JP4077095B2 - 新規アミラーゼ - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、高度なキレート剤耐性能を有し、洗浄剤配合成分として有用なアルカリ液化型アミラーゼに関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
α−アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合の適性が知られており、洗浄力増強成分として自動食器洗浄機用洗剤や衣料用洗剤などへも配合が行われている(Enzymes in Detergency, P203. Marcel Dekker Inc., New York(1995))。
【0003】
洗浄剤用として有用なアルカリ側に最適作用を有している液化型α−アミラーゼとしては、本発明者らが以前に見出したバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−1378(FERM BP−3048)株由来のものが知られていた(WO94/26881)。また、最近、至適pHを8〜8.5付近に有するα−アミラーゼが開示された(WO95/2639)が、これはKSM−1378株のアミラーゼとその性質及び構造が酷似しているものであった。
【0004】
一方、洗剤には、洗浄妨害イオンであるカルシウム等を洗浄液中から除く為にリン酸、クエン酸あるいはゼオライト等のキレート剤が配合されており、液化型α−アミラーゼはEDTAにより失活することが知られていた〔HANDOBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZYMES, P43. The Amylase Research Society of Japan(1988)〕。前述のバチルス エスピー KSM−1378(FERM BP−3048)株由来のアルカリ液化型α−アミラーゼに関してもキレート剤による酵素活性の阻害が認められ、自動食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗剤に配合すると必ずしもその効果は十分とはいえなかった。また、最適作用pHは中酸性であるがアルカリ性でも活性を示し、現在、自動食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗剤の配合成分として最もよく用いられているバチルス リケニフォルミス由来の液化型α−アミラーゼ(ターマミル及びデュラミル、いずれもノボ社製)に関しても、そのキレート剤耐性能は十分とはいえなかった。
これまでに知られている液化型アミラーゼのうち、キレート剤に対して影響されないものとしては、パイロコッカス(Pyrococcus)属の株由来の液化型α−アミラーゼ(WO90/11352)及び澱粉の液化工程に有効なスルホロブス(Sulfolobus)属の株由来のα−アミラーゼ(WO96/02633)が挙げられるが、これら酵素の最適作用pHはそれぞれ、pH4〜6及びpH2.5〜4.5にあり、アルカリ性では作用しないため、洗浄剤の配合成分としては適していなかった。
【0005】
従って、本発明は、従来の洗剤用アミラーゼに比べて高度なキレート剤耐性能を有し、洗浄剤配合成分として有用なアルカリ液化型アミラーゼ、及びこれを配合した洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明は、1〜100mMのEDTAあるいはEGTA存在下、pH10、45℃、30分間処理後の残存活性が70%以上であるアルカリ液化型アミラーゼを提供するものである。
【0007】
また、本発明は当該アルカリ液化型アミラーゼをコードするDNA断片を提供するものである。
更にまた、本発明は当該アルカリ液化型アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明において、アルカリα−アミラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるものをいう。また、中性とはpH6〜8の範囲をいい、アルカリ性とはそれ以上の範囲をいう。更に、HANDBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZYMES〔P40〜41.The Amylase Research Society of Japan(1988)〕に記載されているように、液化型とは澱粉及び澱粉系多糖類を高ランダムに分解するものをいう。
【0009】
本発明酵素は1〜100mMのEDTAあるいはEGTA存在下、pH10、45℃、30分間処理後の残存活性が70%以上であるアルカリ液化型アミラーゼであり、当該残存活性は、80%以上が好ましく、90%以上がより好ましい。
【0010】
本発明酵素は上記のキレート剤耐性を有すればよいが、更に下記1)及び2)の性質を有するもの、特に1)〜5)の性質を有するものが好ましい。
1)最適作用pH
最適作用pHが8.0を超える(可溶性澱粉を基質、50℃、15分間反応)。
2)作用
澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−1,4グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース(G1)、マルトース(G2)、マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、マルトヘキサオース(G6)及びマルトヘプタオース(G7)を生成する。ただしプルランには作用しない。
3)pH安定性(ブリットン−ロビンソン緩衝液)
40℃、30分間処理条件下で、pH6.5〜11.0の範囲で70%以上の残存活性を示す。
