアルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニルオキシ
基、または C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオキシ基を
表し、それぞれの R¹⁷ は独立して水素原子、ヒドロキ
シ基、または ハロゲン原子を表し、R¹⁸ は C₁-C₆ アル
キル基、ハロゲン原子、または C₁-C₆ ハロアルキル基
を表し、R¹⁹ および R²⁰ はそれぞれ独立して水素原
子、C₁-C₆ アルキル基、または C₁-C ₆ ハロアルキル基
を表し、Z² は酸素原子、硫黄原子、-NR⁹ 基、または-C
R⁹R¹⁰ 基を表し、R²¹ および R²² はそれぞれ独立して
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アル
ケニル基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、またはC₃-C₆ ハロアルキニル基を表し、R²³ は水素
原子、ハロゲン原子、またはシアノ基を表し、R²⁴ は C
₁-C₆ アルキルスルフォニル基、C₁-C₆ アルキル基、C₁-
C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アル
キニル基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ハロアルコキシ
基、またはハロゲン原子を表し、R²⁵ は C₁-C₆ アルキ
ル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、ま
たは C₃-C₆ アルキニル基を表し、R²⁶ は C₁-C₆ アルキ
ル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、または、環上で C₁-C₆
アルキル基、1 ないし 2 個のハロゲン原子、1 ないし
2 個のニトロ基、C₁-C₆ アルコキシ基、および CF₃ 基
からなるグループの中から選択される置換基で置換され
ていてもよいフェニル基を表し、W¹ は窒素原子または
CH 基を表し、T は下記の一般式T-1、T-2、またはT-3
のいずれかの基を表し、 （式中、E¹、E²、E³、E⁴、E⁵、E⁶、E⁷、E⁸、E⁹、E¹⁰、E
¹¹、E¹² はそれぞれ水素原子または C₁-C₃ アルキル基
を表す。）R²⁷ は C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈ シクロア
ルキル基、C₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキニル基、
C₁-C₈ ハロアルキル基、C₂-C₈ アルコキシアルキル基、
C₂-C₈アルキルチオアルキル基、C₂-C₈ アルキルスルフ
ィニルアルキル基、C₂-C₈ アルキルスルフォニルアルキ
ル基、C₁-C₈ アルキルスルフォニル基、フェニル環上で
ハロゲン原子および C₁-C₄ アルキル基からなるグルー
プの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換
されていてもよいフェニルスルフォニル基、C₄-C₈ アル
コキシアルコキシアルキル基、C₄-C₈ シクロアルキルア
ルキル基、C₆-C₈ シクロアルコキシアルキル基、C₄-C₈
アルケニルオキシアルキル基、C₄-C₈アルキニルオキシ
アルキル基、C₃-C₈ ハロアルコキシアルキル基、C₄-C₈
ハロアルケニルオキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアルキニ
ルオキシアルキル基、C₆-C₈ シクロアルキルチオアルキ
ル基、C₄-C₈ アルケニルチオアルキル基、C₄-C₈ アルキ
ニルチオアルキル基、環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アル
キル基および C₁-C₃ ハロアルキル基からなるグループ
の中から選択される少なくともひとつの置換基で置換さ
れていてもよいフェノキシ基で置換された C₁-C₄ アル
キル基、環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および
C₁-C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から選択
される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよ
いベンジルオキシ基で置換されたC₁-C₄ アルキル基、C₄
-C₈トリアルキルシリルアルキル基、C₃-C₈ シアノアル
キル基、C₃-C₈ ハロシクロアルキル基、C₃-C₈ ハロアル
ケニル基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル基、C₅-C₈ ハロ
アルコキシアルキニル基、C₅-C₈ アルキルチオアルケニ
ル基、C₃-C₈ ハロアルキニル基、C₅-C₈ アルコキシアル
キニル基、C₅-C₈ ハロアルコキシアルキニル基、C₅-C₈
アルキルチオアルキニル基、C₂-C₈ アルキルカルボニル
基、環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-
C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から選択され
る少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベ
ンジル基、-CHR³⁴COR²⁸ 基、-CHR³⁴COOR²⁸ 基、-CHR³⁴P
(O)(OR²⁸)₂ 基、-CHR³⁴P(S)(OR²⁸)₂基、-CHR³⁴C(O)NR²⁹
R³⁰ 基、または -CHR³⁴C(O)NH₂ 基を表し、R²⁸ は C₁-C
₆ アルキル基、C₂-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、またはテトラヒドロフラニル基を表し、R²⁹ および
R³¹ は独立して水素原子、または C₁-C₄ アルキル基を
表し、R³⁰ および R³² は独立して C₁-C₄ アルキル基、
または環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C
₁-C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から選択さ
れる少なくともひとつの置換基で置換されていてもよい
フェニル基を表し、あるいは、R²⁹と R³⁰とで -(CH₂)
₅-、-(CH₂)₄-、または -CH₂CH₂OCH₂CH₂- を表していて
もよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、
C₁-C₃ アルキル基、フェニル基およびベンジル基から
なるグループの中から選択される置換基で置換されてい
てもよい、あるいは、R³¹と R³²とはこれらが結合して
いる炭素原子とで C₃-C₈ シクロアルキル基を表してい
てもよく、R³³ は C₁-C₄ アルキル基、C₁-C₄ ハロアル
キル基、または C₃-C₆ アルケニル基を表し、R³⁴ およ
び R³⁵ は独立して水素原子または C₁-C₄ アルキル基を
表し、R³⁶ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アル
ケニル基、または C₃-C₆ アルキニル基を表し、R³⁷ は
水素原子、C₁-C₄ アルキル基、またはハロゲン原子を表
し、R³⁸ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ シクロ
アルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₂-C₆ アルコキシアルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル
基、環上でハロゲン原子、C₁-C₄ アルキル基および C₁-
C₄ アルコキシ基からなるグループの中から選択される
少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェ
ニル基、-CH₂CO₂(C₁-C₄ アルキル)基、または -CH(CH₃)
CO₂(C₁-C₄ アルキル)基を表し、R³⁹ は水素原子、C₁-C₂
アルキル基、または C(O)O(C₁-C₄ アルキル)基を表
し、R⁴⁰ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ アルコ
キシ基、または NH(C₁-C₆ アルキル)基を表し、R⁴¹ は
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C₆ アル
コキシ基、NH(C₁-C₆ アルキル)基、R⁴² 基で置換されて
いてもよいフェニル基、ベンジル基、または C₂-C₈ ジ
アルキルアミノ基を表し、R⁴² は C₁-C₆ アルキル基、1
ないし 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基、ま
たは CF₃ 基を表す。Where the formulas J-5, J-6, J-12 and J-24
Indicates that the ring on the left contains only a single bond.
Or one bond in a ring is a double bond between carbon atoms
X represents an oxygen atom or a sulfur atom, and Y represents
Represents an oxygen or sulfur atom, R¹ Is a hydrogen atom or
Represents a halogen atom, R^Two Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl
Group, C₁-C₈ Haloalkyl group, halogen atom, hydroxyl group, -O
R²⁷ Group, -SH group, -S (O) pR²⁷ Group, -COR²⁷ Group, -CO_TwoR²⁷ 
Group, -C (O) SR²⁷Group, -C (O) NR²⁹R³⁰ Group, -CHO group, -CR²⁷= N
OR³⁶ Group, -CH = CR³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -CH_TwoCHR ³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -C
O_TwoN = CR³¹R³² Group, nitro group, cyano group, -NHSO_TwoR³³ Group,
-NHSO_TwoNHR³³ Group, -NR²⁷R³⁸ Group, -NH_Two Group or one
Substituted with the same or different C1-C4 alkyl groups
Represents an optionally substituted phenyl group, p is 0, 1 or 2
And R^Three Is C₁-C_Two Alkyl group, C₁-C_Two Haloalkyl
Group, -OCH_Three Group, -SCH_Three Group, -OCHF_TwoGroup, halogen atom,
Represents an ano group or a nitro group, R^Four Is a hydrogen atom, C₁-C_Three
 Alkyl group, C₁-C_Three Haloalkyl group or halogen
Represents an atom, R^Five Is a hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl group, halo
Gen atom, C₁-C_Three Haloalkyl group, cyclopropyl group,
Vinyl group, C_Two Alkynyl group, cyano group, -C (O) R³⁸ Group,
-CO_TwoR^{Three 8} Group, -C (O) NR³⁸R³⁹ Group, -CR³⁴R³⁵CN group, -CR³⁴R
³⁵C (O) R³⁸ Group, -CR³⁴R³⁵CO_TwoR³⁸Group, -CR³⁴R³⁵C (O) NR³⁸R
³⁹ Group, -CHR³⁴OH group, -CHR³⁴OC (O) R³⁸ Group, or -OCH
R³⁴OC (O) NR³⁸R³⁹ Represents a group, or G is G-2
Or R for G-6^FourAnd R^FiveAnd these are combined
And a carbon atom may represent a C = O group;⁶ Is C₁-C₆
 Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Two-C₆ Alkoki
Silalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ A
X represents a rukinyl group;¹ Is a direct bond, an oxygen atom, a sulfur atom
, -NH group, -N (C₁-C_Three Alkyl) group, -N (C₁-C_ThreeHaloal
Kill) group, or -N (allyl) group, R⁷ Is hydrogen field
Child, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, halogen
Atom, -S (O)_Two(C₁-C₆Alkyl) group, or -C (= O) R⁴⁰ 
Represents a group, R⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ 
Cycloalkyl group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Archi
Nyl group, C₁-C₈ Haloalkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyal
Kill group, C_Three-C₈ Alkoxyalkoxyalkyl group, C_Three-C
₈ Haloalkynyl group, C_Three-C₈Haloalkenyl group, C₁-C₈ 
Alkylsulfonyl group, C₁-C₈ Haloalkylsulfonyl
Group, C_Three-C₈ Alkoxycarbonylalkyl group, -S (O)_TwoNH
(C₁-C₈ Alkyl) group, -C (O) R⁴¹ Group or phenyl ring
On R⁴² Represents a benzyl group optionally substituted with
 And m are each independently 0, 1, 2 or 3.
And m + n represents 2 or 3, and Z is -CR⁹R^Ten 
Group, oxygen atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two Group, also
Is -N (C₁-C _Four Alkyl) group, each R⁹ Is German
Standing hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl group, halogen atom, ar
Droxy group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl
Group, C₁-C₆ Haloalkoxy group, C_Two-C₆ Alkyl carboni
Roxy group, or C_Two-C₆ Haloalkylcarbonylo
Represents a xy group, each R^Ten Is independently a hydrogen atom, C
₁-C_Three Alkyl group, hydroxy group, or halogen atom
And R¹¹ And R¹² Are independently hydrogen sources
Child, halogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Alkene
Or C₁-C₆ Represents a haloalkyl group, R¹³ Is water
Elementary atom, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three
-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ A
Rukinyl group, C_Three-C₆ Haloalkynyl group, HC (= 0) group, (C₁-
C_Four Alkyl) C (= O) group, or -NH_Two Represents a group, R¹⁴ Is
 C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Alkylthio group, C₁-C₆ C
Loalkyl group, or -N (CH_Three)_Two W represents a nitrogen atom
Child or -CR¹⁵ Represents a group, R¹⁵ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ A
Alkyl group, halogen atom, or C₁-C₆ Alkyl group,
1 or 2 halogen atoms, C₁-C₆ Alkoxy groups
Or -CF_Three Phenyl group which may be substituted
And each Q is independently an oxygen or sulfur atom
And Q¹ Represents an oxygen atom or a sulfur atom; Z¹ Is-
CR¹⁶R¹⁷ Group, oxygen atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two 
Group, or -N (C₁-C_Four Alkyl) group,
R¹⁶ Is independently a hydrogen atom, a halogen atom, hydroxy
Group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C
₆ Haloalkoxy group, C_Two-C₆ Alkylcarbonyloxy
Group or C_Two-C₆ A haloalkylcarbonyloxy group
Represent each R¹⁷ Is independently hydrogen atom, hydroxy
Or a halogen atom, R¹⁸ Is C₁-C₆ Al
Kill group, halogen atom, or C₁-C₆ Haloalkyl group
And R¹⁹ And R²⁰ Are independently hydrogen sources
Child, C₁-C₆ Alkyl group, or C₁-C ₆ Haloalkyl group
And Z^Two Is an oxygen atom, a sulfur atom, -NR⁹ Group, or -C
R⁹R^Ten Represents a group, R^{twenty one} And R^{twenty two} Are independent of each other
C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Al
Kenyl group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, or C_Three-C₆ Represents a haloalkynyl group, R^{twenty three} Is hydrogen
Represents an atom, a halogen atom, or a cyano group; R^{twenty four} Is C
₁-C₆ Alkylsulfonyl group, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-
C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Al
Quinyl group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆Haloalkoxy
Represents a group or a halogen atom, R^{twenty five} Is C₁-C₆ Archi
Group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group,
Or C_Three-C₆ Represents an alkynyl group, R²⁶ Is C₁-C₆ Archi
Group, C₁-C₆ Haloalkyl group or C on the ring₁-C₆ 
An alkyl group, one or two halogen atoms, one to
Two nitro groups, C₁-C₆ Alkoxy group, and CF_Three Base
Substituted with a substituent selected from the group consisting of
Represents a phenyl group which may be¹ Is a nitrogen atom or
Represents a CH group, where T is the following general formula T-1, T-2, or T-3
Represents any group of(Where E¹, E^Two, E^Three, E^Four, E^Five, E⁶, E⁷, E⁸, E⁹, E^Ten, E
¹¹, E¹² Is a hydrogen atom or C₁-C_Three Alkyl group
Represents ) R²⁷ Is C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ Cycloa
Lucyl group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl group,
C₁-C₈ Haloalkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyalkyl group,
C_Two-C₈Alkylthioalkyl group, C_Two-C₈ Alkylsulf
Ynylalkyl group, C_Two-C₈ Alkylsulfonylalkyl
Group, C₁-C₈ Alkylsulfonyl group on the phenyl ring
Halogen atom and C₁-C_Four Glue composed of alkyl groups
Substituted with at least one substituent selected from
An optionally substituted phenylsulfonyl group, C_Four-C₈ Al
Coxyalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Cycloalkylua
Lucyl group, C₆-C₈ Cycloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ 
Alkenyloxyalkyl group, C_Four-C₈Alkynyloxy
Alkyl group, C_Three-C₈ Haloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ 
Haloalkenyloxyalkyl group, C_Four-C₈ Halo alkini
Roxyalkyl group, C₆-C₈ Cycloalkylthioalkyl
Group, C_Four-C₈ Alkenylthioalkyl group, C_Four-C₈ Archi
Nylthioalkyl group, halogen atom on the ring, C₁-C_Three Al
Kill group and C₁-C_Three Group consisting of haloalkyl groups
Substituted with at least one substituent selected from
Substituted with an optionally substituted phenoxy group₁-C_Four Al
Kill group, halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and
 C₁-C_Three Select from a group consisting of haloalkyl groups
May be substituted with at least one substituent
Substituted with a benzyloxy group₁-C_Four Alkyl group, C_Four
-C₈Trialkylsilylalkyl group, C_Three-C₈ Cyanoal
Kill group, C_Three-C₈ Halocycloalkyl group, C_Three-C₈ Haloal
Kenyl group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Halo
Alkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Alkylthioalkenyl
Group, C_Three-C₈ Haloalkynyl group, C_Five-C₈ Alkoxyal
Quinyl group, C_Five-C₈ Haloalkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ 
Alkylthioalkynyl group, C_Two-C₈ Alkylcarbonyl
Group, halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-
C_Three Selected from the group consisting of haloalkyl groups
Be substituted with at least one substituent.
Benzyl group, -CHR³⁴COR²⁸ Group, -CHR³⁴COOR²⁸ Group, -CHR³⁴P
(O) (OR²⁸)_Two Group, -CHR³⁴P (S) (OR²⁸)_TwoGroup, -CHR³⁴C (O) NR²⁹
R³⁰ Group, or -CHR³⁴C (O) NH_Two Represents a group, R²⁸ Is C₁-C
₆ Alkyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, or tetrahydrofuranyl group, R²⁹ and
 R³¹ Is independently a hydrogen atom, or C₁-C_Four An alkyl group
Represents, R³⁰ And R³² Is independently C₁-C_Four Alkyl group,
Or a halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C
₁-C_Three Selected from the group consisting of haloalkyl groups
May be substituted with at least one substituent
Represents a phenyl group, or R²⁹And R³⁰And in-(CH_Two)
_Five-,-(CH_Two)_Four-Or -CH_TwoCH_TwoOCH_TwoCH_Two-Represents
In each ring thus formed,
 C₁-C_Three From alkyl, phenyl and benzyl groups
Substituted with a substituent selected from the group consisting of
Or R³¹And R³²And these are combined
Carbon atoms and C_Three-C₈ Represents a cycloalkyl group
May be, R³³ Is C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Haloal
Kill group, or C_Three-C₆ Represents an alkenyl group, R³⁴ And
And R³⁵ Is independently a hydrogen atom or C₁-C_Four An alkyl group
Represents, R³⁶ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Al
Kenyl group, or C_Three-C₆ Represents an alkynyl group, R³⁷ Is
Hydrogen atom, C₁-C_Four Displays an alkyl group or halogen atom
Then R³⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Cyclo
Alkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C_Two-C₆ Alkoxyalkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl
Group, halogen atom on the ring, C₁-C_Four Alkyl group and C₁-
C_Four Selected from the group consisting of alkoxy groups
Fe which may be substituted with at least one substituent
Nyl group, -CH_TwoCO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, or -CH (CH_Three)
CO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, R³⁹ Is a hydrogen atom, C₁-C_Two
 Alkyl group or C (O) O (C₁-C_Four Alkyl) group
Then R⁴⁰ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Arco
Xyl group, or NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴¹ Is
C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C₆ Al
Coxy group, NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴² Substituted with a group
Optionally phenyl, benzyl, or C_Two-C₈ The
Represents an alkylamino group, R⁴² Is C₁-C₆ Alkyl group, 1
 Or two halogen atoms, C₁-C₆ An alkoxy group
Or CF_Three Represents a group.

【００１０】[0010]

【化７】 Embedded image

【化８】 Embedded image

【化９】 Embedded image

【化１０】 Embedded image

【００１１】さらに、ＰＰＯ阻害型除草性化合物とし
て、下記 化１１記載の一般式で示される N-置換ピラ
ゾール（国際特許公開 WO 94/08999、WO 93/10100 およ
び Schering に対する米国特許第5405829参照）等があ
げられる。Further, as PPO-inhibiting herbicidal compounds, N-substituted pyrazoles represented by the following general formula (see International Patent Publications WO 94/08999, WO 93/10100 and US Pat. No. 5,405,829 to Schering) and the like: Is raised.

【化１１】 ここで、R⁴³ は C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁴⁴ は C₁-C
₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルキルチオ基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基、 C₁-C₄ハロアルキル基、 C₁-C₄ ハロアルキル
チオ基、または C₁-C₄ ハロアルコキシ基を表し、ある
いは、R⁴³ とR⁴⁴とで-(CH₂)₃- または -(CH₂)₄- を表し
ていてもよく、R⁴⁵ は水素原子またはハロゲン原子を表
し、R⁴⁶ は水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁴⁷ は水素原子、ニトロ基、シアノ基、-COOR⁴⁹ 基、-C
(=X)NR⁵⁰R⁵¹ 基、または-C(=X²)R⁵² 基を表し、R⁴⁸ は
水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ハロゲン原子およ
び水酸基からなるグループの中から選択される少なくと
もひとつの置換基で置換されていてもよいC₁-C₄ アルキ
ル基、 C₁-C₄ アルコキシ基、環上でハロゲン原子、ニ
トロ基、シアノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基およびハロ-C₁-C₄ アルキル基からなるグループ
の中から選択される少なくともひとつの置換基で置換さ
れていてもよいフェニル基、ピローリル基、 C₂-C₈ ア
ルキル基、 C₃-C₈ アルケニル基、 C₃-C₈ アルキニル
基、 C₃-C₈ アルコキシ基、（該C₂-C₈ アルキル基、該
C ₃-C₈ アルケニル基、 該C₃-C₈ アルキニル基および 該
C₃-C₈ アルコキシ基には少なくともひとつ以上の酸素原
子が挿入されていてもよい）、または以下に示す基を表
し、 R⁴⁹ R⁵⁰ およびR⁵¹ は同じであっても異なってもよく、
水素原子または C₁-C₄アルキル基を表し、あるいは、R
⁵⁰ とR⁵¹とはこれらが結合する窒素原子とで5員もしく
は6員の飽和した環を形成していてもよい、R⁵² は水素
原子、 C₁-C₄ アルキル基、または少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換された C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁵³ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニ
ル基、 C₃-C₆ アルキニル基、フェニル基（該 C₁-C₄ ア
ルキル基、該 C₂-C₆ アルケニル基、該C₃-C₆ アルキニ
ル基、および該フェニル基はハロゲン原子で置換されて
いてもよい）、 C ₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチ
ル基、または R⁶³CO-基を表し、R⁵⁴ は水素原子、ハロ
ゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₆ アルキル基、
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₂-C₆ アルケニ
ル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい C₃-C₆ ア
ルキニル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェ
ニル基、 C₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチル基、
C₁-C₄ アルコキシ C ₁-C₆ アルキル基、 ジ C₁-C₄ アル
キルアミノ C₁-C₄ アルキル基、テトラヒドロフルフリ
ルメチル基、 C₃-C₆ アルキニルオキシ C₁-C₄ アルキル
基、ベンジル基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シア
ノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基および
ハロ C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から選択
される置換基で置換されていてもよいベンジル基、-C(=
X²)R⁶³基、-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁰ 基、-(CH₂)_a-O-(CH₂)_b-R
⁷⁰ 基、または-(CH₂)_a-X²-R⁷⁶基を表し、あるいは、R⁵³
とR⁵⁴とはこれらが結合している窒素原子とで、3員、5
員もしくは6員の飽和した環または5員もしくは6員の芳
香環（該飽和した環および該芳香環においては1つの炭
素原子が1つの酸素原子で置換されていてもよい）を形
成していてもよい、R⁵⁵ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ アルキニル基
を表し、あるいはR⁵⁵ とR⁵⁶ とで-(CH₂)_e-基を形成して
いてもよい、R⁵⁶ とR⁵⁷ はそれぞれ C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基もしく
はフェニル基（該C₁-C₄ アルキル基、 該C₂-C₆ アルケ
ニル基、該C₃-C₆ アルキニル基および該フェニル基はハ
ロゲン原子で置換されていてもよい）、 水素原子、 C₃
-C₆ シクロアルキル基、-X²R⁶⁰ 基、または-NR⁶¹R⁶²基
を表し、R⁵⁸ は水素原子、 C₁-C₆ アルキル基、 C₂-C₆
アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基、 C₁-C₄ アルキル
カルボニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ アル
コキシカルボニル C₁-C₄ アルキル基、ジ C₁-C₄ アルコ
キシカルボニル C₁-C₄アルキル基、ベンジル基、 C₁-C₄
アルコキシ- C₁-C₄アルキニル基、-(CH₂)_a-R⁷⁵基、-(CH
₂)_a-X²-R⁷²基、-(CH₂)_a-X²-(CH₂)_b-R⁷²基、または-(C
H₂)_a-X²-(CH₂)_b-X ²-(CH₂)_c-R⁷²基を表し、R⁵⁹ は水素原
子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆
アルキニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルカルボニル C₁-C₃ アルキル基、またはフェニル
基を表し、R⁶⁰ は少なくとも1つのハロゲン原子で置換
されていてもよい C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶¹ とR⁶²
は同じであっても異なってもよく、水素原子、または
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶³ は少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₄ アルキル
基、 C₁-C₄ アルコシキ C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルチオ C₁-C₄ アルキル基、 C₃-C₆ シクロアルキル
基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、 C₁-C₄
アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基およびハロ C₁-C₄
アルキル基からなるグループの中から選択されるひとつ
の置換基で置換されていてもよいフェニル基、-NR⁷³R⁷⁴
基、または-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁵基を表し、R⁶⁴ は C₁-C₄
アルコキシカルボニル基、またはカルボキシル基を表
し、R⁶⁵ はクロロメチル基、シアノメチル基、少なくと
も1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆ シ
クロアルキル基、または C₁-C₄ アルコキシカルボニル
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁶ は水酸基、または-NR⁶⁷R
⁶⁸を表し、A は -NR⁶⁷R⁶⁸、または -S(O)_f-R⁶⁹基を表
し、R⁶⁷ とR⁶⁸ は同じであっても異なってもよく、水素
原子、または C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁹ は C₁-C₄
アルキル基、または C₁-C₄ ハロアルキル基を表し、R⁷⁰
は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、少なくとも1つ以
上の C₁-C₄ アルコキシ基で置換されていてもよい C₁-C
₄ アルキル基、少なくとも1つ以上の酸素原子が挿入さ
れていてもよい C₃-C₆シクロアルキル基、1もしくは2個
のメチル基で置換されていてもよい C₃-C₆シクロアルキ
ル基、フリル基、チエニル基、または -C(=O)R⁷¹基を表
し、R⁷¹ とR⁷² は同じであっても異なってもよく、 C₁-
C₄ アルキル基、または C₁-C ₄ アルコキシ基を表し、R
⁷³ とR⁷⁴ は同じであっても異なってもよく、 C₁-C₄ ア
ルキル基、またはフェニル基を表し、R⁷⁵ は少なくとも
1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆シク
ロアルキル基、1または2個のメチル基で置換されていて
もよい C₃-C₆シクロアルキル基、フリル基、チエニル
基、または -C(=O)R⁷¹基を表し、R⁷⁶ は C₁-C₄ アルキ
ル基を表し、a、b、およびc はそれぞれ独立して1、2、
または3を表し、d は0または1を表し、e は2または3を
表し、f は1または2を表し、X² は酸素原子または硫黄
原子を表す。Embedded imageWhere R⁴³ Is C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁴⁴ Is C₁-C
_Four Alkyl group, C₁-C_Four Alkylthio group, C₁-C_Four Arco
Xyl group, C₁-C_FourHaloalkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Thio group, or C₁-C_Four Represents a haloalkoxy group;
Well, R⁴³ And R⁴⁴And in-(CH_Two)_Three-Or- (CH_Two)_Four-Represents
May be R⁴⁵ Represents a hydrogen atom or a halogen atom
Then R⁴⁶ Is a hydrogen atom or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁴⁷ Is hydrogen atom, nitro group, cyano group, -COOR⁴⁹ Group, -C
(= X) NR⁵⁰R⁵¹ Group, or -C (= X^Two) R⁵² Represents a group, R⁴⁸ Is
Hydrogen atom, halogen atom, cyano group, halogen atom and
At least selected from the group consisting of
May also be substituted with one substituent₁-C_Four Archi
Group, C₁-C_Four An alkoxy group, a halogen atom on the ring,
Toro, cyano, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Arco
Xy group and halo-C₁-C_Four Group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one substituent selected from
Optionally substituted phenyl, pyrrolyl, C_Two-C₈ A
Ruquil group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl
Group, C_Three-C₈ An alkoxy group, (the C_Two-C₈ An alkyl group,
C _Three-C₈ An alkenyl group, the C_Three-C₈ An alkynyl group and
C_Three-C₈ An alkoxy group contains at least one oxygen source
Or a group shown below.
AndR⁴⁹ R⁵⁰ And R⁵¹ May be the same or different,
Hydrogen atom or C₁-C_FourRepresents an alkyl group, or R
⁵⁰ And R⁵¹Is a 5-member or a nitrogen atom to which these bind
May form a 6-membered saturated ring, R⁵² Is hydrogen
Atom, C₁-C_Four An alkyl group, or at least one or more
C substituted with a halogen atom₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁵³ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkene
Group, C_Three-C₆ Alkynyl group, phenyl group (C₁-C_Four A
Alkyl group, the C_Two-C₆ Alkenyl group, the C_Three-C₆ Alkini
And the phenyl group is substituted with a halogen atom.
May be present), C _Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethy
Or R⁶³Represents a CO- group, R⁵⁴ Is a hydrogen atom, halo
C optionally substituted with a gen atom₁-C₆ Alkyl group,
C optionally substituted with a halogen atom_Two-C₆ Alkene
Group optionally substituted with a halogen group or a halogen atom_Three-C₆ A
Alkynyl group,
Nyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethyl group,
C₁-C_Four Alkoxy C ₁-C₆ Alkyl group, di C₁-C_Four Al
Killamino C₁-C_Four Alkyl group, tetrahydrofurfury
Methyl group, C_Three-C₆ Alkynyloxy C₁-C_Four Alkyl
Group, benzyl group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano
No group, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four An alkoxy group and
Halo C₁-C_Four Select from groups consisting of alkyl groups
Benzyl group which may be substituted with a substituent represented by -C (=
X^Two) R⁶³Group,-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁰ Group,-(CH_Two)_a-O- (CH_Two)_b-R
⁷⁰ Group, or-(CH_Two)_a-X^Two-R⁷⁶Represents a group, or R⁵³
 And R⁵⁴Is the nitrogen atom to which they are attached, 3 members, 5 members
6 or 6 membered saturated ring or 5 or 6 membered ring
Aromatic ring (in the saturated ring and the aromatic ring, one charcoal
Element atom may be replaced by one oxygen atom)
May be formed, R⁵⁵ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ Alkynyl group
Or R⁵⁵ And R⁵⁶ And in-(CH_Two)_e-Form a group
May be, R⁵⁶ And R⁵⁷ Is C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group or
Is a phenyl group (the C₁-C_Four An alkyl group, the C_Two-C₆ Arche
Nyl group, the C_Three-C₆ An alkynyl group and the phenyl group are
Hydrogen atom, C_Three
-C₆ Cycloalkyl group, -X^TwoR⁶⁰ Group, or -NR⁶¹R⁶²Base
And R⁵⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Two-C₆ 
Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group, C₁-C_Four Alkyl
Carbonyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four Al
Coxycarbonyl C₁-C_Four Alkyl group, di C₁-C_Four Arco
Xycarbonyl C₁-C_FourAlkyl group, benzyl group, C₁-C_Four
Alkoxy-C₁-C_FourAlkynyl group,-(CH_Two)_a-R⁷⁵Group,-(CH
_Two)_a-X^Two-R⁷²Group,-(CH_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-R⁷²Group, or-(C
H_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-X ^Two-(CH_Two)_c-R⁷²Represents a group, R⁵⁹ Is hydrogen field
Child, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆
 Alkynyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucylcarbonyl C₁-C_Three Alkyl group or phenyl
Represents a group, R⁶⁰ Is replaced by at least one halogen atom
May be C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶¹ And R⁶²
 May be the same or different and represent a hydrogen atom, or
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶³ Is at least one
C optionally substituted with a halogen atom₁-C_Four Alkyl
Group, C₁-C_Four Alkoshki C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucircio C₁-C_Four Alkyl group, C_Three-C₆ Cycloalkyl
Group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano group, C₁-C_Four
 Alkyl group, C₁-C_Four Alkoxy group and halo C₁-C_Four 
One selected from the group consisting of alkyl groups
A phenyl group optionally substituted with a substituent of -NR⁷³R⁷⁴
Group, or-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁵Represents a group, R⁶⁴ Is C₁-C_Four
Displays an alkoxycarbonyl group or carboxyl group
Then R⁶⁵ Is a chloromethyl group, a cyanomethyl group, at least
May also have one or more oxygen atoms inserted C_Three-C₆ Shi
Chloroalkyl group, or C₁-C_Four Alkoxycarbonyl
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁶ Is a hydroxyl group, or -NR⁶⁷R
⁶⁸And A is -NR⁶⁷R⁶⁸, Or -S (O)_f-R⁶⁹Table
Then R⁶⁷ And R⁶⁸ May be the same or different, and hydrogen
Atom, or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁹ Is C₁-C_Four 
Alkyl group, or C₁-C_Four Represents a haloalkyl group, R⁷⁰
 Is a hydrogen atom, hydroxyl group, halogen atom, at least one
C on₁-C_Four C optionally substituted with an alkoxy group₁-C
_Four Alkyl group, at least one oxygen atom is inserted
May be C_Three-C₆1 or 2 cycloalkyl groups
C optionally substituted with a methyl group_Three-C₆Cycloalkyl
Group, furyl group, thienyl group, or -C (= O) R⁷¹Table
Then R⁷¹ And R⁷² May be the same or different and C₁-
C_Four Alkyl group, or C₁-C _Four Represents an alkoxy group, R
⁷³ And R⁷⁴ May be the same or different and C₁-C_Four A
Represents a alkyl group or a phenyl group;⁷⁵ Is at least
One or more oxygen atoms may be inserted C_Three-C₆Shiku
Substituted with 1 or 2 methyl groups,
Good C_Three-C₆Cycloalkyl group, furyl group, thienyl
Group, or -C (= O) R⁷¹Represents a group, R⁷⁶ Is C₁-C_Four Archi
A, b, and c are each independently 1, 2,
Or 3; d represents 0 or 1; e represents 2 or 3
Represents, f represents 1 or 2, X^Two Is an oxygen atom or sulfur
Represents an atom.

【００１２】その他の N-置換ピラゾールとして、下記
化１２記載の構造式３８で示されるニピラクロフェ
ン{"The Pesticide Manual"，9th ed.、C. R. Worthing
編、British Crop Protection Council，Surrey (199
1) の 621 頁参照}、および 3-置換-2-アリール-4,5,6,
7-テトラヒドロインダゾール{Lyga et al., PesticideS
ci. 42: p29(1994)}をあげられる。Other N-substituted pyrazoles include
Nipiraclofen represented by Structural Formula 38 described in Chemical Formula 12 {"The Pesticide Manual", 9th ed., CR Worthing
Ed., British Crop Protection Council, Surrey (199
1), p. 621}, and 3-substituted-2-aryl-4,5,6,
7-tetrahydroindazole {Lyga et al., PesticideS
ci. 42: p29 (1994)}.

【化１２】 Embedded image

【００１３】また、光合成における電子伝達を阻害する
雑草防除剤の有効成分として含まれる化合物としては、
次のような化合物があげられる。例えば、光化学系Iの
電子伝達を阻害する化合物としては、パラコート(paraq
uat)またはダイコート(diquat)などがあげられ、光化学
系IIの電子伝達を阻害する化合物としては、アトラジン
(atrazine)等のトリアジン(triazine)系化合物、ジウロ
ン(diuron)等のウレア(urea)系化合物、または、ブロモ
キシニル(bromoxynil)もしくはアイオキシニル(ioxyni
l)等のニトリル(nitrile)系化合物などがあげられ、4-H
PPDを阻害する化合物としては、イソクサフルトール(is
oxaflutole)等のイソクサゾール(isoxazole)系化合物、
ピラゾール(pyrazole)系化合物またはトリケトン(trike
tone)系化合物などがあげられる。カロチノイド生合成
を阻害する雑草防除剤の有効成分として含まれる化合物
としては、PDSを阻害する化合物、例えばノルフラゾン
(norflurazon)、フルロクロリドン(flurochloridone)、
フルリドン(fluridone)、フルタモン(flurtamone)また
はジフルフェニカン(diflufenican)などがあげられる。
アミノ酸生合成を阻害する雑草防除剤の有効成分として
含まれる化合物としては、EPSPSを阻害する化合物の例
としてグリフォセート(glyphosate)などがあげられ、AL
Sを阻害する化合物の例として、スルフォニルウレア(su
lfonylurea)系化合物、イミダゾリノン(imidazolinone)
系化合物、ピリミジニルチオベンゾエート(pyrimidinin
ylthiobenzoate)系化合物またはトリアゾロピリミジン
(triazolopyrimidine)系化合物などがあげられ、GSを阻
害する化合物の例としてビアラフォス(bialaphos)また
はグルフォシネート(glufosinate)などがあげられ、DHP
を阻害する化合物の例としてアスラン(asulam)などがあ
げられる。脂質生合成を阻害する雑草防除剤の有効成分
として含まれる化合物としては、ACCを阻害する化合物
の例としてシクロヘキサンジオン(cyclohexanedione)系
化合物またはアリロキシフェノキシプロピオネート(ary
loxyphenoxypropionate)系化合物などがあげられる。細
胞壁の生合成を阻害する雑草防除剤の有効成分として含
まれる化合物としては、セルロースの生合成を阻害する
化合物の例としてジクロベニル(dichlobenil)などがあ
げられる。[0013] The compound contained as an active ingredient of a weed controlling agent that inhibits electron transfer in photosynthesis includes:
The following compounds may be mentioned. For example, compounds that inhibit electron transfer of photosystem I include paraquat (paraq
uat) or diquat, and the compound that inhibits electron transfer of photosystem II is atrazine
(atrazine) and other triazine (triazine) compounds, diuron (diuron) and other urea (urea) compounds, or bromoxynil (bromoxynil) or ioxynil (ioxyni
l) and the like, and nitrile compounds such as 4-H
Compounds that inhibit PPD include isoxaflutol (is
oxaflutole) and other isoxazole compounds.
Pyrazole compounds or triketones
tone) -based compounds. Compounds included as active ingredients of the weed control agent that inhibits carotenoid biosynthesis include compounds that inhibit PDS, such as norfurazone
(norflurazon), flurochloridone,
Examples include fluridone, flutamone, and diflufenican.
Examples of the compound contained as an active ingredient of the weed control agent that inhibits amino acid biosynthesis include glyphosate (glyphosate) as an example of a compound that inhibits EPSPS.
Examples of compounds that inhibit S include sulfonylurea (su
lfonylurea) -based compound, imidazolinone
Compound, pyrimidinyl thiobenzoate (pyrimidinin
ylthiobenzoate) compound or triazolopyrimidine
(triazolopyrimidine) compounds and the like.Examples of compounds that inhibit GS include bialaphos or glufosinate, and DHP
Examples of the compound that inhibits the activity include aslan (asulam). Examples of the compound contained as an active ingredient of the weed control agent that inhibits lipid biosynthesis include cyclohexanedione (cyclohexanedione) -based compound or allyloxyphenoxypropionate (ary) as an example of a compound that inhibits ACC.
loxyphenoxypropionate) compounds. Examples of the compound contained as an active ingredient of the weed control agent that inhibits cell wall biosynthesis include dichlobenil as an example of a compound that inhibits cellulose biosynthesis.

【００１４】雑草防除剤が植物に施用された際に植物細
胞内で該雑草防除作用発現に関わる植物細胞内因性物質
としては、例えば、雑草防除剤の有効成分が作用する標
的酵素の基質または該基質の前駆体もしくは代謝物であ
って、植物細胞内で蓄積すると細胞の機能傷害を惹起す
る物質、あるいは、このような物質により植物細胞内で
生成する物質であって細胞の機能傷害を惹起する物質等
があげられる。より具体的には、ＰＰＯ阻害型除草性化
合物で植物を処理すると、該植物の細胞内にＰＰＯの基
質であるプロトポルフィリノーゲンIXが蓄積し、これが
細胞内で代謝されてプロトポルフィリンIXを生じ、さら
に、プロトポルフィリンIXと光の存在下に細胞内で活性
酸素が生成し、その結果、細胞機能が傷害を受けること
が知られており（宮本純之編、1993年、新しい農薬の科
学 第3章 3.3節、p106、広川書店東京）、この系におけ
るプロトポルフィリノーゲンIX、プロトポルフィリンIX
および活性酸素をあげることができる。The plant cell endogenous substance involved in the expression of the weed controlling action in the plant cells when the weed controlling agent is applied to the plant includes, for example, a substrate of the target enzyme on which the active ingredient of the weed controlling agent acts or the target enzyme. A substance that is a precursor or metabolite of a substrate that, when accumulated in plant cells, causes cell dysfunction, or that is produced in plant cells by such a substance and causes cell dysfunction. Substances. More specifically, when a plant is treated with a PPO-inhibiting herbicidal compound, protoporphyrinogen IX, a substrate of PPO, accumulates in the cells of the plant and is metabolized in the cell to produce protoporphyrin IX. In addition, it has been known that active oxygen is generated in cells in the presence of protoporphyrin IX and light, resulting in impaired cell function (Miyamoto, Jun., Eds., 1993; Chapter 3, section 3.3, p106, Hirokawa Shoten Tokyo), protoporphyrinogen IX, protoporphyrin IX in this system
And active oxygen.

【００１５】本発明方法１において使用される遺伝子は
下記の(1)〜(3)の性質を有するタンパク質をコードする
遺伝子である。 （１）本物質に特異的に結合する。 （２）当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する
変性能を実質的に持たない。 （３）免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない。 本発明において、タンパク質が物質に「特異的に結合す
る」とは、例えば、酵素と基質、または、酵素と阻害剤
もしくは活性調節因子との間の酵素化学的結合、受容体
とリガンドとの間の受容体化学的結合等において示され
るような親和性と特異性に基いて、タンパク質が物質に
結合することを意味する。「当該タンパク質が特異的に
結合する物質に対する変性能を実質的に持たない」と
は、該物質との酵素化学的な反応性が不活性である{但
し、上記の性質(1)でいう本物質との特異的結合性を除
く}ことを意味し、例えば、該物質を、該物質を示す化
学構造式とは異なる化学構造式で示される物質に変換す
る酵素化学的反応を触媒する能力を実質的に持たない場
合をあげることができる。「変性能を実質的に持たな
い」タンパク質は、例えば、該タンパク質をコードする
遺伝子を、当該変性能を有するタンパク質をコードする
遺伝子が欠失し通常の条件では生育できなくなった微生
物に、発現可能な状態で導入した場合に、該微生物の生
育が相補されないことを指標に選択してもよい。本発明
において、「免疫グロブリンの可変領域のフレームワー
ク領域を実質的に含まない」とは、免疫グロブリンの可
変領域に特有の立体構造を形成しないことを意味する。
ここで、「免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク
領域」とは、免疫グロブリン分子を構成するH鎖およびL
鎖の可変領域のうち、超可変領域（hypervariable regi
on）を除いた残りの領域であって、アミノ酸配列の保存
性が比較的高く、可変領域の高度に保存された立体構造
の保持に働く領域である。可変領域が前記の立体構造を
とることにより、H鎖およびL鎖のそれぞれ３ヶ所に散在
する超可変領域が該立体構造上の１か所にまとまり、抗
原結合部位が形成される[Alberts, B., et al. ed. (19
83) Molecular Biology of the Cell p979,Garland Pub
lishing, Inc. New York]。「免疫グロブリンの可変領
域のフレームワーク領域を実質的に含まない」タンパク
質は、例えば、該タンパク質のアミノ酸配列に基づいて
選び出すことができ、このようなタンパク質として具体
的には例えば、免疫グロブリンの可変領域のフレームワ
ーク領域の既知のアミノ酸配列と約６０％以上の相同性
を示す約３０アミノ酸以上からなるアミノ酸配列を含ま
ないタンパク質をあげることができる。また、上記のフ
レームワーク領域を含むか否かは、例えば、該タンパク
質をコードする遺伝子を鋳型にして、免疫グロブリンの
H鎖もしくはL鎖由来の可変領域をコードする塩基配列を
有するＤＮＡを増幅可能なプライマー、具体的には例え
ば、Clackson, T. et al., Nature 352; p624(1991)に
記載されるプライマーVH1BACKとVH1FOR-2、もしくは、V
K2BACKとVK4FOR、または、組換え抗体遺伝子のクローニ
ングのための市販のキット、例えばRecombinant Phage
Antibody System(Pharmacia Biotech社製)に含まれるプ
ライマーHeavy primers mixもしくはLight primer mix
などを用いてＰＣＲを行い、特定の長さのＤＮＡの増幅
の有無を分析することによって確認することもできる。The gene used in the method 1 of the present invention is a gene encoding a protein having the following properties (1) to (3). (1) Specific binding to the substance. (2) The protein does not substantially have the ability to alter the substance to which it specifically binds. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. In the present invention, the term “specifically binds” a substance to a substance refers to, for example, an enzyme-substrate or an enzyme-chemical bond between an enzyme and an inhibitor or an activity regulator, a receptor-ligand. Means that a protein binds to a substance based on affinity and specificity as shown in the receptor chemical binding and the like. "Substantially does not have the property of altering the substance to which the protein specifically binds" means that the enzymatic reactivity with the substance is inactive. Excluding specific binding to a substance}, for example, the ability to catalyze an enzymatic chemical reaction that converts the substance into a substance represented by a chemical structural formula different from the chemical structural formula representing the substance. There are cases where they do not have them substantially. A protein "having substantially no metamorphosis" can express, for example, a gene encoding the protein in a microorganism in which the gene encoding the protein having the metamorphic property has been deleted and cannot grow under normal conditions. May be selected as an indicator that the growth of the microorganism is not complemented when introduced in a proper state. In the present invention, "substantially not containing the framework region of the immunoglobulin variable region" means that a three-dimensional structure specific to the immunoglobulin variable region is not formed.
Here, "the framework region of the variable region of the immunoglobulin" refers to the heavy chain and the light chain constituting the immunoglobulin molecule.
Of the variable regions of the chain, the hypervariable region (hypervariable regi
The remaining region excluding on) is a region in which the amino acid sequence is relatively highly conserved and serves to maintain the highly conserved three-dimensional structure of the variable region. By taking the above-mentioned three-dimensional structure of the variable region, hypervariable regions scattered at three positions of each of the H chain and the L chain are united at one position on the three-dimensional structure to form an antigen binding site [Alberts, B ., et al. ed. (19
83) Molecular Biology of the Cell p979, Garland Pub
lishing, Inc. New York]. A protein “substantially free of the framework region of the immunoglobulin variable region” can be selected, for example, based on the amino acid sequence of the protein. Proteins that do not contain an amino acid sequence consisting of about 30 amino acids or more that show about 60% or more homology with the known amino acid sequence of the framework region of the region. Whether or not the above-described framework region is contained may be determined, for example, by using a gene encoding the protein as a template and immunoglobulin.
A primer capable of amplifying a DNA having a nucleotide sequence encoding a variable region derived from an H chain or an L chain, specifically, for example, primer VH1BACK described in Clackson, T. et al., Nature 352; p624 (1991) And VH1FOR-2 or V
K2BACK and VK4FOR, or commercially available kits for cloning recombinant antibody genes, such as Recombinant Phage
Primer Heavy primers mix or Light primer mix contained in Antibody System (Pharmacia Biotech)
It can also be confirmed by performing PCR using, for example, and analyzing the presence or absence of amplification of DNA of a specific length.

