JP2000245475A - グルコデキストラナーゼ遺伝子及びグルコデキストラナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】α-1,6-グルコシド結合に特異性の強いグルコ
デキストラナーゼ活性を有するポリペプチドを製造する
方法及びそれに使用するDNAを提供する。 【解決手段】 配列表に配列番号１として示す塩基配列
中の304番目の塩基から3363番目までの塩基で示される
グルコデキストラナーゼ遺伝子、配列表に配列番号２と
して示すアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から1020番
目のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＤＮＡ及
び配列表に配列番号１として示す塩基配列中の２２２番
目の塩基から３０３番目までの塩基で示されるＤＮＡ、
または配列表に配列番号３として示されるアミノ酸配列
からなるシグナルペプチドをコードするＤＮＡ。上記Ｄ
ＮＡを含むベクターで形質転換した微生物を培養し、グ
ルコデキストラナーゼ活性を有するポリペプチドを採取
するグルコデキストラナーゼ活性を有するポリペプチド
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルコデキストラ
ナーゼ遺伝子情報を担うＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ
新規プラスミド、グルコデキストラナーゼ活性を有する
ポリペプチド、ポリペプチドの分泌に用いられるシグナ
ルペプチド、及び該プラスミドを保有する微生物を用い
る蛋白質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコデキストラナーゼ（EC 3.2.1.70,
1,6-α-Glucan glucohydrolase）は、１９７４年沢井
らによってアルスロバクター・グロビホルミスＩ４２株
（Arthrobacter globiformis I42）の培養液中に初めて
発見されたものであって、デキストラン等からグルコー
スを効率よく生産する酵素である。本酵素はアルスロバ
クター・グロビホルミスＩ４２株（Arthrobacter globi
formis I42）以外にも、同じアルスロバクター・グロビ
ホルミスＴ−３０４４株（Arthrobacter globiformis T
-3044）からも見出されているが、両者は酵素化学的諸
性質に違いが認められる。特にアルスロバクター・グロ
ビホルミスＩ４２株（Arthrobacter globiformis I42）
由来のグルコデキストラナーゼは、デキストランを分解
する活性に対して、可溶性澱粉を分解する活性が約１０
０分の１であるのに対して、アルスロバクター・グロビ
ホルミスＴ−３０４４株（Arthrobacter globiformis T
-3044）由来のグルコデキストラナーゼの場合には約７
分の１である。また、アルスロバクター・グロビホルミ
スＩ４２株（Arthrobacter globiformis I42）由来のグ
ルコデキストラナーゼは、ニゲロース分解活性がほとん
どないのに対して、アルスロバクター・グロビホルミス
Ｔ−３０４４株（Arthrobacter globiformis T-3044）
由来のグルコデキストラナーゼの場合にはマルトースと
同等の分解性を有する。

【０００３】本酵素を高濃度のグルコースに作用させる
と、大量のイソマルトオリゴ糖を生成すること（特許第
２７９８９２０号参照）が報告されているが、この反応
では本酵素の有する縮合反応を利用している。縮合反応
によりイソマルトオリゴ糖を生成させるためには、グル
コースをα-1,6-グルコシド結合でつなげていかなけれ
ばならず、α-1,6-グルコシド結合に対する高い特異性
が要求される。上記のアルスロバクター・グロビホルミ
スＩ４２株（Arthrobacter globiformis I42）由来のグ
ルコデキストラナーゼとアルスロバクター・グロビホル
ミスＴ−３０４４株（Arthrobacter globiformis T-304
4）由来のグルコデキストラナーゼでは、アルスロバク
ター・グロビホルミスＩ４２株（Arthrobacter globifo
rmis I42）由来のグルコデキストラナーゼの方がα-1,6
-グルコシド結合に対する特異性が高く、上記方法によ
るイソマルトオリゴ糖の製造には向いている。イソマル
トオリゴ糖は、抗う蝕性を有すること（特開昭５８−７
６０６３号参照）、及びヒトの腸内有用細菌であるビフ
ィズス菌の増殖効果を有すること（特開昭６１−２２７
７７号参照）などが報告され、イソマルトオリゴ糖の利
用は食品分野を中心に拡大している。

【０００４】本酵素を高濃度のグルコースに作用させ、
大量のイソマルトオリゴ糖を生成する（特許第２７９８
９２０号参照）方法では、多量のグルコデキストラナー
ゼが必要である。グルコデキストラナーゼ遺伝子は、既
にアルスロバクター・グロビホルミスＴ−３０４４株
（Arthrobacter globiformis T-3044）由来の遺伝子が
取得されているが（特開平１０−７０９８１）、上記に
示したようにα-1,6-グルコシド結合に対する特異性が
低く、特許第２７９８９２０号によるイソマルトオリゴ
糖の製造には適さなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】α-1,6-グルコシド結
合に特異性の強いグルコデキストラナーゼの必要性は非
常に高いものの、このような性質を有するグルコデキス
トラナーゼは、アルスロバクター・グロビホルミスＩ４
２株（Arthrobacter globiformis I42）の培養液中に少
量含まれることが知られているだけで、多量に生産する
方法は知られていない。

【０００６】そこで、本発明の第１の目的は、α-1,6-
グルコシド結合に特異性の強いグルコデキストラナーゼ
を遺伝子工学的に多量に生産するために、α-1,6-グル
コシド結合に特異性の強いグルコデキストラナーゼ活性
を有するポリペプチドのアミノ酸配列及びポリペプチド
の分泌に用いられるシグナルペプチド配列を明らかに
し、それらをコードするＤＮＡを提供することにある。
さらに本発明の第２の目的は、上記ＤＮＡを用いてα-
1,6-グルコシド結合に特異性の強いグルコデキストラナ
ーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法を提供す
ることにある。

