JP2000270882A - 新規微生物およびそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 - Google Patents
新規微生物およびそれを用いるｌ−アミノ酸の製法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 高いフェニルアラニン・トランスアミナー
ゼ活性を有する、新規組換え微生物を提供する。また該
微生物を用いた工業的有利なＬ-アミノ酸の製法を提供
する。さらに、これらを利用したＮ−置換アミノ酸誘導
体および２−オキソイミダゾリジン誘導体の製法を提供
する。 【解決手段】 宿主微生物中で機能するプロモータの下
流に、パラコッカス属に属する微生物由来のフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込
まれた組換えプラスミドを、エシェリシア・コリである
宿主微生物中に含有せしめた組換え微生物であって、該
プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの
翻訳開始コドンとの間の塩基配列が配列番号５に示され
た配列である、組換え微生物。該微生物を利用したＬ−
アミノ酸の製法。また、Ｎ−置換アミノ酸誘導体および
２−オキソイミダゾリジン誘導体の製法。
ゼ活性を有する、新規組換え微生物を提供する。また該
微生物を用いた工業的有利なＬ-アミノ酸の製法を提供
する。さらに、これらを利用したＮ−置換アミノ酸誘導
体および２−オキソイミダゾリジン誘導体の製法を提供
する。 【解決手段】 宿主微生物中で機能するプロモータの下
流に、パラコッカス属に属する微生物由来のフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込
まれた組換えプラスミドを、エシェリシア・コリである
宿主微生物中に含有せしめた組換え微生物であって、該
プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの
翻訳開始コドンとの間の塩基配列が配列番号５に示され
た配列である、組換え微生物。該微生物を利用したＬ−
アミノ酸の製法。また、Ｎ−置換アミノ酸誘導体および
２−オキソイミダゾリジン誘導体の製法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フェニルアラニン
・トランスアミナーゼ生産能を有する新規組換え微生物
および該微生物を用いるＬ-アミノ酸の製法に関する。
・トランスアミナーゼ生産能を有する新規組換え微生物
および該微生物を用いるＬ-アミノ酸の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】フェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性を有するパラコッカス属等の微生物を利用して、Ｌ
−アミノ酸をオキソ酸化合物から酵素的に製造する方法
が知られていた。具体的には例えば、Ｌ−フェニルアラ
ニンをフェニルピルビン酸から製造する方法（Applied
Biochemistry and Biotechnology、第11巻、第367頁、1
985年）や医薬として有用な２−オキソイミダゾリジン
誘導体（塩酸イミダプリルなど）の製造中間体であるＬ
−２−アミノ−４−フェニル酪酸を、２−オキソ−４−
フェニル酪酸から製造する方法（特開昭６０−１５６３
９４号）が知られていた。
活性を有するパラコッカス属等の微生物を利用して、Ｌ
−アミノ酸をオキソ酸化合物から酵素的に製造する方法
が知られていた。具体的には例えば、Ｌ−フェニルアラ
ニンをフェニルピルビン酸から製造する方法（Applied
Biochemistry and Biotechnology、第11巻、第367頁、1
985年）や医薬として有用な２−オキソイミダゾリジン
誘導体（塩酸イミダプリルなど）の製造中間体であるＬ
−２−アミノ−４−フェニル酪酸を、２−オキソ−４−
フェニル酪酸から製造する方法（特開昭６０−１５６３
９４号）が知られていた。
【０００３】また、パラコッカス・デニトリフィカンス
からフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードす
る遺伝子が単離されており、これを含む組換えプラスミ
ドを宿主大腸菌に導入した組換え微生物が報告されてい
る（Oueら、J.Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997
年；Takagiら、Biotechnology and Applied Biochemist
ry、第13巻、第112-119頁、1991年；特開平１−１５３
０８４号）。前記組換え微生物は、親株であるパラコッ
カス・デニトリフィカンスよりも高いフェニルアラニン
・トランスアミナーゼ生産能を有していた。
からフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードす
る遺伝子が単離されており、これを含む組換えプラスミ
ドを宿主大腸菌に導入した組換え微生物が報告されてい
る（Oueら、J.Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997
年；Takagiら、Biotechnology and Applied Biochemist
ry、第13巻、第112-119頁、1991年；特開平１−１５３
０８４号）。前記組換え微生物は、親株であるパラコッ
カス・デニトリフィカンスよりも高いフェニルアラニン
・トランスアミナーゼ生産能を有していた。
【０００４】しかしながら、Ｌ−アミノ酸類の工業的製
造に利用するためには、さらに高いフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ生産能を有する微生物の育種が望ま
れていた。
造に利用するためには、さらに高いフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ生産能を有する微生物の育種が望ま
れていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高い
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有する、
新規組換え微生物を提供することにある。また該微生物
を用いた工業的有利なＬ-アミノ酸の製法を提供するこ
とにある。さらに、これらを利用したＮ−アルキル化ア
ミノ酸エステルおよび２−オキソイミダゾリジン誘導体
の製法を提供することにある。
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有する、
新規組換え微生物を提供することにある。また該微生物
を用いた工業的有利なＬ-アミノ酸の製法を提供するこ
とにある。さらに、これらを利用したＮ−アルキル化ア
ミノ酸エステルおよび２−オキソイミダゾリジン誘導体
の製法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
した結果、トランスアミナーゼ発現プラスミドから、パ
ラコッカス・デニトリフィカンスに由来するフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼ翻訳領域の上流域に存在し
たロダニース様蛋白質翻訳領域を除去するとともに特定
塩基配列に置きかえることにより、組換え微生物のトラ
ンスアミナーゼ生産能が顕著に高まることを見出し、本
発明を完成した。
した結果、トランスアミナーゼ発現プラスミドから、パ
ラコッカス・デニトリフィカンスに由来するフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼ翻訳領域の上流域に存在し
たロダニース様蛋白質翻訳領域を除去するとともに特定
塩基配列に置きかえることにより、組換え微生物のトラ
ンスアミナーゼ生産能が顕著に高まることを見出し、本
発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、宿主微生物中で機能
するプロモータの下流に、パラコッカス属に属する微生
物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコー
ドするＤＮＡが組込まれた組換えプラスミドを、エシェ
リシア・コリである宿主微生物中に含有せしめた組換え
微生物であって、該プロモータとフェニルアラニン・ト
ランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が
配列番号５に示された配列である、組換え微生物であ
る。
するプロモータの下流に、パラコッカス属に属する微生
物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコー
ドするＤＮＡが組込まれた組換えプラスミドを、エシェ
リシア・コリである宿主微生物中に含有せしめた組換え
微生物であって、該プロモータとフェニルアラニン・ト
ランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が
配列番号５に示された配列である、組換え微生物であ
る。
【０００８】また、前記微生物又は該微生物の処理物
を、アミノ供与体の存在下に一般式（ＩＩ）
を、アミノ供与体の存在下に一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化７】
【００１０】（但し、式中、ｎは１または２を表す。）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることを特徴とす
る、一般式（Ｉ）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることを特徴とす
る、一般式（Ｉ）
【００１１】
【化８】
【００１２】（但し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるＬ-アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニ
ル酪酸等）の製法である。
で示されるＬ-アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニ
ル酪酸等）の製法である。
【００１３】さらに、前記製法により得たＬ−２−アミ
ノ−４−フェニル酪酸から、Ｎ−置換アミノ酸誘導体、
さらに２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理
学的に許容しうる塩を製造する方法である。
ノ−４−フェニル酪酸から、Ｎ−置換アミノ酸誘導体、
さらに２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理
学的に許容しうる塩を製造する方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の微生物は、パラコッカス
属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
を発現するためのプラスミド（以下、トランスアミナー
ゼ発現プラスミドと称する）を、エシェリシア・コリの
宿主微生物中に導入することにより得られる。
属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
を発現するためのプラスミド（以下、トランスアミナー
ゼ発現プラスミドと称する）を、エシェリシア・コリの
宿主微生物中に導入することにより得られる。
【００１５】トランスアミナーゼ発現プラスミドは、フ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮ
Ａが、プロモータの下流に機能的に連結されており、フ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼが該プロモータの
調節の下に発現する。
ェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮ
Ａが、プロモータの下流に機能的に連結されており、フ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼが該プロモータの
調節の下に発現する。
【００１６】本発明の微生物の含有するトランスアミナ
ーゼ発現プラスミドは、パラコッカス属微生物由来のフ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮ
Ａがプロモータの下流に組込まれた組換えプラスミドで
あって、該プロモータとフェニルアラニン・トランスア
ミナーゼの翻訳開始コドンとの間の領域は配列番号５に
示された塩基配列を有する。
ーゼ発現プラスミドは、パラコッカス属微生物由来のフ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮ
Ａがプロモータの下流に組込まれた組換えプラスミドで
あって、該プロモータとフェニルアラニン・トランスア
ミナーゼの翻訳開始コドンとの間の領域は配列番号５に
示された塩基配列を有する。
【００１７】パラコッカス属に属する微生物は、フェニ
ルアラニン・トランスアミナーゼを産生する能力を有す
る微生物であれば限定されず、例えば、パラコッカス・
デニトリフィカンス等が挙げられる。
ルアラニン・トランスアミナーゼを産生する能力を有す
る微生物であれば限定されず、例えば、パラコッカス・
デニトリフィカンス等が挙げられる。
【００１８】フェニルアラニン・トランスアミナーゼを
コードするＤＮＡとしては、パラコッカス属微生物由来
のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の中の
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする翻
訳領域を用いることができる。
コードするＤＮＡとしては、パラコッカス属微生物由来
のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の中の
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする翻
訳領域を用いることができる。
【００１９】パラコッカス属微生物由来のフェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、例えば、文献（タ
カギら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第
13巻、第112−119頁、1991年）記載の方法と同様に、シ
ョットガンクローニングによりパラコッカス属微生物か
ら以下のようにして単離することができる。
ニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、例えば、文献（タ
カギら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第
13巻、第112−119頁、1991年）記載の方法と同様に、シ
ョットガンクローニングによりパラコッカス属微生物か
ら以下のようにして単離することができる。
【００２０】まずパラコッカス属微生物から染色体ＤＮ
Ａを調製する。これを適当な制限酵素で処理（Sau3AIに
よる部分切断等）した後、適当なベクタープラスミドの
プロモータ下流（ｐＬＧ３３９のＢａｍＨＩ切断部位、
ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト等）に連結す