【００１６】本発明方法１において使用される遺伝子に
コードされるタンパク質としては、上記(1)〜(3)の性質
を有していれば、天然に存在するタンパク質であって
も、天然のタンパク質にアミノ酸置換、付加、欠失等が
導入されてなるタンパク質であっても、ランダムなアミ
ノ酸配列を有する人為的に作出されたタンパク質の中か
ら本物質との結合性を指標に選抜されたタンパク質であ
ってもよい。尚、本発明において、「タンパク質」と
は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合し
た物質をいい、例えば、４〜１００個程度のアミノ酸が
ペプチド結合によって結合してなる物質も含まれる。上
記の性質（１）〜（３）を有するタンパク質の具体例と
して、下記のようなタンパク質をあげることができる。
プロトポルフィリンIXに特異的に結合するタンパク質と
して、例えば、マグネシウムケラターゼ(magnesium pro
toporphyrin IX chelatase)のプロトポルフィリンIX結
合サブユニットタンパク質、または該タンパク質の改変
タンパク質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結
合するタンパク質をあげることができ、より具体的に
は、該サブユニットタンパク質からオルガネラ移行シグ
ナル配列が除去されたタンパク質等があげられる。ま
た、フェロケラターゼ(protoheme ferrolyase; EC 4.9.
9.1)の改変タンパク質であって、プロトポルフィリンIX
に対する変性能を持たずプロトポルフィリンIXに特異的
に結合するタンパク質をあげることもでき、より具体的
には、フェロケラターゼにおいて鉄イオンとの結合部位
と推定される領域が改変されてなりプロトポルフィリン
IXに対する変性能を持たないタンパク質等をあげること
ができる。さらに、コバルトケラターゼ(cobaltochelat
ase)の基質結合サブユニットタンパク質、または該タン
パク質の改変タンパク質であってプロトポルフィリンIX
に特異的に結合するタンパク質をあげることもできる。
プロトポルフィリンIXに特異的に結合するタンパク質と
しては、配列番号５１もしくは５３で示されるアミノ酸
配列を含みプロトポルフィリンIXに特異的に結合するタ
ンパク質、配列番号５５もしくは５７で示されるアミノ
酸配列を含みポルフィリン化合物に特異的に結合するタ
ンパク質などをあげることもできる。このようなタンパ
ク質としては、具体的には、配列番号５１、５３、５５
もしくは５７で示されるアミノ酸配列を１回含むタンパ
ク質や、該アミノ酸配列を複数回含むタンパク質などが
あげられ、該タンパク質を構成するアミノ酸の数として
は、例えば、４個〜約１００個程度をあげることができ
る。より具体的な例としては、配列番号５２、５４、５
６もしくは５８で示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質や、配列番号５１、５３、５５もしくは５７で示さ
れるアミノ酸配列を４回もしくは８回繰返し含むタンパ
ク質、例えば、配列番号５９、６０、６１または６２で
示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等をあげるこ
とができる。プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結
合するタンパク質としては、ＰＰＯの改変タンパク質で
あって、プロトポルフィリノーゲンIXを酸化する能力を
持たずプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する
タンパク質をあげることができ、より具体的には、ＰＰ
ＯにおいてFAD結合部位と推定される領域(アミノ酸配列
GXGXXGを有する領域であって、ここでXは任意のアミノ
酸を示す。例えば、シロイヌナズナ葉緑体局在型ＰＰＯ
のアミノ末端から63〜68番目のアミノ酸からなり、アミ
ノ酸配列GGGISGを有する領域)が欠失したタンパク質等
をあげることができる。また、プロトポルフィリノーゲ
ンIXに結合するタンパク質としては、コプロポルフィリ
ノーゲンIIIオキシダーゼ(coproporphyrinogen III oxi
dase; EC 1.3.3.3)の改変タンパク質であって、プロト
ポルフィリノーゲンIXおよびコプロポルフィリノーゲン
IIIを酸化する能力を持たずプロトポルフィリノーゲンI
Xに特異的に結合するタンパク質をあげることもでき
る。上記のようなタンパク質が、細胞内で本物質と結合
することにより、該物質によって惹起される細胞機能傷
害が防がれ、雑草防除剤耐性が発現され得る。かかるタ
ンパク質をコードする遺伝子は、例えば次のようにして
得ることができる。The protein encoded by the gene used in the method 1 of the present invention may be a naturally occurring protein, as long as it has the above-mentioned properties (1) to (3). Even proteins that have amino acid substitutions, additions, deletions, etc. introduced into them, are proteins that have been selected based on the binding to the substance from among artificially created proteins having random amino acid sequences. There may be. In the present invention, the term “protein” refers to a substance in which two or more amino acids are bound by a peptide bond, and includes, for example, a substance in which about 4 to 100 amino acids are bound by a peptide bond. Specific examples of proteins having the above properties (1) to (3) include the following proteins.
Proteins that specifically bind to protoporphyrin IX include, for example, magnesium keratase (magnesium pro
toporphyrin IX chelatase), or a modified protein of the protein, which specifically binds to protoporphyrin IX, and more specifically, an organelle from the subunit protein. Examples include proteins from which the translocation signal sequence has been removed. In addition, ferrokeratase (protoheme ferrolyase; EC 4.9.
9.1) the modified protein of protoporphyrin IX,
And proteins that specifically bind to protoporphyrin IX without influencing the ability to bind to protoporphyrin IX.More specifically, a region in ferrochelatase that is presumed to be a binding site for iron ions is modified to produce protoporphyrin.
Proteins that do not have the ability to alter IX can be mentioned. Furthermore, cobalt chelatase (cobaltochelat)
ase) substrate-binding subunit protein, or a modified protein of said protein, comprising protoporphyrin IX
And proteins that specifically bind to.
Examples of the protein that specifically binds to protoporphyrin IX include a protein that specifically includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 or 53 and a protein that specifically binds to protoporphyrin IX, a porphyrin compound that includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55 or 57 And proteins that specifically bind to E. coli. Specific examples of such proteins include SEQ ID NOs: 51, 53, and 55.
Or a protein containing the amino acid sequence represented by 57 once or a protein containing the amino acid sequence plural times, and the number of amino acids constituting the protein is, for example, about 4 to about 100. Can be. As more specific examples, SEQ ID NOs: 52, 54, 5
A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 58, or a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, 53, 55 or 57 repeated 4 or 8 times, for example, represented by SEQ ID NO: 59, 60, 61 or 62 And the like consisting of the amino acid sequence of the present invention. Proteins that specifically bind to protoporphyrinogen IX include modified proteins of PPO that do not have the ability to oxidize protoporphyrinogen IX and specifically bind to protoporphyrinogen IX. And more specifically, PP
Region predicted to be the FAD binding site in O (amino acid sequence
A region having GXGXXG, where X represents any amino acid. For example, Arabidopsis chloroplast localized PPO
And a protein comprising the amino acids 63-68 from the amino terminus and lacking the amino acid sequence GGGISG). In addition, proteins that bind to protoporphyrinogen IX include coproporphyrinogen III oxidase.
dase; EC 1.3.3.3), comprising protoporphyrinogen IX and coproporphyrinogen.
Protoporphyrinogen I without the ability to oxidize III
Proteins that specifically bind to X can also be mentioned. By binding of the protein as described above to the substance in the cell, cell dysfunction caused by the substance is prevented, and resistance to the weed control agent can be expressed. A gene encoding such a protein can be obtained, for example, as follows.

【００１７】マグネシウムケラターゼのプロトポルフィ
リンIX結合サブユニットタンパク質をコードする遺伝子
としては、光合成細菌Rhodobacter capsulatus (Geneba
nk accession M74001)、シロイヌナズナ(Genebank acce
ssion Z68495)、オオムギ(Genebank accession U9621
6)、キンギョソウ(Genebank accession X73144)、Synec
hocystis P.C.C.6803(Genebank accession U29131)等由
来の遺伝子の塩基配列が知られている。このような塩基
配列既知の遺伝子は、目的の遺伝子を持つ生物のゲノム
DNAまたはcDNAを鋳型にして、その遺伝子にコードされ
るタンパク質のアミノ末端付近に相当する塩基配列およ
びカルボキシ末端付近に相当する塩基配列をもとに作製
したプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅しこ
れを単離することができる。また、上記以外の光合成生
物から、マグネシウムケラターゼのプロトポルフィリン
IX結合サブユニットタンパク質をコードする遺伝子を取
得することもできる。まず、目的とする光合成生物から
mRNAを調製し、該mRNAを鋳型として逆転写酵素を用いて
cDNAを合成し、これをZAPIIなどのファージベクターまた
はpUCなどのプラスミドベクターに組み込んでcDNAライ
ブラリーを作製する。このcDNAライブラリーを鋳型にし
て、上記のような塩基配列既知の遺伝子間で良好に保存
された塩基配列に基づき設計し合成されたプライマーを
用いてPCRを行うことによって、マグネシウムケラター
ゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質
遺伝子の少なくとも一部を含むDNA断片を増幅すること
ができる。このDNA断片をプローブにしてcDNAライブラリ
ーをスクリーニングし、陽性クローンを選抜する。選抜
したクローンの有するDNAの塩基配列を決定することに
よって、目的とするマグネシウムケラターゼのプロトポ
ルフィリンIX結合サブユニットタンパク質の遺伝子であ
ることを確認することができる。 マグネシウムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サ
ブユニットタンパク質の改変タンパク質であってプロト
ポルフィリンIXに特異的に結合するタンパク質をコード
する遺伝子を取得するには、例えば、該サブニユットタ
ンパク質の遺伝子に塩基の置換、欠失、付加等の変異を
導入し、該遺伝子をGibson, L.C.D. etal., Proc. Aca
d. Sci. USA, 92; p1941(1995)に記載の方法に準じて大
腸菌BL21(DE3)株に導入して形質転換株を取得し、導入
した遺伝子が高発現する条件で該形質転換株を培養す
る。培養菌体が赤色化し、プロトポルフィリンIXの蓄積
を示す蛍光吸収（励起波長405nm、蛍光波長630nm）が観
察される株を選抜することにより、該サブユニットタン
パク質の改変タンパク質であってプロトポルフィリンIX
に特異的に結合するタンパク質をコードする遺伝子を得
ることができる。The gene encoding the protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase includes the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus (Geneba
nk accession M74001), Arabidopsis (Genebank acce
ssion Z68495), barley (Genebank accession U9621)
6), snapdragon (Genebank accession X73144), Synec
The nucleotide sequences of genes derived from hocystis PCC6803 (Genebank accession U29131) and the like are known. Such a gene whose base sequence is known is the genome of the organism having the gene of interest.
Using DNA or cDNA as a template, amplification is performed by performing PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminus and the nucleotide sequence near the carboxy terminus of the protein encoded by the gene. This can be isolated. In addition, from the photosynthetic organisms other than the above, protoporphyrin of magnesium keratase
Genes encoding IX binding subunit proteins can also be obtained. First, from the target photosynthetic organism
Prepare mRNA, using reverse transcriptase with this mRNA as template
cDNA is synthesized, and this is inserted into a phage vector such as ZAPII or a plasmid vector such as pUC to prepare a cDNA library. By using this cDNA library as a template and performing PCR using primers designed and synthesized based on a base sequence well-conserved among genes whose base sequence is known as described above, protoporphyrin of magnesium keratase A DNA fragment containing at least a part of the IX binding subunit protein gene can be amplified. Using this DNA fragment as a probe, a cDNA library is screened to select a positive clone. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the selected clone, it can be confirmed that the gene is the protoporphyrin IX-binding subunit protein gene of the target magnesium keratase. In order to obtain a gene encoding a protein that specifically binds to protoporphyrin IX, which is a modified protein of the protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase, for example, substituting a base for the subunit protein gene , Deletion, addition, etc., and the gene was transferred to Gibson, LCD et al., Proc.
d. Sci. USA, 92; introduced into E. coli BL21 (DE3) strain according to the method described in p1941 (1995) to obtain a transformant, and transforming the transformant under conditions in which the introduced gene is highly expressed. Incubate. By selecting strains in which the culture cells turn red and exhibit fluorescence absorption (excitation wavelength 405 nm, fluorescence wavelength 630 nm) indicating accumulation of protoporphyrin IX, a modified protein of the subunit protein, protoporphyrin IX
To obtain a gene encoding a protein that specifically binds to.

【００１８】フェロケラターゼをコードする遺伝子とし
ては、これまでに大腸菌Esherichiacoli (Genebank acc
ession D90259)、枯草菌Bacillus subtilis (Genebank
accession M97208)、Bradyrhizobium japonicum (Geneb
ank accession M92427)、酵母Saccharomyces cerevisia
e (Genebank accession J05395)、マウス(Genebankacce
ssion J05697)、ヒト(Genebank accession D00726)、オ
オムギ(Genebank accession D26105)、キュウリ(Geneba
nk accession D26106)等由来の遺伝子の塩基配列が知ら
れている。このような塩基配列既知の遺伝子は、目的の
遺伝子を持つ生物のゲノムDNAもしくはcDNAを鋳型にし
て、その遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ末端
付近に相当する塩基配列およびカルボキシ末端付近に相
当する塩基配列をもとに作製したプライマーを用いてPC
Rを行うことにより、増幅し単離することができる。ま
た、塩基配列の知られていないフェロケラターゼ遺伝子
を取得するには、まず、目的とする生物からmRNAを調製
し、該mRNAを鋳型として逆転写酵素を用いてcDNAを合成
し、これをZAPIIなどのファージベクターまたはpUCなど
のプラスミドベクターに組み込んでcDNAライブラリーを
作製する。このcDNAライブラリーを、Miyamoto,K.,et a
l. Plant Physiol., 105; p769 (1994)に記載の大腸菌
のフェロケラターゼ欠失変異株VS200に導入し相補試験
を行うことによって、該cDNAライブラリーから目的の生
物由来のフェロケラターゼ遺伝子を有するクローンを選
抜することができる。また、前記cDNAライブラリーを鋳
型にして、上記のような塩基配列既知の遺伝子間で良好
に保存された塩基配列に基づき作製されたプライマーを
用いてPCRを行うことによってDNA断片を増幅し、該DNA
断片をプローブにして前記cDNAライブラリーをスクリー
ニングし、陽性クローンを選抜してもよい。このように
して選抜されたクローンの有するDNAの塩基配列を決定
することによって、目的とするフェロケラターゼ遺伝子
であることを確認することができる。 フェロケラターゼの改変タンパク質であってプロトポル
フィリンIXに対する変性能を持たずプロトポルフィリン
IXに特異的に結合するタンパク質、例えば、フェロケラ
ターゼにおいて鉄イオンとの結合部位と推定される領域
が改変されてなりプロトポルフィリンIXに対する変性能
を持たないタンパク質をコードする遺伝子を取得するに
は、該領域付近のアミノ酸配列をコードする塩基配列に
基づき、該領域に変異を導入するためのプライマーを作
製し、この変異導入プライマーを用いて、市販の部位特
異的変異導入キット(Mutan-Super Express Km、宝酒造
製)を用いたPCRを行うことにより、上記領域の変異体を
コードする遺伝子を調製することができる。具体的に
は、野生型のフェロケラターゼ遺伝子をプラスミドベク
ターpKF19kのクローニング部位に挿入し、得られたプラ
スミドのDNAを鋳型に、前述の変異導入プライマーとpKF
19kのカナマイシン耐性遺伝子上にあるアンバー変異を
復帰させるための選抜プライマーとを用いてPCRを行う。
該PCRで増幅された遺伝子を大腸菌MV1184株（サプレッ
サーフリー）に導入し、遺伝子導入株をカナマイシン耐
性で選抜することにより、目的の領域を構成するアミノ
酸に相当する塩基配列が改変されたフェロケラターゼ遺
伝子を持つ大腸菌を単離することができる。該大腸菌の
有するプラスミドDNAの塩基配列を解析することによっ
て、単離した遺伝子が目的とする改変タンパク質をコー
ドする遺伝子であることを確認することができる。[0018] As a gene encoding ferrochelatase, Escherichia coli (Genebank acc.
ession D90259), Bacillus subtilis (Genebank
accession M97208), Bradyrhizobium japonicum (Geneb
ank accession M92427), yeast Saccharomyces cerevisia
e (Genebank accession J05395), mouse (Genebankacce
ssion J05697), human (Genebank accession D00726), barley (Genebank accession D26105), cucumber (Geneba
nk accession D26106) and the like are known. Such a gene having a known base sequence is prepared by using a genomic DNA or cDNA of an organism having the gene of interest as a template, and a base sequence corresponding to the vicinity of the amino terminal and a base corresponding to the vicinity of the carboxy terminal of the protein encoded by the gene. PC using primers based on sequence
By performing R, it can be amplified and isolated. To obtain a ferrochelatase gene whose base sequence is not known, first, mRNA is prepared from the target organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template by using a reverse transcriptase, and this is used as a ZAPII or the like. A cDNA library is prepared by incorporating the plasmid into a phage vector or a plasmid vector such as pUC. This cDNA library was transferred to Miyamoto, K., et a
l. Plant Physiol., 105; p769 (1994), by introducing into a ferrochelatase deletion mutant VS200 of Escherichia coli and performing a complementation test, a clone having a ferrochelatase gene derived from the target organism was selected from the cDNA library. can do. Further, using the cDNA library as a template, a DNA fragment is amplified by performing PCR using primers prepared based on a nucleotide sequence well-conserved between genes having a known nucleotide sequence as described above, DNA
The cDNA library may be screened using the fragment as a probe to select a positive clone. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the clone thus selected, it can be confirmed that the clone is the target ferrochelatase gene. Protoporphyrin, a modified protein of ferrochelatase, that has no altering ability for protoporphyrin IX
To obtain a gene encoding a protein that specifically binds to IX, for example, a protein in which a region presumed to be a binding site for iron ions in ferrochelatase is modified and has no metamorphic property to protoporphyrin IX, Based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence in the vicinity of the region, a primer for introducing a mutation into the region is prepared, and a commercially available site-directed mutagenesis kit (Mutan-Super Express Km, By performing PCR using Takara Shuzo, a gene encoding a mutant in the above region can be prepared. Specifically, the wild-type ferrochelatase gene was inserted into the cloning site of the plasmid vector pKF19k, and the above-mentioned mutagenesis primer and pKF
PCR is performed using a selection primer for reversing the amber mutation on the 19k kanamycin resistance gene.
By introducing the gene amplified by the PCR into Escherichia coli MV1184 strain (suppressor-free) and selecting the transgenic strain with kanamycin resistance, a ferrokeratase gene having a modified base sequence corresponding to the amino acid constituting the target region was obtained. Can be isolated. By analyzing the base sequence of the plasmid DNA of the Escherichia coli, it can be confirmed that the isolated gene is a gene encoding the desired modified protein.

【００１９】配列番号５１、５３、５５もしくは５７で
示されるアミノ酸配列を４回もしくは８回繰返し含むタ
ンパク質をコードする遺伝子は、例えば、開始コドンAT
Gの後ろに前記アミノ酸配列をコードする塩基配列が所
定の回数繰返されてなる塩基配列を選定し、該塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドおよび該塩基配列に相補的
な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、DNA合成装
置を用いてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせ
ることによって作製することができる。また、配列番号
５２、５４、５６もしくは５８で示されるアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードする遺伝子は、該アミノ酸
配列をコードする塩基配列を選定し、該塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドおよび該塩基配列に相補的な塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドを、DNA合成装置を用
いて合成し、これらをアニーリングさせることによって
作製することができる。ここで、所定のアミノ酸配列を
コードする塩基配列を選定する際には、例えば、植物由
来の遺伝子において頻度高く使用されているコドンを選
ぶとよい。A gene encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, 53, 55 or 57 repeated four or eight times may be, for example, the start codon AT
After G, a base sequence encoding the amino acid sequence is selected a base sequence repeated a predetermined number of times, an oligonucleotide consisting of the base sequence and an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence, DNA It can be manufactured by synthesizing each using a synthesizer and annealing them. For a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, 54, 56 or 58, a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence is selected, and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence and complementary to the nucleotide sequence are selected. Oligonucleotides consisting of a specific base sequence can be synthesized by using a DNA synthesizer and annealed. Here, when selecting a base sequence encoding a predetermined amino acid sequence, for example, a codon frequently used in a plant-derived gene may be selected.

【００２０】ＰＰＯ遺伝子は、これまでに大腸菌Esheri
chia coli (Genebank accession X68660)、枯草菌Bacil
lus subtilis (Genebank accession M97208)、Haemophi
lusinflunzae (Genebank accession L42023)、マウス(G
enebank accession D45185)、ヒト(Genebank accession
D38537)、シロイヌナズナ(Genebank accession D8313
9)、タバコ(Genebank accession Y13465, Y13466)等由
来の遺伝子の塩基配列が知られている。このような塩基
配列既知の遺伝子は、目的の遺伝子を持つ生物のゲノム
DNAもしくはcDNAを鋳型にして、その遺伝子にコードさ
れるタンパク質のアミノ末端付近に相当する塩基配列お
よびカルボキシ末端付近に相当する塩基配列をもとに作
製したプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅
し、これを単離することができる。また、塩基配列の知
られていないＰＰＯ遺伝子を取得するには、まず、目的
の遺伝子を持つ生物から前述の方法でcDNAライブラリー
を作製する。このcDNAライブラリーを、Narita,S., et
al., Gene, 182; p169 (1996)等に記載の大腸菌のＰＰ
Ｏ欠失変異株VSR800に導入し相補試験を行うことによっ
て、該cDNAライブラリーから目的の生物由来のＰＰＯ遺
伝子を有するクローンを選抜することができる。また、
前記cDNAライブラリーを鋳型にして、上記のような塩基
配列既知の遺伝子間で良好に保存された塩基配列に基づ
き作製されたプライマーを用いてPCRを行うことによっ
てDNA断片を増幅し、該DNA断片をプローブにして前記cD
NAライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを選
抜してもよい。選抜されたクローンの有する塩基配列を
決定することによって、目的とするＰＰＯ遺伝子である
ことを確認することができる。 ＰＰＯの改変タンパク質であって、プロトポルフィリノ
ーゲンIXを酸化する尿力を持たずプロトポルフィリノー
ゲンIXに特異的に結合するタンパク質の遺伝子を取得す
るには、例えば、ＰＰＯ遺伝子に塩基の置換、欠失、付
加等の変異を導入し、該改変遺伝子をＰＰＯ阻害型除草
剤処理によって光依存的に増殖が阻害される上述の大腸
菌に導入する。該大腸菌をヘミン、アミノレブリン酸お
よびＰＰＯ阻害型除草剤存在下に培養して明所でも生育
可能なクローンを選抜することにより、プロトポルフィ
リノーゲンIX結合能を有するタンパク質をコードする遺
伝子を選抜することができる。このようにして選抜され
た改変遺伝子を大腸菌等の宿主細胞で発現させて該遺伝
子のコードするタンパク質を調製し、得られたタンパク
質のプロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化能を、例
えば、Jacob,N.J.and Jacobs,J.M.(1982) Enzyme, 28,
206-219等に記載の方法に準じて測定することにより、
プロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化能を持たない
タンパク質の遺伝子を選抜することができる。より具体
的には、上記改変遺伝子を大腸菌用の発現ベクターに挿
入して、Yamamoto,F.et al., Japanese J. Genet.,63;
p237(1988)等に記載されている大腸菌BT3株のような、
ＰＰＯ遺伝子(hemG遺伝子座)欠損突然変異系統大腸菌に
導入し、該大腸菌に導入したベクター上の選抜マーカー
に対応する細胞生育阻害剤に加えヘミンおよびアミノレ
ブリン酸を含む培地で該大腸菌を培養して形質転換株を
取得し、該形質転換株から上記改変遺伝子のコードする
タンパク質を調製してもよい。また、該形質転換株をヘ
ミンおよびアミノレブリン酸を実質的に含まない培地で
培養し、生育しない株を確認することにより、該形質転
換株からその宿主細胞のＰＰＯ遺伝子欠損を相補しない
遺伝子を得ることができ、かかる方法をプロトポルフィ
リノーゲンIXに対する酸化能を持たないタンパク質をコ
ードする遺伝子の選抜に利用してもよい。また、ＰＰＯ
においてFADとの結合部位と推定される領域(アミノ酸配
列GXGXXGを有する領域であって、ここでＸは任意のアミ
ノ酸を示す。)を欠失したタンパク質をコードする遺伝
子を取得するには、まず、該領域付近のアミノ酸配列を
コードする塩基配列に基づき、該領域の欠失変異を導入
するためのプライマーを作製する。この変異導入プライ
マーを用いて、前述のように市販の部位特異的変異導入
キット(Mutan-Super Express Km、宝酒造製)を用いてPC
Rを行い該領域の欠失変異体をコードする遺伝子を調製
することができる。The PPO gene has been used in Escherichia coli Esheri
chia coli (Genebank accession X68660), Bacillus subtilis Bacil
lus subtilis (Genebank accession M97208), Haemophi
lusinflunzae (Genebank accession L42023), mouse (G
enebank accession D45185), human (Genebank accession
D38537), Arabidopsis (Genebank accession D8313)
9), base sequences of genes derived from tobacco (Genebank accession Y13465, Y13466) and the like are known. Such a gene whose base sequence is known is the genome of the organism having the gene of interest.
Using DNA or cDNA as a template, amplification is performed by performing PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminus and the nucleotide sequence near the carboxy terminus of the protein encoded by the gene. Can be isolated. To obtain a PPO gene whose base sequence is not known, first, a cDNA library is prepared from an organism having a target gene by the above-described method. This cDNA library was purchased from Narita, S., et.
al., Gene, 182; PP of Escherichia coli described in p169 (1996) and the like.
By introducing the gene into the O-deletion mutant VSR800 and performing a complementation test, a clone having the PPO gene derived from the target organism can be selected from the cDNA library. Also,
Using the cDNA library as a template, amplify a DNA fragment by performing PCR using primers prepared based on a base sequence well-conserved among genes whose base sequence is known as described above, Using the above cD
The NA library may be screened to select positive clones. By determining the nucleotide sequence of the selected clone, it can be confirmed that it is the target PPO gene. To obtain a gene for a protein that is a modified protein of PPO and specifically binds to protoporphyrinogen IX without urinary ability to oxidize protoporphyrinogen IX, for example, substitution of a base into the PPO gene, Mutations such as deletion and addition are introduced, and the modified gene is introduced into Escherichia coli described above whose growth is inhibited in a light-dependent manner by treatment with a PPO-inhibiting herbicide. Selecting a gene encoding a protein having binding ability to protoporphyrinogen IX by culturing the Escherichia coli in the presence of hemin, aminolevulinic acid and a PPO-inhibiting herbicide and selecting a clone capable of growing in the light; Can be. The modified gene selected in this manner is expressed in a host cell such as Escherichia coli to prepare a protein encoded by the gene. , JM (1982) Enzyme, 28,
By measuring according to the method described in 206-219 etc.,
A gene of a protein having no oxidizing ability to protoporphyrinogen IX can be selected. More specifically, the modified gene is inserted into an expression vector for Escherichia coli, Yamamoto, F. et al., Japanese J. Genet., 63;
such as the E. coli BT3 strain described in p237 (1988), etc.
A PPO gene (hemG locus) -deficient mutant strain Escherichia coli was introduced, and the Escherichia coli was cultured in a medium containing hemin and aminolevulinic acid in addition to a cell growth inhibitor corresponding to the selectable marker on the vector introduced into the Escherichia coli. A transformant may be obtained, and a protein encoded by the modified gene may be prepared from the transformant. Further, by culturing the transformant in a medium substantially free of hemin and aminolevulinic acid, and confirming the strain that does not grow, obtaining a gene that does not complement the PPO gene deficiency of the host cell from the transformant Such a method may be used for selecting a gene encoding a protein having no ability to oxidize protoporphyrinogen IX. Also, PPO
In order to obtain a gene encoding a protein in which a region presumed to be a binding site to FAD (a region having the amino acid sequence GXGXXG, where X represents an arbitrary amino acid), Based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence near the region, a primer for introducing a deletion mutation in the region is prepared. Using this mutagenesis primer, as described above, using a commercially available site-directed mutagenesis kit (Mutan-Super Express Km, Takara Shuzo)
By performing R, a gene encoding a deletion mutant of the region can be prepared.

【００２１】コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダー
ゼをコードする遺伝子としては、これまでに大腸菌Eshe
richia coli (Genebank accession X75413)、Salmonell
a typhimurium (Genebank accession L19503)、酵母Sac
charomyces cerevisiae (Genebank accession J0387
3)、マウス(Genebank accession D16333)、ヒト(Geneba
nk accession D16611)、ダイズ(Genebank accession X7
1083)、オオムギ(Genebank accession X82830)、タバコ
(Genebank accession X82831)等由来の遺伝子の塩基配
列が知られている。このような塩基配列既知の遺伝子
は、目的の遺伝子を持つ生物のゲノムDNAもしくはcDNA
を鋳型にして、その遺伝子にコードされるタンパク質の
アミノ末端付近に相当する塩基配列およびカルボキシ末
端付近に相当する塩基配列をもとに作製したプライマー
を用いてPCRを行うことにより、増幅し単離することが
できる。また、塩基配列の知られていないコプロポルフ
ィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子を取得するには、
まず、目的とする生物からmRNAを調製し、該mRNAを鋳型
として逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、これをSikorsk
i,R.S. et al. Genetics, 122; p19 (1989)に記載のpRS
313などのプラスミドベクターに組み込んでcDNAライブ
ラリーを作製する。このcDNAライブラリーを、Troup, B.
et al. J. Bacteriol., 176; p673 (1994)に記載の酵
母コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ欠失変異
株HEM13に導入して相補試験を行い、生育可能なクロー
ンを選抜することによって、該cDNAライブラリーから目
的の生物由来のコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダ
ーゼ遺伝子を有するクローンを選抜することができる。
また、前記cDNAライブラリーを鋳型にして、上記のよう
な塩基配列既知の遺伝子間で良好に保存された塩基配列
に基づき作製されたプライマーを用いてPCRを行うこと
によってDNA断片を増幅し、該DNA断片をプローブにして
前記cDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性クロー
ンを選抜してもよい。このようにして選抜されたクロー
ンの有するDNAの塩基配列を決定することによって、目
的とするコプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子であることを確認することができる。 コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼの改変タン
パク質であって、プロトポルフィリノーゲンIXおよびコ
プロポルフィリノーゲンIIIに対する酸化能を持たずプ
ロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合するタンパク
質の遺伝子を取得するには、例えば、コプロポルフィリ
ノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子に塩基の置換、欠失、
付加等の変異を導入し、該改変遺伝子をＰＰＯ阻害型除
草剤処理によって光依存的に増殖が阻害される上述の大
腸菌に導入する。該大腸菌をヘミン、アミノレブリン酸
およびＰＰＯ阻害型除草剤存在下に培養して明所でも生
育可能なクローンを選抜することにより、プロトポルフ
ィリノーゲンIX結合能を有するタンパク質をコードする
遺伝子を選抜することができる。このようにして選抜さ
れた改変遺伝子を、例えば、大腸菌等の宿主細胞で発現
させて該遺伝子のコードするタンパク質を調製し、得ら
れたタンパク質のプロトポルフィリノーゲンIXに対する
酸化能を、例えば、Jacob,N.J.and Jacobs,J.M.(1982)
Enzyme, 28, 206-219等に記載の方法に準じて測定する
ことにより、プロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化
能を持たないタンパク質の遺伝子を選抜することができ
る。さらに、前記のようにして大腸菌から調製されたタ
ンパク質について、コプロポルフィリノーゲンIIIをプ
ロトポルフィリノーゲンIXに変換する能力(コプロポル
フィリノーゲンIIIオキシダーゼ活性)を、例えば、Yosh
inaga, T.,Sano,S., J. Biol. Chem., 255; p4722(198
0)等に記載の方法に準じて測定することにより、コプロ
ポルフィリノーゲンIIIに対する酸化能を持たないタン
パク質の遺伝子を選抜することができる。The gene encoding coproporphyrinogen III oxidase has so far been Escherichia coli Eshe
richia coli (Genebank accession X75413), Salmonell
a typhimurium (Genebank accession L19503), yeast Sac
charomyces cerevisiae (Genebank accession J0387
3), mouse (Genebank accession D16333), human (Geneba
nk accession D16611), soybean (Genebank accession X7
1083), barley (Genebank accession X82830), tobacco
(Genebank accession X82831) and the like are known. Such a gene whose base sequence is known is a genomic DNA or cDNA of an organism having the gene of interest.
Amplified and isolated by performing PCR using primers prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminal and the nucleotide sequence near the carboxy terminal of the protein encoded by the gene as a template can do. To obtain a coproporphyrinogen III oxidase gene whose base sequence is not known,
First, mRNA is prepared from the target organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template using reverse transcriptase, and
pRS described in i, RS et al. Genetics, 122; p19 (1989)
A cDNA library is prepared by incorporating it into a plasmid vector such as 313. This cDNA library was transferred to Troup, B.
et al. J. Bacteriol., 176; p673 (1994), introduced into the yeast coproporphyrinogen III oxidase deletion mutant HEM13, performed a complementation test, and selected a viable clone to obtain the cDNA. From the library, a clone having a coproporphyrinogen III oxidase gene derived from the target organism can be selected.
Further, using the cDNA library as a template, a DNA fragment is amplified by performing PCR using primers prepared based on a nucleotide sequence well-conserved between genes having a known nucleotide sequence as described above, The cDNA library may be screened using a DNA fragment as a probe to select a positive clone. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the clone selected in this way, it can be confirmed that the gene is the target coproporphyrinogen III oxidase gene. In order to obtain a gene for a protein that is a modified protein of coproporphyrinogen III oxidase and does not have the ability to oxidize protoporphyrinogen IX and coproporphyrinogen III and specifically binds to protoporphyrinogen IX, For example, base substitution, deletion, in coproporphyrinogen III oxidase gene,
A mutation such as addition is introduced, and the modified gene is introduced into Escherichia coli described above whose growth is inhibited in a light-dependent manner by treatment with a PPO-inhibiting herbicide. Selecting a gene encoding a protein having binding ability to protoporphyrinogen IX by culturing the Escherichia coli in the presence of hemin, aminolevulinic acid and a PPO-inhibiting herbicide and selecting a clone capable of growing in the light; Can be. The modified gene thus selected is expressed, for example, in a host cell such as Escherichia coli, to prepare a protein encoded by the gene. , NJand Jacobs, JM (1982)
By measuring according to the method described in Enzyme, 28, 206-219, etc., a gene of a protein having no ability to oxidize protoporphyrinogen IX can be selected. Further, for the protein prepared from E. coli as described above, the ability to convert coproporphyrinogen III to protoporphyrinogen IX (coproporphyrinogen III oxidase activity), for example, Yosh
inaga, T., Sano, S., J. Biol. Chem., 255; p4722 (198
By performing the measurement according to the method described in (0) and the like, a gene of a protein having no oxidizing ability to coproporphyrinogen III can be selected.

【００２２】本物質に特異的に結合可能なタンパク質の
遺伝子は、例えば、Sugimoto,N., Nakano,S., Chem. Le
tt., p939(1997)等に記載のように、コンビナトリアル
ケミストリー法を用いて合成されたペプチドライブラリ
ーから本物質に対して結合性を示すペプチドを選抜し、
選抜されたペプチドのアミノ酸配列をペプチドシークエ
ンサーで解析し、該アミノ酸配列をコードする塩基配列
を含む遺伝子を設計してこれをDNA合成装置等で合成す
ることによっても、取得することができる。また、ファ
ージディスプレー法を用いて、本物質に対して結合性を
有するタンパク質を提示するファージクローンをファー
ジライブラリーから選抜し取得することもできる。具体
的には、例えば、M13ファージ遺伝子のコートタンパク
質pIIIをコードする領域の上流側に、ランダムなアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を挿入
することによって、M13ファージ粒子表面にランダムな
アミノ酸配列を有するタンパク質が提示されたファージ
ライブラリーを構築する。一方、ビオチン標識化した本物
質を、アビジンもしくはストレプトアビジンでコートし
たプレートに結合させることにより、本物質でコートさ
れた支持体を作製する。前述のファージライブラリーを
この本物質でコートされたプレート上でスクリーニング
すると、本物質に結合性のある目的のタンパク質を提示
したファージを単離することができ、単離されたファー
ジから目的のタンパク質の遺伝子を取得することができ
る。The genes of proteins capable of specifically binding to this substance are described, for example, in Sugimoto, N., Nakano, S., Chem.
As described in tt., p939 (1997), etc., a peptide showing a binding property to the substance was selected from a peptide library synthesized using a combinatorial chemistry method,
It can also be obtained by analyzing the amino acid sequence of the selected peptide with a peptide sequencer, designing a gene containing a base sequence encoding the amino acid sequence, and synthesizing it with a DNA synthesizer or the like. Further, a phage clone displaying a protein having a binding property to the present substance can be selected from a phage library and obtained by using a phage display method. Specifically, for example, by inserting a nucleotide sequence encoding a protein having a random amino acid sequence upstream of the region encoding the coat protein pIII of the M13 phage gene, a random amino acid sequence on the surface of the M13 phage particle To construct a phage library displaying a protein having On the other hand, a biotin-labeled substance is bound to a plate coated with avidin or streptavidin to prepare a support coated with the substance. When the phage library described above is screened on a plate coated with this substance, a phage displaying a target protein capable of binding to the substance can be isolated. Gene can be obtained.

【００２３】本発明方法２において使用される遺伝子
は、下記の(1)〜(3)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子である。 （１）プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 （２）プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持
たない。 （３）免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない。 ここで、「プロトポルフィリンIXに特異的に結合する」
とは、前述のごとく、例えば、酵素と基質、または、酵
素と阻害剤もしくは活性調節因子との間の酵素化学的結
合、受容体とリガンドとの間の受容体化学的結合等にお
いて示されるような親和性と特異性に基いて、当該タン
パク質がプロトポルフィリンIXに結合することを意味す
る。また、「プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性
能を持たない」とは、プロトポルフィリノーゲンIXとの
酵素化学的な反応性が不活性であることを意味し、例え
ば、プロトポルフィリノーゲンIXを、その化学構造式と
は異なる化学構造式で示される物質に変換する酵素化学
的反応を触媒する能力を実質的に持たない場合をあげる
ことができる。「免疫グロブリンの可変領域のフレーム
ワーク領域を実質的に含まない」とは、前述のとおり、
免疫グロブリンの可変領域に特有の立体構造を形成しな
いことを意味する。本発明方法２に使用される遺伝子に
コードされるタンパク質としては、上記(1)〜(3)の性質
を有していれば、天然に存在するタンパク質であって
も、天然のタンパク質にアミノ酸置換、付加、欠失等が
導入されてなるタンパク質であっても、ランダムなアミ
ノ酸配列を有する人為的に作出されたタンパク質の中か
ら本物質との結合性を指標に選抜されたタンパク質であ
ってもよい。このようなタンパク質の具体例としては、
例えば、マグネシウムケラターゼ、および、マグネシウ
ムケラターゼの改変タンパク質であってプロトポルフィ
リンIXに特異的に結合しプロトポルフィリノーゲンIXを
変性する能力を持たないタンパク質をあげることができ
る。また、フェロケラターゼ、および、フェロケラター
ゼの改変タンパク質であって、プロトポルフィリンIXに
特異的に結合しプロトポルフィリノーゲンIXを変性する
能力を持たないタンパク質をあげることもできる。さら
に、配列番号５１もしくは５３で示されるアミノ酸配列
を含みプロトポルフィリンIXに特異的に結合するタンパ
ク質、配列番号５５もしくは５７で示されるアミノ酸配
列を含みポルフィリン化合物に特異的に結合するタンパ
ク質などをあげることもできる。このようなタンパク質
としては、具体的には、配列番号５１、５３、５５もし
くは５７で示されるアミノ酸配列を１回含むタンパク質
や、該アミノ酸配列を複数回含むタンパク質などがあげ
られ、該タンパク質を構成するアミノ酸の数としては、
例えば、４個〜約１００個程度をあげることができる。
より具体的な例としては、配列番号５２、５４、５６も
しくは５８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
や、配列番号５１、５３、５５もしくは５７で示される
アミノ酸配列を４回もしくは８回繰返し含むタンパク
質、例えば、配列番号５９、６０、６１または６２で示
されるアミノ酸配列からなるタンパク質等をあげること
もできる。The gene used in the method 2 of the present invention is a gene encoding a protein having the following properties (1) to (3). (1) Specific binding to protoporphyrin IX. (2) It does not have the ability to transform protoporphyrinogen IX. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. Here, "specifically binds to protoporphyrin IX"
As described above, for example, as indicated in an enzymatic chemical bond between an enzyme and a substrate or an enzyme and an inhibitor or an activity modulator, a receptor chemical bond between a receptor and a ligand, and the like. Means that the protein binds to protoporphyrin IX based on high affinity and specificity. Further, `` has no metamorphic property to protoporphyrinogen IX '' means that the enzymatic chemical reactivity with protoporphyrinogen IX is inactive, for example, protoporphyrinogen IX, There may be mentioned a case where the compound does not substantially have the ability to catalyze an enzymatic chemical reaction for converting into a substance represented by a chemical structural formula different from the chemical structural formula. "Substantially free of the framework regions of the immunoglobulin variable regions", as described above,
It does not form a conformation unique to the variable region of an immunoglobulin. As the protein encoded by the gene used in the method 2 of the present invention, even if it has the above-mentioned properties (1) to (3), even if it is a naturally-occurring protein, it can be substituted with a natural protein by amino acid substitution. , Addition, deletion, etc., even if the protein is selected from the artificially created protein having a random amino acid sequence based on the binding to the substance as an index Good. Specific examples of such proteins include:
For example, magnesium keratase and modified proteins of magnesium keratase which specifically bind to protoporphyrin IX and do not have the ability to denature protoporphyrinogen IX can be mentioned. In addition, ferrochelatase and modified proteins of ferrochelatase, which specifically bind to protoporphyrin IX and do not have the ability to denature protoporphyrinogen IX, can also be mentioned. Further, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 or 53 and specifically binding to protoporphyrin IX, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55 or 57 and specifically binding to a porphyrin compound, and the like are mentioned. You can also. Specific examples of such a protein include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, 53, 55, or 57 once, a protein containing the amino acid sequence multiple times, and the like. The number of amino acids
For example, about 4 to about 100 pieces can be given.
As a more specific example, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, 54, 56 or 58 or a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, 53, 55 or 57 repeated 4 or 8 times For example, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59, 60, 61 or 62 can be mentioned.