4)作用温度範囲及び最適作用温度
20〜80℃の広範囲で作用し、最適作用温度は50〜60℃である。
5)温度安定性
50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中、30分間処理で、40℃で80%以上の残存活性を示し、45℃でも約60%の残存活性を示す。
【0011】
また本発明酵素の例としては、配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸の1もしくは2以上が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられる。当該置換、欠失又は付加の範囲は、相同性80%以上が好ましく、90%以上が特に好ましい。なお、相同性はLipman-Pearson法(Science, 227, 1435(1985))により計算される。
【0012】
本発明の酵素は、例えばバチルス属に属するその生産菌を培養した後培養物から採取することにより製造される。かかる生産菌としては、例えば下記の菌学的性質を有するKSM−K36株及びKSM−K38株が挙げられる。
【0013】
【表1】
【0014】
以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー〔Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology, Williams & Wilkins, United States of America(1986)〕及びジーナス・バチルス〔The Genus Bacillus, Agricultural Research Service, Washington, D. C.(1973)〕を参照し、比較検討した結果、両菌株は有胞子桿菌であるバチルス(Bacillus)属の一種であると認められる。しかし、両菌株は中性領域では生育できず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことから、いわゆる好アルカリ性(Alkaliphilic)微生物に属し、従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。更に、菌学的及び生理学的性質を公知の好アルカリ性バチルスと比較した〔Microbiol., 141, 1745(1995)〕結果、KSM−K36株及びKSM−K38株は公知の好アルカリ性バチルスのいずれとも一致しないので、これらを新規菌株と判断して、KSM−K36株及びKSM−K38株をそれぞれ、第16816号(FERM P−16816)及び第16817号(FERM P−16817)として通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【0015】
上記の微生物を用いて本発明のアルカリ液化型アミラーゼを得るには、培地に微生物を接種し、常法に従って培養すればよく、好アルカリ性菌である為に、培地のpHがアルカリ性であることが望ましい。斯くして得られた培養物中から目的のアルカリ液化型アミラーゼを採取することができる。この培養上清液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、塩析法、沈殿法、限外濾過法の分離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化することにより精製酵素として使用することも可能である。
【0016】
以下、本発明のアルカリ液化型アミラーゼの精製法の一例を挙げる。培養上清液について、(1)硫安沈殿、(2)DEAE−トヨパール(トーソー社製)カラムクロマトグラフィー、(3)ゲル濾過をすることにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度10%)及びソディウムドデシル硫酸(SDS)電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができる。
【0017】
更に、本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、例えば、本発明アルカリ液化型アミラーゼをコードする遺伝子及びこれを含有するベクタープラスミドを取得し、次いで該プラスミドを用いて、適当な微生物、好ましくはバチルス属細菌を形質転換し、これを培養することにより得ることもできる。
本発明のアルカリ液化型アミラーゼをコードする遺伝子の例としては、配列番号3及び4に記載した塩基配列を有するものが挙げられる。
【0018】
前記の如く本発明のアルカリ液化型アミラーゼはアルカリ側に最適作用pHを有し、かつ高いキレート剤耐性能を有するので、洗浄剤配合用酵素として特に有用である。また、KSM−K36株及びKSM−K38株由来のアミラーゼは、更に強力な酸化剤耐性も有するので、漂白剤等の酸化剤を配合する洗浄剤にも配合可能である。本発明酵素の洗浄剤への配合量は、0.001〜5重量%が好ましい。
【0019】
本発明洗浄剤組成物には、前記アルカリ液化型アミラーゼのほかに、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄成分としては、WO94/26881の第5頁、右上欄、第14行〜右下欄、第29行記載のもの、例えば界面活性剤、キレート剤、アルカリ剤及び無機塩、漂白剤、蛍光剤等を使用することができる。
【0020】
界面活性剤は、洗浄剤組成物中0.5〜60重量%(以下単に%で示す)配合され、特に粉体状洗浄剤組成物については10〜45%、液体洗浄剤組成物については20〜50%配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に1〜10%、好ましくは1〜5%配合される。二価金属イオン捕捉剤は0.01〜50%、好ましくは5〜40%配合される。アルカリ剤及び無機塩は0.01〜80%、好ましくは1〜40%配合される。
