JP2000245466A - 変異α−アミラーゼ - Google Patents
変異α−アミラーゼInfo
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- JP2000245466A JP2000245466A JP11048213A JP4821399A JP2000245466A JP 2000245466 A JP2000245466 A JP 2000245466A JP 11048213 A JP11048213 A JP 11048213A JP 4821399 A JP4821399 A JP 4821399A JP 2000245466 A JP2000245466 A JP 2000245466A
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Abstract
向上したα−アミラーゼ、該α−アミラーゼをコードす
る遺伝子等、及び該α−アミラーゼを含有する洗浄剤組
成物、澱粉液化・糖化用組成物、繊維糊抜き剤の提供。 【解決手段】 配列番号1で示されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するア
ミノ酸配列における193位のイソロイシンに相当する
アミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に置換されたアミノ酸
配列を有する変異α−アミラーゼ;該変異α−アミラー
ゼをコードする遺伝子;該遺伝子を含有するベクタープ
ラスミド;該ベクタープラスミドで形質転換又は染色体
相同組換えされた形質転換細胞;該変異α−アミラーゼ
を含有する洗浄剤組成物。
Description
pHを有し、かつ優れた熱安定性を有し、特に洗剤用酵素
として有用な変異α−アミラーゼ及びその遺伝子並びに
該変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物等に関す
る。
は、衣料や食器等の澱粉汚れや、糊剤の除去に有効であ
ることが知られているが、洗剤においては、洗浄水がア
ルカリとなるため、アルカリ側に至適pHを有するものが
好ましい。その例として、好アルカリ性Bacillus sp. K
SM-AP1378(FERM BP-3048)の生産する、配列番号1で
示されるアミノ酸配列を有するアルカリ液化型α−アミ
ラーゼが知られており(WO94/26881)、洗浄剤用として
極めて有用である。
洗浄は、10〜50℃で行われるのが一般的であり、洗
剤に配合するα−アミラーゼは、室温〜50℃で熱安定
性に優れていることが好ましいが、上記アルカリ液化型
α−アミラーゼは、耐熱性がやや低かった。
として、特定位置のアミノ酸を欠失又は他のアミノ酸に
置換する方法があり、例えば133位のヒスチジンをチ
ロシンに置換したBacillus licheniformis由来のα−ア
ミラーゼが知られている(J.Biol. Chem., 15481-1548
8, 1990)。
列を有するα−アミラーゼでは、133位に相当する位
置にヒスチジンは存在せず、かかる方法を用いることは
できなかった。このため配列番号1で示されるアミノ酸
配列を有するα−アミラーゼの優れた特性を維持しつ
つ、耐熱性に優れたα−アミラーゼが求められていた。
く注目されなかった193位のイソロイシンに着目し
た。そして該α−アミラーゼの193位のイソロイシン
を欠失又は他のアミノ酸に置換することにより、該α−
アミラーゼの有する優れた特性を維持しながら、耐熱性
が向上することを見出した。
るアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して70%以上
の相同性を有するアミノ酸配列における193位のイソ
ロイシンに相当するアミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に
置換されたアミノ酸配列を有する変異α−アミラーゼを
提供するものである。本発明はまた、かかる変異α−ア
ミラーゼをコードする遺伝子を提供するものである。本
発明はまた、かかる遺伝子を含有する組換えベクターを
提供するものである。本発明はまた、かかる組換えベク
ターで形質転換又は染色体相同組換えされた形質転換細
胞を提供するものである。本発明はまた、かかる変異α
−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するもので
ある。
配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号1に示すア
ミノ酸配列と70%以上の相同性を有する液化型アルカ
リα−アミラーゼ(以下、「配列番号1等で示されるα
−アミラーゼ」という。)を欠失又は他のアミノ酸に置
換して得られるものである。配列番号1で示される液化
型アルカリα−アミラーゼとしては、例えば本発明者ら
が先に報告したWO94/26881記載の、Bacillus sp. KSM-A
P1378(FERM BP-3048)から得られる野生型液化型α−ア
ミラーゼが挙げられる。相同性は70%以上であること
が必要であり、80%以上が好ましく、90%以上がよ