る。ついで、得られた組換えプラスミドを用いて、宿主
大腸菌を形質転換する。宿主大腸菌として、例えばアス
パラギントランスアミナーゼ酸及び芳香族アミノ酸トラ
ンスアミナーゼの同時欠損変異を有し、該欠損変異に基
いてフェニルアラニン要求性を示す菌株（例えばエシェ
リシア・コリＤＧ３０株（Journal of Bacteriology、
第130巻、第441−444頁、1987年）を用いれば、目的遺
伝子を含む組換えプラスミドが導入された菌株は、Ｌ−
フェニルアラニンを含まない最小培地で、Ｌ−フェニル
アラニン要求性が相補された菌株として容易に選択でき
る。
Ａを調製する。これを適当な制限酵素で処理（Sau3AIに
よる部分切断等）した後、適当なベクタープラスミドの
プロモータ下流（ｐＬＧ３３９のＢａｍＨＩ切断部位、
ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト等）に連結す
る。ついで、得られた組換えプラスミドを用いて、宿主
大腸菌を形質転換する。宿主大腸菌として、例えばアス
パラギントランスアミナーゼ酸及び芳香族アミノ酸トラ
ンスアミナーゼの同時欠損変異を有し、該欠損変異に基
いてフェニルアラニン要求性を示す菌株（例えばエシェ
リシア・コリＤＧ３０株（Journal of Bacteriology、
第130巻、第441−444頁、1987年）を用いれば、目的遺
伝子を含む組換えプラスミドが導入された菌株は、Ｌ−
フェニルアラニンを含まない最小培地で、Ｌ−フェニル
アラニン要求性が相補された菌株として容易に選択でき
る。
【００２１】選択された形質転換株を培養し、得られた
菌体を用いて、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性を測定することにより、組換えプラスミド上に目的
遺伝子が含まれていることを確認することができる。
菌体を用いて、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性を測定することにより、組換えプラスミド上に目的
遺伝子が含まれていることを確認することができる。
【００２２】パラコッカス属微生物由来のフェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、上記のような方法
により単離できるほか、既知の塩基配列情報を利用し
て、取得することもできる。
ニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、上記のような方法
により単離できるほか、既知の塩基配列情報を利用し
て、取得することもできる。
【００２３】例えば、オウエらの文献（J.Biochem.、第
121巻、第161−171頁、1997年）及び後記配列表の配列
番号１には、パラコッカス・デニトリフィカンス（パラ
コッカス・デニトリフィカンス ＩＦＯ１２４４２）か
ら単離したフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝
子を含む染色体断片の塩基配列が開示され、同文献及び
後記配列表の配列番号２には、当該フェニルアラニン・
トランスアミナーゼのアミノ酸配列が開示されている。
121巻、第161−171頁、1997年）及び後記配列表の配列
番号１には、パラコッカス・デニトリフィカンス（パラ
コッカス・デニトリフィカンス ＩＦＯ１２４４２）か
ら単離したフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝
子を含む染色体断片の塩基配列が開示され、同文献及び
後記配列表の配列番号２には、当該フェニルアラニン・
トランスアミナーゼのアミノ酸配列が開示されている。
【００２４】開示された塩基配列の情報をもとにプライ
マーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（Poly
merase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼ
ーション法などを適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリ
ーから、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン
・トランスアミナーゼ遺伝子を取得できる。
マーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（Poly
merase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼ
ーション法などを適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリ
ーから、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン
・トランスアミナーゼ遺伝子を取得できる。
【００２５】ＤＮＡライブラリーは、パラコッカス属微
生物の染色体ＤＮＡを用い、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.
F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laborat
ory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により
調製できる。
生物の染色体ＤＮＡを用い、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.
F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laborat
ory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により
調製できる。
【００２６】かくして単離されたパラコッカス属微生物
由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の
塩基配列を決定し、翻訳領域を同定できる。この翻訳領
域を含むＤＮＡ断片を切り出して、フェニルアラニン・
トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとして用いるこ
とができる。
由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の
塩基配列を決定し、翻訳領域を同定できる。この翻訳領
域を含むＤＮＡ断片を切り出して、フェニルアラニン・
トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとして用いるこ
とができる。
【００２７】フェニルアラニン・トランスアミナーゼを
コードするＤＮＡとしては、具体的には、例えば配列番
号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基からなる塩基配
列を含むＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。
コードするＤＮＡとしては、具体的には、例えば配列番
号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基からなる塩基配
列を含むＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】このほか、配列番号１の第１０２４〜２２
０５番目の塩基で示される塩基配列を有するＤＮＡと、
ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション
（すなわち６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイ
ブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件
下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×Ｓ
ＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて
予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩
濃度の溶液中で洗浄を行うこと）によりハイブリダイズ
し得るＤＮＡであって、フェニルアラニントランスアミ
ナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げら
れる。
０５番目の塩基で示される塩基配列を有するＤＮＡと、
ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション
（すなわち６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイ
ブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件
下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×Ｓ
ＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて
予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩
濃度の溶液中で洗浄を行うこと）によりハイブリダイズ
し得るＤＮＡであって、フェニルアラニントランスアミ
ナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げら
れる。
【００２９】フェニルアラニン・トランスアミナーゼを
コードするＤＮＡは、自然界に存在するフェニルアラニ
ン・トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を用いること
もできるが、その一部の塩基配列を改変したものであっ
てもよい。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々
１〜６種類知られており、塩基配列を改変する際は、通
常、コードするアミノ酸配列に変更が生じないように設
計される。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、化学合成
したＤＮＡの連結、ＤＮＡの断片化と結合、部位特異的
変異導入法（site specific mutagenesis）（Proceedin
gs of NationalAcademy of Sciences、第81巻、第5662
〜5666頁、1984年）等を組み合わせることによって取得
できる。
コードするＤＮＡは、自然界に存在するフェニルアラニ
ン・トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を用いること
もできるが、その一部の塩基配列を改変したものであっ
てもよい。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々
１〜６種類知られており、塩基配列を改変する際は、通
常、コードするアミノ酸配列に変更が生じないように設
計される。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、化学合成
したＤＮＡの連結、ＤＮＡの断片化と結合、部位特異的
変異導入法（site specific mutagenesis）（Proceedin
gs of NationalAcademy of Sciences、第81巻、第5662
〜5666頁、1984年）等を組み合わせることによって取得
できる。
【００３０】フェニルアラニン・トランスアミナーゼを
コードするＤＮＡを、適当なベクタープラスミド中のプ
ロモータ下流に連結することにより、トランスアミナー
ゼ発現プラスミドを得ることができる。この際、該プロ
モータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳
開始コドンとの間の塩基配列が、特定の配列、すなわち
後記配列表の配列番号５に示された配列となるようにす
ればよい。
コードするＤＮＡを、適当なベクタープラスミド中のプ
ロモータ下流に連結することにより、トランスアミナー
ゼ発現プラスミドを得ることができる。この際、該プロ
モータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳
開始コドンとの間の塩基配列が、特定の配列、すなわち
後記配列表の配列番号５に示された配列となるようにす
ればよい。
【００３１】プロモータとフェニルアラニン・トランス
アミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列は、フェ
ニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡ
の制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化、断片化したＤ
ＮＡの結合、化学合成したリンカーＤＮＡの連結、部位
特異的変異導入法、ＰＣＲ法等を適宜組合わせることに
よって、後記配列表の配列番号５に示された塩基配列と
なるように構築することができる。
アミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列は、フェ
ニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡ
の制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化、断片化したＤ
ＮＡの結合、化学合成したリンカーＤＮＡの連結、部位
特異的変異導入法、ＰＣＲ法等を適宜組合わせることに
よって、後記配列表の配列番号５に示された塩基配列と
なるように構築することができる。
【００３２】プロモータは、宿主微生物である大腸菌
（エシェリシア・コリ）中で機能し得るプロモータであ
ればよく、特に限定されない。このようなプロモーター
としては、例えばｌａｃプロモーター（大腸菌ラクトー
スオペロンのプロモーター）が挙げられる。ｌａｃプロ
モーターの塩基配列を後記配列表の配列番号３に示し
た。
（エシェリシア・コリ）中で機能し得るプロモータであ
ればよく、特に限定されない。このようなプロモーター
としては、例えばｌａｃプロモーター（大腸菌ラクトー
スオペロンのプロモーター）が挙げられる。ｌａｃプロ
モーターの塩基配列を後記配列表の配列番号３に示し
た。
【００３３】ベクタープラスミドは、宿主微生物である
大腸菌（エシェリシア・コリ）中で複製可能なプラスミ
ドであれば特に限定されない。このようなベクタープラ
スミドとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
（＋）（Stratagene社製)、ｐＬＧ３３９（Gene、第１
８巻、第３３５頁、１９８２年、ATCC37131）、ｐＵＣ
１８（Gene、第３３巻、第１０３頁、１９８５年、ATCC
37253）等が挙げられる。このうち、ｐＵＣ１８がとり
わけ好ましい。
大腸菌（エシェリシア・コリ）中で複製可能なプラスミ
ドであれば特に限定されない。このようなベクタープラ
スミドとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
（＋）（Stratagene社製)、ｐＬＧ３３９（Gene、第１
８巻、第３３５頁、１９８２年、ATCC37131）、ｐＵＣ
１８（Gene、第３３巻、第１０３頁、１９８５年、ATCC
37253）等が挙げられる。このうち、ｐＵＣ１８がとり