【００２４】上記のタンパク質をコードする遺伝子は、
例えば、以下のようにして取得することができる。マグ
ネシウムケラターゼは、プロトポルフィリンIXにマグネ
シウムイオンを配位しマグネシウムポルフィリンIXを生
成する能力を有し、プロトポルフィリンIX結合サブユニ
ットタンパク質、Ｉサブユニットタンパク質およびＤサ
ブユニットタンパク質で構成される。マグネシウムケラ
ターゼを植物で発現させるには、これらの３つのサブユ
ニットタンパク質をコードする遺伝子を取得する。マグ
ネシウムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユ
ニットタンパク質をコードする遺伝子は、前記の方法で
取得することができる。マグネシウムケラターゼのＩサ
ブユニットタンパク質をコードする遺伝子として、光合
成細菌Rhodobacter sphaerides (Genebank accession A
F017642)、光合成細菌Rhodobacter capsulatus (Geneba
nk accession Z11165)、シロイヌナズナ(Genebank acce
ssion D49426)、オオムギ(Genebank accession U2654
5)、ダイズ(Genebank accession D45857)、タバコ(Gene
bank accession AF14053)、Synechocystis P.C.C.6803
(Genebank accession U35144)等由来の遺伝子が知られ
ている。このような公知の遺伝子(塩基配列が公知)は、
目的の遺伝子を持つ生物のゲノムDNAまたはcDNAを鋳型
にして、その遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ
末端付近に相当する塩基配列およびカルボキシ末端付近
に相当する塩基配列をもとに作製したプライマーを用い
てPCRを行うことにより増幅しこれを単離することがで
きる。また、上記以外の光合成生物から、マグネシウム
ケラターゼＩサブユニットタンパク質をコードする遺伝
子を取得することもできる。まず、目的とする光合成生
物からmRNAを調製し、該mRNAを鋳型として逆転写酵素を
用いてcDNAを合成し、これをZAPIIなどのファージベクタ
ーまたはpUCなどのプラスミドベクターに組み込んでcDN
Aライブラリーを作製する。このcDNAライブラリーを鋳型
にして、上記のような公知の遺伝子との間で良好に保存
された塩基配列に基づき設計し合成されたプライマーを
用いてPCRを行うことによって、マグネシウムケラター
ゼのIサブユニットタンパク質の遺伝子の少なくとも一
部を含むDNAを増幅することができる。このDNAをプロー
ブにしてcDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性ク
ローンを選抜する。選抜したクローンの有するDNAの塩基
配列を決定することによって、目的とするマグネシウム
ケラターゼのＩサブユニットタンパク質の遺伝子である
ことを確認することができる。 また、マグネシウムケラターゼのＤサブユニットタンパ
ク質をコードする遺伝子として、光合成細菌Rhodobacte
r sphaerides (Genebank accession AJ001690)、光合成
細菌Rhodobacter capsulatus (Genebank accession Z11
165)、エンドウ(Genebank accession AF014399)、タバ
コ(Genebank accession Y10022)、Synechocystis P.C.
C.6803(Genebank accession X96599)等由来の遺伝子が
知られている。マグネシウムケラターゼDサブユニットタ
ンパク質をコードする遺伝子は、前記のマグネシウムケ
ラターゼＩサブユニットタンパク質をコードする遺伝子
を取得する方法と同様の方法で取得することができる。
これらの3つのサブユニットタンパク質からなるマグネ
シウムケラターゼの活性の検出は、例えば、Gibson, L.
C.D. et al., Proc. Acad. Sci. USA, 92; p1941(1995)
等に記載の方法に準じて実施することができる。フェロ
ケラターゼをコードする遺伝子は前述の方法で取得する
ことができる。フェロケラターゼの活性の検出は、例え
ば、Porra, R.J., Anal. Biochem., 68;p289(1975)等に
記載の方法に準じて実施することができる。The gene encoding the above protein is
For example, it can be obtained as follows. Magnesium keratase has the ability to coordinate magnesium ions to protoporphyrin IX to generate magnesium porphyrin IX, and is composed of protoporphyrin IX binding subunit protein, I subunit protein and D subunit protein. To express magnesium keratase in plants, genes encoding these three subunit proteins are obtained. The gene encoding the protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase can be obtained by the above-described method. As a gene encoding the I subunit protein of magnesium keratase, a photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaerides (Genebank accession A
F017642), photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus (Geneba
nk accession Z11165), Arabidopsis (Genebank acce
ssion D49426), barley (Genebank accession U2654)
5), soybean (Genebank accession D45857), tobacco (Gene
bank accession AF14053), Synechocystis PCC6803
(Genebank accession U35144) and the like are known. Such a known gene (having a known base sequence)
Using a genomic DNA or cDNA of the organism having the gene of interest as a template, a primer prepared based on the nucleotide sequence near the amino terminus and the nucleotide sequence near the carboxy terminus of the protein encoded by that gene is used. Amplification and isolation can be performed by performing PCR. In addition, a gene encoding a magnesium keratase I subunit protein can be obtained from a photosynthetic organism other than those described above. First, mRNA is prepared from the desired photosynthetic organism, cDNA is synthesized using the mRNA as a template using reverse transcriptase, and this is incorporated into a phage vector such as ZAPII or a plasmid vector such as pUC to obtain cDN.
Create A library. Using this cDNA library as a template, PCR is performed using primers designed and synthesized based on the base sequence well-conserved between the above-mentioned known genes, and the I-subunit of magnesium keratase is obtained. DNA containing at least a part of the gene of the unit protein can be amplified. Using this DNA as a probe, a cDNA library is screened to select positive clones. By determining the nucleotide sequence of the DNA of the selected clone, it can be confirmed that the gene is the gene for the target I subunit protein of magnesium keratase. In addition, a gene encoding the D subunit protein of magnesium keratase is used as a photosynthetic bacterium Rhodobacte.
r sphaerides (Genebank accession AJ001690), photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus (Genebank accession Z11
165), pea (Genebank accession AF014399), tobacco (Genebank accession Y10022), Synechocystis PC
Genes derived from C.6803 (Genebank accession X96599) and the like are known. The gene encoding the magnesium keratase D subunit protein can be obtained by the same method as the method for obtaining the gene encoding the magnesium keratase I subunit protein.
Detection of the activity of magnesium keratase consisting of these three subunit proteins is described, for example, in Gibson, L.
CD et al., Proc.Acad.Sci. USA, 92; p1941 (1995)
And the like. The gene encoding ferrochelatase can be obtained by the method described above. The detection of the activity of ferrochelatase can be carried out, for example, according to the method described in Porra, RJ, Anal. Biochem., 68; p289 (1975) and the like.

【００２５】本発明方法３において使用される遺伝子
は、下記の(1)〜(3)の性質を有するタンパク質をコード
する遺伝子である。 （１）プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合す
る。 （２）コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を
持つ。 （３）免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域
を実質的に含まない。 「プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する」と
は、前述のごとく、例えば、酵素と基質、または、酵素
と阻害剤もしくは活性調節因子との間の酵素化学的結
合、受容体とリガンドとの間の受容体化学的結合等にお
いて示されるような親和性と特異性に基いて、当該タン
パク質がプロトポルフィリノーゲンIXに結合することを
意味する。「コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変
性能を持つ」とは、コプロポルフィリノーゲンIIIに対
して酵素化学的な反応性があることを意味し、例えば、
コプロポルフィリノーゲンIIIを、その化学構造式とは
異なる化学構造式で示される物質に変換する酵素化学的
反応を触媒する能力を実質的に持つ場合をあげることが
できる。具体的には例えば、コプロポルフィリノーゲン
IIIをプロトポルフィリノーゲンIXに変換する能力(コプ
ロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ活性)をあげるこ
とができ、該変換能力は、例えば、Yoshinaga, T.,San
o,S., J. Biol. Chem., 255; p4722(1980)等に記載の方
法に準じて測定することができる。「免疫グロブリンの
可変領域のフレームワーク領域を実質的に含まない」と
は、前述のとおり、免疫グロブリンの可変領域に特有の
立体構造を形成しないことを意味する。本発明方法３に
おいて使用される遺伝子にコードされるタンパク質とし
ては、上記(1)〜(3)の性質を有していれば、天然に存在
するタンパク質であっても、天然のタンパク質にアミノ
酸置換、付加、欠失等が導入されてなるタンパク質であ
っても、ランダムなアミノ酸配列を有する人為的に作出
されたタンパク質の中から本物質との結合性を指標に選
抜されたタンパク質であってもよい。このようなタンパ
ク質としては、具体的には、コプロポルフィリノーゲン
IIIオキシダーゼ、および、コプロポルフィリノーゲンI
IIオキシダーゼの改変タンパク質であってコプロポルフ
ィリノーゲンIIIを酸化してプロトポルフィリノーゲンI
Xを生成する能力を持つタンパク質などがあげられる。
コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼをコードす
る遺伝子は、例えば、前述の方法で取得することができ
る。The gene used in the method 3 of the present invention is a gene encoding a protein having the following properties (1) to (3). (1) Specific binding to protoporphyrinogen IX. (2) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. "Specifically binds to protoporphyrinogen IX" refers to, as described above, for example, an enzyme and a substrate, or an enzymatic chemical bond between an enzyme and an inhibitor or activity modulator, a receptor and a ligand. Means that the protein binds to protoporphyrinogen IX on the basis of affinity and specificity as shown in receptor chemical binding and the like. "Having an ability to transform coproporphyrinogen III" means that there is enzymatic chemical reactivity with coproporphyrinogen III, for example,
Coproporphyrinogen III may be substantially capable of catalyzing an enzymatic chemical reaction that converts coproporphyrinogen III into a substance represented by a chemical structural formula different from its chemical structural formula. Specifically, for example, coproporphyrinogen
The ability to convert III to protoporphyrinogen IX (coproporphyrinogen III oxidase activity) can be given, for example, Yoshinaga, T., San
o, S., J. Biol. Chem., 255; p4722 (1980) and the like. The expression "substantially free of the framework region of the immunoglobulin variable region" means that a three-dimensional structure specific to the immunoglobulin variable region is not formed, as described above. As the protein encoded by the gene used in the method 3 of the present invention, even if it has the above-mentioned properties (1) to (3), even if it is a naturally-occurring protein, it can be substituted with a naturally-occurring protein by amino acid substitution. , Addition, deletion, etc., even if the protein is selected from the artificially created protein having a random amino acid sequence based on the binding to the substance as an index Good. Specific examples of such proteins include coproporphyrinogen
III oxidase and coproporphyrinogen I
A modified protein of II oxidase that oxidizes coproporphyrinogen III to oxidize protoporphyrinogen I
Examples include proteins capable of producing X.
The gene encoding coproporphyrinogen III oxidase can be obtained, for example, by the method described above.

【００２６】本発明方法１〜３においては、各方法にお
いて必要とされる性質を具備する上述のようなタンパク
質（以下、一括して本タンパク質という。）をコードす
る遺伝子を、目的の植物の細胞に導入し発現させる。本
タンパク質をコードする遺伝子の１種類を細胞に導入し
てもよいし、異なる本タンパク質をコードする複数種の
遺伝子を導入してもよい。遺伝子を植物の細胞に導入す
る方法としては、アグロバクテリウム感染方法(特公平2
-58917および特開昭60-70080)、プロトプラストへのエ
レクトロポレーション方法(特開昭60-251887および特開
平5-68575)、またはパーティクルガン方法(特表平5-508
316および特開昭63-258525)などの公知の手段を用いる
ことができる。細胞に導入する遺伝子は、細胞生育阻害
剤耐性を該細胞に付与し得る遺伝子などの選抜マーカー
遺伝子を有するベクターに組み込んでおくとよい。本タ
ンパク質をコードする遺伝子を植物の細胞で発現させる
には、相同組換え[Fraley,R.T. et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 80; p4803 (1983)]によって該遺伝子を
植物の染色体に導入し該遺伝子を発現する細胞を選抜し
てもよいし、該遺伝子をあらかじめ、植物細胞で機能可
能なプロモーターおよび植物細胞で機能可能なターミネ
ーターと機能可能な形で結合させて、これを細胞に導入
してもよい。ここで、「機能可能な形で」とは、本タン
パク質をコードする遺伝子が、導入される植物の細胞に
おいて前記プロモーターおよびターミネーターの制御下
に発現するように、これらのプロモーターおよびターミ
ネーターと結合された状態にあることを意味する。植物
細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、ノパ
リン合成酵素遺伝子プロモーター、オクトピン合成酵素
遺伝子プロモーター等のT-DNA由来の構成型プロモータ
ー、カリフラワーモザイクウィルス由来の19Sプロモー
ターもしくは35Sプロモーター等の植物ウィルス由来の
プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺
伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモー
ター、Pathogenesis-related protein遺伝子プロモータ
ー等の誘導型プロモーターなどを挙げることができる。
さらに、これらに限定されない他の植物プロモーターを
用いてもよい。また、植物細胞で機能可能なターミネー
ターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子ターミ
ネーターなどT-DNA由来のターミネーター、ニンニクウ
ィルスGV1,GV2のターミネーターなどの植物ウィルス由
来のターミネーターなどを挙げることができる。さら
に、これらに限定されない他の植物ターミネーターを用
いるてもよい。In the methods 1 to 3 of the present invention, a gene encoding the above-described protein having the properties required in each method (hereinafter collectively referred to as the present protein) is replaced with a target plant cell. And expressed. One kind of the gene encoding the present protein may be introduced into a cell, or a plurality of kinds of genes encoding different present proteins may be introduced. Methods for introducing genes into plant cells include the Agrobacterium infection method (Japanese Patent Publication No.
-58917 and JP-A-60-70080), an electroporation method for protoplasts (JP-A-60-251887 and JP-A-5-68575), or a particle gun method (Tokuhyohei 5-508)
316 and JP-A-63-258525) can be used. The gene to be introduced into the cell is preferably incorporated into a vector having a selectable marker gene such as a gene capable of imparting cell growth inhibitor resistance to the cell. To express the gene encoding this protein in plant cells, homologous recombination [Fraley, RT et al., Proc. Natl.
cad. Sci. USA, 80; p4803 (1983)], the gene may be introduced into the chromosome of a plant, and a cell expressing the gene may be selected. It may be operably linked to a terminator operable in a plant cell and introduced into the cell. Here, `` in a operable form '' means that the gene encoding the present protein is linked to these promoter and terminator such that the gene is expressed under the control of the promoter and terminator in a plant cell to be introduced. Means in state. Examples of a promoter operable in a plant cell include, for example, a nopaline synthase gene promoter, a constitutive promoter derived from T-DNA such as an octopine synthase gene promoter, a plant virus such as a cauliflower mosaic virus-derived 19S promoter or 35S promoter. Inducible promoters such as a promoter, a phenylalanine ammonia lyase gene promoter, a chalcone synthase gene promoter, and a Pathogenesis-related protein gene promoter can be exemplified.
Further, other plant promoters not limited to these may be used. Examples of the terminator that can function in a plant cell include a T-DNA-derived terminator such as a nopaline synthase gene terminator, and a plant virus-derived terminator such as a garlic virus GV1 or GV2 terminator. Further, other plant terminators not limited to these may be used.

【００２７】かかる遺伝子を導入する細胞としては、植
物組織、植物個体、培養細胞、種子などを用いることが
できる。また、かかる遺伝子を導入する植物種として
は、例えば、タバコ、ワタ、ナタネ、テンサイ、シロイ
ヌナズナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、バレイショ、ア
ルファルファ、レタス、バナナ、ダイズ、エンドウ、そ
の他のマメ類、マツ、ポプラ、リンゴ、ブドウ、オレン
ジ、レモン、その他の柑橘類、アーモンド、クルミ、そ
の他のナッツ類等の双子葉植物、トウモロコシ、イネ、
コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ソルガム、オ
ートムギ、サトウキビ、芝類等の単子葉植物をあげるこ
とができる。導入された遺伝子を発現する形質転換植物
細胞は、該遺伝子が導入された細胞を、該遺伝子に座上
・連結させた選抜マーカー遺伝子に対応する選抜用培
地、例えば細胞生育阻害剤を含む培地等で培養し、該培
地において増殖可能なクローンを単離することによって
取得することができる。また、前記形質転換植物細胞
は、遺伝子が導入された細胞を、耐性付与対象の雑草防
除剤またはその有効成分を含む培地で培養し増殖可能な
クローンを単離することによっても選抜することができ
る。このようにして得られた形質転換植物細胞から、例
えば、植物遺伝子操作マニュアル：トランスジェニック
植物の作り方（内宮著、講談社サイエンティフィック19
90年）、27-55頁などに記載されている植物細胞培養方
法により植物体を再生させることによって、導入された
遺伝子を発現する植物を得ることができる。より具体的
には、例えば、モデル植物の実験プロトコール イネ・
シロイヌナズナ編（島本功、岡田清孝監修、秀潤社1996
年）、第4章に記載の方法によって、本タンパク質をコ
ードする遺伝子を発現するイネやシロイヌナズナを得る
ことができる。また、特開平3-291501に記載されている
方法で、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入
し、本タンパク質をコードする遺伝子を発現するダイズ
を得ることができる。同様に、Fromm,M.E.,et al. Bio/
Technology, 8; p838(1990)に記載されている方法に準
じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に
導入し、本タンパク質をコードする遺伝子を発現するト
ウモロコシを得ることができ、宅見ら著、育種学会雑
誌、1995年、第44巻、別冊1号、57頁に記載されている
通常の方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培
養したコムギ未熟胚盤に導入し、本タンパク質をコード
する遺伝子を発現するコムギを得ることができる。同様
に、萩尾ら著、育種学会雑誌、1995年、第44巻、別冊1
号、67頁に記載されている通常の方法に準じて、パーテ
ィクルガンを用いて無菌培養したオオムギ未熟胚盤に導
入し、本タンパク質をコードする遺伝子を発現するオオ
ムギを得ることができる。本タンパク質をコードする遺
伝子を発現する植物の雑草防除剤耐性を確認するには、
該植物の栽培域に耐性付与の対象の雑草防除剤を散布
し、該植物の生育度を測定するとよい。より定量的に確
認するには、例えば、ＰＰＯ阻害型除草剤に対する耐性
植物の場合、該植物の葉片を様々な濃度のＰＰＯ阻害型
除草剤を含む水溶液中に浸すか、または、該植物の葉片
に除草剤水溶液を噴霧し寒天培地上で明所室温で放置
し、数日後、該葉片からMacknney, G., J. Bol. Chem.,
140; p315(1941)に記載の方法に準じてクロロフィルを
抽出してクロロフィル含量を測定するとよい。As the cells into which such a gene is introduced, plant tissues, plant individuals, cultured cells, seeds and the like can be used. Examples of plant species into which such genes are introduced include, for example, tobacco, cotton, rape, sugar beet, Arabidopsis, canola, flax, sunflower, potato, alfalfa, lettuce, banana, soybean, pea, other legumes, pine, poplar Dicotyledonous plants such as apples, grapes, oranges, lemons, other citrus fruits, almonds, walnuts, other nuts, corn, rice,
Monocotyledonous plants such as wheat, barley, rye, oat, sorghum, oats, sugarcane, turf and the like can be mentioned. A transformed plant cell that expresses the introduced gene may be a selection medium corresponding to a selection marker gene linked to the gene-transfected cell, for example, a medium containing a cell growth inhibitor. And a clone capable of growing in the medium is isolated. The transformed plant cells can also be selected by culturing the cells into which the gene has been introduced in a medium containing a weed-controlling agent to which resistance is to be imparted or a medium containing the active ingredient thereof, and isolating a clone capable of growing. . From the transformed plant cells thus obtained, for example, a plant gene manipulation manual: How to make a transgenic plant (by Uchimiya, Kodansha Scientific 19)
1990), pp. 27-55, and the like, and a plant expressing the introduced gene can be obtained by regenerating the plant by the plant cell culture method. More specifically, for example, experimental protocols for rice plants
Arabidopsis edited by Isao Shimamoto and Kiyotaka Okada, Shujunsha 1996
By the method described in Chapter 4, rice and Arabidopsis thaliana expressing the gene encoding the present protein can be obtained. Further, a soybean expressing a gene encoding the present protein can be obtained by introducing the gene encoding the present protein into a soybean somatic embryo using a particle gun by a method described in JP-A-3-291501. Similarly, Fromm, ME, et al. Bio /
Technology, 8; In accordance with the method described in p838 (1990), transfected into a maize somatic embryo using a particle gun, it is possible to obtain corn expressing a gene encoding the present protein. According to the usual method described in the Journal of the Japanese Society of Breeding, 1995, Vol. 44, Separate Volume 1, page 57, introduced into a wheat immature scutellum aseptically cultured using a particle gun and encodes the protein Wheat expressing the gene can be obtained. Similarly, Hagio et al., Journal of Japanese Society of Breeding, 1995, Vol. 44, separate volume 1
No., p. 67, and introduced into a barley immature scutellum aseptically cultured using a particle gun to obtain a barley expressing a gene encoding the present protein. To confirm the resistance of a plant expressing the gene encoding the present protein to a weed control agent,
It is preferable to spray a weed controlling agent for imparting resistance to the cultivation area of the plant and measure the growth of the plant. To confirm more quantitatively, for example, in the case of a plant resistant to a PPO-inhibiting herbicide, the leaf pieces of the plant are immersed in an aqueous solution containing various concentrations of the PPO-inhibiting herbicide, or Sprayed with an aqueous solution of a herbicide and allowed to stand on an agar medium at room temperature in the light, and several days later, Macknney, G., J. Bol. Chem.,
140; p315 (1941), chlorophyll may be extracted and the chlorophyll content measured according to the method described in p315 (1941).

【００２８】本発明によって得られる雑草防除剤耐性植
物は、雑草防除剤に対して耐性を示すため、雑草防除剤
が散布された場合も良好に生育することができる。従っ
て、本発明によって目的の栽培植物に雑草防除剤に対す
る雑草防除剤耐性を付与し、該植物を栽培してその栽培
域に前記の雑草防除剤を散布することにより、該植物以
外の雑草を効率よく取り除くことができ、該栽培植物の
収量の向上、高品質化、使用する除草剤の量の軽減、省
力化などが可能となる。The weed controlling agent-tolerant plant obtained according to the present invention is resistant to the weed controlling agent, and therefore can grow well even when the weed controlling agent is sprayed. Therefore, by imparting the weed control agent resistance to the weed control agent to the target cultivated plant according to the present invention, by cultivating the plant and spraying the weed control agent on the cultivation area, weeds other than the plant can be efficiently treated. The cultivated plant can be removed well, so that the yield of the cultivated plant can be improved, the quality can be improved, the amount of the herbicide to be used can be reduced, and labor can be saved.

【００２９】[0029]

【実施例】以下、実施例および参考例により本発明をよ
り詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples and reference examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００３０】参考例１ マグネシウムケラターゼのプロ
トポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質遺伝子の
単離 光合成細菌Rhodobacter sphaeroides ATCC17023のゲノ
ムDNAをゲノムDNA調製用のキットISOPLANT(ニッポンジ
ーン社製)を用いて調製した。次いで、Gibson,L.C.D. e
t al., Proc. Acad. Sci. USA, 92; p1941(1995)の記載
に従い、該ゲノムDNA約1μgを鋳型にし、配列番号１で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配
列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド各10pmolをプライマーに用いてPCRを行い、マグネシ
ウムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニッ
トタンパク質遺伝子bchHを含むＤＮＡ断片を増幅した。
なお、該オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプラ
イドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesi
zer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチド精製用カー
トリッジ（PEアプライドバイオシステムズ社：OPC カー
トリッジ）で精製した。また、ＰＣＲは、94℃にて2分
間次いで96℃にて40秒間さらに68℃にて7分間の保温を1
回行った後、96℃にて40秒間次いで68℃にて7分間の保
温を１サイクルとしてこれを28回実施し、最後に、96℃
にて40秒間次いで68℃にて7分間さらに72℃にて10分間
の保温を1回行った。Reference Example 1 Isolation of Protoporphyrin IX Binding Subunit Protein Gene of Magnesium Keratase Genomic DNA of the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides ATCC17023 was prepared using a genomic DNA preparation kit ISOPLANT (Nippon Gene). Next, Gibson, LCD e
Acad. Sci. USA, 92; p1941 (1995), and using about 1 μg of the genomic DNA as a template, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 PCR was performed using 10 pmol of each oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence as a primer to amplify a DNA fragment containing the protoporphyrin IX binding subunit protein gene bchH of magnesium keratase.
The oligonucleotide was used in a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesi
and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). In addition, PCR was carried out at 94 ° C. for 2 minutes, then at 96 ° C. for 40 seconds, and further at 68 ° C. for 7 minutes.
This cycle was repeated 28 times, with the heat retention at 96 ° C for 40 seconds and then at 68 ° C for 7 minutes as one cycle.
For 40 seconds and then at 68 ° C. for 7 minutes and at 72 ° C. for 10 minutes once.

【００３１】参考例２ 大腸菌におけるマグネシウムケ
ラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタン
パク質遺伝子の発現 Gibson, L.C.D. et al., Proc. Acad. Sci. USA, 92; p
1941(1995)の記載に従って、参考例1において調製され
たbchH遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素NdeIとBglII
で消化し、得られたＤＮＡ断片を発現ベクターpET11a(S
tratagene社製)のNdeI切断部位とBamHI切断部位の間に
挿入することにより、プラスミドpETBCH（図１）を作製
した。このプラスミドpETBCHを大腸菌BL21(DE3)株のコ
ンピテントセル(Stratagene社製)に、該コンピテントセ
ル添付の使用マニュアルの記載に従って導入し、大腸菌
BL21(DE3)/pETBCH株を得た。該菌株を試験管（14×10 m
m）に入れたアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地
（1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl）1.5 m
lに接種し、試験管をアルミ箔で覆って（以下、暗所条
件と記す。）３７℃で蛍光燈の照明下(約8000 lux)にて
振とう培養した。培養液の600nmにおける吸光度が約0.6
に達したとき、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノ
シド(IPTG)を最終濃度0.4mMとなるよう該培養液に添加
し、さらに約20時間培養を継続したところ、Gibson, L.
C.D. et al., Proc. Acad. Sci. USA,92; p1941(1995)
に記載の通り、該大腸菌は赤色化し、該大腸菌において
プロトポルフィリンIXの蓄積を示す蛍光吸収（励起波長
405nm、蛍光波長630nm）が観察された。なお、大腸菌BL
21(DE3)/pETBCH株をIPTGを添加せずに前記と同様に培養
した場合は、大腸菌の赤色化が認められず、前記の蛍光
吸収も検出されなかった。一方、大腸菌BL21(DE3)/pETB
CH株を、前記と同様にIPTGを添加して、ただしアルミ箔
で試験管を覆わずに（以下、明所条件と記す。）培養し
たところ、該大腸菌株は前記と同様に増殖し赤色化し
た。Reference Example 2 Expression of Protoporphyrin IX Binding Subunit Protein Gene of Magnesium Keratase in Escherichia coli Gibson, LCD et al., Proc. Acad. Sci. USA, 92; p.
According to the description of 1941 (1995), the DNA fragment containing the bchH gene prepared in Reference Example 1 was digested with the restriction enzymes NdeI and BglII.
The resulting DNA fragment was digested with the expression vector pET11a (S
Plasmid pETBCH (FIG. 1) was prepared by insertion between the NdeI cleavage site and BamHI cleavage site of tratagene. This plasmid pETBCH was introduced into competent cells of Escherichia coli BL21 (DE3) strain (manufactured by Stratagene) as described in the instruction manual attached to the competent cells.
BL21 (DE3) / pETBCH strain was obtained. The strain was placed in a test tube (14 × 10 m
LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 100 μg / ml ampicillin
The test tubes were covered with aluminum foil (hereinafter referred to as dark conditions) and cultured at 37 ° C. with shaking under fluorescent light (about 8000 lux). The absorbance of the culture at 600 nm is about 0.6
Reached, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 0.4 mM, and the culture was further continued for about 20 hours.
CD et al., Proc.Acad.Sci. USA, 92; p1941 (1995)
As described in the above, the Escherichia coli turns red, and fluorescence absorption indicating the accumulation of protoporphyrin IX in the Escherichia coli (excitation wavelength
405 nm, fluorescence wavelength 630 nm) were observed. In addition, E. coli BL
When the 21 (DE3) / pETBCH strain was cultured in the same manner as described above without adding IPTG, red coloration of Escherichia coli was not observed, and the fluorescence absorption was not detected. On the other hand, E. coli BL21 (DE3) / pETB
When the CH strain was cultured in the same manner as described above with the addition of IPTG, but without covering the test tube with aluminum foil (hereinafter referred to as light conditions), the E. coli strain grew and became red as described above. did.

【００３２】参考例３ hemG遺伝子欠失大腸菌における
ダイズ由来ＰＰＯ遺伝子の発現 ダイズ(Glycine max var. Williams82)を播種後、25℃
で20日間栽培し、緑葉を採取した。採取した緑葉5gを液
体窒素で凍結させ、これを乳鉢と乳棒で磨砕し、該磨砕
物から、RNA抽出試薬ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用
いて付属のマニュアルにしたがってRNAを抽出した。得
られたRNA抽出液からエタノール沈殿で全RNAを回収し、
これをpoly(A)RNA分画キットBIOMAG mRNA Purification
Kit(パーセプティブバイオシステム社製)を用いて付属
のマニュアルに準じて分画し、poly(A)RNA画分を回収し
た。このpoly(A)RNA画分1μgを鋳型に用いてMarathon c
DNAamplification kit(Clontech社製)に含まれるcDNA合
成試薬を用い付属のマニュアルに従ってcDNAを合成し
た。得られたcDNAを鋳型にして、配列番号３で示される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４
で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプラ
イマーに使ってPCRを行い、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を含
むDNA断片を増幅した。なお、該オリゴヌクレオチドはD
NA合成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model
394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌ
クレオチド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシ
ステムズ社：OPC カートリッジ）で精製した。また、Ｐ
ＣＲは、94℃にて1分間次いで65℃にて5分間の保温を1
回行った後、94℃にて15秒間次いで65℃にて5分間の保
温１サイクルとしてこれを29回実施した。PCR反応後、
反応液をMicroSpin S-400HR(ファルマシアバイオテク社
製)で濾過することによって、増幅されたDNA断片を精製
し、該DNA断片を、制限酵素SalIで切断されたプラスミ
ドpCR2.1(Invitrogen社製)と連結することにより、プラ
スミドpSPPO-Pを得た。次いで、該プラスミドを大腸菌I
NVαF'株のコンピテントセル(Invitrogen社製)に導入
し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜され
たアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列
をDye terminator cycle sequencing kit(PEアプライド
バイオシステムズ社製)およびDNAシークエンサー373S(P
Eアプライドバイオシステムズ社製)を用いて決定した。
その結果、配列番号５で示される塩基配列が明らかとな
り、プラスミドpSPPO-Pはダイズの葉緑体型ＰＰＯ遺伝
子を含むことが確認された。このプラスミドpSPPO-Pを
制限酵素PshBIで消化し、得られたＤＮＡ断片の末端をT
4 DNA polymeraseを用いて平滑化した後、さらにSphIで
消化し、ダイズの葉緑体型ＰＰＯ遺伝子とlacプロモー
ターとを含むDNA断片を単離した。次に、プラスミドpAC
YC184（ニッポンジーン社製）を制限酵素NruIとSphIで
消化し、410bpの断片を除去してこれに替えて前記DNA断
片を挿入することにより、プラスミドpACYCSP（図２）
を得た。次いで、該プラスミドpACYCSPを、Yamamoto,F.
et al.,Japanese J. Genet.,63; p237(1988)等に記載さ
れているＰＰＯ遺伝子(hemG遺伝子座)欠損突然変異系統
大腸菌BT3株にHanahan,D.J., Mol. Biol., 166; p557(1
983)に記載の方法に従って導入し、これを15μg/mlクロ
ランフェニコール、10μg/mlカナマイシンを含むYPT培
地(5g/l酵母エキス, 5g/lトリプトン, 5g/lペプトン, 1
0g/l NaCl, pH7.0)で培養することにより、クロランフ
ェニコールおよびカナマイシンに耐性であり、hemG遺伝
子欠失がダイズ由来のＰＰＯ遺伝子で相補された大腸菌
BT3/pACYCSP株を選抜した。Reference Example 3 Expression of PPO Gene Derived from Soybean in Escherichia coli Deleting the hemG Gene Soybean (Glycine max var. Williams 82) was inoculated at 25 ° C.
For 20 days, and green leaves were collected. 5 g of the collected green leaves were frozen with liquid nitrogen, ground with a mortar and pestle, and RNA was extracted from the ground with an RNA extraction reagent ISOGEN (Nippon Gene) according to the attached manual. Total RNA was collected from the obtained RNA extract by ethanol precipitation,
This is poly (A) RNA fractionation kit BIOMAG mRNA Purification
Using a Kit (manufactured by Perceptive Biosystems), fractionation was performed according to the attached manual, and a poly (A) RNA fraction was collected. Using 1 μg of this poly (A) RNA fraction as a template, Marathon c
Using the cDNA synthesis reagent included in the DNAamplification kit (Clontech), cDNA was synthesized according to the attached manual. Using the obtained cDNA as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4
PCR was performed using an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by the above as a primer to amplify a DNA fragment containing the chloroplast PPO gene. The oligonucleotide is D
NA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model
394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Also, P
The CR is kept at 94 ° C for 1 minute and then at 65 ° C for 5 minutes.
This was performed 29 times as one heat retention cycle at 94 ° C. for 15 seconds and then at 65 ° C. for 5 minutes. After the PCR reaction,
The reaction solution was filtered through MicroSpin S-400HR (Pharmacia Biotech) to purify the amplified DNA fragment, and the DNA fragment was treated with plasmid pCR2.1 (Invitrogen) cut with restriction enzyme SalI. By ligation, plasmid pSPPO-P was obtained. The plasmid was then transformed into E. coli I
The strain was introduced into competent cells of NVαF ′ strain (manufactured by Invitrogen), and ampicillin-resistant strains were selected. Furthermore, the nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was analyzed using a Dye terminator cycle sequencing kit (manufactured by PE Applied Biosystems) and a DNA sequencer 373S (P
E Applied Biosystems).
As a result, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 was clarified, and it was confirmed that the plasmid pSPPO-P contained the soybean chloroplast PPO gene. This plasmid pSPPO-P was digested with the restriction enzyme PshBI, and the end of the obtained DNA fragment was
4 After blunting using DNA polymerase, the fragment was further digested with SphI to isolate a DNA fragment containing the soybean chloroplast PPO gene and the lac promoter. Next, the plasmid pAC
YC184 (manufactured by Nippon Gene) was digested with restriction enzymes NruI and SphI, the 410 bp fragment was removed, and the DNA fragment was inserted in place of the fragment to obtain plasmid pACYCSP (FIG. 2).
I got Then, the plasmid pACYCSP, Yamamoto, F.
et al., Japanese J. Genet., 63; p237 (1988) and the like.Hanahan, DJ, Mol. Biol., 166; p557 ( 1
983) and introduced into a YPT medium containing 5 μg / ml chloramphenicol and 10 μg / ml kanamycin (5 g / l yeast extract, 5 g / l tryptone, 5 g / l peptone, 1 g
0g / l NaCl, pH 7.0), the cells were resistant to chloramphenicol and kanamycin, and the hemG gene deletion was complemented with the soybean-derived PPO gene.
The BT3 / pACYCSP strain was selected.

【００３３】実施例１ マグネシウムケラターゼのプロ
トポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質の除草剤
耐性付与能の試験 参考例３で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株を、前記
構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を10また
は1ppm含み、10μg/mlヘミン、50μg/mlアミノレブリン
酸、15μg/mlクロランフェニコールおよび10μg/mlカナ
マイシンを含むYPT培地に接種し、参考例２と同様にし
て暗所条件下または明所条件下に培養した。なお、対照
として、該除草性化合物を含まない上記培地を用い大腸
菌BT3/pACYCSP株を同様に培養した。培養開始18時間後
に、培養液の600nmにおける吸光度を測定し、該除草性
化合物を含まない培地で培養したときの吸光度を１と
し、該除草性化合物を含む培地で培養した場合の吸光度
の相対値を求めた。結果を表１に示す。Example 1 Test of the ability of magnesium keratase to impart herbicide resistance to protoporphyrin IX binding subunit protein The E. coli BT3 / pACYCSP strain prepared in Reference Example 3 was
Inoculating a YPT medium containing 10 or 1 ppm of a PPO-inhibiting herbicidal compound represented by Structural Formula 8 and containing 10 μg / ml hemin, 50 μg / ml aminolevulinic acid, 15 μg / ml chloramphenicol and 10 μg / ml kanamycin, In the same manner as in Example 2, the cells were cultured under dark or light conditions. As a control, Escherichia coli BT3 / pACYCSP strain was similarly cultured using the above-mentioned medium containing no herbicidal compound. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 1 shows the results.

【００３４】[0034]

【表１】 [Table 1]

【００３５】配列番号１で示される塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドおよび配列番号２で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて参考
例1と同様に光合成細菌Rhodobacter sphaeroides由来の
bchH遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ
断片を制限酵素NcoIとBglIIで消化し、これをプラスミ
ドpTV118N(宝酒造社製)のNcoI切断部位とBamHI切断部位
の間に挿入することにより、プラスミドpTVBCH（図３）
を構築した。該プラスミドpTVBCHおよびpTV118Nをそれ
ぞれ、参考例3で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株にHana
han,D.J., Mol. Biol., 166; p557(1983)に記載の方法
に従って導入し、これらを100μg/mlアンピシリン、15
μg/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイシンを
含むYPT培地で培養することにより、プラスミドpACYCSP
とpTVBCHとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTVBCH株およびプ
ラスミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+
pTV118N株を得た。これらの大腸菌株を、前記 構造式8
で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を10または1ppm含
み、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlクロランフェニ
コール、10μg/mlカナマイシン、10μg/mlヘミンおよび
50μg/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地に接種し、参
考例２と同様にして暗所条件下または明所条件下に培養
した。培養開始18時間後に、培養液の600nmにおける吸
光度を測定し、該除草性化合物を含まない培地で培養し
たときの吸光度を１とし、該除草性化合物を含む培地で
培養した場合の吸光度の相対値を求めた。結果を表２に
示す。An oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 were used as primers in the same manner as in Reference Example 1 to derive from the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides.
The DNA fragment containing the bchH gene was amplified and the resulting DNA
The fragment was digested with restriction enzymes NcoI and BglII, and inserted into the plasmid pTV118N (Takara Shuzo) between the NcoI cleavage site and the BamHI cleavage site to obtain the plasmid pTVBCH (FIG. 3).
Was built. The plasmids pTVBCH and pTV118N were each added to the Escherichia coli BT3 / pACYCSP strain prepared in Reference Example 3 by Hanana.
han, DJ, Mol. Biol., 166; p557 (1983), and these were introduced at 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml.
By culturing in YPT medium containing μg / ml chloramphenicol and 10 μg / ml kanamycin, plasmid pACYCSP
Escherichia coli BT3 / pACYCSP + with pTVBCH and E. coli BT3 / pACYCSP + with plasmids pACYCSP and pTV118N
pTV118N strain was obtained. These E. coli strains were converted to
Containing 10 or 1 ppm of a PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the formula: 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml hemin and
YPT medium containing 50 μg / ml aminolevulinic acid was inoculated, and cultured under dark or light conditions in the same manner as in Reference Example 2. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 2 shows the results.

【００３６】[0036]

【表２】 [Table 2]

【００３７】また、これらの大腸菌株を、前記の構造式
１、構造式１４、構造式１５、構造式１８〜２２、構造
式２９、構造式３２、構造式３３、構造式３４または構
造式３６で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物のいずれ
かを含み、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlクロラン
フェニコール、10μg/mlカナマイシン、10μg/mlヘミン
および50μg/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地に接種
し、参考例２と同様にして暗所条件下または明所条件下
に培養した。培養開始18時間後に、培養液の600nmにお
ける吸光度を測定し、除草性化合物を含まない培地で培
養したときの吸光度を１とし、該除草性化合物を含む培
地で培養した場合の吸光度の相対値を求めた。結果を表
３に示す。These Escherichia coli strains were prepared by the above-mentioned structural formula 1, structural formula 14, structural formula 15, structural formulas 18 to 22, structural formula 29, structural formula 32, structural formula 33, structural formula 34 or structural formula 36. And inoculated in a YPT medium containing 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml hemin and 50 μg / ml aminolevulinic acid, containing In the same manner as in Reference Example 2, the cells were cultured under dark or bright conditions. 18 hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was defined as 1. I asked. Table 3 shows the results.