【０００７】本発明者らは、上記の目的を達成するた
め、α-1,6-グルコシド結合に特異性の強いグルコデキ
ストラナーゼ生産菌よりα-1,6-グルコシド結合に特異
性の強いグルコデキストラナーゼ遺伝子をクローン化し
た後、ＤＮＡ全塩基配列を決定し、そこにコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を解読した。さらに、該遺
伝子を種々にベクターに組み込んで宿主微生物に導入
し、得られた組換え体微生物にα-1,6-グルコシド結合
に特異性の強いグルコデキストラナーゼを生産させるこ
とに成功し、本発明を完成した。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表に配列
番号１として示す塩基配列中の304番目の塩基から3363
番目までの塩基で示されるグルコデキストラナーゼ遺伝
子に関する。さらに本発明は、配列表に配列番号２とし
て示すアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から1020番目
のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＤＮＡに関
する。また、本発明は、配列表に配列番号１として示す
塩基配列中の２２２番目の塩基から３０３番目までの塩
基で示されるＤＮＡ、または配列表に配列番号３として
示されるアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡに関する。本発明の別の態様は、配列表に
配列番号１として示す塩基配列中の304番目の塩基から3
363番目までの塩基で示されるグルコデキストラナーゼ
遺伝子又は配列表に配列番号２として示すアミノ酸配列
中の1番目のアミノ酸から1020番目のアミノ酸からなる
タンパク質をコードするＤＮＡの、及び配列表に配列番
号１として示す塩基配列中の２２２番目の塩基から３０
３番目までの塩基で示されるＤＮＡ、または配列表に配
列番号３として示されるアミノ酸配列からなるシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換
した微生物を培養し、グルコデキストラナーゼ活性を有
するポリペプチドを採取することを特徴とするグルコデ
キストラナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に
関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に、発明を具体的に説明す
る。配列表に示した配列番号１の塩基配列について説明
する。配列番号１の塩基配列は、配列の長さが３４９５
であり、配列の型が核酸であり、鎖の数が二本鎖であ
り、トポロジーが直鎖状であり、配列の種類がゲノミッ
ク（Genomic）DNAである。このＤＮＡの起源は、アルス
ロバクター・グロビホルミスＩ４２株（Arthrobacter g
lobiformis I42）である。配列番号１のＤＮＡ中、３０
４番目の塩基から３３６３番目までの塩基が、本発明の
グルコデキストラナーゼ遺伝子である。さらに２２２か
ら３０３までが、本発明のシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡである。このシグナルペプチドは、グルコデキ
ストラナーゼ活性を有するポリペプチドが菌体外に分泌
される際に用いられる。

【００１０】配列表に示した配列番号２にはアミノ酸配
列が記載され、1番目のアミノ酸から1020番目のアミノ
酸配列はグルコデキストラナーゼのポリペプチドをコー
ドしている。本発明は、前記配列番号１に示されたグル
コデキストラナーゼ遺伝子以外に、配列番号２に記載の
アミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも
包含する。

【００１１】配列表に示した配列番号３にはアミノ酸配
列が記載され、このアミノ酸配列はグルコデキストラナ
ーゼ活性を有するポリペプチドが菌体外に分泌される際
に用いられるシグナルペプチドのものである。本発明で
は、配列番号１のＤＮＡ中の２２２から３０３までのＤ
ＮＡを包含する。このＤＮＡは、配列番号３に記載のア
ミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする。さ
らに、本発明は、配列番号１のＤＮＡ中の２２２から３
０３までのＤＮＡ以外のＤＮＡであって、配列番号３と
して示されるアミノ酸配列からなるシグナルペプチドを
コードするＤＮＡも包含する。

【００１２】本発明のグルコデキストラナーゼ遺伝子の
クローン化は、具体的には実施例において詳細に説明す
るが、以下概略を説明する。グルコデキストラナーゼ生
産能を有する供与体微生物のＤＮＡは、供与体微生物を
培養し、得られる培養物を遠心分離して菌体を集菌し、
次いでこれを溶菌する事により調製することができる。
溶菌方法は、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処
理や超音波処理などが用いられる。また、必要によりプ
ロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの他の酵素剤やラウ
リル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用される。ま
た凍結融解処理を施すこともある。このようにして得ら
れる溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従っ
て、例えばフェノール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ
処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分
離などの方法を適宜組み合わせることによって行うこと
ができる。

【００１３】ＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処
理、制限酵素処理などにより行うことができる。切断
後、必要に応じてフォスファターゼやＤＮＡポリメラー
ゼ等の修飾酵素が用いられる。また種々のリンカーやア
ダプターを用いることによりＤＮＡ断片末端の塩基配列
を変えることができる。切断されたＤＮＡ断片から、食
塩密度勾配遠心法、蔗糖密度勾配遠心法や電気泳動した
ゲルからの抽出等によって最適な長さの断片のみが得ら
れる。得られたＤＮＡ断片は、常法により、例えばＤＮ
Ａリガーゼ等を用いて、宿主微生物中で自律的に増殖し
得るファージまたはプラスミドベクターに挿入して組換
えＤＮＡを得る。

【００１４】組替えＤＮＡが導入された形質転換微生物
の選択は、形質転換微生物を培養し、グルコデキストラ
ナーゼの精製標品の部分アミノ酸配列をもとに推定して
合成したプローブとを、コロニーハイブリダイゼーショ
ンにより行うことができる。得られた形質転換微生物を
培養し、公知の方法、例えばアルカリ抽出法［Birnboi
m, H. C. and Doly, J., Nucleic Asids Res., 7, 1513
(1979)］によってプラスミドを得ることができる。
ＤＮＡ塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法
［Maxam, A. M. and Gilbert, W., Methods in Enzymol
ogy, 65, 499 (1980)］やジデオキシヌクレオチド鎖修
飾法［Messing, J. and Vieira, J., Gene,19, 269 (19
82)］等により決定することができる。またポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、塩基配列より解読することができ
る。同様に、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナ
ルペ配列のアミノ酸配列も同様にして決定する。