わけ好ましい。
【００３４】トランスアミナーゼ発現プラスミドを、通
常の形質転換法により宿主微生物となるエシェリシア・
コリに導入することにより、本発明の組換え微生物を取
得できる。このような宿主微生物は特に限定されない
が、例えば、エシェリシア・コリＤＨ５株、エシェリシ
ア・コリＪＭ１０９株、エシェリシア・コリＨＢ１０１
株（Journal of molecular biology、第４１巻、第４５
９頁、１９６９年、ATCC33694）、エシェリシア・コリ
ＪＭ１０９株（蛋白質・核酸・酵素、第２９巻、第２９
４頁、１９８１年）等が挙げられる。このうち、エシェ
リシア・コリＨＢ１０１株が好ましい。
常の形質転換法により宿主微生物となるエシェリシア・
コリに導入することにより、本発明の組換え微生物を取
得できる。このような宿主微生物は特に限定されない
が、例えば、エシェリシア・コリＤＨ５株、エシェリシ
ア・コリＪＭ１０９株、エシェリシア・コリＨＢ１０１
株（Journal of molecular biology、第４１巻、第４５
９頁、１９６９年、ATCC33694）、エシェリシア・コリ
ＪＭ１０９株（蛋白質・核酸・酵素、第２９巻、第２９
４頁、１９８１年）等が挙げられる。このうち、エシェ
リシア・コリＨＢ１０１株が好ましい。
【００３５】本発明の組換え微生物において、フェニル
アラニン・トランスアミナーゼの高発現が実現する。フ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性は、フェニル
ピルビン酸、２−オキソ−４−フェニル酪酸などを基質
とし、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などをア
ミノ供与体として含む反応溶液中、微生物菌体を酵素源
として添加し、公知の方法により測定できる。
アラニン・トランスアミナーゼの高発現が実現する。フ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性は、フェニル
ピルビン酸、２−オキソ−４−フェニル酪酸などを基質
とし、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などをア
ミノ供与体として含む反応溶液中、微生物菌体を酵素源
として添加し、公知の方法により測定できる。
【００３６】本発明の組換え微生物もしくは該微生物の
処理物を利用した酵素反応により、オキソ酸化合物（フ
ェニルピルビン酸または２−オキソ−４−フェニル酪
酸）からＬ−アミノ酸（Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ
−２−アミノ−４−フェニル酪酸）を製造することがで
きる。
処理物を利用した酵素反応により、オキソ酸化合物（フ
ェニルピルビン酸または２−オキソ−４−フェニル酪
酸）からＬ−アミノ酸（Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ
−２−アミノ−４−フェニル酪酸）を製造することがで
きる。
【００３７】すなわち、本発明の組換え微生物もしくは
該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に、一般式
（ＩＩ）
該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に、一般式
（ＩＩ）
【００３８】
【化９】
【００３９】（但し、式中、ｎは１または２を表す。）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることにより、一
般式（Ｉ）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることにより、一
般式（Ｉ）
【００４０】
【化１０】
【００４１】（但し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるＬ-アミノ酸を製造できる。
で示されるＬ-アミノ酸を製造できる。
【００４２】酵素反応に用いる微生物（生菌体、培養物
等）及びそれらの処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、培養上
清、菌体破砕物、菌体自己消化物、菌体抽出物等）は、
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するも
のであればよく、その形態は特に限定されない。
等）及びそれらの処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、培養上
清、菌体破砕物、菌体自己消化物、菌体抽出物等）は、
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するも
のであればよく、その形態は特に限定されない。
【００４３】微生物の培養は常法により行うことができ
る。例えば、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類な
どを含む通常の栄養培地のpHを5.0〜9.0に調整し、これ
に微生物を接種したのち10〜45℃、好ましくは28〜37℃
で、好気的に培養すればよい。本発明の微生物の含有す
る発現プラスミドにおいて、トランスアミナーゼがｌａ
ｃプロモータの制御下に発現するよう構築されている場
合には、培地中にラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル
−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）などの酵素誘導物
質を添加することが、トランスアミナーゼ発現を高める
ために望ましい。
る。例えば、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類な
どを含む通常の栄養培地のpHを5.0〜9.0に調整し、これ
に微生物を接種したのち10〜45℃、好ましくは28〜37℃
で、好気的に培養すればよい。本発明の微生物の含有す
る発現プラスミドにおいて、トランスアミナーゼがｌａ
ｃプロモータの制御下に発現するよう構築されている場
合には、培地中にラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル
−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）などの酵素誘導物
質を添加することが、トランスアミナーゼ発現を高める
ために望ましい。
【００４４】微生物の培養液から遠心分離またはろ過等
により生菌体を得ることができる。また、生菌体を生理
食塩水等で洗浄することにより洗浄菌体を得ることがで
き、生菌体や洗浄菌体等を凍結乾燥またはアセトン乾燥
することにより乾燥菌体を得ることができる。また、生
菌体、洗浄菌体等を種々の物理化学的方法（例えば、超
音波、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、アルミナ破
壊、溶菌酵素、界面活性剤または有機溶媒等で処理）で
処理することにより、菌体の破砕物を得ることができ、
これら菌体や細胞の破砕物からろ過または遠心分離など
により固形物を除去することによって菌体の抽出物を得
ることができる。
により生菌体を得ることができる。また、生菌体を生理
食塩水等で洗浄することにより洗浄菌体を得ることがで
き、生菌体や洗浄菌体等を凍結乾燥またはアセトン乾燥
することにより乾燥菌体を得ることができる。また、生
菌体、洗浄菌体等を種々の物理化学的方法（例えば、超
音波、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、アルミナ破
壊、溶菌酵素、界面活性剤または有機溶媒等で処理）で
処理することにより、菌体の破砕物を得ることができ、
これら菌体や細胞の破砕物からろ過または遠心分離など
により固形物を除去することによって菌体の抽出物を得
ることができる。
【００４５】基質とするオキソ酸化合物およびアミノ供
与体は、遊離の形でも塩の形でも反応系に供することが
できる。
与体は、遊離の形でも塩の形でも反応系に供することが
できる。
【００４６】アミノ供与体としては、例えばＬ−アスパ
ラギン酸、Ｌ−グルタミン酸が挙げられ、Ｌ−グルタミ
ン酸が好ましい。アミノ供与体は、オキソ酸化合物１モ
ルに対して通常１〜３モル、とりわけ１．３〜１．５モ
ル使用するのが好ましい。
ラギン酸、Ｌ−グルタミン酸が挙げられ、Ｌ−グルタミ
ン酸が好ましい。アミノ供与体は、オキソ酸化合物１モ
ルに対して通常１〜３モル、とりわけ１．３〜１．５モ
ル使用するのが好ましい。
【００４７】酵素反応は、フェニルアラニン・トランス
アミナーゼの安定性を考慮して４０℃未満で行うのが好
ましいが、とりわけ28〜37℃で実施するのが好ましく、
また、そのpHは７〜９となるよう調整するのが好まし
い。また、上記酵素反応に際しては、臭化セチルトリメ
チルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム等の界面活
性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度になるよう添加して
おくことにより酵素反応を促進させることもできる。
アミナーゼの安定性を考慮して４０℃未満で行うのが好
ましいが、とりわけ28〜37℃で実施するのが好ましく、
また、そのpHは７〜９となるよう調整するのが好まし
い。また、上記酵素反応に際しては、臭化セチルトリメ
チルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム等の界面活
性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度になるよう添加して
おくことにより酵素反応を促進させることもできる。
【００４８】本酵素反応は反応時間を適当に調整するこ
とにより反応進行率を１００％にまで高めることができ
る。反応液中に生成した目的Ｌ−アミノ酸の分離精製
は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独
で、或いは組合せて容易に行うことができる。
とにより反応進行率を１００％にまで高めることができ
る。反応液中に生成した目的Ｌ−アミノ酸の分離精製
は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独
で、或いは組合せて容易に行うことができる。
【００４９】上記のようにして得たＬ−アミノ酸（Ｌ−
２−アミノ−４−フェニル酪酸）から、既知の方法（米
国特許第４５４２２３４、同第４３４４９４９、特開昭
５９−１８１２４７、特開昭６０−１３７１５、特開昭
６３−１７４９５５および特開昭６３−１７４９５６記
載の方法等）により、Ｎ−置換アミノ酸誘導体へ導くこ
とができる。
２−アミノ−４−フェニル酪酸）から、既知の方法（米
国特許第４５４２２３４、同第４３４４９４９、特開昭
５９−１８１２４７、特開昭６０−１３７１５、特開昭
６３−１７４９５５および特開昭６３−１７４９５６記
載の方法等）により、Ｎ−置換アミノ酸誘導体へ導くこ
とができる。
【００５０】すなわち、上記のようにして得たＬ−２−
アミノ−４−フェニル酪酸をエステル化した後、α位に
脱離基を有するα−置換カルボン酸又はα−置換カルボ
ン酸エステル化合物と反応させて、一般式（ＩＩＩ）
アミノ−４−フェニル酪酸をエステル化した後、α位に
脱離基を有するα−置換カルボン酸又はα−置換カルボ
ン酸エステル化合物と反応させて、一般式（ＩＩＩ）
【００５１】
【化１１】
【００５２】（但し、式中、Ｒ1は、低級アルキル基、
アラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表
す。Ｒ2は、低級アルキル基、アラルキル基またはアリ
ール基を示す。Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基、ア
ラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表
す。）で示される化合物を得、ついでＲ3が水素原子で
ない場合には、所望により、該化合物を接触還元及び／
又は酸処理（好ましくは接触還元）することにより置換
基Ｒ3を除去することにより、Ｎ−置換アミノ酸誘導体
を得ることができる。
アラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表
す。Ｒ2は、低級アルキル基、アラルキル基またはアリ
ール基を示す。Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基、ア
ラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表
す。）で示される化合物を得、ついでＲ3が水素原子で
ない場合には、所望により、該化合物を接触還元及び／
又は酸処理（好ましくは接触還元）することにより置換
基Ｒ3を除去することにより、Ｎ−置換アミノ酸誘導体
を得ることができる。
【００５３】一般式（III）で示される化合物におい
て、Ｒ1、Ｒ2又はＲ3で示される低級アルキル基（炭素
数１〜４のアルキル基）としては、メチル基、エチル
基、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−
ブチル基、tert−ブチル基などが挙げられる。アラルキ
ル基としては、ベンジル基、α−フェネチル基、β−フ
ェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル基として
は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプ
チル基などが挙げられる。アリール基としては、無置換
フェニル基、アルキル基置換フェニル基（トリル基
等）、ハロゲン原子・ニトロ基置換フェニル基などが挙
げられる。
て、Ｒ1、Ｒ2又はＲ3で示される低級アルキル基（炭素
数１〜４のアルキル基）としては、メチル基、エチル
基、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−
ブチル基、tert−ブチル基などが挙げられる。アラルキ
ル基としては、ベンジル基、α−フェネチル基、β−フ
ェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル基として
は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプ
チル基などが挙げられる。アリール基としては、無置換
フェニル基、アルキル基置換フェニル基（トリル基
等）、ハロゲン原子・ニトロ基置換フェニル基などが挙
げられる。
【００５４】一般式（III）で示される化合物におい
て、Ｒ1がエチル基、Ｒ2がメチル基であることが好まし
い。
て、Ｒ1がエチル基、Ｒ2がメチル基であることが好まし
い。
【００５５】α−置換カルボン酸又はα−置換カルボン
酸エステル化合物がα位に有する脱離基としては、ハロ
ゲン原子（塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、ス
ルホニルオキシ基（脂肪族置換スルホニルオキシ基、芳
香族置換スルホニルオキシ基、ハロスルホニルオキシ基
等）が挙げられる。
酸エステル化合物がα位に有する脱離基としては、ハロ
ゲン原子（塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、ス
ルホニルオキシ基（脂肪族置換スルホニルオキシ基、芳
香族置換スルホニルオキシ基、ハロスルホニルオキシ基