【００３８】[0038]

【表３】 [Table 3]

【００３９】実施例２ マグネシウムケラターゼのプロ
トポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質をコード
する遺伝子のタバコへの導入 bchH遺伝子をアグロバクテリウム法で植物へ導入するた
めのプラスミドを構築した。まず、バイナリーベクター
pBI121(Clontech社製)を制限酵素SacIで消化しKpnIリン
カー(宝酒造製)を挿入して、pBI121のSacI認識部位を除
去しKpnI認識部位を付加したプラスミドpBIKを作製し
た。一方、参考例１記載の方法と同様に、配列番号６で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ
ーおよび配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、光合成細菌Rhodobac
ter sphaeroides のゲノムDNAを鋳型にしてＰＣＲを実
施することによりbchH遺伝子を含むDNA断片を増幅し
た。次いで、前記プラスミドpBIKを制限酵素XbaIとKpnI
で消化することによりβ-glucuronidase遺伝子を除去
し、これに替えて、前記のbchH遺伝子を含むDNA断片を
制限酵素XbaIとKpnIで消化して得られるDNA断片を挿入
し、35Sプロモーターの下流にbchH遺伝子が結合されて
なるプラスミドpBIBCH（図４）を作製した。また、バイ
ナリーベクターpBI121(Clontech社製)を制限酵素BamHI
とSacIで消化することによりβ-glucuronidase遺伝子を
除去し、得られたＤＮＡ断片の末端をT4 DNA polymeras
eを用いて平滑化した後、T4 DNA ligaseを用いて自己環
化させプラスミドpNO(図５)を構築した。該プラスミド
はbchH発現プラスミドpBIBCHのベクターコントロールと
して用いた。該プラスミドpBIBCHおよびpNOをそれぞ
れ、Agrobacterium tumefaciens LBA4404に導入し、こ
れらを300μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlリファ
ンピシン、25μg/mlカナマイシンを含む培地で培養して
形質転換体を選抜することによってpBIBCHを持つアグロ
バクテリウム株およびpNOを持つアグロバクテリウム株
を単離した。次いで、植物遺伝子操作マニュアル(内宮
博文著、講談社サイエンティフィック、1992年)に記載
されている方法に準じて、タバコへの遺伝子導入を行っ
た。プラスミドpBIBCHを持つアグロバクテリウム株をLB
培地(0.5% Yeast extract, 1.0% Bacto tryptone, 0.5%
NaCl)中で28℃にて終夜培養し、該培養液に無菌培養し
たタバコ(Nicotiana tabacum cv. SR1)の葉片を浸漬し
た。該タバコ葉片を0.8%寒天、0.1mg/lナフタレン酢酸
および1.0mg/lベンジルアミノプリンを含むMurashige
T. and Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, p473に
記載のMurashige-Skoog培地(MS培地)上で室温にて2日間
培養した。次に、該タバコ葉片を滅菌水で洗浄した後、
0.8%寒天、0.1mg/lナフタレン酢酸、1.0mg/lベンジルア
ミノプリン、および、500μg/mlセフォタキシムを含むM
S培地上で7日間培養した。次いで、該タバコ葉片を0.8%
寒天、0.1mg/lナフタレン酢酸、1.0mg/lベンジルアミノ
プリン、500μg/mlセフォタキシム、および、100μg/ml
カナマイシンを含むMS培地(以下、選抜用MS培地と記
す。)上に移植し培養した。該培養は、前記タバコ葉片
を1ヶ月後毎に新鮮な選抜用MS培地に移植しながら継続
的に４ヶ月間実施した。この間に、該タバコ葉片から出
現した茎葉分化したシュートを、0.8%寒天、300μg/ml
セフォタキシム、および、50μg/mlカナマイシンを含む
MS培地に移植して発根させ再生個体を得た。該再生個体
を0.8%寒天、および、50μg/mlカナマイシンを含むMS培
地に移植して培養し、bchH遺伝子が導入されたタバコ個
体を取得した。また、同様にして、pNOを持つアグロバ
クテリウム株をタバコの葉片に感染させ、該タバコ葉片
から再生個体を得て、タバコ個体（以下、コントロール
組換えタバコと記す。）を取得した。Example 2 Introduction of Gene Encoding Protoporphyrin IX Binding Subunit Protein of Magnesium Keratase into Tobacco A plasmid for introducing the bchH gene into plants by the Agrobacterium method was constructed. First, the binary vector
pBI121 (manufactured by Clontech) was digested with a restriction enzyme SacI, a KpnI linker (manufactured by Takara Shuzo) was inserted, the SacI recognition site of pBI121 was removed, and a plasmid pBIK having a KpnI recognition site added was prepared. On the other hand, in the same manner as in the method described in Reference Example 1, the photosynthetic bacterium Rhodobac
A DNA fragment containing the bchH gene was amplified by performing PCR using the genomic DNA of ter sphaeroides as a template. Next, the plasmid pBIK was replaced with the restriction enzymes XbaI and KpnI.
The β-glucuronidase gene was removed by digestion with a DNA fragment obtained by digesting the DNA fragment containing the bchH gene with the restriction enzymes XbaI and KpnI in place of this, and bchH downstream of the 35S promoter. A plasmid pBIBCH (FIG. 4) to which the gene was linked was prepared. In addition, the binary vector pBI121 (Clontech) was replaced with the restriction enzyme BamHI.
The β-glucuronidase gene was removed by digestion with SacI and the end of the obtained DNA fragment was T4 DNA polymeras
After blunting using e, self-cyclization was performed using T4 DNA ligase to construct a plasmid pNO (FIG. 5). This plasmid was used as a vector control for the bchH expression plasmid pBIBCH. Each of the plasmids pBIBCH and pNO was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, and these were cultured in a medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin, and a transformant was selected. Bacterium strains and Agrobacterium strains with pNO were isolated. Next, the gene was introduced into tobacco according to the method described in a plant gene manipulation manual (Hirofumi Uchimiya, Kodansha Scientific, 1992). LB Agrobacterium strain carrying plasmid pBIBCH
Medium (0.5% Yeast extract, 1.0% Bacto tryptone, 0.5%
(NaCl) at 28 ° C. overnight, and aseptically cultured tobacco (Nicotiana tabacum cv. SR1) leaf pieces were immersed in the culture solution. Murashige containing 0.8% agar, 0.1 mg / l naphthalene acetic acid and 1.0 mg / l benzylaminopurine
It was cultured at room temperature for 2 days on a Murashige-Skoog medium (MS medium) described in T. and Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, p473. Next, after washing the tobacco leaf pieces with sterile water,
M containing 0.8% agar, 0.1 mg / l naphthalene acetic acid, 1.0 mg / l benzylaminopurine, and 500 μg / ml cefotaxime
The cells were cultured on S medium for 7 days. Then 0.8% of the tobacco leaf pieces
Agar, 0.1 mg / l naphthalene acetic acid, 1.0 mg / l benzylaminopurine, 500 μg / ml cefotaxime, and 100 μg / ml
The cells were transplanted and cultured on an MS medium containing kanamycin (hereinafter, referred to as an MS medium for selection). The culturing was continuously performed for 4 months while transplanting the tobacco leaf pieces into a fresh MS medium for selection every one month. During this time, shoots differentiated in foliage emerged from the tobacco leaf pieces were 0.8% agar, 300 μg / ml
Contains cefotaxime and 50 μg / ml kanamycin
Transplanted into MS medium and rooted to obtain regenerated individuals. The regenerated individual was transplanted and cultured in an MS medium containing 0.8% agar and 50 μg / ml kanamycin to obtain a tobacco individual into which the bchH gene had been introduced. Similarly, an Agrobacterium strain having pNO was transmitted to tobacco leaf pieces, and a regenerated individual was obtained from the tobacco leaf pieces to obtain tobacco individuals (hereinafter referred to as control recombinant tobacco).

【００４０】実施例３ マグネシウムケラターゼのプロ
トポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質をコード
する遺伝子の導入されたタバコの除草剤耐性試験 実施例２で得られたbchH遺伝子が導入されたタバコの葉
およびコントロール組換えタバコの葉を採取して、これ
らをそれぞれ主葉脈に沿って左右均等に２分割し、一方
の葉片に前記 構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除草性
化合物を0.3ppmの濃度で含む水溶液を全面に塗布した。
尚、他方の葉片には前記の除草性化合物の塗布を行なわ
なかった。これらの葉片を、0.8%寒天を含むMS培地上に
置き、明所、室温にて7日間放置した。次いで、各葉片
を、それぞれ乳鉢と乳棒で5mlの80%アセトン水溶液中で
磨砕してクロロフィルを抽出した。抽出液を80%アセト
ン水溶液で10倍に希釈した後、750nm、663nm、645nmに
おける吸光度を測定し、Macknney G., J. Biol. Chem.
(1941) 140, p315記載の方法によって総クロロフィル含
量を算出した。bchH遺伝子が導入されたタバコの4クロ
ーン(BCH1〜4)およびコントロール組換えタバコについ
て得られた結果を表４に示す。表中、除草性化合物に対
する耐性度は、除草性化合物処理した葉片の総クロロフ
ィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対す
る百分率で表した。Example 3 Tobacco herbicide tolerance test of tobacco into which a gene encoding a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase has been introduced Tobacco leaf into which the bchH gene obtained in Example 2 has been introduced and a control group Replaced tobacco leaves are collected and divided equally into two along the main vein, and an aqueous solution containing the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the above structural formula 8 at a concentration of 0.3 ppm in one leaf piece. It was applied to the entire surface.
The other leaf piece was not coated with the herbicidal compound. These leaf pieces were placed on an MS medium containing 0.8% agar and allowed to stand in the light at room temperature for 7 days. Next, each leaf piece was ground in a 5 ml 80% aqueous acetone solution with a mortar and pestle to extract chlorophyll. After diluting the extract 10-fold with 80% acetone aqueous solution, the absorbance at 750 nm, 663 nm, and 645 nm was measured, and Macknney G., J. Biol. Chem.
(1941) 140, p315 The total chlorophyll content was calculated by the method described. Table 4 shows the results obtained for four tobacco clones (BCH1 to 4) into which the bchH gene was introduced and control recombinant tobacco. In the table, the degree of resistance to the herbicidal compound was expressed as a percentage of the total chlorophyll content of leaf pieces treated with the herbicidal compound, relative to the total chlorophyll content of untreated leaf pieces.

【００４１】[0041]

【表４】 [Table 4]

【００４２】また、bchH遺伝子が導入されたタバコおよ
びコントロール組換えタバコを、前記 構造式３、構造
式７、構造式１０、構造式１１、構造式１３、構造式１
７、構造式２３、構造式２４、構造式２５、構造式２
７、構造式２８、構造式３０、または構造式３５で示さ
れるＰＰＯ阻害型除草性化合物のいずれかを含む水溶液
で同様に処理し、各除草性化合物に対する耐性度を測定
した。結果を表5に示す。表中、除草性化合物に対する耐
性度は、除草性化合物処理した葉片の総クロロフィル含
量の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対する百分
率で表した。Further, the tobacco into which the bchH gene was introduced and the control recombinant tobacco were subjected to the structural formulas 3, 7, 7, 10, 11, 13, and 1 respectively.
7, structural formula 23, structural formula 24, structural formula 25, structural formula 2
7, treated similarly with an aqueous solution containing any of the PPO-inhibiting herbicidal compounds represented by Structural Formula 28, Structural Formula 30, or Structural Formula 35, and the degree of resistance to each herbicidal compound was measured. Table 5 shows the results. In the table, the degree of resistance to the herbicidal compound was expressed as a percentage of the total chlorophyll content of leaf pieces treated with the herbicidal compound, relative to the total chlorophyll content of untreated leaf pieces.

【００４３】[0043]

【表５】 [Table 5]

【００４４】参考例４ タバコマグネシウムケラターゼ
のプロトポルフィリンIX結合サブユニットの改変タンパ
ク質をコードする遺伝子の取得 タバコ（Nicotiana tabacum cv. SR1）の葉部組織か
ら、RNeasy Plant Kit(QIAGEN社製)を用いて付属のマニ
ュアルにしたがって操作を行ない、全 RNA を調製し
た。さらに、RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1（宝酒造社
製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行ない、
葉緑体移行シグナルを欠失したタバコマグネシウムケラ
ターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタンパ
ク質(以下、本改変タバコケラターゼサブユニットと記
す。)をコードする遺伝子を含むDNA断片を取得した。ま
ず、プライマーとして前記キットに含まれるOligo dT-Adap
tor Primerを用い、タバコ全RNAを鋳型として、前記キット
に含まれる逆転写酵素を添加して1st strand cDNAを合
成した。続いて、該1st strand cDNAを鋳型として、前
記キットに含まれるLA Taq polymeraseを用いてPCRを行
い、本改変タバコケラターゼサブユニットをコードする
遺伝子を含むDNA断片を増幅した。ここでＰＣＲのプラ
イマーとしては、配列番号８で示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号９で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いた。該オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PE
アプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Sy
nthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチド精製
用カートリッジ（PEアプライドバイオシステムズ社：OP
C カートリッジ）で精製した。また、ＰＣＲは、94℃に
て2分間の保温を1回行い、続いて、94℃にて30秒間、次
いで50℃にて30秒間、さらに72℃にて7分間の保温を１
サイクルとしてこれを30サイクル実施した。前記のＰＣ
Ｒ反応後、TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて
付属のマニュアルに従って操作を行ない、該ＰＣＲ反応
で増幅されたＤＮＡ断片をpCR2.1プラスミドにクローニ
ングした。得られたプラスミドのＤＮＡを制限酵素KpnI
で消化した後、アガロースゲル電気泳動で分析し、8.0k
bのＤＮＡ断片が検出されたプラスミドをpTCHLHと名付
けた。該プラスミドは、本改変タバコケラターゼサブユ
ニットをコードする遺伝子がlacプロモーターの制御下
で発現可能な方向に挿入された構造を有する。さらに、
このプラスミドpTCHLHを制限酵素KpnIで消化した後、自
己環化させ、約60塩基からなるDNA断片がプラスミドpTC
HLHから除去された構造を有するプラスミドpTCHLH1(図
６)を得た。Reference Example 4 Acquisition of Gene Encoding a Modified Protein of Protoporphyrin IX-Binding Subunit of Tobacco Magnesium Keratase Using RNeasy Plant Kit (QIAGEN) from leaf tissue of tobacco (Nicotiana tabacum cv. SR1) The operation was performed according to the attached manual to prepare total RNA. In addition, perform the operation using RNA LA PCR Kit (AMV) Ver 1.1 (Takara Shuzo) according to the attached manual,
A DNA fragment containing a gene encoding a protoporphyrin IX binding subunit protein of tobacco magnesium keratase lacking a chloroplast translocation signal (hereinafter, referred to as the present modified tobacco keratase subunit) was obtained. First, Oligo dT-Adap included in the kit as a primer
Using tor Primer, the reverse transcriptase contained in the kit was added to the tobacco total RNA as a template to synthesize 1st strand cDNA. Subsequently, PCR was performed using the 1st strand cDNA as a template and LA Taq polymerase included in the kit to amplify a DNA fragment containing the gene encoding the modified tobacco keratase subunit. Here, as a primer for PCR, an oligonucleotide primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 and an oligonucleotide primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9 were used. The oligonucleotide is a DNA synthesizer (PE
Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Sy
nthesizer) and a cartridge for oligonucleotide purification (PE Applied Biosystems: OP
C cartridge). The PCR was performed once at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 94 ° C. for 30 seconds, then at 50 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 7 minutes.
This was carried out for 30 cycles. The PC mentioned above
After the R reaction, operation was performed using a TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached manual, and the DNA fragment amplified by the PCR reaction was cloned into pCR2.1 plasmid. The resulting plasmid DNA was digested with the restriction enzyme KpnI.
After digestion with agarose gel electrophoresis,
The plasmid in which the DNA fragment of b was detected was named pTCHLH. The plasmid has a structure in which a gene encoding the modified tobacco keratase subunit is inserted in a direction that allows expression under the control of a lac promoter. further,
After digesting this plasmid pTCHLH with the restriction enzyme KpnI, self-cyclization was performed, and a DNA fragment consisting of about 60 bases was converted into plasmid pTCHLH.
A plasmid pTCHLH1 (FIG. 6) having a structure removed from HLH was obtained.

【００４５】実施例４ 本改変タバコケラターゼサブユ
ニットの除草剤耐性付与能の試験 参考例４で作製されたプラスミドpTCHLH1またはpCR2.1
をそれぞれ、参考例3で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株
に、Hanahan,D.J., Mol. Biol., 166; p557(1983)に記
載の方法に従って導入し、これらを100μg/mlアンピシ
リン、15μg/mlクロランフェニコール、50μg/mlカナマ
イシンを含むYPT培地で培養することにより、プラスミ
ドpACYCSPとpTCHLH1とを有する大腸菌BT3/pACYCSP+pTCH
LH1株、および、プラスミドpACYCSPとpCR2.1とを有する
大腸菌BT3/pACYCSP+pCR2.1株を得た。これらの大腸菌株
を、前記 構造式8で表されるＰＰＯ阻害型除草性化合
物を10または1ppm含み、100μg/mlアンピシリン、15μg
/mlクロランフェニコール、50μg/mlカナマイシン、10
μg/mlヘミンおよび50μg/mlアミノレブリン酸を含むYP
T培地に接種し、参考例２と同様にして暗所条件下また
は明所条件下に培養した。培養開始18時間後に、培養液
の600nmにおける吸光度を測定し、該除草性化合物を含
まない培地で培養したときの吸光度を１とし、該除草性
化合物を含む培地で培養した場合の吸光度の相対値を求
めた。結果を表６に示す。Example 4 Test of the ability of the modified tobacco keratase subunit to impart herbicide tolerance The plasmid pTCHLH1 or pCR2.1 prepared in Reference Example 4
Were introduced into the E. coli BT3 / pACYCSP strain prepared in Reference Example 3 according to the method described in Hanahan, DJ, Mol.Biol., 166; p557 (1983). Chloranphenicol, Escherichia coli BT3 / pACYCSP + pTCH having plasmids pACYCSP and pTCHLH1 by culturing in YPT medium containing 50 μg / ml kanamycin
The LH1 strain and the E. coli BT3 / pACYCSP + pCR2.1 strain having the plasmids pACYCSP and pCR2.1 were obtained. These Escherichia coli strains contain 10 or 1 ppm of the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the above structural formula 8, and 100 μg / ml ampicillin, 15 μg
/ ml chloramphenicol, 50 μg / ml kanamycin, 10
YP with μg / ml hemin and 50 μg / ml aminolevulinic acid
The medium was inoculated into a T medium, and cultured in the dark or in the light in the same manner as in Reference Example 2. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 6 shows the results.

【００４６】[0046]

【表６】 [Table 6]

【００４７】参考例５ 本改変タバコケラターゼサブユ
ニットをコードする遺伝子のタバコへの導入 本改変タバコケラターゼサブユニットをコードする遺伝
子をアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラ
スミドを構築した。まず、参考例４で作製されたプラス
ミドpTCHLH1を制限酵素KpnIとSalIとで消化することに
より、本改変タバコケラターゼサブユニットをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。一方、バイナリ
ーベクターpBI121(Clontech社製)を制限酵素SmaIで消化
し、そこへKpnIリンカー(宝酒造製)を挿入することによ
り、pBI121のSmaI認識部位が除去されKpnI認識部位が付
加されたプラスミドpBI121Kを作製した。該プラスミドp
BI121KのＤＮＡを制限酵素SacIで消化した後、DNA poly
merase Iを用いて2本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチ
ドを付加して該ＤＮＡの末端を平滑化した。次に仔牛小
腸由来のAlkaline phosphataseで該ＤＮＡの5'末端を脱
りん酸化し、りん酸化SalIリンカー(宝酒造製4680P)を
挿入して環化させ、プラスミドpBI121KSを構築した。該
バイナリーベクターpBI121KSを制限酵素KpnIとSalIとで
消化することによりβ-glucuronidase遺伝子を除去し、
これに替えて、前記の本改変タバコケラターゼサブユニ
ットをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し、該
遺伝子が35Sプロモーターの下流に結合されてなるプラ
スミドpBITCHLH（図７）を作製した。該プラスミドpBIT
CHLHをAgrobacterium tumefaciens LBA4404に導入し、
これを300μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlリファ
ンピシン、25μg/mlカナマイシンを含む培地で培養して
形質転換体を選抜することによってpBITCHLHを持つアグ
ロバクテリウム株を単離した。該アグロバクテリウム株
を無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例2記載
の方法と同様の操作で、本改変タバコケラターゼサブユ
ニットをコードする遺伝子が導入されたタバコを取得す
る。Reference Example 5 Introduction of Gene Encoding the Modified Tobacco Keratase Subunit into Tobacco A plasmid for introducing the gene encoding the modified tobacco keratase subunit into plants by the Agrobacterium method was constructed. First, the plasmid pTCHLH1 prepared in Reference Example 4 was digested with restriction enzymes KpnI and SalI to prepare a DNA fragment containing a gene encoding the present modified tobacco keratase subunit. On the other hand, by digesting the binary vector pBI121 (manufactured by Clontech) with the restriction enzyme SmaI and inserting a KpnI linker (manufactured by Takara Shuzo), the plasmid pBI121K to which the SmaI recognition site of pBI121 was removed and the KpnI recognition site was added was added. Produced. The plasmid p
After digesting the DNA of BI121K with the restriction enzyme SacI, the DNA poly
Using merase I, nucleotides were added to the gaps of the double-stranded DNA to blunt the ends of the DNA. Next, the 5 ′ end of the DNA was dephosphorylated with an alkaline phosphatase derived from calf small intestine, a phosphorylated SalI linker (4680P, manufactured by Takara Shuzo) was inserted and cyclized to construct plasmid pBI121KS. The β-glucuronidase gene was removed by digesting the binary vector pBI121KS with restriction enzymes KpnI and SalI,
Instead, a DNA fragment containing the gene encoding the present modified tobacco keratase subunit was inserted, and a plasmid pBITCHLH (FIG. 7) in which the gene was ligated downstream of the 35S promoter was prepared. The plasmid pBIT
CHLH was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404,
This was cultured in a medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin, and a transformant was selected to isolate an Agrobacterium strain having pBITCHLH. The Agrobacterium strain is infected into aseptically cultured tobacco leaf pieces, and tobacco into which the gene encoding the modified tobacco keratase subunit has been introduced is obtained in the same manner as in Example 2.

【００４８】参考例６ 本改変タバコケラターゼサブユ
ニットをコードする遺伝子が導入されたタバコの除草剤
耐性の確認 参考例５で作製された本改変タバコケラターゼサブユニ
ットをコードする遺伝子が導入されたタバコを、実施例
３と同様の操作で試験することにより、該タバコの除草
性化合物に対する耐性度を定量的に確認する。Reference Example 6 Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which the gene encoding the present modified tobacco keratase subunit was introduced The gene encoding the present modified tobacco keratase subunit produced in Reference Example 5 was introduced. By testing tobacco in the same manner as in Example 3, the degree of resistance of the tobacco to the herbicidal compound is quantitatively confirmed.

【００４９】参考例７ ダイズＰＰＯの改変タンパク質
であってプロトポルフィリノーゲンIXに対する酸化能を
持たずプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する
タンパク質をコードする遺伝子の取得 配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドおよび配列番号１１で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドをプライマーに用い、参考例3で作
製されたプラスミドpSPPO-Pを鋳型にしてＰＣＲを行
い、葉緑体移行シグナルとＦＡＤ結合配列を欠失したダ
イズＰＰＯ（以下、本改変ダイズＰＰＯと記す。）をコ
ードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、前記オリゴヌク
レオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシステム
ズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成
し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PEアプラ
イドバイオシステムズ社：OPC カートリッジ）で精製し
た。また、ＰＣＲは、94℃にて1分間次いで55℃にて２
分間さらに72℃にて3分間の保温を１サイクルとしてこ
れを30回実施した。増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素Nc
oIとSalIで消化し、プラスミドpTV118N(宝酒造社製)のN
coI切断部位とSalI切断部位の間に挿入することによ
り、プラスミドpTVGMP（図８）を構築した。該プラスミ
ドpTVGMPをＰＰＯ遺伝子欠失突然変異系統大腸菌BT3株
にHanahan,D.J., Mol. Biol.,166; p557(1983)に記載の
方法に従って導入し、これを100μg/mlアンピシリン、1
0μg/mlカナマイシンを含むYPT培地(5g/l酵母エキス, 5
g/lトリプトン, 5g/lペプトン, 10g/l NaCl, pH7.0)で
培養したところ、生育相補されたクローンは全く得られ
なかった。Reference Example 7 Acquisition of a gene encoding a protein which is a modified protein of soybean PPO and has no ability to oxidize protoporphyrinogen IX and specifically binds to protoporphyrinogen IX SEQ ID NO: 10 Using the oligonucleotide consisting of the sequence and the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 as primers, PCR was performed using the plasmid pSPPO-P prepared in Reference Example 3 as a template, and a chloroplast translocation signal and FAD binding A DNA fragment encoding a soybean PPO having a deleted sequence (hereinafter referred to as the present modified soybean PPO) was amplified. The oligonucleotide was synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). PCR was performed at 94 ° C for 1 minute and then at 55 ° C for 2 minutes.
This was carried out 30 times with one cycle of keeping the temperature at 72 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme Nc.
digested with oI and SalI, and the plasmid pTV118N (Takara Shuzo)
Plasmid pTVGMP (FIG. 8) was constructed by inserting between the coI and SalI cleavage sites. The plasmid pTVGMP was introduced into the PPO gene deletion mutant strain Escherichia coli BT3 according to the method described in Hanahan, DJ, Mol. Biol., 166; p557 (1983).
YPT medium containing 0 μg / ml kanamycin (5 g / l yeast extract, 5
g / l tryptone, 5 g / l peptone, 10 g / l NaCl, pH 7.0), no clones with growth complementation were obtained.

【００５０】実施例５ 本改変ダイズＰＰＯの除草剤耐
性付与能の試験 参考例７で作製されたプラスミドpTVGMPおよびpTV118N
をそれぞれ、参考例3で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株
にHanahan,D.J., Mol. Biol., 166; p557(1983)に記載
の方法に従って導入し、これらを100μg/mlアンピシリ
ン、15μg/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイ
シンを含むYPT培地で培養することにより、プラスミドp
ACYCSPとpTVGMPとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTVGMP株、
および、プラスミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大腸菌BT
3/pACYCSP+pTV118N株を得た。これらの大腸菌株を、前
記 構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を10
または1ppm含み、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlク
ロランフェニコール、10μg/mlカナマイシン、10μg/ml
ヘミンおよび50μg/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地
に接種し、参考例２と同様にして暗所条件下または明所
条件下に培養した。培養開始18時間後に、培養液の600n
mにおける吸光度を測定し、該除草性化合物を含まない
培地で培養したときの吸光度を１とし、該除草性化合物
を含む培地で培養した場合の吸光度の相対値を求めた。
結果を表７に示す。Example 5 Test of ability of the modified soybean PPO to impart herbicide tolerance Plasmids pTVGMP and pTV118N prepared in Reference Example 7
Were introduced into the E. coli BT3 / pACYCSP strain prepared in Reference Example 3 according to the method described in Hanahan, DJ, Mol. Biol., 166; By culturing in YPT medium containing lanfenicol and 10 μg / ml kanamycin, plasmid p
E. coli BT3 / pACYCSP + pTVGMP strain with ACYCSP and pTVGMP,
And Escherichia coli BT having plasmids pACYCSP and pTV118N
3 / pACYCSP + pTV118N strain was obtained. These Escherichia coli strains were isolated from the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the above structural formula 8 by 10
Or 1 ppm, 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml
YPT medium containing hemin and 50 μg / ml aminolevulinic acid was inoculated and cultured in the dark or in the light in the same manner as in Reference Example 2. 18 hours after the start of culture, 600 n
The absorbance at m was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was defined as 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was determined.
Table 7 shows the results.

【００５１】[0051]

【表７】 [Table 7]

【００５２】実施例６ 本改変ダイズＰＰＯをコードす
る遺伝子のタバコへの導入 本改変ダイズＰＰＯをコードする遺伝子をアグロバクテ
リウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築し
た。参考例7記載の方法と同様に、配列番号１２で示さ
れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーお
よび配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて、参考例3で作製された
プラスミドpSPPO-Pを鋳型にしてＰＣＲを実施すること
により、本改変ダイズＰＰＯをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を増幅した。次いで、参考例5で作製された
プラスミドpBI121Kを制限酵素KpnIとSacIで消化するこ
とによりβ-glucuronidase遺伝子を除去し、これに替え
て、前記の本改変ダイズＰＰＯをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片を制限酵素KpnIとSacIで消化して得られる
ＤＮＡ断片を挿入し、該遺伝子が35Sプロモーターの下
流に結合されてなるプラスミドpBIGMP（図９）を作製し
た。該プラスミドpBIGMPをAgrobacterium tumefaciens
LBA4404に導入し、これを300μg/mlストレプトマイシ
ン、100μg/mlリファンピシン、25μg/mlカナマイシン
を含む培地で培養して形質転換体を選抜することによっ
てpBIGMPを持つアグロバクテリウム株を単離した。該ア
グロバクテリウム株を、無菌培養したタバコの葉片に感
染させ、実施例2記載の方法と同様の操作で、本改変ダ
イズＰＰＯをコードする遺伝子が導入されたタバコを取
得した。Example 6 Introduction of the Gene Encoding the Modified Soy PPO into Tobacco A plasmid for introducing the gene encoding the modified soy PPO into plants by the Agrobacterium method was constructed. Similarly to the method described in Reference Example 7, using the oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 and the oligonucleotide primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, the plasmid pSPPO prepared in Reference Example 3 By performing PCR using -P as a template, a DNA fragment containing the gene encoding the present modified soybean PPO was amplified. Next, the plasmid pBI121K prepared in Reference Example 5 was digested with restriction enzymes KpnI and SacI to remove the β-glucuronidase gene, and instead, a DNA fragment containing the gene encoding the present modified soybean PPO was replaced with the DNA fragment containing the gene encoding the modified soybean PPO. A DNA fragment obtained by digestion with the restriction enzymes KpnI and SacI was inserted to prepare a plasmid pBIGMP (FIG. 9) in which the gene was ligated downstream of the 35S promoter. The plasmid pBIGMP was replaced with Agrobacterium tumefaciens.
The Agrobacterium strain having pBIGMP was isolated by introducing the gene into LBA4404, culturing it in a medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin, and selecting transformants. The Agrobacterium strain was infected to aseptically cultured tobacco leaf pieces, and tobacco into which the gene encoding the modified soybean PPO was introduced was obtained in the same manner as in Example 2.

【００５３】実施例７ 本改変ダイズＰＰＯをコードす
る遺伝子が導入されたタバコの除草剤耐性の確認 実施例６で作製された本改変ダイズＰＰＯをコードする
遺伝子が導入されたタバコについて、実施例３と同様の
操作により、前記 構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除
草性化合物に対する耐性度を定量的に測定した。本改変
ダイズＰＰＯをコードする遺伝子が導入されたタバコの
4クローン(GMP1〜4)、およびコントロール組換えタバコ
について、得られた結果を表８に示す。表中、除草性化
合物に対する耐性度は、除草性化合物処理した葉片の総
クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含
量に対する百分率で表した。Example 7 Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which the gene encoding the present modified soybean PPO was introduced Example 3 was carried out on the tobacco introduced with the gene encoding the modified soybean PPO produced in Example 6 By the same operation as described above, the degree of resistance to the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by Structural Formula 8 was quantitatively measured. Tobacco into which the gene encoding the modified soybean PPO has been introduced
Table 8 shows the results obtained for the four clones (GMP1 to 4) and the control recombinant tobacco. In the table, the degree of resistance to the herbicidal compound was expressed as a percentage of the total chlorophyll content of leaf pieces treated with the herbicidal compound, relative to the total chlorophyll content of untreated leaf pieces.

【００５４】[0054]

【表８】 [Table 8]

【００５５】参考例８ コナミドリムシＰＰＯ遺伝子の
取得 コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）CC407
株を、Chlamydomonas Genetics Center (address: DCM
B Group, Department of Botany, Box 91000, Duke Uni
versity, Durham, NC 27708-1000, USA)より入手し、20
0μE/m²/秒の光合成活性照明下、7mM NH₄Cl、0.4mM MgS
O₄・7H₂O、0.34mM CaCl₂・2H₂O、25mM リン酸カリウム、
0.5mM トリス（pH 7.5）、1ml/L ハトナー微量要素、お
よび 1ml/L 氷酢酸からなる TAP 液体培地（E. H. Harr
is、The Chlamydomonas Sourcebook、Academic Press、
San Diego、1989年、576-577頁）中で５日間培養し、初
期定常増殖期の細胞を含む培養液 200ml（1.0x10⁶ cell
s/ml）を得た。この細胞から、ISOGEN（日本ジーン社
製）を用いて付属のマニュアルにしたがって操作を行な
い、全 RNA を調製した。さらに、BioMag mRNA Purific
ation Kit（パーセプティブバイオシステム社）を用い
て付属のマニュアルに従って操作を行ない、poly(A)RNA
を分画した。得られた poly(A)RNA から、Marathon cD
NAAmplification Kit（Clontech 社製）を用いて付属の
マニュアルに従って操作を行ないｃＤＮＡを合成し、Ｐ
ＣＲの鋳型とした。ＰＣＲのプライマーとして、配列番
号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
および配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを調製した。オリゴヌクレオチドはDNA合
成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394
DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレ
オチド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステ
ムズ社：OPC カートリッジ）で精製した。ＰＣＲは、Ad
vantage cDNA PCR Kit（Clontech 社製）を用いて付属
のマニュアルに従って反応液を調製し、94℃にて1分間
次いで65℃にて5分間の保温を1回行った後、94℃にて15
秒間次いで65℃にて5分間の保温を１サイクルとしてこ
れを29回実施した。ＰＣＲ反応後、反応液をMicroSpin
S-400HR(ファルマシアバイオテク社製)で濾過すること
によって、増幅されたＤＮＡ断片を精製した。TA Cloni
ng Kit（Invitrogen社製）を用いて付属のマニュアルに
従って操作を行ない、該増幅ＤＮＡ断片をpCR2.1プラス
ミドにクローニングし、プラスミドpCPPOを構築した。
得られた組換えプラスミドpCPPOが有するＤＮＡ断片の
塩基配列をDye terminator cycle sequencing kit（PE
アプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシークエ
ンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用
い決定した。その結果、配列番号１６で示される塩基配
列が明らかとなり、pCPPOはコナミドリムシのＰＰＯの
完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドであることが判明し
た。Reference Example 8 Acquisition of PPO gene of Paramecium bursaria Chlamydomonas reinhardtii CC407
Transfer the strain to the Chlamydomonas Genetics Center (address: DCM
B Group, Department of Botany, Box 91000, Duke Uni
versity, Durham, NC 27708-1000, USA)
7 μM NH ₄ Cl, 0.4 mM MgS under 0 μE / m ² / s photosynthesis active illumination
_{O 4 · 7H 2 O, 0.34mM} CaCl 2 · 2H 2 O, potassium 25mM phosphate,
TAP liquid medium (EH Harr) consisting of 0.5 mM Tris (pH 7.5), 1 ml / L Hartner trace elements, and 1 ml / L glacial acetic acid
is, The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press,
(San Diego, 1989, pp. 576-577) for 5 days, and a 200 ml (1.0 × 10 ⁶ cell) culture solution containing cells in the initial stationary growth phase.
s / ml). From these cells, total RNA was prepared by using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) according to the attached manual. In addition, BioMag mRNA Purific
Perform the operation using the ation Kit (Perceptive Biosystems) in accordance with the attached manual to obtain poly (A) RNA.
Was fractionated. From the obtained poly (A) RNA, Marathon cD
Using the NAAmplification Kit (manufactured by Clontech), perform the operation according to the attached manual to synthesize cDNA,
It was used as a CR template. As a PCR primer, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 14 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 15 were prepared. The oligonucleotide is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394)
The DNA was synthesized using a DNA / RNA Synthesizer, and purified using an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). PCR
A reaction solution was prepared using a vantage cDNA PCR Kit (manufactured by Clontech) in accordance with the attached manual.
This was carried out 29 times with one cycle of keeping the temperature at 65 ° C. for 5 minutes for one second. After the PCR reaction, the reaction solution is
The amplified DNA fragment was purified by filtration through S-400HR (Pharmacia Biotech). TA Cloni
Using ng Kit (manufactured by Invitrogen), the operation was performed according to the attached manual, and the amplified DNA fragment was cloned into pCR2.1 plasmid to construct plasmid pCPPO.
The nucleotide sequence of the DNA fragment contained in the obtained recombinant plasmid pCPPO was analyzed using a dye terminator cycle sequencing kit (PE
It was determined using a DNA sequencer 373S (manufactured by Applied Biosystems) and a DNA sequencer 373S (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 became clear, and it was revealed that pCPPO was a plasmid containing the full-length cDNA of PPO of Paramecium bursaria.

【００５６】参考例９ コナミドリムシＰＰＯの改変タ
ンパク質であってプロトポルフィリノーゲンIXに対する
酸化能を持たずプロトポルフィリノーゲンIXに特異的に
結合するタンパク質をコードする遺伝子の取得 配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドおよび配列番号１８で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドをプライマーに用い、参考例８で作
製されたプラスミドpCPPOを鋳型にしてＰＣＲを行い、
葉緑体移行シグナルとＦＡＤ結合配列を欠失したコナミ
ドリムシのＰＰＯ（以下、本改変コナミドリムシＰＰＯ
と記す。）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、
オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイ
オシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を
用いて合成し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ
（PEアプライドバイオシステムズ社：OPC カートリッ
ジ）で精製した。また、ＰＣＲは、94℃にて1分間次い
で55℃にて２分間さらに72℃にて3分間の保温を１サイ
クルとしてこれを30回実施した。増幅したＤＮＡ断片
を、制限酵素BamHIとSacIで消化し、これをプラスミドp
TV119N(宝酒造社製)のBamHI切断部位とSacI切断部位の
間に挿入することにより、プラスミドpTVCRP（図１０）
を構築した。該プラスミドpTVCRPをＰＰＯ遺伝子欠失突
然変異系統大腸菌BT3株にHanahan,D.J., Mol. Biol., 1
66; p557(1983)に記載の方法に従って導入し、これを10
0μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含むYPT
培地(5g/l酵母エキス, 5g/lトリプトン, 5g/lペプトン,
10g/l NaCl, pH7.0)で培養したところ、生育相補され
たクローンは全く得られなかった。Reference Example 9 Acquisition of a gene encoding a protein which is a modified protein of P. chrysalis PPO and has no ability to oxidize protoporphyrinogen IX and specifically binds to protoporphyrinogen IX SEQ ID NO: 17 Using the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence and the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 as primers, PCR was performed using the plasmid pCPPO prepared in Reference Example 8 as a template,
PPO of Paramecium bursaria lacking a chloroplast translocation signal and an FAD binding sequence (hereinafter referred to as the present modified Paramecium bursaria PPO)
It is written. ) Was amplified. In addition,
Oligonucleotides were synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). The PCR was carried out 30 times, with one cycle of 94 ° C. for 1 minute, followed by 55 ° C. for 2 minutes and further 72 ° C. for 3 minutes as one cycle. The amplified DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and
Plasmid pTVCRP (FIG. 10) was inserted between the BamHI and SacI cleavage sites of TV119N (Takara Shuzo).
Was built. The plasmid pTVCRP was transformed into a PPO gene deletion mutant strain E. coli BT3 strain by Hanahan, DJ, Mol. Biol., 1
66; p557 (1983).
YPT containing 0 μg / ml ampicillin, 10 μg / ml kanamycin
Medium (5 g / l yeast extract, 5 g / l tryptone, 5 g / l peptone,
When the cells were cultured at 10 g / l NaCl (pH 7.0), no clones with growth complementation were obtained at all.

【００５７】実施例８ 本改変コナミドリムシＰＰＯの
除草剤耐性付与能の試験 参考例９で作製されたプラスミドpTVCRPおよびpTV118N
をそれぞれ、参考例3で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株
にHanahan,D.J., Mol. Biol., 166; p557(1983)に記載
の方法に従って導入し、これらを100μg/mlアンピシリ
ン、15μg/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイ
シンを含むYPT培地で培養することにより、プラスミドp
ACYCSPとpTVCRPとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTVCRP株、
および、プラスミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大腸菌BT
3/pACYCSP+pTV118N株を得た。これらの大腸菌株を、前
記 構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を10
または1ppm含み、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlク
ロランフェニコール、10μg/mlカナマイシン、10μg/ml
ヘミンおよび50μg/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地
に接種し、参考例２と同様にして暗所条件下または明所
条件下に培養した。培養開始18時間後に、培養液の600n
mにおける吸光度を測定し、該除草性化合物を含まない
培地で培養したときの吸光度を１とし、該除草性化合物
を含む培地で培養した場合の吸光度の相対値を求めた。
結果を表９に示す。Example 8 Test of the ability of the modified P. paramecium PPO to impart herbicide resistance The plasmids pTVCRP and pTV118N prepared in Reference Example 9
Were introduced into the E. coli BT3 / pACYCSP strain prepared in Reference Example 3 according to the method described in Hanahan, DJ, Mol. Biol., 166; By culturing in YPT medium containing lanfenicol and 10 μg / ml kanamycin, plasmid p
E. coli BT3 / pACYCSP + pTVCRP strain with ACYCSP and pTVCRP,
And Escherichia coli BT having plasmids pACYCSP and pTV118N
3 / pACYCSP + pTV118N strain was obtained. These Escherichia coli strains were isolated from the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the above structural formula 8 by 10
Or 1 ppm, 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml
YPT medium containing hemin and 50 μg / ml aminolevulinic acid was inoculated and cultured in the dark or in the light in the same manner as in Reference Example 2. 18 hours after the start of culture, 600 n
The absorbance at m was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was defined as 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was determined.
Table 9 shows the results.

【００５８】[0058]

【表９】 [Table 9]

【００５９】実施例９ 本改変コナミドリムシＰＰＯを
コードする遺伝子のタバコへの導入 本改変コナミドリムシＰＰＯをコードする遺伝子をアグ
ロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを
構築した。参考例９で作製されたプラスミドpTVCRPを制
限酵素BamHIとSacIとで消化することにより、本改変コ
ナミドリムシＰＰＯをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片を調製した。バイナリーベクターpBI121(Clontech社
製)を制限酵素BamHIとSacIとで消化することによりβ-g
lucuronidase遺伝子を除去し、これに替えて、前記の本
改変コナミドリムシＰＰＯをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を挿入し、該遺伝子が35Sプロモーターの下流
に結合されてなるプラスミドpBICRP（図１１）を作製し
た。該プラスミドpBICRPをAgrobacterium tumefaciens
LBA4404に導入し、これを300μg/mlストレプトマイシ
ン、100μg/mlリファンピシン、25μg/mlカナマイシン
を含む培地で培養して形質転換体を選抜することによっ
て、pBICRPを持つアグロバクテリウム株を単離した。該
アグロバクテリウム株を無菌培養したタバコの葉片に感
染させ、実施例2記載の方法と同様の操作で、本改変コ
ナミドリムシＰＰＯをコードする遺伝子が導入されたタ
バコを取得した。Example 9 Introduction of the Gene Encoding the Modified P. paramecium PPO into Tobacco A plasmid for introducing the gene encoding the modified P. amphida PPO into plants by the Agrobacterium method was constructed. The plasmid pTVCRP prepared in Reference Example 9 was digested with the restriction enzymes BamHI and SacI to prepare a DNA fragment containing the gene encoding the modified P. lactis PPO. Β-g by digesting the binary vector pBI121 (Clontech) with restriction enzymes BamHI and SacI
The lucuronidase gene was removed and replaced with a D-containing gene encoding the present modified chlamydomonas PPO.
The plasmid pBICRP (FIG. 11) was prepared by inserting the NA fragment and ligating the gene downstream of the 35S promoter. The plasmid pBICRP was replaced with Agrobacterium tumefaciens.
The Agrobacterium strain having pBICRP was isolated by introducing it into LBA4404, culturing it in a medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin, and selecting transformants. The Agrobacterium strain was infected into aseptically cultured leaf pieces of tobacco, and tobacco into which the gene encoding the modified P. lactis PPO was introduced was obtained in the same manner as in Example 2.