り好ましく、95%以上が特に好ましく、99%以上が
最も好ましい。なお相同性は、Lipman-Pearson法(Scie
nce, 227, 1435(1985))により計算される。また配列番
号1に示すアミノ酸配列と70%以上の相同性を示すア
ミノ酸配列を有するα−アミラーゼとしては、例えばWO
95/26397記載のNCIB 12512、NCIB 12513由来のα−アミ
ラーゼ等がある。
のアミノ酸に置換することが好ましく、アスパラギン酸
に置換することがより好ましい。これにより耐熱性が向
上する。さらに、181位のアルギニン及び182位の
グリシンに相当するアミノ酸が欠失したものが特に好ま
しい。これにより耐熱性がさらに向上し、また通常洗剤
に含まれるキレート剤に対する耐性も向上する。
列番号1等で示されるα−アミラーゼをコードするDN
Aに部位特異的変異を導入して、変異α−アミラーゼを
コードする遺伝子を得、次いでこれを含有する組換えベ
クター、好ましくはプラスミドを作成し、該ベクターを
用いて宿主を形質転換するか、染色体相同組換えにより
形質転換体を得、これを培養することによって製造され
る。部位特異的変異の方法としては一般的に行なわれて
いる方法であればいずれも採用できるが、例えばTakara
社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan Super E
xpress Km Kit等を用いて行なうことができる。本発明
の変異α−アミラーゼをコードする遺伝子としては、例
えば配列番号2で示される塩基配列を有するものが挙げ
られる。
70%以上の相同性を有する他のアミノ酸配列を、一文
字表記で図1及び図2に示した。
ゼは、熱に対する安定性が向上し、洗浄剤組成物、澱粉
液化、糖化用組成物、繊維糊抜き剤等として有用であ
る。ここで本発明の洗浄剤組成物には、本発明変異α−
アミラーゼ以外に、さらに、枝切り酵素(例えばプルラ
ナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼなど)、α
−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、
セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナ
ーゼ、ペクチン酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカ
ーゼ及びカタラーゼからなる群より選ばれる1種以上の
酵素を配合することができる。また、洗浄剤組成物に通
常配合される界面活性剤、キレート剤、アルカリ剤、無
機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、蛍
光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性
化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活
性化剤、酵素安定化剤、調節剤等を配合することができ
る。
アミラーゼ及び上記公知の洗浄成分を配合し、常法に従
い製造できる。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択する
ことができ、例えば、液体、粉末、顆粒等にすることが
できる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、
漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、
義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗浄剤、
漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用
することができる。
た澱粉液化・糖化用組成物は、本発明の変異α−アミラ
ーゼ以外に必要に応じてさらにグルコアミラーゼ、マル
ターゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプルラナ
ーゼからなる群より選ばれる1種以上の酵素を配合して
得ることができる。該組成物を用いて常法に従い澱粉を
液化・糖化することができる。
繊維糊抜き剤は、本発明の変異α−アミラーゼ以外に、
さらに必要に応じてプルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネ
オプルラナーゼ等を配合して得ることができる。該糊抜
き剤は、常法に従い使用できる。
示す方法で測定した。アミラーゼ活性測定は、3,5−
ジニトロサリチル酸法(DNS法)で測定した。すなわ
ち、50mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.5)中に可溶性澱
粉を溶解した反応液を用い、40℃で15分間の反応を
行なった後、生成した還元糖をDNS法で定量すること
によって測定した。酵素の力価は1分間に1μmol のグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を1単位と
した。蛋白量の測定は、牛血清アルブミンを標準とし