等）が挙げられる。
【００５６】かくして、各種アンジオテンシン変換酵素
（ＡＣＥ）阻害剤の共通な合成中間体として有用なＮ−
置換アミノ酸誘導体であるＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカ
ルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンなど
を製造できる。
（ＡＣＥ）阻害剤の共通な合成中間体として有用なＮ−
置換アミノ酸誘導体であるＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカ
ルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンなど
を製造できる。
【００５７】得られたＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボ
ニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンはさら
に、特開昭６２−４８６９６記載の方法により、酸塩化
物（例えば、塩化ギ酸の反応性誘導体（ホスゲンな
ど））と反応させることによって、下式
ニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンはさら
に、特開昭６２−４８６９６記載の方法により、酸塩化
物（例えば、塩化ギ酸の反応性誘導体（ホスゲンな
ど））と反応させることによって、下式
【００５８】
【化１２】
【００５９】で示される化合物に変換することができ
る。
る。
【００６０】また、本発明の製法において得られる生成
化合物（Ｌ−アミノ酸、Ｎ−置換アミノ酸誘導体）は、
遊離の形であってもよく、或いは塩の形であってもよ
い。かかる塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸
塩、硫酸塩、リン酸塩等）および有機酸塩（コハク酸
塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩
等）が挙げられる。
化合物（Ｌ−アミノ酸、Ｎ−置換アミノ酸誘導体）は、
遊離の形であってもよく、或いは塩の形であってもよ
い。かかる塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸
塩、硫酸塩、リン酸塩等）および有機酸塩（コハク酸
塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩
等）が挙げられる。
【００６１】さらに、上記で得られたＮ−置換アミノ酸
誘導体から、既知の方法（特開昭５８−２０３９７１記
載の方法等）により、２−オキソイミダゾリジン誘導体
またはその薬理学的に許容しうる塩へ導くことができ
る。
誘導体から、既知の方法（特開昭５８−２０３９７１記
載の方法等）により、２−オキソイミダゾリジン誘導体
またはその薬理学的に許容しうる塩へ導くことができ
る。
【００６２】すなわち、上記で得られたＮ−〔（１Ｓ）
−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−
アラニンを、その活性エステル体に変換した後、一般式
（ＩＶ）
−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−
アラニンを、その活性エステル体に変換した後、一般式
（ＩＶ）
【００６３】
【化１３】
【００６４】（但し、Ｒ4は低級アルキル基又はフェニ
ル基置換低級アルキル基を表す。）で示される２−オキ
ソイミダゾリジン−４−カルボン酸誘導体と縮合反応さ
せ、得られた化合物をさらに、酸処理及び／又は接触還
元（好ましくは酸処理）して置換基Ｒ4を除去して、下
式
ル基置換低級アルキル基を表す。）で示される２−オキ
ソイミダゾリジン−４−カルボン酸誘導体と縮合反応さ
せ、得られた化合物をさらに、酸処理及び／又は接触還
元（好ましくは酸処理）して置換基Ｒ4を除去して、下
式
【００６５】
【化１４】
【００６６】で示される化合物を得、所望により、該化
合物をその薬理的に許容し得る塩とすることにより、２
−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許
容しうる塩を製造できる。かかる塩としては、無機酸塩
（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、ア
ルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩
等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウ
ム塩等）、有機酸塩（コハク酸塩、マレイン酸塩、フマ
ール酸塩、メタンスルホン酸塩など）、有機塩基との塩
（リジン塩、オルニチン塩等）が挙げられる。
合物をその薬理的に許容し得る塩とすることにより、２
−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許
容しうる塩を製造できる。かかる塩としては、無機酸塩
（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、ア
ルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩
等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウ
ム塩等）、有機酸塩（コハク酸塩、マレイン酸塩、フマ
ール酸塩、メタンスルホン酸塩など）、有機塩基との塩
（リジン塩、オルニチン塩等）が挙げられる。
【００６７】Ｎ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３
−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンの活性エステル体
とは、そのカルボキシル基における反応性誘導体を意味
する。このような活性エステル体は、例えば前記化合物
を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は１−ヒドロ
キシコハク酸イミドと、縮合剤（ジシクロヘキシルカル
ボジイミド等）の存在下で反応させることにより得られ
る。
−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンの活性エステル体
とは、そのカルボキシル基における反応性誘導体を意味
する。このような活性エステル体は、例えば前記化合物
を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は１−ヒドロ
キシコハク酸イミドと、縮合剤（ジシクロヘキシルカル
ボジイミド等）の存在下で反応させることにより得られ
る。
【００６８】一般式（IV）においてＲ4で示される低級
アルキル基としては、tert−ブチル基などが挙げられ
る。フェニル基置換低級アルキル基としては、ベンジル
基などが挙げられる。このうちＲ4は、ベンジル基であ
ることが好ましい。
アルキル基としては、tert−ブチル基などが挙げられ
る。フェニル基置換低級アルキル基としては、ベンジル
基などが挙げられる。このうちＲ4は、ベンジル基であ
ることが好ましい。
【００６９】かくして、塩酸イミダプリル（化学名：
（４Ｓ）−１−メチル−３−｛（２Ｓ）−２−〔Ｎ−
（（１Ｓ）−１−エトキシカルボニル−３−フェニルプ
ロピル）アミノ〕プロピオニル｝−２−オキソイミダゾ
リジン−４−カルボン酸塩酸塩）など、アンジオテンシ
ン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤として有用な２−オキソイ
ミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩
を製造することができる。
（４Ｓ）−１−メチル−３−｛（２Ｓ）−２−〔Ｎ−
（（１Ｓ）−１−エトキシカルボニル−３−フェニルプ
ロピル）アミノ〕プロピオニル｝−２−オキソイミダゾ
リジン−４−カルボン酸塩酸塩）など、アンジオテンシ
ン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤として有用な２−オキソイ
ミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩
を製造することができる。
【００７０】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecu
lar Cloning）」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びMan
iatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Press
より１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、ま
たは、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指
示書に従って使用した。
明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecu
lar Cloning）」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びMan
iatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Press
より１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、ま
たは、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指
示書に従って使用した。
【００７２】
【実施例】実施例１ トランスアミナーゼ高発現プラス
ミドｐＰＡＰ２４３及びこれを含む大腸菌形質転換株の
取得 (１)発現プラスミドｐＰＡＰ１４２の調製 タカギらの文献（Biotechnology and Applied Biochemi
stry、第13巻、112-119頁、1991年；特開平１−１５３
０８４)記載の方法に従って、パラコッカス・デニトリ
フィカンス（Paracoccus denitrificans IFO12442）の
染色体ＤＮＡからトランスアミナーゼ遺伝子（フェニル
アラニントランスアミナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片
を単離し、これを含む組換え発現プラスミドｐＰＡＰ１
４２を得た。
ミドｐＰＡＰ２４３及びこれを含む大腸菌形質転換株の
取得 (１)発現プラスミドｐＰＡＰ１４２の調製 タカギらの文献（Biotechnology and Applied Biochemi
stry、第13巻、112-119頁、1991年；特開平１−１５３
０８４)記載の方法に従って、パラコッカス・デニトリ
フィカンス（Paracoccus denitrificans IFO12442）の
染色体ＤＮＡからトランスアミナーゼ遺伝子（フェニル
アラニントランスアミナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片
を単離し、これを含む組換え発現プラスミドｐＰＡＰ１
４２を得た。
【００７３】ｐＰＡＰ１４２は、トランスアミナーゼ遺
伝子を含むパラコッカス・デニトリフィカンス染色体Ｄ
ＮＡ断片（約２．２ｋｂ）が、ベクタープラスミドｐＵ
Ｃ１８のｌａｃプロモータ下流に連結されている。この
染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を後記配列表の配列番号１
に示し、この染色体ＤＮＡ断片にコードされるトランス
アミナーゼのアミノ酸配列を後記配列表の配列番号２に
示した。この染色体ＤＮＡ断片中、トランスアミナーゼ
遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番
目の塩基に相当する塩基配列を有する）の上流には、パ
ラコッカス・デニトリフィカンス由来の、プロモータ領
域と、ロダニース様蛋白質をコードする領域（配列番号
１の第１６６〜９２７番目の塩基に相当する塩基配列を
有する）が存在する。
伝子を含むパラコッカス・デニトリフィカンス染色体Ｄ
ＮＡ断片（約２．２ｋｂ）が、ベクタープラスミドｐＵ
Ｃ１８のｌａｃプロモータ下流に連結されている。この
染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を後記配列表の配列番号１
に示し、この染色体ＤＮＡ断片にコードされるトランス
アミナーゼのアミノ酸配列を後記配列表の配列番号２に
示した。この染色体ＤＮＡ断片中、トランスアミナーゼ
遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番
目の塩基に相当する塩基配列を有する）の上流には、パ
ラコッカス・デニトリフィカンス由来の、プロモータ領
域と、ロダニース様蛋白質をコードする領域（配列番号
１の第１６６〜９２７番目の塩基に相当する塩基配列を
有する）が存在する。
【００７４】ｐＰＡＰ１４２中、ｌａｃプロモータ（配
列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッカス由
来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第
１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有
する）との間の塩基配列は、後記配列表の配列番号４に
示した通りである。配列番号４の第２３７〜９９８番目
の塩基に相当する塩基配列は、ロダニース様蛋白質をコ
ードする領域の塩基配列である。
列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッカス由
来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第
１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有
する）との間の塩基配列は、後記配列表の配列番号４に
示した通りである。配列番号４の第２３７〜９９８番目
の塩基に相当する塩基配列は、ロダニース様蛋白質をコ
ードする領域の塩基配列である。
【００７５】ｐＰＡＰ１４２を導入した大腸菌中では、
パラコッカス・デニトリフィカンス由来のトランスアミ
ナーゼ遺伝子はベクター中のｌａｃプロモータによって
発現すると考えられる。
パラコッカス・デニトリフィカンス由来のトランスアミ
ナーゼ遺伝子はベクター中のｌａｃプロモータによって
発現すると考えられる。
【００７６】(２)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３の調製 前記(１)で得たプラスミドｐＰＡＰ１４２から、パラコ
ッカス（パラコッカス・デニトリフィカンス）由来染色
体ＤＮＡ断片中の、遺伝子源本来のプロモータ領域とロ
ダニース様蛋白質をコードする領域を欠失させ、大腸菌
でのトランスアミナーゼの発現に必要な領域のみを残し
たプラスミドを、以下のようにして構築した。（構築方
法の概略図を図１に示した。）まず、ｐＰＡＰ１４２を
鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）によ
り、ｐＰＡＰ１４２中のトランスアミナーゼ翻訳域Ｎ末
端側（１７７ｂｐ）とその上流非翻訳域の一部（９５ｂ