【００１５】次に、本発明の前記グルコデキストラナー
ゼ遺伝子及びシグナルペプチドのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを用いる、グルコデキストラナーゼ活性を有
するポリペプチドの製造方法について説明する。配列表
に配列番号１として示す塩基配列中の304番目の塩基か
ら3363番目までの塩基で示されるグルコデキストラナー
ゼ遺伝子又は配列表に配列番号２として示すアミノ酸配
列中の1番目のアミノ酸から1020番目のアミノ酸からな
るタンパク質をコードするＤＮＡの、及び配列表に配列
番号１として示す塩基配列中の２２２番目の塩基から３
０３番目までの塩基で示されるＤＮＡ、または配列表に
配列番号３として示されるアミノ酸配列からなるシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターからなる
組換えＤＮＡを調製する。該組換えＤＮＡは、上記遺伝
子及びシグナル配列のＤＮＡを、宿主微生物で自律的に
増殖し得るファージベクター又はプラスミドベクターに
挿入することにより形成することができる。前記組換え
ＤＮＡの作成は、常法により、ＤＮＡ断片とベクター断
片とをＤＮＡリアーゼの作用により結合させることによ
り行なうことができる。

【００１６】宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ
ベクターとしては、例えば大腸菌を宿主微生物としてλ
ＥＭＢＬ３などを挙げることができる。また、プラスミ
ドベクターとしては大腸菌を宿主微生物としてｐＵＣ１
１８などを挙げることができる。また、枯草菌を宿主微
生物としてｐＵＢ１１２などを挙げることができる。さ
らに、プロモーターを有する発現プラスミドベクターと
しては、例えば大腸菌を宿主微生物としてｐＫＫ２３３
−２などを挙げることができる。次いで、得られた組換
えＤＮＡを用いて、微生物を形質転換する。宿主として
用いる微生物は、組換えＤＮＡが安定、かつ自律的増殖
が可能でその形質が発現できるものであればよく、前記
の微生物を例として挙げることができる。宿主微生物に
組換えＤＮＡを導入する方法は、公知の方法、例えば宿
主微生物として大腸菌を用い、かつベクターとしてプラ
スミドベクターを用いる場合、カルシウム法［Leberber
g,E. M. and Cohen, S. N., J. Bacteriol., 199, 1072
(1974)］などまたはその変法を採用することができ
る。例えば、ベクターとしてλファージＤＮＡを用いる
場合は、インビトロ・パッケイジング法［Horn, B., Me
thods in Enzymology,68, 299 (1979)］によりλファー
ジ粒子を大腸菌の培養菌懸濁液に添加して、グルコデキ
ストラナーゼ生産能を有する特殊形質導入ファージを得
ることができる。

【００１７】本発明では、上記のようにして得られた形
質転換体を培養し、培養後に培養液からグルコデキスト
ラナーゼ活性を有するポリペプチドを採取する。培養の
条件は、宿主微生物の種類に応じて、適宜決定すること
ができる。例えば宿主微生物が大腸菌の場合、培養液と
して例えばＹＴ培地を用い、培養温度３７℃で、培養時
間を約５〜２４時間とすることができる。また、宿主微
生物が枯草菌の場合、培養液としてＬ培地を用い、培養
温度３０〜３７℃で、培養時間を約１２〜３６時間とす
ることができる。培養後の培養液からのグルコデキスト
ラナーゼ活性を有するポリペプチドの採取は、常法によ
り行なうことができる。例えば、遠心分離等により菌体
を集菌し、フレンチプレス等で細胞破砕後、細胞残査を
遠心分離等により取り除くことにより、グルコデキスト
ラナーゼ活性を有するポリペプチドを採取することがで
きる。採取されたグルコデキストラナーゼ活性を有する
ポリペプチドは、例えば、岡田らの方法[Okada, G., Un
no, T., and Sawai, T., Agric. Biol. Chem., 52, 217
7 (1988)]により精製することができる。さらに精製す
る場合には、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎
水クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等によ
り精製することもできる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００１９】実施例１ （１）使用菌株及びプラスミド アルスロバクター・グロビフォルミス I42株（Arthroba
cter globiformis I42株）をグルコデキストラナーゼ遺
伝子供与体として用いた。この菌株は、東京大学応用微
生物研究所（東京都文京区弥生１−１−１）に寄託番号
IAM12102 として寄託されており、また、Northern Reg
ional Research Center, Peoria, Ill.,U. S. A. に寄
託番号NRRL B-4427として寄託されている。さらに、工
業技術院生命工学工業研究所に寄託番号 FERM P-15806
として寄託されている。大腸菌 XL1-Blue MRA 並びにλ
EMBL3 ファージベクターを遺伝子ライブラリー作成のた
めの宿主ーベクター系として用いた。

【００２０】（２）培地及び培養条件 アルスロバクター・グロビフォルミス I42株は沢井ら
[Sawai, T., Yamaki, T. and Ohya, T., Argic. Biol.
Chem.,40, 1293 (1976)] によって記載されている条件
に従った。また、大腸菌群はSambrookら [Sambrook,
J., Fritsch, E. F.and Maniatis, T., MolecularCloni
ng: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Habor
Laboratory (1989)]によって記載されている条件に従
った。

【００２１】（３）グルコデキストラナーゼの部分アミ
ノ酸配列の決定 グルコデキストラナーゼの精製は岡田ら [Okada, G., U
nno, T. and Sawai, T.,Agric. Biol. Chem., 52, 2177
(1988)] の方法に準じて行い、精製酵素表品を得た。
精製酵素タンパク質とリジルエンドペプチダーゼをモル
比 100:1で 4 M尿素を含む 0.02 M トリスー塩酸緩衝液
(pH 9.0) 中で 30℃, 24時間反応し、逆相 HPLC によ
り分画した。分画したペプチドのアミノ酸分析を行い、
以下の表１に示す１２種の部分アミノ酸配列を決定し
た。これらの配列は配列表に配列番号４〜１５として記
載した。