再汚染防止剤は0.001〜10%、好ましくは1〜5%配合される。
本発明のアミラーゼ以外にプロテアーゼ、セルラーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等を使用することができる。これらの酵素は0.001〜5%、好ましくは0.1〜3%配合される。漂白剤(例えば過酸化水素、過炭酸塩等)は1〜10%配合するのが好ましい。漂白剤を使用するとき漂白活性化剤(アクチベーター)を0.01〜10%配合することができる。蛍光剤はビフェニル型蛍光剤(例えばチノパールCBS−X)やスチルベン型蛍光剤(例えばDM型蛍光染)等が挙げられる。蛍光剤は0.001〜2%配合するのが好ましい。
【0021】
上記の洗浄剤組成物の形態は、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、この洗浄剤組成物は、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。
【0022】
【実施例】
酵素活性の測定には次の緩衝液を用い、以下の方法に従って行った。
pH4.5〜6.0 酢酸緩衝液
pH6.0〜8.0 リン酸カリウム緩衝液
pH9.0〜10.5 グリシン水酸化ナトリウム緩衝液
pH10.0〜12.0 炭酸緩衝液
pH4.0〜12.0 ブリットン−ロビンソン緩衝液
【0023】
〔アミラーゼ活性測定方法〕
1.試薬の調製法
(1%可溶性澱粉水溶液の調製法)
可溶性澱粉(ポテト由来、シグマ社製)5gをイオン交換水400mLに懸濁した後、沸騰水中で攪拌しながら約10分間加熱溶解し、イオン交換水にて500mLに定容する。
(250mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)の調製法)
グリシン(和光純薬社製特級)9.38gをイオン交換水約300mLに溶解した後、pHメーターを用い、約5Nの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを10に調整する。更にイオン交換水にて500mLに定容する。
(DNS試薬の調製法)
水酸化ナトリウム(和光純薬社製特級)8gをイオン交換水300mLに溶解する。これに3,5−ジニトロサリチル酸(DNS、和光純薬社製特級)2.5gを徐々に添加しながら溶解する。DNSを完全に溶解させた後、酒石酸ナトリウムカリウム(和光純薬社製特級)を150g加える。完全に溶解させた後、イオン交換水にて500mLに定容する。
(検量線作成用ブドウ糖溶液の調製法)
ブドウ糖標準液(光電用、和光純薬社製)とイオン交換水を用い、0、1、2、3、4、5(μmol/0.1mL)のブドウ糖溶液を調製する。
2.アミラーゼ活性の測定法
(酵素溶液の希釈)
精製酵素を、δ吸光度〔=(サンプルの吸光度)−(ブランクの吸光度)〕が0.6以下になるように10mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)で希釈する。
(サンプルの測定)
試験管に1%可溶性澱粉水溶液0.5mL、250mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)0.2mL、イオン交換水0.2mLを加え(以下、基質溶液と略す)、これを50℃の水浴中で約5分間予熱する。予熱後、適当に希釈した酵素溶液0.1mLを加え、50℃で、15分間反応させる。反応終了後、DNS試薬1.0mLを加え、沸騰水中で5分間加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水4.0mLを加え、混合し、535nmにおける吸光度を測定する。
(ブランクの測定)
試験管に基質溶液0.9mLを入れ、これにDNS試薬1.0mLを加える。更に酵素溶液0.1mLを加え、沸騰水中で5分間加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水4.0mLを加え、混合し、535nmにおける吸光度を測定する。
(検量線の作成)
試験管に基質溶液0.9mLを入れ、これにDNS試薬1.0mLを加える。更に各濃度の検量線作成用ブドウ糖溶液0.1mLを加え、沸騰水中で5分間加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水4.0mLを加え、混合し、535nmにおける吸光度を測定する。横軸にブドウ糖溶液の濃度(μmol/0.1mL)、縦軸に吸光度をとり、最小二乗法により傾きを求め、換算係数(F)を次式に従って算出する。
換算係数(F)=〔1/傾き〕×〔1/15〕×〔1000/0.1〕
尚、検量線は活性測定毎に作成するものとする。
(活性の算出)
酵素の力価は、1分間に1μmolのブドウ糖に相当する還元糖を生成する酵素量を1単位(U)とし、次式に従って算出する。
アミラーゼ活性(U/L)=〔δ吸光度〕×〔換算係数(F)〕×〔酵素希釈倍率〕
【0024】
〔キレート剤耐性能試験方法〕
(EDTA溶液の調製)
EDTA(シグマ社製)9.3gをイオン交換水約80mLに溶解した後、pHメーターを用い、約5Nの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを8に調整する。更にイオン交換水にて100mLに定容することによって250mM EDTA溶液を調製する。次にこれをイオン交換水で希釈して10〜100mMのEDTAを調製する。