【００６０】実施例１０ 本改変コナミドリムシＰＰＯ
をコードする遺伝子が導入されたタバコの除草剤耐性の
確認 実施例９で作製された本改変コナミドリムシＰＰＯをコ
ードする遺伝子が導入されたタバコについて、実施例３
と同様の操作により、構造式８で示される除草性化合物
に対する耐性度を定量的に測定した。本改変コナミドリ
ムシＰＰＯをコードする遺伝子が導入されたタバコの4
クローン(CRP1〜4)、およびコントロール組換えタバコ
について、得られた結果を表10に示す。表中、除草性化
合物に対する耐性度は、除草性化合物処理した葉片の総
クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含
量に対する百分率で表した。Example 10 This modified P. amphida PPO
Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which the gene encoding the gene of the present invention has been introduced.
By the same operation as described above, the degree of resistance to the herbicidal compound represented by Structural Formula 8 was quantitatively measured. 4 of the tobacco into which the gene encoding the modified P.
Table 10 shows the obtained results of the clones (CRP1 to 4) and the control recombinant tobacco. In the table, the degree of resistance to the herbicidal compound was expressed as a percentage of the total chlorophyll content of leaf pieces treated with the herbicidal compound, relative to the total chlorophyll content of untreated leaf pieces.

【００６１】[0061]

【表１０】 [Table 10]

【００６２】実施例１１ オオムギフェロケラターゼの
改変タンパク質であってプロトポルフィリノーゲンIXに
特異的に結合するタンパク質の除草剤耐性付与能の試験 Miyamoto,K. et al., Plant Physiol. 105; p769(1994)
に記載の方法で取得されたオオムギのフェロケラターゼ
遺伝子を有するプラスミドを、制限酵素NspIとEcoRIと
で消化し、シグナル配列を欠失したオオムギフェロケラ
ターゼ（以下、本改変オオムギフェロケラターゼと記
す。）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し
た。このＤＮＡ断片をプラスミドpTV119N(宝酒造社製)
のSphI切断部位とEcoRI切断部位との間に挿入すること
により、プラスミドpTVHVF1（図１２）を構築した。該
プラスミドpTVHVF1およびpTV118Nをそれぞれ、参考例３
で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株にHanahan,D.J., Mo
l. Biol., 166; p557(1983)に記載の方法に従って導入
し、これらを100μg/mlアンピシリン、15μg/mlクロラ
ンフェニコール、10μg/mlカナマイシンを含むYPT培地
で培養することにより、プラスミドpACYCSPとpTVHVF1と
を持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTVHVF1株、および、プラス
ミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTV1
18N株を得た。これらの大腸菌株を、前記 構造式8で示
されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を10または1ppm含み、
100μg/mlアンピシリン、15μg/mlクロランフェニコー
ル、10μg/mlカナマイシン、10μg/mlヘミンおよび50μ
g/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地に接種し、参考例
２と同様にして暗所条件下または明所条件下に培養し
た。培養開始18時間後に、培養液の600nmにおける吸光
度を測定し、該除草性化合物を含まない培地で培養した
ときの吸光度を１とし、該除草性化合物を含む培地で培
養した場合の吸光度の相対値を求めた。結果を表１１に
示す。Example 11 Test of ability to impart herbicide resistance to a modified protein of barley ferrochelatase, which specifically binds to protoporphyrinogen IX Miyamoto, K. et al., Plant Physiol. 105; p769 (1994)
The plasmid having the barley ferrochelatase gene obtained by the method described in (1) is digested with restriction enzymes NspI and EcoRI to delete the signal sequence. A DNA fragment containing the gene encoding was obtained. This DNA fragment was converted to plasmid pTV119N (Takara Shuzo).
Plasmid pTVHVF1 (FIG. 12) was constructed by insertion between the SphI cleavage site and the EcoRI cleavage site. The plasmids pTVHVF1 and pTV118N were used in Reference Example 3 respectively.
E. coli BT3 / pACYCSP strain prepared in
l. Biol., 166; p557 (1983), and these were cultured in a YPT medium containing 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, and 10 μg / ml kanamycin to obtain the plasmid E. coli BT3 / pACYCSP + pTVHVF1 strain having pTVHVF1 and pTVHVF1, and E. coli BT3 / pACYCSP + pTV1 having plasmids pACYCSP and pTV118N
18N strains were obtained. These Escherichia coli strains contain 10 or 1 ppm of the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the structural formula 8,
100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml hemin and 50 μ
A YPT medium containing g / ml aminolevulinic acid was inoculated, and cultured under dark or light conditions in the same manner as in Reference Example 2. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 11 shows the results.

【００６３】[0063]

【表１１】 [Table 11]

【００６４】実施例１２ 本改変オオムギフェロケラタ
ーゼをコードする遺伝子のタバコへの導入 本改変オオムギのフェロケラターゼ遺伝子をアグロバク
テリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築し
た。実施例11記載のプラスミドpTVHVF1を制限酵素NcoI
で消化した後、DNA polymerase Iを用いて2本鎖ＤＮＡ
のギャップにヌクレオチドを付加しＤＮＡの末端を平滑
化した。次に仔牛小腸由来のAlkaline phosphataseで処
理して該ＤＮＡの5'末端を脱りん酸化し、りん酸化BamH
Iリンカー(宝酒造製4610P)を挿入して環化させ、プラス
ミドpTVHVF2を構築した。ついで、pTVHVF2を制限酵素Ec
oRIで消化した後、DNA polymerase Iを用いて2本鎖ＤＮ
Ａのギャップにヌクレオチドを付加してＤＮＡの末端を
平滑化した。さらに、仔牛小腸由来のAlkaline phospha
taseで処理して該ＤＮＡの5'末端を脱りん酸化し、りん
酸化SalIリンカー(宝酒造製4680P)を挿入して環化さ
せ、プラスミドpTVHVF3を構築した。参考例５で作製さ
れたプラスミドpBI121KSを制限酵素BamHIとSalIとで消
化することによりβ-glucuronidase遺伝子を除去し、一
方、前記のpTVHVF3を制限酵素BamHIとSalIとで消化して
本改変オオムギフェロケラターゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を前記のβ-glu
curonidase遺伝子に替えてプラスミドpBI121KSに挿入す
ることにより、35Sプロモーターの下流に本改変オオム
ギフェロケラターゼをコードする遺伝子が結合されてな
るプラスミドpBIHVF（図１３）を作製した。該プラスミ
ドpBIHVFをAgrobacterium tumefaciens LBA4404に導入
し、これを300μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlリ
ファンピシン、25μg/mlカナマイシンを含む培地で培養
して形質転換体を選抜することによってpBIHVFを持つア
グロバクテリウム株を単離した。該アグロバクテリウム
株を無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例2記
載の方法と同様の操作で、本改変オオムギフェロケラタ
ーゼをコードする遺伝子が導入されたタバコを取得し
た。Example 12 Introduction of a Gene Encoding the Modified Barley Ferrokeratase into Tobacco A plasmid was constructed for introducing the ferrochelatase gene of the modified barley into plants by the Agrobacterium method. The plasmid pTVHVF1 described in Example 11 was replaced with the restriction enzyme NcoI.
After digestion with double-stranded DNA using DNA polymerase I
Nucleotides were added to the gaps to make the ends of the DNA blunt. Next, the DNA was treated with alkaline phosphatase derived from calf small intestine to dephosphorylate the 5 ′ end of the DNA, and phosphorylated BamH
An I linker (Takara Shuzo 4610P) was inserted and cyclized to construct a plasmid pTVHVF2. Then, pTVHVF2 was replaced with the restriction enzyme Ec.
After digestion with oRI, double-stranded DN
A nucleotide was added to the gap of A to blunt the end of the DNA. In addition, Alkaline phospha from calf small intestine
The DNA was treated with tase to dephosphorylate the 5'-end of the DNA, and a phosphorylated SalI linker (4680P, manufactured by Takara Shuzo) was inserted for cyclization to construct a plasmid pTVHVF3. The β-glucuronidase gene was removed by digesting the plasmid pBI121KS prepared in Reference Example 5 with restriction enzymes BamHI and SalI, while the above-mentioned pTVHVF3 was digested with restriction enzymes BamHI and SalI to obtain the modified barley ferrochela A DNA fragment containing the gene encoding the enzyme is prepared, and the DNA fragment is
By inserting the gene encoding the modified barley ferrochelatase downstream of the 35S promoter by inserting the plasmid pBI121KS in place of the curonidase gene, a plasmid pBIHVF (FIG. 13) was prepared. The plasmid pBIHVF was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, and this was cultured in a medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin to select an Agrobacterium strain having pBIHVF by transformant selection. Isolated. The Agrobacterium strain was infected aseptically into leaf pieces of tobacco, and tobacco into which the gene encoding the modified barley ferrochelatase was introduced was obtained in the same manner as in Example 2.

【００６５】実施例１３ 本改変オオムギフェロケラタ
ーゼをコードする遺伝子が導入されたタバコの除草剤耐
性の確認 実施例１２で作製された本改変オオムギフェロケラター
ゼをコードする遺伝子が導入されたタバコを、実施例３
と同様の操作により、構造式８で示される除草性化合物
に対する耐性度を定量的に測定した。本改変オオムギフ
ェロケラターゼをコードする遺伝子が導入されたタバコ
の4クローン(HVF1〜4)、およびコントロール組換えタバ
コについて、得られた結果を表１２に示す。表中、除草
性化合物に対する耐性度は、除草性化合物処理した葉片
の総クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィ
ル含量に対する百分率で表した。Example 13 Confirmation of Herbicide Tolerance of Tobacco Introduced with Gene Encoding the Modified Barley Ferrokeratase The tobacco transfected with the gene encoding the modified barley ferrochelatase prepared in Example 12 was obtained. Example 3
By the same operation as described above, the degree of resistance to the herbicidal compound represented by Structural Formula 8 was quantitatively measured. Table 12 shows the results obtained for four tobacco clones (HVF1-4) into which the gene encoding the modified barley ferrochelatase was introduced (HVF1-4) and control recombinant tobacco. In the table, the degree of resistance to the herbicidal compound was expressed as a percentage of the total chlorophyll content of leaf pieces treated with the herbicidal compound, relative to the total chlorophyll content of untreated leaf pieces.

【００６６】[0066]

【表１２】 [Table 12]

【００６７】実施例１４ キュウリフェロケラターゼの
改変タンパク質であってプロトポルフィリノーゲンIXに
特異的に結合するタンパク質の除草剤耐性付与能の試験 配列番号１９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドおよび配列番号２０で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドをプライマーに用い、Miyamoto,K.
et al., Plant Physiol., 105; p769(1994)に記載の方
法で単離されたキュウリのフェロケラターゼｃＤＮＡク
ローンを鋳型にしてＰＣＲを行い、シグナル配列を欠失
したキュウリのフェロケラターゼ（以下、本改変キュウ
リフェロケラターゼと記す。）をコードするＤＮＡ断片
を増幅した。なお、オリゴヌクレオチドはDNA合成装置
（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RN
A Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチド
精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステムズ
社：OPC カートリッジ）で精製した。また、ＰＣＲは、
94℃にて1分間次いで55℃にて２分間さらに72℃にて3分
間の保温を１サイクルとしてこれを30回実施した。増幅
したＤＮＡ断片を、制限酵素BamHIとSacIとで消化し、
プラスミドpTV119N(宝酒造社製)のBamHI切断部位とSacI
切断部位との間に挿入することにより、プラスミドpTVC
SF（図14）を構築した。該プラスミドpTVCSFおよびpTV1
18Nをそれぞれ、参考例３で作製された大腸菌BT3/pACYC
SP株にHanahan,D.J., Mol. Biol., 166; p557(1983)に
記載の方法に従って導入し、これらを100μg/mlアンピ
シリン、15μg/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナ
マイシンを含むYPT培地で培養することにより、プラス
ミドpACYCSPとpTVCSFとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTVCS
F株、および、プラスミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大
腸菌BT3/pACYCSP+pTV118N株を得た。これらの大腸菌株
を、前記 構造式8で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合
物を10または1ppm含み、100μg/mlアンピシリン、15μg
/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイシン、10
μg/mlヘミンおよび50μg/mlアミノレブリン酸を含むYP
T培地に接種し、参考例２と同様にして暗所条件下また
は明所条件下に培養した。培養開始18時間後に、培養液
の600nmにおける吸光度を測定し、該除草性化合物を含
まない培地で培養したときの吸光度を１とし、該除草性
化合物を含む培地で培養した場合の吸光度の相対値を求
めた。結果を表１３に示す。Example 14 Test of ability to impart herbicide resistance to a modified protein of cucumber ferrochelatase which specifically binds to protoporphyrinogen IX Oligonucleotide and sequence consisting of base sequence represented by SEQ ID NO: 19 Using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by No. 20 as a primer, Miyamoto, K. et al.
et al., Plant Physiol., 105; p769 (1994), PCR was performed using a cucumber ferrochelatase cDNA clone as a template, and a signal sequence-deleted cucumber ferrochelatase (hereinafter referred to as this modified product). A DNA fragment encoding cucumber ferrochelatase) was amplified. Oligonucleotides were synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RN).
A Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). In addition, PCR
This was carried out 30 times with one cycle of holding at 94 ° C. for 1 minute, then at 55 ° C. for 2 minutes, and further at 72 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA fragment is digested with restriction enzymes BamHI and SacI,
BamHI cleavage site of plasmid pTV119N (Takara Shuzo) and SacI
Plasmid pTVC is inserted by inserting into the cleavage site.
The SF (Fig. 14) was constructed. The plasmids pTVCSF and pTV1
E. coli BT3 / pACYC prepared in Reference Example 3
The SP strain was introduced according to the method described in Hanahan, DJ, Mol. Biol., 166; p557 (1983), and these were introduced in a YPT medium containing 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, and 10 μg / ml kanamycin. By culturing, E. coli BT3 / pACYCSP + pTVCS with plasmids pACYCSP and pTVCSF
F strain and E. coli BT3 / pACYCSP + pTV118N strain having plasmids pACYCSP and pTV118N were obtained. These Escherichia coli strains contain 10 or 1 ppm of the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the above structural formula 8, and 100 μg / ml ampicillin, 15 μg
/ ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10
YP with μg / ml hemin and 50 μg / ml aminolevulinic acid
The medium was inoculated into a T medium, and cultured in the dark or in the light in the same manner as in Reference Example 2. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 13 shows the results.

【００６８】[0068]

【表１３】 [Table 13]

【００６９】実施例１５ 本改変キュウリフェロケラタ
ーゼをコードする遺伝子のタバコへの導入 本改変キュウリフェロケラターゼ遺伝子をアグロバクテ
リウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築し
た。プラスミドpBI121(Clontech社製)を制限酵素BamHI
とSacIとで消化することによりβ-glucuronidase遺伝子
を除去し、一方、実施例１４記載のプラスミドpTVCSFを
制限酵素BamHIとSacIとで消化して本改変キュウリフェ
ロケラターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を調
製し、該ＤＮＡ断片を前記のβ-glucuronidase遺伝子に
替えてプラスミドpBI121に挿入することにより、本改変
キュウリフェロケラターゼをコードする遺伝子が35Sプ
ロモーターの下流に結合されてなるプラスミドpBICSF
（図15）を作製した。該プラスミドpBICSFをAgrobacter
ium tumefaciens LBA4404に導入し、これを300μg/mlス
トレプトマイシン、100μg/mlリファンピシン、25μg/m
lカナマイシンを含む培地で培養して形質転換体を選抜
することによってpBICSFを持つアグロバクテリウム株を
単離した。該アグロバクテリウム株を無菌培養したタバ
コの葉片に感染させ、実施例2記載の方法と同様の操作
で、本改変キュウリフェロケラターゼ遺伝子が導入され
たタバコを取得した。Example 15 Introduction of a Gene Encoding the Modified Cucumber Ferrochelatase into Tobacco A plasmid for introducing the modified cucumber ferrochelatase gene into plants by the Agrobacterium method was constructed. Plasmid pBI121 (Clontech) with restriction enzyme BamHI
The β-glucuronidase gene was removed by digestion with SacI and SacI, while the plasmid pTVCSF described in Example 14 was digested with the restriction enzymes BamHI and SacI, and the DNA fragment containing the gene encoding the modified cucumber ferrochelatase. And by inserting the DNA fragment into the plasmid pBI121 instead of the β-glucuronidase gene, the plasmid pBICSF in which the gene encoding the modified cucumber ferrochelatase is linked downstream of the 35S promoter.
(FIG. 15) was produced. The plasmid pBICSF was replaced with Agrobacter
ium tumefaciens LBA4404, 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, 25 μg / m
An Agrobacterium strain having pBICSF was isolated by culturing in a medium containing lkanamycin and selecting transformants. The Agrobacterium strain was infected into aseptically cultured tobacco leaf pieces, and tobacco into which the modified cucumber ferrochelatase gene had been introduced was obtained in the same manner as in Example 2.

【００７０】参考例１０ 本改変キュウリフェロケラタ
ーゼをコードする遺伝子が導入されたタバコの除草剤耐
性の確認 実施例１５で作製された本改変キュウリフェロケラター
ゼをコードする遺伝子が導入されたタバコを、実施例３
と同様の操作で試験し、該タバコの除草性化合物に対す
る耐性度を定量的に確認する。Reference Example 10 Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which the gene encoding the present modified cucumber ferrochelatase was introduced The tobacco introduced with the gene encoding the present modified cucumber ferrochelatase produced in Example 15 was Example 3
And the degree of resistance of the tobacco to the herbicidal compound is quantitatively confirmed.

【００７１】参考例１１ 大腸菌コプロポルフィリノー
ゲンIIIオキシダーゼ(hemF)遺伝子の単離 ゲノムDNA調製用のキットISOPLANT(ニッポンジーン社
製)を用いて、大腸菌LE392株からゲノムDNAを調製す
る。一方、GenBank (Accession X75413)に登録された大
腸菌hemF遺伝子とその5'および'3'領域の塩基配列に従
って、配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドプライマーおよび２２で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。該
オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイ
オシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を
用いて合成し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ
（PEアプライドバイオシステムズ社：OPC カートリッ
ジ）で精製する。大腸菌LE392株ゲノムDNA約1μgを鋳型
にし、前記オリゴヌクレオチド各10pmolをプライマーに
用いてPCRを行い、大腸菌のhemF遺伝子を含むＤＮＡ断
片を増幅する。ＰＣＲは、96℃にて1分間、55℃にて２
分間、72℃にて3分間の保温を1サイクルとしてこれを30
サイクル行なう。Reference Example 11 Isolation of Escherichia coli coproporphyrinogen III oxidase (hemF) gene A genomic DNA is prepared from Escherichia coli LE392 using a genomic DNA preparation kit ISOPLANT (manufactured by Nippon Gene). On the other hand, according to the Escherichia coli hemF gene registered in GenBank (Accession X75413) and the nucleotide sequence of the 5 ′ and '3 ′ regions thereof, it consists of an oligonucleotide primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and the nucleotide sequence of 22 Synthesize oligonucleotide primers. The oligonucleotide is synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Using about 1 μg of genomic DNA of E. coli LE392 strain as a template, PCR is performed using 10 pmol of each of the above oligonucleotides as primers to amplify a DNA fragment containing the hemF gene of E. coli. PCR was performed at 96 ° C for 1 minute and at 55 ° C for 2 minutes.
30 minutes at 72 ° C for 3 minutes.
Perform cycle.

【００７２】実施例１６ 大腸菌hemFタンパク質の除草
剤耐性付与能の試験 参考例１１に記載の方法で増幅されたhemF遺伝子を含む
DNA断片を制限酵素FbaIとPstIとで消化し、市販のプラ
スミドpUC118(宝酒造社製)のBamHI切断部位とPstI切断
部位との間に挿入することにより、プラスミドpHEMF(図
16)を構築した。該プラスミドpHEMFおよびpTV118Nをそ
れぞれ、参考例３で作製された大腸菌BT3/pACYCSPにHan
ahan,D.J., Mol. Biol.166; p557(1983)に記載の方法に
従って導入し、これらを100μg/mlアンピシリン、15μg
/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイシンを含
むYPT培地で培養することにより、プラスミドpACYCSPと
pHEMFとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pHEMF株、および、プ
ラスミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+
pTV118N株を得た。これらの大腸菌株を、前記 構造式8
で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を10または1ppm含
み、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlクロランフェニ
コール、10μg/mlカナマイシン、10μg/mlヘミンおよび
50μg/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地に接種し、参
考例２と同様にして暗所条件下または明所条件下に培養
した。培養開始18時間後に、培養液の600nmにおける吸
光度を測定し、該除草性化合物を含まない培地で培養し
たときの吸光度を１とし、該除草性化合物を含む培地で
培養した場合の吸光度の相対値を求めた。結果を表１４
に示す。Example 16 Test of Escherichia coli hemF protein for imparting herbicide resistance The hemF gene contains the hemF gene amplified by the method described in Reference Example 11.
The DNA fragment was digested with restriction enzymes FbaI and PstI, and inserted between the BamHI cleavage site and the PstI cleavage site of the commercially available plasmid pUC118 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
16) was constructed. The plasmids pHEMF and pTV118N were added to E. coli BT3 / pACYCSP prepared in Reference Example 3, respectively.
ahan, DJ, Mol. Biol. 166; p557 (1983), and introduced these at 100 μg / ml ampicillin, 15 μg.
/ ml chloramphenicol and 10 μg / ml kanamycin in a YPT medium containing plasmid pACYCSP.
E. coli BT3 / pACYCSP + with pHEMF and E. coli BT3 / pACYCSP + with plasmids pACYCSP and pTV118N
pTV118N strain was obtained. These E. coli strains were converted to
Containing 10 or 1 ppm of a PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the formula: 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml hemin and
YPT medium containing 50 μg / ml aminolevulinic acid was inoculated, and cultured under dark or light conditions in the same manner as in Reference Example 2. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 14 shows the results.
Shown in

【００７３】[0073]

【表１４】 [Table 14]

【００７４】参考例１２ 大腸菌hemF遺伝子のタバコへ
の導入 大腸菌hemF遺伝子をアグロバクテリウム法で植物へ導入
するためのプラスミドを構築した。まず、大腸菌hemF遺
伝子を取得するために、配列番号２３で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドプライマーおよび配列番
号２４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
プライマーを合成した。該オリゴヌクレオチドはDNA合
成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394
DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレ
オチド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステ
ムズ社：OPC カートリッジ）で精製した。該オリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、参考例１１に記載の方法
と同様にＰＣＲを行い、大腸菌hemF遺伝子を含むＤＮＡ
断片を増幅した。プラスミドpBI121(Clontech社製)を制
限酵素BamHIとSacIとで消化することによりβ-glucuron
idase遺伝子を除去し、一方、前記のＰＣＲ増幅ＤＮＡ
断片を制限酵素BamHIとSacIとで消化して大腸菌hemF遺
伝子断片を調製し、該遺伝子断片を前記のβ-glucuroni
dase遺伝子に替えてプラスミドpBI121に挿入することに
より、大腸菌hemF遺伝子が35Sプロモーターの下流に結
合されてなるプラスミドpBIHEMF（図17）を作製した。
該プラスミドpBIHEMFをAgrobacterium tumefaciens LBA
4404に導入し、これを300μg/mlストレプトマイシン、1
00μg/mlリファンピシン、25μg/mlカナマイシンを含む
培地で培養して形質転換体を選抜することによってpBIH
EMFを持つアグロバクテリウム株を単離した。該アグロ
バクテリウム株を無菌培養したタバコの葉片に感染さ
せ、実施例2記載の方法と同様の操作で、大腸菌hemF遺
伝子が導入されたタバコを取得する。Reference Example 12 Introduction of E. coli hemF Gene into Tobacco A plasmid for introducing the E. coli hemF gene into plants by the Agrobacterium method was constructed. First, in order to obtain the E. coli hemF gene, an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 and an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24 were synthesized. The oligonucleotide is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394).
The DNA was synthesized using a DNA / RNA Synthesizer, and purified using an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Using this oligonucleotide primer, PCR was performed in the same manner as in the method described in Reference Example 11, and DNA containing the E. coli hemF gene was obtained.
The fragment was amplified. Β-glucuron by digesting plasmid pBI121 (Clontech) with restriction enzymes BamHI and SacI
The enzyme is removed from the PCR amplified DNA
The fragment was digested with restriction enzymes BamHI and SacI to prepare an E. coli hemF gene fragment, and the gene fragment was treated with the β-glucuroni
By inserting the plasmid pBI121 in place of the dase gene, a plasmid pBIHEMF (FIG. 17) in which the E. coli hemF gene was linked downstream of the 35S promoter was prepared.
The plasmid pBIHEMF was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA
4404, 300 μg / ml streptomycin, 1
PBIH was obtained by culturing in a medium containing 00 μg / ml rifampicin and 25 μg / ml kanamycin and selecting transformants.
Agrobacterium strain with EMF was isolated. The Agrobacterium strain is infected aseptically into leaf pieces of tobacco, and tobacco into which the E. coli hemF gene has been introduced is obtained in the same manner as described in Example 2.

【００７５】参考例１３ 大腸菌hemF遺伝子が導入され
たタバコの除草剤耐性の確認 参考例１２で作製される大腸菌hemF遺伝子が導入された
タバコを、実施例３と同様の操作で試験し、該タバコの
除草性化合物に対する耐性度を定量的に確認する。Reference Example 13 Confirmation of herbicide resistance of tobacco introduced with E. coli hemF gene The tobacco introduced with E. coli hemF gene prepared in Reference Example 12 was tested in the same manner as in Example 3, and To quantitatively confirm the degree of tolerance to herbicidal compounds.

【００７６】参考例１４ ポルフィリン化合物結合性タ
ンパク質とプロトポルフィリンIXの結合 北野ら、1998年日本化学会第74春季年会講演予稿集II、
1353頁 4G511に記載の方法に従って、ランダムな5つの
アミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質を提示
するファージライブラリー、および、ポルフィリン化合
物 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl)-21
H,23H-porphine (H₂TMpyP)に特異的に結合可能なアミノ
酸配列HASYSもしくはRASSL(Hはヒスチジン、Aはアラニ
ン、Sはセリン、Yはチロシン、Rはアルギニン、Lはロイ
シンを表す。)を含むタンパク質を提示するファージク
ローンを作製した。まず、ランダムな5つのアミノ酸か
らなるアミノ酸配列を含むタンパク質を提示するファー
ジライブラリーを次のようにして作製した。配列番号２
５で示される塩基配列からなる混合オリゴヌクレオチド
および配列番号２６で示される塩基配列からなる混合オ
リゴヌクレオチドを合成した。該混合オリゴヌクレオチ
ドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：M
odel 394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリ
ゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PEアプライドバイ
オシステムズ社：OPC カートリッジ）で精製した。前記
の混合オリゴヌクレオチド50pmolにそれぞれT4 DNA kin
aseを作用させて該オリゴヌクレオチドの5'末端をりん
酸化した後これらを混合し、70℃で10分間加熱した後、
毎分0.5℃の速度で室温まで緩やかに冷却することによ
ってアニーリングさせた。プラスミドpCANTAB5E(ファル
マシアバイオテク社製)を制限酵素SfiIとNotIとで消化
することによって、該プラスミドから組換え抗体遺伝子
ScFvを除去し、これに替えて、前記のりん酸化しアニー
リングさせたオリゴヌクレオチド対を挿入することによ
って、ランダムな5つのアミノ酸からなるアミノ酸配列
に続いてM13ファージの表面タンパク質のアミノ酸配列
が連結されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
する塩基配列を含むプラスミドを作製した。該プラスミ
ドを、大腸菌TG-1株にHanahan,D.J., Mol. Biol.166; p
557(1983)に記載の方法に従って導入し、該大腸菌株を1
00μg/mlアンピシリンを含む2xYT培地(10g/l酵母エキ
ス, 15g/lトリプトン, 5g/l NaCl, pH7.2)で培養するこ
とにより、組換え大腸菌TG-1株を得た。該組換え大腸菌
TG-1株を100μg/mlアンピシリンを含む2xYT培地に接種
し37℃で振とう培養を行い、培養開始1時間後に6x10¹⁰p
fuのヘルパーファージM13KO7(Pharmacia Biotech社製)
を接種し、さらに18時間振とう培養した。次いで、培養
液を1000xgで20分間遠心分離し、ランダムな5アミノ酸
からなるアミノ酸配列を含むタンパク質を提示するファ
ージライブラリーを回収した。また、アミノ酸配列HASY
S（配列番号５１）を含むタンパク質を提示するファー
ジクローンを作製するために、配列番号２７で示される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２
８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合
成した。さらに、アミノ酸配列RASSL（配列番号５３）
を含むタンパク質を提示するファージクローンを作製す
るために、配列番号２９で示される塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドおよび配列番号３０で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオ
リゴヌクレオチドは、DNA合成装置（PEアプライドバイ
オシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を
用いて合成し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ
（PEアプライドバイオシステムズ社：OPC カートリッ
ジ）で精製した。前記のランダムな5アミノ酸からなる
アミノ酸配列を含むタンパク質を提示したファージライ
ブラリーを作製した場合と同様に操作を行い、アミノ酸
配列HASYSまたはRASSLを含むタンパク質を提示したファ
ージクローンを得た。アミノ酸配列HASYSを含むタンパ
ク質を提示するファージクローン、アミノ酸配列RASSL
を提示するファージクローン、または、ランダムな5ア
ミノ酸からなるタンパク質を提示するファージライブラ
リーを含むファージ懸濁液(力価10⁵ pfu)をそれぞれニ
トロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell社製)
にスポットした後、該ニトロセルロースフィルターを1
％牛血清アルブミンを含むPBT緩衝液(137mM NaCl, 8.10
mM Na₂HPO₄, 2.68mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 0.05% Tween
20,pH7.2)中で1時間振とうしブロッキングした。PBT緩
衝液で該ニトロセルロースフィルターを洗浄した後、10
μMプロトポルフィリンIXを含む2xSSC緩衝液(0.3MNaCl,
0.03Mクエン酸ナトリウム)中で18時間振とうした。さ
らに、該ニトロセルロースフィルターを2xSSC緩衝液で
洗浄し乾燥させた後、紫外光(365nm)照射下でプロトポ
ルフィリンIX由来の蛍光を検出した。ファージライブラ
リーのスポットは蛍光を示さなかったが、アミノ酸配列H
ASYSを含むタンパク質を提示したファージクローンのス
ポット、および、アミノ酸配列RASSLを含むタンパク質
を提示したファージクローンのスポットは明瞭な蛍光を
示した。Reference Example 14 Binding of porphyrin compound binding protein to protoporphyrin IX Kitano et al., Proceedings of the 74th Annual Meeting of the Chemical Society of Japan in 1998,
According to the method described on page 1353 4G511, a phage library displaying a protein containing an amino acid sequence consisting of five random amino acids, and a porphyrin compound 5,10,15,20-tetrakis (N-methylpyridinium-4-yl) -twenty one
Amino acid sequence HASYS or RASSL capable of specifically binding to H, 23H-porphine (H ₂ TMpyP) (H represents histidine, A represents alanine, S represents serine, Y represents tyrosine, R represents arginine, and L represents leucine.) A phage clone displaying a protein containing was prepared. First, a phage library displaying a protein containing an amino acid sequence consisting of five random amino acids was prepared as follows. SEQ ID NO: 2
A mixed oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a mixed oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 were synthesized. The mixed oligonucleotide is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: M
odel 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). T4 DNA kin to each 50 pmol of the mixed oligonucleotide
After reacting ase to phosphorylate the 5 ′ end of the oligonucleotide, mix them, and heat them at 70 ° C. for 10 minutes,
Annealing was performed by slow cooling to room temperature at a rate of 0.5 ° C. per minute. By digesting plasmid pCANTAB5E (manufactured by Pharmacia Biotech) with restriction enzymes SfiI and NotI, a recombinant antibody gene was obtained from the plasmid.
By removing the ScFv and instead inserting the phosphorylated and annealed oligonucleotide pair, the amino acid sequence of the random five amino acids is followed by the amino acid sequence of the surface protein of M13 phage. A plasmid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence was prepared. The plasmid was transformed into E. coli TG-1 strain by Hanahan, DJ, Mol. Biol. 166; p.
557 (1983).
Recombinant Escherichia coli TG-1 strain was obtained by culturing in 2 × YT medium (10 g / l yeast extract, 15 g / l tryptone, 5 g / l NaCl, pH 7.2) containing 00 μg / ml ampicillin. The recombinant E. coli
The TG-1 strain was inoculated into 2xYT medium containing 100 μg / ml ampicillin, and shake-cultured at 37 ° C. 1 hour after the start of culture, 6x10 ¹⁰ p
fu helper phage M13KO7 (Pharmacia Biotech)
And cultured with shaking for another 18 hours. Next, the culture solution was centrifuged at 1000 × g for 20 minutes, and a phage library displaying a protein containing an amino acid sequence consisting of five random amino acids was recovered. Also, the amino acid sequence HASY
In order to prepare a phage clone displaying a protein containing S (SEQ ID NO: 51), an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 2
An oligonucleotide having the base sequence represented by No. 8 was synthesized. Furthermore, the amino acid sequence RASSL (SEQ ID NO: 53)
In order to prepare a phage clone displaying a protein containing, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 were synthesized. These oligonucleotides were synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). The same operation as in the case of preparing the phage library displaying the protein containing the amino acid sequence consisting of five random amino acids was performed to obtain a phage clone displaying the protein containing the amino acid sequence HASYS or RASSL. Phage clone displaying protein containing amino acid sequence HASYS, amino acid sequence RASSL
Phage clones presenting, or phage suspension containing the phage library displaying a protein consisting of five random amino acids (titer 10 ⁵ pfu) respectively nitrocellulose filters (Schleicher & Schuell, Inc.)
After spotting the nitrocellulose filter,
% Bovine serum albumin in PBT buffer (137 mM NaCl, 8.10
mM Na ₂ HPO ₄ , 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH ₂ PO ₄ , 0.05% Tween
20, pH 7.2) for 1 hour for blocking. After washing the nitrocellulose filter with PBT buffer, 10
2xSSC buffer containing 0.3M protoporphyrin IX (0.3M NaCl,
(0.03M sodium citrate) for 18 hours. Further, the nitrocellulose filter was washed with 2 × SSC buffer and dried, and then the fluorescence derived from protoporphyrin IX was detected under irradiation with ultraviolet light (365 nm). The spots in the phage library did not show fluorescence, but the amino acid sequence H
The spot of the phage clone displaying the protein containing ASYS and the spot of the phage clone displaying the protein containing the amino acid sequence RASSL showed clear fluorescence.

【００７７】実施例１７ プロトポルフィリンIX結合性
タンパク質の除草剤耐性付与能の試験 まず、アミノ酸配列HASYS（配列番号５１）、または、
アミノ酸配列RASSL（配列番号５３）を含むタンパク質
をコードする遺伝子を発現可能なプラスミドを作製し
た。まず、配列番号５２で示されるアミノ酸配列からな
るタンパク質（以下、タンパク質MGHASYSと記す。）を
コードする遺伝子を発現可能なプラスミドを作製するた
めに、配列番号３１で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド、および配列番号３２で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌク
レオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシステム
ズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成
し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PEアプラ
イドバイオシステムズ社：OPC カートリッジ）で精製し
た。前記オリゴヌクレオチド50pmolにそれぞれT4 DNA k
inaseを作用させて該オリゴヌクレオチドの5'末端をり
ん酸化した後これらを混合し、70℃で10分間加熱した
後、毎分0.5℃の速度で室温まで緩やかに冷却すること
によってアニーリングさせた。プラスミドpTV118Nを制
限酵素NcoIとEcoRIとで消化することによって16塩基対
からなる遺伝子断片を該プラスミドから除去し、これに
替えて、前記のりん酸化しアニーリングさせたオリゴヌ
クレオチド対を挿入することによって、タンパク質MGHA
SYSをコードする遺伝子を発現可能なプラスミドpHASYS
を作製した。次に、配列番号５４で示されるアミノ酸配
列からなるタンパク質（以下、タンパク質MGRASSLと記
す。）をコードする遺伝子を発現可能なプラスミドを作
製するために、配列番号３３で示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチド、および、配列番号３４で示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。該
オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイ
オシステムズ社：Model394 DNA/RNA Synthesizer）を用
いて合成し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ
（PEアプライドバイオシステムズ社：OPC カートリッ
ジ）で精製した。プラスミドpHASYSを作製した場合と同
様な操作を行い、タンパク質MGRASSLをコードする遺伝
子を発現可能なプラスミドpRASSLを作製した。次に、ポ
ルフィリン化合物H₂TMPyPに結合可能なアミノ酸配列YAG
YまたはYAGF(Yはチロシン、Aはアラニン、Gはグリシ
ン、Fはフェニルアラニンを表す。）を含むタンパク質
をコードする遺伝子を発現可能なプラスミドを作製し
た。配列番号５６で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質（以下、タンパク質MGYAGYと記す。）をコードす
る遺伝子を発現可能なプラスミドを作製するために、配
列番号３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド、および配列番号３６で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドを合成した。また、配列番号５８で
示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、タン
パク質MGYAGFと記す。）をコードする遺伝子を発現可能
なプラスミドを作製するために、配列番号３７で示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番
号３８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を合成した。これらのオリゴヌクレオチドはDNA合成装置
（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RN
A Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌクレオチド
精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシステムズ
社：OPC カートリッジ）で精製した。プラスミドpHASYS
を作製した場合と同様な操作を行い、タンパク質MGYAGY
をコードする遺伝子を発現可能なプラスミドpYAGY、お
よび、タンパク質MGYAGFをコードする遺伝子を発現可能
なプラスミドpYAGFを作製した。上記のプラスミドpHASY
S、pRASSL、pYAGY、pYAGFまたはpTV118Nをそれぞれ、参
考例３で作製された大腸菌BT3/pACYCSP株にHanahan,D.
J., Mol. Biol., 166;p557(1983)に記載の方法に従って
導入し、これらを100μg/mlアンピシリン、15μg/mlク
ロランフェニコール、10μg/mlカナマイシンを含むYPT
培地で培養することにより、プラスミドpACYCSPとpHASY
Sとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pHASYS株、プラスミドpAC
YCSPとpRASSLとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pRASSL株、プ
ラスミドpACYCSPとpYAGYとを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pY
AGY株、プラスミドpACYCSPとpYAGFとを持つ大腸菌BT3/p
ACYCSP+pYAGF株、および、プラスミドpACYCSPとpTV118N
とを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pTV118N株を得た。これら
の大腸菌株を、前記 構造式８で示されるＰＰＯ阻害型
除草性化合物を1ppm含み、100μg/mlアンピシリン、15
μg/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイシン、
10μg/mlヘミンおよび50μg/mlアミノレブリン酸を含む
YPT培地に接種し、参考例２と同様にして暗所条件下ま
たは明所条件下に培養した。培養開始18時間後に、培養
液の600nmにおける吸光度を測定し、該除草性化合物を
含まない培地で培養したときの吸光度を１とし、該除草
性化合物を含む培地で培養した場合の吸光度の相対値を
求めた。結果を表１５に示す。Example 17 Test of ability of protoporphyrin IX-binding protein to impart herbicide resistance First, amino acid sequence HASYS (SEQ ID NO: 51) or
A plasmid capable of expressing a gene encoding a protein containing the amino acid sequence RASSL (SEQ ID NO: 53) was prepared. First, in order to prepare a plasmid capable of expressing a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 (hereinafter, referred to as protein MGHASYS), an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31, And an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 32 was synthesized. The oligonucleotide was synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Each of the oligonucleotides 50 pmol T4 DNA k
After phosphorylation of the 5 'end of the oligonucleotide by the action of inase, these were mixed, heated at 70 ° C for 10 minutes, and then annealed by slowly cooling to room temperature at a rate of 0.5 ° C per minute. By digesting the plasmid pTV118N with the restriction enzymes NcoI and EcoRI, a 16-bp gene fragment was removed from the plasmid, and the above-described phosphorylated and annealed oligonucleotide pair was inserted instead. Protein MGHA
PHASYS, a plasmid capable of expressing the gene encoding SYS
Was prepared. Next, in order to prepare a plasmid capable of expressing a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 (hereinafter referred to as protein MGRASSL), an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 , And an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 34 was synthesized. The oligonucleotide was synthesized using a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). The same operation as in the case of preparing the plasmid pHASYS was performed to prepare a plasmid pRASSL capable of expressing a gene encoding the protein MGRASSL. Next, the amino acid sequence YAG capable of binding to the porphyrin compound H ₂ TMPyP
A plasmid capable of expressing a gene encoding a protein containing Y or YAGF (Y represents tyrosine, A represents alanine, G represents glycine, and F represents phenylalanine) was prepared. In order to prepare a plasmid capable of expressing a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56 (hereinafter, referred to as protein MGYAGY), an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35, and a sequence An oligonucleotide having the base sequence represented by No. 36 was synthesized. In addition, in order to prepare a plasmid capable of expressing a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 (hereinafter, referred to as protein MGYAGF), an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37, And an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38 was synthesized. These oligonucleotides were used on a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 394 DNA / RN).
A Synthesizer) and purified with an oligonucleotide purification cartridge (PE Applied Biosystems: OPC cartridge). Plasmid pHASYS
Perform the same operation as in the case of preparing the protein MGYAGY
A plasmid pYAGY capable of expressing a gene encoding the gene and a plasmid pYAGF capable of expressing a gene encoding the protein MGYAGF were prepared. The above plasmid pHASY
S, pRASSL, pYAGY, pYAGF or pTV118N, respectively, were added to the E. coli BT3 / pACYCSP strain prepared in Reference Example 3 by Hanahan, D .;
J., Mol. Biol., 166; p557 (1983), and these were introduced into a YPT containing 100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin.
By culturing in a medium, plasmids pACYCSP and pHASY
E. coli BT3 / pACYCSP + pHASYS strain with S, plasmid pAC
E. coli BT3 / pACYCSP + pRASSL strain with YCSP and pRASSL, E. coli BT3 / pACYCSP + pY with plasmids pACYCSP and pYAGY
AGY strain, E. coli BT3 / p with plasmids pACYCSP and pYAGF
ACYCSP + pYAGF strain, and plasmids pACYCSP and pTV118N
Escherichia coli BT3 / pACYCSP + pTV118N strain was obtained. These Escherichia coli strains contained 1 ppm of the PPO-inhibiting herbicidal compound represented by the structural formula 8, and contained 100 μg / ml ampicillin,
μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamycin,
Contains 10 μg / ml hemin and 50 μg / ml aminolevulinic acid
The cells were inoculated into a YPT medium and cultured under dark or light conditions in the same manner as in Reference Example 2. Eighteen hours after the start of the culture, the absorbance of the culture solution at 600 nm was measured, and the absorbance when cultured in a medium containing no herbicidal compound was set to 1, and the relative value of the absorbance when cultured in a medium containing the herbicidal compound was set to 1. I asked. Table 15 shows the results.