【００２２】

【表１】

【００２３】（４）グルコデキストラナーゼ遺伝子のク
ローニング まずアルスロバクター・グロビフォルミス I42株を培養
し、培養液から遠心分離によって菌体を回収し、クロモ
ゾームDNA を Murray らの変法 [Murray, M. G. and Th
ompson, W. F., Nucl. Acid Res.,8, 4321 (1980)]によ
り調製した。この DNAを制限酵素 Sau3AI、0.2 U にて
各 50mg ずつ 45, 60 及び 90 分間部分分解した後、食
塩密度勾配遠心（食塩濃度 5-25%, 37,000 rpm, 4.5
h）にかけ9-20 kbの DNA断片からなる画分を得た。この
DNA断片 1.5μg とλEMBL3（BamHI アーム）ファージ
DNA 1.0μg を用いてライゲーション反応を行い、Gigap
ackIII Gold （STRATAGENE社製）を用いてインビトロ・
パッケージングを行い遺伝子ライブラリーを作成した。

【００２４】（５）プローブ DNAの作成 （３）で得られた部分アミノ酸配列をもとに、27残基の
センスプライマー及び32残基のアンチセンスプライマー
を合成し（アプライド・バイオシステム）、アルスロバ
クター・グロビフォルミス I42株のゲノムDNA を鋳型に
して、LAPCRキット（宝酒造社製）を用いた PCR法によ
りグルコデキストラナーゼ遺伝子の一部を増幅させた。
増幅された約 1.4 kb の DNA断片を含んだ反応液を 1.0
% アガロースゲル電気泳動操作に供し、目的の DNA断片
をゲルから常法に従って抽出し、エタノール沈殿処理
後、TE [(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)]緩衝液
に溶解した。この断片を pBluescript SKII （STRATAGE
NE社）に挿入し、常法に従い塩基配列を決定し、PCR 増
幅断片がグルコデキストラナーゼ遺伝子の一部をコード
することを確認した。この増幅断片を制限酵素 PvuIIで
完全分解し、760 bpの DNA断片を常法に従い抽出し、TE
緩衝液に溶解した。該 DNA溶液を DIGDNA ラベリング &
ディテクションキット（ベーリンガー社製）を用いてラ
ベルし、プローブ DNAを作成した。

【００２５】（６）グルコデキストラナーゼ遺伝子の検
索 （４）で得られた遺伝子ライブラリーからのスクリーニ
ングを（５）で得られたプローブ DNAを用いて、プラー
クハイブリダイゼーション法により行った。陽性を示し
たファージプラークを単離し、常法に従い組換えファー
ジ DNAを調製した。（５）で得た PCR増幅断片並びに陽
性組換えファージ DNAの制限酵素地図をもとに、約3.5
kbの BamHI断片及びこれと重なる約 1.2 kb の SalI 断
片を組換えファージDNA より単離し、pBluescript SKII
の BamHI部位あるいは SalI 部位に挿入した。それぞれ
を pGD1 及び pGD2 プラスミドと命名した。

【００２６】（７）グルコデキストラナーゼ遺伝子の塩
基配列の決定 グルコデキストラナーゼ遺伝子の塩基配列の決定は、
（６）で得た pGD1 及びpGD2プラスミドの各種制限酵素
消化断片の解析より行った。その結果（DNA 塩基配列）
を、配列番号１に、また、配列番号１に示されるDNA 塩
基配列により類推されるポリペプチドのアミノ酸配列を
配列番号２に示す。

【００２７】実施例２ グルコデキストラナーゼ活性を有するポリペプチドの N
末端アミノ酸配列の決定アルスロバクター・グロビフォ
ルミス I42株を岡田らの方法[Okada, G., Unno,T. and
Sawai, T., Agric. Biol. Chem., 52, 2177 (1988)の方
法]に準じて培養し、その培養液よりグルコデキストラ
ナーゼを精製し、電気泳動的に単一バンドを示すポリペ
プチドを得ることができた。ポリペプチドの N末端アミ
ノ酸配列の決定は、気相式ペプチドシーケンサー（アプ
ライド・バイオシステム）によって行った。この結果か
ら配列番号２中のグルコデキストラナーゼ活性を有する
ポリペプチドの N末端側に続くポリペプチドは、ポリペ
プチドの分泌に関わるシグナル配列であることが判明し
た。このポリペプチドの分泌に関わるシグナル配列を配
列番号３に示す。

【００２８】実施例３ グルコデキストラナーゼ遺伝子の発現 グルコデキストラナーゼ遺伝子を大腸菌中で発現させる
ために、グルコデキストラナーゼ遺伝子全長を含むプラ
スミドを作成した。具体的には、pGD1プラスミドをBamH
I および KpnI で消化して得た約 3.1 kb の DNA断片
と、pGD2プラスミドをKpnI及び SalI で消化して得た約
1 kb の DNA断片を同時に、pBluscript SKII のBamHI
及び SalI 部位に挿入して、図１に制限酵素地図を示す
pGD3プラスミドを得た。プラスミド pGD3 を用いて大腸
菌 JM109を形質転換し、この形質転換株を 20mLの YT
培地で 30℃, 24時間培養を行った。培養後、遠心分離
によって集菌し、抽出用緩衝液 [20 mM tric-HCl (pH
7.5), 10 mM 2-mercaptoethanol, 5% glycerol,0.15% T
riton X-100] で洗浄し、同緩衝液 4 mL に懸濁した。
これを超音波破砕機に供し細胞破砕後、細胞残査を遠心
分離により取り除き、上清のグルコデキストラナーゼ活
性を測定したところ、粗酵素液中のグルコデキストラナ
ーゼ活性は 0.05unit/mLであった。なお、比較のために
グルコデキストラナーゼ遺伝子を含まないプラスミド D
NAを有する大腸菌を用いて、上記と同様の処理を行って
得た細胞抽出液中のグルコデキストラナーゼ活性を測定
した結果、活性は検出されなかった。