EGTA(シグマ社製)9.5gをイオン交換水約80mLに溶解した後、pHメーターを用い、約5Nの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを8に調整する。更にイオン交換水にて100mLに定容することによって250mM EGTA溶液を調製する。次にこれをイオン交換水で希釈して、10〜100mMのEGTA溶液を調製する。
(キレート剤耐性能の試験法)
1 mM EDTA、40℃、30分間処理の場合
試験管に10mM EDTA溶液0.1mL、250mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)0.2mL、イオン交換水0.1mLを加え、45℃の水浴中で約5分間予熱する。予熱後、10mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)で適当に希釈した酵素溶液0.1mLを加え、45℃で、30分間保温する。30分後、予め50℃の水浴中で予熱した基質溶液0.9mLに処理溶液0.1mLを加え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測定する。
【0025】
〔酸化剤耐性能試験方法〕
試験管に過酸化水素(30% 過酸化水素水、和光純薬社製)0.067mL、250mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)0.2mL、イオン交換水0.633mLを加え、30℃の水浴中で約5分間予熱する。予熱後、10mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)で適当に希釈した酵素溶液0.1mLを加え、30℃で、60分間保温する。60分後、予め氷水中に準備したカタラーゼ(牛肝臓由来、ベーリンガーマンハイム社製)1μL添加試験管に処理溶液0.2mLを加え、過酸化水素を失活させ反応を停止する。その後、予め50℃の水浴中で予熱した基質溶液0.9mLにこの反応停止処理溶液0.1mLを加え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測定する。
〔タンパク質定量法〕
タンパク質は、バイオラッド社製のプロテインアッセイキットII(カタログ番号500−0002)を用い、標準アッセイ法に従って、キットに添付されたウシ血清アルブミンを標準タンパク質として定量した。
【0026】
実施例1 キレート剤耐性能を有するアルカリ液化型アミラーゼのスクリーニング
土壌約0.5gを滅菌水に懸濁し、80℃で15分間加熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈して、分離用寒天培地(培地A)に塗布した。次いで、これを30℃で2日間培養し、集落を形成させた。集落の周に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分離菌を培地Bに接種し、30℃で2日間好気的に振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレート剤(EDTA)耐性能を測定し、更に最適作用pHを測定して、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ生産菌をスクリーニングした。
【0027】
上述の方法により、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−K36株及びバチルス エスピー(Bacillus sp.) KSM−K38株を取得することができた。
【0028】
【0029】
【0030】
実施例2 KSM−K36株及びKSM−K38株の培養
実施例1の液体培地Bに、KSM−K36株あるいはKSM−K38株を接種し、30℃で2日間好気的に振盪培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性(pH8.5)を測定した結果、培養液1L当たり、それぞれ1177U及び557Uの活性を有していた。
【0031】
実施例3 本発明のアルカリ液化型アミラーゼの精製
実施例2で得られたバチルス エスピー KSM−K36株の培養上清液に80%飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて攪拌後、生成した沈殿を回収し、2mM CaCl2 を含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同緩衝液で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラムに添着し、同緩衝液を用いてO−1Mの食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動(ゲル濃度10%)及びソディウムドデシル硫酸(SDS)電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。尚、バチルス エスピー KSM−K38株の培養上清液からも同様の方法で精製酵素を得ることができた。
【0032】
実施例4 本発明アルカリ液化型アミラーゼのキレート剤耐性能
実施例3でKSM−K36株及びKSM−K38株の培養上清液から得た本発明のアルカリ液化型アミラーゼ精製品(以下、それぞれK36及びK38と略す)を用い、各種キレート剤に対する耐性能を測定した。
【0033】
1)EDTA及びEGTA耐性能