【００７８】[0078]

【表１５】 [Table 15]

【００７９】さらに、アミノ酸配列HASYS、RASSLが複数
回連続して接続されたアミノ酸配列を含むタンパク質を
コードする遺伝子を発現可能なプラスミドを作製した。
配列番号５９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク
質（以下、タンパク質MG(HASYS)₄と記す。）[ここで、
(HASYS)_nはペプチドHASYSがn回繰り返しつながった配列
を意味する。]をコードする遺伝子を発現可能なプラス
ミドを作製するために、配列番号３９、配列番号４０、
配列番号４１、または配列番号４２で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリ
ゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシ
ステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用い
て合成し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PE
アプライドバイオシステムズ社：OPC カートリッジ）で
精製した。まず、配列番号４０で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドと配列番号４１で示される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチドにT4 DNA kinaseを作
用させその5'末端をそれぞれりん酸化した。その後、配
列番号３９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドとりん酸化された配列番号４０で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチド、または、りん酸化された
配列番号４１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドと配列番号４２で示される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドとをそれぞれ300pmolずつ混合し、70℃
で5分間加熱した後0.5℃/minの速度で緩やかに室温まで
冷却することによってアニーリングさせた。前記のアニ
ーリングさせたオリゴヌクレオチド対２種を混合し、T4
DNA ligaseを用いてこれらを連結させた後、得られた
ＤＮＡ断片のその5'末端をT4 DNA kinaseを用いてりん
酸化した。一方、ベクターpTV118Nを制限酵素NcoIとEco
RIで消化し、16塩基対からなるDNA断片を除去し、これ
に替えて、前記のりん酸化ＤＮＡ断片を挿入することに
よって、タンパク質MG(HASYS)₄をコードする遺伝子を発
現するプラスミドpHASYS4を取得した。さらに、配列番
号６０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以
下、タンパク質MG(HASYS)₈と記す。）をコードする遺伝
子を発現可能なプラスミドを作製するために、配列番号
４３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
および配列番号４４で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレオチドはDNA
合成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 39
4 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成し、オリゴヌク
レオチド精製用カートリッジ（PEアプライドバイオシス
テムズ社：OPC カートリッジ）で精製した。まず、T4 D
NA kinaseを用いて前記オリゴヌクレオチドの5'末端を
りん酸化した。その後、配列番号３９で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドとりん酸化された配列番
号４０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を300pmolずつ混合し、りん酸化された配列番号４１で
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番
号４２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を300pmolずつ混合し、さらに、りん酸化された配列番
号４３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
とりん酸化された配列番号４４で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドを600pmolずつ混合し、それぞ
れを70℃で5分間加熱した後0.5℃/minの速度で緩やかに
室温まで冷却することによってアニーリングした。前記
のアニーリングしたオリゴヌクレオチド対3種を混合
し、T4 DNA ligaseを用いて連結させた後、得られたＤ
ＮＡ断片のその5'末端をT4 DNA kinaseを用いてりん酸
化した。その後、前述のプラスミドpHASYS4を作製した
場合と同様の操作を行い、タンパク質MG(HASYS)₈をコー
ドする遺伝子を発現可能なプラスミドpHASYS8を取得し
た。次に、配列番号６１で示されるアミノ酸配列からな
るタンパク質（以下、タンパク質MG(RASSL)₄と記す。）
[ここで、(RASSL)_nはペプチドRASSLがn回繰り返しつな
がった配列を意味する。]をコードする遺伝子を発現可
能なプラスミドを作製するために、配列番号４５、配列
番号４６、配列番号４７、または配列番号４８で示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。ま
た、配列番号６２で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質（以下、タンパク質MG(RASSL)₈と記す。）をコー
ドする遺伝子を発現可能なプラスミドを作製するため
に、配列番号４９で示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチド、および配列番号５０で示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドを合成した。該オリゴヌクレ
オチドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシステムズ
社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて合成
し、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PEアプラ
イドバイオシステムズ社：OPC カートリッジ）で精製し
た。プラスミドpHASYS4を作製した場合と同様な操作を
行い、タンパク質MG(RASSL) ₄を発現可能なプラスミドpR
ASSL4を作製した。また、プラスミドpHASYS8を作製した
場合と同様な操作を行い、タンパク質MG(RASSL)₈を発現
可能なプラスミドpRASSL8、を作製した。上記のプラス
ミドpHASYS4、pHASYS8、pRASSL4、pRASSL8またはpTV118
Nをそれぞれ、参考例３で作製された大腸菌BT3/pACYCSP
株にHanahan,D.J., Mol. Biol.,166; p557(1983)に記載
の方法に従って導入し、これらを100μg/mlアンピシリ
ン、15μg/mlクロランフェニコール、10μg/mlカナマイ
シンを含むYPT培地で培養することにより、プラスミドp
ACYCSPとpHASYS4とを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pHASYS4
株、プラスミドpACYCSPとpHASYS8とを持つ大腸菌BT3/pA
CYCSP+pHASYS8株、プラスミドpACYCSPとpRASSL4とを持
つ大腸菌BT3/pACYCSP+pRASSL4株、プラスミドpACYCSPと
pRASSL8とを持つ大腸菌BT3/pACYCSP+pRASSL8株、およ
び、プラスミドpACYCSPとpTV118Nとを持つ大腸菌BT3/pA
CYCSP+pTV118N株を得た。これらの大腸菌株を、前記
構造式８で示されるＰＰＯ阻害型除草性化合物を1ppm含
み、100μg/mlアンピシリン、15μg/mlクロランフェニ
コール、10μg/mlカナマイシン、10μg/mlヘミンおよび
50μg/mlアミノレブリン酸を含むYPT培地に接種し、参
考例２と同様にして暗所条件下または明所条件下に培養
した。培養開始18時間後に、培養液の600nmにおける吸
光度を測定し、該除草性化合物を含まない培地で培養し
たときの吸光度を１とし、該除草性化合物を含む培地で
培養した場合の吸光度の相対値を求めた。結果を表１６
に示す。Furthermore, the amino acid sequences HASYS and RASSL
Proteins containing amino acid sequences connected consecutively
A plasmid capable of expressing the encoding gene was prepared.
A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59
Quality (hereinafter, protein MG (HASYS)_FourIt is written. )[here,
(HASYS)_nIs a sequence consisting of the peptide HASYS repeated n times
Means That can express the gene encoding
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40,
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41 or 42
Was synthesized. These ori
The oligonucleotide is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems)
Stems: Model 394 DNA / RNA Synthesizer)
And oligonucleotide purification cartridge (PE
Applied Biosystems: OPC cartridge)
Purified. First, from the base sequence represented by SEQ ID NO: 40
And a base represented by SEQ ID NO: 41
Create T4 DNA kinase on sequence oligonucleotide
The 5 'end of each was phosphorylated. After that,
Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39
Base sequence represented by SEQ ID NO: 40 phosphorylated with tide
An oligonucleotide consisting of, or phosphorylated
An oligonucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 41
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 42
And 300 pmol each at 70 ° C
For 5 minutes and slowly reach room temperature at a rate of 0.5 ° C / min.
Annealed by cooling. The ani
The two pairs of oligonucleotides were mixed and T4
 After ligating these using DNA ligase, the resulting
The 5 'end of the DNA fragment is phosphorylated using T4 DNA kinase.
Oxidized. On the other hand, the vector pTV118N was replaced with the restriction enzymes NcoI and Eco.
Digestion with RI to remove the 16 bp DNA fragment
Instead of inserting the phosphorylated DNA fragment
Therefore, protein MG (HASYS)_FourGene that encodes
The resulting plasmid, pHASYS4, was obtained. Furthermore, the array number
No. 60 (hereinafter referred to as a protein)
Bottom, protein MG (HASYS)₈It is written. Genetics that encode)
SEQ ID NO:
An oligonucleotide having a base sequence represented by 43,
And an oligo consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 44
Nucleotides were synthesized. The oligonucleotide is DNA
Synthesizer (PE Applied Biosystems: Model 39)
4 DNA / RNA Synthesizer)
Reotide Purification Cartridge (PE Applied Biosis
(Thames: OPC cartridge). First, T4 D
The 5 'end of the oligonucleotide is
Phosphorylated. Thereafter, the base sequence shown in SEQ ID NO: 39
Sequence oligonucleotides and phosphorylated sequence numbers
Oligonucleotide consisting of the base sequence represented by No. 40
Are mixed at 300 pmol each and phosphorylated SEQ ID NO: 41
Oligonucleotide consisting of the indicated base sequence and sequence number
Oligonucleotide consisting of the base sequence represented by No. 42
Are mixed at 300 pmol each, and the phosphorylated sequence
Oligonucleotide consisting of the base sequence represented by No. 43
From the base sequence represented by SEQ ID NO: 44
Oligonucleotides of 600 pmol each
After heating it at 70 ° C for 5 minutes, slowly heat it at a rate of 0.5 ° C / min.
Annealed by cooling to room temperature. Said
Mixes three pairs of annealed oligonucleotide pairs
And after ligation using T4 DNA ligase, the resulting D
Phosphate the 5 'end of the NA fragment using T4 DNA kinase
It has become. Then, the above-described plasmid pHASYS4 was prepared.
Perform the same operation as in the above procedure to obtain protein MG (HASYS).₈The
Obtain the plasmid pHASYS8 that can express the gene to be
Was. Next, from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 61,
Protein (hereinafter referred to as protein MG (RASSL)_FourIt is written. )
[Where (RASSL)_nIs the peptide RASSL repeated n times
Means a crooked array. ] Can be expressed
SEQ ID NO: 45, to produce a functional plasmid
SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 or SEQ ID NO: 48
Oligonucleotides consisting of different base sequences were synthesized. Ma
A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62
Protein (hereinafter referred to as protein MG (RASSL)₈It is written. )
A plasmid capable of expressing the gene to be expressed
An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50
Oligonucleotides were synthesized. The oligonucleotide
Otide is a DNA synthesizer (PE Applied Biosystems)
(Synthesis using Model 394 DNA / RNA Synthesizer)
And an oligonucleotide purification cartridge (PE
Id Biosystems: OPC cartridge)
Was. Perform the same operation as when plasmid pHASYS4 was prepared.
Do, protein MG (RASSL) _FourPlasmid pR capable of expressing
ASSL4 was prepared. In addition, plasmid pHASYS8 was prepared.
Perform the same operation as in the above procedure to obtain protein MG (RASSL).₈Express
A possible plasmid, pRASSL8, was created. Plus above
Mid pHASYS4, pHASYS8, pRASSL4, pRASSL8 or pTV118
N represents E. coli BT3 / pACYCSP prepared in Reference Example 3, respectively.
Described in Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166; p557 (1983)
And introduce them at 100 μg / ml ampicillin
, 15 μg / ml chloramphenicol, 10 μg / ml kanamai
By culturing in YPT medium containing syn, plasmid p
Escherichia coli BT3 / pACYCSP + pHASYS4 with ACYCSP and pHASYS4
Strain, Escherichia coli BT3 / pA with plasmids pACYCSP and pHASYS8
CYCSP + pHASYS8 strain, carrying plasmids pACYCSP and pRASSL4
E. coli BT3 / pACYCSP + pRASSL4 strain, plasmid pACYCSP
E. coli BT3 / pACYCSP + pRASSL8 strain with pRASSL8, and
E. coli BT3 / pA with plasmids pACYCSP and pTV118N
CYCSP + pTV118N strain was obtained. These E. coli strains were
Contains 1 ppm of a PPO-inhibiting herbicidal compound represented by Structural Formula 8
100 μg / ml ampicillin, 15 μg / ml chlorampheni
Cole, 10 μg / ml kanamycin, 10 μg / ml hemin and
Inoculate YPT medium containing 50 μg / ml aminolevulinic acid,
Culture under dark or light conditions as in Example 2.
did. 18 hours after the start of the culture, the absorption of the culture solution at 600 nm was performed.
Measure the light intensity and culture in a medium without the herbicidal compound.
The absorbance at the time of exposure was set to 1, and the medium containing the herbicidal compound was used.
The relative value of the absorbance when cultured was determined. Table 16 shows the results.
Shown in

【００８０】[0080]

【表１６】 [Table 16]

【００８１】参考例１５ プロトポルフィリンIX結合性
タンパク質をコードする遺伝子のタバコへの導入 まず、プロトポルフィリンIX結合性タンパク質MG(HASY
S)₈をコードする遺伝子をアグロバクテリウム法で植物
へ導入するためのプラスミドを構築した。実施例１７で
作製されたプラスミドpHASYS8を制限酵素NcoIで消化し
た後、DNA polymerase Iを用いて2本鎖ＤＮＡのギャッ
プにヌクレオチドを付加しＤＮＡの末端を平滑化した。
次に該ＤＮＡを仔牛小腸由来のAlkaline phosphataseで
処理してその5'末端を脱りん酸化し、りん酸化BamHIリ
ンカー(宝酒造製4610P)を挿入して環化させ、プラスミ
ドpHASYS8Bを構築した。また、プラスミドpBI121(Clont
ech社製)を制限酵素BamHIとSacIとで消化することによ
りβ-glucuronidase遺伝子を除去した。一方、プラスミ
ドpHASYS8Bを制限酵素BamHIとSacIで消化してタンパク
質MG(HASYS)₈をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を調
製し、該ＤＮＡ断片を前記のβ-glucuronidase遺伝子に
替えてプラスミドpBI121に挿入することにより、プロト
ポルフィリンIX結合性タンパク質MG(HASYS)₈をコードす
る遺伝子が35Sプロモーターの下流に結合されてなるプ
ラスミドpBIHASYS8（図18）を作製した。次に、プロト
ポルフィリンIX結合性タンパク質MG(RASSL)₈をコードす
る遺伝子をアグロバクテリウム法で植物へ導入するため
のプラスミドを構築した。実施例１７で作製されたプラ
スミドpRASSL8を、前記のpBIHASYS8を作製した方法に準
じて構築し、プロトポルフィリンIX結合性タンパク質MG
(RASSL)₈をコードする遺伝子が35Sプロモーターの下流
に結合されてなるプラスミドpBIRASSL8（図19）を作製
した。上記のプラスミドpBIHASYS8またはpBIRASSL8を、
それぞれAgrobacterium tumefaciens LBA4404に導入
し、これを300μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlリ
ファンピシン、25μg/mlカナマイシンを含む培地で培養
して形質転換体を選抜することによってpBIHASYS8を持
つアグロバクテリウム株、およびpBIRASSL8を持つアグ
ロバクテリウム株を単離した。該アグロバクテリウム株
を無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例2記載
の方法と同様の操作でプロトポルフィリンIX結合性タン
パク質MG(HASYS)₈をコードする遺伝子が導入されたタバ
コ、およびプロトポルフィリンIX結合性タンパク質MG(R
ASSL)₈をコードする遺伝子が導入されたタバコを取得す
る。REFERENCE EXAMPLE 15 Introduction of Gene Encoding Protoporphyrin IX-Binding Protein into Tobacco First, protoporphyrin IX-binding protein MG (HASY
S) A plasmid was constructed for introducing the gene encoding ₈ into plants by the Agrobacterium method. After the plasmid pHASYS8 prepared in Example 17 was digested with the restriction enzyme NcoI, nucleotides were added to the gaps of the double-stranded DNA using DNA polymerase I to blunt the ends of the DNA.
Next, the DNA was treated with Alkaline phosphatase derived from calf small intestine to dephosphorylate its 5 'end, and a phosphorylated BamHI linker (4610P, manufactured by Takara Shuzo) was inserted and cyclized to construct plasmid pHASYS8B. In addition, plasmid pBI121 (Clont
ech) was digested with restriction enzymes BamHI and SacI to remove the β-glucuronidase gene. On the other hand, plasmid pHASYS8B is digested with restriction enzymes BamHI and SacI to prepare a DNA fragment containing a gene encoding protein MG (HASYS) ₈ , and the DNA fragment is inserted into plasmid pBI121 instead of the β-glucuronidase gene described above. As a result, a plasmid pBIHASYS8 (FIG. 18) in which the gene encoding the protoporphyrin IX-binding protein MG (HASYS) ₈ was linked downstream of the 35S promoter. Next, a plasmid for introducing the gene encoding the protoporphyrin IX-binding protein MG (RASSL) ₈ into plants by the Agrobacterium method was constructed. The plasmid pRASSL8 prepared in Example 17 was constructed according to the method for preparing pBIHASYS8 described above, and the protoporphyrin IX binding protein MG was constructed.
A plasmid pBIRASSL8 (FIG. 19) in which the gene encoding (RASSL) ₈ was linked downstream of the 35S promoter was prepared. Plasmid pBIHASYS8 or pBIRASSL8 above,
Agrobacterium strain having pBIHASYS8, and pBIRASSL8 were introduced by introducing each into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, culturing them in a medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin and selecting transformants. Agrobacterium strains were isolated. The Agrobacterium strain was infected into aseptically cultured tobacco leaf pieces, and tobacco into which the gene encoding the protoporphyrin IX binding protein MG (HASYS) ₈ was introduced in the same manner as described in Example 2, and Porphyrin IX binding protein MG (R
ASSL) Tobacco into which the gene encoding ₈ has been introduced is obtained.

【００８２】参考例１６ プロトポルフィリンIX結合性
ペプチドをコードする遺伝子が導入されたタバコの除草
剤耐性の確認参考例１５で作製されたプロトポルフィリ
ンIX結合性タンパク質をコードする遺伝子が導入された
タバコを、実施例３と同様の操作で試験し、該タバコの
除草性化合物に対する耐性度を定量的に確認する。Reference Example 16 Confirmation of herbicide resistance of tobacco into which a gene encoding a protoporphyrin IX-binding peptide was introduced The tobacco having a gene encoding a protoporphyrin IX-binding protein produced in Reference Example 15 was introduced. A test was conducted in the same manner as in Example 3 to quantitatively confirm the degree of resistance of the tobacco to the herbicidal compound.

【００８３】[0083]

【発明の効果】本発明により、雑草防除剤に対する耐性
が付与された植物の作出が可能となる。Industrial Applicability According to the present invention, it is possible to produce a plant having resistance to a weed control agent.

【００８４】[配列表フリーテキスト] 配列番号１ bchH遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオ
チドプライマー 配列番号２ bchH遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオ
チドプライマー 配列番号３ ダイズ由来のPPO遺伝子を増幅するために設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマー 配列番号４ ダイズ由来のPPO遺伝子を増幅するために設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマー 配列番号６ bchH遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオ
チドプライマー 配列番号７ bchH遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオ
チドプライマー 配列番号８ タバコ由来のchlH遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ
断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号９ タバコ由来のchlH遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ
断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号１０ ダイズ由来のPPO遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ
断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号１１ ダイズ由来のPPO遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ
断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号１２ ダイズ由来のPPO遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ
断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号１３ ダイズ由来のPPO遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡ
断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプ
ライマー 配列番号１４ コナミドリムシ由来のPPO遺伝子を増幅するために設計
されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１５ コナミドリムシ由来のPPO遺伝子を増幅するために設計
されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１７ コナミドリムシ由来のPPO遺伝子の部分塩基配列を有す
るＤＮＡ断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレ
オチドプライマー 配列番号１８ コナミドリムシ由来のPPO遺伝子の部分塩基配列を有す
るＤＮＡ断片を増幅するために設計されたオリゴヌクレ
オチドプライマー 配列番号１９ キュウリ由来のフェロケラターゼ遺伝子の部分塩基配列
を有するＤＮＡ断片を増幅するために設計されたオリゴ
ヌクレオチドプライマー 配列番号２０ キュウリ由来のフェロケラターゼ遺伝子の部分塩基配列
を有するＤＮＡ断片を増幅するために設計されたオリゴ
ヌクレオチドプライマー 配列番号２１ 大腸菌由来のhemF遺伝子を増幅するために設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマー 配列番号２２ 大腸菌由来のhemF遺伝子を増幅するために設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマー 配列番号２３ 大腸菌由来のhemF遺伝子を増幅するために設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマー 配列番号２４ 大腸菌由来のhemF遺伝子を増幅するために設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマー 配列番号２５ ランダムな５つのアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む
タンパク質をコードする遺伝子を作製するために設計さ
れたオリゴヌクレオチド 配列番号２６ ランダムな５つのアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む
タンパク質をコードする遺伝子を作製するために設計さ
れたオリゴヌクレオチド 配列番号２７ アミノ酸配列ＨＡＳＹＳを含むタンパク質をコードする
遺伝子を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号２８ アミノ酸配列ＨＡＳＹＳを含むタンパク質をコードする
遺伝子を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号２９ アミノ酸配列ＲＡＳＳＬを含むタンパク質をコードする
遺伝子を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３０ アミノ酸配列ＲＡＳＳＬを含むタンパク質をコードする
遺伝子を作製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３１ タンパク質ＭＧＨＡＳＹＳをコードする遺伝子を作製す
るために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３２ タンパク質ＭＧＨＡＳＹＳをコードする遺伝子を作製す
るために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３３ タンパク質ＭＧＲＡＳＳＬをコードする遺伝子を作製す
るために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３４ タンパク質ＭＧＲＡＳＳＬをコードする遺伝子を作製す
るために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３５ タンパク質ＭＧＹＡＧＹをコードする遺伝子を作製する
ために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３６ タンパク質ＭＧＹＡＧＹをコードする遺伝子を作製する
ために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３７ タンパク質ＭＧＹＡＧＦをコードする遺伝子を作製する
ために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３８ タンパク質ＭＧＹＡＧＦをコードする遺伝子を作製する
ために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号３９ タンパク質ＭＧ(ＨＡＳＹＳ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４０ タンパク質ＭＧ(ＨＡＳＹＳ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４１ タンパク質ＭＧ(ＨＡＳＹＳ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４２ タンパク質ＭＧ(ＨＡＳＹＳ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４３ タンパク質ＭＧ(ＨＡＳＹＳ)₈をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４４ タンパク質ＭＧ(ＨＡＳＹＳ)₈をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４５ タンパク質ＭＧ(ＲＡＳＳＬ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４６ タンパク質ＭＧ(ＲＡＳＳＬ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４７ タンパク質ＭＧ(ＲＡＳＳＬ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４８ タンパク質ＭＧ(ＲＡＳＳＬ)₄をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号４９ タンパク質ＭＧ(ＲＡＳＳＬ)₈をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号５０ タンパク質ＭＧ(ＲＡＳＳＬ)₈をコードする遺伝子を作
製するために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号５１ プロトポルフィリンIX結合タンパク質HASYS 配列番号５２ プロトポルフィリンIX結合タンパク質MGHASYS 配列番号５３ プロトポルフィリンIX結合タンパク質RASSL 配列番号５４ プロトポルフィリンIX結合タンパク質MGRASSL 配列番号５５ H₂TMpyP結合タンパク質YAGY 配列番号５６ H₂TMpyP結合タンパク質MGYAGY 配列番号５７ H₂TMpyP結合タンパク質YAGF 配列番号５８ H₂TMpyP結合タンパク質MGYAGF 配列番号５９ プロトポルフィリンIX結合タンパク質MG(HASYS)₄ 配列番号６０ プロトポルフィリンIX結合タンパク質MG(HASYS)₈ 配列番号６１ プロトポルフィリンIX結合タンパク質MG(RASSL)₄ 配列番号６２ プロトポルフィリンIX結合タンパク質MG(RASSL)₈ [Sequence Listing Free Text] SEQ ID NO: 1 Oligonucleotide primer designed to amplify bchH gene SEQ ID NO: 2 Oligonucleotide primer designed to amplify bchH gene SEQ ID NO: 3 Soybean-derived PPO gene Oligonucleotide primer designed to amplify SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide primer designed to amplify soybean-derived PPO gene SEQ ID NO: 6 Oligonucleotide primer designed to amplify bchH gene SEQ ID NO: 7 bchH gene SEQ ID NO: 8 DNA having partial nucleotide sequence of tobacco-derived chlH gene
Oligonucleotide primer designed to amplify fragment SEQ ID NO: 9 DNA having partial base sequence of tobacco-derived chlH gene
Oligonucleotide primer designed to amplify fragment SEQ ID NO: 10 DNA having partial base sequence of PPO gene derived from soybean
Oligonucleotide primer designed to amplify fragment SEQ ID NO: 11 DNA having partial base sequence of PPO gene derived from soybean
Oligonucleotide primer designed to amplify fragment SEQ ID NO: 12 DNA having partial base sequence of PPO gene derived from soybean
Oligonucleotide primer designed to amplify fragment SEQ ID NO: 13 DNA having partial base sequence of PPO gene derived from soybean
Oligonucleotide primer designed to amplify the fragment SEQ ID NO: 14 Oligonucleotide primer designed to amplify the PPO gene derived from Euglena sequence SEQ ID NO: 15 Oligo designed to amplify the PPO gene derived from Euglena Nucleotide primer SEQ ID NO: 17 Oligonucleotide primer designed to amplify a DNA fragment having a partial base sequence of PPO gene derived from Paramecium bursaria SEQ ID No. 18: Amplify DNA fragment having a partial base sequence of PPO gene derived from Paramecium bursaria Oligonucleotide primer designed for amplifying a DNA fragment having a partial base sequence of cucumber-derived ferrochelatase gene SEQ ID NO: 20 Oligonucleotide primer designed to amplify DNA fragment having partial base sequence of erokeratase gene SEQ ID NO: 21 Oligonucleotide primer designed to amplify hemF gene derived from Escherichia coli SEQ ID NO: 22 Amplify hemF gene derived from Escherichia coli SEQ ID NO: 23 Oligonucleotide primer designed to amplify hemF gene derived from E. coli SEQ ID NO: 24 Oligonucleotide primer designed to amplify hemF gene derived from E. coli SEQ ID NO: 25 Oligonucleotide designed to prepare a gene encoding a protein containing an amino acid sequence consisting of five random amino acids SEQ ID NO: 26 Protein containing an amino acid sequence consisting of five random amino acids Oligonucleotide designed to produce gene encoding SEQ ID NO: 27 Oligonucleotide designed to produce gene encoding protein containing amino acid sequence HASYS SEQ ID NO: 28 Gene encoding protein containing amino acid sequence HASYS SEQ ID NO: 29 designed to produce a gene encoding a protein comprising the amino acid sequence RSSL SEQ ID NO: 30 Designed to produce a gene encoding a protein comprising the amino acid sequence RASS SEQ ID NO: 31 designed to produce a gene encoding protein MGHASYS SEQ ID NO: 32 designed to produce a gene encoding protein MGHASYS Oligonucleotides designed to make genes SEQ ID NO: 33 Oligonucleotides designed to make a gene encoding protein MGRASSSL SEQ ID NO: 34 Oligonucleotides designed to make a gene encoding protein MGRASSSL SEQ ID NO: 35 Oligonucleotide designed to produce gene encoding protein MGYAAGY SEQ ID NO: 36 Oligonucleotide designed to produce gene encoding protein MGYAAGY SEQ ID NO: 37 Gene producing gene encoding protein MGYAGF Oligonucleotide designed for generating a gene encoding protein MGYAGF SEQ ID NO: 38 ASYS) ₄ is designed to produce a gene encoding the oligonucleotide SEQ ID NO: 40 protein MG (hasys) ₄ is designed to produce a gene encoding the oligonucleotide SEQ ID NO: 41 protein MG a (hasys) ₄ Oligonucleotide designed to produce gene encoding SEQ ID NO: 42 Oligonucleotide designed to produce gene encoding protein MG (HASYS) ₄ SEQ ID NO: 43 Gene encoding protein MG (HASYS) ₈ Oligonucleotides designed to produce SEQ ID NO: 44 Oligonucleotides designed to produce a gene encoding protein MG (HASYS) ₈ SEQ ID NO: 45 To produce a gene encoding protein MG (RASSSL) ₄ Designed Oligonucleotides SEQ ID NO: designed to produce a gene encoding the oligonucleotide SEQ ID NO: 47 protein MG (RASSL) _4, which is designed to produce a gene encoding the oligo nucleotide SEQ ID NO: 46 protein MG (RASSL) ₄ 48 Oligonucleotide designed to create a gene encoding protein MG (RASSSL) ₄ SEQ ID NO: 49 Oligonucleotide designed to create a gene encoding protein MG (RASSSL) ₈ SEQ ID NO: 50 Protein MG ( oligonucleotide designed SEQ ID NO: 51 protoporphyrin IX binding protein HASYS SEQ ID NO: 52 protoporphyrin IX binding protein MGHASYS SEQ ID NO: 53 protoporphyrin IX binding to produce a gene encoding RASSL) ₈ Protein RASSL SEQ ID NO: 54 protoporphyrin IX binding protein MGRASSL SEQ ID NO: 55 H ₂ TMPyP binding protein YAGY SEQ ID NO: 56 H ₂ TMPyP binding protein MGYAGY SEQ ID NO: 57 H ₂ TMPyP binding protein YAGF SEQ ID NO: 58 H ₂ TMPyP binding protein MGYAGF SEQ ID NO: 59 Protoporphyrin IX binding protein MG (HASYS) ₄ SEQ ID NO: 60 Protoporphyrin IX binding protein MG (HASYS) ₈ SEQ ID NO: 61 Protoporphyrin IX binding protein MG (RASSL) ₄ SEQ ID NO: 62 Protoporphyrin IX binding protein MG (RASSL) ₈

【００８５】[0085]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Method for producing herbicide resistant plants <130> P150318 <150> JP 10/120553 <151> 1998-04-30 <150> JP 10/281127 <151> 1998-10-02 <150> JP 10/330981 <151> 1998-11-20 <150> JP 11/054730 <151> 1999-03-02 <160> 62 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 1 gacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 2 acggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t 31 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify soybean PPO gene <400> 3 tcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify soybean PPO gene <400> 4 ttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg 36 <210> 5 <211> 1632 <212> DNA <213> Glycine max var. Williams82 <220> <221> CDS <222> (1)...(1632) <400> 5 atg gtt tcc gtc ttc aac gag atc cta ttc ccg ccg aac caa acc ctt 48 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 ctt cgc ccc tcc ctc cat tcc cca acc tct ttc ttc acc tct ccc act 96 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 cga aaa ttc cct cgc tct cgc cct aac cct att cta cgc tgc tcc att 144 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 gcg gag gaa tcc acc gcg tct ccg ccc aaa acc aga gac tcc gcc ccc 192 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro 50 55 60 gtg gac tgc gtc gtc gtc ggc gga ggc gtc agc ggc ctc tgc atc gcc 240 Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala 65 70 75 80 cag gcc ctc gcc acc aaa cac gcc aat gcc aac gtc gtc gtc acg gag 288 Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu 85 90 95 gcc cga gac cgc gtc ggc ggc aac atc acc acg atg gag agg gac gga 336 Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly 100 105 110 tac ctc tgg gaa gaa ggc ccc aac agc ttc cag cct tct gat cca atg 384 Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met 115 120 125 ctc acc atg gtg gtg gac agt ggt tta aag gat gag ctt gtt ttg ggg 432 Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140 gat cct gat gca cct cgg ttt gtg ttg tgg aac agg aag ttg agg ccg 480 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro 145 150 155 160 gtg ccc ggg aag ctg act gat ttg cct ttc ttt gac ttg atg agc att 528 Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile 165 170 175 ggt ggc aaa atc agg gct ggc ttt ggt gcg ctt gga att cgg cct cct 576 Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro 180 185 190 cct cca ggt cat gag gaa tcg gtt gaa gag ttt gtt cgt cgg aac ctt 624 Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 195 200 205 ggt gat gag gtt ttt gaa cgg ttg ata gag cct ttt tgt tca ggg gtc 672 Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 210 215 220 tat gca ggc gat cct tca aaa tta agt atg aaa gca gca ttc ggg aaa 720 Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys 225 230 235 240 gtt tgg aag ctg gaa aaa aat ggt ggt agc att att ggt gga act ttc 768 Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe 245 250 255 aaa gca ata caa gag aga aat gga gct tca aaa cca cct cga gat ccg 816 Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro 260 265 270 cgt ctg cca aaa cca aaa ggt cag act gtt gga tct ttc cgg aag gga 864 Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly 275 280 285 ctt acc atg ttg cct gat gca att tct gcc aga cta ggc aac aaa gta 912 Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val 290 295 300 aag tta tct tgg aag ctt tca agt att agt aaa ctg gat agt gga gag 960 Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu 305 310 315 320 tac agt ttg aca tat gaa aca cca gaa gga gtg gtt tct ttg cag tgc 1008 Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys 325 330 335 aaa act gtt gtc ctg acc att cct tcc tat gtt gct agt aca ttg ctg 1056 Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 340 345 350 cgt cct ctg tct gct gct gct gca gat gca ctt tca aag ttt tat tac 1104 Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr 355 360 365 cct cca gtt gct gca gtt tcc ata tcc tat cca aaa gaa gct att aga 1152 Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg 370 375 380 tca gaa tgc ttg ata gat ggt gag ttg aag ggg ttt ggt caa ttg cat 1200 Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His 385 390 395 400 cca cgt agc caa gga gtg gaa aca tta gga act ata tac agc tca tca 1248 Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser 405 410 415 cta ttc ccc aac cga gca cca cct gga agg gtt cta ctc ttg aat tac 1296 Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr 420 425 430 att gga gga gca act aat act gga att tta tcg aag acg gac agt gaa 1344 Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu 435 440 445 ctt gtg gaa aca gtt gat cga gat ttg agg aaa atc ctt ata aac cca 1392 Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro 450 455 460 aat gcc cag gat cca ttt gta gtg ggg gtg aga ctg tgg cct caa gct 1440 Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala 465 470 475 480 att cca cag ttc tta gtt ggc cat ctt gat ctt cta gat gtt gct aaa 1488 Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys 485 490 495 gct tct atc aga aat act ggg ttt gaa ggg ctc ttc ctt ggg ggt aat 1536 Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn 500 505 510 tat gtg tct ggt gtt gcc ttg gga cga tgc gtt gag gga gcc tat gag 1584 Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu 515 520 525 gta gca gct gaa gta aac gat ttt ctc aca aat aga gtg tac aaa tag 1632 Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys 530 535 540 543 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <213> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 6 gacatctagt ctagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 7 acggaagctt ggtacctcac tcggcggcaa t 31 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of tobacco chlH gene <400> 8 ccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc 35 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of tobacco chlH gene <400> 9 gagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg 34 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of soybean PPO gene <400> 10 ggcggaggcg tcaccatggt ctgcatcgcc caggcc 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of soybean PPO gene <400> 11 gcctgcaggt cgacaactgc tactatttgt acactc 36 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of soybean PPO gene <400> 12 cacaggaaag gtaccatggt ctgcatcgcc cag 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of soybean PPO gene <400> 13 cctgcagctc gagagctcct actatttgta cac 33 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Chlamydomonas PPO gene <400> 14 aatgatgttg acccagactc ctgggacc 28 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Chlamydomonas PPO gene <400> 15 tactacacat cccagcaagc gccaatg 27 <210> 16 <211> 1838 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii CC407 <220> <221> CDS <222> (2)...(1693) <400> 16 a atg atg ttg acc cag act cct ggg acc gcc acg gct tct agc cgg 46 Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg 1 5 10 15 cgg tcg cag atc cgc tcg gct gcg cac gtc tcc gcc aag gtc gcg cct 94 Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro 20 25 30 cgg ccc acg cca ttc tcg gtc gcg agc ccc gcg acc gct gcg agc ccc 142 Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro 35 40 45 gcg acc gcg gcg gcc cgc cgc aca ctc cac cgc act gct gcg gcg gcc 190 Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 act ggt gct ccc acg gcg tcc gga gcc ggc gtc gcc aag acg ctc gac 238 Thr Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp 65 70 75 aat gtg tat gac gtg atc gtg gtc ggt gga ggt ctc tcg ggc ctg gtg 286 Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val 80 85 90 95 acc ggc cag gcc ctg gcg gct cag cac aaa att cag aac ttc ctt gtt 334 Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val 100 105 110 acg gag gct cgc gag cgc gtc ggc ggc aac att acg tcc atg tcg ggc 382 Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly 115 120 125 gat ggc tac gtg tgg gag gag ggc ccg aac agc ttc cag ccc aac gat 430 Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp 130 135 140 agc atg ctg cag att gcg gtg gac tct ggc tgc gag aag gac ctt gtg 478 Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val 145 150 155 ttc ggt gac ccc acg gct ccc cgc ttc gtg tgg tgg gag ggc aag ctg 526 Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu 160 165 170 175 cgc ccc gtg ccc tcg ggc ctg gac gcc ttc acc ttc gac ctc atg tcc 574 Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser 180 185 190 atc ccc ggc aag atc cgc gcc ggg ctg ggc gcc atc ggc ctc atc aac 622 Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn 195 200 205 gga gcc atg ccc tcc ttc gag gag agt gtg gag cag ttc atc cgc cgc 670 Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg 210 215 220 aac ctg ggc gat gag gtg ttc ttc cgc ctg atc gag ccc ttc tgc tcc 718 Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser 225 230 235 ggc gtg tac gcg ggc gac ccc tcc aag ctg tcc atg aag gcg gcc ttc 766 Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe 240 245 250 255 aac agg atc tgg att ctg gag aag aac ggc ggc agc ctg gtg gga ggt 814 Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly 260 265 270 gcc atc aag ctg ttc cag gaa cgc cag tcc aac ccg gcc ccg ccg cgg 862 Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg 275 280 285 gac ccg cgc ctg ccg ccc aag ccc aag ggc cag acg gtg ggc tcg ttc 910 Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe 290 295 300 cgc aag ggc ctg aag atg ctg ccg gac gcc att gag cgc aac atc ccc 958 Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro 305 310 315 gac aag atc cgc gtg aac tgg aag ctg gtg tct ctg ggc cgc gag gcg 1006 Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala 320 325 330 335 gac ggg cgg tac ggg ctg gtg tac gac acg ccc gag ggc cgt gtc aag 1054 Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys 340 345 350 gtg ttt gcc cgc gcc gtg gct ctg acc gcg ccc agc tac gtg gtg gcg 1102 Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala 355 360 365 gac ctg gtc aag gag cag gcg ccc gcc gcc gcc gag gcc ctg ggc tcc 1150 Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser 370 375 380 ttc gac tac ccg ccg gtg ggc gcc gtg acg ctg tcg tac ccg ctg agc 1198 Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser 385 390 395 gcc gtg cgg gag gag cgc aag gcc tcg gac ggg tcc gtg ccg ggc ttc 1246 Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe 400 405 410 415 ggt cag ctg cac ccg cgc acg cag ggc atc acc act ctg ggc acc atc 1294 Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile 420 425 430 tac agc tcc agc ctg ttc ccc ggc cgc gcg ccc gag ggc cac atg ctg 1342 Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu 435 440 445 ctg ctc aac tac atc ggc ggc acc acc aac cgc ggc atc gtc aac cag 1390 Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln 450 455 460 acc acc gag cag ctg gtg gag cag gtg gac aag gac ctg cgc aac atg 1438 Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met 465 470 475 gtc atc aag ccc gac gcg ccc aag ccc cgt gtg gtg ggc gtg cgc gtg 1486 Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val 480 485 490 495 tgg ccg cgc gcc atc ccg cag ttc aac ctg ggc cac ctg gag cag ctg 1534 Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu 500 505 510 gac aag gcg cgc aag gcg ctg gac gcg gcg ggg ctg cag ggc gtg cac 1582 Asp Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His 515 520 525 ctg ggg ggc aac tac gtc agc ggt gtg gcc ctg ggc aag gtg gtg gag 1630 Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu 530 535 540 cac ggc tac gag tcc gca gcc aac ctg gcc aag agc gtg tcc aag gcc 1678 His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala 545 550 555 gca gtc aag gcc taa gcggctgcag cagtagcagc agcagcatcg ggctgtagct 1733 Ala Val Lys Ala 560 563 ggtaaatgcc gcagtggcac cggcagcagc aattggcaag cacttggggc aagcggagtg 1793 gaggcgaggg gggggctacc attggcgctt gctgggatgt gtagt 1838 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of Chlamydomonas PPO gene <400> 17 ggtcggtgga ggggatccga tgctggtgac cg 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of Chlamydomonas PPO gene <400> 18 gctactgctg cgagctctta ggccttgact gc 32 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of cucumber ferrochelatase gene <400> 19 gctttagaat cggatcctat ggcagtggat gac 33 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of cucumber ferrochelatase gene <400> 20 ggtgaacttc tatttgagct ctcaggtaaa tataag 36 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF ge ne <400> 21 gctgaaggcg tgatcagtta tttcc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF ge ne <400> 22 catcagcctg cagtgcgaaa agtg 24 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF ge ne <400> 23 cgaaaaaggg atccgttatg aaaccc 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF ge ne <400> 24 gctgttttcc gagctcccgt cac 23 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides to synthesize genes coding proteins whic h contain amino acid sequences comprised with random 5 amino acids <400> 25 tggccnnknn knnknnknnk gc 22 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotides to synthesize genes coding proteins whic h contain amino acid sequences comprised with random 5 amino acids <400> 26 ggccgcmnnm nnmnnmnnmn nggccagct 29 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid sequence HASYS <400> 27 tggcccatgc tagttagtcg gc 22 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid squence HASYS <400> 28 tggcgccgac taactagcat gggccagct 29 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid sequence RASSL <400> 29 tggcccgggc gtcgtcgttg gc 22 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid sequence RASSL <400> 30 ggccgccaac gacgacgccc gggccagct 29 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGHASYS <400> 31 catgggtcac gcttcttact cctaag 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGHASYS <400> 32 aattcttagg agtaagaagc gtgacc 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGRASSL <400> 33 catgggtcgt gcttcttccc tgtaag 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGRASSL <400> 34 aattcttaca gggaagaagc acgacc 26 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGY <400> 35 catgggttac gctggctact aag 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGY <400> 36 aattcttagt agccagcgta acc 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGF <400> 37 catgggttac gctggcttct aag 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGF <400> 38 aattcttaga agccagcgta acc 23 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(HASYS)₄ <400> 39 catgggtcac gcttcttact cccatgcatc ttac 34 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(HASYS)₄ <400> 40 gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc gtgacc 36 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(HASYS)₄ <400> 41 tcccacgctt cttactccca tgcatcttac tcctaag 37 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(HASYS)₄ <400> 42 aattcttagg agtaagatgc atgggagtaa gaagc 35 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(HASYS)₈ <400> 43 tcccacgctt cttactccca tgcatcttac 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(HASYS)₈ <400> 44 gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc 30 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(RASSL)₄ <400> 45 catgggtcgt gcttcttccc tgcgcgcatc ttcc 34 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(RASSL)₄ <400> 46 acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc acgacc 36 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(RASSL)₄ <400> 47 ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc ctgtaag 37 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(RASSL)₄ <400> 48 aattcttaca gggaagatgc gcgcagggaa gaagc 35 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(RASSL)₈ <400> 49 ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG(RASSL)₈ <400> 50 acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc 30 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein HASYS <400> 51 His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MGHASYS <400> 52 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein RASSL <400> 53 Arg Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MGRASSL <400> 54 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H₂TMpyP binding protin YAGY <400> 55 Tyr Ala Gly Tyr 1 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H₂TMpyP binding protin MGYAGY <400> 56 Met Gly Tyr Ala Gly Tyr 1 5 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H₂TMpyP binding protin YAGF <400> 57 Tyr Ala Gly Phe 1 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H₂TMpyP binding protin MGYAGF <400> 58 Met Gly Tyr Ala Gly Phe 1 5 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(HASYS)₄ <400> 59 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Ser His Ala Ser Tyr Ser 20 <210> 60 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(HASYS)₈ <400> 60 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser 20 25 30 His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser 35 40 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(RASSL)₄ <400> 61 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ser Ser Leu 20 <210> 62 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protoporphyrin IX binding protein MG(RASSL)₈ <400> 62 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu 20 25 30 Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu 35 40[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Method for producing herbicide resistant plants <130> P150318 <150> JP 10/120553 <151> 1998-04-30 <150> JP 10/281127 <151 > 1998-10-02 <150> JP 10/330981 <151> 1998-11-20 <150> JP 11/054730 <151> 1999-03-02 <160> 62 <210> 1 <211> 39 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 1 gacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 2 acggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t 31 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify soybean PPO gene <400> 3 tcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify soybean PPO gene <400> 4 ttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg <210 > 5 <211> 1 632 <212> DNA <213> Glycine max var. Williams82 <220><221> CDS <222> (1) ... (1632) <400> 5 atg gtt tcc gtc ttc aac gag atc cta ttc ccg ccg aac caa acc ctt 48 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 ctt cgc ccc tcc ctc cat tcc cca acc tct ttc ttc acc tct ccc act 96 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 cga aaa ttc cct cgc tct cgc cct aac cct att cta cgc tgc tcc att 144 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 gcg gag gaa tcc acc gcg tct ccg ccc aaa acc aga gac tcc gcc ccc 192 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro 50 55 60 gtg gac tgc gtc gtc gtc ggc gga ggc gtc agc ggc ctc tgc atp gcc Valc 240 Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala 65 70 75 80 cag gcc ctc gcc acc aaa cac gcc aat gcc aac gtc gtc gtc acg gag 288 Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu 85 90 95 gcc cga gac cgc gtc ggc ggc aac atc acc acg atg gag agg gac g ga 336 Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly 100 105 110 tac ctc tgg gaa gaa ggc ccc aac agc ttc cag cct tct gat cca atg 384 Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met 115 120 125 ctc acc atg gtg gtg gac agt ggt tta aag gat gag ctt gtt ttg ggg 432 Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140 gat cct gat gca cct cgg ttt ggt ttg tgg aac agg aag ttg agg ccg 480 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro 145 150 155 160 gtg ccc ggg aag ctg act gat ttg cct ttc ttt gac ttg atg agc att 528 Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile 165 170 175 ggt ggc aaa atc agg gct ggc ttt ggt gcg ctt gga att cgg cct cct 576 Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro 180 185 190 cct cca ggt cat gag gaa tcg gtt gaa gag ttt gtt cgt cgg aac ctt 624 Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 195 200 205 ggt gat gag gtt ttt gaa cgg ttg ata gag cct ttt t gt tca ggg gtc 672 Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 210 215 220 tat gca ggc gat cct tca aaa tta agt atg aaa gca gca ttc ggg aaa 720 Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys 225 230 235 240 gtt tgg aag ctg gaa aaa aat ggt ggt agc att att ggt gga act ttc 768 Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe 245 250 255 aaa gca ata caa gag aga aat gga gct tca aaa cca cct cga gat ccg 816 Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro 260 265 270 cgt ctg cca aaa cca aaa ggt cag act gtt gga tct ttc cgg aag gga864 Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly 275 280 285 ctt acc atg ttg cct gat gca att tct gcc aga cta ggc aac aaa gta 912 Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val 290 295 300 aag tta tct tgg aag ctt tca agt att agt aaa ctg gat agt gga gag 960 Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu 305 310 315 320 tac agt ttg aca tat gaa aca cca g aa gga gtg gtt tct ttg cag tgc 1008 Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys 325 330 335 aaa act gtt gtc ctg acc att cct tcc tat gtt gct agt aca ttg ctg 1056 Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 340 345 350 cgt cct ctg tct gct gct gct gca gat gca ctt tca aag ttt tat tac 1104 Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr 355 360 365 cct cca gtt gct gca gtt tcc ata tcc tat cca aaa gaa gct att aga 1152 Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg 370 375 380 tca gaa tgc ttg ata gat ggt gag ttg aag ggg ttt ggt ca ttg cat 1200 Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His 385 390 395 400 cca cgt agc caa gga gtg gaa aca tta gga act ata tac agc tca tca 1248 Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser 405 410 415 cta ttc ccc aac cga gca cca cct gga agg gtt cta ctc ttg aat tac 1296 Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr 420 425 430 att gga gga gc a act aat act gga att tta tcg aag acg gac agt gaa 1344 Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu 435 440 445 ctt gtg gaa aca gtt gat cga gat ttg agg aaa atc ctt ata aac cca 1392 Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro 450 455 460 aat gcc cag gat cca ttt gta gtg ggg gtg aga ctg tgg cct caa gct 1440 Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala 465 470 475 480 att cca cag ttc tta gtt ggc cat ctt gat ctt cta gat gtt gct aaa 1488 Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys 485 490 495 gct tct atc aga aat act ggg ttt gaa ggg ctc ttc ctt ggg ggt aat 1536 Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn 500 505 510 tat gtg tct ggt gtt gcc ttg gga cga tgc gtt gag gga gcc tat gag 1584 Tyr Val Seryr Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu 515 520 525 gta gca gct gaa gta aac gat ttt ctc aca aat aga gtg tac aaa tag 1632 Val Ala Ala Gla Val Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys 530 535 540 543 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><213> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 6 gacatctagt ctagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39 <210> 7 <211> 31 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify bchH gene <400> 7 acggaagctt ggtacctcac tcggcggcaa t 31 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of tobacco chlH gene <400> 8 ccaatgtaat gctatggtac ctatgttatt cactc 35 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of tobacco chlH gene <400> 9 gagatcattc tttttgctgt cgacttatcg atcg 34 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 10 ggcggaggcg tcaccatggt ctgcatcgcc caggcc 36 <210> 1 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 11 gcctgcaggt cgacaactgc tactatttgt acactc 36 <210> 12 <211 > 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 12 cacaggaaag gtaccatggt ctgcatcgcc cag 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of soybean PPO gene <400> 13 cctgcagctc gagagctcct actatttgta cac 33 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify Chlamydomonas PPO gene <400> 14 aatgatgttg acccagactc ctgggacc 28 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify Chlamydomonas PPO gene <400> 15 tactacacat cccagcaagc gccaatg 27 <210> 1 6 <211> 1838 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii CC407 <220><221> CDS <222> (2) ... (1693) <400> 16 a atg atg ttg acc cag act cct ggg acc gcc acg gct tct agc cgg 46 Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg 1 5 10 15 cgg tcg cag atc cgc tcg gct gcg cac gtc tcc gcc aag gtc gcg cct 94 Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro 20 25 30 cgg ccc acg cca ttc tcg gtc gcg agc ccc gcg acc gct gcg agc ccc 142 Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro 35 40 45 gcg acc gcg gcg gcc cgc cgc aca ctc cac cgc act gct gcg gcg gcc 190 Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 act ggt gct ccc acg gcg tcc gga gcc ggc gtc gcc aag acg ctc gac Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp 65 70 75 aat gtg tat gac gtg atc gtg gtc ggt gga ggt ctc tcg ggc ctg gtg 286 Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val 80 85 90 95 acc ggc cag gcc ctg gcg gct cag cac aaa att cag aac t tc ctt gtt 334 Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val 100 105 110 acg gag gct cgc gag cgc gtc ggc ggc aac att acg tcc atg tcg ggc 382 Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Ile Thr Ser Met Ser Gly 115 120 125 gat ggc tac gtg tgg gag gag ggc ccg aac agc ttc cag ccc aac gat 430 Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp 130 135 140 agc atg ctg cag att gcg gtg gac tct ggc tgc gag aag gac ctt gtg 478 Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val 145 150 155 ttc ggt gac ccc acg gct ccc cgc ttc gtg tgg tgg gag ggc agg Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu 160 165 170 175 cgc ccc gtg ccc tcg ggc ctg gac gcc ttc acc ttc gac ctc atg tcc 574 Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser 180 185 190 atc ccc ggc aag atc cgc gcc ggg ctg ggc gcc atc ggc ctc atc aac 622 Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn 195 200 205 gga gcc atg ccc tcc ttc gag gag g ag cag ttc atc cgc cgc 670 Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg 210 215 220 aac ctg ggc gat gag gtg ttc ttc cgc ctg atc gag ccc ttc tgc tcc 718 Asn Leu Gly Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser 225 230 235 ggc gtg tac gcg ggc gac ccc tcc aag ctg tcc atg aag gcg gcc ttc 766 Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe 240 245 250 255 aac agg atc tgg att ctg gag aag aac ggc ggc agc ctg gtg gga ggt 814 Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly 260 265 270 gcc atc aag ctg ttc cag gaa cgc gcc ccc gcc cgg 862 Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg 275 280 gac ccg cgc ctg ccg ccc aag ccc aag ggc cag acg gtg ggc tcg ttc 910 Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Val Gly Ser Phe 290 295 300 cgc aag ggc ctg aag atg ctg ccg gac gcc att gag cgc aac atc ccc 958 Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro 305 310 315 gac aag atc cgc gt a ag ctg gtg tct ctg ggc cgc gag gcg 1006 Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala 320 325 330 335 gac ggg cgg tac ggg ctg gtg tac gac acg ccc gag ggc cgt Ggt gag Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys 340 345 350 gtg ttt gcc cgc gcc gtg gct ctg acc gcg ccc agc tac gtg gtg gcg 1102 Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Ala 355 360 365 gac ctg gtc aag gag cag gcg ccc gcc gcc gcc gag gcc ctg ggc tcc 1150 Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser 370 375 380 ttc gac tac ccg ccg gtg gg gcc gcc gcc tac ccg ctg agc 1198 Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser 385 390 395 gcc gtg cgg gag gag cgc aag gcc tcg gac ggg tcc gtg ccg ggc ttc 1246 Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys A Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe 400 405 410 415 ggt cag ctg cac ccg cgc acg cag ggc atc acc act ctg ggc acc atc 1294 Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile 420 425 430 tac ag c tcc agc ctg ttc ccc ggc cgc gcg ccc gag ggc cac atg ctg 1342 Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu 435 440 445 ctg ctc aac tac atc ggc ggc acc acc ac cgc acc ac cgc cag 1390 Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln 450 455 460 acc acc gag cag ctg gtg gag cag gtg gac aag gac ctg cgc aac atg 1438 Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met 465 470 475 gtc atc aag ccc gac gcg ccc aag ccc cgt gtg gtg ggc gtg cgc gtg 1486 Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val 480 485 490 490 495 tgg ccg cgg gcc cag ttc aac ctg ggc cac ctg gag cag ctg 1534 Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu 500 505 510 gac aag gcg cgc aag gcg ctg gac gcg gcg ggg ctg cag ggc ggg ggg ctg cag ggg gg Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His 515 520 525 ctg ggg ggc aac tac gtc agc ggt gtg gcc ctg ggc aag gtg gtg gag 1630 Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val 530 535 540 cac ggc tac gag tcc gca gcc aac ctg gcc aag agc gtg tcc aag gcc 1678 His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala 545 550 555 555 gca gtc aag gcc taa gcggctgcag cag cag cag cag cag tagg Val Lys Ala 560 563 ggtaaatgcc gcagtggcac cggcagcagc aattggcaag cacttggggc aagcggagtg 1793 gaggcgaggg gggggctacc attggcgctt gctgggatgt gtagt 1838 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> fragment Artificial Sequencer tial sequence of Chlamydomonas PPO gene <400> 17 ggtcggtgga ggggatccga tgctggtgac cg 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of Chlamydomonas PPO gene <400> 18 gctactgctg cgagctctta ggccttgact gc 32 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having par tial sequence of cucumber ferrochelatase gene <4 00> 19 gctttagaat cggatcctat ggcagtggat gac 33 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment having partial sequence of cucumber ferrochelatase gene <400> 20 ggtgaacttc tatttgagct ctcaggtaaa tataag 36 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene ne <400> 21 gctgaaggcg tgatcagtta tttcc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 22 catcagcctg cagtgcgaaa agtg 24 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 23 cgaaaaaggg atccgttatg aaaccc 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide primer to amplify Esherichia coli hemF gene <400> 24 gctgttttcc gagctcccgt cac 23 <210> 25 <211> 22 <2 12> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotides to synthesize genes coding proteins whic h contain amino acid sequences comprised with random 5 amino acids <400> 25 tggccnnknn knnknnknnk gc 22 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotides to synthesize genes coding proteins whic h contain amino acid sequences comprised with random 5 amino acids <400> 26 ggccgcmnnm nnmnnmnnmn nggccagct 29 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid sequence HASYS <400> 27 tggcccatgc tagttagtcg gc 22 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid squence HASYS <400> 28 tggcgccgac taactagcat gggccagct 29 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 ><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid sequence RASSL <400> 29 tggcccgggc gtcgtcgttg gc 22 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein including amino acid sequence RASSL <400> 30 ggccgccaac gacgacgccc gggccagct 29 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGHASYS <400> 31 catgggtcac gcttcttact cctaag 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGHASYS <400> 32 aattcttagg agtaagaagc gtgacc 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGRASSL <400> 33 catgggtcgt gcttcttccc tgtaag 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGRASSL <400> 34 aattct taca gggaagaagc acgacc 26 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGY <400> 35 catgggttac gctggctact aag 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGY <400> 36 aattcttagt agccagcgta acc 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGF <400> 37 catgggttac gctggcttct aag 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MGYAGF <400> 38 aattcttaga agccagcgta acc 23 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (HASYS) ₄ <400> 39 catgggtcac gcttcttact cccatgcatc ttac 34 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> D esigned oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (HASYS) ₄ <400> 40 gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc gtgacc 36 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (HASYS) ₄ <400> 41 tcccacgctt cttactccca tgcatcttac tcctaag 37 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (HASYS) ₄ <400> 42 aattcttagg agtaagatgc atgggagtaa gaagc 35 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (HASYS ) ₈ <400> 43 tcccacgctt cttactccca tgcatcttac 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (HASYS) ₈ <400> 44 gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc 30 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to sy nthesize the gene coding the protein MG (RASSL) ₄ <400> 45 catgggtcgt gcttcttccc tgcgcgcatc ttcc 34 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (RASSL) ₄ <400> 46 acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc acgacc 36 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG ( RASSL) ₄ <400> 47 ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc ctgtaag 37 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (RASSL) ₄ <400> 48 aattcttaca gggaagatgc gcgcagggaa gaagc 35 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (RASSL) ₈ <400> 49 ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designed oligonucleotide to synthesize the gene coding the protein MG (RASSL) ₈ <400> 50 acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc 30 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein HASYS <400> 51 His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein MGHASYS <400> 52 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein RASSL <400> 53 Arg Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein MGRASSL <400> 54 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> H ₂ TMpyP binding protin YAGY <400> 55 Tyr Ala Gly Tyr 1 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> H ₂ TMpyP binding protin MGYAGY <400> 56 Met Gly Tyr Ala Gly Tyr 1 5 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> H ₂ TMpyP binding protin YAGF <400> 5 7 Tyr Ala Gly Phe 1 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> H ₂ TMpyP binding protin MGYAGF <400> 58 Met Gly Tyr Ala Gly Phe 1 5 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein MG (HASYS) ₄ <400> 59 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Ser His Ala Ser Tyr Ser 20 <210> 60 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein MG (HASYS) ₈ <400> 60 Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser 20 25 30 His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser 35 40 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX binding protein MG (RASSL) ₄ <400> 61 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ser Ser Leu 20 <210> 62 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Protoporphyrin IX bind ining protein MG (RASSL) ₈ <400> 62 Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu 20 25 30 Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu 35 40