【００２９】実施例４ 実施例３で得られたグルコデキストラナーゼ活性を含む
上清を、岡田ら[Okada,G., Unno, T. and Sawai, T., A
gric. Biol. Chem., 52, 2177 (1988)]の方法に準じて
精製を行ない、精製酵素標品を得た。この精製酵素標品
のグルコデキストラナーゼ活性とグルコアミラーゼ活性
の比を岡田ら[Okada, G. and Unno, T., Agric. Biol.
Chem., 53, 223 (1989)]の方法に準じて測定した。その
結果、グルコデキストラナーゼ活性に対するグルコアミ
ラーゼ活性は１００分の１であり、これはアルスロバク
ター・グロビフォルミス I42株（Arthrobacter globif
ormis I42株）を岡田ら[Okada, G., Unno, T. and Sawa
i, T., Agric. Biol. Chem.,52, 2177 (1988)]の方法に
準じて培養して得られた精製酵素標品と同一の結果であ
った。

【００３０】

【発明の効果】本発明により、グルコデキストラナーゼ
活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、ポリペプチ
ドの分泌に必要なシグナル配列およびそれらをコードす
る遺伝子の塩基配列が提供される。さらに、本発明のグ
ルコデキストラナーゼ遺伝子をベクターに組み込んで宿
主微生物に導入し、この組換え体微生物が安定的にグル
コデキストラナーゼ活性を有することで、ポリペプチド
を生産することができる。得られたグルコデキストラナ
ーゼ活性を有するポリペプチドは、グルコデキストラナ
ーゼ活性を有するポリペプチドを安定的に供給し、さら
に供給量の増大を可能にするので、イソマルトオリゴ糖
の製造に極めて有利である。