終濃度0〜100mMのEDTA(シグマ社製)あるいはEGTA(シグマ社製)を含む50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中に、10mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)で適当に希釈した精製酵素を添加し、所定の温度(30℃、40℃及び45℃)で30分間処理を行った後、アミラーゼ活性測定法〔50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)使用〕に準じて残存酵素活性を測定した。尚、対照として、バチルス リケニフォルミス由来のアミラーゼである、ターマミル及びデュラミル(いずれもノボ社製の造粒物より精製したもの)を使用した。
その結果、図1及び2に示したように、K36及びK38とも高濃度のEDTA及びEGTAによっても全く影響を受けず、ターマミル及びデュラミルと比べて、高度な耐性能を有することが明らかになった。
【0034】
2)クエン酸及びゼオライト耐性能
終濃度0〜0.5%のクエン酸三ナトリウム二水和物(和光純薬社製特級)あるいは合成ゼオライトA−3(和光純薬社製)を含む50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中に、10mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)で適当に希釈した精製酵素を添加し、所定の温度(40℃及び45℃)で30分間処理を行った後、アミラーゼ活性測定法〔50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)使用〕に準じて残存酵素活性を測定した。
【0035】
その結果、K36及びK38ともクエン酸及びゼオライトにより全く影響を受けないことが示された(図3〜6)。
【0036】
実施例5 本発明アルカリ液化型アミラーゼの作用pH及び最適作用pH
終濃度50mMの各種緩衝液〔酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.0〜10.5)及び炭酸緩衝液(pH10.0〜12.0)〕を用い、アミラーゼ活性測定法に準じてK36及びK38を測定し、それぞれ最大の活性を100%として、相対活性で示した。
この結果(図7及び8)、いずれも、pH6.0〜10.0の範囲で作用し、最適作用pHは8.0〜9.0であることが明らかになった。尚、pHは反応液の実測値を測定して示した。
【0037】
実施例6 本発明アルカリ液化型アミラーゼの酸化剤耐性能及び酵素比活性
終濃度2%(580mM)のH2O2を含む50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中に、10mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)で適当に希釈した酵素(K36、K38、ターマミル及びデュラミル)を添加し、30℃で60分間処理を行い、経時的にアミラーゼ活性測定法〔50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)使用〕に準じて残存活性を測定した。酸化剤耐性能はそれぞれ、未処理での活性を100%として、残存活性で示した。
【0038】
その結果(図9)、K36及びK38はいずれも、2%H2O2存在下、pH10、30℃、60分間処理後でも70%以上、特に94%以上の残存活性を維持しており、充分な酸化剤耐性能を有することが認められた。
また、pH10、50℃、15分間反応(可溶性澱粉を基質)での酵素活性値と、プロテインアッセイキット(バイオラド社製)により測定したタンパク質量より算出したK36及びK38の酵素比活性は、それぞれ、4300U/mg及び3600U/mgとなり(表2)、両酵素はいずれも3000U/mg以上の比活性を有しており、タンパク工学によって構築された酸化剤耐性酵素(LAMY・M202T(WO98/44126)及びデュラミル)と比較して、極めて高い酵素比活性を有することが明らかになった。従って、本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、洗剤への配合量などの面や工業的発酵生産の面に於いて優位である。
【0039】
【表2】
【0040】
実施例7 本発明アルカリ液化型アミラーゼ(K36及びK38)のその他の酵素学的性質
両精製酵素の解析を行った結果、以下の特性が明らかになった。
【0041】
(1)作用
いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−1,4グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース(G1)、マルトース(G2)、マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、マルトヘキサオース(G6)及びマルトヘプタオース(G7)を生成する。ただしプルランには作用しない。
(2)pH安定性(ブリットン−ロビンソン緩衝液)
いずれも、40℃、30分間処理条件下で、pH6.5〜11.0の範囲で70%以上の残存活性を示す。
(3)作用温度範囲及び最適作用温度
いずれも、20〜80℃の広範囲で作用し、最適作用温度は50〜60℃である。
(4)温度安定性
50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中にて温度を変化させ、各温度で30分間処理することにより失活の条件を調べると、いずれも40℃で80%以上の残存活性を示し、45℃でも約60%の残存活性を示した。
(5)分子量
いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量は55,000±5,000である。
(6)等電点
いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は4.2付近である。
(7)界面活性剤の影響