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】プラスミドpETBCHの制限酵素地図を示す。bchH
は光合成細菌Rhodobacter sphaeroidesのマグネシウム
ケラターゼサブユニット遺伝子であり、T7 proはT7ファ
ージのプロモーター配列を、T7 terはT7ファージのター
ミネーター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン
耐性遺伝子、lacI^qはラクトースオペロンのリプレッサ
ータンパク質遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 1 shows a restriction map of plasmid pETBCH. bchH
Is a magnesium keratase subunit gene of photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides, T7 pro means a promoter sequence of T7 phage, and T7 ter means a terminator sequence of T7 phage. Amp ^r is an ampicillin resistance gene, lacI ^q is a lactose operon repressor protein gene, and ori is a replication origin.

【図２】プラスミドpACYCSPの制限酵素地図を示す。PPO
はダイズのプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ遺
伝子であり、lac proラクトースオペロンのプロモータ
ー配列を意味する。また、Cm^rはクロランフェニコール
耐性遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 2 shows a restriction map of plasmid pACYCSP. PPO
Is the soybean protoporphyrinogen IX oxidase gene, which means the promoter sequence of the lac pro lactose operon. Cm ^r represents a chloramphenicol resistance gene, and ori represents a replication origin.

【図３】プラスミドpTVBCHの制限酵素地図を示す。bchH
は光合成細菌Rhodobacter sphaeroidesのマグネシウム
ケラターゼサブユニット遺伝子であり、lac proはラク
トースオペロンのプロモーター配列を意味する。また、
Amp^rはアンピシリン耐性遺伝子、oriは複製開始点を表
す。FIG. 3 shows a restriction map of plasmid pTVBCH. bchH
Is the magnesium keratase subunit gene of the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides, and lac pro means the promoter sequence of the lactose operon. Also,
Amp ^r represents the ampicillin resistance gene, and ori represents the replication origin.

【図４】プラスミドpBIBCHの制限酵素地図を示す。bchH
は光合成細菌Rhodobacter sphaeroidesのマグネシウム
ケラターゼサブユニット遺伝子であり、NPはノパリン合
成酵素遺伝子のプロモーター配列を、NTはノパリン合成
酵素遺伝子のターミネーター配列を、35Sはカリフラワ
ーモザイクウィルスの35Sプロモーターを意味する。ま
た、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNA
の左右境界配列を表す。FIG. 4 shows a restriction map of plasmid pBIBCH. bchH
Is the magnesium keratase subunit gene of the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII is a kanamycin resistance gene, RB and LB are T-DNA
Represents the left and right boundary array.

【図５】プラスミドpNOの制限酵素地図を示す。NPはノ
パリン合成酵素遺伝子のプロモーター配列を、NTはノパ
リン合成酵素遺伝子のターミネーター配列を、35Sはカ
リフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターを意味
する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、RB及びL
BはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 5 shows a restriction map of plasmid pNO. NP indicates the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT indicates the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S indicates the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII is a kanamycin resistance gene, RB and L
B represents the right and left border sequence of T-DNA.

【図６】プラスミドpTCHLHの制限酵素地図を示す。TCHL
Hは葉緑体移行シグナルを欠失したタバコマグネシウム
ケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニット遺
伝子であり、lac proはラクトースオペロンのプロモー
ター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン耐性遺
伝子、Km^rはカナマイシン耐性遺伝子、oriは複製開始点
を表す。FIG. 6 shows a restriction map of plasmid pTCHLH. TCHL
H is a protoporphyrin IX binding subunit gene of tobacco magnesium keratase lacking a chloroplast translocation signal, and lac pro means a promoter sequence of a lactose operon. Amp ^r is an ampicillin resistance gene, Km ^r is a kanamycin resistance gene, and ori is a replication origin.

【図７】プラスミドpBITCHLHの制限酵素地図を示す。TC
HLHは葉緑体移行シグナルを欠失したタバコマグネシウ
ムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニット
遺伝子であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモー
ター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネー
ター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35S
プロモーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン
耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 7 shows a restriction map of plasmid pBITCHLH. TC
HLH is a protoporphyrin IX binding subunit gene of tobacco magnesium keratase lacking the chloroplast translocation signal, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, 35S is the Cauliflower mosaic virus 35S
Means promoter. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図８】プラスミドpTVGMPの制限酵素地図を示す。GMP
は葉緑体移行シグナルとＦＡＤ結合配列を欠失したダイ
ズＰＰＯ遺伝子であり、lac proはラクトースオペロン
のプロモーター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシ
リン耐性遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 8 shows a restriction map of plasmid pTVGMP. GMP
Is a soybean PPO gene lacking a chloroplast translocation signal and a FAD binding sequence, and lac pro means a promoter sequence of a lactose operon. Amp ^r represents an ampicillin resistance gene, and ori represents a replication origin.

【図９】プラスミドpBIGMPの制限酵素地図を示す。GMP
は葉緑体移行シグナルとＦＡＤ結合配列を欠失したダイ
ズＰＰＯ遺伝子であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子の
プロモーター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のタ
ーミネーター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィ
ルスの35Sプロモーターを意味する。また、NPTIIはカナ
マイシン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列
を表す。FIG. 9 shows a restriction map of plasmid pBIGMP. GMP
Is the soybean PPO gene lacking the chloroplast translocation signal and FAD binding sequence, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. Means NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図１０】プラスミドpTVCRPの制限酵素地図を示す。CR
Pは葉緑体移行シグナルとＦＡＤ結合配列を欠失したコ
ナミドリムシＰＰＯ遺伝子であり、lac proはラクトー
スオペロンのプロモーター配列を意味する。また、Amp^r
はアンピシリン耐性遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 10 shows a restriction map of plasmid pTVCRP. CR
P is the Chlamydomonas reinhardtii PPO gene lacking the chloroplast translocation signal and the FAD binding sequence, and lac pro means the promoter sequence of the lactose operon. Also, Amp ^r
Represents an ampicillin resistance gene, and ori represents an origin of replication.

【図１１】プラスミドpBICRPの制限酵素地図を示す。CR
Pは葉緑体移行シグナルとＦＡＤ結合配列を欠失したコ
ナミドリムシＰＰＯ遺伝子であり、NPはノパリン合成酵
素遺伝子のプロモーター配列を、NTはノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター配列を、35Sはカリフラワーモ
ザイクウィルスの35Sプロモーターを意味する。また、N
PTIIはカナマイシン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左
右境界配列を表す。FIG. 11 shows a restriction map of plasmid pBICRP. CR
P is the Chlamydomonas reinhardtii PPO gene lacking the chloroplast translocation signal and FAD binding sequence, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the cauliflower mosaic virus. Means 35S promoter. Also, N
PTII represents the kanamycin resistance gene, and RB and LB represent the left and right border sequences of T-DNA.

【図１２】プラスミドpTVHVF1の制限酵素地図を示す。H
VFはシグナル配列を欠失したオオムギフェロケラターゼ
遺伝子であり、lac proはラクトースオペロンのプロモ
ーター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン耐性
遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 12 shows a restriction map of plasmid pTVHVF1. H
VF is a barley ferrochelatase gene lacking a signal sequence, and lac pro means a promoter sequence of a lactose operon. Amp ^r represents an ampicillin resistance gene, and ori represents a replication origin.

【図１３】プラスミドpBIHVFの制限酵素地図を示す。HV
Fはシグナル配列を欠失したオオムギフェロケラターゼ
遺伝子であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモー
ター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネー
ター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35S
プロモーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン
耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 13 shows a restriction map of plasmid pBIHVF. HV
F is the barley ferrochelatase gene with the signal sequence deleted, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, 35S is the cauliflower mosaic virus 35S
Means promoter. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図１４】プラスミドpTVCSFの制限酵素地図を示す。CS
Fはシグナル配列を欠失したキュウリフェロケラターゼ
遺伝子であり、lac proはラクトースオペロンのプロモ
ーター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン耐性
遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 14 shows a restriction map of plasmid pTVCSF. CS
F is a cucumber ferrochelatase gene lacking a signal sequence, and lac pro means a promoter sequence of a lactose operon. Amp ^r represents an ampicillin resistance gene, and ori represents a replication origin.

【図１５】プラスミドpBICSFの制限酵素地図を示す。CS
Fはシグナル配列を欠失したキュウリフェロケラターゼ
遺伝子であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモー
ター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネー
ター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35S
プロモーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン
耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 15 shows a restriction map of plasmid pBICSF. CS
F is the cucumber ferrochelatase gene lacking the signal sequence, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, 35S is the cauliflower mosaic virus 35S
Means promoter. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図１６】プラスミドpHEMFの制限酵素地図を示す。HEM
Fは大腸菌コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺
伝子hemFであり、lac proはラクトースオペロンのプロ
モーター配列を意味する。また、Amp^rはアンピシリン耐
性遺伝子、oriは複製開始点を表す。FIG. 16 shows a restriction map of plasmid pHEMF. HEM
F is E. coli coproporphyrinogen III oxidase gene hemF, and lac pro means a promoter sequence of a lactose operon. Amp ^r represents an ampicillin resistance gene, and ori represents a replication origin.

【図１７】プラスミドpBIHEMFの制限酵素地図を示す。H
EMFは大腸菌コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ
遺伝子hemFであり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロ
モーター配列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミ
ネーター配列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルス
の35Sプロモーターを意味する。また、NPTIIはカナマイ
シン耐性遺伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表
す。FIG. 17 shows a restriction map of plasmid pBIHEMF. H
EMF is Escherichia coli coproporphyrinogen III oxidase gene hemF, NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図１８】プラスミドpBIHASYS8の制限酵素地図を示
す。HASYS8はタンパク質MG(HASYS)₈をコードする遺伝子
であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター配
列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配
列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモ
ーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺
伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 18 shows a restriction map of plasmid pBIHASYS8. HASYS8 is a gene encoding the protein MG (HASYS) ₈ , NP means the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT means the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S means the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

【図１９】プラスミドpBIRASSL8の制限酵素地図を示
す。RASSL8はタンパク質MG(RASSL)₈をコードする遺伝子
であり、NPはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター配
列を、NTはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配
列を、35Sはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモ
ーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺
伝子、RB及びLBはT-DNAの左右境界配列を表す。FIG. 19 shows a restriction map of plasmid pBIRASSL8. RASSL8 is a gene encoding the protein MG (RASSL) ₈ , NP is the promoter sequence of the nopaline synthase gene, NT is the terminator sequence of the nopaline synthase gene, and 35S is the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. NPTII represents a kanamycin resistance gene, and RB and LB represent left and right border sequences of T-DNA.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平11−54730 (32)優先日 平成11年３月２日(1999．3．2) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 11-54730 (32) Priority date March 2, 1999 (1999.3.2) (33) Priority claim country Japan (JP)