【００３１】

【配列表】 <110>日本食品化工株式会社 Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. <120>グルコデキストラナーゼ遺伝子及びグルコデキストラナーゼ活性を有する ポリペプチドの製造方法 <130>99516H <160>15 <210>1 <211>3710 <212>DNA <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>１ ctgcagcacg gcttccgcgg tgatccgccg cagacgggag cggtggcggc cgttcgcttc 60 ggcgacatac tttccgtacc ccttgacgtc cggacaaatg ctctcccata ctagctggca 120 gcggtttatt aaagctatta ataaaccctg tccaaggttt ggctcagaag tttctggggt 180 tctctggccg gacaaatttc cgcactcaca ccgaggagag ca atg aag caa cgc 234 ctc aaa tcc gcc tgc agt gcc acc gcc ctg gcg ctg cgt ttc ggc gct ggg 285 cct gag ccc gcc gtc gcg gaa aca gcc gag ccg ccc ggt tcg ccc gga gcc 336 gcc gct acc tgg acc aag ggg gac aag gag ggg gtc ggc acg tcc ctc aac 387 ccc gcc tcc aag gtc tgg tac acc ctg acc gaa ggc acc atg agc gag gtc 438 tac tac cct cat gcc gat acc ccc aat acg cgg gag ctg cag ttc gcc gtc 489 agt gac gca cca gcg ccc cag cgc gag agt gag cag acc acc cgc acc gtt 540 gaa ctg gcc gat ccg aaa gcc ctc agc tac cgc cag acc acc acg gac aac 591 gcc ggc cgc tgg cgg ctc acc aag acc tac gtc acc gac ccc cgg cgc tcc 642 acc gtg atg ctg ggc gtc acg ttc gaa gtg ctc gac ggc ggc gac tac cag 693 ctg ttc gtc ctc tcg gac ccg tcg ctg gcc ggg acc tcc ggc ggc gac acc 744 ggc agc gtg acc gac ggc gcc ctc ctc gcc tcc gat ctc gcc gac gca gcc 795 acc ccc gtt gcc acc gcg ctc gtt tcc tcc gtg gga ttc ggc gcc gtc gcc 846 aac ggc tac gtg gga acc agc gac ggg tgg acc gac ctc gcc gcg gac ggc 897 cgg ctg gac aac gcg tcc gcc acc gcc ggc ccc ggc aac atc tcc cag acc 948 ggc cag att ccg ctg gca gca ggc ggg aag acc gag ttc tcg ctc gcc ctc 999 ggc ttc ggt gcg gac acg gcc gaa gca ctc gcc acc gcc aag gcg agc ctc 1050 ggc acc ggc tac aag aag gtg agc aaa agc tac acg ggg gag tgg aag aag 1101 tat ctg aac tcc ctt gac gcg ccc gcc acg tcg ctc aca ggc gca ctg cga 1152 acg cag tac gac gtt tcc ctc atg acc gtg aag tcc cac gag gac aag acc 1203 ttc ccc ggc gcc ttc atc gcc tcg ctg acc atc ccg tgg ggc cag gcg gcc 1254 agt gcc gag acc cac cgc gag ggt tac cac gcc gtc tgg gcg cgg gac atg 1305 tac cag tcg gtc act gcc ctc ctt gct gcc ggc gat gag gag gct gca gcc 1356 cgc ggc gtc gaa tgg ctg ttc aca tac cag cag cag ccg gac ggg cac ttc 1407 ccg cag acc tca cgt gtg gac ggc acg atc ggc cag aac ggc atc cag ctg 1458 gac gaa acg gcg ttc ccc atc ctg ctg gcc aac cag atc ggc cgc acc gac 1509 gcc ggc ttc tac cgg aac gag ctc aag ccc gca gcc gac tat ctc gtt gcg 1560 gcc ggt ccc aag acg ccg cag gaa cgc tgg gag gag acc ggc ggc tac tcg 1611 acg tcc acg ctg gcc tcc cag atc gca gca ctc gcc gcg gcg gcg gac att 1662 gcc gga aag aac ggc gac gcc ggc tcc gcc gcc gtt tac cgc gcc acc gcc 1713 gac gag tgg cag cgc agc acc gaa aag tgg atg ttc acc acg aac ggc ccg 1764 gtg gga gac ggc aag tat tac ctg cgc atc agc gcc acc ggc aac ccg aac 1815 gac ggc gcc acc cgg gac tgg ggg aac ggc gcc gga gtg cac cct gag aat 1866 gcc gtc ctg gac ggc gga ttc ctg gaa ttt gtc cgg ctc ggc gtc aag gca 1917 ccg gcg gac ccc tac gtt gcg gac tct ttg gcc gag acc gac gcc tcg att 1968 tcc cag gaa acc ccc ggc ggc cgc atg tgg cac cgg tac acc tac gac ggc 2019 tat ggc gaa aag gcc gac ggc tcg ccc tgg gac ggc acg ggc atc ggc cgt 2070 ctt tgg ccc ctc ctc agc ggt gaa cgc ggc gag tac gcg ctc gcc aac ggc 2121 cag gac gca ctg ccg tac ctg gag acc atg cac tcc gcg gcc aac gcc ggc 2172 tac atg atc ccc gag cag gtc tgg gac cgg gac gag ccc acc tcc tac ggc 2223 cac gag ctg ggc cgc agc acc gga tcg gcg tcg ccg ctc tcc tgg gcc atg 2274 gcc cag tac gtc cgc ctg gcc gcc ggc gtg aag gcc ggc gcc ccc gtg gaa 2325 acg cca cag aac gtt gcc gcc cgc tac gcc gcc gga aca ccg ctc tcg agc 2376 ccg gaa ctc tcc gtc acc gca ccg gag gcg ctg tcg acg gcg gac tcg gcc 2427 acc gcc gtc gtc cgc gga acc acg aac gcc gcg aag gtg tac gtg tcc gtg 2478 aac ggg act gcc acg gaa gcg cca gta act gac gga acg ttc agc ctc gac 2529 gtc gcg ctc acc ggc gcg aag aac aaa gtc acg gtc gca gcc gtc gcc gca 2580 gac ggc ggc acg gcc gtc gag gac cgc acg gtc ctc tac tac ggc agc cgg 2631 atc ggg gcc ctt agc gac cct gcg ggc gac gac aac ggc ccc gga acc tac 2682 agg tac ccg acc aac agc gca tac gtt cct ggc gcc ttt gac ctg acc gga 2733 gtg gac gtc tac gac gcc ggc gat gac tac gcc ttc gtc gcc acc atc gcc 2784 ggc gaa gtg acc aac ccc tgg ggc ggc cag gcg atc tcg cac cag cgc gtc 2835 aat atc tac ctg ggc aag ggc gag ggc ggg gcc acc ccg gga ctg ccc ggc 2886 acc aac atc aac ctg gag cat gcg tgg gat tcg gtg atc gtc acg gac ggc 2937 cgg ttc gac ggc gcc ggc gtg tac gca ccg gac ggc acc cgc acc tcc gcg 2988 gtc tcg ctc ctg gct gtc ccg gag gcg cgg cag atc gtc acc cgc gtg ccc 3039 aag gcg gcc ctc ggc ggg ctg gat ccc gcg acg gcc cgg atg tcc gtg gcc 3090 atg ttc ggc aac gcg