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、SDS、石鹸及びソフタノール等の各種界面活性剤0.1%溶液中で、pH10、30℃で30分間処理しても、いずれも殆ど活性阻害を受けない(活性残存率90%以上)。
(8)金属塩の影響
各種金属塩と共存させて、pH10、30℃で30分間処理してその影響を調べた。K36は、1mMのMn2+により阻害され(阻害率約95%)、1mMのHg2+、Be2+及びCd2+により若干阻害される(阻害率30〜40%)。K38は、1mMのMn2+により阻害され(阻害率約75%)、1mMのSr2+及びCd2+により若干阻害される(阻害率約30%)。
(9)N末端アミノ酸配列
両アミラーゼのN末端アミノ酸配列をエンドマン分解法〔Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 283,(1948)〕によりプロテイン−ケンサー(ABI社製)477Aを用いて測定した結果、いずれも、Asp-Gly-Leu-Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Tyr-Glu-Trp-His-Leu の配列を有することが判った。
【0042】
実施例8 本発明アルカリ液化型アミラーゼの自動食器洗浄機用洗剤洗浄力評価本発明のアルカリ液化型アミラーゼ(K36及びK38)の自動食器洗浄機用洗剤での洗浄評価を下記条件で行った。別に対照として本発明酵素を含有しない洗剤を用いた。
1)汚染皿の調製
沸騰水道水で煮沸した後、水道水を加えて溶液状にしたオートミール(クエーカー社製)1mLを磁性皿に塗布し、室温で約3時間乾燥させた後、使用直前まで5℃(半密閉状態)にて保存した。1回の洗浄には3枚供した。
2)洗浄条件
・使用機種;松下電器(株)製全自動食器洗い機NP−810
・洗浄温度;水温から約55℃まで徐々に昇温する。
・洗浄用水;水道水
・洗浄剤濃度;0.2重量%
・洗浄時間;洗浄約20分→すすぎ約20分(標準コース)
・洗浄時の循環水量;3.5L
3)洗剤組成(%は重量%を示す)
プルロニックL−61 2.2%、炭酸ナトリウム24.7%、炭酸水素ナトリウム24.7%、過炭酸ナトリウム10.0%、1号珪酸ナトリウム12.0%及びクエン酸3ナトリウム20.0%、ポリプロピレングリコール3000
2.2%、シリコーンKST−04(東芝シリコーン社製)0.2%、ソカランCP−45(BASF社製)4.0%。
4)添加酵素量
緩衝液としてグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)を用い、上述のアミラーゼ活性測定法により実施例3で得られた精製酵素の活性値を測定し、洗浄当たり150U添加した。
5)洗浄力評価方法
洗浄後の皿にヨウ素溶液を塗布し、ヨウ素−澱粉反応による色を目視で判定した。
【0043】
その結果、本発明酵素含有洗剤を用いた場合汚れを完全に除去でき、本発明酵素を含有しない場合と比べ極めて優れた洗浄性能を有していた。
【0044】
実施例9
SaitoとMiuraの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1961)〕によって抽出したKSM−K36株及びKSM−K38株の染色体DNAを鋳型とし、既知のバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼに於いて保存性が高いMet-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp配列、及びTrp-Phe-Lys-Pro-Leu-Tyr配列を基にしてデザインした2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法に従ってPCRを行った結果、いずれの場合も約1.0kbの増幅DNA断片が得られた。両DNA断片の塩基配列を解析し、次いで、両断片の上流側、下流側のDNA断片を逆PCR法〔T. Trigliaら, Nucleic Acids Res., 16, 81(1988)〕及びPCRインビトロクローニングキット(ベーリンガーマンハイム社製)を用いて取得し、その塩基配列の解析を行った。この結果、両株ともに約1.7kbの遺伝子領域中に配列番号1及び2に示した501アミノ酸残基をコードする唯一のオープン リーディング フレーム(Open reading frame, ORF)が見出され、アミノ末端領域の配列(アミノ酸番号Asp1〜Leu15)が、KSM−K36株及びKSM−K38株の培養液から精製されたアミラーゼK36及びK38のアミノ末端配列(15アミノ酸残基)と完全に一致することが明らかになった。決定されたK36及びK38アミラーゼ遺伝子は、それぞれ、配列番号3及び4に示した塩基配列を有していた。
【0045】
実施例10
両株の染色体DNAを鋳型としたPCR法によって、開始コドンの0.7kb上流から終始コドンの0.1kb下流までの1.7kbのDNA断片を増幅し、シャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト本社製)を用いて、枯草菌ISW1214株に導入した。得られた組換え体枯草菌株は、いずれも液体培養に於いて培養液中にアミラーゼを生産した。実施例3に示した方法によって培養上清からアミラーゼを精製し、その特性を解析したところ、KSM−K36株及びKSM−K38株の培養液から精製されたアミラーゼの特性と良く一致し、いずれも作用至適pHはpH8〜9に認められ、pH10に於いて約4000U/mgの比活性を有し、更に、キレート剤及び酸化剤に対して高い耐性を有していることが明らかになった。
【0046】
【発明の効果】