Claims (56)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する
方法であって、下記(1)、(2)および(3)の性質を有する
タンパク質をコードする遺伝子を植物の細胞に導入し発
現させる工程を含むことを特徴とする方法。 (1)該雑草防除剤の雑草防除作用に関わる物質に特異的
に結合する。 (2)当該タンパク質が特異的に結合する物質に対する変
性能を実質的に持たない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。1. A method for imparting resistance to a weed controlling agent to a plant, wherein a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) is introduced into a plant cell and expressed. A method comprising the steps of: (1) It specifically binds to a substance related to the weed controlling action of the weed controlling agent. (2) The protein has substantially no ability to alter the substance to which it specifically binds. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項２】遺伝子が、植物細胞で機能可能なプロモー
ターおよび植物細胞で機能可能なターミネーターと機能
可能な形で結合されてなる遺伝子である請求項１記載の
方法。2. The method according to claim 1, wherein the gene is a gene operably linked to a promoter operable in plant cells and a terminator operable in plant cells. 【請求項３】タンパク質が、雑草防除剤に有効成分とし
て含まれる物質に特異的に結合する性質を有するタンパ
ク質である請求項１または２記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the protein is a protein having a property of specifically binding to a substance contained as an active ingredient in a weed controlling agent. 【請求項４】タンパク質が、植物細胞内で雑草防除剤の
雑草防除活性発現に関わる植物細胞内因性物質に特異的
に結合する性質を有するタンパク質である請求項１また
は２記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the protein has a property of specifically binding to a plant cell endogenous substance involved in the expression of the weed controlling activity of the weed controlling agent in the plant cell. 【請求項５】雑草防除剤が、植物のポルフィリン生合成
を阻害もしくは抑制する雑草防除剤である請求項１〜４
記載の方法。5. The weed controlling agent according to claim 1, which is a weed controlling agent that inhibits or suppresses porphyrin biosynthesis in plants.
The described method. 【請求項６】雑草防除剤が、プロトポルフィリノーゲン
IXオキシダーゼ阻害型除草剤である請求項１〜５記載の
方法。6. The method for controlling weeds according to claim 6, wherein the weed control agent is protoporphyrinogen.
The method according to claims 1 to 5, which is an IX oxidase-inhibiting herbicide. 【請求項７】雑草防除剤が、下記(1)〜(3)のいずれかの
化合物群の中から選ばれる化合物を有効成分とするプロ
トポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤であ
る請求項1〜6記載の方法。 （１）クロルメトキシニル、ビフェノックス、クロルニ
トロフェン(CNP)、アシフルオルフェン〔5-[2-クロロ-4
-(トリフルオロメチル)フェノキシ]-2-ニトロ安息香
酸〕およびそのエチルエステル、アシフルオルフェン-
ソディウム、オキシフルオルフェン〔2-クロロ-1-(3-エ
トキシ-4-ニトロフェノキシ)-4-トリフルオロメチルベ
ンゼン〕、オキサジアゾン〔3-[2,4-ジクロロ-5-(1-メ
チルエトキシ)フェニル]-5-(1,1-ジメチルエチル)-1,3,
4-オキサジアゾール-2 (3H)-オン〕、S-23142〔2-[4-ク
ロロ-2-フルオロ-5-(プロップ-2-イニロキシ)フェニル]
-2,3,4,5,6,7-ヘキサヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジ
オン〕、クロロフタリム〔N-(4-クロロフェニル)-3,4,
5,6-テトラヒドロフタルイミド〕、 TNPP-エチル〔エチ
ル2-[1-(2,3,4-トリクロロフェニル)-4-ニトロピラゾリ
ル-5-オキシ]プロピオネート〕、LS82-556〔N3-(1-フェ
ニルエチル)-2,6-ジメチル-5-プロピオニルニコチンア
ミド〕 （２）一般式Ｉで示される化合物 Ｊ−Ｇ (一般式I) ここで、Ｇは下記のＧ−1〜9で示される基、Ｊは下記の
Ｊ−1〜30で示される基である。 ここで、式 J-5、J-6、J-12 および J-24 における破線
は、左側の環が一重結合のみを含むことまたは環内のひ
とつの結合が炭素原子間の二重結合であることを表し、
X は酸素原子または硫黄原子を表し、Y は酸素原子また
は硫黄原子を表し、R¹ は水素原子またはハロゲン原子
を表し、R² は水素原子、C₁-C₈ アルキル基、C₁-C₈ ハ
ロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、-OR²⁷ 基、-SH
基、-S(O)pR²⁷ 基、-COR²⁷ 基、-CO₂R²⁷ 基、-C(O)SR²⁷
基、-C(O)NR²⁹R³⁰ 基、-CHO 基、-CR²⁷=NOR³⁶ 基、-CH=
CR³⁷CO₂R²⁷ 基、-CH₂CHR ³⁷CO₂R²⁷ 基、-CO₂N=CR³¹R³²
基、ニトロ基、シアノ基、-NHSO₂R³³ 基、-NHSO₂NHR³³
基、-NR²⁷R³⁸ 基、-NH₂ 基、または、1つ以上の同種も
しくは異種の C1-C4アルキル基で置換されていてもよい
フェニル基を表し、p は 0、1 または 2 を表し、R³ は
C₁-C₂ アルキル基、C₁-C₂ ハロアルキル基、-OCH₃
基、-SCH₃ 基、-OCHF₂基、ハロゲン原子、シアノ基、ま
たはニトロ基を表し、R⁴ は水素原子、C₁-C₃ アルキル
基、C₁-C₃ ハロアルキル基、またはハロゲン原子を表
し、R⁵ は水素原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロゲン原
子、C₁-C₃ ハロアルキル基、シクロプロピル基、ビニル
基、C₂ アルキニル基、シアノ基、-C(O)R³⁸ 基、-CO₂R^3
8 基、-C(O)NR³⁸R³⁹ 基、-CR³⁴R³⁵CN 基、-CR³⁴R³⁵C(O)
R³⁸ 基、-CR³⁴R³⁵CO₂R³⁸基、-CR³⁴R³⁵C(O)NR³⁸R³⁹ 基、
-CHR³⁴OH 基、-CHR³⁴OC(O)R³⁸ 基、または -OCHR³⁴OC
(O)NR³⁸R³⁹ 基を表すか、あるいは、G が G-2 もしくは
G-6 の場合に R⁴とR⁵とはこれらが結合している炭素原
子とで C=O 基を表していてもよく、R⁶ は C₁-C₆ アル
キル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₂-C₆ アルコキシアル
キル基、C₃-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ アルキニ
ル基を表し、X¹ は直接結合、酸素原子、硫黄原子、-NH
基、-N(C₁-C₃ アルキル)基、-N(C₁-C₃ハロアルキル)
基、または -N(アリル)基を表し、R⁷ は水素原子、C₁-C
₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、ハロゲン原子、
-S(O)₂(C₁-C₆アルキル)基、または -C(=O)R⁴⁰ 基を表
し、R⁸ は水素原子、C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈ シクロ
アルキル基、C₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキニル
基、C₁-C₈ ハロアルキル基、C₂-C₈ アルコキシアルキル
基、C₃-C₈ アルコキシアルコキシアルキル基、C₃-C₈ ハ
ロアルキニル基、C₃-C₈ハロアルケニル基、C₁-C₈ アル
キルスルホニル基、C₁-C₈ ハロアルキルスルホニル基、
C₃-C₈ アルコキシカルボニルアルキル基、-S(O)₂NH(C₁-
C₈ アルキル)基、-C(O)R⁴¹ 基、またはフェニル環上で
R⁴² で置換されていてもよいベンジル基を表し、n およ
び m はそれぞれ独立して 0、1、2 または 3 であり、
かつ m + n が2または3を表し、Z は -CR⁹R¹⁰ 基、酸素
原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂ 基、または -N(C₁-
C ₄ アルキル)基を表し、それぞれの R⁹ は独立して水素
原子、C₁-C₃ アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C
₆ ハロアルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニルオキシ
基、または C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオキシ基を
表し、それぞれの R¹⁰ は独立して水素原子、C₁-C₃ ア
ルキル基、ヒドロキシ基、またはハロゲン原子を表し、
R¹¹ および R¹² はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲ
ン原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、また
は C₁-C₆ ハロアルキル基を表し、R¹³ は水素原子、C₁-
C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケ
ニル基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₃-C₆ ハロアルキニル基、HC(=0)基、(C₁-C₄ アル
キル)C(=O) 基、または -NH₂ 基を表し、R¹⁴ は C₁-C₆
アルキル基、C₁-C₆ アルキルチオ基、C₁-C₆ ハロアルキ
ル基、または -N(CH₃)₂ 基を表し、W は窒素原子または
-CR¹⁵ 基を表し、R¹⁵ は水素原子、C₁-C₆ アルキル
基、ハロゲン原子、または、C₁-C₆ アルキル基、1 ない
し 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基もしくは
-CF₃ 基で置換されていてもよいフェニル基を表し、そ
れぞれの Q は独立して酸素原子または硫黄原子を表
し、Q¹ は酸素原子または硫黄原子を表し、Z¹ は -CR¹⁶
R¹⁷ 基、酸素原子、硫黄原子、-S(O) 基、-S(O)₂ 基、
または -N(C₁-C₄ アルキル)基を表し、それぞれの R¹⁶
は独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、C₁
-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C₆ ハロ
アルコキシ基、C₂-C₆ アルキルカルボニルオキシ基、ま
たは C₂-C₆ ハロアルキルカルボニルオキシ基を表し、
それぞれの R¹⁷ は独立して水素原子、ヒドロキシ基、
または ハロゲン原子を表し、R¹⁸ は C₁-C₆ アルキル
基、ハロゲン原子、または C₁-C₆ ハロアルキル基を表
し、R¹⁹ および R²⁰ はそれぞれ独立して水素原子、C₁-
C₆ アルキル基、または C₁-C ₆ ハロアルキル基を表し、
Z² は酸素原子、硫黄原子、-NR⁹ 基、または -CR⁹R¹⁰
基を表し、R²¹ および R²² はそれぞれ独立して C₁-C₆
アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル
基、C₃-C₆ ハロアルケニル基、C₃-C₆ アルキニル基、ま
たはC₃-C₆ ハロアルキニル基を表し、R²³ は水素原子、
ハロゲン原子、またはシアノ基を表し、R²⁴ は C₁-C₆
アルキルスルフォニル基、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハ
ロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₁-C₆ アルコキシ基、C₁-C₆ハロアルコキシ基、ま
たはハロゲン原子を表し、R²⁵ は C₁-C₆ アルキル基、C
₁-C₆ ハロアルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、または C₃
-C₆ アルキニル基を表し、R²⁶ は C₁-C₆ アルキル基、C
₁-C₆ ハロアルキル基、または、環上で C₁-C₆ アルキル
基、1 ないし 2 個のハロゲン原子、1 ないし 2 個のニ
トロ基、C₁-C₆ アルコキシ基、および CF₃ 基からなる
グループの中から選択される置換基で置換されていても
よいフェニル基を表し、W¹ は窒素原子または CH 基を
表し、T は下記の一般式T-1、T-2、またはT-3 のいずれ
かの基を表し、 （式中、E¹、E²、E³、E⁴、E⁵、E⁶、E⁷、E⁸、E⁹、E¹⁰、E
¹¹、E¹² はそれぞれ水素原子または C₁-C₃ アルキル基
を表す。） R²⁷ は C₁-C₈ アルキル基、C₃-C₈ シクロアルキル基、C
₃-C₈ アルケニル基、C₃-C₈ アルキニル基、C₁-C₈ ハロ
アルキル基、C₂-C₈ アルコキシアルキル基、C₂-C₈アル
キルチオアルキル基、C₂-C₈ アルキルスルフィニルアル
キル基、C₂-C₈ アルキルスルフォニルアルキル基、C₁-C
₈ アルキルスルフォニル基、フェニル環上でハロゲン原
子および C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から
選択される少なくともひとつの置換基で置換されていて
もよいフェニルスルフォニル基、C₄-C₈ アルコキシアル
コキシアルキル基、C₄-C₈ シクロアルキルアルキル基、
C₆-C₈ シクロアルコキシアルキル基、C₄-C₈ アルケニル
オキシアルキル基、C₄-C₈アルキニルオキシアルキル
基、C₃-C₈ ハロアルコキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアル
ケニルオキシアルキル基、C₄-C₈ ハロアルキニルオキシ
アルキル基、C₆-C₈ シクロアルキルチオアルキル基、C₄
-C₈ アルケニルチオアルキル基、C₄-C₈ アルキニルチオ
アルキル基、環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基お
よび C₁-C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から
選択される少なくともひとつの置換基で置換されていて
もよいフェノキシ基で置換された C₁-C₄ アルキル基、
環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-C₃
ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少
なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジ
ルオキシ基で置換されたC₁-C₄ アルキル基、C₄-C₈トリ
アルキルシリルアルキル基、C₃-C₈ シアノアルキル基、
C₃-C₈ ハロシクロアルキル基、C₃-C₈ ハロアルケニル
基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル基、C₅-C₈ ハロアルコ
キシアルキニル基、C₅-C₈ アルキルチオアルケニル基、
C₃-C₈ ハロアルキニル基、C₅-C₈ アルコキシアルキニル
基、C₅-C₈ ハロアルコキシアルキニル基、C₅-C₈ アルキ
ルチオアルキニル基、C₂-C₈ アルキルカルボニル基、環
上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-C₃ ハ
ロアルキル基からなるグループの中から選択される少な
くともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル
基、-CHR³⁴COR²⁸ 基、-CHR³⁴COOR²⁸ 基、-CHR³⁴P(O)(OR
²⁸)₂ 基、-CHR³⁴P(S)(OR²⁸)₂基、-CHR³⁴C(O)NR²⁹R³⁰
基、または -CHR³⁴C(O)NH₂ 基を表し、R²⁸ は C₁-C₆ ア
ルキル基、C₂-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル基、
またはテトラヒドロフラニル基を表し、R²⁹ および R³¹
は独立して水素原子、または C₁-C₄ アルキル基を表
し、R³⁰ および R³² は独立して C₁-C₄ アルキル基、ま
たは環上でハロゲン原子、C₁-C₃ アルキル基および C₁-
C₃ ハロアルキル基からなるグループの中から選択され
る少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフ
ェニル基を表し、あるいは、R²⁹と R³⁰とで -(CH₂)₅-、
-(CH₂)₄-、または -CH₂CH₂OCH₂CH₂- を表していてもよ
く、このようにして形成されるそれぞれの環では、 C₁-
C₃ アルキル基、フェニル基およびベンジル基からなる
グループの中から選択される置換基で置換されていても
よい、あるいは、R³¹と R³²とはこれらが結合している
炭素原子とで C₃-C₈ シクロアルキル基を表していても
よく、R³³ は C₁-C₄ アルキル基、C₁-C₄ ハロアルキル
基、または C₃-C₆ アルケニル基を表し、R³⁴ および R
³⁵ は独立して水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表
し、R³⁶ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ アルケ
ニル基、または C₃-C₆ アルキニル基を表し、R³⁷ は水
素原子、C₁-C₄ アルキル基、またはハロゲン原子を表
し、R³⁸ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₃-C₆ シクロ
アルキル基、C₃-C₆ アルケニル基、C₃-C₆ アルキニル
基、C₂-C₆ アルコキシアルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル
基、環上でハロゲン原子、C₁-C₄ アルキル基および C₁-
C₄ アルコキシ基からなるグループの中から選択される
少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェ
ニル基、-CH₂CO₂(C₁-C₄ アルキル)基、または -CH(CH₃)
CO₂(C₁-C₄ アルキル)基を表し、R³⁹ は水素原子、C₁-C₂
アルキル基、または C(O)O(C₁-C₄ アルキル)基を表
し、R⁴⁰ は水素原子、C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ アルコ
キシ基、または NH(C₁-C₆ アルキル)基を表し、R⁴¹ は
C₁-C₆ アルキル基、C₁-C₆ ハロアルキル基、C₁-C₆ アル
コキシ基、NH(C₁-C₆ アルキル)基、R⁴² 基で置換されて
いてもよいフェニル基、ベンジル基、または C₂-C₈ ジ
アルキルアミノ基を表し、R⁴² は C₁-C₆ アルキル基、1
ないし 2 個のハロゲン原子、C₁-C₆ アルコキシ基、ま
たは CF₃ 基を表す。 (3)一般式IIで示される化合物およびニピラクロフェン 一般式(II) ここで、R⁴³ は C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁴⁴ は C₁-C
₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルキルチオ基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基、 C₁-C₄ハロアルキル基、 C₁-C₄ ハロアルキル
チオ基、または C₁-C₄ ハロアルコキシ基を表し、ある
いは、R⁴³ とR⁴⁴とで-(CH₂)₃- または -(CH₂)₄- を表し
ていてもよく、R⁴⁵ は水素原子またはハロゲン原子を表
し、R⁴⁶ は水素原子または C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁴⁷ は水素原子、ニトロ基、シアノ基、-COOR⁴⁹ 基、-C
(=X)NR⁵⁰R⁵¹ 基、または-C(=X²)R⁵² 基を表し、R⁴⁸ は
水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ハロゲン原子およ
び水酸基からなるグループの中から選択される少なくと
もひとつの置換基で置換されていてもよいC₁-C₄ アルキ
ル基、 C₁-C₄ アルコキシ基、環上でハロゲン原子、ニ
トロ基、シアノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコ
キシ基およびハロ-C₁-C₄ アルキル基からなるグループ
の中から選択される少なくともひとつの置換基で置換さ
れていてもよいフェニル基、ピローリル基、 C₂-C₈ ア
ルキル基、 C₃-C₈ アルケニル基、 C₃-C₈ アルキニル
基、 C₃-C₈ アルコキシ基、（該C₂-C₈ アルキル基、該
C ₃-C₈ アルケニル基、 該C₃-C₈ アルキニル基および 該
C₃-C₈ アルコキシ基には少なくともひとつ以上の酸素原
子が挿入されていてもよい）、または以下に示す基を表
し、 R⁴⁹ R⁵⁰ およびR⁵¹ は同じであっても異なってもよく、
水素原子または C₁-C₄アルキル基を表し、あるいは、R
⁵⁰ とR⁵¹とはこれらが結合する窒素原子とで5員もしく
は6員の飽和した環を形成していてもよい、R⁵² は水素
原子、 C₁-C₄ アルキル基、または少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換された C₁-C₄ アルキル基を表し、R
⁵³ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニ
ル基、 C₃-C₆ アルキニル基、フェニル基（該 C₁-C₄ ア
ルキル基、該 C₂-C₆ アルケニル基、該C₃-C₆ アルキニ
ル基、および該フェニル基はハロゲン原子で置換されて
いてもよい）、 C ₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチ
ル基、または R⁶³CO-基を表し、R⁵⁴ は水素原子、ハロ
ゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₆ アルキル基、
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₂-C₆ アルケニ
ル基、ハロゲン原子で置換されていてもよい C₃-C₆ ア
ルキニル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェ
ニル基、 C₃-C₈ シクロアルキル基、シアノメチル基、
C₁-C₄ アルコキシ C ₁-C₆ アルキル基、 ジ C₁-C₄ アル
キルアミノ C₁-C₄ アルキル基、テトラヒドロフルフリ
ルメチル基、 C₃-C₆ アルキニルオキシ C₁-C₄ アルキル
基、ベンジル基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シア
ノ基、 C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基および
ハロ C₁-C₄ アルキル基からなるグループの中から選択
される置換基で置換されていてもよいベンジル基、-C(=
X²)R⁶³基、-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁰ 基、-(CH₂)_a-O-(CH₂)_b-R
⁷⁰ 基、または-(CH₂)_a-X²-R⁷⁶基を表し、あるいは、R⁵³
とR⁵⁴とはこれらが結合している窒素原子とで、3員、5
員もしくは6員の飽和した環または5員もしくは6員の芳
香環（該飽和した環および該芳香環においては1つの炭
素原子が1つの酸素原子で置換されていてもよい）を形
成していてもよい、R⁵⁵ は水素原子、 C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、または C₃-C₆ アルキニル基
を表し、あるいはR⁵⁵ とR⁵⁶ とで-(CH₂)_e-基を形成して
いてもよい、R⁵⁶ とR⁵⁷ はそれぞれ C₁-C₄ アルキル
基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基もしく
はフェニル基（該C₁-C₄ アルキル基、 該C₂-C₆ アルケ
ニル基、該C₃-C₆ アルキニル基および該フェニル基はハ
ロゲン原子で置換されていてもよい）、 水素原子、 C₃
-C₆ シクロアルキル基、-X²R⁶⁰ 基、または-NR⁶¹R⁶²基
を表し、R⁵⁸ は水素原子、 C₁-C₆ アルキル基、 C₂-C₆
アルケニル基、 C₃-C₆ アルキニル基、 C₁-C₄ アルキル
カルボニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ アル
コキシカルボニル C₁-C₄ アルキル基、ジ C₁-C₄ アルコ
キシカルボニル C₁-C₄アルキル基、ベンジル基、 C₁-C₄
アルコキシ- C₁-C₄アルキニル基、-(CH₂)_a-R⁷⁵基、-(CH
₂)_a-X²-R⁷²基、-(CH₂)_a-X²-(CH₂)_b-R⁷²基、または-(C
H₂)_a-X²-(CH₂)_b-X ²-(CH₂)_c-R⁷²基を表し、R⁵⁹ は水素原
子、 C₁-C₄ アルキル基、 C₂-C₆ アルケニル基、 C₃-C₆
アルキニル基、シアノ C₁-C₃ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルカルボニル C₁-C₃ アルキル基、またはフェニル
基を表し、R⁶⁰ は少なくとも1つのハロゲン原子で置換
されていてもよい C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶¹ とR⁶²
は同じであっても異なってもよく、水素原子、または
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶³ は少なくとも1つ以上の
ハロゲン原子で置換されていてもよい C₁-C₄ アルキル
基、 C₁-C₄ アルコシキ C₁-C₄ アルキル基、 C₁-C₄ ア
ルキルチオ C₁-C₄ アルキル基、 C₃-C₆ シクロアルキル
基、環上でハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、 C₁-C₄
アルキル基、 C₁-C₄ アルコキシ基およびハロ C₁-C₄
アルキル基からなるグループの中から選択されるひとつ
の置換基で置換されていてもよいフェニル基、-NR⁷³R⁷⁴
基、または-(CH₂)_a-(O)_d-R⁷⁵基を表し、R⁶⁴ は C₁-C₄
アルコキシカルボニル基、またはカルボキシル基を表
し、R⁶⁵ はクロロメチル基、シアノメチル基、少なくと
も1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆ シ
クロアルキル基、または C₁-C₄ アルコキシカルボニル
C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁶ は水酸基、または-NR⁶⁷R
⁶⁸を表し、A は -NR⁶⁷R⁶⁸、または -S(O)_f-R⁶⁹基を表
し、R⁶⁷ とR⁶⁸ は同じであっても異なってもよく、水素
原子、または C₁-C₄ アルキル基を表し、R⁶⁹ は C₁-C₄
アルキル基、または C₁-C₄ ハロアルキル基を表し、R⁷⁰
は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、少なくとも1つ以
上の C₁-C₄ アルコキシ基で置換されていてもよい C₁-C
₄ アルキル基、少なくとも1つ以上の酸素原子が挿入さ
れていてもよい C₃-C₆シクロアルキル基、1もしくは2個
のメチル基で置換されていてもよい C₃-C₆シクロアルキ
ル基、フリル基、チエニル基、または -C(=O)R⁷¹基を表
し、R⁷¹ とR⁷² は同じであっても異なってもよく、 C₁-
C₄ アルキル基、または C₁-C ₄ アルコキシ基を表し、R
⁷³ とR⁷⁴ は同じであっても異なってもよく、 C₁-C₄ ア
ルキル基、またはフェニル基を表し、R⁷⁵ は少なくとも
1つ以上の酸素原子が挿入されていてもよい C₃-C₆シク
ロアルキル基、1もしくは2個のメチル基で置換されてい
てもよい C₃-C₆シクロアルキル基、フリル基、チエニル
基、または -C(=O)R⁷¹基を表し、R⁷⁶ は C₁-C₄ アルキ
ル基を表し、a、b、およびc はそれぞれ独立して1、2、
または3を表し、d は0または1を表し、e は2または3を
表し、f は1または2を表し、X² は酸素原子または硫黄
原子を表す。7. The weed controlling agent according to any one of the following (1) to (3):
A professional whose active ingredient is a compound selected from the group of compounds
Topolphyrinogen IX oxidase inhibitory herbicide
The method according to claim 1, wherein (1) Chlormethoxynil, bifenox, chlorni
Trophen (CNP), acifluorfen [5- [2-chloro-4
-(Trifluoromethyl) phenoxy] -2-nitrobenzoate
Acid] and its ethyl ester, acifluorfen
Sodium, oxyfluorfen [2-chloro-1- (3-E
(Toxi-4-nitrophenoxy) -4-trifluoromethylbe
Senzen), oxadiazone (3- [2,4-dichloro-5- (1-
Tylethoxy) phenyl] -5- (1,1-dimethylethyl) -1,3,
4-oxadiazole-2 (3H) -one], S-23142 [2- [4-
Loro-2-fluoro-5- (prop-2-iniloxy) phenyl]
-2,3,4,5,6,7-Hexahydro-1H-isoindole-1,3-di
On), chlorophthalim (N- (4-chlorophenyl) -3,4,
5,6-tetrahydrophthalimide), TNPP-ethyl (ethyl
2- [1- (2,3,4-trichlorophenyl) -4-nitropyrazoli
-5-oxy] propionate], LS82-556 [N3- (1-Fe
Nylethyl) -2,6-dimethyl-5-propionylnicotinia
Mido] (2) Compound JG represented by general formula I (general formula I) wherein G is a group represented by the following G-1 to 9;
Groups represented by J-1 to 30. Where the dashed lines in equations J-5, J-6, J-12 and J-24
Indicates that the ring on the left contains only a single bond or
Represents that one bond is a double bond between carbon atoms,
X represents an oxygen atom or a sulfur atom; Y represents an oxygen atom or
Represents a sulfur atom; R¹ Is a hydrogen atom or a halogen atom
And R^Two Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl group, C₁-C₈ C
Roalkyl group, halogen atom, hydroxyl group, -OR²⁷ Group, -SH
Group, -S (O) pR²⁷ Group, -COR²⁷ Group, -CO_TwoR²⁷ Group, -C (O) SR²⁷
Group, -C (O) NR²⁹R³⁰ Group, -CHO group, -CR²⁷= NOR³⁶ Group, -CH =
CR³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -CH_TwoCHR ³⁷CO_TwoR²⁷ Group, -CO_TwoN = CR³¹R³² 
Group, nitro group, cyano group, -NHSO_TwoR³³ Group, -NHSO_TwoNHR³³ 
Group, -NR²⁷R³⁸ Group, -NH_Two Group or one or more of the same species
Or different C1-C4 alkyl groups
Represents a phenyl group, p represents 0, 1 or 2;^Three Is
 C₁-C_Two Alkyl group, C₁-C_Two Haloalkyl group, -OCH_Three 
Group, -SCH_Three Group, -OCHF_TwoGroup, halogen atom, cyano group,
Or a nitro group, R^Four Is a hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl
Group, C₁-C_Three Shows haloalkyl group or halogen atom
Then R^Five Is a hydrogen atom, C₁-C_Three Alkyl group, halogen source
Child, C₁-C_Three Haloalkyl group, cyclopropyl group, vinyl
Group, C_Two Alkynyl group, cyano group, -C (O) R³⁸ Group, -CO_TwoR^Three
8 Group, -C (O) NR³⁸R³⁹ Group, -CR³⁴R³⁵CN group, -CR³⁴R³⁵C (O)
R³⁸ Group, -CR³⁴R³⁵CO_TwoR³⁸Group, -CR³⁴R³⁵C (O) NR³⁸R³⁹ Group,
-CHR³⁴OH group, -CHR³⁴OC (O) R³⁸ Group, or -OCHR³⁴OC
(O) NR³⁸R³⁹ Represents a group, or G is G-2 or
 R for G-6^FourAnd R^FiveIs the carbon source to which they are attached
And a child may represent a C = O group;⁶ Is C₁-C₆ Al
Kill group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Two-C₆ Alkoxyal
Kill group, C_Three-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ Alkini
X¹ Is a direct bond, an oxygen atom, a sulfur atom, -NH
Group, -N (C₁-C_Three Alkyl) group, -N (C₁-C_ThreeHaloalkyl)
Group, or -N (allyl) group, R⁷ Is a hydrogen atom, C₁-C
₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, halogen atom,
-S (O)_Two(C₁-C₆Alkyl) group, or -C (= O) R⁴⁰ Table
Then R⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ Cyclo
Alkyl group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl
Group, C₁-C₈ Haloalkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyalkyl
Group, C_Three-C₈ Alkoxyalkoxyalkyl group, C_Three-C₈ C
Loalkynyl group, C_Three-C₈Haloalkenyl group, C₁-C₈ Al
Killsulfonyl group, C₁-C₈ Haloalkylsulfonyl group,
C_Three-C₈ Alkoxycarbonylalkyl group, -S (O)_TwoNH (C₁-
C₈ Alkyl) group, -C (O) R⁴¹ Group, or on the phenyl ring
R⁴² Represents a benzyl group which may be substituted with n and n and
And m are each independently 0, 1, 2 or 3;
And m + n represents 2 or 3, and Z is -CR⁹R^Ten Group, oxygen
Atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two Group, or -N (C₁-
C _Four Alkyl) group, each R⁹ Is independently hydrogen
Atom, C₁-C_Three Alkyl group, halogen atom, hydroxy
Group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C
₆ Haloalkoxy group, C_Two-C₆ Alkylcarbonyloxy
Group or C_Two-C₆ A haloalkylcarbonyloxy group
Represent each R^Ten Is independently a hydrogen atom, C₁-C_Three A
Represents a alkyl group, a hydroxy group, or a halogen atom,
R¹¹ And R¹² Are each independently a hydrogen atom, halogen
Atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl groups, also
Is C₁-C₆ Represents a haloalkyl group, R¹³ Is a hydrogen atom, C₁-
C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Arche
Nyl group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C_Three-C₆ Haloalkynyl group, HC (= 0) group, (C₁-C_Four Al
Kill) C (= O) group, or -NH_Two Represents a group, R¹⁴ Is C₁-C₆ 
Alkyl group, C₁-C₆ Alkylthio group, C₁-C₆ Haloalk
Or -N (CH_Three)_Two W represents a nitrogen atom or
 -CR¹⁵ Represents a group, R¹⁵ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl
Group, halogen atom, or C₁-C₆ No alkyl group, 1
And two halogen atoms, C₁-C₆ An alkoxy group or
-CF_Three Represents a phenyl group which may be substituted with
Each Q independently represents an oxygen or sulfur atom
Then Q¹ Represents an oxygen atom or a sulfur atom; Z¹ Is -CR¹⁶
R¹⁷ Group, oxygen atom, sulfur atom, -S (O) group, -S (O)_Two Group,
Or -N (C₁-C_Four Alkyl) group, each R¹⁶ 
Is independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, C₁
-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C₆ Halo
Alkoxy group, C_Two-C₆ An alkylcarbonyloxy group,
Or C_Two-C₆ Represents a haloalkylcarbonyloxy group,
Each R¹⁷ Is independently a hydrogen atom, a hydroxy group,
Or represents a halogen atom, R¹⁸ Is C₁-C₆ Alkyl
Group, halogen atom, or C₁-C₆ Table showing haloalkyl groups
Then R¹⁹ And R²⁰ Are each independently a hydrogen atom, C₁-
C₆ Alkyl group, or C₁-C ₆ Represents a haloalkyl group,
Z^Two Is an oxygen atom, a sulfur atom, -NR⁹ Group, or -CR⁹R^Ten 
Represents a group, R^{twenty one} And R^{twenty two} Are each independently C₁-C₆ 
Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl
Group, C_Three-C₆ Haloalkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group
Or C_Three-C₆ Represents a haloalkynyl group, R^{twenty three} Is a hydrogen atom,
Represents a halogen atom or a cyano group, R^{twenty four} Is C₁-C₆ 
Alkylsulfonyl group, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ C
Loalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C₁-C₆ Alkoxy group, C₁-C₆Haloalkoxy groups
Or a halogen atom, R^{twenty five} Is C₁-C₆ Alkyl group, C
₁-C₆ Haloalkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, or C_Three
-C₆ Represents an alkynyl group, R²⁶ Is C₁-C₆ Alkyl group, C
₁-C₆ Haloalkyl group or C on the ring₁-C₆ Alkyl
Group, one or two halogen atoms, one or two
Toro group, C₁-C₆ Alkoxy group, and CF_Three Consisting of
Even if substituted with a substituent selected from the group
Represents a good phenyl group, W¹ Represents a nitrogen atom or a CH group
And T is any of the following general formulas T-1, T-2, or T-3
Represents a group of(Where E¹, E^Two, E^Three, E^Four, E^Five, E⁶, E⁷, E⁸, E⁹, E^Ten, E
¹¹, E¹² Is a hydrogen atom or C₁-C_Three Alkyl group
Represents ) R²⁷ Is C₁-C₈ Alkyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, C
_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl group, C₁-C₈ Halo
Alkyl group, C_Two-C₈ Alkoxyalkyl group, C_Two-C₈Al
Quilthioalkyl group, C_Two-C₈ Alkylsulfinyl al
Kill group, C_Two-C₈ Alkylsulfonylalkyl group, C₁-C
₈ Alkyl sulfonyl group, halogen source on phenyl ring
Child and C₁-C_Four From the group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one selected substituent
Phenylsulfonyl group, C_Four-C₈ Alkoxyal
Coxyalkyl group, C_Four-C₈ Cycloalkylalkyl group,
C₆-C₈ Cycloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Alkenyl
Oxyalkyl group, C_Four-C₈Alkynyloxyalkyl
Group, C_Three-C₈ Haloalkoxyalkyl group, C_Four-C₈ Haloal
Kenyloxyalkyl group, C_Four-C₈ Haloalkynyloxy
Alkyl group, C₆-C₈ Cycloalkylthioalkyl group, C_Four
-C₈ Alkenylthioalkyl group, C_Four-C₈ Alkynylthio
Alkyl group, halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group
And C₁-C_Three From the group consisting of haloalkyl groups
Substituted with at least one selected substituent
Substituted with a good phenoxy group₁-C_Four Alkyl group,
Halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-C_Three 
Selected from the group consisting of haloalkyl groups
Benzen optionally substituted with at least one substituent
C substituted with a ruoxy group₁-C_Four Alkyl group, C_Four-C₈bird
Alkylsilylalkyl group, C_Three-C₈ Cyanoalkyl group,
C_Three-C₈ Halocycloalkyl group, C_Three-C₈ Haloalkenyl
Group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Halo alco
Xylalkynyl group, C_Five-C₈ Alkylthioalkenyl group,
C_Three-C₈ Haloalkynyl group, C_Five-C₈ Alkoxyalkynyl
Group, C_Five-C₈ Haloalkoxyalkynyl group, C_Five-C₈ Archi
Luthioalkynyl group, C_Two-C₈ Alkylcarbonyl group, ring
A halogen atom, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-C_Three C
Selected from the group consisting of
Benzyl optionally substituted with at least one substituent
Group, -CHR³⁴COR²⁸ Group, -CHR³⁴COOR²⁸ Group, -CHR³⁴P (O) (OR
²⁸)_Two Group, -CHR³⁴P (S) (OR²⁸)_TwoGroup, -CHR³⁴C (O) NR²⁹R³⁰ 
Group, or -CHR³⁴C (O) NH_Two Represents a group, R²⁸ Is C₁-C₆ A
Lucyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group,
Or a tetrahydrofuranyl group, R²⁹ And R³¹
 Is independently a hydrogen atom, or C₁-C_Four Table showing alkyl groups
Then R³⁰ And R³² Is independently C₁-C_Four Alkyl group
Or a halogen atom on the ring, C₁-C_Three Alkyl group and C₁-
C_Three Selected from the group consisting of haloalkyl groups
A group optionally substituted with at least one substituent
Represents an phenyl group, or R²⁹And R³⁰And in-(CH_Two)_Five-,
-(CH_Two)_Four-Or -CH_TwoCH_TwoOCH_TwoCH_Two-May be represented
In each ring thus formed, C₁-
C_Three Consists of alkyl, phenyl and benzyl groups
Even if substituted with a substituent selected from the group
Good or R³¹And R³²And these are combined
C with carbon atoms_Three-C₈ Even if it represents a cycloalkyl group
Well, R³³ Is C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Group or C_Three-C₆ Represents an alkenyl group, R³⁴ And R
³⁵ Is independently a hydrogen atom or C₁-C_Four Table showing alkyl groups
Then R³⁶ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Arche
Nyl group, or C_Three-C₆ Represents an alkynyl group, R³⁷ Is water
Elementary atom, C₁-C_Four Displays an alkyl group or halogen atom
Then R³⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Three-C₆ Cyclo
Alkyl group, C_Three-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl
Group, C_Two-C₆ Alkoxyalkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl
Group, halogen atom on the ring, C₁-C_Four Alkyl group and C₁-
C_Four Selected from the group consisting of alkoxy groups
Fe which may be substituted with at least one substituent
Nyl group, -CH_TwoCO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, or -CH (CH_Three)
CO_Two(C₁-C_Four Alkyl) group, R³⁹ Is a hydrogen atom, C₁-C_Two
 Alkyl group or C (O) O (C₁-C_Four Alkyl) group
Then R⁴⁰ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Arco
Xyl group, or NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴¹ Is
C₁-C₆ Alkyl group, C₁-C₆ Haloalkyl group, C₁-C₆ Al
Coxy group, NH (C₁-C₆ Alkyl) group, R⁴² Substituted with a group
Optionally phenyl, benzyl, or C_Two-C₈ The
Represents an alkylamino group, R⁴² Is C₁-C₆ Alkyl group, 1
 Or two halogen atoms, C₁-C₆ An alkoxy group
Or CF_Three Represents a group. (3) a compound represented by the general formula II and nipyraclofen general formula (II)Where R⁴³ Is C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁴⁴ Is C₁-C
_Four Alkyl group, C₁-C_Four Alkylthio group, C₁-C_Four Arco
Xyl group, C₁-C_FourHaloalkyl group, C₁-C_Four Haloalkyl
Thio group, or C₁-C_Four Represents a haloalkoxy group;
Well, R⁴³ And R⁴⁴And in-(CH_Two)_Three-Or- (CH_Two)_Four-Represents
May be R⁴⁵ Represents a hydrogen atom or a halogen atom
Then R⁴⁶ Is a hydrogen atom or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁴⁷ Is hydrogen atom, nitro group, cyano group, -COOR⁴⁹ Group, -C
(= X) NR⁵⁰R⁵¹ Group, or -C (= X^Two) R⁵² Represents a group, R⁴⁸ Is
Hydrogen atom, halogen atom, cyano group, halogen atom and
At least selected from the group consisting of
May also be substituted with one substituent₁-C_Four Archi
Group, C₁-C_Four An alkoxy group, a halogen atom on the ring,
Toro, cyano, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four Arco
Xy group and halo-C₁-C_Four Group consisting of alkyl groups
Substituted with at least one substituent selected from
Optionally substituted phenyl, pyrrolyl, C_Two-C₈ A
Ruquil group, C_Three-C₈ Alkenyl group, C_Three-C₈ Alkynyl
Group, C_Three-C₈ An alkoxy group, (the C_Two-C₈ An alkyl group,
C _Three-C₈ An alkenyl group, the C_Three-C₈ An alkynyl group and
C_Three-C₈ An alkoxy group contains at least one oxygen source
Or a group shown below.
AndR⁴⁹ R⁵⁰ And R⁵¹ May be the same or different,
Hydrogen atom or C₁-C_FourRepresents an alkyl group, or R
⁵⁰ And R⁵¹Is a 5-member or a nitrogen atom to which these bind
May form a 6-membered saturated ring, R⁵² Is hydrogen
Atom, C₁-C_Four An alkyl group, or at least one or more
C substituted with a halogen atom₁-C_Four Represents an alkyl group, R
⁵³ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkene
Group, C_Three-C₆ Alkynyl group, phenyl group (C₁-C_Four A
Alkyl group, the C_Two-C₆ Alkenyl group, the C_Three-C₆ Alkini
And the phenyl group is substituted with a halogen atom.
May be present), C _Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethy
Or R⁶³Represents a CO- group, R⁵⁴ Is a hydrogen atom, halo
C optionally substituted with a gen atom₁-C₆ Alkyl group,
C optionally substituted with a halogen atom_Two-C₆ Alkene
Group optionally substituted with a halogen group or a halogen atom_Three-C₆ A
Alkynyl group,
Nyl group, C_Three-C₈ Cycloalkyl group, cyanomethyl group,
C₁-C_Four Alkoxy C ₁-C₆ Alkyl group, di C₁-C_Four Al
Killamino C₁-C_Four Alkyl group, tetrahydrofurfury
Methyl group, C_Three-C₆ Alkynyloxy C₁-C_Four Alkyl
Group, benzyl group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano
No group, C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four An alkoxy group and
Halo C₁-C_Four Select from groups consisting of alkyl groups
Benzyl group which may be substituted with a substituent represented by -C (=
X^Two) R⁶³Group,-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁰ Group,-(CH_Two)_a-O- (CH_Two)_b-R
⁷⁰ Group, or-(CH_Two)_a-X^Two-R⁷⁶Represents a group, or R⁵³
 And R⁵⁴Is the nitrogen atom to which they are attached, 3 members, 5 members
6 or 6 membered saturated ring or 5 or 6 membered ring
Aromatic ring (in the saturated ring and the aromatic ring, one charcoal
Element atom may be replaced by one oxygen atom)
May be formed, R⁵⁵ Is a hydrogen atom, C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, or C_Three-C₆ Alkynyl group
Or R⁵⁵ And R⁵⁶ And in-(CH_Two)_e-Form a group
May be, R⁵⁶ And R⁵⁷ Is C₁-C_Four Alkyl
Group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group or
Is a phenyl group (the C₁-C_Four An alkyl group, the C_Two-C₆ Arche
Nyl group, the C_Three-C₆ An alkynyl group and the phenyl group are
Hydrogen atom, C_Three
-C₆ Cycloalkyl group, -X^TwoR⁶⁰ Group, or -NR⁶¹R⁶²Base
And R⁵⁸ Is a hydrogen atom, C₁-C₆ Alkyl group, C_Two-C₆ 
Alkenyl group, C_Three-C₆ Alkynyl group, C₁-C_Four Alkyl
Carbonyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four Al
Coxycarbonyl C₁-C_Four Alkyl group, di C₁-C_Four Arco
Xycarbonyl C₁-C_FourAlkyl group, benzyl group, C₁-C_Four
Alkoxy-C₁-C_FourAlkynyl group,-(CH_Two)_a-R⁷⁵Group,-(CH
_Two)_a-X^Two-R⁷²Group,-(CH_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-R⁷²Group, or-(C
H_Two)_a-X^Two-(CH_Two)_b-X ^Two-(CH_Two)_c-R⁷²Represents a group, R⁵⁹ Is hydrogen field
Child, C₁-C_Four Alkyl group, C_Two-C₆ Alkenyl group, C_Three-C₆
 Alkynyl group, cyano C₁-C_Three Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucylcarbonyl C₁-C_Three Alkyl group or phenyl
Represents a group, R⁶⁰ Is replaced by at least one halogen atom
May be C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶¹ And R⁶²
 May be the same or different and represent a hydrogen atom, or
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶³ Is at least one
C optionally substituted with a halogen atom₁-C_Four Alkyl
Group, C₁-C_Four Alkoshki C₁-C_Four Alkyl group, C₁-C_Four A
Lucircio C₁-C_Four Alkyl group, C_Three-C₆ Cycloalkyl
Group, halogen atom on the ring, nitro group, cyano group, C₁-C_Four
 Alkyl group, C₁-C_Four Alkoxy group and halo C₁-C_Four 
One selected from the group consisting of alkyl groups
A phenyl group optionally substituted with a substituent of -NR⁷³R⁷⁴
Group, or-(CH_Two)_a-(O)_d-R⁷⁵Represents a group, R⁶⁴ Is C₁-C_Four
Displays an alkoxycarbonyl group or carboxyl group
Then R⁶⁵ Is a chloromethyl group, a cyanomethyl group, at least
May also have one or more oxygen atoms inserted C_Three-C₆ Shi
Chloroalkyl group, or C₁-C_Four Alkoxycarbonyl
C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁶ Is a hydroxyl group, or -NR⁶⁷R
⁶⁸And A is -NR⁶⁷R⁶⁸, Or -S (O)_f-R⁶⁹Table
Then R⁶⁷ And R⁶⁸ May be the same or different, and hydrogen
Atom, or C₁-C_Four Represents an alkyl group, R⁶⁹ Is C₁-C_Four 
Alkyl group, or C₁-C_Four Represents a haloalkyl group, R⁷⁰
 Is a hydrogen atom, hydroxyl group, halogen atom, at least one
C on₁-C_Four C optionally substituted with an alkoxy group₁-C
_Four Alkyl group, at least one oxygen atom is inserted
May be C_Three-C₆1 or 2 cycloalkyl groups
C optionally substituted with a methyl group_Three-C₆Cycloalkyl
Group, furyl group, thienyl group, or -C (= O) R⁷¹Table
Then R⁷¹ And R⁷² May be the same or different and C₁-
C_Four Alkyl group, or C₁-C _Four Represents an alkoxy group, R
⁷³ And R⁷⁴ May be the same or different and C₁-C_Four A
Represents a alkyl group or a phenyl group;⁷⁵ Is at least
One or more oxygen atoms may be inserted C_Three-C₆Shiku
Substituted with 1 or 2 methyl groups
May be C_Three-C₆Cycloalkyl group, furyl group, thienyl
Group, or -C (= O) R⁷¹Represents a group, R⁷⁶ Is C₁-C_Four Archi
A, b, and c are each independently 1, 2,
Or 3; d represents 0 or 1; e represents 2 or 3
Represents, f represents 1 or 2, X^Two Is an oxygen atom or sulfur
Represents an atom. 【請求項８】タンパク質がプロトポルフィリンIXに特異
的に結合する性質を有するタンパク質である請求項１、
２、４、５、６または７記載の方法。8. The protein according to claim 1, wherein the protein has a property of specifically binding to protoporphyrin IX.
The method according to 2, 4, 5, 6 or 7. 【請求項９】タンパク質が、マグネシウムケラターゼの
プロトポルフィリンIX結合サブユニットタンパク質であ
るか、または該タンパク質の改変タンパク質であってプ
ロトポルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタ
ンパク質である請求項１、２、４、５、６、７または８
記載の方法。9. The protein according to claim 1, wherein the protein is a protoporphyrin IX binding subunit protein of magnesium keratase, or a modified protein of said protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 2,4,5,6,7 or 8
The described method. 【請求項１０】タンパク質が、光合成微生物由来のマグ
ネシウムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユ
ニットタンパク質であるか、または該タンパク質の改変
タンパク質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結
合する性質を有するタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７、８または９記載の方法。10. The protein is a protoporphyrin IX-binding subunit protein of magnesium keratase derived from a photosynthetic microorganism, or a modified protein of the protein having a property of specifically binding to protoporphyrin IX. Certain claims 1, 2,
The method according to 4, 5, 6, 7, 8 or 9. 【請求項１１】タンパク質が、植物由来のマグネシウム
ケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニットタ
ンパク質であるか、または該タンパク質の改変タンパク
質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結合する性
質を有するタンパク質である請求項１、２、４、５、
６、７、８または９記載の方法。11. The protein is a protoporphyrin IX-binding subunit protein of magnesium keratase derived from a plant, or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. Claims 1, 2, 4, 5,
The method according to 6, 7, 8 or 9. 【請求項１２】タンパク質が、タバコ由来のマグネシウ
ムケラターゼのプロトポルフィリンIX結合サブユニット
タンパク質であるか、または該タンパク質の改変タンパ
ク質であってプロトポルフィリンIXに特異的に結合する
性質を有するタンパク質である請求項１、２、４、５、
６、７、８、９または１１記載の方法。12. The protein is a protoporphyrin IX binding subunit protein of tobacco-derived magnesium keratase, or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. Claims 1, 2, 4, 5,
The method according to 6, 7, 8, 9 or 11. 【請求項１３】タンパク質が、配列番号５１で示される
アミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７または８記載の方法。13. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
The method according to 4, 5, 6, 7 or 8. 【請求項１４】タンパク質が、配列番号５２で示される
アミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７、８または１３記載の方法。14. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52.
The method according to 4, 5, 6, 7, 8 or 13. 【請求項１５】タンパク質が、配列番号５３で示される
アミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７または８記載の方法。15. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53.
The method according to 4, 5, 6, 7 or 8. 【請求項１６】タンパク質が、配列番号５４で示される
アミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７、８または１５記載の方法。16. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54.
The method according to 4, 5, 6, 7, 8 or 15. 【請求項１７】タンパク質が、配列番号５５で示される
アミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７または８記載の方法。17. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55.
The method according to 4, 5, 6, 7 or 8. 【請求項１８】タンパク質が、配列番号５６で示される
アミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７、８または１７記載の方法。18. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56.
The method according to 4, 5, 6, 7, 8 or 17. 【請求項１９】タンパク質が、配列番号５７で示される
アミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７または８記載の方法。19. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 57.
The method according to 4, 5, 6, 7 or 8. 【請求項２０】タンパク質が、配列番号５８で示される
アミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１、２、
４、５、６、７、８または１９記載の方法。20. The protein according to claim 1, wherein the protein comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58.
The method according to 4, 5, 6, 7, 8 or 19. 【請求項２１】タンパク質が、４個以上１００個以下の
アミノ酸からなるタンパク質である請求項１、２、４、
５、６、７、８、１３，１４，１５，１６，１７，１
８，１９または２０記載の方法。21. The protein according to claim 1, wherein the protein is a protein consisting of 4 to 100 amino acids.
5, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 1
The method according to 8, 19 or 20. 【請求項２２】タンパク質がプロトポルフィリノーゲン
IXに特異的に結合する性質を有するタンパク質である請
求項１、２、４、５、６または７記載の方法。(22) the protein is protoporphyrinogen;
The method according to claim 1, 2, 4, 5, 6, or 7, which is a protein having a property of specifically binding to IX. 【請求項２３】タンパク質が、プロトポルフィリノーゲ
ンIXオキシダーゼの改変タンパク質であって、プロトポ
ルフィリノーゲンIXに対する酸化能を持たず、プロトポ
ルフィリノーゲンIXに特異的に結合する性質を有するタ
ンパク質である請求項１、２、４、５、６、７または２
２記載の方法。23. The protein is a modified protein of protoporphyrinogen IX oxidase, which has no ability to oxidize protoporphyrinogen IX and has a property of specifically binding to protoporphyrinogen IX. Claim 1, 2, 4, 5, 6, 7 or 2
2. The method according to 2. 【請求項２４】タンパク質が、プロトポルフィリノーゲ
ンIXオキシダーゼの改変タンパク質であって、プロトポ
ルフィリノーゲンIXに対する酸化能を持たず、プロトポ
ルフィリノーゲンIXオキシダーゼ阻害型除草剤に有効成
分として含まれる物質に特異的に結合する性質を有する
タンパク質である請求項１、２、３、５、６、７または
２２記載の方法。24. A protein which is a modified protein of protoporphyrinogen IX oxidase, does not have an ability to oxidize protoporphyrinogen IX, and is contained as an active ingredient in a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide. 23. The method according to claim 1, 2, 3, 3, 5, 6, 7 or 22, which is a protein having a property of specifically binding to. 【請求項２５】プロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼが、植物由来のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼである請求項２３または２４記載の方法。25. The method according to claim 23, wherein the protoporphyrinogen IX oxidase is plant-derived protoporphyrinogen IX oxidase. 【請求項２６】プロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼが、ダイズ由来のプロトポルフィリノーゲンIXオキシ
ダーゼである請求項２３、２４または２５記載の方法。26. The method according to claim 23, 24 or 25, wherein the protoporphyrinogen IX oxidase is soybean-derived protoporphyrinogen IX oxidase. 【請求項２７】プロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼが、藻類由来のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダ
ーゼである請求項２３または２４記載の方法。27. The method according to claim 23, wherein the protoporphyrinogen IX oxidase is algae-derived protoporphyrinogen IX oxidase. 【請求項２８】プロトポルフィリノーゲンIXオキシダー
ゼが、コナミドリムシ由来のプロトポルフィリノーゲン
IXオキシダーゼである請求項２３、２４または２７記載
の方法。(28) the protoporphyrinogen IX oxidase is a protoporphyrinogen derived from Paramecium bursaria
28. The method according to claim 23, 24 or 27, which is IX oxidase. 【請求項２９】タンパク質が、コプロポルフィリノーゲ
ンIIIオキシダーゼの改変タンパク質であって、プロト
ポルフィリノーゲンIXおよびコプロポルフィリノーゲン
IIIに対する酸化能を持たず、プロトポルフィリノーゲ
ンIXに特異的に結合する性質を有するタンパク質である
請求項１、２、４、５、６、７または２２記載の方法。29. The modified protein of coproporphyrinogen III oxidase, wherein the protein is protoporphyrinogen IX and coproporphyrinogen.
23. The method according to claim 1, 2, 4, 5, 6, 7, or 22, which is a protein having no ability to oxidize III and having a property of specifically binding to protoporphyrinogen IX. 【請求項３０】雑草防除剤に対する耐性を植物に付与す
る方法であって、下記(1)、(2)および(3)の性質を有す
るタンパク質をコードする遺伝子を植物の細胞に導入し
発現させる工程を含むことを特徴とする方法。 (1)プロトポルフィリンIXに特異的に結合する。 (2)プロトポルフィリノーゲンIXに対する変性能を持た
ない。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。30. A method for imparting resistance to a weed control agent to a plant, comprising introducing a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) into a plant cell and expressing the gene: A method comprising the steps of: (1) It specifically binds to protoporphyrin IX. (2) It does not have the ability to transform protoporphyrinogen IX. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項３１】遺伝子が、植物細胞で機能可能なプロモ
ーターおよび植物細胞で機能可能なターミネーターと機
能可能な形で結合されてなる遺伝子である請求項３０記
載の方法。31. The method according to claim 30, wherein the gene is a gene operably linked to a promoter operable in plant cells and a terminator operable in plant cells. 【請求項３２】雑草防除剤が、植物のポルフィリン生合
成を阻害もしくは抑制する雑草防除剤である請求項３０
または３１記載の方法。32. The weed controlling agent which is a weed controlling agent which inhibits or suppresses porphyrin biosynthesis in plants.
Or the method of 31. 【請求項３３】雑草防除剤が、プロトポルフィリノーゲ
ンIXオキシダーゼ阻害型除草剤である請求項３０〜３２
記載の方法。33. The weed control agent is a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide.
The described method. 【請求項３４】タンパク質がマグネシウムケラターゼで
あるか、または該タンパク質の改変タンパク質であって
プロトポルフィリンIXに特異的に結合する性質を有する
タンパク質である請求項３０〜３３記載の方法。34. The method according to any one of claims 30 to 33, wherein the protein is magnesium keratase, or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 【請求項３５】タンパク質がフェロケラターゼである
か、または該タンパク質の改変タンパク質であってプロ
トポルフィリンIXに特異的に結合する性質を有するタン
パク質である請求項３０〜３３記載の方法。35. The method according to any one of claims 30 to 33, wherein the protein is ferrochelatase, or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrin IX. 【請求項３６】タンパク質が植物由来のフェロケラター
ゼである請求項３０、３１、３２、３３または３５記載
の方法。36. The method according to claim 30, 31, 32, 33 or 35, wherein the protein is a plant-derived ferrochelatase. 【請求項３７】タンパク質がオオムギ由来のフェロケラ
ターゼである請求項３０、３１、３２、３３、３５また
は３６記載の方法。37. The method according to claim 30, 31, 32, 33, 35 or 36, wherein the protein is ferrochelatase derived from barley. 【請求項３８】タンパク質がキュウリ由来のフェロケラ
ターゼである請求項３０、３１、３２、３３、３５また
は３６記載の方法。38. The method according to claim 30, 31, 32, 33, 35 or 36, wherein the protein is cucumber-derived ferrochelatase. 【請求項３９】タンパク質が４以上１００以下のアミノ
酸からなるタンパク質である請求項３０〜３３記載の方
法。39. The method according to claim 30, wherein the protein is a protein consisting of 4 to 100 amino acids. 【請求項４０】雑草防除剤に対する耐性を植物に付与す
る方法であって、下記(1)、(2)および(3)の性質を有す
るタンパク質をコードする遺伝子を植物の細胞に導入し
発現させる工程を含むことを特徴とする方法。 (1)プロトポルフィリノーゲンIXに特異的に結合する。 (2)コプロポルフィリノーゲンIIIに対する変性能を持
つ。 (3)免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域を
実質的に含まない。40. A method for imparting resistance to a weed control agent to a plant, comprising introducing a gene encoding a protein having the following properties (1), (2) and (3) into a plant cell and expressing the gene: A method comprising the steps of: (1) It specifically binds to protoporphyrinogen IX. (2) It has the ability to transform coproporphyrinogen III. (3) It does not substantially contain a framework region of an immunoglobulin variable region. 【請求項４１】遺伝子が、植物細胞で機能可能なプロモ
ーターおよび植物細胞で機能可能なターミネーターと機
能可能な形で結合されてなる遺伝子である請求項４０記
載の方法。41. The method according to claim 40, wherein the gene is a gene operably linked to a promoter operable in plant cells and a terminator operable in plant cells. 【請求項４２】雑草防除剤が、植物のポルフィリン生合
成を阻害もしくは抑制する雑草防除剤である請求項４０
または４１記載の方法。42. The weed controlling agent which is a weed controlling agent which inhibits or suppresses porphyrin biosynthesis in plants.
Or the method of 41. 【請求項４３】雑草防除剤が、プロトポルフィリノーゲ
ンIXオキシダーゼ阻害型除草剤である請求項４０〜４２
記載の方法。43. The weed control agent is a protoporphyrinogen IX oxidase-inhibiting herbicide.
The described method. 【請求項４４】タンパク質がコプロポルフィリノーゲン
IIIオキシダーゼであるか、または該タンパク質の改変
タンパク質であってプロトポルフィリノーゲンIXに特異
的に結合する性質を有するタンパク質である請求項４０
〜４３記載の方法。(44) the protein is coproporphyrinogen;
41. A protein which is III oxidase or a modified protein of the protein, which has a property of specifically binding to protoporphyrinogen IX.
-43. 【請求項４５】タンパク質が微生物由来のコプロポルフ
ィリノーゲンIIIオキシダーゼである請求項４０〜４４
記載の方法。(45) the protein is coproporphyrinogen III oxidase derived from a microorganism;
The described method. 【請求項４６】タンパク質が大腸菌由来のコプロポルフ
ィリノーゲンIIIオキシダーゼである請求項４０〜４５
記載の方法。46. The protein according to claim 40, wherein the protein is coproporphyrinogen III oxidase derived from Escherichia coli.
The described method. 【請求項４７】請求項１〜３９記載の方法により雑草防
除剤耐性を付与された植物。47. A plant which has been rendered tolerant to a weed control agent according to the method of any one of claims 1 to 39. 【請求項４８】請求項４０〜４６記載の方法により雑草
防除剤耐性を付与された植物。48. A plant to which weed control agent resistance has been imparted by the method according to claim 40. 【請求項４９】請求項４７記載の植物を増殖させること
を特徴とする雑草防除剤耐性植物の製造方法。49. A method for producing a plant resistant to a weed controlling agent, which comprises growing the plant according to claim 47. 【請求項５０】請求項４８記載の植物を増殖させること
を特徴とする雑草防除剤耐性植物の製造方法。50. A method for producing a weed-controlling agent-resistant plant, comprising growing the plant according to claim 48. 【請求項５１】請求項４７記載の植物の栽培域に雑草防
除剤を散布する雑草防除方法。51. A method for controlling weeds, which comprises spraying a weed controlling agent on a plant cultivation area according to claim 47. 【請求項５２】請求項４８記載の植物の栽培域に雑草防
除剤を散布する雑草防除方法。52. A method for controlling weeds, which comprises spraying a weed controlling agent on the plant cultivation area according to claim 48. 【請求項５３】請求項４７記載の植物の栽培域に雑草防
除剤を散布する雑草防除剤耐性植物の選抜方法。53. A method for selecting a weed-controlling agent-resistant plant, which comprises spraying the weed controlling agent on the cultivation area of the plant according to claim 47. 【請求項５４】請求項４８記載の植物の栽培域に雑草防
除剤を散布する雑草防除剤耐性植物の選抜方法。54. A method for selecting a weed controlling agent-resistant plant, which comprises spraying the weed controlling agent on the cultivation area of the plant according to claim 48. 【請求項５５】請求項４７記載の植物の細胞の培養域に
雑草防除剤を添加する雑草防除剤耐性植物細胞の選抜方
法。55. A method for selecting a plant cell resistant to a weed controlling agent, which comprises adding a weed controlling agent to the culture area of the plant cell according to claim 47. 【請求項５６】請求項４８記載の植物の細胞の培養域に
雑草防除剤を添加する雑草防除剤耐性植物細胞の選抜方
法。56. A method for selecting a plant cell resistant to a weed controlling agent, comprising adding a weed controlling agent to the culture area of the plant cell according to claim 48.