て、Bio-Rad 社のProtein Assay Kit を用いて定量し
た。
遺伝子の調製 特開平8−336392号公報の実施例に従い、バチル
ス エスピー KSM-AP1378 株(FERM BP-3048)から、配
列番号2に示す塩基配列を有する遺伝子を調製した。
遺伝子への変異導入 Takara社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-S
uper Express Km Kitを用い、変異導入用鋳型プラスミ
ドとしてpKF19LAMYを用いた。本プラスミド
は、変異用プラスミドベクターpKF19kのSmaI部
位に、我々が独自に開発した発現プロモーター領域SP
64及びBacillus sp. KSM-AP1378 株(FERM BP-3048)
由来の配列番号2に示す塩基配列を有するα−アミラー
ゼ遺伝子(約2.1kb)を導入したものである(図3)
(Ikawa et al., Biosci.Biotech. Biochem., 62, 1720
-1725, 1998)。また、変異導入プライマーとして配列
番号3に示すものを用いた。(配列表フリーテキスト:
配列番号2の配列812〜838において、824〜8
26のata をgat に置換したものである。)配列番号3
の塩基配列は、アニールする対象の鋳型配列の193位
のイソロイシンをコードするATAの位置を、ATAか
らGATへ入れ替えたものであり、これを用いて、イソ
ロイシンをアスパラギン酸に置換した。これをI193
Dと略記する。次いで、配列番号4に示す塩基配列を有
する変異導入プライマーを用いて、181位のアルギニ
ン及び182位のグリシンをコードするAGA及びGG
Tを欠失させ、これにより両アミノ酸が欠失した変異α
−アミラーゼが得られた(RG+I193D)。(配列表フリー
テキスト:配列番号2の配列773〜814において、
788〜793のaga ggt を欠失させたものである。) 尚、得られた変異体は塩基配列解析を行なって変異を確
認した。次いで、得られた変異体プラスミド(pKF19LAM
YAA)の変異部位を含む部分を増幅し(図3)、これを
高発現誘導領域SP64を含むプラスミドベクターpHSP64の
SmaI部位に導入した(pHSPLAMYAA、図3)。
(I193D 及びRG+I193D)の大量培養 変異プラスミド(pHSPLAMYAA)をB. subtilis ISW1214
株(leuA metB5 hsdM1)にプロトプラスト法(Chang &
Cohen, Mol. Gen. Genet., 168, 111-115, 1979)によ
り形質転換し、適当な液体培地(コーンスティープリカ
ー、4%;トリプトース、1%;肉エキス、1%;リン
酸1カリウム、0.1%;硫酸マグネシウム0.01
%;マルトース、2%;塩化カルシウム、0.1%;テ
トラサイクリン、15μg/ml)で30℃で3日間、坂
口フラスコ中で培養した。得られた培養上清液を硫安分
画(60%飽和)して2mM CaCl2を含むTris-HCl緩衝液
pH7.5にて透析し、同緩衝液にて平衡化した陰イオン
交換樹脂カラム(DEAE−トヨパール)を通過させた後、
この通過溶液を陽イオン交換樹脂カラム(CM−トヨパー
ル)に吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させ
た。この溶出液を限外濾過膜(アミコン社のPM−10)に
より濃縮し、上記緩衝液にて透析することにより、均一
な精製酵素を得ることができた。得られた、精製品は、
SDS-PAGEにより単一バンドを与え、分子量は約55kDa
と決定された。
て、次に示す手法で熱安定性を検定した。対照として野
生型を用いた。
てプリインキュベートした中に、約0.2U/mlとなる
よう酵素を添加後、0分、20分、40分、60分にサ
ンプリングし、上記実施例に示す方法で残存するアミラ
ーゼ活性を測定した。それぞれのスタート時の活性を1
00%として相対活性を求め、アミラーゼ残存活性とし
た。結果を表1に示す。
どないのに対し、I193Dでは50%以上であった。
RG+I193Dではほとんど活性が減少しなかった。
mM Tris-HCl pH8.5を予め60℃で5分間プリインキ
ュベートした。その中に野生型及びRG+I193Dを
約0.2U/mlとなるように加え、60℃、30分間放
置した後、残存するアミラーゼ活性を測定した。残存活
性はインキュベート前の活性を100%とし、相対活性
で示した。結果を表2に示す。
り顕著に向上した。
した。本洗浄剤に、実施例3で得られた変異α−アミラ
ーゼを配合することにより、優れた洗浄効果を示した。
がアルカリ側にあり、かつ熱安定性が向上したものであ
る。かかる変異α−アミラーゼは、洗浄剤組成物、液化
・糖化用組成物、繊維糊抜き剤等に配合することにより
効果を発揮する。
ラーゼ(KSMAP1378)の成熟酵素アミノ酸配列(配列番
号1と同じ)とその他のBacillus属細菌α−アミラーゼ
の成熟酵素アミノ酸配列との相同性を示す図である。NC
IB 12512とNCIB 12513はWO9526397 記載のα−アミラー
ゼ、B. amyloはB. amyloliquefaciens、B. stearo はB.