acg tcc ggc gag gga atc ggc aac gtg cgg ccc gtc 3141 tat gac ggc gcc tac tgg gaa gcc ggc gac ccg gcc tgg atc aag gaa tgg 3192 cgc ttc ggc ggc gga cgg ggt gtc ttc gac ggc act atc ccg tcc cgg gac 3243 acg gac acc gac gac ccc aat gcc ctg gac gtc ctc gtc ggc gaa ggc cag 3294 acg cag gca gcc gtg ctg gac tgg cgc gcg ggc tcg ccc gtg gtg gtg ccg 3345 atg ctg ggc ctc cag ccg taa ctgc ggttccggca acgcactctc tggcagcggc 3400 ataagaataa cggcgaccgc ctttccgggc gggtgccggc gtggctgtgg gcggggattg 3460 acccggcaac cttcccggac aagactttca ctgggcccgc agcccctacg ccgccgaccg 3520 ggaggaacca gccatgacca tcgaggaaac cgaggaagaa gcaacctacc gggccggcag 3580 ggaatggttc aagagtgccg tcgtgtacca gatctacccc cgcacgttcg ccgattccga 3640 cggtgacggc gtgggcgacc tccgcgggat catcggcaag ctggactacc ttcagaagct 3700 gggcgtcgac 3710 <210>2 <211>1047 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>2 Met Lys Gln Arg Leu Lys Ser Ala Cys Ser Ala Thr Ala Leu Ala Leu -25 -20 -15 Arg Phe Gly Ala Gly Pro Glu Pro Ala Val Ala Glu Thr Ala Glu Pro -10 -5 1 5 Pro Gly Ser Pro Gly Ala Ala Ala Thr Trp Thr Lys Gly Asp Lys Glu 10 15 20 Gly Val Gly Thr Ser Leu Asn Pro Ala Ser Lys Val Trp Tyr Thr Leu 25 30 35 Thr Glu Gly Thr Met Ser Glu Val Tyr Tyr Pro His Ala Asp Thr Pro 40 45 50 Asn Thr Arg Glu Leu Gln Phe Ala Val Ser Asp Ala Pro Ala Pro Gln 55 60 65 Arg Glu Ser Glu Gln Thr Thr Arg Thr Val Glu Leu Ala Asp Pro Lys 70 75 80 85 Ala Leu Ser Tyr Arg Gln Thr Thr Thr Asp Asn Ala Gly Arg Trp Arg 90 95 100 Leu Thr Lys Thr Tyr Val Thr Asp Pro Arg Arg Ser Thr Val Met Leu 105 110 115 Gly Val Thr Phe Glu Val Leu Asp Gly Gly Asp Tyr Gln Leu Phe Val 120 125 130 Leu Ser Asp Pro Ser Leu Ala Gly Thr Ser Gly Gly Asp Thr Gly Ser 135 140 145 Val Thr Asp Gly Ala Leu Leu Ala Ser Asp Leu Ala Asp Ala Ala Thr 150 155 160 165 Pro Val Ala Thr Ala Leu Val Ser Ser Val Gly Phe Gly Ala Val Ala 170 175 180 Asn Gly Tyr Val Gly Thr Ser Asp Gly Trp Thr Asp Leu Ala Ala Asp 185 190 195 Gly Arg Leu Asp Asn Ala Ser Ala Thr Ala Gly Pro Gly Asn Ile Ser 200 205 210 Gln Thr Gly Gln Ile Pro Leu Ala Ala Gly Gly Lys Thr Glu Phe Ser 215 220 225 Leu Ala Leu Gly Phe Gly Ala Asp Thr Ala Glu Ala Leu Ala Thr Ala 230 235 240 245 Lys Ala Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Lys Lys Val Ser Lys Ser Tyr Thr 250 255 260 Gly Glu Trp Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Ala Pro Ala Thr Ser 265 270 275 Leu Thr Gly Ala Leu Arg Thr Gln Tyr Asp Val Ser Leu Met Thr Val 280 285 290 Lys Ser His Glu Asp Lys Thr Phe Pro Gly Ala Phe Ile Ala Ser Leu 295 300 305 Thr Ile Pro Trp Gly Gln Ala Ala Ser Ala Glu Thr His Arg Glu Gly 310 315 320 325 Tyr His Ala Val Trp Ala Arg Asp Met Tyr Gln Ser Val Thr Ala Leu 330 335 340 Leu Ala Ala Gly Asp Glu Glu Ala Ala Ala Arg Gly Val Glu Trp Leu 345 350 355 Phe Thr Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly His Phe Pro Gln Thr Ser Arg 360 365 370 Val Asp Gly Thr Ile Gly Gln Asn Gly Ile Gln Leu Asp Glu Thr Ala 375 380 385 Phe Pro Ile Leu Leu Ala Asn Gln Ile Gly Arg Thr Asp Ala Gly Phe 390 395 400 405 Tyr Arg Asn Glu Leu Lys Pro Ala Ala Asp Tyr Leu Val Ala Ala Gly 410 415 420 Pro Lys Thr Pro Gln Glu Arg Trp Glu Glu Thr Gly Gly Tyr Ser Thr 425 430 435 Ser Thr Leu Ala Ser Gln Ile Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Asp Ile 440 445 450 Ala Gly Lys Asn Gly Asp Ala Gly Ser Ala Ala Val Tyr Arg Ala Thr 455 460 465 Ala Asp Glu Trp Gln Arg Ser Thr Glu Lys Trp Met Phe Thr Thr Asn 470 475 480 485 Gly Pro Val Gly Asp Gly Lys Tyr Tyr Leu Arg Ile Ser Ala Thr Gly 490 495 500 Asn Pro Asn Asp Gly Ala Thr Arg Asp Trp Gly Asn Gly Ala Gly Val 505 510 515 His Pro Glu Asn Ala Val Leu Asp Gly Gly Phe Leu Glu Phe Val Arg 520 525 530 Leu Gly Val Lys Ala Pro Ala Asp Pro Tyr Val Ala Asp Ser Leu Ala 535 540 545 Glu Thr Asp Ala Ser Ile Ser Gln Glu Thr Pro Gly Gly Arg Met Trp 550 555 560 565 His Arg Tyr Thr Tyr Asp Gly Tyr Gly Glu Lys Ala Asp Gly Ser Pro 570 575 580 Trp Asp Gly Thr Gly Ile Gly Arg Leu Trp Pro Leu Leu Ser Gly Glu 585 590 595 Arg Gly Glu Tyr Ala Leu Ala Asn Gly Gln Asp Ala Leu Pro Tyr Leu 600 605 610 Glu Thr Met His Ser Ala Ala Asn Ala Gly Tyr Met Ile Pro Glu Gln 615 620 625 Val Trp Asp Arg Asp Glu Pro Thr Ser Tyr Gly His Glu Leu Gly Arg 630 635 640 645 Ser Thr Gly Ser Ala Ser Pro Leu Ser Trp Ala Met Ala Gln Tyr Val 650 655 660 Arg Leu Ala Ala Gly Val Lys Ala Gly Ala Pro Val Glu Thr Pro Gln 665 670 675 Asn Val Ala Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Pro Leu Ser Ser Pro Glu 680 685 690 Leu Ser Val Thr Ala Pro Glu Ala Leu Ser Thr Ala Asp Ser Ala Thr 695 700 705 Ala Val Val Arg Gly Thr Thr Asn Ala Ala Lys Val Tyr Val Ser Val 710 715 720 725 Asn Gly Thr Ala Thr Glu Ala Pro Val