本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、今までに知られている洗剤用アミラーゼに比べて、高度なキレート剤耐性能を有する。また最適作用pHは8を超える。従って、本発明のアルカリ液化型アミラーゼはアルカリ領域で澱粉を加工する工程など極めて広範囲の産業分野で使用され得る。特に、キレート剤を含有する自動食器洗浄機用洗剤、衣料用洗剤及び漂白剤等に配合することにより有利に使用することができるものであり、工業的に極めて大きな意義を有するものである。
【0047】
【配列表】
【0048】
【0049】
【0050】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ(K36及びK38)と既知の洗剤用アミラーゼのEDTA処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図2】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ(K36及びK38)と既知の洗剤用アミラーゼのEGTA処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図3】本発明のアルカリ液化型アミラーゼK36のゼオライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図4】本発明のアルカリ液化型アミラーゼK36のクエン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図5】本発明のアルカリ液化型アミラーゼK38のゼオライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図6】本発明のアルカリ液化型アミラーゼK38のクエン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図7】本発明のアルカリ液化型アミラーゼK36の反応pHと相対活性との関係を示す図面である。
【図8】本発明のアルカリ液化型アミラーゼK38の反応pHと相対活性との関係を示す図面である。
【図9】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ(K36及びK38)と既知の洗剤用アミラーゼのH2O2処理時間と残存活性との関係を示す図面である。
Claims (2)
- 次の酵素学的性質を有するバチルス属微生物由来のアルカリ液化型アミラーゼ。
1)最適作用pH
最適作用pHが8.0〜9.0(可溶性澱粉を基質、50℃、15分間反応)。
2)作用
澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−1,4グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース(G1)、マルトース(G2)、マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、マルトヘキサオース(G6)及びマルトヘプタオース(G7)を生成する。ただしプルランには作用しない。
3)pH安定性(ブリットン−ロビンソン緩衝液)
40℃、30分間処理条件下で、pH6.5〜11.0の範囲で70%以上の残存活性を示す。
4)作用温度範囲及び最適作用温度
20〜80℃の広範囲で作用し、最適作用温度は50〜60℃である。
5)温度安定性
50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中、30分間処理で、40℃で80%以上の残存活性を示し、45℃でも約60%の残存活性を示す。
6)分子量
ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量は55,000±5,000である。
7)キレート剤耐性能
1〜100mMのEDTAあるいはEGTA存在下、pH10、45℃、30分間処理後の残存活性が70%以上である。 - 次の酵素学的性質を有するバチルス属微生物由来のアルカリ液化型アミラーゼ。
1)最適作用pH
最適作用pHが8.0〜9.0(可溶性澱粉を基質、50℃、15分間反応)。
2)作用
澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−1,4グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース(G1)、マルトース(G2)、マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、マルトヘキサオース(G6)及びマルトヘプタオース(G7)を生成する。ただしプルランには作用しない。
3)pH安定性(ブリットン−ロビンソン緩衝液)
40℃、30分間処理条件下で、pH6.5〜11.0の範囲で70%以上の残存活性を示す。
4)作用温度範囲及び最適作用温度
20〜80℃の広範囲で作用し、最適作用温度は50〜60℃である。
5)温度安定性
50mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)中、30分間処理で、40℃で80%以上の残存活性を示し、45℃でも約60%の残存活性を示す。
6)分子量
ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量は55,000±5,000である。
7)酸化剤耐性能
2%H2O2存在下、pH10、30℃、60分間処理後、70%以上の残存活性を維持する。
8)酵素比活性
pH10、50℃、15分間反応(可溶性澱粉を基質)での酵素活性値と、タンパク質量より算出した酵素比活性は、3000U/mg以上である。
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