ｐ）を含む断片を増幅した。
ッカス（パラコッカス・デニトリフィカンス）由来染色
体ＤＮＡ断片中の、遺伝子源本来のプロモータ領域とロ
ダニース様蛋白質をコードする領域を欠失させ、大腸菌
でのトランスアミナーゼの発現に必要な領域のみを残し
たプラスミドを、以下のようにして構築した。（構築方
法の概略図を図１に示した。）まず、ｐＰＡＰ１４２を
鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）によ
り、ｐＰＡＰ１４２中のトランスアミナーゼ翻訳域Ｎ末
端側（１７７ｂｐ）とその上流非翻訳域の一部（９５ｂ
ｐ）を含む断片を増幅した。
【００７７】ＰＣＲのためのプライマーとしては、後記
配列表の配列番号９及び配列番号１０に示した塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを各々センスプライマ
ー及びアンチセンスプライマーとして用いた。
配列表の配列番号９及び配列番号１０に示した塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを各々センスプライマ
ー及びアンチセンスプライマーとして用いた。
【００７８】センスプライマーの配列は、上流非翻訳域
部分配列（配列番号１の第９２９〜９５８番目の塩基に
相当）のＮ末側を一部改変してＫｐｎＩ認識部位が生成
されるように設計した。また、アンチセンスプライマー
の配列は、トランスアミナーゼ翻訳域中の部分配列（配
列番号１の第１１７１〜１２００番目の塩基に相当）に
基づいて設計した。
部分配列（配列番号１の第９２９〜９５８番目の塩基に
相当）のＮ末側を一部改変してＫｐｎＩ認識部位が生成
されるように設計した。また、アンチセンスプライマー
の配列は、トランスアミナーゼ翻訳域中の部分配列（配
列番号１の第１１７１〜１２００番目の塩基に相当）に
基づいて設計した。
【００７９】ＰＣＲの反応は、5μｌ（0.09μｇ）のプ
ラスミド pPAP142、各4μＭのプライマー、1.0単位の
ＤＮＡポリメラーゼ、5μｌの10倍緩衝液、各5μｌ（2m
M）のデオキシＮＴＰおよび30.5μｌの水からなる混合
液を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃
で１分の工程を、３０回繰り返すことにより行った。反
応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的と
するＰＣＲ産物のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）をゲル中
から回収した。
ラスミド pPAP142、各4μＭのプライマー、1.0単位の
ＤＮＡポリメラーゼ、5μｌの10倍緩衝液、各5μｌ（2m
M）のデオキシＮＴＰおよび30.5μｌの水からなる混合
液を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃
で１分の工程を、３０回繰り返すことにより行った。反
応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的と
するＰＣＲ産物のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）をゲル中
から回収した。
【００８０】得られたＤＮＡ断片をベクタープラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製）
のＥｃｏＲＶで切断部位に挿入し、プラスミドｐＢＳＫ
１を得た。ｐＢＳＫ１中のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲで得たＤＮＡが
目的とする正しい配列を有していることを確認した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製）
のＥｃｏＲＶで切断部位に挿入し、プラスミドｐＢＳＫ
１を得た。ｐＢＳＫ１中のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲで得たＤＮＡが
目的とする正しい配列を有していることを確認した。
【００８１】プラスミドｐＢＳＫ１をさらにＥｃｏＲＩ
で切断し、得られた約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＰＡ
Ｐ１４２のＥｃｏＲＩ切断断片（約３８００ｂｐ：アン
ピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスア
ミナーゼ遺伝子の３’末端側を含む）と連結して、組換
え発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を得た。
で切断し、得られた約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＰＡ
Ｐ１４２のＥｃｏＲＩ切断断片（約３８００ｂｐ：アン
ピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスア
ミナーゼ遺伝子の３’末端側を含む）と連結して、組換
え発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を得た。
【００８２】ｐＰＡＰ２４３は、ｌａｃプロモータの下
流にパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳
領域及び３’非翻訳領域が正方向に連結されており、ｐ
ＰＡＰ１４２におけるパラコッカス由来のプロモータ領
域とロダニース様蛋白質をコードする領域が欠失してい
る。
流にパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳
領域及び３’非翻訳領域が正方向に連結されており、ｐ
ＰＡＰ１４２におけるパラコッカス由来のプロモータ領
域とロダニース様蛋白質をコードする領域が欠失してい
る。
【００８３】ｐＰＡＰ２４３において、ｌａｃプロモー
タ（配列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッ
カス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号
１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配
列を有する）との間の塩基配列は、配列番号５で示した
通りである。
タ（配列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッ
カス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号
１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配
列を有する）との間の塩基配列は、配列番号５で示した
通りである。
【００８４】(３)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を含む
大腸菌形質転換株の取得 前項(２)で得た発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を、エシ
ェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ＨＢ１０１株に導入し、形質転換株 ＨＢ１０１（ｐ
ＰＡＰ２４３）を得た。
大腸菌形質転換株の取得 前項(２)で得た発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を、エシ
ェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ＨＢ１０１株に導入し、形質転換株 ＨＢ１０１（ｐ
ＰＡＰ２４３）を得た。
【００８５】実施例２ トランスアミナーゼ発現プラス
ミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の培養物の
トランスアミナーゼ活性 前記実施例１(３)で得たトランスアミナーゼ発現プラス
ミドｐＰＡＰ２４３を導入した形質転換株ＨＢ１０１
（ｐＰＡＰ２４３）（実施例１(３)）のトランスアミナ
ーゼ活性を測定した。
ミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の培養物の
トランスアミナーゼ活性 前記実施例１(３)で得たトランスアミナーゼ発現プラス
ミドｐＰＡＰ２４３を導入した形質転換株ＨＢ１０１
（ｐＰＡＰ２４３）（実施例１(３)）のトランスアミナ
ーゼ活性を測定した。
【００８６】また、ロダニース様蛋白質をコードする領
域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡＰ１４２（実施
例１(１)）、ロダニース様蛋白質をコードする領域など
は除かれているがプロモータ（ｌａｃ）とトランスアミ
ナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ２４３とは異な
る対照発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６（後記参考例１
(１)）、ｐＰＡＰ１４１７（後記参考例１(２)）及びｐ
ＰＡＰＳＤ６１（後記参考例１(３)）について、これら
を導入した形質転換株のトランスアミナーゼ活性を測定
・比較した。
域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡＰ１４２（実施
例１(１)）、ロダニース様蛋白質をコードする領域など
は除かれているがプロモータ（ｌａｃ）とトランスアミ
ナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ２４３とは異な
る対照発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６（後記参考例１
(１)）、ｐＰＡＰ１４１７（後記参考例１(２)）及びｐ
ＰＡＰＳＤ６１（後記参考例１(３)）について、これら
を導入した形質転換株のトランスアミナーゼ活性を測定
・比較した。
【００８７】形質転換株の培養及びトランスアミナーゼ
活性の測定は、以下のように行った。ＬＢＧ寒天培地
（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラ
クト、０．５％ＮａＣｌ、２％グルコース、２％寒天）
で前培養した菌を一白金耳、生理食塩水４．５ｍｌに懸
濁した後０．５ｍｌを生産用培地（１％乳糖、０．２％
ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％
コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン
酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１
％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・
７水和物、０．０３％カラリン、アンピシリン２００μ
ｇ／ｍｌを含む培地（ｐＨ７．０））５０ｍｌに植菌
し、３７℃にて２６．５時間振とう培養した。培養後、
培養液０．２ｍｌを採取し、洗浄用液（０．０１％臭化
セチルトリメチルアンモニウム、０．９％塩化ナトリウ
ム）４ｍｌに添加して３０℃、３０分間インキュベート
した。これを遠心分離した後上清４ｍｌを除去し、残っ
た菌体について、トランスアミナーゼ活性を測定した。
活性の測定は、以下のように行った。ＬＢＧ寒天培地
（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラ
クト、０．５％ＮａＣｌ、２％グルコース、２％寒天）
で前培養した菌を一白金耳、生理食塩水４．５ｍｌに懸
濁した後０．５ｍｌを生産用培地（１％乳糖、０．２％
ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％
コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン
酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１
％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・
７水和物、０．０３％カラリン、アンピシリン２００μ
ｇ／ｍｌを含む培地（ｐＨ７．０））５０ｍｌに植菌
し、３７℃にて２６．５時間振とう培養した。培養後、
培養液０．２ｍｌを採取し、洗浄用液（０．０１％臭化
セチルトリメチルアンモニウム、０．９％塩化ナトリウ
ム）４ｍｌに添加して３０℃、３０分間インキュベート
した。これを遠心分離した後上清４ｍｌを除去し、残っ
た菌体について、トランスアミナーゼ活性を測定した。
【００８８】トランスアミナーゼ活性（フェニルアラニ
ン・トランスアミナーゼ活性）は、２−オキソ−４−フ
ェニル酪酸を基質とし、Ｌ−グルタミン酸をアミノ供与
体として、以下のように測定した。
ン・トランスアミナーゼ活性）は、２−オキソ−４−フ
ェニル酪酸を基質とし、Ｌ−グルタミン酸をアミノ供与
体として、以下のように測定した。
【００８９】前記被験菌体（０．２ｍｌ）に基質溶液
（0.25M ２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム、0.3
75M Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよび0.125M ピリ
ドキサール−５’−リン酸）０．８ｍｌを添加し、３０
℃で３０分反応させた後、１Ｎ塩酸４ｍｌを添加して反
応停止させた。これを蒸留水で適宜希釈した後、ＨＰＬ
Ｃ（Nucleosil 10C18カラム（４×２５０ｍｍ、ＭＡＣ
ＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）、移動相４０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ２．５）／ＣＨ3ＣＮ［９／1］、流速１
ｍｌ／分、検出波長２５４ｎｍ）にて、反応生成物Ｌ−
２−アミノ−４−フェニル酪酸を測定・定量した。
（0.25M ２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム、0.3
75M Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよび0.125M ピリ
ドキサール−５’−リン酸）０．８ｍｌを添加し、３０
℃で３０分反応させた後、１Ｎ塩酸４ｍｌを添加して反
応停止させた。これを蒸留水で適宜希釈した後、ＨＰＬ
Ｃ（Nucleosil 10C18カラム（４×２５０ｍｍ、ＭＡＣ
ＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）、移動相４０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ２．５）／ＣＨ3ＣＮ［９／1］、流速１
ｍｌ／分、検出波長２５４ｎｍ）にて、反応生成物Ｌ−
２−アミノ−４−フェニル酪酸を測定・定量した。
【００９０】測定結果を下記表１に示した。
【００９１】
【表１】
【００９２】表１に示した通り、ｐＰＡＰ２４３をＨＢ
１０１株に導入した形質転換株は、ロダニース様蛋白質
をコードする領域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡ
Ｐ１４２を導入した株の約２．１倍の高い活性を示し
た。
１０１株に導入した形質転換株は、ロダニース様蛋白質