Thr Asp Gly Thr Phe Ser Leu 730 735 740 Asp Val Ala Leu Thr Gly Ala Lys Asn Lys Val Thr Val Ala Ala Val 745 750 755 Ala Ala Asp Gly Gly Thr Ala Val Glu Asp Arg Thr Val Leu Tyr Tyr 760 765 770 Gly Ser Arg Ile Gly Ala Leu Ser Asp Pro Ala Gly Asp Asp Asn Gly 775 780 785 Pro Gly Thr Tyr Arg Tyr Pro Thr Asn Ser Ala Tyr Val Pro Gly Ala 790 795 800 805 Phe Asp Leu Thr Gly Val Asp Val Tyr Asp Ala Gly Asp Asp Tyr Ala 810 815 820 Phe Val Ala Thr Ile Ala Gly Glu Val Thr Asn Pro Trp Gly Gly Gln 825 830 835 Ala Ile Ser His Gln Arg Val Asn Ile Tyr Leu Gly Lys Gly Glu Gly 840 845 850 Gly Ala Thr Pro Gly Leu Pro Gly Thr Asn Ile Asn Leu Glu His Ala 855 860 865 Trp Asp Ser Val Ile Val Thr Asp Gly Arg Phe Asp Gly Ala Gly Val 870 875 880 885 Tyr Ala Pro Asp Gly Thr Arg Thr Ser Ala Val Ser Leu Leu Ala Val 890 895 900 Pro Glu Ala Arg Gln Ile Val Thr Arg Val Pro Lys Ala Ala Leu Gly 905 910 915 Gly Leu Asp Pro Ala Thr Ala Arg Met Ser Val Ala Met Phe Gly Asn 920 925 930 Ala Thr Ser Gly Glu Gly Ile Gly Asn Val Arg Pro Val Tyr Asp Gly 935 940 945 Ala Tyr Trp Glu Ala Gly Asp Pro Ala Trp Ile Lys Glu Trp Arg Phe 950 955 960 965 Gly Gly Gly Arg Gly Val Phe Asp Gly Thr Ile Pro Ser Arg Asp Thr 970 975 980 Asp Thr Asp Asp Pro Asn Ala Leu Asp Val Leu Val Gly Glu Gly Gln 985 990 995 Thr Gln Ala Ala Val Leu Asp Trp Arg Ala Gly Ser Pro Val Val Val 1000 1005 1010 Pro Met Leu Gly Leu Gln Pro 1015 1020 <210>3 <211>27 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>３ Met Lys Gln Arg Leu Lys Ser Ala Cys Ser Ala Thr Ala Leu Ala Leu 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Gly Pro Glu Pro Ala Val Ala 20 25 <210>4 <211>8 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>４ Ala Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Lys 1 5 <210>5 <211>12 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>５ Glu Gly Val Gly Thr Ser Leu Asn Pro Ala Ser Lys 1 5 10 <210>6 <211>7 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>６ Ser Tyr Thr Gly Glu Trp Lys 1 5 <210>7 <211>17 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>７ Asp Thr Ala Glu Pro Pro Gly Ser Pro Gly Ala Ala Ala Thr Phe Thr 1 5 10 15 Lys <210>8 <211>17 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>8 Leu Ser Tyr Arg Gln Thr Thr Thr Asp Asn Ala Gly Arg Xaa Arg Leu 1 5 10 15 Thr <210>9 <211>22 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>9 Asn Gly Asp Ala Gly Ser Ala Ala Val Tyr Arg Ala Thr Ala Asp Glu 1 5 10 15 Leu Gln Arg Ser Thr Glu 20 <210>10 <211>13 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>10 Trp Met Phe Thr Thr Asn Gly Pro Val Gly Asp Gly Lys 1 5 10 <210>11 <211>18 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>11 Ala Gly Ala Pro Val Glu Thr Pro Gln Asn Val Ala Ala Arg Tyr Ala 1 5 10 15 Ala Gly <210>12 <211>27 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>12 Ala Pro Ala Asp Pro Tyr Val Ala Asp Ser Leu Ala Glu Thr Asp Val 1 5 10 15 Ser Ile Ile Gln Glu Xaa Pro Gly Gly Xaa Met 20 25 <210>13 <211>26 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>13 Val Trp Tyr Thr Leu Thr Glu Gly Thr Met Ser Glu Val Tyr Tyr Pro 1 5 10 15 His Ala Asp Thr Pro Asn Thr Glu Leu Gln 20 25 <210>14 <211>18 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>14 Thr Pro Gln Glu Ile Trp Glu Glu Thr Asn Gly Tyr Ser Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Ala <210>15 <211>13 <212>PRT <213>Arthrobacter globiformis I42 <400>15 Tyr Arg Leu Arg Glu Ser Ala Thr Gly Asn Pro Asn Asp 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図1】プラスミドpGD3の制限酵素地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 本間 守 北海道石狩郡石狩市花川北２条５丁目91− 10 (72)発明者 千葉 誠哉 北海道札幌市手稲区星置１−４−９−24 (72)発明者 岡田 嚴太郎 静岡県静岡市大谷3800−151 (72)発明者 海野 剛裕 静岡県富士市中丸703−25 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA12 CA03 DA05 EA04 4B050 CC03 DD02 LL02

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表に配列番号１として示す塩基配列
   中の304番目の塩基から3363番目までの塩基で示される
   グルコデキストラナーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表に配列番号２として示すアミノ酸
   配列中の1番目のアミノ酸から1020番目のアミノ酸から
   なるタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表に配列番号１として示す塩基配列
   中の２２２番目の塩基から３０３番目までの塩基で示さ
   れるＤＮＡ、または配列表に配列番号３として示される
   アミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするＤ
   ＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表に配列番号１として示す塩基配列
   中の304番目の塩基から3363番目までの塩基で示される
   グルコデキストラナーゼ遺伝子又は配列表に配列番号２
   として示すアミノ酸配列中の1番目のアミノ酸から1020
   番目のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ、及び配列表に配列番号１として示す塩基配列中の２
   ２２番目の塩基から３０３番目までの塩基で示されるＤ
   ＮＡ、または配列表に配列番号３として示されるアミノ
   酸配列からなるシグナルペプチドをコードするＤＮＡを
   含むベクターで形質転換した微生物を培養し、グルコデ
   キストラナーゼ活性を有するポリペプチドを採取するこ
   とを特徴とするグルコデキストラナーゼ活性を有するポ
   リペプチドの製造方法。