stearothermophilus、B. lichen はB. licheniformis
の生産するα−アミラーゼ。下記した*は全てのα−ア
ミラーゼで相同性があることを示している。
ラーゼ(KSMAP1378)の成熟酵素アミノ酸配列(配列番
号1と同じ)とその他のBacillus属細菌α−アミラーゼ
の成熟酵素アミノ酸配列との相同性を示す図である。NC
IB 12512とNCIB 12513はWO9526397 記載のα−アミラー
ゼ、B. amyloはB. amyloliquefaciens、B. stearo はB.
stearothermophilus、B. lichen はB. licheniformis
の生産するα−アミラーゼ。下記した*は全てのα−ア
ミラーゼで相同性があることを示している。
アミラーゼ遺伝子の枯草菌による生産の模式図である。
Claims (7)
- 【請求項1】 配列番号1で示されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するア
ミノ酸配列における193位のイソロイシンに相当する
アミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に置換されたアミノ酸
配列を有する変異α−アミラーゼ。 - 【請求項2】 さらに181位のアルギニン及び182
位のグリシンに相当するアミノ酸が欠失したものである
請求項1記載の変異α−アミラーゼ。 - 【請求項3】 他のアミノ酸が、アスパラギン酸である
請求項1又は2記載の変異α−アミラーゼ。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれか1項記載の変異
α−アミラーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項5】 請求項4記載の遺伝子を含有する組換え
ベクター。 - 【請求項6】 請求項5記載の組換えベクターで形質転
換又は染色体相同組換えされた形質転換細胞。 - 【請求項7】 請求項1〜3のいずれか1項記載の変異
α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。
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---|---|---|---|
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---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
JP2008505632A (ja) * | 2004-07-07 | 2008-02-28 | ダニスコ エイ/エス | 非マルトース生成エキソアミラーゼ改変体 |
US7803604B2 (en) | 2000-07-28 | 2010-09-28 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Amylolytic enzyme extracted from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and washing and cleaning agents containing this novel amylolytic enzyme |
US8030050B2 (en) | 2005-07-07 | 2011-10-04 | Danisco A/S | Modified amylases from Pseudomonas species |
US8129511B2 (en) | 2003-07-07 | 2012-03-06 | Danisco A/S | Modified amylases, nucleic acids encoding those amylases and uses thereof |
US8143048B2 (en) | 2003-07-07 | 2012-03-27 | Danisco A/S | Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof |
US8178336B2 (en) | 2006-06-19 | 2012-05-15 | Danisco A/S | Polypeptide |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
-
1999
- 1999-02-25 JP JP04821399A patent/JP4220611B2/ja not_active Expired - Fee Related
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US8143048B2 (en) | 2003-07-07 | 2012-03-27 | Danisco A/S | Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof |
US8663966B2 (en) | 2003-07-07 | 2014-03-04 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polypeptide |
US8809032B2 (en) | 2003-07-07 | 2014-08-19 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof |
JP2008505632A (ja) * | 2004-07-07 | 2008-02-28 | ダニスコ エイ/エス | 非マルトース生成エキソアミラーゼ改変体 |
US8137944B2 (en) | 2004-07-07 | 2012-03-20 | Danisco A/S | Modified amylases from pseudomonas species, methods of making and uses thereof |
JP2012070751A (ja) * | 2004-07-07 | 2012-04-12 | Danisco As | ポリペプチド |
JP2014221074A (ja) * | 2004-07-07 | 2014-11-27 | デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス | ポリペプチド |
US8030050B2 (en) | 2005-07-07 | 2011-10-04 | Danisco A/S | Modified amylases from Pseudomonas species |
US8178336B2 (en) | 2006-06-19 | 2012-05-15 | Danisco A/S | Polypeptide |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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