をコードする領域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡ
Ｐ１４２を導入した株の約２．１倍の高い活性を示し
た。
【００９３】また、ｐＰＡＰ２４３と同様にロダニース
様蛋白質をコードする領域などは除かれているがプロモ
ータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰ
ＡＰ２４３とは異なる発現プラスミド、ｐＰＡＰ１４１
６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を各々導入
した形質転換株では、ｐＰＡＰ２４３を導入した株の約
１／２以下の活性しか認められなかった。
様蛋白質をコードする領域などは除かれているがプロモ
ータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰ
ＡＰ２４３とは異なる発現プラスミド、ｐＰＡＰ１４１
６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を各々導入
した形質転換株では、ｐＰＡＰ２４３を導入した株の約
１／２以下の活性しか認められなかった。
【００９４】実施例３ Ｌ−２−アミノ−４−フェニル
酪酸の製造 生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ
−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカ
ー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、
０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウ
ム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０
３％カラリンを含む培地（ｐＨ７．０））１００ｍｌ
に、前記実施例１の（３）で得た大腸菌形質転換株ＨＢ
１０１（ｐＰＡＰ２４３）を１白金耳植種し、３７℃で
２６時間培養する。この培養液に２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸カリウム４．３３ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリ
ウム５．０７ｇおよびピリドキサルリン酸２．６５ｍｇ
を添加後、アンモニア水でｐＨ８．８に調整し、更に３
０℃で２６．５時間静置して酵素反応を行う。２時間お
よび５時間反応後に、それぞれ２−オキソ−４−フェニ
ル酪酸カリウム２．１６ｇとＬ−グルタミン酸ナトリウ
ム２．５４ｇ（ｐＨ８．８）を添加して反応を行う。反
応後、コットンフィルターでろ過を行い、ＨＣｌで溶解
後、活性炭処理して、５Ｎ ＮａＣｌでｐＨ５．５に調
整する。かくして収率約８８％で光学活性体Ｌ−２−ア
ミノ−４−フェニル酪酸の結晶を得ることができる。
酪酸の製造 生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ
−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカ
ー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、
０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウ
ム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０
３％カラリンを含む培地（ｐＨ７．０））１００ｍｌ
に、前記実施例１の（３）で得た大腸菌形質転換株ＨＢ
１０１（ｐＰＡＰ２４３）を１白金耳植種し、３７℃で
２６時間培養する。この培養液に２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸カリウム４．３３ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリ
ウム５．０７ｇおよびピリドキサルリン酸２．６５ｍｇ
を添加後、アンモニア水でｐＨ８．８に調整し、更に３
０℃で２６．５時間静置して酵素反応を行う。２時間お
よび５時間反応後に、それぞれ２−オキソ−４−フェニ
ル酪酸カリウム２．１６ｇとＬ−グルタミン酸ナトリウ
ム２．５４ｇ（ｐＨ８．８）を添加して反応を行う。反
応後、コットンフィルターでろ過を行い、ＨＣｌで溶解
後、活性炭処理して、５Ｎ ＮａＣｌでｐＨ５．５に調
整する。かくして収率約８８％で光学活性体Ｌ−２−ア
ミノ−４−フェニル酪酸の結晶を得ることができる。
【００９５】参考例１ 対照トランスアミナーゼ発現プ
ラスミドの調製 プロモータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列
がｐＰＡＰ１４３とは異なる発現プラスミドｐＰＡＰ１
４１６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を以下
のように調製した。
ラスミドの調製 プロモータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列
がｐＰＡＰ１４３とは異なる発現プラスミドｐＰＡＰ１
４１６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を以下
のように調製した。
【００９６】(１)ｐＰＡＰ１４１６の調製 実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２
を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られ
たＤＮＡ断片（３８９０ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝
子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域
を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカ
ーＤＮＡ：配列番号６の第７０〜８４番目の塩基に相
当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６
を得た（調製方法の概略を図２に示した。）。リンカー
ＤＮＡは、３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイオ
システム社製）を用いてホスホアミダイト法によって合
成したものを用いた（以下、同）。
を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られ
たＤＮＡ断片（３８９０ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝
子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域
を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカ
ーＤＮＡ：配列番号６の第７０〜８４番目の塩基に相
当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６
を得た（調製方法の概略を図２に示した。）。リンカー
ＤＮＡは、３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイオ
システム社製）を用いてホスホアミダイト法によって合
成したものを用いた（以下、同）。
【００９７】得られた発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６
は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トラン
スアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌ
ａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列
は、配列番号６で示した通りである。
は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トラン
スアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌ
ａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列
は、配列番号６で示した通りである。
【００９８】(２)ｐＰＡＰ１４１７の調製 実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２
を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断した後、Ｍ
Ｂヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）で処理して末端
平滑化した。得られたＤＮＡ断片（約３８９０ｂｐ：ア
ンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランス
アミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（Ｋｐｎ
Ｉ−平滑末端リンカーＤＮＡ：配列番号７の第７０〜８
８番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミド
ｐＰＡＰ１４１７を得た（調製方法の概略を図２に示し
た。）。
を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断した後、Ｍ
Ｂヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）で処理して末端
平滑化した。得られたＤＮＡ断片（約３８９０ｂｐ：ア
ンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランス
アミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（Ｋｐｎ
Ｉ−平滑末端リンカーＤＮＡ：配列番号７の第７０〜８
８番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミド
ｐＰＡＰ１４１７を得た（調製方法の概略を図２に示し
た。）。
【００９９】得られた発現プラスミドｐＰＡＰ１４１７
は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トラン
スアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌ
ａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列
は、配列番号７に示した通りである。
は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トラン
スアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌ
ａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列
は、配列番号７に示した通りである。
【０１００】(３)ｐＰＡＰＳＤ６１の調製 実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２
を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られ
たＤＮＡ断片（約３．９ｋｂ：アンピシリン耐性遺伝
子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域
を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカ
ーＤＮＡ：配列番号８の第６９〜７８番目の塩基に相
当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１
を得た。
を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られ
たＤＮＡ断片（約３．９ｋｂ：アンピシリン耐性遺伝
子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域
を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカ
ーＤＮＡ：配列番号８の第６９〜７８番目の塩基に相
当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１
を得た。
【０１０１】得られた発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１
は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トラン
スアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌ
ａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列
は、配列番号８で示した通りである。
は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トラン
スアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌ
ａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列
は、配列番号８で示した通りである。
【０１０２】
【発明の効果】本発明の微生物は、従来のトランスアミ
ナーゼ発現組換え微生物と比較して顕著に高いトランス
アミナーゼ発現能及び生産能を有する。また、本発明の
微生物は、トランスアミナーゼ以外のパラコッカス・デ
ニトリフィカンス由来蛋白質を発現しない点でも有利で
ある。
ナーゼ発現組換え微生物と比較して顕著に高いトランス
アミナーゼ発現能及び生産能を有する。また、本発明の
微生物は、トランスアミナーゼ以外のパラコッカス・デ
ニトリフィカンス由来蛋白質を発現しない点でも有利で
ある。
【０１０３】本新規微生物を用いることにより、Ｌ-ア
ミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸など）を工
業的有利に製造できる。また、本新規微生物を用いるこ
とにより、Ｌ-アミノ酸を経由してＮ−置換アミノ酸誘
導体アルキル及び２−オキソイミダゾリジン誘導体また
はその薬理学的に許容しうる塩を工業的有利に製造でき
る。
ミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸など）を工
業的有利に製造できる。また、本新規微生物を用いるこ
とにより、Ｌ-アミノ酸を経由してＮ−置換アミノ酸誘
導体アルキル及び２−オキソイミダゾリジン誘導体また
はその薬理学的に許容しうる塩を工業的有利に製造でき
る。
【０１０４】「配列表フリーテキスト」 配列番号５のフリーテキスト <223> ベクターの一部分とパラコッカス由来トランスア
ミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分が融合した
配列（Sequence of the fusion of a portionof a vect
or and 5' upstream part of the Paracoccus transami
nase gene coding region）
ミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分が融合した
配列（Sequence of the fusion of a portionof a vect
or and 5' upstream part of the Paracoccus transami
nase gene coding region）
【０１０５】配列番号６、７及び８のフリーテキスト <223> ベクターの一部分とリンカーとパラコッカス由来
トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分
が融合した配列（Sequence of the fusion ofa portion
of a vector,a linker,and 5' upstream part of the
Paracoccus transaminase gene coding region）
トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分
が融合した配列（Sequence of the fusion ofa portion
of a vector,a linker,and 5' upstream part of the
Paracoccus transaminase gene coding region）
【０１０６】配列番号９及び１０のフリーテキスト <223> 人工的に合成されたプライマーの配列（Artifici
ally synthesized primer sequence）
ally synthesized primer sequence）
【０１０７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TANABE SEIYAKU CO., LTD. <120> Novel Microorganism and Process for Preparing L-Amino Acid Using the Same <130> A00-4691 <140> <141> <150> JP013688/1999 <151> 1999-01-22 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0
【０１０８】 <210> 1 <211> 2251 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <220> <221> CDS <222> (1024)..(2205) <400> 1 gatcggcgtc gccaagggca agaaggtcgc cgacaagcgc gaaaccgccg ccaagcgcga 60 ctggaaccgg cagaaacacg tttggctgaa gcagggttaa gccttgccgc cccgcgcggc 120 tgcggttaca tcggtgtcgt ttctgcgcgc gcgggaggaa ggccgatgtc caccgattcc 180 gacgatccga aagtgctggt ctcgaccgac tggctcgccg cccatctgag cgatcccgac 240 ctgcgcgtca tcgacgccac ctggttcctg gagcccggcc gcgatgcgcg ggccgaatac 300 atggccgctc atatccccgg cggcccgctt cttcgacatc gacgagatcg cggacaagcg 360 cagcaactgc cgcatatggc gccccagccc gagatgttca tcagccgcat gcgcgccatg 420 ggcatcggcg acggccatca ggtcgtgatc tacgacaatt cgcccgtgcg ctcggcggcg 480 cgggtctggt ggaccttcaa gctgatgggc aagcaggacg tggcggtgct ggacgcggct 540 tcggcaaatg gctggccgag ggccgcgaga tcgaggacat gccgccgatc ctgcgcgacc 600 gccacatcac cgtgcaacgc caggcggcgc tggtgcgctg acgtgaccca ggtcgccgcg 660 gccagcaagc tgggcgacca tgagatcgtc gatgcgcgct cggccgaagc cttccgcggc 720 gaggcgaccg aaccgcgggc cggcctgcgc tcgggccaca tccccggctc gaaaagcctg 780 cccttcggcc ggctctacga ccaggacggc acgctgaaat cacccgatgc gtgcgcgccg 840 aattcgaggc cgccggcgtg gacctgtcga aacccgtcat caccactgcg gctcgggggt 900 gacggcggcc gtgctgttcc tggcgcttga acgcatcggg caccgggacc attcgcttta 960 tgacggaagc tgggccgaat ggggcaggtt ccccgacctt aaaatcgcaa ccggagacgc 1020 gtg atg ctg ggc aat ctg aaa ccg cag gcc ccc gac aag atc ctg gcc 1068 Met Leu Gly Asn Leu Lys Pro Gln Ala Pro Asp Lys Ile Leu Ala 1 5 10 15 ctg atg ggc gaa ttc agg gcc gat ccc cgc cag ggc aag atc gac ctg 1116 Leu Met Gly Glu Phe Arg Ala Asp Pro Arg Gln Gly Lys Ile Asp Leu 20 25 30 ggc gtg ggg gtc tac aag gat gcc acc ggc cac acc ccg atc atg cgg 1164 Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Ala Thr Gly His Thr Pro Ile Met Arg 35 40 45 gcc gtc cac gcc gcc gag cag cgc atg ctg gaa acc gag acc acc aag 1212 Ala Val His Ala Ala Glu Gln Arg Met Leu Glu Thr Glu Thr Thr Lys 50 55 60 acc tat gcc ggc ctc tcg ggc gag ccc gag ttc caa aag gcc atg ggc 1260 Thr Tyr Ala Gly Leu Ser Gly Glu Pro Glu Phe Gln Lys Ala Met Gly 65 70 75 gag ctg atc ctg ggc gac gga ctg aaa tcc gag acc acc gcg acg ctg 1308 Glu Leu Ile Leu Gly Asp Gly Leu Lys Ser Glu Thr Thr Ala Thr Leu 80 85 90 95 gcg acg gtc ggc ggc acc ggc gcc ctc cgg cag gcg ctg gaa ctg gcg 1356 Ala Thr Val Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ala 100 105 110 cgc atg gcg aac ccg gac ctg cgg gtc ttc gtc agc gat ccg acc tgg 1404 Arg Met Ala Asn Pro Asp Leu Arg Val Phe Val Ser Asp Pro Thr Trp 115 120 125 ccg aac cat gtc tcg atc atg aat ttc atg ggc ctg ccg gtg cag acc 1452 Pro Asn His Val Ser Ile Met Asn Phe Met Gly Leu Pro Val Gln Thr 130 135 140 tat cgc tat ttc gat gcc gag acc cgc ggc gtc gat ttc gag ggc atg 1500 Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr Arg Gly Val Asp Phe Glu Gly Met 145 150 155 aag gcc gac ctc gcc gcc gcg aaa aag ggc gac atg gtg ctg ctg cac 1548 Lys Ala Asp Leu Ala Ala Ala Lys Lys Gly Asp Met Val Leu Leu His 160 165 170 175 ggc tgc tgc cac aac ccg acc ggc gcc aac ctg acg ctg gat caa tgg 1596 Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asn Leu Thr Leu Asp Gln Trp 180 185 190 gcc gag atc gcc tcg atc ctg gaa aag acc ggc gcg ctg ccg ctg atc 1644 Ala Glu Ile Ala Ser Ile Leu Glu Lys Thr Gly Ala Leu Pro Leu Ile 195 200 205 gac ctg gcc tat cag ggc ttc ggc gac ggg ctg gaa gag gac gcg gcc 1692 Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Asp Gly Leu Glu Glu Asp Ala Ala 210 215 220 ggc acc cgg ctg atc gcc tcg cgc atc ccc gag gtg ctg atc gcg gcc 1740 Gly Thr Arg Leu Ile Ala Ser Arg Ile Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala 225 230 235 tcg tgc agc aag aac ttc ggc atc tac cgc gaa cgc acc ggc tgc ctg 1788 Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Cys Leu 240 245 250 255 ctg gcg ctt tgc gcc gat gcg gcg acc agg gag ctg gcg cag ggc gcc 1836 Leu Ala Leu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gly Ala 260 265 270 atg gcc ttc ctg aac cgc cag acc tat tcc ttc ccg ccc ttc cac ggc 1884 Met Ala Phe Leu Asn Arg Gln Thr Tyr Ser Phe Pro Pro Phe His Gly 275 280 285 gcc aag atc gtc tcg acc gtg ctg acc acg ccc gaa ctg cgc gcc gac 1932 Ala Lys Ile Val Ser Thr Val Leu Thr Thr Pro Glu Leu Arg Ala Asp 290 295 300 tgg atg gcc gag ctg gaa gcg gtg cgc agc ggc atg ctg cgc ctg cgc 1980 Trp Met Ala Glu Leu Glu Ala Val Arg Ser Gly Met Leu Arg Leu Arg 305 310 315 gag caa ttg gcg ggc gag ttg cgc gat ctc agc ggt tcg gac cgt ttc 2028 Glu Gln Leu Ala Gly Glu Leu Arg Asp Leu Ser Gly Ser Asp Arg Phe 320 325 330 335 ggc ttc gtg gcc gag cat cgc ggc atg ttc tcg cgc ctg ggc gcc acg 2076 Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met Phe Ser Arg Leu Gly Ala Thr 340 345 350 ccc gaa cag gtc aag cgc atc aag gaa gag ttc ggc atc tac atg gtg 2124 Pro Glu Gln Val Lys Arg Ile Lys Glu Glu Phe Gly Ile Tyr Met Val 355 360 365 ggc gat tcg cgc atc aac atc gcc ggg ctg aac gac aac acc atc ccg 2172 Gly Asp Ser Arg Ile Asn Ile Ala Gly Leu Asn Asp Asn Thr Ile Pro 370 375 380 atc ctg gcc cgc gct atc atc gag gtg ggg gtc taagccaccg caagggcgcc 2225 Ile Leu Ala Arg Ala Ile Ile Glu Val Gly Val 385 390 ggagacgcgc cctttttctt ccacgt 2251
【０１０９】 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Paracoccus denitrificans <400> 2 Met Leu Gly Asn Leu Lys Pro Gln Ala Pro Asp Lys Ile Leu Ala Leu 1 5 10 15 Met Gly Glu Phe Arg Ala Asp Pro Arg Gln Gly Lys Ile Asp Leu Gly 20 25 30 Val Gly Val Tyr Lys Asp Ala Thr Gly His Thr Pro Ile Met Arg Ala 35 40 45 Val His Ala Ala Glu Gln Arg Met Leu Glu Thr Glu Thr Thr Lys Thr 50 55 60 Tyr Ala Gly Leu Ser Gly Glu Pro Glu Phe Gln Lys Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Leu Ile Leu Gly Asp Gly Leu Lys Ser Glu Thr Thr Ala Thr Leu Ala 85 90 95 Thr Val Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ala Arg 100 105 110 Met Ala Asn Pro Asp Leu Arg Val Phe Val Ser Asp Pro Thr Trp Pro 115 120 125 Asn His Val Ser Ile Met Asn Phe Met Gly Leu Pro Val Gln Thr Tyr 130 135 140 Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr Arg Gly Val Asp Phe Glu Gly Met Lys 145 150 155 160 Ala Asp Leu Ala Ala Ala Lys Lys Gly Asp Met Val Leu Leu His Gly 165 170 175 Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asn Leu Thr Leu Asp Gln Trp Ala 180 185 190 Glu Ile Ala Ser Ile Leu Glu Lys Thr Gly Ala Leu Pro Leu Ile Asp 195 200 205 Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Asp Gly Leu Glu Glu Asp Ala Ala Gly 210 215 220 Thr Arg Leu Ile Ala Ser Arg Ile Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser 225 230 235 240 Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Cys Leu Leu 245 250 255 Ala Leu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gly Ala Met 260 265 270 Ala Phe Leu Asn Arg Gln Thr Tyr Ser Phe Pro Pro Phe His Gly Ala 275 280 285 Lys Ile Val Ser Thr Val Leu Thr Thr Pro Glu Leu Arg Ala Asp Trp 290 295 300 Met Ala Glu Leu Glu Ala Val Arg Ser Gly Met Leu Arg Leu Arg Glu 305 310 315 320 Gln Leu Ala Gly Glu Leu Arg Asp Leu Ser Gly Ser Asp Arg Phe Gly 325 330 335 Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met Phe Ser Arg Leu Gly Ala Thr Pro 340 345 350 Glu Gln Val Lys Arg Ile Lys Glu Glu Phe Gly Ile Tyr Met Val Gly 355 360 365 Asp Ser Arg Ile Asn Ile Ala Gly Leu Asn Asp Asn Thr Ile Pro Ile 370 375 380 Leu Ala Arg Ala Ile Ile Glu Val Gly Val 385 390
【０１１０】 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtg 35
【０１１１】 <210> 4 <211> 1094 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <400> 4 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaattcga 60 gctcggtacc cgatcggcgt cgccaagggc aagaaggtcg ccgacaagcg cgaaaccgcc 120 gccaagcgcg actggaaccg gcagaaacac gtttggctga agcagggtta agccttgccg 180 ccccgcgcgg ctgcggttac atcggtgtcg tttctgcgcg cgcgggagga aggccgatgt 240 ccaccgattc cgacgatccg aaagtgctgg tctcgaccga ctggctcgcc gcccatctga 300 gcgatcccga cctgcgcgtc atcgacgcca cctggttcct ggagcccggc cgcgatgcgc 360 gggccgaata catggccgct catatccccg gcggcccgct tcttcgacat cgacgagatc 420 gcggacaagc gcagcaactg ccgcatatgg cgccccagcc cgagatgttc atcagccgca 480 tgcgcgccat gggcatcggc gacggccatc aggtcgtgat ctacgacaat tcgcccgtgc 540 gctcggcggc gcgggtctgg tggaccttca agctgatggg caagcaggac gtggcggtgc 600 tggacgcggc ttcggcaaat ggctggccga gggccgcgag atcgaggaca tgccgccgat 660 cctgcgcgac cgccacatca ccgtgcaacg ccaggcggcg ctggtgcgct gacgtgaccc 720 aggtcgccgc ggccagcaag ctgggcgacc atgagatcgt cgatgcgcgc tcggccgaag 780 ccttccgcgg cgaggcgacc gaaccgcggg ccggcctgcg ctcgggccac atccccggct 840 cgaaaagcct gcccttcggc cggctctacg accaggacgg cacgctgaaa tcacccgatg 900 cgtgcgcgcc gaattcgagg ccgccggcgt ggacctgtcg aaacccgtca tcaccactgc 960 ggctcggggg tgacggcggc cgtgctgttc ctggcgcttg aacgcatcgg gcaccgggac 1020 cattcgcttt atgacggaag ctgggccgaa tggggcaggt tccccgacct taaaatcgca 1080 accggagacg cgtg 1094
【０１１２】 <210> 5 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the fusion of a portion of a vector and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region. <400> 5 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaattcga 60 tgaaggtacc gggcaccggg accattcgct ttatgacgga agctgggccg aatggggcag 120 gttccccgac cttaaaatcg caaccggaga cgcgtg 156
【０１１３】 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the fusion of a portion of a vector, a linker,and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region. <400> 6 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaattcga 60 gctcggtacc taaggaggtt taagcgcgtg 90
【０１１４】 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the fusion of a portion of a vector, a linker,and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region. <400> 7 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaattcga 60 gctcggtacc taaggaggtt taagctattg 90
【０１１５】 <210> 8 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the fusion of a portion of a vector, a linker,and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region. <400> 8 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaattcga 60 gctcggtacc ttaaggagac gcgtg 85
【０１１６】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence. <400> 9 gaaggtaccg ggcaccggga ccattcgctt 30
【０１１７】 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence. <400> 10 ggtttccagc atgcgctgct cggcggcgtg 30
【０１１８】
【図１】トランスアミナーゼ高発現プラスミドｐＰＡＰ
２４３の作製方法概略を示す模式図。
２４３の作製方法概略を示す模式図。
【図２】対照トランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡ
Ｐ１４１６及びｐＰＡＰ１４１７の作製方法概略を示す
模式図。
Ｐ１４１６及びｐＰＡＰ１４１７の作製方法概略を示す
模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 吉岡 龍蔵 大阪府三島郡島本町東大寺３丁目80番２− 306
Claims (12)
- 【請求項１】 宿主微生物中で機能するプロモータの下
流に、パラコッカス属に属する微生物由来のフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込
まれた組換えプラスミドを、エシェリシア・コリである
宿主微生物中に含有せしめた組換え微生物であって、該
プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの
翻訳開始コドンとの間の塩基配列が配列番号５に示され
た配列である、組換え微生物。 - 【請求項２】 パラコッカス属に属する微生物が、パラ
コッカス・デニトリフィカンスである請求項１記載の微
生物。 - 【請求項３】 該プロモータがｌａｃプロモーターであ
る、請求項１記載の組換え微生物。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載の微生
物を用いて、フェニルアラニン・トランスアミナーゼを
生産する方法。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項記載の微生
物または該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下
に、一般式（ＩＩ） 【化１】 （但し、式中、ｎは１または２を表す。）で示されるオ
キソ酸化合物に作用させることを特徴とする、一般式
（Ｉ） 【化２】 （但し、ｎは前記と同一意味を有する。）で示されるＬ
-アミノ酸の製法。 - 【請求項６】 アミノ供与体が、Ｌ−アスパラギン酸又
はＬ−グルタミン酸である請求項５記載の製法。 - 【請求項７】 オキソ酸化合物が２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸でありＬ−アミノ酸がＬ−２−アミノ−４−フ
ェニル酪酸である、請求項５記載の製法。 - 【請求項８】 請求項７記載の製法によりＬ−２−アミ
ノ−４−フェニル酪酸を得、該化合物をエステル化した
後、α位に脱離基を有するα−置換カルボン酸又はα−
置換カルボン酸エステル化合物と反応させて、一般式
（ＩＩＩ） 【化３】 （但し、式中、Ｒ1は、低級アルキル基、アラルキル
基、シクロアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ
2は、低級アルキル基、アラルキル基またはアリール基
を示す。Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基、アラルキ
ル基、シクロアルキル基またはアリール基を表す。）で
示される化合物を得、ついでＲ3が水素原子でない場合
には、所望により、該化合物を接触還元及び／又は酸処
理することにより置換基Ｒ3を除去することを特徴とす
る、Ｎ−置換アミノ酸誘導体の製法。 - 【請求項９】 Ｒ1がエチル基、Ｒ2がメチル基である請
求項８記載の製法。 - 【請求項１０】 Ｎ−置換アミノ酸誘導体が、Ｎ−
〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピ
ル〕−Ｌ−アラニンである請求項９記載の製法。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の製法によりＮ−
〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピ
ル〕−Ｌ−アラニンを得、該化合物をさらに酸塩化物と
反応させて、下式 【化４】 で示される化合物に変換することを特徴とするＮ−置換
アミノ酸誘導体の製法。 - 【請求項１２】 請求項１０記載の製法により得たＮ−
〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピ
ル〕−Ｌ−アラニンを、その活性エステル体（カルボキ
シル基における反応性誘導体）に変換した後、一般式
（ＩＶ） 【化５】 （但し、Ｒ4は低級アルキル基又はフェニル基置換低級
アルキル基を表す。）で示される２−オキソイミダゾリ
ジン−４−カルボン酸誘導体と縮合反応させ、得られた
化合物をさらに酸処理および／又は接触還元して置換基
Ｒ4を除去して、下式 【化６】 で示される化合物を得、所望により、該化合物をその薬
理的に許容し得る塩とすることを特徴とする、２−オキ
ソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しう
る塩の製法。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2001087858A1 (fr) * | 2000-05-15 | 2001-11-22 | Kaneka Corporation | Procedes de cristallisation d'un n-carboxyanhydride de n-(1(s)-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-l-alanine |
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| JP2006160678A (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-22 | Ohara Yakuhin Kogyo Kk | ２−オキソイミダゾリジン誘導体の製造方法 |
-
2000
- 2000-01-20 JP JP2000011171A patent/JP4505917B2/ja not_active Expired - Fee Related
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